JP2019505175A - 鳥の未孵化卵内の胚の性別決定法及びその手段 - Google Patents
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Abstract
Description
WO 2010/103111
WO 2014/0296707
米国特許第6244214号
06124456A2
米国特許公開第2014069336号
WO16005539
WO 96/39505
WO 97/49806
Quansah,E.,Long,J.A.,Donovan,D.M.,Becker,S.C.,Telugu,B.,Foster Frey,J.A.,Urwin,N.2014.Sperm−mediated transgenesis in chicken using a PiggyBac transposon system.Poultry Science Association Meeting Abstract.BARC Poster Day.
Jinek,M.,Chylinski,K.,Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,J.A.,& Charpentier,E.(2012).A programmable dual−RNA−guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science,337(6096),816−821.
Cong,L.,& Zhang,F.(2015).Genome engineering using CRISPR−Cas9 system.Chromosomal Mutagenesis,197−217。
食品業界では、雛は、窒息又はすりつぶしにより数十億が日常的に処分されている。雄は卵を産むのに有用ではないので、処分されるか又は食肉用に飼育され、弱いか又は不健康な雌も処分されている。したがって、孵化前に卵内での、又は胚の性別決定の方法は、倫理的及び経済的配慮の両方から非常に望まれている。
最初に、工程(a)において、性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所(本明細書では遺伝子座とも呼ばれる)に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも1羽のトランスジェニック鳥対象若しくは動物を提供又は取得する工程、
第2の工程(b)で、トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物からの又はその任意の細胞の少なくとも1個の受精卵を取得する工程、
次の工程(c)は、少なくとも1つの検出可能なシグナルが検出されるか否かを卵において決定する工程を伴う。より具体的な実施形態において、少なくとも1つの検出可能なシグナルの検出は、該少なくとも1つのレポーター遺伝子の発現、それによる、鳥胚内の染色体W又は染色体Zの存在を示す。
(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列;並びに(b)少なくとも1つの該レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列、
を含むキットを提供する。
最初に、工程(a)において、性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも1羽のトランスジェニック鳥対象若しくは動物を提供又は取得する工程、
第2の工程(b)で、トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物からの又はその任意の細胞の少なくとも1個の受精卵を取得する工程、
次の工程(c)は、少なくとも1つの検出可能なシグナルが検出されるか否かを卵において決定する工程を伴う。より具体的な実施形態において、少なくとも1つの検出可能なシグナルの検出は、少なくとも1つのレポーター遺伝子の発現、それによる、鳥胚内の染色体W又は染色体Zの存在を示す。したがって、レポーター遺伝子が雌トランスジェニック鳥の染色体Zに組み込まれた場合には、検査卵における検出可能なシグナルの特定は、その胚がその中に組み込まれたレポーター遺伝子を有する母系の染色体Zを有することを示し、それにより、その胚は雄として特定される。或いは、レポーター遺伝子が雌トランスジェニック鳥の染色体Wに組み込まれた場合には、検査卵における検出可能なシグナルの特定は、その胚が母系の染色体Wを保有し、したがって、雌として決定されることによってその性別決定を提供することを示す。
(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つの該レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列、
を含むキットを提供する。
さらに詳述することなく、当業者は、前述の説明を用いて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。以下の好ましい特定の実施形態は、したがって、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる意味でも特許請求される発明を限定するものではない。
動物:
商業用白色レグホン鶏を、ヘンドリックスISA、及びMinnesotaから入手する。
マーカーライン鶏は、Pacific Agri−Food Research Centre,Agassiz,カナダのブリティッシュコロンビア州からのものである。
トランスジェニックマウスCAG−luc−eGFPは、ジャクソン研究所(カタログ番号L2G85)からのものである。
トランスジェニックマウスC57BL/6−Tg(CAG−EGFP)1Osb/Jは、ジャクソン研究所(カタログ番号00329)からのものである。
Cas9 SmartNuclease(商標)オールインワンタグ付きベクターは、System Bioscience社、カタログ番号CAS8/9xxシリーズから注文する。
pCMV−Gluc 2ベクターは、New England Biolabs社、カタログ番号N8081Sから注文する。
雌の細胞は、Gallus gallus鶏のTリンパ球細胞である。
雄の細胞は、ATCC(登録商標)番号CRL−2118(商標)から注文したGallus gallus鶏の肝臓のものである。
始原生殖細胞(PGC)株。
卵の殻を通したレポーター遺伝子の生物発光検出
D−ルシフェリン(Sigma−Aldrich Co.LLC、イスラエル、カタログ番号2591−17−5)を、室温で、15mg/mLの最終濃度までDPBSに溶解する。0.1mlの量のルシフェリン又は生理食塩水(陰性対照)を、トランスジェニックルシフェラーゼ発現マウスの首及び肩の領域の周囲の弛緩性皮膚に皮下注射する。耳及び尾部を、10分後に摘出し、鶏胚(10日齢)に導入する。
Cas9−SmartNuclease(商標)ベクターへのgRNAの挿入は、制限フリー方法(Peleg Yら,2010)を適用することによって行う。プライマーは、Sigma−Genosys(Rehovot,Israel)から注文し、続いて、RF反応をPhusionポリメラーゼ(Thermo Scientific,Hudson,NH,USA)を用いて行った。プラスミド精製を、MEGAspinキット及びDNA−spinプラスミドDNA精製キット(それぞれIntron Biotechnology Biotechnology,Daejoen,South Korea)を用いて行う。
PGCを、その40%をバッファローラット肝臓細胞(BRL、ATCC)に予め馴化させ、7.5%ウシ胎児血清(Hyclone)、2.5%照射鶏血清、1×非必須アミノ酸、2mMのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMのβ−メルカプトエタノール(全てLife Technologiesから)、4ng/mlの組換えヒト線維芽細胞増殖因子、6ng/mlの組換えマウス幹細胞因子(両方ともR&D Systemsから)を補完したKO−DMEM(Life Technologies)中で増殖させ、BRL細胞の照射したフィーダー層上で成長させる。細胞を新鮮なフィーダー層上に、週3回継代する。
染色体W又はZの上記遺伝子座を標的化する安定したトランスフェクタントのために、15μgのベクター含有gRNA及び15μgの環状ルシフェラーゼ含有ベクターを、5×106個の細胞に加え、V−緩衝液(lonza,Walkersville)で100μlの体積にした。細胞懸濁液を2mmのキュベットに移し、350ボルト/100μ秒の8つの方形波パルス(BTX 830電気穿孔器)に供する。次いで、細胞をネオマイシン耐性照射BRLと共にプレーティングし、ウェル当たり105個の細胞密度で48ウェルプレートに播種する。3日後、40μg/mlのネオマイシンを添加し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の安定な組み込みを有する細胞を選択する。
濃縮ビヒクル(約107 MOIの力価のレンチウイルス又はプラスミドDNAのいずれかであり得る)を、25個の産みたて卵の胚に注入する。注入は週3回行う。注入した胚は、注入後3週間で孵化する。これらは、G0鳥である。孵化直後に、DNAを、孵化した雛のCAM試料から抽出し、ベクターDNAの存在/不在の検出を半定量PCRによって行う。血液を、2〜3週齢のG0鳥から採取し、PCRスクリーニングを繰り返す。G0鳥は、雄については16〜20週、雌については20〜24週の性成熟まで育てる。雄の雛鳥を、約16週から精液の生成について試験する。雌鳥を受精させ、受精卵を毎日収集する。G1雛は3週間後に孵化し、各個々の雛の翼を縛って、雛の漿尿膜(CAM)試料を殻から採取する。CAM試料からDNAを抽出し、導入遺伝子の存在についてPCRスクリーニングを行い、単一コピーレベルであると予測する。2〜3週間後に確認のためのスクリーニングを繰り返し、血液試料からのDNA上で雛の性別を判定する。数週齢の時点で、血液試料をG1鳥から採取し、PCR分析のためにゲノムDNAを調製する。G1鳥をG2の繁殖のために使用する。
家禽における視覚的な性別特定のためのレポーター遺伝子の選択
卵内の家禽の性別を視覚的に特定する実現可能性を実証するために、蛍光レポーター遺伝子と比較する生物発光の使用を評価した。したがって、ホタルルシフェラーゼなどの(配列番号20に示す核酸配列を有し、配列番号21に示すアミノ酸配列をコードする)レポーター遺伝子及び緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するトランスジェニックマウスを、最初に使用した。
ガイドRNAベクターの設計
性染色体W又はZにルシフェラーゼレポーター遺伝子を組み込むために、CRISPR/Cas9媒介HDR法を選択する。次いで、関連gRNA部位を、両方の性染色体からさがす。
ルシフェラーゼ標的化ベクターの設計
雌の染色体W又は雌の染色体Zの遺伝子座の上記で示した適切な隣接配列と相同性のある隣接配列を、CMVプロモーターの上流及びネオマイシン耐性の下流或いはポリA部位(注文した合成DNA、Integrated DNA Technologies,Inc.,USA)の下流の位置でルシフェラーゼ発現ベクターに導入する。
CRISPR処理細胞の生殖系列伝達
2つの上記のベクター、具体的には、gRNA/Cas9及びレポーター遺伝子ベクターを、実験手順に詳述するPGCに共トランスフェクトする。安定なクローンを特定した後、細胞を増殖させ、PCRによるルシフェラーゼ組み込みについて確認する。確認したクローンを、段階14〜16のレシピエント鶏胚(H&H)に注入する。注入した胚を代理の殻に移し、37℃で孵化するまでインキュベートする。雛の性別を、染色体WについてPCRによる孵化後に決定する。
Claims (50)
- 鳥の受精した未孵化卵の性別決定の方法であって、
(a)性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも1羽のトランスジェニック鳥動物を提供/取得する工程、
(b)前記トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物からの又はその任意の細胞の少なくとも1個の受精卵を取得する工程、
(c)少なくとも1つの検出可能なシグナルが検出されるかどうかを前記卵内で決定する工程であって、前記少なくとも1つの検出可能なシグナルの検出が、前記鳥胚内で前記少なくとも1つのレポーター遺伝子の発現、それによって、前記染色体W又は染色体Zの存在を示す工程、
を含む方法。 - 前記少なくとも1羽のトランスジェニック鳥対象が、少なくとも2つの異なるレポーター遺伝子を含み、各レポーター遺伝子が、性染色体Z又はWの一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれている、請求項1に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、少なくとも1つの生物発光レポーター遺伝子である、請求項1及び請求項2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項3に記載の方法。
- 前記方法がさらに、工程(c)で検出される前記検出可能なシグナルの形成のために、工程(b)の前記卵に、前記生物発光レポーター遺伝子と互換性のある基質及び酵素のうちの少なくとも一方を提供する工程を含む、請求項1、3及び4に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのトランスジェニック鳥対象、具体的には、動物が雌の鳥動物であり、前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌の染色体Zの少なくとも1つの位置に組み込まれ、それによって、検出可能なシグナルの検出が、前記未孵化卵内の前記胚が雄であることを示す、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのトランスジェニック鳥対象、具体的には、動物が雌の鳥動物であり、前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌の染色体Wの少なくとも1つの位置に組み込まれ、それによって、検出可能なシグナルの検出が、前記未孵化卵内の前記胚が雌であることを示す、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、少なくとも1つのプログラム可能に遺伝子操作されたヌクレアーゼ(PEN)を用いて、前記トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物の前記性染色体に組み込まれる、請求項1に記載の方法。
- 前記PENが、クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し(clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR))タイプIIシステムである、請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、少なくとも1つのCRISPR/CRISPR関連エンドヌクレアーゼ9(Cas9)システムによって媒介される相同性指向性修復(HDR)により前記トランスジェニック鳥動物の前記性染色体に組み込まれる、請求項9に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列を、前記鳥動物の少なくとも1つの細胞又は前記鳥動物に導入される少なくとも1つの細胞に共トランスフェクトすることによって、前記トランスジェニック鳥動物の性染色体に組み込まれる、請求項10に記載の方法。
- 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子に、その5’及び3’で、前記組み込み部位でのHDRのために相同アームが隣接している、請求項11に記載の方法。
- 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか1つに作動可能に連結される、請求項11及び12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも1つの非コード領域に組み込まれている、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性染色体Wの遺伝子座1022859〜1024215の少なくとも1つの部位に組み込まれている、請求項14に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのgRNAが、配列番号1及び2のいずれか一項に示す核酸配列を含む、請求項11及び15に記載の方法。
- 前記gRNAが配列番号1に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項16に記載の方法。
- 前記gRNAが配列番号2に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項16に記載の方法。
- 性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む鳥トランスジェニック動物。
- 前記少なくとも1つのトランスジェニック動物が、少なくとも2つの異なるレポーター遺伝子を含み、各レポーター遺伝子が、性染色体Z又はWの一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれている、請求項19に記載のトランスジェニック動物。
- 前記レポーター遺伝子が、少なくとも1つの生物発光レポーター遺伝子である、請求項19及び請求項20のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項21に記載のトランスジェニック動物。
- 前記少なくとも1羽のトランスジェニック鳥動物が雌であり、前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌染色体Zの少なくとも1つの位置に組み込まれている、請求項19に記載のトランスジェニック動物。
- 前記少なくとも1羽のトランスジェニック鳥動物が雌であり、前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌染色体Wの少なくとも1つの位置に組み込まれている、請求項19に記載のトランスジェニック動物。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、少なくとも1つのPENを使用して前記トランスジェニック動物の前記性染色体に組み込まれている、請求項19に記載のトランスジェニック動物。
- 前記PENが、CRISPRタイプIIシステムである、請求項25に記載のトランスジェニック動物。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、少なくとも1つのCRISPR/Cas9システムによって媒介されるHDRによる前記トランスジェニック鳥動物の前記性染色体に組み込まれている、請求項26に記載のトランスジェニック動物。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのgRNAをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列を、前記鳥動物の少なくとも1つの細胞又は前記鳥動物に導入される少なくとも1つの細胞に共トランスフェクトすることによって、前記トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物の性染色体に組み込まれる、請求項27に記載のトランスジェニック動物。
- 前記第2の核酸配列中の少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、前記組み込み部位でのHDRのために相同アームが隣接している、請求項28に記載のトランスジェニック動物。
- 前記第2の核酸配列中の少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか1つに作動可能に連結される、請求項28及び29のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも1つの非コード領域に組み込まれている、請求項28〜30のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性染色体Wの遺伝子座1022859〜1024215の少なくとも1つの部位に組み込まれている、請求項31に記載のトランスジェニック動物。
- 前記少なくとも1つのgRNAが、配列番号1及び2のいずれか一項に示す核酸配列を含む、請求項28及び32に記載のトランスジェニック動物。
- 前記gRNAが、配列番号1に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項33に記載のトランスジェニック動物。
- 前記gRNAが、配列番号2に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項33に記載のトランスジェニック動物。
- 性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞。
- 前記細胞が鳥細胞である、請求項36に記載の細胞。
- 前記鳥細胞が、始原生殖細胞(PGC)である、請求項37に記載の細胞。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列を前記細胞に共トランスフェクトすることによって、前記細胞の性染色体に組み込まれる、請求項36〜38のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、前記組み込み部位でのHDRのために相同アームが隣接している、請求項39に記載の細胞。
- 前記gRNAが配列番号1に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項39及び40のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記gRNAが配列番号2に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項39及び40のいずれか一項に記載の細胞。
- (a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列;並びに
(b)少なくとも1つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列、
を含むキット。 - 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、前記組み込み部位でのHDRのために相同アームが隣接している、請求項43に記載のキット。
- 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか1つに作動可能に連結される、請求項43及び44のいずれか一項に記載のキット。
- 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも1つの非コード領域に組み込まれ、前記少なくとも1つのgRNAが、配列番号1及び2のいずれか1つに示す核酸配列を含む、請求項43〜45のいずれか一項に記載のキット。
- 前記gRNAが配列番号1に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項46に記載のキット。
- 前記gRNAが配列番号2に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項46に記載のキット。
- 前記レポーター遺伝子が、少なくとも1つの生物発光レポーター遺伝子である、請求項43〜48のいずれか一項に記載のキット。
- 性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む1羽のトランスジェニック鳥動物の作製に使用するための、請求項43〜49のいずれか一項に記載のキット。
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