CN116855539B

CN116855539B - 一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法

Info

Publication number: CN116855539B
Application number: CN202310881137.1A
Authority: CN
Inventors: 李奎; 牟玉莲; 黄雷
Original assignee: Zhongnong Seed Source Shenzhen Technology Co ltd
Current assignee: Zhongnong Seed Source Shenzhen Technology Co ltd
Priority date: 2023-07-18
Filing date: 2023-07-18
Publication date: 2024-06-04
Anticipated expiration: 2043-07-18
Also published as: CN116855539A

Abstract

本发明提供了一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法，属于动物育种技术领域。本发明通过基因编辑技术对猪CD163、pAPN和MSTN基因定点敲除，鉴于MSTN基因编辑后的引进商业猪种后代易出现后肢无力的畸形表型，将MSTN基因编辑引进商业猪种和MSTN基因编辑地方猪进行杂交，获得的MSTN基因编辑二元杂交猪突出廋肉型商品猪种和脂肪型地方猪种的品种特性，并保留MSTN基因编辑对猪种廋肉率和肉质改良的优势表型，将其与CD163和pAPN双基因编辑猪杂交，实现3个基因位点快速聚集。本发明成功育成抗蓝耳病、传染性胃肠炎、猪德尔塔冠状病毒病，并且瘦肉率高的优质猪新品系。

Description

一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法

技术领域

本发明属于动物育种技术领域，具体涉及一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法。

背景技术

猪的生长速度和背膘厚度是当前养猪业的重要育种目标之一，具有重要的经济价值。但是猪的生长和背膘厚性状是由不同层级的多基因控制的复杂性状，是多个基因及其产物形成的调控网络的综合作用结果。因此很难通过传统育种技术和方法实现精确的育种选择。抗病力性状改良一直以来都是猪遗传育种研究的重点，然而由于这类性状度量困难，而且遗传力相对较低，常规手段改良进展速度较缓慢。因此，在培育抗病高产优质猪新品种的过程中，需要开发新的育种方法和采用协同选育策略。

我国是世界生猪养殖量和消费最大的国家，生猪养殖不仅是我国农业经济的重要组成部分，而且对国民生活具有重大的影响。目前生猪养殖行业面临的最大问题就是猪的传染性疾病，尤其是猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)、猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis ofswine，TGE)、猪德尔塔冠状病毒病(porcine deltacoronavirus disease，PDCoVD)等疾病，该疾病传染快、致死率高，严重影响了生猪养殖的健康发展。如何将这一严重损失降到最低，是目前迫切需要解决的一个科学问题。与此同时，培育瘦肉率高、肉质优良的生猪新品种也是猪经济性状改良的重要方向。培育抗病和品质等经济性状协同改良的新品种猪种是国家的重大需求，但是也是猪遗传育种领域的重点与难点。传统的动物育种方法受到种源的限制，其过程需要耗费大量的人力、物力和财力，经历漫长的培育过程。而且不同种间的杂交很困难，育种成果很难取得突破性进展。近年来出现的TALEN和CRISPR/Cas9等新型的基因组编辑工具，大大提高了基因组编辑的效率，无需携带外源筛选标记基因，较传统打靶技术具有更高的效率和安全性，为培育新品种猪种提供了快速高效的途径。

研究表明，CD163是仅在单核细胞/巨噬细胞细胞膜上存在的跨膜蛋白分子，是清道夫受体超家族成员。CD163蛋白不仅与内源性配体结合，调节炎症反应，还能作为细菌、病毒的受体，与外源性配体结合。CD163蛋白作为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染肺泡巨噬细胞的一种关键受体，能够促进PRRSV病毒脱衣壳以及将病毒基因组RNA释放到靶细胞胞浆中，而引起致病。

pAPN蛋白名为猪氨基肽酶N(Porcine aminopeptidase N，pAPN)，是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的跨膜受体，属于Ⅱ型糖蛋白，它主要在仔猪小肠黏膜中表达量丰富，其表达量占分化肠细胞顶膜蛋白总量的8％，并且主要分布于仔猪空肠、回肠绒毛的刷状缘。pAPN蛋白在猪传染性胃肠炎病毒的感染过程中起关键作用，入侵的TGEV主要依赖于S蛋白受体结合域与pAPN蛋白的结合而最终导致猪传染性胃肠炎疾病的发生。猪德尔塔冠状病毒(porcine deltaconoravirus,PDCoV)感染猪只的临床症状与PEDV和TGEV感染后的症状类似，也有认为PDCoV主要感染猪的小肠组织的原因可能是小肠上皮细胞上大量表达pAPN。

肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)可通过抑制MyoD基因家族成员的活性负向调控肌肉组织的生长，其表达量与肌群重量的改变呈负相关。MSTN基因作为一种肌肉生长的负性调控因子，其突变可引起肌细胞的增生和肥大，从而造成肌肉质量的增加。与此同时，MSTN基因编辑猪骨骼肌中多不饱和脂肪酸占骨骼肌总脂肪酸的比例增加，即脂肪酸不饱和度提高。因此，通过抑制MSTN蛋白活性培育出具有瘦肉率和猪肉品质均提高的生猪新品种，是猪分子育种领域内的前沿和热点，应用价值巨大，市场前景广阔。

尽管目标蛋白的功能已知，但培育多种优良性状聚集的新型猪品种存在较大的困难，现有技术也没有关于同时聚合优质高产、优质且抗猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎和猪德尔塔冠状病毒病等疾病性状的猪新品种培育方法的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法，使得到的基因编辑猪对PRRSV(猪蓝耳病毒)、TGEV以及PDcoV具有抗性，同时具有骨骼肌增多和肌内不饱和脂肪酸含量提高的表型，得到一种抗蓝耳病、抗传染性胃肠炎和猪德尔塔冠状病毒病及猪肉品质高的猪新品种。

本发明提供了一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法，包括以下步骤：

用基因编辑方法分别制备F0代MSTN基因编辑大白猪、F0代MSTN基因编辑梅山猪和F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪；

将所述F0代MSTN基因编辑大白猪为父本，以F0代MSTN基因编辑梅山猪为母本进行交配，得到F1代MSTN基因编辑大梅猪；

将所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪为父本，以所述F1代MSTN基因编辑大梅猪为母本进行交配，横交固定，得到同时敲除CD163、pAPN、MSTN的基因编辑猪。

优选的，所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪的制备方法包括采用CRISPR/Cas9技术制备CD163、pAPN双基因编辑大白猪细胞，利用体细胞克隆生产F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪。

优选的，所述CD163基因的特异性gRNA如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述pAPN基因的特异性gRNA如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述F0代MSTN基因编辑大白猪、F0代MSTN基因编辑梅山猪的制备方法为利用TALEN技术分别制备MSTN基因编辑大白猪和MSTN基因编辑梅山猪细胞，利用体细胞克隆生产F0代MSTN基因编辑大白猪和F0代MSTN基因编辑梅山猪。

优选的，所述MSTN基因的第三外显子特异性识别序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。

优选的，所述横交固定后，对得到的F2代猪只进行CD163、pAPN和MSTN基因型检测；

所述检测的方法包括PCR扩增目标基因序列。

优选的，CD163基因型检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物。

优选的，pAPN基因型检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反向引物。

优选的，MSTN基因型检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的反向引物。

本发明提供了一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法，通过基因编辑技术对猪CD163、pAPN和MSTN基因进行定点敲除，从而阻断PRRSV、TGEV和PDCoV的感染途径，使猪具备抗蓝耳病、抗传染性胃肠炎和猪德尔塔冠状病毒病的抗性并且提高了骨骼肌的产量和肌内脂肪含量。具体的，MSTN基因编辑大白猪、MSTN基因编辑梅山猪的编辑位点均位于的MSTN基因的第三外显子。在这两种育种材料的制备过程中，本发明发现MSTN基因编辑大白猪的后代仔猪容易出现后肢无力的畸形表型，严重影响了个体的生长和群体的扩繁，其原因可能是在廋肉型商品猪种大白猪中进行MSTN基因编辑，使得该品种的廋肉率过高进而导致个体后肢肌无力的病理表型。为了克服这个技术障碍，本发明在脂肪型地方猪种梅山猪中开展了MSTN基因编辑，其后代仔猪未出现后肢无力的畸形表型。经过综合评估，为了突出廋肉型商品猪种和脂肪型地方猪种的品种特性，并保留MSTN基因编辑对猪种廋肉率和肉质改良的优势表型，本发明将MSTN基因编辑大白猪、MSTN基因编辑梅山猪进行杂交，获得了MSTN基因编辑大梅猪，将其与CD163和pAPN双基因编辑猪进行进一步杂交，使MSTN、CD163和pAPN基因在杂交猪中快速聚集，进而完成新品系的培育。本发明成功育成抗蓝耳病、抗传染性胃肠炎和猪德尔塔冠状病毒病及猪肉品质高的猪新品系。

附图说明

图1为本发明提供的猪品系培育技术路线；

图2为MSTN基因编辑大白猪后代出现的后肢无力情况形态图；

图3为猪70k功能位点基因芯片的测试样品SNP检出率；

图4为CD163、pAPN和MSTN基因PCR产物电泳图；

图5为CD163基因PCR产物测序峰图，注:CD163-WT：野生型猪样品，CD163(-8/-8bp)：基因编辑猪样品；

图6为pAPN基因PCR产物测序峰图，注：pAPN-WT：野生型猪样品，pAPN(-26/-26bp)：基因编辑猪样品；

图7为MSTN基因PCR产物测序峰图；注：MSTN-WT：野生型猪样品，MSTN(-2bp)，MSTN(-11bp)：基因编辑猪样品；

图8为基因编辑猪瘦肉中的脂肪酸组成和含量，注：PUFA(Polyunsaturated fattyacid，多不饱和脂肪酸)，MUFA(Monounsaturated fatty acid，单不饱和脂肪酸)，SFA(Saturated fatty acid，饱和脂肪酸)；

图9为PRRSV或TGEV攻毒试验猪肺脏、小肠组织样品HE染色结果。

具体实施方式

将所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪为父本，以所述F1代MSTN基因编辑大梅猪为母本进行交配，横交固定，得到同时敲除CD163、pAPN、MSTN的3基因编辑猪。

本发明用基因编辑方法分别制备F0代MSTN基因编辑大白猪、F0代MSTN基因编辑梅山猪和F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪。

在本发明中，所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪的制备方法优选包括采用CRISPR/Cas9技术制备CD163、pAPN双基因编辑大白猪细胞，利用体细胞克隆生产F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪。

在本发明中，所述CRISPR/Cas9技术的基因编辑载体优选为pX330-gRNA载体。所述CD163基因CDS序列(EU016226.1)全长3348bp，编码含1115个氨基酸的蛋白。所述CD163基因的编辑的位点位于CD163基因的第七外显子。针对CD163基因的第七外显子设计特异性gRNA，核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1(GGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGG)所示。基因编辑后，CD163基因失活，猪的单核细胞和巨噬细胞膜上将缺失CD163蛋白，从而阻断猪呼吸与繁殖综合征病毒对单核细胞和巨噬细胞的感染。所述pAPN基因CDS序列(MN514020.1)全长2892bp，编码含963个氨基酸的蛋白。所述pAPN基因的基因编辑位点优选为所述pAPN基因的第二外显子。针对所述pAPN基因的第二外显子设计特异性gRNA，核苷酸序列优选如SEQ IDNO:2(GCATCCTCCTCGGCGTGGCGG)所示。基因编辑后，pAPN基因失活，将阻断猪传染性胃肠炎病毒对猪肠道细胞的感染。

在本发明中，制备CD163、pAPN双基因编辑大白猪细胞的方法参见公开号CN107937345A的专利，具体为构建双基因敲除载体系统(pX330-CD163gRNA载体和pX330-pAPNgRNA载体)；将所述双基因敲除载体系统转入猪成纤维细胞中，通过筛选和鉴定获得纯合敲除CD163基因和pAPN基因的单克隆细胞。所述猪成纤维细胞为猪胎儿成纤维细胞。所述转入的方法优选通过电转染的方式转入猪胎儿成纤维细胞，通过有限稀释法筛选单克隆细胞，并鉴定所述单克隆细胞系是否为CD163基因和pAPN基因纯合敲除的阳性单克隆细胞。所述鉴定的方法优选为PCR扩增检测。所述CD163基因型检测用引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物。pAPN基因型检测用引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反向引物。

在本发明中，所述F0代MSTN基因编辑大白猪、F0代MSTN基因编辑梅山猪的制备方法优选为利用TALEN技术分别制备MSTN基因编辑大白猪和MSTN基因编辑梅山猪细胞，利用体细胞克隆生产F0代MSTN基因编辑大白猪和F0代MSTN基因编辑梅山猪。

在本发明中，所述MSTN基因的基因编辑位点优选为所述MSTN基因的第三外显子。MSTN基因CDS序列(大白猪：AF188638.1，梅山猪：NM_214435.2)全长1128bp，包括一个开放阅读框，编码含375个氨基酸的前体蛋白。所述MSTN基因的第三外显子特异性识别序列优选为如SEQ ID NO:3(CGTTACCCTCTAACTG)和SEQ ID NO:4(TGGGACTGGATTATTGC)所示。基因编辑后，MSTN基因失活，解除其对肌肉生长的抑制作用，使猪获得瘦肉率和肉质提高等特性。MSTN基因编辑大白猪细胞和MSTN基因梅山猪细胞的制备方法参见公开号CN104059877A的专利，具体为通过TALEN对猪成纤维细胞的MSTN基因第三外显子中的靶点区域进行编辑，使第三外显子提前形成终止密码子而终止表达，验证后，得到MSTN基因敲除细胞。所述验证的方法优选为PCR扩增检测。MSTN基因型检测用引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的反向引物。

在本发明中，所述体细胞克隆生产F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪、F0代MSTN基因编辑大白猪细胞或F0代MSTN基因梅山猪的方法，优选为将基因编辑细胞注入去核的卵母细胞透明带内侧，进行电融合及激活获得重构胚，并将其培养至2-4细胞期，然后将胚胎移植至代孕母猪输卵管壶腹部，进行基因编辑细胞克隆猪的生产。

得到F0代基因编辑猪后，本发明将所述F0代MSTN基因编辑大白猪为父本，以F0代MSTN基因编辑梅山猪为母本进行交配，得到F1代MSTN基因编辑大梅猪。

本发明对所述交配的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的交配方法即可。F1代MSTN基因编辑大梅猪携带了大白猪和梅山猪来源的MSTN突变等位基因。

得到F1代MSTN基因编辑大梅猪后，本发明将所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪为父本，以所述F1代MSTN基因编辑大梅猪为母本进行交配，横交固定，得到同时敲除CD163、pAPN、MSTN的基因编辑猪。

本发明对横向固定的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的横向固定的方法即可。所述横交固定后，优选对得到的F2代猪只进行CD163、pAPN和MSTN基因型检测。扩增用引物同上述验证时引物，在此不做赘述。得到的三个基因纯合突变的F2代大大梅猪即为同时敲除CD163、pAPN、MSTN的基因编辑猪。所述猪育种芯片检测的方法优选利用猪70K液相基因芯片(中农种源(深圳)科技有限公司)选育携带优势基因型的个体。所述基因编辑猪含有25％梅山猪基因组和75％大白猪基因组，既保留了地方猪种的优势表型(梅山猪高肌内脂肪含量和高繁殖性能)，又能有效避免MSTN基因编辑大白猪后代的后肢无力的情况。

下面结合实施例对本发明提供的一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN的3基因编辑猪的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN的3基因编辑猪的培育方法(见图1)

1.基因编辑猪的制备方法

1)本发明利用CRISPR/Cas9技术对CD163和pAPN基因进行编辑。本发明所用的基因编辑载体为pX330-gRNA载体。CD163第七外显子和pAPN基因第二外显子的特异性gRNA的设计和序列信息，CD163-gRNA的核苷酸序列为GGAAACCCAGGCTGGTTGGAGGG(SEQ ID NO:1)；pAPN-gRNA的核苷酸序列为GCATCCTCCTCGGCGTGGCGG(SEQ ID NO:2)。双敲大白猪成纤维细胞的制备方法详见本团队的授权专利“CN107937345A”，具体为构建靶向CD163基因和pAPN基因的CRISPR/Cas9打靶载体，具体构建方法如下：(1)人工合成CD163-gRNA和pAPN-gRNA；用限制性内切酶Bbs I对含有Cas9序列的pX330骨架载体在37℃条件下酶切2h，切胶回收线性化片段；(3)之后，将线性化片段与退火后的寡聚核苷酸在16℃连接1h，随后转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄的LB平板生长；(4)挑取单菌落扩大培养并测序。序列正确，进行扩大培养；(5)用质粒去内毒素大提试剂盒提供的方法，提取质粒，所提的质粒用于细胞的转染。将这两个载体分别命名为pX330-CD163和pX330-pAPN。同时敲除CD163基因和pAPN基因的大白猪胎儿成纤维细胞系的建立，首先细胞转染，转染前一天将原代大白猪胎儿成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。转染步骤严格按照Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。

阳性单克隆细胞系的筛选

电转48h后细胞汇合度大约为90％左右时以适宜的密度铺板，每3天更换一次培养液。铺板后的细胞大约培养10天左右，可以观察到合适大小的克隆点形成。将单克隆细胞进行扩大培养，同时取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。

阳性单克隆细胞系的鉴定

以提取的细胞基因组为模板，用Premix Taq DNA聚合酶进行PCR，所述PCR扩增引物如下所示：

其中CD163基因的引物为CD163-F：5’-AAGCCCACTGTAGGCAGAA-3’(SEQ ID NO：5)和CD163-R：5’-CCCCAGGAGGGAAACCAC-3’(SEQ ID NO：6)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；36个循环，2％琼脂糖凝胶电泳观察条带。

其中pAPN基因的扩增引物为pAPN-F:5’-TACCCAGTTCAGTGACCTTCGTC-3’(SEQ IDNO：7)和pAPN-R:5’TGCTCGGCATTCTTGTTCTTCT3’(SEQ ID NO：8)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；34个循环，2％琼脂糖凝胶电泳观察条带。

PCR产物送北京天一辉远公司测序，根据测序结果，筛选双基因同时发生移码突变的细胞系用作核移植时的供体细胞。

测序结果显示，成功的获得了多株CD163基因和pAPN基因都敲除的猪胎儿成纤维细胞系，其中部分双等位基因敲除细胞系基因型，CD163和pAPN双基因编辑的效率为6.30％。

体细胞核移植技术制备同时敲除CD163和pAPN基因的基因编辑猪的方法，具体如下：

以上述获得的阳性细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的青年猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠,手术法胚胎移植步骤为呼吸机麻醉，并伴有2％的水合氯醛维持麻醉，在手术架上仰卧绑定，腹中线做一个长约10cm的手术切口，曝露卵巢、输卵管及子宫,用胚胎移植玻璃管沿输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部－峡部结合处。胚胎移植后，技术人员注意观察其返情情况，定期用B型超声波检查受体母猪妊娠情况。

实验结果：成功获得同时敲除CD163基因和pAPN基因的基因编辑猪。

2)用TALEN技术对MSTN基因进行编辑。MSTN基因第三外显子特异性识别序列的设计及其编码基因信息详见本团队的授权专利“CN102964431A”，其中设计的识别序列如CGTTACCCTCTAACTG(SEQ ID NO:3)和TGGGACTGGATTATTGC(SEQ ID NO:4)。MSTN基因编辑大白猪和梅山猪的制备方法详见本团队的授权专利“CN104059877A”，具体如下：

A.猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast，PEF)的获得：将不同品种猪的35胎龄胚胎，去除胎儿的头、尾、四肢、内脏和骨头，将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴FBS，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用得到离体猪胎儿成纤维细胞(PEF)。2)含有MSTN基因型细胞的获得：A.质粒转入PEF细胞获得单克隆细胞针对猪MSTN基因的外显子3设计TALEN质粒对pcs2-TALE-peas-1L和pcs2-TALE-peas-1R。将SEQ ID NO:11所示的DNA分子通过NheI和SpeI酶切位点连入pCS2-FokI载体(载体购自康为世纪，货号为：CWBIOCatNo.CW2273)，从而获得重组质粒pcs2-TALE-peas-1L，该重组质粒进入细胞后，其翻译蛋白可以特异识别序列SEQ ID NO:13自5’末端第847-862位核苷酸(SEQ ID NO:3)。将SEQ ID NO:12所示的DNA分子通过NheI和SpeI酶切位点连入pCS2-FokI载体(载体购自康为世纪，货号为：CWBIOCatNo.CW2273)，从而获得重组质粒pcs2-TALE-peas-1R，该重组质粒进入细胞后，其翻译蛋白可以特异识别序列SEQ ID NO:13自5’末端第883-899位核苷酸(SEQ ID NO:4)。采用电转的方法将2.5ug重组质粒pcs2-TALE-peas-1L和2.5μg重组质粒pcs2-TALE-peas-1R通过电转化的方式共转染1×10⁶G1代(原代细胞传代后的第一代细胞称为G1代细胞)的PEF细胞，得到重组细胞。电转严格按照试剂盒和核转仪说明书操作。电转后，将得到的重组细胞30℃培养72小时，然后收集细胞。对细胞进行稀释，每个10cm培养皿铺一定数量的细胞，每2-3天换一次培养基。铺板约10天后，细胞单克隆开始形成，收集每个单克隆一半的细胞量用于基因组提取，剩下的细胞继续培养。

B.鉴定含有MSTN基因型细胞，设计用于扩增切割区域的引物对如下：MSTN-F引物：5’-TTGCTACTATTAACTCTTCTTTCA-3’(SEQ ID NO:9)；MSTN-R引物：5’-TATATTATTTGTTCTTTGCCATTA-3’(SEQ ID NO:10)。将提取上述A得到的各单克隆细胞的基因组DNA作为模板，用MSTN正向引物与MSTN反向引物组成的引物对进行PCR扩增。回收PCR扩增产物并测序，该产物涵盖MSTN基因的部分内含子2和部分外显子3。选取扩增产物中含有突变型MSTN基因的单克隆细胞为含有MSTN基因型细胞。

采用上述记载的体细胞克隆方法制备F0代MSTN基因编辑大白猪和F0代MSTN基因编辑梅山猪。

2.CD163、pAPN和MSTN基因编辑猪基础育种群的构建方法

(1)F1代CD163、pAPN和MSTN基因编辑猪的生产

以F0代MSTN基因编辑大白猪为父本，MSTN基因编辑梅山猪为母本，生产F1代MSTN基因编辑大梅猪(二元杂交猪)，携带了大白猪和梅山猪来源的MSTN突变等位基因。

以F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪为父本，F1代MSTN大梅猪为母本，生产CD163、pAPN和MSTN基因杂合突变的F1代大大梅猪。通过横交固定，获得三个基因纯合突变的F2代大大梅猪。

本品系有25％梅山猪基因组和75％大白猪基因组，既保留了地方猪种的优势表型，又能够有效避免MSTN基因编辑大白猪后代的后肢无力的情况(图2)。

实施例2

三个基因纯合突变的F2代大大梅猪的扩繁及性能测定

利用自然交配或人工授精等方式，进行横交固定，对F2代大大梅猪进行繁育，扩大基因编辑猪群体，以获得基因型和表型稳定遗传的F2代猪群。按照正常饲养管理方法进行基因编辑猪的喂养，参照猪育种方法设立野生型猪为对照，测定各个生长时期的生长速度、背膘厚度、眼肌面积等指标。通过屠宰实验，测定基因编辑猪的屠宰率，瘦肉率，脂肪含量及瘦肉脂肪酸含量等育种经济性状。并检测基因编辑猪对呼吸综合征病毒和传染性胃肠炎病毒的抵抗能力。

实施例3

分子标记辅助选育

利用针对猪70K液相基因芯片(中国农业科学院(深圳)农业基因组研究所)选育携带优势基因型的个体。芯片位点的设计基于猪整合组学数据库ISwine，包含超过1,000头猪全基因组重测序数据和鉴定到的超220,000个候选调控元件，综合考虑基因组序列特征、生物学功能、多态信息含量及单倍型特征等因素，通过滑动窗口打分策略筛选重要候选变异位点。同时考虑兼容地方猪种，包括梅山猪等品种，结合遗传聚类分析鉴定不同地方猪谱系群体特异受自然/人工选择的基因组遗传变异。提取基因编辑猪DNA，交由武汉影子基因科技有限公司进行液相基因芯片检测。各样本核心SNP检出率(有效深度大于10×)超过99.98％，说明使用猪70K功能位点基因芯片能获得更有效、更完整的变异分型结果(图3)。依据综合选择指数，构建基因组选择模型，对参考群个体进行排名，选择排名前30％个体留种。

实施例4

CD163、pAPN和MSTN基因型检测

采集野生型猪以及20头F2代基因编辑猪的耳组织，提取DNA；根据靶位点所在位置设计引物，进行PCR扩增及Sanger测序检测。引物序列分别为：

CD163-F：5’-AAGCCCACTGTAGGCAGAA-3’(SEQ ID NO:5)；

CD163-R：5’-CCCCAGGAGGGAAACCAC-3’(SEQ ID NO:6)；

pAPN-F：5’-TACCCAGTTCAGTGACCTTCGTC-3’(SEQ ID NO:7)；

pAPN-R：5’-TGCTCGGCATTCTTGTTCTTCT-3’(SEQ ID NO:8)。

MSTN-F：5’-TTGCTACTATTAACTCTTCTTTCA-3’(SEQ ID NO:9)；

MSTN-R：5’-TATATTATTTGTTCTTTGCCATTA-3’(SEQ ID NO:10)。

对扩增得到的PCR产物进行克隆测序，结果与野生型序列进行比对。

结果见图4。20头F2代基因编辑猪(1#-20#)的CD163基因在第七外显子形成了8个碱基缺失的突变(图5)；pAPN基因在第二外显子处形成了26个碱基缺失的突变(图6)，MSTN基因其中一个等位基因在第三外显子处形成了2个碱基的缺失(梅山猪基因组来源的等位基因)，在另外一个等位基因第三外显子处形成了11个碱基的缺失和1个碱基的突变(大白猪来源的等位基因)(图7)。三个基因的氨基酸序列都在打靶位点后发生了移码突变并提前终止检测其突变位点。

实施例5

生产性能测定

利用自动饲喂系统对上述获得的基因编辑猪的体重进行检测。

结果显示，与野生型猪相比，基因编辑猪达到屠宰体重日龄显著降低(基因编辑猪，152天；野生型，156天)；料重比(基因编辑猪，2.29；野生型，2.35)降低2.55％(即饲料利用率提高2.55％)。

实施例6

屠宰性能测定

将猪处死后去毛，沿耳根后缘及下颌第一条自然横褶切离寰、枕关节去头；沿前肢断离腕掌关节，后肢在跗关节内侧断离第一间褶关节处去蹄；紧贴肛门切断尾根去尾；并完成内脏分离工作，但保留板油和肾脏。沿背线中间开片成左右对称的胴体并称重。在胴体背中线肩部最厚处测量背膘厚、在最后肋骨处的背最长肌横截面测量眼肌面积，之后进行骨肉分离，分割皮、骨、肉、脂肪组织并分别称重。

实验结果：相较于野生型猪，基因编辑猪眼肌面积提高28.96％(P＜0.01)，腿臀比提高7.08％(P＜0.05)，胴体瘦肉率提高7.48％(P＜0.01)，平均背膘厚降低12.97％(P＜0.01)，剪切力降低37.92％(即肌肉更嫩)(P＜0.01)，数据详见表1。

表1基因编辑猪的屠宰性能

实施例7

瘦肉中脂肪酸测定

采集背最长肌的相应部位，肌肉样品交由北京营养源研究所分析中心进行脂肪酸的检测。检测方法按照食品脂肪酸检测国家标准执行(GB 5009.168-2016)。

实验结果：与野生型猪相比，三基因编辑猪的瘦肉中的有益多不饱和脂肪酸含量显著增加，从21.52％提高到30.99％(图8)。

实施例8

抗病性能测定

1.细胞水平检测双基因敲除对PRRSV的易感性影响

分别分离基因编辑猪和WT猪的肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)并在基因编辑猪PAMs和WT PAMs中分别接种高致病性PRRSV病毒株(MOI＝0.1)。分别于攻毒后12h、36h、60h收细胞，并提取细胞RNA和总蛋白，用以检测PRRSV的病毒含量。利用qRT-PCR和western-blot实验检测PRRSV在PAMs上的增殖情况，其中qRT-PCR所涉及的引物和反应体系见表2和表3。

表2qRT-PCR引物

表3qRT-PCR反应体系

反应条件为：95℃10min；95℃15s，56℃15s，72℃30s 40个循环。反应以不同浓度稀释的含有病毒目基因的质粒标准品(质粒拷贝数分别为：1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹)作为参照标准，计算检测样品中的病毒RNA拷贝数。

实验结果：和WT猪的PAMs相比，基因编辑猪的PAMs除了在病毒感染后12h可以检测到少量的PRRSV外，其余时间点都没有检测到病毒的存在。基因编辑猪的PAMs在病毒感染后12h能够检测到少量的PRRSV，可能与CD163在PRRSV感染过程中的作用有关，CD163的作用为促进已进入细胞的PRRSV脱衣壳并释放病毒核酸，CD163敲除并不影响病毒的粘附功能，但是使病毒丧失了脱衣壳和复制的能力。以上数据表明，双基因敲除在细胞水平可以完全抵抗PRRSV的感染。

2猪个体水平的检测PRRSV易感性检测

在猪个体水平检测了基因编辑猪对PRRSV易感性的影响，具体如下：4头45日龄左右的基因编辑猪和6头同日龄、同品种的WT猪被用来攻毒，攻毒的毒株为PRRSVWH3。采用滴鼻和肌注两种方式结合的方法(每头猪的攻毒量为：肌注2mL(10⁶TCID₅₀/mL)+滴鼻2mL(10⁶TCID₅₀/mL))对两组猪进行攻毒。

攻毒后，每天测量猪只的体温，每天记录猪只的采食、呼吸、排便和精神状况等临床症状表型数据，并对临床症状进行打分汇总。数据显示，WT猪在攻毒后1天即开始发烧，WT组除两只猪在死亡当天体温低于40℃以外，其余时间所有猪只的体温均高于40℃；而基因编辑组的所有猪只在整个攻毒期间体温都低于40℃，都未发烧。对猪只临床症状记录并打分的结果显示，WT猪在攻毒1天后即表现出明显的PRRSV临床症状，包括食欲下降、呼吸急促、咳嗽、精神萎靡、嗜睡、行走困难等，而基因编辑组除了两头猪有一次短暂性的咳嗽和拉稀外其余都未见异常。WT猪在攻毒期间身体日渐消瘦，体重呈缓慢下降的趋势，除1头在攻毒后第10天扑杀用于分PAMs外，其余5头在攻毒11天内全部死亡，而4头基因编辑猪在14天攻毒期间体重呈增长趋势且健康状况良好。

本发明还利用qRT-PCR对两组猪攻毒后第0天、第3天、第7天、第10天、第14天的血清中的PRRSV病毒载量进行了检测。WT猪在攻毒后第0-7天内，血液中的PRRSV病毒载量呈快速显著上升趋势，并在第7天达到最大值，猪在整个攻毒过程中的PRRSV病毒血症一直处于阴性状态。对攻毒后两组猪的PAMs、肺组织和扁桃体组织中的PRRSV病毒载量进行检测显示，WT组的这些样品中都检测到了大量的PRRSV病毒，而在猪中几乎检测不到PRRSV的存在。另外，本发明还通过ELISA实验对两组猪血清中的PRRSV特异性抗体水平进行了检测，结果显示，在攻毒3天后，WT猪血清中的抗体显著快速升高，攻毒后第7天和第10天抗体水平为阳性(S/P>0.4)，而猪血清中的抗体始终为阴性水平(S/P<0.4)。

对病死和扑杀猪进行解剖，观察肺组织病变情况显示，WT组猪只的肺组织出现明显的病变，肺肿大，出血严重，肉样变，而DKO猪的肺组织未出现病变。肺组织切片HE染色显示，WT组肺组织病理变化明显，肺组织呈现出炎性细胞浸润，肺泡壁毛细血管扩张、出血，肺泡腔可见淋巴细胞和脱落的上皮细胞，这些病理变化在三基因编辑猪的肺组织中没有被观察到(图9)。

3.基因编辑猪的抗TGEV感染检测

为了检测基因编辑对TGEV易感性的影响，在猪个体水平进行TGEV攻毒实验。4头45日龄左右的猪和6头同日龄、同品种的WT对照猪在同样条件下饲喂，并进行TGEV攻毒，每头猪分两次(攻毒后第0天和攻毒后第1天，两次间隔24h)共口服10mL TGEV WH-1组织毒(每次口服5mL，病毒滴度为7×10⁵TCID₅₀/mL)。在攻毒后的14天内，除在攻毒后第3天各扑杀一头猪和WT猪用于观察肠道组织大体病变及采集肠道组织进行病理检测外，其余猪只均正常饲养至攻毒后第14天扑杀采样。攻毒后的14天内，每天测量体温，观察小猪有无呕吐、腹泻等异常情况，定期采集小猪血液用于分离血清及称量小猪的体重。在攻毒后的14天内，WT组有两头猪发现有拉稀便迹象，其余WT组猪只和猪只都没有发现异常现象，两组相比，体重增长未见差异。血清中的TGEV特异性抗体水平检测结果显示：猪在攻毒后的14天内未检测到中和抗体；而部分WT猪在攻毒后第7天检测为中和抗体阳性，所有WT猪在攻毒后第14天都检测为中和抗体阳性。

对所有扑杀猪进行解剖，观察WT猪和猪小肠组织的大体病变情况。在攻毒后第3天的WT猪的小肠组织出现了小肠充血、小肠壁变薄、小肠颜色发黄等典型的TGEV临床症状，在攻毒后第14天的WT猪的十二指肠、空肠、回肠也都有明显的出血现象，并且伴有肠壁变薄变透明，肠内充满积液，肠系膜淋巴结肿大等明显的TGEV临床表型；而猪在攻毒后第3天和攻毒后第14天的小肠组织中都没有发现这些病变情况。小肠组织切片病理检测发现，WT猪的小肠组织都出现了肠粘膜上皮细胞坏死、脱落，而三基因编辑猪的小肠组织均正常(图9)。

4.基因编辑猪的PDCoV抵抗作用检测

2头45日龄的三基因编辑猪和4头同日龄、同品种的WT猪在同样条件下饲喂，并进行PDCoV攻毒实验，每头猪分两次共口服16mL PDCoV WH-1组织毒(两次间隔24h，每次口服8mL，病毒滴度为2.5×10⁸TCID₅₀/mL)。攻毒后的14天期间，两组猪生长状况都正常，体温和体重变化未见差异。攻毒后第0、7、14天采集血液分离血清用于检测病毒的特异性抗体水平，抗体水平检测结果显示，WT猪在攻毒后第7天和第14天全部为抗体阳性，而三基因编辑猪攻毒后第7天为抗体阴性，第14的抗体水平和WT组相当，表明三基因编辑猪延缓了体液免疫的发生时间。

攻毒后第14天对所有猪只进行扑杀并观察两组猪小肠组织的大体病变情况，结果显示，WT猪小肠肠壁变薄，小肠内有水样积液，肠系膜充血等明显的PDCoV临床表型，而在基因编辑组小肠组织中都没有发现这些病变。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种同时敲除CD163、pAPN、MSTN基因抗病和品质改良猪培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

以所述F0代MSTN基因编辑大白猪为父本，以F0代MSTN基因编辑梅山猪为母本进行交配，得到F1代MSTN基因编辑大梅猪；

将所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪为父本，以所述F1代MSTN基因编辑大梅猪为母本进行交配，横交固定，得到同时敲除CD163、pAPN、MSTN的基因编辑猪；

所述F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪的制备方法包括采用CRISPR/Cas9技术制备CD163、pAPN双基因编辑大白猪细胞，利用体细胞克隆生产F0代CD163、pAPN双基因编辑大白猪；

所述CD163基因的特异性gRNA如SEQ ID NO:1所示；

所述pAPN基因的特异性gRNA如SEQ ID NO:2所示；

所述F0代MSTN基因编辑大白猪、F0代MSTN基因编辑梅山猪的制备方法为利用TALEN技术分别制备MSTN基因编辑大白猪和MSTN基因编辑梅山猪细胞，利用体细胞克隆生产F0代MSTN基因编辑大白猪和F0代MSTN基因编辑梅山猪；

所述MSTN基因的第三外显子特异性识别序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，所述横交固定后，对得到的F2代猪只进行CD163、pAPN和MSTN基因型检测；

所述检测的方法包括PCR扩增目标基因序列。

3.根据权利要求2所述培育方法，其特征在于，CD163基因型检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反向引物。

4.根据权利要求2所述培育方法，其特征在于，pAPN基因型检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示的反向引物。

5.根据权利要求2所述培育方法，其特征在于，MSTN基因型检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示的反向引物。