CN117247938A - 一种IscB融合蛋白表达载体及其构建方法和基因编辑的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种融合蛋白表达载体及应用。一种IscB融合蛋白表达载体，含有依次连接的拟南芥的U6启动子、WRNA片段、拟南芥UBQ1的启动子、Flag、核定位信号DNA片段及IscB基因的重组载体。所述表达载体以含有上述的IscB融合蛋白表达载体的宿主细胞可用于植物基因打靶或者编辑植物细胞DNA。由于IscB基因序列短，其在动植物的遗传转化中有明显的优势，可开发一种成编辑多种物种的新技术，克服因为Cas9基因序列长，可遗传转化的物种少的缺点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种融合蛋白表达载体及基因编辑的应用。
背景技术
随着生物技术的不断发展，出现了越来越多的育种新技术。传统育种技术周期长，难以对目标形状作定点定向改良。近些年兴起的生物技术育种很大程度上缩短了育种周期，可定点改造植物内部基因，通过定点插入碱基、缺失碱基或者大片段插入、缺失碱基，或单碱基替换等方式在DNA水平上编辑指定基因的核苷酸序列，从而导致翻译的蛋白突变，获得可遗传的新表型植株。
基因编辑技术在育种中意义重大。目前，主要有以下基因编辑技术，包括ZFN(Zinc-finger nucleases),TALEN(Transctiption activator-like affectornucleases)和CRISPR(clustered regularly interspersed short palindromicrepeats)/Cas等。其中，用得最多的是CRISPR/Cas。该技术来源于细菌及古细菌中的免疫系统，主要通过靶点特异性的RNA引导Cas蛋白对靶位点的序列进行切割，从而形成各种突变。该系统中的Cas9已成功应用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、酵母、拟南芥、烟草、大豆、水稻、杨树、柑橘、丹参等多个物种。在医学上，该技术可用于疾病的诊断和治疗。在基础研究中，该方法可用于研究基因的功能。该技术也可用于新品种的培育，在植物、动物、微生物的育种改良中具有重要的应用价值。
虽然CRISPR/Cas很有应用前景，但是CRISPR/Cas技术也有缺点：Cas9基因长度为4287bp，编码的氨基酸为1429个，存在遗传转化的载体构建难度大，且不易转化到目的物种中，且翻译的蛋白太大的缺点，限制了其利用。因此，需要开发出来小的、灵活的编辑系统用于新品种的培育。
IscB是从缬草杆菌(Oscillibacter valericigenes)中分离得到的一个转座子基因，该基因和Cas12有类似的结构域，可能是Cas12的祖先(Altae-Tran et al.2021)。IscB蛋白长约400个氨基酸，结构类似于Cas9蛋白，包含一个RuvC核酸内切酶结构域，被一个插入的桥螺旋分开；还有一个HNH核酸内切酶结构域。目前有研究表明IscB能够编辑序列人类细胞(Altae-Tran et al.2021)，但还没有IscB编辑植物基因的报道。
IscB蛋白与Cas9具有相同的RucV和HNH内切酶结构域，而缺少了α-螺旋识别结构域(REC)。研究人员发现，IscB附近有一类非编码的RNA，它指导IscB酶切割特定的DNA序列。这些RNA为被称为“ωRNA”，或称WRNA。
Cas9使用α-螺旋识别结构域(REC)来促进对靶标的识别，而IsrB则依赖于它的ωRNA，ωRNA的一部分形成了一个复杂的三维结构，起到了类似于REC的作用。IscB与1个约200-400nt的非编码RNA结合，从而实现对特定DNA序列的识别靶向和切割，其ωRNA要比Cas9的约100nt的向导RNA大得多。
建立一种用来识别植物基因靶标的ωRNA以及能够识别植物基因靶标的IscB融合蛋白表达载体，可实现植物基因打靶或编辑植物基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ωRNA及含有IscB融合蛋白基因及这种ωRNA的表达载体，可以用来转染植物，进行植物基因的编辑。
本发明的方案如下：
一种ωRNA，其保守序列的互补DNA含有如SEQ ID No.1的所示的核苷酸序列。优选的，所述ωRNA的保守序列的互补DNA如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：ggctcttccaactttatggttgcgaccgtaggttgaaagagcacaggctgaga cattcgtaaggccgaaagaccggacgcaccctgggatttccccagtccccggaactgcatagcggatgccagttgatggagcaatctatcagataagccagggggaacaatcacctctctgtatcagagagagttttacaaaaggaggaacgg
优选的，所述ωRNA由保守序列及下游连接的与植物靶基因匹配的核苷酸序列组成。所述与靶基因匹配的核苷酸序列长度为15-20bp，优选为16bp。
上述ωRNA的保守序列或ωRNA及其互补DNA序列可用于构建IscB融合蛋白表达载体，用于植物基因打靶或编辑植物基因。
一种IscB融合蛋白表达载体，含有依次连接的启动子、拟南芥的U6启动子、能够转录上述ωRNA的DNA序列(即ωRNA序列互补的DNA)、拟南芥UBQ1的启动子、Flag、核定位信号DNA片段及IscB基因。
所述IscB基因编码含有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白；优选的，所述IscB基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述的核定位信号序列优选为Sv40NLS，如SEQ ID No.3所示。
优选的，在IscB基因下游为终止子，优选为UBQ终止子。
载体为质粒，质粒优选为PCAMBIA1304。
所述IscB融合蛋白表达载体的构建方法为，步骤包括：
(1)依次连接拟南芥的U6启动子(pAtU6)序列、ωRNA序列互补的DNA、拟南芥UBQ1的启动子(pAtUBQ1序列)、Flag序列、核定位信号序列Sv40NLS和IscB基因；
(2)将上述序列通过酶切同源重组的方式，与载体连接，形成IscB融合蛋白表达载体。
ωRNA序列互补的DNA含有如SEQ ID No.1的所示的保守序列。优选的，所述ωRNA序列互补的DNA由SEQ ID No.1核苷酸序列和植物靶基因序列组成。
在本发明的一个优选方式中，采用PCAMBIA1304为载体，分别对以上PCAMBIA1304骨架质粒以及步骤(1)连接后得到的序列在Pst1和EcoRI的两酶切位点进行酶切，然后通过同源重组的方式连接，得到IscB融合蛋白表达载体。
一种宿主细胞，含有上述的IscB融合蛋白表达载体。优选的，所述宿主细胞为农杆菌。
上述IscB融合蛋白表达载体或者宿主细胞在植物基因打靶或编辑植物基因方面的应用。
一种基因打靶方法，步骤为：将上述IscB融合蛋白表达载体转染到植物中；或者，将含有IscB融合蛋白表达载体宿主细胞转染到植物中。
植物靶基因下游为IscB蛋白识别的位点即TAM位点。TAM(又称PAM)位点的序列为HWWGAA，其中，H＝A/T/C，W＝A/T。
优选的，转染的植物对象可以是原生质体、植株或者植物的花、叶、根、茎。
具体的，可以将IscB融合蛋白表达载体转化到宿主细胞(例如，农杆菌)中，采用注射、浸泡等方法，使宿主细胞转染植物的植株或者植物的花、叶、根、茎。
或者，将IscB融合蛋白表达载体转化到植物原生质体中。
本发明的方案可用于多种植物的基因编辑。
在本发明的优选实施例中，利用所述IscB融合蛋白表达载体进行基因打靶；所述的植物为黄芩；所述基因为黄芩CLL基因，所用的体系为黄芩原生质体。
拟南芥原生质体的基因TTG1
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了一种IscB在植物中编辑基因的新方法。本方法通过构建载体，在植物中表达IscB蛋白，在ωRNA序列的指导下编辑目的基因，以达到基因打靶的效果。
在本发明一个特别优选的实施例中，公开了一种含有IscB序列的相关载体在植物中的应用。具体包括：制备上述的IscB蛋白序列、构建质粒载体；设计特异性识别、切割黄芩基因组指定位点序列的基因组编辑工具ωRNA，使用原生质体转化的方法将含有所述基因编辑工具ωRNA的质粒载体转化到黄芩的原生质体中，通过PCR的方法鉴定基因编辑效率。
通过IscB介导基因打靶方法，利用本发明提供的融合蛋白进行基因编辑，可以避免CRISPR/Cas9技术中CRISPR/Cas9核酸序列过长的问题。我们将此方法具体应用在敲除黄芩CLL基因的载体构建过程中。我们的实验包括如下步骤：
并且，采用了新的ωRNA序列，能够适用于多种植物细胞的编辑。
本发明一方面因为载体小，可以简单、灵活、方便地在更多物种中实现基因编辑。更重要的是，本发明所提供的IscB-1304载体以碱基替换为主，避免了碱基的插入和缺失，可防止脱靶带来的影响。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明公开了一种ωRNA序列、IscB融合蛋白表达载体及其在编辑植物基因中的应用。结果显示，IscB融合蛋白表达载体能够对黄芩的CLL基因进行有效基因打靶，打靶率高达12％。
由于IscB基因序列短，其在动植物的遗传转化中有明显的优势，可开发一种成编辑多种物种的新技术，克服因为Cas9基因序列长，可遗传转化的物种少的缺点。
IscB基因序列为1488bp，Cas9基因序列为4287bp，约为Cas9基因序列的四分之一，因此，通过本发明的方法能够实现更方便、自由的编辑，适合更大范围的物种，对于分子育种有重要的意义。
附图说明
图1为包含有不同结构域的IscB结构示意图；
图2为用于编辑黄芩的IscB-1304质粒构建流程图；
图3为采用实施例1的IscB-1304质粒转化后的黄芩原生质体图；
图4为实施例3中，IscB-1304质粒转化黄芩原生质体后对CCL基因的编辑测序结果；
图5为实施例4中，IscB-1304质粒编辑的拟南芥原生质体TTG1基因的测序结果。
具体实施方式
以下对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不局限于以下的实施例介绍，凡依照本发明的原理或理念所作的等同的变化或变通都应视为本发明保护的范畴。发明涉及的IscB蛋白序列如SEQ ID No.2；ωRNA的保守序列的互补DNA如SEQ ID No.1；核定位信号序列(nuclear localization sequence,NLS)如SEQ ID No.3。
SEQ ID No.1:ggctcttccaactttatggttgcgaccgtaggttgaaagagcacaggctgaga cattcgtaaggccgaaagaccggacgcaccctgggatttccccagtccccggaactgcatagcggatgccagttgatggagcaatctatcagataagccagggggaacaatcacctctctgtatcagagagagttttacaaaaggaggaacgg
SEQ ID No.2：MMAVVYVISKSGKPLMPTTRCGHVRILLKEGKARVVER KPFTIQLTYESAEETQPLVLGIDPGRTNIGMSVVTESGESVFNAQIETRNKDV PKLMKDRKQYRMAHRRLKRRCKRRRRAKAAGTAFEEGEKQRLLPGCFKPITCKSIRNKEARFNNRKRPVGWLTPTANHLLVTHLNVVKKVQKILPVAKVVLELNRFSFMAMNNPKVQRWQYQRGPLYGKGSVEEAVSMQQDGHCLFCKHGIDHYHHVVPRRKNGSETLENRVGLCEEHHRLVHTDKEWEANLASKKSGMNKKYHALSVLNQIIPYLADQLADMFPGNFCVTSGQDTYLFREEHGIPKDHYLDAYCIACSALTDAKKVSSPKGRPYMVHQFRRHDRQACHKANLNRSYYMGGKLVATNRHKAMDQKTDSLEEYRAAHSAADVSKLTVKHPSAQYKDMSRIMPGSILVSGEGKLFTLSRSEGRNKGQVNYFVSTEGIKYWARKCQYLRNNGGLQIYV
SEQ ID No.3：aaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaa g。
实施例1
构建用于编辑黄芩CLL基因的IscB-1304的目的表达载体。
IscB蛋白的结构域示意图如图1，其序列依次包括PLMP-RuvCⅠ-Bridge Helix-Linker-RuvCⅡ-HNH-RuvCⅢ-P1 D-TID，氨基酸序列如SEQ ID No.1。
表达载体构建流程方法如图2。
首先，依次连接pAtU6序列、能够转录ωRNA序列的DNA片段、pAtUBQ1序列、Flag序列、核定位信号序列Sv40NLS和编码IscB蛋白的序列及UBQ终止子，通过基因合成得到图2A的序列。其中编码的IscB蛋白序列如SEQ ID No.2，能够转录ωRNA序列的DNA片段由SEQ IDNo.1所示的保守序列以及与靶基因匹配的核苷酸序列依次连接所组成，与靶基因匹配的核苷酸序列长度16bp，靶序列如SEQ ID No.4所示，用于编辑CLL基因。
SEQ ID No.4：gcagctgggaaaatac。
测序结果验证表明该部分序列成功合成。
再以PCAMBIA1304骨架质粒上的Pst1和EcoRI的两酶切位点的序列(如图2B)以同源重组的方式重组在一起形成一个新的载体，命名为IscB-1304，如图2C。构建好的IscB-1304的表达质粒载体使用引物扩增法对其序列进行测序验证，测序结果验证了构建成功。设计引物序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，扩增出该部分序列，测序结果说明成功构建了IscB-1304表达载体(图2C)。
SEQ ID No.5：5’-ggctcttccaactttatggttg-3’
SEQ ID No.6：5’-gaattcgagctcggtaccacataaacggtcattatttcacgata-3’
实施例2黄芩原生质体的构建和转化
选取一个月左右的黄芩植株的叶片，切成1-2mm的长条，然后浸入到酶解液于水平摇床23℃黑暗酶解4-6h，摇床转速为40-60rpm。
然后向酶解液中加入等体积的W5溶液(154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾，2mM MES，pH 5.7)，用150μm尼龙膜过滤后离心，取原生质体。
获得的原生质体用W5溶液重悬，加入6-10μg重组质粒、200μL原生质体-MMG混悬液、220μL 40％ PEG4000转化原生质体。
转化条件为：将转化体系轻柔混匀后于23℃放置20-25min，然后于23℃培养24-48h获得编辑的原生质体，如图3。
实施例中溶液组成如下：
酶解液：1.65％纤维素酶R10，0.44％离析酶R10，0.4mol/L甘露醇，0.02mol/L氯化钾，pH 5.7的0.02mol/L MES，0.01mol/L氯化钙，0.1％ BSA
W5溶液：154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾，2mM MES(pH5.7)。
MMG溶液：0.4M甘露醇，15mM氯化镁，4mM MES(pH 5.7)。
40％PEG4000溶液：40％PEG4000，0.8M甘露醇，1M氯化钙。
实施例3黄芩原生质体DNA提取和编辑位点的鉴定
通过CTAB法提取原生质体的DNA。具体方法如下。
裂解原生质体：将黄芩原生质体在液氮和37℃水浴中反复冻融10次，以裂解原生质体。在原生质体裂解液中加入CTAB溶液500μL，涡旋混匀；1000rpm离心10min，取上清与新的EP管中；在上清中加入等体积的氯仿，上下颠倒充分混匀后，1200rpm离心10min，取上清于新的EP管中；在上清中加入等体积的预冷的异丙醇，上下颠倒轻柔混匀，12000rpm离心10min，弃上清；在EP管中加入500μL 75％的乙醇，轻轻吹打，悬浮离心管底部的DNA，然后12000rpm离心10min，弃上清。常温干燥6h；在干燥后的EP管中加入30μL无菌水，吹打，溶解DNA。以DNA为模板作PCR鉴定。
通过高保真酶进行PCR反应，KOD反应体系：
5×KOD buffer，5μL；dNTP，5μL；MgSO4，2μL；SEQ ID No.7(10μM)，1μL；SEQ IDNo.8(10μM)，1μL；模板DNA，1μL；KOD酶，1μL；dH2O，34μL。PCR上下游引物序列分别如SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8所示。
SEQ ID No.7：5’-caatatgatgcaaggttattttaagaatc-3’
SEQ ID No.8：5’-ttataacttcgatcggaccttt-3’
PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，68℃2min，35个循环；68℃10min；4℃10min。
经PCR扩增后，将扩增产物连接PJET1.2，连接体系如下：
T4连接buffer，2.5μL；PCR产物，1μL；PJET1.2，0.25μL；T4连接酶，0.25μL；dH2O，1μL。
PCR产物22℃连接30min。30min后转化大肠杆菌。转化完成后，涂抗性平板，37℃过夜培养。第二天挑单板作PCR鉴定，rTaq Mix反应体系如下：
rTaq Mix，5μL；PF(10μM)，1μL；PR(10μM)，1μL；DNA模板，1μL；dH2O，2μL。
PCR程序如下：95℃5min；然后95℃30s、55℃30s和72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃10min。
PCR结束后，电泳进行阳性鉴定；把阳性克隆送测序公司测序。结果表明，本发明构建的IscB表达载体能在黄芩的原生质体中编辑CLL基因(图4)。
图4中第一个是未经过编辑的CLL基因序列片段，其余为编辑后的序列。下划线为PAM(TAM)序列，色块部分为靶序列。
从图4结果看，编辑率达到12％；并且，IscB以碱基替换为主；而Cas9的突变以插入和缺失为主。
实施例中溶液组成如下：
2％ CTAB(w/v)溶液：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA，1.4M NaCl，1％(v/v)PVP，高温灭菌。加1.5％(v/v)的β-巯基乙醇(现配现用)。
实施例4拟南芥原生质体DNA提取和编辑位点的鉴定
构建表达载体，编辑拟南芥TTG1基因。构建方法如实施例1，区别在于，拟南芥TTG1基因的靶序列如SEQ ID No.9所示。
SEQ ID No.9：gctcatgataaagagg
实施例2的方法获得拟南芥原生质体，用W5溶液重悬，加入6-10μg重组质粒、200μL原生质体-MMG混悬液、220μL 40％ PEG4000转化原生质体。转化条件为：将转化体系轻柔混匀后于23℃放置20-25min，然后于23℃培养24-48h获得编辑的原生质体。
通过CTAB法提取原生质体的DNA。具体方法如下。
裂解原生质体：将拟南芥原生质体在液氮和37℃水浴中反复冻融10次，以裂解原生质体。在原生质体裂解液中加入CTAB溶液500μL，涡旋混匀；1000rpm离心10min，取上清与新的EP管中；在上清中加入等体积的氯仿，上下颠倒充分混匀后，1200rpm离心10min，取上清于新的EP管中；在上清中加入等体积的预冷的异丙醇，上下颠倒轻柔混匀，12000rpm离心10min，弃上清；在EP管中加入500μL 75％的乙醇，轻轻吹打，悬浮离心管底部的DNA，然后12000rpm离心10min，弃上清。常温干燥6h；在干燥后的EP管中加入30μL无菌水，吹打，溶解DNA。以DNA为模板作PCR鉴定。
通过高保真酶进行PCR反应，KOD反应体系：
5×KOD buffer，5μL；dNTP，5μL；MgSO4，2μL；SEQ ID No.10(10μM)，1μL；SEQ IDNo.11(10μM)，1μL；模板DNA，1μL；KOD酶，1μL；dH2O，34μL。PCR上下游引物序列如SEQ IDNo.10和11。
SEQ ID No.10：5’-cgtctttgggaaattaacgaaga-3’
SEQ ID No.11：5’-gcctgatacgcctttgttaa-3’
PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，68℃2min，35个循环；68℃10min；4℃10min。
经PCR扩增后，将扩增产物连接PJET1.2，连接体系如下：
T4连接buffer，2.5μL；PCR产物，1μL；PJET1.2，0.25μL；T4连接酶，0.25μL；dH2O，1μL。
PCR产物22℃连接30min。30min后转化大肠杆菌。转化完成后，涂抗性平板，37℃过夜培养。第二天挑单板作PCR鉴定，rTaq Mix反应体系如下：
rTaq Mix，5μL；PF(10μM)，1μL；PR(10μM)，1μL；DNA模板，1μL；dH2O，2μL。
PCR程序如下：95℃5min；然后95℃30s、55℃30s和72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃10min。
PCR结束后，电泳进行阳性鉴定；把阳性克隆送测序公司测序。结果表明，本发明构建的IscB表达载体能在拟南芥的原生质体中编辑TTG1基因(图5)。
图5中第一个是未经过编辑的TTG1基因序列片段，其余为编辑后的序列。下划线为PAM(TAM)序列，色块部分为靶序列。
从图5结果看，编辑率达到9.2％；并且，IscB以碱基替换为主。
实施例中溶液组成如下：
2％ CTAB(w/v)溶液：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA，1.4M NaCl，1％(v/v)PVP，高温灭菌。加1.5％(v/v)的β-巯基乙醇(现配现用)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均未脱离本发明的内容，都包含在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种ωRNA，其特征在于，其保守序列的互补DNA含有如SEQ ID No.1的所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的ωRNA，其特征在于，由保守序列及下游连接的与植物靶基因匹配的核苷酸序列组成，所述保守序列的互补DNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的ωRNA，其特征在于，所述与靶基因匹配的核苷酸序列长度为15-20bp。
4.一种IscB融合蛋白表达载体，其特征在于，含有依次连接的拟南芥的U6启动子、能转录权利要求1-3任一项所述的ωRNA的DNA序列、拟南芥UBQ1的启动子、Flag、核定位信号DNA片段及IscB基因。
5.根据权利要求4所述的IscB融合蛋白表达载体，其特征在于，所述IscB基因为编码SEQ ID No.2所示氨基酸的核苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的IscB融合蛋白表达载体，其特征在于，以PCAMBIA1304骨架质粒为载体。
7.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求5或6所述的IscB融合蛋白表达载体。
8.权利要求1-3任一项所述的ωRNA序列、权利要求4-6任一项所述的IscB融合蛋白表达载体或者权利要求7所述的宿主细胞在植物基因打靶或者编辑植物细胞DNA方面的应用。
9.一种编辑植物基因的方法，其特征在于，将权利要求4-6任一项所述的IscB融合蛋白表达载体转染到植物中；或者，将权利要求8所述的宿主细胞转染到植物中。
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