KR101074448B1 - 효율적인 이종간 조류의 생식선 카이메라 및 형질전환체의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조류 사이의 이종간(interspecies) 생식선 카이메라의 제조방법 및 형질전환 조류의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 생식세포를 이용한 조류 사이의 이종간 생식선 카이메라 생산 시스템을 처음으로 확립한 것으로, 본 발명에서 연중 번식하는 가금을 이용하여 생산된 생식선 카이메라는 연중 번식이 가능하지 않은 준가금류 또는 멸종 위기 조류의 생식세포를 생산할 수 있으므로, 야생 또는 멸종 위기의 조류를 보존하는데 크게 기여할 수 있다. 또한 상기 방법은 이종의 품종을 이용하여 검정교배를 실시함으로써 이식된 공여체 유래 생식세포의 수정률을 높이는 효과를 가져올 수 있어 유전자 전이 기법의 응용과 함께 고효율의 형질전환조류 생산기법으로의 활용이 가능하다.
이종간 생식선 카이메라, 생식세포, 야생 조류, 멸종 위기의 조류, 형질전환 조류 생산 효율 개선
Description
본 발명은 조류 사이의 이종간(interspecies) 생식선 카이메라의 제조방법 및 이를 이용한 효율적인 형질전환 조류의 제조방법에 관한 것이다.
종래의 생식선 카이메라는 배아에 생식세포를 이전함으로써 가금류에서 생산되어 왔다1 -4. 이러한 기술은 생식세포가 기능을 갖는 생식세포로 분화하는 유연성5 -7 및 혈류를 통해 조류 생식세포가 이전되는8 독특한 패턴을 사용한다. 이러한 성공에 기초하여, 좀더 발전된 기술은 형질전환 새를 생산하는데 사용되었고, 이어서 형질전환 메추리를 생산하기에 이르렀다9. 포유동물의 보존에 사용되는 체세포 핵치환 기술10 -16이 조류에는 적용되지 않기 때문에, 그 대안으로써, 야생 또는 멸종위기의 조류 보존을 위해 생식세포 매개 생식선 전이가 시도되었다. 이 기술은 계절에 따른 생식, 다산의 증가 및 기술적 타당성으로 인한 야생 조류의 생식적 제 한을 극복할 수 있다. 그러나 이러한 기술적 실현 가능성이 있음에도 불구하고 그동안 성공하지 못해왔다.
국제 자연 보호 연합(IUCN, International Union for the Conservation of Nature and Natural Resources)은 2006년에 평가된 종의 시료들에 기초할 때 1,206 종의 조류가 포함하여 모든 생명체의 76%가 멸종 위기에 있는 것으로 추정하였다24. 따라서 이종간 생식선 이식은 멸종 위기인 조류의 보존을 위한 중요한 기술이 될 수 있으며, 이를 바탕으로 미래에 본 발명의 기술은 포유류, 파충류, 양서류 및 어류의 다른 척추 동물들에게도 적용될 수 있을 것이다.
본 발명은 특히 야생 조류를 생산하는 이종간의 생식세포 전이 기술에 대한 개발에 초점이 맞추어져 있다. 본 발명은 공여체의 생식세포를 야생 또는 멸종위기 조류 또는 연중 번식을 하지 않는 준가금류(예컨대, 꿩)의 배아에서 회수하여 가금류(예컨대, 닭)의 배아에 이전하는 시스템을 이용하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 그 동안의 연구 개발을 통해 습득한 조류의 생식세포 전이 기술을 바탕으로 조류 사이의 이종간(interspecies)에도 생식세포를 전이할 수 있는 효율적인 카이메라 및 형질전환체의 생산 시스템을 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 야생 또는 멸종 위기의 조류의 생산에 크게 기여할 수 있는 이종간 생식선 카이메라의 제조방법 및 이를 이용한 형질전환 조류의 생산 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 조류 사이의 이종간 생식선 카이메라의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 이종간 카이메라를 이용한 고효율 형질전환 조류의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 공여체 조류의 생식세포를 준비하는 단계; (b) 상기 공여체 조류의 생식세포를 다른 종에 속하는 수용체 조류의 난의 배아에 이식하는 단계; 및 (c) 상기 수용체 난을 배양 및 부화하여 생식선 카이메라 조류 개체를 수득하는 단계를 포함하는 조류 사이의 이종간(interspecies) 생식선 카이메라의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 그 동안의 연구 개발을 통해 습득한 조류의 생식세포 전이 기술을 바탕으로 조류 사이의 이종간(interspecies)에도 생식세포를 전이할 수 있는 효율적인 카이메라 및 형질전환체의 생산 시스템을 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 야생 또는 멸종 위기의 조류의 생산에 크게 기여할 수 있는 이종간 생식선 카이메라의 제조방법 및 형질전환 조류의 생산 가능성을 확인하였다.
본 발명은 조류에 있어서, 생식세포를 이용한 조류 사이의 이종간 생식선 카이메라 생산 시스템을 확립한 최초의 발명이다. 본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다:
(a) 공여체 조류로부터의 생식세포 준비
조류 사이의 이종간 생식선 카이메라를 제조하기 위한 본 발명의 첫 번째 프로토콜에 따르면, 공여체 조류의 생식세포(germ cells)가 이용된다.
본 명세서에서 조류를 언급하면서 사용되는 용어 “생식세포(germ cells)"는 조류의 생식체(gamete), 즉 정자 또는 난자의 선조체(progenitors)를 의미하며, 예를 들어 원시생식세포(primordial germ cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 정소생식세포(testicular germ cell), 정원줄기세포(spermatogonial stem cell) 및 생식선줄기세포(germline stem cell)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생식세포는 원시생식세 포(primordial germ cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 정소생식세포(testicular germ cell), 정원줄기세포(spermatogonial stem cell) 또는 생식선줄기세포(germline stem cell)이고, 보다 바람직하게는 원시생식세포(primordial germ cell)이다.
본 명세서에서 용어 “원시생식세포(primordial germ cells)”는 난자(ova) 및 정자(spermatozoa)의 선조세포를 의미하며, 전능성(pluripotent) 배아줄기세포 또는 배아생식세포를 생성할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 약어 “PGCs”로 나타낼 수 있다.
조류의 원시생식세포는 외배엽에서 유래되어 배 발달 스테이지 4(배양 18 내지 19시간) 내에 생식선 반월(germinal crescent)로 이동하고(Swift, C. H., Am. J. Anat.,15, 483-516(1914); Hamburger, V. and Hamilton, H. L., J. Morphol.,88, 49-92(1951); and Eyal-Giladi, H. and Kochav, S.,Dev. Biol.,49, 321-337(1976)), 배 발달 스테이지 10 내지 12에서 생식선 반월로부터 혈관으로 이동한 다음(Ando, Y. and Fujimoto, T.,Dev. Growh Differ.,25, 345-32(1983); and Ukeshima, A. et al.,J. Electron. Microsc.,40, 124-128(1991)), 배 발달 스테이지 17(배양 2.5일)까지 혈액을 따라 순환하여 최종적으로 원시생식기내에 정착한 후, 정착 및 콜로니화된다(Nieuwkoop, P. D. and Sutasurya, L. A.,In Primordial Germ Cells in the Chrodates, 113-127(1979)). 이 이동경로 및 발달과정은 포유류에서와는 크게 다르다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PGC는 배아의 혈액 또는 원시생 식기(embryonic gonad)로부터 유래되며, 보다 바람직하게는 원시생식기로부터 유래된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 PGC는 공여체의 1-10일령 배아의 원시생식기로부터 유래된다.
본 발명에서 이용될 수 있는 원시생식세포는 다양한 소스로부터 얻을 수 있으나, 가장 바람직하게는 공여체 조류 배아의 원시생식기(embryonic gonad)로부터 분리된 것이다. 예를 들어, 원시생식세포의 소스로서 꿩의 배아를 이용하는 경우, 본 발명에서 이용되는 공여체 조류인 꿩의 배아는 다양한 단계에 진입한 것이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 1-10 일령, 보다 바람직하게는 5-9일령 꿩 배아의 원시생식기로부터 유래되며, 가장 바람직하게는 7일령 꿩 배아의 원시생식기로부터 유래된 것을 이용한다. 원시생식기로부터 원시생식세포를 수득하는 방법은 다양하게 실시될 수 있으며, 본 발명자들의 특허 제 305715 호 및 특허 제 267633 호에 개시되어 있다. 예컨대, 난황이 제거된 배아로부터 원시생식기를 회수하고, 원시생식기에 단백질분해효소 (예: 트립신)를 처리하여, 원시생식기 세포를 분리하고 배양한다. 원시생식기 세포의 배양은 원시생식기-유래 기저세포층 위에서 실시되는 것이 가장 바람직하며, 원시생식기 세포는 기저세포층에 부착되어 증식하여 콜로니를 형성하며, 이로부터 원시생식세포를 형성한다.
본 발명의 공여체가 될 수 있는 대상은 조류에 해당하는 동물로서 연중 번식이 가능하지 않은 준가금류 또는 멸종 위기의 조류이며, 하기 단계 (b)에서 사용한 수용체와 다른 종에 속하는 조류이어야 한다. 바람직하게는 공여체로 사용할 수 있는 조류로, 멸종 위기의 조류, 타조, 공작 또는 꿩이며, 보다 바람직하게는 타조 또는 꿩이며, 가장 바람직하게는 꿩이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생식세포는 자기활성 세포분류기(Magnetic activated cell sorter: MACS)를 이용하여 분리된다.
상기한 생식세포의 자기활성 세포분류기를 이용한 분리법은 본 발명자들이 개발한 방법에 따라 실시하는 것이 가장 바람직하다(참조: 대한민국 특허 제 470170 호). 예를 들어, PGC를 이용하는 경우, 상기 수득한 PGC에 PGC-특이 제 1 차 항체를 처리하여 PGC의 표면에 상기 제 1 차 항체 (primary antibody)를 결합시킨다. 본 발명에서 이용되는 항체는 원시생식세포에 결합 친화성 및 특이성을 나타내는 어떠한 것도 이용될 수 있으나, 바람직하게는 단일클론항체가 이용되며, 보다 바람직하게는 조류가 닭인 경우에는 항-SSEA-1 항체, 조류가 꿩 또는 메추라기인 경우에는 QCR1 항체이다. 가장 바람직하게는, 조류가 꿩인 경우에는 QCR1 항체이다. 이어, 자성을 갖으며, 상기 제 1 차 항체에 대하여 결합 친화성을 갖는 제 2 차 항체가 표면에 결합된 마이크로비드를 처리하고, 결합하지 않은 마이크로비드를 제거하기 위하여 세척과정을 거친 다음, 자성을 갖는 분리기 (separator)에 적용하여 PGC-제 1 차 항체-제 2 차 항체-마이크로비드 복합체를 분리한다. 이러한 과정은 면역자기 분리 과정에 따른 것으로서, 상기 과정의 일반적인 내용은 미합중국 특허 제5,385,707호, 제5,541,072호, 제5,646,001호, 제6,008,002호 및 제6,153,411호에 개시되어 있으며, 이용되는 마이크로비드 및 분리기는 Miltenyi Biotech(독일)에서 용이하게 구입할 수 있다. 이처럼 상기 자기활성 세포분류기 에 의해 분리 후 최종적으로 PGC-제 1 차 항체-제 2 차 항체-마이크로비드 복합체를 MACS 컬럼으로부터 세척함으로써 원시생식세포가 풍부화(enrichment)된 시료를 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생식세포는 상기 수용체와 성(sex)이 동일한 공여체로부터 분리된다.
본 발명에서 공여체로부터 분리되는 생식세포는 수용체와 성을 맞추는 것이 바람직하다. 이를 위해, 생식세포를 이전시키기 전에 3일 내지 6일령의 수용체 및 공여체의 배아로부터 혈액 세포를 수득하고, PCR을 통해 W 염색체 상의 비반복 DNA 시퀀스를 주형으로 하여 성을 확인한다. 이후, 수용체 및 공여체의 성이 동일한 것을 선택하여 공여체로부터 분리된 생식세포를 수용체의 배아에 주입하게 된다.
(b) 공여체 조류의 생식세포를 다른 종에 속하는 수용체 조류의 난의 배아에 이식
상기 단계 (a)에서 수득한 공여체 조류의 생식세포는 다른 종에 속하는 수용체 조류의 난의 배아에 이식한다.
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 대상은 조류에 해당하는 동물로서 특별히 제한되지는 않으나, 연중 번식이 가능한 가금류가 바람직하며, 상기 단계 (a)에서 사용한 공여체와 다른 종에 속하는 조류이어야 한다. 보다 바람직하게는, 수용체로 사용할 수 있는 조류로, 닭(Gallus gallus), 메추라기(Coturnix japonica), 칠면조(Meleagris gallopavo), 오리(Ansa platyrhy), 거위(Anser domesticus) 및 비 둘기(Columba livia)이며, 보다 더 바람직하게는 닭 및 메추라기이고, 가장 바람직하게는 닭이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 공여체의 생식세포는 수용체 조류 배아의 등쪽 대동맥에 이식된다.
본 발명에서 상기 준비된 공여체 조류의 생식세포는 다른 종에 속하는 수용체 조류의 배아에 이식한다. 본 발명에서 생식세포를 수용체 배아에 주입하는 방법은 다양한 방법에 따라 실시될 수 있으며, 바람직하게는 배아의 등쪽 대동맥에 주입하여 실시된다. 예를 들어, 적합한 개수의 생식세포를 포함하는 세포 현탁액을 배아의 등쪽 대동맥에 미세바늘로 주입하고, 밀봉한 다음 적합한 시간 동안 배양하여 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수용체 조류의 배아는 스테이지 4-39의 배아이다.
본 발명에서 수용체 배아는 다양한 발달 단계에 있는 것이 이용될 수 있으며, 상술한 바와 같이 배아의 등쪽 대동맥에 주입하는 것이 가장 바람직하다. 예를 들어 닭의 경우라면, 상기 수용체 조류의 배아는 바람직하게는 배 발달 스테이지 4-39를 이용하고, 보다 바람직하게는 배 발달 스테이지 12-28를 이용하며, 가장 바람직하게는 배 발달 스테이지 17을 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 공여체 생식세포의 5,000-30,000 세포가 수용체 조류에 이식되며, 바람직하게는 10,000-20,000 세포가 수용체 조류에 이식되며, 가장 바람직하게는 12,000 세포가 수용체 조류에 이식된다.
(c) 생식선 카이메라 조류 개체의 수득
본 발명에 의해 제조되는 카이메라는 생식선 전이(germline transmission) 카이메라이다. 본 명세서에서 용어 “생식선 전이”는 다른 개체에 주입된 생식세포가 세대를 따라 자손들에게 전달되는 양상을 의미한다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 조류가 생식선 카이메라인지 여부는 검정교배를 통하여 확인할 수 있다. 검정 교배의 자손을 분석함으로써, 수용체 조류의 난의 배아에 이식된 PGC가 정상적으로 증식 및 생식세포로의 분화가 이루어졌는지를 알 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생식선 카이메라는 50-70%의 생식선 카이메리즘(germline chimerism)을 나타내며, 바람직하게는 55-75%, 더욱 바람직하게는 65-67%이며, 가장 바람직하게는 66.1%이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 공여체 조류의 생식세포를 준비하는 단계; (b) 상기 공여체 조류의 생식세포에 외래 유전자를 전이하는 단계; (c) 상기 외래 유전자가 전이된 생식세포를 다른 종에 속하는 수용체 조류의 난의 배아에 이식하는 단계; 및 (d) 상기 수용체 난을 배양 및 부화하여 형질전환 조류를 수득하는 단계를 포함하는 형질전환 조류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 제조방법은 외래 유전자를 전이하는 단계 및 형질전환 조류를 수득하는 단계를 제외하고, 상술한 본 발명의 조류 사이의 이종간 생식선 카이메라의 제조방법을 이용하기 때문에, 그 발명들 사이의 공통 사항은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명에서는 형질전환 조류를 생산하기 위해 외래 유전자를 공여체 조류의 생식세포에 도입시킨다.
본 발명의 방법에 있어서, 공여체 조류의 생식세포에 외래 유전자를 전이시키는 것은 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전이방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 전기동공법 (electroporation), 리포좀-매개 전이방법 (Wong, 등, 1980) 및 레트로바이러스-매개 전이방법 (Chen, H.Y., et al., (1990), J. Reprod. Fert. 41:173-182; Kopchick, J.J. et al., (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos. In Transgenic Animals, ed. N.L. First & F.P. Haseltine, pp.275-293, Boston; Butterworth-Heinemann; Lee, M.-R. and Shuman, R. (1990) Proc. 4th World Congr. Genet. Appl. Livestock Prod. 16, 107-110)이 있다. 상기한 전기동공법은 본 발명자들이 개발한 방법에 따라 실시하는 것이 가장 바람직하다(참조: 대한민국 특허 제 305715 호).
외래 유전자의 전이 후에는 상술한 본 발명의 조류 사이의 이종간 생식선 카이메라의 제조방법과 동일한 방법으로 생식선 카이메라를 제조하게 되고, 이후 수용체를 이종의 다른 개체와 교배시켜 자손을 얻게 됨으로써, 외래 유전자를 포함한 자손이 형질전환 조류를 생산하게 된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 조류 사이의 이종간 생식선 카이메라의 제조방법 및 형질전환 조류의 제조방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명은 생식세포를 이용한 조류 사이의 이종간 생식선 카이메라 생산 시스템을 처음으로 확립한 것이다.
(ⅲ) 또한, 본 발명의 생식선 카이메라는 연중 번식이 가능하지 않은 준가금류 또는 멸종 위기의 조류의 생식세포를 생산할 수 있으므로, 야생 또는 멸종 위기의 조류를 보존하는데 크게 기여할 수 있다.
(iv) 본 발명에서 이용되는 생식선 카이메라 생산 기법은 기존의 방법에 비하여 매우 고효율로 생산이 가능하여 이를 이용한 형질전환 조류 생산 효율을 향상시키는데 기여할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 실험 방법
일반적 실험 과정
이종간의 생식세포를 배아에 이전하는 일반적인 방법은 Park et al.2의 방법을 변형하였으며 실험 과정의 모식도는 도 1에 나타내었다. 7일령의 배아로부터 꿩의 생식(gonadal) 세포를 회수하고 생식세포 내의 PGC 파퓰레이션을 자기 활성 세포 분류기(Magnetic activated cell sorter: MACS)로 최적화하였다. 이후, 생식세포는 2.5일령 닭의 배아의 등쪽 대동맥에 이식하고 수용체 배아는 부화할 때까지 배양하였다. 수용체 배아로부터 부화한 자손은 성 성숙시까지 지속하였고, 성 성숙된 자손으로부터 얻은 정액은 자성 꿩에 인공 수정하였다. 이후, 순차적으로, 닭의 배아생식세포에 꿩의 PGC를 전이하였음을 확인하고, 성 성숙한 자손의 정액에서 카이메라화를 확인하였으며, 검정교배를 통해 꿩으로부터 유래하였음을 확인하였다.
실험 동물 및 동물의 관리
한국산 꿩 (Phasianus colchicus) 및 화이트 레그혼(Gallus gallus)의 배아를 각각 PGC의 공여체 및 수용체로 사용하였다. 실험 동물들은 서울대학교 동물 농장에서 유지 및 관리하였으며, 서울대학교의 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 동물 관리, 생식 및 배아 조작은 서울대학교의 동물 유전 공학과의 표준 프로토콜을 따랐다.
공여체의 성 결정
각 공여체 배아의 성은 W 염색체 상의 비반복 DNA 시퀀스를 이용하여 PCR을 통해 PGC를 이전시키기 전에 확인하였다17. 배아 혈액 세포 (1 ㎕)를 3일령 내지 6일령 배아의 등쪽 대동맥으로부터 수득하였다. 각 혈액 시료는 1x PBS에 100배 희석하고, PCR에 사용하기 직전에 99℃에서 5분간 끓였다. Psex 프라이머 쌍은 396-bp의 절편을 증폭하는데 사용하였다.
공여체 PGCs의 회수
생식선 세포는 이전의 방법에 따라 7일령 꿩 배아의 생식기(gonad)로부터 회수하였다18. 배아는 칼슘 및 마그네슘이 들어있지 않은 PBS로 세척하여 난황으로부터 제거하였고, 생식선은 실체현미경 하에서 배(abdomen)를 통하여 날카로운 핀셋을 이용하여 회수하였다. 생식선 조직은 0.53 mM EDTA가 포함된 0.05%(v/v) 트립신 용액에서 천천히 파이펫팅을 하여 분리하였다. 200 x g에서 5분간 원심 분리를 한 뒤, 1 x 106의 생식선 세포를 QCR1 (마우스 IgG 아이소타입)으로 라벨링하였으며19, PGC 파퓰레이션을 증가시키기 위해 MACS에 적용하였다. 생식선 세포 현탁액 내에서 PGCs의 개수는 퍼옥시다아제 LSAB1 키트(Dako, Capinteria, CA)로 카운트하였다.
수용체 배아에 주입한 PGCs의 추적
수용체 배아에 접근하기 위해, 수용체 알의 첨단부에 작은 창을 만들었다. 1.2 x 104의 MACS-처리한 세포가 포함된 세포 현탁액 약 2 ㎕를 60시간령 배아의 등쪽 대동맥에 이식하였다. 수용체의 알에 생긴 창은 파라핀 필름으로 밀봉하였으며, 첨단부를 아래쪽으로 하여 유지시켰다. 이식 후 생식선 전이를 모니터링하기 위해, PGCs가 포함된 꿩의 생식선 세포를 이식 전에 PKH26 형광 다이(Sigma, St. Louis, MO)로 라벨링하였다. 수용체 배아는 이식 후 4.5일간 배양하였으며, 공여체 PGC 전이는 형광 현미경(IX70; Olympus, Tokyo, Japan)하에서 모니터링하였으며, 이종 이식된 PGCs의 위치는 면역조직화학염색방법(immunohistochemical) 분석으로 모니터링하였다. 7일령 수용체 배아(이식한 지 4.5일 후)로부터 회수한 전체 생식선은 파라포름알데히드로 고정하였다. 이후, 생식선은 QCR1 (마우스 IgG 아이소타입, 1 x PBS에 0.1% 트리톤-X와 5% BSA에서 1:100으로 희석)으로 밤새 반응시켰으며, 플루오르세인 이소티오시아네이트(FITC)가 컨쥬게이션된 고트 항-마우스 IgG(1 x PBS에 0.1% 트리톤-X와 5% BSA에서 1:100으로 희석)에서 반응시켰다.
꿩의 정자의 검출 및 실시간
PCR
을 통한 정량화
성 성숙된 자손의 정액에서 꿩 정자의 존재를 확인하였다. 공여체 PGCs로부터 유래한 꿩의 정자 수를 정량하기 위해, 25, 30, 35, 45 및 55주령의 자손으로부터 정액을 채취하였다. 닭(CSP #1) 또는 꿩-특이[CYTB(Cyto B), IGLC 및 TAPBP(Tapasin); 이하 참조] 마커를 실험에 사용하였다. 게놈 DNA는 PUREGENE DNA 순화 키트(Gentra Systems Inc., Minneapolis, MN)를 이용하여 추출하였다. CYTB는 척추동물의 CYTB의 유니버셜 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 정량된 330-bp의 앰플리콘(Amersham, Little Chalfont, UK)은 10 pg/㎕로 희석하여 실시간 PCR 분석을 위한 주형으로 사용하였다. 실시간 PCR 분석은 iCycler iQ 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하였다. 표준 곡선은 꿩 앰플리콘(y=-3.317x + 7.940, r=0.999)의 10 pg으로부터 10배씩 희석하여 사용하였고, 꿩 앰플리콘에 상대적인 평균 카피 수를 계산하였다.
프라이머
디자인
꿩-특이 프라이머는 꿩과 닭의 시토크롬 b(CYTB; GenBank 접근 번호 AY368060.1, AF354171), TAPBP(AL004999, AJ972781) 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인(IGLC) 중에서 시퀀스 차이에 기초하여 디자인하였다 (표 1). IGLC는 2개의 닭의 가변 도메인 골격 지역-특이 프라이머[유전자 특이 프라이머 1(GSP1), 5'-CCT GGC AGT GCC CCT GTC AC-3';GSP2, 5'-CAC ATT AAC CAT CAC TGG GGT CC-3']를 이용하여 3'-말단 RACE를 통하여 클로닝하였다. 닭-특이적 프라이머(CSP#1)는 대조군으로 사용하였다(표 1)20.
자손 테스트
수용체 배아로부터의 자손들은 본 발명자들의 표준 관리 프로그램에 따라 6 개월까지 관리하였다. 정액을 배출할 수 있는 성 성숙된 웅성 자손은 자성 꿩의 검정 교배 인공 수정에 사용하였다.
통계 분석
대부분 수적 데이터는 최소 4반복에 의해 이루어졌으며 통계분석 시스템 (SAS) 프로그램의 일반선형모델(PROC-GLM)을 이용하였다. 모델효과가 유의적일 때 각 처리효과는 최소 자승 방법에 의해 비교하였다(P<0.05).
2. 실험 결과
생식선
카이메라의
생산 및 공여체
PGCs
에 이식에 의한 자손
3.6 x 103에서 4.0 x 103의 PGCs를 포함한 12,000개의 꿩 생식선 세포들을 각각 수용체의 배아에 이식하였다. 232개의 WL 배아(자성 112개 및 웅성 120개; 표 1)를 PGC 이식의 수용체로 사용하였다. 이들 중, 자성 PGCs를 받은 알의 72.3% 및 웅성 PGCs를 받은 알의 59.2%가 성공적으로 부화하였다. 부화 후에, 117(77%)마리의 웅성 및 자성의 병아리가 성 성숙에 이르렀다(자성 공여체 PGCs, 66.7%; 웅성 공여체 PGCs, 88.7%). 이때 PGC 성에 따른 발생률(P=0.0353)과 성성숙(P=0.0011)에는 유의적 차이가 있었다. 웅성자손 59수는 검정교배에 사용되어졌으며, 이것 중 39수(자성 PGC로부터 유래 17수와 웅성 PGC로부터 유래 22수)는 닭과 꿩의 정자를 생산하였다. 4가지 교배 조합(웅성 카이메라-자성 카이메라, 웅성 카이메라-자성 WL, 웅성 꿩-자성 카이메라 및 웅성 카이메라-자성 꿩)에 의한 검정 교배 생식을 통하여 3가지 타입(꿩, 닭 또는 하이브리드)의 자손들이 생산되었다. 표 3에서 보는 바와 같이, 오직 닭 유생들만이 카이메라-카이메라(2,148개의 수정란; 85.9% 부화율) 및 카이메라-WL(3,270개의 수정란; 79.2% 부화율) 교배 조합으로부터 생산되었다. 웅성 꿩-자성 카이메라 조합은 하나의 웅성 하이브리드를 생산하였으나, 야생 웅성 꿩으로부터 정액을 채취하는데에 기술적 문제점으로 인하여 꿩 유생들은 얻지 못하였다. 웅성 카이메라-자성 꿩 조합(도 2a)은 75개의 수정란을 생산하였고, 부화율은 76%였다. 57마리의 유생 중에 10마리는 표현형적으로 볼 때 정상 꿩(도 2d)이었으며, 나머지 47마리는 하이브리드였다. 5마리의 웅성 카이메라는 검정 교배에 사용되었으며, 3마리(K#1-2, K#1-6 및 K#1-16)가 꿩 자손을 생산하였고 이는 모두 하이브리드 자손이었다(표 4). 총 자손 중에서 꿩의 백분율을 측정할 때, 이종간 PGC 이전에 의한 꿩 생산의 효율은 평균적으로 17.5%였다(0-33.3%). 꿩 유생과 크기가 유사한 총 47마리의 하이브리드 유생은 표현형적으로 우성이 갖는 색의 작은 반점들을 보였다(도 2b 및 도 2c).
| 프라이머 명 | 염기서열 | 크기(bp) |
| Psex-F | 5- CTA TGC CTA CCA CAT TCC TAT TTG C-3 | 396 |
| Psex-R | 5- TCT TCT ACC AGA CTT CAG GTC GA -3 | 396 |
| CYTB -F | 5- CAC ACA TGT CGA AAT GTG CAG -3 | 205 |
| CYTB -R | 5- GCA TCC TAT ACA GGA AGG TAC TC -3 | 205 |
| TAPBP -F | 5- GGG ACA CAG TGA TGG ACA GC -3 | 230 |
| TAPBP -R | 5- CGG AGT AGG CAA CCG AGA TG -3 | 230 |
| IGLC -F | 5- ACC ATC AAA GGA GGA GCT GGA A-3 | 120 |
| IGLC -R | 5- TCA CCG CTC TGG TGT CGT GG -3 | 120 |
| CSP#1-F | 5- GAG TGT AGA CAG TAG TGT ATC -3 | 363 |
| CSP#1-R | 5- GTC ACT TTT ACC ACG GGA CTC -3 | 363 |
| 꿩 PGCs*의 성별 | 수용체 닭 배아의 개수 | 부화된 알의 개수(%)a | 성 성숙된 자손의 숫자(%)b | 수용체의 성 | 꿩의 정자를 생산한 웅성의 숫자(%)c | |
| 자성 | 웅성 | |||||
| 자성 | 112 | 81(72.3)d | 54(66.7)d | 25 | 29 | 17(58.6) |
| 웅성 | 120 | 71(59.2)e | 63(88.7)e | 33 | 30 | 22(73.3) |
| 총합 | 232 | 152(65.5) | 117(77.0) | 58 | 59 | 39(66.1) |
*웅성과 자성의 꿩 PGCs는 닭 배아(배 발달 스테이지 17)의 등쪽 대동맥에 주입하였으며, 웅성 자손은 카이메라 어세이에 사용되었다.
a부화된 수용체 닭 배아의 백분율.
b성 성숙한 유생의 백분율.
c꿩의 정자를 생산한 웅성 자손의 백분율.
d,e부화된 알수와 성성숙 자손수에서 공여체의 암수 PGCs에서 유의차 확인(P<0.0353), 하지만 다른 파라미터에서는 유의차 확인 안됨(P>0.2399).
| 검정 교배 | 알의 개수 | 자손의 숫자(%)c | |||||
| 웅성 | 자성 | 배양된 | 수정된 (%)a |
부화된 (%)b |
꿩 | 하이브리드 | 닭 |
| 카이메라 | 카이메라 | 2,990 | 2,148(71.8)d | 1,846(85.9)d | 0d | 0d | 1,846(100)d |
| 카이메라 | 화이트 레그혼 | 4,828 | 3,270(67.7)e | 2,591(79.2)e | 0d | 0d | 2,591(100)d |
| 꿩 | 카이메라 | 161 | 1(0.6)f | 1(100)de | 0d | 1(100)e | 0e |
| 카이메라 | 꿩 | 273 | 75(27.5)g | 57(76)e | 10(17.9)e | 47(82.5)f | 0e |
처리구의 모델효과는 모든 파라매타에서 0.001이하였다.
a수정이 이루어진 배양된 알의 백분율.
b부화된 수정란의 백분율.
c부화된 알의 백분율.
d-g유의차 확인, P<0.05.
| 검정교배 | 알의 개수 | 자손의 숫자(%)c | |||||
| 카이메라 (웅성) |
꿩 (자성) |
배양된 | 수정된(%)a | 부화된(%)b | 꿩 | 합계(%) | 하이브리드 |
| K#1-2 | #1 | 34 | 0(0)e | - | - | 1/22(4.5) | - |
| #2 | 32 | 18(56.3)f | 14(77.8) | 0(0) | 14(100) | ||
| #4 | 12 | 3(25.0)ef | 1(33) | 0 | 1(100) | ||
| #5 | 18 | 8(44.4)f | 7(87.5) | 1(14.3) | 6(85.7) | ||
| K#1-5 | #3 | 17 | 4(23.5) | 2(50) | 0 | 0/2(0) | 2(100) |
| K#1-6 | #1 | 11 | 1(9.1)e | 0(0) | - | 9/27(33.3) | - |
| #3 | 33 | 19(57.6)f | 15(78.9) | 1(6.7) | 14(93.3) | ||
| #4 | 23 | 3(13.0)e | 3(100) | 1(33.3) | 2(66.7) | ||
| #5 | 24 | 10(41.7)f | 9(90) | 7(77.8) | 2(22.2) | ||
| K#1-7 | #1 | 7 | 0(0) | - | - | 0/4(0) | - |
| #2 | 12 | 4(33.3) | 4(100) | 0(0) | 4(100) | ||
| K#1-16 | #1 | 8 | 2(25.0) | 1(50) | 0(0)d | 0/2(50)d | 1(100) |
| #3 | 42 | 3(7.1) | 1(33.3) | 0(0) | 1(100) | ||
| 총합 | 273 | 75(27.5) | 57(76.0) | 10(17.5) | 47(82.5) | ||
발생한 자손에서 비교된 꿩 수의 모델효과는 0.0606이다.
a수정이 이루어진 배양된 알의 백분율.
b부화된 수정란의 백분율.
c부화된 알의 백분율.
d꿩 표현형을 갖는 한 마리 배자는 부화되기 전에 죽은 것(포함되지 않음).
ef같은 웅성 카이메라내에서 유의차 확인, P<0.05.
수용체에서 꿩 생식세포의 확인
PKH26-양성인 꿩의 PGCs에 의해 생성된 강한 시그널이 수용체 배아의 생식선에서 발견되었다(도 3a 및 도 3b). 또한, 이종간 이식된 PGCs의 생식선 전이는 인택트(도 3c 및 도 3d) 또는 냉동절단된 조직의 면역염색으로 검출하였다(도 3e 및 도 3f). 58마리의 성 성숙된 웅성 유생으로부터 채취한 정액중에서, 39(66.1%; 자성 공여체 PGCs, 17; 웅성 공여체 PGCs, 22)마리가 CYTB-양성 밴드 패턴을 보이는 정자를 생산하였다. 세 번의 실험결과 지속적으로 CYTB와 반응하거나 또는 꿩의 정자를 대량 생산하는 5마리의 웅성(K#1-2, K#1-5, K#1-6, K#1-7 및 K#1-16)은 혈액 및 정액 시료에서 카이메라화 여부를 확인하는데 사용하였다. 비록 닭의 유전형이 생식선 카이메라로부터의 혈액 시료로부터 생성된 것이 발견되었으나, 카이메라화가 정자에서 검출되었다(도 3g). 꿩 정자의 파퓰레이션 백분율은 25주에서 55주령에서 0.02%에서 9.04%였지만(도 3h), 관찰 시간 및 정자의 파퓰레이션 사이에 어떠한 긍정적인 관계는 발견되지 않았다.
논의 사항
본 발명자들은 이종간에 PGC를 발생 중인 배아에 이전함을 증명하였다. 검정 교배 인공 수정 야생 조류를 생성하는데 사용될 수 있다. 이종간 이식된 꿩의 PGCs는 닭의 배아의 생식세포로 이전되었고 순차적으로 이종 정자생성에 관여하게 되었다. 이는 배 발달 스테이지 X의 배반엽 세포로 이전시키는 것 보다 생식선 카이메라를 생성하는 데 더욱 효과적인 기술이다21. 이러한, 이종간 생식세포 이전 기술의 성공은 멸종 위기의 조류를 보존하는 대체적인 생산 기술로의 사용으로 확장될 수 있을 것이다.
본 발명에서 4가지의 교배 조합으로 이루어진 검정 교배의 결과는 오직 웅성의 카이메라와 자성의 꿩의 교배에서만 꿩의 자손을 얻을 수 있다는 사실을 보여준다. 5마리의 웅성 카이메라가 검정 교배 생산에 사용된 것으로부터, 꿩 생산의 평균 효율은 정자의 게놈 DNA의 정량적 실시간 PCR로부터의 결과와 비교할 때 높은 것으로 측정되었다. 이러한 차이는 정자가 질내에서 이동하는 동안에 종-특이적 장벽이 있을 것이기 때문이라고 추측된다22. 유사하게, 정자의 생존, 수정 및 배아의 발생의 기회는 동종 자성 꿩의 생식 통로로 들어간 후에 증가할 것으로 추측할 수 있다.
Tagami et al.23은 자성 PGC가 웅성의 정소에서 정자(Z- 또는 W-를 갖는)로 분화할 수 있음을 보고하였다. 그러나, ZW 생식세포는 정자 생성 과정 동안 어떠한 지점에서 제한되었다. 표 2에서와 같이, 꿩의 자성 PGC의 이전은 웅성 및 자성 카이메라를 생산하였다. 본 발명자들은 양쪽 성의 카이메라들이 난소 및 정소 조직에서 높은 비율의 이질성을 갖는 것을 발견하였다. 그러나 생존은 다른-성의 PGC 이전에서 보다 동일-성의 PGC 이전에서 더욱 높았다. 웅성 정소에서 자성의 생식세포의 대부분은 성 성숙 후에 줄어들었다. 공여체 생식세포 및 수용체를 동일-성으로 사용하는 것은 이종간 생식선 전이에 있어서 매우 중요한 요소일 것으로 생각된다.
생식선 카이메라는 무계절적 경향을 가진 살아있는 꿩의 난을 계속적으로 생산하는데, 이는 멸종 위기종을 보존하는 기술의 가능성을 더욱 높여준다. 원하는 종의 생식세포를 대량으로 증식시킬 수 있는 한, 상술한 바에 따라 1년 내내 생산이 가능하므로, 본 발명의 이종간 생식세포 생산 시스템은 야생 또는 멸종 위기종 조류의 생산에 크게 기여할 수 있을 것이다.
본 발명에서, 본 발명자들은 3,600-4,000 PGCs를 하나의 배아에 이식하여 각각의 카이메라를 생산하였다. 꿩은 보통 한 번에 40 내지 100개의 알을 낳기 때문에, 꿩의 알로부터 충분한 양의 PGCs를 회수할 수 있었다. 1년에 매우 적은 양의 알을 낳는 야생 조류 또는 멸종 위기의 조류들의 경우, PGCs의 인 비트로 배양 시스템은 생산 능력을 높일 수 있을 것이다. Park et al.2은 약 10일까지 PGCs를 인 비트로로 배양하는 경우 생식선 전이의 효능이 증가한다고 보고하였으며, Han et al.1은 PGCs는 생식세포의 활성이 변하지 않은 상태에서 60일까지 지속된다고 제시한 바 있다.
본 발명에서 개발된 이종간, 그리고 카이메라간 및 카이메라와 일반축과의 교배결과에서 보여주듯이 이를 이용할 때에는 이종의 정자나 난자가 서로 수정이 되기 쉽지 않은 이유로 동종의 생식선 카이메라가 높은 효율로 생산 될 수 있다는 결과를 보여주었다. 조류 형질전환 기술에서 핵심적인 사항으로 알려진 생식선카이메라 효율은 본 연구와 같은 방법을 통하여 높은 효율로 개선될 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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24. IUCN Red List Statistics. URL: http://www.iucnredlist.org/ (2006).
도 1은 닭의 배아로 이종간에 원시생식세포를 이전하여 꿩(Phasianus colchicus)을 생산하는 전체적인 모식도를 나타낸다.
도 2는 웅성의 생식선 카이메라와 자성의 꿩을 검정교배하여 생산한 꿩을 나타낸다(A). 꿩의 원시생식세포를 닭의 배아에 이전하여 생식선 카이메라를 생산하였으며, 검정 교배를 통해 꿩(D-L) 및 하이브리드 자손을 얻었다(C). 꿩 및 하이브리드 유생의 크기는 화이트 레그혼 병아리보다 일반적인 꿩의 병아리와 더 유사하였으며(B), 한 마리의 자손은 부화 후 즉시 죽었다. 도면의 병아리들은 각각 1일령(B), 31일령(C), 25일령(D), 54일령(E), 49일령(F), 43일령(G-I), 41일령(J), 37일령(K) 및 35일령(L)이다.
도 3은 수용체 닭 배아의 배아생식세포에서 꿩 PGCs의 전이 및 잠정적인 생식선 카이메라에서 꿩 PGC-유래 정자의 검출을 나타낸다. 생식선 전이는 PGCs를 이전한 지 4.5일후에 검출하였다. PGCs는 각각 PKH26 형광 다이(A, B), QCR1 항체(C, D) 및 수용체 생식선의 면역조직화학염색으로 라벨링하였다. 각 마커에 대한 강한 시그널이 생식선에서 검출되었는데, 이는 이종간 이식된 PGCs의 생식선 전이가 완료되었음을 의미한다. (G)는 정액 및 혈청 분석에 의한 카이메라화의 확인을 나타낸다. 카이메라로부터 추출한 정자 및 혈액 DNA가 PCR 분석에 사용되었으며, 이 때 프라이머는 꿩-특이 마커인 CYTB, IGLC 및 TAPBP 및 닭-특이 마커인 CSP#1 마커를 사용하였다. 카이메라화는 정액에서 검출되었으나, 혈액 시료에서는 단지 닭의 유전자형만이 검출되었다. M, 100-bp DNA 마커; 레인 1, K#1-2 혈 액 DNA; 레인 2, K#1-5 혈액 DNA; 레인 3, K#1-6 혈액 DNA; 레인 4, K#1-7 혈액 DNA; 레인 5, K#1-16 혈액 DNA; 레인 6, K#1-2 정자 DNA; 레인 7, K#1-5 정자 DNA; 레인 8, K#1-6 정자 DNA; 레인 9, K#1-7 정자 DNA; 레인 10, K#1-16 정자 DNA; 레인 11, WL 정자 DNA; 레인 12, 꿩 정자 DNA; 레인 13, 주형 없음. (H)는 서로 다른 령에서 생산된 카이메라 정액의 정량적인 분석을 나타낸다. 꿩과 닭의 정자 비율은 25주령에서 55주령까지 모니터링하였다. 총 정자에서 꿩의 정자의 백분율은 0.02%에서 9.04%였다. 도면에서 스케일 바는 A, C 및 E에서 100 ㎛를, B, D 및 F에서 50 ㎛를 나타낸다.
Claims (16)
- 다음의 단계를 포함하는 조류 사이의 이종간(interspecies) 생식선 카이메라의 제조방법:(a) 공여체 조류의 생식세포(germ cell)를 준비하는 단계;(b) 상기 공여체 조류의 생식세포를 다른 종에 속하는 수용체 조류로서 닭, 메추라기, 칠면조, 오리, 거위 또는 비둘기의 난의 배아에 이식하는 단계; 및(c) 상기 수용체 난을 배양 및 부화하여 생식선 카이메라 조류 개체를 수득하는 단계.
- 다음의 단계를 포함하는 형질전환 조류의 제조방법:(a) 공여체 조류의 생식세포를 준비하는 단계;(b) 상기 공여체 조류의 생식세포에 외래 유전자를 전이하는 단계;(c) 상기 외래 유전자가 전이된 생식세포를 다른 종에 속하는 수용체 조류로서 닭, 메추라기, 칠면조, 오리, 거위 또는 비둘기의 난의 배아에 이식하는 단계; 및(d) 상기 수용체 난을 배양 및 부화하여 형질전환 조류를 수득하는 단계.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 생식세포는 원시생식세포(primordial germ cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 정소생식세포(testicular germ cell), 정원줄기세포(spermatogonial stem cell) 또는 생식선줄기세포(germline stem cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 생식세포는 원시생식세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 원시생식세포는 상기 공여체의 1-10일령 배아의 원시생식기로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 공여체 조류는 멸종위기 조류, 타조, 공작 또는 꿩인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 공여체 조류는 꿩인 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 수용체 조류는 닭인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 생식세포는 자기활성 세포분류기(MACS)를 이용하여 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 생식세포는 상기 수용체와 성(sex)이 동일한 공여체로부터 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 공여체의 생식세포는 수용체 조류 배아의 등쪽 대동맥에 이식되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 공여체 생식세포의 5,000-30,000 세포 가 수용체 조류에 이식되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 수용체 조류의 배아는 스테이지 4-39의 배아인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 수용체 조류의 배아는 스테이지 12-28의 배아인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 생식선 카이메라는 50-70%의 생식선 카이메리즘(germline chimerism)을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR1020080078998A KR101074448B1 (ko) | 2008-08-12 | 2008-08-12 | 효율적인 이종간 조류의 생식선 카이메라 및 형질전환체의 제조방법 |
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| KR1020080078998A KR101074448B1 (ko) | 2008-08-12 | 2008-08-12 | 효율적인 이종간 조류의 생식선 카이메라 및 형질전환체의 제조방법 |
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|---|
| Biology of Reproduction Vol.68, pp.1657-1662(2003)* |
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