CN114592008A - 一种非人哺乳动物性早熟动物模型的建立方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种非人哺乳动物性早熟动物模型的建立方法及其用途，具体地，本发明提供了一种非人哺乳动物的性早熟动物模型的制备方法，该方法包括以下步骤：(a)提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的MKRN3(环指蛋白3基因，Makorin Ring Finger Protein 3)基因失活，得到MKRN3基因失活的非人哺乳动物细胞；和(b)利用步骤(a)中得到的MKRN3基因失活的细胞，制备得到MKRN3基因失活的性早熟动物模型。本发明的动物模型是一种有效的性早熟动物模型，可用于研究(a)缩短非人哺乳动物的性成熟时间；和/或(b)动物模型产生时间。

Description

一种非人哺乳动物性早熟动物模型的建立方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种非人哺乳动物性早熟动物模型的建立方法及其用途。

背景技术

猕猴和人类一样是有月经周期的单胎生殖动物，其性成熟时间在4年以上，怀孕期和哺乳期也都在半年以上，如此长的繁育周期极大地限制了基因编辑猴模型构建及相关研究工作的进度。而啮齿类动物青春期很短，在啮齿类水平上开展性早熟研究不足以揭示人类性早熟的相关机制，因此在该领域研究中猕猴具有不可替代性。

然而目前的猕猴方面的性早熟动物模型还没有相关报道。

因此，本领域迫切需要开发一种能够诱导性早熟的动物实验模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够诱导性早熟的动物实验模型。

本发明第一方面提供了一种非人哺乳动物的性早熟动物模型的制备方法，包括以下步骤：

(a)提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的MKRN3(环指蛋白3基因，MakorinRing Finger Protein 3)基因失活，得到MKRN3基因失活的非人哺乳动物细胞；和

(b)利用步骤(a)中得到的MKRN3基因失活的细胞，制备得到MKRN3基因失活的性早熟动物模型。

在另一优选例中，所述性早熟包括雄性性早熟。

在另一优选例中，所述性早熟包括儿童中枢性性早熟。

在另一优选例中，所述性早熟包括中枢性性早熟、外周性性早熟、部分性性早熟。

在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括如下步骤：

(a1)利用CRISPR基因编辑技术，将所述MKRN3基因进行剔除或中断，得到MKRN3基因失活的非人哺乳动物细胞。

在另一优选例中，利用CRISPR基因编辑技术，将所述MKRN3基因中的第一个外显子进行剔除或中断，得到MKRN3基因失活的非人哺乳动物细胞。

在另一优选例中，利用CRISPR基因编辑技术，将所述MKRN3基因中的编码区进行剔除或基因编辑，从而得到MKRN3基因失活的非人哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述CRISPR基因编辑技术包括CRISPR-Cas9基因编辑技术。

在另一优选例中，所述步骤(a1)中包括将gRNA和cas9 mRNA混合物注射至非人哺乳动物细胞的受精卵中。

在另一优选例中，所述步骤(a1)中包括将携带有gRNA和cas9 mRNA编码序列的载体转染到非人哺乳动物的受精卵中。

在另一优选例中，所述携带有gRNA和cas9 mRNA编码序列的载体是病毒载体。

在另一优选例中，所述gRNA进入到非人哺乳动物受精卵以后，能够靶向MKRN3基因，并在cas9的作用下对MKRN3基因进行编辑，导致MKRN3基因失活。

在另一优选例中，所述gRNA序列选自下组：

(i)SEQ ID NO.1和2所示的序列，或其组合；

(ii)与(i)限定的序列互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物细胞为受精卵细胞。

在另一优选例中，所述受精卵细胞处于一细胞时期。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔和/或猴、黑猩猩。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括非人灵长类动物。

在另一优选例中，所述非人灵长类动物包括猴、黑猩猩。

在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括如下步骤：

(b1)利用步骤(a)中得到的MKRN3基因失活的非人哺乳动物细胞制备得到嵌合非人哺乳动物；

(b2)将步骤(b1)中得到的嵌合非人哺乳动物和正常野生型非人哺乳动物交配繁育(比如借助辅助生殖手段)，在后代中筛选获得MKRN3基因失活的杂合子非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述将MKRN3基因失活包括基因剔除、基因中断或基因插入。

在另一优选例中，所述基因失活包括MKRN3基因不表达，或表达没有活性的MKRN3蛋白。

在另一优选例中，所述步骤(b)中得到的MKRN3基因失活的非人哺乳动物的动物模型中，与野生型对照动物相比，具有选自下组的一个或多个特征：

(t1)体重显著增加；

(t2)两侧睾丸大小显著增加；

(t3)性成熟期显著缩短。

本发明第二方面提供了一种本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，将该模型用作研究(a)缩短非人哺乳动物的性成熟时间；和/或(b)动物模型产生时间的动物模型。

本发明第三方面提供了一种试剂，包括：

(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas 13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；和

(b)gRNA或其表达载体，其中所述gRNA引导所述基因编辑蛋白特异性结合MKRN3基因的DNA或RNA。

在另一优选例中，所述gRNA的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO.1－2中任一所示的序列，或其组合。

在另一优选例中，所述gRNA的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO.1和2。

在另一优选例中，所述表达载体包括病毒载体。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、SV40、痘病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、或其组合，较佳地，所述载体为腺相关病毒(AAV)。

在另一优选例中，所述试剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述试剂的剂型为液体制剂。

在另一优选例中，所述试剂的剂型为注射剂型。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体和gRNA的表达载体为同一载体或不同载体。

在另一优选例中，所述组分(a)与组分(b)的重量比为100:1-0.01:1，较佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.1-90wt％，更佳地，1-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(b)的含量为0.0001-99wt％，较佳地，0.01-90wt％，更佳地，0.1-70wt％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)和组分(b)占所述组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

在另一优选例中，所述的组合物基本上(≥90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％)或全部由组分(a)和组分(b)构成。

在另一优选例中，所述组分(a)和组分(b)的浓度(ng/μL)比为1：1。

在另一优选例中，所述组分(a)和组分(b)的浓度(ng/μL)比为gRNA1:gRNA2:Cas9＝1:1:2(50ng/μL:50ng/μL:100ng/μL)。

在另一优选例中，所述组合物为制备诱导非人哺乳动物性早熟动物模型的组合物。

在另一优选例中，所述动物模型包括敲除MKRN3基因的杂合的动物模型。

本发明第四方面提供了一种分离的细胞，所述的细胞中的MKRN3基因失活。

在另一优选例中，所述细胞为经本发明第二方面所述的组合物处理的细胞。

另一优选例中，所述细胞的基因组中MKRN3基因转录本的第1个外显子切除。

另一优选例中，所述细胞包括体细胞、生殖细胞和/或胚胎干细胞。

另一优选例中，所述细胞选自人、和/或非人哺乳动物的细胞。

另一优选例中，所述胚胎干细胞还包括少于14天的胚胎、和/或受精卵。

另一优选例中，所述细胞选自人或非人哺乳动物，较佳地，包括啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔和/或猴、黑猩猩。

另一优选例中，所述细胞为人或非人哺乳动物的受精卵。

本发明第五方面提供了一种非人哺乳动物模型，用本发明第一方面所述方法制备。

在另一优选例中，对于MKRN3基因失活而言，所述的非人哺乳动物模型是杂合的或纯合的。

本发明第六方面提供了一种细胞的用途，所述细胞中的MKRN3基因失活，用于制备构建非人哺乳动物的性早熟动物模型的生物制剂。

在另一优选例中，所述生物制剂为液态制剂。

本发明第七方面提供了一种MKRN3基因或其蛋白的失活剂的用途，用于制备构建非人哺乳动物的性早熟动物模型的制剂。

在另一优选例中，所述失活剂包括抑制剂。

在另一优选例中，所述失活剂选自下组：抗体、小分子化合物、核酸、或其组合。

在另一优选例中，所述的MKRN3基因或其蛋白的失活剂选自：

(i)靶向MKRN3基因的gRNA；

(ii)携带有gRNA编码序列的载体；

在另一优选例中，所述载体为病毒载体。

本发明第八方面提供了一种MKRN3基因失活剂，所述基因失活剂为gRNA，所述gRNA序列选自下组：

(i)SEQ ID NO.1－2中任一所示的序列，或其组合；

(ii)与(i)限定的序列互补的多核苷酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了与同龄野生型对照猴相比，0183#体重身长明显更高大。

图2显示了与同龄野生型对照猴相比，0183#在发育过程中体重一直保持较高，且体重增长趋势明显，2岁半时的体重已接近性成熟的体重。

图3显示了0183#与同龄对照猴右侧睾丸发育情况对比；正常野生型猴一般在4岁后进入性成熟期，此时性器官(睾丸)会有明显的增长趋势，而0183#在2岁多时，睾丸就已接近性成熟时的大小。

图4显示了0183#与同龄对照猴左侧睾丸发育情况对比；正常野生型猴一般在4岁后进入性成熟期，此时性器官(睾丸)会有明显的增长趋势，而0183#在2岁多时，睾丸就已接近性成熟时的大小。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，建立了一种遗传稳定、表型稳定的性早熟动物模型，它是MKRN3基因被剔除或失活的非人哺乳动物。本发明的动物模型是一种有效的性早熟动物模型，可用于研究(a)缩短非人哺乳动物的性成熟时间；和/或(b)动物模型产生时间。在此基础上完成了本发明。

MKRN3基因

环指蛋白3(makorin ring finger protein 3,MKRN3)基因位于Prader-Willi综合征关键区域的染色体15q11.2上，仅有外显子，不含内含子，是一种母系印记基因。MKRN3基因家族用特定的锌指基序阵列编码核糖核蛋白。MKRN3蛋白具有2个N末端C3H锌指模体，1个MKRN特异性Cys-His结构域，1个C3H4 RING锌指模体和1个C末端C3H锌指模体。该蛋白参与细胞信号转导过程及蛋白质的泛素化过程。近年来，MKRN3基因已被确定为导致中枢性性早熟的易感基因，该基因的缺失突变会导致垂体-下丘脑-性腺轴(HPG)过早激活，但目前关于它的具体功能以及突变是如何导致中枢性性早熟的研究还不明确。

食蟹猴(Macaca fascicularis)的MKRN3基因(Gene ID:102124068)与人的MKRN3基因同源度约为97％，蛋白同源度约为94％。

应理解，术语“MKRN3”还包括各种天然存在的MKRN3基因的野生型和变异形式。代表性的例子包括：因密码子的简并性而编码与野生型相同的MKRN3蛋白的核苷酸序列，编码野生型MKRN3蛋白的保守性变异多肽的核苷酸序列。此外，对于猴(食蟹猴)之外的其他灵长类动物时，该术语指MKRN3基因在该灵长类动物中的同系物。例如对于人而言，该术语指人的MKRN3(已知猴(食蟹猴)MKRN3基因与人类MKRN3基因的cDNA同源度约为97％，氨基酸序列的同源度约为94％)。

MKRN3基因或其蛋白的失活剂

在本发明中，所述MKRN3的失活剂包括全部失活或部分失活。

本发明的MKRN3蛋白的失活剂包括(a)抑制剂，所述抑制剂的例子包括(但并不限于)：小分子化合物、抗体、反义核酸、miRNA、siRNA、或其组合；(b)MKRN3基因的敲除剂；(c)靶向(c)靶向MKRN3基因的gRNA、携带有gRNA编码序列的载体、或其组合。

在一个优选例中，MKRN3基因的失活剂为gRNA，所述gRNA选自下组：

(i)SEQ ID NO.1-2中任一所示的序列，或其组合；

(ii)与(i)限定的序列互补的多核苷酸。

性早熟

性早熟是指女孩8岁、男孩9岁以前呈现第二性征。男孩女孩均会出现身高和体重过快增长，女孩具体表现为乳房发育，阴毛、腋毛出现，月经来潮等；男孩表现为睾丸容积增大，阴茎增长增粗，胡须、阴毛出现等。

基因失活

对于功能未知基因的研究可采用许多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所得的遗传修饰的表型变化，进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联，从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因中断或基因插入的方式来完成。其中，基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非常强有力的手段。

如本文所用，术语“基因失活”、“基因敲除”可互换使用，指通过对某一目的基因进行中断、敲除等遗传操作，从而使得该目的基因的表达和/或活性大幅下降甚至完全丧失。

动物模型

在本发明中，提供了一种非常有效的性早熟的非人哺乳动物模型。

在本发明中，非人哺乳动物的例子包括(但并不限于)：小鼠、大鼠、兔、猴、黑猩猩等，较佳地，猴和黑猩猩，更佳地，食蟹猴、狨猴、猕猴。

如本文所用，术语“MKRN3基因失活”包括一个或两个MKRN3基因被失活的情况，即包括MKRN3基因杂合地和纯合地失活。例如，MKRN3基因失活的非人哺乳动物，比如猴可以是杂合或纯合的。

在本发明中，可基因剔除或转入外源基因(或片段)而使MKRN3基因失活等方法制备MKRN3基因失活的非人哺乳动物(如猴)。在本领域中，通过基因剔除或转入外源基因而使靶基因失活的技术是已知的，这些常规技术都可用于本发明。

在本发明的另一优选例中，MKRN3基因的失活是通过基因剔除实现的。

在本发明的另一优选例中，MKRN3基因的失活是通过MKRN3基因中插入外源基因(或片段)而实现的。

用本发明方法获得的纯合或杂合的非人哺乳动物，比如猴可育。失活的MKRN3基因可以孟德尔规律遗传给后代非人哺乳动物，比如猴。

在一优选例中，本发明提供了一种缺失MKRN3基因的纯合模型动物。

基因编辑器

在本发明中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。在一优选实施方式中，本发明的基因编辑器包括基因编辑蛋白和任选的gRNA。

基因编辑蛋白

在本发明中，基因编辑蛋白的核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。在本发明的一个优选例中，所述基因编辑蛋白包括，但并不限于Cas13(如CasRx)、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c。

CRISPR/Cas系统

CRISPR/Cas系统(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein)是原核生物中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫防御机制。由细菌和古生菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断进化而来。该系统能够整合外援侵入宿主的DNA片段到CRISPR位点，然后通过相应的CRISPR RNAs(crRNAs)引导Cas核酸内切酶对外源DNA序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵。CRISPR/Cas基因簇由一系列Cas蛋白(Cas1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpf1等)的编码基因和一段CRISPR序列组成，

CRISPR序列由一段前导序列(leader)、众多短而保守的重复序列区(repeat)和间隔区(spacer)组成。重复序列区含有回文序列，能够形成发卡结构。而间隔区就是被宿主俘获的外源DNA序列。这些被俘获的外源DNA序列相当于免疫系统的“黑名单”，当这些外源的遗传物质再次入侵宿主时，细菌开始转录CRISPR，形成初级转录产物pre-crRNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA，与特异的CRISPR效应蛋白形成核糖核蛋白复合体，识别并切割能与crRNA互补配对的外源DNA，造成双链断裂，引发宿主细胞的自我修复。

根据Cas基因的组成和效应蛋白的数量，CRISPR被分为了2类5型，共16种亚型。1类为利用多个效应蛋白复合物干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；2类为利用单一的效应蛋白干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅱ型和Ⅴ型。目前研究和利用最广泛的为2类Ⅱ型，即为CRISPR/Cas9系统。该系统2013年在哺乳动物细胞中成功实现了基因编辑。Ⅱ型系统可以通过crRNA的引导利用单个Cas9核酸酶对DNA靶位点进行精确充分地切割。该系统操作简单，实验周期短，效率高，且广泛适用于多个物种。该系统需要设计一段特殊的引导RNA，即sgRNA(single guide RNA)，sgRNA的序列设计是在基因组序列中的PAM(NGG)区的一段20nt左右核苷酸序列。在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以对基因组实现定点切割，引起DNA双链断裂，激活细胞的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)两种修复机制，从而实现基因的敲除、随机的片段缺失或插入，或者利用特定的模板修复，从而实现对基因组的永久性修饰。

在本发明的一个实施例中，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建MKRN3基因敲除小鼠模型的gRNA，其序列包含MKRN3外显子中所有可用于设计sgRNA的序列，如SEQ ID NO.:1－2中任一所示、或其组合。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次构建了MKRN3基因被剔除或失活的非人哺乳动物，该哺乳动物可用于研究缩短非人哺乳动物的动物模型产生时间。

(2)本发明的性早熟动物模型的遗传稳定、表型稳定。

(3)用本发明方法获得的纯合或杂合的动物模型可育。

(4)本发明的性早熟动物模型表现出如下表型：体长体重性器官等发育指标提早达到性成熟时期的标准(比如，出生6个月后，体重明显重于同龄的野生型对照动物；从出生第28个月开始监测睾丸大小，从那时起，两侧睾丸大小显著增加；本发明的动物模型(比如猴)2岁多便可以采精，其精子可使母猴孕育生产健康的个体，而正常野生型动物(比如猴)一般4-5岁性成熟，才具备繁殖的能力。

(5)本发明的MKRN3敲除的非人灵长类性早熟模型，不仅可缩短猕猴的繁殖周期，减少其使用时间和数量，同时也可为临床上CPP的研究与治疗提供动物模型，进而解答相关机制问题。

(6)利用本发明MKRN3敲除猴的精子构建转基因或基因编辑猴模型，将会加速得到F1代转基因或基因编辑猴模型，对转基因或基因编辑猴模型的广泛应用起到重要的推动作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

MKRN3基因编辑首建猴生长发育性状数据采集：

通过常规体检检测记录MKRN3基因编辑首建猴的体重、生殖器官变化等指标，确定生长曲线和公猴首次出现成熟精子时间，进而对其性成熟时间做出判定。

性早熟公猴辅助生殖实验：

采集性成熟的MKRN3公猴精子，与野生型猴卵子进行辅助生殖实验，检验MKRN3基因编辑首建猴的生殖能力。

分子遗传检测取样：

采集所需要检测的猴子组织样品(如皮肤、血液、耳尖等)，对实验猴进行局部麻醉(普罗卡因，0.5％-1％)，后在取样处刮毛，喷酒精消毒，用灭菌消毒后的手术剪迅速剪取小块所需的皮肤或耳尖等组织，或用注射器进行采血，取样结束后迅速用棉球按压伤口止血，并奖励花生米、瓜子、苹果等零食。

MKRN3基因编辑子代猴构建：

此过程首先对MKRN3性早熟雄性猴子进行电刺激采精获得目标精子，同时对雌性供体猴进行超排和取卵等操作获得正常卵子，然后进行体外受精，挑选胚胎，对受体猴进行胚胎移植，检测受孕情况，然后对怀孕猴子进行密切观察，追踪至MKRN3基因编辑子代猴出生。

猴MKRN3基因表达谱分析：

利用平台意外死亡或安乐死的猴组织，采用定量PCR分析MKRN3基因在猴体内表达的组织定位和表达时序变化情况。

动物伦理声明：

食蟹猴的使用和护理(Macaca fascicularis)符合中国科学院上海生命科学研究院动物咨询委员会批准的名为“代基因改性的猴模型通过体细胞核移植(ION-2018002)”的指导。在这个实验中使用的猴子被安置在空调环境(温度:22±1摄氏度；湿度:50％±5％RH)，12小时光明/12小时黑暗周期(07:00到19:00)。所有饲料均采购自苏州Anmufei，每天两次，青料以水果和蔬菜为主每天补充一次。

本项目保证动物处于安全卫生且舒适的饲养环境，同时安排长期与动物相处并富有经验的实验人员进行实验操作(采血、皮肤取样、精子采集、超排取卵、胚胎移植等)，避免实验动物在以上实验过程中产生紧张和恐惧等不适感。

实验设计与流程：

根据食蟹猴MKRN3基因序列设计若干条sgRNA，以如下两条sgRNA为例：gcagctccctcagaagccca和aggcaggtgctgaggcagca)，分别将其与cas9组合注入若干食蟹猴受精卵中，体外培养至桑椹胚，检测sgRNA在胚胎中的切割效率，选择效率高的sgRNA组合注入发育良好的食蟹猴受精卵中，而后将发育好的胚胎植入受体母猴，待其怀孕生产。对于出生的子代进行基因型检测鉴定，最终获得MKRN3敲除的阳性个体(首建猴)。

实验结果与进展：

2017年3月24日得到两只(0182#♀；0183#♂)MKRN3基因编辑猴。雄性MKRN3基因编辑猴在接近31月龄(2019年10月5日)时首次采集到精子；雌性MKRN3猴在接近34月龄(2020年1月13日)时首次观察到月经，但后续(截止目前)未再观察到来月经情况。相对于正常野生型食蟹猴，它们第二性征出现的时间均有所提前。截止目前，平台兽医持续对它们的生长发育和体征变化(体重、生殖器官、激素等)进行监测。其中，雄性食蟹猴于2019年10月5号已开始采精，用于辅助生殖。截止目前，已获得出生MKRN3编辑阳性个体5只(目前F1代出生个体11只，其中编辑阳性的6只)，该实验目前仍在继续，对于出生的F1代阳性猴安排了兽医进行发育相关检测；孕期流产的0183#子代猴取相应组织进行检测、鉴定。

结果如表1所示，结果表明，当sgRNA1:sgRNA2:Cas9为50ng/ul：50ng/ul：100ng/ul时混合注入受精卵时，编辑效率较高。注射48枚受精卵，取发育良好的35枚胚胎进行移植，移植的12只受体中有4只怀孕，最终获得2只新生猴，且都是被编辑的。

由表1可知，该实验获得了2只编辑阳性的食蟹猴，其个体信息分别见表2；2只食蟹猴的第二性征都提前出现。

结果如图1－4所示，图1显示了与同龄野生型对照猴相比，0183#体重身长明显更高大。

图2显示了与同龄野生型对照猴相比，0183#在发育过程中体重一直保持较高，且体重增长趋势明显，2岁半时的体重已接近性成熟的体重。

图3显示了0183#与同龄对照猴右侧睾丸发育情况对比；正常野生型猴一般在4岁后进入性成熟期，此时性器官(睾丸)会有明显的增长趋势，而0183#在2岁多时，睾丸就已接近性成熟时的大小。

图4显示了0183#与同龄对照猴左侧睾丸发育情况对比；正常野生型猴一般在4岁后进入性成熟期，此时性器官(睾丸)会有明显的增长趋势，而0183#在2岁多时，睾丸就已接近性成熟时的大小。

表1

表2

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心

<120> 一种非人哺乳动物性早熟动物模型的建立方法及其用途

<130> P2020-1103

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gcagctccct cagaagccca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

aggcaggtgc tgaggcagca 20

Claims (10)

1.一种非人哺乳动物的性早熟动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的MKRN3(环指蛋白3基因，Makorin RingFinger Protein 3)基因失活，得到MKRN3基因失活的非人哺乳动物细胞；和

(b)利用步骤(a)中得到的MKRN3基因失活的细胞，制备得到MKRN3基因失活的性早熟动物模型。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述性早熟包括雄性性早熟。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中得到的MKRN3基因失活的非人哺乳动物的动物模型中，与野生型对照动物相比，具有选自下组的一个或多个特征：

(t1)体重显著增加；

(t2)两侧睾丸大小显著增加；

(t3)性成熟期显著缩短。

4.一种权利要求1所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，将该模型用作研究(a)缩短非人哺乳动物的性成熟时间；和/或(b)动物模型产生时间的动物模型。

5.一种试剂，其特征在于，包括：

(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合；和

(b)gRNA或其表达载体，其中所述gRNA引导所述基因编辑蛋白特异性结合MKRN3基因的DNA或RNA。

6.如权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述gRNA的核苷酸序列选自下组：SEQ IDNO.1－2中任一所示的序列，或其组合。

7.一种分离的细胞，其特征在于，所述的细胞中的MKRN3基因失活。

8.一种细胞的用途，其特征在于，所

述细胞中的MKRN3基因失活，用于制备构建非人哺乳动物的性早熟动物模型的生物制剂。

9.一种MKRN3基因或其蛋白的失活剂的用途，其特征在于，用于制备构建非人哺乳动物的性早熟动物模型的制剂。

10.一种MKRN3基因失活剂，其特征在于，所述基因失活剂为gRNA，所述gRNA序列选自下组：

(i)SEQ ID NO.1－2中任一所示的序列，或其组合；

(ii)与(i)限定的序列互补的多核苷酸。

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