CN102807993A

CN102807993A - 一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞

Info

Publication number: CN102807993A
Application number: CN2012103195873A
Authority: CN
Inventors: 郑艳玲; 张涌; 权富生; 王勇胜; 刘军
Original assignee: YANGLING KEYUAN CLONE CO Ltd; Northwest A&F University
Current assignee: YANGLING KEYUAN CLONE CO Ltd; Northwest A&F University
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2032-08-31
Also published as: CN102807993B

Abstract

本发明公开了一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞，首先构建含有靶向Myostatin基因的pre-miRNA和MYL1基因启动子的骨骼肌特异性miRNA表达载体pmiR-MNM2，然后通过电转染法将外源性表达载体pmiR-MNM2导入红安格斯新生牛成纤维细胞并经G418筛选获得阳性细胞，进行PCR鉴定，证实目的基因整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；将转染pmiR-MNM2的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫，为生产具有双肌性状的红安格斯克隆牛奠定了坚实的基础。

Description

一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞。

背景技术

Myostatin是骨骼肌生长发育的负调控因子，Myostatin基因（MSTNgene）的自然突变使肉牛、猪、绵羊等动物的骨骼肌呈现过度发育的双肌表型。Myostatin敲除的小鼠其肌肉量是野生型小鼠的2-3倍(McPherron,Lawler,.et al.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-βsuperfamilymember[J].Nature,1997,387:83-90.)，因此，可以通过Myostatin基因失活的方法来生产具有高产肉性状的转基因家畜。现有的失活方法包括以下几种：

1）Myostatin基因的缺失或变异

通过使Myostatin缺失或变异可以使动物体的肌肉大量生长。McPherron等(McPherron,Lawler,.et al.Regulation of skeletal muscle mass in mice by anew TGF-βsuperfamily member[J].Nature,1997,387:83-90.)报道肌抑素敲除鼠在青年期(2～5月龄)的肌肉量大约提高了30%，并且纯合子鼠的增重几乎全部为肌纤维的增生和肥大。McPherron等(McPherron AC,Lee SJ.1997.Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene.Proc Natl AcadSci U S A 94:12457-12461.)发现肌抑素缺失突变对鼠肌肉量影响较牛明显。张蕾（Zhang,L.,Yang,X.,An,X.,Chen,Y.,2007.Myostatin gene targeting incultured China Han ovine myoblast cells.Animal 1,1401-1408）等通过基因打靶的方法对绵羊骨骼肌细胞的Myostatin基因进行的敲除，发现阳性细胞的Myostatin蛋白表达量较阴性对照明显降低。Myostatin缺失变异可提高肌肉量并改善饲料利用效率，野生型的Myostatin前肽在体内是异变的，当注射它在BMP-1/TLD家族的金属蛋白酶的切割位点的突变体到正常小鼠或杂合子小鼠时其在增加肌肉量上有很强的作用(Bogdanovich V， Pogrebniak SG.2009.[Analysis of non-specific immunity status in children using basic statistic].Lik Sprava:92-97.Wolfman NM,McPherron AC,Pappano WN,Davies MV，Song K,Tomkinson KN,Wright JF,Zhao L,Sebald SM,Greenspan DS,Lee SJ.2003.Activation of latent myostatin by the BMP-1/tolloid family ofmetalloproteinases.Proc Natl Acad Sci U S A 100:15842-15846.)。

2）肌肉生长抑制素抗体

用肌肉生长抑制素特异性抗体来抑制肌肉生长抑制素活性。Whittemore等将肌肉生长抑制素的抑制剂JA16单克隆抗体给予5～8周龄的C57Bl/6正常成年鼠，结果发现成年鼠的体重比对照抗抗体处理组鼠的体重约提高了10%(Whittemore LA,Song K,Li X,et al.,Inhibition of myostatin in adult miceincreases skeletal muscle mass and strength[J].Biochem Biophys ResCommun,2003,300:965-971.)。Murphy等报道直接阻断Myostatin的抗体可以增加21月龄的小鼠骨骼肌的质量(Murphy KT,Koopman R,et al.Antibody-directed myostatin inhibition in 21-mo-old mice reveals novel roles formyostatin signaling in skeletal muscle structure and function.FASEB J,2010,24:4433-4442.，Murphy等得出Myostatin中和抗体不仅能够促进肌肉质量的增加而且能够提高肥胖的胰岛素抑制ob/ob小鼠葡萄糖的耐受力和脂肪量(Bernardo BL,Wachtmann TS,Cosgrove PG，Kuhn M,Opsahl AC,JudkinsKM,Freeman TB,Hadcock JR,LeBrasseur NK.2010.Postnatal PPARdeltaactivation and myo statin inhibition exert distinct yet complimentary effects on themetabolic profile of obese insulin-resistant mice.PLoS One 5:e11307.)。Kim等(Kim YS,Bobbili NK,Lee YK,Jin HJ,Dunn MA.2007.Production of apolyclonal anti-myostatin antibody and the effects of in ovo administration of theantibody on posthatch broiler growth and muscle mass.)制备了Myostatin的单克隆抗体和多克隆抗体并将其注射到肉鸡卵黄中，发现孵化后的肉鸡肌肉和体重显著增加。

3）卵泡抑制素及其相关蛋白FLRG和GASP

卵泡抑制素是一种分泌型的蛋白，它是Myostatin基因的拮抗剂，它能够在很多组织中表达。卵泡抑制素能够与许多TGF-β家族的成员相互结合,并抑制其功能。卵泡抑制素过表达能够促进肌肉质量大量增加，卵泡抑制素过表达动物骨骼肌比Myostatin基因敲除动物的骨骼肌更加强壮(Gilson H,Schakman O,Kalista S,Lause P，Tsuchida K,Thissen JP.2009.Follistatin inducesmuscle hypertrophy through satellite cell proliferation and inhibition of bothmyostatin and activin.Am J Physiol Endocrinol Metab 297:E157-164.)。卵泡抑素在体外能抑制Myostatin的活性，在体内通过调节Myostatin活性可以促进肌肉的生长(Lee SJ,McPherron AC.2001.Regulation of myostatin activity andmuscle growth.Proc Natl Acad Sci U S A 98:9306-9311.Zimmers,Davies,etal.2002.Induction of cachexia in mice by systemically administered myostatin.Science 296:1486-1488.Lee SJ,Lee YS,Zimmers TA et al.2010.Regulation ofmuscle mass by follistatin and activins.Mol Endocrinol 24(10):1998-2008.)。卵泡抑素能够通过抑制activinA与Myostatin的活性，改善恢复肌肉的强度(Kota J,Handy CR等.2009.Follistatin gene delivery enhances muscle growth andstrength in nonhuman primates.Sci Transl Med 1:6ra15.)。

4）肌肉生长抑制素前肽

Myostatin前肽是一种内源性的Myostatin特异性抑制子，可用于抑制Myostatin基因的活性。在体外的研究结果表明肌肉生长抑制素前肽能抑制肌肉生长抑制素C-末端二聚体同Act RⅡB的结合，Lee等将肌抑素前肽区域克隆入含有肌球蛋白轻链启动子和1/3增强子MDAF2载体中以过量表达肌抑素前肽,进行在体内的研究时发现转基因鼠的肌肉重量相比对照处理组提高了20%～110%。静脉注射表达Myostatin突变前肽的重组AAV8载体8周后可以增加小鼠的胫骨前肌、伸肌和趾长肌的肌肉量，17周后可以增加胫骨前肌、腓肠肌和股直肌的肌肉量(Matsakas A,Patel K.2009.Intracellularsignalling pathways regulating the adaptation of skeletal muscle to exercise andnutritional changes.Histol Histopathol 24:209-222.)。有研究者在小鼠肌肉内注射裸露的编码突变的Myostatin前肽的质粒DNA会显著的增加小鼠的骨骼肌的肌肉量。因此，BMP-1/TLD蛋白酶抑制Myostatin前肽而使Myostatin失活的方法可以有效的促使肌肉生长。

5）RNA干扰

将RNAi用于干扰Myostatin基因的研究可在不改变动物遗传结构的基础上增加瘦肉的产量，是一个全新的研究方向（杜荣,秦健,崔丽春,杜娟.2009.肌肉生长抑制素基因在畜禽肌肉发育调控中的研究进展[J].中国家禽.31（10）:34-36）。Chiou-Yueh Lee等(Chiou-Yueh Lee,Shao-Yang Hu,Hong-Yi Gong,Mark Hung-Chih Chen,Jenn-Kan Lu,Jen-Leih Wu.Suppression of myostatinwith vector-based RNA interference causes a double-muscle effect in transgeniczebrafish.Biochemical and Biophysical Research Communications 387(2009)76)。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种靶向Myostatin基因的骨骼肌特异性miRNA表达载体及重组细胞，将重组的包含靶向Myostatin基因的骨骼肌特异性miRNA表达载体的红安格斯新生牛成纤维细胞系作为核供体细胞，为生产具有双肌性状的红安格斯克隆牛奠定了坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，包括MYL1启动子，在MYL1-2启动子的下游设有针对位于Myostatin基因进行干扰的干扰序列。

所述的MYL1-2启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；所述的干扰序列是包含有能够表达如SEQ.ID.NO.2所示的miRNA成熟体序列的片段。

所述的干扰序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的MYL1-2启动子与干扰序列之间设有荧光标记筛选基因，在干扰序列的下游设有抗生素筛选基因。

所述的抗生素筛选基因的上下游还分别设有一个同向的Loxp序列。

所述的荧光标记筛选基因为EmGFP基因，抗生素筛选基因为neo基因；

EmGFP基因与neo基因之间还还设有SV40ori元件。

所述的miRNA表达载体为pmiR-MNM2，该载体是在pcDNA6.2-GW/EmGFP载体的EmGFP下游克隆如SEQ.ID.NO.1所示的干扰序列及其互补序列形成的miR元件，在SV40ori元件下游连接pA2T载体中的Loxp-neo-Loxp片段，再在EmGFP的上游克隆MYL1-2启动子。

一种基于所述的miRNA表达载体的包含靶向myostatin基因的pre-miRNA的重组细胞，宿主细胞为新生牛的成纤维细胞，通过转染外源性表达载体pmiR-MNM2，将目的基因靶向myostatin基因的pre-miRNA整合到新生牛的成纤维细胞的基因组。

所述的重组细胞，所述的宿主细胞为1～3代的红安格斯新生牛成纤维细胞。

所述的包含靶向myostatin基因的pre-miRNA的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明提供的靶向Myostatin基因的骨骼肌特异性miRNA表达载体，通过在目的基因靶向myostatin基因的pre-miRNA的上游加入牛骨骼肌特异性表达基因的启动子MYL1基因启动子来实现，牛MYL1基因的启动子能够指导目的基因在牛的骨骼肌组织中特异性高效表达；而pre-miRNA是针对位于第三外显子及部分第二外显子序列进行干扰的寡聚单链DNA及其互补链，转染细胞后，在细胞核内产生发夹结构的pre-miRNA，此结构会由exportin-5将其从细胞核内转入细胞质内，然后由Dicer加工成21个核苷酸的miRNA成熟体，miRNA成熟体与miRISC结合形成复合物，引导miRNA与靶基因Myostatin上的反向互补序列结合，从而降解靶基因，从而形成myostatin基因的干扰或沉默。

2、本发明将目的基因靶向myostatin基因的pre-miRNA克隆到基础载体pcDNAM6.2-GW/EmGFPmiR上，再依次构建启动子和抗生素筛选基因，构建了靶向myostatin基因的骨骼肌特异性miRNA表达载体miR-MNM；将其转染到红安格斯新生牛成纤维细胞，构建了转基因的红安格斯新生牛成纤维细胞系；荧光显微镜观察标记基因EmGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性细胞，并进行PCR鉴定证实目的基因靶向myostatin基因的pre-miRNA整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。

转染骨骼肌成肌细胞和成纤维细胞的对照显示，所构建的载体具有骨骼肌特异性；

实时荧光定量PCR检测干扰载体的干扰效果显示，pmiR-MNM2能降低骨骼肌成肌细胞Myostatin mRNA的表达，Myostatin mRNA表达水平差异显著；而且转染干扰载体pmiR-MNM2组细胞Myostatin蛋白表达比未转染组明显降低，表明干扰效果显著。

3、以包含目的基因靶向myostatin基因的pre-miRNA的新生红安格斯牛成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚，检测结果表明目的载体已经整合到胚胎基因组中，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出靶向myostatin基因的pre-miRNA的肉牛，也即myostatin基因被干扰的克隆牛，为生产具有双肌性状的红安格斯克隆牛奠定了坚实的基础。

附图说明

图1是骨骼肌特异性表达载体pmiR-MNM2的质粒图谱；

图2是Sal I单酶切鉴定阳性重组质粒pmiR-MSTN-4；

图3是Bst1107I单酶切及Sal I单酶切重组质粒pmiRNA-MSTN-4-neo

图4是NruI单酶切鉴定阳性重组质粒pmiR-MNM2；

图5是载体pmiR-MNM2分别转染成纤维细胞和骨骼肌成肌细胞48h后报告基因绿色荧光蛋白基因的表达检测结果（A、A1是成纤维细胞；B、B1是骨骼肌成肌细胞；A、B是光学显微镜下观察结果；A1、B1是荧光显微镜下观察结果）；

图6是未转染骨骼肌成肌细胞及转染pmiR-MNM2 48h后的骨骼肌成肌细胞中Myostatin mRNA表达量的实时荧光定量结果；

图7是未转染组骨骼肌成肌细胞及转染干扰载体pmiR-MNM2的骨骼肌成肌细胞中Myostatin蛋白的Western blot检测结果；

图8是对pmiR-MNM2载体转基因阳性红安格斯新生牛成纤维细胞基因组的外源基因的多重PCR扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；

图9是包含靶向Myostatin基因的pre-miRNA DNA序列的重组囊胚发育图；

图10是转基因阳性克隆胚多重PCR扩增鉴定结果。

具体实施方式

本发明首先构建含有靶向Myostatin基因的pre-miRNA和MYL1基因启动子的骨骼肌特异性miRNA表达载体pmiR-MNM2，其次用脂质体法将外源性表达载体pmiR-MNM2导入牛骨骼肌成肌细胞，荧光显微镜观察标记基因EmGFP的表达情况，并通过RT-PCR法检测转染组与未转染组骨骼肌成肌细胞Myostatin mRNA的表达高低，通过western blot法检测转染组与未转染组骨骼肌成肌细胞Myostatin蛋白表达的高低。然后通过电转染法将外源性表达载体pmiR-MNM2导入红安格斯新生牛成纤维细胞并经G418筛选获得阳性细胞，进行PCR鉴定，证实目的基因靶向Myostatin基因的pre-miRNA基因序列整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；最后，将转染靶向Myostatin基因的pre-miRA的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚。

下面结合具体的实施方案对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

具体所涉及的试剂如下：G418、DMEM/F12培养基和胎牛血清均购自美国GIBCO(Invitrogen）公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，细胞培养板和培养皿为丹麦Nunclon公司产品，质粒提取试剂盒购自Promega公司，细胞基因组提取试剂盒均购自天根公司，Taq DNA聚合酶购自Takara公司。

1、骨骼肌特异性表达载体pmiR-MNM2的构建

1.1pmiR-MSTN-4的构建

1.1.1靶向目的基因Myostatin基因的pre-miRNA的设计与合成

根据牛Myostatin(序列号：AY160688)基因序列，应用invitrogen公司的在线设计软件Invitrogen’s RNAi Designer设计得到4条pre-miRNA寡聚单链DNA干扰序列，其中前三条位于第一外显子或第二外显子，第四条位于第三外显子及部分第二外显子，由于Myostatin基因的C端活性区位于其第三外显子，所以针对位于第三外显子及部分第二外显子序列进行干扰的寡聚单链DNA及其互补链进行合成后用于组织特异性miRNA表达载体的构建。

所述的寡聚单链DNA序列为（如SEQ.ID.NO.1所示）：

5'TGCTGTGGAGTGTTCATCACAATCAAGTTTTGGCCACTGACTGA

CTTGATTGTTGAACACTCCA 3'（下划线部分标示的序列为miRNA成熟体序列，与目标基因干扰位点序列反向互补）

其互补链为：

5'CTGTGGAGTGTTCAACAATCAAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTT

GATTGTGATGAACACTCCAC 3'；

将以上互补的两条寡聚单链DNA退火形成双链后连入pcDNA6.2-GW/EmGFP(invitrogen,Catalog no.K4936-00)载体上的ds DNA装载位点，构建的载体转染细胞后，在细胞核内产生发夹结构的pre-miRNA，此结构会由exportin-5将其从细胞核内转入细胞质内，然后由Dicer加工成21个核苷酸的miRNA成熟体，miRNA成熟体与miRISC结合形成复合物，引导miRNA与靶基因Myostatin上的反向互补序列结合，从而降解靶基因。

1.1.2双链DNA的退火和装载

将上述寡聚单链DNA退火后形成双链

具体按照BLOCK-iT^TM Pol II miR RNAi Expression Vector Kit试剂盒说明书配置反应体系及程序对上述寡聚单链DNA的退火，得到双链DNA，寡聚单链DNA退火所用的体系如下：

100μM top strand oligo 5μL，100μM bottom strand oligo 5μL，10×oligoannealing buffer 2μL，ddH₂O 8μL，总体积为20μL。

1.1.3双链DNA的装载构建重组质粒pmiR-MSTN-4

合成双链DNA后，将其克隆入pcDNA6.2-GW/EmGFP载体上的ds DNA装载位点。具体为将退火的双链DNA继续稀释成10nM浓度，按如下体系配制连接液，在室温连接30分钟，从而构建miRNA表达载体。连接体系如下：5×ligation buffer 4μL，pcDNA6.2-GW/EmGFP 2μL，ds oligo(10nM)4μL，T4DNA ligase（1U/μl）1μL，ddH₂O 9μL，总体积为20μL。

将连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，涂布于含有50μg/mL壮观霉素的LB固体培养基上，通过α-互补的蓝白斑筛选挑选重组子，经SalI酶切鉴定酶切鉴定如图2所示，结果正确。酶切正确的重组质粒pmiR-MSTN-4送交上海英骏生物技术有限公司测序。

靶向Myostatin基因miRNA成熟体序列的测序结果如SEQ.ID.NO.2所示，与设计的序列同源性100%，该miRNA表达载体构建完成。

1.2、pG-MYL1-2的构建

1.2.1MYL1基因启动子的扩增

在NCBI上查得Myosin轻链1基因（即MYL1），序列号为NM 001079578，用其与NCBI上牛的基因组序列进行比对，找出转录起始位点上游2500bp的基因序列。

设计上下游引物MYL1-2s、MYL1a克隆MYL1基因启动子，具体的以红安格斯新生牛成纤维细胞基因组为模板，分别以MYL1-2s为上游引物，以MYL1a为下游引物，PCR扩增出长度1586bp启动子片段MYL1-2。

MYL1-2s：5'ACTAGTTCAGACCAAAAGAAAGTGGCTAAAATC 3'（下划线部分为SpeI酶切位点）

MYL1a：5'GAGCTCGCACCTCCAAAAGAACCTGTCAAAG 3'（下划线部分为SacI酶切位点）

PCR反应条件为:94℃预变性3min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸2min，30个PCR循环；72℃再延伸10min。

PCR扩增产物的测序结果经比对，表明所得序列位于MYL1基因上游确实为MYL1基因的启动子序列，碱基序列结果完全正确。

将扩增的MYL1启动子MYL1-2通过TA克隆到pGEMT-Easy载体的T位点得到pGMYL1-2载体。

1.3pmiR-MNM2的载体构建

以pmiR-MSTN-4载体、pA2T载体和pGMYL1-2载体构建包含靶向Myostatin基因的pre-miRNA的骨骼肌特异性miRNA表达载体pmiR-MNM2，其质粒图谱如图1所示。该载体是在pcDNA6.2-GW/EmGFP载体的EmGFP下游克隆如SEQ.ID.NO.1所示的干扰序列及其互补序列形成的miR元件，在SV40ori元件下游连接pA2T载体中的Loxp-neo-Loxp片段，再在EmGFP的上游克隆MYL1-2启动子。

1.3.1靶向Myostatin基因的miRNA表达载体的构建

1.3.1.1pA2T和pmiRNA-MSTN-4的双酶切

将质粒pA2T用Not I和Bst1107 I双酶切，pmiRNA-MSTN-4用Sma I和Bst1107 I双酶切，酶切体系如下：

回收pA2T酶切后的小片段，命名为Loxp-neo-Loxp，用Pfu DNA聚合酶补平，于72℃孵育15min，用胶回收试剂盒回收目的片段。

pmiRNA-MSTN-4用Sma I和Bst1107 I双酶切后回收切掉杀稻瘟抗性的载体骨架片段将其命名为miRNA-MSTN-4-Blast^-，用牛小肠碱性磷酸酶对片段miRNA-MSTN-4-Blast^-的5'端进行去磷酸化作用，于37℃反应30min，用胶回收试剂盒回收目的片段miRNA-MSTN-4-Blast^-。

1.3.1.4含有neo^r基因的miRNA表达载体的构建

将片段miRNA-MSTN-4-Blast-与片段Loxp-neo-Loxp用T4 DNA连接酶于4℃连接过夜连接，然后转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆，摇菌，利用质粒提取试剂盒提取质粒，分别用限制性内切酶Bst1107 I及Sal I进行单酶切，然后跑1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图3所示，将酶切鉴定正确的质粒命名为pmiRNA-MSTN-neo。

1.3.2靶向Myostatin基因的骨骼肌特异性miRNA表达载体的构建

1.3.2.1质粒pmiR-MSTN-neo与pG-MYL1-2的双酶切

用限制性内切酶SpeI和SacI对质粒pmiR-MSTN-neo及pG-MYL1-2进行双酶切，质粒pmiR-MSTN-neo双酶切后去掉CMV启动子，pG-MYL1-2双酶切后去掉T载体序列，酶切后1%的琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收目的片段。pmiR-MSTN-neo酶切电泳后回收长5628bp的大片段，将其命名为miR-MSTN-neo-CMV^-，pG-MYL1-2酶切电泳后回收长为1586bp的目的片段MYL1-2。

1.3.2.2酶切回收片段的连接

将片段MYL1-2与片段miR-MSTN-neo-CMV^-用T4DNA连接酶4℃连接过夜，然后转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆，摇菌，通过Nru I单酶切进行。单酶切得到一条7224bp的目的条带，结果正确，如图4。正确连接MYL1基因启动子的质粒命名为pmiR-MNM2。

由于质粒在大肠杆菌中增殖，用普通的质粒提取方法容易将细菌内毒素带到终产物中，细菌内毒素的存在会影响质粒转染效率和细胞生长，所以使用去内毒素的质粒提取试剂盒，以减少内毒素对试验结果的负面影响。用promega公司的去内毒素的质粒纯化试剂盒提取质粒后，用NruI对质粒进行线性化，用乙醇沉淀法浓缩线性化的DNA，用核酸蛋白测定仪测定质粒的浓度和纯度，经测定，质粒的浓度为588ng/μl，OD260/280为1.81，说明质粒较纯，可用于转染。

1.4pmiR-MNM2载体功能的验证

1.4.1启动子特异性的验证

干扰载体转染成纤维细胞及骨骼肌成肌细胞48h后检测报告基因绿色荧光蛋白基因的表达，以检测其组织特异性。

用脂质体转染方法将含有骨骼肌特异性启动子的干扰载体pmiR-MNM2瞬时转染骨骼肌成肌细胞，同时转染一孔成纤维细胞作为对照，转染48h后观察报告基因的表达。结果显示转染48h后，成纤维细胞转染组没有报告基因绿色荧光蛋白的表达，而骨骼肌成肌细胞转染组有报告基因绿色荧光蛋白的表达。结果说明所用的启动子MYL1具有骨骼肌特异性，结果如图5所示。

1.4.2干扰效果验证

1.4.2.1实时荧光定量PCR检测干扰载体的干扰效果

实时荧光定量PCR方法检测未转染组骨骼肌成肌细胞及转染干扰载体pmiR-MNM2的骨骼肌成肌细胞Myostatin mRNA表达水平，试验按照SYBRPremix Ex Taq TM说明书进行相对定量试验，用2^-△△ct法分析各组的干扰效率。采用SPSS 13.0软件对相对定量试验数据采用单因素ANOVA分析，进行差异显著性检验，P＜0.05具有统计学意义。结果显示载体pmiR-MNM2能降低骨骼肌成肌细胞Myostatin mRNA的表达，统计结果显示，pmiR-MNM2转染组相比未转染组Myostatin mRNA表达水平差异显著（P＜0.05），结果如图6所示。

1.4.2.2Western blot检测Myostatin的蛋白表达

按照凯基膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒的说明从未转染组骨骼肌成肌细胞及转染干扰载体pmiR-MNM2的骨骼肌成肌细胞中提取膜蛋白进行Western blot检测，以β-actin为内参照来反应蛋白上样量一致。转染干扰载体pmiR-MNM2组细胞Myostatin蛋白表达比未转染组明显降低，结果如图7所示。

2、pmiR-MNM2载体转染红安格斯新生牛成纤维细胞构建核供体细胞系

2.1红安格斯新生牛成纤维细胞的培养

将新生红安格斯牛耳部消毒后通过外科手术方法取部分耳部皮肤组织，置于加入青链霉素的无菌PBS中，尽快带回实验室。在超净台中剔除软骨组织取下皮肤，用加入青链霉素的无菌PBS冲洗三次，用无菌剪刀将组织剪成1mm³左右大小的组织块，将其贴于60mm培养皿，在组织块上滴加少量的细胞培养液，倒置放于含5% CO₂的37℃饱和湿度的培养箱培养4h，使组织充分贴壁，然后取出培养皿，在皿底轻轻滴入细胞培养液，继续培养24h后取出培养皿在显微镜下观察，发现有细胞从组织块周围迁出，3～4天后有大量细胞从组织块中迁出，培养5～6d后细胞已铺满皿底80%以上，此时将皿中的组织块弃去，因为迁出的成纤维细胞中混有上皮细胞，而用胰蛋白酶消化这两种细胞，细胞脱壁的时间不同，所以可以用差速消化的方法分离两种细胞，具体用胰蛋白酶消化混合细胞2min后，用细胞培养液中和，吹打混匀后用移液枪吸入4mL离心管中（培养皿底未消化起来的圆形贴壁细胞即为上皮细胞，将其弃去），1000r/min离心5min后，弃去上清，用细胞培养液重悬离心管底部细胞团块，将其接种在60mm细胞培养皿中，用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基对细胞进行培养。将1～3代的红安格斯新生牛成纤维细胞，培养至细胞达到90%汇合用于转染。

以G418作为筛选药物，由于表达载体pmiR-MNM2的骨架上有G418抗性基因neo^r，整合有外源基因的红安格斯新生牛成纤维细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会在该浓度下死亡，因此需要确定正常细胞G418的最小致死浓度来作为筛选浓度。

G418最小致死浓度的测定：在牛胎儿成纤维细胞培养液（含15%胎牛血清的DMEM/F12）中分别加入100μg/mL浓度梯度的G418筛选2周,测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度≧600μg/mL时，在显微镜下可见细胞全部死亡,所以G418的最小致死浓度为600μg/mL。

2.2pmiR-MNM2表达载体转染红安格斯新生牛成纤维细胞

转基因的方法有很多种，包括电穿孔法、显微注射法、基因枪法、病毒载体法、受体介导法等。选用电穿孔法将表达载体pmiR-MNM2转染红安格斯新生牛成纤维细胞，具体为：

观察在60mm培养皿中培养的红安格斯新生牛成纤维细胞生长达到90％汇合时，用胰酶将细胞消化下来，中和离心后弃上清。用无血清培养液Opti-MEM重悬细胞（细胞数量约2×10⁶），再次离心弃上清。加入电转染液用移液器轻轻吹打细胞使其重新将悬浮起来，向细胞悬液中加入10μg的线性化后的质粒，混匀，室温放置10min，然后转移至0.4cm电转杯，在510V/cm，2ms条件下，电穿孔3次，然后再在室温放置10min，接种在三个盛有10mL培养液的10cm培养皿中。

2.3阳性克隆的筛选

电转染36h后，换含有G418的筛选培养液（G418含量为600μg/ml）进行筛选，2~3d换一次液，待对照组细胞死完，将G418的筛选浓度减半继续培养，直至长出单克隆。

2.4阳性细胞的PCR鉴定

阳性细胞的转基因多重PCR检测

以基因组DNA为模板进行多重PCR反应，扩增EmGFP，neo^r和pre-miRNA，同时扩增阴性对照未转染组成纤维细胞EGmFP，neo^r和pre-miRNA。EGmFP、neo^r和pre-miRNA引物序列序列如表1所示：

表1用于多重PCR扩增的引物序列和PCR扩增片段长度

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃温度梯度退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃5min。取5μL PCR产物，用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，如图8所示，其中，泳道1为阴性对照基因组多重PCR扩增结果，泳道2为50bp DNALadder，泳道3为阳性细胞多重PCR扩增结果，泳道4-6为以质粒pmiR-MNM2为模板分别扩增EmGFP、neo^r和pre-miRNA的结果，实验结果说明目的基因已经整合到阳性细胞的基因组中。

3、以上述基因组整合了目的基因靶向Myostatin基因的pre-miRNA的红安格斯新生牛成纤维细胞作为核供体细胞，构建转基因克隆胚

3.1卵母细胞的采集和成熟培养

在西安屠宰场采集的牛卵巢放于30~37℃的无菌的并加有抗生素的生理盐水中保存尽快运回到实验室。再用灭菌的生理盐水洗涤卵巢2~3次后，用灭菌纱布擦试卵巢表面，然后放入灭菌的的D-PBS液里，用12号针头抽取直径为2~8mm卵泡的卵泡液，在倒置显微镜下收集卵丘卵母细胞复合物(COCs)。选择胞质均一，颗粒细胞包裹3~6层的COCs，用D-PBS缓冲液清洗2~3次，再放置于培养箱内平衡至少2h的卵母细胞成熟液洗两次，然后置于30mm U形培养皿中于38.5℃、5% CO₂、饱和湿度下成熟培养20-22h。卵母细胞成熟培养液（OM）组分为：TCM-199+10%FCS（Hyclone）+10μg/mlLH+1μg/ml 17β-estradiol+1μg/ml FSH+1%（V:V）penicillin/streptomycin。

3.2卵母细胞的去核操作

用0.1%透明质酸酶吹打消化在体外成熟培养22~24h的卵母细胞，用以去除其透明带外周的颗粒细胞，在显微镜下将排出第一极体的具有良好形态的卵母细胞挑出备用。在去核前，用7.5μg/mL细胞松弛素B（cytochalasin B，CB）、5μg/mL Hoechst 33342、10%FBS的PBS孵育卵母细胞15min，用外径为20μm的斜口去核管吸出极体及附近的部分细胞质，荧光显微镜下选出没有蓝色荧光的、完全去核的卵母细胞，放入培养箱恢复至少20min，然后用于核移植。

3.3供体细胞的准备及注核

在核移植前，挑选形态良好的阳性细胞（实验组）和未转染的（对照组）新生牛胎儿成纤维细胞，经血清饥饿（0.5%FBS）1~2d，消化并离心细胞。用含10%FBS，7.5μg/mL CB的PBS重悬细胞，作为核供体细胞进行核移植。在倒置显微镜下用注核针吸取已经消化处理好的供体细胞注入去核后的卵母细胞的透明带下，注核成功的卵母细胞-供体细胞复合体在培养箱至少恢复20min。

3.4核质复合体的电融合

注射后，细胞-卵胞质重组体用微电极融合法进行电融合，首先将核质复合体在电融合液（0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1% BSA）中平衡3min，然后用微电极法进行融合，融合参数为电压28V、脉冲时长20μs、2次直流电脉冲，间隔10μs。融合后的重组体置于10% FBS的M199中，38.5℃、5% CO2、饱合湿度培养箱中培养，2h后观察电融合情况。再过48h后检查卵裂率，第7～9d检查并记录囊胚发育的情况，结果如图9所示。

3.5核移植胚胎的激活

成功融合后的重组胚在含10% FBS的M199中平衡4h后，先在含有5μmol/L离子霉素（Ionomycin）的SOFaa（SOF+2% BME+1% MEM+1mM谷氨酰胺+80mg/mL BSA（不含脂肪酸）+100IU/mL青霉素+100μg/mL链霉素）中处理5min，再用PBS至少洗三次后，放入含有2mmol/L 6-DMAP的SOFaa中于38.5℃、5% CO2、饱和湿度下进行培养，每48h半量换液1次，第72h加入10%的FBS，48h后检查卵裂率，第7～9d检查记录囊胚发育情况。

3.6转基因克隆胚PCR鉴定

重组胚胎基因组DNA的提取：将重组胚胎样品放入100μL灭菌的离心管中,加入20μL灭菌双蒸水，煮沸5min后稍离心，置于-20℃保存或直接用于PCR。

以提取的重组克隆胚的基因组为模板，PCR鉴定目的基因EmGFP、neo^r和pre-miRNA，以未转基因的克隆胚为阴性对照。PCR扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳,以50bp DNA Ladder为分子质量标准，PCR扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，如图10所示，其中，泳道1为阴性对照基因组多重PCR扩增结果，泳道2为50bp DNA Ladder，泳道3为阳性克隆胚多重PCR扩增结果，泳道4-6为以质粒pmiR-MNM2为模板分别扩增EmGFP、neo^r和pre-miRNA的结果，实验结果说明目的载体已经整合到胚胎基因组中，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出转靶向myostatin基因的pre-miRNA的红安格斯克隆牛。

Claims

1.一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，包括MYL1启动子，在MYL1-2启动子的下游设有针对Myostatin基因进行干扰的干扰序列。

2.如权利要求1所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的MYL1-2启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；所述的干扰序列是包含有能够表达如SEQ.ID.NO.2所示的miRNA成熟体序列的片段。

3.如权利要求1或2所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的干扰序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

4.如权利要求1所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的MYL1-2启动子与干扰序列之间设有荧光标记筛选基因，在干扰序列的下游设有抗生素筛选基因。

5.如权利要求4所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的抗生素筛选基因的上下游还分别设有同向的Loxp序列。

6.如权利要求4所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的荧光标记筛选基因为EmGFP基因，抗生素筛选基因为neo基因；

EmGFP基因与neo基因之间还还设有SV40ori元件。

7.如权利要求1所述的骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体，其特征在于，所述的miRNA表达载体为pmiR-MNM2，该载体是在pcDNA6.2-GW/EmGFP载体的EmGFP下游克隆如SEQ.ID.NO.1所示的干扰序列及其互补序列形成的miR元件，在SV40ori元件下游连接pA2T载体中的Loxp-neo-Loxp片段，再在EmGFP的上游克隆MYL1-2启动子。

8.一种基于权利要求7所述的miRNA表达载体的包含靶向myostatin基因的pre-miRNA的重组细胞，其特征在于，宿主细胞为新生牛的成纤维细胞，通过转染外源性表达载体pmiR-MNM2，将目的基因靶向myostatin基因的pre-miRNA整合到新生牛的成纤维细胞的基因组。

9.如权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为1～3代的红安格斯新生牛成纤维细胞。

10.权利要求8所述的包含靶向myostatin基因的pre-miRNA的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。