JP2003532364A

JP2003532364A - トリ始原生殖細胞（ｐｇｃ）細胞系とその長期間培養法

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Publication number: JP2003532364A
Application number: JP2000505275A
Authority: JP
Inventors: ドレオン、エフ、アベルポンス; ブラックウェル、キャサリン; ガオ、ザイウ、イイング; ロブル、ジェームズ、エム; スタイス、スチーブン、エル; ジェリー、ディ、ジョセフ
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-08-04
Publication date: 2003-11-05
Also published as: CA2300380A1; CN1195844C; AU8759398A; EP1616943A1; EP1007633A1; EP1007633B1; ES2252851T3; DE69831958T2; EP1007633A4; ATE307196T1; NZ502712A; WO1999006533A1; US20040226058A1; AU736087B2; DE69831958D1; CN1273600A; BR9811830A

Abstract

(57)【要約】トリＰＧＣを組織培養中で長期間維持するための培養系を提供する。この培養系は、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−ＩおよびＳＣＦを使用する。得られたＰＧＣは、トランスジェニックおよびキメラのトリ、特にニワトリまたは七面鳥を産生する上で有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）この発明は、トリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）、特にニワトリのＰＧＣを組織培養中
で長期間維持するための新しい方法を提供するものである。このようなＰＧＣは
、希望するＤＮＡ配列、例えばヒト遺伝子などを挿入するために利用することが
できる。これらの培養ＰＧＣ、およびそれから作成したトランスジェニックＰＧ
Ｃを利用して、キメラトリ、特にキメラニワトリを産生することができる。

【０００２】（発明の背景）近年、キメラ、クローンおよびトランスジェニック動物の産生に関する数多く
の研究が行なわれている。

【０００３】特に、家畜種のゲノム改良が積極的に進められており、過去２０年間に様々な
成功例が得られている。例えば、トランスジェニックなブタ、ウシ、およびニワ
トリを産生するために、このような研究が行なわれている。現在産生されている
トランスジェニック動物の大部分は、目的とする遺伝子を含有するＤＮＡ構築物
を単細胞の胚に直接マイクロインジェクションするという方法によって得られた
ものである。しかし、マイクロインジェクションの技術が成功したとしても、こ
のような方法はコストが高く効率も悪いことが多いという欠点をもつ。

【０００４】最近、「ノックアウト」マウスの産生のための胚幹（ＥＳ）細胞技術が成功し
たため、家畜種のＥＳ細胞および始原生殖細胞（ＰＧＣ）のための組織培養系を
開発する研究に焦点が当てられている。未分化のＥＳ細胞を連続培養として維持
することができれば、このような細胞をｉｎｖｉｔｒｏでトランスフェクトし
たり、理想的にはキメラ動物を産生するために発育中の胚の内部細胞塊に移す前
にトランスフェクトした細胞の中で希望の遺伝子を含有する細胞を選別したりす
ることが可能となる。理想的には、このようにして産生したキメラ動物のうち少
なくとも一部でよいから、生殖系列を通じてＤＮＡ構築物を分泌し、それによっ
てトランスジェニックな子孫を残すことができるのが望ましい。現時点では、他
の動物種の中に標的とするＤＮＡを組み込ませる技術はまだ限られている。しか
し、この分野における研究は進歩途上であり、遠からず認められるはずである。

【０００５】特に、キジおよびニワトリに関しては経済上かなりの重要性があるため、その
ゲノムを改良するための研究が盛んに行なわれている。３年前に、トランスジェ
ニックなニワトリを産生するための研究の進行状況をほぼ完全にまとめた総説が
発表された（Ｓａｎｇ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈ，１２：４１５−
４２０（１９９４））。これに述べられているように、トランスジェニックなニ
ワトリを産生するための方法として主に２種類の経路が検討されている。これら
の方法の相違は、ゲノムに操作を加える時期の違い、すなわち、産卵の前か後か
の違いである。後者の方法として、供与体のＥＳおよびＰＧＣを受容体の胚に移
すというものがある。さらに、どちらの経路の場合にも、目的とする遺伝子を含
有するレトロウイルスベクターによって供与細胞を感染させることで成功してい
る研究がほとんどである。

【０００６】最初のアプローチは、産卵の前にゲノムに操作を加えるというものだが、結果
はよくわからない、かつ／または無効なものであった。例えば、卵巣中の卵母細
胞の感染（Ｓｈｕｍａｎ，ａｎｄＳｈｏｆｆｎｅｒ，ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｔ
．，６５：１４３７−１４９４（１９８６））やプラスミドＤＮＡを加えた精子
のプレインキュベーション（Ｇｒｕｅｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍＳｕｐｐ．，１５：１９４（１９９１））は無効であり、繰り返されてい
ない。また、リポフェクションによる精子細胞のプラスミド構築物トランスフェ
クションが確認されている（ＳｑｕｉｒｅｓａｎｄＤｒａｋｅ，Ａｎｉｍ．
Ｂｉｏｔｅｃｈ．、４：７１−７８１９９３）。しかし、生殖系列による伝達
については報告されていない。

【０００７】また、胚盤中にＤＮＡを直接マイクロインジェクションした後胚を培養すると
いう手法も報告されており、生きたトランスジェニックなキメラトリが０．１％
の割合で発生し（Ｓａｎｇ，Ｗ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈ．，１
２：４１５−４２（１９９２））、１匹のトリがその子の３．４％にトランスジ
ーンを伝達する（Ｌｏｖｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６０−６
３（１９９４））という結果であった。これと同じアプローチがＮａｉｔｏら（
Ｊ．Ｒｅｐｒｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．，１０２：３２１−３２５（１９９４））によ
っても行われた。しかし、やはり生殖系列によるトランスジーンの伝達は報告さ
れなかった。

【０００８】２番目のアプローチは、産卵後にゲノムの操作を行なうもので、こちらの方が
良好な結果が得られている。産卵された卵に複製能のあるレトロウイルスベクタ
ーを注射することによって産生されたキメラトリでは、その子の１％から１１％
に生殖系列伝達が起こることが示されている（Ｓａｌｔｅｒら、ＩｎＭａｎｉ
ｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｖｉａｎＧｅｎｏｍｅ，Ｅｔｃｈｅｓ，
ＲＪら、編。１３８−１５０ページＣＲＣＰｒｅｓｓ（１９９３））。複製能
のないレトロウイルスベクターを用いて産卵された卵に注射する方法により、さ
らに有望な結果が得られており、８％の雄のキメラトリが発生し、２〜８％の頻
度でベクターを子に伝達した（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３
：５３５−５３５（１９８９））。

【０００９】しかし、トランスフェクションを促進することで知られた物質の存在下でプラ
スミド構築物を産卵された卵に注射するという試みは、安定して組み込まれた構
築物あるいはトランスジェニックなトリを産生することができずに失敗した（Ｒ
ｏｓｅｎｂｌｕｍａｎｄＣｈｅｎｇ，Ｊ．，ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍＳ
ｕｐｐ．，１５Ｅ２０８（１９９１））。一般に、トランスジェニックなニワト
リを産生するためにレトロウイルスベクターを使用するという手法には多大な欠
点があるため、あまり広く行なわれていない。その欠点とは、安定して導入され
ることのできるクローニング挿入配列の大きさには制限があることであり、さら
に重大な欠点は内在するウイルス遺伝子座または他のトリ白血病ウイルスとの間
で組み替えを起こす可能性があるということである。

【００１０】このような方法のすべてに伴って起こる重大な問題は、ニワトリのＥＳおよび
ＰＧＣのための長期間培養系を確立するのが比較的困難であるという事実である
。発明者の知る限りでは、トリＰＣＧを培養してキメラトリの産生に成功した例
の最長培養期間は５日未満であると思われる。

【００１１】以前のＰＧＣ培養法では、増殖因子、特にＬＩＦまたはＩＧＦ−１が使用され
ていた。しかし、前述のようにこのような方法によっては長期間の培養を行なう
ことができず、トランスジェニックＰＧＣの産生を容易にできるであろうと考え
られるため共通の懸念となっている。

【００１２】長期間培養を達成する上での問題点はあるが、ＥＳおよびＰＧＣの両方の細胞
を使用して、複製能をもつ、あるいはもたないレトロウイルスベクターによって
これらの細胞を感染させることによりキメラを産生することに成功している。さ
らに、上述のように、採取した直後の胚盤葉細胞を受容体である胚に注射するこ
とにより、キメラ生殖腺をもつトリを産生することができた（Ｃａｒｓｉｅｎｃ
ｅら、Ｄｅｖｅｌ．、１１７：６６９−６７５１９９３））。胚盤葉細胞はリ
ポフェクションによって効率よくトランスフェクトされ、その後受容体である胚
に移すことができる。しかし、トランスフェクトした細胞の生殖系伝達について
は報告されていない。

【００１３】また、Ｐａｉｎら、Ｄｅｖｅｌ．，１２２：２３２９−２３９８（１９９６）
は最近、胚盤葉細胞から採取した推定上のニワトリＥＳ細胞の存在を確認してい
る。彼らはさらに、これらの細胞のＥＳの表現型を失うことなく（マウスＥＳ細
胞に対するモノクローナル抗体によって定義）３５代目まで培養中で確実に維持
することができた、と報告した（Ｉｄ．）。これらの細胞は一見、トリ胚への伝
達によってＰＧＣに発育し、生殖腺中に定着するように見える。しかし、彼らは
これらの細胞が本当にＥＳ細胞であるかどうか明確には実証しなかった。

【００１４】マウスのＥＳモノクローナル抗体がニワトリのＥＳ細胞との間に交差反応性を
有することは、種を越えたＥＳ受容体の保存を主張する上で有利な証拠となるか
もしれない。また、これらの研究者は７日目の培養胚盤葉細胞を注射することに
よって２羽のニワトリを産生することにも成功しているため、彼らの系の中にＥ
Ｓ細胞が存在したことが示唆されるとの主張があるかもしれない。しかし彼らは
、自分達の複雑な培養系の中にＰＧＣが存在していたという可能性を除外しなか
った。したがって、この長期ＥＳ培養系に関しては多能性および生殖系列伝達に
ついてのさらなる検討を行なうべきである（Ｉｄ．）。

【００１５】ＥＳ細胞を産生するためのもう１つの経路は、ＰＧＣである。ＰＧＣを分離し
供与体から受容体の胚に移すための手法が開発され、キメラニワトリの産生に成
功し、供与体の遺伝子型が生殖系列によって伝達された（Ｖｉｃｋら、Ｌｏｎｄ
ｏｎＳｅｒ．Ｂ，２５１：１７９−１８２（１９９３）、Ｔａｊｉｍａら、Ｔ
ｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４０：５０９−５１９（１９９３））。さらに、
ＰＧＣを凍結保存し、後に解凍してキメラトリの産生に成功した例もある（Ｎａ
ｉｔｏら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．，１０２：３２１−３２５（１９
９４））。しかし、この系は非常な労力を要し、胚１個当たり平均でわずか５０
〜８０個のＰＧＣしか得られない。レトロウイルスベクターによってＰＧＣを感
染させる手法も報告されている。しかし、現時点では、トランスフェクトしたＰ
ＧＣの選別を容易にするためにＰＧＣを培養中で長期間生育させることには成功
していない。したがって、上述のように、ＰＧＣを培養するための改良法に対す
る本分野での需要が非常に高いのは明らかである。

【００１６】（発明の目的）この発明の目的は、これまでに知られている技術の問題点を解決することであ
る。

【００１７】この発明の具体的な目的は、トリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）を組織培養中で長期
間培養するための新しい方法を提供することである。

【００１８】この発明のさらに具体的な目的は、キジ目、特にニワトリの始原生殖細胞（Ｐ
ＧＣ）を組織培養中で長期間培養するための新しい方法を提供することである。

【００１９】この発明の別の目的は、組織培養中で長期間培養したトリ始原生殖細胞を利用
してキメラのトリ、望ましくは家禽、そして最も望ましくはニワトリまたは七面
鳥を産生することである。

【００２０】この発明の別の目的は、組織培養中で長期間培養したトリ始原生殖細胞の中に
希望する核酸配列を導入することである。

【００２１】この発明のさらに別の目的は、培養中で長期間維持したトリ始原生殖細胞に希
望する核酸配列を導入し、それを利用してトランスジェニックなキメラトリ、望
ましくはトランスジェニックなキメラニワトリまたは七面鳥を産生することであ
る。

【００２２】この発明のさらに別の目的は、このようなトランスジェニックキメラトリ、望
ましくはキジ目、そして最も望ましくはニワトリを利用して、それに導入した細
胞中に含まれる核酸配列によりコードされる異種蛋白質を産生することである。
このような蛋白質は、トランスジェニックなキメラトリ、特にトランスジェニッ
クなキメラニワトリの卵から回収するのが望ましい。これとは別に、このような
蛋白質をキメラトリから直接採取する、例えば血液やその他の組織から分離する
等の手段も可能である。

【００２３】（発明の簡単な説明）前述のように、この発明はトリ（ニワトリ）の始原生殖細胞（ＰＧＣ）を組織
培養中で長期間、すなわち最低１４日間、さらに望ましくは最低２５日間、そし
て理想的には無限に維持するための新しい方法を提供するものである。

【００２４】この発明以前には、トリＰＧＣを約５日間以上維持するための組織培養中で維
持する方法は報告されていない（キメラトリの産生能によって実証）。この発明
の発明者は、慎重な研究を重ねた結果、少なくとも以下の増殖因子：白血病阻止
因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ
）およびインシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）を含有する培養液を使用するこ
とによりトリ始原生殖細胞、特にニワトリの始原生殖細胞を長期間、すなわち最
低１４日間にわたって、そして組織培養中ではさらに長期間にわたって維持し増
殖させ得るという驚くべき事実を発見した。さらに、このようにして得られたＰ
ＧＣはキメラニワトリを産生す上で有用であることも実証された。

【００２５】また、これらのＰＧＣはトランスジェニックなトリＰＧＣを産生するためにも
有用であるはずで、それによってトランスジェニックなキメラトリを産生するこ
とが可能である。このようなトランスジェニックキメラトリは、異種蛋白質の回
収のために有用であると思われ、このようなキメラトランスジェニックトリの卵
から直接回収できるのが望ましい。例えば、このようなトリは治療用に使用する
蛋白質や他のポリぺプチドを産生し回収するために利用できる。

【００２６】（発明の詳細な説明）このように、この発明はトリＰＧＣを組織培養中で５日間以上維持できなかっ
たこれまでのＰＧＣ培養方法に伴う問題点を解消するものである。特に、この発
明の発明者は、以下に示す４種類の増殖因子を少なくとも含有する培養液を使用
することによって、トリＰＧＣ、望ましくはキジ目のＰＧＣ、そして最も望まし
くはニワトリのＰＧＣが組織培養中で長期間、すなわち最低１４日間、さらに望
ましくは最低２５日間、そしてさらに長期間にわたって維持することが可能であ
る、という驚くべき事実を発見した：白血病阻止因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インシュリン様増殖因
子（ＩＧＦ−Ｉ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）。

【００２７】全般的に、今回の培養方法は以下の工程から成るものである：（ｉ）供与体であるトリ胚からＰＧＣを分離する；そして（ｉi）このようにして分離したトリＰＧＣを、その増殖を長期間、すなわち最
低１４日間、組織培養中で促進するために有効な量のＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ
およびＩＧＦ−Ｉを含有する培養液中で培養する。長期間とは、先に定義したよ
うに１４日間以上の培養期間をさす。

【００２８】供与体であるトリ胚から始原生殖細胞を分離するための方法は文献中に報告さ
れており、本分野の専門家であれば容易に実施することができる（例えば、１９
９３年９月７日発行ＪＰ９２４９９７、公開第０５−２２７９４７号；Ｃｈａ
ｎｇら、ＣｅｌｌＢｉｏｌ．Ｉｎｔ．，１９（２）：１４３−１４９（１９９
２）；Ｎａｉｔｏら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．，３９：１５３−１
６１（１９９４）；Ｙａｓｕｄａら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．，９６：５
２１−５２８（１９９２）；およびＣｈａｎｇら、ＣｅｌｌＢｉｏｌ．Ｉｎｔ
．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，１６（９）：８５３−８５７（１９９２）を参照。これら
はすべて参考文献中にその全体を記載する）。

【００２９】この発明の発明者は、約５３時間インキュベートしたニワトリ卵（胚発育の１
２−１４期）からトリＰＧＣを分離し、そこから胚を除去し、その背側大動脈か
ら胚血液を採取した後、適切な細胞培養培地（Ｍ１９９培地）に移すという方法
をとった。次にこのＰＧＣをフィコール密度遠心によって精製し、増殖因子を含
有する本発明の培養培地１０μｌ中に再懸濁した。しかし、上述のように、ＰＧ
Ｃを分離するための方法は他にも知られており、別の様々な手段を用いることが
できる。

【００３０】次に、分離したＰＧＣを計測し、手作業で分離する（例えばピペットを使用し
て）。その後、これらの複数のトリ胚から採取したＰＧＣを集め（ＰＧＣの数を
増やすため）、増殖因子を含有する本発明の培地中でインキュベートする。

【００３１】以後「完全」培地と呼ぶこの培養液は、ＰＧＣおよび胚幹細胞用の培地に一般
に含まれる成分と共に、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦおよびＩＧＦ−Ｉを含有する
。具体的には、本発明の「完全」培地は、よく知られた市販の細胞増殖用培地で
あるα−ＭＥＭに上記の４種類の増殖因子を添加し、１０％のウシ胎児血清、２
ｍＭのＬ−グルタミン、０．５６％の抗生物質／抗真菌剤、３４．５６ｍＭの２
−βメルカプトエタノール、１．０Ｕ／μｌのＬＩＦ、４０．０ｐｇ／μｌのｂ
ＦＧＦ、６０．０ｐｇ／μｌのＩＧＦ−Ｉおよび８０．０ｐｇ／μｌのＳＣＦを
含有するのが望ましい。

【００３２】現時点までに実施された実験に基づき、この濃度がこれらの増殖因子の濃度と
して適当であると考えられる。しかし、以下に述べるように、これらの増殖因子
の量は組織培養中で維持されるＰＧＣにより変動する可能性がある。特に、これ
らの増殖因子のそれぞれの量を増やしても悪影響が出ないことが知られている。
さらに、例えば他のトリのＰＧＣを培養する際などには、この最適量を変更して
もよい。

【００３３】既に述べたように、この発明の発明者は基本培地として、よく知られた市販の
組織培養用培地α−ＭＥＭを使用した。しかし、これら４種類の必須増殖因子が
存在していれば、別の培地を使用してもかまわない。申請者は特に、ウシ胎児血
清には未特定の、および変動しやすい成分が含まれているため、今回の「完全」
培地からウシ胎児血清を除いて改良しようと試みている。

【００３４】また、申請者は支持細胞を使用せずにＰＧＣを培養したが、支持細胞も有用で
はないかと考えている。特に、線維芽細胞、望ましくはトリの線維芽細胞、そし
て最も望ましくはキジ目の線維芽細胞（さらに望ましくはニワトリの線維芽細胞
）を使用することによって、４種類の増殖因子が存在していれば、ＰＧＣを組織
培養中で維持することができると思われる。さらに、これらの増殖因子をコード
する遺伝子によってこの支持細胞をトランスフェクトすることにより、培養の間
にこれらの増殖因子を外部から添加する必要性を消失させることができるかもし
れない。この細胞がこれら増殖因子の恒久的な供給源になると考えられる（この
ためには、これらの増殖因子の遺伝子とその分泌を起こす配列を強力な構成プロ
モーターの制御下に置き、それによってこれらの増殖因子が培養ＰＧＣに供給さ
れるようにすればよい）。

【００３５】既に述べたように、これらの因子の量とは、トリＰＧＣ、望ましくはキジ目の
ＰＧＣ、そして最も望ましくはニワトリまたは七面鳥のＰＧＣを組織培養中で長
期間培養することができる量のことである。

【００３６】これら増殖因子の量は以下の範囲内であることが望ましい：

【００３７】ＬＩＦは０．１Ｕ／μｌから１００．０Ｕ／μｌ、より望ましくは１．０から
１０．０Ｕ／μｌ、そして最も望ましくは１．０から２．０Ｕ／μｌ；

【００３８】ＩＧＦ−Ｉは６．０ｐｇ／μｌから６０００．０ｐｇ／μｌ、より望ましくは
重量で６０．０ｐｇ／μｌから６００．０ｐｇ／μｌ、そして最も望ましくは６
０．０ｐｇ／μｌから１２０．０ｐｇ／μｌ；

【００３９】ＳＣＦは重量で８．０ｐｇ／μｌから８０００ｐｇ／μｌ、より望ましくは８
０．０ｐｇ／μｌから重量で８００．０ｐｇ／μｌ、そして最も望ましくは８０
．０ｐｇ／μｌから１６０．０ｐｇ／μｌ；および

【００４０】ｂＦＧＦは４．０ｐｇ／μｌから４０００．０ｐｇ／μｌ、より望ましくは重
量で４０．０ｐｇ／μｌから４００．０ｐｇ／μｌ、そして最も望ましくは４０
．０ｐｇ／μｌから８０．０ｐｇ／μｌ。

【００４１】上記の範囲の中で、上限は本発明にとって決定的に重大なものではなく、主に
コストよって決まる（増殖因子の製造には高額の費用がかかるため）。

【００４２】しかし、例えばα−ＭＥＭを他の増殖用培地に変えたり他の種類のトリＰＧＣ
を培養したりするような場合には、これらの推奨範囲が変動する可能性がある。

【００４３】既に述べたように、これらのＰＧＣを培養中で長期間維持することができ、キ
メラトリの産生に成功している。現時点では、約４ヵ月間にわたって細胞を組織
培養中で維持しており、見かけ上悪影響はないようである。また、２５日間まで
培養した細胞がトリ胚生殖腺を効率よく定着させキメラトリを産生し得るかどう
かの検討も行なっている。しかし、キメラトリの産生能を保持したままこれらの
細胞を無期限に培養できることが期待される。

【００４４】キメラを産生するために使用する方法は、先に述べたこれまでの技術によって
証明されており、この分野ではよく知られている。以下の例の中で公開する方法
に従って受容体であるトリ胚中にＰＧＣを移すのが望ましい。その後、生殖腺中
におけるＰＧＣの移動および定着、ＰＧＣ表現型の保持に基づいて、あるいは孵
化および繁殖の後に生殖腺中に供与体のＰＧＣが存在するかどうか探すことによ
って、キメラ産生に成功したかどうか評価する。

【００４５】今回の例において発明者は、体色に影響を及ぼすため追跡が容易な表現型を選
択した。供与体のトリは白色のブロイラー種、受容体のトリは羽毛の黒い鳥であ
り、それぞれ特異的な遺伝子型を有していた。キメラと推定される鳥は黒色の羽
毛であり、黒色の鳥と交配した時に黒色／白色の子が生まれた。キメラと推定さ
れる鳥と別の黒色の鳥とを交配した後、黒色／白色の子が生まれたことによって
、キメラの産生が成功したことが実証された。

【００４６】第２の戦略として、横縞ロック鳥を受容体として用い、白色の羽毛をもつ鳥を
供与体として用いた。一部横縞の羽毛をもつ白色の子が生まれたことに基づき、
キメラと推定される鳥の確認を行なった。

【００４７】しかし、本発明の方法は、キメラ形成によって希望するあらゆる特徴を導入す
るために応用できるはずである。これはもちろん、移したＰＧＣの遺伝子型の特
性に依存するであろう。

【００４８】既に述べたように、培養中で長期間維持できる本発明のＰＧＣの重要な応用分
野は、キメラトリの産生である。これは、希望するＤＮＡ配列を培養したＰＧＣ
に導入することによって可能となる。受容体細胞の中にＤＮＡを導入するための
手段はよく知られており、リポフェクション、トランスフェクション、マイクロ
インジェクション、トランスフォーメーション、マイクロプロジェクト技術など
多くの手法がある。特に、本発明の発明者は、リポーター遺伝子を含有するベク
ターを導入するための手段としてまずリポフェクションを選択した。しかし、一
時的にトランスフェクトされたＰＧＣは産生されたが、安定してトランスフェク
トされている細胞株は現時点ではまだ分離されていない。しかし、本発明のＰＧ
Ｃを利用して既知の技術を用いることにより、これが可能となることが期待され
る。

【００４９】トリにおいて操作が可能な配列の制御下で、希望する遺伝子、例えば治療用ポ
リペプチド、増殖因子、酵素などをコードするＤＮＡを導入するのが望ましい。
このような制御配列は、真核生物由来、最も望ましくはトリ、例えばニワトリの
制御配列であることが望ましい。トリ細胞において操作可能なプロモーター、例
えばトリ遺伝子またはウイルスに由来するプロモーターは、本分野においてよく
知られている。

【００５０】最初に、希望する蛋白質を産生する安定した細胞系を分離し、キメラ産生のた
めに利用する。また、挿入したＤＮＡを含む細胞をより簡単に識別するために、
導入するＤＮＡには発現が容易に検出できるマーカーＤＮＡが含まれていること
が望ましい。このように選別可能なマーカーはよく知られており、β−ラクタマ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどが挙
げられる。

【００５１】このようにして得られたトランスジェニックＰＧＣをトリ胚中に注射すること
によって、トランスジェニックなキメラトリが得られる。次に、希望する蛋白質
をこれらのトランスジェニックなトリの卵から回収し、それによって蛋白質の連
続供給源を得ることが望ましい。これとは別に、例えば、全身循環系から分離す
るなど、キメラトリから直接蛋白質を回収することも可能である。

【００５２】（例）以下に記載する実験においては、次の材料および方法を使用した。

【００５３】（材料および方法）（動物）白色の（Ｅ／ＥおよびＩ／Ｉ）ブロイラー型のニワトリをＰＧＣの供与体とし
て用い、長期間ＰＧＣ培養系を開発した。受容体の胚として優性の黒色羽毛（Ｅ
／−およびｉ／ｉ）ニワトリ系統と横縞（Ｅ／Ｅおよびｉ／ｉ）ロック系統の２
種類を鳥を使用した。白色ブロイラー（ＷＢ）型のＰＧＣを注射した優性の黒色
鳥をＥ／−（ＷＢ）と表し、白色ブロイラー型のＰＧＣを注射した横縞ロック鳥
をＢＲ（ＷＢ）とする。

【００５４】（ＰＧＣの抽出）ＰＧＣ抽出のために、第１３〜１４期の胚を選択した。ＰＧＣは、Ｎａｉｔｏ
ら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３７：１６７−１７１（１９９４）の報
告に従い、細いマイクロピペットを用いて背側大動脈から採集した。２０個の胚
から採取したＰＧＣを、１０％ウシ胎児血清添加Ｈａｎｋｓ溶液中に集め、フィ
コール密度勾配遠心によって濃縮した（Ｎａｉｔｏら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．
Ｄｅｖ．，３９：１５３−１７１（１９９４））。ＰＧＣの計数を行ない、ＰＧ
Ｃが１滴（１０μｌ）当たり約１００個になるよう培養液（ＤＭＥＭ、種々の量
の増殖因子を含有）１滴（１０μｌ）中に懸濁した。培養液の水滴の上に滅菌し
た白色鉱物油を重層した。

【００５５】（受容体胚へのＰＧＣの注射）第１４〜１５期の胚を受容体胚として使用した。卵を適当な表面上に置いた後
、発育中の胚が自然に静止卵の上側に来るまで放置した。細い鉗子によって、卵
殻に約１０ｍｍ以下の小さい「窓」を開けた。抗生物質４％添加したリン酸緩衝
液を添加しながら、胚を表面近くにもってきた。胚の心臓が見えるようになるま
で発育させると、辺縁静脈および／または背側大動脈が容易に識別できた。０．
０４％トリパンブルーを含有する培地２μｌ中に懸濁した２００個の供与体ＰＧ
Ｃをマイクロピペット中に入れた。ＰＧＣを受容体胚の背側大動脈中に注射した
。不活性の細胞染料であるトリパンブルーによって、ＰＧＣ懸濁液が注入される
様子を見ることができた。注射の後、卵殻の開口部を外科用テープで閉じ、パラ
フィンで補強した。加湿ＣＯ２インキュベーター中で２４時間卵を監視した後、
通常のインキュベーターに移して孵化させた。

【００５６】（ＰＧＣの生体蛍光染色）ＰＧＣ注入の成否かつ／または生殖腺への移動能について評価するために、Ｐ
ＧＣをＤｉＩ蛍光染料によって染色した。注入してから２４時間後に胚を採取し
、ぺトリ皿上に置いて、表面蛍光分析装置を取り付けた倒立顕微鏡下で観察した
。

【００５７】（ＰＧＣの培養条件）各種濃度のヒト白血病阻止因子（Ｌｉｆ）、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（
ｂＦＧＦ）、ヒトインシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）およびヒト幹細胞因子
（ＳＣＦ）を用いて検討した。同様に、マイトマイシン処理したニワトリ線維芽
細胞およびマウスＳＴＯ細胞による支持層の検討も行なった。

【００５８】（ＰＧＣ長期間細胞培養のための培地）以後の実験で使用した完全細胞培養液の組成は次のとおりであった：α−ＭＥ
Ｍ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ｃａｔ＃１
２−１６９Ｆ）、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，Ｃ
ａｔ＃３００７０．０３）、２ｍＭＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ，ＭＯ，Ｃａｔ＃Ｇ７５１３）、０．４８％抗生物質／抗真菌剤（Ｓｉｇｍ
ａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｃａｔ＃Ａ７９７２）、１３２μＭ２βメルカプ
トエタノール（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ，Ｃａｔ
２１９５−０２３）、０．００６２５Ｕ／μｌの白血病阻止因子（ＬＩＦ）、
０．２５ｐｇ／μｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、０．５６２５
ｐｇ／μｌのインシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）および４．０ｐｇ／μｌの
幹細胞因子（ＳＣＦ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＬＩＦ、
ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−ＩおよＳＣＦの各Ｃａｔ＃１９９９−０１、１２０８−００
、ＦＧ１２１１−１および１８３３−０１）。培地の交換は１日おきに行ない、
５μｌの培地を除去して２倍濃度の新しい培地を５μｌ添加した。連続培養にお
いてある程度の期間が経過すると増殖因子が不安定になると推測して、このよう
な手順をとった。しかし、実際の結果は、増殖因子の濃度が２倍になっている。
このため、最終培地には以下の濃度の増殖因子が含まれている：白血病阻止因子
（ＬＩＦ）０．０１２５Ｕ／μｌ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）０．
５ｐｇ／μｌ、インシュリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）１．１２５ｐｇ／μ
ｌおよび幹細胞因子（ＳＣＦ）８．０ｐｇ／μｌ。ここに記載する濃度範囲の増
殖因子は、連続培養においてＰＧＣの維持および増殖を促進する。さらに、上記
の濃度においてもこれらの細胞は生存し増殖し得ることが後から明らかになった
。（また、上述の培地において増殖因子を変更できることも後から明らかになっ
た。特に、上に述べたように、始原生殖細胞培養を維持するために特に適してい
る培養液は、上記と同様の成分であり、ＬＩＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＳＣＦおよびｂＦ
ＧＦの量が以下のものである：ＬＩＦ：１．０ｕｎｉｔ／μｌｂＦＧＦ：４０．０ｐｇ／μｌＳＣＦ：８０．０ｐｇ／μｌＩＧＦ−Ｉ：６０．０ｐｇ／μｌ。）

【００５９】このような培養条件を用いると、ＰＧＣは採取後３〜４日以内に大きく、集密
状態の、緩く付着した細胞集塊を形成する（集塊の中には数百個の細胞を含むも
のもある）ことが明らかになった。７日目の終わりには、集塊の中に死細胞が多
数存在するようになり、細胞破片がその周囲を取り囲む。ＰＧＣ集塊は４週間ま
で生存し、単層細胞となる。１，２および３週間後に集塊を解離させ、生体染料
ＤｉＩによって染色した後、受容体である胚に移した。３時点の細胞はいずれも
、一部の受容体胚の生殖腺中で検出された。細胞の数と、生殖腺中で染色したＰ
ＧＣが見られた胚の数は、ＰＧＣ培養の経過日数に反比例していた。

【００６０】（受容体胚へのＰＧＣの注入）ＰＧＣ注入のために、解剖顕微鏡下で受容体である卵を水平に置いた。卵の内
圧を下げ漏出を防ぐために、卵の気室に小さい穴を開けた。卵の側面に１０ｍｍ
の窓を開け、胚が卵殻の窓の高さよりもやや低い位置に上がって来るまで、穴か
ら４％抗生物質／抗真菌剤を添加したＰＢＳ〜１ｍｌを注射した。ＰＧＣを注射
するために３０μｍのピペットを傾け、マイクロフォージを用いて研いたエッジ
により細かい点ができるよう引っ張った。以下の記載に従って解離させた、胚１
個当たり２００個の注入用ＰＧＣをニードルピペットおよび吸引チューブを用い
て手作業で吸引した。注入の前にピペットの中で、ＰＧＣをトリパンブルー染料
の０．０４％溶液と混合した。胚当たりの総注入容積は２μｌであった。最終段
階として、受容体である胚の辺縁静脈の位置が見えるように置き換えた。ＰＧＣ
の入ったニードルピペットを挿入し、内容物を注意深く押し出した。ニードルピ
ペットを数秒間そのままの位置に置いた後、取り出した。受容体である卵を２重
にした外科用テープでふさぎ、その後全面にパラフィンワックスを塗布した。受
容体卵を回転式インキュベーターの中に戻し、孵化までインキュベートした。

【００６１】（ＰＧＣ表現型の評価）ニワトリのＰＧＣは過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）に陽性であり、アルカリ
性ホスファターゼにも陽性であると言われている。しかし、ニワトリのＰＧＣが
後者に陽性であることの確実な証拠は得られていない。ニワトリＰＧＣの特徴解
析のために代わりとなる酵素法または分子マーカー法はないため、細胞を受容体
胚中に注入し発育中の胚の生殖腺にそれらが存在するかどうか評価することによ
って表現型の分析を行なった。この方法では、受容体胚に注入する前に、１００
μｇ／ｍｌのＤｉＩを添加したα−ＭＥＭ培地中で培養し、すすぎを行なう必要
があった。注入してから２４時間後に受容体胚を取り出し、倒立顕微鏡下に置い
た。生殖腺中にＤｉＩで標識した細胞が観察されれば、ＰＧＣの生殖腺への移動
が成功したと解釈でき、ＰＧＣの特徴が保持されたことが確認できる。ＰＧＣ表
現型の保持について評価するためのもう１つの方法として、受容体胚を孵化させ
、生育させた後、生殖腺中に供与体のＰＧＣが存在するかどうか検討するという
手段も採用した。

【００６２】（ＰＧＣ評価のための交配方法）２種類の交配方法を用いた。第１の方法では、受容体としてｉ／ｉ、Ｅ／Ｅ、
ｓ／ｓ、ｂ／ｂの遺伝子型をもつ可能性のある黒色羽毛の鳥を用い、供与体とし
てＩ／Ｉ、Ｅ／Ｅ、Ｓ／Ｓ、Ｂ／Ｂの遺伝子型をもつ白色羽毛のブロイラー型の
鳥を用いた。受容体の動物がキメラであることを証明するため、すなわち生殖腺
中に自身のＰＧＣと供与体のＰＧＣが含まれることを証明するために、純血の黒
色羽毛鳥と交配した。生まれた子のすべてが黒色羽毛であれば、その動物はキメ
ラではないと推定される。しかし、一部黒色羽毛斑のある白色羽毛の子が少数で
も生まれた場合には、受容体動物はキメラであると考えられる。第２の方法は、
横縞ロック鳥を受容体胚として使用し、供与体はやはり白色羽毛のブロイラー型
鳥を使用するというものであった。後者の場合、キメラと推定される鳥を純血の
横縞ロック鳥と交配し、一部横縞羽毛のある白色羽毛の子が生まれればキメラト
リであることが確認される。キメラと推定される各鳥から生まれた５０羽の子に
ついて、キメラであるかどうかの結論を下した。

【００６３】（子の検査）キメラと推定されるＥ／−（ＷＢ）鳥をＷＢ鳥と交配した結果、供与体（ＷＢ
）のＰＧＣに由来するものであれば純血種の白色鳥が発生し、（Ｅ／−）ＰＧＣ
に由来するものであれば黒色斑のある白色羽毛鳥が発生した。同様に、ＢＲ（Ｗ
Ｂ）をＷＢ鳥と交配した場合、供与体（ＷＢ）ＰＧＣに由来するものであれば純
血の白色鳥が発生し、（ＢＲ）ＰＧＣに由来するものであれば白色斑のある黒色
鳥が発生した。キメラと推定されるＢＲ鳥の間での交配も行なった。この場合、
（ＷＢ）ＰＧＣ同士で受精した結果白色のニワトリが発生し、（ＢＲ）ＰＧＣ同
士の受精の結果は黒色のニワトリが発生した。黒色斑のある中間の白色羽毛鳥が
発生したのは、（ＢＲ）ＰＧＣを（ＷＢ）ＰＧＣと受精させた場合のみであった
。

【００６４】（２５日以上の長期間培養）連続培養が２５日間以上経過すると、ＰＧＣの集塊は速やかに広がる単層を形
成する。この細胞単層は、平坦な付着基部とゆるい集塊、および表面上のＰＧＣ
様細胞の鎖をもつ。これらの細胞単層の一部は、ＰＡＳ陽性であり続ける。これ
らの単層から採取したＤｉＩ染色細胞を、受容体である胚に移した。生殖腺中に
少数の細胞が局在する胚もいくつか存在した。細胞単層の継代は成功している。
一般に、これらの細胞は３〜５回の継代を重ねることができ、その後増殖速度が
遅くなり、老化し、線維芽細胞の様相を呈するようになる。連続培養において約
４ヶ月間、多数の継代を行なっても見かけ上分化することなく増殖し続ける細胞
系は少ししか存在しない。

【００６５】単層から採取した２種類の細胞系、Ｐ１０２８９６およびＰ１１０５９６を凍
結保存した。前者は見かけ上分化せず、アルカリ性ホスファターゼに対してわず
かに陽性を示したが、後者はニューロン細胞の形態を示し、アルカリ性ホスファ
ターゼに対して強い陽性であった。ここに述べたＰＧＣ単層は、分化全能性およ
び多能性に関するさらなる特徴づけを行なう必要がある。

【００６６】（結果の要約）採取直後および凍結保存したＰＧＣから、キメラニワトリが発生した。採取直
後のＰＧＣを注入することによって産生したキメラニワトリと推定される３４羽
のうち２５羽（７４％）が、子の検査の後、真のキメラ動物であることが証明さ
れた。凍結保存したＰＧＣの注入によって産生したキメラトリと推定される３４
羽のうち３０羽（８８％）が、真のキメラニワトリであることが実証された。ど
の場合も最低４０羽の子が生まれ、受精させた供与体ＰＧＣの数はキメラトリ１
匹当たり１．４％から１００％の範囲であり、大半は３０％から６０％の範囲で
あった。後者は注入後に生殖腺に移動したＰＧＣの数を反映するものであると考
えると、１回の注入当たりの成功の範囲は変動が大きかったと言える。しかし、
受容体の生殖腺中で定着するＰＧＣの数に影響を及ぼす別の機序が働いた可能性
もある。本研究では、このような機序についての検討は行なわなかった。また、
平均すると、キメラトリの子の雌雄比に有意な変化は認められなかった。

【００６７】（ＰＧＣの培養条件）本研究では、支持細胞層によってＰＧＣの長期間培養条件が改善されることは
なかった。どの増殖因子も、研究に用いたいずれの濃度においても、単独ではＰ
ＧＣをｉｎｖｉｔｒｏで分化させることなく維持させることはできなかった。
２種類および３種類の増殖因子の組み合わせについても検討したが、ほとんど成
功しなかった。我々の結果に基づき、ＰＧＣの長期間培養のためには前述の４種
類の因子すべて（ＬＩＦ、ＢＦＧＦ、ＩＧＦ−ＩおよびＳＣＦ）が必要であると
考えられる。我々は引き続き上述の増殖因子の濃度および組み合わせを変えて検
討を行なっており、ＰＧＣの長期間培養のために最良と思われる条件を模索して
いる。ＰＧＣのＤｉＩ染色から、我々の培養条件下において、１４日目の連続培
養から採取したＰＧＣが注入後に受容体胚の生殖腺に移動することが認められた
。また、２５日間培養中で維持したＰＧＣを３個の受容体胚中に注入した。これ
らの胚のうち１個は、子の検査によりキメラであることが判明した。

【００６８】（長期間培養条件下でのＰＧＣ表現型）ＰＧＣを採取した後、その大きさと細胞質中の油滴の存在とによって確認する
。採取後約４８時間でＰＧＣは互いに凝集し、集塊のサイズおよび集塊のトリプ
シン分解後に観察される細胞数とが増えることから、分裂を開始することが証明
される。集塊を形成するＰＧＣだけが生存し、他はすべて死ぬ。一般に、１００
個のＰＧＣから培養を開始すると、７日間以内に平均６００〜８００個のＰＧＣ
となる。明らかに分裂するＰＧＣが存在するが、効率のよい割合ではない。しか
し、既に述べたように、これらのＰＧＣは生殖腺に移動する能力を維持している
。

【００６９】（２５日以上の長期間培養）連続培養が２５日間以上経過すると、ＰＧＣの集塊は速やかに広がる単層を形
成する。この細胞単層は、平坦な付着基部とゆるい集塊、および表面上のＰＧＣ
様細胞の鎖をもつ。これらの細胞単層の一部は、ＰＡＳ陽性であり続ける。これ
らの単層から採取したＤｉＩ染色細胞を、受容体である胚に移した。生殖腺中に
少数の細胞が局在する胚もいくつか存在した。細胞単層の継代は成功している。
一般に、これらの細胞は３〜５回の継代を重ねることができ、その後増殖速度が
遅くなって老化し、繊維芽細胞の様相を呈するようになる。連続培養において約
４ヶ月間、多数の継代を行なっても見かけ上分化することなく増殖し続ける細胞
系は少ししか存在しない。

【００７０】単層から採取した２種類の細胞系、Ｐ１０２８９６およびＰ１１０５９６を凍
結保存した。前者は見かけ上分化せず、アルカリ性ホスファターゼに対してわず
かに陽性を示したが、後者はニューロン細胞の形態を示し、アルカリ性ホスファ
ターゼに対して強い陽性であった。ここに述べたＰＧＣ単層は、分化全能性およ
び多能性に関するさらなる特徴づけを行なう必要がある。

【００７１】特に、上記４種類の増殖因子を使用して最低２５日間培養したＰＧＣは、生殖
腺にうまく定着してキメラニワトリを発生させ得ることが示された。また我々は
、ＰＣＧ細胞を培養中で４ヵ月間まで維持している。このような長期間培養であ
っても、目的とするＰＧＣ表現型をもつ細胞をまだ含有していると思われる。こ
れらの細胞に関してキメラトリを産生し得るかどうかは検討しなかったが、その
外観から判断して、その目的のために有用であるはずである。

【００７２】（ＰＧＣトランスフェクション）緑色蛍光蛋白質レポーター遺伝子を含有するベクターのリポフェクションを用
いて、ＰＧＣのトランスフェクションを行なった。平均１／５０のＰＧＣが一時
的にトランスフェクトされたが、安定したトランスフェクト細胞系はまだ確立さ
れていない。

【００７３】まとめとして、これらの結果から、ＰＧＣを長期間維持することができ、キメ
ラトリの産生に利用可能であることが示される。増殖因子の濃度をさらに変え、
他の増殖因子を使用することによって、培養条件がさらに向上する可能性がある
。ＰＧＣ培養系が有用となるためには、ＰＧＣの生殖腺への移動能を維持しなが
ら、トランスフェクションおよび選別が可能でなければならない。また、関連申
請書中に詳細を公開したように（同日提出）、ニワトリのＰＧＣは、１９９８年
３月に、長期培養の後、マウスのＰＧＣの場合と同様（Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｅｌ
ｌ，７０：８４１−８４７、１９９２）ＥＳ細胞の表現型に戻っている。このよ
うに、離散させたＥＳ細胞を受容体である胚盤葉に注射する方法は、キメラおよ
びトランスジェニックなニワトリを産生するための別の手段として有用なはずで
ある。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年８月３０日（１９９９．８．３０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ポンスドレオン、エフ、アベルアメリカ合衆国ミネソタ、セントポール、フォルウェルアベニュー 2180 (72)発明者ブラックウェル、キャサリンアメリカ合衆国マサチューセッツ、ウォレン、カルターロード 285 (72)発明者ガオ、ザイウ、イイングアメリカ合衆国マサチューセッツ、エス、ディアフィールド、ワードアベニュー 14 (72)発明者ロブル、ジェームズ、エムアメリカ合衆国マサチューセッツ、ベンチャータウン、オールドエンフィールドロード 196 (72)発明者スタイス、スチーブン、エルアメリカ合衆国マサチューセッツ、ベンチャータウン、アマーストロード 468 (72)発明者ジェリー、ディ、ジョセフアメリカ合衆国マサチューセッツ、シャテスベリー、ダブリュ、ペルハムロードＦターム(参考） 4B024 AA10 CA04 DA02 EA04 GA03 GA08 GA23 4B064 AG01 CA10 CA19 CA20 CC24 DA11 4B065 BC03 BC50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下に記載の工程から成るトリ始原生殖細胞を長期間維持す
るための培養方法：（ｉ）対象となるトリから始原生殖細胞を分離する；および（ｉｉ）当該ＰＧＣを組織培養中で長期間維持するために十分な量の以下の増殖
因子を少なくとも含有する培養液中で当該始原生殖細胞を培養する：（１）白血病阻止因子（ＬＩＦ）、（２）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、（３）幹細胞因子（ＳＣＦ）および（４）インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、長期間培養のため。
【請求項２】当該増殖因子の最低量が以下の範囲であることが望ましい、
請求項１に記載の方法：（１）ＬＩＦ０．１Ｕ／μｌから１００．０Ｕ／μｌ（２）ｂＦＧＦ４．０ｐｇ／μｌから４０００ｐｇ／μｌ（３）ＩＧＦ−Ｉ６．０ｐｇ／μｌから６０００．０ｐｇ／μｌ、および（４）ＳＣＦ８．０ｐｇ／μｌから８０００ｐｇ／μｌ。
【請求項３】当該増殖因子の量が以下の範囲であることがさらに望ましい
、請求項２に記載の方法：（１）ＬＩＦ１．０Ｕ／μｌから１０．０Ｕ／μｌ（２）ｂＦＧＦ４０．０ｐｇ／μｌから４００．０ｐｇ／μｌ（３）ＩＧＦ−Ｉ６０．０ｐｇ／μｌから６００．０ｐｇ／μｌ、および（４）ＳＣＦ８０．０ｐｇ／μｌから８００．０ｐｇ／μｌ。
【請求項４】当該トリＰＧＣをキジ（Ｇａｌｌｉｎａｃｅａ）属のトリか
ら入手する請求項１に記載の方法。
【請求項５】当該ＰＧＣがニワトリのＰＧＣまたは七面鳥のＰＧＣである
請求項４に記載の方法。
【請求項６】当該ＰＧＣが培養液中で少なくとも１４日間維持される請求
項１に記載の方法。
【請求項７】当該ＰＧＣが培養液中で少なくとも２５日間維持される請求
項６に記載の方法。
【請求項８】当該ＰＧＣが培養液中で少なくとも４ヶ月間維持される請求
項７に記載の方法。
【請求項９】以下の工程をさらに含有する請求項１に記載の方法：（ｉiｉ）得られたＰＧＣを希望する核酸配列によってトランスフェクトまたは
トランスフォームする。
【請求項１０】当該核酸配列が治療のためのポリペプチドをコードする請
求項９に記載の方法。
【請求項１１】以下に記載の工程から成るキメラトリを産生するための改
良法：（ｉ）トリから始原生殖細胞を分離する；（ｉｉ）少なくとも以下の増殖因子を含有する組織培養液中でこのＰＧＣを維持
する；（１）白血病阻止因子（ＬＩＦ）、（２）塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、（３）幹細胞因子（ＳＣＦ）および（４）インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）；（ｉｉｉ）当該ＰＧＣを受容体であるトリ胚に移す；そして（ｉｖ）希望するＰＧＣ表現型をもつキメラトリを選択する。
【請求項１２】当該ＰＧＣをキジ属のトリの胚から採取する請求項１１に
記載の方法。
【請求項１３】当該トリ胚が七面鳥またはニワトリの胚である請求項１２
に記載の方法。
【請求項１４】ＰＣＧを受容体であるトリ胚に移す前に希望する核酸配列
によりＰＧＣをトランスフェクトまたはトランスフォームする請求項１１に記載
の方法。
【請求項１５】当該核酸配列が治療のためのポリペプチドをコードする請
求項１４に記載の方法。
【請求項１６】（ｉｖ）の工程に基づいて生産したキメラトリの卵から当
該治療用ポリペプチドを精製することをさらに含有する請求項１５に記載の方法
。
【請求項１７】ＰＧＣを受容体であるトリ胚の背側大動脈かつ／または辺
縁静脈中、あるいは受容体の胚盤葉中に注射する請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】請求項１に記載の方法で培養することにより得られたトリ
ＰＧＣ細胞系。
【請求項１９】ニワトリまたは七面鳥のＰＧＣ細胞株である請求項１８に
記載の細胞系。
【請求項２０】挿入した核酸配列を含有する請求項１８に記載の細胞系。