KR20190067212A - 변형된 cd163을 포함하는 돼지 및 관련 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 5(SRCR5) 도메인(CD163 도메인 5로도 알려짐)이 결실된 CD163 단백질을 생산하는 유전자 편집 돼지에 관한 것이다. 이러한 돼지는 건강하고, 부정적인 특성을 나타내지 않으며, PRRSV 감염에 대해 저항성이 있는 것으로 밝혀졌다. 편집된 돼지에서 발현된 CD163은 또한 헤모글로빈-합토글로빈 스캐빈저로서 기능하는 능력의 보유를 보여준다. 이러한 돼지를 생산하는 방법 또한 제공된다.

Description

변형된 CD163을 포함하는 돼지 및 관련 방법
본 발명은 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 5(scavenger receptor cysteine-rich 5, SRCR5) 도메인이 결실된 CD163 단백질을 생산하는 유전자 편집 돼지(swine)에 관한 것이다. 이러한 돼지(swine)는 건강하고, 부정적인 특성을 나타내지 않으며, PRRSV 감염에 대해 저항성이 있는 것으로 밝혀졌다. 게다가, SRCR5가 없는 CD163 단백질은 헤모글로빈-합토글로빈 스캐빈저로서 기능하는 능력을 보유한다. 본 발명은 또한 이러한 돼지(swine)를 생산하는 방법에 관한 것이다.
돼지 생색기 호흡 증후군 바이러스(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)는 돼지 생식기 호흡 증후군(PRRS)라고 불리는 돼지(pig)의 질환을 야기하는 바이러스이다.
많은 돼지(pig) 생산 국가에서 고질적인, 이러한 경제적으로 중요한 질병은 어린 돼지(pig)의 종축 및 호흡기 질환에서 생식 장애를 야기한다. 초기에 "미스터리 돼지 질환" 및 "미스터리 생식 증후군"이라고 불리는 이것은 1987년 북미와 중유럽에서 처음 보고되었다. 이 질환으로 미국 돼지 산업계는 연간 6.5억 달러 정도의 비용이 소요될 것으로 추산된다.
PRRSV는 대식세포 세포표면 마커: CD169 및 CD163의 세트를 통해 대식세포로 들어간다. CD169/시알로어드헤신의 역할은 Ghent 내 Hans Nauwynck의 그룹에 의해 발견되었다. CD163의 역할은 Pfizer(Clavert et al. 2007)와 함께 일하는 과학자들에 의해 발견되었다. Calvert 등(2007)은 비-민감성 세포의 CD163으로의 형질감염이 PRRSV에 민감성인 세포로 만들 수 있다는 것을 입증하였다. 그것은 Marc-145 세포를 이용할 필요 없이 백신 균주의 생성을 가능하게 한다.
Van Gorp 등(“Susceptible cell lines for the production of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by stable transfection of sialoadhesin and CD163”, BMC Biotechnology 2010, 10:48)은 CD163 단백질의 도메인 5 내지 9가 PRRSV의 비-민감성 세포로의 진입에 있어서 중요하다는 것을 입증하였고, 도메인 5가 중요할 수 있다는 것을 강조하였다.
Das 등(“The Minor Envelope Glycoproteins GP2a and GP4 of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Interact with the Receptor CD163”, JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 2010, p. 1731-1740)은 PRRSV 당단백질 GP2A 및 GP4가 CD163과 물리적으로 상호작용한다는 것을 입증하였다.
Pfizer((Zoetis)가 보유한 US 20050271685는 CD163 분자의 사용이 세포를 PRRSV 및 ASFV에 대해 민감하게 만들 수 있다는 것을 시사한다.
WO 2012/158828은 SIGLEC1 및/또는 CD163 유전자가 비활성화된 PRRS 저항성 동물을 설명한다. 그러나, CD163은 정상적인 생리 활성에 있어서 역할을 수행한다. 그러므로, 동물에 대한 바람직하지 않고 예상할 수 없는 노크-온 효과가 있을 수 있으므로, 이러한 유전자를 비활성화시키는 것은 바람직하지 않다.
PRRSV의 예방 및 치료에 있어서 개선이 필요하다.
본 발명자들은 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 5(SRCR5) 도메인(CD163 도메인 5로도 알려짐)이 결실되어 있는 CD163을 생산하는 유전자 편집 돼지(swine)를 생성하는데 성공하였다. 본 발명자에 의해 생산된 돼지(swine)는 건강하며, 부정적인 특성을 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들에 의해 수행된 실험은 돼지(swine)가 PRRSV 감염에 대해 저항성을 발휘하는 것을 나타낸다. 편집된 돼지(swine)에서 발현된 CD163은 또한 헤모글로빈-합토글로빈 스캐빈저로서 기능하는 능력의 보유를 입증한다.
본 발명의 첫번째 측면에 따르면, 유전자 편집 돼지(genetically edited swine)로서, 편집이 돼지(swine)에 의해 생산된 CD163 단백질로부터 SRCR5 도메인의 결실을 야기하는 편집된 게놈을 포함하는 돼지(swine)가 제공된다. 다시 말해서, 유전자 편집 돼지(swine)는 SRCR5(상황에 따라 도메인 5라고도 함)가 없는, 변형된 형태의 CD163 단백질을 생산한다.
바람직하게는 상기 돼지(swine)은 돼지(pig) (Sus scrofa), 가장 바람직하게는 가축 돼지(pig) (Sus scrofa domesticus 또는 Sus domesticus)이다.
적합하게 돼지(swine)는 편집이 동물에 의해 생산된 CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 편집되고, 모든 다른 CD163 도메인은 존재하며, 그의 아미노산 서열이 변경되지 않은, 편집된 게놈을 포함한다. 따라서, 돼지(swine)는 적합하게 SRCR5가 없으나, 막관통 분절(segment) 및 세포질 도메인인, SRCR 도메인 1 내지 4 및 6 내지 9는 변경되지 않은 CD163을 생산한다. 본 발명자들은 놀랍게도, SRCR5가 결실되어 있는 CD163 단백질이 헤모글로빈-합토글로빈 스캐빈저로서 그의 생리학적 기능을 보유할 수 있으나, 변형된 CD163 단백질을 가지는 세포에서 PRRSV에 의한 감염에 높은 수준의 저항성을 생성한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, 편집된 게놈으로부터 발현된 CD163 단백질은 바람직하게는 실질적으로 기능적인 것으로 남아있다. 이러한 문맥에서 '실질적으로 기능적인'은 SRCR5 도메인에 의존적이지 않은 생리학적 기능을 보유하는 단백질을 나타낸다. 적합하게 변형된 CD163 단백질은 헤모글로빈-합토글로빈 스캐빈저로서 기능할 수 있다는 점에서 실질적으로 기능적이다. 헤모글로빈-합토글로빈 스캐빈저로서 기능하는 CD163 단백질의 능력은 본원에서 설명된 방법론에 따라, 즉 편집된 돼지(swine) 유래 말초 혈액 단핵구-유래 대식세포가 헤모글로빈-합토글로빈을 스캐빈지하는 능력에 기반하여, 미리 평가될 수 있다. 헤모글로빈-합토글로빈 스캐빈저로서 기능하는 CD163 단백질의 능력은 CD163 단백질이 SRCR5 도메인의 결실에도 불구하고 바르게 폴딩되고 기능적이라는 것을 나타낸다.
CD163의 SRCR5는 다음 아미노산 서열을 가진다:
HRKPRLVGGDIPCSGRVEVQHGDTWGTVCDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSLLGGAHFGEGSGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPDGTCSHSRDVGVVCS (서열번호 2).
따라서, 편집된 돼지(swine)에 의해 생산된 변형된 CD163 단백질은 적합하게는 상술한 아미노산 서열, 즉, 서열번호 2가 결핍된다. 적합하게 편집된 돼지(swine)에 의해 생산된 CD163 단백질은 야생형 아미노산 서열에 대해 추가 변화를 가지지 않는다.
돼지(swine)는 바람직하게는 동물에 의해 생산된 CD163으로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 편집에 대해 동형접합성(homozygous) 또는 이중대립성(biallelic)이다. 이러한 문맥에서 '동형접합성'은 돼지(swine)가 두 염색체 상의 CD163 유전자 내 동일한 편집을 포함하는 것, 즉 그것이 두 염색체 상에 동일한 대립유전자를 가지는 것을 의미한다. 이러한 문맥에서 '이중대립성'은 돼지(swine)가 각각의 염색체에서 상이한 편집을 가지나, 두 편집 모두 CD163에 대해 바라직한 편집을 야기하는 것, 즉 동물에 의해 생산된 CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 것을 의미한다.
바람직하게는 동물의 모든 세포는 편집된 게놈을 포함한다. 그러나, 일부 경우에서, 동물은 편집된 게놈을 포함하는 일부 세포 및 편집된 게놈을 포함하지 않는 다른 세포와 함께, 모자이크 현상을 나타낼 수 있다. PRRSV는 대식세포를 감염시키고, 따라서 제공된 대식세포 및 그의 전구세포는 SRCR5를 포함하는 CD163을 발현시키지 않아, 동물은 PRRSV 감염에 대해 저항성이 있을 것이다.
돼지(swine)가 SRCR5를 포함하는 어떠한 CD163도 생산하지 않는 것, 즉 동물의 모든 세포가 돼지(swine)에 의해 생산된 CD163으로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 편집에 대해 동형접합성 또는 이중대립성인 것이 일반적으로 바람직하다.
본 발명의 유전자 편집 돼지(swine)가 본원에서 설명된 유전자 편집 방법론에 직접적으로 대상이 된 돼지(swine), 또는 편집된 게놈을 보유하는 이러한 돼지(swine)의 후손일 수 있다는 것은 당업자에게 있어서 명백할 것이다. 실제로, 유전자 편집 방법론의 대상이 된 돼지(swine)는 일부 경우에서 동형접합성일 것이고, 동형접합성 또는 이중대립성 후손에 도달하기 위해 사육될 것이다.
적합하게는 게놈은 SRCR5를 암호화하는 서열이 편집된 CD163 유전자로부터 생산된 mRNA(바람직하게는 성숙 mRNA)에서 없도록 편집된다. 이는 CD163 유전자로부터, CD163 단백질의 SRCR5 도메인을 암호화하는, 엑손 7을 결실시키는 편집에 의해, 또는 편집된 CD163 유전자 유래 전사물로부터 엑손 7에 의해 암호화되는 RNA 서열의 제거를 야기하는 편집에 의해, 예를 들어, mRNA의 형성 동안 스플라이싱의 결과로서, 달성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, CD163 유전자의 엑손 7은 결실된다. CD163 유전자의 엑손 7의 결실은 물론 암호화된 CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 엑손 7의 5'에 위치한 스플라이스 억셉터 부위(splice acceptor site)는 비활성화된다. 엑손 7의 5' 말단의 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화는 편집된 CD163 유전자로부터 생산된 mRNA 밖으로 엑손 7이 스플라이싱되어, 번역될 때 mRNA로부터 얻은 CD163 단백질로부터 SRCR5를 결실시키는 것을 야기한다.
돼지(swine)가 CD163 유전자의 엑손 7이 결실되어 있는 편집된 게놈을 포함하는 본 발명의 구현예에서, 이는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 결실은 엑손 7에 제한될 수 있거나, 결실은 엑손 7을 넘어서서 옆에 있는 인트론 영역(즉, 인트론 6 및 7)으로 연장될 수 있다. 전체 엑손 7이 결실되는 것이 전형적으로 바람직하다.
적합하게는 편집된 게놈은 엑손 7이 결실되도록 편집되나, CD163 영역의 다른 암호화 영역에 대한 변화는 없다. 특히, 편집되지 않은 게놈과 비교할 때 다른 CD163의 엑손이 변경되지 않는 것이 전형적으로 바람직하다. 따라서, 엑손 1 내지 6 및 8 내지 16은 바람직하게는 변경되지 않는다.
일부 구현예에서, 엑손 7 및 엑손 7 옆의 인트론 6 및 7 부분은 결실되나, CD163 유전자의 나머지 영역에는 다른 변경이 없다.
엑손 7은 서열번호 1을 참고하여 위치 23392에서 위치 23706까지 걸친다. 따라서 이러한 영역은 적합하게는 편집된 돼지(swine) 게놈에서 결실된다.
CD163 내 위치 또는 영역이 서열번호 1을 참고하여 본원에서 설명되는 반면, 상이한 개별 돼지(swine)(예, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs) 또는 다른 다형성이 발생한 것) 사이의 CD163의 서열에 변이가 있을 수 있고, 따라서 개별 돼지(swine)는 서열번호 1과 약간 상이한 CD163 서열을 포함할 수 있다는 것을 알아야만 한다. 서열번호 1을 참고하여 만들어진 위치 또는 영역의 언급은 엄격히 제한적인 것을 의미하지 않으나, 이러한 서열 변이를 가지는 돼지(swine)의 CD163 유전자 내 상응하는 위치를 대표하는 것으로 해석되어야만 한다. 당업자는 종래 서열 정렬 기술, 예, BLAST를 이용하여 서열 변이를 포함하는 CD63 유전자 내 상응하는 위치 또는 영역을 쉽게 확인할 수 있다.
적합하게는 편집된 게놈은 인트론 6 내 스플라이스 부위 도너(donor) 서열(즉, 엑손 6 및 인트론 6의 접합부에 위치) 및 인트론 7 내 스플라이스 부위 억셉터 부위(즉, 인트론 7 및 엑손 8의 접합부에 위치)가 변경되지 않고 기능적인 것으로 유지되도록 편집된다. 이는 편집된 CD163 유전자로부터 생산된 전사물의 올바른 스플라이싱을 촉진한다. 따라서, 본 발명의 구현예에서, 서열번호 1을 참고하여, 위치 10451에서 위치 10465, 및 위치 23783에서 위치 23824까지 연장되는 영역 내 서열은 변경되지 않는다.
적합하게는 게놈은 서열번호 1을 참고하여 위치 10466에서 23782까지 연장되는 CD163 유전자의 영역의 적어도 일부가 결실되도록 편집되고, 상기 부분은 엑손 7을 포함한다. 위치 10466은 예측된 인트론 6의 스플라이스 도너 부위의 3'(즉, 엑손 6의 3' 말단)에 즉시 놓인다. 위치 23782는 예측된 인트론 7의 스플라이스 억셉터 부위의 5'(즉, 엑손 8의 5' 말단)에 즉시 놓인다. 상기 영역은 물론 엑손 7을 포함한다면, 더 작을 수 있다.
적합하게는 게놈은 서열번호 1을 참고하여 위치 1에서 위치 10465까지 및 위치 23783 또는 23754에서 위치 32908까지의 영역이 변경되지 않도록 편집된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 엑손 7은 엑손 7의 5' 말단의 5'를 연장하는 5000개 염기, 적합하게는 2000개 염기, 적합하게는 1000개 염기, 적합하게는 500개 염기, 적합하게는 300개 염기 또는 적합하게는 100개 염기와 함께 결실된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 엑손 7은 엑손의 3' 말단의 3'를 연장하는 75개 염기와 함께 결실된다. 이러한 영역은 엑손 7의 3' 말단에서 엑손8의 5' 말단의 예측된 스플라이스 억셉터 부위까지 연장된다. 적합하게는 엑손 7은 엑손 7의 3' 말단의 3'을 연장하는 50개 염기와 함께 결실된다.
하나의 구현예에서, 편집된 게놈은 서열번호 1을 참고하여, 대략 위치 23060에서 대략 위치 23760까지, 예를 들어, 위치 23064 또는 23065에서 위치 23753 또는 23754까지, 적합하게는 20365 내지 위치 23753까지 연장되는 영역의 결실을 포함한다.
또 다른 하나의 구현예에서, 편집된 게놈은 서열번호 1을 참고하여, 대략 위치 23260에서 대략 위치 23760까지, 예를 들어, 위치 23267 또는 23268에서 위치 23753 또는 23754까지, 적합하게는 23268 내지 위치 23753까지 연장되는 영역의 결실을 포함한다.
또 다른 하나의 구현예에서, 편집된 게놈은 서열번호 1을 참고하여, 대략 위치 23370에서 대략 위치 23760까지, 예를 들어, 위치 23373 또는 23374에서 위치 237543 또는 23754까지, 적합하게는 23374 내지 위치 23753까지 연장되는 영역의 결실을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 편집된 게놈은 관련 위치에서 정상적으로 발견되지 않은 삽입 서열(즉, 이종접합 삽입 서열)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 엑손 7을 포함하는 CD163 유전자의 구역이 결실된 경우, 삽입 서열은 결실이 발생된 위치에 존재할 수 있다. 이러한 삽입은 유전자 편집을 통한 서열의 결실의 상대적으로 일반적인 인공물이다. 이러한 삽입은 본 문맥에서 전형적으로 중요하지 않고, 삽입 서열은 전형적으로 유전자로부터 생산된 전사물 밖으로 스플라이싱된다. 따라서, 삽입 서열은 전형적으로 어떠한 특별한 효과를 야기하지 않는다. 삽입 서열은 일반적으로 CD163 유전자 유래 서열 또는 임의의 동족체 또는 다른 관련 서열이 아니다. 이러한 이종접합 삽입 서열이 편집된 게놈에 존재하지 않는 것이 전형적으로 바람직하다.
하나의 특히 바람직한 구현예에서, 편집된 게놈은 위치 23268에서 위치 23753까지 연장되는 영역의 결실을 포함하고, 결실 위치에서 서열의 삽입은 없다. 이러한 구현예에서, 결실된 엑손 7의 전자의 유전자 자리의 돼지(swine)의 편집된 게놈은 다음 서열을 가진다
ATTGTCTCCAGGGAAGGACAGGGAGGTCTAGAATCGGCTAAGCCCAC||GTAGGGTTAGGTAGTCA - 서열번호 36(||는 영역을 삭제하는데 사용될 수 있는 두 개의 절단 부위의 인접을 나타낸다).
본 발명의 특정 구현예에서, 돼지(swine)는 CD163의, 즉 엑손 7의 5' 말단에 위치된, 인트론 6 내 스플라이스 억셉터 부위가 비활성화된 편집된 게놈을 포함한다. 상술한 바와 같이, 엑손 7의 5' 말단의 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화는 엑손 7이 편집된 CD163 유전자로부터 생산된 mRNA 밖으로 스플라이싱되어, mRNA로부터 번역된 CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기한다.
인트론 6 내 예측된 스플라이스 억셉터 부위는 서열번호 1을 참고하여, 위치 23378에서 23416까지 연장된다. 따라서, 이러한 서열은 스플라이스 억셉터 부위를 비활성화시키도록 적합하게 편집된다.
스플라이스 억셉터 부위는 부분적으로 또는 전체적으로 결실될 수 있고, 또는 더 이상 기능적이지 않도록 임의의 다른 적합한 방법으로 변경된 서열일 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 스플라이스 억셉터 부위는 결실된다. 또 다른 하나의 구현예에서, 서열은 그 비활성화를 야기하는 스플라이스 억셉터 부위로 삽입된다. 또 다른 하나의 구현예에서, 스플라이스 억셉터 부위는 비활성화되도록, 예를 들어, 상동직접수선(HDR) 매개 유전자 이입 사건을 통해, 변형된다.
하나의 구현예에서, 스플라이스 억셉터 부위의 서열은 그것이 제한효소 부위를 포함하도록 변경된다. 예를 들어, 변경된 서열은 NcoI 제한효소 부위를 포함하도록 변경될 수 있다. 그러나, 제공될 수 있는 아주 많은 수의 다른 제한효소 부위가 있다. 변경된 스플라이스 억셉터 부위에의 제한효소 부위의 도입의 이점은 성공적인 편집 사건의 발생에 대한 쉬운 분석을 가능하게 한다는 것이다.
하나의 구현예에서, 스플라이스 억셉터 부위는 AATGCTATTTTTCAGCCCACAGGAAACCCAGG(서열번호 3)에서 AATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGG(서열번호4)로 서열을 변경하도록 편집된다. 서열 변화는 소문자로 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 유전자 편집 돼지(swine)는 PRRSV 감염에 대한 향상된 내성 또는 저항성을 가진다. 적합하게는 동물은 PRRS 감염에 대해 저항성이 있다. CD163으로부터 SRCR5의 결실은 CD163 발현 세포, 특히 폐포대식세포(particularly pulmonary alveolar macrophages, PAMs) 및 말초 혈액 단핵구-유래 대식세포(peripheral blood monocyte-derived macrophages, PMMs)를 야기하여, PRRSV에 의한 감염에 대해 고도의 저항성을 가지게 하는 것으로 나타났다.
본 발명의 두번째 측면에 따르면, 유전자 편집 돼지(swine) 또는 배아가 제공되는데, 편집은 돼지(swine) 세포 또는 배아에 의해 생산된 CD163 단백질로부터 SRCR5 도메인의 결실을 야기한다. 이러한 문맥에서 "세포 또는 배아"는 체세포, 생식세포(germ cell), 줄기세포, 배우자(gamete), 접합자(zygote), 배반포, 배아, 태아 및/또는 도너 세포를 망라한다.
본 발명의 첫번째 측면에 관하여 논의된 다양한 특징들은 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 두번째 측면에 적용한다. 예를 들어, 돼지(swine)에 관하여 상기 논의된 다양한 편집의 본질은 편집 세포 또는 배아에 동등하게 적용된다.
본 발명의 세번째 측면에 따르면, 유전자 편집 돼지(swine)의 생산 방법으로서, 상기 방법은
a) 돼지(swine) 세포를 제공하는 단계;
b) CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 변형을 만들도록 세포의 게놈을 편집하는 단계; 및
c) 상기 세포로부터 동물을 생성시키는 단계:를 포함하는 방법이 제공된다.
CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 변형은 CD163 유전자로부터 엑손 7의 결실, 또는 CD163 유전자의 엑손 7과 연관된 스플라이스 억셉터 부위, 즉 엑손 7의 5' 말단에 위치한 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화일 수 있다.
단계 a)에서, 돼지(swine) 세포는 임의의 적합한 세포일 수 있다. 적합하게는 돼지(swine) 세포는 체세포, 배우자, 생식세포, 배우자모세포(gametocyte), 줄기세포(예, 전능줄기세포(totipotent stem cell) 또는 만능줄기세포(pluripotent stem cell)) 또는 접합자일 수 있다.
바람직하게는 방법은 접합자 상에서 수행된다. 용어 "접합자"는 배우자의 융합에 의해 형성된 단일 세포를 말하는 것으로 엄밀한 의미로 사용될 수 있다. 그러나, 본 문맥에서 진정한 접합자의 첫번째 몇몇 분열에 의해 야기된 세포 다발(bundle)을 말하는 것으로 더욱 넓게 사용될 수도 있다 - 이는 상실배(morula)로 더욱 적절히 알려져 있다.
본 방법은 단일 세포 단계의 접합자에서, 적어도 개시되고, 바람직하게는 완료된다. 이는 동일한 편집을 포함하는 돼지(swine)의 모든 세포를 야기하여야만 한다. 그러나, 접합자는 편집 과정이 발생하는 동안 분열할 수 있다는 것이 가능하다. 편집 과정의 단계와 관련하여 세포 분열이 일어나는 때에 따라, 다음 중 하나가 발생하는 것이 가능하다:
- 모든 세포는, 분열이 일어나기 전에 편집된 단일 세포에서 유래되므로, 동일한 편집을 포함할 것이다(편집은 세포에서 하나의 대립유전자 또는 두 대립유전자에 대한 것일 수 있고, 일부 경우에서 각각의 대립유전자는 동일한 편집된 서열을 가질 수 있으며, 다른 경우에서, 그들은 상이한 편집된 서열, 즉 이중대립성 편집 사건이 발생될 수 있다);
- 동일한 편집 사건이 분열이 발생한 후에 딸세포에서 발생되므로, 모든 세포는 동일한 편집을 포함할 것이다;
- 세포가 편집 사건 발생 전에 분열되고 오로지 하나의 딸세포가 편집되므로, 편집 사건이 있거나 없는 세포의 모자이크가 만들어진다; 그리고
- 세포가 분열되고 상이한 편집 사건이 딸세포에서 발생되므로, 상이한 편집을 갖는 세포의 모자이크가 만들어진다.
편집은 또한 첫번째 세포 분열 후에 수행될 수 있고, 결과물은 흥미로울 수 있다. 그러나, 이는 일반적으로 바람직한 결과가 비-모자이크 동물인 경우 덜 바람직하다.
단계 b)는 적합하게는
- CD163 유전자 내 적합한 표적 서열을 표적화하는 부위-특이적 뉴클레아제를 세포에 도입하는 단계;
- 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 또는 주위의 DNA에 작용하기 위한 적합한 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
- 그에 따라 CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 CD163 유전자 내 편집 사건을 유도하는 단계:를 포함한다.
CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 편집 사건은 CD163 유전자로부터 엑손 7의 결실, 또는 엑손 7과 연관된, 즉 엑손 7의 5' 말단에 위치한, 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화일 수 있다.
특정 구현예에서, 단계 b)는 적합하게는 엑손 7의 양측에 이중가닥 DNA 절단을 유도하여, 그 결실을 야기하기 위하여, CD163 유전자의 엑손 7 옆의 표적 부위를 표적화하는 세포에 부위-특이적 뉴클레아제를 도입하는 것을 포함한다. 표적 부위는 인트론 6 및 7 내가 적합하다. 표적 부위가 인트론 6 내일 때, 절단 부위는 바람직하게는 엑손 6의 3' 말단의 스플라이스 도너 부위의 3'이다. 표적 부위가 인트론 7 내일 때, 절단 부위는 바람직하게는 엑손 8의 5'의 스플라이스 억셉터 부위의 5'이다.
특정 구현예에서, 단계 b)는 적합하게는 세포에 CD163의 엑손 7의 표적 부위 상류(upstream)를 표적화하는 상류 부위-특이적 뉴클레아제를 도입하는 단계, 및 세포에 CD163의 엑손 7의 표적 부위 하류(downstream)를 표적화하는 하류 부위-특이적 뉴클레아제를 도입하는 단계를 포함한다.
이러한 문맥에서 '상류'는 CD163 유전자의 엑손 7의 5' 말단의 상류에 위치한 부위를 말한다. 바람직하게는 상류 표적 부위는 엑손 7의 5' 말단과 엑손 6의 3' 말단에 위치한 스플라이스 도너 부위 사이의 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 상류 표적 부위는 엑손 7의 5' 말단의 상류 2000개 염기(적합하게는 1000개 염기, 500개 염기, 300개 염기, 200개 염기 또는 100개 염기) 내에 위치한다. 부위-특이적 뉴클레아제의 절단 부위는 전형적으로 그의 표적 부위 내이거나 매우 가깝고, 따라서 부위-특이적 뉴클레아제는 엑손 7의 5' 말단의 상류 2000, 1000, 500, 300, 200 또는 100 개 염기 내 DNA 절단을 유도한다. 부위-특이적 뉴클레아제의 절단 부위는 적합하게는 엑손 7의 5' 말단과 엑손 6의 3' 말단에 위치한 스플라이스 도너 부위 사이의 영역 내에 있다.
당업자는 알려진 부위-특이적 뉴클레아제(CRISPR/Cas9 또는 다른 CRIPR 뉴클레아제, TALENs 또는 ZFNs와 같은)를 상기 논의한 영역에 위치한 임의의 바람직한 표적에 쉽게 표적화할 수 있다. CRISPR/Cas9 또는 다른 CRIPR 뉴클레아제의 경우, 상기 방법은 적합하게는 바람직한 표적 부위에 Cas9 단백질을 향하도록 가이드 RNA를 제공하는 단계를 포함한다. TALEN 또는 ZFN의 경우, 그것은 부위-특이적 뉴클레아제의 결합 부위를 결정하는 부위-특이적 뉴클레아제의 단백질 코드이다.
부위-특이적 뉴클레아제가 CRISPR/Cas9인 경우에 사용될 수 있는, 예시적인 상류 표적 부위를, 연관된 절단 위치 및 sgRNA와 함께 하기에 제공한다(절단 위치는 "|" 기호로 나타냄):
- sgRNA(sgSL25) TGAAAAATAGCATTTCGGTG (서열번호 5), CD163 유전자 표적 부위 및 절단 위치: CAC|CGAAATGCTATTTTTCA (서열번호 6)
- sgRNA(sgSL26) GAATCGGCTAAGCCCACTGT (서열번호 7), CD163 유전자 표적 부위 및 절단 위치: GAATCGGCTAAGCCCAC|TGT (서열번호 8)
- sgRNA(sgSL27) GTCCTCCATTTACTGTAATC (서열번호 9), CD163 유전자 표적 부위 및 절단 위치: GAT|TACAGTAAATGGAGGAC (서열번호 10).
이러한 문맥에서, '하류'는 CD163 유전자의 엑손 7의 3' 말단에 또는 주위에 위치한 부위를 말한다. 전형적으로, 하류 부위는 인트론 7 내에 위치한다. 바람직하게는 하류 표적 부위는 엑손 7의 3' 말단과 엑손 8의 5' 말단에 위치한 스플라이스 억셉터 부위 사이의 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 하류 표적 부위는 엑손 7의 3' 말단의 3' 75개 염기 또는 50개 염기 내에 위치한다. 부위-특이적 뉴클레아제의 절단 부위는 다라서 적합하게는 이렇게 정의된 영역 내에 있어, 절단은 엑손 7의 3' 말단의 3' 및 엑손 8의 5' 말단에 위치한 스플라이스 억셉터 부위의 5' 말단의 3'에서 발생되고, 예를 들어, 부위-특이적 뉴클레아제의 절단 부위는 전형적으로 엑손 8의 5' 말단에 위치한 스플라이스 억셉터 부위의 5'이다.
부위-특이적 뉴클레아제가 CRISPR/Cas9인 경우에 사용될 수 있는 예시적인 하류 표적 부위를 연관 절단 위치 및 sgRNA 서열과 함께 하기에 제공한다(절단 위치는 "|" 기호로 나타냄):
- sgRNA(sgSL28) CCCATGCCATGAAGAGGGTA (서열번호 11), CD163 유전자 표적 부위 및 절단 위치: CCCATGCCATGAAGAGG|GTA (서열번호 11).
특정 구현예에서, 단계 b)는 적합하게는 엑손 7과 연관된, 즉 엑손 7의 5' 말단에 위치한, 스플라이스 억셉터 부위를 표적화하는 부위-특이적 뉴클레아제를 도입하는 단계를 포함한다.
적합하게는 부위-특이적 뉴클레아제는 엑손 7과 연관된 스플라이스 억셉터 부위 내에 또는 주위에 이중 가닥 절단을 유도한다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 뉴클레아제는 서열번호 1을 참고하여, 위치 23378로부터 위치 23416까지 연장되는 영역 내, 또는 5' 또는 3' 방향으로 상기 영역의 200, 100, 50 또는 25 개 염기 내 위치에서, 절단을 유도한다. 다시 말해서, 부위-특이적 뉴클레아제는 엑손 7과 연관된 예측된 스플라이스 억셉터 부위 또는 옆의 영역에 이중가닥 절단을 유도한다.
당업자는 알려진 부위-특이적 뉴클레아제(CRISPR/Cas9 또는 다른 CRIPR 뉴클레아제, TALENs 또는 ZFNs와 같은)를 상기 논의한 영역에 위치한 임의의 바람직한 표적에 쉽게 표적화할 수 있다. CRISPR/Cas9 또는 다른 CRIPR 뉴클레아제의 경우, 상기 방법은 적합하게는 바람직한 표적 부위에 Cas9 단백질을 향하도록 가이드 RNA를 제공하는 단계를 포함한다. TALEN 또는 ZFN의 경우, 그것은 부위-특이적 뉴클레아제의 결합 부위를 결정하는 부위-특이적 뉴클레아제의 단백질 코드이다.
CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집의 경우, 엑손 7과 연관된 스플라이스 억셉터 부위를 표적화하기에 적합한 가이드 RNA 서열은 다음과 같다:
sgRNA 1: AACCAGCCTGGGTTTCCTGT (서열번호 12)
sgRNA 2: CAACCAGCCTGGGTTTCCTG (서열번호 13)
이러한 두 가지 가이드 서열은 Cas9에 의해 엑손 7의 5' 말단의 다음 서열에서 이중가닥 절단 부위의 유도를 야기한다(절단 위치는 "|" 기호로 나타냄):
ACA|GGAAACCCAGGCTGGTT (서열번호 14) - sgRNA 1 사용
CAG|GAAACCCAGGCTGGTTG (서열번호 15) - sgRNA 2 사용
부위-특이적 뉴클레아제는 적합하게는 바람직한 절단 부위에서 단일의 이중가닥 절단을 만든다. 그러한 경우, 엑손 7과 연관된 스플라이스 억셉터 부위는 비-상동 말단 부착(non-homologous end joining, NHEJ) 또는 상동 직접 수선(homology directed repair, HDR)에 의해 비활성화될 수 있다. HDR이 의도된 비활성화 방법인 경우, HDR 주형이 제공된다. 당업계에 알려져 있는 것과 같이, HDR 주형은 정상적으로 발생한 서열을 대체하도록 의도된 서열을 함유하는 중앙 부분, 및 정상 서열에 동형접합인 측면 부분을 포함한다. 따라서 HDR 주형은 적합하게는 HDR에 의해 CD163 유전자에 도입될 때 스플라이스 억셉터 부위를 비활성화시키는 서열을 가지는 중앙 부분을 포함한다.
예시적인, 제한적이지 않은, HDR 주형은 다음 서열을 가진다:
GAAGGAAAATATTGGAATCATATTCTCCCTCACCGAAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGGGACATTCCCTGCTCTGGTC (서열번호 16) (소문자는 변경되지 않은 서열과 비교하여 만들어진 변화를 나타냄).
상기 정리된 예시적인 표적 부위는 CRISPR/Cas9 부위 특이적 뉴클레아제에 관련된 반면, 당업자에게 있어서 많은 다른 표적 부위가 사용될 수 있고, 또한 다른 부위 특이적 뉴클레아제(이러한 문맥에서 '편집자(editor)' 또는 '유전자 편집자'로 종종 불림)가 사용될 수 있다는 것은 즉시 명백할 것이다. 대안적인 부위 특이적 뉴클레아제에 대해 적합한 표적 부위는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 부위-특이적 뉴클레아제는 적어도 하나의 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease, ZFN), 전사 활성화 인자-유사 효과기 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN), RNA-가이드 CRISPR 뉴클레아제(RNA-guided CRISPR nuclease) (예, CRISPR/Cpf와 같은 CRISPR/Cas9 또는 다른 CRISPR 뉴클레아제), 또는 메가뉴클레아제를 포함한다.
부위-특이적 뉴클레아제는 전형적으로 게놈 DNA 내 이중가닥 절단(break)을 일으킬 수 있다. 이는 제한되는 것은 아니나, CRISPR/Cas 또는 다른 CRISPR 뉴클레아제, ZFN 및 TALEN을 포함하는, 많은 부위-특이적 뉴클레아제로 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 뉴클레아제는 한 쌍의 협력하는 부위-특이적 뉴클레아제를 포함하는데, 각각은 단일 가닥 절단을 생성할 수 있다. 적합하게는 부위-특이적 뉴클레아제는 한 쌍의 협력하는 ZFN, TALEN 또는 CRISPR '닉카아제(nickase)' (예, 오로지 하나의 DNA 가닥을 절단할 수 있는 변형된 Cas9 또는 다른 뉴클레아제를 가짐)을 포함하는데, 이는 게놈 DNA 내 이중가닥 절단을 생성하기 위해 협력한다. 이러한 구현예에서, 표적 부위는 적합하게는 각각의 절반 부위에 결합하는 쌍 중 하나와 함께, 한 쌍의 절반 부위를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 부위-특이적 뉴클레아제는 쌍의 두 구성원이 존재하고 DNA 분자의 두 가닥 모두를 절단할 수 있는 헤테로다이머를 형성할 때에만 이중 가닥 DNA 절단을 야기할 수 있는, 한 쌍의 ZFN, TALEN 또는 RNA-가이드 CRISPR '닉카아제' (예, 오로지 하나의 DNA 가닥을 절단할 수 있는 변형된 Cas9 또는 다른 뉴클레아제를 가짐)을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 부위-특이적 뉴클레아제는 한 쌍의 ZFN을 포함한다. 수 쌍의 상응하는 부위-특이적 뉴클레아제의 사용은 표적을 벗어난(off-target) 절단을 감소시키는데 이점을 가질 수 있다.
부위-특이적 뉴클레아제는 임의의 적합한 형태로 세포에 도입될 수 있다는 점을 알아야 한다. 예를 들어, 뉴클레아제는 기능성 단백질로서 세포에 직접적으로 제공될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레아제는 활성 뉴클레아제가 세포에 의해 생산되는 전구체 또는 주형의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA는 세포에, 예를 들어, 주입에 의해 도입된다. 그 때 mRNA는 기능하는 단백질을 형성하기 위해 세포에 의해 발현된다. 이러한 방법으로의 mRNA의 사용은 세포 내 뉴클레아제의 신속하지만 일시적인 발현을 허용하는데, 이는 유전자 편집의 목적에 있어서 이상적이다. RNA가 부위-특이적 뉴클레아제를 표적화하기 위해 사용되는 경우, 이는 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다.
용어 '뉴클레아제'는 표적 핵산의 단일 또는 이중 가닥 절단을 만들어내는 임의의 생물학적 효소를 포괄하도록 의도된다는 것을 알아야만 한다. 따라서, 상기 용어는 닉카아제 및 재조합효소, 뿐만 아니라 단일 또는 이중 가닥 절단을 야기하는 더 많은 종래의 뉴클레아제를 포함한다.
ZFN 기술은 문헌에, 그 중에서도, 다음의 특허 문헌: US 6,479,626, 6,534,261, 6,607,882, 6,746,838, 6,794,136, 6,824,978, 6,866,997, 6,933,113, 6,979,539, 7,013,219, 7,030,215, 7,220,719, 7,241,573, 7,241,574, 7,585,849, 7,595,376, 6,903,185, 6,479,626, 8,106,255, 20030232410, 및 20090203140에 광범위하게 설명되어 있는데, 이들 모두는 참조로서 포함된다. ZFN은 CompoZr® Zinc Finger Nuclease Technology 브랜드 상품 및 서비스로 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, US)로부터 상업적으로 얻을 수 있다.
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CRISPR/Cas 기술은 문헌(예, Cong et al. 'Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems', Science, 15 February 2013: Vol. 339 no. 6121 pp. 819-823)에, 그 중에서도, 다음 특허 문헌: US 8,697,359, US2010076057, WO2013/176772, US8,771,945, US2010076057, US2014186843, US2014179770, US2014179006, WO2014093712, WO2014093701, WO2014093635, WO2014093694, WO2014093655, WO2014093709, WO2013/188638, WO2013/142578, WO2013/141680, WO2013/188522, US8546553, WO2014/089290, 및 WO2014/093479에 광범위하게 설명되어 있는데, 이들 모두는 참조로서 포함된다. CRISPR/Cas9 시스템은 CRISPR/Cas Nuclease RNA-guided Genome Editing 수트의 상품 및 서비스로 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, US)로부터, 또는 GeneArt® CRISPR 브랜드 상품 및 서비스로 Thermo Fisher Scientific, Inc.(Waltham, MA, US)로부터 상업적으로 얻을 수 있다. CRISPR/Cpf는 또한 문헌에 광범위하게 설명되어 있다.
물론, 이렇게 신속하게 발달하는 분야에서, 유전자 편집에 대한 다른 기술들이 사용가능할 수 있다. 이러한 기술들은 많은 경우 본 발명에 사용을 위해 쉽게 적용될 수 있다.
단계 c)와 관련하여, 유전자 변경을 포함하는 세포로부터 동물을 생산하는데 사용될 수 있는 당업계에 알려진 다양한 기술이 있다. 이러한 기술들은 제한 없이, 전핵미세주입(U.S. Patent No. 4,873,191) 또는 배아의 전기천공법(Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814), 정자-매개 유전자 이동(Lavitrano et al. 25 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 14230-14235; Lavitrano et al. (2006) Reprod. Fert. Develop. 18, 19-23), 및 난구세포 또는 유방세포와 같은 체세포, 또는 성체, 태아 또는 배아 줄기세포의 시험관내 형질전환 및 뒤이은 핵 이식(Wilmut et al. (1997) Nature 385, 810-813; and Wakayama et al. (1998) Nature 394, 369-374)을 포함한다. 표준 사육 기술이 초기 이형접합 시조(founder) 동물로부터 바람직한 유전자 편집에 대해 동형접합성 또는 이중대립성인 동물을 만드는데 사용될 수 있다. 특정한 설명은 편집된 접합자로부터 동물을 생성하는 예시적이나, 제한적이지 않은 방법의 세부사항을 제공한다. 본 발명은 단계 b)에서 생산된 편집된 세포로부터 동물을 생성하는 임의의 특정한 방법으로 제한되지 않는다.
상기 방법의 단계 c)는 선택적으로 클로닝, 예를 들어, 체세포 핵 치환(somatic cell nuclear transfer, SCNT)에 관련될 수 있다. 이러한 구현예에서, 유전자 편집 사건은 편집된 핵이 제핵 난자로 이동된 후, 체세포 상에서 수행된다. 전형적으로, 한 집단의 체세포가 편집될 수 있고, 바람직한 편집 사건이 발생된 세포가 SCNT를 위한 도너 핵을 제공하기 위해 사용될 것이다. 그러나, 편집이 클로닝할 필요 없이 수행될 수 있다는 것이 본 발명의 장점이다.
상기 방법은 적합하게는 후손 돼지(swine)를 얻기 위해 유전자 편집 세포로부터 생산된 돼지(swine)를 또 다른 하나의 돼지(swine)와 교배시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는 후손 돼지(swine)는 동물에 의해 생산된 CD163으로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 편집에 대해 동형접합성 또는 이중대립성이다. 이는 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 두 이형접합 돼지(swine)를 교배시켜, 달성될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 방법은 적합하게는 단계 c)에서 생산된 돼지(swine)(동물에 의해 생산된 CD163으로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 편집에 대해 이형접합성일 수 있음)를 동물에 의해 생산된 CD163으로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 편집에 대해 이형접합성인 또 다른 하나의 돼지(swine)와 교배시키는 단계 d)를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은
- 돼지(swine) 접합자를 제공하는 단계;
- CD163 유전자 내 적합한 표적 서열을 표적화하는 부위-특이적 뉴클레아제를 접합자에 도입시키는 단계;
- 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 또는 주위의 DNA에 작용하기에 적합한 조건 하에서 상기 접합자를 배양시켜, CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 CD163 유전자 내 편집 사건을 유도하는 단계; 및
- 상기 유전자 편집 접합자로부터 동물을 생성시키는 단계:를 포함한다.
유전자 편집 접합자는 배아 및 결국 성체 동물이 되도록 성장될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 편집 사건이 단일세포 접합자에서 발생되면, 그러므로 동물의 모든 세포가 단일의 유전자 편집 세포로부터 유래되므로, 그 때 이러한 동물의 모든 세포가 변형된 CD163 유전자를 포함할 것이다. 편집 사건이 하나 이상의 세포 분열 후에 발생되면, 결과 발생된 동물은 편집 사건에 대한 모자이크가 되기 쉬울 것이고, 즉 그것은 편집된 세포 유래 몇몇 세포 및 편집되지 않은 세포 유래 몇몇 세포를 가질 것이다.
상기 방법은 발생된 유전자 편집 사건을 특징짓는 것과 연관될 수 있다. 이를 달성하기에 적합한 방법들은 하기에 정리한다.
상기 방법은 다수의 접합자 상에서 수행될 수 있고, 상기 방법은 바람직한 유전자 변형이 달성된 접합자를 선택하는 것에 연관될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 방법에 따라 생산된 돼지(swine)는 동물에 의해 생산된 CD163으로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 편집에 대해 동형접합성 또는 이중대립성이다. 이는 단계 b)의 편집 과정의 결과로서, 또는 두마리 이형접합 돼지(swine) 사이의 뒤이은 교배 단계에 의해 직접적으로 달성될 수 있다.
본 발명의 네번째 측면에 따르면, 유전자 편집 돼지(swine) 세포 또는 배아를 생산하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은
- 돼지(swine) 세포 또는 배아를 제공하는 단계;
- CD163의 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 편집을 만들어내도록 세포의 게놈 또는 배아 내 세포들을 편집하는 단계:를 포함한다.
본 발명의 세번째 측면에 관련하여 논의된 다양한 특징들은 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 네번째 측면에 적용된다.
본 발명의 다섯번째 측면에 따르면, 본 발명의 세번째 또는 네번째 측면에 따라 생산된 동물, 세포 또는 배아가 제공된다.
본 발명의 여섯번째 측면에 따르면, CD163 단백질의 SRCR5 도메인의 결실을 야기하는 변형을 만들어내도록 돼지(swine) 내 세포의 게놈을 편집하는 단계를 포함하는, PRRSV에 대한 그 저항성 또는 내성을 증가시키기 위해 돼지(swine)를 변형시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 일곱번째 측면에 따르면, SRCR5 도메인이 결실되어 있는 CD163 단백질을 발현시키거나 가지는 돼지(swine) 또는 돼지(swine)의 세포가 제공된다. 세포는 적합하게는 대식세포일 수 있고, 일부 경우에서, 말초 혈액 단핵구-유래 대식세포(PMM) 또는 폐포대식세포(PAM)일 수 있다.
본 발명의 구현예들은 첨부된 도면을 참조하여, 제한적이지 않은 예로서, 지금 설명될 것이다.
도 1: CRISPR/Cas9을 이용한 CD163 내 엑손 7 결실의 생성. A) 염색체 5 상의 돼지(pig) 게놈 내 CD163 유전자의 도식. 적색으로 나타낸 것은 CD163 mRNA를 암호화하는 16 엑손이고, 아래 다양한 색으로 나타낸 것은 CD163 단백질의 "끈 위의 진주(pearl on a string)" 구조를 형성하는 9개의 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(SRCR) 도메인이다. 옆의 인트론에 위치한 두 개의 가이드 RNA(sgSL26 & sgSL28)을 이용한 엑손 7의 절제는 암호화된 단백질로부터 SRCR5 제거를 야기하여야만 한다. 또한 sgRNA SL25 및 SL27의 위치를 나타낸다. B) 가이드 RNA sgSL25, sgSL26, sgSL27, 및 sgSL28의 시험관내 평가. PK15 세포를 가이드 RNA + Cas9을 암호화하는 단일 플라스미드로 형질감염시키거나 또는 두 개의 이러한 플라스미드의 조합으로 공동-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 GFP 발현으로 확인하고 FACS로 분리하였다. 단일 가이드 RNA 형질감염의 절단 효율성을 Cel1 측량 분석으로 평가하였다. 이중 형질감염에 대한 엑손 7 결실의 상대적인 효율성을 PCR로 평가하였다. C) Cas9/가이드 RNA의 접합자에의 주입의 도식. 주입 혼합물은 접합자의 세포질에 주입되고, 캡핑되지 않은, 비-폴리아데닐화 가이드 RNA sgSL26 및 sgSL28, 뿐만 아니라 캡핑된, 폴리아데닐화 Cas9 mRNA를 포함하였다.
도 2: 돼지(pig) 내 SRCR5 CD163 결실을 야기하는 엑손 7의 절제. A) 5 개월령의 세 가지 상이한 △SRCR5 유전자형을 가진 수컷 형제 돼지(pig)의 대표적인 사진. 왼쪽은 야생형 돼지(pig) 628, 중간은 이형접합성 돼지(pig) 627, 오른쪽은 이중대립성 돼지(pig) 629이다. B) 폐포대식세포(PAM)의 지노타이핑. DNA를 PAM으로부터 추출하고, 유전자형을 인트론 6 내지 엑손 8에 걸쳐 PCR에 의해 평가하였다. 변형되지 않은 게놈 PCR은 엑손 7 결실이 450bp PCR 산물을 발생시켜야만 할 때, 900bp 산물을 발생시킨다고 예측된다. C) 폐포대식세포의 RNA 표현형. RNA는 PAM으로부터 추출하고, 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA로 전환시키고, 엑손 4-9에 걸쳐 PCR에 의해 분석하였다. 변형되지 않은 cDNA는 엑손 7 결실이 1371 bp 산물을 만들 것이라고 예측될 때, 1686 bp 산물을 발생시켜야만 한다. D) PAM 유래 CD163의 단백질 표현형. PAM 세포를 SDS 샘플 버퍼를 감소시켜 용해시키고, CD163 발현을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. E) PAM 내 CD163 mRNA 수준. RNA를 동일한 수의 PAM 세포로부터 추출하고, DNA를 DNase 처리로 제거하고, RNA를 1-단계 RT-qPCR로 정량화하였다. 발현 수준을 β-액틴 발현 수준을 이용하여 가장 높은 CD163 발현 동물에 대해 정상화하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다, n=3*2.
도 3: △SRCR5 폐포대식세포(PAM)는 완전히 분화되고 대식세포-특이적 마커를 발현시킨다. 기관지 폐포에 의해 분리된 PAM을 다양한 대식세포 마커로의 염색 및 FACS 분석에 의해 평가하였다. 동형 제어 염색(왼쪽 피크)에 상대적인 표면 발현된 CD163의 원래의 구조에 대한 염색(오른쪽 피크).
도 4: △SRCR5 폐포대식세포(PAM)는 PRRSV 유전자형 1 감염에 민감하지 않다. A-C) 야생형(wt, 왼쪽 두 컬럼), 이형접합(het, 중간 두 컬럼) 및 △SRCR5(이중대립성 또는 동형접합성 SRCR5 결실) (오른쪽 두 컬럼) 동물 유래 PAM을 PRRSV 유전자형 1, 서브타입 1(균주 H2, A), 서브타입 2(균주 DAI, B) 및 서브타입 3(균주 SU1-Bel, C)의 MOI(감염다중도) = 1에서 접종하였다. 감염 19시간 후(hpi) 세포를 떼어놓고, 고정시키고, 항 PRRSV-N 단백질 항체 및 CD163으로 염색하였다. FACS 분석으로 감염을 정량화하였다. 감염된 대식세포 98% 이상을 CD163 양성으로 보았다. 감염 수준을 모든 het 또는 모든 bia/hom에 대한 모든 wt의 비쌍체 t-검정(unpaired t-test)를 이용하여 통계적으로 분석하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다, n=3. D-F) PRRSV 유전자형 1, 서브타입 1(균주 H2, C), 서브타입(균주 DAI, D) 및 서브타입 3(균주 SU1-Bel, F)의 복제 성장 곡선. 야생형(628 채워진 원, 633 열린 원), 이형접합성(627 채워진 사각형, 633 열린 사각형) 및 △SRCR5(629 아래로 향하는 삼각형, 630 위로 향하는 삼각형) 유래 PAM은 각 균주의 MOI=0.1에서 접종하였다. 세포 상층액을 지시된 시점에 수득하여 RT-qPCR에 의해 방출된 바이러스성 RNA를 측정하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다, n=3*2. G-J) TCID50 분석에 의해 48hpi에서 생산된 감염성 입자의 정량화. 시간 경로 실험의 감염의 48hpi 시점에서 수득한 세포 상층액을 50% 조직 배양 감염량(TCID50)에 의해 정량화된 감염성 바이러스성 입자 생산에 대해 분석하였다. 감염 수준을 모든 het 또는 모든 △SRCR5에 대한 모든 wt의 비쌍체 t-검정을 이용하여 통계적으로 분석하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다, n=3. 컬럼은 창(pane) A-C와 동일하다.
도 5: △SRCR5 말초혈액 단핵구-유래 대식세포(PMM)는 완전히 분화되고 대식세포-특이적 마커를 발현시킨다. 말초혈액 단핵구를 야생형, 이형접합성 및 △SRCR5 동물의 혈액으로부터 분리하였다. 7일 간의 재조합 인간 콜로니 자극 인자 1(Recombinant human Colony Stimulating Factor 1, rhCSF1)의 존재 시 배양에 뒤이어, PMM을 FACS로 분석하였다. A) 동형(isotype) 대조군(동형 대조군은 각 그래프의 하부 왼쪽 등고선(contour plot)으로 나타내고, 대식세포-특이적 마커는 상부 오른쪽 등고선임)과 관련된 원래 구조의 단백질(등고선; 628 및 633 = 야생형, 627 및 364 = 이형접합성, 629 및 630 = △SRCR5)을 인식하는 CD14-FITC 및 CD16-PE 항체로 공동-염색. B) 동형 대조군(하부 왼쪽)과 관련된 원래 구조의 단백질(상부 오른쪽 등고선)을 인식하는 CD169-FITC 및 CD172a-PE 항체로 공동-염색. C) 동형 대조군(하부 왼쪽)과 관련된 원래 구조의 단백질(상부 오른쪽 등고선)을 인식하는 SWC9(CD203a)-FITC 및 CD151-RPE 항체로 공동-염색. D) 동형 대조군 염색(왼쪽 도표)과 관련된 원래 구조의 표면 발현된 CD163(오른쪽 도표)에 대한 염색.
도 6: △SRCR5 말초혈액 단핵구-유래 대식세포(PMM)는 여전히 헤모글로빈-합토글로빈(Hb-Hp) 스캐빈저로서 기능한다. A) Hb-Hp 흡수에 의한 헴 옥시게나제 1(HO-1)의 유도. PMM을 100 μg/ml Hb-Hp의 존재하에서 24시간 동안 배양시켰다. RNA를 세포로부터 분리시키고 헴 옥시게나제 1(HO-1) mRNA의 수준을 RT-qPCR로 확인하였다(윤곽 막대가 유도되지 않은, 채워진 막대가 유도된 Hb-Hp 흡수; 왼쪽 두 컬럼 = 야생형, 중간 두 컬럼 = 이형접합성, 오른쪽 두 컬럼 = △SRCR5). 발현 수준을 β-액틴 발현 수준을 이용하여 각 동물의 자극되지 않은 HO-1 mRNA 발현 수준까지 정상화하였다. 유도되지 않은 것 대비 유도된 HO-1 발현 수준을 비쌍체 t-검정에 의해 분석하였다. 오차 막대는 SEM, n=3을 나타낸다. B) PMM을 100 μg/mol Hb-Hp 존재하에서 24시간 동안 배양하였다. PMM을 SDS 샘플 버퍼를 감소시켜 용해시키고, HO-1 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. C) Hb-Hp 흡수의 정량화. PMM을 10 μg/ml HbAF488-Hp의 존재하에서 30분(min) 동안 배양시켰다. HbAF488-Hp의 흡수를 FACS 분석(오른쪽 피크)으로, 동형 대조군(왼쪽 피크)에 관련하여, 측정하였다. Hb-Hp 흡수를 또한 가시화하였다. PMM을 10 μg/ml HbAF488-Hp로 30분 동안 배양시켰다. 세포를 고정시키고, 투과시키고, CD163 및 DAPI로 염색하였다(데이터는 나타내지 않음).
도 7: △SRCR5 말초혈액 단핵구-유래 대식세포(PMM)는 PRRSV 유전자형 1 감염에 민감하지 않다. A-C) 야생형(왼쪽 두 컬럼), 이형접합(중간 두 컬럼) 및 △SRCR5(오른쪽 두 컬럼) 동물 유래 PAM을 PRRSV 유전자형 1, 서브타입 1(균주 H2, A), 서브타입 2(균주 DAI, B) 및 서브타입 3(균주 SU1-Bel, C)의 MOI(감염다중도) = 1에서 접종하였다. 19 hpi 세포를 떼어놓고, 고정시키고, 항 PRRSV-N 단백질 항체 및 CD163으로 염색하였다. FACS 분석으로 감염을 정량화하였다. 감염 수준을 모든 het 또는 모든 △SRCR5에 대한 모든 wt의 비쌍체 t-검정를 이용하여 통계적으로 분석하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다, n=3. D-F) 유전자형 1, 서브타입 1(균주 H2, D), 서브타입 2(균주 DAI, E) 및 서브타입 3(균주 SU1-Bel, F)에 장기 감염에서 PMM에 대한 PRRSV의 복제. 야생형(628 채워진 원, 633 열린 원), 이형접합성(627 채워진 사각형, 633 열린 사각형) 및 △SRCR5(629 아래로 향하는 삼각형, 630 위로 향하는 삼각형) 동물 유래 PMM을 각 균주의 MOI=0.1에서 접종하였다. 세포 상층액을 지시된 시점에 수득하여 RT-qPCR에 의해 방출된 바이러스성 RNA를 측정하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다, n=3*2.
도 8: △SRCR5 폐포대식세포(PAM)의 PRRSV 감염은 복제/전사 복합체의 형성 이전에 중단된다. 야생형(상단 패널), 이형접합성(중간 패널) 및 △SRCR5(하단 패널) 동물 유래 PAM을 PRRSV 유전자형 1, 서브타입 1(균주 H2, 상단 줄), 서브타입 2(균주 DAI, 중간 줄) 및 서브타입 3(균주 SU1-Bel, 하단 줄)로 MOI=2에서 접종하였다. 22 hpi 세포를 고정시키고 항 PRRSV-nsp2 항체, DAPI 및 팔로이딘으로 염색하였다.
도 9: 시조 동물의 유전자형. A) 시조 동물 310 (f)의 유전자형. 310의 유전자형을 인트론 6 내지 엑손 8에 걸쳐 PCR에 의해 평가하였다. DNA 주형을 두 귀 생체검사, 꼬리 잘라내기(tail clipping) 및 연막(buffy coat)으로부터 추출하였다. 엑손 7 결실이 450 bp PCR 산물을 발생시켜야만 할 때, 변형되지 않은 게놈 PCR은 900 bp 산물을 야기할 것으로 예측된다. 대조군으로서 그 변형되지 않은 형제 (311) 중 하나로부터 발생된 PCR을 또한 나타낸다. B) 인트론 6 내지 엑손 8에 걸쳐 PCR 산물의 생어 시퀀싱에 의해 평가된 301의 특정한 유전자형. C) 시조 동물 345 (m), 346 (f), 및 347 (f)의 유전자형. 동물의 유전자형을 인트론 6 내지 엑손 8에 걸쳐 PCR에 의해 평가하였다. DNA 주형을 두 귀 생체검사로부터 추출하였고, 그 중 하나는 귓부리(표피 및 진피), 연막 및 폐포대식세포만을 포함한다. 상이한 조직 샘플 유래 유전자형은 이형접합 및 동형접합 조직의 모자이크 현상을 밝혔다. 변형되지 않은 형제 대조군 동물 342, 343 및 344로부터 발생된 PCR 산물을 또한 나타낸다. B) PCR 산물의 생어 시퀀싱에 의해 평가된 345, 346 및 347의 특정한 유전자형.
도 10: 310x345 교배에 의한 한배 새끼(litter)의 유전자형. A) 새끼돼지 627-635 및 ovl/SB(Ovl= 중첩 돼지(overlaid pig), SB= 사산) 새끼돼지의 유전자형을 인트론 6 내지 엑손 8에 걸쳐 PCR에 의해 평가하였다. DNA 주형을 귀 생체검사로부터 추출하였다. 변형되지 않은 게놈 PCR은 엑손 7 결실이 450 bp PCR 산물을 발생시켜야만 할 때, 900 bp 산물을 야기할 것이라고 예측된다. B) 나타낸 유전자형을 가진 가계도. 이미지 상에, 310 및 345의 이형접합 유전자형을 명암법(shading)으로 나타내고, 어두운 회색은 편집된 대립유전자를 나타내며, 밝은 회색은 변형되지 않은 (대립유전자)를 나타낸다. 310 및 345는, 이는 생식계열에서 발견된 유전자형을 나타내므로, 두 동물에서 발견된 모자이크 현상에도 불구하고 이형접합성으로 나타난다. 630은 310 유래 편집된 대립유전자에 대해 동형접합성이다. 627, 634, 635, OVL/SB1, OVL/SB2, OVL/SB4는 하나의 345 유래 편집된 대립유전자 및 다른 변경되지 않은 것에 이형접합성이다. 629는 하나의 345 유래 편집된 대립유전자 및 310 유래 하나와 이형접합성이다.
도 11: △SRCR5 돼지(pig)의 생성 및 실험 구성. A) △SRCR5 돼지(pig)를 생성하기 위한 게놈 편집. 게놈-편집된 시조 동물을 두 개의 가이드 RNA, sgSL26 및 sgSL28을 이용한 CRISPR/Cas9 편집 시약의 접합자 주입에 의해, CD163 내 엑손 7의 결실을 생성시키는 것과 조합하여, 생성하였다. 동물을 두 가지 가이드 RNA의 절단 부위에서 깨끗한 재-결찰(re-ligation)을 나타내는 하나의 유전자형에 초점을 맞추어 F1 및 F2 세대를 생성시키기 위해 사육하였다. 동형접합성 F2 세대 동물은 두 개의 대립유전자에 이러한 유전자형을 가진다(하단). B) F2 동물의 폐포대식세포 내 △SRCR5의 구조 예측 및 발현. 왼쪽: RaptorX를 이용한 단백질 구조 예측은 SRCR5의 결실시 온전한 단백질 산물을 제거한다. C) 도전적 연구의 실험 디자인. F1 세대 동물의 이형접합성/이형접합성 교배로부터 4마리 동형접합성(녹색) 및 4마리 야생형(주황색) 형제를 이유기부터 같이 살게하였다. 유전자형을 엑손 7에 걸친 PCR 증폭에 의해(도 1A 참조) 그리고 생어 시퀀싱에 의해 확인하였다. 새끼돼지를 이유기 후에, 같이 살게하였고, 특정한 병원체가 없는 단위에 1주 동안 적응시킨 후, 7-8주령에서 도전 0일 및 1일째에 PRRSV-1, 서브타입 2 균주 BOR-57의 5E6 TCID50로 14일 동안 비강내 접종시켰다.
도 12: △SRCR5 돼지(pig)는 가용성 C163의 정상적인 혈청 수준을 나타낸다. 도전 2주 및 0일 전에 수득된 혈청 샘플을 상업적 ELISA를 이용하여 존재하는 CD163 수준에 대해 평가하였다. n=2*2*3, 최소/최대 및 90 백분위수를 표시한다. 비쌍체 t-검정을 이용한 통계적 분석은 유의한 차이를 나타내지 않았다.
도 13: △SRCR5 돼지(pig)는 PRRSV-1 감염의 임상적 신호, 바이러스 복제 또는 병리를 나타내지 않는다. A) BOR-57의 도전시 △SRCR(채워진 원) 및 야생형 새끼돼지(채워진 사각형)의 직장 온도. 직장 온도를 먹이를 주는 동안 매일 측정하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다, n=4. B) 도전 0, 7 및 14일째 체중 측정을 기반으로 한 평균 일간 체중 증가. A&B; 이원 ANOVA & 시닥 다중비교검정(Sidak's multiple comparison test)을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. C) BOR-57로 도전시 바이러스 감염. 혈청 샘플을 진공 튜브를 이용하여 경정맥으로부터 0, 3, 7, 10 및 14 일째에 수득하였고, 바이러스 RNA를 BOR-57의 ORF5에 특이적인 프라이머로 RT-qPCR을 이용하여 분리하고 정량화하였다. D) 도전시 PRRSV-1에 대한 항체 반응. 혈청 샘플을 IDEXX PRRSV X3 ELISA 시험을 이용하여 PRRSV 항체의 존재에 대하여 분석하였다. <0.40=음성; ≥0.4=양성. E) 폐 및 림프절 병리, 조직병리 및 면역조직화학 점수. 왼쪽 막대는 △SRCR5, 오른쪽 막대는 야생형 돼지(pig)를 나타낸다. 폐 병리를 맹검 방식으로 평가하였고, 확립된 스코어링 시스템을 이용한 총 폐 병변의 중증도에 대한 주고나적인 점수를 적용하였다(규모 0-100). 폐 조직병리 구역을 0 내지 6 범위의 간질성 폐렴의 존재 및 중증도에 대하여 스코어링하였다(0, 정상; 1, 가벼운 다병소성; 2, 가벼운 확산; 3, 중도의 다병소성; 4, 중도의 확산; 5, 심각한 다병소성; 6, 심각한 확산). 폐 및 림프절 구역의 PRRSV-N에 대한 면역조직화학 염색을 0-3의 범위로 스코어링하였다(0, 신호없음; 1, 적은 수의 양성세포; 2, 중간 수의 양성세포; 3, 풍부). F) 폐 조직 및 면역조직화학. 상단: 도전 후 14일째 부검에서, 포르말린-고정, 파라핀-매립, 헤마톡실린 및 에오신 염색된 폐 구역. 왼쪽: △SRCR5, 오른쪽: 야생형 새끼돼지. 규모 막대는 100μm를 나타낸다. 하단: PRRSV 항원에 대한 포르말린-고정, 파라핀-매립 면역조직화학 염색 및 헤마톡실린 대비염색. 왼쪽: △SRCR5, 오른쪽: 야생형 새끼돼지. 규모 막대는 50μm를 나타낸다. G) 폐 병리. 도전 후 14일째 부검에서 돼지(pig) 유래 폐; 왼쪽, 두 마리 △SRCR5 돼지(pig) 유래 폐 및 오른쪽, 두 마리 야생형 돼지(pig) 유래 폐.
도 14: △SRCR5 돼지(pig)는 정상적인 사이토카인 수준을 나타내고 BOR-57 PRRSV 감염에 대해 사이토카인 반응을 나타내지 않는다. 도전 0일 및 도전 3, 7, 10 및 14일 전에 수득된 혈청 샘플 내 사이토카인 수준을 사이토카인 항체 분석을 이용하여 측정하였다. △SRCR5 = 채워진 원 및 야생형 새끼돼지 = 채워진 사각형. A) 인터페론 α (IFNα), B) 인터루킨 17A (IL-17A), C) 인터루킨 1 수용체 안타고니스트 (IL-1ra), D) 인터루킨 4 (IL-4), E) 인터루킨 6 (IL-6), F) 인터루킨 4 (IL-4), G) 감마 인터페론에 의해 유도된 모노카인 (MIG/CXCL9), H) 대식세포 감염성 단백질-1β (MIP-1β/CCL4), I) 케모카인 리간드 3-유사 1 (CCL3L1), J) 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), K) 종양 괴사 인자 알파 (TNFα), L) 인터루킨 12 (IL-12), M) 인터루킨 1 beta (IL-1β), N) 인터루킨 10 (IL-10), O) 형질전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1), P) 인터페론 감마 (IFNγ), Q) 인터루킨 18 (IL-18), R) 혈소판 내피세포 부착 분자 (PECAM-1/CD31), S) 인터루킨 1 알파 (IL-1α), T) 인터루킨 13 (IL-13). 오차 막대는 SEM을 나타낸다, n=2*4. 통계 분석을 이원 ANOVA & 시닥 다중비교검정을 이용하여 수행하였다.
본 발명의 다양한 구현예의 제작 및 사용이 하기 상세히 논의되나, 본 발명은 매우 다양한 특정한 내용에 있어서 구현될 수 있는 많은 적용가능한 발명적 개념을 제공한다는 것을 이해하여야만 한다. 본원에서 논의된 특정한 구현예는 본 발명을 제작하고 사용하기 위한 특정한 방법을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하지는 않는다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여, 다수의 용어가 하기에 정의된다. 본원에서 정의된 용어는 본 발명과 관련된 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. "하나의(a)", "하나의(an)" 및 "그(the)"와 같은 용어는 단일 개체만을 지칭하는 것이 아니라, 그의 특정한 예가 예시를 위해 사용될 수 있는 일반적인 부류를 포함한다. 본원에서 전문용어는 본 발명의 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용되나, 청구범위에 설명된 것을 제외하고는 그 사용이 본 발명을 제한하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "돼지(swine)" 또는 그 변이형은 페커리(peccary), 바비루사(babirusa) 및 와트호그(warthog)를 포함하는, Sus 속 및 다른 관련 종의 동물을 포함하는 소목의 Suidae 과(family) 내 임의의 동물을 말한다.
본원에서 사용된 용어 "돼지(pig)" 또는 그 변이형은 Sus 속의 임의의 동물을 말한다. 이는 가축 돼지(Sus scrofa domesticus or Sus domesticus) 및 그 조상, 일반적인 유라시아 멧돼지(Sus scrofa)를 포함한다. 본 목적을 위해, 가축 되지는 Sus scrofa 종의 아종인 것으로 간주된다. 그것은 페커리, 바비루사 및 와트호그를 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "가축 돼지(pig)" 또는 그 변이형은 Sus scrofa domesticus 아종의 동물을 말한다.
본원에서 사용된 용어 "부위-특이적 뉴클레아제" 또는 그 변이형은 바람직한 위치의 DNA를 절단하도록 구성될 수 있는 조작된(engineered) 뉴클레아제를 말한다. 이러한 부위-특이적 뉴클레아제는 또한 조작된 뉴클레아제, 표적화가능한 뉴클레아제, 게놈 편집 뉴클레아제, 분자 가위 등등으로도 알려져 있다. 부위-특이적 뉴클레아제의 예는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화 인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), CRISPR/Cas 시스템(CRISPR/Cas) 및 하이브리드 메가뉴클레아제와 같은 메가뉴클레아제를 포함한다.
대상 생물학적 물질과 관련하여 사용될 때 "유전자 편집(genetically edited)" 또는 "유전자 변형(genetically modified)"은 대상 생물학적 물질이 대조군, 예를 들어, 야생형, 생물학적 물질과 비교하여 그 유전자 변형을 만들기 위해 처리되는 사실을 말한다.
"표적 부위"는 부위-특이적 뉴클레아제가 결합하는 핵사 서열을 가진 부위를 말한다. 부위-특이적 뉴클레아제가 표적 부위에 결합할 때, 표적 부위 내 또는 인접한 DNA를 절단하도록 작용하는데(이는 바람직하게 두 개의 이른바 "절반-부위(half-site)"가 있는 경우에, 단일 부위-특이적 뉴클레아제 또는 상응하는 쌍 또는 뉴클레아제에 의해 달성될 수 있다), 절단 위치는 "절단 부위(cut site)" 또는 "절단 부위(cutting site)"로 불린다. 표적 부위를 상기 부위-특이적 뉴클레아제에 대해 정의할 때, 절단 부위는 적합하게는 표적 부위와 함께 또는 표적 부위 부근에 있다. 표적 부위가 게놈 내 특정한 특징, 예를 들어, 편집 사건에서 결실되거나 보존되는 특징(엑손 7 또는 스플라이스 부위와 같이)에 가깝거나 근접한 것으로 언급되고, 절단 부위는 바람직한 결과를 달성하기 위해 위치되어야만 하는데, 즉, 바람직하게 특징의 결실 또는 보존을 초래한다. 부위-특이적 뉴클레아제는 임의의 바람직한 표적 부위를 표적화하도록 설계될 수 있다; 예를 들어, CRISPR/Cas9과 함께, 이는 적합한 sgRNA를 사용하여 달성될 수 있고, ZFN 또는 TALEN에 대해 적합한 단백질이 상업적 출처로부터 설계되고 얻어질 수 있다.
"△SRCR5"는 이중대립성 또는 동형접합성 CD163 SRCR5 결실을 포함하는 동물, 전형적으로 돼지(swine)를 말한다.
핵산 서열(게놈 또는 유전자의 영역과 같이)을 참고하여 "변경되지 않은(unaltered)"은 야생형 서열로부터 변경되지 않은 서열을 말한다.
"내성(tolerance) 또는 저항성(resistance)" - 동물은, 동물에 PRSSV 감염이 발생했을 때, 사망률, 이환율, 현저한 이환을 나타내는 동물의 비율(예, 체중 감소 또는 감소된 성장률), 이환 수준 또는 이환 기간이 감소될 때, PRRSV 감염에 대해 더욱 내성이 있거나 저항성이 있다고 할 수 있다. 동일한 독성 수준의 PRRSV(이상적으로 동일한 분리물)에 노출되었을 때, 유전자 편집 돼지(pig) 집단과 동등한 비-편집 돼지(pig)의 집단 사이의 사망률 또는 이환율에 어떠한 통계적으로 유의한 감소(예, 적절한 시험을 이용하여, 95% 신뢰도, 또는 99% 신뢰도)는 향상된 내성 또는 저항성을 입증한다. 향상된 내성 또는 저항성은 감염이 발생할 때, PRRSV 감염에 대한 감소된 민감성 또는 통증 이완에 의해 입증될 수 있다. 돼지(swine)에서 감염에 대한 향상된 저항성은 PAM 및 PMM 세포에 대해 하기 설명된 방법론을 이용하여 시험관내 시험될 수 있다.
본원에서 사용된 "단백질" 및 "펩타이드"는 상호교환적으로 사용될 수 있고(문맥상 다르게 나타내지 않는 한), 펩티딜(peptidyl) 결합에 의해 연결된 적어도 두 개의 공유결합으로 부착된 아미노산을 의미한다. 용어 단백질은 정제된 자연 산물, 또는 재조합 또는 합성 기술을 이용하여 부분적으로 또는 전체적으로 제조될 수 있는 산물을 포함한다. 용어 펩타이드 및 단백질은 이합체 또는 다른 다합체, 융합 단백질, 단백질 변이체 또는 그 유도체와 같은 총 단백질을 말하는 것일 수 있다. 단백질은 핵산 코돈에 의해 암호화되지 않는 아미노산, 즉 비-자연 아미노산을 포함할 수 있다.
서론
PRRS는 전세계적으로 돼지에 영향을 미치는 경제적으로 가장 중요한 감염성 질환 중 하나이다. "미스터리 돼지(swine) 질환"은 1980년대 후반에 북미와 유럽에서 거의 동시에 첫번째로 관찰되었다[1,2]. PRRS의 원인 인자는 후에 PRRS 바이러스(PRRSV)라고 명명된 바이러스로 확인되었다. 감염된 돼지(pig)는 식욕 부진, 열, 무기력 및 호흡 곤란과 관련된 증상을 나타낼 수 있다. 그러나, PRRSV 감염의 가장 파괴적인 영향은 어린 새끼 돼지 및 임신한 암퇘지에게서 관찰된다. 임신한 암퇘지에서 PRRSV 감염은 태아의 부분적 변위를 유발하여, 완전 낙태 또는 자궁내 태아의 사망 및 미라화(mummification)를 유도할 수 있다[3]. 후기 낙태는 100% 사산된 새끼 돼지를 포함하는 한배 새끼를 가진, 감염된 암퇘지의 30%까지 발생한다. 출산전 감염으로부터 태어난 새끼돼지들은 종종 약하고, 심각한 호흡기 증상을 나타내며, 그들 중 80%가 이유기 전(pre-weaning) 주간 기준으로 사망한다[4,5]. PRRSV에 감염된 어린 새끼돼지는 종종 폐의 병변에 의해 유발되는 설사 및 심각한 호흡 곤란을 나타낸다. 이유기 전 새끼돼지에서, 감염은 감염된 암퇘지의 유선 분비물을 통해 전염될 수 있다[6]. 이 나이에, 감염은 동물의 80%에서 치명적인 결과를 낳는다. 이유 후 사망률이 감소하지만, 감소된 일일 증가 및 사료 효율의 감소로 인한 계속적인 경제적 손실이 종종 관찰된다[4,7,8]. 모든 PRRSV 감염된 돼지(pig)의 임신의 감소 또는 상실, 어린 새끼돼지의 사망 및 감소된 성장률로 인해, 미국에서만 돼지고기 생산자에게 매년 6.5 억달러 이상이 손실되는 것으로 추산된다[9,10].
PRRSV는 Nidovirales 순서로 Arteriviridae 과에 속하는 외피성, 플러스-가닥 RNA 바이러스이다[11,12]. PRRSV 게놈(~15 kb)은 적어도 12개의 비-구조적 및 7개의 구조적 단백질을 암호화한다. 바이러스 RNA는 뉴클레오캡시드 단백질 N에 의해 포장되는데, 이는 비-글리코실화된 막 단백질 M 및 E, 뿐만 아니라 4개의 글리코실화된 당단백질 GP2, GP3, GP4 및 GP%를 포함하는, 지질단백질 외피(envelope)에 둘러싸여, 이에 따라 GP2, 3 및 4는 복합체를 형성한다[13-17].
PRRSV는 오로지 특정한 부분집합의 돼지(porcine) 대식세포를 감염시키는 매우 좁은 숙주 범위를 가진다[18-20]. 얼마나 널리 PRRSV 감염이 Suidae 상과에 퍼져있는지 아직 알려지지 않았다. 유럽 멧돼지가 PRRSV의 저장소 역할을 하는 것으로 나타났으나[21], 부시피크 및 와트호그와 같은 아프리카계 수이드(suid) 내 감염에 대해서는 거의 알려진 것이 없다. 시험관내 바이러스 복제는 아프리카계 녹색 원숭이 세포주 MARC-145에 의해 뒷받침된다. PRRSV의 대식세포에의 진입은 pH-의존적, 수용체 매개 세포내섭취를 통해 발생하는 것으로 알려져 있다[22,23]. 다양한 부착 인자 및 수용체가 PRRSV 진입 과정에 연관되어 있는 것으로 나타났다([24]에서 검토됨). 헤파란 황산은 바이러스의 부착 인자로서 일찍이 확인되었다[25-27]. MARC-145 세포가 아니라, 폐포대식세포(PAM)의 시험관내 감염은 대식세포의 표면에서 발현되는 렉틴인, CD169(시알로어드헤신)을 표적화하는 항체에 의해 억제되는 것으로 나타났다[28]. 이전에 허용되지 않는 PK-15 세포에서 CD169의 과발현은 내재화를 나타냈으나, PRRSV의 생산 복제는 아니었다[29]. 결국, CD169 유전자가 녹아웃된 유전자 변형 돼지(pig)의 생체내 도전은 PRRSV 감염에 대한 증가된 저항성을 나타내지 않아, 이는 CD169가 PRRSV 감염에 필수적이지 않은 인자라는 것을 시사한다[30]. 비록 세포 표면 단백질 발현이 PRRSV 결합 및 내재화의 주요한 결정인자라고 하더라도, 아직까지 확인되지 않은 수용체가 추가적으로 관여될 가능성이 있는 세포 표면 부착 인자 중에 중복이 있는 것으로 보인다[31]. 합토글로빈 스캐빈저 수용체 또는 p155로도 알려진, 스캐빈저 수용체 CD163은 대식세포의 특정한 서브타입에서 발현되고, PRRSV에 대한 융합 수용체로 확인되었다. CD163의 세포외 부분은 9개의 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부(SRCR) 도메인의 끈 위의 진주 구조를 형성하고, 단일 막관통 분절 및 짧은 세포질 도메인으로 고정된다[32]. CD163은 전신성 염증 매개 및 혈장으로부터 헤모글로빈의 제거를 포함하는 다양한 생물학적 기능을 가진다([33,34]에서 검토됨). CD163의 과발현은 PRRSV 감염에 허용되는 비-민감성 세포를 제공하여[35], 이에 따라 CD163이 내재화를 매개하지는 않으나, 융합에 중요하다는 것이 발견되었다[36]. 막관통 고정 및 CD163의 SRCR 도메인 5(SRCR5)와의 상호작용은 PRRSV의 성공적인 감염에 필수적인 것으로 밝혀졌다[34,35]. CD163 녹아웃 돼지(pig)를 이용한 최근의 생체내 실험이 수행되었다[37]. 그러나, CD163은 중요한 생물학적 기능을 가지므로, 완전한 녹아웃이 돼지(pig)에, 특히 다른 병원체에 의한 염증 및/또는 감염과 관련하여, 부정적인 생리적 영향을 줄 수 있다.
본 연구는 정의된 CD163 SRCR5 결실을 가진 돼지(pig)를 생성하고, 이러한 돼지(pig) 유래 대식세포의 PRRSV 감염에 대한 민감성을 평가하기 위한 것이다.
재료 및 방법
모든 동물 작업은 에든버러 대학의 동물 윤리 위원회의 검토 후 영국 내무성 허가(UK Home Office license)에 승인되었고, 승인된 지침에 따라 수행되었다.
세포 및 바이러스
PRRSV 유전자형 1, 서브타입 1 균주 H2(PRRSV H2)[52], 서브타입 2 균주 DAI(PRRSV DAI)[53] 및 서브타입 3 균주 SU1-Bel(PRRSV SU1-Bel)[54]의 증식을 위한 일차 폐포대식세포(PAM)를 이전에 설명된 바와 같이 6-9 주령의 야행성 과잉 연구 동물로부터 수득하였다[45]. 간략히, 스케줄 Ι 방법에 따라 동물을 안락사시켰다. 폐를 제거하고 멸균 환경으로 얼음 위로 이동시켰다. 따뜻한 PBS로 폐를 두 번 씻어, PAM을 폐로부터 추출하고, 대식세포를 방출하도록 마사지하였다. 새포를 400 g에서 10분 동안 원심분리하여 수득하였다. 필요시, 적색 세포를 PBS로 다시 씻기 전에 적색 세포 용해 버퍼(10 mM KHCO3, 155 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)를 이용하여 5분 동안 제거하였다. 전과 같이 세포를 원심분리하여 수득하고, 90% FBS(HI, GE Healthcare), 10% DMSO(Sigma)에서 동결시켰다. 150℃로 이동되기 전에, -80℃ 냉동고에서 1℃/분으로 점차 세포를 동결시켰다.
동물 627, 628, 629, 630, 633, 및 634 유래 PAM을 8주령에 수득하였다. 이를 위해 새끼돼지를 케타민/아자페론 약물치료 전 혼합물(Ketamine/Azaperone pre-medication mix)을 이용하여 진정제를 주고 케타민/미다졸람(Midazolam)으로 마취시켰다. 과정 전반에 마취를 세보플루란(Sevoflurane)을 이용하여 유지하였다. PAM을 기류 접근(air flow access)을 이용한 삽관을 통해 기관지 폐포 세척(bronchoalveolar lavage, BAL)에 의해 수득하였다. 세 개의 폐 분절을 각 동물에서 2x20 ml PBS를 이용하여 씻어 내었다. 유체 회수는 60-80% 사이었다. 세포를 BAL 유체로부터 400 g에서 10분 동안의 원심분리로 수득하고 상기와 같이 동결시켰다.
말초혈액 단핵구(PBMS)를 이전에 설명된 바와 같이 분리하였다[45]. 간략히, 10주령의 새끼돼지의 경정맥으로부터 EDTA 코팅된 진공 튜브를 이용하여 혈액을 수득하였다. 혈액을 1200 g에서 15분 동안 원심분리하였고, 연막을 PBS로 이동시켰다. 림포프렙(Axis-Shield)을 연막/PBS와 동일한 부피로 덮어씌우고 400 g에서 45분 동안 원심분리하였다. 단핵 세포 분획을 PBS로 씻고, 세포를 수득하고 상기 설명된 바와 같이 동결시켰다.
PAM 세포를 RPMI-1640, 글루타맥스(Glutamax, Invitrogen), 10% FBS(HI, GE Healthcare), 100 IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen) (cRPMI)에서 배양시켰다. PBMC를 감염 전 6일 동안 rhCSF-1(1Х104 units/ml; 케이론(Chiron)으로부터의 선물)이 보충된 cRPMI에서 배양시켰다.
PK15 세포를 글루타맥스 보충된 DMEM(Invitrogen), 10% FBS(HI, GE Healthcare), 100 IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen)에서 배양하였다.
가이드 RNA의 설계 및 시험관내 절단 효율 평가
세 개의 잠재적인 가이드 RNA 서열을 인트론 6의 200 bp에서, 하나를 97 bp긴 인트론 7에서 선택하였다. 올리고머(Invitrogen)을 이전에 설명된 바와 같이 정리하고 혼성화하였고[72], 그 다음 플라스미드 pSL66([42]에 설명된 바와 같은 sgRNA 스캐폴드에 대해 변형을 가진 px458의 유도체)의 BbsI 부위에 묶었다. 생성된 플라스미드는 가이드 RNA 서열의 발현을 유도하는 hU6 프로모터 및 N-말단의 SV40 핵 위치화 신호(nuclear localization signal, NLS) 및 Cas9의 C-말단의 뉴클레오플라스민 NLS과 함께, Cas9-2A-GFP를 유도하는 CBA 프로모터를 포함한다. 각 유전자의 절단 효율을 20 mS의 2 펄스와 함께 1200 mV로 설정된 네온 형질주입 시스템(Invitrogen)을 이용하여 돼지(pig) PK15 세포로 플라스미드를 형질주입하여 평가하였다. 형질주입 48시간 후 GFP 향성 세포를 FACS Aria Ⅲ 세포 분류기(Becton Dickinson)를 이용하여 수득하였고, 게놈 DNA(DNeasy Blood & Tissues Kit, Qiagen)의 제조 전 추가 4일 동안 배양하였다. 표적 부위에 걸친 PCR은, 940 bp의 산물을 생산하기 위하여, AccuPrime Taq DNA 중합효소 HiFi(Life Technologies)를 이용하여, oSL46(ACCTTGATGATTGCGCTCTT - 서열번호 17) 및 oSL47(TGTCCCAGTGAGAGTTGCAG - 서열번호 18)을 이용하였다. CelI 분석(Transgenomic; Surveyor Mutation Detection Kit)을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다[73]. GFP 발현에 대한 축재 없이 형질주입 40 시간 후에 세포를 수득하는 것을 제외하고는, 상기 설명된 바와 같이, PK15 세포의 엑손 7 옆 가이드를 암호화하는 수쌍의 플라스미드와의 공동-형질주입을 수행하였다. 이러한 예에서, 940 bp 단편에 추가로 절단된 PCR 산물이 관찰되었고, 이는 엑손 7의 결실을 나타낸다.
단일 및 이중 절단 효율 모두에 기초하여, 엑손 7의 121 bp 상류 에 위치한 SL26(GAATCGGCTAAGCCCACTGT - 서열번호 7) 및 엑손 7의 30 bp 하류 에 위치한 SL28(CCCATGCCATGAAGAGGGTA - 서열번호 11) 가이드 RNA를 생체내 실험을 위해 선택하였다.
가이드 RNA의 생성 및 품질 평가
전체 가이드 RNA 스캐폴드 및 T7 프로모터를 포함하는 DNA 올리고머 단편을 다음과 같이 각각의 플라스미드 주형으로부터 PCR에 의해 생성하였다; 각각의 가이드 RNA의 첫번째 18 bp에 뒤이은 T7 프로모터를 포함하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 oSL6(AAAAGCACCGACTCGGTGCC - 서열번호 19)를 Phusion 중합효소(NEB)와 조합하여 사용하였다. DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen)를 이용하여 1.5% 아가로오스 겔에서 정제하였다. DNA 용리액(eluate)을 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5% SDS 내 200μg/ml Proteinase K(Qiagen)로 50℃에서 30분 동안 처리하고, 뒤이어 페놀/클로로포름 추출하였다. 가이드 RNA를 제조자의 지시에 따라 MEGAshortscript Kit(Thermo Fisher)를 이용하여 결과적인 DNA 단편으로부터 생성시켰다. RNA를 페놀/크로로포름 추출에 뒤이은 에탄올 침전을 이용하여 정제하였고, EmbryoMax Injection Buffer(Millipore)에서 재부유시켰다. RNA의 순도 및 농도를 제조자의 지시에 따라 Agilent TapeStation 상 RNA Screen Tape(Agilent)를 이용하여 평가하였다.
접합자 주입 및 이동
이전에 설명된 바와 같이 큰 흰 어린 암퇘지로부터 배아를 생산하였다[73]. 간략하게, 발정 후 11 및 15 일 사이에 regumate/PMSG/Chorulon 요법을 이용하여 어린 암퇘지를 과잉배란시켰다. 가열 후, 도너 어린 암퇘지를 6시간 간격으로 두 번 수정시켰다. 접합자를 교배된 도너로부터 NCSU-23 HEPES 기본 배지로부터 외과적으로 회수한 다음, EmbryoMax Injection 버퍼(Millipore) 내 50 ng/μl의 각 가이드(SL26 및 SL28) 및 100 ng/μl Cas9 mRNA(PNA Bio or Tri-Link)를 포함하는 주입 혼합물로 단일 2-5pl 세포질 주입에 대상으로 하였다. 수취인 암컷을 도너 어린 암퇘지와 동일하게 처리하였으나, 교배되지 않은 상태로 두었다. 수술시, 생식 기관이 노출되었고, 24-39개 접합자를 3.5 프랑스 게이지 수고양이 카테터를 이용하여 수취인의 난관으로 이동시켰다. 한배 새끼 크기는 5-12 새끼돼지의 범위이었다.
배반포 내 시험관내 평가 게놈 편집
주입되지 않은 대조군 접합자 및 주입된 잉여 접합자를 시스테인 및 BSA로 보충된, NCSU-23 HEPES 기본 배지에서 5-7일 동안 38.5℃에서 배양하였다. 배반포를 배양 7일 후에 수득하였고 게놈을 제조자의 지시에 따라 REPLI-g Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 증폭시켰다. 하기 설명된 바와 같이 지노타이핑을 수행하였다.
지노타이핑
게놈 DNA를 DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)를 이용하여 산후 2일째 새끼돼지로부터 취한 귀 생체검사 또는 꼬리 잘라내기로부터 추출하였다. 인트론 6 내지 엑손 8에 걸친 영역을 프라이머 oSL46(ACCTTGATGATTGCGCTCTT - 서열번호 17) 및 oSL47(TGTCCCAGTGAGAGTTGCAG - 서열번호 18)을 이용하여 증폭시켜, 온전한 대립유전자로부터 904 bp 산물 및 엑손 7의 완전한 결실이 발생한 경우, 454 bp 산물을 생성시켰다. 모든 절단된 단편의 1% 아가로오스 겔 상의 분리 및 이어진 생어 시퀀싱에 의해, PCR 산물을 분석하였다. 야생형 길이에 상응하는 단편을 제조자의 지시에 따라 T7 엔도뉴클레아제 I(NEB) 소화에 의해 추가로 분석하였다.
RNA 표현형 결정(phenotyping)
컬럼내(on-column) DNase 소화를 포함하여, 제조자의 지시에 따라, RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용하여, 상기 설명된 RNA를 분리하였다. 제조자의 지시에 따라, SuperScript II 역전사제(Invitrogen)와 조합하여, Oligo-dT 프라이머를 이용하여, 첫번째-가닥 cDNA를 합성하였다. 프라이머 P0083(ATGGATCTGATTTAGAGATGAGGC - 서열번호 20) 및 P0084(CTATGCAGGCAACACCATTTTCT - 서열번호 21)를 이용하여 엑손 4 내지 9에 걸쳐 RNA 표현형을 평가하기 위하여 cDNA를 사용하였고, 온전한 대립유전자에 대해 1686 bp 길이 및 엑손 7의 정밀한 결실 후 1371 bp의 PCR 산물을 생성하였다. PCR 산물을 1% 아가로오스 겔 상의 분리 및 뒤이은 결실 단편의 생어 시퀀싱에 의해 분석하였다.
웨스턴 블롯에 의한 단백질 표현형 분석
BAL에 의해 분리된 45E PAM 세포를 300 rcf에서 10분 동안 원심분리하여 수득하였다. 펠렛을 100 mM DTT를 포함하는 램나이(Laemmli) 샘플 버퍼에서 재부유시키고, 95℃에서 10분 동안 끓이고, 7.5% 아크릴아미드(Bio-Rad) 겔 상에서 전기영동하였다. 니트로셀룰로오스 막(Amersham)에의 이동 후, 세포 단백질의 존재를 1 μg/ml에서 CD163(토끼 pAb, abcam, ab87099) 및 1:2000에서 β-액틴(HRP-tagged, 생쥐 mAb, Sigma, A3854)에 대한 항체로 조사하였다. CD163에 대하여, 블롯을 1:5000에서 HRP-표지 토끼 항-생쥐 항체(DAKO, P0260)로 그 후에 배양시켰다. HRP-표지 항체의 결합을 제조자의 지시에 따라 Pierce ECL Western Blotting Substrate(Thermo Fisher)를 이용하여 가시화하였다.
RT-qPCR에 의한 CD163 mRNA의 정량화
컬럼내 DNase 소화를 포함하여, 제조자의 지시에 따라, RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 1E6 PAM으로부터 RNA를 분리하였다. LightCycler 480(Roche) 상에서 제조자의 지시에 따라 GoTaq 1-Step RT-qPCR 시스템(Promega)을 이용하여 RNA 수준을 측정하였다. CD163의 mRNA를 프라이머 P0074 (CATGGACACGAGTCTGCTCT - 서열번호 22) 및 P0075(GCTGCCTCCACCTTTAAGTC - 서열번호 23)을 이용하여 정량화하였고, β-액틴의 참조 mRNA 수준을 프라이머 P0081 (CCCTGGAGAAGAGCTACGAG - 서열번호 24) 및 P0082(AAGGTAGTTTCGTGGATGCC - 서열번호 25)를 이용하여 정량화하였다.
유세포분석에 의한 대식세포의 특성화
PAM을 분석 하루 전에 시딩하였다. PBMC를 분석 7일 전에 시딩하였고 PBMC-유래 대식세포(PMM)을 생산하기 위하여 CSF1 자극에 의해 분화시켰다. 세포를 고무찰자로 긁어 내어 수득하고, 실온에서 15분 동안 4% 포름알데하이드/PBS에서 고정시켰다. 항체로 염색하기 전에 세포를 차단 용액(PBS, 3% BSA)으로 45분 동안 배양시켰다. 세포를 생쥐 항-돼지(pig) CD14(AbD Serotec, MGA1273F, 1:50) 및 생쥐 항-돼지(pig) CD16(AbD Serotec, MCA2311PE, 1:200), 생쥐 항-돼지(pig) CD169(AbD Serotec, MCA2316F, 1:50) 및 생쥐 항-돼지(pig) CD172a(SoutherBiotech, 4525-09, 1:400), 생쥐 항-인간 CD151(AbD Serotec, MCA1856PE, 1:50) 및 생쥐 항-돼지(pig) SWC9 (CD203a)(AbD Serotec, MCA1973F, 1:50), 생쥐 항-돼지(pig) CD163(AbD Serotec, MCA2311PE, 1:50), 또는 생쥐 IgG1 또는 IgG2b 음성 대조군(AbD Serotec, MCA928PE,MCA691F, 또는 Sigma, F6397; 일차 Ab와 동일한 농도) 중 하나를 표적화하는 항체로 염색하였다. 세포를 PBS로 세 번 씻어내고 FACS 버퍼(PBS 내 2% FBS, 0.05M EDTA, 0.2% NaN3)에서 재부유시켰다. 항체 표지에 의해 결정된 유전자 발현을 FlowJo 소프트웨어를 이용한 FACS Calibur(Becton Dickinson) 상에서 FACS 분석에 의해 평가하였다.
고 MOI 단일-라운드(single-round) 감염 분석
PAM을 분석 하루 전에 시딩하였다. PBMC를 분석 7일 전에 시딩하였고 PBMC-유래 대식세포(PMM)을 생산하기 위하여 CSF1 자극에 의해 분화시켰다. 세포를 37℃에서 3시간 동안 cRPMI 내 각 바이러스 균주(PRRSV H2, DAI, 또는 SU1-Bel)의 MOI=1에서 접종하였다. 접종물을 따뜻한 cRPMI로 교체하였다. 19hpi 세포를 세포 스크레이퍼를 이용하여 탈착하였다. 세포를 RT에서 15분 동안 PBS(Gibco) 내 4% 포름알데하이드(Sigma-Aldrich)에서 고정시키고, PBS로 씻어내고, 이어서 10분 동안 0.1% Triton-X-100(Alfa Aesar)을 포함하는 PBS에서 투과성으로 만들었다. 세포를 PBS 내 3% BSA에서, 상기 설명한 바와 같이, PRRSV-N에 대한 항체(SDOW17-F, RTI, KSL0607, 1:200) 및 CD163(AbD Serotec, MCA2311PE, 1:50) 또는 생쥐 IgG1 음성 대조군과 함께 배양시켰다. 세포를 PBS로 세 번 씻어내고 FACS 버퍼에서 재부유시켰다. 항체 표지에 의해 결정된 감염 수준을 FlowJo 소프트웨어를 이용한 FACS Calibur(Becton Dickinson) 상에서 FACS 분석에 의해 평가하였다.
저 MOI 다중-라운드(multiple-round) 감염 분석
PAM을 분석 하루 전에 시딩하였다. PBMC를 분석 7일 전에 시딩하였고 PMM을 생산하기 위하여 rhCSF1 자극에 의해 분화시켰다. 세포를 37℃에서 3시간 동안 cRPMI 내 각 바이러스 균주(PRRSV H2, DAI, 또는 SU1-Bel)의 MOI=0.1에서 접종하였다. 접종물을 따뜻한 cRPMI로 교체하였다. 접종물을 제거하고, 세포를 PBS로 1x 씻어내고, 감염을 지속하였다. 접종 후 지시된 시간에 샘플을 평가하기 위하여 수득하였다. 모든 샘플을 시간 경과에 따라 수득하자마자, 모든 샘플을 동결시키고 가공하였다.
바이러스성 RNA(vRNA)를 제조자의 지시에 따라 QIAmp Viral RNA Mini Kit를 이용하여 상층액으로부터 추출하였다. 바이러스 RNA 수준을 제조자의 지시에 따라, PRRSV H2 및 SU1-Bel에 대해 GoTaq Probe 1-Step RT-qPCR 시스템(Promega)을, PRRSV DAI에 대해 GoTaq 1-Step RT-qPCR 시스템(Promega)을 이용한 RT-qPCR에 의해 정량화하였다. 이를 위해 다음 프라이머 및 프로브가 사용되었다: H2 fwd(GATGACRTCCGGCAYC - 서열번호 26), H2 rev(CAGTTCCTGCGCCTTGAT - 서열번호 27), H2 프로브(6-FAM-TGCAATCGATCCAGACGGCTT-TAMRA - 서열번호 28), (JP Frossard에서 얻은 최적 H2 프라이머/프로브 서열, AHVLA), SU1-Bel fwd(TCTTTGTTTGCAATCGATCC - 서열번호 29), SU1-Bel rev(GGCGCACTGTATGACTGACT - 서열번호 30), SU1-Bel 프로브(6-FAM-CCGGAACTGCGCTTTCA-TAMRA - 서열번호 31), DAI fwd(GGATACTATCACGGGCGGTA - 서열번호 32), DAI rev(GGCACGCCATACAATTCTTA - 서열번호 33). RNA 수준을 고역가의 vRNA 분리물로부터 생성된 표준 곡선을 이용하여 LightCycler 480(Roche)에서 측정하였다.
생산된 바이러스의 감염성을 야생형 과잉 연구 동물로부터 분리된 PAM 상에서 선택된 시점의 TCID50 분석을 이용하여 평가하였다.
PMM의 Hb-Hp 자극에 대한 헴 옥시게나아제 1의 mRNA 및 단백질 수준
PBMC를 분석 7일 전에 시딩하고 PMM을 생산하도록 CSF1 자극에 의해 분화시켰다. 헤모글로빈(Hb, Sigma-Aldrich, A0, H0267) 및 합토글로빈(Hp, Sigma Aldrich, Phenotype 2-2, H9762)을 실험 전에 수직 롤러에서 15분 동안 PBS 내에서 1:1 wt/wt 비율로 혼합하였다. PMM을 37℃에서 24시간 동안 cRPMI 내 100 μg/ml Hb-Hp과 함께 배양시켰다. 세포를 고무철자로 긁어내어 수득하였다. RNA를 컬럼내 DNase 소화를 포함하여, 제조자의 지시에 따라, RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 1E6 세포로부터 분리하였다. RNA 수준을 LightCycler 480(Roche)에서 제조자의 지시에 따라 GoTaq 1-Step RT-qPCR 시스템(Promega)을 이용하여 측정하였다. 헴 옥시게나아제 1(HO-1)의 mRNA 수준을 프라이머 P0239(TACATGGGTGACCTGTCTGG - 서열번호 34) 및 P0240(ACAGCTGCTTGAACTTGGTG - 서열번호 35)를 이용하여, 프라이머 P0081 및 P0082를 이용하여 β-액틴의 참조 mRNA 수준을, 측정하였다. HP-1의 단백질 수준의 분석을 위해, 세포를 300rcf에서 10분 동안 원심분리하여 수득하였다. 펠렛을 100mM DTT를 포함하는 램나이 샘플 버퍼에서 재부유시키고, 95℃에서 10분 동안 끓이고, 12% 아크릴아미드(Bio-Rad) 겔 상에 전기영동하였다. 니트로셀룰로오스 막(Amersham)으로 이동 후, 세포 단백질의 존재를 HO-1에 대한 항체(생쥐 mAb, abcam, ab13248, 1:250), 및 칼모듈린(토끼 mAb, abcam, ab45689, 1:1000)으로 검출하였다. 이어서 블롯을 1:5000에서 HRP-표지 염소 항-토끼 항체(DAKO, PI-1000)와 함께 배양시켰다. HRP-표지 항체의 결합을 제조자의 지시에 따라 Pierce ECL Western Blotting Substrate(Thermo Fisher)를 이용하여 가시화하였다.
헤모글로빈-합토글로빈 흡수의 정량화 및 가시화
PBMC를 분석 7일 전에 시딩하고 PMM을 생산하도록 CSF1 자극에 의해 분화시켰다. 형광현미경 분석을 위해, 세포를 유리 커버 슬립에서 시딩하였다. 헤모글로빈(Sigma-Aldrich, A0, H0267)을 제조자의 지시에 따라 단백질 표지 키트(Molecular Probes)를 이용하여 Alexa Fluor 488(AF-488)로 표지하였다. HbAF488 및 Hp를 실험 전에 수직 롤ㄹ러에서 15분 동안 PBS에서 1:1 wt/wt 비율로 혼합하였다. PMM을 37 ℃에서 30분 동안 cRPMI 내 10 μg/ml HbAF488-Hp와 함께 배양하였다.
FACS에 의한 정량화를 위해, 고무철자로 세포를 수득하고 이전에 설명된 바와 같이 표면 결합 HbAF488-Hp를 제거하기 위해 무 Ca2+/Mg2+ PBS(Ca2+/Mg2+-free PBS)로 세번 씻어내었다[60]. 세포를 RT에서 15분 동안 PBS(Gibco) 내 4%(wt/v) 포름알데하이드(Sigma-Aldrich)에서 고정시키고, PBS로 씻어내고, 이어서 0.1% Triton-X-100(Alfa Aesar)를 포함하는 PBS에서 10분 동안 투과성으로 만들었다. 세포를 상기 설명된 바와 같이 생쥐 항 돼지(pig) CD163 항체(AbD Serotec, MCA2311PE, 1:50)로 염색한 다음, PBS로 세번 씻어내고, FACS 버퍼에서 재부유시켰다. 항체 표지에 의해 결정된 유전자 발현을 FlowJo 소프트웨어를 이용한 FACS Calibur(Becton Dickinson) 상에서 FACS 분석에 의해 평가하였다.
면역형광 이미징을 위해, 세포를 무 Ca2+/Mg2+ PBS로 세번 씻어내고, RT에서 15분 동안 PBS(Gibco) 내 4%(wt/v) 포름알데하이드(Sigma-Aldrich)에서 고정시키고, PBS로 씻어내고, 이어서 0.1% Triton-X-100(Alfa Aesar)를 포함하는 PBS에서 10분 동안 투과성으로 만들었다. 세포를 PBS로 씻어내고 차단 버퍼(PBS, 3% FBS)에서 CD163에 대한 항체(토끼 pAb, abcam, ab87099, 5 μg/ml)와 함께 1시간 동안 배양시키고, 씻어 내고, 이차 염소 항-토끼 AF594 항체(A11037, 1:100), AF647 팔로이딘(A22287, 1:100), 및 DAPI(1:10,000; 모두 Life Technologies)과 함께 배양하였다. 샘플을 공초점 레이저-스캐닝 현미경(Zeiss LSM-710)을 이용하여 분석하였다.
감염된 PAM 내 RTC 형성의 면역형광 분석
PAM을 감염 하루 전에 커버슬립 상에서 시딩하였다. 세포를 37℃에서 3시간 동안 cRPMI 내 각각의 바이러스 균주(PRRSV H2, DAI, 또는 SU1-Bel)의 MOI=2에서 접종하였다. 접종물을 따뜻한 cRPMI로 교체하였다. 19hpi 세포를 상기 설명된 바와 같이 RT에서 15분 동안 PBS(Gibco) 내 4% 포름알데하이드(Sigma-Aldrich)에서 고정시키고, PBS로 씻어내고, 투과성으로 만들었다. 세포를 1시간 동안 차단 버퍼에서 PRRSV nsp2에 대한 항체(Ying Fang의 선물, 사우스 다코타 주립대학교, [74], 1:400)와 함께 배양시키고, 씻어내고, 이차 염소 항-생쥐 AF488 항체(A11029, 1:100), AF568 팔로이딘(A12380, 1:100), 및 DAPI(1:10,000; 모두 Life Technologies)과 함께 배양하였다. 샘플을 공초점 레이저-스캐닝 현미경(Zeiss LSM-710)을 이용하여 분석하였다.
결과
접합자 내 CRISPR/Cas9 편집에 의한 살아있는 CD163 SRCR5 결실 돼지(pig)의 생성
CD163 유전자는 현재 돼지(pig) 참고 게놈 서열(Sscrofa10.2)에서 정확히 나타나지 않는다[38]. 표적 시퀀싱을 통해, 돼지의 CD163 유전자좌의 구체적인 모델을 확립하였다(공개되지 않은 결과 L. Zen/A. Archibald/T. Ait-Ali) - CD163 유전자의 게놈 서열은 서열번호 1로 하기에 설정하였다. 간략히, CD163은 단백질의 SRCR 도메인을 암호하하는 것으로 예측된 엑손 2-13을 포함하는 16 엑손에 의해 암호화된다[39]. 흥미롭게도, SRCR5는 하나의 단일 엑손, 즉 엑손7에 의해 암호화될 것으로 예측된다(도 1A). 따라서, CRISPR/Cas9 게놈 편집 시스템을 이용하여 엑손 7을 잘라내기 위해 편집 전fir을 개발하였다[40,41]. 두 개의 가이드 RNA의 조합, 인트론 5' 내지 엑손 7에 위치한 하나와 엑손 7 및 8 사이 짧은 인트론 내 하나는, 남아있는 엑손의 정확한 스플라이싱을 가능하게 하면서, 엑손 7의 결실을 생성할 것으로 예측되었다. 엑손 7 및 8 사이의 인트론의 짧은 길이(97 bp)로 인해, 프로토스페이서 인접 모티프에 상응하는 오로지 하나의 적합하게 독특한 표적화 서열(crRNA)을 확인하였다. 세 개의 후보 crRNA 서열을 엑손 7의 바로 옆 상류 영역에서 선택하였다. 선택적인 부위-특이적 뉴클레아제(예를 들어, ZFN 또는 TALEN) 또한 사용될 수 있다는 것을 알아야만 하고, 당업자는 적절한 표적 부위를 쉽게 결정할 수 있다; 특히 이러한 편집은 PAM 서열의 존재를 요구하지 않아, 따라서 표적 부위 선택에 대한 제한이 적다.
hU6 프로모터에 의해 유도된 완전한 단일 가이드 서열(sgRNA), 및 CAG 프로모터 유도 NLS-Cas9-2A-GFP를 암호화하는, px458에 근거한 플라스미드로 돼지의 신장 PK15 세포의 형질주입에 의한 절단 효율에 대해, 네 가지 서열 모두를 시험관내 평가하였다[42]. 형질주입된 세포를 GFP에 대한 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS)에 의해 분리하였고, 표적 부위에서의 절단 효율을 Cel1 측량 분석을 이용하여 평가하였다. 네 가지 가이드 중 세 가지를 예상되는 바와 같이 DNA의 절단을 지시하는 것으로 나타났다(엑손 7의 두 상류 및 하나의 하류). 이중 형질주입 분석 및 이어진 PCR 분석에 따라, 가이드 SL26 및 SL28의 조합이 CD163 유전자 내 엑손 7 결실을 효과적으로 생성한다는 것을 발견하였다(도 1B). 이러한 결과에 근거하여, sgSL26 및 sgSL28의 가이드 조합을 생체내 실험에 사용하였다.
sgRNA SL26 및 SL28을 Cas9 뉴클레아제를 암호하하는 mRNA와 함께 접합자의 세포질 내로 미세주입하였다. 편집 효율을 시험관내 배반포 단계로의 배양, 게놈 DNA 추출, 전체 게놈 증폭 및 엑손 7에 걸친 PCR 증폭에 의해, 적은 수의 주입된 접합자에서 평가하였다. 분석은 17개의 배반포 중 2개가 의도된 크기의 결실을 포함한다는 것을 밝혔고, 생어 시퀀싱은 엑손 7의 결실을 확인하였다. 편집된 배반포 B14가 의도된 결실에 더하여, 표적 부위에 25개 뉴클레오티드의 임의의 삽입 또한 있었다는 것을 나타내는 반면, 편집된 배반포 B2는 깔끔한 결실 및 이어진 sgSL26 및 sgSL28의 절단 부위의 재-결찰을 나타내었다. 전장 PCR 산물 중 어느 것도 T7 엔도뉴클레아제 분석에서 절단 부위에서의 뉴클레오티드 불일치를 나타내지 않았다. 배반포 내 편집 비율은 전체 편집 비율의 11.7%에 상응한다.
살아있는 돼지(pig)를 생성하기 위하여, sgSL26, sgSL28 및 Cas9 mRNA 주입된 24-39 접합자를 수취인 암퇘지의 난관에 이동시켰다. 총 32마리의 살아있는 새끼돼지가 태어났고, 귀 및 꼬리의 지노타이핑은 새끼돼지 4 마리가 엑손 7 결실을 가졌으면, 이는 전체의 12.5%에 상응한다는 것을 밝혔다. 의도된 엑손 7의 결실에 더하여, 네 마리 동물 중 세 마리는 아마도 비-동형접합 말단 접합 수선의 결과로서 표적 부위에 새로운 DNA의 삽입을 나타내었다. 돼지(pig) 347은 sgSL26 절단 부위에 2 bp 절단, 및 절단 부위 사이의 66 bp 삽입을 나타내었고, 돼지(pig) 346은 sgSL26 절단 부위 후 304 bp의 결실을 나타내었고, 돼지(pig) 310은 절단 부위에 짧은 9 bp 삽입(서열 TCAGTCACT을 가짐)을 나타내었다. 돼지(pig) 345는 절단 부위에 임의의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실 없이, 정확한 엑손 7의 결실을 가지는 것으로 밝혀졌다(도 9, B 및 D). 흥미롭게도, PCR 증폭은, 돼지(pig) 345 및 347이 동형접합성(두 대립유전자 모두 편집) 및 이형접합성 세포 유형 모두를 가지는 반면, 돼지(pig) 310이 편집돼지 않은 세포와 비교할 때 낮은 빈도 이형접합성(편집된 하나의 대립유전자)을 가진다는 것과 함께, 돼지(pig) 310, 345 및 347은 편집 사건에 대해 모두 모자이크성이었다는 것을 나타내었다(도 9, A 및 C).
F1 세대 돼지(pig)의 유전자형 및 표현형
완전히 동형접합성 및 이형접합성 돼지(pig)를 생성하기 위하여, 310을 345와 교배시켰다. 이러한 교배는 6 이형접합성, 2 이중대립성/동형접합성 CD163 SRCR5 결실(△SRCR5), 및 4 야생형 CD163 새끼돼지의 한배 새끼를 생산하였다(도 10). 동물의 시퀀싱은 모든 이형접합자가 345로부터 상속된 그의 편집된 대립 유전자를 가진다는 것을 밝혔다. 돼지(pig) 629는 345의 유전자형을 가진 하나의 대립유전자 및 310 유래의 다른 대립유전자와 함께 엑손 7 결실에 대해 이중대립성인 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도 630은 310 시조/부모에서 발견된 sgSL26 및 sgSL28의 절단 부위 사이에 9bp 삽입을 가진 편집된 대립유전자에 대해 동형접합성인 것으로 밝혀졌다(표 1). 이러한 동형접합성 부위가 접합자 내 유전자 전환 사건으로부터 발생된 것이라고 결론을 내린다.
평가된 F1 동물의 유전자형 및 성장
동물 ID 성별 탄생 체중 60일 체중 유형
628 수컷 1.2kg 25kg 야생형
633 암컷 1.6kg 26kg 야생형
627 수컷 1.6kg 25kg 이형접합성
634 암컷 1.3kg 27kg 이형접합성
629 수컷 1.4kg 25kg 이중대립성
630 수컷 1.6kg 27kg 동형접합성
다양한 유전자형(야생형, 이형접합성 및 이중대립성/동형접합성) 및 성별을 나타내는, 동물 627, 628, 629, 630, 633, 및 634을 추가 분석을 위해 선택하였다. △SRCR5 및 이형접합성 동물 모두의 성장 속도는 야생형 동물에 필적하였다(표 1). 혈액 샘플을 10주령에 6마리 동물 모두로부터 채취하여 에든버러 대학교, 왕립대학(Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh), 진단 실험실에서 수행한 전혈계산(full blood count)에 의해 분석하였다. 모든 동물의 혈수는 참고 값 내였다(표 1). △SRCR5 및 이형접합성 돼지(pig)의 크기, 키 및 다른 형태학적 특징들은 그 야생형 자손들에 필적하였다(도 2A).
8주령에, 폐포대식세포(PAM)를 기관지 폐포 세척(BAL)에 의해 6마리 동물 모두로부터 분리하였다. DNA를 PAM으로부터 추출하였고, PCR 및 생어 시퀀싱으로 분석하였다. PAM 유전자형은 귀 생체검사로부터 얻은 결과를 확인하였다; 각각, 628 및 633은 야생형이고, 627 및 633은 이형접합성이고, 629 및 630은 △SRCR5이었다. PCR 산물의 시퀀싱은 모든 편집 사건이 엑손 7의 완전한 결실을 야기하였다는 것을 확인하였다. 돼지(pig) 627 및 633이 하나의 대립유전자 내 sgSL26 및 sgSL28 절단 부위에서 정밀한 재-결찰과 함께 깔끔한 엑손 7의 결실을 가지는 반면, 629는 깔끔한 결실을 가진 하나의 대립유전자 및 부위간 9bp 삽입을 가진 하나의 대립유전자를 가졌고, 돼지(pig) 630은 9bp 삽입을 가진 두 대립유전자를 가졌다. RNA를 PAM으로부터 추출하였고, 올리고(dT) 대비 역전사(oligo(dT) primed reverse transcription)를 이용하여 cDNA로 전환시키고, PCR로 증폭하고, 생어 시퀀싱으로 분석하였다. 엑손 4 내지 9에 걸친 PCR 산물은 이형접합성 및 △SRCR5 동물 모두에서 예측된 315 bp 결실을 나타내었다(도 2C). 627 및 634 내 전장 및 엑손 7 결실 밴드 사이에 놓인 세번째 단편은 전장 및 엑손 7 결실 단편의 하이브리드인 것으로 확인되었다. 이는 엑손 7의 결실이 엑손 8의 정확한 스플라이스 억셉터 부위의 사용을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다. CD163 단백질의 발현을 PAM 용리물의 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 야생형 돼지(pig) 628 및 633은 전장 단백질을 예측된 크기 120kDa으로 발현시켰으나, 아마 글리코실화로 인해, 거의 150 kDa에서 운영되는 것으로 설명되며[43], 이에 따라 거의 100 kDa의 단백질 밴드는 설명된 인간 동형 CRA_a 또는 CRA_b(GenBank 참고 EAW88664.1 및 EAW88666.1)에 상응할 수 있는, 또 다른 하나의 동형의 발현을 나타낼 수도 있다. 이형접합성 동물 627 및 634는 전장 및 △SRCR5 단백질 모두를 발현시킨다(도 2D). 전장 단백질의 밴드는 정확히 더 강하였고, 이는 본 연구에서 사용된 다클론 CD163 항체에 의한 전장 유전자의 더 강한 발현 또는 전장 단백질의 증가된 결합을 나타낸다. 이를 추가로 조사하기 위하여, 유전자 발현을 PAM으로부터 추출된 RNA 상에서 RT-qPCR에 의해 정량화하고 β-액틴 발현으로 정상화하였는데, 이는 야생형, 이형접합성 및 △SRCR5 동물 사이의 전체 CD163 mRNA 발현에 유의한 차이가 없음을 입증한다(도 2E).
△SRCR5 돼지(pig)의 폐포대식세포는 완전히 분화되고 대식세포-특이적 표면 단백질을 발현시킨다
BAL에 의해 분리된 PAM을 대식세포-특이적 표면 단백질의 발현에 대해 특성화하였다. CD14 및 CD16은 단핵구에서 발현되지 않으나, 대식세포로 성숙으로 수준이 증가된다. CD16은 강하게 발현된 반면, PAM내 CD14는 정적한 수준인 것으로 발견되었다[44]. △SRCR5, 이형접합성 및 야생형 동물 유래 PAM의 CD14/CD16 염색은 다양한 유전자형 간에 관찰된 차이와 함께(데이터는 나타내지 않음), 모두 이전에 관찰되고 문서화된 수준 내이었다[45]. CD172a, 또는 SIRPa로도 알려진 것은 단핵구 및 대식세포 모두에서 높은 수준으로 발현되고[46], 모든 동물 유래 세포에서 높은 수준으로 발현되었다. PRRSV에 대한 부착 인자로 설명된 CD169[29]는 단핵구에서는 발현되지 않으나 조직 대식세포에서는 고 발현되고[47], 본 동물 유래 세포에서는 예상된 수준으로 발현되었다(데이터는 나타내지 않음). 인간에서와 같이, 돼지(pig) 내 CD163의 발현은 단핵구 및 대식세포로 제한된다. CD163은 조직 대식세포에서는 높은 수준으로 발현되나, 혈액 단핵구 및 골수-유래 대식세포 내에서는 낮은 수준으로 발현된다[48](돼지의 대식세포 마커는 [49]에서 검토됨). 야생형 및 SRCR5 결실 CD163 모두가 PAM의 표면에서 인식되었다(도 3). 이는 SRCR5 결실된 버전의 Cd163이, 클론 2A10/11 항체가 오로지 비-훤원된, 자연적 형태의 단백질을 인식하기 때문에, 적절히 폴딩되기 쉽다. 돼지(pig) 628, 633, 627, 634, 629, 630의 CD163 형광 강도의 중간값은 2.13-3.84 범위의 동형 대조 중간값과 함께, 각각, 35.9, 22.7, 26.4, 24.4, 17.9, 및 26.7이었다. 전반적으로, 그들의 유전자형에 무관하게, 모든 동물로부터 분리된 PAM은 완전히 분화되고 PRRSV 진입에 원인이 되는 기능을 가지는, CD169 및 CD163을 포함하는, 대식세포-특이적 표면 마커를 발현시킨다고 나타났다.
△SRCR5 폐포대식세포는 PRRSV 유전자형 1의 감염에 민감하지 않다
PRRSV는 유럽 및 아시아에서 첫번째로 발견된 유전자형 1 및 아메리카 및 아시아에서 발견된 유전자형 2를 포함하여, 특징적인 지리적 분포를 가진, 두 개의 상이한 유전자형을 가진다. 두 개의 유전자형은 항원성 및 병리의 중증도 모두에서 차이를 나타내고, 그들 간 >15% 게놈 차이를 가진다([50]에서 검토). 유전자형 1은 ORF7 서열 및 지리적 분포에 근거하여 세 개의 서브타입으로 추가로 나뉠 수 있고, 이에 따라 서브타입 2 및 3은 현재 동유럽으로 한정된 반면, 서브타입 1은 범유럽이다[51]. 여기서 각각 원래 UK, 리투아니아 및 벨로루시에서 분리된, 서브타입 1 균주 H2(PRRSV H2)[52], 서브타입 2 균주 DAI(PRRSV DAI)[53], 및 서브타입 3 균주 SU1-Bel(PRRSV SU1-Bel)[54]로 나타낸, PRRSV의 모든 유전자형 1 서브타입을 시험하였다.
PAM을 단일-라운드 감염에서 MOI=1에서 감염시켰다. 접종후(hpi) 19시간 후 세포를 수득하고 PRRSV-N 단백질에 대한 FITC-표지 항체로 염색하였다. 감염 수준을 FACS 분석으로 평가하였다. 모든 세 가지 바이러스 서브타입이 CD163 양성으로 분류된 감염된 세포의 98% 이상으로, 야생형 및 이형접합성 동물 내 40-60%의 감염 수준을 야기하였다. 약간 더 높은, 통계적으로 유의한 감염이 PRRSV H2 및 DAI에 감염된 이형접합서 동물에서 관찰되었다. 이에 대한 이유는 불명확하나, 아직 확인되지 않은 유전적 특징으로서, 이형접합성 동물 또는 다른 것 내 변경된 CD163 단백질 발현 프로파일을 반영할 수 있다. 반대로, 두 △SRCR5 동물(629 및 630) 유래 세포는 이러한 분석에서 감염에 대해 매우 저항성이 있는 것으로 발견되었다(도 4 A-C). 바이러스가 PAM에서 복제된 다음 다중-라운드 감염 시간 코스로 인접한 세포를 감염시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위하여 두번째 분석을 수행하였다. MOI=0.1에서 세포를 접종시키고, 상층액 샘플을 지시된 시점에 수득하였다. 바이러스 RNA를 상층액으로부터 추출하고 RT-qPCR에 의해 분석하였다. PRRSV H2 및 SU1-Bel에 대해, ORF7에 대한 특이적 프로브 및 프라이머를 이용하였다. ORF5 및 BRYT에 대한 PRRSV DAI vRNA 특이적 프라이머를 평가하기 위하여, 본 균주에 사용가능한 제한된 게놈 정보로 인해, 녹색 염료 결합을 사용하였다. 모든 야생형 및 이형접합성 동물은 유사한 수준으로 바이러스를 복제하였다. 바이러스 수준은 12hpi까지 오르기 시작하였고, 그들이 정체될 때 36 hpi까지 기하급수적으로 증가하였다. PRRSV SU1-Bel 수준은 48 hpi에 그들의 정체에 도달하였다. RT-aPCR의 검출 한계는 35의 CT 값에 상응하였는데, 이는 PRRSV H2에 대한 1E4 TCID50/ml, PRRSV DAI에 대한 1E3 TCID50/ml 및 PRRSV SU1-Bel에 대한 5E3에 상응한다. 본 다중-라운드 감염에서 △SRCR5 PAM 유래 상층액 내 바이러스성 RNA(vRNA)는 검출 한계 이상으로 증가하지 않았다(도 4 D-F). 감염성 비리온이 생산되었는지 여부를 평가하기 위하여, TCID50 분석을 세 가지 서브타입 모두가 정체에 도달한, 48 hpi에 수득된 상층액에 대해 수행하였다. 연속 희석을 1:10 희석에서 시작하였고, 이는 63 TCID50/ml의 검출 한계에 상응한다. 야생형 또는 이형접합성 기원의 PAM으로부터 생산된 바이러스는 감염성이었고, 측정된 수준은 vRNA 추출에 대해 계산된 것에 필적할만하였다. 반대로, 동형접합성 △SRCR5 PAM은 본 분석의 검출 한계에서 바이러스 생산을 뒷받침하지 않았다(도 4 G-J). 요약하면, △SRCR5 동물 유래 PAM은 고 MOI에서 PRRSV 유전자형에 의해 감염되지 않을 수 있었고, 72시간 시간 경과 후 바이러스를 복제하지 않았다.
△SRCR5 돼지(pig) 유래 말초혈액 단핵구는 CSF1-유도로 CD163-발현 대식세포로 분화되고, 대식세포-특이적 마커를 발현시킨다
단핵구의 CD163-발현 대식세포로의 발현 잠재성을 평가하기 위하여, 전혈로부터 말초혈액 단핵구(PBMC)를 분리한 다음, 그들을 7일 간의 CSF1-유도에 의해 대식세포로 분화시켰다. 대식세포 특이적 마커의 발현을 면역형광 표지 및 FACS 분석으로 평가하였다. CD14 및 CD16 수준은 분화시 현저히 증가하는 둘 다의 수준과 함께, 말초혈액 단핵구의 분화에 대한 분명한 지표이다[44,46]. 그의 대식세포 마커로서의 역할이 상기 논의된 CD172a, CD169 및 CD163에 더하여, CD203a로도 알려진, PBMC 분화 마커, SWC9, 및 추정 PRRSV 부착 인자 CD151을 포함시켰다[55,56].
△SRCR5, 이형접합성 및 야생형 동물 유래 PMBC-유래 대식세포(PMM)의 CD14/CD16 염색은, 유전자형 간 관찰된 차이 없이, 모두 이전에 관찰되고 문서화된 수준 내이었다(도 5A). 단핵구/대식세포 계통 마커 CD172a는 모든 동물에서 높은 수준으로 발현되고, CD169는 예상된 수준으로 발현되었다(도 5B). SWC9의 발현은 PMM의 완전한 분화를 강조하였다. 이전에 나타낸 CD169 발현과 함께 CD151 발현은 이러한 추정 PRRSV 부착 인자 또는 수용체 둘 다 △SRCR5 동물 유래 대식세포 상에서 여전히 발현된다는 것을 입증하였다(도 5C). PAM과 함께, 변형되지 않은 것과 △SRCR5 CD163 단백질 둘 다 PMM의 표면 상에서 검출되었다(도 5D). 돼지(pig) 628, 633, 627, 634, 629, 630의 CD163 형광 강도의 중간값은 1.88-3.79 범위의 동형 대조 중간값과 함께, 각각, 23.3, 16.7, 18.3, 16.5, 18.8, 및 17.2이었다. 이는 PAM과 비교할 때, PMM 상의 약간 더 낮은 CD163 발현 수준을 나타낸다. 전반적으로, 모든 동물 유래 PBMC는 그들의 유전자형에 무관하게 rhCSF1 유도시 PMM으로 완전히 분해된다고 나타났다. 그들은 모두 PRRSV 진입에 추정 기능을 가지는, CD169, CD151 및 CD163을 포함하는, 대식세포-특이적 표면 마커를 발현시켰다.
△SRCR5 말초혈액 단핵구-유래 대식세포는 여전히 CD163-의존적 헤모글로빈-합토글로빈 스캐빈저로서 기능한다.
PRRSV 민감성에 대한 기여에 더하여, CD163은 다양한 중요한 생물학적 기능을 가진다고 설명되어 왔다. CD163은 SRCR 도메인 2와의 연대를 통해, 미성숙 적아세포의 생존, 증식 및 분화를 향상시키는, 적아세포 결합 인자이며, CD163 발현 대식세포는 또한 노화된 그리고 기형인 적아세포를 제거한다. SRCR 도메인 3은 헤모글로빈(Hb)-합토글로빈(Hp) 스캐빈저 수용체로서 중요한 역할을 한다. 자유 Hb는 산화력이 있고 독성이다; Hp와 결합하면 대식세포 표면 상의 SRCR3에의 결합 및 뒤이은 세포내섭취를 통해 제거된다. 이는 산화적 손상을 막고, 항상성을 유지하며, 철의 재활용을 돕는다. CD163 발현 대식세포는 또한 본 과정에 관련된 SRCR5를 제외한 모든 SRCR과 함께, TNK-유사 약한 세포사멸 유도제(TNF-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)로 불리는 사이토카인의 제거에 관여하는 것으로 밝혀졌다[57]. 가용성 CD163은 혈장에서 고농도로 발견될 수 있으나, 이러한 틈새에서의 기능은 아직 알려져 있지 않다([34,58]에서 검토). 이러한 생물학적 기능을 유지하는 것은 건강한, 유전자 편집 동물의 생산에 있어 중요할 수 있다. 흥미롭게도, CD163에 할당된 생물학적 기능 중 어느 것도 SRCR5와 관련되어 있지 않다. △SRCR5 대식세포가 여전히 Hb-Hp 복합체를 취할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 다양한 시험관내 실험을 수행하였다. 시험관내 PMM 내 Hb-Hp 복합체 흡수를 과거에 광범위하게 조사하여, PMM은 CD163-의존적 방식으로 Hb 및 Hb-Hp 복합체 모두를 취할 수 있고, 헴 옥시게나아제의 유도성 형태인, 헴 옥시게나아제 1(HO-1)은 Hb-Hp 흡수에 따라 상향조절된다[59,60].
PBMC를 7일 동안의 CSF1-유도에 의해 PMM으로 분화시켰고, 이어서 PMM을 HO-1 상향조절을 자극하기 위하여 24시간 동안 Hb-Hp의 존재하에서 배양시켰다. RT-qPCR에 의해 평가된, HO-1 mRNA 상향조절은, 상이한 유전자형 사이에 유의한 차이없이, 모든 동물 유래 PMM에서 2- 내지 6-배로 증가하였다(도 6A). 웨스턴 블롯팅에 의해 HO-1 수준을 평가하기 위하여, PMM을 24시간 동안 Hb-Hp 존재하에서 배양시켰고, 환원성 램나이 샘플 버퍼를 이용하여 용리시켰고, 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. HO-1의 수준을, 로딩 대조군으로서 칼모듈린에 대한 단클론 항체와 함께, 단백질에 대한 단클론 항체를 이용하여 평가하였다. HO-1 단백질 발현은 CD163 유전자형에 무관하게, 모든 동물에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다(도 6B). Hb-Hp의 흡수를 직접 평가하기 위하여, Hb를 Alexa Fluor 488(AF488)로 표지하였다. PMM을 HbAF488-Hp와 함께 30분 동안 배양시키고 뒤이어 FACS 분석을 하였다. 배경 거짓-처리 세포 중간값이 2.41-4.74일 때, CD163 유전자형에 무관하게, HbAF488-Hp가, 각각 329, 305, 329, 366, 340, and 405 for animals 628, 633, 627, 634, 629, 및 630의 녹색 형광의 중간값과 함께, PMM에 의해 효율적으로 취해졌다(도 6C). HbAF488-Hp의 PMM으로의 흡수는 공초점 현미경에 의해 확인되었다. 추가 실험에서, PMM을 HbAF488-Hp와 함께 30분 동안 배양시키고 뒤이어 고정 및 CD163에 대해 염색하였다. HbAF488-Hp는 CD163과 명백한 공동-위치화가 없이, 구분된 자리, 아마도 엔도좀에서 발견되었다. 이러한 공동위치화의 결핍은 관찰된 대다수의 HbAF488-Hp 복합체가 이미 말의 엔도좀 및 리소좀에 위치할 수 있었기 때문에, 놀랍지 않다. 전반적으로, 이러한 데이터는 △SRCR5 동물 유래 대식세포가 헤모글로빈-합토글로빈 스캐빈저로서의 그들의 역할을 수행하는 능력을 보유한다는 것을 입증한다.
△SRCR5 동물 유래 말초혈액 단핵구-유래 대식세포는 PRRSV 유전자형 1의 감염에 민감하지 않다
PMM이 PRRSV 감염을 모니터링하고 PAM과 같이, △SRCR5 PM이 PRRSV 감염에 대해 저항성이 있는 적합한 대안이라는 가능성을 조사하기 위하여, 상기 설명된 균주에 의해 나타낸, PRRSV의 세 가지 유전자형 1 서브타입 모두로 감염성을 시험하였다.
PMM을 단일-라운드 감염에서 MOI=1에서 감염시켰다. FACS에 의해 평가된 감염 수준으로, 19 hpi 세포를 수득하고 PRRSV-N 단백질에 대한 FITC-표지 항체로 염색하였다. 세 가지 서브타입 모두는 야생형 및 이형접합성 동물에서 35-80%의 감염 수준을 나타내었다. PAM에서 관찰된 것과 같이, 약간 더 높은, 통계적으로 유의한 감염이 PRRSV H2로 감염된 이형접합성 동물에서 관찰된 반면, △SRCR5 동물 유래 세포에서는 유의한 감염이 관찰되지 않았다(도 7 A-C). 바이러스가 상이한 CD163 유전자형 유래 PMM에서 복제되는지 여부를 평가하기 위하여, 다중-라운드 감염을 수행하였다. 세포를 MOI=0.1에서 접종하ㅣ였고, 샘플을 감염의 정체 단계에 걸친 시점(PAM 감염 시간 경과 동안 확인된 24, 48 및 72 hpi)에서 수득하였다. 바이러스성 RNA를 상층액으로부터 추출하였고, RT-qPCR에 의해 분석하였다. 모든 야생형 및 이형접합성 동물은 유사한 수준에서 바이러스를 복제하였다. 흥미롭게도, PMM은 PAM 보다 더 높은 수준까지 모든 바이러스를 복제하였는데, 이는 PMM이 적합할 뿐만 아니라 사실상 PRRSV에 대한 시험관내 감염 연구에 있어서 우수한 모델이라는 점을 나타낸다. RT-qPCR의 검출 한계는 상기 설명된 바와 동일하였다. PRRSV의 복제는 △SRCR5 동물에서는 관찰되지 않았다(도 7 D-F).
△SRCR5 폐포대식세포(PAM)의 감염 정지가 복제/전사 복합체의 형성 이전에 발생한다.
PRRSV 부착 인자 CD169로 형질주입된, CD163 발현이 결핍된, 돼지의 신장 세포주 PK-15에서, 바이러스가 내재화되나 껍질벗김을 겪지 않는다고 밝혀졌다[36]. 이는 부착/내재화 인자와의 밀접한 상호작용에서 CD163이 PRRSV의 진입 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. △SRCR5 대식세포 내 감염 과정이 복제 전에 정지되는지 여부를 평가하기 위하여, PAM 세포를 MOI=2에서, 상기 설명된 균주에 의해 나타낸, 세 가지 PRRSV 유전자형 1 서브타입 모두로 접종시켰다. 접종물을 3 hpi에 제거하였고, 감염은 22 hpi까지 계속되도록 허용되었다. 세포를 고정시키고 복제 개시로 PRRSV에 의해 형성된 복제-전사 복합체에 대해 염색하였다. 이중막 소포의 형성에 관련된([61]에서 검토됨), PRRSV nsp2 단백질을 RTCdp 대한 대표적인 마커로 선택하였다. PRRSV nsp2의 존재에 대해 세포를 투과성으로 만들고 염색하였다. PRRSV에 감염된 야생형 및 이형접합성 동물 둘 다 유래의 대식세포가 서브타입에 무관하게 RTC를 형성한다는 것을 밝혔다. 그러나, △SRCR5 동물 유래 대식세포에서, RTC 형성이 관찰되지 않았다. 이는 PRRSV 감염의 진입 및 껍질벗김 과정에서 CD163의 관여를 분명히 보여준다. 그것은 또한 바이러스 또는 바이러스성 단백질이 증폭되기 전에 PRRSV 감염을 파기하는 효과적인 방법으로서 SRCR5의 결실을 뒷받침한다(도 8).
토론
본 연구의 결과는 CD163 SRCR5 결실을 갖는 살아있는 돼지(Pig)가 건강하고 단백질의 주요한 생물학적 기능을 유지하는 반면, 결실이 바이러스 감염에 대해 저항성이 있는 PRRSV의 표적 세포를 제공한다는 것을 나타낸다. 접합자 내 CRISPR/Cas9 편집에 있어서 CD163의 엑손 7 옆의 두 개의 sgRNA를 이용하여, CD163 △SRCR5 유전자형을 생산하는 돼지(pig)의 게놈 유래의 상기 엑손의 절단을 달성하였다. 절단된 유전자의 발현을 cDNA의 PCR, RT-qPCR 및 CD163에 대한 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다. 야생형 CD163, 이형접합성 및 △SRCR5 동물의 폐로부터 분리된 대식세포는 완전한 분화 및 폐포 영역으로부터 분리된 대식세포의 대식세포 표면 마커 특성의 발현을 나타내었다. PAM은 PRRSV 감염의 일차 표적 세포이다. 고용량, 단일-라운드 감염 및 저용량, 다중-라운드 감염 모두에 있어서 상이한 유전자형 동물 유래 PAM의 감염 평가는 △SRCR5 돼지(pig) 유래 PAM이 감염에 저항성이 있다는 것을 시험관내 나타내었다. 유전자 편집 CD163 동물 유래 단핵구/대식세포 계통의 세포의 분화 능력을 PBMC의 분리 및 분화에 의해 추가로 확인하였다. △SRCR5 돼지(pig) 유래 PMM은 또한 PRRSV 감염에 대해 저항성이 있는 것으로 나타났다. PMM은 혈액 내 Hb-Hp 복합체에 대한 스캐빈저 역할을 하는, 중요한 생물학적 역할을 갖는다. Hb-Hp 자극에 대한 HO-1의 증가를 모니터링하기 위하여, 유전자 상향조절 분석 뿐만 아니라 형광 표지 Hb-Hp 복합체의 흡수 실험을 이용하여, 이러한 중요한 생물학적 기능이 △SRCR5 동물에서 분리된 대식세포에서 유지된다는 것을 확인하였다.
접합자 내 CRISPR/Cas9 편집을 이용하여, 엑손 7 CD163 결실을 갖는 살아있는 돼지(pig)를 생성하였다. 태어난 동물 뿐만 아니라 시험관내 배양된 배반포 모두에서, 수술 일자에 의존적으로, 편집 효율은 매우 다양하였고, 이에 따라 전체 수가 낮을 것이라고 간주될 필요가 있다. 다양한 수술 일자에 사용된 시약은 동일하였고, 수정 및 수술 시간 모두 일정하게 유지되었다. 그러나, 고도로 숙련된 사람 및 기술 재현성을 필요로 하는 게놈 편집 과정에 많은 요소가 있다. 접합자 내 게놈 편집에 대한 핵산 운반 방법의 최근 발전은 게놈 편집 과정을 표준화할 수 있는 가능한 방법을 제공할 수 있다. 다양한 그룹은 최근 투명대의 제거 없이 생쥐 및 쥐에서 분리된 접합자로의 CRISPR/Cas9 시약의 시험관내 전기천공법에 의한 성공적인 게놈 편집을 보고하였다[62-64]. 생체내 게놈 편집 시약을 전달하기 위한 전기천공법을 이용하여 타카하시(Takahasi) 등은 임신 1.6일 후 생쥐 배아에서 이러한 방법으로 큰 성공을 나타내었다[65]. 시험관내 전기천공법의 사용은 주입 과정을 표준화하고 고도로 훈련된 사람의 필요를 감소시킬 수 있다. 대안으로서, 생체내 전기천공법은 도너 동물의 필요 및 재-이식 전 접합자의 긴 처리 공정을 제거할 수 있으나, 이러한 과정은 현재 생쥐에 대해서만 개발되어 있다([66]에서 검토됨). 네 마리의 시조 동물 중 세 마리가 모자이크 패턴으로 편집된다고 밝혀졌다. 동물 310에서, 모자이크 현상은 CRISPR/Cas9 복합체의 지연된 활성으로부터 발생되어, 4- 또는 8-세포 단계에서 단일 세포 내 하나의 대립유전자의 편집을 야기한다. 동물 345 및 347에서, 초기 편집 사건은 1-세포 단계에서 하나의 대립유전자 내에서 발생하는 것으로 나타나고, 두번째 편집 사건은 2-세포 단계에서 세포 중 하나 내 두번째 대립유전자를 변형시켜, 동형접합성/이형접합성 모자이크 동물을 야기한다. 모자이크 현상은 게놈 편집자의 돼지의 접합자로의 주입을 이용한 다양한 연구에서 관찰되어 왔다[67-69]. 도입된 mRNA의 비대칭 확산은 단위생식으로 활성화된 돼지의 난모세포를 이용한 시험관내 EGFP mRNA 주입을 수행하여, 이에 따라 상대적으로 동형접합성인 형광 패턴이 관찰될 수 있었던, 사토(Sato) 등의 결과에 따르지 않는 것으로 보인다[69]. 오히려, 모자이크 현상은 몇가지 세포 분열 또는 아마도 세포 분열에 의해 유발된 지연된 mRNA 발현에 걸쳐, 활성인 상태로 유지된, Cas9 단백질/sgRNA 복합체가 원인인 것으로 보인다. 전자의 이론은 유전자형 345 및 347에 의해 뒷받침되는데, 이는 하나의 세포 단계에서 하나의 대립유전자 내 초기 편집 단계 및 2-세포 또는 4-세포 단계 세포 중 하나의 두번째 대립유전자의 편집으로부터 발달된 것일 수 있다. 접합자의 직접 주입에 의해 더욱 이중대립성인 동물을 생성하기 위하여, 더욱 활성인 시약 세트가 이로울 수 있다. 최근 연구는 Cas9/sgRNA 리보뉴클레오단백질(RNP)의 주입이 mRNA 주입 보다 더욱 효율적이라는 것을 나타낸다. 또한, RNP 주입은 시험관내 전기천공법과 조합될 수 있다[70].
F0 세대 동물 310 및 345의 교배는 야생형, 이형접합성 및 이중대립성 편집 동물을 야기하였다. 이는 모자이크 현상에도 불구하고, 두 동물 모두 생식선 이형접합성이라는 것을 나타내었다. 새끼 중 어느 것도 표준 축산 조건하에서 게놈 편집으로부터 어떠한 역효과를 나타내지 않았다. 흥미롭게도, 동물 중 하나, 630은 추정 유전자 전환 사건을 나타내었다. 대립유전자내 유전자 전환의 메커니즘을 근거로, 동형접합성 재조합이 이러한 동물에서 345의 편집된 유전자형을 나타내는 하나의 대립유전자와 310의 편집된 유전자형을 나타내는 다른 대립유전자 사이에 발생한다고 추정한다. 유전자 전환은 접합자 단계에서 발생하여, 310의 유전자형에 대해 동형접합성인 630을 제공하는 것으로 보인다([71]에서 검토됨).
PRRSV는 오로지 특정한 돼지의 대식세포 서브세트만을 감염시키는, 매우 좁은 숙주세포 굴성(tropism)을 나타낸다. 본 유전자 편집 동물 및 이들의 야생형 자손으로부터 이러한 세포를 분리하여, CD163 SRCR5 도메인의 제거가 PRRSV 감염에 대한 대식세포의 완전한 저항성을 야기한다는 것을 나타내었다. 나아가 △SRCR5 동물이 모든 유전자형 1의 모든 유럽 서브타입 감염에 대해 저항성이 있다는 것을 입증하였다. 이는 SRCR5의 표적화된 제거가 시험관내 PRRSV 감염에 대한 완전한 저항성을 달성하기에 충분하다는 것을 나타낸다. PRRSV 부착 인자 CD151 및 CD169는 여전히 △SRCR5 대식세포에서 발현되어, 이러한 단백질은 PRRSV 감염에 대해 충분하지 않다는 것을 분명히 나타낸다. △SRCR5 동물 유래 대식세포에 대한 PRRSV 감염은 복제 전사 복합체의 형성 전에 중단되어, CD163이 PRRSV 복제 주기의 진입 또는 껍질벗기 단계에 관여한다는 것을 입증한다. △SRCR5 대식세포는 실생활에서 이 과정을 상세히 연구할 수 있는 새로운 도구를 제공할 것이다.
Suidae 상과 내 CD163의 유전적 변이가 있을 수 있으므로, 와트호그(Phacocherus africanus) PMM의 PRRSV 감염에 대한 민감성을 평가하기 위한 시험관내 대조 실험을 수행하였다. 흥미롭게도, 와트호그 PMM은 돼지(pig) PMM과 같이 모든 PRRSV 유전자형 1 서브타입 감염에 대해 민감성인 것으로 밝혀졌다. 그들 모두는 유사한 속도로 필적할만한 역가로 바이러스를 복제하였다(데이터는 나타내지 않음). 이는 Suidae 상과 내 CD163의 유전적 변이가 아마도 매우 제한적이며 PRRSV 감염이 확산될 것이라는 것을 나타낸다. 이는 또한 바이러스가 아프리카계 돼지(pig) 사육 국가에 대한 위협을 제기한다는 것을 나타낸다. △SRCR5 동물은 이미 설명된 PRRSV 감염에 대해 저항성인 유전자 편집 동물을 넘어 몇가지 이점을 가진다. 위트워스(Whitworth) 등은 CD163 유전자의 엑손 3의 미숙 종결 코돈을 가진 동물을 생성하여, 그에 따라 CD163 발현의 제거를 야기하였다[37]. 이와 반대로, 생체내 게놈 편집 도구의 특정한 적용이 CD163의 엑손 7의 정밀한 결실을 가진 동물을 효과적으로 생성하는데 사용될 수 있고, 이러한 동물은 자연적 구조의 특정한 분화된 대식세포의 표면 상 CD163 단백질의 잔여물의 발현을 보유한다는 것을 입증하였다. 나아가 이러한 △SRCR5 동물 유래 대식세포가 CSF-1 첨가에 의해 분화되도록 자극된 PBMC 뿐만 아니라 PAM 모두에서 완전한 분화 잠재성을 보유하며, 편집된 동물 유래 대식세포가 헤모글로빈/합토글로빈 흡수와 같은, CD163 발현과 관련된 중요한 생물학적 기능을 수행하는 능력을 보유한다는 것을 나타내었다. 전반적으로, 본 연구는 표적화된 유전자의 생물학적 기능을 보유하면서, PRRSV 감염에 대해 저항성이 있는 돼지(swine)을 제공하기 위한 표적화된 게놈 편집 접근법을 활용하는 것이 가능하다는 것을 입증한다. 돼지 사육에 CD163 SRCR5 결실 동물의 도입은 PRRSV 감염과 관련된 경제적 손실을 현저히 감소시킬 수 있다.
인트론 6 내 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화
CD163의 SRCR5 도메인을 결실시키기 위한 대안적인 전략은 CD163 유전자의 엑손 7의 5' 말단에 위치한 스플라이스 억셉터 부위를 비활성화시키는 것이다.
엑손 7 내 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화는 많은 방법으로 달성될 수 있고, 두 가지 적합한 전략을 하기 간략히 논하는데, 하나는 비-상동 말단 부착(NHEJ)이 뒤따르는 이중 가닥 절단 발생과 관련되고, 다른 하나는 상동직접수선(HDR)을 이용한다. 첫번째 옵션은 적합하게는 표적 세포에 의한 단일 가이드 RNA 및 NHEJ를 이용한다. 두번째 접근, HDR을 이용하여, 서열 변형을 도입하기 위한 세포의 이중가닥 절단 수선 기구에 의해 사용되는, 주형이 제공된다. 그에 따라 몇몇 뉴클레오티드는 표적화된 방식으로 스플라이스 억셉터 부위를 파괴하기 위해 교체되고, HDR 사건이 발생된다는 편리한 확인을 위해 허용되는 제한 부위(예 NcoI)를 도입할 수 있다.
돼지(pig) 배아 내 편집 사건 및 편집된 배아로부터의 동물의 생성을 달성하기 위한 적합한 방법론을 상기 논의하고, 이는 또한 문헌에 광범위하게 논의되어 있으며, 따라서 간결성을 위해 여기서 반복하지 않는다.
CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집의 경우, 스플라이스 억셉터 부위를 표적화하기 위한 적합한 가이드 RNA 서열은 다음과 같다:
sgRNA 1: AACCAGCCTGGGTTTCCTGT (서열번호 12)
sgRNA 2: CAACCAGCCTGGGTTTCCTG (서열번호 13)
이러한 두 가지 가이드 서열은 다음의 Cas9에 의한 엑손 7의 5' 말단의 서열에서 이중 가닥 절단 부위의 도입을 야기한다:
ACA|GGAAACCCAGGCTGGTT (서열번호 14) - sgRNA 1 사용
CAG|GAAACCCAGGCTGGTTG (서열번호 15)- sgRNA 2 사용
접근 1 - NHEJ
sgRNA1 또는 2의 Cas9과의 RNP 복합체는 CD163의 유전자의 표적 부위에 결합하고 이중-가닥 절단을 야기한다. 절단이 NHEJ 사건 발생을 야기하여, 일반적으로 결실 사건이 발생되고 삽입된다. 삽입 또는 결실 사건이 인트론 6 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화를 야기할 가능성이 크다. 그것은 단순히 그 후 스플라이스 억셉터 부위의 필수적인 불능화를 갖는 배아를 확인하는 문제이다.
접근 2 - HDR
다시, sgRNA1 또는 2의 Cas9과의 RNP 복합체는 CD163의 유전자의 표적 부위에 결합하고 이중-가닥 절단을 야기한다. 그러나, 이 경우, 예를 들어, 단일 또는 이중 가닥 DNA 분자에 대해, HDR 주형이 제공되는데, 이는
AATGCTATTTTTCAGCCCACAGGAAACCCAGG(서열번호3)
:에서
AATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGG(서열번호4)
:로 CD163 유전자 내 서열의 변화를 야기하는 서열을 포함한다.
적합한 HDR 주형은 다음 서열을 갖는다:
GAAGGAAAATATTGGAATCATATTCTCCCTCACCGAAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGGGACATTCCCTGCTCTGGTC(서열번호 16 - 소문자는 변경되지 않은 서열과 ㅂ비비교하여 만들어진 변화를 나타낸다).
CD163 전후에서 전환된 서열은 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화 및 NcoI 제한 분위의 도입을 야기한다. NcoI 부위의 존재는 바람직한 HDR 편집이 달성되는 배아/동물의 확인을 촉진한다.
추가 실험 작업
△SRCR5 CD163 돼지(pig)에 대한 접합자 내 게놈 편집 및 유전자형으로 균일한 F2 세대에 대한 사육
단백질의 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 도메인 5(SRCR5)를 암호화하는, CD163 유전자 내 엑손 7의 결실을 갖는 시조 세대 F0 동물을 상기 설명된 바와 같이 CRISPR/Cas9 유전자 편집으로 생성하였다(75 또한 참조). 그러므로, 엑손 7 옆의 CRISPR/Cas9-매개 이중가닥 절단(DSB)을 달성하기 위하여 Cas9 mRNA와 조합하여, 두 가지 가이드 RNA, sgSL26 및 sgSL28을 접합자에 미세주입하였다. 뒤이은 DSB 수선은 엑손 7의 결실을 유발한다(도 11A). 이형접합성 시조 동물 및 야생형 돼지(pig)와의 사육은 이형접합성 및 이중대립성 편집 동물의 첫번째 세대(F1 세대)를 만들었다. 이러한 단계에서, 추가 사육을 위한 sgSL26 및 sgSL28의 절단 부위에서, "깔끔한" 결찰을 나타내는, 즉 이러한 부위에서 임의의 삽입 또는 결실이 없는, 이형접합성 F1 동물을 선택하였다. 절반-자손 이형접합성 동물 및 야생형 동물을 "깔끔한-절단" 유전자형을 갖는 동형접합성 △SRCR5 동물의 계통(도 11A) 및 유사한 유전적 배경을 갖는 야생형 자손 및 반(semi)-자손 동물을 생산하기 위해 사육하였다.
이미 설명한 바와 같이, △SRCR5 동물은 야생형 자손과 동등한 수준에서 △SRCR5 CD163 mRNA 및 단백질을 발현시킨다. 게다가, 자연적 구조의 △SRCR5 CD163은 각각의 항체에 의해 폐포대식세포(PAM)의 표면에서 인식된다. RaptorX를 이용한 주형-기반 단백질 구조 예측이 서브도메인의 적절한 폴딩 및 완전한 △SRCR5 CD163 단백질에 대한 이러한 발견을 확인하는지 여부를 추가로 분석하였다(39). 도 1Bdp 나타낸 바와 같이, 전장 및 △SRCR5 CD163 모두의 서브도메인 모두가 구형 구조 및 끈 위의 진주 구조를 채택하는 것으로 예측된다. 이는 △SRCR5 단백질의 적절한 폴딩 및 발현에 대한 본 발견을 뒷받침한다.
이전에, PAM 및 시험관내 분화된 말초혈액 단핵구가 돼지 생색기 호흡 증후군 바이러스 1(PRRSV-1) 및 PRRSV-2 모두의 감염에 대해 저항성이 있다는 것을 나타내었다. 지금, 생체내 PRRSV-1 감염에 대한 저항성을 평가하여 시험관내 결과를 확인하고자 하였다. 그러므로, 네 마리의 동형접합성 △SRCR5 F2 동물 및 네 마리의 야생형 자손 및 반-자손을 선택하였다. 동물을 이유기부터 공동-사육하였다. 6주령에서 특정한 무-병원체(SPF) 단위로 이동시키고 도전이 지속되는 동안 공동-사육하였다(도 11C).
△SRCR5 돼지(pig)는 정상 전혈수(whole blood count) 및 가용성 CD163 혈청 수준을 나타낸다
SPF 단위로 이동되기 전에, 혈액 샘플을 여덟 마리 돼지(pig) 모두로부터 취하여, 에든버러 대학교, 왕립 수의학 대학의 진단 실험실에서 수행된 전혈수(full blood count)로 분석하였다. 모든 동물의 전혈수는 참조 값 내였는데, 이는 좋은 일반 건강 및 감염 또는 염증의 부재를 나타낸다. 게다가, 모든 동물의 헤모글로빈 수준은 참조 값 내였는데, 이는 CD163의 헤모글로빈/합토글로빈 소거(scavenging) 활성의 정상적인 기능을 나타낸다(표 2).
SPF 단위로의 이동 전 및 PRRSV-1을 이용한 도전 0일 전에 모든 동물로부터 혈청을 수득하였다. 가용성 CD163(sCD163) 혈청 수준을, 가용성 돼지의 CD163을 인식하는, 상업적으로 이용가능한 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)를 이용하여 평가하였다. 혈청 CD163 수준은 △SRCR5 돼지(pig)에서 463.5±68.99 ng/ml, 야생형 돼지(pig)에서 433.2±69.57 ng/ml인 것으로 밝혀졌다(도 12). 이러한 수준은 인간의 sCD163 수준에 필적할만하고(예, (76)), 서로 유의한 차이는 없다.
5.5 주령에서 △SRCR5 및 야생형 새끼돼지의 전혈수 결과. 4-7 △SRCR5. 8-11 야생형 돼지(pig).
지표 4 5 6 7 8 9 10 11 단위 참조 값
WBC 22.5 24 14 15.1 12.4 19.6 26.1 14.4 x109/l 11-22
호중구(분절(segmented)) 5.85 4.8 4.62 5.889 4.64 7.252 7.83 4.32 x109/l 2-15
호중구(분절) 26 20 33 39 35 37 30 39 % 20-70
호중구(비-분절) 0 0 0 0 0 0 0 0 x109/l 0-0.8
호중구(비-분절) 0 0 0 0 0 0 0 0 % 0-4
림프구 15.3 18.72 8.82 8.305 7.564 11.76 16.182 9.36 x109/l 3.8-16.5
림프구 68 78 63 55 61 60 62 65 % 35-75
단핵구 0.675 0.48 0.42 0.755 0.496 0.588 1.044 0.576 x109/l 0-1
단핵구 3 2 3 5 4 3 4 4 % 0-10
호산구 0.675 0 0 0.151 0 0 1.044 0.144 x109/l 0-1.5
호산구 3 0 0 1 0 0 4 1 % 0-15
호염기구 0 0 0.14 0 0 0 0 0 x109/l 0-0.5
호염기구 0 0 1 0 0 0 0 0 % 0-3
RBC 6.03 6.64 6.99 6.58 6.3 6.53 7.52 6.97 x1012/l 5-9
PCV/헤마토크리트 0.384 0.391 0.383 0.388 0.382 0.39 0.429 0.421 0.36-0.43
Hb 11.5 11.9 10.9 11.8 11.6 12 13.8 12.3 g/dl 10-16
MCV 63.7 58.9 54.8 58.9 60.7 59.8 57.1 60.5 fL 50-62
MCHC 29.9 30.4 28.3 30.5 30.3 30.9 32.1 29.1 g/dl 30-36
혈소판 219 230 605 397 483 519 219 606 120-720
RDW 20.9 23.1 28.9 20.6 21 18 17 22.6
△SRCR5 돼지(pig)는 PRRSV-1 감염의 신호를 나타내지 않는다
7-8주령의 돼지(pig)에 PRRSV-1 서브타입 2 균주 BOR-57을 비강내 접종하였다(77). 일반적으로, PRRSV-1, 서브타입 2 균주의 감염은 가벼운 호흡기 증상, 상승된 체온, 광범위한 폐 병리 및 높은 바이러스혈증과 관련된다. 각 바이러스의 5E6 TCID50 0일 및 1일에 접종에 뒤이어 14일 기간 동안 도전을 수행하였다. 직장 온도, 호흡기 및 다른 잠재적 증상 및 거동을 매일 기록하였고, 혈청 샘플을 0(도전 전), 3, 7, 10 및 14(안락사 전)에 수득하였다. 체중을 0, 7 및 14(안락사 전)에 기록하였다. 도전을 수행하고 병리를 분석한 사람은 동물의 유전자형을 알지 못하였다.
△SRCR5 동물에서 체온 증가가 관찰되지 않은 반면, 야생형 동물에서는 도전 6-9일째에 직장 온도가 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(도 13A). △SRCR5 돼지(pig)의 평균 일간 체중 증가는 전체 도전 기간에 걸쳐 야생형 대응물과 비교하여 더 높았고, 7-14일에 걸쳐 현저하였다(도 13B). 단지 하나의 야생형 돼지(pig)만이 7 내지 8일째에 변화된 거동을 나타내었고, 이를 제외하고는, 호흡기 증상 또는 다른 행동 장애가 관찰되지 않았다. 바이러스성 RNA를 혈청으로부터 분리하고, DNA 단편 주형 표준을 이용하여 바이러스 수준을 정량화하였고, 알려진 감염성 바이러스 동물로부터 바이러스성 RNA를 추출하였다. 야생형 돼지(pig)는 높은 바이러스혈증을 나타내는 반면, 바이러스성 RNA는 △SRCR5 돼지(pig)의 혈청에서 검출되지 않았다(도 13C). PRRSV에 대한 항체의 존재를모든 PRRSV-1 서브타입 및 PRRSV-2에 대한 항체를 검출할 수 있는 상업적인 ELISA를 이용하여 평가하였다. PRRSV 항체는 7일부터 야생형 돼지(pig)에서 검출되었고, 10 및 14일째에 유의한 수준으로 존재하였다(도 13D). 부검시 폐를 초기에 평가하였고 세부사항 사진을 등 및 배 쪽으로 찍었다. 폐 병변의 존재에 대하여 폐에 점수를 매겼다. 그러므로, 완전한 폐 부피에 대한 각각의 폐 구역의 대략적인 기여에 근거한, 확립된 스코어링 시스템을 사용하였다(78). 야생형 동물에 대한 평균 폐 병변 점수는 △SRCR5 돼지(pig)의 0.25와 비교하여 61이었다(도 13 E & G). 폐의 샘플을 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 매립시키고, 구역으로 절단하고, 추가 분석을 위해 염색하였다. 일반적인 폐 조직을 평가하기 위하여, 샘플을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 각 돼지(pig) 유래 구역을 0-6 규모로 간질성 폐렴에 대해 평가하였다(0, 정상; 1, 가벼운 다병소성; 2, 가벼운 확산; 3, 중도의 다병소성; 4, 중도의 확산; 5, 심각한 다병소성; 6, 심각한 확산). 야생형 동물의 폐 조직 점수는 △SRCR5 돼지(pig) 폐의 0과 비교하여 평균 4이었다(도 13 E & F, 상단). PRRSV 항원의 존재를 이전에 설명된 바와 같이 PRRSV-N 단백질에 대한 두가지 상이한 항체의 혼합물을 이용하여 폐 구역 및 림프절 구역에 대한 면역조직화학법에 의해 평가하였다(79). PRRSV 항원은 △SRCR5 유래 구역에서 검출되지 않았으나, PRRSV 항원은 네 가지 동물의 폐 구역 중 셋 및 야생형 동물의 네 가지 림프절 구역 중 하나에서 검출되었다(도 13 E & F, 하단).
전반적으로, △SRCR5 동물이 PRRSV-1 감염에 대해 저항성이 있다는 것으 나타내는, 감염의 신호는 큰 접종 부피 및 감염되고 탈피(shedding) 야생형 동물에의 노출에도 불구하고, △SRCR5 동물에서 검출되지 않았는데, 이는 PRRSV-1 및 PRRSV-2 모두에서 시험관내 발견된 결과를 확인한다.
△SRCR5 돼지(pig)는 PRRSV-1 감염에 대한 사이토카인 반응을 나타내지 않고 일반적으로 정상인 사이토카인 수준을 나타낸다
PRRSV-1 감염에 이어 염증 및 감염 반응을 평가하기 위하여, 20 사이토카인 패널을 돼지(pig)의 혈청 내 그들의 수준에 대하여 분석하였다. 그러므로, 상업적인 정량 항체 분석을 사용하였고, 도전 0(도전 전), 3, 7, 10 및 14일째에 혈청 샘플을 수득하였다. 전반적으로, 기준치로 간주된, 0일의 사이토카인 수준은 △SRCR5 및 야생형 돼지(pig) 간에 유사하였다. 감마 인터페론에 의해 유도된 모노카인(MIG, CXCL9로도 알려짐)은 더 이상 유의한 차이가 검출되지 않는, 14일까지 야생형 돼지(pig)에서 지속적으로 더 높은 수준을 나타내는 것으로 밝혀졌다. MIG는 염증 부위에 대한 T-세포 화학유인물질이며, 조직 손상 복구에 관련된다. 야생형 동물에서, MIG는 도전 7 및 10일째에 강하게 상향조절된다(80) (도 14H). 또한, 케모카인 리간드 3-유사 1(CCL3L1)은 △SRCR5 동물과 비교할 때 야생형에서 더 높은 것으로 밝혀졌다(도 14J). CCL3L1은 염증 반응에 관련되어 있고 IL-10에 의해 하향조절된다. 야생형 동물에서, CCL3L1은 10 및 14일에 혈청에서 상승되나, 도전 기간에 걸쳐 유의한 IL-10 상승은 발견되지 않았다(도 14O). (80,81)
그렇지 않으면 인터페론 α(IFNα) 및 인터루킨-17A(IL-17A) 및 인터루킨 1 수용체 길항제(IL-1ra)의 이른 증가와 함께, 일련의 사이토카인 반응을 볼 수 있었다(도 14 A, B 및 C). 이를 접종 후(dpi) 7일부터, 바이러스혈증의 고점에서 인터루킨 4, 6 및 8(각각, IL-4, IL-6 및 IL-8)의 증가가 뒤따른다(도 14 D, E 및 F). MIG의 증가된 수준, 및 대식세포 감염성 단백질 1β(MIP-1β, CCL4로도 알려짐)은 단지 10 dpi에 일시적으로 관찰되었다(도 14 G 및 H). 도전의 마지막 기간에만, 중간의 바이러스혈증 수준으로, CCL3L1, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터루킨 12 및 1β)의 상승이 검출되었다(도 14 I, J, K, L 및 M). 야생형 동물에서 상승하는 것으로 밝혀진 모든 이러한 사이토카인에 있어서, △SRCR5 동물에서 사이토카인 반응이 관찰되지 않았다. IL-10, 형질전환 성장 인자 β1(TGFβ) 및 인터페론 γ(IFNγ)는 각 시점에서 △SRCR5 돼지(pig)의 수준과 비교할 때 야생형에서 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 야생형 동물에서 시간이 지남에 따라 현저히 변화하는 것으로 밝혀졌다(이원자 ANOVA를 이용하여 계산됨) (도 14 N, O, P). 인터루킨 18(IL-18) 수준은 야생형 동물에서 시간이 지남에 따라 현저히 감소하였으나, 각 시점에서 △SRCR5 돼지(pig)에서와 유의한 차이가 없었다(도 14Q). 혈소판 내피세포 접착 분자(PECAM1)은 △SRCR5 돼지(pig)의 수준과 비교할 때, 도전 3일째에 현저히 상승되었고, 10일째에 감소되었다(도 14R). △SRCR5 및 야생형 돼지(pig) 간, 또는 시간이 지남에 따라, 인터루킨 1α(Il-1α) 및 인터루킨 13(IL-13)의 수준에 유의한 차이는 발견되지 않았다(도 14 S 및 T).
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핵산 서열:
CD163 가이드 서열:
sgSL25 TGAAAAATAGCATTTCGGTG (서열번호 5)
CD163 유전자 절단 위치: CAC|CGAAATGCTATTTTTCA (서열번호 6)
sgSL26 GAATCGGCTAAGCCCACTGT (서열번호 7)
CD163 유전자 절단 위치: GAATCGGCTAAGCCCAC|TGT (서열번호 8)
sgSL27 GTCCTCCATTTACTGTAATC (서열번호 9)
CD163 유전자 절단 위치: GAT|TACAGTAAATGGAGGAC (서열번호 10)
sgSL28 CCCATGCCATGAAGAGGGTA (서열번호 11)
CD163 유전자 절단 위치: CCCATGCCATGAAGAGG|GTA (서열번호 11)
절단 위치는 | 기호로 나타낸다.
큰 흰 돼지(pig)의 CD163 유전자 자리의 게놈 서열(서열번호 1)
굵은 글씨 = 엑손
단일 밑줄 및 점선 밑줄 = 스플라이스 억셉터 부위 예측
이중 밑줄 = 스플라이스 도너 부위 예측
sgRNA 결합 위치 및 절단 부위는 소문자 이탤릭체로 표시하고, 상기 부위에 결합하는 특정 sgRNA 또한 표시한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
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Figure pct00004
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Figure pct00010
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Figure pct00012
<110> THE UNIVERSITY COURT OF THE UNIVERSITY OF EDINBURGH <120> SWINE COMPRISING MODIFIED CD163 AND ASSOCIATED METHODS <130> IP2243GB <150> GB 1617559.8 <151> 2016-10-17 <150> PCT/EP 2017/076460 <151> 2017-10-17 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32908 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (21960)..(22059) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 tcttcatcct attagagaca ctgctataca gcagaaattg acacaacatt gtaaatcaac 60 tatactttaa taaaataaaa aaaagaaata caagtgcttt ctacagacaa tctgcacaag 120 ttatttgtta gacatatttg attatagaat taatattaaa aggggttata acaatcaagc 180 attgataatt taattatgtt tgcctatttt actttagttt tttgacataa ctgtgtaact 240 attgcgattt ttttattcct aatgtaatta gttcaaaaca aagtgcagaa atttaaaata 300 ttcaattcaa caacagtata taagtcaata ttcccccctt aaatttttac aaatctttag 360 ggagtgtttc tcaatttctc aatttctttg gttgtttcat gtcccatatg gaagaaaaca 420 tgggtgtgaa agggaagctt actcttttga ttacttccct tttctggttg actccacctc 480 cattatgaag cctttctgta tttttgtgga agtgaaatga tttttagaat tcttagtggt 540 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ttcagacaag acagtgtcca 27240 ggcacatgtg ggtggacaat gttcagtgtc ctaaaggacc tgacacccta tggcagtgcc 27300 catcatctcc atggaagaag agactggcca gcccctcaga ggagacatgg atcacatgtg 27360 ccagtgagta tccattcttt agcgccactg ttatcttctg atctacctaa gcagaagtgt 27420 tataaccttt agataatccc tattctacct ggatgatgag attcattctc tttaatttgg 27480 tgtgcaggta ttcaggatca gtgatcattt tcccaaagac catcatgctc tgatggtctt 27540 ctcaaaagtt ctaatcagtt gcttcctccg tgaacagttg aggagcagag aatatgtaat 27600 tcagaatttg actattgaat catcccattt ttctttcaca tagtcttttg ttgcactgag 27660 tataaggaga gaagcagtca gaaagatcaa tcctgaatta tttctccatt ctacatctgt 27720 tttaaatttc aaaaaaaatt gttataggtg atttacaatg tctgtcaatt tctgctctac 27780 agcaaagtga cccagttatt tacatataca ttctttttct catattttta aaccgggaga 27840 tttctatcca cctggcagtt tgagggaatt taacattatg catttatgtt aactttattc 27900 acctgatgtt ttctaagtca tactgagatt cttatgtcca ggatggaata cacctggttt 27960 gctggaaaga catgtgcttt cataaagatg aattttggaa aaaatataaa atttaaaagt 28020 cccattaaat aagcaaagtt ttaagagatt tcaaaaaaaa tttcatctct ctcttttcct 28080 ctttgacctc ttgggcacgt tcatcttctc aaatatgatc ttggtgtttc tgacttttca 28140 gacaaaataa gacttcaaga aggaaacact aattgttctg gacgtgtgga gatctggtac 28200 ggaggttcct ggggcactgt gtgtgacgac tcctgggacc ttgaagatgc tcaggtggtg 28260 tgccgacagc tgggctgtgg ctcagctttg gaggcaggaa aagaggccgc atttggccag 28320 gggactgggc ccatatggct caatgaagtg aagtgcaagg ggaatgaaac ctccttgtgg 28380 gattgtcctg ccagatcctg gggccacagt gactgtggac acaaggagga tgctgctgtg 28440 acgtgctcag gtgagggcag agagtctgga ttgagcttgg aagctctggc agcaaagaga 28500 gggtgggcgg tgacctgcat tgggtaaaga ttggaaggtc cagcctaagg atctggtggt 28560 ggggggagac atgatgtttc agtctgaaga atgatgaaaa cctgtgttgt tacgcatggg 28620 ccttcaccga ggaaaggaac ataacttaca tgtatcctcc tgcagaggga ggaagaacta 28680 ggggattcta gttttgtgtg ggaaggagca gtttacttgg ttcaggaggc actaaaggct 28740 cagataggaa acagagatct gttccattct tactcccaga actgattctc ttctcttttc 28800 tcctacagaa attgcaaaga gccgagaatc cctacatgcc acaggtatat aaaaaagttt 28860 aagaacatgg gacccattgt ctgcattttg tggaatccct cttattaaga cattctgggt 28920 cagaagttct gaggatttga catttacttc agctatctgt tatcttaccc aagagaggga 28980 tggtaactag gaacccaggt cttttagcta agacattatc acctcttgtg atgtttactt 29040 gttctcaggt cgctcatctt ttgttgcact tgcaatcttt ggggtcattc tgttggcctg 29100 tctcatcgca ttcctcattt ggactcagaa gcgaagacag aggcagcggc tctcaggtct 29160 gaacaaaatt acggtctctc taatgtttct atgggataag aagcctctct ggataataaa 29220 acaaaaaaat tacattcaag tatcagttgg ccagaaagag ggaacctaga agaggtttaa 29280 gcagtttctc cgaaacaggg aacaagaatt cagagaagaa aaggcacatt ggctgtactg 29340 atgatacctg cactcgctat gtatgtttaa tgggggacag tagagaattg atagtttaga 29400 aggagtatgc ttatatggtt ctggatgaat cctgtatccc cccaaacatt tattttctct 29460 tactatatac ttattactaa tttaactctt ctgtcaagcc gtgtgctagg ttctgaagat 29520 ggttcagact tggatactca agtgcttttg ttttcatgga atttccagtt tagtggaaga 29580 gataaatatg taaacaaata aattgcaatg ttttattata cattcgtgtg aataaggaac 29640 aaaggaggca cagagaataa agtaattact gaaaggggaa ggggagtatc agagacttct 29700 aagtttggag gcagattttg aagacagaaa tcaaagtact gggtaagatg catttcagga 29760 aagaagaaaa atatgtacac gtgtagagaa gcttaaaaga gggcacattt gttgttttgg 29820 aggggagtac aagttgagtt aaagagagaa gtttctgtta aggctgaaga atagggaaga 29880 tacacgtagc gatgctctgt gttgcatgat aagaagagtc ggagttatta aagagtatga 29940 gataggggag tgagataggc aggcaggtcc ttagaaagtt ctgtttggaa atgggatgtc 30000 ggaggggttg aaagagaacc atatattgac aaggagagca ttttgaagta gttgtgatga 30060 aagataaaat ggactttata gtgagaatgg ctgggaaagg atagatttta tacaaatctc 30120 caatgaatta cagaagaatg ctacctgtct ttggggaaga aacagggtta tccgatggca 30180 tcctgttgcg tttgagttcg tgacatcatg agggaaaggc ttggcagcgt ttactcggta 30240 ctgtgtggta acttatatgg aaaaaaatat gagaaggaat gagtgtgtgt ataactaatt 30300 tacttagctg tatgcctgaa attaatacaa ttttataagt caactctact ccaataaaac 30360 aaacaaataa ataaataatt ttaactacct gaacaaaaaa aaaagaatgg actggagaca 30420 agtcaaaagt atggatgatg actacgttat gcttgcactg ctggggaaaa gcacacatag 30480 ggagggaacg ttttattatg acccagtccc taacctatga cctctgttat cagttttctc 30540 aggaggagag aattctgtcc atcaaattca ataccgggag atgaattctt gcctgaaagc 30600 agatgaaacg gatatgctaa atccctcagg tccgtgggtt ctttgagggc ctgtagccct 30660 ggggttcaga tcagcagctg cagttgaggt tgaggcatgc tactttgcac agcagtagaa 30720 agaaatctca actgtaatag gaagcttggg atgcatatga ggaagaaagg caagaatgaa 30780 ccacaaatta ttcttaggga agataaaaat tgcagtcatg gggagacctc tggctgagag 30840 ggccgtgatt atttctgaca gagggattat ggagtagaat atgatggctt ggaccttttt 30900 tcactaaaac aagtcagtct tctcaaaggt agtttagctt ttcatatatc tttctcagtt 30960 tcttccattc ccatttcctg ccattttcct ttctctaact tttatttatt atattttttc 31020 ctaaaagttt aaattttcta tatctttatc ccttcagaag ccatccctag tcacaggact 31080 agttttattt cccattatgt aatgcttctt tctctgtctg ttgacttcta tttagaacca 31140 gtgcactaaa tctgcctcta ggaacatacc tctgctaggt tgcaagaaat atcccattcc 31200 ccactcactc tgtgaagact caatgcttct caatattcct tacctcctga gagggacttg 31260 cctcacttct ttaatccaag ggactcgatt tttgccaaaa ctaagtcagg aaaacctaca 31320 taagacatag gaaagacttg ctgtgcttct taaaccccac tgtttgtttt cctaattgtg 31380 aacagtattt ttaaagttca aagagcttct aaggcacttg aggggagatc tgatttattt 31440 cccagtaatt attttattcc tttcagaaaa ttccaatgaa taagatggtt ttaatgatgt 31500 gggactaatt tttgtgtcta aatctcttcc tatttctgga tgaaaaaaag gagaccactc 31560 tgaagtacaa tgaaaaggaa aatgggaatt ataacctggt gaggtgagta aaaagaattt 31620 attcatcatt gctgaaaaca ggtacattcc ttttgaaagt tgggaactcc tctggtatta 31680 gaaaaaaaaa aaagaacgta tatacacata tatttccatg tctatgttta tgtttgtaaa 31740 tccatattca gaatatgcaa caacttttta taactatgac ttcagtccat cttttagtta 31800 catatatatt ctaaacaaca actattgcta agagaagctg ggtaagtaaa tgtgaataaa 31860 tcttctaaag atattacagg aagttcctgc tgcggctcag tgggttaagg acttgatgtc 31920 tttgtgaaga tgagggctcg agccctggcc tcactcagtg agttaaggat ctagcattgc 31980 tgtaagctgc agcgtaggtt gcagatgggg ctcagatcca gtgttgctgt ggctgtggcc 32040 tcagttgcag ctctgattca acccttaggc gaggaacttc catatgcagc aaatgtggcc 32100 attaaaaaaa aacaaaaaac attataggag tcatttcata aaagagataa gacgtttcta 32160 tagttatata gtgcatactc tggtaaagat agtataggat actataggaa tatagaaagc 32220 ttgcctatga aaatttggga agattgtgga aaagacatct caaaatatgg catagaaaag 32280 aatcatatct ttgaggaaca gtaagttttt cattcaaaac cgtgtattga acatacttat 32340 ggtgacaaat ggtgtcttga gtactaaaaa ttcagtgata aaagatgctc ttgacaaaga 32400 catggctgtt gaatagaagg tctcactgtc aatgtgtggg aattatggac agcctatgtg 32460 gacacaggga atagatgaga ctctaggctg gaaggctgca ttgagcccag taatgaatgg 32520 tcctgtctga tatatttcat gctcatattt tattttaggg actattgggg aggtggtggg 32580 ctttggaaga ttaagctgag gcaagacaca atcagattgc cttttataat ttactttcag 32640 gaggaaaatc taactaaaga aaaaaagtga ataaggcaag aaacataagt tatacatcaa 32700 aaagaaaagg tagtggagtt cctgttgtgg ctcagtggtt aatgaaccct gctaggaacc 32760 atgaggttgt gggttcgatc cctggccttg ctcagtgggt taaggatcca gcgatgccat 32820 gagttgtggt gtaggtcgca gaccgtggct tgggtcccgc attgctgtgg ctatggtgtt 32880 ggctggcagc tgcagacagc tctgatta 32908 <210> 2 <211> 104 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 2 His Arg Lys Pro Arg Leu Val Gly Gly Asp Ile Pro Cys Ser Gly Arg 1 5 10 15 Val Glu Val Gln His Gly Asp Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Ser Asp 20 25 30 Phe Ser Leu Glu Ala Ala Ser Val Leu Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly 35 40 45 Thr Val Val Ser Leu Leu Gly Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly 50 55 60 Gln Ile Trp Ala Glu Glu Phe Gln Cys Glu Gly His Glu Ser His Leu 65 70 75 80 Ser Leu Cys Pro Val Ala Pro Arg Pro Asp Gly Thr Cys Ser His Ser 85 90 95 Arg Asp Val Gly Val Val Cys Ser 100 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 3 aatgctattt ttcagcccac aggaaaccca gg 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified splice acceptor site <400> 4 aatgctattt ttcggccatg gggaaaccca gg 32 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgSL25 <400> 5 tgaaaaatag catttcggtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 6 caccgaaatg ctatttttca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgSL26 <400> 7 gaatcggcta agcccactgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 8 gaatcggcta agcccactgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgSL27 <400> 9 gtcctccatt tactgtaatc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 10 gattacagta aatggaggac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgSL28 <400> 11 cccatgccat gaagagggta 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA 1 <400> 12 aaccagcctg ggtttcctgt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA 2 <400> 13 caaccagcct gggtttcctg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 14 acaggaaacc caggctggtt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 15 caggaaaccc aggctggttg 20 <210> 16 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HDR template <400> 16 gaaggaaaat attggaatca tattctccct caccgaaatg ctatttttcg gccatgggga 60 aacccaggct ggttggaggg gacattccct gctctggtc 99 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oSL46 <400> 17 accttgatga ttgcgctctt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oSL47 <400> 18 tgtcccagtg agagttgcag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer oSL6 <400> 19 aaaagcaccg actcggtgcc 20 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P0083 <400> 20 atggatctga tttagagatg aggc 24 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P0084 <400> 21 ctatgcaggc aacaccattt tct 23 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P0074 <400> 22 catggacacg agtctgctct 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P0075 <400> 23 gctgcctcca cctttaagtc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P0081 <400> 24 ccctggagaa gagctacgag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P0082 <400> 25 aaggtagttt cgtggatgcc 20 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H2 fwd <400> 26 gatgacrtcc ggcayc 16 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer H2 rev <400> 27 cagttcctgc gccttgat 18 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2 Probe <400> 28 tgcaatcgat ccagacggct t 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SU1-Bel fwd <400> 29 tctttgtttg caatcgatcc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SU1-Bel rev <400> 30 ggcgcactgt atgactgact 20 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SU1-Bel probe <400> 31 ccggaactgc gctttca 17 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DAI fwd <400> 32 ggatactatc acgggcggta 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DAI rev <400> 33 ggcacgccat acaattctta 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P0239 <400> 34 tacatgggtg acctgtctgg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer P0240 <400> 35 acagctgctt gaacttggtg 20 <210> 36 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Edited CD163 gene sequence <400> 36 attgtctcca gggaaggaca gggaggtcta gaatcggcta agcccacgta gggttaggta 60 gtca 64

Claims (44)

  1. 유전자 편집 돼지(genetically edited swine)로서, 돼지는 편집된 게놈을 포함하며, 편집은 돼지에 의해 생성된 CD163 단백질로부터 SRCR5 도메인의 결실을 야기하는, 유전자 편집 돼지.
  2. 제1항에 있어서, 돼지는 돼지에 의해 생성된 CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 편집된 게놈을 포함하고, CD163 단백질의 다른 도메인 모두가 존재하고 그 아미노산 서열은 변경되지 않은, 유전자 편집 돼지.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 편집 돼지에 의해 생성된 CD163 단백질은 실질적으로 기능성을 유지하는, 유전자 편집 돼지.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CD163 단백질은 하기 아미노산 서열이 결핍된, 유전자 편집 돼지:
    HRKPRLVGGDIPCSGRVEVQHGDTWGTVCDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSLLGGAHFGEGSGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPDGTCSHSRDVGVVCS(서열번호: 2).
  5. 제4항에 있어서, 유전자 편집 돼지에 의해 생성된 CD163 단백질은 야생형 아미노산 서열에 추가의 변화가 없는, 유전자 편집 돼지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에 의해 생성된 CD163 단백질로부터 SRCR5 도메인의 결실을 야기하는 게놈 편집에 대해 동형접합성 또는 이중대립성인, 유전자 편집 돼지.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 동물의 모든 세포는 편집된 게놈을 포함하는, 유전자 편집 돼지.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지의 게놈은 편집된 CD163 유전자로부터 생성된 성숙 mRNA로부터 SRCR5를 암호화하는 서열이 없도록 편집된, 유전자 편집 돼지.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지는 CD163 유전자의 엑손 7이 결실되어 있는 편집된 게놈을 포함하는, 유전자 편집 돼지.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CD163 유전자의 엑손 7의 5'에 위치하는 스플라이스 억셉터 부위가 비활성화된, 유전자 편집 돼지.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CD163 유전자의 엑손 1 내지 6 및 8 내지 16은 야생형 서열과 비교하여 변경되지 않은, 유전자 편집 돼지.
  12. 제11항에 있어서, 엑손 7 및 엑손 7 옆의 인트론 6 및 7 부분이 CD163 유전자로부터 결실되나, CD163 유전자의 나머지 영역에는 다른 변경이 없는, 유전자 편집 돼지.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 편집된 게놈은 인트론 6 내 스플라이스 부위 도너 서열 및 인트론 7 내 스플라이스 부위 억셉터 부위가 변경되지 않고, 기능성을 유지하도록 편집된, 유전자 편집 돼지.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈은 서열번호 1을 참고하여, 위치 10466에서 23782까지 연장된 CD163의 적어도 일부 영역이 결실되도록 편집된, 유전자 편집 돼지.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈은 서열번호 1을 참고하여, 위치 1에서 10465까지 및 위치 23783에서 32908까지의 영역이 변경되지 않도록 편집된, 유전자 편집 돼지.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈은 엑손 7이 엑손 7의 5' 말단의 5'를 연장하는, 5000개 염기, 적합하게 2000개 염기, 적합하게 1000개 염기, 적합하게 500개 염기, 적합하게 300개 염기 또는 적합하게 100개 염기와 함께 결실되도록 편집된, 유전자 편집 돼지.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈은 엑손 7이 엑손 7의 3' 말단의 3'를 연장하는, 75개 염기와 함께 결실되도록 편집된, 유전자 편집 돼지.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈은 편지된 게놈이
    a) 서열번호 1을 참고하여, 대략 위치 23060로부터 대략 위치 23760까지, 예를 들어, 위치 23065로부터 위치 23753까지;
    b) 서열번호 1을 참고하여, 대략 위치 23260로부터 대략 위치 23760까지, 예를 들어, 위치 23268로부터 위치 23753까지; 또는
    c) 서열번호 1을 참고하여, 대략 위치 23370로부터 대략 위치 23760까지, 예를 들어, 위치 23374로부터 위치 23753까지:
    연장되는 영역의 결실을 포함하도록 편집된, 유전자 편집 돼지.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 편집된 게놈은 삽입된 서열을 포함하는, 유전자 편집 돼지.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈은 서열번호 1을 참고하여, 인트론 6 내 스플라이스 억셉터 부위가 비활성화되도록 편집되도록, 위치 23378로부터 위치 23416까지 연장되는 영역이 편집된, 유전자 편집 돼지.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 6 내 스플라이스 억셉터 부위가 부분적으로 또는 전체적으로 결실되거나, 그 서열이 다른 적합한 방법으로 변경되어 더 이상 기능적이지 않은, 유전자 편집 돼지.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, AATGCTATTTTTCAGCCCACAGGAAACCCAGG(서열번호: 3)에서 AATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGG(서열번호: 4)로 서열을 변경하도록 스플라이스 억셉터 부위가 편집되고, 서열 변화는 소문자로 표시된, 유전자 편집 돼지.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 돼지는 야생형 돼지와 비교하여 PRRSV 감염에 대해 향상된 내성 또는 저항성을 가지는 것으로, 바람직하게는 동물이 PRRS 감염에 저항성이 있는, 유전자 편집 돼지.
  24. 편집이 돼지 세포 또는 배아에 의해 생산될 수 있는 CD163 단백질로부터 SRCR5 도메인의 결실을 야기하는, 유전자 편집 돼지 세포 또는 배아.
  25. 유전자 편집 돼지를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 돼지 세포를 제공하는 단계;
    b) CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 변형을 만들도록 세포의 게놈을 편집하는 단계; 및
    c) 상기 세포로부터 동물을 생성하는 단계:
    를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 변형은 CD163 유전자로부터 엑손 7의 결실 또는 CD163 유전자의 인트론 6 내 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화인, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 돼지 세포는 체세포, 배우자, 생식세포, 배우자모세포, 줄기세포(예, 전능줄기세포 또는 만능줄기세포) 또는 접합자인, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서, 돼지 세포는 단일세포 접합자이고, 방법의 단계 b)는 단일세포 단계의 접합자에서 적어도 개시되고, 바람직하게는 완료되는, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서,
    - CD163 유전자 내 적절한 표적 서열을 표적화하는 부위-특이적 뉴클레아제를 세포에 도입하는 단계;
    - 상기 부위-특이적 뉴클라아제가 상기 표적 서열에 또는 주위의 DNA에 작용하기에 적절한 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    - 그에 따라 CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 CD163 유전자 내 편집 사건을 유도하는 단계:
    를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 편집 사건은 CD163 유전자로부터 엑손 7의 결실 또는 CD163 유전자의 인트론 6 내 스플라이스 억셉터 부위의 비활성화일 수 있는, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 단계 b)는 엑손 7의 양측에 이중가닥 DNA 절단을 유도하기 위해 CD163 유전자의 엑손 7의 옆에 있는 표적 부위를 표적하는 세포에 부위-특이적 뉴클레아제를 도입하여, 그 결실을 야기하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 하나의 표적 부위는 인트론 6 내에 있고, 절단 부위는 엑손 6의 3' 말단의 스플라이스 도너 부위의 3'이고, 또 다른 하나의 표적 부위는 인트론 7 내에 있고, 절단 부위는 엑손 8의 5'의 스플라이스 억센터 부위의 5'인, 방법.
  33. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)는 CD163의 엑손 7의 상류의 표적 부위를 표적화하는 상류 부위-특이적 뉴클레아제를 세포에 도입하는 단계, 및 CD163의 엑손 7의 하류의 표적 부위를 표적화하는 하류 부위-특이적 뉴클레아제를 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제29항 또는 제30항에 있어서, 단계 b)는 인트론 6 내 스플라이스 억셉터 부위를 표적화하는 부위-특이적 뉴클레아제를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 인트론 6 내 스플라이스 억셉터 부위를 표적화하는 부위-특이적 뉴클레아제는 비-상동 말단 부착(NHEJ) 또는 상동 직접 수선(HDR)에 의해 엑손 7과 연관된 스플라이스 억셉터 부위를 비활성화하기 위해 목적하는 절단 부위에 단일 이중가닥 절단을 생성하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, HDR 주형을 제공하는 단계를 포함하는 것으로, 바람직하게는 HDR 주형은 다음 서열:
    GAAGGAAAATATTGGAATCATATTCTCCCTCACCGAAATGCTATTTTTCgGCCatggGGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGGGACATTCCCTGCTCTGGTC(서열번호:16)을 가지고, 소문자는 변경되지 않는 서열과 비교하여 만들어진 변화를 나타내는, 방법.
  37. 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 부위-특이적 뉴클레아제는 적어도 하나의 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), RNA-가이드 CRISPR/Cas 뉴클레아제(CRISPR/Cas) 또는 메가뉴클라아제를 포함하는, 방법.
  38. 제25항에 있어서,
    - 돼지 접합자를 제공하는 단계;
    - CD163 유전자 내 적합한 표적 서열을 표적화하는 부위-특이적 뉴클레아제를 접합자에 도입하는 단계;
    - 상기 부위-특이적 뉴클레아제가 상기 표적 서열에 또는 주위의 DNA에 작용하기에 적합한 조건 하에서 상기 접합자를 배양시켜, CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 CD163 유전자 내 편집 사건을 유도하는 단계; 및
    - 상기 유전자 편집 접합자로부터 동물을 생성하는 단계:
    를 포함하는, 방법.
  39. 제25항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 발생한 유전적 편집 사건을 특성화하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 유전자 편집 돼지 세포 또는 배아를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    - 돼지 세포 또는 배아를 제공하는 단계;
    - CD163 단백질로부터 SRCR5의 결실을 야기하는 게놈 편집을 만들도록 세포 또는 배아 내 세포의 게놈을 편집하는 단계:
    를 포함하는, 방법.
  41. CD163 단백질의 SRCR5 도메인의 결실을 야기하는 변형을 만들도록 돼지 내 세포의 게놈을 편집하는 단계를 포함하는, PRRSV에 대한 저항성 또는 내성을 증가시키도록 돼지를 변형하는 방법.
  42. 제25항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 동물, 세포 또는 배아, 또는 제25항 내지 제39항 또는 제41항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 동물의 후손인 동물.
  43. SRCR5 도메인이 결실된 CD163 단백질을 가지거나 발현시키는 돼지 또는 돼지의 세포.
  44. 말초 혈액 단핵구-유래 대식세포(PMM) 또는 폐포대식세포(PAM)인, 제43항에 따른 세포.
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