JP2019505175A - 鳥の未孵化卵内の胚の性別決定法及びその手段 - Google Patents

鳥の未孵化卵内の胚の性別決定法及びその手段 Download PDF

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Abstract

本発明は、鳥対象における性別の決定及び特定の方法に関する。より具体的には、本発明は、少なくとも1つの性染色体Z又はWに組み込まれた少なくとも1つのレポーター遺伝子を含むトランスジェニック鳥動物を用いた非侵襲的な方法を提供する。本発明のトランスジェニック鳥動物は、未孵化鳥の卵内の胚の性別の決定及び選択のために使用される。【選択図】なし

Description

本発明は、鳥対象における性別の決定及び特定の方法に関する。より具体的には、本発明は、鳥の未孵化卵内の胚の性別の決定及び選択のための非侵襲的な方法並びにトランスジェニック鳥動物を提供する。
本明細書に開示される主題の背景として関連すると考えられる参考文献を以下に記載する:
WO 2010/103111
WO 2014/0296707
米国特許第6244214号
06124456A2
米国特許公開第2014069336号
WO16005539
WO 96/39505
WO 97/49806
Quansah,E.,Long,J.A.,Donovan,D.M.,Becker,S.C.,Telugu,B.,Foster Frey,J.A.,Urwin,N.2014.Sperm−mediated transgenesis in chicken using a PiggyBac transposon system.Poultry Science Association Meeting Abstract.BARC Poster Day.
Jinek,M.,Chylinski,K.,Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,J.A.,& Charpentier,E.(2012).A programmable dual−RNA−guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science,337(6096),816−821.
Cong,L.,& Zhang,F.(2015).Genome engineering using CRISPR−Cas9 system.Chromosomal Mutagenesis,197−217。
上記参考文献の謝辞は、本明細書では、これらが多少なりとも本開示の主題の特許性に関連するという意味として推察されるものではない。
(発明の背景)
食品業界では、雛は、窒息又はすりつぶしにより数十億が日常的に処分されている。雄は卵を産むのに有用ではないので、処分されるか又は食肉用に飼育され、弱いか又は不健康な雌も処分されている。したがって、孵化前に卵内での、又は胚の性別決定の方法は、倫理的及び経済的配慮の両方から非常に望まれている。
具体的には、家禽類の受精卵を視覚的に特定することにより、孵化費用を(未受精卵の孵化の防止により)節約し、受精卵と共に、これらの混入し易い未受精卵のインキュベーションの継続に関わるバイオセキュリティリスクを下げるために未受精卵の除去が可能になることが重要である。
未孵化卵内の胚の初期段階で卵の受精を視覚的に特定することは、外側から光源をあてることを伴い、初期胚の段階では困難で、事実上不可能であり得る。さらに大きな課題は、胚の性別を特定することであり、現在は、繁殖性があると思われる未孵化卵における雄と雌の識別に利用できる方法はない。しかしながら、初期胚の段階での受精の特定及び家禽の性別決定は、鳥類の飼育、科学研究、及び保全に不可欠である。形態学的特徴による若鳥の性別決定は、ほとんどの種にとって非常に困難である。性別は、個々のベント雌雄鑑別によって決定することができ、それは、雛から糞を手でつかみだすことを伴い、雛の肛門を少し開け、雛が小さい「隆起」を有しているかどうかを調べることができると、その鶏は雄であることを示す。しかしながら、この方法は、訓練を受けた人が手作業で行う面倒な作業と共に、鳥の傷害及び性別決定の間違いのリスクが高い。
ベント雌雄鑑別及び雛の雌雄鑑別は、通常、雛雌雄鑑別士又は鶏雌雄鑑別士と呼ばれる訓練を受けた人が鶏の性別と他の孵化を区別する方法である。鶏の雌雄鑑別は、性別グループに分けるための性別と、異なるプログラムに入れるための性別の違いを知っている必要がある大規模な商業孵化場で主に行われており、これにより、一方のグループは成長させ、他方のグループは商用ニーズを満たしていない性別であるために処分することを含むことができる(例として、産卵の商用品種の卵から孵化した雄。この雄は、食肉生産量が良好ではなく、卵を産まないので、雌雄鑑別後に処分される。雌雄鑑別後、関係する性別は、雄又は雌の目的を果たすためにそのコースを継続するが、他の性又はそのほとんどは、卵生産とは無関係であるので、孵化後数日以内に処分される)。
卵を生産する農場では、雄は不要であり、不要な性別の雛は、ブリーダーにかかる費用を削減するためにほとんどすぐに殺される。雛はコンベアベルトに置かれ、そこで雛雌雄鑑別士が、雄を取り除き、それらをシュートに投げ入れ、そこで、通常、雄は肉挽き器で生きたまますりつぶされる。
孵化前の卵の受精及び卵内の胚の性別の特定並びに決定は、卵の状態で未受精卵及び胚の不要な種類の除去を可能にし、ひいては、(大気汚染及びエネルギー消費量と共に、エネルギー及び効率費用を含む)インキュベーション費用を大幅に削減する。加えて、雛を苦しめなくなり、処分からの汚染が防止される。自動化された雌雄鑑別装置は、さらに鶏雌雄鑑別士の必要性を排除することによって卵の生産費用を削減し、早い段階でそのプロセスから卵の50%が減るので必要な孵化場のサイズを低減し、ひいては、これらの卵を孵化させる費用、並びにそれ以降の任意の精巧な殺傷手段の必要性が低減される。
繁殖、産卵、又は食肉生産が目的の全ての商業的な鳥の種類において、受精及び胚の性別を決定する必要がある。省エネ、バイオセキュリティリスク低減、ゴミ処理、雌雄鑑別の人件費及び雌雄鑑別の間違い、処分費用及び廃棄、並びに動物の福祉において大きな経済的利益がある。
WO 2010/103111は、とりわけ、胚上の性別特異的抗原と一致するように特別に設計された標識抗体を卵に導入する一連の工程を含む侵襲的方法について記載している。
WO 2014/0296707は、鳥の卵に注入されるワクチンの定量化又は接種の効率を評価するためのバイオマーカーとして機能するように設計された輝度組成物について記載している。
性別決定については、本開示では記載も、示唆もしない。卵内注入装置及び検出方法は、米国特許第6244214号により開示された。
WO 06124456A2は、鳥の卵からの胚性流体(例えば、尿膜腔液又は血液)の試料中のエストロゲン様ステロイド化合物の存在を決定することにより、鳥胚の卵内性別決定の侵襲的方法を開示している。化合物の存在を決定することは、蛍光顕微鏡を利用する競合イムノアッセイによって、該鳥の卵から得られた試料中の分析物を測定することで行われる。
分光法はまた、とりわけ、鳥胚の羽の色(孵化前)のスクリーニング及び羽の色に基づく鳥胚の性別の決定に基づく米国特許公開第2014069336号、又は入射光シグナルに対する殻特異的スペクトル反応を取得する装置を開示しているWO16005539に記載されていた。
この問題のためのさらなる遺伝的手法は、鳥の染色体Z及びW上に位置する2つの特定の遺伝子を検出するための、受精卵から得られるDNA試料のDNA配列決定(WO 96/39505)、又は雌の染色体Wの特定の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を含む(WO 97/49806)。これらの方法は侵襲的であり、したがって、安全戦略を提供しない。
クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR))/CRISPR関連(Cas)システムは、高い成功率で単純な構築物の設計を可能にする最先端の遺伝子編集システムである(J.Doudna,2012)。
Niuら(2014)は、3つの標的遺伝子を改変するためにサル卵母細胞にガイドRNA(gRNA)及びCas9 RNAを注入し、Hwangら(2013)は、2つの遺伝子座の変異体を得るために、ゼブラフィッシュ胚でdrd3及びgsk3b遺伝子を改変した。Cong及びZhang(2015)は、生細胞内で任意の遺伝子を編集するためにCRISPRシステムを改変した。
Veron及び共同研究者(2015)は、鶏胚での体細胞の発現レベルがPAX7転写因子に対するCRISPR gRNAプラスミド(Nadegeら、2015)のエレクトロポレーションによって改変されることを実証し、Baiと共同研究者らは、PPAR−g、ATPシンターゼのイプシロンサブユニット(ATP5E)を編集した。
Quansah、E.らは、PiggyBacトランスポゾンシステムを用いて鶏における精子媒介遺伝子導入を開示した。特に、彼らは、aGFPプラスミドとリポフェクタミンLTXTM 9LPX)の組み合わせが、鶏精子の生存能力、可動性又は受精率に影響を及ぼさなかったことを開示している。
そのため、鶏の孵化前の卵段階における性別特定のための効果的かつ非侵襲的な方法は、現在利用可能ではない。したがって、長い間、未孵化卵における胚の正確かつ安全な性の特定を可能にする方法が必要とされている。
本発明の第一の態様は、鳥、又は未孵化卵、具体的には、受精した未孵化卵内の鳥胚の性別決定の方法に関する。いくつかの特定の実施形態において、本方法は、以下の工程を含むことができる:
最初に、工程(a)において、性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所(本明細書では遺伝子座とも呼ばれる)に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも1羽のトランスジェニック鳥対象若しくは動物を提供又は取得する工程、
第2の工程(b)で、トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物からの又はその任意の細胞の少なくとも1個の受精卵を取得する工程、
次の工程(c)は、少なくとも1つの検出可能なシグナルが検出されるか否かを卵において決定する工程を伴う。より具体的な実施形態において、少なくとも1つの検出可能なシグナルの検出は、該少なくとも1つのレポーター遺伝子の発現、それによる、鳥胚内の染色体W又は染色体Zの存在を示す。
第2の態様において、本発明は、その少なくとも1つの細胞において、性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所(本明細書では遺伝子座とも呼ばれる)に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む鳥トランスジェニック動物に関する。
さらに別の態様において、本発明は、性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は遺伝子座に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞に関する。
さらなる態様において、本発明は、
(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列;並びに(b)少なくとも1つの該レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列、
を含むキットを提供する。
本明細書に開示される主題をよりよく理解するため及びそれを実際に行うことができる方法を例示するために、添付図面を参照して、単なる非限定的な例としてこれから実施形態を説明する。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子シグナルは卵殻を貫通する。ルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスに、ルシフェリンを皮下注射した。その10分後に、耳(図1A)及び尾部(図1B)を切除し、未受精卵に組み込む。卵を、バイオスペース光子イメージャー(bio−space photon Imager(Bio space lab,USA))を使用して画像化した。 ルシフェラーゼレポーター遺伝子シグナルは受精卵で形成され、卵殻を貫通する。ルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスから切除した耳(図2A)及び尾部(図2B)を、10日齢の鶏胚を有する受精卵に組み込んだ。その後、生物発光を誘導するためにルシフェリンを注入する。その10分後に、バイオスペース光子イメージャー(Bio space lab,USA)を使用して画像を取得した。 GFPレポーター遺伝子シグナルは卵殻を通して検出されない。GFP発現トランスジェニックマウスからの尾部を、鶏胚(10日)に組み込むか、又は殻の外側に配置した。卵の殻の外側に配置した尾部からのみGFP蛍光が観察できた(図3A)が、卵の中に配置した場合は、シグナルは検出されなかった(図3B)。その5分後に、Maestro 2.2 Imager(Cambridge Research & Instrumentation社、米国)を用いて画像を取得した。 雌の鳥胚の検出。ルシフェラーゼレポーター遺伝子(星)は、雌のトランスジェニック鶏(hen)の染色体Wに組み込まれている。染色体W及びZを保有する雌の卵のみが、レポーター遺伝子、具体的には、ルシフェラーゼシグナルを提供する。 雄の鳥胚の検出。ルシフェラーゼレポーター遺伝子(星)は、雌のトランスジェニック鶏(hen)の染色体Zに組み込まれている。雄の胚は、ルシフェラーゼシグナルを介して検出され、雌は外来DNAを含まない。
産卵又は食肉用に育てるのに有用ではないので、毎日、数十億の雄の雛が窒息又はすりつぶしにより処分されている。孵化前の胚の性別を決定する能力は、倫理的にも、経済的にも非常に重要である。鶏において、性染色体の遺伝的構成は、雄についてはZZで、雌についてはZWである。つまり、雌の性別を決定するのは染色体Wである。これは、雄の性別を決定するのが父からのYであるヒトとは異なる。
本発明は、トランスジェニック鳥対象の性特異的染色体に組み込まれたレポーター遺伝子を使用して、性別決定の非侵襲的かつ効率的な方法を提供する。未孵化卵の胚におけるこのレポーター遺伝子の発現は、明確かつ正確に該胚の性別を特定する。
したがって、本発明の第一の態様は、性別決定の方法、必要に応じて、未孵化卵、具体的には、受精した未孵化卵内の鳥、又は鳥胚の選択の方法に関する。いくつかの特定の実施形態において、本方法は、以下の工程を含むことができる:
最初に、工程(a)において、性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも1羽のトランスジェニック鳥対象若しくは動物を提供又は取得する工程、
第2の工程(b)で、トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物からの又はその任意の細胞の少なくとも1個の受精卵を取得する工程、
次の工程(c)は、少なくとも1つの検出可能なシグナルが検出されるか否かを卵において決定する工程を伴う。より具体的な実施形態において、少なくとも1つの検出可能なシグナルの検出は、少なくとも1つのレポーター遺伝子の発現、それによる、鳥胚内の染色体W又は染色体Zの存在を示す。したがって、レポーター遺伝子が雌トランスジェニック鳥の染色体Zに組み込まれた場合には、検査卵における検出可能なシグナルの特定は、その胚がその中に組み込まれたレポーター遺伝子を有する母系の染色体Zを有することを示し、それにより、その胚は雄として特定される。或いは、レポーター遺伝子が雌トランスジェニック鳥の染色体Wに組み込まれた場合には、検査卵における検出可能なシグナルの特定は、その胚が母系の染色体Wを保有し、したがって、雌として決定されることによってその性別決定を提供することを示す。
本明細書において詳細に後述するように、本発明によって提供されるトランスジェニック鳥は、雌又は雄のいずれかであり得ることを理解されたい。より具体的な実施形態において、トランスジェニック鳥対象が雌である場合、本発明の方法によって特定された卵は、本発明によって提供される雌のトランスジェニック鳥が産んだものである。より具体的な実施形態において、トランスジェニック雌は、トランスジェニック雄又は野生型鳥雄のいずれかによって受精し得る。さらに、受精は、トランスジェニック又は野生型の鳥雄から得られた精子との交配によって、又はトランスジェニック鳥雌への人工授精のいずれかによって起こり得る。さらに他の実施形態において、トランスジェニック鳥が雄である場合、本発明の方法によって特定される卵は、野生型又は本発明によって提供されるトランスジェニック雄と交配させたトランスジェニック雌のいずれかが産むことができるか、又はそれらの任意の細胞、具体的には、その性染色体に組み込まれた本発明の外因性レポーター遺伝子を含む精子細胞によって人工授精することができる。
したがって、本発明は、未孵化受精卵内の鳥胚の性別を検出する方法を提供する。本発明の方法は、鳥胚の任意の胚段階の未孵化卵に適用することができることを理解されたい。
本明細書で使用する「鳥胚の胚発生段階又は工程」は、胚ディスクが胚盤葉段階にあり、分割キャビティが暗いリング形状をとる1日目の段階、第一の溝が胚盤葉の中央に現れ、卵黄膜が現れる2日目の段階、血液循環が始まり、頭及び胴体を特定することができ、脳及び心臓が形成されて、鼓動が始まる3日目の段階、羊膜腔が胚を取り囲むように成長し、尿膜小胞が現れる4日目の段階、胚がC形状を取り、手足が伸びる5日目の段階、上下の手足の指が明確になる6日目の段階、首が明らかに頭部と身体を分離し、くちばしが形成され、脳が徐々に頭部領域に入る7日目の段階、眼の色素沈着が容易に目に見え、翼及び脚が区別され、外耳道が開口している8日目の段階、鉤爪が現れ、最初の羽包が出芽する9日目の段階、鼻孔が存在し、まぶたが成長し、卵歯が現れる10日目の段階、眼瞼開口部が楕円形状を有し、胚が雛の側面を有する11日目の段階、羽包が外耳道を囲み、上まぶたを覆うが、下まぶたは角膜の大部分を覆う12日目の段階、尿膜が漿尿膜になり、鉤爪及び脚の大きさが明らかになる13日目の段階、全身が急速に成長し、卵黄縮小が加速し、卵白が徐々に消える14〜16日目の段階、腎臓系が尿酸を生成し、くちばしが気室の方に向き、卵白が完全に吸収される17日目の段階、卵黄が内部移行し、羊水の量が減る18日目の段階、卵黄吸収が加速し、くちばしが内卵殻膜を貫通する準備ができている19日目の段階、卵黄が完全に再吸収され、臍が閉じられ、雛が内卵殻膜を貫通し、気室で呼吸し、孵化する準備ができている20日目の段階、雛が卵歯によって円形に殻を刺し通し、12〜18時間で殻から自身を出し、自身を乾燥させる21日目の段階を指すことに留意されたい。
より具体的には、本発明の方法は、胚の発達過程の全ての段階で、卵の中の卵内の鳥胚の性別を決定する際に適用することができる。より具体的には、1日目から、2日目から、3日目から、4日目から、5日目から、6日目から、7日目から、8日目から、9日目から、10日目から、11日目から、12日目から、13日目から、14日目から、15日目から、16日目から、17日目から、18日目から、19日目から、20日目から及び21日目から適用できる。より具体的には、本発明の方法は、具体的には、1〜10日、より具体的には、1〜5日に胚の性別の早期検出に適用することができる。
上述したように、本発明の方法は、受精した未孵化卵に適用することができる。用語「受精卵」は、本明細書以下では、雌鶏が産む卵を指し、その雌鶏は2週間以内に雄鶏と交尾すると、雄の精子が雌卵管漏斗に堆積し、卵巣からの卵子の放出の際に受精事象が生じることが可能になる。本明細書で使用する「未孵化卵」は、構造的に一体化(壊れていない)殻内に胚(本明細書では受精卵とも呼ばれる)を含有する卵に関する。
本発明の方法は、検査卵に存在するトランスジェニック鳥の雌又は雄の特定の遺伝子座に組み込まれたレポーター遺伝子によって形成された検出可能なシグナルの決定に基づいている。
本明細書で用いる「染色体への外来又は外因性DNA/遺伝子の組み込み」は、本明細書以下では、生物の染色体のヌクレオチド配列の永久的な改変を指す。この改変はさらに、細胞分裂中に受け継がれ、胚細胞株で生じる場合には、子孫にも伝達される。この場合、組み込まれたレポーター遺伝子は、未孵化卵内の胚に受け継がれ得る。本明細書で使用する用語「外因性」とは、例えば、特別に操作されたベクター、ウイルス又は任意の他のビヒクルでの形質転換又はトランスフェクションによって生物に導入された生物の外部から派生することを指す。特定の実施形態による組み込まれた外因性遺伝子は、レポーター遺伝子であり得る。用語「レポーター遺伝子」は、発現を様々な公知のアッセイで検出することができ、検出されたシグナルのレベルが該レポーターの存在を示すポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
上述のように、外因性レポーター遺伝子は、鳥性染色体Z又はWに組み込まれ得る。本明細書で使用する鳥の「性染色体Z又はW」は、雄が同型配偶子の性(ZZ)であり、雌が異型配偶子の性(ZW)である鶏の子孫の性別を決定する染色体システムを指す。卵子の染色体Wの存在は、子孫の性別を決定するが、染色体Zは、より大きな、より多くの遺伝子を有することが知られている。
本発明の方法は、レポーター遺伝子の存在、それによる特定の性染色体の存在を示し、反映する検出可能なシグナルの検出に基づいている。「検出可能なシグナル」は、本明細書以下では、観察又は計器のいずれかによって知覚可能である変化を指す。限定することなく、シグナルは、試薬の存在下で、直接又は唯一検出することができる。いくつかの実施形態において、検出可能な応答は、化学発光基を含むが、これらに限定されない光シグナルである。
いくつかの特定の実施形態において、本発明の方法によって提供される少なくとも1羽のトランスジェニック鳥対象は、少なくとも2つの異なるレポーター遺伝子を含むことができ、各レポーター遺伝子は、性染色体Z若しくはWの一方の少なくとも1つの位置又は場所に組み込まれ得ることを理解されたい。少なくとも2つの異なるレポーター遺伝子の場合には、性染色体の各々は、別々に標識することができる。形成された検出可能なシグナルの評価は、試験した胚の性別を示すことができる。
さらにいくつかの特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥内に含まれるレポーター遺伝子は、少なくとも1つの生物発光レポーター遺伝子であり得る。そのため、いくつかの実施形態において、発現するポリペプチドは生物発光タンパク質であり、したがって、アッセイは生物発光反応から放出される光のレベルを測定する。用語「生物発光」は、タンパク質などの生体分子による光の放出を指す。本明細書以下で詳細に説明するように、生物発光は、酸素分子、オキシゲナーゼ、及び基質ルシフェリンに作用するルシフェラーゼを含む。
より具体的な実施形態において、該レポーター遺伝子はルシフェラーゼであり得る。用語「ルシフェラーゼ」は、本明細書以下で、生物発光(光子放出)を生成する酸化酵素のクラスを指す。放出された光子は、ルミノメーター又は改変光学顕微鏡などの感光性装置によって検出することができる。ルシフェラーゼは、主に、レポーター遺伝子として使用するための様々な生物において遺伝子工学により生成することができる。ルシフェラーゼは、細菌、藻類、真菌、クラゲ、昆虫、エビ、及びイカの中に天然に存在する。細菌において、発光反応を担う遺伝子(luxオペロン中にコードされるlux遺伝子)が単離され、490nmの最大強度を有する青緑色光を発するバイオレポーターの構築に広く使用されている。luxの3つの変異体が利用可能であり、1つは30℃未満で、別のものは37℃未満、及び3つ目は45℃未満で機能する。lux遺伝子システムは、5つの遺伝子、luxA、luxB、luxC、luxD、及びluxEからなる。使用されるこれらの遺伝子の組み合わせに依存して、生物発光バイオレポーターのいくつかの異なる種類を構築することができる。ルシフェラーゼタンパク質は、luxA及びluxBの遺伝子産物によって形成されたヘテロ二量体である。luxC、luxD、及びluxEの遺伝子産物はそれぞれ、生物発光反応のためのアルデヒド基質を生成するために、単一複合体中で一緒に機能するレダクターゼ、トランスフェラーゼ、及びシンターゼをコードする。luxABバイオレポーターは、光シグナルを生成することができるluxA及びluxB遺伝子のみを含有する。しかしながら、発光反応を完全に完了するためには、基質(長鎖アルデヒド)を細胞に供給しなければならない。
一方、luxCDABEバイオレポーターは、luxカセットの全5つの遺伝子を含有し、それにより、基質の外部からの追加も、外部光源による励起も必要としない完全に独立した光生成システムを可能にする。リアルタイムに及びオンラインでバイオアッセイを繰り返し実行する能力と共に、それらの迅速性及び使いやすさが、luxCDABEのバイオレポーターを非常に魅力的にさせている。そのため、ある実施形態において、本発明の方法は、レポーター遺伝子としてluxCDABEのバイオレポーターを使用することができる。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法は、レポーター遺伝子としてluc遺伝子を使用することができる。ホタルルシフェラーゼ(luc遺伝子)は、550〜575nmの範囲の可視光を生成する反応を触媒する。595nmに近いピークで光を生成するコメツキムシルシフェラーゼも利用可能である。両方のルシフェラーゼは、光反応を発生させるために、外因性基質(ルシフェリン)の添加を必要とする。
当技術分野で公知の任意の供給源の、本明細書に記載のルシフェラーゼのいずれも、本発明の方法及びキットに適用することができることを理解されたい。
さらにいくつかの特定の実施形態において、本発明の方法によって使用することができるルシフェラーゼは、Gaussia princepsルシフェラーゼであり得る。さらにより具体的な実施形態において、本発明により使用されるルシフェラーゼは、GenBank:AAG54095.1によって開示されるアミノ酸配列を有する、GenBank:AY015993.1によって開示される核酸配列によってコードされるルシフェラーゼであり得る。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明の方法及びキットで使用されるルシフェラーゼは、配列番号22によって示される配列を含む核酸配列によってコードされ得る。さらにいくつかのさらなる実施形態において、かかるルシフェラーゼは、配列番号23に示すアミノ酸配列、又はその任意の相同体、変異体若しくは誘導体を含み得る。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明により使用されるルシフェラーゼは、P.pyralis(ホタル)ルシフェラーゼであり得る。いくつかの特定の実施形態において、かかるルシフェラーゼは、GenBank:AAA29795.1によって開示されるアミノ酸配列を有する、GenBank:M15077.1によって開示される核酸配列によってコードされるルシフェラーゼであり得る。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明の方法及びキットで使用されるルシフェラーゼは、配列番号20によって示される配列を含む核酸配列によってコードされ得る。さらにいくつかのさらなる実施形態において、かかるルシフェラーゼは、配列番号21によって示すアミノ酸配列、又はその任意の相同体、変異体若しくは誘導体を含むことができる。
上述したように、本発明の方法で使用されるルシフェラーゼは、さらなる試薬、具体的には、基質を補う必要があり得る。
したがって、さらにいくつかのさらなる実施形態において、本方法はさらに、工程(b)の該卵に、生物発光レポーター遺伝子と互換性のある基質及び酵素のうちの少なくとも一方を提供する工程を含むことができる。かかる基質又は酵素は、工程(c)で検出された検出可能なシグナルの形成に必要とされ得ることに留意されたい。より具体的には、本発明の方法は、例えば、注入により、ルシフェラーゼの基質を工程(b)の卵に提供する工程を含むことができる。いくつかの特定の実施形態において、かかる基質はルシフェリンであり得る。本明細書で使用するルシフェリンは、生物発光を生成する生物において見出される発光化合物の総称である。ルシフェリンは、典型的には、酵素触媒酸化を受け、得られた励起状態の中間体は、その基底状態に減衰する際に光を発する。さらにいくつかのさらなる実施形態において、該検出可能なシグナルの形成に必須の要素である基質ルシフェリンは、工程(c)で実行されるとおり、具体的には、該シグナルの測定及び決定の前に、該卵に注入される。いくつかの実施形態において、該基質は、該鳥対象、具体的には動物の胚発生の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21日目に注入することができる。さらにいくつかのさらなる実施形態において、検出可能なシグナルの形成に必要な基質及び/又はさらなる酵素は、該レポーター遺伝子と作動可能に連結された該基質及び/又は酵素をコードする核酸配列として受精卵に提供することができる。かかる特定の実施形態は、例えば、上記のようなluxCDABEバイオレポーターの使用を指すことができる。LuxCDABEシステムは、luxカセットの5つの遺伝子を含有し、それにより基質の外部からの追加も、外部光源による励起も必要としない完全に独立した光生成システムを可能にする。
いくつかの実施形態において、検出可能なシグナル、具体的には、生物発光シグナルは、適切な生物発光手段を用いて検出することができることに留意されたい。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子によって形成された検出シグナルは、ルミノメーター又は改良された光学顕微鏡又は電荷結合素子(CCD)、高感度光子検出器などの光感応装置によって検出することができる。
さらに別の実施形態において、本発明の方法によって提供される少なくとも1羽のトランスジェニック鳥対象又は動物は、雌の鳥対象又は動物であり得る。より具体的な実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌の染色体Zの少なくとも1つの位置に組み込まれた場合、検出可能なシグナルの検出は、未孵化卵における胚が雄であることを示す。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法によって提供される少なくとも1羽のトランスジェニック鳥対象又は動物は、雌の鳥対象又は動物であり得る。いくつかの具体的な実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌の染色体Wの少なくとも1つの位置に組み込まれた場合、検出可能なシグナルの検出は、未孵化卵における胚が雌であることを示す。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法によって提供されるトランスジェニック動物は、その染色体Zに組み込まれたレポーター遺伝子を有する雄の対象であり得る。このような場合には、かかるトランスジェニック雄又はそれらの任意の精子によって受精された卵で決定される検出可能なシグナルは、胚がトランスジェニックレポーター遺伝子を含む父系染色体Zを保有し、それゆえ雄であることを示す。さらなる実施形態において、両方とも、その染色体Zに組み込まれた本発明のレポーター遺伝子を保有するトランスジェニック雄鳥によって受精され、トランスジェニック雌鳥が産んだ卵における検出可能なシグナルの検出は、強いシグナルの場合に、胚がその雌及び雄の染色体Zに組み込まれたレポーター遺伝子の2コピーを保有することを示すことができる。より弱い強度のシグナルの場合、卵は雌と決定することができる。
本明細書上記の本発明の方法は、トランスジェニック鳥動物の提供を伴う。トランスジェニック鳥動物の作製は、特異的ヌクレアーゼを使用することができる遺伝子工学的手法を使用する必要がある。
したがって、さらにより具体的な実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、少なくとも1つのプログラム可能に遺伝子操作されたヌクレアーゼ(PEN)を用いて、本発明の方法によって提供されるトランスジェニック鳥対象又は動物の性染色体に組み込むことができる。本明細書で使用する用語「プログラム可能に遺伝子操作されたヌクレアーゼ(PEN)」は、二本鎖DNA損傷のDNA修復に関与する天然に存在するヌクレアーゼに由来し、特異的DNA配列を切断して、直接ゲノム編集を可能にする合成酵素を指す。
クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し(CRISPR)タイプIIシステムは、ゲノム工学のために改変された細菌の免疫システムである。しかしながら、全てのゲノム標的に特異的なヌクレアーゼペアの設計及び作製を必要するカスタマイズ可能なDNA結合タンパク質ヌクレアーゼの使用に依存するジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)又は転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)のような他のゲノム遺伝子工学的手法も、本明細書で利用可能であり得ることを理解されたい。
本明細書で使用する場合、SPIDR(スペーサー散在型ダイレクトリピート)としても知られているCRISPRアレイは、通常、特定の細菌種に特異的である最近説明されたDNA遺伝子座のファミリーを構成する。CRISPRアレイは、大腸菌で最初に認識された異なるクラスの散在型短い配列のリピート(SSR)である。その後の数年間に、同様のCRISPRアレイが、結核菌、ハロフェラックス・メディテラネイ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ、サーモトガ・マリティマ及び他の細菌並びに古細菌で見出された。本発明は、既知のCRISPRシステム、特に、本明細書に開示されるCRISPRシステムのいずれかの使用を企図することを理解されたい。CRISPR−Casシステムは、外来DNA又はRNAを標的化することによって、ファージ攻撃及び望ましくないプラスミド複製から保護するために原核生物で進化してきた。CRISPR−Casシステムは、リピート間に存在するスペーサーと呼ばれる短い相同なDNA配列に基づいてDNA分子を標的化する。これらのスペーサーは、プロトスペーサーと呼ばれる外来DNA内の一致する(及び/又は相補的)配列にCRISPR関連(Cas)タンパク質を導き、プロトスペーサーはその後切断される。スペーサーは、合理的に任意のDNA配列を標的化するように設計することができる。さらに、この認識要素は、任意の所望の標的を認識し、標的化するように別々に設計することができる。当業者によって認識されるように、CRISPRシステムに関して、天然CRISPR遺伝子座の構造は、一般に「リピート」と呼ばれるいくつかの短い反復配列を含む。リピートは、クラスター内で発生し、通常、「スペーサー」と呼ばれる独特の介在配列によって一定の間隔を置いて配置されている。典型的には、CRISPRリピートは、長さが約24〜47塩基対(bp)で変化し、部分的にパリンドロームである。スペーサーは、2つのリピートの間に位置しており、典型的には、各スペーサーは、長さが約20bp又はそれ未満から72bp又はそれ以上である独特な配列を有する。このように、特定の実施形態において、本発明の方法及びキットの少なくとも1つのgRNAをコードする配列に使用されるCRISPRスペーサーは、それぞれ10〜75ヌクレオチド(nt)を含むことができる。より具体的には、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75又はそれ以上である。いくつかの特定の実施形態において、該スペーサーは、約20〜25ヌクレオチド、より具体的には約20核酸塩基を含む。
少なくとも1つのリピート及び少なくとも1つのスペーサーに加えて、CRISPR遺伝子座はまた、リーダー配列、及び必要に応じて少なくとも1つのtracrRNAをコードする配列を含む。リーダー配列は、典型的には、最初のリピートの5’末端に直接隣接する最大550塩基対のATリッチな配列である。
より具体的な実施形態において、PENは、クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し(CRISPR)タイプIIシステムであり得る。
より具体的には、CRISPR−Casシステムの3つの主要な種類:タイプI、タイプII及びタイプIIIが示される。
タイプII CRISPR−Casシステムは、「HNH」型システム(連鎖球菌;髄膜炎菌血清型A str.Z2491、又はCASS4についてNmeniサブタイプとしても知られている)を含み、その中の、単一の非常に大きなタンパク質であるCas9は、広範に分布するCas1及びCas2に加えて、crRNAを作製し、標的DNAを切断するのに十分であると思われる。Cas9は、少なくとも2つのヌクレアーゼドメインを含有し、アミノ末端近くにRuvC様ヌクレアーゼドメイン及びタンパク質の中央にHNH(又はMcrA様)ヌクレアーゼドメインがあるが、これらのドメインの機能はまだ解明されていない。しかしながら、HNHヌクレアーゼドメインは制限酵素に豊富で、標的切断に関与するエンドヌクレアーゼ活性を有している。
タイプIIシステムは、tracrRNAとプレcrRNA中のリピートの一部との間の二本鎖形成を伴う独特な機構を介してプレcrRNAを切断する。続いて、プレcrRNAプロセシング経路の最初の切断は、このリピート領域で生じる。さらに、タイプIIシステムはcas9、cas1、cas2 csn2、及びcas4遺伝子の少なくとも1つを含むことに留意されたい。任意のタイプII CRISPR−Casシステムは、具体的には、タイプII−A又はタイプII−Bのいずれか1つを本発明で適用することができることを理解されたい。
したがって、さらにいくつかのさらなる及び代替的な実施形態において、本発明の方法及びキットで使用される少なくとも1つのcas遺伝子は、タイプII CRISPRシステム(タイプII−A又はタイプII−Bのいずれか)の少なくとも1つのcas遺伝子であり得る。より特定の実施形態において、本発明の方法及びキットで使用されるタイプII CRISPRシステムの少なくとも1つのcas遺伝子が、cas9遺伝子であり得る。かかるシステムはさらに、cas1、cas2、csn2及びcas4遺伝子の少なくとも1つを含むことができることを理解されたい。
Cas9による二本鎖DNA(dsDNA)切断は、「タイプII CRISPR−Cas」免疫系の特徴である。CRISPR関連タンパク質Cas9は、配列特異的二本鎖DNA(dsDNA)切断のための標的部位を特定するために、RNA:DNA相補性を使用するRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼであり、特定の標的配列、例えば、鳥性染色体W及びZ内の特定の標的にレポーター遺伝子を組み込むHDRに必要な二本鎖切断(DSB)をもたらす。標的DNA配列は、短いパリンドロームリピートによって分けられた一連の約30〜40塩基対のスペーサーであるCRISPRアレイによって特定される。アレイは、プレcrRNAとして転写され、プロトスペーサーとしても知られている相補的DNA配列を標的化するためのCasタンパク質複合体と結合するより短いcrRNAにプロセシングされる。これらのプロトスペーサー標的はまた、標的認識に必要とされるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)として知られている追加の隣接配列を有していなければならない。結合後、Casタンパク質複合体は、標的の両方の鎖を切断するDNAエンドヌクレアーゼとして機能し、その後、DNA分解がエキソヌクレアーゼ活性を介して生じる。
本明細書で使用するCRISPRタイプIIシステムは、2つの必須成分:「ガイド」RNA(gRNA)及び非特異的CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(Cas9)を含める必要がある。gRNAは、Cas9に結合するのに必要な「足場」配列及び改変されるゲノム標的を定義する約20ヌクレオチド長の「スペーサー」又は「標的化」配列から構成される短い合成RNAである。そのため、gRNAに存在する標的化配列を単に変更することによってCas9のゲノム標的を変更することができる。本明細書で使用するガイドRNA(gRNA)は、Cas9ヌクレアーゼの標的特異性と足場/結合能の両方を提供する、内因性細菌crRNA及びtracrRNAの合成融合物を指す。「単一ガイドRNA」又は「sgRNA」とも呼ばれる。CRISPRはもともと、様々な細胞型及び生物において標的遺伝子を「ノックアウト」するために使用されたが、Cas9酵素の改変によって、標的遺伝子を「ノックイン」し、標的遺伝子を選択的に活性化又は抑制し、特定のDNA領域を精製し、さらには蛍光顕微鏡を用いた生細胞のDNAを画像化するようにCRISPRの適用が拡張された。さらに、gRNAの作製の容易さは、CRISPRを最もスケーラブルなゲノム編集技術の1つにさせ、最近はゲノムワイドスクリーニングに利用されている。
編集されるゲノム内の標的、具体的には、本発明のレポーター遺伝子が組み込まれる予定の性染色体Z又はW内の特定の標的遺伝子座は、プロトスペーサー隣接モチーフ(rotospacer djacent otif(PAM))のすぐ上流に存在すべきである。
PAM配列は、標的結合に絶対的に必要であり、正確な配列はCas9の種(ストレプトコッカス・ピオゲネスCas9の5’NGG 3’)に依存している。特定の実施形態において、S.ピオゲネスのCas9は、本発明の方法及びキットで使用される。それにもかかわらず、任意の既知のCas9が適用できることを理解されたい。本開示において有用なCas9の非限定的な例としては、SpCas9としても本明細書で示される化膿連鎖球菌(SP)、本明細書でSaCas9としても示される黄色ブドウ球菌(SA)、本明細書でNmCas9としても示される髄膜炎菌(NM)、本明細書でStCas9としても示されるストレプトコッカス・サーモフィルス(ST)及び本明細書でTdCas9としても示されるトレポネーマ・デンティコラ(TD)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの特定の実施形態において、ストレプトコッカス・ピオゲネスのM1 GASのCas9、具体的には、タンパク質id:AAK33936.1のCas9は、本発明の方法及びキットに適用することができる。いくつかの実施形態において、Cas9タンパク質は、配列番号24に示す核酸配列によってコードされ得る。さらに特定の実施形態においては、Cas9タンパク質は、配列番号25に示すアミノ酸配列、又は任意の誘導体、変異体、又はそれらの変異体を含むことができる。発現すると、Cas9タンパク質及びgRNAは、gRNA「足場」ドメインとCas9上の正電荷の表面に露出した溝との間の相互作用を介してリボタンパク質複合体を形成する。Cas9は、gRNA結合の際に、不活性の非DNA結合立体構造から活性のあるDNA結合立体構造に分子をシフトする立体構造変化を受ける。重要なことに、gRNAの「スペーサー」配列は、標的DNAと相互作用するために遊離状態のままである。Cas9−gRNA複合体は、PAMを有する任意のゲノム配列に結合するが、Cas9が切断するかどうかは、gRNAスペーサーが標的DNAと一致する程度によって決まる。Cas9−gRNA複合体が推定DNA標的に結合すると、gRNAの標的化配列の3’末端の「シード」配列は、標的DNAにアニールし始める。シード配列及び標的DNA配列が一致する場合は、gRNAは、3’から5’方向に標的DNAにアニールし続ける。
十分な相同性がgRNAスペーサーと標的配列の間に存在する場合、Cas9のみが標的を切断する。さらに、Cas9ヌクレアーゼは、2つの機能性エンドヌクレアーゼドメイン:RuvC及びHNHを有する。Cas9は、標的結合の際に、標的DNAの反対の鎖を切断するようにヌクレアーゼドメインを配置する第2の立体構造変化を受ける。Cas9媒介性DNA切断の最終結果は、PAM配列の約3〜4ヌクレオチド上流に生じる標的DNA内の二本鎖切断(DSB)である。
得られたDSBは、その後、効率的であるが、エラーを起こしやすい非相同末端結合(NHEJ)経路及び効率的ではないが、高忠実度の相同性指向性修復(HDR)経路の2つの一般的な修復経路のうちの1つによって修復することができる。いくつかの実施形態において、性染色体W又はZ内の特定の標的遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を特異的に組み込む挿入は、Cas9によって引き起こされるDSBの修復の結果である。いくつかの特定の実施形態において、本発明のレポーター遺伝子は、HDRによって標的遺伝子座に組み込まれるか、又はノックインされる。
本明細書で使用する用語「相同性指向性修復(HDR)」は、二本鎖DNAの損傷を修復するための細胞内機構を指す。HDRの最も一般的な形態は相同組換えである。HDR修復機構は、ほとんどが細胞周期のG2及びS期の核にDNAの相同部分が存在する場合に、細胞が唯一使用することができる。ホモログDNA断片が存在しない場合、非相同末端結合(NHEJ)と呼ばれる別のプロセスが、代わりに生じ得る。ゲノム編集のためのプログラム可能に遺伝子操作されたヌクレアーゼ(PEN)方法は、特定の二本鎖DNA切断後のHDR機構の細胞の活性化に基づいている。
前述したように、Cas9は、2つのヌクレアーゼドメインのRuvC及びHNHの組み合わせ活性を介して二本鎖切断(DSB)をもたらす。エンドヌクレアーゼ活性に重要である各ヌクレアーゼドメイン内の正確なアミノ酸残基は、公知であり(S.ピオゲネスCas9においてHNHについてはD10A及びRuvCについてはH840A)、唯一の活性触媒ドメインを含有するCas9酵素の改変バージョン(「Cas9ニッカーゼ」と呼ばれる)が作製されている。Cas9ニッカーゼは、依然としてgRNA特異性に基づいてDNAに結合するが、ニッカーゼは、DSBの代わりに、DNA鎖の一方のみを切断し、「ニック」、又は一本鎖切断をもたらすことができる。DNAニックは、鋳型として無傷の相補的DNA鎖を用いてHDR(相同性指向性修復)によって急速に修復される。そのため、反対の鎖を標的にする2つのニッカーゼが、標的DNA内でDSBをもたらすのに必要とされる(しばしば「ダブルニック」又は「デュアルニッカーゼ」CRISPRシステムと呼ばれる)。2つのオフターゲットニックは、DSBを引き起こすのに十分な近接内で生成されることはほとんどないので、この要件は標的特異性を劇的に高める。したがって、本発明はさらに、特異性を高め、オフターゲット効果を減少させるために二重ニック誘発性DSBをもたらすためのデュアルニッカーゼアプローチの使用を包含することを理解されたい。
したがって、特定の実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、少なくとも1つのCRISPR/CRISPR関連エンドヌクレアーゼ9(Cas9)システムによって媒介される相同性指向性修復(HDR)によってトランスジェニック鳥対象、具体的には動物の性染色体に組み込むことができる。
いくつかのさらなる実施形態において、本発明のキットのgRNAは、少なくとも1つのCRISPR RNA(crRNA)及び少なくとも1つのトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含むことができる。
いくつかの代替実施形態において、本発明のキットは、少なくとも1つのgRNAをコードする核酸配列を含むことができる。そのような核酸配列は、標的ゲノムDNA配列中の少なくとも1つのプロトスペーサーを標的化し、したがって、これと同一である少なくとも1つのスペーサー配列を含むCRISPRアレイを含むことができる。核酸配列はさらに少なくとも1つのtracrRNAをコードする配列を含むことに留意されたい。
いくつかの実施形態において、本開示に係るCRISPRアレイは、少なくとも1つのスペーサー及び少なくとも1つのリピートを含む。さらに別の実施形態において、本発明は、さらに、同一又は異なる標的を標的にすることができるいくつかの最終gRNA生成物にプロセシングすることができるプレcrRNAを提供する選択を包含する。
さらにいくつかのより特定の実施形態において、本発明のgRNAに含まれるcrRNAは、標的ゲノムDNA配列に相補的な一本鎖リボ核酸(ssRNA)配列であり得る。いくつかの具体的な実施形態において、標的ゲノムDNA配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列のすぐ上流及びさらに上流に配置され得る。
本明細書で示されるように、本発明のキットのgRNAは、標的ゲノムDNAに、少なくとも部分的に相補的であり得る。ある実施形態において、「相補性」は、それぞれ、ロック・アンド・キー原理に従う2つの構造の間の関係を指す。自然界では、相補性は、配列が互いに反平行に整列されている場合、配列中の各位置でのヌクレオチド塩基が相補的(例えば、AとT又はU、CとG)であるように2つのDNA又はRNA配列間で共有される特性であるので、DNAの複製及び転写の基本的な原理である。
上記に示したように、本発明のキットのgRNAによって標的化されるゲノムDNA配列は、PAM配列のすぐ上流に位置する。いくつかの実施形態において、このようなPAM配列は、核酸配列NGGの配列であり得る。
ある実施形態において、本発明によって言及されるPAM配列は、N、すなわち任意のヌクレオチド、具体的には、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)又はチミン(T)のいずれか1つを含むことができる。さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明に係るPAM配列は、A、G、C、又はT及び2つのグアニンから構成される。
一実施形態によれば、本発明のgRNAをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも1つのスペーサー、及び必要に応じて、少なくとも1つのリピートを含むことができる。さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明のgRNAをコードするDNAは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100又はそれ以上、具体的には、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200又はそれ以上のスペーサーを含むことができる。いくつかの実施形態において、各スペーサーは、2つのリピートの間に配置される。さらに、本発明のgRNAをコードする核酸配列のスペーサーは、同一又は異なるスペーサーのいずれかであり得ることを理解されたい。より多くの実施形態において、これらのスペーサーは、同一又は異なる標的ゲノムDNAのいずれかを標的とし得る。さらにいくつかの他の実施形態において、そのようなスペーサーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100又はそれ以上の標的ゲノムDNA配列を標的とし得る。これらの標的配列は、単一遺伝子座、或いは、いくつかの標的遺伝子座に由来し得る。
本明細書で使用する用語「スペーサー」は、特定の配列を標的化するように設計されており、CRISPRアレイの複数の短いダイレクトリピート(すなわち、CRISPRリピート)との間に配置される非反復スペーサー配列を指す。いくつかの特定の実施形態において、スペーサーは、約15〜約30ヌクレオチド、具体的には、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。より具体的には、約20〜25ヌクレオチドである。
本発明のCRISPRシステムによりコードされるガイドRNA又は標的化RNAは、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化RNA(tracrRNA)を含むことができる。CRISPRスペーサーによりコードされる標的化RNAの配列は、本明細書で「プロトスペーサー」とも呼ばれる、鳥ゲノムDNA中の標的配列を指向する(すなわち、同一又は相補的であるセグメントを有する)要件によること以外は特に限定されるものではない。そのようなプロトスペーサーは、本発明の方法及びキットのgRNAをコードする核酸配列内に含まれるCRISPRスペーサーによりコードされる標的化RNAに十分な相補性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、crRNAは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、又は40ntのスペーサー(標的化)配列に続く19〜36ntのリピート配列を含むか、又はそれらからなる。特定の非限定的な実施形態において、標的化スペーサーは、代表的なスペーサー配列が、本明細書に示されているゲノムDNA配列のいずれか1つを標的にするセグメントを含むか、又はそれからなることができる。
いくつかの特定の実施形態において、本発明のCRISPRシステムのスペーサーは、標的化ガイドRNA(gRNA)をコードすることができることに留意されたい。「gRNA」又は「標的化RNA」は、それをコードするCRISPRシステムの一部から転写された場合に、標的ゲノムDNA中のDNA配列と同一(RNAの場合、TとUを置換することを除いて)又は相補的(そのため、「標的」)であるRNA配列の少なくとも1つのセグメントを含むRNAである。本開示のCRISPRシステムは、必要に応じて、複数の標的化RNAをコードすることができ、標的化RNAは、ゲノムDNA中の1以上の標的配列を指向することができる。
さらに、いくつかの実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つのレポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列を、鳥対象、具体的には、動物の少なくとも1つの細胞、又は鳥対象、具体的には、動物に導入される少なくとも1つの細胞に共トランスフェクトすることによって、トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物の性染色体に組み込むことができる。
したがって、本発明の方法によって使用されるトランスジェニック鳥動物を作製するための少なくとも2つの核酸分子が提供されるべきである。
本明細書で使用する「核酸又は核酸分子」は、用語「ポリヌクレオチド(複数可)」と交換可能であり、一般に、非改変RNA若しくはDNA又は改変RNA若しくはDNA、又はそれらの任意の組み合わせであり得る任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「核酸」は、限定することなく、1本鎖及び2本鎖の核酸を含む。本明細書で使用する用語「核酸(複数可)」はまた、1以上の改変塩基を含有する上記のDNA又はRNAを含む。本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、2以上のデオキシリボヌクレオチド及び/又はリボヌクレオチド、好ましくは3以上から構成される分子として定義される。その正確なサイズは、多くの要因に依存し、ひいては、オリゴヌクレオチドの最終的な機能及び使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、約8〜約1,000ヌクレオチド長であり得る。より具体的には、本発明のキットで使用されるオリゴヌクレオチド分子(複数可)は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000又はそれ以上の塩基長のいずれか1つを含むことができる。
核酸分子は、(DNA及びRNAなどの)天然に存在するヌクレオチド、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体(例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー型)、又は改変ヌクレオチド若しくはそれらの任意の組み合わせである単量体から構成され得る。本明細書において、この用語はまた、cDNA、すなわち逆転写酵素(RNA依存性DNAポリメラーゼ)の作用によりRNA鋳型から生成された相補的DNA又はコピーDNAを包含する。
これに関連して、「単離されたポリヌクレオチド」は、生物のゲノムから分離された核酸分子である。例えば、本発明の方法及びキットで使用されるレポーター遺伝子又はその任意の誘導体若しくはホモログ、並びに本発明の方法及びキットのCRISPR/Cas9及びgRNAをコードする配列をコードし、細胞のゲノムDNAから分離されたDNA分子は、単離DNA分子である。単離核酸分子の別の例として、生物のゲノム中に組み込まれていない化学合成核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なDNA分子よりも小さい。いくつかの実施形態において、本発明の方法及びキットによって使用される核酸配列、具体的には、Cas9及びgRNA、或いは本発明のレポーター遺伝子をコードする配列を含む核酸配列は、ベクター内に構築して提供することができる。したがって、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えDNA構築物、及び必要に応じて、本発明の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、調節エレメント及び制御エレメント、翻訳シグナル、発現シグナル及び他のシグナルなどのさらなる追加の要素に関する。
本明細書で使用する用語「組換えDNA」、「組換え核酸配列」又は「組換え遺伝子」は、鳥染色体Z及び/又はW内の特定の遺伝子座にCas9を標的化する本発明のgRNAと共に、本発明のCRISPRシステムの1つ、具体的には、CRISPR/Cas9タイプIIをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。さらなる別の実施形態において、本明細書で使用される組換えDNAはさらに、本発明のレポーター遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸、具体的には、導入遺伝子を指す。
本明細書で言及する用語「遺伝子」又は「導入遺伝子」は、タンパク質生成物をコードする天然又は合成のいずれかの核酸を意味する。用語「核酸」は、天然及び/又は合成のヌクレオチド及びヌクレオシド、例えば、cDNA、ゲノムDNA(gDNA)、mRNA、及びRNA、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、及びそれらの誘導体の直鎖、環状並びに連続的なアレイを意味することを意図する。
語句「作動可能に連結された」は、導入遺伝子の転写を可能にする方法での結合を意味することを意図する。用語「コードする」は、例えば、本発明の核酸が適切なベクター(例えば、発現ベクター)中のプロモーター及びエンハンサーエレメントなどの適切な制御配列に連結される場合、及びベクターが適切なシステム又は細胞に導入される場合に、本発明の核酸が、適切な発現系において所望のポリペプチド又は本発明のタンパク質のいずれかに転写及び翻訳され得ることを意味することが意図される。
いくつかの実施形態において、本発明の方法及びキットによって提供され、使用される第1並びに第2の核酸配列の少なくとも1つは、ベクター内で構築され、ベクター内に含まれ得ることを理解されたい。本明細書で使用する「ベクター」又は「ビヒクル」は、宿主のゲノムへのDNA断片の組み込みを可能にするか、或いは、組み込まれない遺伝的要素の発現を可能にするプラスミド、ファージミド、ウイルス、組み込み可能なDNA断片、及び他のビヒクルなどのベクターを包含する。ベクターは、典型的には、所望の核酸配列を含有し、かつ適切な宿主細胞内で認識され、所望のスペーサーの翻訳に影響を及ぼす作動可能に連結された遺伝子制御エレメントを含有する自己複製DNA又はRNA構築物である。一般的に、遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモーター系又は真核生物プロモーター発現制御システムを含むことができる。そのようなシステムは、典型的には、RNA発現レベルを上昇させる転写プロモーター、転写エンハンサーを含む。ベクターは、通常、宿主細胞から独立してベクターの複製を可能にする複製起点を含有する。さらなるいくつかの代替実施形態において、本発明で使用される発現ベクターは、鳥の性別特異的染色体W及び/又はZへの本発明の所望のレポーター遺伝子の組み込みに必要な要素を含むことができる。
したがって、用語「制御及び調節エレメント」は、プロモーター、ターミネーター及び他の発現制御要素を含む。かかる調節エレメントは、Goeddel;[Goeddelら,遺伝子発現技術:酵素学の方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)]に記載されている。例えば、作動可能に連結される場合に、DNA配列の発現を制御する様々な発現制御配列のいずれかは、本発明の方法を使用して任意の所望のタンパク質をコードするDNA配列を発現させるために、これらのベクターにおいて使用することができる。
ベクターはさらに、ベクター含有細胞の選択に適切な制限部位、抗生物質耐性又は他のマーカーを含むことができる。プラスミドは、最も一般的に用いられるベクターの形態であるが、同等の機能を果たしており、当技術分野で公知であるか、又は公知になるベクターの他の形態が本明細書で使用するのに適している。例えば、参照により本明細書に組み込まれるPouwelsら,クローニングベクター:実験室マニュアル(Cloning Vectors:a Laboratory Manual)(1985及び補遺),Elsevier,N.Y.;並びにRodriquezら(編)ベクター:分子クローニングベクター及びその使用の調査(Vectors:a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses,Buttersworth,Boston,Mass(1988)を参照されたい。
本発明の方法で使用されるトランスジェニック鳥動物を作製するために、その性染色体Z又はW内の特定の遺伝子座に組み込まれたレポーター遺伝子を含む鳥細胞を調製しなければならない。かかる細胞は、本発明の方法及びキットによって提供される第1及び第2の核酸配列、又はこれを含む任意の構築物を該細胞に共トランスフェクトすることによって調製することができる。本明細書で使用する「トランスフェクション」は、哺乳動物細胞にDNA及び二本鎖RNAなどの遺伝物質を挿入する過程を意味する。細胞へのDNAの挿入は、細胞自身の機構を使用してタンパク質の発現、又は生成を可能にする。したがって、本明細書で使用する共トランスフェクションは、各単一細胞への少なくとも2つの異なる核酸分子又はこれを含む任意のベクターの同時トランスフェクションを指す。さらに、トランスフェクトされる核酸配列は、一過的に短期間発現させるか、又はゲノムDNAに組み込むことができ、分裂により変化が細胞から細胞へ受け継がれる。
本発明は、したがって、レポーター遺伝子、具体的には、ルシフェラーゼの発現に基づく卵内での鳥胚の卵内性別決定法を提供する。「発現」は、一般的に、遺伝子コード情報が細胞内に存在し、動作する構造体に変換されるプロセスを指す。したがって、本発明によると、レポーター遺伝子の「発現」は、具体的には、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、又はさらにはタンパク質の翻訳後修飾を指すことができる。
さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、第2の核酸配列における少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で相同アームが隣接し得る。いくつかの実施形態において、これらのアームは、必要とされるため、組み込まれる部位でのレポーター遺伝子のHDRを促進することを理解されたい。
より具体的な実施形態において、本発明の方法によって使用される第2の核酸配列中のレポーター遺伝子は、HDRを介して特定の組み込みを促進するための組み込み部位として機能する、性染色体Z又はW内の標的遺伝子座内に含まれる少なくとも1つの核酸配列と相同であるか、又は約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の相同性若しくは同一性を示す2つのアームと隣接し得る。特定の実施形態において、標的配列は、本明細書では、本発明で使用されるgRNAの一部である「スペーサー」配列により認識され、第1の核酸配列によって提供される少なくとも1つの「プロトスペーサー」とも呼ばれる。
本明細書で使用される用語「相同アーム」は、改変される標的配列の周囲にある程度の相同性(使用されるPENに依存する)を有する遺伝子に特定の変異又は新しい要素の挿入を行うために使用される特定のベクター又はウイルスに導入されるHDR鋳型を指す。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、CRISPRがPENとして使用される場合、アーム配列(左、上流及び右、下流)は、約10〜5000bp、具体的には、約50〜1000bp、100〜500、具体的には、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000bpを含むことができる。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法及びキットによって提供される第1の核酸配列によってコードされるgRNA内の標的化配列は、本明細書で「スペーサー」配列とも呼ばれ、本明細書で「プロトスペーサー」と呼ばれる性染色体Z又はW内の標的遺伝子座内に含まれる少なくとも1つの核酸配列と約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の相同性又は同一性を示す。
いくつかの実施形態において、第2の核酸配列中の少なくとも1つのレポーター遺伝子は、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター(例えば、Masonら、1996に記載のα−グロビンプロモーター)及び誘導性プロモーター(例えば、米国特許第5750385号に記載の大豆SSU遺伝子に由来する、又はWeisshaarら、1991に記載のパセリのカルコン合成酵素CHSプロモーターに由来する光誘導性プロモーター、又はMetta−Menaら、2014から引用される青色光で照射したときに発現を活性化する細菌の光−酸素−電圧タンパク質であるEL222の工学処理バージョン)の任意の1つに作動可能に連結することができる。さらにより具体的な実施形態において、該レポーター遺伝子は、胚性プロモーターの制御下にあり、それによって、トランスジェニックレポーター遺伝子の発現を胚段階に制限するので、成体鶏では発現しない。かかる実施形態において、レポーター導入遺伝子は、診断目的のために使用され、胚段階でのみ発現する。
より具体的には、本明細書で使用される「プロモーター」は、下流に配置されている遺伝子の発現を制御する能力を有するDNAの特定領域を指す。このように、「雛における性別特異的プロモーター」は、本明細書以下で、特定の雛の性別(すなわち、雄又は雌)でのみ遺伝子の発現を活性化するプロモーターを指す。さらに、「雛における発達に特異的なプロモーター」は、雛の発達の特定の段階でのみ遺伝子の発現を活性化するプロモーターを指す。
いくつかの特定の実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、標的性染色体の少なくとも1つの非コード領域に挿入し、それによって組み込むことができる。そのようなアプローチは、未孵化胚の発達及び成熟に必要とされ得る遺伝子の破壊を回避する。
本明細書で使用する「非コード領域」は、タンパク質配列をコードしない生物のDNAの構成要素を指す。いくつかの非コードDNA領域は、機能的非コードRNA分子に転写され、非コードDNA領域の他の機能には、タンパク質コード配列の転写及び翻訳調節、足場付着領域、DNA複製の起点、セントロメア及びテロメアが含まれる。機能しないと仮定される部分(又は未知の機能のDNA)は、しばしば「ジャンクDNA」と呼ばれている。
いくつかの特定の実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、性染色体Wの少なくとも1つの部位に組み込むことができる。より具体的な実施形態において、染色体Wの特定の遺伝子座は、位置1022859〜1024215であり得る。いくつかの特定の実施形態において、標的遺伝子座は、配列番号3に示す核酸配列を含むことができる。
より具体的な実施形態において、染色体W中のかかる特定の位置へレポーター遺伝子を標的化するのに必要な少なくとも1つのgRNAは、配列番号1及び2のいずれか1つに示す核酸配列を含むことができ、これらのgRNAは、それぞれgRNA1及びgRNA2として本明細書に示されている。
さらにいくつかのより具体的な実施形態において、トランスジェニック鳥雌を調製するために本発明の方法で使用されるgRNAは、配列番号1(gRNA1)に示す核酸配列を含むことができる。このような場合には、該第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ染色体W内の該特定の遺伝子座へのその組み込みを促進する配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。これらのアームはまた、本明細書ではそれぞれ左アーム及び右アームと呼ばれることを理解されたい。
さらにいくつかの代替実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥雌を調製するために使用されるgRNAは、配列番号2(gRNA2)に示す核酸配列を含むことができる。このような場合には、第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接する。これらのアームはまた、本明細書ではそれぞれ左アーム及び右アームと呼ばれることを理解されたい。
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、トランスジェニック鳥動物を作製するための本発明の方法で使用される少なくとも1つのレポーター遺伝子は、性染色体Zの少なくとも1つの部位に組み込むことができる。より具体的な実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Zの配列番号15に示す領域9156874〜9161874、配列番号16に示す領域27764943〜27769943、配列番号17に示す領域42172748〜42177748、配列番号18に示す領域63363656〜63368656、及び配列番号19に示す領域78777477〜78782477のいずれか1つであり得る。
より具体的な実施形態において、染色体Z内のかかる特定の場所へレポーター遺伝子を標的化するのに必要な少なくとも1つのgRNAは、配列番号11に示すgRNA3:ACAGACCTATGATATGT;配列番号12に示すgRNA4:CGATTATCACTCACAAG;配列番号13に示すgRNA5:CTGGTTAGCATGGGGAC;配列番号14に示すgRNA6:GTAAAGAGTCAGATACAのいずれか1つによって示される核酸配列を含むことができる。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号41に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号42に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号11のgRNA3が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号43に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号44に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号12のgRNA4が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号45に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号46に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号13のgRNA5が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号47に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号48に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号14のgRNA6が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。染色体Z内の特定の遺伝子座への組み込みに適するgRNA配列のさらなる非限定的な例として、配列番号26にも示す核酸配列GTAATACAGAGCTAAACCAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_42174515_−1のgRNA7、配列番号27にも示す核酸配列ACAGACCTATGATATGTGAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_9157091_1のgRNA8、配列番号28にも示す核酸配列GAGCTTGTGAGTGATAATCGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_27767602_−1のgRNA9、配列番号29にも示す核酸配列GTAAAGAGTCAGATACACAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_78779927_1のgRNA10、及び配列番号30にも示す核酸配列CAGTGGGTACTGAAGCTGTGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_63364946_−1のgRNA11を挙げることができるが、これらに限定されない。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号31に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号32に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号26のgRNA7が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号33に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号34に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号27のgRNA8が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号35に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号36に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号28のgRNA9が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号37に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号38に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号29のgRNA10が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号39に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号40に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号30のgRNA11が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
鳥宿主の受精卵細胞の遺伝子座が外因性配列、具体的には、本発明で使用されるレポーター遺伝子を標的化及び/又はトランスフェクトする場合、トランスジェニック動物を作製するためにそのような細胞を使用することが望ましい場合がある。このような手順のために、胚性幹(ES)細胞へのターゲッティング構築物の導入後、細胞を適切な培地、例えば、成長因子及びサイトカイン、ウシ胎児血清及び抗生物質を補完したDMEM中でフィーダー層上に播種することができる。胚性幹細胞は、単一の標的遺伝子座(ヘテロ接合)又は両方の標的遺伝子座(ホモ接合)を有することができる。該構築物を含有する細胞は、選択培地を用いることによって検出することができ、十分な時間コロニーを増殖させた後、コロニーを採取し、遺伝子標的化の発生について分析することができる。いくつかの特定の実施形態において、PCRを適用して、構築物配列の内側及び外側のプライマーを用いて、標的遺伝子座への所望の外因性配列の組み込みを確認することができる。次いで、遺伝子標的化を示すコロニーを、鳥の胚への注入のために使用することができる。次いで、ES細胞を、トリプシン処理することができ、改変細胞を、卵の脇に形成された開口を介して注入することができる。卵は、密封した後、孵化するまで適切な条件下でインキュベートすることができる。新しく孵化した鳥を、例えば、その生物学的試料、例えば、その血液試料を調べることによって、標的構築物配列の存在について試験することができる。鳥は成熟した後交配し、外因性の組み込まれた配列が生殖系列を介して伝達されるかどうかを決定するためにそれらの子孫を調べることができる。
生殖系列を介して遺伝子改変を伝えることができる、改変された胚性幹細胞又は受精卵細胞に部分的に由来するキメラ鳥を作製する。外因性配列、具体的には、本発明で使用するレポーター遺伝子又はその一部を含有する鳥系統を、鳥の野生型遺伝子座又はその一部を修復した系統と交配すると、卵内での検出可能な性別を示す子孫が生じるはずである。
さらに、トランスジェニック鳥も他の方法によって生成することができ、そのいくつかを以下で説明する。トランスジェニック動物を作製するための形質転換に適する鳥細胞には、始原生殖細胞(PGC)、精子細胞及び受精卵細胞(胚性幹細胞を含む)がある。精子細胞は、エレクトロポレーション、微粒子銃、及びリポフェクションなどを含む任意の適切な方法によりDNA構築物で形質転換することができる。精子は、鳥の人工授精に使用することができる。上記のように、受精鳥の子孫を外因性配列について調べることができる。
或いは、始原生殖細胞を、鳥の卵から単離して、任意の適切な方法によって本発明の外因性レポーター遺伝子でトランスフェクトし、新しい胚に移すか、又は挿入することができ、その胚で発達している生殖腺に組み込むことができる。孵化鳥及びその子孫は、本発明に記載のとおり、外因性レポーター遺伝子配列を調べることができる。
さらに別のアプローチでは、卵から単離され、分散している胚盤葉細胞を、任意の適切な手段により外因性レポーター遺伝子配列又はその一部でトランスフェクトし、性別特異的染色体Z又はWに組み込まれた後、無傷の卵の胚下腔に注入することができる。上記のように、孵化した鳥対象及びそれらの子孫を、外因性レポーター遺伝子について検査することができる。
鶏始原生殖細胞(PGC)は卵子及び精子の前駆体である。したがって、そのいくつかの態様において、本発明は、性別特異的染色体W及びZへのレポーター遺伝子の組み込みを指示するレポーター遺伝子構築物及びCRISPR/Cas9 gRNA構築物で共トランスフェクトしたPGCを用いた生殖系列伝達システムを介するトランスジェニック鶏の生成を提供する。PGCを、選別し、生殖細胞系伝達のために2.5日目のレシピエント胚の血流中に移す。
したがって、いくつかの特定の実施形態において、「トランスジェニック鳥動物の作製」は、ゲノムが改変された鶏の生成のための遺伝子工学技術を含む多段階法を指し、その中で、a)始原生殖細胞(PGC)を2日齢雛胚の血液から単離し、b)導入遺伝子構築物を、レンチウイルスシステム、Piggybacトランスポゾンベクター、TALENS又はCRISPR/Cas9技術を用いることによって培養したPGCに組み込み;(c)トランスジェニックPGCを特定し、胚の循環系に注入し、発達している生殖腺に移行させ;d)レシピエント胚を孵化するまで37℃でインキュベートし、(d)孵化した雄を、性的に成熟するまで飼育し、野生型雌鳥と交配し、(e)子孫をスクリーニングして、トランスジェニックPGCに由来するものを特定する。
したがって、第2の態様において、本発明は、その少なくとも1つの細胞において、性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所(本明細書では遺伝子座とも呼ぶ)に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む鳥トランスジェニック動物に関する。
用語「鳥」は、羽、歯のないくちばしをもつ顎、硬い殻の卵を産むこと、高い代謝率、4つ部屋からなる心臓、及び軽量だが強力な骨格を特徴とする鳥由来の任意の種に関する。鳥の種には、限定されないが、鶏、ウズラ、七面鳥、アヒル、キジ目(Gallinacea)の種、ガチョウ、キジ及び他の家禽が含まれる。用語「雌鳥」には、鳥の種の全ての雌が含まれる。「トランスジェニック鳥」は、一般に、鳥の生殖細胞の染色体に組み込まれた異種DNA配列、又は通常、鳥にとって内因性の1以上の追加のDNA配列(本明細書では総称して「導入遺伝子」と呼ぶ)を有する鳥を指す。そのような導入及び組み込みの結果として、導入配列は、トランスジェニック鳥の子孫へ生殖細胞を介して受け継がれ得る。トランスジェニック鳥(その子孫を含む)はまた、体細胞の性染色体に組み込まれた導入遺伝子を有する。
いくつかの特定の実施形態において、本発明の少なくとも1つのトランスジェニック動物は、少なくとも2つの異なるレポーター遺伝子を含むことができる。このような場合に、各レポーター遺伝子は、性染色体Z若しくはWの一方の少なくとも1つの位置又は場所に組み込むことができる。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明のトランスジェニック動物内に含まれるレポーター遺伝子は、少なくとも1つの生物発光レポーター遺伝子であり得る。
より具体的な実施形態において、かかる生物発光レポーター遺伝子はルシフェラーゼを含むことができるか、又はルシフェラーゼであり得る。
ある実施形態において、本発明によって提供される少なくとも1羽のトランスジェニック鳥動物は、雌であり得る。より具体的な実施形態において、かかるトランスジェニック鳥雌内の少なくとも1つのレポーター遺伝子は、雌の染色体Zの少なくとも1つの位置に組み込むことができる。
さらにいくつかの代替実施形態において、少なくとも1羽のトランスジェニック鳥動物は、雌の染色体Wの少なくとも1つの位置に組み込まれた少なくとも1つのレポーター遺伝子を有する雌であり得る。
いくつかの特定の実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、少なくとも1つのPENを使用して、本発明のトランスジェニック動物の性染色体に組み込むことができる。
より具体的には、かかるPENは、ある実施形態において、CRISPRタイプIIシステムであり得る。
さらにより具体的な実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、少なくとも1つのCRISPR/Cas9システムによって媒介されるHDRによって、本発明のトランスジェニック鳥動物の性染色体に組み込むことができる。
より具体的な実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、この鳥動物の少なくとも1つの細胞、又は該鳥動物に導入される少なくとも1つの細胞に少なくとも2つの核酸配列と共にトランスフェクトすることにより、本発明のトランスジェニック鳥動物の性染色体に組み込むことができる。より具体的には、かかる細胞に、(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのgRNAをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つのレポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列を共トランスフェクトすることによって、CRISPR媒介組み込みを提供することができる。
より具体的な実施形態において、第2の核酸配列中の少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で相同アームが隣接し得る。これらのアームは、標的性染色体内での組み込み標的部位に相同性を示し、それによって、組み込まれた部位でHDRを促進する。
さらにより具体的な実施形態において、第2の核酸配列中の少なくとも1つのレポーター遺伝子は、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか1つに作動可能に連結することができる。かかるプロモーターは、本発明のレポーター遺伝子の発現を特定の所望の性別(性別特異的プロモーターの場合)、特定の胚段階(胚特異的プロモーター)、又は特定の条件(誘導条件)に制限しなければならない。
さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥動物内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その性染色体の1つの少なくとも1つの非コード領域に組み込むことができる。
ある実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、性染色体Wの少なくとも1つの部位に組み込むことができる。いくつかの特定の実施形態において、組み込み部位は、染色体Wの遺伝子座1022859−1024215、具体的には、染色体W:1022859−1024215のgalGal5_dna範囲に配置することができる。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、かかる遺伝子座は、配列番号3に示す核酸配列を含む。
上記の遺伝子座内の任意の位置での本発明のレポーター遺伝子の特異的組み込みのために、特異的gRNAが必要とされ得る。したがって、いくつかの特定の非限定的な実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥動物の作製のために使用される適切なgRNAは、配列番号1及び2のいずれか1つによって示される核酸配列を含むことができる。いくつかの特定の実施形態において、これらgRNAは、本明細書では、それぞれgRNA1及びgRNA2と呼ばれる。
いくつかの特定の実施形態において、本発明によって提供されるトランスジェニック鳥動物を、配列番号1に示す核酸配列を含むgRNA1を用いて調製した。かかる特定の場所に本発明のレポーター遺伝子の組み込みを可能にするために、組み込まれるべきレポーター遺伝子は、ある実施形態において、使用されるgRNAによって指向される標的組み込み部位におけるその取り込みを促進する特定のアームを保有しなければならない。したがって、いくつかの特定の実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、第2の核酸配列内に含めることができ、このレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している。
さらにいくつかの代替実施形態において、本発明によって提供されるトランスジェニック鳥動物は、配列番号2に示す核酸配列を含むgRNA2を用いて調製することができる。そのような場合、該gRNA2によって認識される特異的部位での本発明のレポーター遺伝子の組み込みを可能にするために、第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、特定の実施形態によれば、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、本発明のトランスジェニック鳥動物は、性染色体Zの少なくとも1つの部位に組み込まれた少なくとも1つのレポーター遺伝子を含むことができる。いくつかの特定の非限定的な実施形態において、かかる鳥トランスジェニック動物は、染色体Zに組み込まれたトランスジェニックレポーター遺伝子を保有する雌であり得る。より具体的な実施形態において、染色体Z中の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Zの、配列番号15に示す領域9156874〜9161874、配列番号16に示す領域27764943〜27769943、配列番号17に示す領域42172748〜42177748、配列番号18に示す領域63363656〜63368656、及び配列番号19に示す領域78777477〜78782477のいずれか1つであり得る。
より具体的な実施形態において、染色体Z内のかかる特定の場所にレポーター遺伝子を標的化するのに必要な少なくとも1つのgRNAは、配列番号11に示すgRNA3:ACAGACCTATGATATGT;配列番号12に示すgRNA4:CGATTATCACTCACAAG;配列番号13に示すgRNA5:CTGGTTAGCATGGGGAC;配列番号14に示すgRNA6:GTAAAGAGTCAGATACAのいずれか1つに示す核酸配列を含むことができる。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号41に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号42に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号11のgRNA3が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号43に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号44に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号12のgRNA4が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号45に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号46に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号13のgRNA5が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号47に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号48に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号14のgRNA6が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
染色体Z内の特定の遺伝子座への組み込みに適するgRNA配列のさらなる非限定的な例として、配列番号26にも示す核酸配列GTAATACAGAGCTAAACCAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_42174515_−1のgRNA7、配列番号27にも示す核酸配列ACAGACCTATGATATGTGAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_9157091_1のgRNA8、配列番号28にも示す核酸配列GAGCTTGTGAGTGATAATCGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_27767602_−1のgRNA9、配列番号29にも示す核酸配列GTAAAGAGTCAGATACACAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_78779927_1のgRNA10、及び配列番号30にも示す核酸配列CAGTGGGTACTGAAGCTGTGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_63364946_−1のgRNA11を挙げることができるが、これらに限定されない。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号31に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号32に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号26のgRNA7が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号33に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号34に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号27のgRNA8が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号35に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号36に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号28のgRNA9が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号37に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号38に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号29のgRNA10が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号39に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号40に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号30のgRNA11が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
さらに別の態様において、本発明は、性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所に組み込まれる少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞に関する。
いくつかの具体的な実施形態において、本発明によって提供される細胞は鳥細胞であり得る。
いくつかの特定の実施形態において、本発明によって提供される鳥細胞は、始原生殖細胞(PGC)であり得る。
用語「生殖細胞」は、別の生殖細胞と結合する際に、配偶子へと発達する胚細胞を指す。本明細書で使用する「始原生殖細胞(PGC)」は、配偶子の前駆体として働き、多能性胚性幹細胞を生じる生殖細胞系列幹細胞に関する。胚形成の間に、PGCになるようにシグナル伝達される原腸形成胚内の細胞は、生殖隆起に移動し、生殖腺になり、成熟した配偶子に分化する。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明によって提供される細胞は、細胞の性染色体に組み込まれた少なくとも1つのレポーター遺伝子を含むことができる。より具体的な実施形態において、かかるレポーター遺伝子の特定の組み込みは、(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列;並びに(b)少なくとも1つの該レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列を細胞に共トランスフェクトすることによって可能になり得る。
特定の実施形態において、本発明の細胞に共トランスフェクトされる第2の核酸配列中の少なくとも1つのレポーター遺伝子は、組み込み部位でのHDRのためにその5’及び3’で相同アームが隣接し得る。
いくつかの特定の実施形態において、本発明によって提供される細胞中の染色体Wにレポーター遺伝子の組み込みを標的化するために、特定のgRNAが使用されるべきである。さらなる特定の実施形態において、gRNAは、配列番号1に示す、本明細書でgRNA1と呼ばれる核酸配列を含むことができる。このような場合、第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、本発明によって提供される細胞は、本明細書でgRNA2と呼ばれるgRNAを用いて調製することができる。特定の実施形態において、gRNA2は、配列番号2に示す核酸配列を含むことができる。かかる特定の実施形態において、第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、本発明によって提供される細胞は、細胞の染色体Zに、本発明の少なくとも1つのレポーター遺伝子を組み込むことによって調製することができる。特定の実施形態において、本発明の細胞を調製するために、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、性染色体Zの少なくとも1つの部位に組み込むことができる。より具体的な実施形態において、染色体Zにおける特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Zの、配列番号15に示す領域9156874〜9161874、配列番号16に示す領域27764943〜27769943、配列番号17に示す領域42172748〜42177748、配列番号18に示す領域63363656〜63368656、及び配列番号19に示す領域78777477〜78782477のいずれか1つであり得る。
より具体的な実施形態において、本発明の細胞の染色体Z内のかかる特定の場所にレポーター遺伝子を標的化するのに必要な少なくとも1つのgRNAは、配列番号11に示すgRNA3:ACAGACCTATGATATGT;配列番号12に示すgRNA4:CGATTATCACTCACAAG;配列番号13に示すgRNA5:CTGGTTAGCATGGGGAC;配列番号14に示すgRNA6:GTAAAGAGTCAGATACAのいずれか1つによって示される核酸配列を含むことができる。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号41に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号42に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号11のgRNA3が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号43に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号44に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号12のgRNA4が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号45に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号46に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号13のgRNA5が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号47に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号48に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号14のgRNA6が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。染色体Z内の特定の遺伝子座への組み込みに適するgRNA配列のさらなる非限定的な例として、配列番号26にも示す核酸配列GTAATACAGAGCTAAACCAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_42174515_−1のgRNA7、配列番号27にも示す核酸配列ACAGACCTATGATATGTGAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_9157091_1のgRNA8、配列番号28にも示す核酸配列GAGCTTGTGAGTGATAATCGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_27767602_−1のgRNA9、配列番号29にも示す核酸配列GTAAAGAGTCAGATACACAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_78779927_1のgRNA10、及び配列番号30にも示す核酸配列CAGTGGGTACTGAAGCTGTGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_63364946_−1のgRNA11を挙げることができるが、これらに限定されない。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の細胞の染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号31に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号32に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号26のgRNA7が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号33に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号34に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号27のgRNA8が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号35に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号36に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号28のgRNA9が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号37に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号38に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号29のgRNA10が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号39に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号40に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号30のgRNA11が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
さらなる態様において、本発明は、
(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つの該レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列、
を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明のキット内に含まれる第2の核酸配列における少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、組み込み部位でのHDRのために相同アームが隣接し得る。
さらにいくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明のキットの第2の核酸配列中の少なくとも1つのレポーター遺伝子は、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか1つに作動可能に連結することができる。
特定の実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、性染色体、具体的には、染色体Wの少なくとも1つの非コード領域に組み込むことができる。このような場合に、本発明のキットの第1の核酸配列は、本明細書ではそれぞれgRNA1及びgRNA2とも呼ばれる配列番号1並びに2のいずれか1つに示す核酸配列を含む少なくとも1つのgRNAをコードすることができる。
いくつかの特定の実施形態において、本発明のキットの第1の核酸配列は、gRNA1であるgRNAを含むことができる。いくつかの実施形態において、かかるgRNA1は、配列番号1に示す核酸配列を含むことができる。このような場合において、本発明のキットの該第2の核酸配列内に含まれるレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、本発明のキットは、その第1の核酸配列中にgRNA2をコードする配列を含むことができる。いくつかの特定の実施形態において、かかる配列は、配列番号2に示す核酸配列をコードする。さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明のキットの第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。
さらにいくつかのさらなる代替実施形態において、少なくとも1つのレポーター遺伝子は、性染色体Zの少なくとも1つの部位に組み込むことができる。より具体的な実施形態において、染色体Z中の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Zの、配列番号15に示す領域9156874〜9161874、配列番号16に示す領域27764943〜27769943、配列番号17に示す領域42172748〜42177748、配列番号18に示す領域63363656〜63368656、及び配列番号19に示す領域78777477〜78782477のいずれか1つであり得る。
したがって、より具体的な実施形態において、本発明のキットの第1の核酸配列は、配列番号11に示すgRNA3:ACAGACCTATGATATGT;配列番号12に示すgRNA4:CGATTATCACTCACAAG;配列番号13に示すgRNA5:CTGGTTAGCATGGGGAC;配列番号14に示すgRNA6:GTAAAGAGTCAGATACAの少なくとも1つであるgRNAを含むことができる。
さらなる実施形態において、本発明のキットの第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、配列番号41〜48のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。より具体的には、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号41に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号42に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号11のgRNA3が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号43に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号44に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号12のgRNA4が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号45に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号46に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号13のgRNA5が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。いくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号47に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号48に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号14のgRNA6が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
本発明のキットの第1の核酸配列の非限定的なさらなる例としては、配列番号26にも示す核酸配列GTAATACAGAGCTAAACCAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_42174515_−1のgRNA7、配列番号27にも示す核酸配列ACAGACCTATGATATGTGAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_9157091_1のgRNA8、配列番号28にも示す核酸配列GAGCTTGTGAGTGATAATCGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_27767602_−1のgRNA9、配列番号29にも示す核酸配列GTAAAGAGTCAGATACACAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_78779927_1のgRNA10、及び配列番号30にも示す核酸配列CAGTGGGTACTGAAGCTGTGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_63364946_−1のgRNA11のうちの少なくとも1つであるgRNAを挙げることができる。
さらなる実施形態において、本発明のキットの第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、配列番号31〜40のいずれか1つに示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接し得る。より具体的には、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号31に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号32に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号26のgRNA7が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号33に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号34に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号27のgRNA8が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号35に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号36に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号28のgRNA9が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号37に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号38に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号29のgRNA10が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号39に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号40に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号30のgRNA11が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
いくつかの実施形態において、本発明のキットの第2の核酸配列内に含まれるレポーター遺伝子は、少なくとも1つの生物発光レポーター遺伝子であり得る。
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明のキットは、性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所に組み込まれる少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含むトランスジェニック鳥動物の作製に使用するのに適切であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載の本発明のキットのいずれかを使用することができる。
さらに、本発明のキットはさらに、本発明のトランスジェニック鳥動物の作製に必要な試薬、緩衝液、媒体又は材料を含むことができることが理解されなければならない。本発明のキットはさらに、取扱説明書及びその異なる成分用の容器を含むことができる。
ある実施形態において、本発明のキット(複数可)及び方法(複数可)で使用されるオリゴヌクレオチド(複数可)又はポリヌクレオチド(複数可)は、単離及び/又は精製された分子であることを理解されたい。本明細書で使用する場合、核酸に関連して使用される場合「単離された」又は「精製された」は、天然に存在する配列がその正常な細胞(例えば、染色体)環境から取り出されたか、又は非天然環境(例えば、人工合成)で合成されることを意味する。したがって、「単離された」又は「精製された」配列は、無細胞溶液中にあるか、又は異なる細胞環境に置くことができる。用語「精製された」は、配列が存在する唯一のヌクレオチドであるが、それと自然界で関連する非ヌクレオチド物質を本質的に含まず(約90%〜95%純粋)、したがって、単離された染色体とは区別されることを意味するものではない。
本明細書で使用される全ての科学用語及び技術用語は、特に断りのない限り、当技術分野で一般に使用される意味を有する。本明細書に提供される定義は、本明細書でしばしば使用される特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。
本発明の特定の態様及び実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、特定の方法、及び記載される実験条件に限定されず、かかる方法及び条件は変化することができることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈が特に明確に指示しない限り、単数形「1つ(a)」、「1つ(an)」、及び「その」は、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載の、かつ/又は本開示などを読む際に当業者に明らかになるであろう1以上の方法、及び/又は種類の工程を含む。
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料をこれから記載する。
特に文脈が必要としない限り、以下の本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、単語「含む(comprise)」、並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変形は、規定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程のグループを包含するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程のグループを除外しないことを意味すると理解される。より具体的には、用語「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する」及びそれらの活用形は、「含むが、これに限定されない」を意味する。この用語は、用語「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。語句「から本質的になる」は、組成物又は方法が、追加の成分及び/又は工程を含むことができるが、ただし、追加の成分及び/又は工程は、特許請求の組成物又は方法の基本的かつ新規な特徴を著しく変えないことを意味する。
本明細書で使用される用語「約」は、言及される値よりも最大1%、より具体的には5%、より具体的には10%、より具体的には15%、場合によっては最大20%高く又は低く逸脱することができる値を示し、偏差範囲は、整数値及び、該当する場合、同様に非整数値を含み、連続した範囲を構成する。本明細書で使用する用語「約」は、±10%を指す。
本発明の様々な実施形態が範囲形式で提示され得ることに留意されたい。範囲形式での記載は便宜と簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲における柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能なサブ範囲並びにその範囲内の個々の数値を有すると考慮されるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの具体的に開示されるサブ範囲、並びにその範囲内の個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、及び6を有すると考慮されるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用する。数値範囲が本明細書に示されているときはいつでも、示された範囲内の任意の引用される数字(分数又は整数)を含むことを意味する。第1の示される数と第2の示される数の「間の範囲(ranging)/範囲(range)」及び第1の示される数「から」第2の示される数「の範囲(ranging)/範囲(range)」という語句は、本明細書で互換的に使用され、第1及び第2の示される数、並びにその間の全ての小数及び整数を含むことが意図される。
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を作製し、使用する方法の完全な開示並びに説明を当業者に提供するために記載されており、本発明者らが彼らの発明として考えるもの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数字(例えば、量、温度など)に関して正確さを確保するように努力は行われているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又は大気圧に近い。
実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らによって使用される技術の代表例である。これらの技術は、本発明の実施のための好ましい実施形態の例示であるが、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び意図される範囲から逸脱することなく、多くの変更を行うことができることを認識することを理解されたい。
明確にするために、別々の実施形態の文脈に記載されている本発明の特定の特徴はまた、単一実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一実施形態の文脈で記載する本発明の様々な特徴はまた、別々に、又は任意の適切なサブコンビネーションで、又は本発明の任意の他の記載される実施形態において好適なものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で記載するいくつかの特徴は、実施形態がそれらの要素なしに機能できない限り、これらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
上述し、以下の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例における実験的裏付けとなる。
開示及び記載されるように、本発明は、本明細書に開示される特定の実施例、方法、工程、及び組成物に限定されるものではなく、かかる方法、工程及び組成物は多少変更することができることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のために使用され、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「1つ(a)」、「1つ(an)」及び「その」は、内容が特に明確に指示しない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。
実施例
さらに詳述することなく、当業者は、前述の説明を用いて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。以下の好ましい特定の実施形態は、したがって、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる意味でも特許請求される発明を限定するものではない。
当技術分野で公知の、本明細書に具体的に記載されていない標準的な分子生物学プロトコルは、一般に、Sambrookら、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular cloning:A laboratory Manual),Cold Springs Harbor Laboratory,New−York(1989,1992),及びAusubelら,分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology),John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1988)に基本的に従う。
試薬
動物:
商業用白色レグホン鶏を、ヘンドリックスISA、及びMinnesotaから入手する。
マーカーライン鶏は、Pacific Agri−Food Research Centre,Agassiz,カナダのブリティッシュコロンビア州からのものである。
トランスジェニックマウスCAG−luc−eGFPは、ジャクソン研究所(カタログ番号L2G85)からのものである。
トランスジェニックマウスC57BL/6−Tg(CAG−EGFP)1Osb/Jは、ジャクソン研究所(カタログ番号00329)からのものである。
動物実験は、IACUC承認プロトコルに厳密に従い、実験の過程で病気に苦しむ動物も、死ぬ動物もいないことを確実にしながら、クリスタルバイオサイエンス(Crystal Bioscience)IACUC委員会の監督下で行った。
ベクター:
Cas9 SmartNuclease(商標)オールインワンタグ付きベクターは、System Bioscience社、カタログ番号CAS8/9xxシリーズから注文する。
pCMV−Gluc 2ベクターは、New England Biolabs社、カタログ番号N8081Sから注文する。
細胞株:
雌の細胞は、Gallus gallus鶏のTリンパ球細胞である。
雄の細胞は、ATCC(登録商標)番号CRL−2118(商標)から注文したGallus gallus鶏の肝臓のものである。
始原生殖細胞(PGC)株。
実験手順
卵の殻を通したレポーター遺伝子の生物発光検出
D−ルシフェリン(Sigma−Aldrich Co.LLC、イスラエル、カタログ番号2591−17−5)を、室温で、15mg/mLの最終濃度までDPBSに溶解する。0.1mlの量のルシフェリン又は生理食塩水(陰性対照)を、トランスジェニックルシフェラーゼ発現マウスの首及び肩の領域の周囲の弛緩性皮膚に皮下注射する。耳及び尾部を、10分後に摘出し、鶏胚(10日齢)に導入する。
或いは、トランスジェニックルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウスから摘出した耳及び尾部を、0.1mlのルシフェリン又は生理食塩水を卵に直接注入する前に鶏胚に組み込む。
生物発光を、バイオ空間光子イメージャー(Bio space lab、USA)を用いて観察する。
制限のない(RF)クローニング
Cas9−SmartNuclease(商標)ベクターへのgRNAの挿入は、制限フリー方法(Peleg Yら,2010)を適用することによって行う。プライマーは、Sigma−Genosys(Rehovot,Israel)から注文し、続いて、RF反応をPhusionポリメラーゼ(Thermo Scientific,Hudson,NH,USA)を用いて行った。プラスミド精製を、MEGAspinキット及びDNA−spinプラスミドDNA精製キット(それぞれIntron Biotechnology Biotechnology,Daejoen,South Korea)を用いて行う。
細胞培養
PGCを、その40%をバッファローラット肝臓細胞(BRL、ATCC)に予め馴化させ、7.5%ウシ胎児血清(Hyclone)、2.5%照射鶏血清、1×非必須アミノ酸、2mMのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMのβ−メルカプトエタノール(全てLife Technologiesから)、4ng/mlの組換えヒト線維芽細胞増殖因子、6ng/mlの組換えマウス幹細胞因子(両方ともR&D Systemsから)を補完したKO−DMEM(Life Technologies)中で増殖させ、BRL細胞の照射したフィーダー層上で成長させる。細胞を新鮮なフィーダー層上に、週3回継代する。
トランスフェクション
染色体W又はZの上記遺伝子座を標的化する安定したトランスフェクタントのために、15μgのベクター含有gRNA及び15μgの環状ルシフェラーゼ含有ベクターを、5×10個の細胞に加え、V−緩衝液(lonza,Walkersville)で100μlの体積にした。細胞懸濁液を2mmのキュベットに移し、350ボルト/100μ秒の8つの方形波パルス(BTX 830電気穿孔器)に供する。次いで、細胞をネオマイシン耐性照射BRLと共にプレーティングし、ウェル当たり10個の細胞密度で48ウェルプレートに播種する。3日後、40μg/mlのネオマイシンを添加し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の安定な組み込みを有する細胞を選択する。
トランスジェニック鶏の作製
濃縮ビヒクル(約10 MOIの力価のレンチウイルス又はプラスミドDNAのいずれかであり得る)を、25個の産みたて卵の胚に注入する。注入は週3回行う。注入した胚は、注入後3週間で孵化する。これらは、G0鳥である。孵化直後に、DNAを、孵化した雛のCAM試料から抽出し、ベクターDNAの存在/不在の検出を半定量PCRによって行う。血液を、2〜3週齢のG0鳥から採取し、PCRスクリーニングを繰り返す。G0鳥は、雄については16〜20週、雌については20〜24週の性成熟まで育てる。雄の雛鳥を、約16週から精液の生成について試験する。雌鳥を受精させ、受精卵を毎日収集する。G1雛は3週間後に孵化し、各個々の雛の翼を縛って、雛の漿尿膜(CAM)試料を殻から採取する。CAM試料からDNAを抽出し、導入遺伝子の存在についてPCRスクリーニングを行い、単一コピーレベルであると予測する。2〜3週間後に確認のためのスクリーニングを繰り返し、血液試料からのDNA上で雛の性別を判定する。数週齢の時点で、血液試料をG1鳥から採取し、PCR分析のためにゲノムDNAを調製する。G1鳥をG2の繁殖のために使用する。
実施例1
家禽における視覚的な性別特定のためのレポーター遺伝子の選択
卵内の家禽の性別を視覚的に特定する実現可能性を実証するために、蛍光レポーター遺伝子と比較する生物発光の使用を評価した。したがって、ホタルルシフェラーゼなどの(配列番号20に示す核酸配列を有し、配列番号21に示すアミノ酸配列をコードする)レポーター遺伝子及び緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するトランスジェニックマウスを、最初に使用した。
ルシフェラーゼ活性を観察するため、図1で、ルシフェリンをルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスに皮下注射し、次いで、尾部及び耳を切除し、未受精卵の卵殻に5mmの穴を通して導入した。図に示すように、ルシフェラーゼの検出可能なシグナルが、明らかに、卵殻を通して尾部及び耳の試料(図1A、1B)で観察される。したがって、本発明者らは、次に、卵内でルシフェラーゼ反応を誘導する実現可能性を調べた。したがって、ルシフェラーゼ発現トランスジェニックマウスの耳及び尾部を切除し、10日齢の鶏の胚を保有する受精卵に穴から導入し、その後、ルシフェリンを注入した。図2A及び図2Bにはっきり示されているとおり、卵内ルシフェラーゼ反応は、卵殻を貫通することができる検出可能なシグナルをもたらすのに成功した。
一方、レポーター遺伝子としてGFPを用いて実行した同様の実験は、図3に見られるように、GFP発現トランスジェニックマウスの尾部及び耳の鶏胚への組み込み後に、GFPシグナルは検出可能ではないことをはっきりと示した。
したがって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子、具体的には、ホタルルシフェラーゼ(配列番号20に示す核酸配列がコードする配列番号21に示すアミノ酸配列を含む)を、性染色体W及びZに組み込むためにさらに選択した。
図4は、卵内の胚の性別を特定するための本発明の方法の概略図を表す。より具体的には、その中に組み込まれたルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する性特異的染色体(W)を含有するトランスジェニック鳥の雌鶏を提供する。該雌鶏が産んだ卵において、検出可能なシグナルによって観察されるレポーター遺伝子の発現は、胚が性染色体Wを保有し、したがって、雌であることを示す。これにより、レポーター遺伝子を保有する雌は廃棄されるが、雄の継続的なインキュベーションについての選択が可能になる。この選択は、おそらく、家禽にとってより適切である。
図5は、卵内の雄胚の決定を容易にするさらなる代替法を概略的に示す。より具体的には、その中に組み込まれたレポーター遺伝子を有する性別特異的染色体Zを保有するトランスジェニック雌鶏の提供により、レポーター遺伝子を含まない(母系野生型染色体Wを受け取った)雌胚又はトランスジェニックルシフェラーゼ遺伝子を発現する(母系標識染色体Zを受け取った)雄胚が得られる。
実施例2
ガイドRNAベクターの設計
性染色体W又はZにルシフェラーゼレポーター遺伝子を組み込むために、CRISPR/Cas9媒介HDR法を選択する。次いで、関連gRNA部位を、両方の性染色体からさがす。
配列番号3に示す核酸配列を含む雌鶏の染色体Wの領域1022859〜1024215を、ガイドRNA設計のために分析する。2つのガイドRNA:配列番号1に示すgRNA1:GCACTAGGAACCAGCAGCAG及び配列番号2に示すgRNA2:GTAGCCCCAAGAGGGCTAGGを選択し、合成し、制限のないクローニングプロトコルによって、野生型Cas9ヌクレアーゼ(Horizon)を含有するCas9 SmartNucleaseベクターに別々にクローニングする。
これらの2つのgRNAの予測パラメーターを表1に提示する。

Figure 2019505175
雌鶏の染色体Zの、配列番号15に示す領域9156874〜9161874、配列番号16に示す領域27764943〜27769943、配列番号17に示す領域42172748〜42177748、配列番号18に示す領域63363656〜63368656、及び配列番号19に示す領域78777477〜78782477を、ガイドRNA設計のために分析する。4つのガイドRNA:配列番号11に示すgRNA3:ACAGACCTATGATATGT;配列番号12に示すgRNA4:CGATTATCACTCACAAG;配列番号13に示すgRNA5:CTGGTTAGCATGGGGAC;配列番号14に示すgRNA6:GTAAAGAGTCAGATACAを選択し、合成し、制限のないクローニングプロトコルによって、野生型Cas9ヌクレアーゼ(Horizon)を含有するCas9 SmartNucleaseベクターに別々にクローニングする。
染色体Z内の特定の遺伝子座への組み込みに適するgRNA配列のさらなる非限定的な例として、配列番号26にも示す核酸配列GTAATACAGAGCTAAACCAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_42174515_−1のgRNA7、配列番号27にも示す核酸配列ACAGACCTATGATATGTGAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_9157091_1のgRNA8、配列番号28にも示す核酸配列GAGCTTGTGAGTGATAATCGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_27767602_−1のgRNA9、配列番号29にも示す核酸配列GTAAAGAGTCAGATACACAGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_78779927_1のgRNA10、及び配列番号30にも示す核酸配列CAGTGGGTACTGAAGCTGTGを含む染色体Z遺伝子座chrZ_63364946_−1のgRNA11を挙げることができるが、これらに限定されない。これらのgRNAは、予測されるオフターゲット部位がほとんどなく、そのどれも既知のコード配列中にない。
実施例3
ルシフェラーゼ標的化ベクターの設計
雌の染色体W又は雌の染色体Zの遺伝子座の上記で示した適切な隣接配列と相同性のある隣接配列を、CMVプロモーターの上流及びネオマイシン耐性の下流或いはポリA部位(注文した合成DNA、Integrated DNA Technologies,Inc.,USA)の下流の位置でルシフェラーゼ発現ベクターに導入する。
雌の染色体Wについては、レポーター遺伝子、具体的には、ルシフェラーゼを、配列番号1に示すガイド1(gRNA1)又は配列番号2に示すガイド2(gRNA2)のいずれかを使用するためにクローニングすることができる。gRNA1を用いてクローニングするために、配列番号4に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号5に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。gRNA2を用いてクローニングするために、配列番号6に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号7に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。
さらに、CMVプロモーターの上流領域の「左アーム」は、配列番号8に示す核酸配列を含み、ネオマイシン耐性の下流領域の場合の「右アーム」は、配列番号9に示す核酸配列を含み、ポリA部位の下流領域の場合は配列番号10に示す核酸配列を含むことができる。雌の染色体Zについては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、配列番号11に示すgRNA3、配列番号12に示すgRNA4、配列番号13に示すgRNA5、配列番号14に示すgRNA6のいずれかを使用するためにクローニングすることができる。
gRNA3を用いてクローニングするために、配列番号41に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号42に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。gRNA4を用いてクローニングするために、配列番号43に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号44に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。gRNA5を用いてクローニングするために、配列番号45に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号46に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。gRNA6を用いてクローニングするために、配列番号47に示す核酸配列を含む「左アーム」及び配列番号48に示す核酸配列を含む「右アーム」を提供する。さらにいくつかのさらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に、本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号31に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号32に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号26のgRNA7が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号33に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号34に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号27のgRNA8が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号35に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号36に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号28のgRNA9が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号37に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号38に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号29のgRNA10が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。さらなる実施形態において、染色体Z内の特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むために、配列番号39に示す核酸配列を含む左アーム及び配列番号40に示す核酸配列を含む右アームを用いて、配列番号30のgRNA11が指向する特定の遺伝子座に本発明のレポーター遺伝子を組み込むことができる。
実施例4
CRISPR処理細胞の生殖系列伝達
2つの上記のベクター、具体的には、gRNA/Cas9及びレポーター遺伝子ベクターを、実験手順に詳述するPGCに共トランスフェクトする。安定なクローンを特定した後、細胞を増殖させ、PCRによるルシフェラーゼ組み込みについて確認する。確認したクローンを、段階14〜16のレシピエント鶏胚(H&H)に注入する。注入した胚を代理の殻に移し、37℃で孵化するまでインキュベートする。雛の性別を、染色体WについてPCRによる孵化後に決定する。
雌及び雄のキメラを、性的に成熟するまで成長させ、野生型のオス及びメスの鶏と交配する。孵化した雛をルシフェラーゼの発現について評価し、標的ルシフェラーゼを保有するかについて生殖細胞系列の子孫をPCRによって確認する。

Claims (50)

  1. 鳥の受精した未孵化卵の性別決定の方法であって、
    (a)性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの位置又は場所に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも1羽のトランスジェニック鳥動物を提供/取得する工程、
    (b)前記トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物からの又はその任意の細胞の少なくとも1個の受精卵を取得する工程、
    (c)少なくとも1つの検出可能なシグナルが検出されるかどうかを前記卵内で決定する工程であって、前記少なくとも1つの検出可能なシグナルの検出が、前記鳥胚内で前記少なくとも1つのレポーター遺伝子の発現、それによって、前記染色体W又は染色体Zの存在を示す工程、
    を含む方法。
  2. 前記少なくとも1羽のトランスジェニック鳥対象が、少なくとも2つの異なるレポーター遺伝子を含み、各レポーター遺伝子が、性染色体Z又はWの一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれている、請求項1に記載の方法。
  3. 前記レポーター遺伝子が、少なくとも1つの生物発光レポーター遺伝子である、請求項1及び請求項2のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項3に記載の方法。
  5. 前記方法がさらに、工程(c)で検出される前記検出可能なシグナルの形成のために、工程(b)の前記卵に、前記生物発光レポーター遺伝子と互換性のある基質及び酵素のうちの少なくとも一方を提供する工程を含む、請求項1、3及び4に記載の方法。
  6. 前記少なくとも1つのトランスジェニック鳥対象、具体的には、動物が雌の鳥動物であり、前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌の染色体Zの少なくとも1つの位置に組み込まれ、それによって、検出可能なシグナルの検出が、前記未孵化卵内の前記胚が雄であることを示す、請求項1に記載の方法。
  7. 前記少なくとも1つのトランスジェニック鳥対象、具体的には、動物が雌の鳥動物であり、前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌の染色体Wの少なくとも1つの位置に組み込まれ、それによって、検出可能なシグナルの検出が、前記未孵化卵内の前記胚が雌であることを示す、請求項1に記載の方法。
  8. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、少なくとも1つのプログラム可能に遺伝子操作されたヌクレアーゼ(PEN)を用いて、前記トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物の前記性染色体に組み込まれる、請求項1に記載の方法。
  9. 前記PENが、クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し(clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR))タイプIIシステムである、請求項8に記載の方法。
  10. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、少なくとも1つのCRISPR/CRISPR関連エンドヌクレアーゼ9(Cas9)システムによって媒介される相同性指向性修復(HDR)により前記トランスジェニック鳥動物の前記性染色体に組み込まれる、請求項9に記載の方法。
  11. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列を、前記鳥動物の少なくとも1つの細胞又は前記鳥動物に導入される少なくとも1つの細胞に共トランスフェクトすることによって、前記トランスジェニック鳥動物の性染色体に組み込まれる、請求項10に記載の方法。
  12. 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子に、その5’及び3’で、前記組み込み部位でのHDRのために相同アームが隣接している、請求項11に記載の方法。
  13. 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか1つに作動可能に連結される、請求項11及び12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも1つの非コード領域に組み込まれている、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性染色体Wの遺伝子座1022859〜1024215の少なくとも1つの部位に組み込まれている、請求項14に記載の方法。
  16. 前記少なくとも1つのgRNAが、配列番号1及び2のいずれか一項に示す核酸配列を含む、請求項11及び15に記載の方法。
  17. 前記gRNAが配列番号1に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項16に記載の方法。
  18. 前記gRNAが配列番号2に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項16に記載の方法。
  19. 性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む鳥トランスジェニック動物。
  20. 前記少なくとも1つのトランスジェニック動物が、少なくとも2つの異なるレポーター遺伝子を含み、各レポーター遺伝子が、性染色体Z又はWの一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれている、請求項19に記載のトランスジェニック動物。
  21. 前記レポーター遺伝子が、少なくとも1つの生物発光レポーター遺伝子である、請求項19及び請求項20のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
  22. 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項21に記載のトランスジェニック動物。
  23. 前記少なくとも1羽のトランスジェニック鳥動物が雌であり、前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌染色体Zの少なくとも1つの位置に組み込まれている、請求項19に記載のトランスジェニック動物。
  24. 前記少なくとも1羽のトランスジェニック鳥動物が雌であり、前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が雌染色体Wの少なくとも1つの位置に組み込まれている、請求項19に記載のトランスジェニック動物。
  25. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、少なくとも1つのPENを使用して前記トランスジェニック動物の前記性染色体に組み込まれている、請求項19に記載のトランスジェニック動物。
  26. 前記PENが、CRISPRタイプIIシステムである、請求項25に記載のトランスジェニック動物。
  27. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、少なくとも1つのCRISPR/Cas9システムによって媒介されるHDRによる前記トランスジェニック鳥動物の前記性染色体に組み込まれている、請求項26に記載のトランスジェニック動物。
  28. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのgRNAをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列を、前記鳥動物の少なくとも1つの細胞又は前記鳥動物に導入される少なくとも1つの細胞に共トランスフェクトすることによって、前記トランスジェニック鳥対象、具体的には、動物の性染色体に組み込まれる、請求項27に記載のトランスジェニック動物。
  29. 前記第2の核酸配列中の少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、前記組み込み部位でのHDRのために相同アームが隣接している、請求項28に記載のトランスジェニック動物。
  30. 前記第2の核酸配列中の少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか1つに作動可能に連結される、請求項28及び29のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
  31. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも1つの非コード領域に組み込まれている、請求項28〜30のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
  32. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性染色体Wの遺伝子座1022859〜1024215の少なくとも1つの部位に組み込まれている、請求項31に記載のトランスジェニック動物。
  33. 前記少なくとも1つのgRNAが、配列番号1及び2のいずれか一項に示す核酸配列を含む、請求項28及び32に記載のトランスジェニック動物。
  34. 前記gRNAが、配列番号1に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項33に記載のトランスジェニック動物。
  35. 前記gRNAが、配列番号2に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項33に記載のトランスジェニック動物。
  36. 性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞。
  37. 前記細胞が鳥細胞である、請求項36に記載の細胞。
  38. 前記鳥細胞が、始原生殖細胞(PGC)である、請求項37に記載の細胞。
  39. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、(a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列、並びに(b)少なくとも1つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列を前記細胞に共トランスフェクトすることによって、前記細胞の性染色体に組み込まれる、請求項36〜38のいずれか一項に記載の細胞。
  40. 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、前記組み込み部位でのHDRのために相同アームが隣接している、請求項39に記載の細胞。
  41. 前記gRNAが配列番号1に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項39及び40のいずれか一項に記載の細胞。
  42. 前記gRNAが配列番号2に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項39及び40のいずれか一項に記載の細胞。
  43. (a)少なくとも1つのCas9タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列及び少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの第1の核酸配列;並びに
    (b)少なくとも1つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも1つの第2の核酸配列、
    を含むキット。
  44. 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、前記組み込み部位でのHDRのために相同アームが隣接している、請求項43に記載のキット。
  45. 前記第2の核酸配列中の前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、性別特異的プロモーター、胚特異的プロモーター及び誘導性プロモーターのいずれか1つに作動可能に連結される、請求項43及び44のいずれか一項に記載のキット。
  46. 前記少なくとも1つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも1つの非コード領域に組み込まれ、前記少なくとも1つのgRNAが、配列番号1及び2のいずれか1つに示す核酸配列を含む、請求項43〜45のいずれか一項に記載のキット。
  47. 前記gRNAが配列番号1に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号4及び5に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項46に記載のキット。
  48. 前記gRNAが配列番号2に示す核酸配列を含み、前記第2の核酸配列内に含まれる前記少なくとも1つのレポーター遺伝子は、その5’及び3’で、それぞれ配列番号6及び7に示すアミノ酸配列を含む相同アームが隣接している、請求項46に記載のキット。
  49. 前記レポーター遺伝子が、少なくとも1つの生物発光レポーター遺伝子である、請求項43〜48のいずれか一項に記載のキット。
  50. 性染色体Z及びWの少なくとも一方の少なくとも1つの遺伝子座に組み込まれた少なくとも1つの外因性レポーター遺伝子を含む1羽のトランスジェニック鳥動物の作製に使用するための、請求項43〜49のいずれか一項に記載のキット。
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