JP2003506076A - トリ始原生殖細胞を使用して、未分化のトリ細胞培養物を取得する方法 - Google Patents
トリ始原生殖細胞を使用して、未分化のトリ細胞培養物を取得する方法Info
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Abstract
Description
特にトリ始原生殖細胞および胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞に関す
る。
発生させる能力を有する。例えば、Hoganの1997年11月25日に発行され
た米国特許第5,690,926号;Hoganの1997年9月23日に発行された
米国特許第5,670,372号;およびHoganの1995年9月26日に発行さ
れた米国特許第5,537,357号は各々、哺乳動物の多能性胚幹細胞およびそ
れらを製造する方法を開示している。これらの特許の開示は、哺乳動物の胚幹細
胞、そして特にSCF、FGFおよびLIFよりなる増殖因子の組み合わせを使
用して、マウスおよび他の哺乳動物の胚幹細胞を培養することに限定されている
。
表現型を保持する努力および増殖を刺激する努力に集中している。例えば、Cha
ng,I. K.ら,Cell. Biol. Int. 1997年8月;21(8)495−9
;Chang,I. K.ら,Cell. Biol. Int. 1995年2月;19(2)14
3−9;Allioli,N.ら,Dev. Biol. 1994年9月;165(1)30−
7;および1999年2月11日に公開されたPCT公開番号WO 99/06
533(出願人−University of Massachusetts;発明者−Ponce de Leonら
)を参照されたい。
る方法は、Petitteらの1994年8月23日に発行された米国特許第5,34
0,740号;Petitteらの1997年8月12日に発行された米国特許第5,6
56,479号;およびPetitteらの1998年11月3日に発行された米国特
許第5,830,510号に開示されている。ESC表現型を発現する未分化のト
リ細胞は、とりわけ、発生学上の開発試験(すなわち、その細胞をマーカー遺伝
子で標識して、インビボに注入した後、それらの分布を観察することによる)お
よびトランスジェニック家禽の産生のためのツールとして有用である。それらは
、トランスジェニック家禽の産生に対して相同的組換えの適用を可能とするのに
有用である。そのような用途から考えて、ESC表現型を発現する未分化のトリ
細胞を得るためのさらなる方法の開発は、当業界での継続的な必要性を表す。
開示する。その方法の好ましい態様は、(a)始原生殖細胞を含有するトリ細胞
を原条形成後のトリ胚から集め;(b)そのトリ細胞を予め調整しておいたフィ
ーダーマトリックスと接触させて置き;そして(c)本質的には、胚幹細胞表現
型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細胞培養物を取得するのに十分な時
間、そのトリ細胞を培地の存在下にフィーダーマトリックスで増殖させる;こと
を含んでなる。
胚、より好ましくは15期〜31期の胚、そしてさらにより好ましくは27期〜
30期の胚から集める。より好ましくは、そのトリ細胞を約10,000〜約2
0,000細胞の範囲数でフィーダーマトリックスと接触させて置く。さらによ
り好ましくは、約20,000のトリ細胞をフィーダーマトリックスと接触させ
て置く。
芽細胞は、約40,000〜約60,000細胞、好ましくは約50,000〜約
60,000細胞、さらにより好ましくは約55,000〜約60,000細胞の
範囲数でフィーダーマトリックスに存在し得る。最も好ましくは、約60,00
0の繊維芽細胞がフィーダーマトリックスに存在する。
TO繊維芽細胞を含んでなる。好ましい態様において、そのマウス繊維芽細胞は
、マウス繊維芽細胞フィーダー層を形成する。
ル、ガチョウ、ウズラおよびキジの胚が含まれる群から任意に選択される胚であ
る。好ましい態様において、そのトリ胚は、ニワトリの胚である。
するための新規方法を提供することである。
殖細胞を含有するトリ細胞から培養する方法を提供することである。
現する未分化のトリ細胞の培養物を作成する際に使用するためのフィーダーマト
リックスを提供することである。
培養物を確立する際に使用するための、始原生殖細胞を含有するトリ細胞の最適
数を特性決定することである。
もよく記載する付随の実験例および図面と関連させると、他の目的も記載が進む
につれて明らかとなるであろう。
存率を図示する棒グラフである。1ウェルあたり10,000の生殖腺細胞を様
々な数のSTO細胞(1ウェルあたり50,000、55,000および60,0
00細胞)に播種した。発生段階特異的マウス胚抗原−1(SSEA−1−PG
CおよびESCのためのマーカー)に陽性の細胞を、培養後、0、1および3日
目に、PGC数として数えた。1ウェルあたり60,000細胞のグループでは
、他のグループより高いPGC数を3日目に示す(P<0.05)。この結果は
、フィーダー細胞の実質的に完全な単層、例えば、約60,000細胞を含有す
る単層が、PGC培養物に好ましいことを示す。
培養の生存率を図示する棒グラフである。1または2日間予め調整しておいた後
、1ウェルあたり20,000の生殖腺細胞を1ウェルあたり60,000のST
O細胞に播種した。2日間予め調整しておいたPGCが高い生存率を示す。
一組の棒グラフである。
Aに提示する凡例では、「10」および「20」として示す)を播種した後の、
様々な数のSTO細胞(1ウェルあたり40,000、50,000または60,
000−図3Aに提示する凡例では、「40」、「50」および「60」として
示す)での20以上のSSEA−1陽性細胞のコロニー数を図示する棒グラフで
ある。このように、図3Aに提示する凡例では、「40/10」、「50/10
」および「60/10」という表示は各々、STO細胞数が1ウェルあたり40
,000、50,000または60,000であること、および1ウェルあたり1
0,000の生殖腺細胞を播種することを示し、そして「40/20」、「50
/20」および「60/20」という表示は各々、STO細胞数が1ウェルあた
り40,000、50,000または60,000であること、および1ウェルあ
たり20,000の生殖腺細胞を播種することを示す。
Bに提示する凡例では、「10」および「20」として示す)を播種した後の、
様々な数のSTO細胞(1ウェルあたり40,000、50,000または60,
000−図3Bに提示する凡例では、「40」、「50」および「60」として
示す)での生殖腺PGCの増殖を図示する棒グラフである。このように、図3B
に提示する凡例では、「40/10」、「50/10」および「60/10」と
いう表示は各々、STO細胞数が1ウェルあたり40,000、50,000また
は60,000であること、および1ウェルあたり10,000の生殖腺細胞を播
種することを示し、そして「40/20」、「50/20」および「60/20
」という表示は各々、STO細胞数が1ウェルあたり40,000、50,000
または60,000であること、および1ウェルあたり20,000の生殖腺細胞
を播種することを示す。20,000の生殖腺細胞 対 10,000の生殖腺細胞
を使用すると、個々のPGCの増殖はより高かった(P<0.05)。同様に、
5日後に形成されたSSEA−1陽性コロニーの数は、播種した生殖腺細胞の数
に依存した。
生殖腺細胞のSSEA−1染色を示す一連の写真である。
日)を図示する。培養を開始した時点では、PGCのみがSSEA−1エピトー
プに対して陽性であった。
する。
ロニーを図示する。
々に染色したPGCおよびSSEA−1陽性ES細胞のコロニーに注目されたい
。
する。
高倍率像を図示する。
発生させる能力を有する。しかしながら、トリ(PGC)の培養物に関する報告
は、PGC表現型を保持する努力および増殖を刺激する努力に集中している。そ
こで、本発明の目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の発生をト
リPGCから可能とする方法を開発して提供することであった。
926号、Hoganの1997年9月23日に発行された米国特許第5,670,3
72号、およびHoganの1995年9月26日に発行された米国特許第5,53
7,357号に開示されているように、PGCを哺乳動物の胚から単離するのと
は違って、本発明に従って単離した始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞は、
相当な数のストローマ細胞も含んでなる。ストローマ細胞の存在は、哺乳動物の
システムでは観察されない本発明の方法の開発に複雑さを加える。
にするために、次の定義を詳述する。
allinacea sp.、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよび
キジを含め、全てのトリ種をいう。ニワトリが一般に好ましい。
う用語は、たとえ細胞が最終的に老化を被るとしても、さらなる細胞分裂をする
ことができる細胞または細胞培養物をいう。
細胞質を有する、未分化のトリ細胞をいう。
スPGCは、胚幹細胞に似ている細胞を結果的にもたらすことが報告されている
。Resnickら,Nature 359:550−551(1992);Matsuiら,Ce
ll 70:841−843(1992)を参照されたい。Resnickら,Nature
359:550−551(1992)は、そのような細胞を、便宜上、「胚細胞
」(EG)と名付けて、それらがインビボでPGCから派生したという意味を含
めることを提唱した。しかしながら、当業者の間では、胚生殖細胞および胚幹細
胞は、それらが(幾つかの遺伝子のメチル化での相違が報告されているにもかか
わらず)顕微鏡検査で同一であるように見え、同一の免疫学的マーカーを示すと
いう点で表現型的に同一であり、そして両方とも培養で広く分化して、胚盤胞へ
と注入した場合にはキメラに与えられることから、それらの多能性および全能性
を実証することを示しているという点で機能的に同一であることが認識されてい
る。従って、「胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞」という語句は、ト
リ始原生殖細胞から誘導された細胞を包含し、それゆえに、本発明の方法に従っ
て培養した細胞を記載するために使用する。
の範囲を含め、本出願で使用する場合には「1以上」を意味する。
のが好ましく、そして性分化より前の時期のものであるのが好ましい。本発明を
実施するために細胞を得るトリ胚は、17、18、19、20および21期を含
め、好ましくは14期以降のもの、より好ましくは14期〜45期のもの、さら
により好ましくは15期〜31期のものであって、最も好ましくはHanburgerお
よびHamilton(H & H)ステージングシステムでの発生の27〜30期のも
のである。
間)、より好ましくは約72〜約168時間(すなわち、約3〜7日間)、さら
により好ましくは約96〜約168時間(すなわち、約4〜7日間)、そしてさ
らにより好ましくは約96〜約120時間(すなわち、約4〜5日間)インキュ
ベートした受精卵から得るのがよい。好ましい態様において、胚生殖腺PGCお
よびストローマ細胞は、EDTAおよび/または緩衝溶液といったような適当な
溶液を使用して、胚生殖腺から集めるのがよい。好ましくは、単細胞懸濁液を得
るよう注意する。
生殖腺細胞からの、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の取得に関係す
る。本発明の開示より前は、当業者の間では、例えば、胚が生殖腺発生と関連の
ある時期に達したら、トリ胚生殖隆起または生殖腺から集めるのがよいといった
ような、始原生殖細胞を含有するトリ胚生殖腺細胞は、最後には生殖細胞のみに
分化するというのが一般的見解であった。本発明は、例えば、トリ胚の生殖隆起
または生殖腺から集めた始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞の一部が、胚幹
細胞表現型を発現する未分化の細胞になることを示す。これゆえに、本発明の方
法は、始原生殖細胞を、例えば、生殖隆起または生殖腺から、より多くの数で単
離するのがよい、胚幹細胞表現型を発現する未分化の細胞を培養する間、便宜性
を提供し、そして典型的には、より進歩したトリ胚の開発から考えて、単離する
のがより容易である。
クスが含まれる。フィーダーマトリックスは、ESCを得る目的で培養した細胞
またはセルラインのいずれかであり得る。あるいはまた、フィーダーマトリック
スは、始原生殖細胞が局在する器官もしくは組織、例えば、生殖腺から誘導する
ことができるか、またはそれらの器官もしくは組織により提供され得る。あるい
はまた、フィーダーマトリックスを含んでなるフィーダー細胞は、結合した増殖
因子を加えた細胞間マトリックスで置換することができる。
ックスを構築する。上述したように、フィーダーマトリックスを予め調整してお
くのが好ましい。「予め調整しておく」という用語は、始原生殖細胞を含有する
生殖腺細胞をフィーダーマトリックスと接触させて置くより前の時間、例えば、
フィーダーマトリックスによる増殖因子または他の因子の産生を開始させて確立
するのに十分な時間、フィーダーマトリックスを培地の存在下に培養することを
意味する。実験例に開示するように、始原生殖細胞を含有する生殖腺細胞をフィ
ーダーマトリックスと接触させて置くより前に、フィーダーマトリックス自体を
1〜2日間培養することにより、フィーダーマトリックスを予め調整しておく。
。STO繊維芽細胞が好ましいが、一次繊維芽細胞も適当である。そしてまた、
本発明は、マウス細胞フィーダーマトリックスの用途に関して記載しているが、
他のマウス種(例えば、ラット);他の哺乳動物の種(例えば、有蹄動物、ウシ
およびブタ種);またはトリ種(例えば、Gallinacea、ニワトリ、シチメンチ
ョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジ)からの細胞を含んでなるフィーダ
ーマトリックスを使用してもよいことを意図する。
んでなるのがよい。標準的な技術を使用して、フィーダー細胞を有糸分裂により
不活性化するのがよい。例えば、フィーダー細胞を、γ放射線(例えば、400
ラドのγ放射線)にさらすのがよいか、またはマイトマイシンC(例えば、10
μg/ml、2−3時間)で処理するのがよい。細胞を有糸分裂により不活性化す
る手順は、典型的には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(AT
CC),10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110−
2209から細胞(例えば、STOフィーダー細胞は、ATCC受託番号 15
03の下に入手可能である)と共に送られる情報にも詳述されている。単層は、
場合により、約80%の集密度まで、好ましくは約90%の集密度まで、そして
より好ましくは約100%の集密度まで培養するのがよい。フィーダー細胞の単
層としての構造は、培養物に好ましい構造であるが、全ての適当な構造が本発明
の範囲内のものであることを意図する。このように、例えば、フィーダー細胞の
層、単層、集合体、凝集体または他の会合体もしくは群集体は、本発明の範囲内
に入ることを意図し、そして特に「マトリックス」という用語の意味に入ること
を意図する。
に、またはそれら全ての組み合わせで、不均一に拡張することができる。本発明
に従って、このように、PGCを適当なフィーダー細胞と混合して、その細胞を
マルチウェルプレートのような適当な培養容器へと挿入することにより、培養物
を形成することができることを意図する。
の培地は、調整培地または合成培地であるのがよく、これらは両方とも当業界で
知られている。調整培地、そして特にBRL調整培地が一般に好ましい。例とし
て、Smith,A. G.およびHooper,M. L.,Dev. Biol. 1987年5月;
121(1):1−9により記載されているような、当業界で認識されている技
術に従って、BRL調整培地を作成する。BRL細胞は、ATCCから受託番号
CRL−1442の下に入手可能である。場合により、その培地には、限定さ
れるものではないが、白血病阻害因子(LIF)、インスリン様増殖因子(IG
F)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)
、幹細胞因子(SCF−スチール因子またはSFとも呼ばれる)、トランスフォ
ーミング増殖因子−β1(TGF−β1)および抗レチノイン酸を含め、増殖因
子を補うのがよい。
細胞を含有するトリ胚生殖腺細胞を、調整培地と共に、予め調整しておいたフィ
ーダーマトリックスへと播種すると、そのトリ細胞は、胚幹細胞表現型を示す細
胞のネストまたはコロニーを発生させる。哺乳動物の幹細胞での場合とは違って
、予め調整しておいたフィーダーマトリックスを有して、ESC表現型を発現す
る未分化のトリ細胞へのトリPGCの生存および発生を容易にするのが一般に好
ましい。本発明のトリ胚細胞は、一次細胞培養物に典型的であるように、少なく
とも1または2ヶ月間培養することができ、これは、インキュベートしていない
トリ胚からの細胞の一次培養物の通常2週間の寿命より相当長い。
により)分離して、その細胞を薬学的に許容され得る担体(例えば、リン酸緩衝
食塩水(PBS)溶液)と完全に混合することにより製剤化するのがよい。その
ような製剤でのトリ細胞を作成して、非相同DNA配列を以下により多く詳細に
記載する方法でトリ被験対象へと運ぶのがよい。
発試験(すなわち、その細胞をマーカー遺伝子で標識して、インビボに注入した
後、それらの分布を観察することによる)およびトランスジェニック家禽の産生
のためのツールとして有用である。それらは、トランスジェニック家禽の産生に
対して相同的組換えの適用を可能とするのに有用である。
のトリを含め、キメラのトリの産生にも有用であるべきである。トランスジェニ
ックのキメラのトリは、異種タンパク質の回収に有用であろうことを意図し、こ
れは、そのようなキメラのトランスジェニックのトリの卵から直接回収すること
ができるのが好ましい。例えば、そのようなトリは、治療用タンパク質および他
のポリペプチドの産生および回収に使用することができる。
あるドナーの細胞型を単離している。Etchesら,Poultry Science 72:8
82−887(1993);Etchesら,Avian Incubationにおいて,第22
章、Butterworth Publishers(1990);Verrinder Gibbinsら,Fourth
World Congress on Genetics Applied to Livestock Production,Edin
burgh(1990);Petitteら,Development 108,185−189(19
90)を参照されたい。これらの試験は、X期の胚(産卵時の胚)から誘導され
た胞胚葉細胞が、比較可能なレシピエントのX期の胚に移された場合でも生存能
力を持ったままであることを示した。このように、本発明は、トリの表現型を変
える新たな方法、および本明細書中に開示するトリ胚幹細胞でそのように産生さ
れたトリを提供する。その方法は、本明細書中に開示するトリ胚幹細胞にインビ
トロでDNA配列を(例えば、レトロウイルスベクターでの電気穿孔またはトラ
ンスフォーメーションにより)トランスフェクトした後、そのトランスフェクト
した胚幹細胞を、孵化後のトリにおいて表現型の変化(例えば、タンパク質発現
の変化、増殖率、試料効率、疾患抵抗性、またはこれらの因子全ての組み合わせ
の変化)をもたらすのに有効であるDNA配列と共に、胚トリを含有する卵へと
(例えば、卵黄嚢へと、または漿尿膜へと、好ましくは胚下腔へと、そして好ま
しくは初期の胚発生の間に(例えば、インキュベーションの2または3日前に、
そして最も好ましくはインキュベーションの1日前に))注入することを含んで
なる。
うに産生されたトリを少なくとも表現型の変化が現れる年齢まで育てる。全ての
適当な方法で測定する測定可能な表現型の変化を誘起するのに十分な孵化後の動
物において、生理反応が得られる限り、トランスフォームした胚およびトリがキ
メラであるならば、それは有害な結果のものではない。さらなる例として、キメ
ラ、またはDNA配列の生殖系列伝達により産生されるそのトランスジェニック
子孫におけるタンパク質発現は、プロモーターを誘発する薬剤での、キメラまた
はそのトランスジェニック子孫の処置で結合した、導入されたDNA配列への誘
発可能なプロモーターの取り込みによって確立され得る。
率を減少させないよう、胚の組織および器官並びにその周囲の胚外膜を過度に損
傷しないのが好ましい。例えば、出願人は、卵に窓を形成させた後、直径50μ
mのマイクロピペットまたは直径50μmの針といったような注入用マイクロピペ
ットまたは針を使用することにより、インオボ注入を実施している。所望ならば
、その卵をワックス等のような実質的に細菌不透過性のシーリング物質でシール
して、その後の望ましくない細菌の侵入を防ぐことができる。適当なシーリング
物質は、場合により、生物学的に許容され得る抗菌組成物を含んでなるのがよい
。
ろうことが予想される。本発明を実施するのに適したそのような装置は全て、本
明細書中に記載する胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞を含む注入器を
含んでなり、その注入器は、その装置により卵にDNAを注入するよう位置する
。加えて、その注入後の卵における穴をシールするために、操作上、注入と関連
のあるシーリング装置を与えるのがよい。
で機能的なプロモーター、およびそのプロモーターに操作可能なように結合させ
たペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる構築物である。好
ましくは、そのタンパク質またはペプチドは、生理学的に活性であって、トリに
おける表現型の変化を引き起こすことができる。一般に、DNA構築物は、リポ
ソーム、リン酸カルシウム、電気穿孔またはDMSOといったような、当業界で
知られている様々な技術を使用して、本発明の胚幹細胞をトランスフォームする
ための、(電気穿孔により本発明の胚幹細胞へと導入された)線状DNA配列、
またはベクターもしくは他の適当な担体により運ばれる配列であるのがよい。以
下に論ずるベクターは、天然型またはその誘導体のどちらかでの、プラスミド、
ウイルス(レトロウイルスを含む)およびファージであるのがよい。
腺放出ホルモン(TRH)、MarekのMDX、およびコクシジウム症のための抗
原のような免疫原性組換え抗原よりなる群から選択されるタンパク質またはペプ
チドをコードする遺伝子である。
ームした宿主細胞、タンパク質およびタンパク質フラグメントの産生は十分知ら
れている。例えば、Bellらの米国特許第4,761,371号,第6コラム第3
行〜第9コラム第65行;Clarkらの米国特許第4,877,729号,第4コラ
ム第38行〜第7コラム第6行;Schillingの米国特許第4,912,038号,
第3コラム第26行〜第14コラム第12行を参照されたい。制限エンドヌクレ
アーゼ消化、ベクターの作成、DNA精製および他のそのような手順のためのプ
ロトコルは、本質的には、標準的なクローニングマニュアルに記載されている通
りである。Sambrookら,Molecular Cloning,a Laboratory Manual(第2
版,Cold Spring Harbor Press,N.Y.(1989)を参照されたい。
させるために本明細書中で使用する製可能なDNA構築物である。適当な発現ベ
クターは、そのベクターを正しい宿主へと導入した場合にクローンcDNAまた
はゲノムDNAを正しい方向で発現させることができる調節要素を有するであろ
う。そのような要素には、典型的には、限定されるものではないが、転写に関与
する細胞タンパク質と特異的に相互作用するプロモーター領域、または誘発剤の
投与により誘発可能であり得るプロモーター領域、結合した非相同プロモーター
、スプライスアクセプターおよび/またはドナー配列からの転写を何倍も刺激す
ることができるエンハンサー要素、並びに終止およびポリアデニル化シグナルが
含まれる。翻訳を可能とすることができるリボソーム結合部位のための配列も必
要であって、これを発現させるべき遺伝子に操作可能なように結合させる。最近
、骨格筋構造遺伝子および必須近位プロモーター配列の両方の上流に位置して、
操作可能なように互いに関連する、筋肉に特異的なプロモーターが単離された(
MarおよびOrdahl,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,6404−6
408(1988))。ベクターは、プラスミド、ウイルス(例えば、アデノウ
イルス、サイトメガロウイルス)、ファージ、および組換えにより宿主ゲノムへ
と組み込み可能なDNAフラグメントを含んでなる。そのベクターは、場合によ
り、独立して宿主ゲノムを複製して機能するのがよく、または幾つかの場合には
、ゲノム自体へと組み込むのがよい。
の発明者達により見出された、または彼らにより意図された技術および手順の面
から、次の実験例のある態様を記載して、本発明の実施において十分行う。これ
らの実施例を発明者達の標準的な実験実施の使用によって例示する。本発明の開
示および当業者の一般的レベルから考えて、当業者は、次の実験例が例示的なも
のであることのみを意図するものであって、本発明の精神および範囲を逸脱する
ことなく、多数の変更、修飾および交替を使用することができることが分かるで
あろう。
0期(H & H)の胚生殖腺から集めた。単細胞懸濁液を得るよう注意する。特
に、27−30期(H & H)のニワトリ胚からの生殖腺を適当な(blunt)切開
により集めて、Ca2+およびMg2+を含んでいないリン酸緩衝食塩水(PBS
(−))1滴にプールした。胚から集めた後、1.5mlのEppendorfチューブ中、
その生殖腺を0.02% EDTA 1mlへと入れた後、37℃のインキュベータ
ーに10分間入れた。次いで、そのチューブを200Gで3分間遠心分離にかけ
て、上澄みを除去した。次いで、集めた生殖腺を、10% ウシ胎児血清(FB
S)を含むDMEMと共に、細胞濾過器(FALCON(登録商標)2360、
細孔径100μM)から新たなチューブへと通した。これは、単細胞懸濁液を与
えた。
6ウェルのプレートに作成した。次いで、FBS起源、フィーダー細胞数、ST
O細胞のバッチ(旧 対 新)、フィーダー層の予調整、および播種した生殖腺細
胞数を含め、幾つかの培養パラメーターを試験した。
色した。単一のSSEA−1陽性PGC数およびSSEA−1陽性コロニー数を
、培養の0、1および3日目に試験した。最も多くの場合、多数のPGCの死が
最初の24時間の培養物で起こり、続いて、単一のPGC数の増大が3−5日目
に起こった。生殖腺PGCの生存および増殖は、STOフィーダー層の質、播種
したSTO細胞数、STOフィーダー層の予調整、および初期に播種した生殖腺
細胞数により影響を受ける。実験の間に、多数の変動がFBSの1つのバッチ内
で観察され、FBS起源が培養物に影響を及ぼし得ることが提唱された。
存率を示す。1ウェルあたり10,000細胞の生殖腺細胞を様々な数のSTO
細胞に播種した:1ウェルあたり50,000、55,000および60,000
細胞。SSEA−1陽性細胞を、培養後、0、1および3日目に、PGC数とし
て数えた。1ウェルあたり60,000細胞のグループでは、PGC数が他のグ
ループより3日目で高い(P<0.05)。この結果は、フィーダー細胞の完全
な単層がPGC培養物に好ましいことを示す。
を改善した。3日間の培養により、SSEA−1陽性細胞のコロニーを単一のP
GCと共に見出すことができた。5日間の培養後、これらのコロニーは、数およ
び大きさを増大させた。コロニー内の細胞は、PGCより小さくて、十分に定義
されたコロニーボーターで密に充填されていることから、胚幹細胞表現型を発現
させた。幾つかのコロニーは、2,000細胞以上含むと推定された。PGCお
よびESC様コロニーの混合物は、生殖腺PGCの画分のみがESC表現型を発
生させることができるであろうことを提唱する。
培養の生存率を示す。1または2日間予め調整しておいた後、1ウェルあたり2
0,000の生殖腺細胞を1ウェルあたり60,000のSTO細胞に播種した。
2日間予め調整しておいたPGCが高い生存率を示す。
した後の、様々な数のSTO細胞(1ウェルあたり40,000、50,000ま
たは60,000)での20以上のSSEA−1陽性細胞のコロニー数を示す。
20以上のSSEA−1陽性細胞を有するコロニー数を測定して、ESC表現型
を発現する未分化の細胞を含有するコロニーを、個々のPGCおよびPGCの任
意の群集体から、保守的な方法で区別する。
した後の、様々な数のSTO細胞(1ウェルあたり40,000、50,000ま
たは60,000)での生殖腺PGCの増殖を示す。20,000の生殖腺細胞
対 10,000の生殖腺細胞を使用すると、個々のPGCの増殖はより高かった
(P<0.05)。同様に、5日後に形成されたSSEA−1陽性コロニーの数
は、播種した生殖腺細胞の数に依存した。
それらが、本明細書中で使用する方法、技術および/または組成物に関する背景
を補い、説明し、提供し、またはそれらを教示する程度まで参照することにより
、本明細書中に組み込まれる。
−9; Chang,I. K.ら,Cell. Biol. Int. 1997年8月;21(8)495
−9; Etchesら,Avian Incubationにおいて,第22章、Butterworth Publisher
s(1990); Etchesら,Poultry Science 72:882−887(1993); MarおよびOrdahl,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,6404−6
408(1988); 1996年5月2日に公開されたPCT公開番号WO 96/12793; 1999年2月11日に公開されたPCT公開番号WO 99/06533; 1999年2月11日に公開されたPCT公開番号WO 99/06534;
1(1):1−9; 米国特許第4,040,388号; 米国特許第4,469,047号; 米国特許第4,593,646号; 米国特許第4,681,063号; 米国特許第4,761,371号; 米国特許第4,877,729号; 米国特許第4,903,625号;
Spring Harbor Press,N.Y.(1989)); Verrinder Gibbinsら,Fourth World Congress on Genetics Applied to
Livestock Production,Edinburgh(1990)。
が理解されるであろう。さらにまた、先の記載は、説明のみを目的とするもので
あって、限定を目的とするものではなく、本発明は、特許請求の範囲により定義
される。
腺PGCの生存率を図示する棒グラフである。
生殖腺PGC培養の生存率を図示する棒グラフである。
果を図示する一組の棒グラフである。
したニワトリ生殖腺細胞のSSEA−1染色を示す一連の写真である。
Claims (43)
- 【請求項1】 胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養物
を取得する方法であって、 (a)始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞を原条形成後のトリ胚から集め; (b)そのトリ生殖腺細胞を予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触
させて置き;そして (c)本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細
胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ生殖腺細胞を培地の存在下に予め
調整しておいたフィーダーマトリックスで増殖させる; ことを含んでなる方法。 - 【請求項2】 トリ生殖腺細胞を14期〜45期の胚から集める、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項3】 トリ生殖腺細胞を15期〜31期の胚から集める、請求項2
に記載の方法。 - 【請求項4】 トリ生殖腺細胞を27期〜30期の胚から集める、請求項3
に記載の方法。 - 【請求項5】 トリ生殖腺細胞を約10,000〜約20,000細胞の範囲
数で予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて置く、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項6】 約20,000のトリ生殖腺細胞を予め調整しておいたフィ
ーダーマトリックスと接触させて置く、請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 予め調整しておいたフィーダーマトリックスが繊維芽細胞を
含んでなる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 繊維芽細胞が約40,000〜約60,000細胞の範囲数で
予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項7に記載の方法
。 - 【請求項9】 繊維芽細胞が約50,000〜約60,000細胞の範囲数で
予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項8に記載の方法
。 - 【請求項10】 繊維芽細胞が約55,000〜約60,000細胞の範囲数
で予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項9に記載の方
法。 - 【請求項11】 約60,000の繊維芽細胞が予め調整しておいたフィー
ダーマトリックスに存在する、請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】 繊維芽細胞がマウス繊維芽細胞である、請求項7に記載の
方法。 - 【請求項13】 マウス繊維芽細胞がマウス繊維芽細胞フィーダー層を形成
する、請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】 マウス繊維芽細胞がマウスSTO繊維芽細胞である、請求
項12に記載の方法。 - 【請求項15】 未分化のトリ細胞を培地の存在下に予め調整しておいた繊
維芽細胞フィーダーマトリックスで少なくとも3日間増殖させる場合に幹細胞表
現型を保持することができる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項16】 トリ胚が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ
、ウズラおよびキジの胚よりなる群から選択される胚である、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項17】 トリ胚がニワトリ胚である、請求項15に記載の方法。
- 【請求項18】 培地が調整培地である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項19】 胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養
物を取得する方法であって、 (a)始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞を原条形成後のトリ胚から集め; (b)そのトリ生殖腺細胞を予め調整しておいた繊維芽細胞フィーダー細胞マト
リックスと接触させて置き;そして (c)本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細
胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ生殖腺細胞を培地の存在下にフィ
ーダー細胞マトリックスで増殖させる; ことを含んでなる方法。 - 【請求項20】 トリ生殖腺細胞を14期〜45期の胚から集める、請求項
19に記載の方法。 - 【請求項21】 トリ生殖腺細胞を15期〜31期の胚から集める、請求項
20に記載の方法。 - 【請求項22】 トリ生殖腺細胞を27期〜30期の胚から集める、請求項
21に記載の方法。 - 【請求項23】 トリ生殖腺細胞を約10,000〜約20,000生殖腺細
胞の範囲数でフィーダー細胞マトリックスと接触させて置く、請求項19に記載
の方法。 - 【請求項24】 約20,000のトリ生殖腺細胞をフィーダー細胞マトリ
ックスと接触させて置く、請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 繊維芽細胞が約40,000〜約60,000細胞の範囲数
で繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項19に記載の方法。 - 【請求項26】 繊維芽細胞が約50,000〜約60,000細胞の範囲数
で繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項25に記載の方法。 - 【請求項27】 繊維芽細胞が約55,000〜約60,000細胞の範囲数
で繊維芽細胞フィーダーマトリックスに存在する、請求項26に記載の方法。 - 【請求項28】 約60,000の繊維芽細胞が繊維芽細胞フィーダーマト
リックスに存在する、請求項27に記載の方法。 - 【請求項29】 繊維芽細胞フィーダーマトリックスがマウス繊維芽細胞を
含んでなる、請求項19に記載の方法。 - 【請求項30】 マウス繊維芽細胞がマウスSTO繊維芽細胞である、請求
項29に記載の方法。 - 【請求項31】 未分化のトリ細胞を培地の存在下に繊維芽細胞フィーダー
マトリックスで少なくとも3日間増殖させる場合に幹細胞表現型を保持すること
ができる、請求項19に記載の方法。 - 【請求項32】 トリ胚が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ
、ウズラおよびキジの胚よりなる群から選択される胚である、請求項19に記載
の方法。 - 【請求項33】 トリ胚がニワトリ胚である、請求項32に記載の方法。
- 【請求項34】 培地が調整培地である、請求項19に記載の方法。
- 【請求項35】 胚幹細胞表現型を発現する未分化のニワトリ細胞の持続性
培養物を取得する方法であって、 (a)生殖腺細胞を27期〜30期のニワトリ胚から集め; (b)その生殖腺細胞を予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー細胞層
と接触させて置き;そして (c)持続性トリ細胞培養物を取得するのに十分な時間、その生殖腺細胞を調整
培地の存在下に予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー細胞層で増殖さ
せ、その持続性トリ細胞培養物は、本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分
化のトリ細胞よりなる; ことを含んでなる方法。 - 【請求項36】 生殖腺細胞を約10,000〜約20,000生殖腺細胞の
範囲数で予め調整しておいたマウスフィーダー細胞層と接触させて置く、請求項
35に記載の方法。 - 【請求項37】 約20,000の生殖腺細胞を予め調整しておいたマウス
フィーダー細胞層と接触させて置く、請求項36に記載の方法。 - 【請求項38】 繊維芽細胞が約40,000〜約60,000細胞の範囲数
で予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項35に
記載の方法。 - 【請求項39】 繊維芽細胞が約50,000〜約60,000細胞の範囲数
で予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項38に
記載の方法。 - 【請求項40】 繊維芽細胞が約55,000〜約60,000細胞の範囲数
で予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項39に
記載の方法。 - 【請求項41】 約60,000の繊維芽細胞が予め調整しておいたマウス
繊維芽細胞フィーダー層に存在する、請求項40に記載の方法。 - 【請求項42】 予め調整しておいたマウス繊維芽細胞フィーダー細胞層が
マウスSTO繊維芽細胞フィーダー細胞層である、請求項35に記載の方法。 - 【請求項43】 未分化のトリ細胞を培地の存在下に予め調整しておいたマ
ウス繊維芽細胞フィーダー層で少なくとも3日間増殖させる場合に幹細胞表現型
を保持することができる、請求項35に記載の方法。
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