ES2252851T3 - Linea celular de celulas germinales primordiales (pgc) de aves y metodo para el cultivo a largo plazo de las mismas. - Google Patents

Abstract

Un método de cultivo, el cual proporciona mantenimiento de células germinales primordiales de aves durante períodos de al menos 14 días en cultivo de tejidos, que comprende los siguientes pasos: (i) aislar una población pura de células germinales primordiales de un ave deseada; y (ii) cultivar dicha población pura, aislada, de células germinales primordiales (PGCs) en un medio de cultivo que contiene al menos los siguientes factores de crecimiento contenidos en cantidades suficientes para mantener dichos PGCs durante al menos 14 días en cultivo de tejido: (1) factor inhibidor de leucemia (LIF), (2) factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), (3) factor de célula eje (SCF) y (4) factor de crecimiento similar a insulina (IGF), durante un período prolongado.

Description

Línea celular de células germinales primordiales (PGC) de aves y método para el cultivo a largo plazo de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención proporciona un novedoso método para mantener células germinales primordiales de aves (PGCs), en particular PGCs de pollo, durante períodos prolongados en cultivo de tejidos. Estas PGCs pueden ser usadas para la inserción de secuencias de DNA deseadas, por ejemplo, genes humanos. Estas PGCs cultivadas y PGCs transgénicas derivadas de las mismas, pueden ser usadas para producir aves quiméricas, en particular pollos quiméricos.

Antecedentes de la invención

En años recientes ha habido mucha investigación enfocada hacia la producción de animales quiméricos, clonados y transgénicos.

En particular, la modificación del genoma de especies de animales de granja es un área la cual ha sido activamente perseguida, con grados variantes de éxito, durante las pasadas dos décadas. Por ejemplo, tal investigación ha sido enfocada hacia la generación de cerdos, vacas y pollos transgénicos. A la fecha, la mayoría de los animales transgénicos disponibles ha sido generada mediante la microinyección directa de embriones de células simples con constructos de DNA que alojan el gen de interés. Sin embargo, aunque las técnicas de microinyección han sido exitosas, tales métodos son desventajosos ya que son muy costosos y frecuentemente sufren de baja eficiencia.

Recientemente, el éxito de la tecnología de célula eje embriónica (ES) para la producción de ratones "knock-out" ha conducido a investigación enfocada hacia el desarrollo de sistemas de cultivo de tejido para células ES y células germinales primordiales (PGCs) en especies de animales de granja. La capacidad para mantener células ES no diferenciadas en cultivo continuo permite la transfección in vitro de tales células e idealmente la selección de células transfectadas, las cuales contienen un gen deseado antes de su transferencia a la masa celular interior de un embrión en desarrollo para generar animales quiméricos. Idealmente, al menos algunos de los animales quiméricos resultantes serían capaces de segregar el constructo de DNA vía la línea germinal y, de ahí, producir progenie transgénica. Sin embargo, a la fecha, las integraciones enfocadas (de sitio específico) han sido logradas solamente en ratones. Actualmente, la capacidad para hacer la integración de DNA enfocada en otras especies animales está limitada. Sin embargo, el trabajo en esta dirección está en progreso y debería ser realizado pronto.

En particular, ha habido una considerable investigación enfocada hacia mejorar el genoma de Gallinacea y pollos, en particular debido a la considerable importancia económica de ello. Una revisión bastante completa del estado de investigación dirigida a la generación de pollos transgénicos fue publicada hace tres años (Sang, Trends in Biotech. 12:415-420 (1994)). Como se discutió en la presente, existen básicamente dos rutas alternativas bajo investigación para producir pollos transgénicos. Estos métodos pueden distinguirse basados en el momento en el cual se efectúa la manipulación del genoma, es decir, antes de la puesta o después de la puesta. El último método incluye la transferencia de PGC y ES del donador a embriones receptores. Más aún, en ambas rutas, el volumen del trabajo ha sido efectuado al infectar células donadoras con vectores retrovirales conteniendo un gen de interés.

La primera aproximación, la cual comprende la manipulación del genoma antes de la puesta ha producido resultados mezclados y/o ineficiente. Por ejemplo, la infección de oocitos en el ovario (Shuman y Shoffner, Poultry Sci. 65:1437-1494 (1986)) y la pre-incubación de esperma con DNA de plásmido (Gruenbaum et al., J. Cell, Biochem Supp., 15:194 (1991) fueron ineficientes y no han sido repetidas. Además, la transfección de células de esperma con un constructo de plásmido por lipofección ha sido demostrada (Squires y Drake, Anim. Biotech., 4:71-78. 1993). Sin embargo, no se reportó la transmisión de líneas germinales.

Además, la microinyección directa de DNA en el disco germinal seguido por el cultivo de embriones ha sido reportada por producir 0,1% de aves quiméricas transgénicas vivas (Sang. W. Trends in Biotech., 12:415-42 (1994)) con un ave transmitiendo el transgen a 3,4% de su progenie (Love et al., Bio/Technology, 12:60-63 (1994)). La misma aproximación fue tomada por Naito et al (J. Reprod. Fertil., 102:321-325 (1994)). Sin embargo, de manera similar no se reportó en la misma ninguna trasmisión de línea germinal del transgen.

La segunda aproximación, la cual comprende la manipulación del genoma después de la puesta, ha producido mejores resultados. Las aves quiméricas, generadas por inyección de huevos puestos con vectores retrovirales de replicación competente, han mostrado transmisión de línea germinal a 1% y 11% de sus progenies (Salter et al., en Manipulation of the Avian Genome (Manipulación del genoma de aves) Etches, RJ et al., eds. Pp 138-150 CRC Press (1993)). Los resultados más alentadores, usando vectores retrovirales de replicación defectuosa e inyección en huevos puestos, generó 8% de las aves macho quiméricas que transmitieron el vector de su progenie a una frecuencia de 2 a 8% (Bosselman et al., Science, 243:535-535 (1989)).

Sin embargo, ha fracasado la inyección de los huevos puestos con constructos de plásmido en la presencia de reactivos conocidos por promover la transfección para producir aves transgénicas o constructos o establemente integrados (Rosenblum y Cheng, J., Cell Biochem Supp., 15E 208 (1991)). En general, el uso de vectores retrovirales para la generación de pollos transgénicos no está muy esparcido debido a las desventajas significativas asociadas con el mismo. Tales desventajas incluyen las restricciones en el tamaño de la inserción de clonación que puede ser introducida establemente en los mismos, y la desventaja potencial más seria de inducir posiblemente casos de recombinación con lugares virales endógenos o con otros virus de leucosis de ave diferente.

Un problema significativo con todos estos métodos es el hecho de que sistemas de cultivo de largo plazo para PGC y ES de pollo han sido relativamente difíciles de establecer. Hasta donde saben los investigadores, se cree que las PGCs de aves más grandes han sido cultivadas con la producción exitosa de aves quiméricas es menor de 5 días.

Los métodos para cultivar PGC previos han incluido el uso de factor de crecimiento, en particular LIF o IGF-I. Sin embargo, como se notó, tales métodos no han sido capaces de proporcionar períodos de cultivo prolongados, una preocupación que prevalece, ya que facilitaría la producción de PGCs transgénicas.

Sin importar los problemas para lograr el cultivo de largo plazo, tanto células ES como PGC han sido usadas exitosamente para generar quimeras mediante infección de tales células con vectores retrovirales de replicación competente e incompetente. Además, como se discutió antes, las células blastodérmicas recién obtenidas han sido inyectadas en embriones receptores, resultando en aves con gónadas quiméricas (Carsience et al., Devel. 117:669-675. (1993)). Las células blastodérmicas pueden ser transfectadas de manera eficiente por lipofección y entonces son transferidas hacia embriones receptores. Sin embargo, no se ha reportado la transmisión de línea germinal de células transfectadas.

Además, Pain et al., Devel., 122:2329-2398 (1996) han demostrado recientemente la presencia de células ES de pollo putativas obtenidas a partir de células blastodérmicas. Reportaron además el mantenimiento de estas células en cultivos por 35 pasos de manera sostenida sin pérdida del fenotipo de ES (como se define por los anticuerpos monoclonales para células ES de ratón) (Id.). Estas células aparentemente se desarrollan en PGCs sobre la transferencia en embriones de ave, donde forman colonias en las gónadas. Sin embargo, no establecieron de manera definitiva que estas células eran, de hecho, células ES.

La reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales de ES de ratón con células ES de pollo podría argüir favorablemente la conservación de receptores de células ES entre especies. Además, el hecho de que estos investigadores también fueron capaces de generar dos pollos quiméricos con inyecciones de cultivos celulares blastodérmicos de 7 días de edad, sugeriría de manera razonada la presencia de células ES en su sistema. Sin embargo, estos investigadores no descartaron la posibilidad de que las PGCs estuvieran presentes en su sistema de cultivo complejo. Así, este sistema de cultivo ES de largo plazo debería ser probado adicionalmente por pluripotencia y transmisión de línea germinal (Id.).

Una ruta alternativa para la producción de células ES, comprende PGCs. Se han desarrollado procedimientos para el aislamiento y transferencia de PGCs de donador a embriones receptores y han generado exitosamente pollos quiméricos con la transmisión de líneas germinales del genotipo del donador (Vick et al London Ser. B. 251:179-182 (1993)). Tajima et al., Theriogenology, 40:509-519 (1993)). Además, se han crioconservado PGCs y han sido descongeladas posteriormente para generar aves quiméricas (Naito et al., J. Reprod. Fertil., 102:321-325 (1994)). Sin embargo este sistema es de mucho trabajo y solo produce, en promedio, solo 50 a 80 PGCs por embrión. La infección de PGCs con vectores retrovirales también ha sido reportada. Sin embargo, a la fecha, no se ha logrado el crecimiento de PGCs en cultivo durante períodos prolongados para facilitar la selección de PGCs transfectadas. Así, con base en lo anterior, está claro que los métodos mejorados para cultivar PGCs comprende una necesidad significativa en la técnica.

Objetivos de la invención

Un objetivo de la invención es resolver los problemas de la técnica anterior.

Un objetivo más específico de la invención es proporcionar un método novedoso para cultivar células germinales primordiales de aves (PGCs) durante períodos prolongados en cultivo de tejido.

Es un objetivo aún más específico de la invención proporcionar un método novedoso para cultivar células germinales primordiales (PGCs) de Gallinacea, especialmente pollo (PGCs) durante períodos prolongados en cultivos de tejido.

Otro objetivo de la invención es usar células germinales primordiales de ave, las cuales han sido cultivadas durante períodos prolongados en cultivo de tejidos para la producción de aves quiméricas, de preferencia aves de corral, y muy preferiblemente pollos o pavos.

Otro objetivo de la invención es introducir secuencias de ácidos nucleicos deseadas en células germinales primordiales de ave, las cuales han sido cultivadas durante períodos prolongados en cultivo de tejidos.

Todavía otro objetivo de la invención es usar células germinales primordiales de aves, las cuales han sido mantenidas en cultivo durante períodos prolongados en las cuales se ha introducido una secuencia de ácido nucleico deseada, para la producción de aves quiméricas transgénicas, de preferencia pollos o pavos quiméricos transgénicos.

Todavía otro objetivo de la invención es usar tales aves quiméricas transgénicas, de preferencia Gallinacea y muy preferiblemente pollos, para la producción de proteína(s) heteróloga(s) codificada(s) por una secuencia de ácido nucleico contenida en células introducidas en las mismas, de preferencia mediante recuperación de tal(es) proteína(s)
de los huevos de tales aves quiméricas transgénicas, en particular, pollos quiméricos transgénicos. De manera alternativa, tales proteínas pueden ser obtenidas a partir del ave quimérica directamente, por ejemplo, aislada de la sangre u otros tejidos.

Breve descripción de la invención

Como se discutió, la presente invención proporciona un método novedoso para mantener células germinales primordiales (PGCs) de ave (pollo) en cultivo de tejido durante períodos prolongados, es decir, durante al menos 14 días, más preferiblemente al menos 25 días, e idealmente, de manera indefinida.

Más específicamente, la invención proporciona un método de cultivo que proporciona para el mantenimiento de células de germen primordial de aves para tiempos de al menos 14 días en cultivo de tejidos incluyendo las siguientes etapas:

(i)

aislar una población pura de células germinales primordiales a partir de un ave deseada; y

(ii)

cultivar dicha población pura aislada de células germinales primordiales en un medio de cultivo que contiene al menos los siguientes factores de crecimiento contenidos en suficientes cantidades para mantener dichas PGCs por al menos 14 días en cultivos de tejidos:

(1)

Factor inhibidor de leucemia (LIF).

(2)

Factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF),

(3)

Factor celular eje (SCF) y

(4)

Factor de crecimiento similar a insulina (IGF), por un período de tiempo prolongado.

La invención proporciona también un cultivo in vitro que consiste esencialmente en PGCs de ave aisladas purificadas en un medio que contiene factores de crecimiento que proporciona para dichas PGCs que sean mantenidas establemente in vitro por al menos 14 días.

Antes de la presente invención, no se había reportado ningún método para mantener PGCs de ave en cultivo de tejidos, el cual proporciona su mantenimiento durante más de aproximadamente 5 días (como es demostrado por su capacidad para producir aves quiméricas). Los presentes inventores han descubierto, de manera sorprendente, mediante experimentación juiciosa, que el uso de un medio de cultivo conteniendo al menos los siguientes factores de crecimiento: factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de célula eje (SCF) y factor de crecimiento similar a insulina (IGF-I) permite que células germinales primordiales de ave, específicamente células germinales primordiales de pollo sean mantenidas y que proliferen durante períodos prolongados, es decir, al menos 14 días, y durante sustancialmente más tiempo en cultivo de tejido. Más aún, se ha demostrado que estas PGCs son útiles para la generación de pollos quiméricos.

Además, estas PGCs deberían ser útiles para la producción de PGCs de aves transgénicas, las cuales pueden ser usadas para producir aves quiméricas transgénicas. Se espera que estas aves quiméricas transgénicas serán útiles para la recuperación de proteínas heterólogas, las cuales preferiblemente pueden ser recuperadas directamente de los huevos de tales aves transgénicas quiméricas. Por ejemplo, tales aves pueden ser usadas para la producción y recuperación de proteínas y otros polipéptidos terapéuticos.

Descripción detallada de la invención

De esta manera, la presente invención obvia los problemas asociados con métodos de cultivo de PGC de ave previos, los cuales no permitían que tales PGCs fueran mantenidas en cultivo de tejido durante períodos mayores que aproximadamente 5 días. En particular, los presentes inventores han descubierto, de manera sorprendente, que las PGCs de ave, de preferencia PGCs de Gallinacea, y muy preferiblemente PGCs de pollo, pueden ser mantenidas en cultivo de tejido durante períodos prolongados, en al menos 14 días, más preferiblemente al menos 25 días y de preferencia más tiempo, mediante el uso de medio de cultivo, el cual contiene al menos los siguientes cuatro factores de crecimiento:

factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de célula eje (SCF), factor de crecimiento similar a insulina (IGF-I) y factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF).

En general, el presente método de cultivo comprende los siguientes pasos:

(i)

aislar PGCs de embriones donadores de ave; y

(ii)

cultivar dichas PGCs de ave aisladas en un medio de cultivo que contiene cantidades relativas de LIF, bFGF, SCF e IGF-I efectivas para promover su proliferación, durante un tiempo prolongado, es decir, al menos 14 días, en cultivo de tejido. Los períodos prolongados, como se definió antes, se refieren a un período de cultivo de 14 días o mayor.

Los métodos para aislamiento de células germinales primordiales de embriones donadores de ave han sido reportados en la literatura y pueden ser efectuados por alguien experto en la técnica (ver, por ejemplo, JP 924997, publicada el 7 de septiembre de 1993. Pub. No. 05/227947; Chang et al., Cell. Biol. Int 19 (2): 143-149 (1992); Naito et al., Mol. Reprodu. Devel., 39.153-161 (1994); Yasuda et al., J. Reprod. Fert., 96:521-528 (1992); y Chang et al., Cell Biol. Int. Reporter, 16(9): 853-857 (1992), todas incorporadas en la presente por referencia en su totalidad).

Los presentes inventores eligieron aislar PGCs de ave a partir de huevos de pollo, los cuales habían sido incubados durante aproximadamente 53 horas (etapa 12-14 de desarrollo embriónico), remoción de embriones de los mismos, recolección de sangre embriónica de la aorta dorsal de los mismos, y transferencia de la misma a medio de cultivo celular adecuado (medio M199). Estas PGCs fueron purificadas entonces por centrifugación de densidad ficoll, y se resuspendieron en 10 \mul de medio de cultivo conteniendo factor de crecimiento de la presente invención. Sin embargo, como se discutió antes, se conocen otros métodos para aislar PGCs y pueden ser usados de manera alternativa.

Las PGCs aisladas fueron contadas entonces y separadas manualmente (por ejemplo, usando una pipeta). Posteriormente, las PGCs recolectadas de estos diferentes embriones de aves son depositadas (para incrementar los números de PGC) e incubadas en el medio que contiene factor de crecimiento objetivo.

Este medio de cultivo, de aquí en adelante referido como medio "completo" contiene LIF, bFGF, SCF e IGF-I, así como otros sustituyentes normalmente comprendidos en medio de células eje embriónicas y PGC. De manera más específica, el medio "completo" objetivo preferiblemente comprenderá \alpha-MEM, un medio de crecimiento celular comercialmente disponible bien conocido, al cual se han agregado los cuatro factores de crecimiento anteriores, y que adicionalmente incluye 10% de suero de ternera fetal, L-glutamina 2 mM, 0,56% de antibiótico/antimitótico, 2-\beta mercaptoetanol, 1,0 U/\mul de LIF, 40,0 pg/\mul de bFGF, 60,0 pg/\mul de IGF-I y 80,0 pg/\mul de SCF.

Basado en los experimentos conducidos a la fecha, se cree que éstas corresponden a las concentraciones preferidas de estos factores de crecimiento. Sin embargo, como se describe infra, las cantidades de estos factores de crecimiento pueden ser variadas, siendo mantenidas exitosamente las PGCs en este cultivo de tejido. En particular, se sabe que las cantidades respectivas de estos factores de crecimiento pueden ser incrementadas sin ningún efecto adverso, Más aún, estas cantidades preferidas pueden variar, por ejemplo, si se cultivan PGCs de otras aves.

Como se nota, los presentes inventores usaron como el medio de base, \alpha-MEM, un medio de cultivo de tejido comercialmente disponible, bien conocido. Sin embargo, se espera que otros medios puedan ser sustituidos por aquél, siempre que también estén presentes estos cuatro factores de crecimiento esenciales. Los solicitantes contemplan particularmente la modificación de los "medios completos" objetivo para eliminar el suero de ternera fetal, debido a su composición variable y no definida.

Además, aunque los solicitantes cultivaron PGCs en la ausencia de células alimentadoras, contemplan además que también pueden ser útiles las células alimentadoras. En particular, el uso de fibroblastos, de preferencia, fibroblastos de ave, y muy preferiblemente fibroblastos de Gallinacea (todavía más preferiblemente fibroblastos de pollo), proporcionarán el mantenimiento de PGCs en cultivo de tejido, siempre que estén presentes los cuatro factores de crecimiento esenciales. Más aún, estas células alimentadoras pueden ser transfectadas con genes que codifican estos factores de crecimiento, eliminando con ello la necesidad de la adición exógena de estos factores durante el cultivo. Esencialmente, las células proporcionarán una fuente continua de estos factores de crecimiento. (Esto se logrará al colocar estos genes de factores de crecimiento bajo el control del promotor fuerte constitutivo y también secuencias que proporcionan la secreción de los mismos, haciendo con ello disponibles a estos factores de crecimiento para PGCs cultivadas).

Como se nota, las cantidades de estos factores se refieren a cantidades relativas de las mismas, efectivas para permitir cultivos prolongados de PGCs de ave, de preferencia, PGCs de Gallinacea, y muy preferiblemente PGCs de pollo o pavo, durante períodos prolongados en cultivo de tejido.

De preferencia, las cantidades relativas de estos factores de crecimiento caerán dentro de los siguientes rangos:

LIF 0,1 U/\mul a 100,0 U/\mul más preferiblemente 1,0 a 10,0 U/\mul y muy preferiblemente 1,0 a 2,0 U/\mul;

IGF-I 6,0 pg/\mul a 6000,0 pg/\mul, más preferiblemente 60,0 pg/\mul a 600,0 pg/\mul en peso y muy preferiblemente 60,0 pg/\mul a 120,0 pg/\mul;

SCF 8,0 pg/\mul a 8000,0 pg/\mul en peso, más preferiblemente 80,0 pg/\mul a 800,0 pg/\mul y muy preferiblemente 80,0 pg/\mul a 160,0 pg/\mul en peso; y

bFGF 4,0 pg/\mul a 4000,0 pg/\mul, más preferiblemente 40,0 pg/\mul a 400,0 pg/\mul en peso y muy preferiblemente 40,0 pg/\mul a 80,0 pg/\mul.

En los rangos expuestos arriba, los rangos superiores no son críticos para la invención y son dictados en gran parte por el costo (dado el significativo gasto asociado con la fabricación de los factores de crecimiento).

Sin embargo, se espera que estos rangos preferidos puedan variar, por ejemplo, si \alpha-MEM es sustituido por otro medio de crecimiento y si otros tipos de PGCs de ave son cultivados.

Como se discutió, estas PGCs pueden ser mantenidas durante períodos largos en cultivo con la producción exitosa de aves quiméricas. A la fecha, las células han sido mantenidas en cultivo de tejido hasta aproximadamente 4 meses, sin efectos adversos aparentes. Además, se han probado las células de hasta 25 días por su capacidad para colonizar de manera efectiva gónadas embriónicas de ave y producir aves quiméricas. Sin embargo, se espera que estas células puedan ser cultivadas de manera indefinida, con retención de la capacidad para producir aves quiméricas.

Los métodos para usar PGCs para producir quimeras son conocidos en la técnica, como es evidenciado por la técnica anterior discutida supra. De preferencia, las PGCs serán transferidas en embriones de aves receptores de acuerdo a los métodos descritos en el ejemplo que sigue. Posteriormente, la producción exitosa de quimeras es evaluada con base en la migración y colonización de PGCs en las gónadas, la retención del fenotipo de PGC, o al buscar la presencia de PGCs del donador en gónadas después de la salida del cascarón y crianza.

En el presente ejemplo, los inventores seleccionaron genotipos que se pueden seguir fácilmente, los cuales afectan la coloración. Las aves donadoras fueron del tipo de pollo tierno blanco y las aves receptoras fueron aves de plumas negras, respectivamente, que tienen genotipos potenciales específicos. Las quimeras putativas fueron de plumas negras y produjeron progenie blanca/negra cuando se aparearon con aves negras. Así, se demostraron quimeras exitosas con base en la producción de progenie con plumas negras/blancas producidas después de aparear el ave quimérica putativa con otra ave de plumas negras.

En una segunda estrategia se usaron aves Bar Rock como receptoras, y aves de plumas blancas como donadoras. Se demostraron aves quiméricas putativas con base en la producción de progenie de plumas blancas que tenían algunas plumas rayadas.

Sin embargo, el método objetivo debería ser aplicable para introducir cualquier rasgo deseado mediante quimerización. Esto dependerá, por supuesto, de las propiedades genotípicas de las PGCs transferidas.

Como se discute, una aplicación significativa de las PGCs objetivo, las cuales pueden ser mantenidas en cultivo durante períodos largos, es la producción de aves quiméricas. Esto se logrará al introducir una secuencia de DNA deseado en las PGCs cultivadas. Los medios para introducir DNAs en células receptoras son conocidos e incluyen técnicas de lipofección, transfección, microinyección, transformación, de microproyectiles, etc. En particular, los presentes inventores eligieron inicialmente introducir un vector conteniendo un gen reportador por lipofección. Sin embargo, aunque se produjeron PGCs transitoriamente transfectadas, no se ha aislado, hasta ahora, una línea celular transfectada estable. Sin embargo, se espera que esto pueda lograrse mediante técnicas conocidas usando las PGCs objetivo.

De preferencia, se introducirá un DNA que codifique un gen deseado, por ejemplo, un polipéptido terapéutico, factor de crecimiento, enzima, etc., bajo el control regulador de secuencias operables en aves. De preferencia, estas secuencias reguladoras serán de origen eucariótico, muy preferiblemente de aves, por ejemplo, secuencias reguladoras de pollo. Los promotores operables en células de aves, por ejemplo, derivados de genes o virus de aves son conocidos en la técnica.

Inicialmente, una línea celular estable, la cual produce la proteína deseada, será aislada y usada para la producción de quimeras. Además, también es deseable que el DNA introducido contenga un DNA marcador, cuya expresión sea detectada fácilmente, para identificar más fácilmente las células que contienen el DNA insertado. Tales marcadores seleccionables son bien conocidos e incluyen \beta-lactamasa, \beta-galactosidasa, neomicin fosfotransferasa, etc.

La inyección de las PGCs transgénicas resultantes en embriones de aves resultará entonces en la producción de aves quiméricas transgénicas. De preferencia, la proteína deseada será recuperada entonces a partir de los huevos de estas aves transgénicas, proporcionando con ello un suministro continuo de la proteína. De manera alternativa, la proteína será recuperada a partir de aves quiméricas de manera directa, por ejemplo, será aislada del sistema circulatorio sistémico.

Ejemplo

Los siguientes materiales y métodos fueron usados en los experimentos descritos a continuación.

Materiales y métodos Animales

Se usaron pollos tipo tierno (para asar) blancos (E/E e I/I) como donadores de PGCs para desarrollar el sistema de cultivo de PGC a largo plazo. Se usaron dos tipos de ave como embriones receptores, una línea de pollo de plumas negras dominante (E/- e i/i) y una línea de Bar Rock (E/E e i/i). Las aves negras dominantes inyectadas con PGCs tipo pollo tierno (WB) son referidas como aves E/-(WB) y Bar Rock inyectadas con PGCs tipo pollo tierno blanco son referidas como BR(WB).

Extracción de PGCs

Se seleccionaron embriones de etapa 13 ó 14 para la extracción de PGC. Las PGCs fueron reclectadas de la aorta dorsal con una micropipeta fina como se describió por Naito et al., Mol. Reprod. Dev. 37:167-171 (1994). Las PGCs de 20 embriones fueron depositadas en solución de Hank complementada con 10% de suero bovino fetal y se concentraron por centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll (Naite et al., Mol. Reprod. Dev. 39:153-171 (1994). Las PGCs fueron contadas y se distribuyeron en gotas de 10 \mul de medio de cultivo (DMEM, conteniendo diferentes cantidades de factores de crecimiento) a aproximadamente 100 PGCs por gota. Las gotas de cultivo fueron sobrepuestas con aceite mineral ligero estéril.

Inyección de PGCs en embriones receptores

Se usaron embriones de etapa 14-15 como embriones receptores. Después de colocar el huevo en una superficie apropiada, se permitió que el embrión se desarrollará para posicionarse por sí mismo en el lado superior del huevo en descanso. Se hizo una pequeña "ventana" de aproximadamente 10 mm o menos en el cascarón con un forceps fino. El embrión fue llevado cerca de la superficie al adicionar una mezcla de solución salina amortiguada con fosfato con 4% de antibióticos. Después de acomodar el embrión para visualizar su corazón, la vena marginal y/o aorta dorsal pudieron ser fácilmente identificadas. Se tomaron en una micropipeta doscientas PGCs donadoras en 2 \mul de medio conteniendo 0,04R de azul tripano. Las PGCs fueron inyectadas en la aorta dorsal del embrión receptor. El azul tripano, un colorante celular inerte, permitió la visualización de la suspensión de PGC, cuando estaba siendo entregada. Después de la inyección se cerró la abertura del cascarón de huevo con cinta quirúrgica y se reforzó con parafina. Los huevos se mantuvieron durante 24 horas bajo observación en una incubadora de CO_{2} humidificada y posteriormente se transfirió a una incubadora regular hasta la salida del cascarón.

Manchado fluorescente viable de PGCs.

Para evaluar el éxito de transferencias y/o la capacidad de PGCs para migrar a las gónadas, PGCs fueron manchadas con mancha fluorescente Dil. Los embriones fueron recolectados después de 24 horas de transferencia, se colocaron en un caja petri y se observaron bajo un microscopio invertido equipado para análisis epi-fluorescente.

Condiciones de cultivo de PGC

Se han probado varias concentraciones de factor inhibidor de leucemia (Lif), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento similar a insulina humano (IGF-I) y factor de célula eje humano (SCF). De igual manera, se probaron capas alimentadoras de células STO de ratón y fibroblasto de pollo tratado con mitomicina.

Medio de cultivo celular de largo plazo de PGCs

En los experimentos que sigue, el medio de cultivo celular completo comprendía los siguientes sustituyentes: \alpha-MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD., Cat#12-169F), 10% de suero de ternera fetal (Hyclone, Logan, UT. Cat#30070.03), L-glutamina 2 mM (Sigma, St. Louis, MO. Cat#G7513), 0,48% de antibiótico/antimicótico (Sigma, St. Louis, MO. Cat#A7292). 2\beta mercaptoetanol 132 \muM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, Cat2195-023), 0,00625 U/\mul de factor inhibidor de leucemia (LIF), 0,25 pg/\mul de factor de crecimiento de fibroblasto básico (b-FGF), 0,5625 pg/\mul de factor de crecimiento similar a insulina (IFG-I) y 4,0 pg/\mul de factor de célula eje (SCF) (Genzyme, Cambridge, MA, Cat#'s 1999-01, 1208-99, FG1211-1 y 1833-01 para LIF, bFGF, IGF-1 y SCF, respecivamente). Los cambios de medio se realizaron un día si y otro no al remover 5 \mul de medio y adicionar 5 \mul de 2X nuevo medio. El último asumió que los factores de crecimiento serán lábiles después de algún período de cultivo continuo. Sin embargo, el resultado neto es que la concentración de factores de crecimiento es doblada. Así, el medio final contiene ahora las siguientes concentraciones de factores de crecimiento: 0,0125 U/\mul de factor inhibidor de leucemia (LIF), 0,5 pg/\mul de factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), 1,125 pg/\mul de factor de crecimiento similar a insulina-I (IGF-I) y 8,0 pg/\mul de factor de célula eje (SCF). El rango de concentraciones de factor de crecimiento descrito aquí, promueve el mantenimiento y proliferación de PGCs en cultivo continuo. Más aún, subsecuentemente se ha encontrado que estas células sobreviven y proliferan opcionalmente en las concentraciones identificadas supra, (además, se ha demostrado subsecuentemente que los factores de crecimiento pueden ser cambiados en el medio del cultivo anterior). En particular, como se discutió supra, un medio de cultivo particularmente preferido para mantener cultivos de células germinales primordiales comprenderán los mismos sustituyentes como antes, en donde las cantidades de LIF, IGF-I, SCF y bFGF son como sigue:

LIF: 1,0 unidad/\mul

bFGF: 40,0 pg/\mul

SCF: 80,0 pg/\mul

IGF-I: 60,0 pg/\mul).

Usando estas condiciones de cultivo, se encontraron que las PGCs forman amontonamientos libremente adherentes, densos, grandes, de células (algunos de los amontonamientos tienen varios cientos de células en ellos) dentro de 3 a 4 días después de la recolección. Al final de 7 días, los amontonamientos comienzan a tener grandes números de células muertas y desechos celulares alrededor de ellas. Los amontonamientos de PGC sobreviven hasta cuatro semanas antes de que se vuelvan monocapas celulares. En las semanas 1, 2 y 3, los amontonamientos han sido disociados, manchados con un colorante vital Dil y transferidos en embriones receptores. En los tres momentos en el tiempo se encontraron células en las gónadas de algunos de los embriones receptores. El número de células y el número de embriones que mostraron PGCs manchadas en las gónadas fueron inversamente proporcionales a la edad del cultivo de
PGCs.

Transferencia de PGC en embriones receptores

Para la transferencia de PGC, el huevo receptor fue colocado horizontalmente bajo un alcance de disección. Se perforó un pequeño orificio en el espacio de aire del huevo para disminuir la presión interna del huevo y prevenir la fuga. Se abrió una ventana de 10 mm en la superficie ventral del huevo y se inyectó \sim 1 ml de PBS con 4% de antibiótico/antimitótico a través del orificio para llevar el embrión casi al ras de la ventana del cascarón del huevo. Para inyectar las PGCs se inclinó una pipeta de 30 \mul y entonces se jaló usando una microforja para formar un punto fino con bordes pulidos. Se escogieron manualmente dos cientos de PGCs para transferencia de embrión, disociadas como se describió más adelante, usando una pipeta de aguja y un tubo de succión. Antes de la transferencia y cuando estaban en la pipeta, las PGCs fueron mezcladas con una solución al 0,04% de mancha de azul tripano. El volumen de inyección total por embrión fue 2 \mul. Para el paso final, el embrión receptor fue colocado para revelar una porción de la vena marginal. La pipeta de agua con las PGCs fue insertada y los contenidos fueron expelidos cuidadosamente. La pipeta de agua fue sostenida en su lugar durante unos cuantos segundos y entonces se removió. Los huevos receptores fueron sellados con 2 capas de cinta quirúrgica seguida por recubrimiento de cera de parafina del área entera. Los huevos receptores fueron colocados entonces de regreso en una incubadora receptora y se incubaron hasta la salida del cascarón.

Evaluación del fenotipo de PGC

Las PGCs de pollo son positivas para manchado ácido de Schiff periódico (PAS) y se reclaman por ser positivas para fosfatasa alcalina. Sin embargo, no existe ninguna evidencia convincente de que las PGCs de pollo son positivas para lo último. En la ausencia de un método marcador molecular o enzimático alternativo para caracterizar PGCs de pollo, se evaluó su fenotipo al transferir células a embriones receptores y evaluar su presencia en las gónadas del embrión en desarrollo. Este método requirió cultivar las PGCs en 100 \mug/ml de Dil en un medio \alpha-MEM y enjuagar antes de la transferencia a embriones receptores. Se removieron los embriones receptores post-transferencia veinticuatro horas después, y se colocaron bajo un microscopio invertido. Las células marcadas con Dil observadas en las gónadas fueron interpretadas como la migración de PGC exitosa a las gónadas y la confirmación de la retención de las características de PGC. Se persiguió un segundo método para evaluar la retención del fenotipo de PGC al dejar que los embriones receptores salieran del cascarón y entonces evaluar la presencia de PGCs donadoras en sus gónadas después de la crianza.

Estrategia de crianza para evaluación de PGC

Se siguieron dos estrategias de crianza. La primera estrategia usó aves de plumas negras receptoras con posible genotipo I/I, E/E, s/s, b/b y aves tipo pollo tierno de plumas blancas donadoras con genotipo I/I, E/E, S/S, B/B. Para probar que los animales receptores fueron quiméricos, es decir, que contienen sus propias PGCs y PGCs donadoras en sus gónadas, fueron apareadas con aves de plumas negras puras. Si la progenie resultante fue toda de plumas negras, entonces, se asumió que el animal era no quimérico. Sin embargo, si alguna de la progenie era de plumas blancas con algunos parches de plumas negras, entonces el animal receptor sería quimérico. Para la segunda estrategia de crianza, se usaron aves Bar Rock como embriones receptores, mientras que las aves tipo pollo tierno de plumas blancas se siguieron usando como donadoras. En este último caso, cuando las aves quiméricas putativas se aparearon con Bar Rock puras, la presencia de progenie de plumas blancas con algunas plumas rayadas identificaría un ave quimérica positiva. Se obtuvieron cincuenta progenie de cada ave quimérica putativa antes de concluir sobre su estado
quimérico.

Pruebas de progenie

Las aves E/-(WB) quiméricas putativas, cuando se cruzaron con aves WB, produjeron pollos blancos puros, cuando se originaron de una PGC donadora (WB) y, pollos de plumas negras salpicadas cuando se originaron de PGC de (E/-).
De manera similar, cuando BR (WB) se cruzaron con aves WB, se produjeron pollos blancos puros cuando se originaban de una PGC donadora (WB) y pollos negros manchados con blanco, cuando se originaron de una PGCs de (BR). También se cruzaron entre aves quiméricas BR putativas. Para las últimas, se produjeron pollos blancos cuando ocurrió fertilización entre dos PGCs de (WB) y pollos negros fueron el resultado de la fertilización con dos PGC de (BR). El pollo blanco intermedio con plumas negras salpicadas solo ocurrió cuando una PGC de (BR) fue fertilizada por una PGC de (WB).

Cultivos de largo plazo más alla de 25 días

Después de 25 días de cultivos continuos, los amontonamientos de PGC forman rápidamente monocapas en propagación. Estas monocapas de células rebanan una base adherente plana y los amontonamientos más sueltos y cadenas de células similares a PGC en la superficie superior. Algunos paquetes de estas monocapas de células siguen siendo PAS positivas. Las células manchadas con Dil obtenidas de estas monocapas han sido transferidas a embriones receptores. Algunos embriones han mostrado pocas células localizadas en sus gónadas. Las monocapas celulares han sido pasadas exitosamente. Generalmente, estas células son capaces de experimentar 3 a 5 pasos antes de que comiencen a disminuir su proliferación, envejezcan y se vuelvan de apariencia fibroblástica. Hay pocas líneas celulares que han atravesado múltiples pasos y continúan medrando sin una aparente diferenciación durante aproximadamente cuatro meses en cultivo continuo.

Se han congelado dos líneas celulares obtenidas de monocapas, P102896 y P110596. La primera no mostró una diferenciación aparente y fue marginalmente positiva para fosfatasa alcalina, mientras que la última mostró morfología celular neuronal y fue fuertemente positiva para fosfatasa alcalina. Caracterizaciones adicionales de monocapas de PGC, como se describe en la presente, siguen siendo valoradas por totipotencia y pluripotencia.

Sumario de resultados

Se generaron pollos quiméricos a partir de PGCs frescas y crioconservadas. Veinticinco (74%) de 34 pollos quiméricos putativos producidos con transferencias de PGCs frescas, probaron ser animales quiméricos verdaderos después de la prueba de la progenie. Treinta (88%) de las 34 aves quiméricas putativas producidas con PGCs crioconservadas, demostraron ser pollos quiméricos verdaderos. En todos los casos, al menos 40 progenie fueron producidas y el número de PGCs donadoras que fueron fertilizadas por ave quimérica variaron desde 1,4% hasta 100%, con la mayoría variando entre 30% a 60%. Asumiendo que lo último es un reflejo del número de PGCs que migraron a la gónada después de la inyección, entonces el rango de éxito por inyección fue variado. Sin embargo, otros mecanismos pudieron estar operando que pudieron impactar en el número de PGCs que se estableció en la gónada receptora. Tales mecanismos no fueron evaluados en este estudio. Además, en promedio, no se observó ninguna alteración significativa de la proporción de sexo en la progenie de aves quiméricas.

Condiciones de cultivo de PGC

Ninguna de las capas alimentadoras celulares evaluadas en este estudio mejoraron las condiciones de cultivo de largo plazo de las PGCs. Ninguno de los factores de crecimiento solo, en ninguna de las concentraciones estudiadas, fue capaz de sostener PGCs in vitro sin diferenciación. También se probaron combinaciones de dos y tres factores de crecimiento con poco éxito. Basándose en nuestros resultados, parece que todos los factores descritos antes (LIF, bFGF, IGF-I y SCF) son requeridos para cultivo a largo plazo de PGCs. Todavía estamos probando diferentes concentraciones y combinaciones de los factores de crecimiento antes mencionados en un esfuerzo para definir las mejores condiciones posibles para cultivo de largo plazo de PGCs. Con base en el manchado con Dil de PGCs hemos observado que, bajo nuestras condiciones de cultivo, las PGCs que se originan de cultivos continuos de 14 días de edad migran a las gónadas de los embriones receptores después de la inyección. También hemos transferido PGCs que han sido mantenidas en cultivo durante 25 días a tres embriones receptores. Uno de estos embriones fue quimérico, como fue demostrado por la prueba de progenie.

Fenotipo de PGC bajo condiciones de cultivo de largo plazo

Después de la recolección, PGCs son reconocidas por su tamaño y por la presencia de gotas "libid" en su citoplasma. A aproximadamente 48 horas después de la recolección, las PGCs se amontonan y comienzan a dividirse como es evidenciado por el crecimiento en tamaño del amontonamiento y el número de células observadas después de la disociación de tripsina del amontonamiento. Solo las PGCs que forman amontonamiento sobreviven, todas las demás mueren. Generalmente, un cultivo que inicia con 100 PGCs terminaría con un promedio de 600 a 800 PGCs dentro de 7 días. Claramente algunas PGCs se dividen, aunque no a una proporción eficiente. Sin embargo, como se indicó antes, estas PGCs mantienen su capacidad de migrar a las gónadas.

Cultivos de largo plazo más alla de 25 días

Después de 25 días de cultivos continuos, los amontonamientos de PGC forman monocapas que se propagan rápidamente. Estas monocapas de células tienen una base adherente plana y amontonamientos más sueltos y cadenas de células similares a PGC en la superficie superior. Algunos paquetes de estas monocapas de células siguen siendo PAS positivas. Las células manchadas con Dil obtenidas a partir de estas monocapas han sido transferidas a embriones receptores. Algunos embriones han mostrado pocas células localizadas en sus gónadas. Las monocapas celulares han sido pasadas exitosamente. Generalmente, estas células son capaces de experimentar 3 a 5 pasos antes de que comiencen a disminuir su proliferación para envejecer y volverse de apariencia similar a fibroblasto. Existen pocas líneas celulares que han atravesado múltiples pasos y continúan medrando sin una aparente diferenciación durante aproximadamente cuatro meses en cultivo continuo.

Se han congelado dos líneas celulares obtenidas de monocapas, P102896 y P110596. La primera no mostró una diferenciación aparente y fue marginalmente positiva para fosfatasa alcalina, mientras que la última mostró morfología celular neuronal y fue fuertemente positiva para fosfatasa alcalina. Caracterizaciones adicionales de monocapas de PGC, como se describe en la presente, siguen siendo valoradas por totipotencia y pluripotencia.

En particular, se ha mostrado que PGCs cultivadas usando los cuatro factores de crecimiento anteriores durante al menos 25 días, pueden colonizar exitosamente las gónadas y producir pollos quiméricos. Además, hemos mantenido células PGC en cultivo hasta por cuatro meses. Estos cultivos todavía parecen comprender células que tienen el fenotipo de PGC deseado. Aunque estas células no fueron probadas por su capacidad para producir aves quiméricas, basadas en su apariencia, se espera que deberían ser útiles para lo mismo.

Transfección de PGC

La lipofección de un vector conteniendo el gen reportador de proteína de fluorescencia verde ha sido usado para la transfección de PGCs. En promedio 1/50 PGCs fueron transfectadas transitoriamente, sin embargo, no se ha desarrollado todavía una línea celular transfectada estable.

En resumen, estos resultados indican que las PGCs pueden ser mantenidas durante períodos largos y ser usadas exitosamente para la producción de aves quiméricas. Cambios adicionales en concentraciones de factor(es) de crecimiento y el uso de otros factores de crecimiento pueden optimizar adicionalmente las condiciones de cultivo. Para ser útil, un sistema de cultivo de PGC debería permitir la transfección y selección de PGCs, al tiempo que mantiene la capacidad de PGC para migrar a las gónadas. Además, como se describe con más detalle en una solicitud relacionada (presentada en la misma fecha), las PGCs de pollo, 3 de agosto de 1998 después de un cultivo prolongado, revierten al fenotipo de célula ES, como ocurre con PGCs de ratón (Matsui et al., Cell, 70:841-847, 1992). En consecuencia, la inyección de células ES dispersadas en blastodermos receptores debería proporcionar otro medio para la generación de pollos quiméricos y transgénicos.

Claims (15)

1. Un método de cultivo, el cual proporciona mantenimiento de células germinales primordiales de aves durante períodos de al menos 14 días en cultivo de tejidos, que comprende los siguientes pasos:

(i)

aislar una población pura de células germinales primordiales de un ave deseada; y

(ii)

cultivar dicha población pura, aislada, de células germinales primordiales (PGCs) en un medio de cultivo que contiene al menos los siguientes factores de crecimiento contenidos en cantidades suficientes para mantener dichos PGCs durante al menos 14 días en cultivo de tejido:

(1)

factor inhibidor de leucemia (LIF),

(2)

factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF),

(3)

factor de célula eje (SCF) y

(4)

factor de crecimiento similar a insulina (IGF), durante un período prolongado.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las cantidades mínimas de dichos factores de crecimiento son:

(1)

LIF (0,00625 U/\mul),

(2)

bFGF (0,25 pg/\mul),

(3)

IGF (0,5625 pg/\mul), y

(4)

SCF (4,0 pg/\mul).

3. El método de la reivindicación 2, en donde las cantidades de dichos factores de crecimiento varían desde:

(1)

LIF 0,1 U/\mul a 100,0 U/\mul

(2)

bFGF 4,0 pg/\mul a 4000 pg/\mul

(3)

IGF-I 6,0 pg/\mul a 6000,0 pg/\mul, y

(4)

SCF 8,0 pg/\mul a 8000 pg/\mul.

4. El método de la reivindicación 3, donde las cantidades de dichos factores de crecimiento varían desde:

(1)

LIF 1,0 U/\mul a 10,0 U/\mul

(2)

bFGF 40,0 pg/\mul a 400,0 pg/\mul

(3)

IGF-I 60,0 pg/\mul a 600,0 pg/\mul, y

(4)

SCF 80,0 pg/\mul a 800,0 pg/\mul.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichas PGCs de ave son obtenidas de un ave del género Gallinacea.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dichas PGCs son PGCs de pollo o PGCs de pavo.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichas PGCs son mantenidas en cultivo durante al menos 14 días.

8. Un método para producir aves quiméricas, el cual comprende:

(i)

aislar una población pura de células germinales primordiales de un ave;

(ii)

mantener dichas PGCs aisladas, purificadas, en un medio de cultivo de tejido que contiene al menos los siguientes factores de crecimiento:

(1)

factor inhibidor de leucemia (LIF),

(2)

factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF),

(3)

factor de célula eje (SCF) y

(4)

factor de crecimiento similar a insulina (IGF);

(iii)

transferir dichas PGCs en un embrión de ave receptor de la misma especie que el ave usada para obtener dichas PGCs aisladas, purificadas;

(iv)

permitir que dicha ave receptora se desarrolle como ave, y

(v)

seleccionar aves quiméricas que expresen el fenotipo de PGC.

9. El método de acuerdo a la reivindicación 8, en donde dichas PGCs son derivadas de embriones de aves del género Gallinacea.

10. El método de acuerdo a la reivindicación 9, en donde dichos embriones de aves son embriones de pavo o pollo.

11. El método de acuerdo a la reivindicación 10, en donde las PGCs son inyectadas en la aorta dorsal y/o vena marginal de un embrión de ave receptor o en blastodermos receptores.

12. Un cultivo in vitro que consiste esencialmente de PGCs de ave aisladas purificadas, en un medio que contiene factores de crecimiento que proporcionan dichas PGCs para ser mantenidas establemente in vitro durante al menos 14 días.

13. El cultivo in vitro de la reivindicación 12, en donde dichos factores de crecimiento comprenden:

(1)

factor inhibidor de leucemia (LIF),

(2)

factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF),

(3)

factor de célula eje (SCF) y

(4)

factor de crecimiento similar a insulina (IGF).

14. El cultivo de la reivindicación 12 ó 13, en donde dichas PGCs de ave son de la especie Gallinacea.

15. El cultivo de la reivindicación 14, en donde dichas PGCs de ave son PGCs de pollo o pavo.