CN115873854A - 一种靶向敲除猪MSTN的sgRNA及其单碱基编辑系统与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种靶向敲除猪MSTN的sgRNA及其单碱基编辑系统与应用，属于基因敲除技术领域，所述sgRNA的核苷酸序列为5′‑GGCACTGGTATTTGGCAGAGC‑3′，所述猪MSTN的sgRNA以第2外显子为打靶区域，能够精准、快速靶向猪MSTN基因，从而能够保证后续猪MSTN基因发生定点突变，达到敲除猪MSTN基因的目的。本发明利用单碱基编辑器在猪MSTN基因第2外显子处成功引入终止密码子，实现定点编辑，为后期生产瘦肉率高的碱基突变猪奠定基础。本发明成功获得了猪MSTN敲除的单克隆细胞，为以后单碱基编辑在大型动物育种上提供了方向，得到的基因缺失单克隆细胞株为动物模型的建立提供了优秀的实验素材，对单碱基编辑猪的培育具有重要意义。

Description

一种靶向敲除猪MSTN的sgRNA及其单碱基编辑系统与应用

技术领域

本发明属于基因敲除技术领域，尤其涉及一种靶向敲除猪MSTN的sgRNA及其单碱基编辑系统与应用。

背景技术

中国猪种质资源丰富，占全世界1/3左右。宁乡花猪是中国本土著名品种，具有繁殖力高、抗病抗逆性强等优势，但其瘦肉率低等缺点限制了该品种在市场中的发展，因此，如何在规避缺点的同时最大化利用其内在优势，对宁乡花猪乃至整个地方猪养殖行业发展有着重要意义。

传统猪遗传育种周期长且成本高，目前，以CRISPR/Cas9技术为基础的基因编辑技术已经广泛应用于一种或多个优良性状的研究，该方法在猪种质资源创新中具有重要意义。2016年，以CRISPR/Cas9技术为基础的单碱基编辑技术应运而生，该技术在不造成DNA双链断裂(DSB)的情况下精准突变单个碱基，其原理是将失去切割活性的核酸酶Cas9(dCas9)和作用于单链DNA(ssDNA)碱基的脱氨酶融合，依靠sgRNA将碱基编辑酶锚定到靶位点上，从而使局部ssDNA上的胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)脱氨，实现精准C→T或A→G替换，从而实现定向突变单个碱基。

肌肉生长抑制素(MSTN)又称生长分化因子8，主要在骨骼肌中表达，是抑制肌细胞增殖和分化的关键基因，在骨骼肌中表达最为明显，负调控骨骼肌生长发育，它的缺失会导致肌细胞增生和肌纤维肥大。MSTN基因自然突变会使牛表现出“双肌”性状，而宁乡花猪在自然情况下不存在MSTN基因有益突变。因此，利用单碱基编辑技术编辑宁乡花猪的MSTN基因，造成猪MSTN基因突变，建立定点基因敲除猪MSTN的单碱基编辑体系，是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向敲除猪MSTN的sgRNA及其单碱基编辑系统与应用，利用单碱基编辑技术在猪MSTN基因编码区引入终止密码子，使翻译提前终止，导致MSTN蛋白表达量显著降低，在猪MSTN基因编码区实现定点编辑，从而提高了猪的瘦肉率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种靶向敲除猪肌抑素基因MSTN的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列为5′-GGCACTGGTATTTGGCAGAGC-3′。

本发明提供了一种含有上述sgRNA的表达载体。

本发明还提供了一种上述表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)利用BsmB I内切酶对pMLM3636-puro载体酶切，得到线性化pMLM3636-puro载体；

(2)将线性化pMLM3636-puro载体与所述sgRNA连接，得到pMLM3636-puro-sgRNA表达载体。

本发明还提供了一种靶向敲除猪肌抑素基因MSTN的单碱基编辑系统，所述单碱基编辑系统包括上述的sgRNA或表达载体。

优选的，所述单碱基编辑系统还包括单碱基编辑器，所述单碱基编辑器包括YE1-BE3-FNLS。

本发明还提供了一种靶向敲除猪肌抑素基因MSTN的试剂盒，上述试剂盒包括上述的单碱基编辑系统。

本发明还提供了一种上述sgRNA、表达载体、上述构建方法得到的表达载体、单碱基编辑系统或试剂盒在制备靶向敲除猪肌抑素基因MSTN基因细胞系中的应用。

优选的，所述敲除猪肌抑素基因MSTN基因细胞系的制备方法，包括以下步骤：

将上述的单碱基编辑器系统转染至细胞系中，得到敲除猪肌抑素基因MSTN基因细胞系。

本发明还提供了一种上述sgRNA、表达载体、上述构建方法得到的表达载体、单碱基编辑系统或试剂盒在改良猪肉品质中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种靶向敲除猪MSTN的sgRNA，所述猪MSTN的sgRNA以第2外显子为打靶区域，能够精准、快速靶向猪MSTN基因，从而能够保证后续猪MSTN基因发生定点突变，达到敲除猪MSTN基因的目的。

本发明提供的单碱基编辑系统包括上述sgRNA和单碱基编辑器，本发明利用单碱基编辑器在猪MSTN基因第2外显子处成功引入终止密码子，使翻译提前终止，且目标位点G→A的编辑效率为5.5％，猪MSTN蛋白的表达量降低约60％，因此，本发明成功运用单碱基编辑技术在猪MSTN基因编码区实现定点编辑，为后期生产瘦肉率高的碱基突变猪奠定基础。

本发明成功筛选出适用于猪肾成纤维细胞的单碱基编辑系统，并获得了猪MSTN敲除的单克隆细胞，为以后单碱基编辑在大型动物育种上提供了方向，得到的基因缺失单克隆细胞株为动物模型的建立提供了优秀的实验素材，对单碱基编辑猪的培育具有重要意义。

附图说明

图1为pMLM3636-puro载体示意图；

图2为pMLM3636-puro-sgRNA表达载体示意图；

图3中，A为pMLM3636-puro和pMLM3636-puro-sgRNA表达载体的电泳图，其中M为15000bp DNA Marker，泳道1为pMLM3636-puro，泳道2为pMLM3636-puro-sgRNA；B为pMLM3636-puro-MSTN表达载体测序峰图；

图4为宁乡猪肾原代成纤维细胞分离结果(100×)，A为原代培养，B为F2代培养；

图5中，A为BE4max-P2A-GFP转染图；B为YE1-BE3-FNLS转染图；C为BE4max-P2A-GFP和YE1-BE3-FNLS的编辑效率对比；

图6为靶位点测序峰图，A为目标突变单克隆细胞电泳图和测序峰图；B为非目标突变单克隆细胞测序峰图，其中M为100bp DNA Ladder，WT为野生型；数字10、25、51、3、6、7、9、15、20和36为突变单克隆细胞编号；

图7为Western blotting检测MSTN蛋白表达量。

具体实施方式

本发明提供了一种靶向敲除猪肌抑素基因MSTN的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列为5′-GGCACTGGTATTTGGCAGAGC-3′(SEQ ID No.1)。

本发明所述sgRNA是以第2外显子为打靶区域，MSTN的sgRNA在猪基因组的准确定位是15号染色体MSTN编码区第2外显子。本发明单碱基编辑的sgRNA的设计应满足以下4个条件：①sgRNA的长度约为20bp，PAM序列为NGG(N代表任意碱基)；②sgRNA中碱基GC含量为40％～60％。③远离PAM位点的4～8位碱基上，正义链需要有C，反义链需要有G；④突变后的碱基(C→T或G→A)与相邻碱基可以在原有氨基酸的基础上形成终止密码子(TAA、TAG、TGA)。基于此，设计本发明的sgRNA，sgRNA寡核苷酸序列为MSTN-sgRNA oligo编码链序列为(5′-acaccGCTCTGCCAAATACCAGTGCCg-3′，SEQ ID No.2)，MSTN-sgRNA oligo非编码链序列为(5′-aaaacGGCACTGGTATTTGGCAGAGCg-3′，SEQ ID No.3)。其中，MSTN-sgRNA oligo编码链序列中，5′端添加“ACACC”酶切位点，3′端添加“g”。MSTN-sgRNA oligo非编码链序列5′端添加“AAAAC”保护碱基，3′端添加“g”，保证将sgRNA与质粒成功连接。加粗划线部分为人为添加碱基。

本发明还提供了一种上述sgRNA的表达载体。

本发明还提供了一种上述表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)利用内切酶对pMLM3636-puro载体酶切，得到线性化pMLM3636-puro载体；

(2)将线性化pMLM3636-puro载体与所述sgRNA连接，得到pMLM3636-puro-sgRNA表达载体。

本发明还提供了一种靶向敲除猪肌抑素基因MSTN的单碱基编辑系统，所述单碱基编辑系统包括上述的sgRNA或表达载体。

在本发明中，所述pMLM3636-puro载体示意图如图1所示。所述表达载体优选为pMLM3636-puro-sgRNA表达载体，pMLM3636-puro-sgRNA表达载体示意图如图2所示。

在本发明中，利用单碱基编辑技术在猪MSTN基因编码区引入终止密码子(TAG、TGA或TAA)，使翻译提前终止，从而实现猪MSTN基因编码区定点编辑。所述单碱基编辑系统还包括单碱基编辑器，所述单碱基编辑器优选地包括YE1-BE3-FNLS。本发明通过dCas9和与脱氨酶融合形成蛋白，利用sgRNA的靶向性，特异性识别猪MSTN基因的特定DNA序列后，精准地在靶位点发生脱氨反应，产生定点突变，因此，本发明利用上述单碱基编辑器通过突变猪MSTN编码区第2外显子的203号氨基酸TGG来产生终止密码子TAA，经转录翻译成终止密码子来产生一个截短猪MSTN蛋白，从而使其丧失活性。

本发明还提供了一种靶向敲除猪肌抑素基因MSTN的试剂盒，上述试剂盒包括上述的单碱基编辑系统。

在本发明中，所述试剂盒还优选地包括转染试剂和敲除基因鉴定用试剂。所述敲除基因鉴定用试剂优选地包括PCR扩增引物对、PCR扩增试剂等。所述PCR扩增引物对为MSTN-F：5′-TGCAAGTGGAAGGAAAACCCA-3′(SEQ ID No.4)，MSTN-R：5′-GGTCCTGGGAAGGTTACAGC-3′(SEQ ID No.5)。当sgRNA的核苷酸序列中的

加粗划线部分是否突变为TAA来判断基因敲除的情况。

本发明还提供了一种上述sgRNA、表达载体、上述构建方法得到的表达载体、单碱基编辑系统或试剂盒在制备靶向敲除猪肌抑素基因MSTN基因细胞系中的应用。

在本发明中，所述细胞系优选地包括HEK 293T细胞或猪肾成纤维细胞。所述敲除猪肌抑素基因MSTN基因细胞系的制备方法，优选地包括以下步骤：将上述的单碱基编辑器系统转染至细胞系中，得到敲除猪肌抑素基因MSTN基因细胞系。

本发明还提供了一种上述sgRNA、表达载体、上述构建方法得到的表达载体、单碱基编辑系统或试剂盒在改良猪肉品质中的应用。

本发明通过单碱基编辑技术靶向定点突变猪MSTN基因，阻断猪MSTN基因的表达，解除对肌肉发育和再生的负调控作用，从而提高瘦肉率。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.1基因靶位点sgRNA设计

在宁乡花猪MSTN基因第2外显子(第15号染色体，GeneID：399534)处设计sgRNA，sgRNA的设计应满足以下4个条件：①sgRNA的长度约为20bp，PAM序列为NGG(N代表任意碱基)；②sgRNA中碱基GC含量为40％～60％。③远离PAM位点的4～8位碱基上，正义链需要有C，反义链需要有G；④突变后的碱基(C→T或G→A)与相邻碱基可以在原有氨基酸的基础上形成终止密码子(TAA、TAG、TGA)。以此为基础，设计sgRNA，并在MSTN-sgRNA oligo编码链序列中，5′端添加“ACACC”酶切位点，3′端添加“g”。MSTN-sgRNA oligo非编码链序列5′端添加“AAAAC”保护碱基，3′端添加“g”。其中，sgRNA靶位点和sgRNA寡核苷酸序列如表1所示：

表1sgRNA靶位点和sgRNA寡核苷酸序列

其中宁乡花猪MSTN基因第2外显子的序列为：

其中SEQ ID No.6序列中的划线加粗部分即为定点突变位点。

1.2pMLM3636-puro-sgRNA表达载体构建

(1)将合成的sgRNA稀释成10μmol/L退火，形成黏性末端双链。

表2sgRNA退火体系

反应条件：95℃，5min；37℃，1h；4℃保存。

(2)pMLM3636-puro载体构建

将puro表达框(1487bp)连接到pMLM3636的Sal I—Bam H I位点之间，puro表达框使用扩增的引物为puro-F和puro-R，形成pMLM3636-puro，使用B52-seq-F(正向通用引物)，下游用puro-R测序。其中，所述B52-seq-F引物序列为5′-GACGTCGCTAGCTGTACA-3′(SEQ IDNo.7)；所述puro-F引物序列为5′-CTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAG-3′(SEQ ID No.8)，所述puro-R引物序列为5′-CCTGCCCGACCTTGGTACCGGATCCTACCACATTTGTAGAGGTTTTAC-3′(SEQ ID No.9)。

将puro表达框连接至pMLM3636骨架后的测序结果和电泳实验表明，pMLM3636-puro构建成功。pMLM3636-puro载体示意图如图1所示，pMLM3636-puro载体电泳图见图3。

测序结果为：

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其中Sal I酶切位点为GTCGAC，Bam H I酶切位点为GGATCC，划横线的部分即为puro基因序列。

(3)pMLM3636-puro载体线性化

选用BsmB I内切酶对pMLM3636-puro载体进行酶切，按照下表酶切体系加样后，混匀，离心3s使得所有反应液体置于管底，将其置于37℃水浴锅中，酶切2h。称取0.15g琼脂糖溶解于15mL 1×TAE缓冲液中，加热至琼脂糖完全溶解，加入1.5μL核酸染料，混匀后倒板。取pMLM3636-puro酶切产物40μL与pMLM3636-puro原质粒载体进行琼脂糖凝胶电泳。电压调节至120V，时间设定为30min。使用紫外凝胶成像仪照胶，结果验证无误后进行下一步，割胶回收。

表3pMLM3636-puro载体线性化酶切体系

反应条件：37℃，1～3h。

(3)pMLM3636-puro线性化产物的回收纯化

酶切产物电泳后，紫外灯下切取含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，并使用Vazyme试剂盒进行胶回收。

(4)构建pMLM3636-puro-sgRNA表达载体

将纯化回收的线性化pMLM3636-puro产物与退火形成双链的sgRNA连接。

表4构建pMLM3636-puro-sgRNA表达载体连接体系

反应条件：37℃恒温水浴锅中连接5h。

(5)连接产物转化及菌液测序鉴定

将pMLM3636-puro-sgRNA重组表达载体转到DH5α感受态细胞中，并均匀涂布在含有Amp抗性的LB固体培养基上，静置于37℃恒温箱过夜培养，挑取单菌落，摇菌后将菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。利用无内毒素质粒小提中量试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取质粒，通过凝胶电泳判断pMLM3636-puro-sgRNA重组表达载体是否构建成功。

pMLM3636-puro-sgRNA表达载体示意图如图2所示。

由图3可知，pMLM3636-puro-sgRNA重组表达载体构建成功。

1.3电转染宁乡花猪肾成纤维细胞

(1)宁乡花猪肾原代成纤维细胞的培养

取7日龄宁乡花猪，用静脉注射法致死，75％乙醇溶液消毒全身，酒精棉球擦拭腹部后，用手术刀割开猪腹部，取出肾组织，用生理盐水清洗5～6次，再用含1％双抗(青霉素和链霉素混合溶液)的DPBS(购自HyClone公司)清洗，将组织放入培养皿中，剪去表面膜，将肾组织剪成约1mm×1mm×1mm大小的组织块，用枪头吸取将组织块均匀铺在6孔板中，于5％CO₂、37℃培养箱倒置1h后，加入2mL完全培养基(DMEM+10％FBS+1％双抗)，继续放入培养箱中培养，每隔2d换一次液，7d后去除组织块，即得宁乡花猪肾原代成纤维细胞。

F2传代培养：将上述培养7d后去除组织块的剩余细胞传代至6孔板中，2d后更换培养基，继续培养。

宁乡花猪肾原代成纤维细胞分离培养结果见图4。

由图4可知，采用组织分离法分离组织块后，培养至第3d时，组织块周边有细胞生长，并呈现星型和纺锤型结构，形态不均一，棱角分明，如图4中A所示。培养7d后，除去组织块，得到比较纯的成纤维细胞，呈现长梭形结构，胞体变小，生长旺盛，如图4中B所示，说明成功分离获得宁乡猪肾原代成纤维细胞。

(2)主要溶液配制：

A细胞培养基配制

高糖培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+1％青霉素-链霉素(双抗)+2％谷氨酰胺。

B电转液配制

10×电转液：称取4.473g KCl、0.0083425g CaCl₂、1.14g K₂HPO₄、2.9787g HEPES、0.37224g EDTA和0.238g MgCl₂，调节pH值为7.6，加入ddH₂O定容50mL，配制成10×电转液，置于4℃保存备用。

1×电转液：使用前用ddH₂O将10×电转液稀释成1×电转液，0.22μm除菌滤器过滤，分装后于4℃保存备用。

(3)电转染猪肾成纤维细胞

为了研究BE4max-P2A-GFP和YE1-BE3-FNLS在肾成纤维细胞中的编辑效率，将两个单碱基编辑器(BE4max-P2A-GFP、YE1-BE3-FNLS)分别与pMLM3636-puro-MSTN表达载体共转染至肾成纤维细胞，具体步骤如下：

1)宁乡肾成纤维细胞F2细胞汇合度达到90％，生长状态良好，可以进行转染。

2)清洗电转杯：使用之前用75％乙醇溶液浸泡20min，弃去乙醇，放置于超净工作台中紫外照射30min，电转杯中加入500μL DPBS，取加长枪头于电转杯中吹打混匀，弃液体，DPBS清洗2遍。加入500μL电转液润洗1遍，置于37℃温箱备用。

3)从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养基，用1mL的DPBS清洗一遍。

4)加入1mL含有DPBS和0.25％胰蛋白酶的等量混合溶液，显微镜下观察至细胞分散边缘收缩呈现圆形。

5)加入1mL培养基终止消化，收集细胞至离心管中。

6)2000rpm离心2min，弃去培养基，用DPBS清洗。

7)2000rpm离心2min，弃DPBS，电转液润洗1遍。

8)弃上清，留下细胞沉淀。将提前准备好的质粒(YE1-BE3-FNLS 6μg或BE4max-P2A-GFP 6μg、pMLM3636-puro-sgRNA 3μg)、细胞沉淀、电转液共100μL转入电转杯中，电转条件：220V，3ms，1pulse。

9)将电转完的细胞加入提前准备好的DMEM培养基的6孔板中，静置培养。

(4)荧光和嘌呤霉素双筛选

电转后24h换液，观察细胞荧光情况并判断转染效率。48h后加入嘌呤霉素开始药筛，嘌呤霉素筛选时间为3d，浓度为1.75ng/μL。之后用含10％FBS的DMEM培养基培养，期间注意观察细胞状态，每3d换一次液，7d后挑取单克隆细胞团至48孔板中。利用Image J软件计算不同视野下带有红色或绿色荧光的细胞占该视野下所有细胞的比例，并计算转染效率，结果如图5所示。

(5)单克隆团挑取及培养

新的48孔板中加入37℃温箱提前预热过的细胞培养基，将细胞板放至37℃培养箱孵育，然后在普通光学显微镜下找到需要挑取的单克隆细胞团，并用记号笔在细胞板的背面做好标记，吸去细胞板中的培养基，用胰酶消化30s左右，弃去胰酶，加入新鲜培养基，将单克隆团挑入提前预热的48孔板中，将其放至37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(6)单克隆细胞的测序分析

分别取200μL单克隆细胞和野生型细胞悬液，用细胞裂解液裂解后直接作为PCR模板，使用检测引物扩增。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；59℃退火30min；72℃延伸1min，共32个循环；72℃终延伸7min。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，将鉴定正确的PCR产物(如图6所示)送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。所述的检测引物为MSTN-F：5′-TGCAAGTGGAAGGAAAACCCA-3′(SEQ ID No.3)，MSTN-R：5′-GGTCCTGGGAAGGTTACAGC-3′(SEQ ID No.4)。

表5PCR扩增体系

如图5所示，经Image J软件计算，BE4max-P2A-GFP转染效率为53.5％，YE1-BE3-FNLS转染效率为67.4％，但BE4max-P2A-GFP编辑的细胞未发生编辑现象，在目标位点发生突变的概率仅为1.5％，而YE1-BE3-FNLS编辑的细胞，在C3位效率可达到35.0％，在C6位效率位10.0％，因此，本发明选用YE1-BE3-FNLS为单碱基编辑器。

由图6所示，PCR扩增基因片段，MSTN基因片段扩增大小为346bp(如图6中的A)，利用单碱基编辑器YE1-BE3-FNLS编辑的MSTN得到55个单克隆细胞团，其中有3个阳性单克隆团在目标位点发生突变，氨基酸序列由色氨酸TGG变成终止密码子TAA，说明10#、25#、51#号引入终止密码子，突变率为5.5％(3/55)，其中只有10#未发现脱靶现象；有9个在非目标位点发生突变，突变率为16.4％(9/55)(见图6中的B)，其中非目标突变位点在第3位，不在传统的碱基编辑窗口(4～8bp)之内。

(7)Western blotting检测MSTN蛋白的表达情况

将野生型细胞和MSTN的10#阳性单克隆细胞进行扩大培养，收集细胞，离心后加入蛋白裂解液，冰浴30min后，4℃、12000r/min离心15min，收集上清液，测定蛋白浓度后按比例加入适量SDS和RIPA混匀，95℃10min，蛋白变性后，-20℃保存备用，在120V、1.5h条件下进行SDS-PAGE分离蛋白，聚丙烯酰胺凝胶浓度为10％，电泳后将蛋白转移至PVDF固态膜上，再经5％脱脂奶粉常温封闭2h，一抗孵育2h，二抗孵育1h，最好滴加显色液后显影，采用Image J软件对Western blotting结果进行量化分析，以β-tubulin作为内参对照，试验数据用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析，结果以平均值±标准差表示，采用t检验分析差异显著性，以P＜0.01表示差异极显著。

由图7所示，相较于野生型，MSTN蛋白表达量下降约60％，结果显示，提前引入的终止密码子能够有效降低目标蛋白水平。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种靶向敲除猪肌抑素基因MSTN的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列为5′-GGCACTGGTATTTGGCAGAGC-3′。

2.含有权利要求1所述sgRNA的表达载体。

3.权利要求2所述表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用内切酶对pMLM3636-puro载体酶切，得到线性化pMLM3636-puro载体；

(2)将线性化pMLM3636-puro载体与所述sgRNA连接，得到pMLM3636-puro-sgRNA表达载体。

4.一种靶向敲除猪肌抑素基因MSTN的单碱基编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑系统包括权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述表达载体。

5.根据权利要求4所述的单碱基编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑系统还包括单碱基编辑器，所述单碱基编辑器包括YE1-BE3-FNLS。

6.一种靶向敲除猪肌抑素基因MSTN的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4或5所述的单碱基编辑系统。

7.权利要求1所述sgRNA、权利要求2所述表达载体、权利要求3所述构建方法得到的表达载体、权利要求4或5所述单碱基编辑系统或权利要求6所述的试剂盒在制备靶向敲除猪肌抑素基因MSTN基因细胞系中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述细胞系包括猪肾成纤维细胞。

9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述敲除猪肌抑素基因MSTN基因细胞系的制备方法，包括以下步骤：

将权利要求4或5所述的单碱基编辑器系统转染至细胞系中，得到敲除猪肌抑素基因MSTN基因细胞系。

10.权利要求1所述sgRNA、权利要求2所述表达载体、权利要求3所述构建方法得到的表达载体、权利要求4或5所述单碱基编辑系统或权利要求6所述的试剂盒在改良猪肉品质中的应用。

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