CN105063023A - 一种锌指核酸酶介导的猪mstn基因突变序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种锌指核酸酶介导的猪MSTN基因突变序列及其应用。本发明利用锌指核酸酶技术介导猪的肌肉生成抑制素MSTN基因发生碱基缺失，造成移码突变，导致翻译提前终止无法形成MSTN功能蛋白，并获得了MSTN基因第3782-3796位核苷酸缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G的突变序列。通过试验证明：MSTN基因第3782-3796位核苷酸缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G的猪表现明显的双肌表型，肌肉量和瘦肉率都显著增加，脂肪含量明显降低。

Description

一种锌指核酸酶介导的猪MSTN基因突变序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种锌指核酸酶介导的猪MSTN基因突变序列及其应用。

背景技术

锌指核酸酶(ZincFingerNuclease，ZFN)是一种由锌指蛋白和FokI核酸内切酶的剪切结构域重组形成的嵌合蛋白，其中锌指蛋白可特异性结合目的靶序列，FokI核酸内切酶则负责对DNA序列进行特异性剪切。当两个ZFN分别结合到位于DNA的双链上间隔5至7个碱基的目的靶序列后，可形成二聚体，进而激活FokI核酸内切酶的功能，使DNA在特定位点产生双链断裂，再通过同源重组或非同源末端连接修复断裂双链。由于非同源末端连接修复的可变性导致突变类型的不可预知性，因此通过筛选可以获得靶基因多种突变类型的细胞克隆。

MSTN又称生长分化因子-8(Growthdifferentiationfactor-8,GDF-8)，属于转化生长因子-β(Transforminggrowthfactor-β,TGF-β)超家族，是骨骼肌发育的主要负调控因子。该基因在不同物种间高度保守，而且在牛、人、羊及狗等物种上都发现了由于MSTN自然突变而导致肌肉肥大，俗称“双肌”的现象。但到目前为止，未见由于猪的MSTN自然或人工突变导致“双肌”表型的报道。猪不仅是重要的肉食来源，而且由于其生理特性与人类相似，又是非常好的疾病动物模型。因此，对猪的MSTN进行突变研究具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子是如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码相同蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同蛋白质的DNA分子。

本发明的第二个目的是提供上述DNA分子的新用途。

本发明提供了上述DNA分子在检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率和/或脂肪含量中的应用。

本发明还提供了上述DNA分子在制备检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率和/或脂肪含量的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率的方法包括如下步骤：是检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子是否发生缺失和第3800位核苷酸分子是否由T突变为G，以确定待测猪的基因型为野生型、双等位基因突变型还是单等位基因突变型，并根据所述待测猪的基因型确定所述待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率：基因型为双等位基因突变型的待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率高于或候选高于基因型为单等位基因突变型的待测猪，基因型为单等位基因突变型的待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率高于或候选高于基因型为野生型的待测猪；

所述双等位基因突变型为两条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均发生缺失，且第3800位核苷酸分子均由T突变为G的基因型；

所述单等位基因突变型为一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G，且另一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子未发生缺失且第3800位核苷酸分子未由T突变为G的基因型；

所述野生型为两条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均未发生缺失且第3800位核苷酸分子均未由T突变为G的基因型；

所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测猪的脂肪含量的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测猪的脂肪含量的方法包括如下步骤：是检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子是否发生缺失和第3800位核苷酸分子是否由T突变为G，以确定待测猪的基因型为野生型、双等位基因突变型还是单等位基因突变型，并根据所述待测猪的基因型确定所述待测猪的脂肪含量：基因型为双等位基因突变型的待测猪的脂肪含量低于或候选低于基因型为单等位基因突变型的待测猪，基因型为单等位基因突变型的待测猪的脂肪含量低于或候选低于基因型为野生型的待测猪；

所述双等位基因突变型为两条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均发生缺失，且第3800位核苷酸分子均由T突变为G的基因型；

所述单等位基因突变型为一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G，另一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子未发生缺失且第3800位核苷酸分子未由T突变为G的基因型；

所述野生型为两条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均未发生缺失且第3800位核苷酸分子均未由T突变为G的基因型；

所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

上述方法中，所述检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子是否发生缺失和第3800位核苷酸分子是否由T突变为G的方法为测序。

本发明的第五个目的是提供一种培育高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含量的猪的方法。

本发明提供的培育高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含量的猪的方法包括选择上述双等位基因突变型或单等位基因突变型的猪进行育种。

本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率和/或脂肪含量的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率和/或脂肪含量包括如下步骤：是检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因为双等位基因突变型、单等位基因突变型还是野生型；

所述野生型为两条同源染色体上的MSTN基因均为野生型MSTN基因；

所述双等位基因突变型为两条同源染色体上的MSTN基因均为突变型MSTN基因；

所述单等位基因突变型为一条同源染色体上的MSTN基因为突变型MSTN基因，且另一条同源染色体上的MSTN基因为野生型MSTN基因；

所述突变型MSTN基因的序列如序列表中序列1所示；

所述野生型MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

本发明的第七个目的是提供一种制备高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含量的猪的方法。

本发明提供的制备高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含量的猪的方法包括如下步骤：将猪的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G，得到瘦肉率提高和/或肌肉含量提高和/或脂肪含量降低的猪。

上述方法中，所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

本发明的第八个目的是提供一种将猪的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G的方法或产品的新用途。

本发明提供了将猪的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G的方法或产品在制备瘦肉率提高和/或肌肉含量提高和/或脂肪含量降低的猪中的应用。

上述应用中，所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

本发明的最后一个目的是提供将猪的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G的产品。

本发明提供的将猪的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G的产品包括TALENmRNA对和DonorDNA。

上述产品中，所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

上述产品中，所述DonorDNA的序列如序列表中序列5所示；所述TALENmRNA对是根据唯尚立德Talen试剂盒制备得到的一对TALENmRNA。

上述产品中，所述TALENmRNA对是将Talen左臂和Talen右臂混合得到的，Talen左臂和Talen右臂主要使用唯尚立德Talen试剂盒中的以下模块制备得到的：从产品盒A和产品盒B中选取以下模块：GC1、T2、GT3、AA4、CC5、TT6、CC7、CA8和GG9制备Talen左臂；从产品盒A和产品盒B中选取以下模块：CA1、G2、TA3、AA4、CT5、CT6、TA7、CC8和AG9制备Talen右臂。上述产品盒A和产品盒B均为唯尚立德Talen试剂盒中的产品。

本发明利用锌指核酸酶技术介导猪的肌肉生成抑制素(Myostatin，MSTN)基因发生碱基缺失，造成移码突变，导致翻译提前终止无法形成MSTN功能蛋白，并获得了MSTN基因第3782-3796位核苷酸缺失且第3800位核苷酸由T突变为G的突变序列。通过试验证明：MSTN基因的第3782-3796位核苷酸缺失且第3800位核苷酸由T突变为G的猪表现明显的双肌表型，肌肉量和瘦肉率都显著增加，脂肪含量明显降低。

附图说明

图1为ZFN的特异结合位点和特异敲除靶位点序列。

图2为ZFN定点敲除MSTN基因载体图。

图3为ZFN定点敲除MSTN特异位点原理图。

图4为MSTN基因突变序列与野生型序列比对图。

图5为三种基因型(MSTN^+/+、MSTN^+/-、MSTN^-/-)梅山猪MSTN基因cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶结果检测图。

图6为MSTN基因缺失突变后该基因的DNA、cDNA及氨基酸序列变化示意图。

图7为MSTN基因在三种基因型(MSTN^+/+、MSTN^+/-、MSTN^-/-)梅山猪中的相对定量PCR结果图。

图8为MSTN^+/+、MSTN^-/-梅山猪中MSTN蛋白的WesternBlot检测结果。

图9为MSTN^+/+、MSTN^+/-、MSTN^-/-梅山猪血清中MSTN蛋白的ELISA检测结果。

图10为三种基因型(MSTN^+/+、MSTN^+/-、MSTN^-/-)梅山猪的代表图。

图11为三种基因型(MSTN^+/+、MSTN^+/-、MSTN^-/-)梅山猪的胴体分割检测结果。

图12为三种基因型(MSTN^+/+、MSTN^+/-、MSTN^-/-)梅山猪不同肌肉块重量检测结果。

图13为Talen载体示意图。

图14为重组PCR示意图。

图15为pBR322-TK骨架载体示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、锌指核酸酶定点敲除MSTN基因

野生型成纤维细胞为离体纯种梅山猪原代成纤维细胞，其基因组中的MSTN基因为野生型MSTN基因(序列表中序列2所示)；

突变型成纤维细胞为将离体纯种梅山猪原代成纤维细胞基因组中MSTN基因第3782-3796位核苷酸敲除且将第3800位核苷酸分子由T突变为G，得到的成纤维细胞，该细胞中为MSTN突变基因(序列表中序列1所示)。

突变型成纤维细胞通过ZFN质粒导入野生型成纤维细胞得到。

ZFN质粒为sigma公司的一对ZFN质粒，其特异靶位点序列为CCTTCCCAGGACcaggaGAAGATGGGCTGGTA(对应序列表中序列2所示的MSTN基因5’末端第3770-3801位核苷酸)。

具体步骤如下：

一、ZFN质粒的设计与构建

1、ZFN质粒的设计

构建定点敲除梅山猪MSTN基因靶序列特异位点的锌指核酸酶(ZFN)质粒pZFN质粒，ZFN由一个DNA结合域和DNA切割结构域组成，ZFN对特异识别结合≥编码区内24bp碱基，保证ZFN切割MSTN基因的高度精确与高效。

锌指核酸酶(ZFN)特异敲除靶位点序列位于MSTN基因的第二外显子，特异靶位点序列为CCTTCCCAGGACcaggaGAAGATGGGCTGGTA(对应序列表中序列2所示的MSTN基因5’末端第3770-3801位核苷酸)，具体如图1所示，其中，两端序列(CCTTCCCAGGAC与GAAGATGGGCTGGTA)是ZFN的特异结合位点，中间部分序列(cagga)是ZFN特异敲除的靶序列位点。

2、ZFN质粒的构建

ZFN质粒(pZFN)由sigma公司构建完成(为一对质粒)，质粒的示意图如图2所示，其中ZFN为含有靶位点结合序列的片段。

ZFN质粒特异敲除靶序列位点的原理如图3所示，在MSTN序列上设计打靶效率最高的目的敲除位点，锌指核酸酶能够识别并结合指定的位点，双体FokI高效且精确地切断靶DNA产生双链DNA的断裂，随后细胞通过“同源定向修复”或“非同源末端连接”—DNA天然修复过程来治愈靶点的断裂，其中非同源末端连接会造成目的基因切口处碱基片段的缺失、突变或插入部分碱基序列进而实现对基因的定点修饰，破坏其功能，最终改变动物的特异性状。

二、锌指核酸酶定点敲除MSTN基因

1、猪胎儿成纤维原代细胞分离培养

(1)选取怀孕35天的纯种梅山妊娠母猪(太仓市种猪场)作为实验动物，通过手术方式取出含有胚胎的子宫，置于无菌烧杯中，封口膜封口带入实验室；

(2)在无菌超净台内将胚胎周围的包膜剔除，将胚胎放于无菌的加有PBS的烧杯中；

(3)将胚胎逐个转移至小的无菌培养皿中，用无菌的剪刀和镊子去除胚胎的头、尾及四肢后，将组织剪成1mm³大小的小块，并加入少许血清使组织湿润；

(4)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距约0.2cm-0.5cm，小块涂布好之后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后向瓶内加入适量培养基，盖好瓶塞，放置于37℃培养箱中；

(5)培养约8小时，待小块贴壁后，将培养瓶缓慢翻转平放，待细胞覆盖培养皿80％左右即可冻存或传代，得到离体纯种梅山猪原代成纤维细胞。

2、核转染pZFNs

将ZFN质粒转染到梅山猪原代成纤维细胞，得到转染后细胞，具体使用Lonza公司提供的电转试剂AmaxaBasicNucleofectorKitforPrimaryMammalianFibroblasts及核转染仪进行转染实验，具体操作：

(1)将离体纯种梅山猪原代成纤维细胞解冻复苏，培养至细胞融合率约为90％，用于转染；

(2)将核转染溶液(NucleofectorSolution)与添加物(Supplement)(试剂盒中含有)按体积比4.5：1的比例配制核转染溶液室温预热，单个样品转染可取82uL核转染溶液加入18uL添加物配制成100uL核转染溶液；

(3)吸去培养基，加入10mL预热至37℃的DPBS冲洗一遍，吸除DPBS；

(4)加入2mL预热至37℃的0.1％胰酶溶液，室温消化约3min；

(5)加入2mL含10％FBS的DMEM培养基终止消化，用移液器反复吹打数次，至细胞全部均匀重悬在培养基中；

(6)将细胞转移至15mL离心管中，取部分进行细胞计数，剩余细胞1000g离心5min；

(7)弃上清液，用微量加样器去除残留培养基，加入提前室温预热的核转染溶液，重悬细胞，使细胞密度在1×10⁶/100uL；

(8)向细胞悬液中加入步骤一的2中制备的pZFN质粒，使质粒浓度为5ug/100uL，轻轻吹吸混匀后转移到电击杯中，注意样品必须能够覆盖电击杯底部且避免生成气泡；

(9)打开核转染仪，选择进入已优化好的程序(T-016)，将电击杯放入电击槽中，按enter键开始电击；

(10)程序结束后取出电击杯，沿电击杯内壁缓缓加入500uL预热的培养基，迅速将样品转移到加有20％FBS的DMEM培养基中，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，得到转染后细胞。

3、有限稀释法制备单细胞克隆及基因型鉴定

(1)将上述步骤2得到的转染后细胞培养至融合率达80％-90％时，用37℃的0.1％胰酶消化，10％FBS的DMEM培养基终止消化后离心收集细胞。

(2)20％FBS的DMEM培养基重悬细胞，取部分细胞进行计数，将细胞稀释至100个/mL，向20个已添加9mL20％FBS的DMEM培养基的100mm培养皿中各加入1mL细胞悬浮液，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。

(3)待培养皿中的细胞克隆生长至直径达2mm以上时，去除培养基，DPBS冲洗后，用牛津杯罩在克隆团上，向其中滴加约20μL37℃的0.1％胰酶，消化约3分钟后，滴加20％FBS的DMEM培养基终止消化，轻轻吹打后将其转移至48孔板中扩大培养。

(4)48孔板中细胞融合率达90％时，消化后取一半细胞用于细胞克隆基因型鉴定，剩余一半继续在孔板中培养。

(5)用于鉴定的细胞经过1000g离心5min后，弃上清，依据细胞沉淀量加入10-20μL细胞裂解液。

(6)吸取3μL细胞裂解液为模板进行PCR鉴定，以表1中的引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：10μL5×Buffer、1μL10mMdNTP、1μL25μM正向引物、1μL25μM反向引物、0.5μLRocheExpandHighFidelity^PLUSPolymerase、200ng基因组DNA，加超纯水至50μL。

PCR扩增程序：95℃5min；94℃20s，退火温度58℃，72℃30s，循环30次，最后72℃延伸5min。

PCR扩增产物送测序公司测序。

表1、扩增MSTN-基因组DNA目的片段引物表

(7)DNA测序结果经Bioedit软件与NCBI中梅山猪的MSTN序列进行比对，发生突变的序列对应的细胞克隆确定为阳性细胞，对该细胞进行冻存。另外，测序结果中出现套峰的序列，需要将其PCR产物进行回收(使用QIAGEN琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒)，使用TakaRaD101A试剂盒，将其连接pMDR18-T载体上，转化DH5α感受态细胞后，每条序列挑取约20个单菌落进行测序，以鉴定套峰是否是由于单等位基因突变、还是不同类型的双等位基因突变造成的。

测序结果表明：阳性细胞中突变的MSTN基因为将一条染色体中野生型MSTN基因第3782-3796位核苷酸敲除且第3800位核苷酸分子由T突变为G得到的DNA分子，将该阳性细胞命名为突变型成纤维细胞。

野生型成纤维细胞基因组中的MSTN基因为野生型MSTN基因(序列表中序列2所示)；

突变型成纤维细胞基因组中的MSTN突变基因(序列表中序列1所示)为将野生型MSTN基因第3782-3796位核苷酸敲除且第3800位核苷酸分子由T突变为G得到的DNA分子。

可以看出，突变型成纤维细胞和野生型成纤维细胞的不同仅在于MSTN基因上是否存在序列2中第3782-3796位核苷酸的缺失和第3800位核苷酸分子是否由T突变为G。

下面的实验研究野生型MSTN基因第3782-3796位核苷酸敲除且第3800位核苷酸分子由T突变为G后对猪的表型带来的影响。

实施例2、MSTN突变基因的应用

一、利用TALEN敲除MSTN基因制备突变型成纤维细胞

野生型成纤维细胞为离体纯种梅山猪原代成纤维细胞，其基因组中的MSTN基因为野生型MSTN基因(序列表中序列2所示)；

突变型成纤维细胞为将离体纯种梅山猪原代成纤维细胞基因组中MSTN基因第3782-3796位核苷酸敲除且将第3800位核苷酸分子由T突变为G，得到的成纤维细胞，该细胞中为MSTN突变基因(序列表中序列1所示)。

突变型成纤维细胞是通过将TALENmRNA对和DonorDNA导入野生型成纤维细胞得到的。

TALENmRNA对是根据唯尚立德Talen试剂盒制备得到的一对TALENmRNA对，其靶位点序列如序列表中序列2的第3780-3795位核苷酸分子所示。TALENmRNA对是将Talen左臂和Talen右臂混合得到的，Talen左臂和Talen右臂主要使用唯尚立德Talen试剂盒中的以下模块制备得到的：从产品盒A和产品盒B中选取以下模块：GC1、T2、GT3、AA4、CC5、TT6、CC7、CA8和GG9制备Talen左臂；从产品盒A和产品盒B中选取以下模块：CA1、G2、TA3、AA4、CT5、CT6、TA7、CC8和AG9制备Talen右臂。上述产品盒A和产品盒B均为唯尚立德Talen试剂盒中的产品。

DonorDNA的序列如序列表中序列5所示。

具体步骤如下：

1、TalenmRNA对的构建

(1)打靶位点的设计

打靶位点区域的核酸序列如序列表中序列2的第3780-3795位核苷酸分子所示，根据ZiFiT在线软件(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)设计并分析TALEN靶点位置，明确Talen左臂和Talen右臂识别序列。靶点信息如下：TGCTGTAACCTTCCCAGGaccaggagaagatgggCTGGTAAGAGTTTACTGA；

Talen左臂识别序列(17bp):GCTGTAACCTTCCCAGG；

对应RVD：NNHDNGGGNGNINIHDHDNGNGHDHDHDNINNNN；

Talen右臂识别序列(17bp):CAGTAAACTCTTACCAG；

对应RVD：HDNINNNGNININIHDNGHDNGNGNIHDHDNINN；

间隔区:16bp。

(2)Talen左臂和Talen右臂的构建

使用唯尚立德Talen试剂盒构建Talen左臂和Talen右臂，按照如下方法选择拼接的模块单元：本试剂盒的TALEN的组装是将模块单元按照识别碱基的位置进行拼接，所以每个模块单元标有碱基字母和数字，数字代表着位置，共有9个固定位置。进行TALE组装时，将Tale的识别序列分成9个部分，其中第9和8部分为固定位置，第9部分为识别序列的最后2个碱基，第8部分为识别序列的倒数3、4碱基，1到7部分则可以拆分组合，即可选单碱基，也可选双碱基，因此拼接的TALE识别DNA长度为11-18bp。

从产品盒A和产品盒B中选取以下模块：GC1、T2、GT3、AA4、CC5、TT6、CC7、CA8和GG9用于制备Talen左臂；从产品盒A和产品盒B中选取以下模块：CA1、G2、TA3、AA4、CT5、CT6、TA7、CC8和AG9用于制备Talen右臂。产品盒A和产品盒B均为唯尚立德Talen试剂盒的产品。

Talen左臂制备方法具体如下：

1)找出需要连接的9个模块后，从-20℃度取出B1、B2、S1(B1和B2为buffer；S1为酶)，置于冰上溶化，按照如下体系加样到PCR管中(V代表Talen载体，是唯尚立德Talen试剂盒中的产品，如图12所示)。

上述9个模块为GC1、T2、GT3、AA4、CC5、TT6、CC7、CA8和GG9，均来源于唯尚立德Talen试剂盒。

用枪吹打混匀后，放置到PCR仪上，按照如下程序设置PCR仪进行反应，得到反应产物(反应时，PCR仪热盖温度一定要关闭)：

2)反应结束后，加入如下Buffer和酶。

3)转化

取步骤2)的产物5-10μL加入到50μLDH5a感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟后，放入42℃水浴锅中热激90s，置于冰上3min后，涂于氨苄抗性的平板。

4)阳性克隆的鉴定

采用菌落PCR方法鉴定阳性克隆。分别挑选6～8个白色克隆至10μL灭菌水中，涡旋混合。取1μL为模板进行菌落PCR。反应条件为94℃10分钟，94℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟，25个循环，72℃10分钟。反应体系为20uL、sq-fp和sq-rp各取0.5uL。

识别序列为17个碱基的tale菌落PCR跑胶结果，使用0.7％agarose胶120V40min。目的条带为1.8Kbp左右即为阳性菌落。将阳性菌落的水溶液接种于5mL氨苄抗性的LB中，37℃，220rpm培养16h左右。次日进行质粒抽提，并使用sq-fp和sq-rp双向测序。

5)测序结果的比对

利用序列分析软件(Bioedit)将测序结果与说明书中提供的RVD序列信息进行比对分析，比对结果一致的质粒即为构建成功的Talen打靶载体，用于后续试验。

6)体外转录mRNA及细胞转染实验

NotI线性化上述步骤5)获得的Talen打靶载体，琼脂糖凝胶检测质粒是否完全切开，回收DNA(即为表2中的LinertemplateDNA)，以回收的DNA为模板，转录得到TALENmRNA(MESSAGESP6Kit,Invitrogen)，反应体系如表2所示，37℃反应2小时。

表2、反应体系

LiCl沉淀回收上述TALENmRNA：在上述反应中加入15μlDEPCH₂O和15μLLiCl，-20℃沉淀30min。4℃最大转速离心15min，弃上清；加入1ml70％乙醇，4℃最大转速离心10min；弃上清，注意管底的白色沉淀，最后溶于20～30μlDEPCH₂O中，nanodrop定量，得到Talen左臂。

按照上述步骤将制备Talen左臂的模块：GC1、T2、GT3、AA4、CC5、TT6、CC7、CA8和GG9换成制备Talen右臂的模块：CA1、G2、TA3、AA4、CT5、CT6、TA7、CC8和AG9，其他步骤不变，得到Talen右臂。

将Talen左臂和Talen右臂混合(Talen左臂和Talen右臂的质量比为1:1)，得到TALENmRNA对，将其进行后续的注射操作。

(3)细胞系基因敲除效率检测

1)细胞转染

取上述步骤(2)得到的TALENmRNA对共2微克(1:1)转染到3.5cm皿的成纤维细胞中，使用Lonza公司提供的电转试剂AmaxaBasicNucleofectorKitforPrimaryMammalianFibroblasts及核转染仪进行转染实验。48h后收集细胞，取1/3的细胞提取细胞基因组DNA进行内源活性的检测，其余的2/3细胞用于单克隆细胞的培养或者冰冻保存。

2)内源活性检测

利用表1(扩增MSTN-基因组DNA目的片段引物表)中的引物进行PCR扩增(突变型的细胞和野生型对照细胞)然后纯化回收PCR产物，定量后，分别取等量的突变型和野生型PCR产物自退火，用T7E1(北京唯尚立德，货号：E001S)酶切(具体使用方法见T7E1的使用手册)，琼脂糖凝胶检测，野生型为单一条带，突变型则出现切割后条带，证明TALENmRNA对是有活性的，并可根据条带亮度来估算突变比例。

2、Talen介导的同源重组载体pBR322-TK-105-2159的构建

(1)重组PCR同源臂引物设计

左臂扩增引物：ZB-105-F1： gtcgacgtgtctcgtccccaggtaat；ZB-105-R1：扩增片段大小为：848bp；下划线字体为SalI酶切位点；加粗字体为保护碱基；斜体为与右臂同源序列。

右臂扩增引物：YB-105-F2：YB-105-R2： atcgattgccccaatcttttcctcca；扩增片段大小为：1351bp；下划线字体为ClaI酶切位点；加粗字体为保护碱基；斜体为与左臂同源序列。

(2)利用重组PCR获得打靶序列

以梅山猪的基因组DNA为模板，采用ZB-105-F1/ZB-105-R1引物对和YB-105-F2/YB-105-R2引物对分别扩增左臂与右臂，引物如表3所示。扩增体系为：模板1μL、引物各1μL、LATaqVersion2.0plusdye酶10μL，将扩增后的产物取1μL，用水稀释100倍，取稀释后的左臂与右臂扩增产物各1μL混合当模版，用ZB-105-F1与YB-105-R2为扩增引物，扩增体系同上，获得同源重组打靶序列，重组PCR原理如图14所示。

表3、突变序列重组PCR引物列表

(3)同源重组打靶载体的构建

1)将上述步骤(2)获得的同源重组打靶序列进行TA克隆，克隆后提取质粒，并对其进行测序。测序结果表明：同源重组打靶序列如序列表中序列3所示。

2)将重组序列酶切连接到打靶骨架载体

用限制性内切酶SalI与ClaI分别将上述步骤1)提取的质粒与pBR322-TK载体(是将pBR322载体(Promega)上连接了TK负筛选标记，pBR322-TK载体的核苷酸序列如序列表中序列4所示)进行双酶切，分别纯化回收得到大小为2159bp的同源重组打靶序列和大小为5948bp的pBR322-TK骨架载体。利用DNALigationKit及其说明书中的方法，将大小为2159bp的同源重组打靶序列和大小为5948bp的pBR322-TK骨架载体连接，获得重组质粒pBR322-TK-105-2159，并对其进行测序。

测序结果表明：重组质粒pBR322-TK-105-2159为将序列表中序列3所示的同源重组打靶序列插入pBR322-TK载体的SalI与ClaI酶切位点间，且保持pBR322-TK载体的其他序列不变得到的载体。

(4)无内毒素大提及质粒线性化

1)无内毒素质粒大量提取

使用QiagenEndoFreePlasmidMaxiKit，提取pBR322-TK-105-2159质粒。操作步骤参与说明书(Qiagen，货号：12362)。

2)质粒线性化及纯化回收：同(3)中的质粒酶切方法，将pBR322-TK-105-2159质粒进行线性化，得到线性化的pBR322-TK-105-2159质粒，并对其进行测序。结果表明：pBR322-TK-105-2159质粒的核苷酸序列如序列表中序列5所示，将其命名DonorDNA。

向酶切溶液中加入1/10体积NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇。混匀后室温放置2min，12000rpm4℃离心5min。加入1mL70％乙醇洗沉淀两次，弃掉乙醇，干燥后用Nclease-free水溶解过夜，测定260/280OD。

3、TALENmRNA对与DonorDNA共转染细胞及细胞筛选

(1)细胞转染

取4微克的TALENmRNA对(1:1)和6微克的线性化的pBR322-TK-105-2159质粒共转染到3.5cm皿的实施例1的步骤二的1制备的离体纯种梅山猪原代成纤维细胞中，使用Lonza公司提供的电转试剂AmaxaBasicNucleofectorKitforPrimaryMammalianFibroblasts及核转染仪进行转染实验。48h后收集细胞，取1/3的细胞提取细胞基因组DNA进行内源活性的检测，其余的2/3细胞用于单克隆细胞的培养及冻存。

(2)有限稀释法获得单克隆细胞

确定转染细胞具有内源活性后，对细胞进行有限稀释以获得单克隆细胞。取部分细胞进行计数，将细胞稀释至100个/100mm，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。在培养过程中，通过加入GANC(丙氧鸟苷)可以在细胞增殖过程中利用自杀机制排除DonorDNA随机整合入基因组的细胞，待细胞克隆生长至直径达2mm以上时，去除培养基，DPBS冲洗后，用牛津杯罩在克隆团上，消化收集细胞将其转移至48孔板中扩大培养。

(3)单克隆基因型检测

48孔板中细胞融合率约达90％时，消化取一半细胞用于细胞克隆基因型鉴定，剩余一半继续在孔板中培养。用表4中的引物扩增测序检测重组序列是否在打靶点整合到了基因组上，同时该引物也可以进一步排除DonorDNA是否存在随机整合的情况。

表4、重组序列整合情况鉴定引物

测序鉴定结果表明：重组序列整合到打靶位点，且不存在DonorDNA整合情况；单克隆细胞中的突变的MSTN基因为将野生型MSTN基因第3782-3796位核苷酸敲除且第3800位核苷酸分子由T突变为G得到的DNA分子(如序列表中序列1所示)，将这类单克隆细胞命名为突变型成纤维细胞，并作为供体细胞，进一步研究MSTN基因第3782-3796位核苷酸缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G后对猪的表型带来的影响。

二、MSTN突变梅山猪的获得

1、MSTN单等位基因突变克隆梅山猪的获得

挑选上述突变型成纤维细胞作为供体细胞，通过体细胞核移植技术构建重组胚胎。具体步骤如下：

1)采集梅山猪的卵巢组织，收集卵母细胞，并进行体外成熟培养，培养41小时后，得到体外成熟培养的卵母细胞；

2)用透明质酸酶处理体外成熟培养的卵母细胞，并吹打去除卵丘细胞，得到优质卵母细胞；

3)以步骤2)挑选的优质卵母细胞作为受体细胞，挑选以步骤一获得的MSTN突变阳性细胞作为供体细胞，在显微操作仪下进行去核及体细胞移植操作，得到重构卵；

4)将步骤3)得到的重构卵放入融合仪中进行融合与激活，得到重组胚胎；

5)待步骤4)得到的重组胚胎发育5-7天后形成具有明显内细胞团的囊胚时进行胚胎移植，将其移植到处于发情期的受体母猪的子宫内；

6)在胚胎移植28天后通过B超检测受体母猪的妊娠情况，之后每两周检测一次以确认其妊娠状况直到妊娠约114天克隆猪出生，得到MSTN单等位基因突变克隆梅山猪。

对MSTN单等位基因突变克隆梅山猪的MSTN基因进行测序，结果表明：MSTN单等位基因突变克隆梅山猪的基因型为单等位基因突变型(MSTN^+/-)。单等位基因突变型为一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子均由T突变为G，且另一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子未发生缺失且第3800位核苷酸分子未由T突变为G。

2、自然交配获得MSTN双等位基因突变克隆梅山猪

待MSTN单等位基因突变克隆梅山猪(MSTN^+/-)发育成熟后将其与野生型梅山母猪(MSTN^+/+)交配，获得F1代单等位基因突变的公猪和F1代单等位基因突变的母猪；将F1代单等位基因突变的公猪和F1代单等位基因突变的母猪交配，获得F2代公猪和F2代母猪。

对F2代公猪和F2代母猪的个体基因型进行检测，个体基因型检测的方法如下：提取个体耳组织的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用表1中的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并对PCR扩增产物测序，根据测序结果判断个体的基因型。

经检测发现：在F2代公猪和F2代母猪的个体中，共存在三种基因型：野生型(MSTN^+/+)、单等位基因突变型(MSTN^+/-)和双等位基因突变型(MSTN^-/-)。双等位基因突变型为两条同源染色体的MSTN基因均仅第3782-3796位核苷酸分子均发生缺失，且第3800位核苷酸分子均由T突变为G的基因型；单等位基因突变型为一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子均由T突变为G，且另一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子未发生缺失且第3800位核苷酸分子未由T突变为G的基因型；野生型为两条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均未发生缺失且第3800位核苷酸分子均未由T突变为G的基因型。其中，基因型为MSTN^-/-克隆梅山猪的MSTN打靶区域的测序结果如图4。克隆梅山猪及后代的MSTN基因变化情况与其来源的细胞克隆相一致。

三、MSTN突变梅山猪MSTNmRNA及蛋白表达情况

采集F2代8月龄的基因型为MSTN^-/-的梅山猪个体(MSTN^-/-个体)、基因型为MSTN^+/-的梅山猪个体(MSTN^+/-个体)和基因型为MSTN^+/+的梅山猪个体(MSTN^+/+个体)的背肌及血清样品液氮中速冻后，-80℃保存。取一定量的背肌样品液氮中研磨成粉末，分别提取RNA和蛋白样品。

1、序列分析

对基因型为MSTN^-/-的个体(MSTN^-/-个体)和基因型为MSTN^+/+的个体(MSTN^+/+个体)的背肌中MSTN基因的cDNA序列进行测序分析。具体步骤如下：

1)使用Trizol(Invitrogen)法提取MSTN^-/-个体和MSTN^+/+个体组织的总RNA，并使用第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas)将mRNA反转录获得cDNA。

2)以获得的cDNA为模板，采用MSTN-CDS引物(表5)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物即MSTN基因的CDS区。

PCR反应体系：10μL5×Buffer、1μL10mMdNTP、1μL25μM正、反向引物、0.5μLRocheExpandHighFidelity^PLUSPolymerase、2uLcDNA，加超纯水至50μL。

PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃70s，循环30次，最后72℃延伸5min。

3)PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序公司测序。

PCR扩增产物的电泳结果如图5所示：从图中可以看出：MSTN^+/-个体扩增出现两条带，MSTN^+/+、MSTN^-/-个体各有一条扩增条带，而且MSTN^-/-个体的扩增条带比野生型个体小约200bp，初步推测该片段缺失是由内含子前段第二个碱基由T突变为G，破坏了内含子的“GT-AG”剪接原则导致内含子剪接前移的结果。

测序结果如图6所示：图中不同颜色字母分别代表：红色为第二外显子碱基；蓝色为第二、三外显子间内含子的碱基；绿色为第三外显子碱基。MSTN^-/-个体的cDNA序列相对MSTN^+/+个体存在193bp的缺失，而且碱基缺失位置正好在第二外显子末端向前193位，且该处正好为存在“GT”的碱基对，这一缺失会导致翻译提前终止，无法形成有功能的MSTN蛋白。

2、相对定量PCR检测

对MSTN^-/-个体、MSTN^+/-个体和MSTN^+/+个体的背肌中MSTN基因RNA水平的表达情况进行了相对定量PCR检测。具体步骤如下：

1)使用Trizol(Invitrogen)法提取F2代8月龄MSTN^-/-个体、MSTN^+/-个体和MSTN^+/+个体组织的总RNA，并使用第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas)将mRNA反转录获得cDNA。

2)分别以MSTN^-/-个体、MSTN^+/-个体和MSTN^+/+个体的cDNA为模板，采用表5中MSTN-qPCR引物进行相对定量PCR。

检测结果如图7所示：和MSTN^+/+个体相比，MSTN^+/-个体没有MSTN基因的完整转录产物，而MSTN^-/-个体没有MSTN基因转录产物。

表5、MSTN基因RNA水平检测引物

3、Western-blot检测

对MSTN^-/-个体、MSTN^+/-个体和MSTN^+/+个体的组织蛋白样品进行了Western-blot检测，具体步骤如下：

1)取50mg背肌样品在液氮条件下研磨成粉末后转移至装有300μL蛋白提取液(Thermo)的离心管中，4℃放置约30min,12000rpm离心10min，上清即为蛋白溶液。

2)使用BCA蛋白分析试剂盒(Thermo)检测所提取的蛋白溶液的浓度，以确定不同个体的上样体积。

3)从MSTN^+/+、MSTN^+/-和MSTN^-/-个体的蛋白样品中分别取20μg上样于12％的SDS-PAGE，70V：30min；100V：90min进行电泳。

4)电泳完成后，将PAGE胶上的蛋白转移到PVDF膜上，湿转100mA约2h。置于5％的脱脂牛奶中封闭过夜。

5)室温条件下分别孵育一抗(abcam，CatNo.ab55106，1:1000，2h)和二抗(CST，#7076，1:2000，1h)。孵育抗体后均用TBST洗膜4次，5min/次。

6)显色：膜冲洗完成后，将其有蛋白一面浸入事先按1:1比例配好的显色液中(Thermo#34080)，室温静置约3min。显色完毕后进行底片的曝光及显影定影。

检测结果如图8所示：在MSTN^-/-个体中未检测到MSTN成熟肽蛋白，而MSTN^+/+和MSTN^+/-均检测出大小为26KDa的MSTN成熟肽蛋白。

4、ELISA检测

使用猪肌肉生长抑制素(MSTN)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒对三种基因型个体血清中的MSTN蛋白进行了定量检测。

具体步骤如下：

1)试剂、样品和标准品的准备：将试剂盒从4度冰箱取出后放置到室温平衡15-30min。-80度冰箱中将血清取出放置到冰上彻底融化。将标准品放置在4度冰箱备用。

2)加样：将标准品和样品分别依次加入事先包埋好的标准孔中，每个样品3次重复，37度孵育30min。(标准品的浓度梯度为3、2、1、0.5和0.25ng/mL，利用样品稀释液将血清稀释5倍加样)。

3)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入50μL酶标试剂37度孵育30min后再按照上述步骤再洗涤。

4)显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟，加入终止液终止显色。

5)测定：加入终止液15min内测定OD值，并根据测定的OD值做出标准品的标准曲线，同时，计算样品的浓度。

检测结果如图9所示：和MSTN^+/+个体与MSTN^+/-个体相比，MSTN^-/-个体血清中未检测到MSTN的存在，而MSTN^+/-个体的MSTN蛋白浓度明显低于MSTN^+/+个体。

经过上述试验证明：MSTN^-/-个体和MSTN^+/-个体的MSTN基因破坏后机体无法形成MSTN功能蛋白。

四、MSTN突变梅山猪的表型

对三种不同基因型(MSTN^-/-、MSTN^+/+和MSTN^+/-)的梅山猪的表型进行观察。

结果如图10所示：与MSTN^+/+和MSTN^+/-梅山猪相比，MSTN^-/-梅山猪表现出明显的“双肌”现象，其背部更宽，臀部更加丰满。

为了检测其“双肌”体型是否由于肌肉量增加导致，对F2代8月龄三种基因型个体进行了解剖分析，并对每个个体的左边胴体的肌肉、脂肪、骨骼和皮肤进行了剥离称重和统计结果显示进行了剥离称重和统计，并对多个肌肉块(背最长肌、半膜肌、肱三头肌、腓肠肌和半腱肌)进行单独称重和统计。

结果如图11和12所示：MSTN^-/-猪、MSTN^+/-、MSTN^+/+猪左边胴体中的骨骼和皮肤重量相差不多，其中，MSTN^-/-猪和MSTN^+/-猪的脂肪含量显著低于MSTN^+/+，但MSTN^-/-猪和MSTN^+/-猪的肌肉含量(瘦肉率)和各个肌肉块重量均显著高于MSTN^+/+，且MSTN^-/-猪的瘦肉率和各个肌肉块重量均显著高于MSTN^-/-猪。

Claims (10)

1.一种DNA分子，是如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2）与1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码相同蛋白质的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的核苷酸序列杂交，且编码相同蛋白质的DNA分子。

2.权利要求1所述的DNA分子在检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率和/或脂肪含量中的应用；

或权利要求1所述的DNA分子在制备检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率和/或脂肪含量的产品中的应用。

3.一种检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率的方法，包括如下步骤：是检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子是否发生缺失和第3800位核苷酸分子是否由T突变为G，以确定待测猪的基因型为野生型、双等位基因突变型还是单等位基因突变型，并根据所述待测猪的基因型确定所述待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率：基因型为双等位基因突变型的待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率高于或候选高于基因型为单等位基因突变型的待测猪，基因型为单等位基因突变型的待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率高于或候选高于基因型为野生型的待测猪；

所述双等位基因突变型为两条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均发生缺失，且第3800位核苷酸分子均由T突变为G的基因型；

所述单等位基因突变型为一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G，且另一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子未发生缺失且第3800位核苷酸分子未由T突变为G的基因型；

所述野生型为两条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均未发生缺失且第3800位核苷酸分子均未由T突变为G的基因型；

所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

4.一种检测或辅助检测待测猪的脂肪含量的方法，包括如下步骤：是检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子是否发生缺失和第3800位核苷酸分子是否由T突变为G，以确定待测猪的基因型为野生型、双等位基因突变型还是单等位基因突变型，并根据所述待测猪的基因型确定所述待测猪的脂肪含量：基因型为双等位基因突变型的待测猪的脂肪含量低于或候选低于基因型为单等位基因突变型的待测猪，基因型为单等位基因突变型的待测猪的脂肪含量低于或候选低于基因型为野生型的待测猪；

所述双等位基因突变型为两条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均发生缺失，且第3800位核苷酸分子均由T突变为G的基因型；

所述单等位基因突变型为一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G，另一条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子未发生缺失且第3800位核苷酸分子未由T突变为G的基因型；

所述野生型为两条同源染色体的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子均未发生缺失且第3800位核苷酸分子均未由T突变为G的基因型；

所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子是否发生缺失和第3800位核苷酸分子是否由T突变为G的方法为测序。

6.一种培育高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含量的猪的方法，包括选择权利要求4或5所述的双等位基因突变型或单等位基因突变型的猪进行育种。

7.一种检测或辅助检测待测猪的肌肉含量和/或瘦肉率和/或脂肪含量的方法，包括如下步骤：是检测待测猪的两条同源染色体上的MSTN基因为双等位基因突变型、单等位基因突变型还是野生型；

所述野生型为两条同源染色体上的MSTN基因均为野生型MSTN基因；

所述双等位基因突变型为两条同源染色体上的MSTN基因均为突变型MSTN基因；

所述单等位基因突变型为一条同源染色体上的MSTN基因为突变型MSTN基因，且另一条同源染色体上的MSTN基因为野生型MSTN基因；

所述突变型MSTN基因的序列如序列表中序列1所示；

所述野生型MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

8.一种制备高瘦肉率和/或高肌肉含量和/或低脂肪含量的猪的方法，包括如下步骤：将猪的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G，得到瘦肉率提高和/或肌肉含量提高和/或脂肪含量降低的猪；

所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

9.将猪的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G的方法或产品在制备瘦肉率提高和/或肌肉含量提高和/或脂肪含量降低的猪中的应用；

所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。

10.将猪的MSTN基因第3782-3796位核苷酸分子发生缺失且第3800位核苷酸分子由T突变为G的产品，包括TALENmRNA对和DonorDNA。

所述MSTN基因的序列如序列表中序列2所示。