CN116497025A - 一种TnpB融合蛋白表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种融合蛋白表达载体及应用。一种TnpB融合蛋白表达载体，含有依次连接的拟南芥的U6启动子、ReRNA片段、拟南芥UBQ1的启动子、Flag、核定位信号DNA片段及TnpB基因。所述表达载体以含有上述的TnpB融合蛋白表达载体的宿主细胞可用于植物基因打靶或者编辑植物细胞DNA。由于TnpB基因序列短，其在动植物的遗传转化中有明显的优势，可开发一种成编辑多种物种的新技术，克服因为Cas9基因序列长，可遗传转化的物种少的缺点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种融合蛋白表达载体及应用。
背景技术
随着生物技术的不断发展，越来越多的育种新技术出现了。传统育种技术周期长，难以对目标形状作定点定向改良。近些年兴起的生物技术育种很大程度上缩短了育种周期，可定点改造植物内部基因，通过定点插入碱基、缺失碱基或者大片段插入、缺失碱基，或单碱基替换等方式在DNA水平上编辑指定基因的核苷酸序列，从而导致翻译的蛋白突变，获得可遗传的新表型植株。
基因编辑技术在育种中意义重大。目前，主要有以下基因编辑技术，包括ZFN(Zinc-finger nucleases),TALEN(Transctiption activator-like affectornucleases)和CRISPR(clustered regularly interspersed short palindromicrepeats)/Cas等。其中，用得最多的是CRISPR/Cas。该技术来源于细菌及古细菌中的免疫系统，主要通过靶点特异性的RNA引导Cas蛋白对靶位点的序列进行切割，从而形成各种突变。该系统中的Cas9已成功应用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、酵母、拟南芥、烟草、大豆、水稻、杨树、柑橘、丹参等多个物种。在医学上，该技术可用于疾病的诊断和治疗。在基础研究中，该方法可用于研究基因的功能。该技术也可用于新品种的培育，在植物、动物、微生物的育种改良中具有重要的应用价值。
虽然CRISPR/Cas很有应用前景，但是，CRISPR/Cas技术也有缺点，cas9基因长度为4287bp，编码的氨基酸为1429个，存在遗传转化的载体构建难度大，且不易转化到目的物种中，且翻译的蛋白太大，限制了其利用。因此，小的、灵活的编辑系统需要开发出来用于新品种的培育。
TnpB是从耐辐射奇球菌(D.radiodurans)中分离得到的一个转座子基因，该基因和Cas12有类似的结构域，可能是Cas12的祖先(Altae-Tran et al.2021)。目前有研究表明TnpB能够编辑序列人类细胞(Altae-Tran et al.2021)但还没有TnpB编辑植物基因的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有TnpB融合蛋白基因的表达载体，可以用来转染植物。
本发明的方案如下：
一种ReRNA的保守序列，含有如SEQ ID No.2的所示的核苷酸序列。优选的，所述ReRNA的保守序列如SEQ ID No.2所示。
一种ReRNA，由上述保守序列及下游连接的与靶基因匹配的核苷酸序列组成。所述与靶基因匹配的核苷酸序列长度为18-24bp，优选为20bp。。
上述ReRNA的保守序列或ReRNA可用于构建TnpB融合蛋白表达载体，用于植物基因打靶或编辑植物基因。
一种TnpB融合蛋白表达载体，含有依次连接的启动子、拟南芥的U6启动子、上述ReRNA片段、拟南芥UBQ1的启动子、Flag、核定位信号DNA片段及TnpB基因。
所述TnpB基因编码含有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白；优选的，所述TnpB基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述的核定位信号序列优选为Sv40NLS，如SEQ ID No.3所示。
载体为质粒，质粒优选为PCAMBIA1304。
所述TnpB融合蛋白表达载体的构建方法为，步骤包括：
(1)依次连接拟南芥的U6启动子(pAtU6)序列、ReRNA序列、拟南芥UBQ1的启动子(pAtUBQ1序列)、Flag序列、核定位信号序列Sv40NLS和TnpB基因；
(2)将上述序列通过酶切同源重组的方式，与载体连接，形成TnpB融合蛋白表达载体。
优选的，在TnpB基因下游为UBQ的终止子。
一种宿主细胞，含有上述的TnpB融合蛋白表达载体。所述的宿主细胞优选为农杆菌。
上述TnpB融合蛋白表达载体或者宿主细胞在植物基因打靶或编辑植物基因方面的应用。
一种基因打靶方法，将上述TnpB融合蛋白表达载体转染到植物中；或者，将含有TnpB融合蛋白表达载体宿主细胞转染到植物中。转染的对象可以是原生质体、植株或者植物的花、叶、根、茎。
可以将TnpB融合蛋白表达载体转化到宿主细胞如农杆菌中，用注射、浸泡等方法，转染植物的植株或者植物的花、叶、根、茎。
或者，将TnpB融合蛋白表达载体转化到植物原生质体中。
本发明的方案可用于多种植物的基因编辑，包括但不限于拟南芥、青蒿、丹参、黄岑等。
在靶基因包括但不限于拟南芥的CHLI2基因、青蒿的CYP71AV1基因、丹参的SmTⅡAS基因、黄芩的GUS基因。
在本发明的优选实施例中，利用所述融合蛋白表达载体进行基因打靶，所述基因为拟南芥基因，所用的体系为拟南芥原生质体；更优选地，所述的体系为拟南芥植株，通过叶片注射的方式。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了一种TnpB在植物中编辑基因的新方法。本方法通过构建载体，在植物中表达TnpB蛋白，在ReRNA序列的指导下编辑目的基因，以达到基因打靶的效果。
在本发明一个特别优选的实施例中，公开了一种含有TnpB序列的相关载体在植物中的应用。具体包括：制备上述的TnpB蛋白序列、构建质粒载体；设计特异性识别、切割拟南芥基因组指定位点序列的基因组编辑工具ReRNA，使用原生质体转化和注射的瞬时转化的方法将含有所述基因编辑工具ReRNA的质粒载体转化到拟南芥的原生质体和拟南芥的叶片中，通过PCR的方法鉴定基因编辑效率。
通过TnpB介导基因打靶方法，利用本发明提供的融合蛋白进行基因编辑，可以避免CRISPR/Cas9技术中CRISPR/Cas9核酸序列过长的问题。我们将此方法具体应用在敲除拟南芥CHLI2基因的载体构建过程中。我们的实验包括如下步骤：
由于TnpB基因序列为1224bp，Cas9基因序列为4287bp，约为Cas9基因序列的四分之一，因此，通过本发明的方法能够实现更方便、自由的编辑，适合更大范围的物种，对于分子育种有重要的意义。
并且，采用了新的ReRNA序列，能够适用于多种植物细胞的编辑。
本发明一方面因为载体小，可以简单、灵活、方便地在更多物种中实现基因编辑。更重要的是，本发明所提供的TnpB-1304载体以碱基替换为主，避免了碱基的插入和缺失，可防止脱靶带来的影响。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
第一，本发明公开了一种含有转座子TnpB蛋白序列的载体及其在编辑植物基因中的应用，实验证明TnpB能够对拟南芥的CHLI2基因进行有效基因打靶，打靶率高达20％。
第二，本发明通过在原生质体中转化TnpB-1304载体，在活体细胞内验证了该方法的可行性，并通过PCR鉴定及通过测序验证突变位点，可靠地证实了TnpB融合蛋白在植物体内编辑基因的能力。
第三，为了进一步验证本发明所使用的TnpB在植物体内的作用，通过在拟南芥叶片注射农杆菌，以瞬时转化的方法验证在植物体内的编辑效率，鉴定结果进一步证明TnpB可在植物体内编辑基因。
本发明所提供的TnpB-1304载体的使用能够靶向编辑基因，由于其基因序列短，其在动植物的遗传转化中有明显的优势，可开发一种成编辑多种物种的新技术，克服因为Cas9基因序列长，可遗传转化的物种少的缺点，该方法具有潜在的重要经济价值和意义。
附图说明
图1为包含有不同结构域的TnpB结构示意图；
图2为用于编辑拟南芥的TnpB-1304质粒构建流程图；
图3为采用实施例1的TnpB-1304质粒转化后的原生质体图；
图4为实施例3的TnpB-1304质粒转化拟南芥原生质体后对基因的编辑测序结果；
图5为实施例4TnpB-1304质粒的农杆菌注射拟南芥后的测序结果；
图6为实施例5TnpB编辑拟南芥和别的物种的基因的测序结果。
具体实施方式
以下对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不局限于以下的实施例介绍，凡依照本发明的原理或理念所作的等同的变化或变通都应视为本发明保护的范畴。发明涉及的TnpB蛋白序列如SEQ ID NO.1；ReRNA序列如SEQ ID NO.2；核定位信号序列(nuclearlocalization sequence,NLS)如SEQ ID NO.3。
实施例1
构建用于编辑拟南芥的TnpB-1304的目的表达载体，TnpB蛋白的结构域示意图如图1，序列依次包括WED-REC-WED-RuvC-HN-ZnF-RuvC，氨基酸序列如SEQ ID NO.1。表达载体构建流程方法如图2。
首先，通过基因合成了图2A的序列，依次连接pAtU6序列、ReRNA序列、与靶基因匹配的核苷酸序列、pAtUBQ1序列、Flag序列、核定位信号序列Sv40NLS和编码TnpB蛋白的序列及UBQ终止子。该部分序列测序结果验证表明该部分序列成功合成，其中ReRNA序列如SEQID NO.2，TnpB蛋白序列如SEQ ID NO.1。与靶基因匹配的核苷酸序列长度20bp，如SEQ IDNo.8所示，用于编辑CHLI2基因。
SEQ ID No.8：atcgaaaaggctttaaccga。
以PCAMBIA1304骨架质粒上的HindIII和EcoRI的两酶切位点的序列(如图2B)以同源重组的方式重组在一起形成一个新的载体，命名为TnpB-1304，如图2C。构建好的TnpB-1304的表达质粒载体使用引物扩增法对其序列进行测序验证，测序结果验证了构建成功。设计引物序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，扩增出该部分序列，测序结果说明成功构建了TnpB-1304表达载体(图2C)。
SEQ ID NO.4：5’-gtaaaacgacggccagtgccaagcttcattcggagttttt-3’
SEQ ID NO.5：5’-acagctatgaccatgattacgaattcgagctcggtaccac-3’
实施例2拟南芥原生质体的构建和转化
选取一个月左右的拟南芥植株的叶片，切成1-2mm的长条，然后浸入到酶解液于水平摇床23℃黑暗酶解4-6h，摇床转速为40-60rpm。进一步的，酶解液加入等体积的W5溶液(154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾，2mM MES，pH 5.7)，用150μm尼龙膜过滤后离心。
获得的原生质体用W5溶液重悬，加入6-10μg重组质粒、200μL原生质体-MMG混悬液、220μL 40％ PEG4000转化原生质体。
转化条件为：将转化体系轻柔混匀后于23℃放置20-25min，然后于23℃培养24-48h获得编辑的原生质体，如图3。
实施例中溶液组成如下：
酶解液：1.65％纤维素酶R10，0.44％离析酶R10，0.4mol/L甘露醇，0.02mol/L氯化钾，pH 5.7的0.02mol/L MES，0.01mol/L氯化钙，0.1％ BSA
W5溶液：154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾，2mM MES(pH5.7)。
MMG溶液：0.4M甘露醇，15mM氯化镁，4mM MES(pH 5.7)。
40％PEG4000溶液：40％PEG4000，0.8M甘露醇，1M氯化钙。
实施例3拟南芥原生质体DNA提取和编辑位点的鉴定
通过CTAB法提取原生质体的DNA。具体方法如下。
裂解原生质体：将拟南芥原生质体在液氮和37℃水浴中反复冻融10次，以裂解原生质体。在原生质体裂解液中加入CTAB溶液500μL，涡旋混匀；1000rpm离心10min，取上清与新的EP管中；在上清中加入等体积的氯仿，上下颠倒充分混匀后，1200rpm离心10min，取上清于新的EP管中；在上清中加入等体积的预冷的异丙醇，上下颠倒轻柔混匀，12000rpm离心10min，弃上清；在EP管中加入500μL 75％的乙醇，轻轻吹打，悬浮离心管底部的DNA，然后12000rpm离心10min，弃上清。常温干燥6h；在干燥后的EP管中加入30μL无菌水，吹打，溶解DNA。以DNA为模板作PCR鉴定。
通过高保真酶进行PCR反应，KOD反应体系：
5×KOD buffer，5μL；dNTP，5μL；MgSO4，2μL；SEQ ID NO.6(10μM)，1μL；SEQ IDNO.7(10μM)，1μL；模板DNA，1μL；KOD酶，1μL；dH2O，34μL。
SEQ ID NO.6：5’-atccgtttgctgctatagttgg-3’
SEQ ID NO.7：5’-ggaaatcctgaagaaggagagctt-3’
PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，68℃2min，35个循环；68℃10min；4℃10min。
经PCR扩增后，将扩增产物连接PJET1.2，连接体系如下：
T4连接buffer，2.5μL；PCR产物，1μL；PJET1.2，0.25μL；T4连接酶，0.25μL；dH2O，1μL。
PCR产物22℃连接30min。30min后转化大肠杆菌。转化完成后，涂抗性平板，37℃过夜培养。第二天挑单板作PCR鉴定，rTaq Mix反应体系如下：
rTaq Mix，5μL；PF(10μM)，1μL；PR(10μM)，1μL；DNA模板，1μL；dH2O，2μL。
PCR程序如下：95℃5min；然后95℃30s、55℃30s和72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃10min。
PCR结束后，跑电泳进行阳性鉴定。把阳性克隆送测序公司测序。结果表明，TnpB能在拟南芥的原生质体中编辑CHLI2基因(图4)。
实施例中溶液组成如下：
2％ CTAB(w/v)溶液：100mM Tris-HCl(pH 8.5)，20mM EDTA，1.4M NaCl，1％(v/v)PVP，高温灭菌。加1.5％(v/v)的β-巯基乙醇(现配现用)。
实施例4农杆菌瞬时转化拟南芥叶片和编辑位点的鉴定
将构建好的质粒转化到农杆菌GV3101中，28℃过夜摇菌后，用MS液体培养基稀释OD＝0.6，加10mM MES+100μM乙酰丁香酮静置3h后注射4w的拟南芥；72h后取叶片于1.5mLEP管(加入两颗钢珠)中，液氮中速冻；
用细胞破碎仪破碎样品，按照CTAB的方法提取DNA用于PCR鉴定(见实施例3)。PCR结束后，跑电泳进行阳性鉴定。把阳性克隆送测序公司测序。测序结果见图5。结果表明，TnpB能在拟南芥的植株中编辑CHLI2基因(图5)，编辑效率在20％。
实施例5拟南芥稳定转化和编辑位点的鉴定
将实施例4的农杆菌通过浸花法稳定转入到拟南芥中，按照实施例4的方法提取DNA并鉴定编辑位点，通过测序鉴定表明该方法能在拟南芥体内编辑DNA(图6A)，结果显示，编辑效率在20％。
实施例6青蒿，丹参和黄芩原生质体的编辑位点的鉴定
按照实施例3的载体构建方法分别将青蒿中的CYP71AV1基因的序列gtggcagatatctttccttc，丹参SmTⅡAS基因的序列gaatgcagattgcaagatga，黄芩GU S基因的序列ttggaatggtatacagaatt(SEQ ID No.9-11)作为与靶基因匹配的核苷酸片段构建到TnpB-1304；参照实施例2、4，制备了青蒿、丹参和黄芩的原生质体，把构建好的质粒转化到相应原生质体中。通过测序鉴定TnpB在原生质体的编辑效率(图6B,C,D)，结果显示，编辑效率在20％。
SEQ ID No.9：gtggcagatatctttccttc
SEQ ID No.10：gaatgcagattgcaagatga
SEQ ID No.11：ttggaatggtatacagaatt
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均未脱离本发明的内容，都包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种ReRNA的保守序列，其特征在于，含有如SEQ ID No.2的所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的ReRNA的保守序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种ReRNA，其特征在于，由权利要求1所述的保守序列及下游连接的与靶基因匹配的核苷酸序列组成。
4.根据权利要求3所述的ReRNA，其特征在于，所述与靶基因匹配的核苷酸序列长度为18-24bp。
5.一种TnpB融合蛋白表达载体，其特征在于，含有依次连接的拟南芥的U6启动子、权利要求3或4任一项所述的ReRNA片段、拟南芥UBQ1的启动子、Flag、核定位信号DNA片段及TnpB基因。
6.根据权利要求5所述的TnpB融合蛋白表达载体，其特征在于，所述TnpB基因编码含有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的蛋白。
7.根据权利要求5所述的TnpB融合蛋白表达载体，其特征在于，所述TnpB基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
8.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求5-7任一项所述的TnpB融合蛋白表达载体。
9.权利要求1或2所述的保守序列、权利要求3或4所述的ReRNA、权利要求5-7任一项所述的TnpB融合蛋白表达载体或者权利要求8所述的细胞在植物基因打靶或者编辑植物细胞DNA方面的应用。
10.一种基因打靶的方法，其特征在于，将权利要求5-7任一项所述的TnpB融合蛋白表达载体转染到植物中；或者，将权利要求8所述的宿主细胞转染到植物中。
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