CN103725711B - 一种猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体和应用，所述表达载体的表达盒是猪内源性的skeletal-α-actin基因座与FST317编码cDNA融合而成，所述猪内源性的skeletal-α-actin基因调控区驱动FST317的表达。本发明的表达载体可以应用体细胞克隆制备转基因猪，在转基因猪的肌肉组织特异性的表达FST317。

Description

一种猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体及其构建方法。

背景技术

猪肉是我国人民主要的动物蛋白来源，对于人民的生活水平提高起到关键性作用。随着我国经济的发展，人民生活水平的提高，中国人猪肉需求量也越来越大，据统计中国每年消费的猪肉量占全世界总量的一半以上。市场的需求扩大，促进了我国现代化规模化养殖业的快速发展。但是同时也提出严峻挑战。在我国，主要畜牧类品种严重依赖于进口，猪品种依赖程度接近90%。这意味着生猪养殖的产业的源头——种畜完全被欧美市场控制，严重的威胁到我国的食品安全。培育自主知识产权的猪新品种是现阶段我国迫切需要解决的农业问题。传统的遗传选育方法周期长见效慢，难以在短期内培育出具有高生产性能猪新品种。自从1997年哺乳动物体细胞克隆技术出现以后，家畜的基因工程育种得到迅速发展，它可以针对单一性状在短期内迅速的提高家畜的生产性能。

卵泡抑素（follistatin，FST）一条多肽链组成的糖蛋白。FST具有多种生物学功能，能与转化生长因子β超家族的多个成员结合。在哺乳动物中FST转录后有两种不同的剪接形式，一种剪接mRNA编码344个氨基酸残基的蛋白（FST-344），另一种剪接体编码317个氨基酸残基的蛋白（FST-317）。FST-344和FST317翻译后修饰分别形成两种成熟蛋白——315个氨基酸残基FST315和288个氨基酸残基的FST288。FST288的C末端少了17个氨基酸残基，其与细胞表面的肝素有很强的结合能力，FST288很难从表达部位扩散到血液中；FST315的C端17个氨基酸残基减弱了其与肝素的结合能力，FST315容易表达组织扩散到血液中。FST288被认为是组织特异性的卵泡抑素蛋白，而FST315被认为是分泌型的卵泡抑素蛋白。虽然是肌肉特性的表达FST315，过量FST315能够从肌肉中扩散到血液，随着血液循环影响其他的组织和器官。血液中高浓度的FST315蛋白可能会导致生殖障碍，对转基因猪产生安全隐患。实际上肌肉特异性表达FST288的才能真正做到肌肉特异性。构建一种猪肌肉特异性表达FST288表达载体，用它制备转基因猪既能提高猪瘦肉率又能保证猪的安全。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种表达载体，增加了转基因猪的安全性。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

一种猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体，所述表达载体的表达盒是猪内源性的skeletal-α-actin基因座与FST317编码cDNA融合而成，所述猪内源性的skeletal-α-actin基因调控区驱动FST317的表达。

进一步的，所述表达载体包括，

skeletal-α-actin基因5’侧翼序列，优选为skeletal-α-actin基因5’侧翼12kb的序列；

FST288编码DNA，优选的FST288是以人FST344cDNA载体为模板通过PCR扩增得到的；

skeletal-α-actin基因3’侧翼的序列，优选为skeletal-α-actin基因3’侧翼7.8kb的序列；

新霉素抗性基因（neo），在新霉素抗性基因上下游插入同向loxp可用于新霉素抗性基因的删除。

进一步的，所述的表达载体序列如序列表SEQ：IDNO：1所示。

本发明的另一目的为提供一种上述表达载体的构建方法，其技术方案如下：

一种表达载体的构建方法，利用Red/ET介导的同源重组技术，包括如下步骤：

1）将含有猪骨骼肌肌动蛋白的21kb基因座抓捕到抓捕载体上，优选的抓捕载体是通过PCR分别扩增左右同源臂后插入到pBR322-loxp-neo-loxp骨架载体构建而成；

2）将FST317基因加上抗性基因定点敲入到骨骼肌肌动蛋白的编码区，优选的抗性基因为zeocin抗性基因；

3）通过Flpase介导的位点专一性重组将抗性基因删除，表达载体构建完成。

本发明还提供了含有上述表达载体的转基因细胞系。

本发明还提供了一种上述表达载体制备转基因猪中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的表达载体可以应用体细胞克隆制备转基因猪，在转基因猪的肌肉组织特异性的表达FST317，从而增加了转基因猪的安全性。

附图说明

图1表达载体构建路线图；

图2酶切鉴定抓捕载体；

图3菌体直接裂解电泳检测重组克隆；

图4抓捕酶切鉴定-重组克隆XbaI酶切；

图5抓捕酶切鉴定-重组克隆HindIII酶切；

图6PCR鉴定hFST基因敲入；

图7PCR鉴定zeocin抗性基因删除；

图8表达载体酶切鉴定；

图9猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体图谱；

图10转基因表达盒的结构示意图；

图11PCR扩增检测外源基因的整合；

图12southern杂交验证外源基因的整合；

图13RT-PCR检测转基因的组织特异性表达。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1载体构建

参见图1，利用Red/ET介导的同源重组，第一步将含有猪骨骼肌肌动蛋白的21kb基因座抓捕到抓捕载体上；第二步将FST317基因加上抗性基因定点敲入到骨骼肌肌动蛋白的编码区；第三步通过Flpase介导的位点专一性重组将抗性基因删除，载体构建完成。

1.1、抓捕载体构建

PCR分别扩增左右同源臂后插入到pBR322-loxp-neo-loxp骨架载体，构建成抓捕载体。

以含有猪骨骼肌肌动蛋白的BAC为模板，分别以：

TYB1F：5′-CGTaagcttAAATCACTGGCTGTGTGCTG-3；’

TYB1R：5′-CTGCAGGCTGAATTCTTTCC-3’；

TYB2F：5′-TCGgaattcCTGAAA-ATTCCCCAAGACGA-3’；

TYB2R：5′-CAGtctagaGAATGGTGGAGGCGAATAGA-3’；

为引物扩增左侧430bp，右侧417bp同源臂。在pBR322-loxp-neo-loxp骨架载体的HindIII和EcoRI酶切位点之间插入由引物TYB1F和TYB1R扩增得到的430bp抓捕载体上游同源臂；再将构建好的载体用EcoRI和XbaI双酶切，插入由引物TYB2F和TYB2R扩增出的417bp抓捕载体下游同源臂，由此获得抓捕载体。

构建好pBR322-loxp-neo-loxp抓捕载体，用HindIII和XbaI双酶切，如图2所示，切出8.1kb和814bp的两条带，证明第一步抓捕载体构建成功。

EcoRⅠ线性化抓捕载体用于下一步抓捕实验。

1.2敲入片段拼接

以人FST344cDNA为模板，FSTF和FSTR为引物，

FSTF：

5′-AATgctagcGCTCGGACCAGTGAGGCTTCCTGCCTGACACGCTGCGCATCTCCACGGCCTTGCTGATCTTGCAGAAACCCGACGCCATTCATATGATGGTCCGCGCGAGGC-3’；

FSTR：

5′-AATgctagcTGCCGCTTGGTGGCTCGAGGTCAGCCACTGCACTTGAGCAGATTCGTCGTCCTGAGGAGAAGTCGCAGCTGTTGGAATGGGGTGAATTCAAAGGCTATGTCAACACTGAACACT-3′；

扩增出两端带有同源臂的FST317基因片段，连接入T载体，测序T-FST质粒。以pEpBudce4质粒为模板，以FZF和FZR为引物，

FZF:

5′-GaattcGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCAGACATGATAAGATACATTGATG-3′；

FZR:

5′-GaattcGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCAGGAGGAGGCTTTTTTGG-3’；

扩增出两端带有FRT的zeocin基因片段。将测序正确的T-FST质粒和FRT-Zeo^r-FRT片段分别用EcoRI酶切，将两个片段胶回收后用T4连接酶进行连接，zeocin筛选连接产物阳性克隆。

NheⅠ酶切后，回收hFST-FRT-Zeo^r-FRT片段，用于下一步基因敲入。

1.3、基因抓捕

将线性化的pBR322-loxp-neo-loxp抓捕载体电转到含有猪骨骼肌肌动蛋白基因的BACSW102重组感受态中，zeocin抗性的LB固体培养基上，32℃过夜培养。从zeocin抗性的克隆中随机挑选20候选克隆划线培养，再挑取少量菌体裂解后直接电泳，如图3所示，初步判断20个克隆中有9个基因抓捕成功，其中16号克隆疑似为双克隆。

选择前7个克隆提取质粒后，分别用XbaI和HindIII酶切鉴定，参见图4，用XbaI能切出791bp、978bp、7812bp、9789bp、10214bp五条带；参见图5，用HindIII能切出大小分别为436bp、752bp、1128bp、2108bp、2197bp、3326bp、3946bp、5265bp、10426bp的条带，这些条带均与酶切分析结果一致，证明成功获得了约29.5kb的重组克隆，阳性率达到40%。

1.4、FST317基因敲入

将步骤1.3中抓捕成功的载体质粒转化后制备成重组感受态，再将步骤1.2中拼接成功的线性DNA片段hFST-FRT-Zeo^r-FRT电转到重组感受细胞，取100μl涂布含有zeocin的LB固体培养皿，32℃培养17h。挑取其中3个候选克隆，以P1+P2为引物进行PCR鉴定，

P1：5′-GCTCCTTCTTTGGTCAGCAC-3′；

P2：5′-TCCTTGCTCAGTTCGGTCTT-3；

如图6所示，都能够扩增出1187bp的条带。然后对其中一个克隆进行测序，结果表明FST317基因定点敲入到了猪骨骼肌肌动蛋白的编码区，已将猪骨骼肌肌动蛋白PSA基因替换。

1.5、抗性基因删除

将步骤1.4中构建好的基因敲入质粒和表达Flpase重组酶的707-FLPe质粒一起导入到大肠杆菌中，37℃诱导位点专一性重组，删除zeocin抗性基因。随机选取两个候选克隆，

P3：5′-GACTGTGGACCTGGGAAAAA-3′；

P4：5′-TGTGAAAAGTGACGCTGAGG-3′；

以P3+P4为引物进行PCR扩增鉴定删除结果，如图7所示，扩增条带比对照条带少800bp左右，说明抗性基因删除成功。挑选一个克隆提取质粒，用HindIII进行酶切和测序鉴定，如图8所示，切出条带大小有436bp、752bp、1128bp、1587bp、2108bp、2197bp、3326bp、3946bp、7109bp、10426bp，该结果与酶切分析一致。

测序分析进一步证明，zeocin基因已经删除，只留下一个FRT位点；FST317编码序列替代猪骨骼肌肌动蛋白编码区，形成一个杂合的表达盒；由猪的骨骼肌肌动蛋白的上下游调控序列启动重组FST317表达。

实施例2转基因细胞获得

2.1杜洛克猪胎儿成纤维细胞建立

2.1.1、取妊娠30d的长白猪，取输卵管子宫，包扎出口，2h内运回实验室。从子宫内取出胎儿，用含抗生素的DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用眼科剪去除胎儿头部、四肢、内脏，用DPBS冲洗；

2.1.2、在直径100mm细胞培养皿内用眼科剪将剩余部分尽量剪碎；

2.1.3、加入少许血清，将1ml枪头尖端用剪刀剪断，留下直径约为40mm以上部分，接上1ml枪，将组织块转移到3个T25细胞培养瓶的底壁，用弯头吸管将组织块均匀铺开；

2.1.4、将铺有组织块的一面向上，各加入5ml细胞培养液，放入CO₂培养箱，39℃，5%CO₂，100%湿度培养；

2.1.5、待培养6-8h后，将铺有组织块的一面翻转，使细胞培养液浸没组织块；

2.1.6、培养5天左右观察组织块周围是否有细胞爬出；

2.1.7、待细胞生长至80%汇合时，进行传代培养或进行冷冻保存。

2.2将实施例1构建的表达Follistatin-317的线性化表达载体转染猪的胎儿成纤维细胞；

2.3G418药物筛选细胞克隆；

2.4PCR鉴定转基因阳性细胞克隆；

实施例3转基因猪的制备

3.1猪卵母细胞体外成熟

从屠宰场取卵巢，放入28℃-35℃、含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，2h内运回实验室用配有18号针头的20mL注射器抽吸卵巢上3-6mm的卵泡。将抽取液放于50mL离心管中，7℃水浴静置15min去上清，加入PVA-TL-HEPES重悬沉淀,再静置15min，重复一次，将重悬液放入直径60mm的塑料培养皿中，在体式显微镜下，用口吸管挑选卵丘包裹2层以上、致密、而且胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte-complexes,COCs)，用成熟培养液洗涤3遍，转入在培养箱中至少已经平衡4h的培养液滴内(每100μL液滴放25枚)。每一直径35mm的塑料培养皿中做4个液滴,用胚胎级矿物油覆盖。

将COCs先在成熟培养液中培养20±2h，然后转移到无hCG以及eCG的成熟液中继续培养20±2h。

3.2体细胞准备

利用血清饥饿法，待细胞生长至80%汇合时，进行血清饥饿处理，即把培养液中的FBS(Gibco,LifeTechnologies)浓度从20%降至0.5%继续培养2-5d，按常规方法消化,离心洗涤，最后加1mL显微操作液重悬细胞沉淀备用。

3.3受体卵母细胞去核及供体细胞核移植

利用盲吸法进行成熟卵母细胞去核，即成熟40-44h猪卵母细胞，脱卵丘后选择胞质均匀，卵周隙清晰，胞膜完整的卵母细胞放入无Ca²⁺、Mg²⁺的HEPES缓冲液NCSU-23备用，然后转移到显微操作液滴内：核移植前1h做好，直径60mm细胞培养皿盖中央(液滴50-80μl，2-3mm宽，8-10mm长，石蜡油覆盖)，作用15-30min，把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入其中于39℃、5%CO₂、100%湿度平衡15min,安装显微固定管以及去核/注射针,调节好操作系统位置，在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜下（40×），用固定管(内径25-35μm，外径100-120μm)吸持卵母细胞用内径15-25μm的去核/注射针拨动卵母细胞,使第一极体处于钟表1点钟位置下，从钟表3点处将去核/注射针刺过透明带，吸出第一极体及其附近少许细胞质，退出去核/注射针，将第一极体以及少许胞质吐出。挑选直径15-20μm、折光性强、圆形、光滑的体细胞，用去核/注射针吸取一个供体细胞，从去核进针处将体细胞注射到透明带下的卵周隙内用注射针点压透明带，使供体细胞与受体卵胞质的细胞膜彼此紧密接触。每批25-30个卵母细胞，构建完成后，将供体细胞-卵胞质构成的细胞对(重构卵)转移到NCSU-23+4mg/mlBSA中，39℃、5%CO₂、100%湿度培养箱中修复1-2h。

3.4融合与激活

将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，用融合/激活液洗涤3遍后，每批5个放入已经铺满融合液的融合槽内，用拉制的且尖端很细的实心玻璃针拨动重组卵，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行用ECM2001融合仪施加一个30μs,，2.0kv/cm的直流电脉冲诱导融合同时激活，用NCSU-23%+4mg/mlBSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，39℃、5%CO₂、100%湿度培养0.5h～1h后取出，在体视显微镜下判定融合。

3.5胚胎培养

在开始显微操作前至少4h预先做好培养液滴，在超净台内取35mm细胞培养皿，做6-8个体积为30μL的液滴，小心加入2.5-3ml矿物油覆盖，做好标记后放入CO₂培养箱内平衡。将上述融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后转入液滴，每个30μL的液滴培养8-10个重构胚，培养48h和168h时记录卵裂和囊胚形成结果。

3.6胚胎移植

用公猪试情或者观察压背反应，挑选自然发情母猪，一般在构建克隆胚的当天，将在CO₂培养箱中培养12-30h的1-2细胞克隆胚取出，装入2.5ml细管内。用灭菌的锡箔纸包装好,做好标记，放到恒温运输箱中运到猪移植地点，用40-60ml（1mg/100kg体重）生理盐水溶解1-1.5mg硫喷妥钠和地西泮，耳静脉注射20ml，待受体猪初步麻醉后，将其抬到手术架上仰卧(青年后备母猪)或者侧卧(经产母猪)保定对后备母猪：在腹部下面第1对和第2对乳头之间，腹中线局部15×10cm²面积内清洁刮毛后先碘酒消毒，后酒精棉脱碘(对经产母猪：在腹部肷窝部15×10cm²的范围内清洁，刮毛碘酒消毒后酒精脱碘)在准备动刀切开腹中线之前，把前面余下的麻醉药再酌情注射20-30ml，沿腹中线切开一个长约8-10cm的口，打开腹腔，探进去一只手，取出卵巢后用润湿的灭菌脱脂纱布盖上(而对经产母猪：沿侧腹部做一个与腹中线面垂直的长约10cm的切口)在手术人员即将取出卵巢，调整好输卵管伞之际，将装在吸管内的胚胎取出放在热台上，体视显微镜下将胚胎装入移植管内，手术人员和胚胎移植人员相互协调，将移植管从输卵管伞部探入输卵管至少5cm大致到了壶腹-峡部结合处，一边推动注射器，以便外撤移植管移植后体视镜下观察胚胎是否仍滞留在移植管内，确认没有后，开始卵巢回位，术口缝合。胚胎移植后第10d肌肉注射800IUhCG，13d注射500IUPMSG。

实施例4转基因猪的分子鉴定和表达检测

提取克隆猪基因组，PCR扩增检测外源基因的整合。参见图10，上下游引物设计分别为：P1位于表达载体5’调控区；P2位于rhFST344的编码区，这种的引物组合避免了内源基因的干扰，在只有整合表达载体的克隆猪基因组中才能扩增到1187bp目的条带。扩增的结果如图11所示，八头克隆猪都都能扩增到和阳性对照大小一致的特异性条带，我们可以初步判断八头克隆猪都是整合了表达载体。

通过southern杂交我们进一步验证外源基因在克隆猪基因组中整合情况。分别取10ug的基因组DNA经限制性内切酶EcoRⅠ消化后，经低压电泳分离后转到膜上，用P9（F：5′-CCCAGGTGGAGAAATTCTGA-3′）和P0（R：5′-GAGCTGCCTGGACAGAAAAC-3）为引物以表达载体为模板PCR扩增合成DIG标记的探针进行southernblot杂交试验。以EcoRⅠ酶切的表达载体为阳性对照，杂交后阳性显示一条约4.1kb的条带，表明表达载体确实整合到克隆猪的基因组中。如图12所示，southern杂交与PCR鉴定的结果一致。

提取猪心、肝、脾、肺、肾、肝、舌、胃、脑、骨骼肌、睾丸、垂体以及小肠总RNA，RT-PCR检测外源Follistatin基因表达，图13结果显示只有在心肌，舌肌以及骨骼肌中转基因大量表达，由此可知表达载体具有很强的肌肉特异性表达能力。

Claims (5)

1.一种猪肌肉特异性表达Follistatin-317的表达载体，其特征在于，其序列如序列表SEQ：IDNO：1所示；所述表达载体的表达盒是猪内源性的skeletal-α-actin基因座与FST317编码cDNA融合而成，所述猪内源性的skeletal-α-actin基因调控区驱动FST317的表达；

所述表达载体包括，skeletal-α-actin基因5’侧翼序列、FST288编码DNA和skeletal-α-actin基因3’侧翼的序列；

所述FST288是以人FST344cDNA载体为模板通过PCR扩增得到的。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述skeletal-α-actin基因5’侧翼序列为skeletal-α-actin基因5’侧翼12kb的序列，skeletal-α-actin基因3’侧翼序列为skeletal-α-actin基因3’侧翼7.8kb的序列。

3.权利要求1-2任一所述表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将含有猪骨骼肌肌动蛋白的基因座抓捕到抓捕载体上；

2)将FST317基因加上抗性基因定点敲入到骨骼肌肌动蛋白的编码区；

3)通过Flpase介导的位点专一性重组将抗性基因删除，表达载体构建完成；

其中，步骤1中的抓捕载体是通过PCR分别扩增左右同源臂后插入到骨架载体构建而成；所述骨架载体为pBR322-loxp-neo-loxp，其中neo为新霉素抗性基因，在新霉素抗性基因上下游插入同向loxp可用于新霉素抗性基因的删除；

其中，步骤2中的抗性基因为zeocin抗性基因。

4.含有权利要求1-2任一所述的表达载体的转基因细胞系。

5.根据权利要求1-2任一所述的表达载体在制备转基因猪中的应用。