CN116210647A - 一种使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法，该方法将经实验室长期培养的白羽肉鸡原始生殖细胞干细胞系注射到蛋鸡的胚胎中，并从该蛋鸡的下一代中获得白羽肉鸡。本发明使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法与传统方法相比，提供了新的育种平台，解决了白羽肉鸡育种过程中耗时较长、管理困难和动物福利等问题。

Description

一种使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法
技术领域
本发明属于鸡生物育种技术领域，具体涉及一种使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法。
背景技术
白羽肉鸡以其生长速度快、料肉比低的优点，已经成为养殖业中最有效的动物蛋白生产方式。白羽肉鸡的高效生产力是通过长期的遗传筛选得到的。
白羽肉鸡的扩繁从纯系原种鸡开始，通过曾祖代种鸡、祖代种鸡、父母代种鸡到商品代肉鸡这种多级放大的方式，使得一个白羽原种可以产出几十万到百万个后代肉鸡。
长期的遗传筛选使肉鸡生长越来越快，同时肉鸡的胃口变得越来越大，进而引起过度肥胖和繁殖力下降。肉鸡种鸡(broiler breeder)生产普遍采取限制食量(feedrestriction)的管理方式，但限制喂食又引起肉鸡种鸡其他问题，比如长期饥饿和应激反应，因而成为生产管理和动物福利的问题。这些问题反而使肉鸡种鸡的进一步遗传筛选变得更加困难。现有的体系下，白羽肉鸡育种好像已走到极限。
现有的白羽肉鸡扩繁方式成本高、管理难、耗时长(从一个白羽优种到市场需要2-3年的时间)，而且种鸡不能长期重复利用，需要不断重新育种扩繁。
因此，本领域亟需一种新的快速扩繁肉鸡的方法。
发明内容
如前所述，本领域需要一种快速扩繁肉鸡的方法。
本发明人选用合适的白羽肉鸡原始生殖细胞进行长期培养以建立原始生殖细胞干细胞系，然后注射合适数量的来源于所述原始生殖细胞干细胞系的细胞到高产蛋鸡胚胎中，再从蛋鸡的下一代受精蛋中获得白羽肉鸡苗。由此，实现了本发明。
因此，本发明提供了一种使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法，所述方法包括以下步骤：
1)从白羽肉鸡胚胎的生殖新月组织分离原始生殖细胞，并培养所述原始生殖细胞以建立原始生殖细胞干细胞系；
2)将来源于所述原始生殖细胞干细胞系的细胞注射到13-18期蛋鸡胚胎的血管中；
3)继续孵化所述蛋鸡胚胎至出雏，并保留孵化出的同性别嵌合体鸡苗；
4)饲养所述同性别嵌合体鸡苗至性成熟，然后进行人工受精或自然交配，以产出受精蛋；
5)孵化所述受精蛋至出雏，并且根据雏鸡的性状来区分其品种。
本发明方法利用原始生殖细胞能够长期培养增殖、随时冷冻保存的特征，突破白羽肉鸡扩繁的数量和时间的限制，使得一个白羽优种可以无限长期扩繁，重复利用；此外，也为白羽肉鸡育种提供新的平台，解决白羽肉鸡育种管理困难和动物福利问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法的示意图。
图2为本发明的使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法的一个具体实施方案的示意图。
图3为本发明的使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法的另一个具体实施方案的示意图。
图4为本发明的使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法的又另一个具体实施方案的示意图。
图5为本发明的使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法的又一个具体实施方案的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
在对本发明进行具体描述之前，需要特别指出，尽管在本文中采用步骤1)、步骤2)等方式来对本发明方法进行了描述，但是应该理解，该数字编号仅用于区分各步骤，而无意于以先后的顺序来对各步骤的顺序进行限定。这些步骤彼此之间可以按照数字编号顺序进行，可以按照数字编号顺序相反地进行，可以以任何其他顺序进行，或者可以同时进行，除非根据上下文可以明确判断需要以特定的顺序进行的除外。对于某个步骤中涉及的各动作，同样地，可以按照文字表述的顺序先后地进行，可以按照文字表述的顺序相反地进行，或者可以按照任何其他顺序进行，或者可以同时进行，除非根据上下文可以明确判断需要以特定的顺序进行的除外。
如上所述，现有的白羽肉鸡扩繁方式成本高、管理难、耗时长，而且种鸡不能长期重复利用，需要不断重新育种扩繁。
因此，本发明提供了一种使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法，所述方法包括以下步骤：
1)从白羽肉鸡胚胎的生殖新月组织分离原始生殖细胞，并培养所述原始生殖细胞以建立原始生殖细胞干细胞系；
2)将来源于所述原始生殖细胞干细胞系的细胞注射到13-18期蛋鸡胚胎的血管中；
3)继续孵化所述蛋鸡胚胎至出雏，并保留孵化出的同性别嵌合体鸡苗；
4)饲养所述同性别嵌合体鸡苗至性成熟，然后进行人工受精或自然交配，以产出受精蛋；
5)孵化所述受精蛋至出雏，并且根据雏鸡的性状来区分其品种。
下面对本发明方法的各步骤进行更详细的描述。
步骤1)：从白羽肉鸡胚胎的生殖新月组织分离原始生殖细胞，并培养所述原始生殖细胞以建立原始生殖细胞干细胞系。
在本文中，术语“原始生殖细胞(Primordial Germ Cell)”有时也表示为“PGC”，是指胚胎中二倍体生殖细胞的祖先细胞，其最终会发育为单倍体配子，如精子或者卵子。术语“原始生殖细胞干细胞系”是指将原始生殖细胞培养至少20天得到的保持其生殖的干细胞性即最终发育为精子或卵子的能力的细胞系。原始生殖细胞能够在实验室进行培养，并且在经至少20天的培养后，其数目可以达到2百万以上。
所述白羽肉鸡胚胎可以是来自于原种代、祖代或父母代的白羽肉鸡的胚胎。本领域技术人员知晓，白羽肉鸡采用四系配套育种方式，其中A系和B系是公系，C系和D系是母系。公系肉鸡生长更快，料肉比更低，但是产蛋少，每年少于100个蛋。母系育种兼顾产蛋和长肉，生长速度和料肉比没有公系好。在本发明中，这四个体系的白羽肉鸡均可公母组合使用，但是优选使用公系的白羽肉鸡。
从处于合适时期(例如从4期开始的时期(H&H期))的供体胚胎(在本发明中为白羽肉鸡胚胎)的生殖新月组织中分离原始生殖细胞。例如，所述白羽肉鸡胚胎为经短时(如约32小时)孵化而处于5-10期(H&H期)的白羽肉鸡胚胎。原始生殖细胞的体积一般是体细胞的2倍，因此很容易根据其大小对两者进行区分和分离。将分离得到的原始生殖细胞培养足够长的一段时间，以获得数量充足(例如2×107个细胞以上)的原始生殖细胞，由此建立原始生殖细胞干细胞系，以用于注射。在一个实施方案中，在步骤1)中，在包含10-100ng/mL酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和4-10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基例如KO-DMEM培养基中将所述原始生殖细胞培养20-60天，以建立所述原始生殖细胞干细胞系。该包含酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基在本文中也称为PGC培养液。所述酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子可以是任何来源，例如，来源于人类，也可以来源于其他动物，例如小鼠、大鼠、鸡等。此外，所述酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子可以直接从表达这些因子的细胞中分离提纯获得，也可以通过重组的方式获得，还可以直接商购。在一个实施方案中，所述PGC培养液包含：KO-DMEM、大鼠肝细胞(Buffalo Rat Liver BRL)KO-DMEM的条件培养液、胎牛血清、鸡血清、谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、青霉素/链霉素、人酸性成纤维细胞生长因子(hFGFa)、人碱性成纤维细胞生长因子(hFGFb)。在一个具体实施方案中，所述PGC培养液包含：46％KO-DMEM、40％大鼠肝细胞(Buffalo Rat Liver BRL)KO-DMEM的条件培养液、7.5％胎牛血清、2.5％鸡血清、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、0.1％β-巯基乙醇、1％青霉素/链霉素、10-100ng/mL人酸性成纤维细胞生长因子(hFGFa)、4-10ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(hFGFb)，其中百分比为各物质的终浓度体积百分比。进一步优选地，在该培养基中，人酸性成纤维细胞生长因子(hFGFa)的浓度为50ng/mL，人碱性成纤维细胞生长因子(hFGFb)的浓度为10ng/mL。在一个实施方案中，将所述细胞培养持续20-60天，由此可以获得相当数量(例如2×107以上)的原始生殖细胞。
在培养结束后，可以将经培养的原始生殖细胞直接注射(如显微注射)到受体胚胎中来实施本发明方法，也可以将经培养的原始生殖细胞冷冻于液氮中备用。在冷冻过程中，可以使用在上述PGC培养液的基础上另外加入10％胎牛血清和10％ DMSO得到的液体制剂作为冷冻保护液。当然，任何其他适合用于冷冻原始生殖细胞的冷冻保护液均可以使用，对此没有特别的要求。这样的原始生殖细胞可以长期冷冻保存，相当于把液氮罐中的PGC细胞系变成了肉鸡种鸡的保种场。
需要注意的是，根据步骤3)可以理解，需要对原始生殖细胞进行性别鉴定(见下文详述)。因此，在分离或者培养原始生殖细胞的过程中，需要分雌雄细胞系进行单独放置和培养。
步骤2)：将来源于所述原始生殖细胞干细胞系的细胞注射到13-18期蛋鸡胚胎的血管中。
首先，所述原始生殖细胞可以是来源于从白羽肉鸡胚胎的生殖新月组织分离的原始生殖细胞并将所述原始生殖细胞经进一步培养得到的原始生殖细胞干细胞系的细胞，还可以是所述原始生殖细胞干细胞系经冷冻保存并在复苏后进一步培养的原始生殖细胞。
在进行原始生殖细胞注射之前，受体鸡胚即蛋鸡胚胎已经进行了短时的孵化或者说已经进行了初步的发育。一般而言，注射优选在受体鸡胚发育的第13-18期(H&H期)进行，最优选在第15期进行。对鸡来说，根据其胚胎发育的各时期与时间的对应关系，注射时间优选在鸡胚发育的第1、2、3或4天，最优选在鸡胚发育的第2-2.5天。
注射原始生殖细胞的这一步骤可以在事先对受体鸡胚进行过或者没有进行过清除内源性原始生殖细胞的情况下进行。在本文中，所谓“清除内源性原始生殖细胞”可以与术语“绝育”互换使用，是指清除掉受体鸡胚自身的原始生殖细胞从而使其基本不能产生其自身的配子(包括精子和卵子)的处理。
因此，在本发明的一个实施方案中，将供体原始生殖细胞注射到事先已清除内源性原始生殖细胞的受体胚胎内。通过这种方式，在受体胚胎发育到性成熟时，其可以产生全部由或者基本由供体原始生殖细胞产生的配子或者说供体配子。所述清除内源性原始生殖细胞的操作可以在进行步骤2)之前以及/或者之后进行，具体取决于所采用的清除方法。另外，清除所述蛋鸡胚胎的内源性原始生殖细胞可以通过以下方法进行：化学方法，如采用白消安(参见，例如，美国专利US6691638B2，其公开内容通过引入纳入本文)；物理方法，如X光辐照；或者生物学方法，如特异性诱导内源性生殖细胞致死的方法(参见，例如，美国专利US20210345592A1，其公开内容通过引入纳入本文)。可以理解，内源性原始生殖细胞的清除可以采用单独的一种方法，也可以采用多种方法，具体视情况而定。另外，内源性原始生殖细胞的清除是在注射供体原始生殖细胞之前还是之后进行，也视情况而定。对于物理或者化学的清除方法，需要在进行步骤2)之前进行，而对于生物学的清除方法，则在进行步骤2)之前或者之后进行均可，但优选在步骤2)之后进行。另外，本领域技术人员还可以理解，物理或者化学的清除方法难以实现百分百清除掉内源性原始生殖细胞，因此本发明方法还可以辅以其他可以鉴别后代品种的方式。例如，可以采用外观与白羽肉鸡不同的蛋鸡(例如，纯种黑色蛋鸡或者裸颈蛋鸡)作为受体蛋鸡，由此可以利用该受体蛋鸡的下一代鸡苗的毛色或者羽毛生长状态等特征来简单地鉴别后代品种(见后文详述)。
在本发明的另一个实施方案中，将供体原始生殖细胞注射到事先未清除内源性原始生殖细胞的受体蛋鸡胚胎内。可以理解，在此种情况下，由于受体蛋鸡还包含自身的内源性原始生殖细胞，因此其后代不仅仅包括纯种白羽肉鸡品种，还包括纯种蛋鸡品种以及这两者的杂交品种。为此，为了简单鉴别这些后代品种，如上所述，可以采用外观与白羽肉鸡不同的蛋鸡(例如，纯种黑色蛋鸡或裸颈蛋鸡)作为受体蛋鸡，由此可以利用该受体蛋鸡的下一代鸡苗的毛色或者羽毛生长状态等特征来简单地鉴别后代品种(见后文详述)。
无论事先有无清除受体鸡胚内的内源性原始生殖细胞，优选地，每个蛋鸡胚胎注射3×104-5×104个供体原始生殖细胞。相比而言，在现有技术中，一般每个受体鸡胚内仅注射数量相对少得多的原始生殖细胞，例如每个受体鸡胚仅注射100-1000个原始生殖细胞。通过在一个蛋鸡胚胎中注射入大量供体原始生殖细胞，可以使该供体原始生殖细胞的数量大大超过内源性蛋鸡原始生殖细胞，以实现用未清除内源性原始生殖细胞的蛋鸡生产出高比例的肉鸡后代。
在进行供体原始生殖细胞注射的过程中，优选地采用针尖直径35-37微米的注射针。根据胚胎的准确的发育时期和位置，将针头注入胚胎外周静脉血管、胚胎腹部主动脉或刚刚开始跳动的心脏，止于鸡上部的体液中或止于鸡本身内。在插入针头之前，可以在蛋壳上打或钻一个孔或一组孔，以免损坏或破坏针头。在注射结束后，可以用诸如蜡之类的细菌基本不能渗透的密封材料密封所述卵，以便阻止不需要的细菌随后进入。
步骤3)：继续孵化所述蛋鸡胚胎至出雏，并保留孵化出的同性别嵌合体鸡苗。
在注射结束后，将所述蛋鸡胚胎转移到孵化器中继续孵化，直至孵化出鸡苗。孵化蛋鸡胚胎可以采用本领域已知的常规条件和方法，只要能使蛋鸡胚胎最终孵化出鸡苗即可，对其没有特别的限制。
本领域技术人员知晓，供体原始生殖细胞具有雌雄性别之分，受体蛋鸡鸡胚也具有雌雄性别之分，因此孵化出的鸡苗会包括四种情况，即：(1)包含雄性供体原始生殖细胞的雄性鸡苗、(2)包含雌性供体原始生殖细胞的雌性鸡苗、(3)包含雄性供体原始生殖细胞的雌性鸡苗、(4)包含雌性供体原始生殖细胞的雄性鸡苗。这其中，第(1)和(2)种情况涉及到的鸡苗在本文中被定义为同性别嵌合体鸡苗，而第(3)和第(4)种情况涉及到的鸡苗在本文中被定义为异性嵌合体鸡苗。因此，在该步骤中，仅保留第(1)和(2)种情况涉及到的同性别嵌合体鸡苗，而剔除第(3)和第(4)种情况涉及到的异性嵌合体鸡苗。
为区分这几种情况下的鸡苗，可以理解，需要对供体原始生殖细胞(或者说供体鸡胚)和受体鸡胚的性别进行鉴定。对于供体原始生殖细胞性别的鉴定，可以采用分离原始生殖细胞后剩余的鸡胚组织来进行，也可以采用经分离和培养的PGC自身来进行，而对于受体鸡胚，可以待鸡苗孵化出后采用其任何合适的样本如血液等来进行性别鉴定，也可采用白羽肉鸡生产过程中常用的鸡苗性别鉴定方法(如翻肛鉴别法)以节省成本。在本发明方法中，可以采用PCR来进行性别鉴定，其中使用可商购的用于鉴定鸟类性别的PCR引物对，例如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对。当然，本领域技术人员知晓，任何其他可以用于进行性别鉴定的方法也是可以使用的，并且均在本领域技术人员的能力范围内。
步骤4)：饲养所述同性别嵌合体鸡苗至性成熟，然后进行人工受精或自然交配，以产出受精蛋。
对于人工受精或者自然交配，可以在雌性同性别嵌合体鸡与雄性同性别嵌合体鸡之间进行，也可以在雌性同性别嵌合体鸡与白羽肉鸡父母代公鸡之间进行。作为一个示例，所述白羽肉鸡父母代公鸡可以是通过本发明方法得到的白羽肉鸡后代。
步骤5)：孵化所述受精蛋至出雏，并且根据雏鸡的性状来区分其品种。
可以理解，在完全清除掉受体鸡胚内的内源性原始生殖细胞的情况下，同性别嵌合体鸡苗通过人工受精或者自然交配所获得的后代均为白羽肉鸡。当然，这是极为理想的情况，现实的情况是难以百分百清除掉受体鸡胚内的内源性原始生殖细胞，特别是在通过物理或者化学的方法进行清除的情况下。此外，如上文所述，在某些情况下，在注射供体原始生殖细胞前并不对受体鸡胚的原始生殖细胞进行清除处理。在以上两种情况下，后代均不可避免地包括纯种肉鸡、纯种蛋鸡以及杂交鸡这三个品种。
为了区分这三个品种，可以考虑采用多种不同的方法。
例如，在肉鸡和蛋鸡品种均具有白色羽毛的情况下，可以根据雏鸡的生长速度和胸肌生长状况来区分后代品种，其中生长速度和胸肌生长最快的为纯种肉鸡，而生长速度和胸肌生长最慢的为纯种蛋鸡，介于其间的则为杂交鸡。
此外，还可以辅以其他能够简单地区分各品种的方式来进行本发明方法。例如，可以采用外观如毛色和羽毛生长状态与白羽肉鸡不同的蛋鸡作为受体蛋鸡，由此可以利用该受体蛋鸡产出的下一代鸡苗的毛色或者羽毛生长状态等特征来简单地鉴别后代品种。作为一个示例，可以采用裸颈蛋鸡作为受体蛋鸡。因此，在新孵出的雏鸡中，白羽肉鸡全身被覆均匀的浅黄色绒毛，而裸颈蛋鸡颈脖处于裸露状态，无羽毛覆盖，而杂交鸡的外观则介于白羽肉鸡和裸颈蛋鸡之间。作为另外一个示例，可以采用黑羽蛋鸡作为受体蛋鸡。因此，在新孵出的雏鸡中，白羽肉鸡全身被覆均匀的浅黄色绒毛，黑羽蛋鸡则具有黑色的羽毛，而杂交鸡的羽毛则间杂有黑色。通过这种方式，可以非常容易地将纯种肉鸡、纯种蛋鸡和杂交鸡这三个品种区分开。
在步骤5)中得到的白羽肉鸡可以作为商品代肉鸡，也可以作为父母代肉鸡进一步用于白羽肉鸡的扩繁中。在进一步用于白羽肉鸡的扩繁中时，可以进一步地选择出与商品代肉鸡相比生长更快且料肉比更小的肉鸡个体，并将由其获得的受精蛋进一步用于本发明方法的步骤1)-5)中，以实现对肉鸡的进一步选种和扩繁。
图1为本发明的使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法的示意图，图2-5示出了本发明方法的几个具体实施方案。下面参照这些附图对本发明方法进行更为详细的描述。
图1为本发明的使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法的示意图。如图所示，首先，将肉鸡种蛋孵化(例如在37.8℃、60％湿度)一段时间(32小时)，以使肉鸡种蛋发育为5-10期(H&H)胚胎。随后，从所述肉鸡胚胎的生殖新月组织分离原始生殖细胞，并培养所述原始生殖细胞以建立原始生殖细胞干细胞系(即供体原始生殖细胞)，然后根据具体情况处理。例如，所述原始生殖细胞干细胞系可以在经培养后用于注射，或者在经培养、冷冻、复苏、再培养后再用于注射。对于作为受体的蛋鸡受精蛋，可以预先将其孵化一段时间，例如2.5天，以使其胚胎发育至13-18期，再将供体原始生殖细胞通过显微注射输送到受体鸡胚的血管内。可以在注射供体PGC之前和/或之后清除受体鸡胚的内源性PGC(未图示)。作为一个示例，可以在注射供体PGC之前通过化学或者物理的方法清除受体鸡胚的内源性PGC，并且在注射供体PGC之后进一步通过生物学的方法来清除受体鸡胚的内源性PGC。当然，可以理解，在注射供体PGC之前可以不清除内源性PGC，而直接在注射供体PGC之后通过生物学方法来特异性诱导杀死内源性PGC。当然，也可以不对受体鸡胚的内源性PGC进行清除，而通过其他方式来鉴别后代品种。随后，继续孵化所述蛋鸡胚胎直至出雏，并保留孵化出的同性别嵌合体鸡苗。饲养所述同性别嵌合体鸡苗至性成熟，然后通过人工受精的方式或者自然交配的方式使雌性同性别嵌合体成鸡生产出受精卵。孵化所述受精卵至出雏，并根据雏鸡的性状来区分其品种。所得纯种白羽肉鸡品种可以作为扩种肉鸡进一步用于本发明方法中，或者作为商品代肉鸡进行饲养并上市。
图2示出了本发明方法的一个具体的实施方案，其中白羽肉鸡和受体蛋鸡在外观上难以区分。在此种情况下，如果能够百分百清除受体鸡胚内的内源性原始生殖细胞，则蛋鸡后代均为肉鸡，该肉鸡可以进一步用于肉鸡扩种或者作为商品代肉鸡使用。当然，在不能够百分百清除受体鸡胚内的内源性原始生殖细胞的情况下，则可以考虑根据蛋鸡后代的生长速度以及胸肌生长状况等特点来进行品种区分，如上文所述。
图3示出了本发明方法的另一个具体的实施方案，其中选用裸颈蛋鸡作为受体蛋鸡。由于裸颈蛋鸡和白羽肉鸡在外观上有明显差异，因此该方案无需对作为受体鸡的裸颈蛋鸡进行内源性PGC清除。在该具体实施方案中，由于裸颈蛋鸡具有不同于白羽肉鸡的外观特征，因此尽管没有对裸颈蛋鸡的内源性PGC进行清除，但是通过新出雏的雏鸡的外观即可简单地区分开纯种肉鸡(浅黄色绒毛)、纯种裸颈蛋鸡(颈脖处裸露)和杂交鸡(介于其间)这三个品种。当然，本领域技术人员可以理解，在该具体实施方案中，也可以对所述裸颈蛋鸡进行内源性PGC清除处理。
图4示出了本发明方法的又另一个具体的实施方案，其中选用黑羽蛋鸡作为受体蛋鸡。由于黑羽蛋鸡和白羽肉鸡在外观上有明显差异，因此该方案无需对作为受体鸡的黑羽蛋鸡进行内源性PGC清除。在该具体实施方案中，由于黑羽蛋鸡具有不同于白羽肉鸡的外观特征，因此尽管没有对黑羽蛋鸡的内源性PGC进行清除，但是通过新出雏的雏鸡的外观即可简单地区分开纯种肉鸡(浅黄色绒毛)、纯种黑羽蛋鸡(主要为黑色绒毛)和杂交鸡(浅黄色绒毛中夹杂少许黑色绒毛)这三个品种。当然，本领域技术人员可以理解，在该具体实施方案中，也可以对所述黑羽蛋鸡进行内源性PGC清除处理。
图5示出了本发明方法的又一个具体的实施方案。在该方法中，从雌性白羽肉鸡(特别是AB系的雌性白羽肉鸡)胚胎的生殖新月组织分离雌性原始生殖细胞，并对其进行培养以获得雌性原始生殖细胞干细胞系，并视情况直接注射到受体蛋鸡鸡胚内，或者在对其进行冻存、复苏、再培养后再注射到受体蛋鸡鸡胚内。另外，由于受体蛋鸡仅接收到雌性原始生殖细胞，因此由该受体蛋鸡得到的后代只能携带雌性原始生殖细胞。因此，使该蛋鸡性腺嵌合体母鸡(即同性别嵌合体鸡)与肉鸡父母代公鸡通过人工受精或自然交配以产生受精蛋，该受精蛋在孵化后可以得到大于50％的纯种白羽肉鸡以及小于50％的杂交817肉鸡。另外，这里可以采用海兰褐蛋鸡作为受体蛋鸡，并且在供体PGC注射过程中，可以在一个受体蛋鸡胚胎的血管内注射3-5万个供体PGC。无论是纯种白羽肉鸡还是杂交817肉鸡，都具有相当的经济价值。在这里，作为肉鸡父母代公鸡，可以是本发明方法的步骤1)中用于分离原始生殖细胞的父母代公鸡，也可以是通过本发明方法获得的纯种肉鸡。
本发明的有益效果包括以下一个或者多个：
(1)高产蛋鸡每年可产300-340个蛋，肉鸡父母代种鸡只产150-170个蛋，用高产蛋鸡代替肉鸡父母代种鸡，鸡苗生产效率提高一倍；
(2)在现有的肉鸡扩繁体系中，从祖代到父母代再到商品代要2年时间，而本发明中原始生殖细胞注射到商品代鸡苗只需要6个月，缩短了肉鸡扩种的周期；
(3)肉鸡父母代种鸡体重是蛋鸡一倍以上，采食量每天至少多吃50％，并难以管理，本发明使用蛋鸡可节省种鸡饲料和管理费用；
(4)优质原始生殖细胞系能够永久保存在液氮罐(-196℃)中，可减少肉鸡育种或进口引种；利用原始生殖细胞培养和原始生殖细胞扩种，一个肉鸡种产生的后代可提高上百万倍；优良肉鸡种系可重复利用，不需要重复育种；
(5)原始生殖细胞扩种彻底解决了肉鸡父母代种鸡长期饥饿的动物福利问题；
(6)提供新的育种平台，加快中国本土肉鸡育种进程。
实施例
下面结合实施例对本发明进行更为具体和详细的描述。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规化试剂商店购买所得。应注意，上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。
实施例1
本实施例给出了使用原始生殖细胞干细胞系和高产蛋鸡(白来航鸡)扩繁白羽肉鸡的一种方法，其流程可以参照图1和图2。下面对该方法进行详细描述。
白羽肉鸡PGC细胞系的建立：
PGC细胞系的培养液(PGC培养液)组成如下：46％ KO-DMEM、40％大鼠肝细胞(Buffalo Rat Liver BRL)KO-DMEM的条件培养液、7.5％胎牛血清、2.5％鸡血清、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、0.1％β-巯基乙醇、1％青霉素/链霉素，上述百分比是指终浓度体积百分比。使用前添加50ng/mL重组人酸性成纤维细胞生长因子和10ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子。
将商品代罗斯308受精卵(即肉鸡种蛋)在37.8℃、60％的湿度情况下孵化32小时，以发育至第5-10期(H&H)。然后从发育到这一时期的胚胎中分离生殖新月(germinalcrescent)的部分组织，并将分离的生殖新月组织转移到含200μL PGC培养液的1.5mL离心管中。然后，将经分离的生殖新月组织用200μL吸头吹打40-50次，使大部分细胞成为单细胞悬浮液，移液至48孔板培养，加入辐照后的大鼠肝细胞作滋养层。从培养开始到培养第10天，每2天除去一半培养液，把剩下的一半移到新的滋养层上，并加一半新的PGC培养液。培养20天以上，细胞数达到2百万，并且1-2天数量翻倍，该培养可确认为PGC干细胞系。对于培养得到的PGC干细胞系，可用添加有10％胎牛血清和10％DMSO的PGC培养液冷冻在液氮罐中，备用。
通过PCR鉴定细胞系性别：
在1.5mL Eppendorf离心管中，一个细胞系1000个以上细胞用20μL 0.1M TrisHCl(pH7.5)悬浮裂解，加入20μL 0.2M NaOH，加热到99℃并在99℃持续6分钟。然后，再加55μL 0.1M Tris HCl中和，并14000转/分钟离心5分钟，取每个样品2μL作为用于PCR的DNA模板。鸟类性别鉴定的PCR引物是USP1(5’-CTATGCCTACCACMTTCCTATTTGC-3’(SEQ ID NO:1)，其中M＝A/C)/USP3(5’-AGCTGGAYTTCAGWSCATCTTCT-3’(SEQ ID NO:2)，其中Y＝T/C，W＝A/T，S＝C/G)以及对照引物actin-F3(5’-ATGCGCATAAAACAAGACGAGATT-3’(SEQ ID NO:3))/actin-R3(5’-GGGGACTGTAAAGCCTTCATTCAC-3’(SEQ ID NO:4))。PCR扩增的程序如表1所示。
表1：PCR扩增程序
Figure BDA0004082090080000141
性腺嵌合体鸡的制备：
在将冷冻的PGC干细胞系复苏后，将其培养5-7天到恢复生长，每2天细胞数加倍。收集PGC培养液，500g离心5分钟，以2×104-3×104/μL的细胞浓度重悬浮。
采用白来杭蛋鸡作为受体蛋鸡。将白来杭蛋鸡受精卵放入孵化器中孵化，并在孵化第2.5天向每个蛋鸡胚胎注射1-1.5μL细胞悬浮液，之后继续孵化直至出雏。然后，采用与上文描述的性别鉴定方法相同的方法对雏鸡进行性别鉴定，仅保留同性别嵌合体雏鸡，包括包含雄性PGC的雄性雏鸡以及包含雌性PGC的雌性雏鸡。表2示出注射供体PGC后受体鸡胚的孵化率，从该表中可以看出孵化率平均可达50％以上。
表2：肉鸡PGC干细胞系注射至蛋鸡胚胎制备性腺嵌合体鸡的孵化率
Figure BDA0004082090080000151
由白来杭蛋鸡受精蛋孵化出白羽肉鸡：
将鉴别出的同性别嵌合体雏鸡饲养至性成熟(大约160天)，然后将注射有肉鸡PGC干细胞系的蛋鸡公鸡和母鸡随机进行人工受精，收集受精卵并孵化收集到的受精卵直至出雏。由于白来杭蛋鸡和白羽肉鸡均具有白色羽毛，因此根据其毛色无法区分纯种肉鸡、杂交鸡或纯种蛋鸡。于是对孵出雏鸡进行饲喂试验，以根据其生长状况来进行区分。具体地，对所有孵出雏鸡饲喂肉鸡饲料，并在同等条件下进行纯肉鸡和蛋鸡饲喂对照。一个星期后，纯种蛋鸡由于生长缓慢而可从纯种肉鸡和杂交鸡中选出。然后利用以下公式可以计算出肉鸡平均性腺传递的比率和纯肉鸡后代的比率：
Figure BDA0004082090080000152
Figure BDA0004082090080000153
表3示出了根据上述公式计算得到的用注射有PGC的公母嵌合体蛋鸡生产出的白羽肉鸡比例。从该表中可以看出，纯种白羽肉鸡后代比率介于61.1％至79.8％之间，平均为71.1％。由此可见，利用蛋鸡扩繁白羽肉鸡，其后代纯种白羽肉鸡占相当比率，实用性极强。
表3：用注射PGC的公母嵌合体蛋鸡生产出肉鸡的比率
Figure BDA0004082090080000154
实施例2
本实施例给出了使用原始生殖细胞干细胞系和高产蛋鸡(黑羽蛋鸡)扩繁白羽肉鸡的另一种方法，其流程可以参照图5。下面对该方法进行详细描述。
白羽肉鸡雌性PGC细胞系的建立：
由商品代罗斯308白羽肉鸡AB公系的胚胎培养出AB2和AB9两个雌性PGC细胞系，建系方法同实施例1中的“白羽肉鸡PGC细胞系的建立”，细胞系性别鉴定同实施例1中的“通过PCR鉴定细胞系性别”，并保留白羽肉鸡雌性PGC细胞系。
性腺嵌合体鸡的制备：
在将冷冻的雌性PGC干细胞系AB2和AB9复苏后，将其培养5-7天到恢复生长，每2天细胞数加倍。收集PGC培养液，500g离心5分钟，以2×104-3×104/μL的细胞浓度重悬浮。
从京粉8号蛋鸡中筛选出纯黑羽蛋鸡作为受体蛋鸡。将黑羽蛋鸡受精卵放入孵化器中孵化，并在孵化第2.5天向每个蛋鸡胚胎注射1-1.5μL细胞悬浮液(约3×104个细胞/蛋鸡鸡胚)，之后继续孵化直至出雏。然后，采用与实施例1中描述的性别鉴定方法相同的方法对雏鸡进行性别鉴定，仅保留嵌合体雌性雏鸡。
由黑羽蛋鸡受精卵孵化后代：
将鉴别出的嵌合体雌性雏鸡饲养至性成熟(大约160天)，然后与白羽肉鸡父母代公鸡进行人工受精，收集受精卵并孵化收集到的受精卵直至出雏。孵化出的后代包括公系肉鸡和817杂交鸡，结果示于表4。从该表中可以看出，白羽肉鸡百分比高达82％-85％，可见所获得的白羽肉鸡比例极高。
表4：扩繁公系白羽肉鸡后代的结果
Figure BDA0004082090080000161
以上对本发明所提供的快速扩繁白羽肉鸡的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法，包括以下步骤：
1)从白羽肉鸡胚胎的生殖新月组织分离原始生殖细胞，并培养所述原始生殖细胞以建立原始生殖细胞干细胞系；
2)将来源于所述原始生殖细胞干细胞系的细胞注射到13-18期蛋鸡胚胎的血管中；
3)继续孵化所述蛋鸡胚胎至出雏，并保留孵化出的同性别嵌合体鸡苗；
4)饲养所述同性别嵌合体鸡苗至性成熟，然后进行人工受精或自然交配，以产出受精蛋；
5)孵化所述受精蛋至出雏，并且根据雏鸡的性状来区分其品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，在包含10-100ng/mL(优选50ng/mL)酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和4-10ng/mL(优选10ng/mL)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基中将所述原始生殖细胞培养20-60天，以建立所述原始生殖细胞干细胞系。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，每个蛋鸡胚胎注射3×104-5×104个来源于所述原始生殖细胞干细胞系的细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在进行步骤2)之前和/或之后，清除所述蛋鸡胚胎的内源性原始生殖细胞；优选地，所述清除通过以下方法进行：化学方法，如采用白消安；物理方法，如X光辐照；以及/或者生物学方法。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，在饲养所述同性别嵌合体鸡苗至性成熟后，使雌性同性别嵌合体成鸡与雄性同性别嵌合体成鸡自然交配或者进行人工受精，以产出受精蛋。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，在饲养所述同性别嵌合体鸡苗至性成熟后，使雌性同性别嵌合体成鸡与白羽肉鸡父母代公鸡自然交配或者进行人工受精，以产出受精蛋。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述白羽肉鸡父母代公鸡是通过权利要求1-5中任一项所述的方法得到的。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤5)中，所述雏鸡的性状包括生长形状如生长速度和胸肌生长状况、或者羽毛外观。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述白羽肉鸡是原种代白羽肉鸡、祖代白羽肉鸡、父母代白羽肉鸡或商品代白羽肉鸡。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，通过PCR来对供体白羽肉鸡和受体蛋鸡的性别进行鉴定。
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