CN115088679A - 一种利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，包括如下步骤：步骤一、取鸡种蛋，孵化9‑11天，取性腺经离心、消化、重悬、过滤后，得单细胞悬液，加冻存液后，冷冻保存；步骤二、将步骤一保存后的单细胞悬液复苏；步骤三、取显性白羽鸡种蛋孵化2.5天，将1‑3μL的溧阳鸡性腺细胞注射进所述孵化后的显性白羽鸡鸡胚血管中；步骤四、将步骤三得到的种蛋经孵化、出雏、饲养至性成熟；步骤五、采集公鸡精液对步骤四获得的性成熟母鸡进行输精，获得种蛋并孵化出雏；步骤六、通过微卫星鉴定鸡后代。本发明能对溧阳鸡进行保种、复种和后代鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法。
背景技术
原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)是指能发育为精子或卵子的祖先细胞，属于配子前体细胞，原始生殖细胞作为干细胞研究的一种材料来源，凭借其自身特性将对研究体外胚胎发育、基因组学研究以及药理研究起到重要作用。在雌性和雄性动物中PGCs可分别形成卵原细胞和精原细胞，可将遗传信息传递给下一代，是具有高度未分化的发育全能性细胞。目前，国内外学者已经实现了从血液、原始生殖嵴等不同途径分离获得PGCs并建立了相应的培养体系。
研究发现，鸡PGCs经过体外培养和保存后，仍保持其生物学特性，注射到鸡胚血液系统后可迁移到性腺并发育成配子。因此，可以利用PGCs技术构建嵌合体鸡，即把供体鸡的PGCs取出，通过胚胎显微注射移植到受体鸡鸡胚中，所得到的嵌合体鸡具有供体鸡和受体鸡两种鸡的特性。此外，研究人员还发现将长期的低温冷冻保存的PGCs，解冻后移入受体胚胎也可以产生可育的生殖嵌合体。将生殖嵌合体的禽类自交，可以产生供体家禽。因此，应用PGCs进行禽类嵌合体的制备具有重要的生物学意义，家禽PGCs细胞为抢救和保护濒危珍稀禽类遗传资源提供了新的思路与方法。
我国地方禽种既是珍贵的自然资源，也是价值极高的经济资源，作为生物多样性的组成部分，还是未来家禽品种改良和适应生产条件变化、保持生产长期持续发展的遗传基础。漂阳鸡是我国优良的地方家禽品种资源，该鸡具有体型大，肉质鲜美和屠宰率较高等特点，先后被列入国家、江苏省家禽优质地方品种。在江苏省家禽生产中一直占有重要的地位。以往的研究已经报道了家禽嵌合体制备的方法，构建了不同的品种嵌合体。迄今为止，禽类嵌合体制备的效率都较低。制备嵌合体模型的条件对于恢复珍稀濒危品种以及品种资源多样性保护和利用起到至关重要的作用，对其条件的深入探索将是未来研究的重要方面。前人报道中，利用PGC技术进行嵌合体构建时，分离PGC多从孵化2.5d左右的鸡胚血液中分离，或从孵化5.5d的鸡胚生殖嵴分离获得。此时的鸡胚血管较细，鸡胚生殖嵴较小，采血和生殖嵴分离难度大，对技术人员的要求较高，可获得的PGC细胞数量也较少。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供本发明提供一种利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，目的是克服PGC构建嵌合体时，鸡胚孵化早期分离PGC细胞操作难度大、细胞数量少的问题。
基于上述目的，本发明提供了本发明提供了一种利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，包括如下步骤：
步骤一、取鸡种蛋，孵化9-11天，取性腺经离心、消化、重悬、过滤后，得单细胞悬液，加冻存液后，冷冻保存；
步骤二、将步骤一保存后的单细胞悬液复苏，调整细胞浓度为1-2×10 4个/μL；约含100-200个/μL的PGCs细胞；
步骤三、取显性白羽鸡种蛋孵化2.5天，将1-3μL的溧阳鸡性腺细胞注射进所述孵化后的显性白羽鸡鸡胚血管中；
步骤四、将步骤三得到的种蛋经孵化、出雏、饲养至性成熟；
步骤五、采集公鸡精液对步骤四获得的性成熟母鸡进行输精，获得种蛋并孵化出雏，分别获得白羽鸡和红羽鸡的后代；
步骤六、通过微卫星鉴定鸡后代。
作为一种可选的实施方式，所述步骤一中的鸡种蛋为溧阳鸡种蛋，孵化时间为10.5天。
所述步骤一中孵化的温度为37.5-38℃，相对湿度为60％。优选的，温度为37.8℃。
优选的，所述步骤一中消化的方法为加入预热的胶原酶IV进行消化，移液器吹打组织30s，37℃加热，直到看不到性腺为止。
优选的，所述步骤一中冷冻保存的温度为-80℃。
所述步骤二中复苏的单细胞悬液为保存6个月的单细胞悬液。
所述步骤三中种蛋孵化的温度为37.5-38℃，相对湿度为60％。优选的，温度为37.8℃。
作为一种可选的实施方式，所述步骤五中公鸡为溧阳鸡公鸡，获得的白羽鸡后代为杂交后代，红羽鸡后代为溧阳鸡后代。
所述步骤六中微卫星鉴定的方法为采集白羽鸡和红羽鸡后代血液提取DNA，合成引物MCW0098-F：GGCTGCTTTGTGCTCTTCTCG，MCW0098-R：CGATGGTCGTAATTCTCACGT，对微卫星位点MCW0098进行PCR扩增和基因型检测，显示出纯合的6个AC重复的个体为复种成功的溧阳鸡后代，否则为溧阳鸡和显性白羽鸡的杂交后代。
本发明的有益效果：本发明构建一种利用鸡胚发育中期性腺细胞构建嵌合体鸡的方法，对溧阳鸡进行保种、复种和后代鉴定，能够克服PGC构建嵌合体时，鸡胚孵化早期分离PGC细胞操作难度大、细胞数量少的问题。有关经济效益的预测分析如下(以保种溧阳鸡为例)：应用本发明的经济效益主要体现在可以用性腺细胞长期冻存保种，可以缩小保种群体规模。预计可以减少保种群个体数2000只，每只鸡以100元计，总共可节省成本20万元。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同鸡24号微卫星位点检测测序峰图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
常规保种需要较大规模的保种群、耗时费力、成本较高。此外，还面临疫病带来的保种群消失等风险。为了克服PGC构建嵌合体时，鸡胚孵化早期分离PGC细胞操作难度大、细胞数量少的问题，本发明构建了一种利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法。具体的优选实例如下。
实施例1
(1)取溧阳鸡种蛋，经消毒后，在37.8℃，相对湿度60％的条件下进行孵化。当种蛋孵化至10.5天时，取出鸡胚后解剖，将性腺收集于加有200μL PBS的1.5mL离心管中，吸弃PBS后，加入500μL预热的胶原酶IV进行消化，移液器吹打组织30s，37℃加热，反复直到看不到性腺为止。加入800μL 10％FBS-DMEM到消化液中终止消化，混匀后，在700g室温离心5min，弃去上清后加入培养基重悬细胞，使用70μM尼龙网过滤后制备成单细胞悬液。加冻存液后，-80℃冷冻保存。
(2)细胞保存6个月后取出并进行复苏，对性腺细胞进行细胞计数，调整细胞浓度为2×10 4个/μL。
(3)取白来航鸡(显性白羽)种蛋，经消毒后，在37.8℃，相对湿度60％的条件下进行孵化。当种蛋孵化至2.5天时，在种蛋钝端开口，将3μL溧阳鸡性腺细胞注射进鸡胚腹主动脉血管中并用无菌封口膜封口。
(4)将注射有溧阳鸡性腺细胞的白来航种蛋按正常孵化程序继续进行孵化，直至出雏，出雏后饲养至性成熟；
(5)当嵌合体母鸡性成熟后，采集溧阳鸡公鸡精液对其进行输精，获得种蛋并按正常孵化程序孵化出雏；分别获得了白羽和红羽的后代，由于白来航的白羽对溧阳鸡红羽为显性，故获得的白羽鸡为溧阳鸡和白来航鸡的杂交后代，红羽鸡为复种获得的溧阳鸡后代。
(6)对获得的红羽鸡继续进行饲养和观察，60日龄时，对这些个体进行血液采集，每只鸡采集0.5mL，提取DNA进行微卫星标记分析，与亲本溧阳鸡和白来航鸡的微卫星位点进行比对，以确认是否获得纯种的溧阳鸡复种后代。
微卫星标记检测和分析方法如下：参照《畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程NYT 1673-2008》附录H中所推荐的鸡微卫星遗传多样性座位和引物对亲本溧阳鸡和白来航鸡进行分析，选出差异位座位，并对后代的对应座位进行检测，根据该座位的微卫星分型情况判断后代是否为纯种溧阳鸡。
表1.MCW0098座位和引物序列
检测和分析结果如下：使用《畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程NYT 1673-2008》附录H中所推荐的鸡微卫星遗传多样性座位和引物对2个供体溧阳鸡鸡胚、3个受体白来航母鸡以及1个用于输精的溧阳鸡公鸡的30个微卫星进行检测分析，结果发现，微卫星位点24(座位名称MCW0098，见表1)在所测溧阳鸡中均为纯合的6个AC重复(图1)，在所测的白来航个体中均为纯合的7个AC重复(图1)，即该位点在品种内保守，品种间存在差异(表2)，是用于区分复种后代遗传来源的良好标记。因此，选择该标记对不同表型的复种后代进行检测，分别检测了红羽公母鸡各1组，白羽母鸡一只，检测结果见图1和表1。从检测结果来看，白羽母鸡的24号位点为6个和7个AC重复的杂合子，表明其为溧阳鸡公鸡和白来航母鸡的杂交后代(溧阳鸡公鸡精子与受体白来航鸡本身卵子结合的后代)；红羽公鸡和母鸡均为纯合的6个AC重复，表明其为复种成功的溧阳鸡后代(溧阳鸡公鸡精子与受体白来航鸡体内所注射入的溧阳鸡PGC形成的卵子结合后的后代)。
表2.亲本及复种后代鸡24号微卫星检测结果
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、取鸡种蛋，孵化9-11天，取性腺经离心、消化、重悬、过滤后，得单细胞悬液，加冻存液后，冷冻保存；
步骤二、将步骤一保存后的单细胞悬液复苏，调整细胞浓度为1-2×104个/μL；
步骤三、取显性白羽鸡种蛋孵化2.5天，将1-3μL的溧阳鸡性腺细胞注射进所述孵化后的显性白羽鸡鸡胚血管中；
步骤四、将步骤三得到的种蛋经孵化、出雏、饲养至性成熟；
步骤五、采集公鸡精液对步骤四获得的性成熟母鸡进行输精，获得种蛋并孵化出雏，分别获得白羽鸡和红羽鸡的后代；
步骤六、通过微卫星鉴定鸡后代。
2.根据权利要求1所述利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，其特征在于，所述步骤一中的鸡种蛋为溧阳鸡种蛋，孵化时间为10.5天。
3.根据权利要求2所述利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，其特征在于，所述步骤一中孵化的温度为37.5-38℃，相对湿度为60％。
4.根据权利要求2所述利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，其特征在于，所述步骤一中消化的方法为加入预热的胶原酶IV进行消化，移液器吹打组织30s，37℃加热，直到看不到性腺为止。
5.根据权利要求2所述利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，其特征在于，所述步骤一中冷冻保存的温度为-80℃。
6.根据权利要求2所述利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，其特征在于，所述步骤二中复苏的单细胞悬液为保存6个月的单细胞悬液。
7.根据权利要求2所述利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，其特征在于，所述步骤三中种蛋孵化的温度为37.5-38℃，相对湿度为60％。
8.根据权利要求2所述利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，其特征在于，所述步骤五中公鸡为溧阳鸡公鸡，获得的白羽鸡后代为杂交后代，红羽鸡后代为溧阳鸡后代。
9.根据权利要求8所述利用性腺细胞构建嵌合体鸡保种的方法，其特征在于，所述步骤六中微卫星鉴定的方法为采集白羽鸡和红羽鸡后代血液提取DNA，合成引物对微卫星位点MCW0098进行PCR扩增和基因型检测，显示出纯合的6个AC重复的个体为复种成功的溧阳鸡后代，否则为溧阳鸡和显性白羽鸡的杂交后代。
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| CN110283894A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-09-27 | 扬州大学 | 一种通过羽色结合分子遗传标记鉴别pgc移植后代鸡的鉴定方法 |
| CN111500531A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-08-07 | 扬州大学 | 一种鸡PGCs在体外长期培养的方法 |
-
2022
- 2022-07-20 CN CN202210863241.3A patent/CN115088679A/zh active Pending
Patent Citations (7)
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