CN109862786A - 包含改性cd163的猪及相关方法 - Google Patents

包含改性cd163的猪及相关方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109862786A
CN109862786A CN201780064104.0A CN201780064104A CN109862786A CN 109862786 A CN109862786 A CN 109862786A CN 201780064104 A CN201780064104 A CN 201780064104A CN 109862786 A CN109862786 A CN 109862786A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pig
cell
gene
srcr5
exon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780064104.0A
Other languages
English (en)
Inventor
西蒙·杰弗里·利利科
艾伦·艾奇伯德
克里斯托弗·布鲁斯·亚历山大·怀特劳
克里斯丁·泰特-布卡德
塔哈·艾特-阿里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Edinburgh
Original Assignee
University of Edinburgh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Edinburgh filed Critical University of Edinburgh
Publication of CN109862786A publication Critical patent/CN109862786A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及基因编辑的猪，其产生的CD163蛋白质中删除了清道夫受体半胱氨酸富集5(SRCR5)区(也被称为CD163区5)。发现这种猪很健康，没有显示不良性能，并对PRRSV感染有抗性。在编辑的猪中表达的CD163还展示了保留有作为血红蛋白‑触珠蛋白清道夫的能力。还提供了这种猪的生产方法。

Description

包含改性CD163的猪及相关方法
本发明涉及基因编辑的猪，其生成的CD163蛋白质中删除了清道夫受体半胱氨酸富集区5(SRCR5)。发现这种猪很健康，不会出现不良性能，并且能抗PRRSV感染。此外，没有了SRCR5的CD163蛋白质保留作为血红蛋白-触珠蛋白的清道夫的能力。本发明还涉及生产这种猪的方法。
发明背景
猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)是引起被称为猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)的猪疾的病毒。
这是经济上十分重要的疾病，其在许多猪生产国家极为普遍，引起种畜繁殖失败以及小猪的呼吸道疾病。其最初被称为“神秘的猪疾”和“神秘的繁殖综合症”，于1987年在北美和中欧首次报道。预计该疾病使美国猪产业每年耗费约6亿5千万美元。
PRRSV经由一组巨噬细胞表面标记物：CD169和CD163，进入巨噬细胞。根特的汉斯·诺文克团队发现了CD169/唾液酸粘附素的作用。与辉瑞共事的科学家们(2007年卡尔氟特等人)发现了CD163的作用。卡尔氟特等人(2007)证明任何带有CD163的非易感的细胞的转染都能够使细胞容易染上PRRSV。这使得能够生成疫苗菌株而无需使用Marc-145细胞。
凡·哥普等人(“Susceptible cell lines for the production of porcinereproductive and respiratory syndrome virus by stable transfection ofsialoadhesin and CD163”，BMC Biotechnology 2010，10：48)已经证明CD163蛋白质的区5-区9对于PRRSV进入非易感的细胞是非常重要的，并强调区5可能是关键性的。
达斯等人(“The Minor Envelope Glycoproteins GP2a and GP4 of PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus Interact with the ReceptorCD163”，JOURNAL OF VIROLOGY，Feb.2010，p.1731-1740)证明了PRRSV糖蛋白GP2A和GP4与CD163物理上相互作用。
辉瑞(硕腾公司)的美国专利申请US20050271685说明使用CD163分子能够使得细胞容易染上PRRSV和非洲猪瘟病毒(ASFV)。
WO2012/158828描述了抗PRRS的动物中SIGLEC1和/或CD163基因是失活的。但是，CD163在正常生理活动中具有作用。因此，不想使该基因失活，因为这可能使动物出现不良的和不可预见的连锁效应。
仍然需要改进PRRSV的预防和治疗。
发明人成功地生成了基因编辑的猪，其产生的CD163中删除了清道夫受体半胱氨酸富集区5(SRCR5)(也被称为CD163区5)。发现发明人生产的猪是健康的，且没有出现不良性能。发明人操作的实验显示了猪展现出对PRRSV感染的抗性。在编辑的猪中表达的CD163还展现出保持作为血红蛋白-触珠蛋白清道夫的作用的能力。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种基因编辑的猪，该猪包括编辑的基因组，其中该编辑导致SRCR5区从由猪产生的CD163蛋白质中删除了。换句话说，基因编辑的猪产生一种改性形式的CD163蛋白质，其中不含SRCR5(文中也被称为区5)。
优选地，猪为猪属动物(野猪)，更优选地为家猪(家猪或家养猪)。
适当地，猪包括编辑的基因组，其中该编辑导致SRCR5从动物产生的CD163蛋白质中删除，且CD163的所有其它区都在，并且未更改它们的氨基酸序列。因此，猪适当地产生CD163，其中没有SRCR5，但SRCR区1至4以及区6至9未更改，如跨膜片段和胞浆区。本发明人意外地发现删除了SRCR5的CD163蛋白质能够保持其作为血红蛋白-触珠蛋白清道夫的生理机能，但是对于在具有改性的CD163蛋白质的细胞中，对PRRSV的感染产生高水平的抗性。
因此，在本发明的某些实施方式中，由编辑的基因组表达的CD163蛋白质优选保持大部分功能性。此文中“大部分功能性”指蛋白质保留不依赖于SRCR5区的生理机能。适当地，改性的CD163蛋白质大体保持功能性，因为其能够作为血红蛋白-触珠蛋白清道夫。根据本文描述的方法，即基于从编辑的猪的外周血单核细胞得到的巨噬细胞清除血红蛋白-触珠蛋白的能力，能够很容易对CD163蛋白质作为血红蛋白-触珠蛋白清道夫的能力进行评估。CD163蛋白质作为血红蛋白-触珠蛋白清道夫的能力表示尽管删除了SRCR5区，CD163蛋白质仍能正确折叠并具有功能性。
CD163的SRCR5具有下列氨基酸序列：
HRKPRLVGGDIPCSGRVEVQHGDTWGTVCDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSLLGGAHFGEGSGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPDGTCSHSRDVGVVCS(SEQ IN NO：2)。
因此，由编辑的猪产生的改性的CD163蛋白质适当地缺乏上述氨基酸序列，即SEQID NO：2。适当地，由编辑的猪产生的CD163蛋白质没有进一步改变野生型氨基酸序列。
优选地，猪为纯合子或双等位基因，用于基因组编辑，其导致SRCR5从由动物产生的CD163删除。文中的“纯合子”指猪在染色体上的CD163基因中都包括相同的编辑，即，在染色体上都具有相同的等位基因。文中的“双等位基因”指猪在每条染色体上具有不同的编辑，但是这些编辑都对CD163进行了期望的编辑，即导致SRCR5从由动物产生的CD163蛋白质中删除。
优选地，动物的所有细胞包括编辑的基因组。但是，在一些情况下，动物能够呈现镶嵌性，一些细胞包括编辑的基因组，其它细胞不包括编辑的基因组。PRRSV感染巨噬细胞，因此提供的巨噬细胞和它们的祖细胞没有表达包含SRCR5的CD163，动物将抗PRRSV感染。
通常优选地，猪不产生任何包括SRCR5的CD163，即动物的所有细胞为纯合子或双等位基因，用于基因编辑，该基因编辑导致SRCR5从由猪产生的CD163删除。
对于本领域技术人员而言，很明显本发明的基因编辑的猪可以是直接经过了本文所述的基因编辑方法的猪，或保留编辑的基因组的这种猪的后代。的确，经过基因编辑方法的猪在某些情况下将为杂合的，然后繁殖成纯合子或双等位基因的后代。
适当地，基因组被编辑为使得来自编辑的CD163基因产生的mRNA(优选为成熟mRNA)中缺失为SRCR5指定遗传密码的序列。这能够通过从CD163基因删除外显子7的编辑实现，该外显子7编码CD163蛋白质的SRCR5区，或通过一种编辑实现，该编辑，例如由于mRNA形成过程中的拼接，导致从编辑的CD163基因的转录本移除由外显子7编码的RNA序列。
因此，在本发明的某些实施方式中，删除CD163基因的外显子7。删除CD163基因的外显子7将必然将SRCR5从编码的CD163蛋白质中删除。
在本发明的某些实施方式中，在外显子7的5’处的剪接受体位点是失活的。在外显子7的5’端处的剪接受体位点的失活导致外显子7从编辑的CD163基因产生的mRNA中剪接掉，由此在翻译时从mRNA获得的CD163蛋白质删除了SRCR5。
在本发明的实施方式中，该实施方式中猪包含编辑的基因组，该编辑的基因组中已经删除了CD163基因的外显子7，这能够通过许多方式实现。例如，该删除可限制为外显子7，或该删除可超出外显子7到旁侧的内含子区(即到内含子6和7)。通常优选地，删除全部外显子7。
适当地，编辑的基因组编辑为删除外显子7，但是CD163区的其他编码区没有其它变化。特别地，相比未编辑的基因组，通常优选地不改变CD163的其它外显子。因此，外显子1至6以及8至16优选不变。
在一些实施方式中，删除外显子7和在外显子7旁侧的部分内显子6和7。但是在CD163基因的剩余区中没有其它改变。
参照SEQ ID NO：1，外显子7范围为从位置23392至位置23706。因此，在编辑的猪的基因组中，该区域被适当地删除。
应当注意到，虽然本文参照SEQ ID NO：1描述了CD163基因的位置或区域，但是在不同个体的猪之间，CD163的序列会有变化(例如，其中出现了单核苷酸多态性(SNPs)或其它多态性)，因此，各个猪可包含稍微不同于SEQ ID NO：1的CD163序列。参照SEQ ID NO：1提及位置和区域并不意味着严格的限定，而是应该被解释为表示具有任何这种序列变化的猪CD163基因的相应位置。使用传统的序列对比技术，例如BLAST，本领域的技术人员可以很容易识别包括序列变化的CD163基因的相应位置或区域。
适当地，编辑的基因组编辑为未改变内含子6的剪接位点供体序列(即位于外显子6和内含子6的连接处)和内含子7的剪接位点受体部位，并保持功能性。这有利于正确剪接从编辑的CD163基因产生的转录本。因此，在本发明的实施方式中，参照SEQ ID NO：1，从位置10451延伸至位置10465、以及从位置23783延伸至位置23824的区域中的序列未改变。
适当地，基因组编辑为，参照SEQ ID NO：1，删除从位置10466延伸至23782的CD163基因的至少一部分区域，其中该部分包括外显子7。位置10466位于内含子6的3’预计剪接供体位点(即在外显子6的3’端)。位置23782位于内含子7的5’预计剪接受体位点(即在外显子8的5’端)。该区域如果包含外显子7，无疑会更小。
适当地，基因组编辑为参照SEQ ID NO：1，未改变从位置1到位置10465的区域和从位置23783或23754到位置32908的区域。
在本发明的某些实施方式中，外显子7连同从外显子7的5’端的5’延伸的多达5000个碱基一起删除，适当地多达2000个碱基，适当地多达1000个碱基，适当地多达500个碱基，适当地多达300个碱基或适当地多达100个碱基。
在本发明的某些实施方式中，外显子7连同从外显子7的3’端的3’延伸的多达75个碱基一起删除。该区域从外显子7的3’端延伸至外显子8的5’端处的预计剪接受体位点。适当地，外显子7连同从外显子7的3’端的3’延伸的多达50个碱基一起删除。
在一个实施方式中，编辑的基因组包括区域的删除，参照SEQ ID NO：1，该区域从大约位置23060延伸至大约位置23760，例如从位置23064或23065延伸至位置23753或23754，适当地，从位置20365延伸至位置23753。
在另一实施方式中，编辑的基因组包括区域的删除，参照SEQ ID NO：1，该区域从大约位置23260延伸至大约位置23760，例如从位置23267或23268延伸至位置237543或23754，适当地，从位置23268延伸至位置23753。
在另一实施方式中，编辑的基因组包括区域的删除，参照SEQ ID NO：1，该区域从大约位置23370延伸至大约位置23760，例如从位置23373或23374延伸至位置237543或23754，适当地，从位置23374延伸至位置23753。
在本发明的一些实施方式中，编辑的基因组可包括在相关位置不常发现的插入序列(即异源插入序列)。例如，当删除了包括外显子7的CD163基因片段时，插入序列可位于进行删除的位置。这种插入是通过基因编辑删除序列的相对寻常的人为现象。这种插入在本文中通常是不重要的，通常从基因产生的转录本将该插入序列剪接掉。因此，插入序列通常不引起任何特别的效果。插入序列普遍不是源于CD163基因的序列或任何同源或其它相关的序列。通常优选地，编辑的基因组中不出现这种异源插入序列。
在一特定优选的实施方式中，编辑的基因组包括删除从位置23268延伸至位置23753的区域，其中没有在删除位置插入序列。在这种实施方式中，猪在删除的外显子7的先前位点的编辑的基因组具有下列序列：
ATTGTCTCCAGGGAAGGACAGGGAGGTCTAGAATCGGCTAAGCCCAC||GTAGGGTT
AGGTAGTCA-SEQ ID NO：36(其中||表示可用于切除该区域的相邻的两个切割位点)。
在本发明的某些实施方式中，猪包括编辑的基因组，其中CD163基因的内含子6的剪接受体位点，即位于外显子7的5’端处的剪接受体位点是失活的。如上所述，外显子7的5’端处的剪接受体位点的失活使得外显子7从mRNA中被剪接掉，该mRNA由编辑的CD163基因产生，由此将SRCR5从mRNA翻译的CD163蛋白质中删除。
参照SEQ ID NO：1，在内含子6中的预计剪接受体位点从位置23378延伸至位置23416。因此，该序列适当地编辑成使剪接受体位点失活。
剪接受体位点可部分或全部删除，或其序列以任何其它适当的方式更改，使得其不再有功能性。因此，在一实施方式中，删除了剪接受体位点。在另一实施方式中，序列插入剪接受体位点中，并引起其失活。在另一实施方式中，例如通过同源性定向修复(HDR)介导的渗入活动，对剪接受体位点进行改性使得其失活。
在一实施例中，改变剪接受体位点的序列使得其包括限制性内切酶位点。例如，能够将改变的序列改变为使其包括NcoI限制性内切酶位点。但是，可提供非常多的其它限制性内切酶位点。在改变的剪接受体位点处引入限制性内切酶位点的好处是使得能够很容易地对成功的编辑活动的发生进行分析。
在一实施方式中，编辑剪接受体位点，以将序列从
AATGCTATTTTTCAGCCCACAGGAAACCCAGG(SEQ ID NO：3)改变为
AATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGG(SEQ ID NO：4)。在下面的情形中示出该序列变化。
在本发明的优选实施方式中，基因编辑的猪对PRRSV感染的耐受性或抗性得到提高。适当地，动物对PRRS感染有抗性。已示出将SRCR5从CD163删除引起CD163表达细胞，尤其是肺泡巨噬细胞(PAMs)和外周血单核细胞来源的巨噬细胞(PMMs)，变得对PRRSV的感染具有极高抗性。
根据本发明的第二方面，提供基因编辑的猪的细胞或胚胎，其中编辑导致SRCR5区从由猪的细胞或胚胎产生的CD163蛋白质中删除。文中的“细胞或胚胎”包括体细胞、生殖细胞、干细胞、配子、受精卵、囊胚、胚胎、胎儿和/或供体细胞。
关于发明的第一方面讨论的各种特征进行适当变通成为发明的第二方面。例如，上文讨论的各种关于猪的编辑的本质同等适用于编辑的细胞或胚胎。
根据本发明的第三方面，提供一种生产基因编辑的猪的方法，该方法包括步骤：
a)提供猪细胞；
b)编辑细胞的基因组来产生导致SRCR5从CD163蛋白质中删除的基因组改性；以及
c)从所述细胞生成动物。
导致SRCR5从CD163蛋白质中删除的基因组改性可为将外显子7从CD163基因中删除，或为剪接受体位点的失活，该剪接受体位点与CD163基因的外显子7相关，即位于外显子7的5’端的剪接受体位点。
在步骤a)中，猪细胞可为任何适当的细胞。适当地，猪细胞可为体细胞、配子、生殖细胞、配子体、干细胞(例如全能干细胞或多能干细胞)或受精卵。
优选地，该方法在受精卵中进行。术语“受精卵”严格意义上可指由配子融合形成的单个细胞。但是，本文中还可更广泛地用于指由真正的受精卵最初几次分裂得到的细胞束，更确切地被称为桑椹胚。
优选地，本发明至少开始于受精卵的单细胞阶段，并优选在该阶段完成。这应该致使猪的所有细胞包含相同的编辑。但是，该受精卵可在进行编辑过程时分裂。根据相对于编辑过程的阶段而言什么时候进行细胞分裂，可发生下列情况：
-所有细胞将含有相同的编辑，因为它们源于发生分裂前编辑的单个细胞(该编辑能够为细胞中的一个等位基因或两个等位基因，在一些情况下每个等位基因可具有同样的编辑的序列，在其它情况下它们可具有不同的编辑的序列，即发生双等位基因编辑活动)；
-所有细胞将含有相同的编辑，因为同样的编辑发生在发生分裂后的子细胞中；
-因为细胞在发生编辑之前分裂，且仅编辑了一个子细胞，因此生成进行编辑和未进行编辑的细胞镶嵌体；以及
-因为细胞分裂，并且子细胞发生的编辑活动不同，因此生成具有不同编辑的细胞镶嵌体。
编辑可在第一次细胞分裂后进行，结果可能很有趣。但是，普遍较不优选预期的结果为非镶嵌体动物。
适当地，步骤b)包括：
-将位点特异性的核酸酶引入至细胞中，该位点特异性的核酸酶靶向CD163基因中适合的靶序列；
-在适当的条件下孵化所述细胞，用于使所述位点特异性的核酸酶作用于DNA上的所述靶序列或靠近所述靶序列；以及
-由此在CD163基因上诱导导致SRCR5从CD163蛋白质中删除的编辑活动。
将SRCR5从CD163蛋白质中删除的编辑可为将外显子7从CD163基因中删除，或使与外显子7相关的，即位于外显子7的5’端处的剪接受体位点失活。
在某些实施方式中，适当地，步骤b)包括将位点特异性的核酸酶引入至细胞中，其靶向CD163基因的外显子7旁侧的靶位点，以便外显子7的两侧引入双链DNA切割，由此引起其删除。该靶位点适合位于内含子6和7中。当靶位点在内含子6中时，切割位点优选为位于外显子6的3’端处的3’剪接供体位点。当靶位点在内含子7中时，切割位点优选为外显子8的5’处的5’剪接受体位点。
在某些实施方式中，适当地，步骤b)包括将上游位点特异性的核酸酶引入细胞中，该上游位点特异性的核酸酶靶向CD163的外显子7的靶位点上游，并将下游位点特异性的核酸酶引入细胞中，该下游位点特异性的核酸酶靶向CD163的外显子7的靶位点下游。文中的“上游”指位于CD163基因的外显子7的5’端的上游的位点。优选地，上游靶位点位于外显子7的5’端和外显子6的3’端处的剪接供体位点之间的区域。在一些实施方式中，上游靶位点位于外显子7的5’端上游的2000个碱基内(适当地，1000个碱基内，500个碱基内，300个碱基内，200个碱基内或100个碱基内)。位点特异性的核酸酶的切割位点通常在其靶位点内或非常接近其靶位点，因此位点特异性的核酸酶包括在外显子7的5’端上游的2000个、1000个、500个、300个或200个或100个碱基内进行DNA切割。适当地，位点特异性的核酸酶的切割位点在外显子7的5’端和外显子6的3’端处的剪接供体位点之间的区域。
本领域技术人员能够很容易将已知的位点特异性的核酸酶(比如CRISPR/Cas 9或其它CRIPR核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)、或锌指核酸酶(ZFNs))靶向至上文所述区域中的任何预期靶位点。在CRISPR/Cas9或其它CRIPR核酸酶的情况下，该方法适当地包括提供向导RNA，以将Cas9蛋白质定向至预期靶位点。在TALENs或ZFNs的情况下，位点特异性的核酸酶的蛋白质编码决定了位点特异性的核酸酶的结合位点。
下文给出了示范性的上游靶位点以及相关的切割位置和sgRNAs(切割位置由符号“|”示出)，该上游靶位点可用于位点特异性的核酸酶为CRISPR/Cas 9的情况：
-sgRNA(sgSL25)TGAAAAATAGCATTTCGGTG(SEQ ID NO：5)，CD163基因靶位点和切割位置：CAC|CGAAATGCTATTTTTCA(SEQ ID NO：6)
-sgRNA(sgSL26)GAATCGGCTAAGCCCACTGT(SEQ ID NO：7)，CD163基因靶位点和切割位置：GAATCGGCTAAGCCCAC|TGT(SEQ ID NO：8)
-sgRNA (sgSL27)GTCCTCCATTTACTGTAATC(SEQ ID NO：9)，CD163基因靶位点和切割位置：
GAT|TACAGTAAATGGAGGAC(SEQ ID NO：10)。
文中的“下游”指位于或邻近CD163基因的外显子7的3’端处的位点。通常，下游位点位于内含子7中。优选地，下游靶位点位于外显子7的3’端与外显子8的5’端处的剪接受体位点之间的区域。在一些实施方式中，下游靶位点位于外显子7的3’端的3’的75个碱基或50个碱基内。因此，位点特异性的核酸酶的切割位点适当地在限定区域内，这样切割发生在外显子7的3’端的3’，以及发生在位于外显子8的5’端处的剪接受体位点的5’端的3’，例如位点特异性核酸酶的切割位点通常为位于外显子8的5’端处的剪接受体位点的5’。
下文示出了示范性的下游靶位点以及相关的切割位置和sgRNA序列(切割位置由符号“|”示出)，该下游靶位点可用于位点特异性的核酸酶为CRISPR/Cas 9的情况：
-sgRNA(sgSL28)CCCATGCCATGAAGAGGGTA(SEQ ID NO：11)，CD163基因靶位点和切割位置：CCCATGCCATGAAGAGG|GTA(SEQ ID NO：11)。
在某些实施方式中，步骤b)适当地包括引入位点特异性的核酸酶，其靶向与外显子7相关的剪接受体位点，即位于外显子7的5’端处。
适当地，位点特异性的核酸酶包括在与外显子7相关的剪接受体位点内的或其附近的双链切割。
在一些实施方式中，位点特异性的核酸酶包括区域中的切割，参照SEQ ID NO：1，该区域从位置23378延伸至位置23416，或在5’或3’方向上的所述区域的200个、100个、50个或25个碱基内的位置处。换句话说，位点特异性的核酸酶包括双链切割，该双链切割在与外显子7相关的预计剪接受体位点或在旁侧区域。
本领域技术人员能够很容易将已知的位点特异性的核酸酶(比如CRISPR/Cas 9、TALENs、或ZFNs)靶向至上文所述区域中的任何预期靶位点。在CRISPR/Cas9或其它CRIPR核酸酶的情况下，该方法适当地包括提供向导RNA，以将Cas9或其它CRIPR核酸酶蛋白质定向至预期靶位点。在TALENs或ZFNs的情况下，位点特异性的核酸酶的蛋白质编码决定了位点特异性的核酸酶的结合位点。
在CRISPR/Cas9介导的基因编辑的情况下，下列为靶向与外显子7相关的剪接受体位点的适合的向导RNA序列：
sgRNA 1：AACCAGCCTGGGTTTCCTGT(SEQ ID NO：12)
sgRNA 2：CAACCAGCCTGGGTTTCCTG(SEQ ID NO：13)。
这两种向导序列通过Cas9在下列外显子7的5’端处的序列中引入双链切割位点(切割位点由符号“|”示出)：
ACA|GGAAACCCAGGCTGGTT(SEQ ID NO：14)-用sgRNA 1
CAG|GAAACCCAGGCTGGTTG(SEQ ID NO：15)-用sgRNA 2。
适当地，位点特异性的核酸酶在预期切割位点处产生单个双链切割。在这种情况下，可通过非同源末端连接(NHEJ)或通过同源性定向修复(HDR)使与外显子7相关的剪接受体位点失活。当HDR为预期的失活方法时，提供HDR模板。如本领域所公知的，HDR模板包括中心部位以及与正常序列同源的旁侧部位，该中心部位包括的序列打算取代通常出现的序列。由此HDR模板适当地包括中心部位，当该中心部位具有的序列通过HDR引入至CD163基因时，使剪接受体位点失活。
示范性但是非限制性的HDR模板具有下列序列：
GAAGGAAAATATTGGAATCATATTCTCCCTCACCGAAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGGGACATTCCCTGCTCTGGTC(SEQ ID NO：16)(小写字母显示与未改变的序列相比的变化)。
虽然上文列出的示范性靶位点与CRISPR/Cas9位点特异性的核酸酶有关，对本领域技术人员而言显而易见地可使用许多其它靶位点，还可使用其它位点特异性的核酸酶(文中通常指“编辑器”或“基因编辑器”)。本领域技术人员可很容易确定对另外的位点特异性核酸酶适合的靶位点。
在优选的实施方式中，位点特异性的核酸酶包括至少一个锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA向导的CRISPR核酸酶(例如CRISPR/Cas9或其它CRISPR核酸酶，比如CRISPR/Cpf)或大范围核酸酶。
位点特异性的核酸酶通常能够在基因组的DNA中产生双链断裂。这能够用许多位点特异性的核酸酶实现，该位点特异性的核酸酶包括但不限于CRISPR/Cas9或其它CRISPR核酸酶、ZFNs和TALENs。
在一些实施方式中，位点特异性的核酸酶包括一对协作的位点特异性的核酸酶，其中每个都能够产生单链断裂。适当地，位点特异性的核酸酶包括一对协作的ZFNs、TALENs或CRISPR“切口酶”(例如具有改性的Cas9或其它能够仅切割一条DNA链的核酸酶)，其协作以在基因组的DNA中产生双链断裂。在这种实施方式中，靶位点适当地包括成对半位点，该成对半位点中的一对在每个半位点上进行结合。因此，在一些实施方式中，位点特异性的核酸酶包括一对ZFNs、TALENs或RNA向导的CRISPR“切口酶”(例如具有改性的Cas9或其它能够仅切割一条DNA链的核酸酶)，仅当该对中的两个成员都出现并形成异质二聚体时，能够引起双链DNA断裂，该异质二聚体能够切割DNA分子的两条链。在一些优选实施方式中，位点特异性的核酸酶包括一对ZFNs。使用成对的相应的位点特异性的核酸酶对减少脱靶切割有好处。
应该注意位点特异性的核酸酶能够以任何适当的形式引入细胞中。例如，核酸酶能够直接作为功能蛋白质提供至细胞中。或者，核酸酶可以以前体或模板的形式提供至细胞，从中通过细胞产生活性核酸酶。在一优选实施方式中，例如通过注射，将编码核酸酶的mRNA引入至细胞中。然后通过细胞表达mRNA，以形成功能蛋白。以这种方式使用mRNA使得核酸酶能在细胞中快速瞬时表达，这对基因编辑是十分理想的。当使用RNA靶向位点特异性的核酸酶时，这能以任意适当的形式进行。
还应该注意术语“核酸酶”意欲包括任何对靶核酸进行单链或双链切割的生物酶。因此，该术语包括切口酶和重组酶以及引起单链或双链断裂的更常见的核酸酶。
ZFN技术在文献中尤其是下列专利文件中进行了广泛描述：US 6,479,626、6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185、6,479,626、8,106,255、20030232410和20090203140，所有这些通过引用并入本文。ZFNs可通过西格玛奥德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯)的锌指核酸酶技术品牌的产品和服务商业获得。
TALEN技术在文献中尤其是下列专利文件中进行了广泛描述：US8420782、US8470973、US8440431、US8440432、US8450471、US8586363、US8697853、EP2510096、US8586526、US8623618、EP2464750、US2011041195、US2011247089、US2013198878、WO2012/116274、WO2014110552、WO2014070887、WO2014022120、WO2013192316和WO2010008562，所有这些通过引用并入本文。TALENs可通过Thermo Fisher Scientific股份有限公司(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)TALs品牌的产品和服务(以前在生命科技品牌下销售)商业获得。
CRISPR/Cas技术在文献(例如Cong等人.‘Multiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas Systems’，Science，2013年2月15：339卷第6121号第819-823页)中尤其是下列专利文件中进行了广泛描述：US 8,697,359、US2010076057、WO2013/176772、US8,771,945、US2010076057、US2014186843、US2014179770、US2014179006、WO2014093712、WO2014093701、WO2014093635、WO2014093694、WO2014093655、WO2014093709、WO2013/188638、WO2013/142578、WO2013/141680、WO2013/188522、US8546553、WO2014/089290和WO2014/093479，所有这些通过引用并入本文。CRISPR/Cas体系可通过西格玛奥德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯)的CRISPR/Cas核酸酶RNA向导基因组编辑套件的产品和服务，或通过Thermo Fisher Scientific股份有限公司(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)CRISPR品牌的产品和服务，而商业获得。CRISPR/Cpf也在文献中广泛描述。
当然，在这个飞速发展的领域，也很可能有其它用于基因编辑的技术。在许多情况下，这些技术很容易适用于本发明。
关于步骤c)，可使用一系列本领域公知的技术从包括基因改造的细胞生产动物。这些技术包括，但不限于，原核显微镜下注射(美国专利号4,873,191)或胚胎的电穿孔(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.3，1803-1814)；精子介导的基因转移(Lavitrano等人.25(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，14230-14235；Lavitrano等人.(2006)Reprod.Fert.Develop.18，19-23)；以及体细胞的体外转化，该体细胞比如卵丘细胞或乳腺细胞，或成人、胎儿或胚胎干细胞；随后是细胞核移植(Wilmut等人.(1997)Nature 385，810-813；和Wakayama等人.(1998)Nature 394，369-374)。为了从首建的杂合动物进行期望的基因编辑，可用标准的育种技术来生产纯合的或双等位基因的动物。详细的描述给出了示范性但并非限制性的从编辑的受精卵生成动物的方法的细节。本发明不限于任何从步骤b)中编辑的细胞生成动物的特定方法。
方法的步骤c)能够可选择地包括克隆，例如体细胞核移植(SCNT)。这此实施方式中，在体细胞上进行基因编辑活动，之后将编辑的核转移至无核卵细胞。通常，将对体细胞群进行编辑，其中发生了期望编辑的细胞将用于为SCNT提供供体细胞核。本领域中已经详细描述了用于SCNT的步骤，这对于本领域人员而言是已知的。但是，本发明的优势为可以无需克隆而进行编辑。
适当地，方法可包括使从基因编辑细胞产生的猪与另外的猪杂交以获得子代的猪。优选地，子代的猪为纯合子或双等位基因的，以进行基因组编辑，导致SRCR5从由动物产生的CD163中删除。如本领域公知的，这能够例如通过将两只杂合的猪杂交而实现。因此，在一些实施方式中，该方法适当地包括步骤d)，使步骤c)中产生的猪(其可能是杂合的，用于进行基因组编辑，导致SRCR5从由动物产生的CD163中删除)与另一只杂合的猪杂交，以进行基因组编辑，导致SRCR5从由动物产生的CD163中删除。
在某些实施方式中，本发明的方法包括下列步骤：
-提供猪的受精卵；
-将位点特异性的核酸酶引入至受精卵，该位点特异性的核酸酶靶向CD163基因中适当的靶序列；
-在适当的条件下孵化所述受精卵，使所述位点特异性的核酸酶作用于所述靶序列上或所述靶序列附近的DNA，由此诱导CD163基因上的编辑活动，导致将SRCR5从CD163蛋白质中删除；以及
-从所述基因编辑的受精卵生成动物。
基因编辑的受精卵能够生长为胚胎并最终为成年动物。如上文所述，如果编辑活动发生在单细胞受精卵中，那么该动物的所有细胞将因此包括改性的CD163基因，因为该动物的所有细胞源于单个基因编辑的细胞。如果编辑活动发生在一次或多次细胞分裂后，那么生成的动物将很可能为用于编辑活动的镶嵌体，因为该动物将具有一些源于已编辑细胞的细胞和一些源于未编辑细胞的细胞。
该方法可包括表征已发生的基因编辑活动。下面陈述了实现此的适当方法。
该方法可在数个受精卵上进行，并且该方法可包括筛选已实现期望的基因改性的受精卵。
优选地，根据本发明的方法生产的猪为纯合子的或双等位基因的，用于进行基因编辑，导致SRCR5从由动物产生的CD163中删除。这能够由于步骤b)的编辑过程，或通过随后两只杂合猪之间进行杂交的步骤而直接实现。
根据本发明的第四方面，提供一种基因编辑的猪的细胞或胚胎的产生方法，该方法包括步骤：
-提供猪的细胞或胚胎；
-在胚胎内编辑细胞或多个细胞的基因组，以产生导致CD163的SRCR5删除的基因组编辑。
关于本发明的第三方面进行讨论的各种特点进行适当改动，应用于发明的第四方面。
根据本发明的第五方面，提供一种根据本发明第三或第四方面产生的动物、细胞或胚胎。
根据本发明的第六方面，提供一种改性猪以增强其对PRRSV的抗性或耐受性的方法，该方法包括在猪中编辑细胞的基因组，以产生改性，该改性导致CD163蛋白质的SRCR5区删除。
根据本发明的第七方面，提供一种猪或猪的细胞，其表达或具有其中删除了SRCR5区的CD163蛋白质。细胞可适当地为巨噬细胞，在某些情况下可为外周血单核细胞来源的巨噬细胞(PMM)或肺泡巨噬细胞(PAM)。
现在将参照附图，通过非限制性的实施例，对本发明的实施方式进行描述。
附图简要说明
图1：用CRISPR/Cas9，生成CD163中外显子7的删除。
A)在猪基因组染色体5上的CD163基因的示意图。红色显示的为编码CD163mRNA的16个外显子，下面各种颜色的为9清道夫受体半胱氨酸富集(SRCR)区，形成CD163蛋白质的“珍珠串”结构。使用位于旁侧内含子中的两种向导RNAs(sgSL26&sgSL28)进行的外显子7的切除将导致SRCR5从编码蛋白质中移除。还显示了sgRNAs SL25和SL27的位置。B)在向导RNAs的sgSL25、sgSL26、sgSL27和sgSL28的体外评估。PK15细胞用编码向导RNA+Cas9的中任一种的单质粒转染，或通过结合两种这样的质粒而共转染。转染细胞通过GFP表达并通过FACS分离。通过Cel1检验测试对单个向导RNA转染的切割效率进行评估。通过PCR对基于双转染的外显子7删除的相对效率进行评估。C)Cas9/向导RNA注射至受精卵的示意图。注射混合物注射至受精卵的细胞质中，并包含未带帽的非多聚腺苷酸向导RNAs sgSL26和sgSL28、以及带帽的多聚腺苷酸的Cas9mRNA。
图2：切除外显子7，导致SRCR5从猪的CD163中删除。A)具有三种不同ΔSRCR5基因型的5个月大的雄性猪同胞的代表照片。左边为野生型猪628，中间为杂合的猪627，右边为双等位基因的猪629。B)肺泡巨噬细胞(PAMs)的基因型分型。从PAMs提取DNA，通过跨内含子6到外显子8的PCR进行其基因型评估。未改性的基因组PCR被预测将得到900bp产物，同时外显子删除应该得到450bp PCR产物。C)肺泡巨噬细胞的RNA表现型。从PAMs提取RNA，用低聚糖(dT)引物转换为cDNA，并通过跨外显子4-9的PCR进行分析。未改性的cDNA应该得到1686bp产物，同时删除外显子7预期生成1371bp产物。D)来自PAMs的CD163的蛋白质表现型。用还原的十二烷基磺酸钠(SDS)样品缓冲液对PAM细胞进行细胞溶解，通过蛋白质印迹分析CD163表达。E)在PAMs中的CD163mRNA水平。从相同数目的PAM细胞提取RNA，通过脱氧核糖核酸酶处理移除DNA，通过一步的实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)定量RNA。用β-肌动蛋白表达水平使表达水平标准化，并达到最高的CD163表达动物。误差条表示SEM，n＝3*2。
图3：ΔSRCR5肺泡巨噬细胞(PAMs)完全分化并表达巨噬细胞特异性标记物。由支气管肺泡灌洗分离PAMs，并通过用各种巨噬细胞标记物染色和FACS分析来进行评估。相对同型对照染色(左手尖峰)的对表面表达CD163的天然结构的染色(右手尖峰)。
图4：ΔSRCR5肺泡巨噬细胞(PAMs)不容易被PRRSV基因型1感染。A-C)来自野生型动物的PAMs(wt，左手两列)，杂合动物的PAMs(het，中间两列)和ΔSRCR5动物的PAMs(双等位基因或同源SRCR5删除)(右手两列)在PRRSV基因型1、亚型1(菌株H2，A)、亚型2(菌株DAI，B)和亚型3(菌株SU1-Bel，C)的MOI(感染多样性)＝1下接种。感染19小时后(hpi)，将细胞分离、固定并用抗PRRSV-N蛋白质抗体和CD163染色。通过FACS分析定量感染。超过98％的感染的巨噬细胞为CD163阳性。用所有来自野生型动物的PAMs对比所有杂合动物的PAMs，或对比所有双等位基因/同源SRCR5删除的动物的PAMs的不成对的t-测试，来统计地分析感染水平。误差条表示SEM，n＝3。D-F)PRRSV基因型1：亚型1(菌株H2，C)、亚型2(菌株DAI，D)和亚型3(菌株SU1-Bel，F)的复制生长曲线。来自野生型动物的PAMs(628填充圆形，633空心圆形)，杂合动物的PAMs(627填充四方形，633空心四方形)和ΔSRCR5动物的PAMs(629朝下的三角形，633朝上的三角形)在各自菌株的MOI(感染多样性)＝1下接种。在显示的时间点收集细胞上层清液，来通过RT-qPCR测量释放的病毒RNA。误差条表示SEM，n＝3*2。G-J)通过TCID50分析定量48hpi产生的感染微粒。在时程实验的感染的48hpi时间点收集细胞上层清液，并分析感染性病毒颗粒产生，该感染性病毒颗粒产生由50％组织培养感染剂量(TCID50)定量。用所有来自野生型动物的PAMs对比所有杂合动物的PAMs或所有双等位基因/同源SRCR5删除的动物的PAMs的不成对的t-测试统计来分析感染水平。误差条表示SEM，n-3。柱条与窗格A-C的一样。
图5：ΔSRCR5外周血单核细胞来源的巨噬细胞(PMMs)完全分化并表达巨噬细胞特异性标记物。将外周血单核细胞从野生型、杂合的、和ΔSRCR5动物的血液中分离。接着在重组人集落刺激因子1(rhCSF1)参与下培养7天，通过FACS分析PMMs。A)用CD14-FITC和CD16-PE抗体共同染色，相对同型对照来识别蛋白质的天然结构(等值线图；628和633＝野生型，627和364＝杂合的，629和630＝ΔSRCR5)(每幅图中用左下方的等值线图表示同型对照，巨噬细胞特异性标记物为右上方的等值线图)。B)用CD169-FITC和CD172a-PE抗体共同染色，相对同型对照(左下)来识别蛋白质的天然结构(右上方等值线图)。C)用SWC9(CD203a)-FITC和CD151-RPE抗体共同染色，相对同型对照(左下)来识别蛋白质的天然结构(右上方等值线图)。D)相对同型对照染色(左手图)，对表面表达CD163的天然结构的染色(右上方等值线图)。
图6：ΔSRCR外周血单核细胞来源的巨噬细胞(PMMs)仍作为血红蛋白-触珠蛋白(Hb-Hp)清道夫。A)通过Hb-Hp摄取诱导血红素氧化酶1(HO-1)表达。在100μg/ml Hb-Hp参与的情况下，将PMMs孵化24小时。将RNA与细胞分离，通过RT-qPCR确定血红素氧化酶1(HO-1)mRNA的水平(空心条为未诱导的，实心条为Hb-Hp摄取诱导的；左手两列＝野生型，中间两列＝杂合的，右手两列＝ΔSRCR5)。用β-肌动蛋白表达水平对表达水平进行标准化，并达到每个动物未受刺激的HO-1mRNA表达的水平。通过不成对的t-测试来分析HO-1表达的未诱导的以及诱导的水平。误差条表示SEM，n＝3。B)在100μg/mol Hb-Hp的情况下，将PMMs孵化24小时。用还原SDS样品缓冲液对PMMs进行细胞溶解，用蛋白质印迹来分析HO-1蛋白质表达。C)Hb-Hp摄取的定量。在10μg/mol HbAF488-Hp的情况，将PMMs下孵化30分钟(min)。通过FACS分析，相对于同型对照(左手峰)测量HbAF488-Hp的摄取(右手峰)。Hb-Hp摄取还进行了可视化。在10μg/mol HbAF488-Hp的情况下，将PMMs孵化30分钟。将细胞固定、渗透然后用DAPI染色CD163(未示出数据)。
图7：ΔSRCR5外周血单核细胞来源的巨噬细胞(PMMs)不容易被PRRSV基因型1感染。A-C)来自野生型动物的PAMs(左手两列)、杂合动物的PAMs(中间两列)和ΔSRCR5动物的PAMs(右手两列)在PRRSV基因型1、亚型1(菌株H2，A)、亚型2(菌株DAI，B)和亚型3(菌株SU1-Bel，C)的MO1＝1下接种。C)在19hpi，将细胞分离、固定、并用抗PRRSV-N蛋白质和CD163抗体染色。通过FACS分析定量感染。用所有来自野生型动物的PAMs对比所有杂合动物的PAMs或所有ΔSRCR5的PAMs的不成对的t-测试来统计分析感染水平。误差条表示SEM，n＝3。D-F)在基因型1：亚型1(菌株H2，D)、亚型2(菌株DAI，E)、和亚型3(菌株SU1-Bel，F)的长期感染中，PRRSV在PMMs上的复制。来自野生型动物的PAMs(628填充圆形，633空心圆形)，杂合动物的PAMs(627填充四方形，633空心四方形)和ΔSRCR5动物的PAMs(629朝下的三角形，633朝上的三角形)在各自菌株的MOI＝1下接种。在显示的时间点收集细胞上层清液，来通过RT-qPCR测量释放的病毒RNA。误差条表示SEM，n＝3*2。
图8：在复制/转录复合体形成之前停止ΔSRCR5肺泡巨噬细胞(PAMs)的PRRSV感染。来自野生型动物的PAMs(顶部板块)，杂合动物的PAMs(中间板块)和ΔSRCR5动物的PAMs(底部板块)在PRRSV基因型1：亚型1(菌株H2，顶行)、亚型2(菌株DAI，中间行)和亚型3(菌株SU1-Bel，底行)的MOI＝2下接种。在22hpi，将细胞固定并用抗PRRSV-nsp2抗体、DAPI和鬼笔环肽染色。
图9：首建动物的基因型。A)首建动物310(f)的基因型。通过跨内含子6至外显子8的PCR来评估基因型310。从两次耳朵活检物、尾巴剪切物，以及从血沉棕黄层提取DNA模板。预期未改性的基因组PCR得到900bp产物，同时外显子7删除应该得到450bpPCR产物。还展示了源于其未改性同胞之一的PCR(311)作为对照。B)通过Sanger测序跨内含子6至外显子8的PCR产物来评估特定的基因型310。C)首建动物的基因型345(m)、346(f)、和347(f)。通过跨内含子6至外显子8的PCR来评估动物的基因型。从两次耳朵活检物，其中一次仅含有耳尖(上皮和真皮)；血沉棕黄层；和肺泡巨噬细胞中提取DNA模板。来自不同组织样本的基因型揭露处杂合和纯合组织的镶嵌性。还展示了源于未改性的同胞对照动物342、343和344的PCR结果。B)通过Sanger测序PCR产物来评估特定基因型345、346和347。
图10：来自310x 345交配的幼崽的基因型。A)通过跨内含子6至外显子8的PCR来评估小猪627-635的基因型和ovl/SB(Ov1＝重叠的猪，SB＝死胎)小猪。从耳朵活检物中提取DNA模板。预测未改性的基因组PCR得到900bp产品，同时外显子删除应该得到450bp PCR产品。B)显示的基因型系谱树。在图中，310和345的杂合的基因型由阴影表示，深灰色表示编辑的等位基因，淡灰色表示未改性的基因(等位基因)。尽管在两个动物中都发现的镶嵌体，但是310和345表示为杂合的，因为这代表在种系中发现的基因型。由于来自310的编辑的等位基因，630为纯合的。627、634、635、OVL/SB1，OVL/SB2，OVL/SB4为异源的，具有一个来自345的已编辑的等位基因，其它的是未改变的。629是杂合的，一个编辑的等位基因来自345，一个来自310。
图11：ΔSRCR5猪的生成和实验构建。A)生成ΔSRCR5猪的基因组编辑。用两种向导RNAs，sgSL26和sgSL28组合在一起将CD163中的外显子7删除，通过CRISPR/Cas9编辑试剂的受精卵注射，生成基因组编辑的首建动物。饲养动物以生成F1和F2代，其专注于一种基因型，在两种向导RNAs的切割位点处显示完全再连接。纯合的F2代动物在两个等位基因上都携带这个基因型(底部)。B)F2动物的肺泡巨噬细胞上的ΔSRCR5的结构预测和表达。左：基于SRCR5的删除，用RaptorX，使蛋白质结构预测不能朝着完整蛋白质产物实现。C)挑战性研究的实验设计。从F1代动物的杂合子与杂合子的交配得到的4个纯合的(绿色)和四个野生型(橙色)的同胞断奶后养在一起。通过跨外显子7的PCR扩增(参见图1A)，并通过Sanger测序，确认基因型。小猪断奶后养在一起，在适应无特定病原体单元一周后，在第7-8周14天的挑战的第0天和第1天，鼻腔接种TCID50为5E6的PRRSV-1的亚型2菌株BOR-57。
图12：ΔSRCR5猪显示可溶C163的正常血清水平。用市售ELISA评估挑战2周内以及挑战之前第0天收集的血清样本目前的sCD163水平。n＝2*2*3，显示最小/最大和百分之九十。用不成对的t-测试的统计分析没有显示出明显不同。
图13：ΔSRCR5猪未显示PRRSV-1感染的临床症状、病毒复制或异常。A)在用BOR-57进行挑战期间的ΔSRCR5(实心圆)和野生型小猪(填充方形)的直肠温度。在饲养过程中每天测直肠温度。误差条表示SEM，n＝4。B)基于挑战第0、7和14天的体重测量值的平均每天体重增长。A&B；用双因素方差分析和Sidak的多重比较检验法进行统计分析。C)使用BOR-57进行的挑战期间的病毒血症。在第0、3、7、10和14天用真空管从颈动脉收集血清样本，将病毒RNA分离，并通过RT-qPCR用对BOR-57的ORF5特定的引物来定量。D)在挑战期间对PRRSV-1的抗体反应。用IDEXX PRRSV X3ELISA测试对PRRSV抗体的存在进行血清样本分析。<0.40＝阴性；≥0.4＝阳性。E)肺和淋巴结病理学、组织病理学和免疫组织化学评分。左边的柱表示ΔSRCR5，右边的柱表示野生型猪。以盲法评估肺病理学，并用确定的计分系统来给出肺病变严重性的主观分数(等级0-100)。针对间质性肺炎的存在度和严重性，对肺部的病理部分进行评分，从0到6(0，正常；1，轻微多病灶；2，轻微扩散；3，中度多病灶；4，中度扩散；5，严重多病灶；6，严重扩散)。对肺和淋巴结部分的PRRSV-N的免疫组织化学染色进行评分，从0-3(0，没有信号；1，少量阳性细胞；2，中等量阳性细胞；3，大量)。F)肺组织学和免疫组织化学。上：在挑战后14天对来自尸体剖检的肺部部分进行福尔马林固定、石蜡包埋、苏木素和曙红染色。左：ΔSRCR5。右：野生型小猪。比例尺表示100μm。下：对PRRSV抗原进行福尔马林固定、石蜡包埋的免疫组织化学染色以及苏木精复染色。左：ΔSRCR5。右：野生型小猪。比例尺表示50μm。G)肺部病理学。来自挑战后14天的尸体剖检中小猪的肺；左，来自两只ΔSRCR5猪的肺；右，来自两只野生型猪的肺。
图14：ΔSRCR5猪显示正常的细胞因子水平，并对BOR-57PRRSV感染没有细胞因子反应。使用细胞因子抗体阵列，测量在挑战前第0天、挑战第3、7、10和14天收集血清样本中的细胞因子水平。ΔSRCR5＝实心圆，野生型小猪＝填充四方形。A)干扰素α(IFNα)，B)白细胞介素17A(IL-17A)，C)白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)，D)白细胞介素4(IL-4)，E)白细胞介素6(IL-6)，F)白细胞介素4(IL-4)，G)由α干扰素诱导的单核因子(MIG/CXCL9)，H)巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β/CCL4)，I)趋化因子配体3样1(CCL3L1)，J)粒细胞巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)，K)肿瘤坏死因子α(TNFα)，L)白细胞介素12(IL-12)，M)白细胞介素1β(IL-1β)，N)白细胞介素10(IL-10)，O)转化生长因子β1(TGFβ1)，P)干扰素γ(IFNγ)，Q)白细胞介素18(IL-18)，R)血小板内皮细胞黏附分子(PECAM-1/CD31)，S)白细胞介素1α(IL-1α)，T)白细胞介素13(IL-13).误差条表示SEM，n＝2*4。用双因素方差分析和Sidak的多重比较检验法进行统计分析。
发明实施方式的具体描述
虽然在下文详细讨论了本发明的各种实施方式的实现和应用，但应该理解本发明提供了许多可在很多特定环境中具体化表达的可适用的发明概念。本文讨论的特定实施方式仅为实现并应用本发明的特定方式的说明，而不限定本发明的范围。
为了促进对本发明的理解，下面限定一些术语。本文限定的术语的意思和与本发明相关领域技术人员的普遍理解一样。术语比如“一”、“一个”和“该”不企图仅指单一的个体，但是包括可用于说明的特定实施例的总类。本文的术语用于描述本发明的特定实施方式，但是它们的使用不限定本发明，除非在权利要求中描绘。
如本文使用的术语“猪”、或其变体指偶蹄目猪科的任何动物，包括猪属和其它近缘种的动物，包括野猪类、鹿豚和疣猪。
如本文使用的术语“猪”或其变体指猪属的任何动物。其包括家猪(家养野猪或家猪)和其原种、常见的欧洲野猪(野猪)。目前，家猪被认为野猪种的亚种。它没有包括野猪类、鹿豚、和疣猪。
如本文使用的术语“家猪”或其变体指家养猪的亚种动物。
如本文使用的术语“位点特异性的核酸酶”或其变体指能够在期望位置切割DNA的工程核酸酶。这种位点特异性的核酸酶又名工程核酸酶、可靶向核酸酶、基因组编辑核酸酶、分子剪刀等等。位点特异性的核酸酶的实例包括锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)、CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas)和大范围核酸酶，比如杂合大范围核酸酶。
当“基因编辑的”或“基因改性的”涉及主题生物材料使用时，指相比对照物例如野生型生物材料，主题生物材料已经进行处理以产生其基因改性的事实。
“靶位点”指一种位点，该位点上具有结合位点特异性核酸酶的核酸序列。当位点特异性的核酸酶结合至靶位点时，它作用于切割靶位点上或邻近靶位点处的DNA(根据需要，这可通过单个位点特异性的核酸酶，或相应的成对核酸酶来实现，在成对核酸酶情况下，将有两个所谓的“半位点”)，切割的位置被称为“切割位点”或“切位点”。在其中靶位点定义为针对上文位点特异性的核酸酶处，切割位点适合于靶位点，或邻近于靶位点。在提及靶位点靠近或邻近基因组中的特定特征时，例如在编辑活动中删除或保留的特征(比如外显子7或剪接位点)，切割位点的位置应该可实现需要的结果，即，其根据需要导致特征的删除或保留。位点特异性的核酸酶能够设计为靶向任意期望的靶位点；例如，用CRISPR/Cas9，这能够通过使用适当的sgRNA实现，对于ZFN或TALENs，可设计并从商业来源获得适合的蛋白质。
“ΔSRCR5”指包括双等位基因或纯合的CD163中删除了SRCR5的的动物，通常是猪。
关于核酸序列(比如基因组或基因的区域)的“未改变”指序列未从野生型序列改变。
“耐受性或抗性”-当动物遭受PRSSV感染，死亡率、发病率、显示明显发病的动物的比例(例如重量减轻或生长率降低)、发病水平或发病时长降低，可称该动物对PRRSV感染更耐受或更具有抗性。当一群基因编辑的猪和一群同等的未基因编辑的猪暴露于相同毒性水平的PRRSV(理想地为相同的隔离种群)，它们的死亡率或发病率的任何统计学上明显的降低(例如通过用合适测试，95％置信度或99％置信度)说明耐受性或抗性提高。通过对PRRSV感染敏感性的降低，或当发生感染时症状减轻，可证明耐受性或抗性提高。可使用下文描述的对于PAM和PMM细胞的方法，在体外测试猪对感染提高的抗性。
如本文所使用的“蛋白质”和“肽”能够可交换地进行使用(除非文本中另有说明)，并指通过肽键连接的至少两个共价结合的氨基酸。术语蛋白质包括纯天然产品，或可使用重组或合成技术部分生产或全部生产的产品。术语肽和蛋白质可指蛋白质的聚集体，比如二聚体或其它多聚体、融合蛋白、蛋白质变体或其衍生物。蛋白质可包括未被核算密码子编码的氨基酸，即非天然氨基酸。
简介
PRRS为全世界影响猪的经济上最重要的传染疾病中的一种。“神秘的猪疾”于1980年代末几乎同时首次在北美和欧洲发现[1，2]。PRRS的病原体被鉴定为病毒，之后命名为PRRS病毒(PRRSV)。感染的猪可呈现有包括食欲不振、高烧、嗜睡和呼吸困难的症状。但是，PRRSV感染最破坏性的效果在年幼的小猪和妊娠母猪上观察到。在妊娠母猪上，PRRSV感染可引起胎盘局部位移，导致完全流产或死亡以及胎儿在子宫内干化[3]。多达30％感染的母猪发生晚期流产，幼崽包含高达100％的小猪死胎。来自产前感染的活胎产的小猪通常虚弱，并展现严重的呼吸症状，高达80％在断奶前基本一周死亡[4，5]。感染有PRRSV的年幼的小猪通常出现腹泻和由于肺病变引起的严重呼吸困难。在断奶前的小猪中，感染可通过受感染母猪的乳腺分泌物传播[6]。处于这个年纪，在高达80％的动物中感染有致命后果。在断奶后，死亡率降低，但是由于日增重降低和饲料转化率降低，使得通常能观察到持续的经济损失[4，7，8]。由于怀孕的降低或减少，年幼小猪的死亡以及所有PRRSV感染猪的生长率降低，据估计仅美国的猪肉生产者每年有超过6亿5千万美元的损失[9，10]。
PRRSV为属于病毒目动脉炎病毒科的包膜正链RNA病毒[11，12]。PRRSV基因组(～15kb)编码至少12个非结构蛋白质以及7个结构蛋白质。病毒RNA被核衣壳蛋白N包裹，其被脂蛋白包膜围绕，包括非糖基化膜蛋白M和E，以及四个糖基化糖蛋白GP2、GA3、GP4和GP5，由此GP2、GP3和GP4形成复合体[13-17]。
PRRSV具有非常窄的宿主范围，仅感染猪巨噬细胞的特定亚群[18-20]。然而仍不知道在猪科的总科中普遍的PRRSV感染是什么样。已显示出欧洲野猪作为PRRSV的储主[21]，对非洲猪，比如非洲灌丛野猪和疣猪，其感染情况知之甚少。体外病毒复制由非洲绿猴细胞系MARC-145支持。已显示，经由依赖pH的、受体介导的内吞作用，PRRSV进入巨噬细胞[22，23]。已表明PRRSV进入过程涉及各种贴附因子和受体(在[24]中回顾)。很早硫酸乙酰肝素就被认定是病毒的贴附因子[25-27]。肺泡巨噬细胞(PAMs)的体外感染显示出被抗体靶向的CD169(唾液酸粘附素)和巨噬细胞表面表达的外源凝集素[28]抑制，而MARC-145细胞却没有。之前非许可的PK-15细胞中的CD169的超表达显示出内在化但是没有显示PRRSV的高效复制[29]。最后，其中CD169基因已经被敲除的基因改性的猪的体外挑战显示出对PRRSV感染抗性没有提高，这表明CD169为对于PRRSV感染非必须的贴附因子[30]。尽管细胞表面蛋白质表达是PRRSV结合并内在化的主要决定因素，但是细胞表面贴附因子还是出现冗余，可能包括额外的至今未识别的受体[31]。也被称为触珠蛋白清道夫受体或p155的清道夫受体CD163在巨噬细胞的特定亚型上表达，并被认定为PRRSV的融合受体。CD163的细胞外部分形成“珍珠串”结构的九个清道夫受体半胱氨酸富集(SRCR)区，并通过单个跨膜区段和短的细胞质区锚定[32]。CD163具有各种生物功能，包括介导全身炎症以及将血红蛋白从血浆中移除(在[33，34]中回顾)。CD163的超表达使得非敏感细胞能够感染PRRSV[35]，由此发现CD163不介导内在化但是对于融合是很重要的[36]。已发现跨膜的锚定和与CD163的SRCR区5(SRCR5)的相互作用对于成功感染PRRSV是很重要的[34，35]。近来进行了CD163敲除的猪的体内实验[37]。但是，因为CD163具有非常重要的生物功能，完全敲除可能对猪产生不良的生理影响，尤其是关于炎症和/或由于其它病原体的感染。
此研究旨在生成精确删除了CD163中SRCR5的猪，并评估这些猪的巨噬细胞对于PRRSV感染的敏感性。
材料和方法
所有的动物工作都在爱丁堡大学的动物伦理委员会审查后由英国内政部许可证批准，并根据法定指南实施。
细胞和病毒
从前述的6-9周大的野生型剩余研究动物收集为了繁殖PRRSV基因型1：亚型1菌株(PRRSV H2)[52]、亚型2菌株DAI(PRRSV DAI)[53]、和亚型3菌株SU1-Bel(PRRSV SU1-Bel)[54]的主要肺泡巨噬细胞(PAMs)。简言之，根据计划I的方法对动物实施安乐死。将肺移除并转移到冰上，到无菌环境。通过用温的PBS将肺洗两次，并按摩以便释放巨噬细胞，由此来提取PAMs。通过在400g下离心分离10分钟来收集细胞。当需要时，在用PBS冲洗前，用红细胞裂解缓冲液(10mM KHCO3，155mM NH4Cl，0.1mM EDTA，pH 8.0)移除红细胞5分钟。像之前一样用离心分离收集细胞，并冷冻于90％的FBS(HI，通用电气医疗集团)和10％DMSO(西格玛公司)中。在转至-150℃之前，细胞在-80℃的冰箱里以1℃/min逐渐冷冻。
收集来自8周大动物627、628、629、630、633和634的PAMs。为此，用氯胺酮/阿扎哌隆术前混合物使小猪镇静，并用氯胺酮/咪达唑仑麻醉。用七氟醚维持整个过程的麻醉。通过用气流通道的插管，由支气管肺泡灌洗法(BAL)收集PAMs。用2×20ml PBS冲洗每只动物的三个肺的区段。液体回收率为60-80％。通过在400g下离心10分钟，从BAL液体中收集细胞，并如上进行冷冻。
如前述分离外周血单核细胞(PBMCs)[45]。简言之，用EDTA包覆的真空管从10周大的小猪的颈静脉收集血液。血液在1200g下离心15分钟，将血沉棕黄层转移至PBS。将等量的血沉棕黄层/PBS覆盖在淋巴细胞分离剂(Axis-Shield公司)上，并在400g下离心45分钟。用PBS洗单核细胞片段，如上所述收集细胞并冷冻。
将PAM细胞在RPMI-1640、Glutamax(Invitrogen)，10％FBS(HI，通用电气医疗集团)，100IU/ml盘尼西林和100μg/ml链霉素(Invitrogen公司)(cRPMI)中进行培养。在感染前，将PBMCs在用rhCSF-1(1×104单位/ml；来自Chiron公司的礼物)补充的cRPMI中培养6天。
将PK15细胞在用Glutamax(Invitrogen公司)、10％FBS(HI，通用电气医疗集团)、100IU/ml盘尼西林和100μg/ml链霉素(Invitrogen公司)补充的DMEM中进行培养。
向导RNAs的设计和体外切割效率评估
在内含子6的200bp上选择三个潜在的向导RNA序列，在内含子7的97bp长上选择一个潜在的向导RNA序列。如前所述将低聚物(Invitrogen公司)排序并杂交[72]，然后连接至质粒pSL66(px458衍生物，具有如[42]所述的对sgRNA支架的改性)的BbsI位点。生成的质粒包含诱导向导RNA序列表达的hU6启动子和诱导Cas9-2A-GFP的CBA启动子，Cas9在N端具有SV40核定位信号(NLS)，在C端具有核质蛋白NLS。通过用Neon转染系统(Invitrogen)，其设定为1400mV，具有2个20mS的脉冲，使质粒转染至猪的PK15细胞中，由此来评估每个向导的切割效率。用FACS Aria III细胞分选仪(Becton Dickinson)收集转染48小时后的GFP阳性细胞，然后在制备基因组DNA之前再培养4天(DNeasy Blood&Tissues Kit，Qiagen)。用AccuPrime Taq DNA聚合酶HiFi(Life Technologies)，将跨靶位点的PCR与oSL46(ACCTTGATGATTGCGCTCTT-序列号：17)和oSL47(TGTCCCAGTGAGAGTTGCAG一序列号18)一起产生940bp的产物。如前所述进行细胞试验(Transgenomic；Surveyor Mutation DetectionKit)[73]。除了再转染后40小时收集细胞而不用进行用于GFP表达的富集，如上文描述进行成对质粒的PK15细胞共转染，该成对质粒编码外显子7旁侧的向导物，。在这种情况下，除了940bp片段，还观察到截短型PCR产物，这表明外显子7的删除。
基于单切割效率和双切割效率，选择位于外显子7上游121bp的向导RNAs SL26
(GAATCGGCTAAGCCCACTGT-SEQ ID NO：7)和位于外显子7下游30bp的SL28
(CCCATGCCATGAAGAGGGTA-SEQ ID NO：11)，用于体内实验。
向导RNA的生成和质量评估
通过PCR从如下各个质粒生成含整个RNA支架和T7启动子的DNA低聚物片段。含T7启动子的正向引物和反向引物oSL6(AAAAGCACCGACTCGGTGCC-SEQ ID NO：19)与Phusion聚合酶(NEB)联合使用，该T7启动子后面是各个第一18bp向导RNA。根据制造商的说明用MinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen)在1.5％琼脂糖胶中纯化DNA片段。在50℃下，将DNA洗出液用含200μg/ml蛋白酶K(Qiagen)的pH 8.0的10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.5％SDS进一步处理30分钟，然后用苯酚/氯仿提取。根据制造商的说明用MEGA shorts cript Kit(Thermo Fisher)，由得到的DNA片段生成向导RNA。通过苯酚/氯仿提取，然后乙醇沉淀，由此纯化RNA，然后再悬浮于EmbryoMax注射缓冲液(Millipore)中。根据制造商的说明，用安捷伦TapeStation上的RNA Screen Tape(安捷伦科技公司)来评估RNA的纯度和浓度。
受精卵注射和转移
如前述由大白母猪产生胚胎[73].简言之，母猪在发情期前11至15天之间用期酶/PMSG/绒毛膜促性腺激素方法超数排卵。受热后，供体母猪以6小时的间隔受精两次。从交配的供体手术获得受精卵，放入NCSU-23HEPES基础培养基中，然后进行注射混合物的单次2-5pl细胞质注射，该注射混合物包含溶于EmbryoMax注射缓冲液(Millipore公司)中的50ng/μl的各个向导物(SL26and SL28)以及100ng/μl的Cas9mRNA(PNA Bio或Tri-Link)。受体雌性动物与供体母猪处理相同，只是不交配。在手术期间，将生殖系统暴露，并用3.5法国剂量tomcat管将24-39个受精卵转移至受体的输卵管。同胎产仔数在5-12只。
胚囊中基因组编辑的体外评估
未注射的对照受精卵和注射的剩余受精卵在38.5℃下，在补充有半胱氨酸和BSA的NCSU-23HEPES基础培养基中培养5-7天。培养7天后收集囊胚，然后根据制造商的说明用REPLI-g Mini Kit(Qiagen公司)进行扩增基因组。如下所述进行基因型分型。
基因型分型
用DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen公司)，从产后两天的小猪的耳朵活检物或尾巴剪截物中提取基因组DNA。用引物oSL46(ACCTTGATGATTGCGCTCTT-SEQ ID NO：17)和oSL47(TGTCCCAGTGAGAGTTGCAG-SEQ ID NO：18)扩增内含子6横跨到外显子8的区域，由完整的等位基因生成904bp产物，如果发生外显子7完全删除，则生成454bp产物。通过在1％琼脂糖胶上的分离和随后Sanger测序所有截短型片段，来分析PCR产物。根据制造商的说明，通过T7核酸内切酶I(NEB)酶解，进一步分析对应于野生型长度的片段。
RNA表型
如上所述，通过限制性内切酶BAL，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)根据制造商的说明，将RNA从1E6PAM细胞分离，包括柱上DNase酶解。根据制造商的说明用Oligo-dT引物结合SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)，来合成第一链cDNA。通过使用引物P0083
(ATGGATCTGATTTAGAGATGAGGC-SEQ ID NO：20)和P0084
(CTATGCAGGCAACACCATTTTCT-SEQ ID NO：21)，用cDNA评估跨外显子4至9的RNA表现型，生成完整等位基因的1686bp长度的PCR产物和随后精确删除外显子7的1371bp。通过在1％琼脂糖胶上的分离和随后Sanger测序删除的片段，来分析PCR产物。
通过免疫印迹进行蛋白质表型分析
在300的相对离心力下，将由BAL分离的4E5PAM细胞离心10分钟来进行收集。将粒状物重悬浮于含100mM DTT的Laemmli样本缓冲液中，在95℃煮10分钟，然后在7.5％丙烯酰胺(Bio-Rad公司)凝胶中进行电泳。在转移至硝酸纤维膜(Amersham公司)后，用1μg/ml抗CD163(rabbitpAb，abcam，ab87099)抗体和1∶2000的β-肌动蛋白(HRP-tagged，mouse mAb，Sigma，A3854)，来探测细胞的蛋白质的存在。对于For CD163，将印迹随后用1∶5000的HRP标记的兔抗鼠抗体(DAKO，P0260)以进行孵化。根据制造商的说明用Pierce ECL WesternBlotting Substrate(Thermo Fisher公司)使HPR标记的抗体的结合可视化。
通过RT-qPCR进行CD163mPNA的定量
用RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen公司)，根据制造商的说明，将RNA从1E6PAMs分离，包括柱上DNase消化。在LightCycler 480(罗氏)上用GoTaq一步RT-qPCR系统(Promega公司)，根据制造商的说明，来测量RNA水平。用引物P0074(CATGGACACGAGTCTGCTCT-SEQ IDNO：22)和P0075(GCTGCCTCCACCTTTAAGTC-SEQ ID NO：23)，来定量CD163的mRNA水平，用引物P0081(CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-SEQ ID NO：24)和P0082(AAGGTAGTTTCGTGGATGCC-SEQ IDNO：25)，来定量β-肌动蛋白的参照mRNA水平。
通过流式细胞术进行巨噬细胞表征
在分析前一天将PAMs种板。在分析前七天将PBMCs种板，并且通过CSF1刺激分化PBMCs，以产生PBMC来源的巨噬细胞(PMMs)。通过橡胶淀帚刮取，收集细胞，然后在室温下在4％的甲醛/PBS中固定15分钟。在用抗体染色前，用封闭液(PBS，3％BSA)孵化细胞45分钟。用抗体染色细胞，该抗体靶向鼠抗猪CD14(AbD Serotec，MGA1273F，1∶50)和鼠抗猪CD16(AbD Serotec，MCA2311PE，1∶200)、鼠抗猪CD169(AbD Serotec，MCA2316F，1∶50)和鼠抗猪CD172a(SoutherBiotech，4525-09，1∶400)、鼠抗人CD151(AbD Serotec，MCA1856PE，1∶50)和鼠抗猪SWC9(CD203a)(AbD Serotec，MCA1973F，1∶50)、鼠抗猪CD163(AbD Serotec，MCA2311PE，1∶50)、或小鼠IgG1或IgG2b阴性对照(AbD Serotec，MCA928PE，MCA691F，或Sigma，F6397；与一抗浓度相同)。用PBS将细胞洗三遍，然后重悬浮于FACS缓冲液(2％FBS，0.05M EDTA，含0.2％NaN3的PBS)。用FlowJo软件，通过在FACS Calibur(贝克顿迪金斯公司)上进行FACS分析，由此来评估通过抗体标记物来确定的基因表达。
高MOI单轮感染测试
在感染前一天将PAMs种板。在感染前七天将PBMCs种板，然后通过CSF1刺激分化PBMCs，以生成PBMC来源的巨噬细胞PMMs。在各个病毒菌株(PRRSV H2，DAI，或SU1-Bel)的MOI＝1下，在37℃下，在cRPMI中将细胞接种3小时。用温的cPRMI替换接种物。在19hpi，用细胞刮棒将细胞分开。在室温下，将细胞在含4％福尔马林(Sigma-Aldrich)的PBS(Gibco)中固定15分钟，用PBS清洗，随后在含0.1％Triton-X-100(Alfa Aesar)的PBS中渗透10分钟。如上所述，用抗PRRSV-N的抗体(SDOW17-F，RTI，KSL0607，1∶200)和CD163(AbD Serotec，MCA2311PE，1∶50)或鼠IgG1阴性对照，将细胞在含3％BSA的PBS中孵化。用PBS将细胞清洗三次，然后重悬浮于FACS缓冲液中。用FlowJo软件通过在FACS Calibur(贝克顿迪金斯公司)上进行FACS分析，由此来评估通过抗体标记物来确定的感染水平。
低MOI多轮感染测试
在感染前一天将PAMs种板。在感染前七天将PBMCs种板，然后通过rhCSF1刺激分化PBMCs，以生成PMMs。在各个病毒菌株(PRRSV H2，DAI，或SU1-Bel)的MOI＝0.1下，在37℃下，在cRPMI中将细胞接种3小时。移除接种物，用PBS清洗细胞一次，继续感染。在指定时间后，收集接种后样本以进行评估。一旦收集了来自一段时间的所有样本，将所有的样本冷冻并进行处理。用QIAmp Viral RNA Mini Kit根据制造商的说明从上层清液样本提取病毒RNA(vRNA)。对于PRRSV H2和SU1-Bel用GoTaq Probe一步RT-qPCR系统(Promega)，对于PRRSVDAI，用GoTaq一步RT-qPCR系统(Promega)，根据制造商的说明，通过RT-qPCR定量病毒RNA水平。为此，使用下列引物和探针：H2 fwd(GATGACRTCCGGCAYC-SEQ ID NO：26)，H2rev(CAGTTCCTGCGCCTTGAT-SEQ ID NO：27)、H2探针(6-FAM-TGCAATCGATCCAGACGGCTT-TAMRA-SEQ ID NO：28)、(从JP Frossard，AHVLA获得的最佳H2引物/探针序列)、SU1-Bel fwd(TCTTTGTTTGCAATCGATCC-SEQ ID NO：29)、SU1-Bel rev(GGCGCACTGTATGACTGACT-SEQ IDNO：30)、SU1-Bel探针(6-FAM-CCGGAACTGCGCTTTCA-TAMRA-SEQ ID NO：31)、DAI fwd(GGATACTATCACGGGCGGTA-SEQ ID NO：32)、DAI rev(GGCACGCCATACAATTCTTA-SEQ ID NO：33)。用由高效价原液的vRNA分离物生成的标准曲线在LightCycler 480(Roche)上测量RNA水平。
用选定时间点的TCID50测试，来评估产生的病毒对分离自野生型剩余研究动物的PAMs的传染性。
基于PMMs的Hb-Hp刺激的血红素氧化酶的mRNA和蛋白质水平
在分析前七天将PBMCs种板，并通过CSF1刺激分化PBMCs，以生成PMMs。实验前，在立辊上，以1∶1的质量比将血红蛋白(Hb，Sigma-Aldrich，A0，H0267)和触珠蛋白(Hp，SigmaAldrich，Phenotype 2-2，H9762)在PBS中混合15分钟。在37℃下，在cRPMI中用100μg/ml的Hb-Hp将PMMs孵化24小时。通过用橡胶淀帚刮取收集细胞。用RNeasy Mini Kit(Qiagen)根据制造商的说明，将RNA从1E6细胞中分离，包括柱上DNase消化。在LightCycler 480(Roche)上，用GoTaq一步RT-qPCR系统(Promega)根据制造商的说明测量RNA水平。用引物P0239(TACATGGGTGACCTGTCTGG-SEQ ID NO：34)和P0240(ACAGCTGCTTGAACTTGGTG-SEQ IDNO：35)，定量血红素氧化酶1(HO-1)的mRNA水平，用引物P0081和P0082定量β-肌动蛋白的参照mRNA水平。为了分析HO-1的蛋白质水平，通过在300的相对离心力(rcf)下离心10分钟来收集细胞。将粒状物重悬浮于含100mM DTT的Laemmli样本缓冲液中，在95℃煮10分钟，然后在12％丙烯酰胺(Bio-Rad公司)凝胶中进行电泳。在转移至硝酸纤维膜(Amersham公司)后，用抗HO-1的抗体(鼠mAb，abcam，ab13248，1∶250)和钙调蛋白(兔mAb，abcam，ab45689，1∶1000)来探测细胞的蛋白质的存在。印迹随后用1∶5000的HRP标记的羊抗兔抗体(DAKO，PI-1000)进行孵化。用Pierce ECL Western Blotting Substrate(Thermo Fisher公司)根据制造商的说明使HPR标记的抗体的结合可视化。
血红蛋白-触珠蛋白摄取的定量化和可视化
在分析前七天将PBMCs种板，然后通过CSF1刺激分化PBMCs，以生成PMMs。对于荧光显微镜，细胞种板在载玻片上。用蛋白质标记试剂盒(Molecular Probes)根据制造商的说明，用Alexa Fluor 488(AF-488)来标记血红蛋白(Sigma-Aldrich，A0，H0267)。实验前，在立辊上，以1∶1的质量比将HbAF488和Hp在PBS中混合15分钟。在37℃下，在cRPMI中将PMMs与10μg/ml HbAF488-Hp一起孵化30分钟。
对于用FACS的定量，细胞用橡胶淀帚收集，并用不含Ca2+/Mg2+的PBS清洗三次，以去除前述的表面结合的HbAF488-Hp[60]。室温下将细胞在含4％(wt/v)甲醛(Sigma-Aldrich)的PBS(Gibco)中固定15分钟，用PBS清洗，随后用含0.1％Triton-X-100(Alfa Aesar)的PBS渗透10分钟。如上文所述，将细胞用鼠抗猪CD163抗体(AbD Serotec，MCA2311PE，1∶50)染色，然后用PBS清洗三次，并重悬浮于FACS缓冲液中。用FlowJo软件通过在FACS Calibur(贝克顿迪金斯公司)上进行分析，由此来评估通过抗体标记来确定的基因表达。
为了免疫荧光成像，将细胞用不含Ca2+/Mg2+的PBS清洗三次，然后室温下在含4％甲醛(Sigma-Aldrich)的PBS(Gibco)中固定15分钟，用PBS清洗，然后用含0.1％Triton-X-100(Alfa Aesar)的PBS渗透10分钟。细胞用PBS清洗，然后在封闭液(PBS，3％FBS)中用抗CD163的抗体(兔pAb，abcam，ab87099，5μg/ml)孵化1小时，清洗，然后用羊抗兔AF594二抗(A11037，1∶100)、AF647毒伞素(A22287，1∶100)和DAPI(1∶10，000；全部Life Technologies公司)进行孵化。用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM-710)分析样品。
在感染的PAMs中RTC形成的免疫荧光分析
在感染前一天将PBMCs在盖玻片上种板。在37℃下，在cRPMI中将细胞在各自病毒菌株(PRRSV H2，DAI，或SU1-Bel)的MOI＝2下接种3小时。用温的cPRMI替换接种物。在19hpi，在室温下，将细胞在含4％福尔马林(Sigma-Aldrich)的PBS(Gibco)中固定15分钟，用PBS清洗，并如上所述进行渗透。将细胞用PBS清洗，并在封闭液中用抗PRRSV nsp2的抗体(来自Ying Fang的礼物，南达科他州立大学，[74]，1∶400)孵化1小时，清洗，然后用羊抗鼠AF488(A11029，1∶100)二抗、AF568鬼笔环肽(A12380，1∶100)和DAPI(1∶10,000；全部LifeTechnologies公司)进行孵化。用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM-710)分析样品。
结果
通过受精卵中的CRISPR/Cas9编辑，生成删除了CD163中SRCR5的活猪
在目前猪的参考基因组序列(Sscrofa10.2)[38]中CD163基因没有正确表现。通过靶向测序，我们建立了猪的CD163位置的详细模型(未公开的结果L.Zen/A.Archibald/T.Ait-Ali)-CD163基因的基因组序列在下文列为SEQ ID NO：1。简言之，CD163由16个外显子编码，其中外显子2-13预计编码蛋白质的SRCR区[39]。有趣的是，预计SRCR5由一个单独的外显子即外显子7编码(图1A)。因此，开发了一种编辑策略是用CRISPR/Cas9基因组编辑系统切除外显子7[40，41]。一个向导RNA位于内含子5’至外显子7处，一个向导RNA位于外显子7和8之间的短内含子7中，预测这两个向导RNAs的结合将生成外显子7的删除，同时使得能够恰当地剪接剩余的外显子。由于外显子7和8之间的内含子的长度(97bp)很短，仅识别出一种适当的独特靶序列(crRNA)，其具有前间区序列邻近基序。在外显子7最接近的上游区域选择三个候选crRNA序列。应该注意也可使用另外的位点特异性的核酸酶(例如ZFNs或TALENs)，本领域技术人员能够很容易确定适合的靶位点，尤其是这些编辑器不需要PAM序列的存在，因此对于靶位点的选择限制较少。
通过由hU6启动子驱动的质粒和驱动NLS-Cas9-2A-GFP的CAG启动子进行猪肾PK15细胞的转染，由此在体外评估所有的四个序列的切割效率，该质粒基于编码完整单个向导序列(sgRNA)的px458[42]。通过GFP的荧光激活细胞分选(FACS)分离转染的细胞，用Cel1检验测试评估靶位点处的切割效率。如预期地，显示四分之三的向导物指向DNA的切割(外显子7的2个上游和1个下游)。在下面的双转染试验和随后的PCR分析中，发现向导物SL26和SL28的结合有效地生成CD163基因中的外显子7的删除(图1B)。基于这些结果，SL26和SL28的向导结合用于体内实验中。
sgRNAs SL26和SL28与编码Cas9核酸酶的mRNA一起显微注射至受精卵的细胞质中。在体外培养至囊胚阶段的少数注射的受精卵、基因组DNA提取、整个基因组扩增以及跨外显子7的PCR扩增中评估编辑效率。该分析显示出十七分之二的囊胚包括删除计划的尺寸，并Sanger测序确认外显子7的删除。编辑的囊胚B2显示出彻底的删除，以及在sgSL26和sgSL28切割位点的再连接，同时编辑的囊胚B14显示出除了计划的删除，还在靶位点随机插入25核苷酸。在T7核酸内切酶试验中，全长的PCR产物没有在任何切割位点显示出核苷不匹配。在囊胚中的编辑率对应于11.7％的整体编辑率。
为了生成活猪，注射有sgSL26，sgSL28，和Cas9mRNA的24-39个受精卵转移至受体母猪的输卵管内。总共出生32只活的小猪，耳朵和尾巴的活检基因型分型显示其中四只小猪具有外显子7删除，相当于总数的12.5％。除了计划的外显子7的删除，四分之三的动物显示在靶位点插入了新的DNA，可能由于非同源端连接修复。猪347在sgSL26切割位点处显示2bp的截短，并在切割位点之间插入66bp，猪346显示在sgSL26的切割位点后删除了304bp，猪310显示在切割位点插入短的9bp(具有序列TCAGTCACT)。发现猪345具有精确的外显子7删除，而没有在切割位点处插入或删除任意的核苷酸(图9B和D)。有趣地是，PCR扩增表明猪310、345和347都具有用于编辑活动的镶嵌性，猪310相对于未编辑细胞具有低频率的杂合细胞类型(编辑了一个等位基因)，同时猪345和347既具有纯合(两个等位基因都进行了编辑)和杂合细胞类型(图9A和C)。
F1代猪的基因型和表现型
为了生成完全纯合和杂合的猪，将310与345交配。这种交配产生的幼崽有6只杂合的小猪，2只双等位基因/纯合子CD163删除了SRCR5(ΔSRCR5)的小猪，4只野生型的CD163小猪(图10)。动物的测序显示所有的杂合子从345继承了它们编辑的等位基因。发现猪629为外显子7删除的双等位基因，其中一个等位基因具有345的基因型，另一个等位基因具有来自310的基因型。有趣的是，发现630为编辑了等位基因的纯合子，在sgSL26和sgSL28的切割位点之间插入了9bp，如同在310首建者/亲代(表1)一样。我们推断这种纯合子状态由受精卵中的基因转换活动产生。
表1评估的F1动物的基因型和生长
选择动物627、628、629、630、633和634用于进一步分析，它们表现各种基因型(野生型、杂合的和双等位的/纯合子的)和性别。将ΔSRCR5和杂合的动物的生长率与野生型动物进行对比(表1)。从所有六只10周大的动物取血液样本，然后通过全血计数进行分析，该全血计数由爱丁堡大学的皇家(Dick)兽医研究院的诊断实验室执行。所有动物的血球计数在参考值(表1)内。将ΔSRCR5猪和杂合的猪的尺寸、身高和其它形态学特点与它们的野生型同胞进行对比(图2A)。
在8周大时，通过支气管肺泡灌洗(BAL)，从所有六只动物中分离肺泡巨噬细胞(PAMs)。DNA从PAMs中提取并通过PCR和桑格测序进行分析。PAM基因型证实了从耳朵活检获得的结果，分别是628和633为野生型，627和633为杂合的，629和630为ΔSRCR5。PCR产物的测序证实了所有的编辑活动导致外显子7的完全删除。同时猪627和633彻底删除了外显子7，在一个等位基因的sgSL26和sgSL28切割位点处精确再连接。629的一个等位基因具有彻底的删除，一个等位基因在位点间插入了9bp。猪630具有两个都插入9bp的等位基因。从PAMs中提取RNA，用低聚糖(dT)准备逆转录，转化成cDNA，通过PCR扩增，并通过Sanger测序进行分析。跨外显子4至9的PCR产物显示在杂合动物和ΔSRCR5动物中具有预期的315bp删除(图2C)。位于627和634的全长和外显子7删除的带之间的第三片段证实为全长和外显子7删除的片段的杂交。这显示出外显子7的删除没有破坏外显子8的正确剪接受体位点的应用。CD163蛋白质的表达通过PAM溶解物的蛋白质印迹来进行评估。野生型猪628和633表达预计尺寸为120kDa的全长蛋白质，但是很可能由于糖基化，该蛋白质描述为在约150kDa[43]进行，由此在约100kDa的蛋白质带可表明另一亚型的表达，这可相当于描述的人亚型CRAa或CRAb(基因库参考EAW88664.1和EAW88666.1)。杂合的动物627和634表达全长和ΔSRCR5蛋白质(图2D)。全长蛋白质的带明显更强，表明通过在此研究中使用多克隆CD163抗体，使得全长基因更高度表达或全长蛋白质结合更强。为了更进一步检查，在从PAMs提取的RNA上通过RT-qPCR来定量基因表达，然后标准化成β-肌动蛋白表达，证明在野生型、杂合的和ΔSRCR5动物之间总CD163mRNA表达没有明显不同(图2E)。
ΔSRCR5猪的肺泡巨噬细胞完全分化并表达巨噬细胞特异性表面蛋白质
由BAL分离的PAMs的特点是巨噬细胞特异性表面蛋白质的表达。CD14和CD16没有在单核细胞上表达，但是在成熟为巨噬细胞后，水平提高。在PAMs中，发现CD14为中等水平，同时CD16强烈地表达[44]。来自ΔSRCR5、杂合的以及野生型动物的PAMs的CD14/CD16染色都在之前观察到和记录的水平内[45]，可观察到各种基因型之间有不同(未示出数据)。CD172a或也被称为SIRPα在单核细胞和巨噬细胞上都高水平表达[46]，在来自所有动物的细胞中都高水平表达。CD169，被描述为用于PRRSV的贴附因子[29]，没有在单核细胞中表达，但是在组织巨噬细胞中高度表达，并在来自我们动物的预期细胞中表达(未示出数据)。如在人类中，CD163在猪中的表达限于单核细胞和巨噬细胞。CD163在组织巨噬细胞中高水平表达，但是在血液单核细胞和骨髓来源的巨噬细胞中低水平表达[48](在[49]中回顾猪的巨噬细胞标记)。野生型和删除了SRCR5的CD163在PAMs表面上识别(图3)。这表明Cd163的SRCR5删除版本很可能适当地折叠，因为克隆2A10/11抗体仅识别非还原性的天然构象的蛋白质。猪628、633、627、634、629、630的CD163荧光强度的中位值分别为35.9、22.7、26.4、24.4、17.9和26.7，亚型对照的中位值范围为从2.13至3.84。总的来说，分离自所有动物的PAMs不依赖它们的基因型都表现出完全分化，并表达巨噬细胞特异性表面标记物，包括CD169和CD163，具有涉及PRRSV进入的功能。
ΔSRCR5肺泡巨噬细胞不容易感染PRRSV基因型1
PRRSV具有两种不同的地域分布的不同基因型，其中基因型1主要发现于欧洲和亚洲，基因型2主要发现于美洲和亚洲。这两种基因型在抗原性和病理严重性上表现出不同，在它们之间具有>15％的基因组分化(在[50]中回顾)。基于ORF7序列和地域分布，基因型1能够进一步分成三种亚型，由此亚型1在整个欧洲，而亚型2和3目前限于东欧[51]。这里我们测试了PRRSV所有的基因型1亚型，由亚型1菌株2(PRRSV H2)[52]、亚型2菌株DAI(PRRSVDAI)[53]、以及亚型3菌株SU1-Bel(PRRSV SU1-Bel)[54]代表，最初分别分离自英国、立陶宛和白罗斯。
在MOI＝1下以单轮感染对PAMs进行感染。接种19小时后(hpi)收集细胞，并用FITC标记的抗PRRSV-N蛋白质的抗体染色。通过FACS分析评估感染水平。所有三种病毒亚型导致野生型和杂合动物的感染水平为40-60％，超过98％的感染细胞被分类为CD163阳性。在感染有PRRSV H2和DAI的杂合的动物中观察到略高的统计学上明显的感染。对此原因不明，但是可以反应出杂合动物的改变的CD163蛋白质表达谱或其它至今仍未确定的基因性能。相比之下，发现来自ΔSRCR5动物(629和630)的细胞对于此试验中的感染具有高抗性(图4A-C)。第二个试验进行为评估在多轮感染时程中，病毒是否在PAMs中复制，然后感染旁边的细胞。在MOI＝0.1下对细胞进行接种，在指示时间点收集上层清液样本。病毒RNA提取自上层清液，然后通过RT-qPCR分析。对于PRRSV H2和SU1-Bel，使用特异性探针和针对ORF7的引物。由于此菌株上基因组信息有限，为了评估PRRSV DAI，使用针对ORF5的特异性vRNA引物和BRYT绿色染料结合。所有野生型和杂合动物复制病毒的水平相似。到12hpi，病毒水平开始升高，指数地提高直至36hpi，那时它们趋于稳定。在48hpi，PRRSV SU1-Bel水平达到它们的稳定水平。RT-qPCR的检测极限对应于CT值35，这对于PRRSV H2对应于1E4TCID50/ml，对于PRRSV DAI对应于1E3TCID50/ml，对于PRRSV SU1-Bel对应于5E3TCID50/ml。在此多轮感染中，来自ΔSRCR5PAMs上层清液的病毒RNA(vRNA)水平没有上升到高过检测极限(图4D-F)。为了评估是否产生了传染性病毒颗粒，当所有三个亚型达到了稳定水平时，在48hpi收集的上层清液中进行TCID50试验。以1∶10稀释开始连续稀释，对应于检测极限63TCID50/ml。产生自野生型PAMs或杂合起源的病毒是感染性的，测得的水平与那些vRNA提取物的水平相当。相比之下，在此试验的检测极限下纯合的ΔSRCR5的PAMs没有支持病毒生产(图4G-J)。总之，来自ΔSRCR5动物的PAMs不能在高MOI下被PRRSV基因型I感染，它们也不能复制病毒超过72小时时程。
在CSF1诱导后，来自ΔSRCR5猪的外周血单核细胞分化成CD163表达的巨噬细胞，并表达巨噬细胞特异性标记
为了评估单核细胞分化成CD163表达的巨噬细胞的潜能，我们从全血中分离外周血单核细胞(PBMCs)，然后在通过CSF1诱导7天后将它们分化成巨噬细胞。通过免疫荧光标记和FACS分析对巨噬细胞特异性标记的表达进行评估。CD14和CD16水平为外周血单核细胞的分化的清楚指标，两者的水平都在分化后显著提高[44，46]。除了如上所述用作为巨噬细胞标记物的CD172a、CD169和CD163，我们包括PBMC分化标记SWC9，也被称为CD203a，以及推定的PRRSV贴附因子CD151[55，56]。
来自ΔSRCR5、杂合的和野生型动物的PMBC来源的巨噬细胞(PMMs)的CD14/CD16染色都在之前观察并记录的水平内，基因型间没有观察到不同(图5A)。在所有动物中，单核细胞/巨噬细胞谱系标记CD172a高水平表达，CD169以期望的水平表达(图5B)。SWC9的表达突出了PMMs的完全分化。CD151表达与之前示出的CD169表达一起证明了这些推定的PRRSV贴附因子或受体都仍在来自ΔSRCR5动物的巨噬细胞上表达(图5C)。正如PAMs，在PMMs的表面上都有检测到未改性的和ΔSRCR5的CD163蛋白质(图5D)。猪628、633、627、634、629、630的CD163的荧光强度的中位值分别是23.3、16.7、18.3、16.5、18.8和17.2，亚型对照中位值为1.88-3.79。与PAMs相比，这表明在PMMs上的CD163的表达水平略低。总而言之，不依赖于分离自所有动物的PBMCs的基因型，它们都表现出在rhCSF1诱导后完全分化成PMMs。它们都表达巨噬细胞特异性表面标记，包括CD169、CD151和CD163，涉及PRRSV进入的推定功能。
ΔSRCR5外周血单核细胞来源的巨噬细胞仍作用为依赖于CD163的血红蛋白-触珠蛋白清道夫
除了有助于PRRSV敏感性，CD163被描述为具有各种各样重要的生物功能。CD163为成红细胞结合因子，通过联合SRCR区2和表达CD163的巨噬细胞，增强未成熟的成红细胞的存活、增殖和分化，也可以清除衰老和畸形的成红细胞。SRCR区3的重要作用是作为血红蛋白(Hb)-触珠蛋白(Hp)清道夫受体。一旦通过结合至巨噬细胞表面的SRCR3以及随后的内吞作用，完成与Hp的复合，该游离的Hb是氧化并有毒的。这防止了氧化性损伤，维持体内平衡并有助于铁的循环利用。还发现表达CD163的巨噬细胞参与名为肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(TWEAK)的细胞因子的清除，除SRCR5之外，所有SRCRs参与了该过程[57]。在血浆中可发现高浓度的可溶CD163，但是在其在此位置的作用仍是未知的(在[34，58]中回顾)。维持这些生物功能很可能对于产生健康的、基因编辑的动物是十分重要的。有趣的是，分配给CD163的生物功能都没有联接至SRCR5。为了确认ΔSRCR5巨噬细胞是否仍能够摄取Hb-Hp复合物，我们进行了各种体外实验。过去已经深入研究了体外PMMs中的Hb-Hp复合物的摄取，PMMs能够以有赖于CD163的方式摄取Hb和Hb-Hp复合物，并且在Hb-Hp摄取后，血红素氧化酶的可诱导形式，血红素氧化酶1(HO-1)被上调[59，60]。
PBMCs用7天通过CSF1诱导分化成PMMs，接着PMMs在Hb-Hpc存在的情况下孵化24小时，以刺激HO-1上调。在来自所有动物的PMMs中，由RT-qPCR评估的HO-1mRNA上调提高2-6倍(图6A)，不同基因型之间没有明显区别。为了用免疫印迹评估HO-1水平，PMMs在Hb-Hp存在的情况下孵化24小时，用还原Laemmli样本缓冲液溶解，通过SDS-PAGE分离蛋白质。用抗蛋白质的单克隆抗体评估HO-1的水平，其中抗钙调蛋白的单克隆抗体作为内参照。发现不依赖于CD163的基因型，在所有动物中HO-1蛋白质表达被上调(图6B)。为了直接评估Hb-Hp的摄取，将Hb用Alexa Fluor 488(AF488)标记。将PMMs用HbAF488-Hp孵化30分钟，然后进行FACS分析。不依赖于CD163的基因型，HbAF488-Hp被PMMs有效摄取，对于动物628、633、627、634、629和630，绿色荧光的中位数各自为329、305、329、366、340和405，同时背景空白对照处理的细胞中位数为2.41-4.74(图6C)。共聚焦显微镜确认了HbAF488-Hp摄取至PMMs中。在另一实验中，PMMs用HbAF488-Hp孵化30分钟，然后对CD163固定并染色。发现HbAF488-Hp在大概是核内体的不同的印迹中，与CD163没有明显共同定位。这种缺乏共同定位并不意外，因为观察到的大部分HbAF488-Hp很可能已经位于晚期核内体和溶酶体中。总之，该数据证明来自ΔSRCR5动物的巨噬细胞保持执行它们作为血红蛋白-触珠蛋白清道夫的能力。
来自ΔSRCR5动物的外周血单核细胞源的巨噬细胞不容易感染PRRSV基因型1
为了探索PMMs能作为监控PRRSV感染的适当替代者的可能性，并研究ΔSRCR5PMMs，像PAM是否对PRRSV感染具有抗性，我们测试了PRRSV的所有三种基因型1亚型的传染性，由上文的菌株代表。
在MOI＝1下以单轮感染对PMMs进行感染。在19hpi，收集细胞，用抗PRRSV-N蛋白质的FITC标记的抗体染色，用FACS评估感染水平。野生型和杂合动物的所有三种亚型显示35-80％的感染水平。如在PAMs中所观察到的，在感染有PRRSV H2的杂合动物中观察到略高的统计学上明显的感染，同时在来自ΔSRCR5动物的细胞中没有观察到明显的感染(图7A-C)。为了评估病毒是否在不同CD163基因型的PMMs中复制，进行多轮感染。在MOI＝1下接种细胞，在整个感染的稳定阶段的时间点(在PAM感染时程期间识别的24，48，和72hpi)收集样本。病毒RNA提取自上层清液并由RT-qPCR进行分析。所有野生型和杂合的动物复制病毒水平相似。有趣的是，PMMs复制所有病毒的水平比PAMs更高，表明PMMs不仅适合而且事实上对于PRRSV的体外感染研究是最优模型。RT-qPCR的检测极限与上文所述的那些相同。在ΔSRCR5动物中没有观察到PRRSV的复制(图7D-F)。
在形成复制/转录复合体之前，发生ΔSRCR5肺泡巨噬细胞(PAMs)感染的停滞
在缺乏CD163表达，转染有PRRSV贴附因子CD169的猪肾脏细胞系PK-15中，发现病毒内在化但是没有经过脱壳[36]。这表明CD163与贴附因子/内在化因子相互影响紧密，在PRRSV的进入过程中起到非常重要的作用。为了评估ΔSRCR5巨噬细胞中的感染过程在复制前是否停滞，在MOI＝2下，我们对所有三种PRRSV基因型1亚型的PAM细胞进行接种，由上文所述的菌株代表。在3hpi，移除接种物，允许感染持续至22hpi。将细胞固定并染色，用于在复制开始后，由PRRSV形成的复制-转录复合体(RTC)。选择参与双层膜囊泡的形成中的PRRSVnsp2蛋白质作为RTC的代表标记物。为了PRRSVnsp2呈现，将细胞渗透并染色。我们发现不依赖于亚型，来自感染有PRRSV的野生型和杂合动物的巨噬细胞都形成RTCs。但是，在来自ΔSRCR5动物的巨噬细胞中，没有观察到RTC的形成。这强调了在PRRSV感染进入和脱壳过程中CD163的参与。还支持了在病毒或病毒蛋白质扩增之前删除SRCR5为取消PRRSV感染的有效方法(图8)。
讨论
此研究的结果表示携带删除了SRCR5的CD163的活猪是健康的，并保持蛋白质的主要生物功能，同时该删除使得PRRSV的靶细胞对病毒感染具有抗性。通过使用两个sgRNAs，该两个sgRNAs在受精卵中编辑的CRISPR/Cas9的CD163的外显子7旁侧，我们实现将所述外显子从猪的基因组切除，生成CD163ΔSRCR5基因型。通过cDNA的PCR、RT-qPCR和对CD163的免疫印迹，确认截短型基因的表达。分离自野生型CD163、杂合子和ΔSRCR5动物的肺的巨噬细胞显示出完全分化以及巨噬细胞表面标记物的表达，该标记物为分离自肺泡区域的巨噬细胞特有的。PAMs为PRRSV感染的主要靶细胞。，评估来自不同基因型动物的PAMs的感染，该感染为高剂量单轮感染以及低剂量多轮感染，该评估显示来自ΔSRCR5猪的PAMs对体外感染是有抗性的。通过PBMCs的隔离和分化，进一步确认来自基因编辑CD163动物的单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞的分化能力。也示出来自ΔSRCR5猪的PMMs对PRRSV感染具有抗性。PMMs在血液中具有重要的生物作用，作为血液中Hb-Hp复合物的清道夫。用荧光标记的Hb-Hp复合物的摄取实验以及基因上调试验来监控在Hb-Hp刺激后HO-1的提高。我们确认分离自ΔSRCR5动物的巨噬细胞维持有该重要的生物功能。
受精卵中使用CRISPR/Cas9编辑生成删除外显子7的CD163的活猪。
在体外培养的囊胚和出生的动物中，编辑效率根据手术天数可变性非常高，由此需要考虑总体数目要低。在不同手术天数中使用的试剂相同，受精和手术的次数保持一致。但是，在赖于高技能型人员和技术再现性的基因组编辑过程中有许多因素。用于受精卵中基因组编辑的核酸递送方法的最新进展可提供可能的方案来使基因组编辑过程标准化。各种团队近来报道了通过体外电穿孔的成功的基因组编辑，该体外电穿孔为使CRISPR/Cas9试剂进入分离自小鼠和老鼠的受精卵，而没有移除透明带[62-64]。使用电穿孔来体外递送基因组编辑试剂，Takahasi等人显示了在怀孕1.6天后在鼠胚胎中用这个方法成功率很高[65]。体外电穿孔的使用可使注射过程标准化，并降低对高度培训人员的需求。作为替代，体内电穿孔将消除供体动物和再移植前受精卵的长处理过程的需要，但是目前该过程仅开发为用于小鼠(在[66]中回顾)。发现四分之三的首建动物编辑为镶嵌形式。在动物310中，该镶嵌性看来源于CRISPR/Cas9复合物的延迟的活性，导致在4细胞阶段或8细胞阶段时单个细胞的一个等位基因的编辑。在动物345和347中，初始编辑活动发生在处于1细胞阶段的一个等位基因中，第二编辑活动改性处于2细胞阶段的一个细胞中的第二个等位基因，由此得到纯合/杂合镶嵌型动物。在将基因组编辑器注射至猪的受精卵的各种研究中，观察到镶嵌性[67-69]。引入的mRNA的不对称传播看起来不太可能遵循Sato等的结果，Sato等人用孤雌生殖激活的猪卵母细胞进行体外EGFP mRNA注射，由此可观察到相对同源的荧光模式[69]。但是，镶嵌性看起来是由于Cas9蛋白质/sgRNA复合物，该复合物在几个细胞分裂期间或在可能由细胞分裂引发的延迟的mRNA表达期间保持活性。前一种理论由345和347的基因型支持，345和347很可能发育自处于1细胞阶段的一个等位基因中的初始编辑步骤和编辑处于2细胞或4细胞阶段的一个细胞中的第二等位基因。为了通过直接注射受精卵生成更多的双等位基因动物，更有活性的试剂组可能是有益的。近来的研究表明注射Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNPs)比注射mRNA更有效。此外，RNP注射可与体外电穿孔结合[70]。
F0代动物310和345的交配得到野生型、杂合的和双等位基因编辑的动物。这表明了尽管有镶嵌性，动物都是种系杂合的。没有后代显示出在标准饲养条件下由于基因组编辑的任何负面影响。有趣的是，其中一个动物630，展现出推定的基因转换活动。基于等位基因间基因转换的机理，我们假设在这个动物中发生了一个显示编辑345的基因型的等位基因和另一个显示编辑310的基因型的等位基因之间同源重组。该基因转换看起来发生在受精卵阶段，使对于310的基因型，630是纯合的(在[71]中回顾)。
PRRSV显示非常窄的宿主细胞嗜性，仅影响特定的猪巨噬细胞亚群。将这些细胞从我们基因编辑的动物和它们的野生型同胞中分离，我们显示CD163的SRCR5区的移除得到巨噬细胞对PRRSV感染的完全抗性。我们进一步证明ΔSRCR5动物对所有欧洲基因型1的亚型的感染具有抗性。这显示在体外SRCR5的靶向移除足以实现对PRRSV感染的完全抗性。PRRSV贴附因子CD151和CD169仍在ΔSRCR5巨噬细胞上表达，强调了这些蛋白质不足以用于PRRSV感染。在复制转录复合物形成之前，来自ΔSRCR5动物的巨噬细胞上的PRRSV感染停止，证明CD163介入了PRRSV复制周期的进入或脱壳阶段。ΔSRCR5巨噬细胞将提供新的工具来在逼真的体系中详细学习这个过程。
由于在野猪总科中可有CD163的遗传变异，我们进行了体外对照实验来评估疣猪(非洲疣猪属)PMMs对PRRSV感染的敏感性。有趣的是，和猪PMMs一样，发现疣猪PMMs对于所有PRRSV基因型1亚型的感染很敏感。它们全部以相似的速率复制病毒并至相当的滴度(未示出数据)。这表明在野猪总科中的CD163的遗传变异很可能非常有限，并且PRRSV感染可能是普遍的。这还显示出病毒对非洲饲养猪的国家造成威胁。比起之前描述的对PRRSV感染有抗性的基因组编辑的动物，ΔSRCR5动物有许多优点。惠特沃斯等人生成的动物在CD163基因的外显子3中具有不成熟的终止密码子，引起CD163表达的消融[37]。与此形成对比，我们证明了体内的基因组编辑工具的特定应用能用于有效地产生精确删除了CD163的外显子7的动物，并且这些动物在特异性分化的巨噬细胞的表面上以天然构象保持剩余CD163蛋白质的表达。我们进一步显示来自这些ΔSRCR5动物的巨噬细胞保留中PAMs和PBMCs中的完全分化潜能，通过添加CSF-1来刺激分化，来自编辑的动物的巨噬细胞保持完成与CD163表达相关的重要生物功能的能力，比如血红蛋白/触珠蛋白摄取。总的来说，该研究证明了可利用靶向的基因组编辑方法来使猪对PRRSV感染有抗性，同时保持靶向的基因的生物功能。在猪饲养中CD163删除了SRCR5的动物的引入可显著地减少与PRRSV感染有关的经济损失。
内含子6剪接受体位点的失活
另外的删除CD163的SRCR5区的策略是使位于CD163基因中外显子7的5’端处的剪接受体位点失活。
外显子7的剪接受体位点的失活可通过许多方式实现，在下面简要讨论两个适当的策略，一个涉及产生双链切割然后非同源末端连接(NHEJ)，另一个使用同源定向的修复(HDR)。第一个选择通过靶细胞，适当地使用单个向导RNA和NHEJ。使用第二个方法提供HDR模板，其通过细胞的双链断裂修复机制进行使用，以引入序列改性。由此为了以靶向方式破坏剪接受体位点，将替换一些核苷酸，同时引入限制位点(例如NcoI)，其使得能够方便地确认HDR活动已经发生。
用于在猪胚胎中实现编辑活动和由编辑的胚胎生产动物的适当方法在上文进行了讨论，也在文献中广泛地讨论，因此为了简明将不在此赘述。
在CRISPR/Cas9介导的基因编辑的情况下，用于靶向剪接受体位点的适当的向导RNA序列如下：
sgRNA 1：AACCAGCCTGGGTTTCCTGT (SEQ ID NO：12)
sgRNA 2：CAACCAGCCTGGGTTTCCTG (SEQ ID NO：13)
这两个向导序列通过Cas9在下列序列的外显子7的5’端诱导双链切割位点：
ACA|GGAAACCCAGGCTGGTT(SEQ ID NO：14)-使用sgRNA 1
CAG|GAAACCCAGGCTGGTTG(SEQ ID NO：15)-使用sgRNA 2
方法1-NHEJ
将sgRNA1或sgRNA2与Cas9的RNP复合物结合至CD163基因的靶位点，并引起双链断裂。在发生断裂处，出现NHEJ活动，通常引起插入或删除活动。很可能无论插入或删除都将引起内含子6剪接受体位点的失活。之后是简单地识别胚胎，该胚胎具有剪接受体位点的必要失能。
方法2-HDR
此外，将sgRNA1或sgRNA2与Cas9的RNP复合物结合至CD163基因的靶位点，并引起双链断裂。但是在这种情况下，提供HDR模板，例如，单链或双链DNA分子，其包括一种序列，该序列引起CD163基因中序列从AATGCTATTTTTCAGCCCACAGGAAACCCAGG(SEQ ID NO：3)变化至：AATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGG(SEQ ID NO：4)。
适当的HDR模板具有下列序列：
GAAGGAAAATATTGGAATCATATTCTCCCTCACCGAAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGGGACATTCCCTGCTCTGGTC(SEQ ID NO：16-小写字母显示与未变化的序列相比的改变)。
在CD163背景下转换的序列引起剪接受体位点的失活以及Ncol限制位点的引入。Ncol位点的出现有助于识别已经实现期望的HDR编辑的胚胎/动物。
进一步实验的工作
在ΔSRCR5CD163猪的受精卵中的基因组编辑和基因型相同的F2代的繁殖
如上所述，通过CRISPR/Cas9基因编辑，生成首建F0代动物，该首建F0代动物携带删除了CD163基因中的外显子7，其编码蛋白质的清道夫受体半胱氨酸富集区5(SRCR5)(还参见75)。因此，用两个向导RNAs即sgSL26和sgSL28，与Cas9 mRNA一起对受精卵进行显微注射，以实现外显子7旁侧的CRISPR/Cas9介导的双链断裂(DSBs)。之后的DSB修复导致外显子7的删除(图11A)。杂合首建动物和野生型猪交配生成了第一代杂合的和双等位基因编辑的动物(F1代)。在此阶段，我们选择呈现“完全”连接的杂合F1动物，即在sgSL26和sgSL28的切割位点的此位点没有任何插入或删除，用于进一步繁殖。异父同胞杂合动物和野生型动物交配，生成携带“完全切割”的基因型的纯合ΔSRCR5动物(图11A)与具有相同遗传背景的野生型同胞和部分同胞动物的谱系。
如前所述，ΔSRCR5动物与野生型同胞表达ΔSRCR5 mRNA的CD163和蛋白质的水平相同。此外，通过各自的抗体，在肺泡巨噬细胞(PAMs)表面识别天然结构的ΔSRCR5CD163。我们已经进一步用RaptorX分析基于模板的蛋白质结构预测是否能确认这些对于子域和完整ΔSRCR5 CD163蛋白质的适当折叠的发现(39)。如图1B所示，预计在全长和ΔSRCR5CD163中的所有子域采用球状结构和串珠构型。这支持了我们对于ΔSRCR5蛋白质的适当的折叠和表达的发现。
之前，我们已经示出了对于猪的繁殖与呼吸综合征病毒1(PRRSV-1)和PRRSV-2的感染，PAMs和体外分化的外周血单核细胞具有抗性。现在，我们旨在通过评估对体内PRRSV-1感染的抗性，确认该体外结果。因此，我们选择四个纯合的ΔSRCR5F2动物和四个野生型同胞和部分同胞。动物断奶后共同饲养。在6周大的年纪，将它们转移到无特定病原体(SPF)单元，并在挑战期间共同饲养(图11C)。
ΔSRCR5猪显示出正常的全血计数和可溶的C163血清水平
在移至SPF单元之前，从所有八只猪取血液样本，并通过全血计数分析，该全血计数由爱丁堡大学的皇家(迪克)兽医研究院的诊断实验室执行。所有动物的血球计数在参考值内，表明总体健康良好，没有感染或炎症。此外，所有动物的血红蛋白水平在参考值内，表明CD163的血红蛋白/触珠蛋白清除作用的正常功能(表2)。
在移至SPF单元之前以及用PRRSV-1挑战前第0天，从所有动物收集血清。用可商业获得的酶联免疫吸附试验(ELISA)识别可溶的猪CD163，来评估可溶的CD163(sCD163)血清水平。发现在ΔSRCR5猪中，血清CD163水平为463.5±68.99ng/ml，在野生型猪中为433.2±69.57ng/ml(图12)。这些水平与人的sCD163水平相当(例如(76))，且相互间无明显不同。
表2：在5.5周大的ΔSRCR5&野生型小猪全血计数结果。4-7为ΔSRCR5，8-11为野生型猪。
ΔSRCR5猪没有显示PRRSV-1感染的迹象
在猪7-8周大时，对其进行鼻内接种PRRSV-1的亚型2菌株BOR-57(77)。一般地，PRRSV-1的亚型2菌株的感染与轻微呼吸症状、体温升高、广泛的肺病和高水平病毒血症有关。挑战进行了14天的时间，在第0天和第1天用病毒的5E6TCID50接种。每天记录直肠温度、呼吸和其它潜在症状和行为，在第0天(挑战前)、第3天、7天、10天和14天(安乐死前)收集血清样本。在第0、7和14天(安乐死前)记录体重。人不管动物的基因型，进行该挑战并分析病理。
对野生型动物，在挑战的第6-9天，直肠温度显示明显上升，但是没有在ΔSRCR5动物中观察到体温升高(图13A)。在整个挑战期间，ΔSRCR5猪的平均每天体重增长比野生型的相对物更高，尤其是在第7-14天(图13B)。仅一只野生型猪在第7至8天表现出变化的行为，除此之外，没有观察到呼吸症状或其它行为异常。从血清分离病毒RNA，并用DNA片段的模板标准定量病毒水平，从已知的传染性病毒原液存中提取病毒RNA。但是野生型猪显示高水平的病毒血症，在ΔSRCR5猪的血清中没有检测到病毒RNA(图13C)。用能够检测针对所有PRRSV-1亚型和PRRSV-2的抗体的商业ELISA，来评估抗PRRSV的抗体的出现。在野生型猪中，从第7天检测到PRRSV抗体，并且PRRSV抗体在第10和14天呈现明显的水平(图13D)。在尸体剖检过程中，最初评估肺，然后取背侧和腹侧的照片细节。针对肺病变的出现对肺进行评分。因此，应用基于每个肺段对于整个肺容量的大致贡献而建立的评分体系(78)。对于野生型动物，平均的肺病变得分是61，与之相比，ΔSRCR5猪(图13E&G)为0.25。将肺的样本固定在福尔马林中，用石蜡包埋，切割成段，然后染色用于进一步分析。为了评估大体的肺组织，样本用苏木素和曙红进行染色。对来自每只猪的部分，用0-6的数值范围(0，正常；1，轻微多病灶；2，轻微传播；3，中度多病灶；4，中度传播；5，严重多病灶；6，严重传播)关于间质性肺炎的出现进行评估。野生型动物的肺组织得分平均为4，与之相比，ΔSRCR5猪肺为0(图13E&F，上部)。如上所述，通过免疫组织化学，评估肺分段上的PRRSV抗原的存在，淋巴结部分用抗PRRSV-N蛋白质的两个不同抗体的混合物(79)。在来自ΔSRCR5的分段上没有检测到PRRSV抗原，但对于野生型动物，在四分之三动物肺的分段上以及四分之一淋巴结部分，有检测到PRRSV抗原(图13E&F，底部)。
总之，尽管接种量高并暴露于感染并脱落的野生型动物，在ΔSRCR5动物中没有检测到感染的迹象，显示出ΔSRCR5动物对PRRSV-1感染有抗性，证实体外用PRRSV-1和PRRSV-2发现的结果。
ΔSRCR5猪没有显示对PRRSV-1感染的细胞因子反应和普遍正常的细胞因子水平
为了评估PRRSV-1感染后的炎症和感染反应，分析一组20种细胞因子在猪血清中的水平。因此，我们使用商业定量的抗体阵列和在挑战的第0天(挑战前)、第3天、第7天、第10天和第14天收集的血清样本。总之，ΔSRCR5和野生型猪在第0天的细胞因子水平相似，该第0天的细胞因子水平被认为基线。在野生型猪上，发现由微克干扰素(MIG，也被称为CXCL9)诱导的单核因子显示持续的较高水平，直至第14天，那时没有再检测到明显区别。MIG为对炎症位点的T-细胞化学引诱物，并介入组织损伤的修复。在野生型动物中，在挑战的第7和10天，MIG猛烈上调(80)(图14H)。此外，相比起ΔSRCR5动物，发现野生型中的趋化因子配体3样1(CCL3L1)更高(图14J)。CCL3L1介入炎症反应，并通过IL-10下调。在第10和14天，野生型动物的血清中CCL3L1升高，但是在整个挑战期间没有发现出现明显的IL-10升高(图14O)。(80，81)
否则，我们能看到一系列细胞因子反应，干扰素α(IFNα)和白细胞介素-17A(IL-17A)、以及白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)早期增加(图14A、B、C)。接着自接种7天后(dpi)，白细胞介素4、6和8(分别为IL-4、IL-6和IL-8)增加到病毒血症的高点(图14D、E和F)。仅在10dpi，片刻地观察到MIG和巨噬细胞炎症蛋白1β(MIP-1β，也被称为CCL4)水平的提高(图14G和H)。仅在具有中度病毒血症的挑战最后期间，检测到CCL3L1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素12和1β(IL-12和IL-1β)的提高(图14I、J、K、L、和M)。对于野生型动物中所有发现提升的这些细胞因子，在ΔSRCR5猪中没有观察到细胞因子反应。在每个时间点，相比起ΔSRCR5猪中的水平，野生型中的IL-10、转变生长因子β1(TGFβ1)和干扰素γ(IFNγ)没有显示明显的不同，但是在野生型动物中发现随时间明显的变化(用双因素方差分析计算)(图14N、O、P)。在野生型动物中，白细胞介素18(IL-18)水平随时间明显降低，但是在每个时间点，与ΔSRCR5猪的那些IL-18水平没有明显区别(图14Q)。与ΔSRCR5猪的水平相比，在挑战的第3天，血小板内皮细胞粘附分子(PECAM1)显著升高，并在第10天降低(图14R)。在ΔSRCR5和野生型猪之间，或随着时间变化，没有发现白细胞介素1α(IL-1α)和白细胞介素13(IL-13)的水平有明显区别(图14S和T)。
参考文献
1.Russell P，Atkinson K，Krishnan L(1980)Recurrent reproductive failuredue to severe placental villitis of unknown etiology.J Reprod Med 24：93-98.
2.Wensvoort G，Terpstra C，Pol JM，ter Laak EA，Bloemraad M，et al.(1991)Mystery swine disease in The Netherlands：the isolation of Lelystad virus.VetQ 13：121-130.
3.Kamiychuk UU，Saha D，Geldhof M，Vanhee M，Cornillie P，et al.(2011)Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)causes apoptosisduring its replication in fetal implantation sites.Microb Pathog 51：194-202.
4.Pejsak Z，Stadejek T，Markowska-Daniel I(1997)Clinical signs andeconomic losses caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virusin a large breeding farm.Vet Microbiol 55：317-322.
5.Christianson WT，Joo HS(1994)Porcine reproductive and respiratorysyndrome：A review.J Swine Health Prod 2：10-28.
6.Wagstrom EA，Chang CC，Yoon KJ，Zimmerman JJ(2001)Shedding of porcinereproductive and respiratory syndrome virus in mammary gland secretions ofsows.Am J Vet Res 62：1876-1880.
7.Moore C(1990)Clinical presentation of mystery swine disease ingrowing pig.Proc Mystery Swine Dis Comm Meet Livest Conserv Inst Denver，CO：173-175.
8.White MEC(1992)The clinical signs and symptoms of blue-eared pigdisease(PRRS).Pig Vet J28：62-68.
9.Holtkamp DJ，Kliebenstein JB，Neumann EJ，Zimmerman JJ，Rotto HF，et al.(2013)Assessment of the economic impact of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus on United States pork producers.J Swine HealthProd 21：72-84.
10.Neumann EJ，Kliebenstein JB，Johnson CD，Mabry JW，Bush EJ，et al.(2005)Assessment of the economic impact of porcine reproductive andrespiratory syndrome on swine production in the United States.J Am Vet MedAssoc 227：385-392.
11.Cavanagh D(1997)Nidovirales：a new order comprising Coronaviridaeand Arteriviridae.Arch Virol 142：629-633.
12.Meulenberg JJ，Hulst MM，de Meijer EJ，Moonen PL，den Besten A，et a1.(1994)Lelystad virus belongs to a new virus family，comprising lactatedehydrogenase-elevating virus，equine arteritis virus，and simian hemorrhagicfever virus.Arch Virol Suppl 9：441-448.
13.Wu WH，Fang Y，Farwell R，Steffen-Bien M，Rowland RR，et al.(2001)A 10-kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virusencoded by ORF2b.Virology 287：183-191.
14.Meulenberg JJ，Petersen-den Besten A(1996)Identification andcharacterization of a sixth structural protein of Lelystad virus：theglycoprotein GP2encoded by ORF2is incorporated in virus particles.Virology225：44-51.
15.Meulenberg JJ，Petersen-den Besten A，De Kluyver EP，Moormann RJ，Schaaper WM，et al.(1995)Characterization of proteins encoded by ORFs 2to 7ofLelystad virus.Virology 206：155-163.
16.Wieringa R，de Vries AA，Rottier PJ(2003)Formation of disulfide-linked complexes between the three minor envelope glycoproteins(GP2b，GP3，andGP4)of equine arteritis virus.J Virol 77：6216-6226.
17.van Nieuwstadt AP，Meulenberg JJ，van Essen-Zanbergen A，Petersen-denBesten A，Bende RJ，et al.(1996)Proteins encoded by open reading frames 3and4of the genome of Lelystad virus(Arteriviridae)are structural proteins of thevirion.J Virol 70：4767-4772.
18.Duan X，Nauwynck HJ，Pensaert MB(1997)Virus quantification andidentification of cellular targets in the lungs and lymphoid tissues of pigsat different time intervals after inoculation with porcine reproductive andrespiratory syndrome virus(PRRSV).Vet Microbiol 56：9-19.
19.Lawson SR，Rossow KD，Collins JE，Benfield DA，Rowland RR(1997)Porcinereproductive and respiratory syndrome virus infection of gnotobiotic pigs：sites of virus replication and co-localization with MAC-387staining at 21dayspost-infection.Virus Res 51：105-113.
20.Teifke JP，Dauber M，Fichtner D，Lenk M，Polster U，et al.(2001)Detection of European porcine reproductive and respiratory syndrome virus inporcine alveolar macrophages by two-colour immunofluorescence and in-situhybridization-immunohistochemistry double labelling.J Comp Pathol 124：238-245.
21.Reiner G，Fresen C，Bronnert S，Willems H(2009)Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus(PRRSV)infection in wild boars.Vet Microbiol136：250-258.
22.Kreutz LC，Ackermann MR(1996)Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus enters cells through a low pH-dependent endocyticpathway.Virus Res 42：137-147.
23.Nauwynck HJ，Duan X，Favoreel HW，Van Oostveldt P，Pensaert MB(1999)Entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcinealveolar macrophages via receptor-mediated endocytosis.J Gen Virol 80(Pt 2)：297-305.
24.Shi C，Liu Y，Ding Y，Zhang Y，Zhang J(2015)PRRSV receptors and theirroles in virus infection.Arch Microbiol 197：503-512.
25.Delputte PL，Vanderheijden N，Nauwynck HJ，Pensaert MB(2002)Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolarmacrophages.J Virol 76：4312-4320.
26.Jusa ER，Inaba Y，Kouno M，Hirose O(1997)Effect ofheparin oninfection of cells by porcine reproductive and respiratory syndrome virus.AmJ Vet Res 58：488-491.
27.Vanderheijden N，Delputte P，Nauwynck H，Pensaert M(2001)Effects ofheparin on the entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virusinto alveolar macrophages.Adv Exp Med Biol 494：683-689.
28.Wissink EH，van Wijk HA，Pol JM，Godeke GJ，van Rijn PA，et al.(2003)Identification of porcine alveolar macrophage glycoproteins involved ininfection of porcine respiratory and reproductive syndrome virus.Arch Virol148：177-187.
29.Vanderheijden N，Delputte PL，Favoreel HW，Vandekerckhove J，Van DammeJ，et al.(2003)Involvement of sialoadhesin in entry ofporcine reproductive andrespiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages.J Virol 77：8207-8215.
30.Prather RS，Rowland RR，Ewen C，Trible B，Kerrigan M，et al.(2013)Anintact sialoadhesin(Sn/SIGLEC1/CD169)is not required for attachment/internalization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus.JVirol 87：9538-9546.
31.Frydas IS，Verbeeck M，Cao J，Nauwynck HJ(2013)Replicationcharacteristics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)European subtyPe 1(Lelystad)and subtyPe 3(Lena)strains in nasal mucosa andcells of the monocytic lineage：indications for the use of new receptors ofPRRSV (Lena).Vet Res 44：73.
32.Law SK，Micklem KJ，Shaw JM，Zhang XP，Dong Y，et al.(1993)A newmacrophage differentiation antigen which is a member of the scavengerreceptor superfamily.Eur J Immunol 23：2320-2325.
33.Onofre G，Kolackova M，Jankovicova K，Krejsek J(2009)Scavengerreceptor CD163and its biological functions.Acta Medica(Hradec Kralove)52：57-61.
34.Van Gorp H，Delputte PL，Nauwynck HJ(2010)Scavenger receptor CD163，aJack-of-all-trades and potential target for cell-directed therapy.Mol Immunol47：1650-1660.
35.Calvert JG，Slade DE，Shields SL，Jolie R，Mannan RM，et al.(2007)CD163expression confers susceptibility to porcine reproductive andrespiratory syndrome viruses.J Virol 81：7371-7379.
36.Van Gorp H，Van Breedam W，Delputte PL，Nauwynck HJ(2008)Sialoadhesinand CD163join forces during entry of the porcine reproductive and respiratorysyndrome virus.J Gen Virol 89：2943-2953.
37.Whitworth KM，Rowland RR，Ewen CL，Trible BR，Kerrigan MA，et al.(2016)Gene-edited pigs are protected from porcine reproductive and respiratorysyndrome virus.Nat Biotechnol 34：20-22.
38.Groenen MA，Archibald AL，Uenishi H，Tuggle CK，Takeuchi Y，et al.(2012)Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography andevolution.Nature 491：393-398.
39.Kallberg M，Wang H，Wang S，Peng J，Wang Z，et al.(2012)Template-basedprotein structure modeling using the RaptorX web server.Nat Protoc 7：1511-1522.
40.Cong L，Ran FA，Cox D，Lin S，Barretto R，et al.(2013)Multiplex genomeengineering using CRISPR/Cas systems.Science 339：819-823.
41.Jinek M，Chylinski K，Fonfara I，Hauer M，Doudna JA，et al.(2012)Aprogrammable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity.Science 337：816-821.
42.Chen B，Gilbert LA，Cimini BA，Schnitzbauer J，Zhang W，et al.(2013)Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.Cell 155：1479-1491.
43.Komohara Y，Hirahara J，Horikawa T，Kawamura K，Kiyota E，et al.(2006)AM-3K，an anti-macrophage antibody，recognizes CD163，a molecule associated withan anti-inflammatory macrophage phenotype.J Histochem Cytochem 54：763-771.
44.Ziegler-Heitbrock HW，Fingerle G，Strobel M，Schraut W，Stelter F，etal.(1993)The hovel subset of CD14+/CD16+blood monocytes exhibits featuresoftissue macrophages.Eur J Immunol 23：2053-2058.
45.Kapetanovic R，Fairbairn L，Downing A，Beraldi D，Sester DP，et al.(2013)The impact of breed and tissue compartment on the response of pigmacrophages to lipopolysaccharide.BMC Genomics 14：581.
46.Fairbairn L，Kapetanovic R，Beraldi D，Sester DP，Tuggle CK，et al.(2013)Comparative analysis of monocyte subsets in the pig.J Immunol 190：6389-6396.
47.Hartnell A，Steel J，Turley H，Jones M，Jackson DG，et al.(2001)Characterization of human sialoadhesin，a sialic acid binding receptorexpressed by resident and inflammatory macrophage populations.Blood 97：288-296.
48.Sanchez C，Domenech N，Vazquez J，Alonso F，Ezquerra A，et al.(1999)Theporcine 2A10antigen is homologous to human CD163and related to macrophagedifferentiation.J Immunol 162：5230-5237.
49.Piriou-Guzylack L，Salmon H(2008)Membrane markers of the immunecells in swine：an update.VetRes 39：54.
50.Kappes MA，Faaberg KS(2015)PRRSV structure，replication andrecombination：Origin of phenotype and genotype diversity.Virology 479-480：475-486.
51.Stadejek T，Oleksiewicz MB，Scherbakov AV，Timina AM，Krabbe JS，et al.(2008)Definition of subtYpes in the European genotype of porcine reproductiveand respiratory syndrome virus：nucleocapsid characteristics and geographicaldistribution in Europe.Arch Virol 153：1479-1488.
52.Edwards S(1992)PRRSV(″blue-eared pig disease″)in GreatBirtain.American Association of Swine Practitionsers Newsletter 4：32-36.
53.Stadejek T，Stankevicius A，Storgaard T，Oleksiewicz MB，Belak S，etal.(2002)Identification of radically different variants of porcinereproductive and respiratory syndrome virus in Eastern Europe：towards acommon ancestor for European and American viruses.J Gen Virol 83：1861-1873.
54.Morgan SB，Graham SP，Salguero FJ，Sanchez Cordon PJ，Mokhtar H，et al.(2013)Increased pathogenicity of European porcine reproductive andrespiratory syndrome virus is associated with enhanced adaptive responses andviral clearance.Vet Microbiol 163：13-22.
55.Basta S，Knoetig SM，Spagnuolo-Weaver M，Allan G，McCullough KC(1999)Modulation of monocytic cell activity and virus susceptibility duringdifferentiation into macrophages.J Immunol 162：3961-3969.
56.Shanmukhappa K，Kim JK，Kapil S(2007)Role of CD151，A tetraspanin，inporcine reproductive and respiratory syndrome virus infection.VirolJ 4：62.
57.Bover LC，Cardo-Vila M，Kuniyasu A，Sun J，Rangel R，et al.(2007)Apreviously unrecognized protein-protein interaction between TWEAK and CD163：potential biological implications.J Immunol 178：8183-8194.
58.Fabriek BO，van Bruggen R，Deng DM，Ligtenberg AJ，Nazmi K，et al.(2009)The macrophage scavenger receptor CD163functiohs as an innate immunesensor for bacteria.Blood 113：887-892.
59.Ugocsai P，Barlage S，Dada A，Schmitz G(2006)Regulation ofsurfaceCD163expression and cellular effects of receptor mediated hemoglobin-haptoglobin uptake on human monocytes and macrophages.Cytometry A 69：203-205.
60.Schaer DJ，Schaer CA，Buehler PW，Boykins RA，Schoedon G，et al.(2006)CD163is the macrophage scavenger receptor for native and chemically modifiedhemoglobins in the absence of haptoglobin.Blood 107：373-380.
61.Snijder EJ，Kikkert M，Fang Y(2013)Arterivirus molecular biology andpathogenesis.J Gen Virol 94：2141-2163.
62.Hashimoto M，Takemoto T(2015)Electroporation enables the efricientmRNA delivery into the mouse zygotes andfacilitates CRISPR/Cas9-based genomeediting.Sci Rep 5：11315.
63.Kaneko T，Sakuma T，Yamamoto T，Mashimo T(2014)Simple khockout byelectroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.Sci Rep4：6382.
64.Qin W，Dion SL，Kutny PM，Zhang Y，Cheng AW，et al.(2015)EfficientCRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing in Mice by Zygote Electroporation ofNuclease.Genetics 200：423-430.
65.Takahashi G，Gurumurthy CB，Wada K，Miura H，Sato M，et al.(2015)GONAD：Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery system：a hovelmicroinjection independent genome engineering method in mice.Sci Rep 5：11406.
66.Sato M，Ohtsuka M，Watanabe S，Gurumurthy CB(2016)Nucleic acidsdelivery methods for genome editing in zygotes and embryos：the old，the new，and the old-new.Biol Direct 11：16.
67.Lillico SG，Proudfoot C，Carlson DF，Stverakova D，Neil C，et al.(2013)Live pigs producedfrom genome edited zygotes.Sci Rep3：2847.
68.Whitworth KM，Lee K，Benne JA，Beaton BP，Spate LD，et al.(2014)Use ofthe CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered pigs from in vitro-derived oocytes and embryos.Biol Reprod 91：78.
69.Sato M，Koriyama M，Watanabe S，Ohtsuka M，Sakurai T，et al.(2015)Direct Injection of CRISPR/Cas9-Related mRNA into Cytoplasm ofParthenogenetically Activated Porcine Oocytes Causes Frequent Mosaicism forIndel Mutations.Int J Mol Sci 16：17838-17856.
70.Chen S，Lee B，Lee AY，Modzelewski AJ，He L(2016)Highly EfficientMouse Genome Editing by CRISPR Ribonucleoprotein Electroporation of Zygotes.JBiol Chem 291：14457-14467.
71.Chen JM，Cooper DN，Chuzhanova N，Ferec C，Patrinos GP(2007)Geneconversion：mechanisms，evolution and human disease.Nat Rev Genet 8：762-775.
72.Ran FA，Hsu PD，Wright J，Agarwala V，Scott DA，et al.(2013)Genomeengineering using the CRISPR-Cas9system.Nat Protoc 8：2281-2308.
73.Lillico SG，Proudfoot C，King TJ，Tan W，Zhang L，et al.(2016)Mammalianinterspecies substitution of immune modulatory alleles by genome editing.SciRep 6：21645.
74.Li Y，Tas A，Snijder EJ，Fang Y(2012)Identification of porcinereproductive and respiratory syndrome virus ORF1a-encoded non-structuralproteins in virus-infected cells.J Gen Virol 93：829-839.
75.Burkard C，Lillico SG，Reid E，Jackson B，Mileham AJ，Ait-AliT，WhitelawCB，Archibald AL.2017.Precision engineering for PRRSV resistance in pigs：Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fullyresistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function.PLoSPathog 13：e1006206.
76.Kulkarni M，Bowman E，Gabriel J，Amburgy T，Mayne E，Zidar DA，Maierhofer C，Turner AN，Bazan JA，Koletar SL，Lederman MM，Sieg SF，FunderburgNT.2016.Altered Monocyte and Endothelial Cell Adhesion Molecule Expression IsLinked to Vascular Inflammation in Human Immunodeficiency VirusInfection.Open Forum Infect Dis 3：ofw224.
77.Rappe JC，Garcia-Nicolas O，Fluckiger F，Thur B，Hofmann MA，Summerfield A，Ruggli N.2016.Heterogeneous antigenic properties of the porcinereproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid.Vet Res 47：117.
78.Halbur PG，Paul PS，Frey ML，Landgraf J，Eernisse K，Meng XJ，Lum MA，Andrews JJ，Rathje JA.1995.Comparison of the pathogenicity of two US porcinereproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of theLelystad virus.Vet Pathol 32：648-660.
79.Halbur PG，Andrews JJ，Huffman EL，Paul PS，Meng XJ，NiyoY.1994.Development of a streptavidin-biotin immunoperoxidase procedure forthe detection of porcine reproductive and80.respiratory syndrome virusantigen in porcine lung.J Vet Diagn Invest 6：254-257.
Arango Duque G，Descoteaux A.2014.Macrophage cytokines：involvement inimmunity and infectious diseases.Frontiers in immunology 5：491.
81.Zhang JM，An J.2007.Cytokines，inflammation，and pain.Internationalanesthesiology clinics 45：27-37.
核酸序列：
CD163向导序列：
sgSL25TGAAAAATAGCATTTCGGTG(SEQ ID NO：5)
CD163基因切割位置：CAC|CGAAATGCTATTTTTCA(SEQ ID NO：6)
sgSL26GAATCGGCTAAGCCCACTGT(SEQ ID NO：7)
CD163基因切割位置：GAATCGGCTAAGCCCAC|TGT(序列号：8)
sgSL27GTCCTCCATTTACTGTAATC(SEQ ID NO：9)
CD163基因切割位置：GAT|TACAGTAAATGGAGGAC(SEQ ID NO：10)
sgSL28CCCATGCCATGAAGAGGGTA(SEQ ID NO：11)
CD163基因切割位置：CCCATGCCATGAAGAGG|GTA(SEQ ID NO：11)
切割位置由符号|示出。
大白猪中基因位点的基因组序列(SEQ ID NO 1)
粗体＝外显子
单下划线和虚线下划线＝剪接受体位点预测
双下划线＝剪接供体位点预测
sgRNA结合位置和切割位点用小写斜体字母表示，还表示结合至位点的特异性sgRNA。
序列表
<110> 爱丁堡大学董事会
<120> 包含改性CD163的猪及相关方法
<130> P237424WO
<150> GB1617559.8
<151> 2016-10-17
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32908
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<220>
<221> misc_feature
<222> (21960)..(22059)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
tcttcatcct attagagaca ctgctataca gcagaaattg acacaacatt gtaaatcaac 60
tatactttaa taaaataaaa aaaagaaata caagtgcttt ctacagacaa tctgcacaag 120
ttatttgtta gacatatttg attatagaat taatattaaa aggggttata acaatcaagc 180
attgataatt taattatgtt tgcctatttt actttagttt tttgacataa ctgtgtaact 240
attgcgattt ttttattcct aatgtaatta gttcaaaaca aagtgcagaa atttaaaata 300
ttcaattcaa caacagtata taagtcaata ttcccccctt aaatttttac aaatctttag 360
ggagtgtttc tcaatttctc aatttctttg gttgtttcat gtcccatatg gaagaaaaca 420
tgggtgtgaa agggaagctt actcttttga ttacttccct tttctggttg actccacctc 480
cattatgaag cctttctgta tttttgtgga agtgaaatga tttttagaat tcttagtggt 540
tctcttcttc aggagaacat ttctaggtaa taatacaaga agatttaaat ggcataaaac 600
cttggaatgg acaaactcag aatggtgcta catgaaaact ctggatctgc aggtaaaatc 660
ttctcattta ttctatattt accttttaat agagtgtagc aatattccga cagtcaatca 720
atctgattta atagtgattg gcatctggag aagaagtaac agggaaaagg caataagctt 780
ataaggggaa cttttatctt ccatagaatc aaaattgaag acgtgactag aagaaggatt 840
agatttggca tcagttttgt aaaattgctg aggtgaaatt aagtaaggga tgaaaattaa 900
ctaaattgtg ttgagtatga aactagtagt tgttagaaaa gatagaacat gaaggaatga 960
atattgattg aaagttgatg acctagagga catttagact aacacctctg agtgtcaaag 1020
tctaatttat gatttacatc gatgcgttaa actcatttaa cattcttact tttttcccct 1080
caagcattta agctgaagta taacatttca catgaaagcc tggattataa atgcacagtt 1140
cagtgaccta tctcagagga gtgactgcca tagcattttt tttgtctttt tgccttcaga 1200
gccacagcaa cgcgggatcc gaagccgcgt ctgcgaccca caccacagct cacggcaatg 1260
ccggatcttt aacccactga gcgaggccgg ggatcgaacc cgcagtctca tggttcctag 1320
taggattcgt taaccactgc gccacgacgg gaactcctac catagcattt ttacttttaa 1380
gttactgttg gtttagagta agaaggagaa atgagagtga tggagcgttt gctatatttg 1440
gagacaaggt cctatattgg aggttctcaa atataaattt tgtcgctttt tcctccaatg 1500
tattgttcaa ctactattta gcaggccact gtgccaggta ctggtgaaac tggtgaacat 1560
gatagatgta attcattccc tcatggaact ttccatctaa caatgtggat caggtaggct 1620
tggagatgag aatgccagtg gttgactatg actctgtggc tgaagggaga gctactcact 1680
tcgtagtttc atcaatgtct ttttggtttt ccaggtttta agccctgctc ttgcaattct 1740
tttcccttct ccaactttct tctaatttct cacccctagg atgcctataa acatgagtat 1800
tttcaaagct acttcactga ggttatatga tcctcgtgtg aatttttcct gcctgccttg 1860
ccatttagaa ggaagtgttt cctggaattt ccattgtggc ttggtggtta aagaccctgc 1920
attgtctctg tgaggatgtg ggttcaatct ctggcctcat tcagtgagtg ggttaaggat 1980
ctggtgtcgc tgcaagctgt ggctaagatc ccacattgcc atggctgtgg tgtagactgg 2040
cacctggagc tctgatttga ccacaatcct aggaacttca gatgttgcca taaaaagaaa 2100
aaaaaagtta ggaagggttt tctgtcttgt tttgaccttt gttaatctca aacctttgga 2160
accatctctc ctccaaaacc tcctttgggt aagactgtat gtttgccctc tctcttcttt 2220
tcgcagactt tagaagatgt tctgcccatt taagttcctt cacttttgct gtagtcgctg 2280
ttctcagtgc ctgcttggtc actagttctc ttggtgagta ctttgacaaa tttacttgta 2340
acctagccca ctgtgacaag aaacactgaa aagcaaataa ttctcctgaa gtctagatag 2400
catctaaaaa catgcttcat ggtttcaaag gatcagatat taaaaacccc aaataggtac 2460
agaaccatgt ggctctctcc ccccaaacaa ataaaacgtt agcatggttt tcaaaaaaat 2520
aaaataacct tcacaggaaa aatggatttt acttaagatt tgaaataata tctaactaaa 2580
aaatagggaa taatgcagaa gaggagaaac ctcagaattg ttgggatgaa ggaattttta 2640
gtaacactaa aaattcaagt gccaaaattt gtctaaaatt gtattcaggg aagccagata 2700
tatatcagtg aaatcgccag ttcctatatt agctaaaata atcacaaggc tgtagcagag 2760
acagttcaga gagaggtgga gatgagattt ttttttttta agtataattg atttacaatg 2820
ttgtggcaat ttctgttgta tagcaagaga tagaattatt ttatggtgga agataataga 2880
aaaatatatc catatcaatt tccatttgag tagataaatt tcaattagag ttcaactagc 2940
aattagtagt tttgcataca tggtgaaata tattcatggt attttgcata tatgtgtgaa 3000
ataggtacta aattcctcat aactgttctt tttagtctca ccatcagcct ctactgatct 3060
taggattttg gagaaacata catagttcat ccctataaaa tgccataaaa tctcattttt 3120
acattaaacc atccaagaga ttatataaat tgaccttata aagaatatca gccataaaat 3180
aaaggtatca tagtatggga ttatttagct ttattggttc tatgtcactg cttaatttga 3240
aacctgtgat attgctgttt gtttttgaac tcctatgaaa taacattctc ccattgtacc 3300
atggatgggt ccagaaacat ttctcaaatc tggctttgaa aaataaataa gtaatctaaa 3360
gaataataat tctctacttg ctctttgaat cttgaccaat tgctgcattt acctattgtt 3420
acaggaggaa aagacaagga gctgaggcta acgggtggtg aaaacaagtg ctctggaaga 3480
gtggaggtga aagtgcagga ggagtgggga actgtgtgta ataatggctg ggacatggat 3540
gtggtctctg ttgtttgtag gcagctggga tgtccaactg ctatcaaagc cactggatgg 3600
gctaatttta gtgcaggttc tggacgcatt tggatggatc atgtttcttg tcgagggaat 3660
gagtcagctc tctgggactg caaacatgat ggatggggaa agcataactg tactcaccaa 3720
caggatgctg gagtaacctg ctcaggtaag acatacacaa ataagtcaag cctatacatg 3780
aaatgctttg tgggaaaaaa tgtatagatg agttaaaaac aaaaaggaac cagttttcta 3840
taagtcatct agtccatgta taaaattacc caatccatta ctaaaagacc acttctggta 3900
ttttacacat gacaaagccc atattaaaaa aaaaaaattc agaagagatt ctgaatgcta 3960
taataaatga gcaagtgact agcttcaatt ttatattagg tcattctacc ttctacttct 4020
acatgaaaat atcataatgt ctaagttaat tccttgtccc ctttcccaat aaagcactgc 4080
tttcatgcac tggcctatga atcatgaact ttttgccctt taactgatga tcaacttacc 4140
aaatcaagaa ataaatattc ttagcactga tccttttttg ttgttgttgg aggaagaatg 4200
ttttgcaaag tagaattgct tttttctgtt taacagtgct attcatttca tttacatggt 4260
cgttttaatt tataaaacat ttcataagtt tcacctcata tgcccttaca ataactcagg 4320
aagttatatg ttagaccttt ctgctgacaa atcccagagt catgtttctg acccagttca 4380
gattccttgg cttcccattt ctctttgctc atgtcattga cctttatgca gccctcttac 4440
ctcccacctt tctattacag accatctcct ccataggact ggtgttagaa agtactaatc 4500
tctacccagg cattgtggtg caatgtgggc agcacaggct ggtatctaga aaaatgctga 4560
agtgaattcc agctcagctg ctcgttaata ctattgtttt aagtaagctg ttcaatcctt 4620
tgaaattcac tttctgagca ctcagtgata taataaatgt agagttactg gtacactgtc 4680
tggtatgtaa taggtgttaa aaattaacct tagtttcctc atgggtcact gcttctcatt 4740
acctagacaa ctcatttctc tttcttcctc tttctctttc tccattctcc tcctccttct 4800
tcctcttctt cttgtctttt attgttattc attttgctga gaaagttaag aaataacaac 4860
tctaacctct acatcgacca cctagagcaa agttaaaaat aataataaac cttgccagac 4920
tcttactata attgttgctg tctatagagt tgactgttta agttaagaca tcagtatagt 4980
atttttaatt tttgtgtttt ttttttcata cttttacatg aggatccttt atataaggat 5040
gagttaaaca aacttgattt ttgaagttta tacccctgag gctcaactgc ataataatag 5100
aaagggatcc atagcctctc aaggacttaa ctagtttcat gagttttcag aatctgaatt 5160
tctgagattc tccaccccaa ttaaagctca agcctcagaa catatatcct tctcttggta 5220
aattctattc ttatcacatg cgtaataata aaaaagagag atgttggaga cagatttttt 5280
tcctcacatt ctgtctctac tgttttctag gtgtttgatt ctgtgttatt taacctcagt 5340
ttgcttatct gtgaagtagg gattatggta ataacatata atgcttaatg ttgtaaagac 5400
taaagaagat agcatatgta acacatttgg aacagggaat gcatattttg attgtgagct 5460
cttattatta ttaccaatca gccataataa aaatcttgtt aagtggaggt ctttggattt 5520
cagagctttt aaaatctaat tactttttca aaaaagagct tcttagtgtt tttttttttt 5580
aaccacaaag tgtttctatt ttttaggtgt cccaaaattt cattccaaat atctttttct 5640
cagatatttt agtcctcata gaacacctag ggatagtgta tagagaaaat tttctttatt 5700
aaaaagctgt tctttgctaa aaattgtagc aggtactttt gggagggggg aaaactttga 5760
ttcagaaact gctaagacat ggagtgtttt gactaatttt tcctcaattt ttaatgtttt 5820
ttataccata gggtactttt gcaaactatt atgcatactt atatattttt acttttttcc 5880
tgtcttttaa cttccaaatt caacttcaga caattattca tgcactaaac tgttgtagta 5940
agaaagatta aaattaaaaa attaaccatt caacaaatga ctggtttgcc atttttacta 6000
ctttgttgta tgaacaattt ttttttctac aaatgaatac tttgagtctg atttatccat 6060
tcctacataa aagtttttac tatatcttag tattggaagg aaacaaaaca aaacacaatg 6120
taaattttaa tctataaatt ttgggggggg gtaaatatac atagatgaaa gtcttaacca 6180
ttaattagag tcaaaagatt aaaattctcc aatatgtgaa cttaggctgc atccaaaatg 6240
aagcatcatt tttaaggaca gcatcaaaag tgaccagagg aattttactt tctttctttt 6300
tttttttttt tttgaatttt agtttctaaa ctcacttctg aataaataca acttctaaat 6360
tctcgtcttt tctctactct agatggatct gatttagaga tgaggctggt gaatggagga 6420
aaccggtgct taggaagaat agaagtcaaa tttcaaggac ggtggggaac agtgtgtgat 6480
gataacttca acataaatca tgcttctgtg gtttgtaaac aacttgaatg tggaagtgct 6540
gtcagtttct ctggttcagc taattttgga gaaggttctg gaccaatctg gtttgatgat 6600
cttgtatgca atggaaatga gtcagctctc tggaactgca aacatgaagg atggggaaag 6660
cacaattgcg atcatgctga ggatgctgga gtgatttgct taagtaagga ctgacctggg 6720
tttgttctgt tctccatgag agggcaaaaa aaggggagta aaagtcttaa aagctcaaac 6780
tgttaaaaac ataatgatga ttgcttcttt tatcatctta ttattatcta atttcaggtc 6840
gaaattctag tacctgtgca gttttttacc ttaactgaaa ttaagataaa taggataggg 6900
aggaaggatg agcagtgaca tttaggtcca agtcatgagg ttagaaggaa atgttcagag 6960
aatagcccat tccctcagcc ctcaaagaaa gaaagaaaga aaaagaaaaa aaaaaagaaa 7020
gcttaactag aaaattttgt tctctggatg ttttagaggc aaaccatccc ttttatcatt 7080
ccttacctac aaagcccttc tctttaatca cattgaccca ccctttccta aactattagt 7140
tcaaattcac ataattgaat gcttttaaaa cttggtttcc tcttataatt atatttatgt 7200
tgtaaggagg cactgtgtct tgtctagaga ctttcatgtt ctatgcttga ttatgggaca 7260
gggacatggc tttgtctgct ccaggatgtc actctccttt tttcacttga gctcctagtt 7320
tgaagaagac ctagtaagtc ttgaactcca gggagtcttt aggaaactat ccctagagca 7380
aaactgtccc tgaattcacc cagtgtcttt tttttttttt tcaaatgaag gaactttagt 7440
tcaaactaaa tttaaaataa gggaattcta attcagaata ctgggaaatc caggagatta 7500
caattggctt catgtgtgat tggattcagc acttcaccaa tgtcatcagg gttctggttc 7560
tttttttatt tcttgaattg gctttttttt ttttttcctt gttgaacaat atgactatct 7620
atactttgaa ccacaaagaa agtgattcct acagaaaaga cagaatgtgt tagctgaagg 7680
aagggaatgg gacttggggt agaaaaaaac accttccgta ttccttaacc tatcaaaaat 7740
ttctaggtac ccctaactaa aatcctaatt caagcatatt ggaggaactt gacaaatcca 7800
ggaataatat tatccgttat caaatacatg cacatcattt acatttctcc atgtctctgc 7860
tcatgcagtt cccggcccta actctaccaa agtattactc tccatctccc tctttttttt 7920
tttaatgatt tttatttttt ctgttatgac tggtttacag tgttctgtca attttctact 7980
gtacagcaaa gtgacccagt cacacattca tatatacatt ctttttctca cattatcctc 8040
catcaggctc catcacaagt gactagacat agttcccaga gctatgcagc aggatctcat 8100
tgctgctcca ttccaaaggc aacagttcac atctattaac cccagattcc cagtccaccc 8160
cactcccttc ccctccctct tggcaaccac aagtctgttc tccaagttca tgagtttatt 8220
ttctgtggaa agttttattt gtgcagtatg ttagattcca gatataagtg ctatcatatg 8280
gtatttgtcc ttctctttct gactgacttc acaaagtatg agagtctcta gttccatcca 8340
tgttactgca aatggcatta ttaatctcca tctttttttg ttcatgtata tgttacccag 8400
attccttgac ttttctacat catcaagata ttgttgatca cttctttgta gtgatttctg 8460
cccttctctg atgtcctgtg acactagtct ggattattca tttacctgaa accacatgtc 8520
tcttataatg tgtatcccaa attaaatatg tctattgtaa tgtgtatccc aaattaaata 8580
tttatctttc taaaaaaaaa aatttctagg cccccaatca gcatgtttct tctcagtgtg 8640
ttttatacat gctgcagaat cataatagac agcataatag acagcataac aaaaactaaa 8700
aatgccaggg gaaaaaagca atttactgat tacaacatat tactcagaat caagttctgt 8760
tctttgagga atattgattg ggggaaaatg aaaataatga tggggaggtc ccttttctct 8820
ttgctttgct tttaaactac ggaagtagtc agaaaggggt caggaatgta atataaacca 8880
ggtagtcctg gtaggtaacg cagccggagg caaaagtgag tgttgagtat tgaggcaaac 8940
tggagggcat ggataccacc tagacagatg caaatatata tttaacaggg aaaaaagaac 9000
caaacaattt caacaaaaaa ccaaacaatt ccaacaaaat tggtccaata agcaaacctc 9060
tagataaatt tcagtccctg gatgttttgt taggaactct tcctacaatg cgtgctttcc 9120
attctgaaaa gtcctatcta cttgcctgat ccacttctcc ttccatccta aacgattttc 9180
agtggtagta tattactgtt gtctctgtct ctacttatat atcttcccct tttcactcac 9240
tcctctcagg tacagctctt cagtttgccc ttattcttgt ttccttgtca atgacttgtt 9300
ttgtgtccct cttacagatg gagcagacct gaaactgaga gtggtagatg gagtcactga 9360
atgttcagga agattggaag tgaaattcca aggagaatgg ggaacaatct gtgatgatgg 9420
ctgggatagt gatgatgccg ctgtggcatg taagcaactg ggatgtccaa ctgctgtcac 9480
tgccattggt cgagttaacg ccagtgaggg aactggacac atttggcttg acagtgtttc 9540
ttgccatgga cacgagtctg ctctctggca gtgtagacac catgaatggg gaaagcatta 9600
ttgcaatcat aatgaagatg ctggtgtgac atgttctggt aagtgaaaac aaaacaccgg 9660
aaggacctgt gttcttcagg attaggaatg gatatgagat aggagaaaaa ttgtatctaa 9720
tattttcttt gttgggaatt cttttacagt tgtgacaaat ctttaacata ttcttcattt 9780
gagtagtttg gagggttgtc tgactgtttt ctataataaa tgtcccaagt gctatgaggt 9840
accacatttc aaattctaat tctacctgaa gctccaaaaa gacaaaatgt tataggtctt 9900
ttctttatat ctaatttgct tatggttttt agccattgac aatttttttt ttcttaactc 9960
ttgaaactat aatcctattt ctaaccaaat tcatgttcta tactggctct tcaaaaaccc 10020
aggagatggg aaagccagaa tctccagtgt ttcagcttct gggaaggagc aagtttttaa 10080
atgtgggagc taaattccac atgtatctat ggcctaagtg tatgtttatt ttgcagatgg 10140
atcagatctg gaactgagac ttaaaggtgg aggcagccac tgtgctggga cagtggaggt 10200
ggaaattcag aaactggtag gaaaagtgtg tgatagaagc tggggactga aagaagctga 10260
tgtggtttgc aggcagctgg gatgtggatc tgcactcaaa acatcatatc aagtttattc 10320
caaaaccaag gcaacaaaca catggctgtt tgtaagcagc tgtaatggaa atgaaacttc 10380
tctttgggac tgcaagaatt ggcagtgggg tggacttagt tgtgatcact atgacgaagc 10440
caaaattacc tgctcaggta agaatttcaa tcaatgtgtt aggaaattgc attctacttt 10500
cttttacatg tagctgtcca gttttcccag caccacttgt tgaagagact gtcttttctt 10560
catcatatag tcctacatcc tttgtcataa attaattgac cataggtgtg tgggtttata 10620
tctgggctct ctattctgtt cctttgatct atgtgtctgt ttttatgcca gcaccatgct 10680
gttttgatta ctatagcttt gtagtatcat ctgaagtcag gaaacatgat tcctccagct 10740
ttgttcttct ttctcaagat tgttttgtct attcagagtt ttatgttcct atgcagattt 10800
tatttttatt tttattttat ttttattttt tttattttcc cactgtacgg caagggggtc 10860
aggttatcct tacatgtata cattacaatt acagtttttc ccccaccctt tcttctgttg 10920
caacatgagt atctagacaa agttctcaat gctattcagc aggatctcct tgtaaatcta 10980
ttctaagttg tgtctgataa gcccaagctc ccgatccctc ccactccctc cccctcccat 11040
caggcagcca caagtctctt ctccaagtcc atgattttct tttctgagga gatgttcatt 11100
tgtgctggat attagattcc agttataagg gatatcatat ggtatttgtc tttgtctttc 11160
tggctcattt cactcaggat gagattctct agttccatcc atgttgctgc aaatggcatt 11220
atgtcattct tttttatggc tgagtagtat tccattgtgt atatatacca cctcttctga 11280
atccaatcct ctgtcgatgg acatttgggt tgtttccatg tcctggctat tgtgaatagt 11340
gctgcaatga acatgcgggt gcacgtgtct cttttaagta gagctttgtc cggatagatg 11400
cccaagagtg ggattgcagg gtcatatgga agttctatgt atagatttct aaggtatctc 11460
caaactgtcc tccatagtgg ctgtaccagt ttacattccc agcagcagtg caggagggtt 11520
cccttttctc cacagcccct ccagcacttg ttatttgtgg atttattaat gatggccatt 11580
ctgactggtg tgaggtggta tctcatggta gttttgattt gcatttctct tataatcagc 11640
gatgttgagc attttttcat gtgtttgctg gccatctgtg tatcttcttt ggagaaatgt 11700
ctattcaggt cttttgccca tttttccatt gattgattgt tttttttgct gttgagttgt 11760
ataagttgct tatatattct agagattaag cccttgtcag ttgcacctat gcagatttta 11820
aaactatttt ctctagttct atgaaaaata ccattggtaa tttgataggg attgccctga 11880
atctgtagat tgccttggat agtattgcca ttttaacaat actgaatctt ccaattcgag 11940
agcacagtgt atctttcttt ctgtgtcatc ttcagttctt ctcatctgca tcttatagtt 12000
ttagaagtac aggtcttttg cctcctaagg tgggtttttt cctaggcatt ttattctttt 12060
caatgtgata gtgaatgaaa ttgtttcctt aattctttct ctctcttttt taatggcttc 12120
acctgcagca tatggaagtc cccaggctag ggatcaaatc acagctgcag ctatgtccat 12180
gccactgcct tggcaacagc agatctgagc cacatctgcc acttacactg tagcttacaa 12240
taatgctgaa tccttaaccc actgctagaa cctgaatcct cacagaaaca atgtcggggt 12300
ccttacctct ctgagccaca atgggaaatc ttcatttttc tttctgataa tttgttgtta 12360
gtgtatagaa atgaaacagg tttcagcata ttaattctta tcctgaagtt ttacccaatt 12420
cattgataaa ctctagtagc tttttggtgg tgtctttagg attttctatg tatagattca 12480
tgttacctgc aaacagtgcc attattactt ccttttttcc aaattggatt ccttttattt 12540
ctttttcttc tctgctgtga ctaggatttc caaaatcatg ttgaataaaa gtagcaagaa 12600
tcagcatcct tgctttgttc ctgaccttag aagaaacaca ttcagcattt aactgtcgag 12660
tatgatgtta gctgtgggct tatcatatat ggcatttatt attttgaggt atattccctc 12720
tatacccact ttgttgagaa ctttttatca tgaatggatg ttaaactttg tctaaagctt 12780
tttctgcatc tagataaccc tattattttt cttttctaat ttgttcatgt ggtgtatcac 12840
actgatttat ttgcagatgt gcatccattc atgtatccca cttgatcgtg gtgtgtaatc 12900
tttttagtgt attagtgaat ttggttgcta gtattttgtt tgaggatttt tgcatataca 12960
ttcatcagcg gtattggatt ttaaatcttt tgtatgtgtc ttgttttggt atcagggtat 13020
cctctagggt atcctcctag aatgagttca gaagggtaca tttctttggg gaatatattt 13080
ggtagaattc acttttgaag ctgtctggtc ctgttctttt gtttgtcggg aagttctttt 13140
taaattatta ttattactga ttcaatttca ttactggtaa ttggaccatt tatattttct 13200
tttttttcct ggttcaatct tgggagattg tatgttttaa aaatttgtcc agttcttcta 13260
ggttgttcat tttattggaa tgtaattgtt tgtttatctt tttttttgca ttttctaggg 13320
ccgcacccat ggcatatgga agttcccagg ctaggggtct aatcggaact gtagccactg 13380
gcctacccca gagccacagc aacgtgggat ctgagccgca tcttcgacct ataccacagc 13440
tcacaacaat gcgggatcct taacccactg agcaaggcca gggattgaac ctgcaacctc 13500
atggttccta gttggattag ttaaccactg agccacgacg ggaactccaa tggtatgtaa 13560
ttgtttatag tgatctctta tgagtcttta tttttctgta gtaatcataa cttctcttat 13620
ttcattttga tcttattgac ttgagccctc tgtttttttc ttagtgactc tagctaaagg 13680
tttatcaatt ttgttcattt ttttcaagga tctggctctt aatttcattc aacttttcta 13740
tttattttag tctctatttc atttacttct gttcagattt ttatgatttc tttctttcta 13800
ctaagttcag ttttggtttg ttcttttcta tttcctttaa gtgtaaggtt atgttgttta 13860
tttgagattt ttgtttcttg aggaaacagg cttgcatatt tgtaaacttc cctcttagaa 13920
tagtttttct taagttccat agtttttttt ttttattttg tggtttttat ttttccatta 13980
tagttcattt acagtgttct gccaattcct actatatagc aaagtgaccc agtcatatat 14040
atatgtatat atgtatatat acacatacat atacacatta tcctccatca tgttccatca 14100
caagtgactg gatacagttc cctgtgctat atagcaggat ctcattgctt atccactcca 14160
aatgtaatag tttgcatcta ttaaccccag atgtcccata gatttggaat tgtgtttttg 14220
ttttcattcg tattcaggtt ttttttaatt tcctctttga tttcttcagt aatccatttg 14280
ttgcttagta atatattgtt tagcctctgc gtgtttgtgg tttgttgcaa ttttcttctt 14340
gtagttgatt tctagtctct ttgtgttgta gttggaaaag atgtatgata tgatttcaac 14400
tttcctaaat ttaccaaggc ttgttttgtg gcctagcatg tgatatatcc tgaagaatgt 14460
tccatgtgca catgaaaaaa atgaatattc tgctgctttc aaatggaatg ctctctctat 14520
ttcaattatg tccatctcta atgttttggg aacatgttct tttgctacct cattttgcct 14580
aatttgctgt tttgggttct aaatatctgg taggttggtt acattttcca accttggaca 14640
aataaccttt tgttgaaaca tcctgtgctt cccagcagca cactcctctc tggtcaccag 14700
agctatatgt tccaggggtg cccccctatg ctgactttgt gagaacttct tttgcagttg 14760
gctgactact gtaggtggtc ttgtaggcat ggctggcccc cagtctggtt gtttgcaaga 14820
agctgccttg tacaaaggct gccagtcact tgttggtggg actgggtcat ggggtggctg 14880
gctatagaga ccagggttgt ctcaggggta gtgctgtctc atttgtgggt ttagccacgt 14940
tttgcagtgg gtgattgtgg ttccagggtt cctagatcta gtgtcagctt gtgggtactg 15000
gggtccccag ctgcagggcc taggagcttc agagctagag ctaacctcct ggtgggtaga 15060
ctgtgtcctg acaaggcagg ttgtagtgtt acagtgatcc tggggctagt atctatccac 15120
tggggggtaa gacttgtccc agggctagca ccagctctct ggtgggtaga tctaggtcct 15180
ggaggttctg gctgcagggc cagggatcca ggagctggtg ttgactggtt ggtggacagg 15240
gccaaggccc agagtgtccc caggctagat ctacttcagt gatgggtgga tctaggtcct 15300
gtatttctgg ctacagggct ctgggatccc agagttggta tgtcagtcaa ctgacataca 15360
gggctggagg cagagagtcc tgaggctggt gcctgcccac tggtgggtgg agctgggatt 15420
cagggtctct gactgaagtg ccctggggat ccctgggcta gtgctggccc actggtgtgt 15480
gtttggttgg gtcctggcca ttctggtaga cagggccata ttcccatatt ccagggtggc 15540
tgtaggctca gggaatctca aggcaaccta ctgctggtta gaggagtgtg tggggaggtg 15600
ctatgtccct gtccagtttg ttgcttggca tgaagcatcc cagtactggt gccaacaggc 15660
taattagtgg gtctgggtcc tggtgctaat aagctagagg gaagattcaa aaatgacatt 15720
tttttaacac cagtgtcctt gtggtaaaat gaactcccca gaatggctac caccagtgtc 15780
tatgtcccca tggtgaattc taattgctcc tgtctcttga agtggctctc caagatcaac 15840
aggtgggtct gatctaagct cctttcaaat tactgcttct gccctgggtc ccagaacatg 15900
tgagattttg tgtgtccttt aagagtggag tctctatttc ccactgctct ctggttctcc 15960
ccaaagtaag ccctgctggc tttcaaaact tctgggagct tgccttcttg gtataggact 16020
cctgggctag ggagtctaat gtttggctta gaccccttac tgcttgggaa gaatctctgc 16080
aactgtaatg aattatcttc ctatttgtgg gttgctgagg atatggtctt aactgttctg 16140
tgttctaccc ctcctatcca tcttgttgtg gttccttctt tatatcttta gttgtagaaa 16200
agtttttctt atcaacagtt gctctgtaaa ttgtaacttg ggtgtacacc tagtaggagg 16260
tgagctcagg gtcttcctac tctgccatct tggccatgtc ctctaaacat tttggtgtat 16320
ttcactgcaa cctttttaaa aatctcaaaa gtgagctgtg attggctagt cttgtggata 16380
atctctagca tttgatgcta atcatattta tacaaatact ttgttgaaaa gtgatgcctt 16440
tttaactatt attaaaaaac gtattgacat aactattgct attatactga aaagaaagac 16500
cttagagaaa atagcataag agcaaaacca ttaaacatgg agacatctag tcatagggtg 16560
gaaattttat gtggtgcata tcccctaacc agtggcttta caccaggcac atcctaacta 16620
agatctgctc ccaagtgtct tccctgatgc tttaaattgt gttacatgga aactatcctt 16680
tgatgaagaa atgcaacctt ttaaaataca acattgaaac ttttgtgctt taattttgct 16740
tttcaacatt ttttcttttt aaaagaagaa atttatttgt ttttttaaat tttaatggcc 16800
acggcatatg gaagttctca ggccagggat agaattcaag ccacaggtgc gacccatgcc 16860
acaactgctg caacaccaga tcctttaacc cactgcacca ggccagggat tgaagccttg 16920
ccttactgac aatctgagcc acttcagtca gataaagaaa tttcttcatt aagcagagta 16980
ttcacatggt ttaaacttca aaatattaaa gtgtaaactc tttccccacc actgtcccca 17040
gctcaccaac tctacttacc acagacaact gatgtggtta gggtatttaa atagtaaatc 17100
caagaaaata taaacaaatc cgtatatata ggtttcaccc cattttatta tcctaatgtt 17160
gcatatcata taaactatac tgtcccttgg gtattcactt agtaaaatat tttgatcata 17220
atttcctatc agtatttaaa gagctttctg aaattatttc tgtataacat ttcttttctc 17280
atcatctatt atgtgcattt atttatattt taacttcttt tattagatga aattatcttc 17340
tgcttcagct tttttttttt tttaagaaca cacagttggg ttttttaagg ttaataccac 17400
ctttgttttc taagtcatta aatttgtttt tctattaatt cacttctgat tctttgaagt 17460
ttgatttctt tttagctttt aacttcttga gttgtatgct taattaattt tgattctttc 17520
ctatttatta atatacatat ttgaagctat aggttttcca ctgagtatac cagtagctat 17580
atcgtataat tgatgaactg atcctctgtg agtctgggac ataaacgtcc tatgactgtt 17640
atgtggtagc tgtgaattgc tctttttaga ttataaagtt ctcatctttt atagttgaac 17700
aatttttgtc ctgaatcaaa tttgttggat attaatatca catctattgc tttatttatt 17760
ttctattctc acttttaacc tctgtgaata atttcactct aggtgcctca cttttttcat 17820
aatagaattg ggatttattt ttaaaaggac tctgattaag taattttctt tttctgatat 17880
gggagatata tttgacctta acttagtcac attatgcatt gttctcttgt catgttatgt 17940
atacataaca tttattgtca ttatggtaca actaaaaaca tatttcactc tgtgaccttt 18000
atggggactc agcatttgtt taggaatgtg gaagtatatt tgtatatctg ataatttcct 18060
tccaaattta aaaaggtttg tatattttca tattaacata tttcatatta attagcatga 18120
atttcagctg cattaaaagg aaaaccacct gagtggtaaa gaaaaagttt ttttttctct 18180
tttttttttt ttttttttta atggccacat ctgtggcatg tgaagttccc aggctagggg 18240
kcgaatagga gctacagctg ccagcttgca ccacagccac aacaatgcca gagccaagcc 18300
tcatctgcga cctataccac aactcatggc aatgctggtt ccttaacccc ctgagtgagg 18360
cctggggtca aacccacatc ctcatggata ctaaccggct ttgttaccgc tgagccatga 18420
gggaaactcc ctttttctca ttgaaaataa gtcaaataga taagcagctt aaggctgttt 18480
gggtgattct gtggtccagt aattatcaaa tcctactgga caagaataga gaatgtgcaa 18540
atgagggaac gtgttggtga gatcaggctc tgcccactga gctatcctct gtcatgggcc 18600
ctgtgctgtt ctcagagctg tacttcctag ggcattgttc tcatttcaat tctgagttca 18660
gtgtggagag tatacgtgtg tgggggctgc acgcttttca caacccactt tctgctgata 18720
ctgatttagg gatccttgga ttgctttaca gttgagtcat cattaactag tgtcacttgc 18780
cttcaaagtc agcaaaataa ttgtctccaa actagtaggc ttctagtgta tttgctttaa 18840
tccaatgcca tgtgaaagta acatggtcaa agaataagtt atataccttg acctaccctg 18900
tgaccaggct cttcctctta atttattgac cactgcctta aggtcatttg aaaccatggg 18960
tttgggagga aggcaaggcc taaatcccgt ctttgttgga aggctcactg tccttgtctt 19020
tagagcatca ttttttttta aactggggta cagtttattt acagtgttgt gtcaatttct 19080
gctgtacagc atagtgaccc agtcatacac atacatacat tctttttctc atactatctt 19140
caattttatt ttgtgctaag tctgccattt tatcatcacc tcagtttgaa ggacaggata 19200
tttagagttt gttttttttt tccccccaat cctgcaattt ctaaattata agactctcaa 19260
ttagccgtat ataacagctg caggcacagg atgtctccct cacaaaattg gtatttttcc 19320
ttccatttct tcttgcagtt tggctatttc ttgtctgagt tcatctctct ttttaagtgt 19380
taaaaagggc aaggaggatt catgctatgt caacattatg attttttctt ttctatactt 19440
gataagagta tacttttccc aaatgtcatc caacttttca gcatcagttt ggacatggtt 19500
ttcttttcaa ggtggtattt ctctaatgtc acttgaataa caagactcgt tagttctcca 19560
ggctacaata tcctagtctg agtatattct gcatgttaat tctattcagc cacatccata 19620
atttaggttt tattcctgga acacctcact tttttttttt ttttggtctt tttatagcca 19680
taaccatggc atatggaggt tcccaggcta ggggtctaat ctgagcttta gccactggcc 19740
catgccacag ccacagccat gccacatctg agccacatct gtgacctttt ccacagctca 19800
cagaaacacc agatccctaa cccactgagt gaggccaggg gtcaaacctg taacctcatg 19860
gttcctagtc agattcgttt cctctgtacc acgatgggaa ttcctaatac ctcacttatg 19920
ataacacatt ctgaattatt taggattcta ttatactgca tgtaatagaa atcccaaata 19980
gcaaaatttg caacttaagg caggttcctg tctttacaaa atcatgtttt cctttgctat 20040
atgtgcactt tgctttcctc tgtgaattcc cttttttgtt atatttctat agcttttgga 20100
aacactttta cttatttggg ggggcctaga tttttaaccc tctccttgtt tttctagaaa 20160
tagagtttat aattttattt cttcatttac ttgatacttt caagagattt ccaggaaaaa 20220
aattatggaa atactgtctc tgtgcctgcc aagttcaaac taagaattgt ataatctgtt 20280
ttaattctta agcatttata gatgacaagg ctttgtgtct gataggggcc agcgaactca 20340
gtaaagaggg aagatgagaa agataatggc aagaatttat ccctgaagtg tagttttgac 20400
aaaccagtca caaagaggtc taagaaattt tggtcacaaa gttgttttga atcccaggca 20460
ttttatttgc aatgattgca tatgttctgg aaaggacatc tgaacctaag aaatagttca 20520
tttgcattgt gttatatttt actaaggtct gagaaataat cttgagatga gaatgaactc 20580
tacttcttca gagtctggaa ggaataaatt atgaaaatgt attaatgctt ctttaaacca 20640
tattgtatat ttatctatta ctaaacaaaa agaagtagct ctatttattt atttatttat 20700
ttatttattt atgtcttttg tctctttagg gccacacctg tggcatatgg aggttcccag 20760
gctagaggtc caattggaga tgtagcagcc agcctatgcc agagccaccg caacacggga 20820
tctgagccac gtctgtgact tacaccacag ctcacagcaa cgcctgatcc tcaacccact 20880
gagcgaggcc agggatcgaa cccatgtcct catggatgct agttgggttc attaactgct 20940
gagccatgat gggaactcca aattaattat ttcttatatt tgttcttcat atattcattt 21000
ctatagaaag aaataaatac agattcagtt aatgatggca ggtaaaagct taacttatta 21060
atcaaaggag ttaatccagg cacaaaaatt caattcatgg ctctctgtta aaatttaggt 21120
ataggtttag caggaagaaa aggttagtag atgcagacta ttacatttag aatggatgga 21180
caatgaagtc ctactataca gcacagggaa ctatatccaa tctcttggga tagaatatga 21240
tggaagacaa aatcagaaca agagagtata tatatatgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 21300
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg actgggtcac cctgcggcac agcagaaatt ggcagaacat 21360
tgtaaatcaa ctatacttta ataggaaaaa tacttttaag ggctaaattt ccaatattct 21420
aaccatgtac acagagtaaa tgtcataagg atgccagtct gtgtagagat tgatgtgtta 21480
ctagcagatt catgaaataa aggctgagga tgtagtcccc aagtcacttc tgagtggaag 21540
aatttctcct ttgtcctgga ctcaaatatt ttaggataaa ggaaaaaaga agatatttat 21600
agaagggact tgttttcaag tacttgacaa aatttcacca ttaaagagaa atttgtggga 21660
gttcccatcg tggctcagtg gaaacaaatc caactaggaa ccatgaggtt gtgggtttga 21720
tccctggcct cactcagtgg gttaaggatc cggtgttgcc gtgagctgtg gtgtaggttg 21780
cagacacggt tctgatcctg cgttgctgtg gctgtggctg tggtgtaggc cagcagcaaa 21840
cagctctgat tagaccccta gcctggaaac ctccatatgc cacaggtgca gccctaaaaa 21900
gacaaaaaaa gagaaaagac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaan 21960
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 22020
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gaaccaccag aggtatttat 22080
ttgtttttgc cttttttcac tgactgtttt ttgtttgttt gtttgagact gatctagaag 22140
actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt cattccaagg 22200
tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga gtatttagtg 22260
agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg gaattttcct 22320
tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt tccatcctgg 22380
gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt gctgccctgg 22440
ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa cctccatgtg 22500
ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaaattaa atcaaggact caagagtctt 22560
tcattatttg tgttgtggaa gctatatttg ttttaaagtc ttagttgtgt ttagaaagca 22620
agatgttctt caactcaaat ttgggaggga acttgtttca tacattttta atggataagt 22680
ggcaaaattt tcatgctgag gtgatctata gtgttgtaat gcagaatata gtcagatctt 22740
gaacatttta ggaagttggt gagggccaat tgtgtatctg tgccatgctg ataagaatgt 22800
caagggatca caagaattcg tgttatttga cagcagtcat ctttaaaagg catttgagaa 22860
agtccaattt caaatgcatt tcctttcttt aaaagataaa ttgaagaaaa taagtcttta 22920
tttcccaagt aaattgaatt gcctctcagt ctgttaaaag aaactcttac cttgatgatt 22980
gcgctcttaa cctggcaaag attgtcttta aaatctgagc tccatgtctt ctgctttatt 23040
tctggtgtgc ctttgactcc agattacagt aaatggagga ctgagtatag ggctaaaaag 23100
tagagagaat ggatgcatat tatctgtggt ctccaatgtg atgaatgaag taggcaaata 23160
ctcaaaggaa agagaaagca tgctccaaga attatgggtt ccagaaggca aagtcccaga 23220
attgtctcca gggaaggaca gggaggtcta gaatcggcta agcccactgt aggcagaaaa 23280
accaagaggc atgaatggct tccctttctc acttttcact ctctggctta ctcctatcat 23340
gaaggaaaat attggaatca tattctccct caccgaaatg ctatttttca gcccacagga 23400
aacccaggct ggttggaggg gacattccct gctctggtcg tgttgaagta caacatggag 23460
acacgtgggg caccgtctgt gattctgact tctctctgga ggcggccagc gtgctgtgca 23520
gggaactaca gtgcggcact gtggtttccc tcctgggggg agctcacttt ggagaaggaa 23580
gtggacagat ctgggctgaa gaattccagt gtgaggggca cgagtcccac ctttcactct 23640
gcccagtagc accccgccct gacgggacat gtagccacag cagggacgtc ggcgtagtct 23700
gctcaagtga gacccaggga atgtgttcac tttgttccca tgccatgaag agggtagggt 23760
taggtagtca cagacatctt tttaaagccc tgtctccttc caggatacac acaaatccgc 23820
ttggtgaatg gcaagacccc atgtgaagga agagtggagc tcaacattct tgggtcctgg 23880
gggtccctct gcaactctca ctgggacatg gaagatgccc atgttttatg ccagcagctt 23940
aaatgtggag ttgccctttc tatcccggga ggagcacctt ttgggaaagg aagtgagcag 24000
gtctggaggc acatgtttca ctgcactggg actgagaagc acatgggaga ttgttccgtc 24060
actgctctgg gcgcatcact ctgttcttca gggcaagtgg cctctgtaat ctgctcaggt 24120
aagagaataa gggcagccag tgatgagcca ctcatgacgg tgccttaaga gtgggtgtac 24180
ctaggagttc ccattgtggc tcagtggtaa caaactcgac tggtatccat gagggtatgg 24240
gtttgatccc tggccttgct caatgggtta aggatccagc attgctgtga gctgtggtat 24300
aggttgcaga ctctgctcag gtcccatgtt gctgtgattg tggtgtaggc tgactgttgc 24360
agcttcaatt tgacccctag cccgggaatt tccataggcc acacgtgcag cactaaggaa 24420
ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagagtgg gtgtgcctat agtgaagaac agatgtaaaa 24480
gggaagtgaa agggattccc ccattctgag ggattgtgag aagtgtgcca gaatattaac 24540
ttcatttgac ttgttacagg gaaagtaaac ttgactttca cggacctcct agttacctgg 24600
tgcttactat atgtcttctc agagtacctg attcattccc agcctggttg acccatcccc 24660
ctatctctat ggctatgttt atccagagca catctatcta acactccagc tgatcttcct 24720
gacacagctg tggcaaccct ggatccttta accaactgtg ccaggctgga gatcaaacct 24780
aagcctctgc agcaacccaa gctgctgcag tcagattttt aaccccctgt gccactgtgg 24840
gtatctccga tattttgtat cttctgtgac tgagtggttt gctgtttgca gggaaccaga 24900
gtcagacact atccccgtgc aattcatcat cctcggaccc atcaagctct attatttcag 24960
aagaaaatgg tgttgcctgc ataggtgaga atcagtgacc aacctatgaa aatgatctca 25020
atcctctgaa atgcatttta ttcatgtttt atttcctctt tgcagggagt ggtcaacttc 25080
gcctggtcga tggaggtggt cgttgtgctg ggagagtaga ggtctatcat gagggctcct 25140
ggggcaccat ctgtgatgac agctgggacc tgaatgatgc ccatgtggtg tgcaaacagc 25200
tgagctgtgg atgggccatt aatgccactg gttctgctca ttttggggaa ggaacagggc 25260
ccatttggct ggatgagata aactgtaatg gaaaagaatc tcatatttgg caatgccact 25320
cacatggttg ggggcggcac aattgcaggc ataaggagga tgcaggagtc atctgctcgg 25380
gtaagttctg cacatcactt cgggttacaa tgatttaaga aacaactaag gtggggcaaa 25440
gggtagtgag gcatatccat cagagcaaat tccttgaaat acggactcag aggaaaccat 25500
tgtgagattg aggttcccag aggtgtggat ttaatgaatt agtgttacct catgtacaag 25560
gtagtatact accagaaaga taaaaattca gaagcgagtt tgcagcaaaa ctcataggga 25620
gaacttcttt tataaataat atgaagctgg atatttagtg caccacctga tgaccacttt 25680
attaataaat aaagagttcc tgttgtggcg cagcggaaat gaatccgaca aataatcatg 25740
agtttgcggg tttgatccct gacctcgctc agtgggttgg ggatctggtg ttgccatgag 25800
ctgtggtgta ggtcgcagat gctgcttgga tcccgctttg ctgtggctgt ggtatagtct 25860
tgtggctaca gctccgattt gaccgctagc ctgggaacct ccatatgctg cgggggtggc 25920
cctcaaaagc aaaataaata aataagtaaa taaataagta gtttaaaaag gacaagaaga 25980
aatatatttg gtattatatt ctacagagac aaagataatc accatgcccg attgattttt 26040
caaggcatat aaatgagacg tcatgggagc aaaaatggtc ataatacaat gcccttgttt 26100
tgtgtacatg gtaagatttt agaaagcatt gtgaagtaga aaagtgtact cagttataat 26160
atattggaga aaacagtact atgagaagta aaaaaatcta catgccggaa tttatttttt 26220
taatgtctct ttagagtcgc acatgcggca tgtggaggtt cccaggctag gggtcgaatc 26280
agagctatag ccactggctt atggcacagc cacaacaacg ctagatctga gccacatcag 26340
agacctatac tatagctcat ggcaatgcca gatccttaac ctactgagcc aagccatggg 26400
tcaaatccag gtcctcatgg atcctaggca aattcatttc tgctgagcca cgaagggaac 26460
tcctcagaag tgattttgat gttactttct tttcatgaca aatctggtaa agtacataca 26520
catagaaact gaagtgtcag aaagggaaat atttcatttt aaggtaatgt atacaaaaca 26580
gtggttttac catctgagta tcttgctaaa ttttaactat caaggacaat tgccaaaaaa 26640
aaaaaaaaaa gagagagaga gagaacagaa tagggttatg aagctaaaat cacagggtta 26700
tgaagctaaa atcacagtaa tttagggaga aaaaaatcca aagcatgtaa ttgataaaag 26760
gctctgagcc tttgtttgag atttagaatt caacttggaa ataccggtgg tattttaaag 26820
cagtccataa gtataaaatc caaggctaaa aagccagaag gtatttgtag aacaaatata 26880
ttttaataag ctctaccaag tcatccagaa gctactaaag aattactggt cactgacata 26940
gtgtacctgt tttcaaggcc attcttacat cagaataaag ggagagcacc ctctgaatct 27000
tcagaaaaga tgtgaaagtg ctaattctct atttcatccc agagttcatg tctctcagac 27060
tgatcagtga aaacagcaga gagacctgtg cagggcgcct ggaagttttt tacaacggag 27120
cttggggcag cgttggcagg aatagcatgt ctccagccac agtgggggtg gtatgcaggc 27180
agctgggctg tgcagacaga ggggacatca gccctgcatc ttcagacaag acagtgtcca 27240
ggcacatgtg ggtggacaat gttcagtgtc ctaaaggacc tgacacccta tggcagtgcc 27300
catcatctcc atggaagaag agactggcca gcccctcaga ggagacatgg atcacatgtg 27360
ccagtgagta tccattcttt agcgccactg ttatcttctg atctacctaa gcagaagtgt 27420
tataaccttt agataatccc tattctacct ggatgatgag attcattctc tttaatttgg 27480
tgtgcaggta ttcaggatca gtgatcattt tcccaaagac catcatgctc tgatggtctt 27540
ctcaaaagtt ctaatcagtt gcttcctccg tgaacagttg aggagcagag aatatgtaat 27600
tcagaatttg actattgaat catcccattt ttctttcaca tagtcttttg ttgcactgag 27660
tataaggaga gaagcagtca gaaagatcaa tcctgaatta tttctccatt ctacatctgt 27720
tttaaatttc aaaaaaaatt gttataggtg atttacaatg tctgtcaatt tctgctctac 27780
agcaaagtga cccagttatt tacatataca ttctttttct catattttta aaccgggaga 27840
tttctatcca cctggcagtt tgagggaatt taacattatg catttatgtt aactttattc 27900
acctgatgtt ttctaagtca tactgagatt cttatgtcca ggatggaata cacctggttt 27960
gctggaaaga catgtgcttt cataaagatg aattttggaa aaaatataaa atttaaaagt 28020
cccattaaat aagcaaagtt ttaagagatt tcaaaaaaaa tttcatctct ctcttttcct 28080
ctttgacctc ttgggcacgt tcatcttctc aaatatgatc ttggtgtttc tgacttttca 28140
gacaaaataa gacttcaaga aggaaacact aattgttctg gacgtgtgga gatctggtac 28200
ggaggttcct ggggcactgt gtgtgacgac tcctgggacc ttgaagatgc tcaggtggtg 28260
tgccgacagc tgggctgtgg ctcagctttg gaggcaggaa aagaggccgc atttggccag 28320
gggactgggc ccatatggct caatgaagtg aagtgcaagg ggaatgaaac ctccttgtgg 28380
gattgtcctg ccagatcctg gggccacagt gactgtggac acaaggagga tgctgctgtg 28440
acgtgctcag gtgagggcag agagtctgga ttgagcttgg aagctctggc agcaaagaga 28500
gggtgggcgg tgacctgcat tgggtaaaga ttggaaggtc cagcctaagg atctggtggt 28560
ggggggagac atgatgtttc agtctgaaga atgatgaaaa cctgtgttgt tacgcatggg 28620
ccttcaccga ggaaaggaac ataacttaca tgtatcctcc tgcagaggga ggaagaacta 28680
ggggattcta gttttgtgtg ggaaggagca gtttacttgg ttcaggaggc actaaaggct 28740
cagataggaa acagagatct gttccattct tactcccaga actgattctc ttctcttttc 28800
tcctacagaa attgcaaaga gccgagaatc cctacatgcc acaggtatat aaaaaagttt 28860
aagaacatgg gacccattgt ctgcattttg tggaatccct cttattaaga cattctgggt 28920
cagaagttct gaggatttga catttacttc agctatctgt tatcttaccc aagagaggga 28980
tggtaactag gaacccaggt cttttagcta agacattatc acctcttgtg atgtttactt 29040
gttctcaggt cgctcatctt ttgttgcact tgcaatcttt ggggtcattc tgttggcctg 29100
tctcatcgca ttcctcattt ggactcagaa gcgaagacag aggcagcggc tctcaggtct 29160
gaacaaaatt acggtctctc taatgtttct atgggataag aagcctctct ggataataaa 29220
acaaaaaaat tacattcaag tatcagttgg ccagaaagag ggaacctaga agaggtttaa 29280
gcagtttctc cgaaacaggg aacaagaatt cagagaagaa aaggcacatt ggctgtactg 29340
atgatacctg cactcgctat gtatgtttaa tgggggacag tagagaattg atagtttaga 29400
aggagtatgc ttatatggtt ctggatgaat cctgtatccc cccaaacatt tattttctct 29460
tactatatac ttattactaa tttaactctt ctgtcaagcc gtgtgctagg ttctgaagat 29520
ggttcagact tggatactca agtgcttttg ttttcatgga atttccagtt tagtggaaga 29580
gataaatatg taaacaaata aattgcaatg ttttattata cattcgtgtg aataaggaac 29640
aaaggaggca cagagaataa agtaattact gaaaggggaa ggggagtatc agagacttct 29700
aagtttggag gcagattttg aagacagaaa tcaaagtact gggtaagatg catttcagga 29760
aagaagaaaa atatgtacac gtgtagagaa gcttaaaaga gggcacattt gttgttttgg 29820
aggggagtac aagttgagtt aaagagagaa gtttctgtta aggctgaaga atagggaaga 29880
tacacgtagc gatgctctgt gttgcatgat aagaagagtc ggagttatta aagagtatga 29940
gataggggag tgagataggc aggcaggtcc ttagaaagtt ctgtttggaa atgggatgtc 30000
ggaggggttg aaagagaacc atatattgac aaggagagca ttttgaagta gttgtgatga 30060
aagataaaat ggactttata gtgagaatgg ctgggaaagg atagatttta tacaaatctc 30120
caatgaatta cagaagaatg ctacctgtct ttggggaaga aacagggtta tccgatggca 30180
tcctgttgcg tttgagttcg tgacatcatg agggaaaggc ttggcagcgt ttactcggta 30240
ctgtgtggta acttatatgg aaaaaaatat gagaaggaat gagtgtgtgt ataactaatt 30300
tacttagctg tatgcctgaa attaatacaa ttttataagt caactctact ccaataaaac 30360
aaacaaataa ataaataatt ttaactacct gaacaaaaaa aaaagaatgg actggagaca 30420
agtcaaaagt atggatgatg actacgttat gcttgcactg ctggggaaaa gcacacatag 30480
ggagggaacg ttttattatg acccagtccc taacctatga cctctgttat cagttttctc 30540
aggaggagag aattctgtcc atcaaattca ataccgggag atgaattctt gcctgaaagc 30600
agatgaaacg gatatgctaa atccctcagg tccgtgggtt ctttgagggc ctgtagccct 30660
ggggttcaga tcagcagctg cagttgaggt tgaggcatgc tactttgcac agcagtagaa 30720
agaaatctca actgtaatag gaagcttggg atgcatatga ggaagaaagg caagaatgaa 30780
ccacaaatta ttcttaggga agataaaaat tgcagtcatg gggagacctc tggctgagag 30840
ggccgtgatt atttctgaca gagggattat ggagtagaat atgatggctt ggaccttttt 30900
tcactaaaac aagtcagtct tctcaaaggt agtttagctt ttcatatatc tttctcagtt 30960
tcttccattc ccatttcctg ccattttcct ttctctaact tttatttatt atattttttc 31020
ctaaaagttt aaattttcta tatctttatc ccttcagaag ccatccctag tcacaggact 31080
agttttattt cccattatgt aatgcttctt tctctgtctg ttgacttcta tttagaacca 31140
gtgcactaaa tctgcctcta ggaacatacc tctgctaggt tgcaagaaat atcccattcc 31200
ccactcactc tgtgaagact caatgcttct caatattcct tacctcctga gagggacttg 31260
cctcacttct ttaatccaag ggactcgatt tttgccaaaa ctaagtcagg aaaacctaca 31320
taagacatag gaaagacttg ctgtgcttct taaaccccac tgtttgtttt cctaattgtg 31380
aacagtattt ttaaagttca aagagcttct aaggcacttg aggggagatc tgatttattt 31440
cccagtaatt attttattcc tttcagaaaa ttccaatgaa taagatggtt ttaatgatgt 31500
gggactaatt tttgtgtcta aatctcttcc tatttctgga tgaaaaaaag gagaccactc 31560
tgaagtacaa tgaaaaggaa aatgggaatt ataacctggt gaggtgagta aaaagaattt 31620
attcatcatt gctgaaaaca ggtacattcc ttttgaaagt tgggaactcc tctggtatta 31680
gaaaaaaaaa aaagaacgta tatacacata tatttccatg tctatgttta tgtttgtaaa 31740
tccatattca gaatatgcaa caacttttta taactatgac ttcagtccat cttttagtta 31800
catatatatt ctaaacaaca actattgcta agagaagctg ggtaagtaaa tgtgaataaa 31860
tcttctaaag atattacagg aagttcctgc tgcggctcag tgggttaagg acttgatgtc 31920
tttgtgaaga tgagggctcg agccctggcc tcactcagtg agttaaggat ctagcattgc 31980
tgtaagctgc agcgtaggtt gcagatgggg ctcagatcca gtgttgctgt ggctgtggcc 32040
tcagttgcag ctctgattca acccttaggc gaggaacttc catatgcagc aaatgtggcc 32100
attaaaaaaa aacaaaaaac attataggag tcatttcata aaagagataa gacgtttcta 32160
tagttatata gtgcatactc tggtaaagat agtataggat actataggaa tatagaaagc 32220
ttgcctatga aaatttggga agattgtgga aaagacatct caaaatatgg catagaaaag 32280
aatcatatct ttgaggaaca gtaagttttt cattcaaaac cgtgtattga acatacttat 32340
ggtgacaaat ggtgtcttga gtactaaaaa ttcagtgata aaagatgctc ttgacaaaga 32400
catggctgtt gaatagaagg tctcactgtc aatgtgtggg aattatggac agcctatgtg 32460
gacacaggga atagatgaga ctctaggctg gaaggctgca ttgagcccag taatgaatgg 32520
tcctgtctga tatatttcat gctcatattt tattttaggg actattgggg aggtggtggg 32580
ctttggaaga ttaagctgag gcaagacaca atcagattgc cttttataat ttactttcag 32640
gaggaaaatc taactaaaga aaaaaagtga ataaggcaag aaacataagt tatacatcaa 32700
aaagaaaagg tagtggagtt cctgttgtgg ctcagtggtt aatgaaccct gctaggaacc 32760
atgaggttgt gggttcgatc cctggccttg ctcagtgggt taaggatcca gcgatgccat 32820
gagttgtggt gtaggtcgca gaccgtggct tgggtcccgc attgctgtgg ctatggtgtt 32880
ggctggcagc tgcagacagc tctgatta 32908
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 2
His Arg Lys Pro Arg Leu Val Gly Gly Asp Ile Pro Cys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Val Glu Val Gln His Gly Asp Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Ser Asp
20 25 30
Phe Ser Leu Glu Ala Ala Ser Val Leu Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly
35 40 45
Thr Val Val Ser Leu Leu Gly Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly
50 55 60
Gln Ile Trp Ala Glu Glu Phe Gln Cys Glu Gly His Glu Ser His Leu
65 70 75 80
Ser Leu Cys Pro Val Ala Pro Arg Pro Asp Gly Thr Cys Ser His Ser
85 90 95
Arg Asp Val Gly Val Val Cys Ser
100
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 3
aatgctattt ttcagcccac aggaaaccca gg 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified splice acceptor site
<400> 4
aatgctattt ttcggccatg gggaaaccca gg 32
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgSL25
<400> 5
tgaaaaatag catttcggtg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 6
caccgaaatg ctatttttca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgSL26
<400> 7
gaatcggcta agcccactgt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 8
gaatcggcta agcccactgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgSL27
<400> 9
gtcctccatt tactgtaatc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 10
gattacagta aatggaggac 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgSL28
<400> 11
cccatgccat gaagagggta 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA 1
<400> 12
aaccagcctg ggtttcctgt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA 2
<400> 13
caaccagcct gggtttcctg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 14
acaggaaacc caggctggtt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 15
caggaaaccc aggctggttg 20
<210> 16
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HDR template
<400> 16
gaaggaaaat attggaatca tattctccct caccgaaatg ctatttttcg gccatgggga 60
aacccaggct ggttggaggg gacattccct gctctggtc 99
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oSL46
<400> 17
accttgatga ttgcgctctt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oSL47
<400> 18
tgtcccagtg agagttgcag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer oSL6
<400> 19
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer P0083
<400> 20
atggatctga tttagagatg aggc 24
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer P0084
<400> 21
ctatgcaggc aacaccattt tct 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer P0074
<400> 22
catggacacg agtctgctct 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer P0075
<400> 23
gctgcctcca cctttaagtc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer P0081
<400> 24
ccctggagaa gagctacgag 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer P0082
<400> 25
aaggtagttt cgtggatgcc 20
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer H2 fwd
<400> 26
gatgacrtcc ggcayc 16
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer H2 rev
<400> 27
cagttcctgc gccttgat 18
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H2 Probe
<400> 28
tgcaatcgat ccagacggct t 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SU1-Bel fwd
<400> 29
tctttgtttg caatcgatcc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SU1-Bel rev
<400> 30
ggcgcactgt atgactgact 20
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SU1-Bel probe
<400> 31
ccggaactgc gctttca 17
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer DAI fwd
<400> 32
ggatactatc acgggcggta 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer DAI rev
<400> 33
ggcacgccat acaattctta 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer P0239
<400> 34
tacatgggtg acctgtctgg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer P0240
<400> 35
acagctgctt gaacttggtg 20
<210> 36
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Edited CD163 gene sequence
<400> 36
attgtctcca gggaaggaca gggaggtcta gaatcggcta agcccacgta gggttaggta 60
gtca 64

Claims (44)

1.一种基因编辑的猪，所述猪包括编辑的基因组，其中所述编辑导致SRCR5区从由所述猪产生的CD163蛋白质中删除。
2.根据权利要求1所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述猪包括导致SRCR5从由所述猪产生的CD163蛋白质中删除的编辑的基因组，其中CD163蛋白质的所有其它区存在，并且它们的氨基酸序列未改变。
3.根据权利要求1或2所述的基因编辑的猪，其特征在于，由基因编辑的猪产生的所述CD163蛋白质保持大部分功能性。
4.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述CD163蛋白质缺乏下列氨基酸序列：
HRKPRLVGGDIPCSGRVEVQHGDTWGTVCDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSLLGGAHFGEGSGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPDGTCSHSRDVGVVCS(SEQ ID NO:2)。
5.根据权利要求4所述的基因编辑的猪，其特征在于，由所述基因编辑的猪产生的所述CD163蛋白质对于野生型氨基酸序列没有进一步改变。
6.根据任一前述权利要求的基因编辑的猪，其特征在于，对于基因编辑所述猪为纯合的或双等位基因的，所述基因编辑导致SRCR5区从由动物产生的CD163蛋白质中删除。
7.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，动物的所有细胞包括编辑的基因组。
8.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述猪的基因组被编辑为使得来自编辑的CD163基因产生的成熟mRNA中，没有编码SRCR5的序列。
9.根据任一前述权利要求的基因编辑的猪，其特征在于，所述猪包括编辑的基因组，其中删除了CD163基因的外显子7。
10.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，位于所述CD163的外显子7的5’端的所述剪接受体位点失活。
11.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，相对野生型序列，CD163基因的外显子1至6和8至16未改变。
12.根据权利要求11所述的基因编辑的猪，其特征在于，外显子7、以及外显子7旁侧的内含子6和7的部分从CD163基因中删除，但是在CD163基因的剩余区域中没有其它变化。
13.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述编辑的基因编辑为在内含子6的剪接位点供体序列和在内含子7的剪接位点受体位点未改变，并保持功能性。
14.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述基因组编辑为使得CD163基因区域的至少一部分区域删除，参照SEQ ID NO:1，所述至少一部分区域从位置10466延伸至23782。
15.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，参照序列号:1，所述基因组编辑为从位置1到位置10465的区域、以及从位置23783到位置32908的区域未改变。
16.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述基因组编辑为使得外显子7连同从外显子7的5’端的5’延伸的多达5000个碱基一起删除，适当地多达2000个碱基，适当地多达1000个碱基，适当地多达500个碱基，适当地多达300个碱基，或适当地多达100个碱基。
17.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述基因组编辑为使得外显子7连同从外显子7的3’端的3’延伸的多达75个碱基一起删除。
18.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述基因组编辑为使得编辑的基因组包括下列区域的删除：
a)参照SEQ ID NO:1，从大约位置23060延伸至大约位置23760,例如从位置23065延伸至位置23753；
b)参照SEQ ID NO:1，从大约位置23260延伸至大约位置23760,例如从位置23268延伸至位置23753；或者
c)参照SEQ ID NO:1，从大约位置23370延伸至大约位置23760,例如从位置23374延伸至位置23753。
19.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述编辑的基因组包括插入的序列。
20.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述基因组编辑为，参照SEQ ID NO:1，从位置23378延伸至位置23416的区域进行编辑，使得内含子6中的剪接受体位点失活。
21.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，内含子6中的所述剪接受体位点部分或全部删除，或它们的序列以任何其他适合的方式改变，如此使得不再有功能性。
22.根据权利要求20或21所述的基因编辑的猪，其特征在于，所述剪接受体位点编辑为使得序列从AATGCTATTTTTCAGCCCACAGGAAACCCAGG(SEQ ID NO:3)变化成AATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGG(SEQ ID NO:4),其中所述序列的改变用小写字母示出。
23.根据任一前述权利要求所述的基因编辑的猪，其特征在于，相对于野生型猪，所述基因编辑的猪对PRRSV感染具有改进的耐受性和抗性，优选地所述动物对PRRS感染具有抗性。
24.一种基因编辑的猪的细胞或胚胎，其中所述编辑导致SRCR5区从由所述猪的细胞或胚胎产生的CD163蛋白质中删除。
25.一种生产基因编辑的猪的方法，所述方法包括下列步骤：
a)提供猪的细胞；
b)编辑所述细胞的基因组，以产生基因组改性，所述基因组改性导致SRCR5从所述CD163蛋白质中删除；并且
c)从所述细胞生成动物。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，导致SRCR5从所述CD163蛋白质中删除的所述基因组改性为使外显子7从所述CD163基因中删除，或使得CD163基因的内含子6中的剪接受体位点失活。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，所述猪的细胞为体细胞、配子、生殖细胞、配子母细胞、干细胞(例如全能干细胞或多能干细胞)或受精卵。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，所述猪的细胞为单细胞受精卵，并在受精卵处于单细胞阶段，至少开始所述方法的步骤b)，优选完成所述方法的步骤b)。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，包括：
-向细胞引入位点特异性的核酸酶，所述位点特异性的核酸酶靶向CD163基因中的适当的靶序列；
-在适当的条件下孵化所述细胞，使所述位点特异性的核酸酶在DNA上或靠近所述靶向序列作用；以及
-由此诱导在CD163基因上进行编辑，所述编辑导致SRCR5从所述CD163蛋白质中的删除。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，将SRCR5从所述CD163蛋白质中删除的所述编辑可为外显子7从所述CD163基因中的删除或CD163基因的内含子6中剪接受体位点的失活。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其特征在于，步骤b)包括将位点特异性的核酸酶引入至细胞，并靶向至CD163基因的外显子7旁侧的靶位点，以便在外显子7的任一侧诱导双链DNA切割，由此引起所述外显子7的删除。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，一个靶位点在内含子6中，所述切割位点为外显子6的3’端处的剪接供体位点的3’，另一靶位点在内含子7中，所述切割位点为外显子8的5’处的剪接受体位点的5’。
33.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其特征在于，步骤b)包括将上游的位点特异性的核酸酶引入至细胞中，所述上游的位点特异性的核酸酶靶向CD163的外显子7上游的靶位点；以及引入下游的位点特异性的核酸酶至细胞中，所述下游的位点特异性的核酸酶靶向CD163的外显子7下游的靶位点。
34.根据权利要求29或30中任一项所述的方法，其特征在于，步骤b)包括引入位点特异性的核酸酶，所述位点特异性的核酸酶靶向内含子6中的剪接受体位点。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)，靶向内含子6中剪接受体位点的所述位点特异性的核酸酶在期望的切割位点产生单个双链切割，以使与外显子7相关的剪接受体位点失活。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，包括提供HDR模板，优选地，所述HDR模板具有下列序列：
GAAGGAAAATATTGGAATCATATTCTCCCTCACCGAAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGGGACATTCCCTGCTCTGGTC SEQ ID NO:16),其中小写字母表示与未改变的序列相比的产生的变化。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的方法，其特征在于，所述位点特异性的核酸酶包括至少一个锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA导向的CRISPR/Cas核酸酶(CRISPR/Cas)或大范围核酸酶。
38.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，包括下列步骤：
-提供猪的受精卵；
-将位点特异性的核酸酶引入至所述受精卵中，所述位点特异性的核酸酶靶向CD163基因中适当的靶序列；
-在适当的条件下孵化所述受精卵，使所述位点特异性的核酸酶在DNA上或靠近所述靶序列作用，由此诱导在CD163基因上进行编辑活动，所述编辑活动导致SRCR5从所述CD163蛋白质中的删除；以及
-从所述基因编辑的受精卵生成动物。
39.根据权利要求25至38中任一项所述的方法，其特征在于，包括表征已发生的基因编辑。
40.一种生产基因编辑的猪的细胞或胚胎的方法，所述方法包括下列步骤：
-提供猪的细胞或受精卵；
-在所述受精卵中编辑细胞或多个细胞的基因组，以形成基因编辑，所述基因编辑导致SRCR5从所述CD163蛋白质中的删除。
41.一种改性猪以增强它对PRRSV的抗性或耐受性的方法，包括编辑猪的细胞的基因组，以形成改性，所述改性导致SRCR5区从所述CD163蛋白质中的删除。
42.根据权利要求25-41中任一项所述的方法产生的动物、细胞或胚胎，或一种动物，所述动物为根据权利要求25-39或41产生的动物的后代。
43.一种猪或猪的细胞，携带有或表达删除了SRCR5区的CD163蛋白质。
44.一种根据权利要求43所述的细胞，所述细胞为外周血单核细胞来源的巨噬细胞(PMM)或肺泡巨噬细胞(PAM)。
CN201780064104.0A 2016-10-17 2017-10-17 包含改性cd163的猪及相关方法 Pending CN109862786A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1617559.8 2016-10-17
GBGB1617559.8A GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-10-17 Swine comprising modified cd163 and associated methods
PCT/EP2017/076460 WO2018073237A1 (en) 2016-10-17 2017-10-17 Swine comprising modified cd163 and associated methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109862786A true CN109862786A (zh) 2019-06-07

Family

ID=57680765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780064104.0A Pending CN109862786A (zh) 2016-10-17 2017-10-17 包含改性cd163的猪及相关方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20200045945A1 (zh)
EP (1) EP3525581A1 (zh)
JP (1) JP2019533445A (zh)
KR (1) KR20190067212A (zh)
CN (1) CN109862786A (zh)
AU (1) AU2017344936A1 (zh)
CA (1) CA3037451A1 (zh)
GB (1) GB201617559D0 (zh)
MX (1) MX2019004464A (zh)
PH (1) PH12019500624A1 (zh)
RU (1) RU2019110035A (zh)
WO (1) WO2018073237A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753832A (zh) * 2018-04-20 2018-11-06 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法
CN108823248A (zh) * 2018-04-20 2018-11-16 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法
CN110438155A (zh) * 2019-08-15 2019-11-12 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 修饰cd163基因第561位氨基酸的组合物、应用、细胞及基因编辑猪的制备方法
CN112094866A (zh) * 2020-11-10 2020-12-18 北京首农未来生物科技有限公司 一种利用SpRY-Cas9系统制备CD163基因编辑猪的方法
CN113151291A (zh) * 2020-05-05 2021-07-23 吉纳斯公司 通过对cd163靶向灭活来改善猪类健康的方法
CN113512534A (zh) * 2020-09-23 2021-10-19 杭州启函生物科技有限公司 用于遗传修饰和靶向的组合物和方法
CN115989030A (zh) * 2020-05-29 2023-04-18 康涅狄格大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制剂

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020198541A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Recombinetics, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) resistant swine
US11240997B2 (en) * 2019-04-09 2022-02-08 Shandong Landsee Genetics Co., Ltd. Method for preparing porcine fibroblasts with both CD163 gene and CD13 gene being knocked-out
CN114774468B (zh) * 2022-04-20 2022-12-20 温氏食品集团股份有限公司 一种等位基因分子标记及抗蓝耳病猪群体组建方法

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
AU746454B2 (en) 1998-03-02 2002-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
JP4968498B2 (ja) 2002-01-23 2012-07-04 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
NZ550145A (en) 2004-04-23 2009-07-31 Pharmacia & Upjohn Co Llc Cellular permissivity factor for viruses, and uses thereof
US20090203140A1 (en) 2007-09-27 2009-08-13 Sangamo Biosciences, Inc. Genomic editing in zebrafish using zinc finger nucleases
WO2010008562A2 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Recombinetics Methods and materials for producing transgenic animals
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
KR102262704B1 (ko) 2009-08-11 2021-06-09 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 표적화 변형에 대한 동형접합성 유기체
AU2010327998B2 (en) 2009-12-10 2015-11-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. TAL effector-mediated DNA modification
PT2534173T (pt) 2010-02-08 2019-10-31 Sangamo Therapeutics Inc Semidomínios de clivagem manipulados
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
BR112013021785A8 (pt) 2011-02-25 2018-07-03 Recombinetics Inc animais geneticamente modificados e métodos para fazer os mesmos
US20140201857A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Recombinetics, Inc. Hornless livestock
HUE039793T2 (hu) 2011-05-16 2019-02-28 Univ Missouri Sertés reproduktív és légzési szindróma vírus rezisztens állatok
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
MX362866B (es) 2012-05-25 2019-02-20 Univ California Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn.
US20150128300A1 (en) 2012-06-12 2015-05-07 Genentech, Inc. Methods and compositions for generating conditional knock-out alleles
WO2013188638A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
AR091482A1 (es) 2012-06-21 2015-02-04 Recombinetics Inc Celulas modificadas geneticamente y metodos par su obtencion
US10058078B2 (en) 2012-07-31 2018-08-28 Recombinetics, Inc. Production of FMDV-resistant livestock by allele substitution
CN105073981A (zh) 2012-10-30 2015-11-18 重组股份有限公司 动物中性成熟的控制
PT3138910T (pt) 2012-12-06 2017-10-18 Sigma Aldrich Co Llc Modificação e regulação de genoma baseado em crispr
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
US20140189896A1 (en) 2012-12-12 2014-07-03 Feng Zhang Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP2931897B1 (en) 2012-12-12 2017-11-01 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
CN113528577A (zh) 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
AU2013359212B2 (en) 2012-12-12 2017-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
EP2932421A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
GB201313235D0 (en) * 2013-07-24 2013-09-04 Univ Edinburgh Antiviral Compositions Methods and Animals
CN104593422A (zh) * 2015-01-08 2015-05-06 中国农业大学 一种抗蓝耳病克隆猪的制备方法
US10827730B2 (en) * 2015-08-06 2020-11-10 The Curators Of The University Of Missouri Pathogen-resistant animals having modified CD163 genes
CA2993435A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 The Curators Of The University Of Missouri Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753832A (zh) * 2018-04-20 2018-11-06 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法
CN108823248A (zh) * 2018-04-20 2018-11-16 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法
CN110438155A (zh) * 2019-08-15 2019-11-12 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 修饰cd163基因第561位氨基酸的组合物、应用、细胞及基因编辑猪的制备方法
CN113151291A (zh) * 2020-05-05 2021-07-23 吉纳斯公司 通过对cd163靶向灭活来改善猪类健康的方法
CN117487855A (zh) * 2020-05-05 2024-02-02 吉纳斯公司 通过对cd163靶向灭活来改善猪类健康的方法
CN115989030A (zh) * 2020-05-29 2023-04-18 康涅狄格大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒的抑制剂
CN113512534A (zh) * 2020-09-23 2021-10-19 杭州启函生物科技有限公司 用于遗传修饰和靶向的组合物和方法
WO2022063160A1 (en) * 2020-09-23 2022-03-31 Qihan-Egenesis Hong Kong Limited Compositions and methods for genetic modification and targeting
CN115176021A (zh) * 2020-09-23 2022-10-11 启函生物香港有限公司 用于遗传修饰和靶向的组合物和方法
CN113512534B (zh) * 2020-09-23 2024-04-23 杭州启函生物科技有限公司 用于遗传修饰和靶向的组合物和方法
CN115176021B (zh) * 2020-09-23 2024-06-04 启函生物香港有限公司 用于遗传修饰和靶向的组合物和方法
CN112094866A (zh) * 2020-11-10 2020-12-18 北京首农未来生物科技有限公司 一种利用SpRY-Cas9系统制备CD163基因编辑猪的方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017344936A1 (en) 2019-04-04
MX2019004464A (es) 2019-09-26
KR20190067212A (ko) 2019-06-14
CA3037451A1 (en) 2018-04-26
GB201617559D0 (en) 2016-11-30
RU2019110035A (ru) 2020-10-05
JP2019533445A (ja) 2019-11-21
US20200045945A1 (en) 2020-02-13
WO2018073237A1 (en) 2018-04-26
EP3525581A1 (en) 2019-08-21
PH12019500624A1 (en) 2019-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109862786A (zh) 包含改性cd163的猪及相关方法
Burkard et al. Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function
US20240122164A1 (en) Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes
Xu et al. CD163 and pAPN double-knockout pigs are resistant to PRRSV and TGEV and exhibit decreased susceptibility to PDCoV while maintaining normal production performance
JP2022081637A (ja) ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス耐性動物
Wang et al. Deletion of CD163 exon 7 confers resistance to highly pathogenic porcine reproductive and respiratory viruses on pigs
KR102495662B1 (ko) 변형된 cd163 유전자를 갖는 병원균-내성 동물
US20200236914A1 (en) Pathogen-resistant animals having modified aminopeptidase n (anpep) genes
CN116348063A (zh) 猪的选性精液和其使用方法
CN112094868B (zh) 一种利用单碱基编辑器SpRY-BE4制备CD163基因编辑猪的方法
KR20230006827A (ko) Cd163의 표적 불활화를 통한 돼지 종의 건강 개선 방법
CN111500589A (zh) 引起内耳发育不全的猪sox10突变基因及其应用
KR20210005074A (ko) 바이러스에 의한 감염으로부터 돼지 태아를 보호하는 방법
CN116855539B (zh) 一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法
JP5771240B2 (ja) 免疫不全ブタ
RU2778405C2 (ru) Способы защиты плодов свиней от инфицирования вирусом
CN117305303A (zh) 一种培育高繁殖力细毛羊的方法
Ishikawa et al. Insertion of transgene in sex chromosomes in generating transgenic mice

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190607