KR102495662B1 - 변형된 cd163 유전자를 갖는 병원균-내성 동물 - Google Patents
변형된 cd163 유전자를 갖는 병원균-내성 동물 Download PDFInfo
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Abstract
CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 비-인간 동물 및 이의 자손이 제공된다. 이러한 변형된 염색체 서열을 함유하는 동물 세포가 또한 제공된다. 동물 및 세포는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)를 포함한 병원균에 대해 증가된 내성을 갖는다. 동물 및 자손은 CD163 유전자의 염색체 변형을 갖는다. 본 발명은 추가로 병원균-내성 동물을 생산하기 위한 번식방법 및 이러한 방법을 사용하여 만들어진 동물의 개체군에 관한 것이다.
Description
본 발명은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 비-인간 동물 및 이의 자손에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 염색체 서열을 함유하는 동물 세포에 관한 것이다. 동물 및 세포는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)를 포함한 병원균에 대해 증가된 내성을 갖는다. 동물 및 자손은 PRRSV 진입 및 복제가 억제되고 이에 따른 동물이 바이러스에 의해 유발된 질환 및 증후군에 대해 내성을 나타내도록 CD163 유전자의 염색체 변형을 갖는다. 본 발명은 또한 병원균-내성 동물을 생산하기 위한 번식방법 및 이러한 방법을 사용하여 만들어진 동물의 개체군에 관한 것이다. 본 발명은 또한 배아의 직접 주사 및 PRRSV와 같은 병원균에 내성인 동물, 시조 동물(founder animal) 및 계통의 발달을 수반한 CD163의 유전자 편집을 위한 방법에 관한 것이다.
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)는 포유류 아테리바이러스(arteriviruses)의 그룹에 속하며, 이것은 또한 뮤린 락트산 탈수소효소-증가 바이러스, 원숭이 출혈열 바이러스 및 말 동맥염 바이러스를 포함한다. 아테리바이러스는 대식세포에 대한 친화성(tropism) 및 중증 질환 및 지속 감염을 야기하는 능력을 포함한 바이러스 발병과 관련된 중요한 특성들을 공유한다. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)로의 감염에 의해 유발되는 임상 질환 증후군은 1987년에 미국에서 처음 보고되었으며(Keffaber, 1989) 후에 1990년에 유럽에서 보고되었다(Wensvoort 등, 1991). PRRSV로의 감염은 기침 및 열을 포함한 호흡기 질환, 임신 후기 동안의 생식 장애, 및 저하된 성장율을 초래한다. 바이러스는 또한 평생 무증상 감염을 유지하면서 각종 다균성 질환 증후군 상호작용에 관여한다(Rowland 등, 2012).
이의 출현 이후로, PRRS은 북아메리카, 유럽 및 아시아에서 상업적 돼지의 가장 중요한 질환이 되어 왔으며, 오스트레일리아 및 남극 대륙에만 이 질환이 없다. 북아메리카에서만 PRRSV-관련 손실이 생산자가 매년 $664 M을 들이는 것으로 추정되고 있다(Holtkamp 등, 2013). 2006년에, 고병원성 PRRS(HP-PRRS)로 알려진 더욱 심각한 형태의 질환이 중국 전역에 걸쳐 돼지 개체군을 살상하였다. 유전적 다양성이 질환을 효과적으로 통제하고 제거하는데 필요한 백신의 개발을 제한하였다. 자연 내성에 대한 유전자 선택이 옵션일 수 있지만, 결과는 지금까지 제한적이었다(Boddicker 등, 2014).
폐포 대식세포의 PRRSV 감염을 기술하는 선행 모델은 SIGLEC1(CD169)을 대식세포의 표면 상의 일차 바이러스 수용체라고 밝혔다; 그러나, SIGLEC1 -/- 돼지를 사용한 선행 연구는 야생형 돼지에 비해 바이러스 복제에 있어서 차이를 보이지 않았다.
PRRSV 발병(특히 분자 수준에서) 및 동물전염병학(epizootiology) 둘 다의 여러 특징들에 대한 이해가 부족하여 제어 노력을 어렵게 한다. 현재 생산자들은 종종 변형된-약독화 생균주 또는 바이러스 사백신으로 PRRSV에 대해 돼지를 예방접종하지만, 현재의 백신은 종종 만족스러운 보호를 제공하지 못한다. 이는 균주 변이 및 면역계의 부적절한 자극 둘 다로 인한 것이다. 이용 가능한 PRRSV 백신의 효능에 대한 우려 외에도, 돼지의 실험적 감염 후 치명적인 사육장 분리물(virulent field isolate)로 입증된 바와 같이(Rowland 등, Virology, 259:262-266 (1999)), 현재 사용중인 변형된-생백신이 개별 돼지 및 돼지 무리에 잔존할 수 있으며 돌연변이를 늘릴 수 있다는 강력한 증거가 있다(Mengeling 등, Am. J. Vet. Res, 60(3): 334-340 (1999)). 게다가, 백신 바이러스가 예방접종된 수퇘지의 정액에서 나오는 것으로 나타났다(Christopher-Hennings 등, Am. J. Vet. Res, 58(1): 40-45 (1997)). 예방접종에 대한 대안으로서, 몇몇 전문가들은 사육하는 무리에서 "시험 및 제거(test and removal)" 전략을 주장하고 있다(Dee and Molitor, Vet. Rec., 143:474-476 (1998)). 이러한 전략의 성공적인 사용은 PRRSV로 급성으로 또는 지속적으로 감염된 모든 돼지의 제거에 이은 바이러스의 재도입을 방지하기 위한 엄격한 통제에 달려 있다. 이러한 전략과 관련된 어려움 및 많은 비용은, 지속적 PRRSV 감염의 발병에 대해 거의 알려져 있지 않고 따라서 지속적으로 감염된 돼지를 확인하기 위한 신뢰할 수 있는 기술이 없다는 것이다.
알 수 있는 바와 같이, 동물에게 PRRSV 내성을 유도하는 전략의 개발 필요성이 당업계에 존재한다.
CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 비-인간 동물, 이의 자손, 및 동물 세포가 제공된다.
병원균에 의한 감염에 대해 감소된 민감성을 갖는 동물 또는 혈통을 생산하기 위한 번식방법이 또한 제공된다. 방법은 난모세포 및 정자 세포 중의 적어도 하나 내로 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 도입하기 위해 난모세포 또는 정자 세포를 유전자 변형시키는 단계, 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 함유하는 수정란을 생산하도록 난모세포를 정자 세포와 수정시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 방법은 수정란 내로 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 도입하기 위해 수정란을 유전자 변형시키는 단계를 포함한다. 방법은 수정란을 대리모 암컷 동물 내로 이식시키는 단계(여기서, 임신 및 만기 분만은 자손 동물을 생산한다), 병원균에 대한 민감성에 대해 자손 동물을 스크리닝하는 단계, 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 동물에 비해 병원균에 대한 감소된 민감성을 갖는 자손 동물을 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
상기한 번식방법에 의해 만들어진 동물의 개체군이 또한 제공된다.
병원균으로의 감염에 대한 가축 동물의 내성을 증가시키는 방법이 또한 제공된다. 방법은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 편집된 염색체 서열을 포함하지 않는 가축 동물에서의 CD63 단백질 생산 또는 활성에 비해 CD163 단백질 생산 또는 활성이 감소되도록 CD163 단백질을 암호화하는 유전자로부터 적어도 하나의 염색체 서열을 유전자 편집함을 포함한다.
본원에 제공된 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에서 염색체 서열에 대한 변형은 병원균(예, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)와 같은 바이러스)에 대한 동물, 자손, 세포, 또는 개체군(예, 돼지 동물, 자손, 세포 또는 개체군)의 민감성을 감소시킨다.
본원에 제공된 돼지 동물, 자손, 세포, 및 방법 중의 어느 것에서, CD163 단백질을 암호화하는 유전자에서 염색체 서열의 변형은 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,137 내지 뉴클레오티드 3,147의 11개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149와 3,150 사이의 2개 염기 쌍 삽입 및 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573 내지 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,147의 124개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,147의 123개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,147과 3,148 간의 1개 염기 쌍 삽입; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,159의 130개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,161의 132개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 1,525 내지 뉴클레오티드 3,030의 1506개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 간의 7개 염기 쌍 삽입; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,818 내지 뉴클레오티드 4,097의 1280개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,724 내지 뉴클레오티드 4,096의 1373개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,431 내지 뉴클레오티드 3,897의 1467개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 488에서 시작되는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 4,531의 1387개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체된다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,440 내지 뉴클레오티드 4,160의 1720개 염기 쌍 결실; 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
단리된 핵산이 또한 제공된다. 단리된 핵산 분자는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다: (a) 서열 번호 47을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (b) 서열 번호 47의 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열(여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 47에 대해 적어도 하나의 치환, 삽입, 또는 결실을 함유한다); 및 (c) (a) 또는 (b)의 cDNA 서열.
추가의 단리된 핵산이 또한 제공된다. 단리된 핵산은 서열 번호 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 또는 114를 포함한다.
또 다른 목적 및 특징들은 이하에서 어느 정도 자명해지고 어느 정도 언급될 것이다.
도 1. CD163을 변형시키는데 사용되는 CRISPR 및 표적화 벡터. 패널 A는 CRISPR을 사용한 변형을 위해 표적화된 CD163 유전자의 야생형 엑손 7, 8 및 9를 도시한다. 패널 B는 돼지 엑손 7(CD163의 돼지 도메인 SRCR5)을 CD163L의 인간 SRCR8을 암호화하는 DNA로 대체하도록 고안된 표적화 벡터를 보여준다. 이러한 표적화 벡터는 G418에 의한 약물 선택과 형질감염에 사용된다. 원거리, 왼팔 및 오른팔 검정(long range, left arm and right arm assay)을 위한 PCR 프라이머가 1230, 3752, 8791, 7765 및 7775에 대한 화살표로 표지되어 있다. 패널 C는 패널 B에 나타낸 것과 동일한 표적화 벡터를 도시하지만, 여기서는 Neo 카세트가 제거되었다. 이러한 표적화 벡터가 이미 네오마이신 내성인 세포에서 CD163을 표적화하는데 사용되었다. 작은 결실 검정에서 사용되는 프라이머는 화살표로 예시되어 있으며 GCD163F 및 GCD163R로 표지된다. 패널 D는 CRISPR에 의해 표적화된 엑손을 강조한다. CRISPR 10, 131, 256 및 282의 위치는 엑손 7 상에 아래로 향하는 화살표로 나타내어진다. CRISPR 수는 인트론 6과 엑손 7의 인트론-엑손 접합부로부터의 염기 쌍의 수를 나타낸다.
도 2. CD1D를 변형시키는데 사용되는 CRISPR 및 표적화 벡터. 패널 A는 CRISPR에 의해 변형을 위해 표적화된 CD1D 유전자의 야생형 엑손 3, 4, 5, 6 및 7을 도시한다. 패널 B는 엑손 3을 선택 마커 Neo로 대체하도록 고안된 표적화 벡터를 보여준다. 이러한 표적화 벡터는 CRISPR과 함께 CD1D를 변형시키는데 사용되었다. 원거리, 왼팔 및 오른팔 검정을 위한 PCR 프라이머가 3991, 4363, 7373 및 12806에 대한 화살표로 표지되어 있다. 패널 C는 CRISPR에 의해 표적화된 엑손을 도시한다. CRISPR 4800, 5350, 5620 및 5626의 위치는 엑손 3 상에 아래로 향하는 화살표로 나타내어진다. 작은 결실 검정에서 사용되는 프라이머는 화살표로 예시되어 있으며 GCD1DF 및 GCD1DR로 표지된다. CRISPR 수는 인트론 6과 엑손 7의 인트론-엑손 접합부로부터의 염기 쌍의 수를 나타낸다.
도 3. CRISPR/Cas9 및 SCNT에 의한 CD163 및 CD1D 녹아웃 돼지(knockout pig)의 생식과정. A) CRISPR/Cas9 및 공여자 DNA로의 형질감염 후 체세포에서의 CD163의 표적화된 결실. 야생형(WT) 유전자형은 6545개 염기 쌍(bp) 밴드를 야기한다. 레인 1-6은 Cas9를 갖는 CRISPR 10 및 Neo를 함유하는 공여자 DNA로의 단일 형질감염으로부터의 6개의 상이한 집락을 나타낸다. 레인 1, 4, 및 5는 1500-2000 bp의 큰 동형접합성 결실을 보인다. 레인 2는 보다 작은 동형접합성 결실을 나타낸다. 레인 3 및 6은 WT 대립유전자 및 작은 결실 또는 대립유전자 둘 다의 이중대립유전자 변형을 나타낸다. 각 집락의 정확한 변형은 단지 SCNT에 사용된 집락에 대한 서열분석에 의해 결정되었다. 레인 중의 일부에서의 희미한 WT 밴드는 인접한 WT 집락로부터의 태아 섬유아세포의 교차-오염을 나타낼 수 있다. NTC = 주형 조절 없음(no template control). B) CRISPR/Cas9 및 공여자 DNA로의 형질감염 후 체세포에서의 CD1D의 표적화된 결실. WT 유전자형은 8729 bp 밴드를 야기한다. 레인 1-4는 CD1D의 500-2000 bp 결실을 갖는 집락을 나타낸다. 레인 4는 WT 집락인 것 같다. NTC ¼ 주형 조절 없음. C) 연구 동안 SCNT에 의해 생산된 CD163 녹아웃 돼지의 영상. 이러한 수컷 새끼 돼지는 CD163의 동형접합성 1506 bp 결실을 함유한다. D) 연구 동안 생산된 CD1D 돼지의 영상. 이러한 새끼 돼지는 CD1D의 1653 bp 결실을 함유한다. E) CD163의 1506 bp 결실을 함유하는 두 개의 SCNT 한배새끼의 유전자형. 레인 1-3(한배새끼 63) 및 레인 1-4(한배새끼 64)는 각 한배새끼로부터의 각각의 새끼 돼지에 대한 유전자형을 나타낸다. Sow는 SCNT 배아의 수용자 암컷을 나타내고, WT는 WT 대조군을 나타낸다. NTC = 주형 조절 없음. F) CD1D의 1653 bp 결실을 함유하는 두 개의 SCNT 한배새끼의 유전자형. 레인 1-7 (한배새끼 158) 및 레인 1-4 (한배새끼 159)는 각 새끼 돼지에 대한 유전자형을 나타낸다.
도 4. 돼지 배아에서 CRISPR/Cas9 시스템의 효과. A) 접합자(zygote)에게 상이한 농도의 CRISPR/Cas9 시스템의 주입 후 배반포 형성의 빈도. CRISPR/Cas9 시스템의 독성은 10 ng/㎕에서 최저이었다. B) CRISPR/Cas9 시스템은 접합자에 도입되는 경우 배반포에서 eGFP의 발현을 성공적으로 교란시킬 수 있다. 원래의 배율 X4. C) CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 생성된 eGFP에 대한 돌연변이의 유형: WT 유전자형 (서열 번호16), #1 (서열 번호17), #2 (서열 번호18), 및 #3 (서열 번호19).
도 5. 돼지 배아에서 CD163을 표적화하는데 있어서의 CRISPR/Cas9 시스템의 효과. A) CRISPR/Cas9 시스템에 의해 CD163 상에 생성된 돌연변이의 예: WT 유전자형 (서열 번호20), #1-1 (서열 번호21), #1-4 (서열 번호22), 및 #2-2 (서열 번호23). DNA 서열분석에 의해 실험된 모든 배아는 CD163 상에 돌연변이를 나타내었다(18/18). CRISPR 131은 굵게 강조되어 있다. B) CRISPR/Cas9 시스템에 의해 야기된 동형접합성 결실의 서열분석 판독. 영상은 CD163의 2 bp 결실을 지닌 패널 A로부터의 # 1-4를 나타낸다.
도 6. 두 가지 유형의 CRISPR로 도입된 경우의 CRISPR/Cas9 시스템의 효과. A) 접합자로서 CRISPR/Cas9로 주입된 배반포에서의 CD163의 PCR 증폭. 레인 1, 3, 6, 및 12는 두 개의 상이한 CRISPR 간의 지정된 결실을 보여준다. B) 접합자로서 CRISPR/Cas9로 주입된 배반포에서의 CD1D의 PCR 증폭. CD1D는 CD163 (3/23)과 비교하는 경우 겔 전기영동에 의해 측정되는 바와 같이 결실의 빈도가 더 낮았다; 레인 1, 8, 및 15는 CD1D에 명백한 결실을 보인다. C) CRISPR/Cas9 시스템은 CD163 및 eGFP를 표적화하는 두 개의 CRISPR이 시스템에 제공되는 경우에 두 개의 유전자를 성공적으로 표적화하였다. CD163 및 eGFP의 변형이 나타내어져 있다: CD163 WT (서열 번호24), CD163 #1 (서열 번호25), CD163 #2 (서열 번호26), CD163 #3 (서열 번호27), eGFP WT (서열 번호28), eGFP #1-1 (서열 번호29), eGFP #1-2 (서열 번호 30), eGFP #2 (서열 번호31), 및 eGFP #3 (서열 번호32).
도 7. 접합자 내에 주입된 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 생성된 CD163 녹아웃 돼지. A) 녹아웃 돼지로부터의 CD163의 PCR 증폭; 한배새끼 67-2 및 67-4에서 결실의 분명한 징후가 검출되었다. B) 대리모를 갖는 CD163 녹아웃 돼지의 영상. 모든 동물은 건강하며 이상 징후를 보이지 않는다. C) CD163 녹아웃 돼지의 유전자형. 야생형(WT) 서열 서열 번호 33으로서 나타내어져 있다. (한배새끼 67-1 (서열 번호34) 및 67-3 (서열 번호37)으로부터의) 두 마리 동물은 CD163에 동형접합성 결실 또는 삽입을 지니고 있다. (한배새끼 67-2 및 67-4로부터의) 다른 두 마리 동물은 CD163의 이중대립유전자 변형을 지니고 있다: #67-2 A1 (서열 번호35), #67-2 A2 (서열 번호36), #67-4 A1 (서열 번호38), 및 #67-4 a2 (서열 번호39). 결실은 Cas9를 지닌 두 개의 상이한 CRISPR 시스템을 도입함으로써 야기되었다. CD163에 대한 접합자 주입으로부터의 어떠한 동물도 모자이크 유전자형을 나타내지 않았다.
도 8. 접합자 내로 주입된 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 생성된 CD1D 녹아웃 돼지. A) 녹아웃 돼지로부터의 CD1D의 PCR 증폭; 166-1은 CD1D에 대한 모자이크 유전자형을 보여준다. 166-2, 166-3, 및 166-4는 앰플리콘에 대해 크기 변화를 보이지 않지만, 엠플리콘의 서열분석 결과 변형을 나타내었다. WT FF = 야생형 태아 섬유아세포. B) 원거리 검정의 PCR 증폭은 새끼 돼지 166-1 및 166-2에서 하나의 대립유전자의 분명한 결실을 보여주었다. C) 대리모를 갖는 CD1D 녹아웃 돼지의 영상. D) CD1D 녹 아웃 돼지의 서열 데이터; WT (서열 번호40), #166-1.1 (서열 번호 41), #166-1.2 (서열 번호42), #166-2 (서열 번호43), #166-3.1 (서열 번호44), #166-3.2 (SEQID NO:45), 및 #166-4 (서열 번호46). 엑손 3에서 atg 개시 코돈은 소문자로 굵게 나타내어져 있다.
도 9. 급성 PRRSV 감염 동안의 임상 징후. CD163 +/+ (n=6) 및 CD163 -/- (n=3)에 대한 호흡기 징후 및 열의 존재에 대한 매일의 평가에 대한 결과.
도 10. 급성 PRRSV 감염 동안의 폐 조직병리학. 야생형 및 녹아웃 돼지로부터의 H 및 E 염색된 조직의 대표적인 현미경 사진. 좌측 패널은 단핵 세포의 침윤 및 부종을 보인다. 녹아웃 돼지로부터의 우측 패널은 정상 폐의 폐 구조를 보인다.
도 11. 다양한 유전자형에서의 바이러스혈증. CD163-/- 새끼 돼지 데이터가 X 축을 따라 놓여 있음을 주지한다.
도 12. 무반응, 야생형 및 비특성화 대립유전자 돼지에서의 항체 생산.
도 13. 개별 돼지에서 CD163의 세포 표면 발현. 비특성화 A, 비특성화 B, 및 CD163 +/+ 패널에서 우측으로 향하는 것으로 보이는 선은 CD163 항체를 나타내는 반면 이들 패널의 좌측편을 향하는 것으로 보이는 선은 항체 조절을 보이지 않는다(백그라운드). CD163-/- 동물에서 CD163 염색은 백그라운드 조절(background control)과 겹치며, 비특성화 대립유전자에서의 CD163 염색은 대충 WT 수준과 백그라운드 간의 중간임을 주지한다(이것은 로그 규모이며, 따라서 ~10% 미만임을 또한 주지한다).
도 14. 세 마리 대표적인 돼지 및 비 항체 대조군으로부터의 폐포 대식세포 상의 CD169의 수준 (FITC 표지된 항-CD169).
도 15. 다양한 유전자형에서의 바이러스혈증. Δ43 아미노산 새끼 돼지 데이터가 X-축을 따라 놓여있음을 주지한다.
도 16. 참조 서열 (서열 번호47)로서 사용된 야생형 CD163 엑손 7-10의 게놈 서열. 서열은 엑손 7의 3000 bp 업스트림 내지 엑손 10의 마지막 염기를 포함한다. 밑줄 친 영역은 각각 엑손 7, 8, 9, 및 10의 위치를 보여준다.
도 2. CD1D를 변형시키는데 사용되는 CRISPR 및 표적화 벡터. 패널 A는 CRISPR에 의해 변형을 위해 표적화된 CD1D 유전자의 야생형 엑손 3, 4, 5, 6 및 7을 도시한다. 패널 B는 엑손 3을 선택 마커 Neo로 대체하도록 고안된 표적화 벡터를 보여준다. 이러한 표적화 벡터는 CRISPR과 함께 CD1D를 변형시키는데 사용되었다. 원거리, 왼팔 및 오른팔 검정을 위한 PCR 프라이머가 3991, 4363, 7373 및 12806에 대한 화살표로 표지되어 있다. 패널 C는 CRISPR에 의해 표적화된 엑손을 도시한다. CRISPR 4800, 5350, 5620 및 5626의 위치는 엑손 3 상에 아래로 향하는 화살표로 나타내어진다. 작은 결실 검정에서 사용되는 프라이머는 화살표로 예시되어 있으며 GCD1DF 및 GCD1DR로 표지된다. CRISPR 수는 인트론 6과 엑손 7의 인트론-엑손 접합부로부터의 염기 쌍의 수를 나타낸다.
도 3. CRISPR/Cas9 및 SCNT에 의한 CD163 및 CD1D 녹아웃 돼지(knockout pig)의 생식과정. A) CRISPR/Cas9 및 공여자 DNA로의 형질감염 후 체세포에서의 CD163의 표적화된 결실. 야생형(WT) 유전자형은 6545개 염기 쌍(bp) 밴드를 야기한다. 레인 1-6은 Cas9를 갖는 CRISPR 10 및 Neo를 함유하는 공여자 DNA로의 단일 형질감염으로부터의 6개의 상이한 집락을 나타낸다. 레인 1, 4, 및 5는 1500-2000 bp의 큰 동형접합성 결실을 보인다. 레인 2는 보다 작은 동형접합성 결실을 나타낸다. 레인 3 및 6은 WT 대립유전자 및 작은 결실 또는 대립유전자 둘 다의 이중대립유전자 변형을 나타낸다. 각 집락의 정확한 변형은 단지 SCNT에 사용된 집락에 대한 서열분석에 의해 결정되었다. 레인 중의 일부에서의 희미한 WT 밴드는 인접한 WT 집락로부터의 태아 섬유아세포의 교차-오염을 나타낼 수 있다. NTC = 주형 조절 없음(no template control). B) CRISPR/Cas9 및 공여자 DNA로의 형질감염 후 체세포에서의 CD1D의 표적화된 결실. WT 유전자형은 8729 bp 밴드를 야기한다. 레인 1-4는 CD1D의 500-2000 bp 결실을 갖는 집락을 나타낸다. 레인 4는 WT 집락인 것 같다. NTC ¼ 주형 조절 없음. C) 연구 동안 SCNT에 의해 생산된 CD163 녹아웃 돼지의 영상. 이러한 수컷 새끼 돼지는 CD163의 동형접합성 1506 bp 결실을 함유한다. D) 연구 동안 생산된 CD1D 돼지의 영상. 이러한 새끼 돼지는 CD1D의 1653 bp 결실을 함유한다. E) CD163의 1506 bp 결실을 함유하는 두 개의 SCNT 한배새끼의 유전자형. 레인 1-3(한배새끼 63) 및 레인 1-4(한배새끼 64)는 각 한배새끼로부터의 각각의 새끼 돼지에 대한 유전자형을 나타낸다. Sow는 SCNT 배아의 수용자 암컷을 나타내고, WT는 WT 대조군을 나타낸다. NTC = 주형 조절 없음. F) CD1D의 1653 bp 결실을 함유하는 두 개의 SCNT 한배새끼의 유전자형. 레인 1-7 (한배새끼 158) 및 레인 1-4 (한배새끼 159)는 각 새끼 돼지에 대한 유전자형을 나타낸다.
도 4. 돼지 배아에서 CRISPR/Cas9 시스템의 효과. A) 접합자(zygote)에게 상이한 농도의 CRISPR/Cas9 시스템의 주입 후 배반포 형성의 빈도. CRISPR/Cas9 시스템의 독성은 10 ng/㎕에서 최저이었다. B) CRISPR/Cas9 시스템은 접합자에 도입되는 경우 배반포에서 eGFP의 발현을 성공적으로 교란시킬 수 있다. 원래의 배율 X4. C) CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 생성된 eGFP에 대한 돌연변이의 유형: WT 유전자형 (서열 번호16), #1 (서열 번호17), #2 (서열 번호18), 및 #3 (서열 번호19).
도 5. 돼지 배아에서 CD163을 표적화하는데 있어서의 CRISPR/Cas9 시스템의 효과. A) CRISPR/Cas9 시스템에 의해 CD163 상에 생성된 돌연변이의 예: WT 유전자형 (서열 번호20), #1-1 (서열 번호21), #1-4 (서열 번호22), 및 #2-2 (서열 번호23). DNA 서열분석에 의해 실험된 모든 배아는 CD163 상에 돌연변이를 나타내었다(18/18). CRISPR 131은 굵게 강조되어 있다. B) CRISPR/Cas9 시스템에 의해 야기된 동형접합성 결실의 서열분석 판독. 영상은 CD163의 2 bp 결실을 지닌 패널 A로부터의 # 1-4를 나타낸다.
도 6. 두 가지 유형의 CRISPR로 도입된 경우의 CRISPR/Cas9 시스템의 효과. A) 접합자로서 CRISPR/Cas9로 주입된 배반포에서의 CD163의 PCR 증폭. 레인 1, 3, 6, 및 12는 두 개의 상이한 CRISPR 간의 지정된 결실을 보여준다. B) 접합자로서 CRISPR/Cas9로 주입된 배반포에서의 CD1D의 PCR 증폭. CD1D는 CD163 (3/23)과 비교하는 경우 겔 전기영동에 의해 측정되는 바와 같이 결실의 빈도가 더 낮았다; 레인 1, 8, 및 15는 CD1D에 명백한 결실을 보인다. C) CRISPR/Cas9 시스템은 CD163 및 eGFP를 표적화하는 두 개의 CRISPR이 시스템에 제공되는 경우에 두 개의 유전자를 성공적으로 표적화하였다. CD163 및 eGFP의 변형이 나타내어져 있다: CD163 WT (서열 번호24), CD163 #1 (서열 번호25), CD163 #2 (서열 번호26), CD163 #3 (서열 번호27), eGFP WT (서열 번호28), eGFP #1-1 (서열 번호29), eGFP #1-2 (서열 번호 30), eGFP #2 (서열 번호31), 및 eGFP #3 (서열 번호32).
도 7. 접합자 내에 주입된 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 생성된 CD163 녹아웃 돼지. A) 녹아웃 돼지로부터의 CD163의 PCR 증폭; 한배새끼 67-2 및 67-4에서 결실의 분명한 징후가 검출되었다. B) 대리모를 갖는 CD163 녹아웃 돼지의 영상. 모든 동물은 건강하며 이상 징후를 보이지 않는다. C) CD163 녹아웃 돼지의 유전자형. 야생형(WT) 서열 서열 번호 33으로서 나타내어져 있다. (한배새끼 67-1 (서열 번호34) 및 67-3 (서열 번호37)으로부터의) 두 마리 동물은 CD163에 동형접합성 결실 또는 삽입을 지니고 있다. (한배새끼 67-2 및 67-4로부터의) 다른 두 마리 동물은 CD163의 이중대립유전자 변형을 지니고 있다: #67-2 A1 (서열 번호35), #67-2 A2 (서열 번호36), #67-4 A1 (서열 번호38), 및 #67-4 a2 (서열 번호39). 결실은 Cas9를 지닌 두 개의 상이한 CRISPR 시스템을 도입함으로써 야기되었다. CD163에 대한 접합자 주입으로부터의 어떠한 동물도 모자이크 유전자형을 나타내지 않았다.
도 8. 접합자 내로 주입된 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 생성된 CD1D 녹아웃 돼지. A) 녹아웃 돼지로부터의 CD1D의 PCR 증폭; 166-1은 CD1D에 대한 모자이크 유전자형을 보여준다. 166-2, 166-3, 및 166-4는 앰플리콘에 대해 크기 변화를 보이지 않지만, 엠플리콘의 서열분석 결과 변형을 나타내었다. WT FF = 야생형 태아 섬유아세포. B) 원거리 검정의 PCR 증폭은 새끼 돼지 166-1 및 166-2에서 하나의 대립유전자의 분명한 결실을 보여주었다. C) 대리모를 갖는 CD1D 녹아웃 돼지의 영상. D) CD1D 녹 아웃 돼지의 서열 데이터; WT (서열 번호40), #166-1.1 (서열 번호 41), #166-1.2 (서열 번호42), #166-2 (서열 번호43), #166-3.1 (서열 번호44), #166-3.2 (SEQID NO:45), 및 #166-4 (서열 번호46). 엑손 3에서 atg 개시 코돈은 소문자로 굵게 나타내어져 있다.
도 9. 급성 PRRSV 감염 동안의 임상 징후. CD163 +/+ (n=6) 및 CD163 -/- (n=3)에 대한 호흡기 징후 및 열의 존재에 대한 매일의 평가에 대한 결과.
도 10. 급성 PRRSV 감염 동안의 폐 조직병리학. 야생형 및 녹아웃 돼지로부터의 H 및 E 염색된 조직의 대표적인 현미경 사진. 좌측 패널은 단핵 세포의 침윤 및 부종을 보인다. 녹아웃 돼지로부터의 우측 패널은 정상 폐의 폐 구조를 보인다.
도 11. 다양한 유전자형에서의 바이러스혈증. CD163-/- 새끼 돼지 데이터가 X 축을 따라 놓여 있음을 주지한다.
도 12. 무반응, 야생형 및 비특성화 대립유전자 돼지에서의 항체 생산.
도 13. 개별 돼지에서 CD163의 세포 표면 발현. 비특성화 A, 비특성화 B, 및 CD163 +/+ 패널에서 우측으로 향하는 것으로 보이는 선은 CD163 항체를 나타내는 반면 이들 패널의 좌측편을 향하는 것으로 보이는 선은 항체 조절을 보이지 않는다(백그라운드). CD163-/- 동물에서 CD163 염색은 백그라운드 조절(background control)과 겹치며, 비특성화 대립유전자에서의 CD163 염색은 대충 WT 수준과 백그라운드 간의 중간임을 주지한다(이것은 로그 규모이며, 따라서 ~10% 미만임을 또한 주지한다).
도 14. 세 마리 대표적인 돼지 및 비 항체 대조군으로부터의 폐포 대식세포 상의 CD169의 수준 (FITC 표지된 항-CD169).
도 15. 다양한 유전자형에서의 바이러스혈증. Δ43 아미노산 새끼 돼지 데이터가 X-축을 따라 놓여있음을 주지한다.
도 16. 참조 서열 (서열 번호47)로서 사용된 야생형 CD163 엑손 7-10의 게놈 서열. 서열은 엑손 7의 3000 bp 업스트림 내지 엑손 10의 마지막 염기를 포함한다. 밑줄 친 영역은 각각 엑손 7, 8, 9, 및 10의 위치를 보여준다.
본원에는 CD163 유전자의 변형을 갖고 PRRSV 및 다른 관련 호흡기 바이러스 감염에 내성인 동물 및 유전자 편집된 동물을 생산하는 방법이 제공되어 있다. 동물은 CD163 유전자 활성을 불활성화시키거나 달리 조절하는 염색체 변형(삽입 또는 결실)을 갖는다. CD163은 세포 내로의 PRRSV 진입 및 바이러스 복제에 필요하다. 따라서 무반응 CD163 동물은 시험감염(challenge)되는 경우 PRRSV 감염에 대해 내성을 나타낸다. 이러한 동물은 유전자 편집을 이용하는 다수의 프로토콜 중의 어느 것을 사용하여 만들어낼 수 있다.
또한 본원에는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas 시스템, 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector nuclease; TALEN), ZFN(징크 핑거 뉴클레아제), 재조합효소 융합 단백질, 또는 메가뉴클레아제와 같은 유전자 편집 방법을 사용하여 돼지 동물 세포 또는 돼지 배아에 세포의 염색체 표면 부위에 특이적으로 결합하여 이중-가닥 DNA 분해를 야기하거나 달리 그 안의 CD163 유전자 또는 단백질의 활성을 불활성화시키거나 감소시키는 제제를 도입함을 포함하여 돼지 동물을 제조하는 방법이 제공된다.
또한 본원에는 CD163 유전자좌 내의 특이 핵산 서열의 절단 및/또는 통합을 수행할 수 있는 폴리펩티드와 함께 하나 이상의 특정 CD163 유전자좌의 용도가 기재되어 있다. CD163 유전자좌의 절단 및/또는 통합을 수행할 수 있는 폴리펩티드 또는 RNA와 함께 CD163 유전자의 용도의 예는 징크 핑거 단백질, 메가뉴클레아제, TAL 도메인, TALENs, RNA-안내된 CRISPR/Cas 재조합효소, 류신 지퍼, 및 기타 당업계에 공지된 것들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다. 특정 예는 부위-특이 DNA 결합 도메인 폴리펩티드 및 절단 도메인 폴리펩티드(예, 뉴클레아제)를 포함하는 키메라 ("융합") 단백질, 예를 들면, 징크-핑거 폴리펩티드 및 FokI 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함하는 ZFN 단백질을 포함한다. 본원에는 CD163 유전자에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 기재되어 있다. 이러한 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드가 표적화된 이중-가닥 분해를 유도할 수 있고/있거나 분해 부위에서 관심 핵산의 재조합을 촉진시킬 수 있도록 뉴클레아제 (절단) 도메인 또는 하프-도메인 (예, 변형된 DNA-결합 도메인을 갖는 호밍(homing) 엔도뉴클레아제를 포함한 호밍 엔도뉴클레아제), 및/또는 리가제 도메인을 포함할 수 있다. CD163 유전자좌를 표적화하는 DNA-결합 도메인은 DNA-절단 기능성 도메인일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 외인성 핵산을 하나 이상의 CD163 유전자좌에서 숙주 생물(예, 동물 종)의 게놈 내에 도입하는데 사용될 수 있다. DNA-결합 도메인은 하나 이상의 징크 핑거(예, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 징크 핑거)를 갖는 징크 핑거 단백질을 포함할 수 있으며, 이것은 CD163 유전자 내의 임의의 서열에 결합하도록 조작(비-자연 발생적)된다. 본원에 기재된 징크 핑거 단백질 중의 어느 것도 표적 유전자의 코딩 서열 내의 또는 인접 서열 내의 표적 부위(예, 촉진제 또는 다른 발현 요소)에 결합할 수 있다. 징크 핑거 단백질은 CD163 유전자에서 표적 부위에 결합할 수 있다.
정의
단위, 접두사, 및 기호는 SI 승인된 형태로 표시될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록되고; 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 명세서 내에 인용된 수치 범위는 범위를 정의하는 수를 포함하며 정의된 범위 내의 각 정수를 포함한다. 아미노산은 일반적으로 알려진 3문자 기호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장되는 1문자 기호로 본원에 나타낼 수 있다. 뉴클레오티드도, 마찬가지로, 일반적으로 승인되는 단일-문자 코드로 나타내어질 수 있다. 달리 제공되지 않는 한, 본원에서 사용되는 소프트웨어, 전기 및 전자공학 용어는 The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5th edition, 1993)에 정의된 바와 같다. 아래에 정의된 용어들은 전체적으로 명세서를 참조하여 더욱 충분히 정의된다.
당업계의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 및 모든 목적을 위하여, 특히 기록된 설명을 제공한다는 측면에서, 본원에 인용된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위-범위 및 이의 하위-범위의 조합, 뿐만 아니라 범위를 구성하는 개별 값, 특히 정수 값을 포함한다. 인용된 범위는 범위 내의 각각의 특정 값, 정수, 소수, 또는 항등식을 포함한다. 임의의 열거된 범위는 동일한 범위를 충분히 설명하고 이를 적어도 등가의 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 또는 1/10로 세분할 수 있는 것으로 쉽게 인지될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 1/3 아래, 1/3 중간 및 1/3 위 등으로 쉽게 세분될 수 있다.
본 발명의 요소들 또는 이의 바람직한 양태(들)을 도입하는 경우, 관사 "a", "an", "the" 및 "said"는 하나 이상의 요소들이 있음을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하는(comprising)", "포함하는(including)" 및 "갖는(having)"은 포괄적이며 열거된 요소들 이외의 추가의 요소들이 있을 수 있음을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "및/또는"은 항목들 중의 어느 하나, 항목들의 임의의 조합, 또는 이 용어와 관련되는 항목들 모두를 의미한다. 어구 "하나 이상의"는 특히 이의 용법의 맥락에서 판독되는 경우 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 이해된다.
"결합 단백질"은 다른 분자에 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들면, DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이것은 자신에게 결합(결합하여 동형이합체, 동형삼합체 등을 형성함)할 수 있고/있거나 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 이상의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들면, 징크 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 관하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열의 동일한 또는 보존적으로 변형된 변이체를 암호화하는 핵산을 가리킨다. 유전 암호의 퇴화 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 명시된 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 기재된 상응하는 코돈 중의 어느 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변형은 "무증상 변이(silent variation)"이며 보존적으로 변형된 변화의 일종을 나타낸다. 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한, 유전 암호를 참조하여, 핵산의 모든 가능한 침묵 변화를 설명한다.
통상의 숙련가는 핵산의 각 코돈(흔히 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG; 및 흔히 트립토판에 대한 유일한 코돈인 UGG 제외)은 기능적으로 동일한 분자를 산출하도록 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 무증상 변이는 각각의 기재된 폴리펩티드 서열에 포함되며 본 발명의 범위내에 있다.
아미노산 서열에 관해, 숙련가는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 여기서 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시킨다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 1 내지 15로 이루어진 정수 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기의 수가 이렇게 변경될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 또는 10회의 변경이 이루어질 수 있다.
보존적으로 변형된 변이체는 전형적으로 이들을 유도하는 비변형된 폴리펩티드 서열과 유사한 생물학적 활성을 제공한다. 예를 들면, 기질 특이성, 효소 활성, 또는 리간드/수용체 결합은 일반적으로 이의 네이티브 기질에 대해 네이티브 단백질의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 널리 공지되어 있다.
하기 여섯 개 그룹 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: [1] 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); [2] 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); [3] 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); [4] 아르기닌 (R), 리긴 (K); [5] 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및 [6] 페닐알라닌 (F), 트립신 (Y), 트립토판 (W). 또한, 문헌[Creighton (1984) Proteins W. H. Freeman and Company]을 참조한다.
용어 "CRISPR"는 "clustered regularly interspaced short palindromic repeats(무리를 이루어 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조의 반복서열)"를 나타낸다. 용어 "Cas9"는 "CRISPR associated protein 9(크리스퍼 연관 단백질 9)를 가리킨다. 용어 "CRISPR/Cas9" 또는 "CRISPR/Cas9 시스템"은 Cas9 단백질, 또는 이의 유도체, 및 Cas9에 대해 CRISPR RNA (crRNA) 및 전사-촉진 RNA (tracrRNA)의 기능을 제공할 수 있는 하나 이상의 비-코딩 RNA를 포함하는 유전자 조작을 위한 프로그래밍 가능한 뉴클레아제 시스템을 가리킨다. crRNA 및 tracrRNA는 "가이드 RNA" (gRNA)를 생산하기 위해 조합될 수 있거나 개별적으로 사용될 수 있다. crRNA 또는 gRNA는 게놈 표적에 상보적인 서열을 제공한다. CRISPR/Cas9 시스템은 이하에서 추가로 설명된다.
뉴클레오티드 x 내지 뉴클레오티드 y의 뉴클레오티드 서열의 결실에 대한 본원의 언급은 x 및 y를 포함하여 범위 내의 뉴클레오티드 모두가 결실되었음을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 어구 "서열 번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,137 내지 뉴클레오티드 3,147의 11개 염기 쌍 결실"은 뉴클레오티드 3,317 및 3,147을 포함하여 뉴클레오티드 3,317 내지 3,147의 각각이 결실되었음을 의미한다.
"질환 내성"은 동물의 특징이며, 여기서 동물은 돼지 동물과 PRRSV 간의 상호작용과 같은 동물-병원균 상호작용의 결과인 질환 증상을 피한다. 즉, 병원균이 동물 질환 및 관련 질환 증상을 야기하는 것을 방지하고, 또는 대안적으로, 임상 징후의 발병률 및/또는 중증도의 감소 또는 임상 증상의 감소. 당업계의 숙련가는 본원에 개시된 조성물 및 방법이 병원균 공격으로부터 동물을 보호하기 위해 당업계에서 이용 가능한 다른 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
특정 핵산과 관련하여, "암호화(encoding)" 또는 "암호화된(encoded)"은 특정 단백질로의 번역에 대한 정보를 포함함을 의미한다. 단백질을 암호화하는 핵산은 핵산의 번역된 영역 내에 개재 서열(예, 인트론)을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 개재 비-번역 서열이 결핍될 수 있다(예, cDNA에서와 같이). 단백질이 암호화되는 정보는 코돈의 사용에 의해 특정된다. 전형적으로, 아미노산 서열은 "보편(universal)" 유전 암호를 사용하여 핵산에 의해 암호화된다. 핵산이 합성에 의해 제조되거나 변경되는 경우, 핵산이 발현하고자 하는 의도된 숙주의 공지된 코돈 선호도를 이용할 수 있다.
본원에서 사용되는 "유전자 편집(gene editing)", "유전자 편집된(gene edited)", "유전적으로 편집된(genetically edited)" 및 "유전자 편집 효과기(gene editiing effectors)"는 "분자 가위", "호밍 엔도뉴클레아제", 또는 "표적화 엔도뉴클레아제"라고도 하는 자연 발생 또는 인공으로 조작된 뉴클레아제를 이용한 호밍 기술의 사용을 가리킨다. 뉴클레아제는 게놈의 목적하는 위치에 특이 이중-가닥 염색체 절단(DSB)을 생성하며, 이것은 몇몇 경우에 세포의 내인성 메카니즘을 이용하여 상동 재조합(HR) 및/또는 비상동 말단-접합(NHEJ)의 자연적인 과정에 의해 유도된 절단을 복구한다. 유전자 편집 효과기는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CAS9) 시스템, 및 메가뉴클레아제(예, 호밍 엔도뉴클레아제로서 재조작된 메가뉴클레아제)를 포함한다. 용어는 또한, 예를 들면, 변화가 결실 또는 비교적 작은 삽입(전형적으로 20nt 미만)이고/이거나 외래 종으로부터의 DNA는 도입하지 않는 경우를 포함하여 유전자이식(transgenic) 과정 및 기술의 사용을 포함한다. 용어는 또한 초기 유전자 편집된 동물로부터 성적 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 것들과 같은 자손 동물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산과 관련하여 "이종(heterologous)"은 외래 종으로부터 기원하거나, 또는 동일 종으로부터 온 것이라면, 인간 개입을 의도함으로써 조성 및/또는 게놈 유전자좌에 있어서 이의 네이티브 형태로부터 실질적으로 변형된 핵산이다. 예를 들면, 이종 구조 유전자에 작동적으로 연결된 촉진제는 구조 유전자를 유도하는 것과는 상이한 종으로부터의 것이거나, 또는 동일한 종으로부터 온 것이라면, 하나 또는 둘 다는 이들 원래의 형태로부터 실질적으로 변형된다. 이종 단백질은 외래 종으로부터 기원할 수 있거나, 또는 동일 종으로부터 온 것이라면, 인간 개입을 의도함으로써 이의 원래의 형태로부터 실질적으로 변형된다.
본원에서 사용되는 "호밍 DNA 기술", "호밍 기술" 및 "호밍 엔도뉴클레아제"는 징크 핑거(ZF) 단백질, 전사 활성인자-유사 효과기(TALE) 메가뉴클레아제, 및 CRISPR/Cas9 시스템을 포함하여, 특정 분자를 특정 DNA 서열에 표적화되도록 하는 어떠한 메카니즘에도 적용된다.
본원에서 용어 "증가된 내성" 및 "감소된 민감성(reduced susceptibility)"은 병원균에 의한 감염과 관련된 임상 징후 또는 임상 증상의 발병률 및/또는 중증도의 통계적으로 유의한 감소를 의미하지만, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, "증가된 내성" 또는 "감소된 민감성"은 비변형 염색체 서열을 갖는 대조 동물에 비하여 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 동물에서 PRRSV에 의한 감염과 관련된 임상 징후 또는 임상 증상의 발병률 및/또는 중증도의 통계적으로 유의한 감소를 가리킬 수 있다. 용어 "임상 증상의 통계적으로 유의한 감소"는 대상체의 편집된 그룹에서 적어도 하나의 임상 증상의 발병 빈도가 감염원으로 시험감염시킨 후 비-편집된 대조 그룹에서보다 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70% 더 낮음을 의미하지만, 이에 국한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "녹-인(knock-in)"은 내인성 유전자의 전사 조절을 유지하면서 내인성 유전자를 이식유전자로 또는 약간의 구조적 변형을 갖는 동일한 내인성 유전자로 대체함을 의미한다.
"녹-아웃"은 유전자의 구조 또는 조절 메카니즘의 붕괴를 의미한다. 녹-아웃은 표적 벡터, 대체 벡터 또는 히트-앤-런 벡터(hit-and-run vector)의 상동 재조합 또는 유전자 기능의 완전한, 부분적 또는 조건적 손실을 야기하는 유전자 트랩 벡터의 무작위 삽입을 통해 생성될 수 있다.
용어 "동물"은 임의의 비-인간 동물, 예를 들면 사육 동물(예 가축 동물)을 포함한다. 용어 "가축 동물"은 전통적으로 목축에서 자라는 임의의 동물, 예를 들면 돼지 동물, 소 동물(예, 육우 또는 젖소), 양 동물, 염소 동물, 말과 동물(예, 말 또는 당나귀), 물소, 낙타, 또는 조류 동물(예, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 뿔닭, 또는 갓 부화한 새)를 포함한다. 이러한 용어 "가축 동물"은 랫트, 마우스, 또는 기타 설치류를 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "돌연변이"는 야생형 서열에 비해, 예를 들면, 유전자 또는 코딩 DNA 서열(CDS)과 같은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 있어서의 변형을 포함한다. 용어는 치환, 삽입, 프레임시프트, 결실, 역위, 전좌, 중복, 스플라이스-공여자 부위 돌연변이(splice-donor site mutation), 점-돌연변이 등을 제한함이 없이 포함한다.
본원에서 사용되는 "작동적으로 연결된"은 두 개의 핵산 서열, 예, 촉진제 서열 및 이차 서열 간의 기능적 연결에 대한 언급을 포함하며, 여기서 촉진제 서열이 이차 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시 및 매개한다. 일반적으로, 작동적으로 연결된은 연결되는 핵산 서열이 인접해 있고, 필요에 따라, 두 개의 단백질 코딩 영역을 인접하여 및 동일한 해독 틀에서 연결시킴을 의미한다.
본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보폴리뉴클레오티드, 리보폴리뉴클레오티드, 또는 보존적으로 변형된 변이체에 대한 언급을 포함하며; 용어는 또한 이들이, 엄격한 혼성화 조건하에서, 자연 발생 뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 혼성화되고/되거나 자연 발생 뉴클레오티드(들)와 동일한 아미노산(들)으로 번역된다는 점에서 자연 리보뉴클레오티드의 본질 속성을 갖는 이의 유사체를 가리킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 네이티브 또는 이종 구조 유전자 또는 조절 유전자의 전장 또는 서브서열일 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 용어는 특정 서열 뿐만 아니라 이의 상보적 서열에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA가 이 용어가 본원에서 의도되는 바와 같은 "폴리뉴클레오티드"이다. 더욱이, 단지 두 가지 에를 들자면 이노신과 같은 특이 염기(unusual base), 또는 트리틸화 염기와 같은 변형 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 용어가 본원에서 사용되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드이다. 당업계의 숙련가들에게 공지된 여러 유용한 목적을 제공하는 매우 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 대해 이루어져 왔음을 인지할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 이러한 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태, 뿐만 아니라 다른 것들 중에서도, 단순 및 복합 세포를 포함한 세포 및 바이러스의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 용어들은 또한 보존적으로 변형된 변이체 및 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체에 적용될 수 있다. 자연 발생 아미노산의 이러한 유사체의 본질 속성은, 단백질에 혼입되는 경우, 단백질이 전적으로 자연 발생 아미노산으로만 이루어진 동일 단백질에 유도되는 항체에 대해 특이적으로 반응성이라는 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 또한 당화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화를 포함하지만, 이에 국한되지 않는 변형을 포함한다. 널리 알려지고 상기 주지된 바와 같이, 폴리펩티드가 항상 전적으로 선형인 것은 아님을 인지할 것이다. 예를 들면, 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로서 분지화될 수 있으며, 이들은 일반적으로 자연 프로세싱 사건 및 자연적으로 일어나지 않는 인간의 조종에 의해 야기되는 사건을 포함한 번역후 사건의 결과로서, 분지화를 갖거나 갖지 않는 원형일 수 있다. 원형, 분지화된 및 분지화된 원형 폴리펩티드는 비-번역 자연 과정에 의해 및 전적으로 합성 방법으로 합성될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 단백질의 메티오닌-함유 및 메티오닌-비함유 아미노 말단 변이체 둘 다의 용도를 고려한다.
본원에서, "임상 징후의 발병률 및/또는 중증도의 감소" 또는 "임상 증상의 감소"는 야생형 감염과 비교하여, 그룹 중의 감염된 대상체의 수 감소, 감염의 임상 징후를 나타내는 대상체의 수의 감소 또는 제거, 또는 하나 이상의 대상체에 존재하는 임의의 임상 증후의 중증도 감소를 의미하지만, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 이들 용어는 감염의 임의의 임상 징후, 폐 병리, 바이러스혈증 항체 생산, 병원균 부하의 감소, 병원균 셰딩(pathogen shedding), 병원균 전파의 감소, 또는 PRRSV의 증상을 보이는 임의의 임상 징후의 감소를 포함한다. 바람직하게는 이들 임상 징후는 CD163 유전자에 변형을 갖지 않고 감염된 대상체와 비교하여 본 발명의 하나 이상의 동물에서 적어도 10%까지 감소된다. 보다 바람직하게는 임상 징후는 본 발명의 대상체에서 적어도 20%까지, 바람직하게는 적어도 30%까지, 보다 바람직하게는 적어도 40%까지, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%까지 감소된다.
용어 "잔기" 또는 "아미노산 잔기" 또는 "아미노산"은 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드(총괄하여 "단백질")에 혼입되는 아미노산을 나타내기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 아미노산은 자연 발생 아미노산일 수 있으며, 달리 제한되지 않는 한, 자연 발생 아미노산와 유사한 방식으로 기능할 수 있는 자연 아미노산의 비-자연 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "선택적으로 혼성화한다(selectively hybridizes)"는, 엄격한 혼성화 조건하에서, 다른 핵산 서열 또는 다른 생물제제로의 핵산 서열의 혼성화에 대한 언급을 포함한다. 혼성화-기반 검출 시스템을 사용하는 경우, 참조 핵산 서열에 상보적인 핵산 프로브가 선택되며, 그 후 적합한 조건의 선택에 의해 프로브 및 참조 서열이 서로에 혼성화하거나 결합하여 이중 분자(duplex molecule)를 형성한다.
용어 "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 프로브가 다른 서열보다도 검출 가능하게 더 큰 정도로(예, 백그라운드 보다 적어도 2배 더 많이) 이의 표적 서열로 혼성화되는 조건에 대한 언급을 포함한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며 여러 상황에서 다를 것이다. 혼성화 및/또는 세척 조건의 엄격도를 조절함으로써, 프로브에 100% 상보적인 표적 서열이 확인될 수 있다(상동 프로빙).
대안적으로, 엄격한 조건은 더 낮은 정도의 유사성이 검출되도록 서열에 약간의 미스매칭을 허용하도록 조절될 수 있다(이종 프로빙). 일반적으로, 프로브는 길이가 약 1000개 뉴클레오티드 미만, 임의로 길이가 500개 뉴클레오티드 미만이다.
전형적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 염 농도가 약 1.5 M 미만 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도이고(또는 다른 염) 온도가 짧은 프로브(예, 10 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 30℃ 및 긴 프로브(예, 50개 이상 뉴클레오티드)의 경우 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 특이성(specificity)은 전형적으로 혼성화후 세척의 작용이며, 결정적인 요인은 이온 강도 및 최종 세척 용액의 온도이다. DNA /DNA 하이브리드의 경우, 열 융점(Tm)은 Meinkoth 및 Wahl의 방정식[Anal. Biochem., 138: 267-284 (1984)]으로부터 근사치를 구할 수 있다: Tm [℃] = 81.5 + 16.6 (log M) + 0.41(% GC)-0.61 (% form)-500/L; 여기서, M은 일가 양이온의 몰농도이고, % GC는 DNA 중의 구아노신 및 사이토신 뉴클레오티드의 퍼센트이며, % form은 혼성화 용액 중의 포름아미드의 퍼센트이고, L은 염기 쌍에서의 하이브리드의 길이이다. Tm은 상보성 표적 서열의 50%가 완전하게 매칭된 프로브로 혼성화되는 온도(정의된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. Tm은 각 1%의 미스매칭에 대해 약 1℃까지 감소한다; 따라서, Tm, 혼성화 및/또는 세척 조건은 목적하는 동일성의 서열로 혼성화되도록 조절될 수 있다. 예를 들면, > 90% 동일성을 갖는 서열이 추구된다면, Tm은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 이의 보체에 대한 Tm보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. 그러나, 심하게 엄격한 조건은 Tm보다 1 내지 4℃ 더 낮은 온도에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 중간 정도로 엄격한 조건은 Tm보다 6 내지 10℃ 더 낮은 온도에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있으며; 낮은 엄격도 조건은 Tm보다 11 내지 20℃ 더 낮은 온도에서 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다. 방정식, 혼성화 및 세척 조성물, 및 목적하는 Tm을 사용하여, 통상의 숙련가들은 혼성화 및/또는 세척 용액의 엄격도에 있어서의 변화가 본질적으로 설명된다는 것을 이해할 것이다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 가이드가 문헌[참조; Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); and Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, 등, Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)]에서 발견된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 도메인은 TALE의 이의 동족 표적 DNA 서열에의 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위"("반복체"라고도 함)는 전형적으로 33-35개 아미노산 길이이며 자연 발생 TALE 단백질 내에서 다른 TALE 반복 서열과 적어도 약간의 서열 상동성을 나타낸다. 징크 핑거 및 TALE 결합 도메인은 자연 발생 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 소정의 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 따라서, 조작된 DNA 결합 단백질(징크 핑거 또는 TALE)은 비-자연 발생적인 단백질이다. DNA-결합 단백질을 조작하기 위한 방법의 비제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 설계/조성이 주로 합리적 기준으로부터 야기되는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준은 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 데이터베이스 저장 정보에서 정보를 처리하기 위한 전산화 알고리즘 및 대입 규칙의 적용을 포함한다. 예를 들면, U.S. Pat. Nos. 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 U.S. 공개 No. 20110301073을 참조한다.
본원에서 사용되는 "벡터"는 숙주 세포의 형질감염에 사용되고 폴리뉴클레오티드에 삽입될 수 있는 핵산에 대한 언급을 포함한다. 벡터는 종종 레플리콘이다. 발현 벡터는 그 안에 삽입된 핵산의 전사를 가능케 한다.
"야생형"은 유전자 편집 또는 달리 유전자 변형되지 않았으며 통상적으로 자연 발생 변종으로부터 발달된 동계교배 및 이계교배된 변종인 동물 및 이로부터 유도된 배반포, 배아 또는 세포를 의미한다.
"징크 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열-특이 방식으로 DNA에 결합하는 단백질, 또는 보다 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 징크 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
"선택된" 징크 핑거 단백질 또는 TALE는 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 실험 과정으로부터 주로 생산되는, 자연에서는 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들면, U.S. Pat. No. 5,789,538; U.S. Pat. No. 5,925,523; U.S. Pat. No. 6,007,988; U.S. Pat. No. 6,013,453; U.S. Pat. No. 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084 및 U.S. 공개 No. 20110301073을 참조한다.
하기 용어들은 본 발명의 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드와 참조 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 간의 서열 관계를 설명하기 위해 사용된다: (a)"참조 서열", (b)"비교 창(comparison window)", (c) "서열 동일성", 및 (d)"서열 동일성 퍼센트".
(a) 본원에서 사용되는 "참조 서열"은 본 발명의 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드와의 서열 비교를 위한 기초로서 사용되는 정의된 서열이다. 참조 서열은 명시된 서열의 서브세트 또는 명시된 서열의 전체일 수 있다; 예를 들면, 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 세그먼트, 또는 완전 cDNA 또는 유전자 서열.
(b) 본원에서 사용되는 "비교 창"은 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열의 인접한 특정 세그먼트에 대한 언급을 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열은 참조 서열과 비교될 수 있으며 비교 창에서 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참고 서열에 비해 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 비교 창은 적어도 20개 인접 뉴클레오티드/아미노산 잔기 길이이고, 임의로 30, 40, 50, 100, 또는 그보다 더 길 수 있다. 당업계의 숙련가들은 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열에의 갭 포함으로 인한 참조 서열과의 높은 유사성을 피하기 위해, 갭 패널티가 전형적으로 도입되며 이것은 매치 횟수(number of matches)에서 뺀다는 것을 이해한다.
비교를 위한 서열의 정렬방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 스미스 및 워터먼의 로컬 상동성 알고리즘[local homology algorithm of Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482(1981)]; 니들먼과 번슈의 상동성 정렬 알고리즘[the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]; 피어슨과 리프먼의 유사성 방법에 대한 검색[the search for similarity method of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 (1988)]; 및 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이들 알고리즘의 전산화된 구현에 의해 수행될 수 있다: CLUSTAL in the PC/Gene program by Intelligenetics, Mountain View, California; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA, and related programs in the GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version 10 (available from Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA). CLUSTAL 프로그램은 문헌[Higgins and Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, 등, Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, 등, Computer Applications in the Biosciences 8 : 155-65 (1992), and Pearson, 등, Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994)]에 의해 잘 설명된다.
데이터베이스 유사성 검색에 사용될 수 있는 BLAST 계열의 프로그램은 다음을 포함한다: 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 쿼리 서열(query sequence)의 경우 BLASTN; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 쿼리 서열의 경우 BLASTX; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 단백질 쿼리 서열의 경우 BLASTP; 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 단백질 쿼리 서열의 경우 TBLASTN; 및 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 쿼리 서열의 경우 TBLASTX. 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, 등, Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995); Altschul 등, J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); and, Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)]을 참조한다. BLAST 분석을 실행하기 위한 소프트웨어는, 예를 들면, 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이러한 알고리즘은 다수의 간행물에 충분히 기재되어 있다. 예를 들면, 문헌[Altschul SF 등, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, 25 NUCLEIC ACIDs Res. 3389 (1997); National Center for Biotechnology Information ,The NCBI Handbook [Internet], Chapter 16: The BLAST Sequence Analysis Tool (McEntyre J, Ostell J, eds., 2002), available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21097/pdf/ch16.pdf]을 참조한다. 아미노산 서열에 대한 BLASTP 프로그램 또한 충분히 기재되어 있다(문헌 참조; Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
서열 동일성 퍼센트를 계산하는 것에 더하여, BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들면, 문헌 참조; Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877 (1993)). 여러 저-복잡도 필터 프로그램이 이러한 저-복잡 정렬을 감소시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, SEG(Wooten and Federhen, Comput. Chem., 17: 149-163 (1993)) 및 XNU(Claverie and States, Comput. Chem., 17: 191-201 (1993)) 저-복잡도 필터가 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 제공된 뉴클레오티드 및 단백질 동일성/유사성 값은 디폴트 값 아래에서 GAP(GCG Version 10)를 사용하여 계산된다. GAP(Global Alignment Program)는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 참조 서열과 비교하는 데에도 사용될 수 있다. GAP는 매치의 수는 최대화하고 갭의 수는 최소화시키는 두 개의 완전 서열의 정렬을 찾아내기 위해 니들먼과 번슈의 알고리즘(J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970)을 사용한다. GAP는 최고의 정렬의 패밀리의 하나의 멤버를 나타낸다. 이 패밀리에는 여러 멤버가 있을 수 있지만, 어떤 다른 멤버도 더 나은 품질을 갖지는 못한다. GAP는 정렬을 위해 네 개의 성능 지수(figures of merit)를 나타낸다: 품질(Quality), 비율(Ratio), 동일성(Identity), 및 유사성(Similarity). 품질은 서열을 정렬하기 위해 최대화되는 측정지표(metric)이다. 비율은 품질을 보다 짧은 세그먼트에서 염기의 수로 나눈 것이다. 동일성 퍼센트는 실제 매치하는 기호의 퍼센트이다. 유사성 퍼센트는 유사한 기호의 퍼센트이다. 갭의 바로 맞은편에 있는 기호는 무시한다. 유사성은 한 쌍의 기호에 대한 스코어링 매트릭스 값이 유사성 역치인 0.50 이상인 경우 스코어링된다. 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지의 버젼 10에서 사용된 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62 (참조; Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915)이다.
서열의 다중 정렬은 디폴트 파라미터(GAPPENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)와 CLUSTAL 정렬법(Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153)을 사용하여 수행될 수 있다. CLUSTAL 방법을 사용한 짝 정렬(pairwise alignment)을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5를 포함한다.
(c) 본원에 사용되는 바와 같이, 두 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 창에 걸쳐 최대 상응성을 위해 정렬되는 경우 동일한 두 개의 서열에서의 잔기에 대한 언급을 포함한다. 서열 동일성의 퍼센트가 단백질에 대해 사용되는 경우 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존적 아미노산 치환에 따라 다르며, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 따라서 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는 것으로 인지된다. 서열이 보존적 치환에 있어서 상이한 경우, 서열 동일성 퍼센트는 치환의 보존적 성질을 교정하는 쪽으로 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열들을 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 한다. 이러한 조정을 이루어기 위한 방법은 당업계의 숙련가들에게 널리 알려져 있다. 전형적으로 이것은 전체 미스매치(full mismatch)라기 보다는 부분 미스매치로서 보존적 치환을 스코어하고, 이에 의해 서열 동일성 퍼센트를 증가시킴을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 동일한 아미노산이 1의 스코어를 받고 비-보존적 치환이 0의 스코어를 받는 경우, 보존적 치환은 0과 1 사이의 스코어를 받는다. 보존적 치환의 스코어링은, 예를 들면 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA)에서 실행되는 바와 같이, 마이어스와 밀러의 알고리즘[Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1988)]에 따라 계산될 수 있다.
(d) 본원에서 사용되는 바와 같이, "서열 동일성의 퍼센트"는 비교 창에 걸쳐 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 의미하며, 여기서 비교 창에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 개의 서열의 최적 정렬을 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센트는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 개의 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 구하여 매치된 위치의 수를 산출하고, 매치된 위치의 수를 비교 창에서의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 산출함으로써 계산된다.
CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 갖는 동물 및 세포
CD163은 17개 엑손을 갖고 단백질은 9개 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(SRCR) 도메인을 갖는 세포외 영역, 막관통 세그먼트, 및 짧은 세포질 꼬리로 이루어진다. 몇 개의 상이한 변이체는 단일 유전자의 차등 스플라이싱(differential splicing)으로부터 야기된다(Ritter 등 1999a; Ritter 등 1999b). 이러한 변형의 대부분은 세포질 꼬리의 길이가 차지한다.
CD163은 합토글로빈-헤모글로빈 스캐빈저 수용체로서 작용함을 포함하여 다수의 중요한 기능을 갖는다. 헴(heme) 그룹이 매우 독성일 수 있기 때문에, 혈중 유리 헤모글로빈의 제거는 CD163의 중요한 기능이다(Kristiansen 등 2001). CD163은 세포내이입(endocytosis)을 촉진시키는 세포질 꼬리를 갖는다. 이 꼬리의 돌연변이는 감소된 합토글로빈-헤모글로빈 착물 흡수를 초래한다(Nielsen 등 2006). C163의 또 다른 기능은 적아세포 부착성(SRCR2), TWEAK 수용체(SRCR1-4 & 6-9), 박테리아 수용체(SRCR5), 아프리카 돼지 바이러스 수용체(Sanchez-Tones 등 2003), 및 면역-조절제로서의 잠재적인 역할(문헌(Van Gorp 등 2010a)에 논의됨)을 포함한다. 이러한 중요한 기능을 고려하여, CD163의 완전한 녹-아웃이 생존할 수 없거나 심각하게 손상된 동물을 생산할 것으로 이전에 생각되었다(예를 들면, PCT 공개 번호 2012/158828 참조).
CD163은 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(SRCR) 수퍼패밀리의 멤버이며 세포내 도메인 및 9개 세포외 SRCR 도메인으로 이루어진다. 인간에서 SRCR3을 통한 CD163 매개된 헤모글로빈-헴 섭취의 세포내 이입은 산화 스트레스로부터 세포를 보호한다(Schaer 등, 2006a; Schaer 등, 2006b; Schaer 등, 2006c). CD163은 또한 아폽토시스의 종양 괴사 인자-유사 약한 유도인자에 대한 수용체(TWEAK: SRCR1-4 & 6-9), 병원균 수용체(African Swine Fever Virus; bacteria: SRCR2), 및 적아세포 결합(SRCR2)으로서 작용한다.
CD163은 여러 상이한 병원균에 의한 감염에서 역할을 하며 따라서 본 발명은 PRRSV 감염에 대해 감소된 민감성을 갖는 동물에 제한되지 않을 뿐만 아니라 세포에의 감염을 위해 또는 세포에서의 후기 복제 및/또는 잔존을 위해 CD163에 의존하는 임의의 병원균에 대해 감소된 민감성을 갖는 동물을 포함한다. PRRSV의 감염 경로는 폐포 대식세포의 표면 상에서 헤파란 설페이트에의 초기 결합에서 시작한다. 2013년 이전에는 확실한 결합이 이후 시알로어드헤신(sialoadhesin)(SIGLEC1, 또한 CD169 또는 SN라고도 함)에 대해 발생한다고 생각되었다. 그 후 바이러스가 클라테린(clatherin)-매개된 세포내이입을 통해 내재화된다. 또 다른 분자, CD163이 그 후 엔도솜에서 바이러스의 탈외피(uncoating)를 촉진시킨다(Van Breedam 등 2010a). 바이러스 게놈이 방출되고 세포가 감염된다.
본원에는 동물에 병원균(예, PRRSV)에 의한 감염에 대해 개선된 또는 완전한 내성을 부여하는, CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열, 예, 삽입 또는 결실("INDEL")을 포함하는 동물 및 이의 자손 및 세포가 기재된다. 본 출원인은 CD163이 PRRSV 감염에 있어 중요한 유전자이며 시조 내성 동물 및 계통을 창조한다는 것을 입증하였다.
본 발명은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전자 변형 동물, 이의 자손, 또는 동물 세포를 제공한다. 본 발명은 이전에 PRRSV 내성에 중요한 것으로 상정되었던 SIGLEC1 (CD169) 유전자의 불활성화 또는 편집을 포함하지 않는다.
편집된 염색체 서열은 (1) 불활성화되거나, (2) 변형되거나, (3) 무반응 돌연변이를 야기하는 통합된 서열을 포함할 수 있다. 불활성화된 염색체 서열은 CD163 단백질 기능이 PRRSV 감염과 관련됨에 따라 이를 손상시키거나, 감소시키거나, 제거하도록 변경된다. 따라서, 불활성화된 염색체 서열을 포함하는 유전자 편집된 동물을 "녹 아웃" 또는 "조건적 녹 아웃(conditional knock out)"이라고 부를 수 있다. 유사하게, 통합된 서열을 포함하는 유전자 편집된 동물을 "녹 인" 또는 "조건적 녹 인(conditional knock in)"이라고 부를 수 있다. 게다가, 변형된 염색체 서열을 포함하는 유전자 편집된 동물은 표적화된 점 돌연변이(들) 또는 변형된 단백질 산물이 생산되도록 하는 기타의 변형을 포함할 수 있다. 간략하게, 과정은 배아 또는 세포에 표적 징크 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 적어도 하나의 RNA 분자 및, 임의로, 적어도 하나의 부(accessory) 폴리뉴클레오티드를 도입함을 포함할 수 있다. 방법은 징크 핑거 뉴클레아제의 발현을 가능케 하도록 배아 또는 세포를 배양함을 추가로 포함하며, 여기서 징크 핑거 뉴클레아제에 의해 표적화 염색체 서열에 도입된 이중-가닥 절단(double-stranded break)은 오류-유발 비-상동 말단-접합 DNA 복구 과정 또는 상동-지시(homology-directed) DNA 복구 과정에 의해 복구된다. 표적화 징크 핑거 뉴클레아제 기술을 사용하여 생식계통 발달과 관련된 단백질을 암호화하는 염색체 서열을 편집하는 방법은 신속하고, 정확하며, 매우 효율적이다.
대안적으로, 과정은 게놈 서열을 변형시키기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용함을 포함할 수 있다. 게놈 서열을 변형시키기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하면, 단백질이 세포로 직접 전달될 수 있거나, Cas9를 암호화하는 mRNA가 세포로 전달될 수 있거나, Cas9를 암호화하는 mRNA의 발현을 제공하는 유전자가 세포로 전달될 수 있다. 또한, 표적 특이 crRNA 및 tracrRNA가 세포로 직접 전달될 수 있거나 표적 특이 gRNA(들)가 세포로 전달될 수 있다(이들 RNAs는 대안적으로 이러한 RNAs를 발현하도록 작제된 유전자에 의해 생산될 수 있다). crRNA/gRNA의 설계 및 표적 부위의 선택은 당업계에 널리 공지되어 있다. gRNAs의 작제 및 클로닝은 http://www.genome-engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/CRISPR-Reagent-Description-Rev20140509.pdf에서 찾아볼 수 있다.
적어도 하나의 CD163 유전자좌가 부위-특이 편집을 위한 표적 부위로서 사용될 수 있다. 부위-특이 편집은 외인성 핵산(예, 관심 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산)의 삽입 또는 유전자좌로부터의 핵산의 결실을 포함할 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산의 통합 및/또는 게놈 핵산의 일부의 결실은 붕괴된(즉, CD163 단백질의 활성 감소) CD163 유전자를 생산하도록 유전자좌를 변형시킬 수 있다.
본원에는 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 비-인간 동물, 상기 동물의 자손, 및 동물 세포가 제공된다.
CD163 단백질을 암호화하는 유전자에서의 염색체 서열의 변형은 병원균(예, PRRSV와 같은 바이러스)에 의한 감염에 대한 동물, 자손, 또는 세포의 민감성을 병원균에 의한 감염에 대한 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 동물, 자손, 또는 세포의 민감성에 비해 감소시킨다.
동물 또는 자손은 배아, 청소년(juvenile), 또는 성인일 수 있다. 유사하게, 세포는 배아 세포, 청소년 동물로부터 유도된 세포, 또는 성인 동물로부터 유도된 세포를 포함할 수 있다.
동물 또는 자손은 사육 동물을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 세포는 사육 동물로부터 유도된 세포를 포함할 수 있다. 사육 동물은 가축 동물, 예를 들면 돼지 동물, 소 동물(예, 육우 또는 젖소), 양 동물, 염소 동물, 말과 동물(예, 말 또는 당나귀), 물소, 낙타, 또는 조류 동물(예, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 뿔닭, 또는 갓 부화한 새)를 포함할 수 있다. 가축 동물은 바람직하게는 소 또는 돼지 동물이고, 가장 바람직하게는 돼지 동물이다.
동물 또는 자손은 유전자 편집된 동물을 포함할 수 있다. 세포는 유전자 편집된 세포를 포함할 수 있다.
동물 또는 세포는 호밍 엔도뉴클레아제를 사용하여 유전자 편집될 수 있다. 호밍 엔도뉴클레아제는 자연 발생 엔도뉴클레아제일 수 있지만, 엔도뉴클레아제가 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 염색체 서열을 표적화하도록 설계된 DNA 인식 서열을 갖는 합리적으로 설계된 비-자연 발생 호밍 엔도뉴클레아제인 것이 바람직하다. 따라서, 호밍 엔도뉴클레아제는 설계된 호밍 엔도뉴클레아제일 수 있다. 호밍 엔도뉴클레아제는, 예를 들면, CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 시스템, 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), ZFN(징크 핑거 뉴클레아제), 재조합효소 융합 단백질, 메가뉴클레아제, 또는 이들의 조합)을 포함할 수 있다. 동물 또는 세포는 바람직하게는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 유전자 편집된 동물 또는 세포이다.
유전자 편집된 동물, 이의 자손, 또는 유전자 편집된 세포는 바람직하게는 비-편집된 동물에 비해 병원균(예, PRRSV와 같은 바이러스)에 대해 증가된 내성을 나타낸다.
동물, 자손, 또는 세포는 변형된 염색체 서열에 대해 이형접합성일 수 있다. 대안적으로, 동물, 자손, 또는 세포는 변형된 염색체 서열에 대해 동형접합성일 수 있다.
어느 동물, 자손 또는 세포에서도, 변형된 염색체 서열은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 삽입, CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 결실, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 변형된 염색체 서열은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 결실(예, 인-프레임 결실)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 변형된 염색체 서열은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 삽입을 포함할 수 있다.
삽입 또는 결실은 CD163 단백질 생산 또는 활성을 삽입 또는 결실이 없는 동물, 자손, 또는 세포에서의 CD163 단백질 생산 또는 활성에 비해 감소시킬 수 있다.
삽입 또는 결실은 동물, 자손, 또는 세포에 의한 실질적으로 비 기능성 CD163 단백질의 생산을 야기할 수 있다. "실질적으로 비 기능성 CD163 단백질"이란, 동물, 자손, 또는 세포 중의 CD163 단백질의 수준이 감지할 수 없거나, 감지할 수 있더라도, 삽입 또는 결실을 포함하지 않는 동물, 자손, 또는 세포에서 관찰되는 수준보다 적어도 약 90% 낮음을 의미한다.
동물, 자손, 또는 세포가 돼지 동물, 자손, 또는 세포를 포함하는 경우, 변형된 염색체 서열은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7, CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 8, CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7 또는 엑손 8과 인접한 인트론, 또는 이의 조합에 변형을 포함할 수 있다. 변형된 염색체 서열은 적절하게는 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7에 변형을 포함한다.
CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7에서의 변형은 결실(예, 엑손 7에서의 인-프레임 결실)을 포함할 수 있다. 대안적으로, CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7에서의 변형은 삽입을 포함할 수 있다.
어느 돼지 동물, 자손, 또는 세포에서도, 변형은 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,137 내지 뉴클레오티드 3,147의 11개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149와 3,150 사이의 2개 염기 쌍 삽입과 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573 내지 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,147의 124개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,146의 123개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,147과 3,148 사이의 1개 염기 쌍 삽입; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,159의 130개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,161의 132개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 1,525 내지 뉴클레오티드 3,030의 1506개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 사이에 7개 염기 쌍 삽입; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,818 내지 뉴클레오티드 4,097의 1280개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,724 내지 뉴클레오티드 4,096의 1373개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,431 내지 뉴클레오티드 3,897의 1467개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 4,531의 1387개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체된다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,440 내지 뉴클레오티드 4,160의 1720개 염기 쌍 결실; 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
서열 번호 47은 야생형 돼지 CD163 유전자의 엑손 7의 업스트림에 3000개 염기 쌍(bp)에서 시작하여 이 유전자의 엑손 10의 마지막 염기까지의 영역을 위한 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 서열 번호 47은 본원에서 참조 서열로서 사용되며 도 16에 나타내어져 있다.
돼지 동물 또는 세포가 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149와 3,150 사이에 2개 염기 쌍 삽입을 포함하는 경우, 2개 염기 쌍 삽입은 디뉴클레오티드 AG의 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포가 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,147과 3,148 사이에 1개 염기 쌍 삽입을 포함하는 경우, 1개 염기 쌍 삽입은 단일 아데닌 잔기의 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포가 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 사이에 7개 염기 쌍 삽입을 포함하는 경우, 7개 염기 쌍 삽입은 서열 TACTACT(서열 번호 115)의 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포가 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실을 포함하고, 여기서, 결실된 서열이 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있는 경우, 12개 염기 쌍 삽입은 서열 TGTGGAGAATTC(서열 번호 116)의 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포가 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실을 포함하고, 여기서 결실된 서열이 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체되는 경우, 11개 염기 쌍 삽입은 서열 AGCCAGCGTGC (서열 번호 117)의 삽입을 포함할 수 있다.
CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 변형된 염색체 서열이 결실을 포함하는 경우, 결실은 바람직하게는 인-프레임 결실을 포함한다. 인-프레임 결실은 삼중조 해독 프레임(triplet reading frame)에 있어서의 변화를 야기하지 않고, 따라서 하나 이상의 아미노산의 내부 결실을 갖지만 끝이 잘리지는 않은 단백질 산물을 초래하는 결실이다. 스플라이싱이 정확하게 일어난다고 하면, 엑손 내의 3개 염기 쌍 또는 3개 염기 쌍의 배수의 결실이 인-프레임 돌연변이를 초래할 수 있다.
돼지 동물 및 세포에 대해 본원에 기재된 다음의 INDEL이 인-프레임 결실을 야기할 것으로 예상되는데, 그 이유는 돼지 CD163 유전자의 엑손 7 내의 결실이 3의 배수이기 때문이다: 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 1,525 내지 뉴클레오티드 3,030의 1506개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,724 내지 뉴클레오티드 4,096의 1373개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,146의 123개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,431 내지 뉴클레오티드 3,897의 1467개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 4,531의 1387개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체된다); 및 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,440 내지 뉴클레오티드 4,160의 1720개 염기 쌍 결실.
따라서, 돼지 동물 및 세포에서, CD163 단백질을 암호화하는 유전자에서의 삽입 또는 결실은 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 1,525 내지 뉴클레오티드 3,030의 1506개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,724 내지 뉴클레오티드 4,096의 1373개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,146의 123개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,431 내지 뉴클레오티드 3,897의 1467개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 4,5311387개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체된다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,440 내지 뉴클레오티드 4,160의 1720개 염기 쌍 결실; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인-프레임 결실을 엑손 7에 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다: 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149와 3,150 사이의 2개 염기 쌍 삽입 및 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573 내지 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실; 및 이들의 조합. 예를 들면, 동물 또는 세포는 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149와 3,150 사이에 2개 염기 쌍 삽입, 및 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573 내지 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다. 동물 또는 세포는 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 사이에 7개 염기 쌍 삽입 및 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,137 내지 뉴클레오티드 3,147의 11개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
상기한 삽입 또는 결실 중의 어느 것을 포함하는 돼지 동물 또는 세포는 삽입 또는 결실 외에 서열 번호 47에 대해 고도의 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 돼지 동물 또는 세포는 삽입 또는 결실 외에 염색체 서열의 영역에서 서열 번호 47에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 서열 번호 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 또는 114를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다. 이하에서 실시예에 추가로 기재된 바와 같이, 서열 번호 98-114는 서열 번호 47에 제공된 야생형 돼지 CD163의 영역에 상응하는 영역에 대해 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 본원에 기재되어 있는 돼지 CD163 염색체 서열에 삽입 또는 결실을 포함한다.
예를 들면, 돼지 동물 또는 세포는 서열 번호 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113, 또는 114를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다. 서열 번호 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113, 또는 114는 돼지 CD163 염색체 서열의 엑손 7에서 인-프레임 결실을 위해 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
또 다른 예로서, 돼지 동물 또는 세포는 서열 번호 103 또는 111을 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 11개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 2개 염기 쌍 삽입과 377개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 124개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 123개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 1개 염기 쌍 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 130개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 132개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 1506개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 7개 염기 쌍 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 1280개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 1373개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 1467개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 인트론 6 결실과 뉴클레오티드 4,488에 12개 염기 쌍 부가 및 엑손 7에 추가의 129개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 28개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 1387개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
돼지 동물 또는 세포는 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 1382개 염기 쌍 결실과 11개 염기 쌍 삽입 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 1720개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 세포 중의 어느 것은 정자 세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들 세포 중의 어느 것은 난 세포(예, 수정란)를 포함할 수 있다.
CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 세포 중의 어느 것은 체세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포 중의 어느 것은 섬유아세포(예, 태아 섬유아세포)를 포함할 수 있다.
CD163
유전자좌에서의
핵산의
표적화된
통합
CD163 유전자좌에서의 외인성 핵산의 부위-특이 통합은 당업계의 숙련가들에게 공지된 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, CD163 유전자좌에서의 외인성 핵산의 통합은 세포(예, 단리된 세포 또는 조직 또는 유기체의 세포)를 외인성 핵산을 포함하는 핵산 분자와 접촉시킴을 포함할 수 있다. 이러한 핵산 분자는 핵산 분자와 적어도 하나의 CD163 유전자좌 간의 상동 재조합을 촉진시키는 외인성 핵산 측면에 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상동 재조합을 촉진시키는 외인성 핵산 측면에 있는 뉴클레오티드 서열은 CD163 유전자좌의 내인성 뉴클레오티드에 상보성일 수 있다. 대안적으로, 상동 재조합을 촉진시키는 외인성 핵산 측면에 있는 뉴클레오티드 서열은 이전의 통합된 외인성 뉴클레오티드에 상보성일 수 있다. 다수의 외인성 핵산은 유전자 스태킹(gene stacking)에서와 같이 하나의 CD163 유전자좌에서 통합될 수 있다.
CD163 유전자좌에서의 핵산의 통합은, 예를 들면 내인성 DNA 및 내인성 재조합 효소와 같지만 이에 제한되지 않는 숙주 세포의 내인성 세포 기전(cellular machinery)에 의해 촉진(예, 촉매)될 수 있다. 대안적으로, CD163 유전자좌에서의 핵산의 통합은 숙주 세포에 제공되는 하나 이상의 인자(예, 폴리펩티드)에 의해 촉진될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레아제(들), 재조합효소(들), 및/또는 리가제 폴리펩티드는 폴리펩티드를 숙주 세포와 접촉시킴으로써, 또는 폴리펩티드를 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 (독립적으로 또는 키메라 폴리펩티드의 일부로서) 제공될 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 뉴클레아제, 재조합 효소, 및/또는 리가제 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 CD163 유전자좌에 부위-특이적으로 통합되는 핵산과 동시에 또는 연속하여 숙주 세포에 도입될 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 뉴클레아제, 재조합 효소, 및/또는 리가제 폴리펩티드는 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다.
DNA-결합 폴리펩티드
부위-특이 통합은, 예를 들면, 숙주 유기체의 게놈에서 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하여 결합할 수 있는 인자들을 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 다수의 단백질은 부위-특이 방식으로 DNA를 인식하여 결합할 수 있는 폴리펩티드 도메인을 포함한다. DNA-결합 폴리펩티드에 의해 인식되는 DNA 서열을 "표적" 서열이라고 할 수 있다. 부위-특이 방식으로 DNA를 인식하여 결합할 수 있는 폴리펩티드 도메인은, 도메인이 원래 분리되었던 단백질 이외의 폴리펩티드에서 발현되는 경우에라도, 일반적으로 정확하게 접히고 부위-특이 방식으로 DNA에 결합하기 위해 독립적으로 기능한다. 유사하게, DNA-결합 폴리펩티드에 의한 인식 및 결합을 위한 표적 서열은 일반적으로, 큰 DNA 구조(예, 염색체)에 존재하는 경우에도, 특히 표적 서열이 위치하는 부위가 가용성 세포 단백질(예, 유전자)에 접근 가능한 것으로 알려진 것인 경우에도, 이러한 폴리펩티드에 의해 인식되고 결합될 수 있다.
자연에 존재하는 단백질로부터 동정된 DNA-결합 폴리펩티드는 전형적으로 별개의 뉴클레오티드 서열 또는 모티프(예, 컨센서스 인식 서열)에 결합하지만, 상이한 뉴클레오티드 서열 또는 모티프를 인식하도록 이러한 다수의 DNA-결합 폴리펩티드를 변형시키기 위한 방법들이 존재하고 당업계에 공지되어 있다. DNA-결합 폴리펩티드는, 예를 들면 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 징크 핑거 DNA-결합 도메인; 류신 지퍼; UPA DNA-결합 도메인; GAL4; TAL; LexA; Tet 억제인자; LacI; 및 스테로이드 호르몬 수용체.
예를 들면, DNA-결합 폴리펩티드는 징크 핑거일 수 있다. 개별 징크 핑거 모티프는 매우 다양한 DNA 부위 중의 어느 것을 표적화하고 이에 특이적으로 결합하도록 설계될 수 있다. 정준(canonical) Cys2His2 (뿐만 아니라 비-정준 Cys3His) 징크 핑거 폴리펩티드는 α-나선을 표적 DNA 이중 나선의 주홈(major groove)에 삽입함으로써 DNA에 결합한다. 징크 핑거에 의한 DNA의 인식은 모듈식이다; 각각의 핑거는 주로 표적 중의 3개의 보존적 염기 쌍과 접촉하고, 폴리펩티드 중의 몇 개의 주요 잔기가 인식을 매개한다. 표적화 엔도뉴클레아제에 다중 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 포함시킴으로써, 표적화 엔도뉴클레아제의 DNA-결합 특이성이 더욱 증가될 수 있다(따라서 이에 의해 부여된 임의의 유전자 조절 효과의 특이성 또한 증가될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Urnov 등 (2005) Nature 435:646-51]을 참조한다. 따라서, 하나 이상의 징크 핑거 DNA-결합 폴리펩티드는 숙주 세포에 도입된 표적화 엔도뉴클레아제가 숙주 세포의 게놈 내에 특유의 DNA 서열과 상호작용하도록 조작되고 이용될 수 있다.
바람직하게는, 징크 핑거 단백질은 선택되는 표적 부위에 결합하도록 조작된다는 점에서 비-자연 발생적이다. 예를 들면, 문헌[Beerli 등 (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo 등 (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan 등 (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal 등 (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo 등 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; U.S. Pat. Nos. 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 U.S. 특허 공개 Nos. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061]을 참조한다.
조작된 징크 핑거 결합 도메인은 자연-발생 징크 핑거 단백질에 비해 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작방법은 합리적 설계(rational design) 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 합리적 설게는, 예를 들면, 삼중조(또는 사중조) 뉴클레오티드 서열 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용함을 포함하며, 여기서 각각의 3개조 또는 4개조 뉴클레오티드 서열은 특정 3개조 또는 4개조 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들면, U.S. Pat. Nos. 6,453,242 및 6,534,261을 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선택방법이 U.S. Pat. Nos. 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증진은, 예를 들면, WO 02/077227에 기술되어 있다.
또한, 이들 및 기타 참고문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 멀티-핑거드(multi-fingered) 징크 핑거 단백질은, 예를 들면, 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함한 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 U.S. Pat. Nos. 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 징크 핑거들 간의 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표적 부위의 선택: ZFP 및 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 작제를 위한 방법은 당업계의 숙련가들에게 알려져 있으며 U.S. Pat. Nos. 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496에 상세하게 기재되어 있다.
또한, 이들 및 기타 참고문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 멀티-핑거드 징크 핑거 단백질은, 예를 들면, 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함한 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해서는 U.S. Pat. Nos. 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 징크 핑거들 간의 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
대안적으로, DNA-결합 폴리펩티드는 GAL4로부터의 DNA-결합 도메인이다. GAL4는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)에서는 모듈식 전사활성인자(modular transactivator)이지만, 이것은 또한 여러 다른 유기체에서 전사활성인자로서 작동한다. 예를 들면, 문헌[Sadowski 등 (1988) Nature 335:563-4]을 참조한다. 이러한 조절 시스템에서, S. 세레비시에에서 갈락토스 메사 경로의 효소를 암호화하는 유전자의 발현은 이용 가능한 탄소 공급원에 의해 엄격히 조절된다[문헌 참조; Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51:458-76]. 이러한 대사 효소의 전사 조절은 양성 조절 단백질, GAL4, 및 GAL4가 특이적으로 결합하는 17 bp 대칭 DNA 서열(업스트림 활성화 서열(UAS)) 간의 상호작용에 의해 매개된다.
네이티브 GAL4는 99 kDa의 분자량을 갖는 881개 아미노산 잔기로 이루어진다. GAL4는 기능적으로 자율성인 도메인을 포함하며, 이의 조합된 활성이 생체내 GAL4의 활성을 설명한다[문헌 참조; Ma and Ptashne (1987) Cell 48:847-53); Brent and Ptashne (1985) Cell 43(3 Pt 2):729-36]. GAL4의 N-말단 65개 아미노산은 GAL4 DNA-결합 도메인을 포함한다[문헌 참조; Keegan 등 (1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nature 328:353-5]. 서열-특이 결합은 DNA 결합 도메인에 존재하는 6개 Cys 잔기에 의해 배위된 2가 양이온의 존재를 필요로 한다. 배위된 양이온-함유 도메인은 DNA 나선의 주홈과의 직접 접촉을 통해 17 bp UAS의 각 말단에서 보존 CCG 삼중조와 상호작용하여 인식한다[문헌 참조; Marmorstein 등 (1992) Nature 356:408-14]. 단백질의 DNA-결합 기능은 활성화 도메인이 전사를 수행할 수 있도록 C-말단 전사 활성화 도메인을 촉진제의 근처에 배치한다.
사용될 수 있는 추가의 DNA-결합 폴리펩티드는, 예를 들면, 제한함이 없이, AVRBS3-유도성 유전자로부터의 결합 서열; AVRBS3-유도성 유전자로부터의 컨센서스 결합 서열 또는 이로부터 조작된 합성 결합 서열(예, UPA DNA-결합 도메인); TAL; LexA(예를 들면, 참조; Brent & Ptashne (1985), supra); LacR(예를 들면, 참조; Labow 등 (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-56; Baim 등 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(12):5072-6); 스테로이드 호르몬 수용체(Ellliston 등 (1990) J. Biol. Chem. 265:11517-121); Tet 억제인자(U.S. Pat. No. 6,271,341) 및 테트라사이클린(Tc)의 부재가 아닌 존재하에서 Tet 작동인자 서열에 결합하는 돌연변이된 Tet 억제인자; NF-kappaB의 DNA-결합 도메인; 및 GAL4, 호르몬 수용체, 및 VP16의 융합을 이용하는 문헌[참조; Wang 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(17):8180-4]에 기재된 조절 시스템의 성분을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용되는 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된(비-자연 발생) TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, U.S. 특허 공개 No. 2011/0301073를 참조한다.
대안적으로, 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 시스템의 RNA 성분을 암호화하는 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 유전자좌, 및 단백질을 암호화하는 Cas(CRISPR-관련) 유전자좌를 포함한다(Jansen 등, 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova 등, 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova 등, 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft 등, 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60). 미생물 숙주에서 CRISPR 유전자좌는 Cas 유전자의 조합 뿐만 아니라 CRISPR-매개된 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 인자를 함유한다.
타입 II CRISPR은 가장 잘 특성화된 시스템 중의 하나이며 표적화된 DNA 이중-가닥 파괴를 사실상 네 개의 연속 단계로 수행한다. 첫째, 두 개의 비-코딩 RNA, pre-crRNA 어레이 및 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 둘째, tracrRNA가 pre-crRNA의 반복 영역에 혼성화되어 개별 스페이서 서열을 함유하는 성숙 crRNA로의 pre-crRNA의 프로세싱을 매개한다. 셋째, 성숙 crRNA:tracrRNA 복합체가 표적 인식을 위한 추가의 필요요건인, crRNA 상의 스페이서 및 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 바로 옆의 표적 DNA 상의 프로토스페이스 사이의 Wastson-Crick 염기-대합(base-pairing)을 통해 Cas9를 표적 DNA로 지시한다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에 이중-가닥 파괴를 생성한다.
표적화된 삽입 및 결실을 생성하기 위한 CRISPR/Cas 시스템의 사용을 위해, 두 개의 비-코딩 RNA(crRNA 및 TracrRNA)를 가이드 RNA(gRNA)라고 하는 단일 RNA로 대체할 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 세 단계로 구성된다: (i) "적응(adaptation)"으로 불리는 과정에서 미래의 공격을 방지하기 위해 CRISPR 어레이로의 외인성 DNA 서열의 삽입, (ii) 관련 단백질의 발현, 뿐만 아니라 어레이의 발현 및 프로세싱에 이은 (iii) 외래 핵산으로의 RNA-매개된 간섭. 박테리아 세포에서는, 몇 가지 Cas 단백질이 CRISPR/Cas 시스템의 자연적인 기능과 연관되며 외래 DNA의 삽입 등과 같은 기능에 있어서 역할을 한다.
Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 네이티브 서열 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 네이티브 서열 폴리펩티드와 공통으로 정성적인 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는, 상응하는 네이티브 서열 폴리펩티드와 공통으로 생물학적 활성을 갖는 한, 네이티브 서열의 단편 및 네이티브 서열 폴리펩티드의 유도체 및 이의 단편을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해시키는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 공유적 변형과 이의 융합, 둘 모두를 포함한다. Cas 폴리펩티드 또는 이의 단편의 적합한 유도체는 Cas 단백질 또는 이의 단편의 돌연변이체, 융합, 공유 변형을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. Cas 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 Cas 단백질, 뿐만 아니라 Cas 단밸질 또는 이의 단편의 유도체는 세포로부터 수득될 수 있거나 화학적으로 또는 이들 두 가지 과정의 조합에 의해 합성될 수 있다. 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하는 세포, 또는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하고 내인성 Cas 단백질을 보다 높은 발현 수준으로 생산하도록 또는 외인성 도입된 핵산(핵산은 내인성 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 암호화한다)으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작되는 세포일 수 있다. 몇몇 경우에, 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하지 않으며 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다.
DNA-결합 폴리펩티드는 숙주 유기체의 게놈 핵산 내에 포함된 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열의 여러 별개의 사례들을 몇몇 예에서 숙주 게놈에서 찾을 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은 유기체의 게놈 내에서 드물 수 있다(예, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 또는 약 1 미만의 카피(들)의 표적 서열이 게놈에 존재할 수 있다). 예를 들면, 표적 뉴클레오티드 서열은 유기체의 게놈 내에 독특한 부위에 위치할 수 있다. 표적 뉴클레오티드 서열은, 예를 들면 제한함이 없이, 서로에 대해 게놈 전반에 걸쳐 무작위로 분산되거나; 게놈에서 상이한 연쇄군(linkage group)에 위치하거나; 동일한 연쇄군에 위치하거나; 상이한 염색체 상에 위치하거나; 동일한 염색체 상에 위치하거나; 유기체에서 유사한 조건하에 발현되는 부위에서 게놈에 위치하거나; 게놈에서 서로 밀접하게 위치할 수 있다(예, 표적 서열은 게놈 유전자좌에서 연쇄체(concatemer)로서 통합된 핵산 내에 포함될 수 있다).
표적화
엔도뉴클레아제
표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드는 표적 서열에 대한 특이 결합을 키메라 폴리펩티드에 부여하도록 키메라 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다. 예에서, 이러한 키메라 폴리펩티드는, 예를 들면 제한함이 없이, 뉴클레아제, 재조합효소, 및/또는 리가제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이들 폴리펩티드는 위에 기재된 바와 같다. DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제, 재조합효소, 및/또는 리가제 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 또한, 예를 들면 제한함이 없이 다음과 같은 다른 기능성 폴리펩티드 모티프 및/또는 도메인을 포함할 수 있다: 키메라 단백질에서 기능성 폴리펩티드 사이에 위치하는 스페이서 서열; 선도 펩티드; 융합 단백질을 소기관(예, 핵)에 표적화하는 펩티드; 세포 효소에 의해 절단되는 폴리펩티드; 펩티드 태그(예, Myc, His, 등); 및 키메라 폴리펩티드의 기능을 방해하지 않는 기타의 아미노산 서열.
키메라 폴리펩티드에서 기능성 폴리펩티드(예, DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드)는 작동적으로 연결될 수 있다. 키메라 폴리펩티드의 기능성 폴리펩티드는 키메라 단백질을 암호화하는 키메라 유전자를 생성하도록 각각의 다른 인-프레임에 결찰된 적어도 기능성 폴리펩티드를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로부터의 이들의 발현에 의해 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 키메라 폴리펩티드의 기능성 폴리펩티드는 독립적으로 발현된 폴리펩티드의 가교-결합에 의한 것과 같은 다른 수단에 의해 작동적으로 연결될 수 있다.
표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드, 또는 가이드 RNA는 천연의 단리된 단백질(또는 이의 돌연변이체) 내에 포함될 수 있으며, 여기서 천연의 단리된 단백질 또는 이의 돌연변이체는 또한 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함한다(그리고 재조합효소 및/또는 리가제 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있다). 이러한 단리된 단백질의 예는 TALENs, 재조합효소 (예, Cre, Hin, Tre, 및 FLP 재조합효소), RNA-안내된 CRISPR/Cas9, 및 메가뉴클레아제를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "표적화 엔도뉴클레아제"는 DNA-결합 폴리펩티드 또는 가이드 RNA 및 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함하는 천연 또는 조작된 단리된 단백질 및 이의 돌연변이체, 뿐만 아니라 DNA-결합 폴리펩티드 또는 가이드 RNA 및 뉴클레아제를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 가리킨다. CD163 유전자좌 내에 포함된 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하여 이에 결합하는 DNA-결합 폴리펩티드 또는 가이드 RNA를 포함하는 임의의 표적화 엔도뉴클레아제(예, 표적 서열이 유전자좌에서 네이티브 서열 내에 포함되기 때문에 또는 표적 서열이, 예를 들면, 재조합에 의해 유전자좌에 도입되었기 때문에)가 사용될 수 있다.
적합한 키메라 폴리펩티드의 몇 가지 예는, 제한함이 없이, 다음의 폴리펩티드들의 조합을 포함한다: 징크 핑거 DNA-결합 폴리펩티드; FokI 뉴클레아제 폴리펩티드; TALE 도메인; 류신 지퍼; 전사 인자 DNA-결합 모티프; 및, 예를 들면, 제한함이 없이, TALEN, 재조합효소(예, Cre, Hin, RecA, Tre, 및 FLP 재조합효소), RNA-안내된 CRISPR/Cas9, 메가뉴클레아제로부터 단리된 DNA 인식 및/또는 절단 도메인; 및 당업계에 공지된 기타의 것들. 특별한 예는 부위-특이 DNA 결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 포함한다. 키메라 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드를 관심의 특정 뉴클레오티드 서열에 표적화하도록, 키메라 폴리펩티드 내에 포함된 DNA-결합 폴리펩티드의 인식 서열을 변경하기 위해 당업계의 숙련가들에게 공지된 방법으로 조작될 수 있다.
키메라 폴리펩티드는 DNA-결합 도메인(예, 징크 핑거, TAL-효과기 도메인 등) 및 뉴클레아제 (절단) 도메인을 포함할 수 있다. 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들면 뉴클레아제로부터의 징크 핑거 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인 또는 TALEN DNA-결합 도메인 및 절단 도메인, 또는 상이한 뉴클레아제로부터의 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인에 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유도될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 예를 들면, 문헌[2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, Mass.; and Belfort 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소가 공지되어 있다(예, 51 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코칼 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 문헌 참조; Linn 등 (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). 이들 효소(또는 이의 기능성 단편) 중의 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 하프-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 하프-도메인은 절단 활성을 위해 이합체화를 필요로 하는, 상기 기재된 바와 같은 임의의 뉴클레아제 또는 이의 일부로부터 유도될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 하프-도메인을 포함한다면 절단을 위해 두 개의 융합 단백질이 필요하다. 대안적으로, 두 개의 절단 하프-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 두 개의 절단 하프-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 단편)으로부터 유도될 수 있거나, 각각의 절단 하프-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 단편)으로부터 유도될 수 있다. 또한, 두 개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 이들의 각각의 표적 부위에 대한 두 개의 융합 단백질의 결합이 절단 하프-도메인이, 예를 들면, 이합체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성하게 하는 공간적 배향으로 절단 하프-도메인을 위치시키도록 서로에 대해 배치된다. 따라서, 표적 부위의 모서리 근처는 5-8개 뉴클레오티드에 의해 또는 15-18개 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 그러나, 임의의 정수 개의 뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 쌍이 두 개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다(예, 2 내지 50개 뉴클레오티드 쌍 또는 그 이상). 일반적으로, 절단의 부위는 표적 부위 사이에 있다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 다수의 종에 존재하고 (인식 부위에서) DNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있으며, 예를 들면, 하나 이상의 외인성 서열(공여자/이식유전자)이 결합 (표적) 부위에서 또는 근처에서 통합되도록 결합 부위에서 또는 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예, 타입 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하며 분리 가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들면, 타입 IIS 효소 Fok I은 한 가닥 상에서는 이의 인식 부위로부터 9개 뉴클레오티드 및 다른 가닥 상에서는 이의 인식 부위로부터 13개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들면, U.S. Pat. Nos. 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 문헌[Li 등 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim 등 (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim 등 (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]을 참조한다. 따라서, 융합 단백질은 적어도 하나의 타입 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 하프-도메인) 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함할 nt 있으며, 이것은 조작될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리 가능한 예시적인 타입 IIS 제한 효소는 Fok I이다. 이러한 특정 효소는 이합체로서 활성이다[참조; Bitinaite 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575]. 따라서, 본 발명의 목적을 위하여, 개시된 융합 단백질에 사용되는 Fok I 효소의 일부는 절단 하프-도메인으로 간주된다. 따라서, 징크 핑거-Fok I 융합을 사용한 세포 서열의 표적화된 대체 및/또는 표적화된 이중-가닥 절단을 위해, FokI 절단 하프-도메인을 각각 포함하는 두 개의 융합 단백질이 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, DNA 결합 도메인 및 두 개의 Fok I 절단 하프-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 사용될 수 있다.
절단 도메인 또는 절단 하프-도메인은 절단 활성을 보유하거나 다합체화(예, 이합체화)하여 기능성 절단 도메인을 형성하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 일부일 수 있다.
예시적인 타입 IIS 제한 효소가 U.S. 특허 공개 No. 2007/0134796에 기재되어 있다. 추가의 제한 효소는 또한 분리 가능한 결합 및 절단 도메인을 함유하며, 이들은 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들면, 문헌[Roberts 등 (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조한다.
절단 도메인은, 예를 들면, U.S. 특허 공개 Nos. 2005/0064474; 2006/0188987 및 2008/0131962에 기재된 바와 같이 동형이합체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 하프-도메인(이합체화 도메인 돌연변이체라고도 함)을 포함할 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소(split-enzyme)" 기술을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체내 조립될 수 있다(예 U.S. 특허 공개 No. 20090068164 참조). 이러한 분할 효소의 성분들은 별도의 발현 작제물 상에 발현될 수 있거나, 개별 성분들이, 예를 들면, 자기-절단 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 개방 해독 프레임에서 연쇄될 수 있다. 성분들은 개별 징크 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
징크
핑거
뉴클레아제
키메라 폴리펩티드는 표적화된 부위-특이 이중-가닥 DNA 절단물을 전달하여 외인성 핵산, 또는 공여자 DNA가 통합될 수 있도록 설계될 수 있는 주문-설계된 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함할 수 있다(US 특허 공개 2010/0257638 참조). ZFN은 제한 엔도뉴클레아제(예, FokI)로부터의 비-특이 절단 도메인을 함유하는 키메라 폴리펩티드 및 징크 핑거 DNA-결합 도메인 폴리펩티드이다. 예를 들면, 문헌[Huang 등 (1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim 등 (1997a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20; Kim 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-60; Kim 등 (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7; Kim 등 (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9; Kim 등 (1997c) Gene 203:43-9; Kim 등 (1998) Biol. Chem. 379:489-95; Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26:1233-9; Smith 등 (1999) Nucleic Acids Res. 27:674-81]을 참조한다. ZFN은 비-정준 징크 핑거 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다(US 특허 공개 2008/0182332 참조). FokI 제한 엔도뉴클레아제는 DNA를 절단하고 이중-가닥 절단물을 도입하기 위해 뉴클레아제 도메인을 통해 이합체화되어야 한다. 그리하여, 이러한 엔도뉴클레아제로부터의 뉴클레아제 도메인을 함유하는 ZFN 또한 표적 DNA를 절단하기 위해 뉴클레아제 도메인의 이합체화를 필요로 한다[참조; Mani 등 (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7; Smith 등 (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9]. ZFN의 이합체화는 두 개의 인접한, 반대로 배향된 DNA-결합 부위에 의해 촉진될 수 있다. Id.
숙주의 적어도 하나의 CD163 유전자좌 내로의 외인성 핵산의 부위-특이 통합을 위한 방법은 숙주의 세포 내로 ZFN을 도입함을 포함할 수 있으며, 여기서 ZFN은 표적 뉴클레오티드 서열을 인식하여 이에 결합하고, 표적 뉴클레오티드 서열은 숙주의 적어도 하나의 CD163 유전자좌 내에 포함된다. 특정 예에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 CD163 유전자좌와는 다른 위치에서는 숙주의 게놈 내에 포함되지 않는다. 예를 들면, ZFN의 DNA-결합 폴리펩티드는 (예, CD163 유전자좌를 서열분석함으로써) 적어도 하나의 CD163 유전자좌 내에서 확인된 표적 뉴클레오티드 서열을 인식하여 이에 결합하도록 조작될 수 있다. 숙주의 세포 내로 ZFN을 도입함을 포함하는, 숙주의 적어도 하나의 CD163 성능 유전자좌 내로의 외인성 핵산의 부위-특이 통합을 위한 방법은 또한 세포 내로 외인성 핵산을 도입함을 포함할 수 있으며, 여기서, 적어도 하나의 CD163 유전자좌를 포함하는 숙주의 핵산으로의 외인성 핵산의 재조합은 표적 서열에 대한 ZFN의 부위-특이인식 및 결합(및 CD163 유전자좌를 포함하는 핵산의 후속적인 절단)에 의해 촉진된다.
CD163
유전자좌에서의
통합을 위한 임의의 외인성 핵산
CD163 유전자좌에서의 통합을 위한 외인성 핵산은 다음을 포함한다: 적어도 하나의 CD163 유전자좌에서의 부위-특이 통합을 위한 외인성 핵산, 예를 들면 제한함이 없이, ORF; 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 및 상기 중의 적어도 하나 또는 둘 다를 포함하는 벡터. 따라서, 특정 핵산은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 구조 뉴클레오티드 서열, 및/또는 DNA-결합 폴리펩티드 인식 및 결합 부위를 포함한다.
부위-특이 통합을 위한 임의의 외인성 핵산 분자
상기 주지된 바와 같이, 외인성 서열("공여자 서열" 또는 "공여자" 또는 "이식유전자"로도 불림)의 삽입이, 예를 들면, 폴리펩티드의 발현을 위해, 돌연변이 유전자의 교정을 위해 또는 야행성 유전자의 증가된 발현을 위해 제공된다. 공여자 서열은 전형적으로 이것이 배치된 게놈 서열과 동일하지 않다는 것은 쉽게 자명할 것이다. 공여자 서열은 관심 위치에서 효율적인 상동-직접 수선(HDR)을 가능케 하도록 상동성의 두 개의 영역이 측면에 있는 비-상동 서열을 함유할 수 있다. 게다가, 공여자 서열은 세포 염색질의 관심 영역에 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 공여자 분자는 세포 염색질에 상동성의 몇몇 불연속 영역을 함유할 수 있다. 예를 들면, 관심 영역에 정상적으로는 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 공여자 핵산 분자에 존재할 수 있으며 관심 영역의 서열에 대한 상동성의 서열이 측면에 있을 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으며 선형 또는 원형으로 세포에 도입될 수 있다. 예를 들면, U.S. 특허 공개 Nos. 2010/0047805, 2011/0281361, 2011/0207221, 및 2013/0326645를 참조한다. 선형으로 도입되는 경우, 공여자 서열의 말단이 당업계의 숙련가들에게 공지된 방법으로 (예를 들면, 핵산말단가수분해에 의한 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고/되거나 자기-상보적 올리고뉴클레오티드가 말단 중의 하나 또는 둘 다에 결찰된다. 예를 들면, 문헌[Chang 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls 등 (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오티드를 보호하기 위한 추가의 방법은 말단 아미노 그룹(들)의 부가 및 변형된 인터뉴클레오티드 연쇄, 예를 들면, 포스포로티오네이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 복제 개시점, 촉진제 및 항생제 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가의 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 게다가, 공여자 폴리뉴클레오티드는 네이키드(naked) 핵산으로서, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 제제와 착화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 바이러스(예, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여자는 일반적으로 이의 발현이 통합 부위에서 내인성 촉진제에 의해, 즉, 공여자가 이에 통합되도록 내인성 유전자의 발현을 구동하는 촉진제(예, CD163)에 의해 이루어지도록 통합된다. 그러나, 공여자가 촉진제 및/또는 증강자, 예를 들면 구성 촉진제 또는 유도성 또는 조직 특이성 촉진제를 포함할 수 있음은 자명할 것이다.
더욱이, 발현을 위해 필요하지는 않지만, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들면, 촉진제, 증강자, 절연제, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드 및/또는 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
CD163 유전자좌를 변형시키도록 부위-특이 방식으로 적어도 하나의 CD163 유전자좌로 통합될 수 있는 외인성 핵산은, 예를 들면 제한함이 없이, 관심 폴리펩티드를 암호하하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 작물 유전자를 포함하는 핵산; RNAi 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산; 또는 CD163 유전자를 분열하는 핵산을 포함한다.
외인성 핵산은 CD163 유전자좌를 변형시키도록 CD163 유전자좌에서 통합될 수 있으며, 여기서, 핵산은 뉴클레오티드 서열이 숙주에서 CD163 유전자좌로부터 발현되도록 관심 폴리펩티드를 암호하하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 예에서, 관심 폴리펩티드(예, 외래 단백질)는 상업적인 양으로 관심 폴리펩티드를 암호하하는 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다. 이러한 예에서, 관심 폴리펩티드는 숙주 세포, 조직, 또는 바이오매스로부터 추출될 수 있다.
표적화
엔도뉴클레아제를
암호하하는
뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자
표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 표적화 엔도뉴클레아제 내에 포함된 폴리펩티드를 암호화하는 네이티브 뉴클레오티드 서열의 조작(예, 결찰)에 의해 조작될 수 있다. 예를 들면, DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 조사하여 DNA-결합 폴리펩티드에 상응하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있고, 뉴클레오티드 서열은 DNA-결합 폴리펩티드를 포함하는 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 구성요소로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 표적화 엔도뉴클레아제의 아미노산 서열은, 예를 들면, 유전 암호의 퇴화에 따라 표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추론하는데 사용될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 예시적인 핵산 분자에서, 뉴클레아제 폴리펩티드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈, 및 DNA-결합 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈은, 예, 인트론 또는 "STOP"을 위한 코딩 없이 임의 갯수의 뉴클레오티드 삼중조에 의해 분리될 수 있다. 마찬가지로, DNA-결합 폴리펩티드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈, 및 뉴클레아제 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 첫번째 코돈은 임의 갯수의 뉴클레오티드 삼중조로 분리될 수 있다. 뉴클레아제 폴리펩티드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 및 DNA-결합 폴리펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 마지막 코돈(즉, 핵산 서열에서 대개 3')은 이에 바로 인접한 추가의 폴리뉴클레오티드 코딩 서열의 첫번째 코돈과 위상-레지스터(phase-register)에서 융합될 수 있거나, 합성 뉴클레오티드 링커(예, 융합을 달성하기 위해 사용될 수 있는 뉴클레오티드 링커)에 의해 암호화된 것과 같은 단지 짧은 펩티드 서열에 의해 이로부터 분리될 수 있다. 이러한 추가의 폴리뉴클레오티드 서열의 예는, 예를 들면 제한함이 없이, 태그, 표적화 펩티드, 및 효소 절단 부위를 포함한다. 마찬가지로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열의 대개 5'(핵산 서열에서)의 첫번째 코돈은 이에 바로 인접한 추가의 폴리뉴클레오티드 코딩 서열의 마지막 코돈과 위상-레지스터에서 융합될 수 있거나, 단지 짧은 펩티드 서열에 의해 이로부터 분리될 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제에서 기능성 폴리펩티드(예, DNA-결합 폴리펩티드 및 뉴클레아제 폴리펩티드)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 분리하는 서열은, 예를 들면, 암호화된 아미노산 서열이 표적화 엔도뉴클레아제의 번역을 상당히 변형시키지 않도록 하는 임의의 서열로 구성될 수 있다. 공지된 뉴클레아제 폴리펩티드 및 공지된 DNA-결합 폴리펩티드의 자율적인 특성(autonomous nature)으로 인해, 개재 서열이 이들 구조의 각각의 기능을 방해하지 않을 것이다.
기타의 녹아웃 방법
당업계에 공지된 기타의 다양한 기법들이 녹-아웃 동물을 만들기 위해 유전자를 불활성화시키고/시키거나 핵산 작제물을 동물에게 도입하여 시조 동물을 생산하고 동물 계열을 만드는데 사용될 수 있으며, 여기서 녹아웃 또는 핵산 작제물은 게놈 내로 통합된다. 이러한 기법들은, 제한함이 없이, 전핵 미량주사(pronuclear microinjection)(U.S. Pat. No. 4,873,191), 생식세포 계열로의 레트로바이러스 매개된 유전자 전달(Van der Putten 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-1652), 배아 줄기 세포로의 유전자 표적화(Thompson 등 (1989) Cell 56, 313-321), 배아의 전기천공(Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814), 정자-매개된 유전자 전달(Lavitrano 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 14230-14235; Lavitrano 등 (2006) Reprod. Fert. Develop. 18, 19-23), 및 체세포, 예를 들면, 난구 또는 유방 세포, 또는 성인, 태아, 또는 배아 줄기 세포의 시험관내 변환에 이은 핵 이식(Wilmut 등 (1997) Nature 385, 810-813; and Wakayama 등 (1998) Nature 394, 369-374)을 포함한다. 전핵 미량주사, 정자 매개된 유전자 전달, 및 체세포 핵 전달이 특히 유용한 기법들이다. 게놈 변형된 동물은 이의 생식세포 계열 세포를 포함한 세포 모두가 유전자 변형을 갖는 동물이다. 이의 유전자 변형에서 모자이크(mosaic)인 동물을 생산하는 방법이 사용되는 경우, 동물은 근친교배될 수 있으며 게놈 변형된 자손이 선택될 수 있다. 예를 들면, 세포가 배반포 상태에서 변형된다면 모자이크 동물을 만드는데 클로닝이 사용될 수 있거나, 단세포가 변형된 경우에는 게놈 변형이 일어날 수 있다. 변형되어 성적으로 성숙하지 못하는 동물은 사용되는 특정 접근법에 따라 변형에 대해 동형접합성이거나 이형접합성일 수 있다. 특정 유전자가 녹 아웃 변형에 의해 불활성화된다면, 동형접합성이 정상적으로는 필요할 것이다. 특정 유전자가 RNA 간섭 또는 우성 음성 전략(dominant negative strategy)에 의해 불활성화된다면, 이형접합성이 종종 적절하다.
전형적으로, 배아/접합자 미량주사에서, 핵산 작제물 또는 mRNA가 수정란으로 도입된다; 1 또는 2개의 세포 수정란이 정자 머리로부터의 유전 물질을 함유하는 핵 구조로서 사용되며 난자는 원형질 내에 보인다. 전핵 상태의 수정란은 시험관내 또는 생체내에서 수득될 수 있다(즉, 공여자 동물의 난관으로부터 수술적으로 회수). 체외 수정란은 다음과 같이 생성될 수 있다. 예를 들면, 돼지 난소를 도살장에서 수집하고 운송 동안 22-28℃에서 유지시킬 수 있다. 난소를 난포성 흡인(follicular aspiration)을 위해 세척하고 분리할 수 있으며, 4-8mm에 이르는 난포를 진공하에서 18 게이지 니들을 사용하여 50 mL 원뿔형 원심분리관으로 흡인시킬 수 있다. 난포액 및 흡인된 난모세포를 시판 TL-HEPES(Minitube, Verona, Wis.)를 갖는 프리-필터를 통해 세정할 수 있다. 조밀한 난구 덩어리(compact cumulus mass)로 둘러싸인 난모세포를 선택하고 38.7℃ 및 5% CO2에서 가습된 공기 중에서 대략 22시간 동안 0.1 mg/mL 시스테인, 10 ng/mL 표피 성장 인자, 10% 돼지 난포액, 50 μM 2-머캅토에탄올, 0.5 mg/ml cAMP, 각각 10 IU/mL의 임신 말 혈청 고나도트로핀(PMSG) 및 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)로 보충된 TCM-199 난모세포 MATURATION MEDIUM (Minitube, Verona, Wis.)에 배치할 수 있다. 그 뒤에, 난모세포를 신선한 TCM-199 성숙 배지(이것은 cAMP, PMSG 또는 hCG를 함유하지 않을 것이다)로 이식시키고 추가로 22시간 동안 배양할 수 있다. 0.1% 히알루로니다제 중에서 1분간 보텍싱함으로써 성숙된 난모세포를 이들의 난구 세포로부터 스트리핑시킬 수 있다.
돼지의 경우, 성숙 난모세포를 Minitube 5-웰 수정 디쉬(fertilization dish)에서 500 ㎕ Minitube PORCPRO IVF MEDIUM SYSTEM (Minitube, Verona, Wis.) 중에서 수정시킬 수 있다. 체외 수정(IVF)을 위한 준비에서, 신선하게-수집된 또는 동결된 수퇴지 정액을 세척하고 PORCPRO IVF Medium에서 400,000개 정자로 되도록 재현탁액시킬 수 있다. 정자 농도는 컴퓨터 지원 정액 분석(SPERMVISION, Minitube, Verona, Wis.)으로 분석할 수 있다. 최종의 체외 정액주입(in vitro insemination)은 수퇘지에 따라 10 ㎕ 용적에서 대략 40개 운동성 정자/난모세포의 최종 농도로 수행될 수 있다. 모든 수정 난모세포를 38.7℃에서 5.0% CO2 대기 중에서 6시간 동안 배양한다. 정액주입 이후 6시간 후, 추정 접합자를 NCSU-23에서 2회 세척하고 0.5 mL의 동일 배지로 이동시킬 수 있다. 이 시스템은 10-30% 다정자 정액주입률(polyspermic insemination rate)로 대부분의 수퇘지에 걸쳐 일상적으로 20-30% 배반포를 생성할 수 있다.
선형화된 핵산 작제물 또는 mRNA를 전핵 중의 하나에 또는 세포질에 주사할 수 있다. 그 후, 주사된 난을 수용자 암컷에게(예, 수용자 암컷의 난관 내로) 이동시키고 수용자 암컷에서 성장하도록 하여 유전자이식(transgenic) 또는 유전자 편집된 동물을 생산할 수 있다. 특히, 체외 수정된 배아를 15,000 x g에서 5분간 원심분리하여 지질을 침강시켜 전핵의 시각화를 가능케 할 수 있다. 배아를 Eppendorf FEMTOJET 주사기를 사용하여 주사할 수 있고 배반포 형성시까지 배양할 수 있다. 배아 절단 및 배반포 형성의 속도 및 품질을 기록할 수 있다.
배아를 비동기 수용자(asynchronous recipient)의 자궁에 수술적으로 이식할 수 있다. 전형적으로, 100-200개 (예, 150-200개) 배아를 5.5-inch TOMCAT® 카테터를 사용하여 난관의 팽대-협부-접합부(ampulla-isthmus junction)에 둘 수 있다. 수술 후, 임신의 실시간 초음파 시험을 수행할 수 있다.
체세포 핵 이식에서, 상기한 핵산 작제물을 포함하는 배아 난할구(embryonic blastomere), 태아 섬유아세포, 성인 귀 섬유아세포, 또는 과립막 세포와 같은 유전자이식 또는 유전자 편집된 세포를 제핵 난모세포에 도입하여 조합된 세포(combined cell)를 확립할 수 있다. 난모세포는 극체 부근의 부분적인 구역 절개에 이어 절개부에서 세포질을 짜냄으로써 제핵시킬 수 있다. 전형적으로, 첨예한 비스듬한 팁을 갖는 주사 피펫이 유전자이식 또는 유전자 편집된 세포를 감수분열 2에 저지되어 있는 제핵 난모세포에 주사하는데 사용된다. 일부 관례에서, 감수분열-2에 저지되어 있는 난모세포를 난이라고 한다. (예를 들면, 난모세포를 융합 및 활성화시킴으로써) 돼지 또는 소 배아를 생산한 후, 배아를 활성화한지 약 20 내지 24시간 후 수용자 암컷의 난관에 이식한다. 예를 들면, 문헌[Cibelli 등 (1998) Science 280, 1256-1258] 및 U.S. Pat. Nos. 6,548,741, 7,547,816, 7,989,657, 또는 6,211,429를 참조한다. 돼지의 경우, 배아를 이식한지 대략 20-21일 후 수용자 암컷에 대해 임신을 확인할 수 있다.
표준 번식 시술을 사용하여 초기 이형접합성 시조 동물로부터의 불활성화된 유전자에 대해 동형접합성인 동물을 만들어낼 수 있다. 그러나, 동형접합성이 필요하지 않을 수 있다. 본원에 기재된 유전자 편집 돼지를 다른 관심 돼지와 함께 번식시킬 수 있다.
일단 유전자 편집 동물이 만들어지면, 내인성 핵산의 불활성화를 표준 기법을 사용하여 평가할 수 있다. 초기 스크리닝은 불활성화가 일어났는지 그렇지 않은지를 알아내기 위한 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)에 의해 달성될 수 있다. 서던 분석의 설명에 대해서는, 문헌[sections 9.37-9.52 of Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview; N.Y]을 참조한다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기법이 또한 초기 스크리닝에 사용될 수 있다. PCR은 표적 핵산을 증폭시키는 과정 또는 기법을 가리킨다. 일반적으로, 관심 영역의 말단 또는 그 너머로부터의 서열 정보가, 증폭시키고자 하는 주형의 반대 가닥에 대한 서열에서 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하는데 사용된다. PCR은 전체 게놈 DNA 또는 전체 세포 RNA로부터의 서열을 포함하여, DNA 뿐만 아니라 RNA로부터의 특이 서열을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 프라이머는 전형적으로 14 내지 40개 뉴클레오티드 길이지만, 10개 뉴클레오티드 내지 수 백개 뉴클레오티드 길이에 이를 수 있다. PCR은, 예를 들면, 문헌[참조; PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. Dieffenbach and Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995]에 기재되어 있다. 핵산은 또한 리가제 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 자가-지속 서열 복제, 또는 핵산 서열-기반 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Lewis (1992) Genetic Engineering News 12,1; Guatelli 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; and Weiss (1991) Science 254:1292]을 참조한다. 배반포 단계에서, 배아를 PCR, 서번 교배(Southern hybridization) 및 splinkerette PCR에 의한 분석을 위해 개별적으로 가공할 수 있다(예를 들면, 문헌 참조; Dupuy 등 Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99:4495).
간섭
RNAs
다양한 간섭 RNA (RNAi) 시스템이 공지되어 있다. 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 상동 유전자 전사체의 서열-특이 저하를 유도한다. RNA-유도형 사일런싱 복합체 (RISC)는 dsRNA를 작은 21-23-뉴클레오티드 작은 간섭 RNAs(siRNAs)로 대사한다. RISC는 이중 가닥 RNAse(dsRNase, 예, Dicer) 및 ssRNase(예, Argonaut 2 또는 Ago2)를 함유한다. RISC는 절단 가능한 표적을 찾기 위한 가이드로서 안티센스 가닥을 이용한다. siRNAs와 microRNAs(miRNAs), 둘 모두는 알려져 있다. 유전자 편집 동물에서 유전자를 불활성화시키는 방법은 표적 유전자 및/또는 핵산의 발현이 감소되도록 표적 유전자 및/또는 핵산에 대해 RNA 간섭을 유도함을 포함한다.
예를 들면 외인성 핵산 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 대해 RNA 간섭을 유도할 수 있다. 예를 들면, 표적 DNA에 상동성인 이중-가닥 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 작은 헤어핀 RNA(shRNA)가 그 DNA의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. siRNA에 대한 작제물은, 예를 들면, 문헌[참조; Fire 등 (1998) Nature 391:806; Romano and Masino (1992) Mol. Microbiol. 6:3343; Cogoni 등 (1996) EMBO J. 15:3153; Cogoni and Masino (1999) Nature 399:166; Misquitta and Paterson (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1451; and Kennerdell and Carthew (1998) Cell 95:1017]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. shRNA에 대한 작제물은 문헌[참조; McIntyre and Fanning (2006) BMC Biotechnology 6:1]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 일반적으로, shRNAs는 상보적 영역을 함유하는 단일-가닥 RNA 분자로서 전사되며, 이것이 어닐링하여 짧은 헤어핀을 형성할 수 있다.
특이 유전자에 지시된 단일, 개별적인 기능성 siRNA 또는 miRNA를 찾을 확률은 높다. 예를 들어, siRNA의 특이 서열의 예측가능성은 약 50%이지만 다수의 간섭 RNAs는 이들 중의 적어도 하나가 효력을 발생할 것이라는 양호한 신뢰에서 만들어질 수 있다.
시험관내 세포, 생체내 세포, 또는 유전자 편집 동물, 예를 들면, CD163을 암호화하는 유전자에 대해 지시된 RNAi를 발현하는 가축 동물이 사용될 수 있다. RNAi는, 예를 들면, siRNA, shRNA, dsRNA, RISC 및 miRNA로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
유도성 시스템
유도성 시스템은 CD163 유전자를 불활성화시키는데 사용될 수 있다. 유전자의 불활성화의 공간적 및 시간적 제어를 가능케 하는 다양한 유도성 시스템이 공지되어 있다. 몇몇은 돼지 동물에서 생체내 기능성인 것으로 판명되었다.
유도성 시스템의 예는 테트라사이클린 (tet)-on 촉진제 시스템이며, 이것은 핵산의 전사를 조절하는데 사용될 수 있다. 이러한 시스템에서, 돌연변이된 Tet 억제인자(TetR)가 단순 헤르페스 바이러스 VP 16 전사-활성인자 단백질의 활성화 도메인에 융합되어 테트라사이클린-조절된 전사 활성인자(tTA)를 생성하며, 이것은 tet 또는 독시사이클린(dox)에 의해 조절된다. 항생제의 부재하에서는 전사가 최소인 반면, tet 또는 dox의 존재하에서는 전사가 유도된다. 대안적인 유도성 시스템은 엑디손 또는 라파마이신 시스템을 포함한다. 엑디손은 엑디손 수용체와 USP(ultraspiracle gene)의 산물과의 이형이합체에 의해 생산이 제어되는 곤충 탈피 호르몬이다. 발현은 엑디손 또는 무리스테론 A와 같은 엑디손의 유사체로의 처리에 의해 유도된다. 유도성 시스템을 촉발시키기 위해 동물에게 투여되는 제제를 유도제라고 한다.
더 흔히 사용되는 유도성 시스템 중에는 테트라사이클린-유도성 시스템 및 Cre/loxP 재조합효소 시스템(구성적 또는 유도적)이 있다. 테트라사이클린-유도성 시스템은 테트라사이클린-제어된 전사활성인자(tTA)/역 tTA(rtTA)를 포함한다. 이러한 시스템을 생체내 사용하기 위한 방법은 두 가지 계통의 유전자 편집 동물을 생성함을 포함한다. 한 동물 계통은 선택된 촉진제의 제어하에서 활성인자(tTA, rtTA, 또는 Cre 재조합효소)를 발현한다. 또 다른 동물 계통은 수용기를 발현하며, 여기서 관심 유전자(또는 변형시키고자 하는 유전자)의 발현은 tTA/rtTA 전사활성인자에 대한 표적 서열의 제어하에 있다(또는 loxP 서열이 측면에 있다). 두 마리 동물의 교미는 유전자 발현의 제어를 제공한다.
테트라사이클린-의존적 조절 시스템(tet 시스템)은 두 가지 성분, 즉, 테트라사이클린-제어된 전사활성인자(tTA 또는 rtTA) 및 테트라사이클린-의존적 방식으로 다운스트림 cDNA의 발현을 제어하는 tTA/rtTA-의존적 촉진제에 의존한다. 테트라사이클린 또는 이의 유도체(예를 들면 독시사이클린)의 부재하에서, tTA가 tetO 서열에 결합하여, tTA-의존적 촉진제의 전사 활성화를 가능케 한다. 그러나, 독시사이클린의 존재하에서, tTA는 이의 표적과 상호작용할 수 없고 전사가 일어나지 않는다. tTA를 사용하는 tet 시스템을 tet-OFF라고 하는데, 그 이유는 테트라사이클린 또는 독시사이클린이 전사 하향-조절을 가능케 하기 때문이다. 테트라사이클린 또는 이의 유도체의 투여는 생체내 이식유전자 발현의 일시적 제어를 가능케 한다. rtTA는 독시사이클린의 부재하에서는 기능하지 못하지만 전사 활성화를 위한 리간드의 존재를 필요로 하는 tTA의 변이체이다. 따라서 이러한 tet 시스템을 tet-ON이라고 한다. tet 시스템은, 예, 리포터 유전자, 종양 유전자, 또는 신호 캐스케이드에 관여하는 단백질을 암호화하는 몇가지 이식유전자의 유도성 발현을 위해 생체내 사용되어 왔다.
Cre/lox 시스템은 두 개의 떨어져 있는 Cre 인식 서열, 즉, loxP 부위 간의 교차에 의해 부위-특이 재결합을 촉매하는 Cre 재조합효소를 사용한다. 두 개의 loxP 서열 사이에 도입되는 DNA 서열(floxed DNA라고 함)은 Cre-매개된 재조합에 의해 절제된다. (조직- 또는 세포-특이 촉진제에 의한) 공간적 제어, 또는 (유도성 시스템에 의한) 시간적 제어를 사용하여 유전자이식 및/또는 유전자 편집 동물에서 Cre 발현을 제어하면 두 개의 loxP 부위 사이의 DNA 절제가 제어된다. 한 가지 적용은 조건 유전자 불활성화(조건적 녹아웃)를 위한 것이다. 또 다른 접근법은 floxed 종결 코돈이 촉진제 서열과 관심 DNA 사이에 삽입되는 단백질 과발현을 위한 것이다. 유전자 편집 동물은 Cre가 발현될 때까지 이식유전자를 발현하지 않아, floxed 종결 코돈의 절제를 야기한다. 이 시스템은 조직-특이 종양형성 및 B 림프구에서의 제어된 항원 수용체 발현에 적용되었다. 유도성 Cre 재조합효소가 또한 발달되었다. 유도성 Cre 재조합효소는 외인성 리간드의 투여에 의해서만 활성화된다. 유도성 Cre 재조합효소는 원래의 Cre 재조합효소 및 특이 리간드-결합 도메인을 함유하는 융합 단백질이다. Cre 재조합효소의 기능적 활성은 융합 단백질에서 이러한 특이 도메인에 결합할 수 있는 외부 리간드에 따라 좌우된다.
유도성 시스템의 제어하에 CD163 유전자를 포함하는 시험관내 세포, 생체내 세포, 또는 유전자 편집 동물, 예를 들면, 가축 동물이 사용될 수 있다. 동물의 유전자 변형은 게놈성 또는 모자이크성일 수 있다. 유도성 시스템은, 예를 들면, Tet-On, Tet-Off, Cre-lox, 및 Hif1 알파로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
벡터 및 핵산
다양한 핵산이 녹아웃 목적으로, 유전자의 불활성화를 위해, 유전자의 발현을 수득하기 위해, 또는 또 다른 목적을 위해 세포에 도입될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산이라는 용어는 DNA, RNA, 및 핵산 유사체, 및 이중-가닥 또는 단일-가닥(즉, 센스 또는 안티센스 단일 가닥) 핵산을 포함한다. 핵산 유사체는, 예를 들면, 핵산의 안정성, 혼성화, 또는 가용성을 개선시키기 위해 염기 모이어티, 당 모이어티, 또는 인산염 골격에서 변형될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형은 데옥시티미딘의 경우 데옥시우리딘, 및 데옥시시티딘의 경우 5-메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-브로모-2'-독시시티딘을 포함한다. 당 모이어티의 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-O-알릴 당을 형성하기 위한 리보스 당의 2' 하이드록실의 변형을 포함한다. 데옥시리보스 인산염 골격을 변형시켜 모르폴리노 핵산을 생산할 수 있으며, 여기서 각 염기 모이어티는 6 원자, 모르폴리노 환, 또는 펩티드 핵산에 연결되고, 데옥시인산염 골격은 슈도펩티드 골격으로 대체되고 네 개의 염기는 보유된다. 문헌[Summerton and Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7(3):187; and Hyrup 등 (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5]을 참조한다. 또한, 데옥시인산염 골격은, 예를 들면, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 골격, 포스포로아미다이트, 또는 알킬 포스포트리에스테르 골격으로 대체될 수 있다.
표적 핵산 서열은 촉진제와 같은 조절 영역에 작동적으로 연결될 수 있다. 조절 영역은 돼지 조절 영역일 수 있거나 다른 종으로부터의 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 작동적으로 연결된 표적 핵산의 전사를 허용하거나 촉진시키는 방식으로 핵산 서열에 대해 조절 영역을 위치시킴을 가리킨다.
어떠한 유형의 촉진제라도 표적 핵산 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 촉진제의 예에는, 제한함이 없이, 조직-특이 촉진제, 구성 촉진제, 유도 촉진제, 및 특정 자극에 반응성 또는 무반응성인 촉진제가 포함된다. 적합한 조직 특이 촉진제는 베타 세포에서 핵산 전사체의 우선적 발현을 야기할 수 있으며, 예를 들면, 인간 인슐린 촉진제를 포함한다. 기타의 조직 특이 촉진제는, 예를 들면, 간세포 또는 심장 조직에서 우선적 발현을 야기할 수 있으며 각각 알부민 또는 알파-미오신 중쇄 촉진제를 포함할 수 있다. 상당한 조직 또는 시간-특이성 없이 핵산 분자의 발현을 촉진시키는 촉진제가 사용될 수 있다(즉, 구성 촉진제). 예를 들면, 베타-액틴 촉진제, 예를 들면, 닭 베타-액틴 유전자 촉진제, 유비퀴틴 촉진제, miniCAGs 촉진제, 글리세르알데히드-3-포스페디트 탈수소효소(GAPDH) 촉진제, 또는 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK) 촉진제, 뿐만 아니라 바이러스성 촉진제, 예를 들면, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK) 촉진제, SV40 촉진제, 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 촉진제가 사용될 수 있다. 예를 들면, 닭 베타 액틴 유전자 촉진제와 CMV 증강자의 융합체가 촉진제로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Xu 등 (2001) Hum. Gene Ther. 12:563; and Kiwaki 등 (1996) Hum. Gene Ther. 7:821]을 참조한다.
핵산 작제물에서 유용할 수 있는 추가의 조절 영역은 폴리아데닐화 서열, 번역 조절 서열(예, 내부 리보솜 진입 세그먼트, IRES), 증강자, 유도 요소, 또는 인트론을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 이러한 조절 영역이 전사, mRNA의 안정성, 번역 효율 등에 영향을 미침으로써 발현을 증가시킬 수 있지만 이것이 필수적인 것은 아닐 수 있다. 이러한 조절 영역은 세포(들)에서 핵산의 최적 발현을 수득하기 위해 원하는 대로 핵산 작제물에 포함될 수 있다. 그러나, 충분한 발현은 때때로 이러한 추가의 요소들 없이 수득될 수 있다.
단일 펩티드 또는 선택 마커를 암호화하는 핵산 작제물이 사용될 수 있다. 암호화된 폴리펩티드가 특정 세포 위치(예, 세포 표면)에 지시되도록 하는 단일 펩티드가 사용될 수 있다. 선택 마커의 비제한적인 예는 퓨로마이신, 간사이클로비르, 아데노신 데아미나제(ADA), 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(neo, G418, APH), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 히그로마이신-B-포스프트랜스퍼라제, 티미딘 키나제(TK), 및 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(XGPRT)를 포함한다. 이러한 마커는 배양물 중의 안정한 형질전환체를 선택하는데 유용하다. 다른 선택 마커는 형광 폴리펩티드, 예를 들면, 녹색 형광 단백질 또는 황색 형광 단백질을 포함한다.
선택 마커를 암호화하는 서열은, 예, Cre 또는 Flp와 같은 재조합효소에 대한 인식 서열이 측면에 있을 수 있다. 예를 들면, 선택 마커가 작제물로부터 절제될 수 있도록 선택 마커는 loxP 인식 부위(Cre 재조합효소에 의해 인식되는 34-bp 인식 부위) 또는 FRT 인식 부위가 측면에 있을 수 있다. 문헌[Orban, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:6861, for a review of Cre/lox technology, and Brand and Dymecki, Dev. Cell (2004) 6:7]을 참조한다. 선택 마커 유전자에 의해 차단된 Cre- 또는 Flp-활성화 가능한 이식유전자를 함유하는 트랜스포슨(transposon)이 또한 이식유전자의 조건적 발현을 갖는 동물을 수득하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 마커/이식유전자의 촉진제 구동 발현은 보편적(ubiquitous)이거나 조직-특이적일 수 있으며, 이것은 F0 동물(예, 돼지)에서 마커의 보편적인 또는 조직-특이적인 발현을 초래할 것이다. 이식유전자의 조직 특이 활성화는, 예를 들면, 마커-차단된 이식유전자를 보편적으로 발현하는 돼지를 조직-특이적인 방식으로 Cre 또는 Flp를 발현하는 돼지에 교배함으로써, 또는 조직-특이적인 방식으로 마커-차단된 이식유전자를 발현하는 돼지를 Cre 또는 Flp 재조합효소를 보편적으로 발현하는 돼지에 교배함으로써 달성될 수 있다. 이식유전자의 조절 발현 또는 마커의 조절된 절제는 이식유전자의 발현을 가능케 한다.
외인성 핵산은 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 암호화된 폴리펩티드의 후속적인 조작을 촉진시키도록(예, 편재 또는 검출을 촉진시키도록) 설계된 "태그"를 암호화하는 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열은 암호화된 태그가 폴리펩티드의 카복실 또는 아미노 말단에 위치하도록 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 삽입될 수 있다. 암호화된 태그의 비제한적인 예는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 및 FLAGTM태그(Kodak, New Haven, Conn.)를 포함한다.
핵산 작제물은 SssI CpG 메틸라제(New England Biolabs, Ipswich, Mass.)를 사용하여 메틸화될 수 있다. 일반적으로, 핵산 작제물을 37℃에서 완충액 중에 S-아데노실메티오닌 및 SssI CpG-메틸라제와 배양할 수 있다. 과메틸화는 작제물을 한 단위의 HinP1I 엔도뉴클레아제와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하고 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석함으로써 확인할 수 있다.
핵산 작제물은 다양한 기법을 사용하여, 예를 들면, 생식 세포, 예를 들면, 난모세포 또는 난자, 전구 세포, 성인 또는 배아 줄기 세포, 원시 생식 세포, 신장 세포, 예를 들면, PK-15 세포, 섬 세포, 베타 세포, 간 세포, 또는 섬유아세포, 예를 들면, 피부 섬유아세포를 포함한 임의 유형의 배아, 태아, 또는 성인 동물 세포에 도입될 수 있다. 기법의 비제한적인 예는 트랜스포슨 시스템, 세포 또는 리포솜을 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 핵산을 세포에 전달할 수 있는 기타의 비-바이러스 방법, 예를 들면, 전기천공, 미량주사, 또는 인산칼슘 침전의 사용을 포함한다.
트랜스포슨 시스템에서, 핵산 작제물의 전사 단위, 즉, 외인성 핵산 서열에 작동적으로 연결된 조절 영역은 트랜스포슨의 역위 반복체가 측면에 있다. 예를 들면, Sleeping Beauty (U.S. Pat. No. 6,613,752 및 U.S. 공개 No. 2005/0003542 참조); Frog Prince (Miskey 등 (2003) Nucleic Acids Res. 31:6873); Tol2 (Kawakami (2007) Genome Biology 8(Suppl.1):S7; Minos (Pavlopoulos 등 (2007) Genome Biology 8(Suppl.1):S2); Hsmar1 (Miskey 등 (2007)) Mol Cell Biol. 27:4589); 및 Passport를 포함하는 몇몇 트랜스포슨 시스템이 핵산을 마우스, 인간, 및 돼지 세포를 포함한 세포에 도입하기 위해 개발되었다. Sleeping Beauty 트랜스포슨이 특히 유용하다. 전위효소는 단백질로서 전달되거나, 외인성 핵산으로서 동일 핵산 작제물 상에 암호화되거나, 별도의 핵산 작제물 상에 도입되거나, mRNA(예, 시험관내 전사 및 캡핑된 mRNA)로서 제공될 수 있다.
외인성 핵산의 발현을 유지하고 숙주 유전자의 원치않는 전사를 억제하기 위해 절연제 요소가 또한 핵산 작제물에 포함될 수 있다. 예를 들면, U.S. 공개 No. 2004/0203158을 참고한다. 전형적으로, 절연제 요소는 전사 단위의 각 면에 측면에 있으며 트랜스포슨의 역위 반복체의 내부에 있다. 절연제 요소의 비제한적인 예는 기질 부착 영역-(MAR) 타입 절연제 요소 및 가장자리-타입(border-type) 절연제 요소를 포함한다. 예를 들면, U.S. Pat. Nos. 6,395,549, 5,731,178, 6,100,448, 및 5,610,053, 및 U.S. 공개 No. 2004/0203158을 참조한다.
핵산은 벡터 내로 삽입될 수 있다. 벡터는 캐리어에서 표적 DNA로 이동하도록 설계된 임의의 특이 DNA 단편을 포함하는 광범위한 용어이다. 벡터는 발현 벡터, 또는 벡터 시스템을 가리킬 수 있으며, 이것은 게놈 또는 다른 표적화된 DNA 서열, 예를 들면, 에피솜, 플라스미드, 또는 심지어 바이러스/파지 DNA 단편으로의 DNA 삽입을 야기하는데 필요한 성분의 한 세트이다. 동물에서 유전자 전달을 위해 사용되는 바이러스 벡터(예, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 통합 파지 바이러스), 또는 비-바이러스 벡터(예, 트랜스포슨)와 같은 벡터 시스템은 두 가지 기본 성분을 갖는다: 1) DNA (또는 cDNA로 역전사되는 RNA)로 구성된 벡터 및 2) 전위효소, 재조합효소, 또는 벡터와 DNA 표적 서열 둘 다를 인식하고 벡터를 표적 DNA 서열 내에 삽입하는 기타의 인테그라제 효소. 벡터는 매우 빈번하게 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 함유하며, 여기서 발현 조절 서열은 각각 다른 DNA 서열 또는 mRNA의 the 전사 및/또는 번역을 제어 및 조절하는 DNA 서열이다.
많은 상이한 유형의 벡터들이 알려져 있다. 예를 들면, 플라스미드 및 바이러스 벡터, 예, 레트로바이러스 벡터가 알려져 있다. 포유류 발현 플라스미드는 전형적으로 복제 개시점, 적합한 촉진제 및 임의의 증강자, 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 접합 공여 및 수용 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 측방 비-전사 서열을 갖는다. 벡터의 예는 다음을 포함한다: 플라스미드(다른 유형의 벡터의 캐리어일 수도 있다), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스(예, 변형된 HIV-1, SIV 또는 FIV), 레트로바이러스(예, ASV, ALV 또는 MoMLV), 및 트랜스포슨(예, Sleeping Beauty, P-요소, Tol-2, Frog Prince, piggyBac).
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산이라는 용어는, 예를 들면, cDNA, 게놈 DNA, 합성(예, 화학적으로 합성된) DNA, 뿐만 아니라 자연 발생 및 화학적으로 변형된 핵산, 예, 합성 염기 또는 대안적인 골격을 포함한 RNA와 DNA, 둘 모두를 가리킨다. 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥(즉, 센스 또는 안티센스 단일 가닥)일 수 있다.
시조 동물, 동물 계통, 형질, 및 번식
시조 동물은 클로닝 및 본원에 기재된 기타의 방법들에 의해 생산될 수 있다. 시조는 접합자 또는 일차 세포가 동형접합성 변형을 겪는 경우에서와 같이 유전자 변형에 대해 동형접합성일 수 있다. 유사하게, 이형접합성인 시조가 또한 만들어질 수 있다. CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 동물의 경우에, 시조는 바람직하게는 이형접합성이다. 시조는 게놈 변형될 수 있으며, 이것은 게놈의 세포 모두가 변형을 겪음을 의미한다. 시조는 벡터가 전형적으로 배반포 단계에서 배아 중의 다수의 세포 중의 하나로 도입되는 경우에 일어날 수 있는 바와 같이 변형에 대해 모자이크일 수 있다. 게놈 변형된 자손을 확인하기 위해 모자이크 동물의 자손을 시험할 수 있다. 동물 계통(animal line)은 변형을 지속적으로 발현하는 이형접합성 또는 동형접합성 자손으로 유성 생식될 수 있거나 보조 생식 기술에 의해 번식될 수 있는 동물 무리를 생산할 수 있는 경우에 확립된다.
가축에서는, 여러 대립유전자가 생산 형질, 타입 형질, 작업성 형질(workability trait), 및 기타의 기능적 형질과 같은 다양한 형질에 관련된 것으로 알려져 있다. 숙련가들은 이러한 형질들을 모니터링하고 특성화하는데 익숙하다[문헌 참조; Visscher 등, Livestock Production Science, 40 (1994) 123-137, U.S. Pat. No. 7,709,206, US 2001/0016315, US 2011/0023140, 및 US 2005/0153317]. 동물 계통은 생산 형질, 타입 형질, 작업성 형질, 생식력 형질, 마더링(mothering) 형질, 및 질병 내성 형질로 이루어진 그룹의 형질로부터 선택된 형질을 포함할 수 있다. 추가의 형질은 재조합 유전자 산물의 발현을 포함한다.
목적하는 형질 또는 형질들을 갖는 동물을 이들의 성적 성숙을 방지하도록 변형시킬 수 있다. 성숙할 때까지 동물이 불임이기 때문에, 동물의 파종(dissemination)를 제어하기 위한 수단으로서 성적 성숙을 조절할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 형질을 갖도록 사육되거나 변형된 동물이 수용자가 동물을 사육하고 자체에 형질의 가치를 책정하는 감소된 위험으로 수용자에게 제공될 수 있다. 예를 들면, 동물의 게놈이 유전자 변형될 수 있으며, 여기서 변형은 성적 성숙 유전자의 불활성화를 포함하며, 여기서 야생형 동물에서의 성적 성숙 유전자는 성적 성숙에 대해 선택적인 인자를 발현한다. 동물에서 성적 성숙을 유도하는 유전자의 발현의 상실에 의해 야기되는 결손을 구제하는 화합물을 투여함으로써 동물을 치료할 수 있다.
성적 성숙을 유도하는 화합물의 투여를 필요로 하는 동물의 번식은 치료 시설에서 유리하게 달성될 수 있다. 치료 시설은 일관된 동물을 효율적으로 생산하기 위해 잘-제어된 균주에 대한 표준화된 프로토콜을 시행할 수 있다. 동물 자손을 키우고자 하는 다수의 장소에 분포시킬 수 있다. 따라서, 농장 및 농장주(목장 및 목장부를 포함한 용어)는 지정된 범위의 나이 및/또는 체중 및/또는 형질을 갖는 원하는 수의 자손을 주문할 수 있고 원하는 시간 및/또는 장소에 데리고 갈 수 있다. 그 후 수용자, 예, 농장주는 동물을 키워서 이들을 원할 때 시장에 배달할 수 있다.
불활성화된 성적 성숙 유전자를 갖는 유전자 변형된 가축 동물은 (예, 하나 이상의 장소로, 다수의 농장에) 배달될 수 있다. 동물은 약 1일 내지 약 180일의 나이를 가질 수 있다. 동물은 하나 이상의 형질(예를 들면 원하는 형질 또는 고가 형질(high-value trait) 또는 신규 형질 또는 재조합 형질을 발현하는 것)을 가질 수 있다.
번식 방법과 감염에 대한 동물의 내성을 증가시키기 위한 방법 및 동물의 개체군
본원에는 병원균에 의한 감염에 대해 감소된 민감성을 갖는 동물 또는 혈통을 생성하기 위한 번식방법이 제공된다. 방법은 난모세포 및 정자 세포 중의 적어도 하나 내로 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 도입하기 위해 난모세포 또는 정자 세포를 유전자 변형시키는 단계, 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 함유하는 수정란을 생성하도록 난모세포를 정자 세포와 수정시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 방법은 수정란 내로 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 도입하기 위해 수정란을 유전자 변형시키는 단계를 포함한다. 방법은 수정란을 대리모 암컷 동물 내로 이식시키는 단계(여기서, 임신 및 만기 분만은 자손 동물을 생산한다), 병원균에 대한 민감성에 대해 자손 동물을 스크리닝하는 단계, 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 동물에 비해 병원균에 대한 감소된 민감성을 갖는 자손 동물을 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
병원균은 바람직하게는 바이러스, 예, PRRSV를 포함한다.
동물 또는 자손은 배아, 청소년, 또는 성인일 수 있다.
동물 또는 자손은 사육 동물을 포함할 수 있다. 사육 동물은 가축 동물, 예를 들면 돼지 동물, 소 동물(예, 육우 또는 젖소), 양 동물, 염소 동물, 말과 동물(예, 말 또는 당나귀), 물소, 낙타, 또는 조류 동물(예, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 뿔닭, 또는 갓 부화한 새)을 포함할 수 있다. 가축 동물은 바람직하게는 소 또는 돼지 동물이고, 가장 바람직하게는 돼지 동물이다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란을 유전자 변형시키는 단계는 난모세포, 정자 세포, 또는 수정란을 유전자 편집함을 포함할 수 있다. 유전자 편집은 호밍 엔도뉴클레아제의 사용을 포함할 수 있다. 호밍 엔도뉴클레아제는 자연 발생 엔도뉴클레아제일 수 있지만, 엔도뉴클레아제가 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 염색체 서열을 표적화하도록 설계된 DNA 인식 서열을 갖는 합리적으로 설계된 비-자연 발생 호밍 엔도뉴클레아제인 것이 바람직하다. 따라서, 호밍 엔도뉴클레아제는 설계된 호밍 엔도뉴클레아제일 수 있다. 따라서, 호밍 엔도뉴클레아제는 설계된 호밍 엔도뉴클레아제일 수 있다. 호밍 엔도뉴클레아제는, 예를 들면, CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 시스템, 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), ZFN(징크 핑거 뉴클레아제), 재조합효소 융합 단백질, 메가뉴클레아제, 또는 이들의 조합)을 포함할 수 있다. 유전자 편집은 바람직하게는 CRISPR/Cas9 시스템의 사용을 포함한다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 변형된 염색체 서열에 대해 이형접합성일 수 있다. 대안적으로, 난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 변형된 염색체 서열에 대해 동형접합성일 수 있다.
변형된 염색체 서열은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 삽입, CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 결실, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 변형된 염색체 서열은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 결실을 포함할 수 있다(예, 인-프레임 결실). 대안적으로, 변형된 염색체 서열은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 삽입을 포함할 수 있다.
삽입 또는 결실은 CD163 단백질 생산 또는 활성을 삽입 또는 결실이 없는 동물에서의 CD163 단백질 생산 또는 활성에 비해 감소시킬 수 있다.
삽입 또는 결실은 동물에 의한 실질적으로 비 기능성 CD163 단백질의 생산을 야기할 수 있다. "실질적으로 비 기능성 CD163 단백질"이란, 동물, 자손, 또는 세포 중의 CD163 단백질의 수준이 감지할 수 없거나, 감지할 수 있더라도, 삽입 또는 결실을 포함하지 않는 동물, 자손, 또는 세포에서 관찰되는 수준보다 적어도 약 90% 낮음을 의미한다.
동물이 돼지 동물인 경우, 변형된 염색체 서열은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7, CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 8, CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7 또는 엑손 8과 인접한 인트론, 또는 이의 조합에 변형을 포함할 수 있다. 변형된 염색체 서열은 적절하게는 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7에 변형을 포함한다.
CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7에서의 변형은 결실(예, 엑손 7에서의 인-프레임 결실)을 포함할 수 있다. 대안적으로, CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 엑손 7에서의 변형은 삽입을 포함할 수 있다.
동물이 돼지 동물인 경우, 변형은 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,137 내지 뉴클레오티드 3,147의 11개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149와 3,150 사이의 2개 염기 쌍 삽입과 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573 내지 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,147의 124개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,146의 123개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,147과 3,148 사이의 1개 염기 쌍 삽입; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,159의 130개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,161의 132개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 1,525 내지 뉴클레오티드 3,030의 1506개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 사이에 7개 염기 쌍 삽입; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,818 내지 뉴클레오티드 4,097의 1280개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,724 내지 뉴클레오티드 4,096의 1373개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,431 내지 뉴클레오티드 3,897의 1467개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 4,531의 1387개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체된다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,440 내지 뉴클레오티드 4,160의 1720개 염기 쌍 결실; 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
돼지 동물이 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149와 3,150 사이에 2개 염기 쌍 삽입을 포함하는 경우, 2개 염기 쌍 삽입은 디뉴클레오티드 AG의 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물이 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,147과 3,148 사이에 1개 염기 쌍 삽입을 포함하는 경우, 1개 염기 쌍 삽입은 단일 아데닌 잔기의 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물이 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 사이에 7개 염기 쌍 삽입을 포함하는 경우, 7개 염기 쌍 삽입은 서열 TACTACT(서열 번호 115)의 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물이 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실을 포함하고, 여기서, 결실된 서열이 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있는 경우, 12개 염기 쌍 삽입은 서열 TGTGGAGAATTC(서열 번호 116)의 삽입을 포함할 수 있다.
돼지 동물이 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실을 포함하고, 여기서 결실된 서열이 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체되는 경우, 11개 염기 쌍 삽입은 서열 AGCCAGCGTGC (서열 번호 117)의 삽입을 포함할 수 있다.
CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 변형된 염색체 서열이 결실을 포함하는 경우, 결실은 바람직하게는 인-프레임 결실을 포함한다. 따라서, 동물이 돼지 동물인 경우, CD163 단백질을 암호화하는 유전자에서의 삽입 또는 결실은 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 1,525 내지 뉴클레오티드 3,030의 1506개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,724 내지 뉴클레오티드 4,096의 1373개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,146의 123개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,431 내지 뉴클레오티드 3,897의 1467개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 4,531의 1387개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실(여기서, 결실된 서열은 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체된다); 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,440 내지 뉴클레오티드 4,160의 1720개 염기 쌍 결실; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 인-프레임 결실을 엑손 7에 포함할 수 있다.
동물이 돼지 동물인 경우, 삽입 또는 결실은 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149와 3,150 사이의 2개 염기 쌍 삽입과 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573과 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실; 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149와 3,150 사이에 2개 염기 쌍 삽입 및 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573 내지 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다. 난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 사이에 7개 염기 쌍 삽입 및 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,137 내지 뉴클레오티드 3,147의 11개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
상기한 삽입 또는 결실 중의 어느 것을 포함하는 난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 삽입 또는 결실 외에 서열 번호 47에 대해 고도의 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 삽입 또는 결실 외에 염색체 서열의 영역에서 서열 번호 47에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 서열 번호 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 또는 114를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다. 이하에서 실시예에 추가로 기재된 바와 같이, 서열 번호 98-114는 서열 번호 47에 제공된 야생형 돼지 CD163의 영역에 상응하는 영역에 대해 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 본원에 기재되어 있는 돼지 CD163 염색체 서열에 삽입 또는 결실을 포함한다.
예를 들면, 난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 서열 번호 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113, 또는 114를 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다. 서열 번호 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113, 또는 114는 돼지 CD163 염색체 서열의 엑손 7에서 인-프레임 결실을 위해 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
또 다른 예로서, 난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 서열 번호 103 또는 111을 포함하는 염색체 서열을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 11개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 2개 염기 쌍 삽입과 377개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 124개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 123개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 1개 염기 쌍 삽입을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 130개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 132개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 1506개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 7개 염기 쌍 삽입을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 1280개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 1373개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 1467개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 인트론 6 결실과 뉴클레오티드 4,488에 12개 염기 쌍 부가 및 엑손 7에 추가의 129개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 28개 염기 쌍 결실 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 1387개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
난모세포, 정자 세포, 또는 수정란은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자에 1382개 염기 쌍 결실과 11개 염기 쌍 삽입 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자의 또 다른 대립유전자에 1720개 염기 쌍 결실을 포함할 수 있다.
번식방법 중의 어느 것에서도, 선택된 동물이 시조 동물로서 사용될 수 있다.
번식방법 중의 어느 것에서도, 수정 단계는 인공 수정을 포함할 수 있다.
번식방법 중의 어느 것에 의해 만들어진 동물의 개체군이 또한 제공된다. 동물의 개체군은 바람직하게는 병원균, 예를 들면 PRRSV와 같은 바이러스에 의한 감염에 대해 내성이다.
병원균으로의 감염에 대한 가축 동물의 내성을 증가시키는 방법이 또한 제공된다. 방법은 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 편집된 염색체 서열을 포함하지 않는 가축 동물에서의 CD63 단백질 생산 또는 활성에 비해 CD163 단백질 생산 또는 활성이 감소되도록 CD163 단백질을 암호화하는 유전자로부터 적어도 하나의 염색체 서열을 유전자 편집함을 포함한다. 병원균은 바람직하게는 바이러스(예, PRRSV)를 포함한다.
단리된
핵산
단리된 핵산이 제공된다. 단리된 핵산 분자는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다: (a) 서열 번호 47을 포함하는 뉴클레오티드 서열; (b) 서열 번호 47의 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열(여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 47에 비해 적어도 하나의 치환, 삽입, 또는 결실을 함유한다); 및 (c) (a) 또는 (b)의 cDNA 서열.
예를 들면, 단리된 핵산은 서열 번호 47을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 단리된 핵산은 서열 번호 47의 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 47에 비해 적어도 하나의 치환, 삽입, 또는 결실을 함유한다. 단리된 핵산은 서열 번호 47의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9%, 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 47에 비해 적어도 하나의 치환, 삽입, 또는 결실을 함유한다)
치환, 삽입, 또는 결실은 바람직하게는 치환, 삽입, 또는 결실을 포함하지 않는 핵산에 비해 CD163 단백질 생산 또는 활성을 감소시키거나 없앤다.
단리된 핵산은 서열 번호 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 또는 114를 포함할 수 있다.
예를 들면, 단리된 핵산은 서열 번호 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113, 또는 114를 포함할 수 있다.
예를 들면, 단리된 핵산은 서열 번호 103 또는 111을 포함할 수 있다.
단리된 핵산은 cDNA를 포함할 수 있다.
추가의 단리된 핵산이 제공된다. 단리된 핵산은 서열 번호 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 또는 114를 포함할 수 있다. 예를 들면, 단리된 핵산은 서열 번호 98, 101, 105, 109, 110, 112, 113, 또는 114를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 단리된 핵산은 서열 번호 103 또는 111을 포함할 수 있다.
본 발명은 성세하게 기술함으로써, 첨부된 청구항에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 개질 및 변화가 가능하다는 것이 자명할 것이다.
실시예
하기 비제한적인 실시예는 본 발명을 추가로 열거하기 위해 제공된다.
실시예
1:
시험관내
유도된 난모세포 및 배아로부터 유전자 조작된 돼지를 생산하기 위한 CRISPR/Cas9 시스템의 사용
징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISPR-관련 (Cas9) 시스템에서의 성분들과 같은 호밍 엔도뉴클레아제를 기술하는 최신 보고서들은 돼지에서의 유전 공학(GE)이 이제 더욱 효율적일 수 있음을 시사한다. 표적화된 호밍 엔도뉴클레아제는 게놈의 특정 위치에서 이중-가닥 절단(DSB)을 유도할 수 있으며 공여자 DNA가 제공된다면 상동 재조합(HR)의 자극 또는 비상동성 말단 접합(NHEJ)을 통해 랜덤 돌연변이를 유발할 수 있다. HR을 통한 게놈의 표적화된 변형은 공여자 DNA가 표적화된 뉴클레아제와 함께 제공된다면 호밍 엔도뉴클레아제로 달성될 수 있다. 체세포에서 특정 변형을 유도한 후, 이들 세포는 SCNT를 통해 다양한 목적으로 GE 돼지를 생산하는데 사용되었다. 따라서, 호밍 엔도뉴클레아제는 GE 돼지를 생산하는데 있어서 유용한 도구이다. 상이한 호밍 엔도뉴클레아제 중에서, 방어 기제로서 사용되는 경우 원핵생물로부터 변경된 CRISPR/Cas9 시스템이 효과적인 접근책인 것으로 보인다. 사실상, Cas9 시스템은 세 가지 성분, 즉, 표적 서열에 상보적인 영역을 함유하는 RNA(~20개 염기)(cis- 억제된 RNA [crRNA]), crRNA에 상보적인 영역을 함유하는 RNA(전사-활성화 crRNA[tracrRNA]), 및 이 복합체 중의 효소 단백질 성분인 Cas9가 필요하다. 염기-대합 crRNA 및 tracrRNA의 역할을 수행하기 위해 단일 가이드 RNA(gRNA)가 작제될 수 있다. gRNA/단백질 복합체가 게놈을 스캔하고 crRNA/gRNA에 상보적인 영역에서 DSB를 촉매할 수 있다. 기타 설계된 뉴클레아제와는 달리, 관심 유전자를 표적화하는데 필요한 시약을 작제하기 위해서는 단지 짧은 올리고머가 설계될 필요가 있는 반면 ZFNs 및 TALENs를 조립하기 위해서는 일련의 클로닝 단계가 필요하다.
유전자 파괴를 위한 현재의 표준 방법과는 달리, 설계된 뉴클레아제의 사용은 GE를 위한 출발 물질로서 접합자를 사용할 기회를 제공한다. 가축에서 유전자 파괴를 위한 표준 방법은 배양된 세포에서의 HR 및 체세포 핵 이식(SCNT)에 의한 배아의 후속적인 복원을 포함한다. SCNT를 통해 생산된 복제 동물은 때때로 발달상의 결함 징후를 보이기 때문에, 시조 동물이 실험에 사용되는 경우 발생할 수 있는 교란 SCNT 이상 및 표현형을 피하기 위해 SCNT/GE 시조의 자손이 전형적으로 연구에 사용된다. 설치류에 비해 돼지의 보다 긴 임신 기간 및 보다 높은 주거 비용을 고려하여, 번식에 대한 감소된 요구에 대해 시간 및 비용 상의 이점이 있다. 최근 보고는 돼지 접합자로의 ZFNs 및 TALENs의 직접 주입이 내인성 유전자를 파괴시킬 수 있고 원하는 돌연변이를 갖는 새끼 돼지를 생산할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 새끼 돼지의 약 10% 만이 표적 유전자의 이중대립유전자 변형을 보였으며, 일부는 모자이크 유전자형을 나타내었다. 최근 기사는 CRISPR/Cas9 시스템이 발달 배아에서 돌연변이를 유도하고 ZFNs 또는 TALENs보다 더 높은 효율로 GE 돼지를 생산할 수 있음을 입증하였다. 그러나, CRISPR/ Cas9 시스템으로부터 생산된 GE 돼지 또한 모자이크 유전자형을 보유하였다. 또한, 상기한 모든 연구들은 실험을 위해 생체내 유도된 접합자를 사용하였는데, 이것은 충분한 수의 접합자를 수득하기 위해 집약적인 노동과 수많은 암퇘지를 필요로 한다.
당해 실시예는 시험관내 유도된 접합자의 주입 및 체세포의 변형에 이은 SCNT를 통해 GE 돼지를 생산하는데 있어서 CRISPR/ Cas9 시스템을 사용하는 효율적인 접근법을 설명한다. 두 개의 내인성 유전자(CD163 및 CD1D)와 한 개의 이식유전자(eGFP)가 표적화되었으며, 단지 시험관내 유도된 난모세포 또는 접합자가 각각 SCNT 또는 RNA 주입을 위해 사용되었다. CD163은 돼지 산업에 상당한 경제적 손실을 야기하는 것으로 알려진 바이러스인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 의한 증식성 감염에 필요한 것으로 보인다. CD1D는 비고전적 주 조직적합성 복합 단백질로 간주되며 불변 자연 살해 T 세포에의 지질 항원의 제시에 관여한다. 이러한 유전자가 결핍된 돼지는 농업 및 생체의학용 모델로 설계되었다. eGFP 이식유전자는 예비 개념-입증 실험 및 방법의 최적화를 위한 표적으로서 사용되었다.
재료 및 방법
화학물질 및 시약. 달리 명시하지 않는 한, 당해 연구에서 사용되는 모든 화학물질은 Sigma로부터 구입하였다.
특정
CRISPR을
구축하기 위한
gRNA의
설계
CRISPR이 야생형 CD163 내에서는 DSB를 초래하지만 도메인 스왑 표적화 벡터에서는 그렇지 않도록 가이드 RNA를 야생형 CD163에 독특하고 도메인 스왑 표적화 벡터(아래 기재됨)에는 존재하지 않는 CD163의 엑손 7 내의 영역에 설계하였다. 표적화 벡터가 S. 피오게네스 (Spy) 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 변경시키는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 도입하는 단지 네 개의 위치가 있다. 다음을 포함하는 네 개의 표적 모두가 선택되었다:
(서열 번호1) GGAAACCCAGGCTGGTTGGAgGG (CRISPR 10),
(서열 번호2) GGAACTACAGTGCGGCACTGtGG (CRISPR 131),
(서열 번호3) CAGTAGCACCCCGCCCTGACgGG (CRISPR 256) 및
(서열 번호4) TGTAGCCACAGCAGGGACGTcGG (CRISPR 282). PAM은 각 gRNA에서 굵은 글꼴로 확인할 수 있다.
CD1D 돌연변이의 경우, CRISPR 표적에 대한 검색은 일차 전사체의 처음 1000 bp 내의 암호 가닥에 임의로 제한되었다. 그러나, RepeatMasker[26]("돼지" 반복 라이브러리)는 일차 전사체의 염기 943에서 시작하는 반복 요소를 확인하였다. 그 후 CRISPR 표적에 대한 검색은 일차 전사체의 처음 942 bp로 제한되었다. 마지막 Spy PAM이 염기 873에 위치하기 때문에 검색은 일차 전사체의 처음 873 bp로 추가로 제한되었다. 제1 표적(CRISPR 4800)이 선택되었는데, 그 이유는 이것이 일차 전사체에서 염기 42에 위치한 개시 코돈과 겹치기 때문이다(CCAGCCTCGCCCAGCGACATgGG (서열 번호5)). 두 개의 추가의 표적(CRISPR 5620 및 5626)이 선택되었는데, 그 이유는 이들이 우리의 임의 선택된 영역 내의 제1 선택에 가장 멀리 있기 때문이었다(CTTTCATTTATCTGAACTCAgGG (서열 번호6) 및 TTATCTGAACTCAGGGTCCCcGG (서열 번호7)). 이들 표적은 겹친다. 개시 코돈에 관하여, 가장 근위의 Spy PAM은 시각적 평가에 의해 결정되는 바와 같이 동형중합체 서열을 광범위하게 함유하는 단순 서열에 위치하였다. 제4 표적(CRISPR 5350)이 선택되었는데, 그 이유는 제1 표적 선택과 관련하여, 이것이 광범위한 단독중합체 영역을 함유하지 않는 가장 근위의 표적이었기 때문이다(CAGCTGCAGCATATATTTAAgGG (서열 번호8)). 설계된 crRNA의 특이성은 GenBank에서 유사한 돼지 서열에 대해 검색함으로써 확인되었다. 올리고뉴클레오티드(표 1)을 어닐링시키고 두 개의 발현 카세트, 인간 코돈-최적화 S. 피오게네스(hSpy) Cas9 및 키메라 가이드 RNA를 함유하는 p330X 벡터로 클로닝하였다. P330X를 Zhang 실험실 프로토콜(http://www.addgene.org/crispr/zhang/)에 따라 BbsI (New England Biolabs)로 소화시켰다.
eGFP를 표적화하기 위해, eGFP 코딩 서열을 표적화하는 두 개의 특이 gRNA를 eGFP 개시 코돈의 처음 60 bp 내에 설계하였다. eGFP1과 eGFP2 gRNA, 둘 모두는 안티센스 가닥 상에 있으며 eGFP1이 개시 코돈을 직접 표적화하였다. eGFP1 gRNA 서열은 CTCCTCGCCCTTGCTCACCAtGG(서열 번호9)이었고 eGFP2 gRNA 서열은 GACCAGGATGGGCACCACCCcGG(서열 번호10)이었다.
표 1. 설계된 crRNAs. 프라이머 1 및 프라이머 2는 Zhang 프로토콜에 따라 어닐링하였다.
CD163 및
CD1D
유전자를 위한 공여자 DNA의 합성
돼지 CD163 및 CD1D 둘 다를 표적화 벡터와 형질감염된 세포주 사이의 동종 매치(isogenic match)를 보장하기 위해 후기 형질감염에 사용되는 태아 섬유아세포로부터 단리된 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 간략하게, 정방향 프라이머 CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT(서열 번호 11), 및 후방향 프라이머 TATTTCTCTCACATGGCCAGTC(서열 번호 12)를 사용하는 LA 태그(Clontech)를 CD163의 9538 bp 단편을 증폭시키는데 사용하였다. 단편을 DNA 서열 분석하고 도메인-스왑 표적화 벡터를 구축하는데 사용하였다(도 1). 이 벡터는 엑손 11로부터의 인간 CD163L과 동일한 아미노산 서열을 암호화하도록 엑손 7 내에 33개 점 돌연변이를 포함하였다. 대체 엑손은 315 bp이었다. 또한, 후속 인트론이 Cre-재조합효소 (Cre)로 제거될 수 있는 선택 마커 유전자를 수용한 변형된 미오스타틴 인트론 B로 대체되었으며 보유된 loxP 부위를 잠복하는 경우 정상적인 스플라이싱을 이전에 입증하였다(Wells, 비공개 결과). 작제물의 긴 팔은 3469 bp이었으며 도메인 스왑 DS 엑손을 포함하였다. 짧은 팔은 1578 bp이었으며 엑손 7 및 8을 포함하였다(도 1b). 이러한 플라스미드가 1차 형질감염 실험에서 엑손 7의 암호 영역을 대체하고자 사용되었고 선택 마커(G418)를 통한 표적화 이벤트의 선택을 가능케 하였다. 표적화를 발생시키고자 한다면, 마커가 Cre-재조합효소에 의해 결실될 수 있다. 그 후, CD163 DS-표적화 벡터가 Cre 결실될 수 없는 Neo로 파괴된 SIGLEC1 유전자를 이미 함유한 세포주에 사용을 위해 변형되었다. 이러한 표적화 벡터에서, Neo 카세트, loxP 및 미오마이신 인트론 B는 제거되고, 단지 DS 엑손 만이 WT 긴 및 짧은 팔에 남아 있다(도 1c).
돼지 CD1D에 대한 게놈 서열을 정방향 프라이머 CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT(서열 번호 13) 및 후방향 프라이머 GACTGGCCATGTGAGAGAAATA(서열 번호 14)를 사용하여 LA taq로 증폭시켜, 8729 bp 단편을 야기하였다. 단편을 DNA 서열분석하고 도 2에 나타낸 표적화 벡터를 구축하는데 사용하였다. Neo 카세트는 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 촉진제의 조절하에 있고 측면에 loxP 서열이 있으며, 이것은 선택을 위해 도입되었다. 작제물의 긴 팔은 4832 bp이었고 짧은 팔은 3563 bp이었으며, 엑손 6 및 7을 포함하였다. 성공적인 HR이 일어난다면, 엑손 3, 4, 및 5가 제거되고 Neo 카세트로 대체될 것이다. NHEJ 복구가 부정확하게 일어난다면, 엑손 3은 파괴될 것이다.
태아 섬유아세포 수집
세포주를 생성하기 위해 돼지 태아 조직을 임신 35일째에 수집하였다. 두 개의 야생형 (WT) 수컷 및 암컷 태아 섬유아세포 세포주를 라지 화이트종 체내 교배(large white domestic cross)로부터 확립하였다. Neo 카세트(SIGLEC1-/- genetics)를 함유하도록 이전에 변형시킨 수컷 및 암컷 태아 섬유아세포가 또한 당해 연구에서 사용되었다. 태아 섬유아세포를 약간 수정하여 기재된 바와 같이 수집하였다; 각 태아로부터의 분쇄된 조직을 20 ml의 소화 배지(200 단위/ml 콜라게나제 및 25 Kunitz 단위/ml DNaseI로 보충된 1 g/L D-글루코스 [Cellgro] 및 L-글루타민을 함유하는 듈베코-개질된 이글 배지[DMEM]) 중에서 38.5℃에서 5 h 동안 소화시켰다. 소화 후, 태아 섬유아세포를 세척하고 DMEM, 15% 태아 소 혈청(FBS), 및 40 ㎍/ml 겐타마이신과 배양하였다. 밤새 배양한 후, 세포를 트립신화하고 10% 디메틸 설폭사이드를 갖는 FBS 중에 분취량으로 -80℃에서 동결시켜 액체 질소에 저장하였다.
세포 형질감염 및 유전형 분석
형질감염 조건은 본질적으로 이전에 보고된 바와 같았다. 공여자 DNA는 다양한 양의 CRISPR/Cas9 플라스미드(아래 열거됨)와 함께 1 ㎍의 일정량으로 항상 사용되었다. 공여자 DNA를 형질감염 전에 MLUI (CD163) (NEB) 또는 AFLII (CD1D) (NEB)와 선형화하였다. 확립된 세포주의 성별을 형질감염 전에 이전에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 알아내었다. 수컷 및 암컷 세포주 둘 다를 형질감염시키고, 게놈 변형 데이터를 형질감염 사이에 함께 분석하였다. 유사한 계대배양수(2-4)의 태아 섬유아세포 세포주를 2일간 배양하고 15% FBS, 2.5 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자, 및 10 mg/ml 겐타마이신으로 보충된 1 g/L D-글루코스 (Cellgro) 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM 중에서 75%-85% 융합도(confluency)로 되도록 성장시켰다. 섬유아세포를 인산염-완충 염수(PBS) (Life Technologies)로 세척하고 트립신화하였다. 세포를 떼어내자 마자, 세포를 전기천공 배지(75% cytosalts [120 mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4, pH 7.6, 5 Mm MgCl2]) 및 25% Opti-MEM (LifeTechnologies)로 세정하였다. 세포 농도를 혈구계를 사용하여 정량하였다. 세포를 600 X g에서 5 min 동안 펠렛화하고 전기천공 배지에서 1 X 106의 농도로 재현탁시켰다. 각각의 전기천공은 250 V에서 BTX ECM 2001을 통해 투여된 세 개의 (1 msec) 구형파 펄스를 갖는 2 mm 갭 큐벳에 200 ㎕의 세포를 사용하였다. 전기천공 후, 세포를 상기한 DMEM에 재현탁시켰다. 선택을 위해, 600 ㎍/ml G418 (Life Technologies)을 형질감염한지 24 h 후 첨가하고, 배지를 7일째에 교체하였다. 집락을 형질감염 후 14일째에 선발하였다. 태아 섬유아세포를 G418 선택이 사용되었다면 10,000개 세포/플레이트로 그리고 G418 선택이 사용되지 않았다면 50개 세포/플레이트로 평판배양하였다. 오토클레이브 진공 그리스에 의해 각 집락 주위에 밀봉된 10 mm 오토클레이브 클로닝 실린더를 적용함으로써 태아 섬유아세포 집락을 수집하였다. 집락을 PBS로 세정하고 트립신을 통해 수확한 다음; DMEM 배양 배지에서 재현탁시켰다. 재현탁된 집락의 일부(1/3)를 96-웰 PCR 플레이트로 옮기고, 남은 (2/3) 세포를 24-웰 플레이트의 웰에서 배양하였다. 세포 펠렛을 6 ㎕의 용해 완충액(40 mM Tris, pH 8.9, 0.9% Triton X-100, 0.4 mg/ml 프로테이나제 K [NEB])에서 재현탁시키고, 세포 용해를 위해 65℃에서 30 min 동안 배양한 다음 85℃에서 10 min 동안 배양하여 프로테이나제 K를 불활성화시켰다.
DS
및 큰 및 작은 결실에 대한
PCR
스크리닝
HR-지시된 복구의 검출. 원거리 PCR을 사용하여 CD163 또는 CD1D에 대한 돌연변이를 확인하였다. 세 가지 상이한 PCR 검정을 사용하여 HR 이벤트를 확인하였다: 공여자 DNA의 CD163 또는 CD1D 서열에서 좌측 또는 우측의 내인성 CD163 또는 CD1D 서열에 이르는 영역의 PCR 증폭 및 설계된 공여자 DNA를 포함하는 CD163 또는 CD1D의 큰 영역을 증폭시키는 원거리 PCR. 외인성 Neo 서열의 부가로부터 생기는 1.8 kb (CD1D) 또는 3.5 kb (CD163)의 PCR 산물의 크기 증가가 유전자의 HR-지시된 복구에 대한 증거로 간주되었다. 모든 PCR 조건은 95℃에서 2 min 간의 초기 변성에 이은 94℃에서 30 sec, 50℃에서 30 sec, 및 68℃에서 7-10 min의 33회 사이클을 포함하였다. LA taq가 제조자의 권고에 따라 모든 검정에 사용되었다. 프라이머는 표 2에 나와있다.
표 2. CD163 및 CD1D의 HR 지시된 복구를 확인하는데 사용되는 프라이머
작은 결실 검정( NHEJ ). 작은 결실은 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 도입된 돌출된 절단 부위가 측면에 있는 CD163 또는 CD1D의 PCR 증폭에 의해 알아내었다. 앰플리콘의 크기는 CD163 및 CD1D에 대해 각각 435 bp 및 1244 bp이었다. 배아 및 태아 섬유아세포 둘 다로부터의 용해물을 LA taq로 PCR 증폭시켰다. 검정의 PCR 조건은 95℃에서 2 min 간의 초기 변성에 이은 94℃에서 30 sec, 56℃에서 30 sec, 및 72℃에서 1 min의 33회 사이클이었다. 형질감염된 세포의 유전형 분석을 위해, 아가로스 겔 전기영동에 의해 PCR 앰플리콘을 분리함으로써 삽입 및 결실(INDEL)을 확인하였다. 배아 유전형 분석을 위해, 생성된 PCR 산물을 후속적으로 DNA 서열분석하여, PCR에서 사용되는 정방향 프라이머를 사용하여 작은 결실을 확인하였다. 프라이머 정보는 표 3에 나타내어져 있다.
표 3. CD163 및 CD1D 상에서 NHEJ를 통한 돌연변이를 확인하는데 사용되는 프라이머
체세포 핵 이식 ( SCNT )
SCNT 배아를 생산하기 위해, 지역 도축장으로부터의 암퇘지(sow)-유도된 난모세포(ART, Inc.) 또는 새끼를 낳은 일이 없는 암퇘지(gilt)-유도된 난모세포를 사용하였다. 암퇘지-유도된 난모세포를 성숙 배지(2.9 mM Hepes, 5 ㎍/ml 인슐린, 10 ng/ml 표피 성장 인자 [EGF], 0.5 ㎍/ml 돼지 난포-자극 호르몬 [p-FSH], 0.91 mM 피루베이트, 0.5 mM 시스테인, 10% 돼지 난포액, 및 25 ng/ml 겐타마이신을 갖는 TCM-199) 중에 밤새 운송하고 24 h 후 신선한 배지로 옮겼다. 40-42 h의 성숙 후, 0.1% 히알루로니다제의 존재하에서 보텍싱함으로써 난구 세포를 난모세포로부터 제거하였다. 새끼를 낳은 일이 없는 암퇘지-유도된 난모세포를 체외 수정(IVF)에 대해 아래에 기재된 바와 같이 성숙시켰다. 조작 동안, 난모세포를 7.0 ㎍/ml 사이토칼라신 B로 보충된 조작 배지(0.6 mM NaHCO3, 2.9 mM Hepes, 30 mM NaCl, 10 ng/ml 겐타마이신, 및 3 mg/ml BSA를 갖는 TCM-199 [Life Technologies], 삼투압 농도 305 mOsm)에 두었다. 중기 II 플레이트를 함유하는 것으로 추정되는 인접 세포질의 일부와 함께 극체를 제거하고, 공여 세포를 가는 유리 모세관을 사용하여 난황주위 공간에 두었다. 그 후, 재구성된 배아를 BTX Electro 세포 조작기(Harvard Apparatus)를 사용하여 1.2 kV/cm에서 30 lsec 동안 두 개의 DC 펄스(1-sec 간격)로 융합 배지(0.3 M 만니톨, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 및 0.5 mM Hepes)에서 융합시켰다. 융합 후, 융합된 배아를 암흑에서 10 min 동안 200 μM 티메로살로 및 30 min 동안 8 mM 디티오트레이톨로 완전히 활성화시켰다. 그 후 배아를 상기한 바와 같이 0.5 μM Scriptaid (S7817; Sigma-Aldrich), 히스톤 데아세틸라제 억제제를 갖는 변형된 돼지 접합자 배지 PZM3-MU1 중에서 14-16 h 동안 배양하였다.
체외 수정 (
IVF
)
IVF를 위해, 새끼를 낳은 일이 없는 사춘기 전의 암퇘지로부터의 난소를 도살장(Farmland Foods Inc.)으로부터 입수하였다. 미숙한 난모세포를 10 ml 시린지에 부착된 18-게이지 피하주사침을 사용하여 중간 크기 (3-6 mm) 난포로부터 흡인시켰다. 그 후, 균일하게 어두운 세포질을 갖는 난모세포 및 원상태의 주위 난구 세포를 성숙을 위해 선택하였다. 대략 50개 난구 난모세포 복합체를 500 ㎕의 성숙 배지, 3.05 mM 글루코스, 0.91 mM 나트륨 피루베이트, 0.57 mM 시스테인, 10 ng/ml EGF, 0.5 ㎍/ml 황체형성 호르몬(LH), 0.5 ㎍/ml FSH, 10 ng/ml 겐타마이신 (APP Pharm), 및 0.1% 폴리비닐 알콜을 갖는 TCM-199 (Invitrogen)를 함유하는 웰에 가습된 공기 중에서 38.5℃, 5% CO2에서 42-44 h 동안 두었다. 성숙 말기에, 주위 난구 세포를 0.1% 히알루로니다제의 존재하에 3 분 동안 보텍싱함으로써 난모세포로부터 제거하였다. 그 후, 시험관내 성숙한 난모세포를 25-30개 난모세포의 그룹에서 50 ㎕ 점적의 IVF 배지(113.1 mM NaCl, 3 mM KCl, 7.5 mM CaCl2, 11 mM 글루코스, 20 mM Tris, 2 mM 카페인, 5 mM 나트륨 피루베이트, 및 2 mg/ml 소 혈청 알부민[BSA]을 함유하는 변형된 Tris-완충 배지)에 두었다. 하나의 100 ㎕ 동결된 정액 펠렛을 0.1% BSA로 보충된 3 ml의 Dulbecco PBS 중에서 해동시켰다. 동결된 WT 또는 신선한 eGFP 정액을 원심분리에 의해 650 3 g에서 20 min 동안 60% Percoll 중에서 및 10 min 동안 변형된 Tris-완충 배지 중에서 세척하였다. 몇몇 경우에, 이전에 기재된 eGFP 이식유전자에 대해 이형접합성인 신선하게 수집된 정액을 PBS 중에서 3회 세척하였다. 그 후, 정액 펠렛을 IVF 배지로 0.5 X 106개 세포/ml로 되도록 재현탁시켰다. 50 마이크로리터의 정액 현탁액을 난모세포를 갖는 점적에 도입하였다. 배우자를 공기중 5% CO2의 대기에서 38.5℃에서 5 시간 동안 공동 배양하였다. 수정 후, 배아를 공기중 38.5℃ 및 5% CO2에서 PZM3-MU1 중에서 배양하였다.
배아 이식
GE CD163 또는 CD1D 돼지를 생산하기 위해 생성된 배아를 1차 승가허용 발정(standing estrus) 후 1일째(SCNT) 또는 6일째(주입된 접합자)에 대리모에게 이식하였다. 6일째 이식을 위해, 접합자를 10 ng/ml ps48 (Stemgent, Inc.)의 존재하에서 PZM3-MU1 중에서 추가로 5일간 배양하였다. 배아를 대리모의 난관의 팽대-협부-접합부에 수술적으로 이식하였다.
CRISPR
/
Cas9
시스템을 위한 RNA의
시험관내
합성
시험관내 전사를 위한 주형 DNA를 PCR을 사용하여 증폭시켰다(표 4). 모든 형질감염 실험에 사용된 CRISPR/Cas9 플라스미드가 PCR을 위한 주형으로 작용하였다. 접합자에서 Cas9를 발현시키기 위해, mMESSAGE mMACHINE Ultra 키트(Ambion)를 사용하여 Cas9의 mRNA를 생산하였다. 그 후, 폴리 A 신호를 폴리 (A) 테일링 키트(Ambion)를 사용하여 Cas9 mRNA에 부가하였다. MEGAshortscript(Ambion)에 의해 CRISPR 가이드 RNA를 생산하였다. 합성된 RNA의 품질을 1.5% 아가로스 겔 상에서 가시화한 다음 10 ng/㎕의 최종 농도로 희석시키고(gRNA 및 Cas9 둘 다) 3 ㎕ 분취액으로 분배하였다.
표 4. 시험관내 전사를 위해 주형을 증폭시키는데 사용되는 프라이머.
접합자에서 설계된
CRISPR
/
Cas9
시스템의 미량주사
Cas9 및 gRNA를 코딩하는 메신저 RNA를 수정후 14 시간에 (추정 접합자) FemtoJet 미량주사기(Eppendorf)를 사용하여 수정된 난모세포의 세포질에 주사하였다. 미량주사는 Nikon 도립 현미경(Nikon Corporation; Tokyo, Japan)의 가열 스테이지 상에서 조작 배지 중에서 수행하였다. 그 후 주사된 접합자를 추가의 사용시까지 10 ng/ml ps48을 갖는 PZM3-MU1에 이식하였다.
통계적 분석
변형된 게놈을 갖는 집락의 수를 1로 분류하고, 게놈의 변형이 없는 집락을 0으로 분류하였다. PROC GLM (SAS)을 사용하여 차이를 측정하였으며, 0.05의 P값을 유의적인 것으로 간주하였다. 평균은 최소-제곱 평규느로서 계산하였다. 데이터는 수치 평균 ± SEM으로 나타내어진다.
결과
체세포에서 CD163 및
CD1D의
CRISPR
/
Cas9
-
매개된
녹아웃
CD163을 표적화하는 네 개의 상이한 CRISPR 플라스미드(가이드 10, 131, 256, 및 282)의 효율을 2 ㎍/㎕ 양의 공여자 DNA에서 시험하였다(표 5). CRISPR 282는 CRISPR 10 및 256 처리보다 유의적으로 더 높은 평균 집락 형성을 초래하였다(P < 0.05). 상기한 원거리 PCR 검정으로부터, 원래 의도된 바와 같은 HR를 통한 DS 대신에 503 bp 내지 1506 bp 정도에 이르는 큰 결실이 발견되었다(도 3a). 다른 DNA-편집 시스템을 사용한 이전의 보고들은 돼지에서 ZFN을 사용하여 6-333 bp의 훨씬 더 작은 결실을 나타내었기 때문에 이것은 예상하지 못했던 것이었다. CRISPR 10 및 네 개의 모든 CRISPR의 믹스는 CRISPR 256 및 282보다 변형된 게놈을 갖는 더 많은 수의 집락을 초래하였다(표 5, P < 0.002). Neo를 함유하지만 CD163에 상동성이 아닌 플라스미드 및 CRISPR 10으로의 형질감염은 큰 결실을 나타내는 집락을 초래하지 않았다. 흥미롭게도, 공여자 DNA가 어떠한 CRISPR 없이 도입되는 경우 하나의 단일대립유전자 결실이 또한 검출되었다. 이 검정은 돌연변이율의 과소평가를 나타내는 것 같은데, 그 이유는 형질감염된 체세포에서 아가로스 겔 상에서 검출될 수 없는 서열분석에 의한 어떠한 가능한 작은 결실도 스크리닝되지 않았기 때문이다.
표 5. CD163을 표적화하는 네 개의 상이한 CRISPR 플라스미드(가이드 10, 131, 256, 및 282)의 효율. 네 개의 상이한 CRISPR을 2 ㎍ 내지 1 ㎍ 양의 공여자 DNA에서 시험하였다(도 1에 나타냄).
* 4 + 공여자 DNA의 믹스는 0.5㎍의 각 CRISPR과 1 ㎍의 공여자 DNA의 동등한 혼합을 나타낸다. 공여자 DNA 처리는 비 CRISPR 대조군으로서 작용하며 10 + Neo 처리는 CRISPR 처리에서 관찰된 큰 결실이 CD163 공여자 DNA가 또한 존재하는 경우에만 존재하였음을 예시한다.
† ANOVA는 CRISPR 독성을 추정하기 위한 집락/플레이트의 평균 수 및 변형된 게놈을 갖는 집락 퍼센트를 비교하여 수행하였다. P값은 각각 0.025 및 0.0002이었다. n/a = 이 처리에 대해서는 레플리케이트가 없었으므로 통계적 분석을 수행하지 않았다.
‡ HR를 갖는 하나의 집락이 부분 HR 이벤트를 나타낸다.
a-c 위첨자 문자는 집락/플레이트의 평균 수 및 변형된 게놈을 갖는 집락 퍼센트 둘 다에 대한 처리군 사이의 유의적인 차이를 나타낸다(P <0.05).
초기 목표는 CD163에 대해 HR에 의해 도메인 스왑(DS)-표적화 이벤트를 수득하는 것이었지만, CRISPR은 표적화 CD163이 효율을 증가시키지 못했다. 이러한 표적화 벡터의 다양한 조합이 종래의 형질감염에 의한 HR에 의해 CD163을 변형시키는데 사용되어 왔으며 3399개 집락을 스크리닝한 후 0개 표적화 이벤트를 초래하였음을 주지해야 한다(Whitworth 및 Prather, 비공개된 결과). 우리는 CRISPR 10 및 DS-표적화 벡터를 공여자 DNA로 하여 형질감염에 의해 도입하고자 하는 32개 돌연변이 중의 16개를 함유하는 HR로부터 야기되는 부분 DS를 갖는 두 마리의 돼지를 수득하였다.
그 후, 약물 선택 없이 CRISPR/Cas9-유도된 돌연변이의 효율을 시험하였다; 당해 연구에서 사용되는 태아 섬유아세포 세포주는 이미 Neo 내성 카세트 및 SIGLEC1의 녹아웃의 통합을 이미 갖고 있었다. 우리는 또한 CRISPR/Cas9 및 공여자 DNA의 비가 게놈 변형을 증가시키거나 높은 농도에서 독성 효과를 야기하는지를 시험하였다. CRISPR 131이 이 시험을 위해 선택되었는데, 그 이유는 이전 실험에서, 이것이 높은 수의 총 집락 및 변형된 게놈을 갖는 집락의 증가된 퍼센트를 초래하였기 때문이다. 3:1에서 20:1로 증가하는 양의 CRISPR 131 DNA는 태아 섬유아세포 생존가능성에 대해 유의적인 효과를 갖지 않았다. NHEJ에 의해 변형된 게놈을 갖는 집락의 퍼센트는 다양한 CRISPR 농도들 간에 유의적인 차이가 없었지만 10:1 비에서 가장 높은 수의 NHEJ를 가졌다(표 6, P = 0.33). 가장 높은 비의 CRISPR DNA 대 공여자 DNA (20:1)에서 조차도, HR은 관찰되지 않았다.
표 6. 약물 선택 없이 CRISPR/Cas9-유도된 돌연변이의 효율. 네 가지 상이한 비의 공여자 DNA 대 CRISPR 131 DNA를 G418 선택의 사용 없이 이전에 변형된 세포주에서 비교하였다.
a NHEJ 복구를 갖는 집락 퍼센트에 대한 처리군 간의 유의적인 차이(P>0.05).
b 증가하는 농도의 CRISPR로 게놈 변형된 집락의 수에 있어서 유의적인 차이는 없었다(P>0.33).
이 실험에 기초하여, 체세포에서 CD1D의 표적화된 파괴를 시도하였다. 네 가지 상이한 CRISPR을 설계하고 수컷과 암컷 세포, 둘 모두에서 시험하였다. 우리는 적용된 CRISPR 중의 세 개로부터 CD1D의 변형을 검출할 수 없었으나, CRISPR 5350의 사용은 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출할 수 있을 정도로 큰 결실을 갖는 CD1D의 변형을 초래하지 않았다(표 7). 흥미롭게도, 우리는 공여자 DNA가 제공되었지만 HR을 통해 어떠한 유전자 변형도 수득하지 못하였다. 그러나, 우리는 CD163 녹아웃 실험과 유사한 큰 결실을 관찰하였다(도 3b). CRISPR/Cas9가 공여자 DNA와 함께 사용되지 않은 경우에는 큰 결실을 갖는 CD1D의 표적화된 변형이 검출되지 않았다. CRISPR/Cas9-안내된 표적화로부터의 CD1D의 변형은 각가 세포의 수컷 및 암컷 집락의 4/121 및 3/28이었다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출 가능한 INDEL 만이 형질감염 데이터에 포함되었다.
표 7. 네 개의 상이한 CRISPR을 2 ㎍ 내지 1 ㎍ 양의 공여자 DNA에서 시험하였다(도 2에 나타냄). 공여자 DNA 처리가 비 CRISPR 대조군으로서 작용하였다.
GE 세포를 사용한
SCNT을
통한 CD163 및
CD1D
돼지의 생산
CD163 또는 CD1D의 변형을 나타내는 세포를 SCNT에 사용하여 CD163 및 CD1D 녹아웃 돼지를 생산하였다(도 3). 새끼를 낳은 일이 없는 수용자 암퇘지에게 7개 배아 이식(CD163 표 8), 6개 배아 이식(CD163-No Neo), 및 5개 배아 이식(CD1D)을 CRISPR/ Cas9 시스템으로 형질감염된 수컷 및 암컷 태아 섬유아세포로부터의 SCNT 배아로 수행하였다. 새끼를 낳은 일이 없는 수용자 암퇘지 중의 6마리(CD163), 2마리(CD163-No Neo), 및 4마리(CD1D)(표 9)가 만삭 임신하여 각각 85.7%. 33.3%, 및 80%의 임신율을 야기하였다. CD163 수용자 중에서, 5마리는 제왕 절개에 의해 건강한 새끼 돼지를 출산하였다. 한 마리(O044)는 자연 분만하였다. 한배새끼 수(Litter size)는 1 내지 8마리에 이르렀다. 출생 후 성장 장애 때문에 4마리 돼지는 안락사하였다. 한 마리 새끼 돼지는 심각한 구개 파열로 인해 안락사하였다. 남은 모든 새끼 돼지는 건강한 것으로 보인다(도 3c). 도 3b에 기재된 공여자 DNA 및 CRISPR 10로 형질감염된 태아 섬유아세포로부터 생신 두 마리의 한배 수컷 새끼 돼지는 CRISPR 10에 인접한 엑손 7에 30 bp 결실 및 선행 인트론의 추가의 1476 bp 결실을 가졌으며, 따라서 CD163의 인트론 6/엑손 7 접합을 제거하였다(도 3e). 유전자형 및 예측된 번역이 표 10에 요약되어 있다. 한 마리의 수컷 새끼 돼지 및 한 마리의 암컷 한배새끼(4마리 새끼 돼지)는 이전에 변형된 SIGLEC1 세포의 CD163-No Neo 형질감염으로부터 수득되었다. 5마리 새끼 돼지 모두는 SIGLEC1 및 CD163에 대한 이중 녹아웃이었다. 수컷 새끼 돼지는 하나의 대립유전자 상에서 엑손 7에 28 bp 결실 및 엑손 7의 부분 결실 및 엑손 8의 완전 결실 및 선행 인트론을 포함한 또 다른 대립유전자 상의 1387 bp 결실을 갖는 CD163의 이중대립유전자 변형을 가졌으며, 따라서 인트론 엑손 접합. 암컷 새끼 돼지는 하나의 대립유전자에 1382 bp 결실과 11 bp 삽입 및 다른 대립유전자에 CD163의 1720 bp 결실을 포함하는 CD163의 이중대립유전자 돌연변이를 가졌다. CD163 변형 및 예측된 번역의 요약을 표 10에서 찾아볼 수 있다. CRISPR 변형에 의한 CD1D 변형 및 예측된 번역의 요약은 표 11에서 찾아볼 수 있다. 간략하게, 한 마리 암컷 및 두 마리 수컷 한배새끼가 태어나, 13마리 새끼 돼지가 생성되었다. 한 마리 새끼 돼지는 출생 직후 사망하였다. 13마리 새끼 돼지 중 12마리는 CD1D의 이중대립유전자 또는 동형접합성 결실을 함유하였다(도 3f). 한 마리 새끼 돼지는 WT이었다.
표 8. CD163에 대한 배아 이식 데이터.
*CD163 CRISPR NT 라인은 형질감염에 의해 변형된 태아 섬유아세포 라인으로 NT에 의해 생성된 배아를 나타낸다. CRISPR 주사된 배아는 CD163 가이드 RNA와 CAS9 RNA로 1 세포기에 주사된 IVF 배아였다. CD163 CRISPR NT-no Neo 태아 라인은 선택 마커의 사용 없이 형질감염에 의해 변형된 이미 Neo 내성인 이전에 변형된 태아 섬유아세포로NT에 의해 생성된 배아를 나타낸다.
† MU는 재료 및 방법의 IVF 부분에 기재된 바와 같이 미주리 대학에서 흡인 및 성숙시킨 새끼를 낳은 일이 없는 암퇘지 난모세포를 가리킨다. ART는 재료 및 방법의 SCNT 부분에 기재된 바와 같이 구입하여 성숙시킨 암퇘지 난모세포를 가리킨다.
표 9. CD1D에 대한 배아 이식 데이터.
* CD1D CRISPR NT 라인은 형질감염에 의해 변형된 태아 섬유아세포 라인으로 NT에 의해 생성된 배아를 나타낸다. CRISPR 주사된 배아는 CD1D 가이드 RNA와 CAS9 RNA로 1 세포기에 주사된 IVF 배아였다.
† MU는 재료 및 방법의 IVF 부분에 기재된 바와 같이 미주리 대학에서 흡인 및 성숙시킨 새끼를 낳은 일이 없는 암퇘지 난모세포를 가리킨다. ART는 재료 및 방법의 SCNT 부분에 기재된 바와 같이 구입하여 성숙시킨 암퇘지 난모세포를 가리킨다.
표 10. CD163 변형된 돼지에 대한 유전자형 및 번역 예측. 일부 돼지는 이중대립유전자 타입의 변형을 함유할 뿐만 아니라 기재된 하나의 대립유전자 및 PCR에 의해 증폭되지 않았던 또 다른 변형된 대립유전자를 갖는다.
*KO, 녹-아웃
** 새끼 돼지가 안락사하였기 때문에 포함되지 않음.
† 이 컬럼에 있는 서열번호는 서열 번호 47과 관련하여 INDEL을 보이는 서열에 대한 서열번호를 가리킨다.
a 삽입된 서열은 TACTACT (서열 번호 115)이었다.
b 삽입된 서열은 AG이었다.
c 삽입된 서열은 단일 아데닌 (A) 잔기였다.
d 삽입된 서열은 TGTGGAGAATTC (서열 번호116)이었다.
e 삽입된 서열은 AGCCAGCGTGC (서열 번호 117)이었다.
표 11. CD1D 변형 돼지에 대한 유전자형 및 번역 예측
*KO, 녹-아웃
돼지 접합자에서
CRISPR
/
Cas9
시스템의 효율
CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 체세포에서의 CD163 및 CD1D의 표적화된 파괴에 기초하여, 당해 방법을 돼지 배아발생(embryogenesis)에 적용하였다. 먼저, 우리는 발달하는 배아에서 CRISPR/Cas9 시스템의 유효성을 시험하였다. eGFP를 표적화하는 CRISPR/Cas9 시스템을 eGFP 이식유전자에 대해 이형접합성인 수퇘지로부터의 정액과 수정된 접합자에 도입하였다. 주사 후, eGFP를 발현하는 후속 배아를 모니터링하였다. 우리는 다양한 농도의 CRISPR/Cas9 시스템을 시험하였으며 전달된 CRISPR/Cas9 시스템의 세포독성을 관찰하였다(도 4a); CRISPR/Cas9 주사 후 배아 발달은 대조군에 비해 더 낮았다. 그러나, 실험된 모든 농도의 CRISPR/Cas9는,eGFP 발현을 갖는 어떠한 배아도 CRISPR/Cas9-주사된 그룹에서 발견되지 않았기 때문에, eGFP의 변형을 생성하는데 있어서 효과적이었다(도 4b); 비주사된 대조군 배아 중의 67.7%가 녹색이었으며, 이것은 eGFP의 발현을 나타낸다. 개별 배반포를 유전형분석한 경우, 우리는 CRISPR 결합 부위 근처에 작은 돌연변이를 확인할 수 있었다(도 4c). 독성 및 유효성에 기초하여, 10 ng/㎕의 gRNA 및 Cas9 mRNA가 하기 실험에 사용되었다.
CD163을 표적화하도록 설계된 CRISPR/Cas9 성분을 추정 접합자에 도입한 경우, 우리는 후속 배반포에서 유전자의 표적화된 변형을 관찰하였다. 개별 배반포를 CD163의 돌연변이에 대해 유전형분석한 경우, 특정 돌연변이가 모든 배아에서 발견되었다(100% GE 효율). 보다 중요하게도, 우리는 동형접합성 또는 이중대립유전자 변형(각각 8/18 및 3/18)을 갖는 배아를 찾을 수 있으면서(도 5), 또한 모자이크(단일대립유전자 변형) 유전자형(4/18 배아)을 검출할 수 있었다. 혼주(pool)로부터의 일부 배아(8/10)에 2 ng/㎕ Cas9 및 10 ng/㎕ CRISPR를 주사하였으며 돌연변이유발 효율에 있어 차이는 발견되지 않았다. 다음으로, 시험관내 결과에 기초하여, 우리는 표적 유전자의 특정 결실을 유도하기 위해 배아발생 동안 CD163 또는 CD1D를 파괴하는 상이한 gRNA를 나타내는 두 개의 CRISPR을 도입하였다. 그 결과, 우리는 두 개의 가이드를 도입함으로써 CD163 및 CD1D의 설계된 결실을 성공적을 유도할 수 있었다. 설계된 결실은 도입된 두 개의 가이드 사이에 게놈 서열을 제거한 결실로서 정의된다. CD163을 표적화하는 두 개의 CRISPR을 제공받은 배아 중에서, 한 개 빼고는 모든 배아가 CD163의 표적화된 변형을 유발하였다. 또한, 우리는 CD163에 설계된 결실을 갖는 5/13 배아(도 6a)를 발견하였으며 10/13 배아는 동형접합성 또는 이중대립유전자 방식으로 CD163의 변형을 갖는 것으로 보인다. 두 개의 CRISPR로 CD1D를 표적화하는 것 또한, 모든 배아(23/23)가 CD1D의 변형을 나타내었기 때문에 효과적이었다. 그러나, 우리는 단지 두 개의 배아(2/23)에서 CD1D의 설계된 결실을 발견할 수 있었다(도 6b). 우리는 또한 모자이크 유전자형을 갖는 5/23 배아를 발견하였지만, 나머지 배아는 CD1D의 동형접합성 또는 이중대립유전자 변형을 가졌다. 마지막으로, 우리는 다수의 유전자가 동일한 배아 내에서 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 표적화될 수 있는지를 시험하였다. 이러한 목적을 위해, CD163과 eGFP, 둘 모두를 표적화하는 것은 이형접합성 eGFP 정액과 수정된 접합자에서 수행하였다. 주사된 배아로부터의 배반포를 CD163 및 eGFP에 대해 유전형분석한 경우, 우리는 CD163 및 eGFP가 배아발생 동안 성공적으로 표적화되었음을 발견하였다. 서열분석 결과는 다수의 유전자가 다중 CRISPR와 Cas9를 도입함으로써 표적화될 수 있음을 입증하였다(도 6c).
CRISPR
/
Cas9
-주사된 접합자로부터의 CD163 및
CD1D
돌연변이체의 생산
우리의 선행 시험관내 연구로부터의 성공에 기초하여, 우리는 몇 가지 CRISPR/Cas9-주사된 접합자를 생산하였으며 수용자당 46-55개 배반포를 이식하였다(이 숫자가 우리의 시험관내 유도된 배아로부터 돼지를 생산하는데 있어서 효과적인 것으로 나타났기 때문에). 우리는 CD163 및 CD1D에 대해 각각 두 개씩 4개의 배아 이식을 수행하였으며, 각각의 변형에 대해 임신을 수득하였다. 우리는 CD163에 변형을 지닌 건강한 네 마리 새끼 돼지를 생산하였다(표 8). 모든 새끼 돼지, 즉 수용자 암퇘지 ID O083으로부터의 한배새끼 67은 CD163의 동형접합성 또는 이중대립유전자 변형을 나타내었다(도 7). 두 마리 새끼 돼지는 전달된 두 개의 CRISPR에 의해 CD163의 설계된 결실을 나타내었다. 모든 새끼 돼지는 건강하였다. CD1D의 경우, 한 번의 임신이 또한 네 마리 새끼 돼지(수용자 암퇘지 식별 번호 O165로부터의 한배새끼 166)를 생산하였다: 암컷 한 마리 및 수컷 세 마리(표 9). 한 마리 새끼 돼지(166-1)는 개시 코돈을 함유하는 엑손 3을 완전히 제거한 362 bp 결실을 포함한 CD1D의 모자이크 돌연변이를 지녔다(도 8). 한 마리 새끼 돼지는 하나의 대립유전자에 2 bp 미스매치와 6 bp 삽입 및 다른 대립유전자에 큰 결실을 함유한다. 두 마리 추가의 새끼 돼지는 이중대립유전자 단일 bp 삽입을 가졌다. CD163에 대해서는 어떠한 모자이크 돌연변이도 검출되지 않았다.
고찰
GE 돼지 생산의 효율 증가는 농업 및 생체의학을 위해 더 많은 GE 돼지를 제공함으로써 넓은 영향을 미칠 수 있다. 상기한 데이터는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용함으로써, 특정 돌연변이를 갖는 GE 돼지가 높은 효율로 생산될 수 있음을 보여준다. CRISPR/Cas9 시스템은 체세포에서 및 착상전 배아에서 유전자를 변형시키는데 성공적으로 적용되었다.
CRISPR/Cas9 시스템이 체세포에 도입되는 경우, 이것은 NHEJ에 의해 우리의 표적 유전자의 표적화된 파괴를 성공적으로 유도하였지만 HR에 의해 표적화하는 능력을 증가시키지는 못했다. 체세포에서 개별 CRISPR/Cas9의 표적화 효율은 가변적이었으며, 이것은 안내의 설계가 표적화 효율에 영향을 미친다는 것을 나타내었다. 특히, 우리는 CRISPR 5350 및 Cas9가 체세포에 도입되는 경우 CD1D의 어떠한 표적화된 변형도 찾아볼 수 없었다. 이것은 돼지를 생산하기 전에 다수의 gRNA를 설계하고 이들의 효율을 입증하는 것이 유리할 수 있음을 시사한다. 공여자 DNA의 존재하에서 HR-지시 복구의 부족의 이유는 여전히 불명확하다. CRISPR 및 공여자 DNA로 형질감염된 886개 집락(CD163 및 CD1D 둘 다)를 스크리닝한 후, 단 하나의 집락 만이 부분 HR 이벤트에 대한 증거를 가졌다. 우리의 결과는 CRISPR/Cas9 시스템이 도입된 공여자 DNA와 함께 작용하여 표적 유전자에 예상치 못한 큰 결실을 유발하지만 이러한 두 개의 특정 표적화 벡터에 대한 HR 효율을 증가시키지는 못한다는 것을 입증하였다. 그러나, 큰 결실 관찰에 대한 특정 메카니즘은 알려져 있지 않다. 우리의 그룹으로부터의 이전의 보고들은 공여자 DNA가 HR-지시 복구를 유도하기 위해 ZFN과 효과적으로 사용될 수 있음을 시사하였다. 유사하게는, 우리는 공여자 DNA가 CRISPR/ Cas9 시스템과 사용되는 경우 표적화 효율의 증가를 보았지만, 완전한 HR 지시된 복구는 관찰되지 않았다. ZFN을 사용한 우리의 선행 연구에서, 우리는 ZFN에 의해 DSB를 유도한 후 유도된 공여자 DNA의 부분 재조합을 발견하였기 때문에 표적화된 변형이 HR과 NHEJ의 병용을 통해 일어날 수 있음을 관찰하였다. HR 및 NHEJ 경로가 독립적인 것이 아니라 DSB가 호밍 엔도뉴클레아제에 의해 유도된 후 복구 과정을 완료하기 위해 함께 작용할 수 있다는 것이 한 가지 설명이 될 수 있다. 보다 높은 농도의 CRISPR이 체세포에서 표적화 효율을 개선시킬 수 있지만 이들 실험 결과에서 통계적 차이는 발견되지 않았다. 이것은 CRISPR이 CRISPR/Cas9 시스템에서 제한 인자이지만, 추가의 검증이 필요하다는 것을 시사할 수 있다. 표적화된 세포가 SCNT를 통해 GE 돼지를 생산하는데 성공적으로 사용되었으며, 이것은 CRISPR/Cas9의 적용이 세포가 복제하는 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 몇몇 새끼 돼지는 건강상의 이유로 안락사하였다; 그러나, 이것은 SCNT-유도된 새끼 돼지에서는 흔히 있는 일이다.
CRISPR/Cas9 시스템이 접합자 주사에 의해 발달하는 배아에 도입되는 경우, 거의 100%의 배아 및 돼지는 표적화된 유전자에 INDEL을 함유하였으며, 이것은 당해 기술이 배아발생 동안 매우 효과적임을 입증한다. 우리의 연구 동안 우리가 관찰한 효율은 배아발생 동안 호밍 엔도뉴클레아제를 사용하는 다른 연구들에서 보고된 빈도를 능가하였다. 배반포 단계에 도달한 배아 수의 감소는 이 연구에서 우리가 도입한 CRISPR/Cas9의 농도가 배아에 독성일 수 있음을 시사하였다. 전달 시스템을 더욱 최적화하는 것이 배아의 생존가능성을 증가시킬 수 있고 따라서 과정의 전반적인 효율을 개선시킬 수 있다. 여기서 관찰된 거의 100% 돌연변이 유발율은 돼지의 CRISPR/Cas9-매개된 녹아웃에서 선행 보고와는 상이하였다; 그러나, 연구들 간의 효율에 있어서의 차이는 선택된 표적 및 가이드의 조합일 수 있다. 우리의 연구에서, 보다 낮은 농도의 CRISPR/Cas9(10 ng/㎕ each)가 발달하는 배아에서 돌연변이를 생성하고 GE 돼지를 생산하는데 효과적이었다. 농도는 돼지 접합자에서 이전에 보고된 것보다 낮다(125 ng/㎕의 Cas9 및 12.5 ng/㎕의 CRISPR). 발달하는 배아에 과량의 핵산을 도입하는 것은 독성일 수 있기 때문에 보다 낮은 농도의 CRISPR/Cas9 성분이 발달하는 배아에 유리할 수 있다. 우리는 우리의 시험관내 검정으로부터의 CRISPR/Cas9-주사된 배아에서 약간의 모자이크 유전자형을 보았다; 그러나, 접근법을 통해 생산된 단 한 마리의 새끼 돼지만이 모자이크 유전자형을 가졌다. 잠재적으로, 모자이크 유전자형은 접합자에서 CRISPR/Cas9 시스템 사용의 주요 장애물로 간주되었기 때문에 CRISPR/Cas9 성분의 주사가 다른 호밍 엔도뉴클레아제의 도입보다 더욱 효과적일 수 있다. 우리의 결과에 의해 입증되는 CRISPR/Cas9 시스템 사용의 또 다른 이익은 우리는 CRISPR/Cas9 시스템으로 주사된 IVF-유도된 접합자로부터 생산된 CD163 녹아웃 돼지를 전혀 잃지 않은 반면에 SCNT로부터 야기된 몇몇 새끼 돼지는 몇 일 후 안락사하였다는 것이다. 이것은 당해 기술이 녹아웃 돼지를 생산하는 데 있어서 SCNT의 필요를 피할 수 있을 뿐만 아니라 SCNT와 관련된 흔한 건강 문제를 극복할 수 있음을 시사한다. 접합자로의 CRISPR/Cas9 mRNA의 주사가 최적화되었으므로, 향후의 실험들은 공여자 DNA의 공동주사를 또한 포함할 것이다.
우리는 접합자에 두 개의 CRISPR와 Cas9를 도입하는 것이 발달하는 배아에서 염색체 결실을 유도할 수 있고 의도하는 결실, 즉, 두 개의 CRISPR 가이드 사이의 특정 결실을 갖는 돼지를 생산할 수 있음을 입증하였다. 이러한 설계된 결실은, 우리가 NHEJ에 의해 야기된 무작위 이벤트에 의존하기 보다는 결실의 크기를 명시할 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 특히, 호밍 엔도뉴클레아제에 의해 유발된 것의 3의 배수로 뉴클레오티드의 삽입/결실이 있다면, 어떠한 프레임 시프트도 일어나지 않기 때문에 돌연변이가 오히려 히이포모르픽 돌연변이(hypomorphic mutation)을 야기할 수 있다. 그러나, 두 개의 CRISPR을 도입함으로써, 우리는 비기능 단백질을 생성할 수 있는 더 높은 기회를 갖는 더 큰 결실을 야기할 수 있다. 흥미롭게도, CD1D CRISPR은 CD163보다 게놈의 더 넓은 영역에 걸쳐 설계되었다; CD163 CRISPR 10 및 131 사이에는 124 bp 간격이 있는 반면 CD1D의 경우 CRISPR 4800 및 5350 사이에 550 bp의 간격이 있었다. CRISPR 사이의 보다 긴 간격은 연구에서 보여지는 바와 같이 결실을 생성하는데 있어서 그다지 효과적이지 않았다. 그러나, 우리는 단지 제한된 수의 관측을 갖고 여기서는 지목하지 않은 개별 CRISPR의 효율을 고려할 필요가 있기 때문에, CRISPR 간의 거리 및 의도된 결실을 야기하는 능력 사이의 관계를 검증하기 위해 추가의 연구가 필요하다.
CRISPR/Cas9 시스템은 또한 동일한 배지 내에 두 개의 유전자를 동시에 표적화하는데 효과적이었으며, 여기서 유일한 추가의 단계는 하나의 추가의 CRISPR와 crRNA를 도입하는 것이다. 이것은 다른 호밍 엔도뉴클레아제에 비해 다수의 유전자를 쉽게 파괴시킴을 예시한다. 이러한 결과는 이 기술이 상보성 효과를 가질 수 있는 유전자 클러스터 또는 유전자 패밀리를 표적화하는데 사용될 수 있으며, 따라서 모든 유전자가 파괴되지 않는다면 개별 유전자의 역할을 결정하기가 어려운 것으로 판명된다는 것을 시사한다. 우리의 결과는 CRISPR/Cas9 기술이 체세포에서 유전자 표적화의 효율을 증가시킴으로써 및 직접 접합자 주사에 의해 GE 돼지를 생산하는데 적용될 수 있음을 입증한다.
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실시예
2: CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 갖는 돼지에서 PRRSV에 대한 증가된 내성
돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)는 지난 4반세기에 걸쳐 돼지 산업을 침해해 왔다. 바이러스 진입 방식에 대한 추측은 SIGLEC1 및 CD163 둘 다를 포함하였다. SIGLEC1의 녹아웃은 바이러스 시험감염에 대한 반응에 영향을 미치지 않았지만, 우리는 CD163 무반응 동물이 감염의 임상 징후, 폐 병변, 바이러스혈증 또는 항체 생산(모두 PRRSV 감염의 특징이다)을 보이지 않음을 여기서 보여준다. PRRSV 진입 매개인자를 확인하였을 뿐만 아니라; 유사하게 생성된 동물이 식량 공급에 들어가도록 허용된다면, 상당한 경제적 손실 및 동물 고통을 방지할 수 있는 전략을 기재하였다.
재료 및 방법
유전형분석. 유전형분석은 DNA 서열분석 및 mRNA 서열분석 둘 다에 기초하였다. 아비(sire)의 유전자형은 하나의 대립유전자에 11 bp 결실을 가졌으며, 이것은 번역되는 경우 도메인 5로의 45개 아미노산을 예측하여, 아미노산 64에 미성숙 종결 코돈을 야기하였다. 또 다른 대립유전자에서는 엑손 7에 2 bp 부가 및 엑손 7 앞의 인트론에 377 bp 결실이 있었으며, 번역되는 경우 도메인 5의 처음 49개 아미노산을 예측하여, 아미노산 85에 미성숙 종결 코돈을 야기하였다. 한 마리의 암퇘지는 하나의 대립유전자에 7 bp 부가를 가졌으며, 도메인 5의 처음 48개 아미노산을 번역 예측한 경우, 아미노산 70에 미성숙 종결 코돈을 야기하였다. 다른 대립유전자는 PCR 또는 원거리 6.3 kb PCR에 의해 엑손 7로부터 어떠한 밴드도 없었기 때문에 비특성화되었다(A). 다른 3마리 암퇘지는 클론이었으며 도메인 5로부터 43개 아미노산의 결실을 야기하는 것으로 예측된 엑손 7에 129 bp 결실을 가졌다. 다른 대립유전자는 비특성화되었다(B).
배양물에서의 PRRSV의 성장 및 돼지의 감염에 대한 바이러스 접종원의 생산은 승인된 IBC 지원 973 하에 있다. PRRSV의 기준주, 단리물 NVSL 97-7895 (GenBank # AF325691 2001-02-11)를 승인된 IBC 프로토콜 973에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 이러한 실험실 단리물은 약 20년 동안 실험 연구에 사용되어 왔다(Ladinig 등, 2015). 2차 단리물을 이전에 기재된 바와 같이(Prather 등, 2013) 2nd 시험, KS06-72109를 위해 사용하였다.
PRRSV로의 돼지의 감염. PRRSV에 대한 표준화된 감염 프로토콜을 돼지의 감염을 위해 사용하였다. 3주령 새끼 돼지에게 근육내(IM) 및 비내(IN) 경로로 투여된 대략 10^4 TCID50의 PRRS 바이러스를 접종하였다. 돼지를 매일 모니터링하였으며 질환 증상을 나타내는 돼지는 CMG 수의사의 권고에 따라 치료한다. 심각한 고통을 보이고 감염으로 쓰러질 위험이 있는 돼지는 인도적으로 안락사시키고 샘플을 수집한다. 평가 또는 치료에서 편견을 없애기 위해 스텝 및 수의사들은 돼지의 유전 상태에 대해 알지 못하게 하였다. PRRSV는 감염 동안 체액에 존재하며; 따라서, 혈액 샘플을 수집하고, 각 돼지에서 바이러스혈증의 양 또는 정도를 알기 위해 측정할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 실험의 말기에, 돼지를 칭량하고 인도적으로 안락사시키고, 조직을 수집하여 파라핀에 매봉된 10% 완충 포르말린에 고정시키고, 면허가 있는 병리학자가 조직병리학을 위해 처리하였다.
시험감염 돼지의 표현형 점수평가. 돼지의 표현형을 다음과 같이 매일 눈가림 점수평가를 하였다: 돼지의 태도는 어떠한가? 태도 점수: 0: BAR, 1: QAR, 2: 약간 우울함, 3: 우울함, 4: 빈사(Moribund). 돼지의 건강 상태는 어떠한가? 건강 상태 점수: 1: 수척, 2: 마름, 3: 이상적, 4: 살찜, 5: 과잉비만/비만. 돼지의 직장 온도는 어떠한가? 정상 체온 101.6-103.6 (열은 ≥ 104로 간주됨). 다리를 저는가(등급)? 어느 다리? 관절 종창 및 발굽 병변(발굽의 바닥 및 측면 체크)에 대해 다리를 평가함. 절뚝거림 점수: 1: 절뚝거림 없음, 2: 걸을 때 약간 고르지 않음, 일부 관절이 뻣뻣해 보이지만 절뚝거림은 없음, 3: 가벼운 절뚝거림, 걸으면서 약간 절뚝거림, 4: 중간 정도의 절뚝거림, 발가락 터칭 절름발이(toe touching lame)를 포함한 명백한 절뚝거림, 5: 심한 절뚝거림, 다리로 체중을 지탱하지 못함, 서고/걷는데 받침(encouragement)을 필요로 함. 호흡 곤란이 있는가(등급)? 입을 벌리고 호흡하는가? 코 분비물이 있는가(분비물 색, 분비물 양: 약함/중간/심함)? 동물 기침을 알아챘는가? 눈 분비물이 있는가? 호흡기 점수: 0: 정상, 1: 스트레스 받을 때(다루어질 때) 약한 호흡곤란 및/또는 빈호흡, 2: 쉴 때 약한 호흡곤란 및/또는 빈호흡, 3: 스트레스 받을 때(다루어질 때) 중간 정도의 호흡곤란 및/또는 빈호흡, 4: 쉴 때 중간 정도의 호흡곤란 및/또는 빈호흡, 5: 스트레스 받을 때(다루어질 때) 심한 호흡곤란 및/또는 빈호흡, 6: 쉴 때 심한 호흡곤란 및/또는 빈호흡. 설사(등급) 또는 구토의 흔적이 있는가? 혈액 또는 점액이 있는가? 설사 점수: 0: 보이는 분변이 없음, 1: 정상적인 대변, 2: 부드럽지만 형태가 있는 대변(소프트 아이스크림 요구르트 조도, 소똥을 만듬), 3: 미립자 분변 물질을 가진 갈색/황갈색의 액체 설사, 4: 미립자 분변 물질이 없는 갈색/황갈색의 액체 설사, 5: 물과 비슷해 보이는 액체 설사.
이러한 점수평가 시스템은 KSU의 메건 니더워더(Megan Niederwerder) 박사에 의해 개발되었으며 다음의 출판물에 기초한다(Halbur 등, 1995; Merck; Miao 등, 2009; Patience and Thacker, 1989; Winckler and Willen, 2001). 점수 및 온도를 처리(treatment)로서 유전자형에 기초하여 분리된 ANOVA를 사용하여 분석하였다.
PRRSV 바이러스혈증의 측정. 바이러스혈증은 두 가지 접근법을 통해 결정하였다. 바이러스 적정은 혈청의 연속 1:10 희석물을 96 웰-플레이트에서 융합성 MARC-145 세포에 첨가함으로써 수행하였다. 혈청을 이전에 기재된 바와 같이(Prather 등, 2013) 8% 태아 소 혈청, 페니실린, 스트렙토마이신, 및 암포테리신 B로 보충된 이글 최소 필수 배지에서 희석시켰다. 세포를 현미경을 사용하여 4일간의 배양 후 세포변성 효과(cytopathic effect)의 존재에 대해 실험하였다. 세포변성 효과를 보이는 최고 희석을 적정 종점으로 스코어링하였다. 총 RNA를 바이러스 핵산을 측정하기 위한 Life Technologies MagMAX-96 바이러스 RNA 분리 키트를 사용하여 혈청으로부터 분리하였다. 역 전사 폴리머라제 연쇄 반응은 제조자의 지침에 따라 CFX-96 실시간 PCR 시스템(Bio-Rad)에서 Tetracore로부터의 EZ-PRRSV MPX 4.0 키트를 사용하여 수행하였다. 각각의 반응물(25 ㎕)은 5.8 ㎕의 혈청으로부터의 RNA를 함유하였다. 표준 곡선은 키트(Tetracore)에 공급된 RNA 대조물의 연속 희석물을 제조함으로써 작성하였다. PCR 당 주형의 수를 기록한다.
PAM 세포의 SIGLEC1 및 CD163 염색. 돼지 폐포 대식세포(PAM)는 폐를 절개하여 이것을 ~100 ml 냉 인산염 완충 염수로 채움으로써 수집하였다. 인산염 완충 염수 세척물을 회수한 후 세포를 펠렛화하고 5 ml 냉 인산염 완충 염수에 재현탁시키고 빙상에서 저장하였다. 대략 107 PAM를 5 ml의 다양한 항체(항-돼지 CD169 (clone 3B11/11; AbD Serotec); 5% 태아 소 혈청 및 0.1% 나트륨 아지드를 갖는 인산염 완충 염수에서 희석시킨 항-돼지 CD163 (clone 2A10/11; AbD Serotec)) 중에 빙상에서 30 분 동안 배양하였다. 세포를 세척하고 염색 완충액에서 희석시킨 염소 항-마우스 IgG (life Technologies)에 접합된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)의 1/100 희석물에 재현탁시키고 30 분 동안 빙상에서 배양하였다. 적어도 104개 세포를 FACSCalibur 유세포 분석기 및 Cell Quest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.
PRRSV -특이 Ig의 측정. PRRSV-특이 Ig를 측정하기 위해 재조합 PRRSV N 단백질을 박테리아에서 발현시키고(Trible 등, 2012) 키트(Luminex Corporation)를 사용하여 자성 Luminex 비드에 접합시켰다. N 단백질-결합된 비드를 10% 염소 혈청을 함유하는 인산염 완충 염수에서 2,500개 비드/50 ㎕로 되도록 희석시키고 96-웰 환저 폴리스티렌 플레이트의 웰에 두었다. 혈청을 10% 염소 혈청을 함유하는 인산염 완충 염수에서 1:400로 희석시키고 50 ㎕를 듀플리케이트 웰에 가하여 실온에서 부드럽게진탕시키면서 30 분 동안 배양하였다. 그 후 플레이트를 10% 염소 혈청을 함유하는 인산염 완충 염수로 세척(3X)하고, 10% 염소 혈청을 함유하는 인산염 완충 염수에서 2 ㎍/ml로 희석시킨 50 ㎕의 비오틴-SP-접합된 친화도-정제된 염소 항-돼지 이차 항체(IgG, Jackson ImmunoResearch) 또는 비오틴-표지된 친화도 정제된 염소 항-돼지 IgM (KPL)을 가하였다. 30 분 배양 후 플레이트를 세척(3X)한 다음 50 ㎕의 스트렙트아비딘-접합된 피코에리트린(10% 염소 혈청을 함유하는 인산염 완충 염수 중의 2 ㎍/ml (Moss, Inc.))을 가하였다. 플레이트를 30 분 후에 세척하고 미소구체를 100 ㎕의 10% 염소 혈청을 함유하는 인산염 완충 염수에 재현탁시키고 MAGPIX 및 Luminex xPONENT 4.2 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 평균 형광 강도(MFI)를 기록한다.
결과
CD163의 돌연변이는 위에 실시예 1에 기재된 바와 같이 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 생성하였다. 접합자 주사로부터 및 체세포 핵 이식으로부터 몇 마리의 시조 동물을 생산하였다. 이들 시조 동물 중의 일부를 교미시켜 새끼를 생산하여 연구하였다. 단일의 시조 수컷을 두 개의 유전자형을 갖는 암컷에 교미시켰다. 시조 수컷(67-1)은 하나의 대립유전자에서 엑손 7에 11 bp 결실 및 다른 대립유전자의 엑손 7에 2 bp 부가(및 앞의 인트론에 377 bp 결실)을 가졌으며 무반응 동물(CD163 -/-)인 것으로 예측되었다. 한 마리의 시조 암컷(65-1)은 하나의 대립유전자에서 엑손 7에 7 bp 부가 및 비특성화된 상응하는 대립유전자를 가졌으며, 따라서 녹아웃(CD163 -/?)에 대해 이형접합성인 것으로 예측되었다. 두 번째 시조 암컷 유전자형(클론인 3마리 동물)은 아직 비특성화된 대립유전자 및 엑손 7에 129 bp 결실을 갖는 대립유전자를 함유하였다. 이러한 결실이 도메인 5에 43개 아미노산의 결실을 초래하는 것으로 예측된다. 이들 동물 간의 교미는 수퇘지로부터의 무반응 대립유전자 및 암퇘지로부터의 43개 아미노산 결실 또는 비특성화된 대립유전자 중의 하나를 물려받은 새끼 돼지를 모두 야기하였다. 바이러스 시험감염에 대한 양성 대조군으로서 작용하는 야생형 새끼 돼지 이외에, 이것은 4개의 추가의 유전자형을 생산하였다(표 8).
표 12. PRRSV 시험감염에의 내성에 대해 시험된 유전자형(NVSL 및 KS06 균주).
이유기에 유전자 편집된 새끼 돼지 및 야생형 동일-연령 새끼 돼지를 PRRSV 시험감염을 위해 캔자스 주립 대학으로 수송하였다. PRRSV 시험감염은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Prather 등, 2013). 새끼 돼지를, 3주령에, 시험감염 시설로 보내어 단독 그룹으로 유지시켰다. 모든 실험은 동물 사용 및 생물안전 위원회(institutional animal use and biosafety committees)의 승인 후 개시하였다. 순응 후, 돼지를 PRRSV 단리물, NVSL 97-7895 (Ladinig 등, 2015)로 시험감염하고, MARC-145 세포 상에 파종시켰다(Kim 등, 1993). 돼지를 대략 105 TCID50의 바이러스로 시험감염시켰다. 접종원의 이분의 일을 근육내로 전달하고 나머지는 비강내로 전달하였다. 감염된 모든 돼지를 단일 그룹으로 유지시켰으며, 이것은 감염된 펜 메이트(pen mate)로부터의 바이러스의 연속 노출을 가능케 하였다. 혈액 샘플을 감염후 35일까지의 다양한 일수에 및 35일째 종료시에 수집하였다. 돼지를 부검하고 조직을 파라핀에 매봉된 10% 완충 포르말린에 고정시키고 조직병리학을 위해 처리하였다. 감염 과정 동안 기록된 PRRSV 관련된 임상 징후는 호흡 곤란, 식욕부진, 무기력 및 열을 포함하였다. 연구 기간에 걸친 임상 징후에 대한 결과가 도 9에 요약되어 있다. 예상대로, 야생형 Wild Type (CD163+/+) 돼지는 PRRSV 감염의 조기 징조를 보였으며, 이것은 5일과 14일 사이에 최고조에 달하였다가 연구의 나머지 동안 그룹에서 지속되었다. 열성(febrile) 돼지의 퍼센트는 약 10일째에 최고조에 달하였다. 이와 달리, 무반응 (CD163-/-) 새끼 돼지는 전체 연구 기간에 걸쳐 임상 징후의 조짐을 보이지 않았다. 급성 PRRSV 감염 동안의 호흡기 징후는 폐에서 상당한 조직병리학적 변화에 반영된다(표 9). 야생형 돼지의 감염은 간질성 부종과 단핵 세포의 침윤을 포함한 PRRS와 일치하는 조직병리학을 나타내었다(도 10). 이와 달리 무반응 (CD163-/-) 돼지에서는 폐 변화에 대한 징조가 없었다. 다양한 유전자형에 대한 샘플 크기는 작다; 그럼에도 불구하고 평균 점수는 야생형의 경우 3.85 (n=7), 비특성화된 A의 경우 1.75 (n=4), 비특성화된 B의 경우 1.33 (n=3), 무반응 (CD163-/-)의 경우 0 (n=3)이었다.
표 13. 현미경을 이용한 폐 평가
최대 임상 징후는 혈중 PRRSV의 수준과 상관성이 있었다. 바이러스 핵산의 측정은 혈청으로부터의 총 RNA의 분리에 이은 상업적 역전사 효소 실시간 PRRSV PCR 테스트(Tetracore, Rockville, MD)를 사용한 PRRSV RNA의 증폭에 의해 수행하였다. 표준 곡선은 RT-PCR 키트에 제공된 PRRSV RNA 대조물의 연속 희석물을 제조함으로써 작성하였으며, 결과를 50 ㎕ PCR 반응당 주형 수로서 표준화하였다. PRRSV 분리는 야생형 CD163+/+ 돼지에서 PRRSV 바이러스혈증에 대한 과정을 따랐다(도 11). 바이러스혈증은 4일째에 뚜렷하였으며, 11일째에 최고조에 달하였다가 연구 말기까지 감소하였다. 이와 달리 바이러스 RNA는 연구 기간 동안 어느 시점에도 CD163 -/- 돼지에서 검출되지 않았다. 바이러스혈증과 일치하게, 무반응 및 비특성화 대립유전자 돼지에 의한 항체 생산은 14일까지 검출 가능하였으며 28일까지 증가하였다. 무반응 동물에서는 항체 생산이 없었다(도 12). 이와 함께, 이러한 데이터는 야생형 돼지가 PRRS와 일치하는 임상 징후의 발생과 PRRSV 복제를 뒷받침함을 보여준다. 이와 달리, 돼지에게 접종하여 감염된 펜 메이트에 줄곧 노출시키더라도 녹아웃 돼지는 바이러스혈증 및 임상 징후를 발생하지 않았다.
연구 말기에, 돼지 폐포 대식세포를 폐 세척(lung lavage)에 의해 제거하고 이전에 기재된 바와 같이(Prather 등, 2013) SIGLEC1(CD169, clone 3B11/11) 및 CD163(clone 2A10/11)의 표면 발현을 위해 염색하였다. 비교적 높은 수준의 CD163 발현이 CD163+/+ 야생형 동물에서 검출되었다(도 13). 이와 달리, CD163-/- 돼지는 단지 백그라운드 수준의 항-CD163 염색을 보였으며, 따라서 녹아웃 표현형을 확인하였다. 다른 대식세포 마커 CD169에 대한 발현 수준은 야생형 및 녹아웃 돼지 둘 다에 대해 유사하였다(도 14). MHC II 및 CD172를 포함한 또 다른 대식세포 표면 마커는 유전자형 둘 다에 대해 동일하였다(데이터는 미표시).
샘플 크기가 작기는 하지만, 야생형 돼지는 실험 과정에 걸쳐 다른 세 가지 유전자형의 돼지(비특성화 A 1.32 kg ± 0.17, n=4; 비특성화 B 1.20 kg ± 0.16, n =3; 무반응 1.21 kg ± 0.16, n=3)에 비해 체중이 덜 증가하는 경향이 있었다(평균 1일 증가 0.81 kg ± 0.33, n=7).
두번째 시도에서 6마리 야생형, 6마리 △43 아미노산, 및 비특성화 대립유전자 (B)를 갖는 6마리 돼지를 KS06-72109를 사용하여 새끼 돼지에게 접종하는 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 시험감염시켰다. NVSL 데이터와 유사하게 야생형 및 비특성화 B 새끼 돼지는 바이러스혈증을 발병하였다. 그러나, △43 아미노산 돼지에서는 KS06이 바이러스혈증을 유발하지 않았다(도 15; 표 7).
결과 및 결론
돼지 산업에 가장 임상적으로 관련있는 질환은 PRRS이다. 백신화 프로그램이 대부분의 돼지 병원균을 방지하거나 개선하는데 성공적이었지만, PRRSV는 오히려 시험감염성인 것으로 판명되었다. 여기서 CD163이 이러한 바이러스 균주에 대한 진입 매개인자로서 확인된다. 시조 숫돼지는 CRISPR/Cas9를 접합자에 주사함으로써 생산되었으며(Whitworth 등, 2014) 따라서 이식유전자는 없다. 추가로 암퇘지(또한 CRISPR/Cas9를 사용하여 생산됨)로부터의 대립유전자 중의 하나는 이식유전자를 함유하지 않는다. 따라서 새끼 돼지 #40은 하나의 대립유전자에 7 bp 부가 및 다른 대립유전자에 11 bp 결실을 지니지만, 이식유전자는 없다. 이러한 CD163의 바이러스-내성 대립유전자는 돼지 게놈이 약 28억 bp (Groenen 등, 2012)인 것을 고려하여 최소의 게놈 편집을 나타낸다. 유사하게 생산된 동물이 식량 공급에 도입된다면, 상당한 경제적 손실을 막을 수 있다.
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본원에 개시된 실시예는 예시에 의해 제공되며 본 발명의 범위를 국한하는 것으로 의도되지 않는다.
상기에 비추어, 본 발명의 몇 가지 목적들이 달성되며 다른 유리한 결과에 이르게 됨을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들이 상기 산물 및 방법에서 이루어질 수 있기 때문에, 상기 설명에 담겨 있고 첨부된 도면[들]에 나타나 있는 모든 문제들은 제한의 의미가 아니라 예시인 것으로 해석되어야 한다.
서열 표
<110> Curators of the University of Missouri
Prather, Randall
Wells, Kevin
Whitworth, Kristin
<120> PATHOGEN-RESISTANT ANIMALS HAVING MODIFIED CD163 GENES
<130> UMO 16001.USP
<160> 117
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
ggaaacccag gctggttgga ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 2
ggaactacag tgcggcactg tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 3
cagtagcacc ccgccctgac ggg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 4
tgtagccaca gcagggacgt cgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 5
ccagcctcgc ccagcgacat ggg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 6
ctttcattta tctgaactca ggg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 7
ttatctgaac tcagggtccc cgg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 8
cagctgcagc atatatttaa ggg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 9
ctcctcgccc ttgctcacca tgg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 10
gaccaggatg ggcaccaccc cgg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 11
ctctccctca ctctaaccta ctt 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 12
tatttctctc acatggccag tc 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 13
ctctccctca ctctaaccta ctt 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 14
gactggccat gtgagagaaa ta 22
<210> 15
<211> 27767
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 15
atacaagtgc cttttacaga caatctgcac aagttatttg ttagacatat ttgattatag 60
aattaatatt aaaaggggtt ataacaatca agcattgata atttaattat gtttgcctat 120
tttactttag ttttttgaca taactgtgta actattgcga tttttttatt cctaatgtaa 180
ttagttcaaa acaaagtgca gaaatttaaa atattcaatt caacaacagt atataagtca 240
atattccccc cttaaatttt tacaaatctt tagggagtgt ttctcaattt ctcaatttct 300
ttggttgttt catgtcccat atggaagaaa acatgggtgt gaaagggaag cttactcttt 360
tgattacttc ccttttctgg ttgactccac ctccattatg aagcctttct gtatttttgt 420
ggaagtgaaa tgatttttag aattcttagt ggttctcttc ttcaggagaa catttctagg 480
taataataca agaagattta aatggcataa aaccttggaa tggacaaact cagaatggtg 540
ctacatgaaa actctggatc tgcaggtaaa atcttctcat ttattctata tttacctttt 600
aaatagagtg tagcaatatt ccgacagtca atcaatctga tttaatagtg attggcatct 660
ggagaagaag taacagggaa aaaggcaata agctttataa ggggaacttt tatcttccat 720
agactcaaaa ttgaagacgt gactagaaga ttgctagatt tggcatcagt tttgtaaaat 780
tgctgaggtg aaattaagta agggatgaaa attaactaaa ttgtgttgag tatgaaacta 840
gtagttgtta gaaaagatag aacatgaagg aatgaatatt gattgaaagt tgatgaccta 900
gaggacattt agactaacac ctctgagtgt caaagtctaa tttatgattt acatcgatgc 960
gttaaactca tttaacattc ttactttttt cccctcaagc atttaagctg aagtataaca 1020
tttcacatga aagcctggat tataaatgca cagttcagtg acctatctca gaggagtgac 1080
tgccatagca ttttttttgt ctttttgcct tcagagccac agcaacgcgg gatccgaagc 1140
cgcgtctgcg acccacacca cagctcacgg caatgccgga tctttaaccc actgagcgag 1200
gccggggatc gaacccgcag tctcatggtt cctagtagga ttcgttaacc actgcgccac 1260
gacgggaact cctaccatag catttttact tttaagttac tgttggttta gagtaagaag 1320
gagaaatgag agtgatggag cgtttgctat atttggagac aaggtcctat attggaggtt 1380
ctcaaatata aattttgtcg ctttttcctc caatgtattg ttcaactact atttagcagg 1440
ccactgtgcc aggtactggt gaaactggtg aacatgatag atgtaattca ttccctcatg 1500
gaactttcca tctaacaatg tggatcaggt aggcttggag atgagaatgc cagtggttga 1560
ctatgactct gtggctgaag ggagagctac tcacttcgta gtttcatcaa tgtctttttg 1620
gttttccagg ttttaagccc tgctcttgca attcttttcc cttctccaac tttcttctaa 1680
tttctcaccc ctaggatgcc tataaacatg agtattttca aagctacttc actgaggtta 1740
tatgatcctg gtgtgaattt ttcctgcctg acttgccatt tagaaggaag tgtttcctgg 1800
aatttccatt gtggcttggt ggttaaagac cctgcattgt ctctgtgagg atgtgggttc 1860
aatctctggc ctcattcagt gagtgggtta aggatctggt gtcgctgcaa gctgtggcta 1920
agatcccaca ttgccatgtc tgtggtgtag actggcacct ggagctctga tttgaccaca 1980
atcttaggaa cttcagatgt ggccataaaa aggaaaaaaa agttaggaag ggttttctgt 2040
cttgtttgga ccttcgttaa tctcaaacct ttggaaccat ctctcctcca aaacctcctt 2100
tgggtaagac tgtatgtttg ccctctctct tcttttcgca gactttagaa gatgttctgc 2160
ccatttaagt tccttcactt tggctgtagt cgctgttctc agtgcctgct tggtcactag 2220
ttctcttggt gagtactttg acaaatttac ttgtaaccga gcccaactgt gacaagaaac 2280
actgaaaagc aaataattgc tcctgaagtc tagatagcat ctaaaaacat gcttcatggt 2340
ttcaaggatc atatattgaa accccaggga tcctctagag tcgacctgca gcatgcaggg 2400
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 2460
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gtgcataagg aaagactatc 2520
tcaacgtctt attcctcagc ttacattaga tttgaaactc tagtcaccta aaatgcaaat 2580
ctcatttact taccatcaga gatattaatg acctatagaa ttcagcataa ataaagtttc 2640
atgtatggat attagcttat ggttctagtc actgctaatt gaaacctgtg atattgctgt 2700
ttgttttgac tcctatgaaa taacattctc ccattgtacc atggatgggt ccagaaacat 2760
ttctcaaatc ctggcttgaa aaaataaata agtaatctaa agaataataa ttctctactt 2820
gctctttgaa tcttgaccaa ttgctgcatt tacctattgt tacaggagga aaagacaagg 2880
agctgaggct aacgggtggt gaaaacaagt gctctggaag agtggaggtg aaagtgcagg 2940
aggagtgggg aactgtgtgt aataatggct gggacatgga tgtggtctct gttgtttgta 3000
ggcagctggg atgtccaact gctatcaaag ccactggatg ggctaatttt agtgcaggtt 3060
ctggacgcat ttggatggat catgtttctt gtcgagggaa tgagtcagct ctctgggact 3120
gcaaacatga tggatgggga aagcataact gtactcacca acaggatgct ggagtaacct 3180
gctcaggtaa gacatacaca aataagtcaa gcctatacat gaaatgcttt gtgggaaaaa 3240
atgtatagat gagttaaaaa caaaaaggaa ccagttttct ataagtcatc tagtccatgt 3300
ataaaattac ccaatccatt actaaaagac cacttctggt attttacaca tgacaaagcc 3360
catattaaaa aaaaaaaatt cagaagagat tctgaatgct ataataaatg agcaagtgac 3420
tagcttcaat tttatattag gtcattctac cttctacttc tacatgaaaa tatcataatg 3480
tctaagttaa ttccttgtcc cctttcccaa taaagcactg ctttcatgca ctggcctatg 3540
aatcatgaac tttttgccct ttaactgatg atcaacttac caaatcaaga aataaatatt 3600
cttagcactg atcctttttt gttgttgttg gaggaagaat gttttgcaaa gtagaattgc 3660
ttttttctgt ttaacagtgc tattcatttc atttacatgg tcgttttaat ttataaaaca 3720
tttcataagt ttcacctcat atgcccttac aataactcag gaagttatat gttagacctt 3780
tctgctgaca aatcccagag tcatgtttct gacccagttc agattccttg gcttcccatt 3840
tctctttgct catgtcattg acctttatgc agccctctta cctcccacct ttctattaca 3900
gaccatctcc tccataggac tggtgttaga aagtactaat ctctacccag gcattgtggt 3960
gcaatgtggg cagcacaggc tggtatctag aaaaatgctg aagtgaattc cagctcagct 4020
gctcgttaat actatcgttt taagtaagct gttcaatcct ttgaaattca ctttctgagc 4080
actcagtgat ataataaatg tagagctact ggtacactgt ctggtatgta ataggtgtta 4140
ccaattaacc ttagtttcct catgggtcac tggttctcat tacctagaca actcatttct 4200
ctttcttcct ctttctcttt ctccattctc ctcctccttc ttcctcttct tcttgtctgt 4260
tattgttata tcattttgct gagaaagtta agaaataaca actctaacct ctacatcgac 4320
cacctagagc aaagttaaaa ataataataa accttgccag actcttacta taattgttgc 4380
tgtctataga gttgactgtt taagttaaga catcagtata tatttttaat ttttgtgttt 4440
tttttttcat acttttacat gaggatcctt tatataagga tgagttaaac aaacttgatt 4500
tttgaagttt atacccctga ggctcaactg cataataata gaaagggatc catagcctct 4560
caaggactta actagtttca tgagttttca gaatctgaat ttctgagatt ctccacccca 4620
attaaagctc aagcctcaga acatatatcc ttctcttggt aaattctatt cttatcacat 4680
gcgtaataat aaaaaagaga gatgttggag acagattttt ttcctcacat tctgtctcta 4740
ctgttttcta ggtgtttgat tctgtgttat ttaacctcag tttgcttatc tgtgaagtag 4800
ggattatggt aataacatat aatgctttat gttgtaaaga ctaaagaaga tagcatatgt 4860
aacacatttg gaacagggaa tgcatatttt gattgtgagc tcttattatt attaccattc 4920
agccctaata aaaatcttgg taagtggaag gctttggatt tcagaacttt taaaatctaa 4980
ttactttttc aaaaaagaac ttcttagggt tttttttttt taaccacaaa gtgtttctat 5040
tttttaggtg tcccaaaatt tcgttccaaa tatctttttc tcagatattt tagtcctcat 5100
agaacaccta gggatagtgg atagagaaaa ttttctttat taaaaagctg ttctttgcta 5160
aaaattgtag caggtacttt tgggaggggg gaaaactttg attcagaaac tgctaagaca 5220
tggagtgttt tgactaattt ttcctcaatt tttaatgttt tttataccat agggtacttt 5280
tgcaaactat tatgcatact tatatatttt tacttttttc ctgtctttta acttccaaat 5340
tcaacttcag acaattattc atgcactaaa ctgtttgtag taagaaagat taaaattaaa 5400
aaattaacca ttcaacaaat gactggtttg ccatttttac tactttgttg tatgaacaat 5460
ttttttttct acaaatgaat actttgagtc tgatttatcc attcctacat aaaagttttt 5520
actatatctt agtattggaa ggaaacaaaa caaaacacaa tgtaaatttt aatctataaa 5580
ttttgggggg gtaaatatac atagatgaaa gtcttaacca ttaattagag tcaaaagatt 5640
aaaattctcc aatatgtgaa cttaggctgc atccaaaatg aagcatcatt tttaaggaca 5700
gcatcaaaag tgaccagagg aattttactt tctttctttt tttttttttt gaattttagt 5760
ttctaaactc acttctgaat aaatacaact tctaaattct cgtcttttct ctactctaga 5820
tggatctgat ttagagatga ggctggtgaa tggaggaaac cggtgcttag gaagaataga 5880
agtcaaattt caaggaacgt ggggaacagt gtgtgatgat cacttcaaca taaatcatgc 5940
ttctgtggtt tgtaaacaac ttgaatgtgg aagtgctgtc agtttctctg gttcagctaa 6000
ttttggagaa ggttctggac caatctggtt tgatgatctt gtatgcaatg gaaatgagtc 6060
agctctctgg aactgcaaac atgaaggatg gggaaagcac aattgcgatc atgctgagga 6120
tgctggagtg atttgcttaa gtaaggactg acctgggttt gttctgttct ccatgagagg 6180
gcaaaaaaag gggagtaaaa gtcttaaaag ctcaaactgt taaaaacata atgatgattg 6240
cttcttttat catcttatta ttatctaatt tcaggtcgaa attctagtac ctgtgcagtt 6300
ttttacctta actgaaatta agataaatag gatagggagg aaggatgagc agtgacattt 6360
aggtccaagt catgaggtta gaaggaaatg ttcagagaat agcccattcc ctcagccctc 6420
aaagaaagaa agaaagaaaa agaaaaaaaa aaagaaagct taactagaaa attttgttct 6480
ctggatgttt tagaggcaaa ccatcccttt atcattccta cctacaaagc cttctcttaa 6540
tcacattacc caccctttcc tactatagtc aggggggggg gggggggggg gggggggggg 6600
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 6660
gggggggggg gtgaaaaaag aaccaaacaa tttcaacaaa aaaccaaaca attccaacaa 6720
aattggtcca ataagcaaac ctctagataa atttcagtgc cctggatgtt ttgttaggaa 6780
ctcttcctac aatgcgtgct ttccattctg aaaagtccta tctacttgcc tgatccactt 6840
ctccttccat cctaaacgat tttcagtggt agtatattac tgttgtctct gtctctactt 6900
atatatcttc cccttttcac tcactcctct caggtacagc tcttcagttt gcccttattc 6960
ttgtttcctt gtcaatgact tgttttgtgt ccctcttaca gatggagcag acctgaaact 7020
gagagtggta gatggagtca ctgaatgttc aggaagattg gaagtgaaat tccaaggaga 7080
atggggaaca atctgtgatg atggctggga tagtgatgat gccgctgtgg catgtaagca 7140
actgggaggt ccaactgctg tcactgccat tgtcgagtta acgccagtga gggactggac 7200
acattggctc acacacatac agccatgaca cgatctgctc tatggtccga tgattaaagg 7260
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 7320
gggggggggg gggggggggg gggggggggg ggggggggag aagagctggt ggacatttct 7380
ggaaaggaac caaaacccgg aagggccttg ttcttcagga tttgggatgg attggggagg 7440
gagaaaattg tttctaatat ttcttggtgg gaattctttt acagttgtga caaatctttc 7500
acatattctt catttgagta gtttggaggg ttgtctgact gttttctata ataaatgtcc 7560
caagtgctat gaggtaccac atttcaaatt ctaattctac ctgaagctcc aaaaagacaa 7620
aatgttatag gtcttttctt tatatctaat ttgcttatgg tttttagcca ttgacaattt 7680
ttttttctta actcttgaaa ctataaccct atttctaacc aaattcatgt tctatactgg 7740
ctcttcaaaa acccaggaga tgggaaagcc agaatctcca gtgtttcagc ttctgggaag 7800
gagcaagttt ttaaaaatac cctctgggag ctaaattcca catgtatcta tggcctaagt 7860
gtatgtttat tttgcagatg gatcagatct ggaactgaga cttaaaggtg gaggcagcca 7920
ctgtgctggg acagtggagg tggaaattca gaaactggta ggaaaagtgt gtgatagaag 7980
ctggggactg aaagaagctg atgtggtttg caggcagctg ggatgtggat ctgcactcaa 8040
aacatcatat caagtttatt ccaaaaccaa ggcaacaaac acatggctgt ttgtaagcag 8100
ctgtaatgga aatgaaactt ctctttggga ctgcaagaat tggcagtggg gtggacttag 8160
ttgtgatcac tatgacgaag ccaaaattac ctgctcaggt aagaatttca atcaatgtgt 8220
taggaaattg cattctactt tcttttacat gtagctgtcc agttttccca gcaccacttg 8280
ttgaagagac tgtcttttct tcatcatata gtcctacatc ctttgtcata aattaattga 8340
ccataggtgt gtgggtttat atctgggctc tctattctgt tcctttgatc tatatgtctg 8400
tttttatgcc agcaccatgc tgttttgatt actatagctt tgtagtatca tctgaagtca 8460
ggaaacatga ttcctccagc tttgttcttc tttctcaaga ttgttttgtc tattcagagt 8520
ttatgttccc atgcagattt aatttttaaa tttatttaat ttttattttt tatttttaat 8580
ttaaattaat ttaaattttt tatttcccaa cgtacagcca agggggccag ggtaaccttt 8640
acatgtatac attaaaaatt tcaggttttt cccccaccca tttctttctg ttggcaagta 8700
aatttttgaa caaagtttcc caatgctttt taaggggaat tcccttgggg gggggggggg 8760
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 8820
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg agacgaaatt gactatattt 8880
tctttgttgg gaatctttta cagttgtgac aaatctttca catattcttc atttgagtag 8940
tttggagggt tgtctgactg ttttctataa taaatgtccc aagtgctatg aggtaccaca 9000
tttcaaattc taattctacc tgaagctcca aaaagacaaa atgttatagg tcttttcttt 9060
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atcagatctg gaactgagac ttaaaggtgg aggcagccac tgtgctggga cagtggaggt 9360
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caaaattacc tgctcaggta agaatttcaa tcaatgtgtt aggaaaattg cattctactt 9660
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cagttcctca ctcaagtaag gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 10140
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggc 10200
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gttctcccca aagtaagccc tgctggcttt caaaacttct gggagcttgc cttcttggta 10320
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gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg ggggaatggg 11700
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ttacttattt gggggggcct agatttttaa ccctctcctt gtttttctag aaatagagtt 14100
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ccttaagagt gggtgtacct aggagttccc attgtggctc agtggtaaca aactcgactg 18060
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atgtctgtca atttctgctc tacagcaaag tgacccagtt atttacatat acattctgtt 21660
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ccaggatgga atacacctgg tttgctggaa agacatgtgc tttcataaag acgaattttg 21840
gaaaaaatat aaaatttaaa aggcccatta aataagcaaa gttttaagag atttcaaaaa 21900
aaatttcatc tctctctttt cctctttgac ctcttgggca cgttcatctt ctcaaatatg 21960
atcttggtgt ttctgacttt tcagacaaaa taagacttca agaaggaaac actaattgtt 22020
ctggacgtgt ggagatctgg tacggaggtt cctggggcac tgtgtgtgac gactcctggg 22080
accttgaaga tgctcaggtg gtgtgccgac agctgggctg tggctcagct ttggaggcag 22140
gaaaagaggc cgcatttggc caggggactg ggcccatatg gctcaatgaa gtgaagtgca 22200
aggggaatga aacctccttg tgggattgtc ctgccagatc ctggggccac agtgactgtg 22260
gacacaagga ggatgctgct gtgacgtgtt caggtgaggg cagagagtct ggattgagct 22320
tggaagctct ggcagcaaag agagggtggg cggtgacctg cattgggtaa agattggaag 22380
gtccagccta aggatctggt ggtgggggga gacatgatgt ttcagtctga agaatgatga 22440
aaacctgtgt ggttacgcat gggccttcgc cgaggaaagg gacataacta ccatgtatcc 22500
tcctgcagag ggaggaagaa ctaggggatt ctagttttgt gtgggaagga gcagtttact 22560
tggctcagga ggcactaaag gctcagatag gaaacagaga tctgttccat tcttactccc 22620
agaactgatt ctcttctctt ttctcctaca gaaattgcaa agagccgaga atccctacat 22680
gccacaggta tatcaaaaag tttaagaaca tgggacccat tgtctgcatt ttgtggaatc 22740
cctcttatta agacattctg ggtcagaagt tctgaggatt tgacatttac ttcagctatc 22800
tgttatctta cccaagagag ggatggtaac taggaaccca ggtcttttag ctaagacatt 22860
atcacctctt gtgatgttta cttgttctca ggtcgctcat cttttgttgc acttgcaatc 22920
tttggggtca ttctgttggc ctgtctcatc gcattcctca tttggactca gaagcgaaga 22980
cagaggcagc ggctctcagg tctgaacaaa attacggtct ctctaatgtt tctatgggag 23040
aagaagcctc tctggataat aaaacaaaaa aattacattc aagtatcagt tggccagaaa 23100
gagggaacct agaagaggtt taagcagttt ctccgaaaca gggaacaaga attcagagaa 23160
gaaaaggcac attggctgta ctgatgatac ctgcactcgc tatgtatgtt taatggggga 23220
cagtagagaa ttgatagttt agaaggagta tgcttatatg gttctggatg aatcctgtat 23280
ccccccaaac atttattttc tcttactata tacttattac taatttaact cttctgtcaa 23340
gccatgtgct aggttctgaa gatggttcag acttggataa ccaagtgctt ttgttttcat 23400
ggaatttcca gtttagtgga agagataaat atgtaaacaa ataaatgggg gggggggggg 23460
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23520
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23580
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23640
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23700
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23760
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23820
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23880
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 23940
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 24000
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg ggggggggtt ggcgggcccc 24060
cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga tatcgaattc gtgagccaga ggacgagact 24120
agagatggat gatgactacg ttatgcttgc actgctgggg aaaagcacac atagggaggg 24180
aacgttttat tatgacccag tccctaacct atgacctctg ttatcagttt tctcaggagg 24240
agagaattct gtccatcaaa ttcaataccg ggagatgaat tcttgcctga aagcagatga 24300
aacggatatg ctaaatccct caggtccgtg ggttctttga ggggctgtag ccctggggtt 24360
cagatcagca gctgcagttg aggttgaggc atgctacttt gcatagcagt agaaagaaat 24420
ctcaactgta ataggaagct tgggatgcat atgaggaaga aaggcaagaa tgaactacaa 24480
attattctta gggaagataa aaattgcagt catggggaga cctctggctg agagggccgt 24540
gattatttct gacagaggga ttatggagta gaatatgatg gcttggacct tttttcacta 24600
aaacaagtca gtcttctcaa aggtagttta gcttttcata tatctttcac agtttcttcc 24660
attcccattt cctgccattt tcctttctct aacttttatt tattatattt tttcctaaaa 24720
gtttaaattt tctatatctt tatcccttca gaagccatcc ctagtcacag gactagtctc 24780
atttcccatt atgtaatgct tctttctctg tctgttgact tctatttaga accagtgcac 24840
taaatctgcc tttaggaaca tacctctgct aggttgcaag aaatatccca ttccccactc 24900
actctgtgaa gactcaatgc ttctcaatat tccttacctc ctgagaggga cttgcctcac 24960
ttctttaatc caagggactc gatttttgcc aaaactaagt caggaaaacc tacataagac 25020
ataggaaaga cttgctgtgc ttcttaaacc ccactgtttg ttttcctaat tgtgaacagt 25080
atttttaaag ttaacaagag agcttctaag gcacttgagg ggagatctga tttatttccc 25140
agtaattatt ttcttccttt cagaaaattc cactgaataa gatggtttta acggatgtgg 25200
gactaatttt tgtgtctaaa tctcttccta tttctggatg aaaaaaagga gaccactctg 25260
aagtacaatg aaaaggaaaa tgggaattat aacctggtga ggtgagtagg aagaatttat 25320
tcatcattgc tgaaaacagg tacattcctt ttgaaagttg agaactcctc tggtattaga 25380
aaaaaaaaaa gaacgtatat acacatatat ttccatgtct atgtttatgt ttgtaaatcc 25440
atattcagaa tatgcaacaa ctttttataa ctatgacttc agtccatctt ttagttacat 25500
atatattcta aacaacaact attgctaaga gaagctgggt aagtaaatgt gaataaatct 25560
tctaaagata ttacaggaag ttcctgctgc ggctcagtgg gttaaagact tgatgtcttt 25620
gtgaagatga gggctcgagc cctggcctca ctcagtgagt taaggatcta gcattgctgt 25680
aagctgcagc gtaggttgca gatagggctc agatccagtg ttgctgtggc tgtggcctca 25740
gttgcagctc tgattcaacc cttaggcgag gaacttccat atgcagcaaa tgtggccatt 25800
aaaaaaaaaa aaaacattat aggagtcatt tcataaaaga gataagacgt ttctatagtt 25860
atatagtgca tactctggta aagatagtat aggatactat aggaatatag aaagcttgcc 25920
tatgaaaatt tgggaagatt gtggaaaaga catctcaaaa tatggcatag aaaagaatca 25980
tatctttgag gaacagtaag tttttcattc aaaaccgtgt attgaacata cttgtggtga 26040
caagtggtgt cctgagtact aaaaattcag tgataaaaga tgctcttgac aaagacatgg 26100
ctgttgaata gaaggtctca ctgtcaatgt gtgggaatta tggacagcct atgtggacac 26160
agggaataga tgagactcta ggctggaagg ctgcattgag cccaataatg aatggtcctg 26220
tctgatatat ttcatgctca tattttattt tagggactat tggggaggtg gtgggttttg 26280
gaagattaag ctgaggcaag acacaatcag attgcctttt ataatttact ttcaggagga 26340
aagtctaact aaaaaaagaa ttcgatatca agcttatcga taccgtcgac ctcgaggagg 26400
cccgcctgcc cttttggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg 26460
gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggggggg gggggcagca 26520
ccaattttat tattggcggg aataaagaga aaaatgtaat ttcaaagatt gctgttggaa 26580
atgaggggtg tggtagcttt tggagaaagc attctggaga cttctattaa tttttttttt 26640
ttaagtgctt caaagatcct ttgatccaac aattctactc ctaaaaattt cttccataca 26700
gataaagcca tttgtctgta tataacaaat agaagagaat tcctttttgc agccttgtta 26760
gtagtgcccc caaactggaa acaaagtgaa tatcagtcag tggggtagcg gctggaaaaa 26820
ttttagtgca cccaaccaac aaagaaaaac catgcacaaa aattcaataa atatcatctc 26880
acttttgtgt tcatgttatt gaatataatt aaacataatg tttacatcta taaaattatc 26940
atatgtatac atgtaaagaa acattaaaac atttttaaca gactgtaaac ttgaggactg 27000
tgaatgactt ttgattgata atctcaaaca tatggatact attctgatgt aataaataat 27060
gattaaattt tttccctaaa gagtaatcac tactgaatcg ttgcctcaga atcatatgga 27120
ggtgctttta aaaaaggcat ttctgcactg ttgttctctg gaatagaagt aattcttatg 27180
tacactgaag tttgaaaatc attgcattta agtgttctgt tcaggaaagt agtgtgcttt 27240
ttaatatttg tgagtgaatg agtaacacaa tacattatat cacattttaa tgtaattcta 27300
cacatgtgca tatgaagaga aaagtaacat ttttttctat ttatgtcttt agttcagcct 27360
ttaagatacc ttgatgaaga cctggactat tgaatgagca agaatctgcc tcttacactg 27420
aagattacaa tacagtcctc tgtctcctgg tattccaaag actgctgttg aatttctaaa 27480
aaatagattg gtgaatgtga ctactcaaag ttgtatgtaa gactttcaag ggcattaaat 27540
aaaaaagaat attgctgatt cttgttcttg attttctgaa tttctgaatc tcttattggg 27600
cttctaattt aaaaaaaaat atctgggcgc ccgcagatat cgaactcttg ggcagtgtga 27660
ccaaacgaag acatatccaa tcaagcatgc aaatggacca gcccactgta ctagcacgct 27720
gtggcagcca atctgaccga gaaagcagac aaccgcaggg agcaacg 27767
<210> 16
<211> 55
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 16
ggtcgccacc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatc 55
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 17
ggtcgccacc atggccatga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcc 54
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 18
ggtcgccacc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggt 48
<210> 19
<211> 55
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 19
ggtcgccacc atggttgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccat 55
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 20
tgcagggaac tacagtgcgg cactgtggtt tccctcctgg ggg 43
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 21
tgcagggaac tacagtgcgg cactgtaaac cactactact gtggtttccc tcctgggggg 60
60
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 22
tgcagggaac tacagtgcgg ctgtggtttc cctcctgggg g 41
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 23
tgcagggaac tacagtgcgg aactactgtg gtttccctcc tggggg 46
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 24
gaaacccagg ctggttggag gggacattcc c 31
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 25
gaaacccagg ctggggacat tccc 24
<210> 26
<211> 13
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 26
aggggacatt ccc 13
<210> 27
<211> 13
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 27
gaaacccatt ccc 13
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 28
ggtcgccacc atggtgagca agggcgagga g 31
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 29
ggtcgccacc atggctgagc aagggcgagg ag 32
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 30
ggtcgccacc atggtgagag ggcgaggag 29
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 31
ggtcgccacc atggttgagc aagggcgagg ag 32
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 32
ggtcgccacc atggtgagca agggcgagga gaacccaggc tggttgga 48
<210> 33
<211> 49
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 33
tgctgtgcag ggaactacag tgcggcactg tggtttccct cctgggggg 49
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 34
tgctgtgcag ggaactctgt ggtttccctc ctgggggg 38
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 35
ctgtggtttc cctcctgggg gg 22
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 36
actgtggttt ccctcctggg ggg 23
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 37
tgctgtgcag ggaactacag tgcggcaact gtggtttccc tcctgggggg 50
<210> 38
<211> 10
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 38
tcctgggggg 10
<210> 39
<211> 8
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 39
ctgggggg 8
<210> 40
<211> 52
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 40
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga catggggtac ctgccgtttg tg 52
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 41
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga gat 33
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 42
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga 30
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 43
agagccagcc tcgcccagca ggggtaccat ggggtacctg ccgtttgtgt 50
<210> 44
<211> 53
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 44
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga gcagtgggta cctgccgttt gtg 53
<210> 45
<211> 53
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 45
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga tcagtgggta cctgccgttt gtg 53
<210> 46
<211> 53
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 46
agagagcaga gccagcgact cgcccagcga acatggggta cctgccgttt gtg 53
<210> 47
<211> 4990
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 47
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60
agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120
ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180
tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240
ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300
ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360
attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420
tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480
gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540
gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600
cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660
tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720
atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780
caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840
gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900
tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960
aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080
actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140
agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200
aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260
cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320
ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380
tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440
cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500
atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560
cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620
aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680
aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800
cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860
gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920
gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980
tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040
gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100
cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160
aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280
tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340
tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400
taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460
atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520
aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580
ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640
tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700
gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760
aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820
agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880
ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940
tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000
cccacaggaa acccaggctg gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac 3060
aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg 3120
tgctgtgcag ggaactacag tgcggcactg tggtttccct cctgggggga gctcactttg 3180
gagaaggaag tggacagatc tgggctgaag aattccagtg tgaggggcac gagtcccacc 3240
tttcactctg cccagtagca ccccgccctg acgggacatg tagccacagc agggacgtcg 3300
gcgtagtctg ctcaagtgag acccagggaa tgtgttcact ttgttcccat gccatgaaga 3360
gggtagggtt aggtagtcac agacatcttt ttaaagccct gtctccttcc aggatacaca 3420
caaatccgct tggtgaatgg caagacccca tgtgaaggaa gagtggagct caacattctt 3480
gggtcctggg ggtccctctg caactctcac tgggacatgg aagatgccca tgttttatgc 3540
cagcagctta aatgtggagt tgccctttct atcccgggag gagcaccttt tgggaaagga 3600
agtgagcagg tctggaggca catgtttcac tgcactggga ctgagaagca catgggagat 3660
tgttccgtca ctgctctggg cgcatcactc tgttcttcag ggcaagtggc ctctgtaatc 3720
tgctcaggta agagaataag ggcagccagt gatgagccac tcatgacggt gccttaagag 3780
tgggtgtacc taggagttcc cattgtggct cagtggtaac aaactcgact ggtatccatg 3840
agggtatggg tttgatccct ggccttgctc aatgggttaa ggatccagca ttgctgtgag 3900
ctgtggtata ggttgcagac tctgctcagg tcccatgttg ctgtgattgt ggtgtaggct 3960
gactgctgca gcttcaattt gacccctagc ccgggaattt ccataggcca cacgtgcagc 4020
actaaggaag gaaaaaaaga aaaaaaaaaa aaaagagtgg gtgtgcctat agtgaagaac 4080
agatgtaaaa gggaagtgaa agggattccc ccattctgag ggattgtgag aagtgtgcca 4140
gaatattaac ttcatttgac ttgttacagg gaaagtaaac ttgactttca cggacctcct 4200
agttacctgg tgcttactat atgtcttctc agagtacctg attcattccc agcctggttg 4260
acccatcccc ctatctctat ggctatgttt atccagagca catctatcta acactccagc 4320
tgatcttcct gacacagctg tggcaaccct ggatccttta accaactgtg ccaggctgga 4380
gatcaaacct aagcctctgc agcaacccaa gctgctgcag tcagattttt aaccccctgt 4440
gccactgtgg gtatctccga tattttgtat cttctgtgac tgagtggttt gctgtttgca 4500
gggaaccaga gtcagacact atccccgtgc aattcatcat cctcggaccc atcaagctct 4560
attatttcag aagaaaatgg tgttgcctgc ataggtgaga atcagtgacc aacctatgaa 4620
aatgatctca atcctctgaa atgcatttta ttcatgtttt atttcctctt tgcagggagt 4680
ggtcaacttc gcctggtcga tggaggtggt cgttgtgctg ggagagtaga ggtctatcat 4740
gagggctcct ggggcaccat ctgtgatgac agctgggacc tgaatgatgc ccatgtggtg 4800
tgcaaacagc tgagctgtgg atgggccatt aatgccactg gttctgctca ttttggggaa 4860
ggaacagggc ccatttggct ggatgagata aactgtaatg gaaaagaatc tcatatttgg 4920
caatgccact cacatggttg ggggcggcac aattgcaggc ataaggagga tgcaggagtc 4980
atctgctcgg 4990
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 48
caccggaaac ccaggctggt tgga 24
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 49
aaactccaac cagcctgggt ttcc 24
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 50
caccggaact acagtgcggc actg 24
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 51
aaaccagtgc cgcactgtag ttcc 24
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 52
caccgcagta gcaccccgcc ctgac 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 53
aaacgtcagg gcggggtgct actgc 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 54
caccgtgtag ccacagcagg gacgt 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 55
aaacacgtcc ctgctgtggc tacac 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 56
caccgccagc ctcgcccagc gacat 25
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 57
aaacatgtcg ctgggcgagg ctggc 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 58
caccgcagct gcagcatata tttaa 25
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 59
aaacttaaat atatgctgca gctgc 25
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 60
caccgctttc atttatctga actca 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 61
aaactgagtt cagataaatg aaagc 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 62
caccgttatc tgaactcagg gtccc 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 63
aaacgggacc ctgagttcag ataac 25
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 64
caccgctcct cgcccttgct cacca 25
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 65
aaactggtga gcaagggcga ggagc 25
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 66
caccggacca ggatgggcac caccc 25
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 67
aaacgggtgg tgcccatcct ggtcc 25
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 68
ttgttggaag gctcactgtc cttg 24
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 69
acaactaagg tggggcaaag 20
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 70
ttgttggaag gctcactgtc cttg 24
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 71
ggagctcaac attcttgggt cct 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 72
ggcaaaattt tcatgctgag gtg 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 73
gcacatcact tcgggttaca gtg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 74
cccaagtatc ttcagttctg cag 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 75
tacaggtagg agagcctgtt ttg 23
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 76
cccaagtatc ttcagttctg cag 23
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 77
ctcaaaagga tgtaaaccct gga 23
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 78
tgttgatgtg gtttgtttgc cc 22
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 79
tacaggtagg agagcctgtt ttg 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 80
ggaggtctag aatcggctaa gcc 23
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 81
ggctacatgt cccgtcaggg 20
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 82
gcaggccact aggcagatga a 21
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 83
gagctgacac ccaagaagtt cct 23
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 84
ggctctagag cctctgctaa cc 22
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 85
ggacttgaag aagtcgtgct gc 22
<210> 86
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 86
taatacgact cactataggg agaatggact ataaggacca cgac 44
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 87
gcgagctcta ggaattctta c 21
<210> 88
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 88
ttaatacgac tcactatagg ctcctcgccc ttgctcacca 40
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 89
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 90
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 90
ttaatacgac tcactatagg aaacccaggc tggttgga 38
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 91
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 92
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 92
ttaatacgac tcactatagg aactacagtg cggcactg 38
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 93
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 94
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 94
ttaatacgac tcactatagg ccagcctcgc ccagcgacat 40
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 95
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 96
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 96
ttaatacgac tcactatagg cagctgcagc atatatttaa 40
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 97
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 98
<211> 3484
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 98
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60
agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120
ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180
tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240
ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300
ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360
attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420
tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480
gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540
gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600
cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660
tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720
atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780
caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840
gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900
tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960
aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080
actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140
agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200
aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260
cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320
ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380
tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440
cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500
atcctgcgtt gctgtggctg tggcacattc cctgctctgg tcgtgttgaa gtacaacatg 1560
gagacacgtg gggcaccgtc tgtgattctg acttctctct ggaggcggcc agcgtgctgt 1620
gcagggaact acagtgcggc actgtggttt ccctcctggg gggagctcac tttggagaag 1680
gaagtggaca gatctgggct gaagaattcc agtgtgaggg gcacgagtcc cacctttcac 1740
tctgcccagt agcaccccgc cctgacggga catgtagcca cagcagggac gtcggcgtag 1800
tctgctcaag tgagacccag ggaatgtgtt cactttgttc ccatgccatg aagagggtag 1860
ggttaggtag tcacagacat ctttttaaag ccctgtctcc ttccaggata cacacaaatc 1920
cgcttggtga atggcaagac cccatgtgaa ggaagagtgg agctcaacat tcttgggtcc 1980
tgggggtccc tctgcaactc tcactgggac atggaagatg cccatgtttt atgccagcag 2040
cttaaatgtg gagttgccct ttctatcccg ggaggagcac cttttgggaa aggaagtgag 2100
caggtctgga ggcacatgtt tcactgcact gggactgaga agcacatggg agattgttcc 2160
gtcactgctc tgggcgcatc actctgttct tcagggcaag tggcctctgt aatctgctca 2220
ggtaagagaa taagggcagc cagtgatgag ccactcatga cggtgcctta agagtgggtg 2280
tacctaggag ttcccattgt ggctcagtgg taacaaactc gactggtatc catgagggta 2340
tgggtttgat ccctggcctt gctcaatggg ttaaggatcc agcattgctg tgagctgtgg 2400
tataggttgc agactctgct caggtcccat gttgctgtga ttgtggtgta ggctgactgc 2460
tgcagcttca atttgacccc tagcccggga atttccatag gccacacgtg cagcactaag 2520
gaaggaaaaa aagaaaaaaa aaaaaaaaga gtgggtgtgc ctatagtgaa gaacagatgt 2580
aaaagggaag tgaaagggat tcccccattc tgagggattg tgagaagtgt gccagaatat 2640
taacttcatt tgacttgtta cagggaaagt aaacttgact ttcacggacc tcctagttac 2700
ctggtgctta ctatatgtct tctcagagta cctgattcat tcccagcctg gttgacccat 2760
ccccctatct ctatggctat gtttatccag agcacatcta tctaacactc cagctgatct 2820
tcctgacaca gctgtggcaa ccctggatcc tttaaccaac tgtgccaggc tggagatcaa 2880
acctaagcct ctgcagcaac ccaagctgct gcagtcagat ttttaacccc ctgtgccact 2940
gtgggtatct ccgatatttt gtatcttctg tgactgagtg gtttgctgtt tgcagggaac 3000
cagagtcaga cactatcccc gtgcaattca tcatcctcgg acccatcaag ctctattatt 3060
tcagaagaaa atggtgttgc ctgcataggt gagaatcagt gaccaaccta tgaaaatgat 3120
ctcaatcctc tgaaatgcat tttattcatg ttttatttcc tctttgcagg gagtggtcaa 3180
cttcgcctgg tcgatggagg tggtcgttgt gctgggagag tagaggtcta tcatgagggc 3240
tcctggggca ccatctgtga tgacagctgg gacctgaatg atgcccatgt ggtgtgcaaa 3300
cagctgagct gtggatgggc cattaatgcc actggttctg ctcattttgg ggaaggaaca 3360
gggcccattt ggctggatga gataaactgt aatggaaaag aatctcatat ttggcaatgc 3420
cactcacatg gttgggggcg gcacaattgc aggcataagg aggatgcagg agtcatctgc 3480
tcgg 3484
<210> 99
<211> 4997
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 99
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60
agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120
ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180
tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240
ttttactaag gtctgagaaa taatcttgag atgagaatga actctacttc ttcagagtct 300
ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360
attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420
tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480
gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540
gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600
cgaacccatg tcctcatgga tgctagttgg gttcgttaac tgctgagcca tgatgggaac 660
tccaaattaa ttatttctta tatttgttct tcatatattc atttctatag aaagaaataa 720
atacagattc agttaatgat ggcaggtaaa agcttaactt attaatcaaa ggagttaatc 780
caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840
gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900
tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960
aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080
actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140
agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200
aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260
cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320
ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380
tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440
cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500
atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560
cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620
aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680
aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800
cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860
gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920
gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980
tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040
gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100
cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160
aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280
tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340
tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400
taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460
atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520
aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580
ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640
tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700
gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760
aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820
agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880
ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940
tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000
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aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg 3120
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<213> Sus scrofa
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tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60
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caggcacaaa aattcaattc atggctctct gttaaaattt aggtataggt ttagcaggaa 840
gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900
tacagcacag ggaactatat ccaatctctt gggatagaat atgatggaag acaaaatcag 960
aacaagagag tatatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1020
tgtgtgactg ggtcaccctg cggcacagca gaaattggca gaacattgta aatcaactat 1080
actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140
agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200
aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260
cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320
ttcaagtact tgacaaaatt tcaccattaa agagaaattt gtgggagttc ccatcgtggc 1380
tcagtggaaa caaatccaac taggaaccat gaggttgtgg gtttgatccc tggcctcact 1440
cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500
atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560
cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620
aaagacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaacccccag 1680
aggtatttat ttgtttttgc cttttttcac tgactgttct ttgtttgttt gtttgagact 1740
gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800
cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860
gtatttagtg agaggaattt caagctcaaa taatgattca gcaagattaa attaaggagg 1920
gaattttcct tgtggctgag tgggttaagg acccaatgtt gtctctgtga ggatgtaggt 1980
tccatcctgg gctttgctca ttaggttaag gatctggcat tgctgcagct cagacccagt 2040
gctgccctgg ttgtggctta ggccaaagct gcagctccaa ttcaatctct ggcctgggaa 2100
cctccatgtg ctacaaggtg cggccttaaa aggaaaaaaa aaaaattaaa tcaaggactc 2160
aagagtcttt cattatttgt gttgtggaag ctatatttgt tttaaagtct tagttgtgtt 2220
tagaaagcaa gatgttcttc aactcaaatt tgggagggaa cttgtttcat acatttttaa 2280
tggataagtg gcaaaatttt catgctgagg tgatctatag tgttgtaatg cagaatatag 2340
tcagatcttg aacattttag gaagttggtg agggccaatt gtgtatctgt gccatgctga 2400
taagaatgtc aagggatcac aagaattcgt gttatttgac agcagtcatc tttaaaaggc 2460
atttgagaaa gtccaatttc aaatgcattt cctttcttta aaagataaat tgaagaaaat 2520
aagtctttat ttcccaagta aattgaattg cctctcagtc tgttaaaaga aactcttacc 2580
ttgatgattg cgctcttaac ctggcaaaga ttgtctttaa aatctgagct ccatgtcttc 2640
tgctttattt ctggtgtgcc tttgactcca gattacagta aatggaggac tgagtatagg 2700
gctaaaaagt agagagaatg gatgcatatt atctgtggtc tccaatgtga tgaatgaagt 2760
aggcaaatac tcaaaggaaa gagaaagcat gctccaagaa ttatgggttc cagaaggcaa 2820
agtcccagaa ttgtctccag ggaaggacag ggaggtctag aatcggctaa gcccactgta 2880
ggcagaaaaa ccaagaggca tgaatggctt ccctttctca cttttcactc tctggcttac 2940
tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000
cccacaggaa acccaggctg gttggagggg acattccctg ctctggtcgt gttgaagtac 3060
aacatggaga cacgtggggc accgtctgtg attctgactt ctctctggag gcggccagcg 3120
tgctgtgcag ggaactacag tgcgattcat catcctcgga cccatcaagc tctattattt 3180
cagaagaaaa tggtgttgcc tgcataggtg agaatcagtg accaacctat gaaaatgatc 3240
tcaatcctct gaaatgcatt ttattcatgt tttatttcct ctttgcaggg agtggtcaac 3300
ttcgcctggt cgatggaggt ggtcgttgtg ctgggagagt agaggtctat catgagggct 3360
cctggggcac catctgtgat gacagctggg acctgaatga tgcccatgtg gtgtgcaaac 3420
agctgagctg tggatgggcc attaatgcca ctggttctgc tcattttggg gaaggaacag 3480
ggcccatttg gctggatgag ataaactgta atggaaaaga atctcatatt tggcaatgcc 3540
actcacatgg ttgggggcgg cacaattgca ggcataagga ggatgcagga gtcatctgct 3600
cgg 3603
<210> 113
<211> 3619
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 113
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60
agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120
ggtctaagaa attttggtca caaagttgtt ttgaatccca ggcattttat ttgcaatgat 180
tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240
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ggaaggaata aattatgaaa atgtattaat gcttctttaa accatattgt atatttatct 360
attactaaac aaaaagaagt agctctattt atttatttat ttatttattt atttatgtct 420
tttgtctctt tagggccaca cctgtggcat atggaggttc ccaggctaga ggtccaattg 480
gagatgtagc agccagccta tgccagagcc accgcaacac gggatctgag ccacgtctgt 540
gacttacacc acagctcaca gcaacgcctg atcctcaacc cactgagcga ggccagggat 600
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gaaaaggtta gtagatgcag actattacat ttagaatgga tggacaatga agtcctacta 900
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actttaatag gaaaaatact tttaagggct aaatttccaa tattctaacc atgtacacag 1140
agtaaatgtc ataaggatgc cagtctgtgt agagattgat gtgttactag cagattcatg 1200
aaataaaggc tgaggatgta gtccccaagt cacttctgag tggaagaatt tctcctttgt 1260
cctggactca aatattttag gataaaggaa aaaagaagat atttatagaa gggacttgtt 1320
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cagtgggtta aggatccggt gttgccgtga gctgtggtgt aggttgcaga cacggttctg 1500
atcctgcgtt gctgtggctg tggctgtggt gtaggccagc agcaaacagc tctgattaga 1560
cccctagcct ggaaacctcc atatgccaca ggtgcagccc taaaaagaca aaaaaagaga 1620
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gatctagaag actagagatt acaagaaata tggatttggc tcactctaag aaactgcttt 1800
cattccaagg tttgggtcta tccaaaagtg gaatagaatc atatgaatac tagtttatga 1860
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tcctatcatg aaggaaaata ttggaatcat attctccctc accgaaatgc tatttttcag 3000
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catatttggc aatgccactc acatggttgg gggcggcaca attgcaggca taaggaggat 3600
gcaggagtca tctgctcgg 3619
<210> 114
<211> 3270
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 114
tatagatgac aaggctttgt gtctgatagg ggccagcgaa ctcagtaaag agggaagatg 60
agaaagataa tggcaagaat ttatccctga agtgtagttt tgacaaacca gtcacaaaga 120
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tgcatatgtt ctggaaagga catctgaacc taagaaatag ttcatttgca ttgtgttata 240
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<210> 115
<211> 7
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 115
tactact 7
<210> 116
<211> 12
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 116
tgtggagaat tc 12
<210> 117
<211> 11
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 117
agccagcgtg c 11
Claims (158)
- CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 적어도 하나의 변형된 염색체 서열을 포함하는 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포로서, 상기 변형이
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,137 내지 뉴클레오티드 3,147의 11개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149 및 3,150 사이에 2개 염기 쌍 삽입과, 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573 내지 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실, 여기서 상기 2개 염기 쌍 삽입은 디뉴클레오티드 AG의 삽입을 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,147의 124개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,146의 123개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,147과 3,148 사이에 1개 염기 쌍 삽입, 여기서 상기 1개 염기 쌍 삽입은 단일 아데닌 잔기의 삽입을 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,159의 130개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,161의 132개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 1,525 내지 뉴클레오티드 3,030의 1506개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 사이에 7개 염기 쌍 삽입, 여기서 상기 7개 염기 쌍 삽입은 서열 TACTACT (서열 번호 115)를 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,818 내지 뉴클레오티드 4,097의 1280개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,724 내지 뉴클레오티드 4,096의 1373개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,431 내지 뉴클레오티드 3,897의 1467개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실, 여기서 결실된 서열은 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 상기 12개 염기 쌍 삽입이 서열 TGTGGAGAATTC (서열 번호 116)를 포함하고, 여기서 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에서의 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있음;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 4,531의 1387개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실, 여기서 결실된 서열은 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 여기서 상기 11개 염기 쌍 삽입은 서열 AGCCAGCGTGC (서열 번호 117)를 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,440 내지 뉴클레오티드 4,160의 1720개 염기 쌍 결실;
및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고,
상기 변형은, CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 의한 감염에 대한 민감성에 비해, PRRSV에 의한 감염에 대한 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포의 민감성을 감소시키는 것인,
돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포. - 청구항 1에 있어서, 상기 돼지 동물 또는 자손이 배아, 청소년(juvenile) 동물, 또는 성체이거나, 또는 상기 세포가 배아 세포, 청소년 돼지 동물로부터 유도된 세포, 또는 성체 돼지 동물로부터 유도된 세포를 포함하는, 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 돼지 동물 또는 자손이 유전자 편집된 동물 또는 자손을 포함하거나, 또는 상기 세포가 유전자 편집된 세포를 포함하며, 여기서 상기 동물 또는 세포가 호밍 엔도뉴클레아제를 사용하여 유전자 편집되고, 상기 호밍 엔도뉴클레아제가 무리를 이루어 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조의 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR))/Cas 시스템, 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 재조합효소 융합 단백질, 메가뉴클레아제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 염색체 서열이 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에서의 삽입, CD163 단백질을 암호화하는 유전자에서의 결실, 또는 이의 조합을 포함하는, 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 염색체 서열이 돼지 동물, 자손 또는 세포에 의한 실질적으로 비 기능성 CD163 단백질의 생산을 야기하는, 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 돼지 동물, 자손, 또는 세포가 삽입 또는 결실 외의 상기 염색체 서열의 영역에서 서열 번호 47에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 염색체 서열을 포함하는, 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 돼지 동물, 자손, 또는 세포가 서열 번호 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 또는 114를 포함하는 염색체 서열을 포함하는, 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포.
- 청구항 1 내지 5 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 정자 세포, 난 세포, 또는 체세포를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 세포.
- 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 의한 감염에 대해 감소된 민감성을 갖는 동물 또는 혈통을 생산하기 위한 번식방법으로서, 상기 방법은
난모세포 및 정자 세포 중의 적어도 하나 내로 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 도입하기 위해 난모세포 또는 정자 세포를 유전자 변형시키는 단계, 및 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 함유하는 수정란을 생산하도록 난모세포를 정자 세포와 수정시키는 단계를 포함하거나; 또는
수정란 내로 CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 도입하기 위해 수정란을 유전자 변형시키는 단계;
수정란을 대리모 암컷 동물 내로 이식시키며, 여기서 임신 및 만기 분만이 자손 동물을 생산하는 단계;
병원균에 대한 민감성에 대해 상기 자손 동물을 스크리닝하는 단계; 및
CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 동물에 비해 병원균에 대한 감소된 민감성을 갖는 자손 동물을 선택하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 변형이
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,137 내지 뉴클레오티드 3,147의 11개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149 및 3,150 사이에 2개 염기 쌍 삽입과, 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573 내지 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실, 여기서 상기 2개 염기 쌍 삽입은 디뉴클레오티드 AG의 삽입을 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,147의 124개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,146의 123개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,147과 3,148 사이에 1개 염기 쌍 삽입, 여기서 상기 1개 염기 쌍 삽입은 단일 아데닌 잔기의 삽입을 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,159의 130개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,161의 132개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 1,525 내지 뉴클레오티드 3,030의 1506개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 사이에 7개 염기 쌍 삽입, 여기서 상기 7개 염기 쌍 삽입은 서열 TACTACT (서열 번호 115)를 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,818 내지 뉴클레오티드 4,097의 1280개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,724 내지 뉴클레오티드 4,096의 1373개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,431 내지 뉴클레오티드 3,897의 1467개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실, 여기서 결실된 서열은 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 상기 12개 염기 쌍 삽입이 서열 TGTGGAGAATTC (서열 번호 116)를 포함하고, 여기서 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에서의 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있음;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 4,531의 1387개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실, 여기서 결실된 서열은 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 여기서 상기 11개 염기 쌍 삽입은 서열 AGCCAGCGTGC (서열 번호 117)를 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,440 내지 뉴클레오티드 4,160의 1720개 염기 쌍 결실;
및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인,
방법. - CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 돼지 동물에서의 CD163 단백질 생산 또는 활성에 비해 CD163 단백질 생산 또는 활성이 감소되도록, CD163 단백질을 암호화하는 유전자로부터 적어도 하나의 염색체 서열을 유전자 변형하는 것을 포함하고, 상기 변형이
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,137 내지 뉴클레오티드 3,147의 11개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,149 및 3,150 사이에 2개 염기 쌍 삽입과, 동일 대립유전자 상에 참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,573 내지 뉴클레오티드 2,949의 377개 염기 쌍 결실, 여기서 상기 2개 염기 쌍 삽입은 디뉴클레오티드 AG의 삽입을 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,147의 124개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,024 내지 뉴클레오티드 3,146의 123개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,147과 3,148 사이에 1개 염기 쌍 삽입, 여기서 상기 1개 염기 쌍 삽입은 단일 아데닌 잔기의 삽입을 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,159의 130개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,030 내지 뉴클레오티드 3,161의 132개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 1,525 내지 뉴클레오티드 3,030의 1506개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,148과 뉴클레오티드 3,149 사이에 7개 염기 쌍 삽입, 여기서 상기 7개 염기 쌍 삽입은 서열 TACTACT (서열 번호 115)를 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,818 내지 뉴클레오티드 4,097의 1280개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,724 내지 뉴클레오티드 4,096의 1373개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,431 내지 뉴클레오티드 3,897의 1467개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 488 내지 뉴클레오티드 2,417의 1930개 염기 쌍 결실, 여기서 결실된 서열은 뉴클레오티드 488에서 시작하는 12개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 상기 12개 염기 쌍 삽입이 서열 TGTGGAGAATTC (서열 번호 116)를 포함하고, 여기서 참조 서열 서열번호 47에 비해 엑손 7에서의 뉴클레오티드 3,044 내지 뉴클레오티드 3,172의 추가의 129개 염기 쌍 결실이 있음;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 3,172의 28개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,145 내지 뉴클레오티드 4,531의 1387개 염기 쌍 결실;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 3,113 내지 뉴클레오티드 4,494의 1382개 염기 쌍 결실, 여기서 결실된 서열은 뉴클레오티드 3,113에서 시작하는 11개 염기 쌍 삽입으로 대체되고, 여기서 상기 11개 염기 쌍 삽입은 서열 AGCCAGCGTGC (서열 번호 117)를 포함함;
참조 서열 서열번호 47에 비해 뉴클레오티드 2,440 내지 뉴클레오티드 4,160의 1720개 염기 쌍 결실;
및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고,
상기 변형이, CD163 단백질을 암호화하는 유전자에 변형된 염색체 서열을 포함하지 않는 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 의한 감염에 대한 민감성에 비해, PRRSV에 의한 감염에 대한 돼지 동물 또는 이의 자손 또는 세포의 민감성을 감소시키는 것인,
PRRSV의 감염에 대한 돼지 동물의 내성을 증가시키는 방법. - 삭제
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