CN1273600A - 鸟原始生殖细胞(pgc)细胞系及其长期培养的方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种在组织培养中长期保持鸟PGCs的培养系统。此培养系统使用LIF、bFGF、IGF－I和SCF。得到的PGCs对于制备转基因和嵌合鸟,特别是家鸡或火鸡是有用的。

Description

鸟原始生殖细胞(PGC)细胞系 及其长期培养的方法
发明领域
本发明提供了一种在组织培养中长期保持鸟原始生殖细胞(PGCs)，特别是家鸡PGCs的新方法。这些PGCs可用于插入所需的DNA序列，例如，人类基因。这些培养的PGCs和从中得到的转基因PGCs可用于制备嵌合鸟，特别是嵌合家鸡。
    发明背景
近年来，有许多研究集中于嵌合、克隆及转基因动物的制备。
特别地，在过去的二十年中，对饲养动物品种基因组的修饰是活跃开展的领域，并取得了不同程度的成功。例如，这种研究集中于产生转基因猪、母牛和家鸡。到目前为止，大多数可得到的转基因动物是由直接显微注射具有带有目的基因DNA构建体的单细胞胚胎而产生。然而，虽然显微注射技术已是成功的，但这些方法又有缺陷因为它们价格昂贵并且经常效率低下。
最近，用于制备“敲除小鼠的胚胎干(ES)细胞技术的成功导致研究集中于对饲养动物品种ES细胞和原始生殖细胞(PGCs)组织培养系统的开发。在连续培养中保持ES未分化细胞的能力使得能够在体外转染这样的细胞并且理想地能够在其转移入发育中胚胎的内细胞团中从而形成嵌合动物之前筛选出转染的细胞。理想地，至少某些得到的嵌合动物将能够通过种系而分离DNA构建体并且，因此，产生转基因子代。然而，到目前为止，靶向(定点)整合仅仅在小鼠中得以成功。目前，在其它动物品种中进行的靶向DNA整合能力是有限的，然而，这个方向中的工作正在进展中并且应该很快得以实现。
特别地，有相当多的研究旨在改进鸡属(Gallinacea)和家鸡的基因组，因为它们具有极大的经济价值。关于转基因家鸡产生研究状况的相当完全的综述已在三年前发表(Sang，生物技术趋势，12：415-420(1994))。与这里讨论的一样，正在研究用于制备转基因家鸡的基本上有2种可选的途径。这些方法可根据基因组操作完成的时间，即产卵前或产卵后加以区分。后者方法包括转移供体ES和PGC到受体胚胎中。此外，在2种途径中，工作量通过用含有目的基因的反转录病毒载体感染供体细胞来完成。
包括在产卵前基因组操作的第一种方法，产生混合和/或无效的结果。例如，卵巢中卵母细胞的感染(Shuman，和Shoffner，家禽科学，65：1437-1494(1986))和精子与质粒DNA的预温育(Gruenbaum等，细胞生化杂志增刊，15：194(1991))是无效的并且没有得到重复。同样，通过脂质体转染用质粒构建体转染精子细胞已得到证实(Squires和Drake，动物生物技术，4：71-78，1993)。然而，还未报道种系的传递。
同样，已报道直接显微注射DNA至胚盘中后进行胚胎培养产生0.1％活的转基因嵌合鸟(Sang，W.，生物技术趋势，12：415-42(1994))，其中一只鸟将该转基因传递到其3.4％的子代中(Love等，生物/技术，12：60-63(1994))。Naito等进行了相同的方法(生殖受精杂志，102：321-325(1994))。然而，类似地其中没有报道该转基因的种系传递。
包括产卵后基因组操作的第二种方法产生了更好的结果。用复制感受态反转录病毒载体感染产下的卵而产生的嵌合鸟已显示出种系传递至其1％到11％的子代(Salter等，在鸟类基因组操作中，Etches，RJ等，编。pp 138-150 CRC出版社(1993))。更为鼓舞人心的结果，是用复制缺陷型反转录病毒载体并且注射入产下的卵中，产生了8％的以2％到8％频率将该载体传递到其子代的嵌合雄性鸟(Bosselmam等，科学，243：535-535(1989))。
然而，在已知促进转染的试剂存在下用质粒构建体注射产下的卵未能产生稳定整合的构建体或转基因鸟(Rosenblum和Cheng，细胞生化杂志增刊，15E208(1991))。一般地，由于其明显的缺陷，故用反转录病毒载体产生转基因家鸡没有普及。这些缺陷包括可稳定导入其中克隆插入子大小的限制和可能诱导与内源病毒座位或与其它鸟类白血病病毒之间重组事件的更为严重的潜在缺陷。
所有这些方法的一个显著问题是相对难以建立家鸡ES和PGC长期培养系统的事实。据本发明人的最新知识，认为最长期的鸟PGCs已得到培养，其中嵌合鸟成功制备不到5天。
以前的PGC培养方法包括生长因子，特别是LIF或IGF-I的使用。然而，正如所述的，这些方法未能提供更长的培养时间，这正是一个将会促进转基因PGCs制备的普通问题。
虽然在得到长期培养中的众多问题，但是ES和PGC细胞均已成功地用于通过用复制感受态和非感受态反转录病毒载体感染这些细胞而产生嵌合体。此外，如上所述，新鲜获得的囊胚层细胞已注射入受体胚胎，得到具有嵌合性腺的鸟(Carsience等，发育，117：669-675(1993))。囊胚层细胞可通过脂质体转染而有效地转染且然后转移到受体胚胎中。然而，转染细胞的种系传递还未有报道。
同样，Pain等，发育，122：2329-2398(1996)最近已证明从囊胚细胞获得的推断性家鸡ES细胞的存在。他们进一步报道这些细胞在培养中保持35代并且宣称无ES表型的丢失(由小鼠ES细胞的单克隆抗体所定义)。(出处同上)这些细胞显然在转移到鸟胚胎中时形成PGCs，在此它们在性腺中建群。然而，他们没有确定地证明这些细胞实际上是ES细胞。
小鼠ES单克隆抗体与家鸡ES之间的交叉-反应性可能有利于不同品种间ES细胞受体的保护。同样，这些研究人员也能够通过注射7天龄的囊胚层细胞培养物来产生2只嵌合家鸡的事实将有利地表明ES细胞在其系统中的存在。然而，这些研究人员没有排除PGCs存在于其复合培养系统中的可能性。因此，该长期ES培养系统应进一步测试其多能性和种系传递。(出处同上)。
制备ES细胞的另一种途径包括PGCs。用于从供体分离和转移PGCs至受体胚胎的方法已经开发出来并且已成功产生种系传递供体表型的嵌合家鸡(Vick等，London Ser.B.，251：179-182(1993)，Tajima等，动物种系学(Theriogenology)，40：509-519(1993))。此外，PGCs被冷冻保藏且然后融化以产生嵌合鸟(Naito等，生殖&受精杂志，102：321-325(1994))。然而，此系统劳动强度很高并且每只胚胎平均仅仅产生50到80个PGCs。用反转录病毒载体感染PGCs也已报道过。然而，到目前为止，PGCs在培养中生长更长的时间以利于转染PGCs的筛选还未成功。因此，根据前述，显然培养PGCs的改进方法包括本领域中一种显著的必要性。
发明目的
解决现有技术中的问题是本发明的一个目的。
提供在组织培养中培养鸟原始生殖细胞(PGCs)更长时间的新方法是本发明一个更为具体的目的。
提供在组织培养中培养鸡属，尤其是家鸡原始生殖细胞(PGCs)更长时间的新方法是本发明一个更为具体的目的。
用已在组织培养中培养更长时间的鸟原始生殖细胞制备嵌合鸟，优选家禽，并且最为优选为家鸡或火鸡是本发明的另一个目的。
导入所需的核酸序列到已在组织培养中培养更长时间的鸟原始生殖细胞中是本发明的另一个目的。
用已在培养中保持更长时间、其中已导入所需核酸序列的鸟原始生殖细胞制备转基因嵌合鸟、优选转基因嵌合家鸡或火鸡是本发明的另一个目的。
用这种转基因嵌合鸟，优选鸡属并且最优选家鸡制备由导入其中的细胞中含有的核酸序列所编码的异源蛋白，优选通过从这些转基因嵌合鸟、尤其是转基因的嵌合家鸡的卵中回收这些蛋白是本发明的另一个目的。
发明简述
正如本文所述，本发明提供了一种在组织培养中保持鸟(家鸡)原始生殖细胞(PGCs)更长时间，即至少14天、更为优选至少25天，并且理想为永久的新方法。
在本发明之前，还未报道用于在提供其保持的组织培养中保持鸟PGCs长于大约5天(由其制备嵌合鸟能力所证实)的任何方法。本发明人通过明断的实验惊奇地发现用含有至少以下生长因子的培养基：白血病抑制因子(LIF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)和胰岛素-样生长因子(IGF-I)能够使鸟原始生殖细胞，特别是家鸡原始生殖细胞得以保持并增殖更长的时间，即至少14天，并且在组织培养中实际上保持和增殖更长时间。此外，已证实这些PGCs对于嵌合家鸡的产生是有用的。
同样，这些PGCs对于可用于制备转基因嵌合鸟的转基因鸟PGCs的制备应是有用的。预计这些转基因嵌合鸟对于优选可直接从这些嵌合转基因鸟卵中回收的异源蛋白的回收将是有用的。例如，这些鸟可用于制备和回收治疗蛋白和其它多肽。
发明详述
因此，本发明避开了与以前鸟PGC培养方法有关的问题，这些问题不能够使这些PGCs保持于组织培养中长于大约5天的时间。特别地，本发明人惊奇地发现用含有至少下面四种生长因子，鸟PGCs，优选鸡属PGCs，且最优选家鸡PGCs可在组织培养中保持更长的时间，至少为14天，更优选至少25天，并且优选更长时间，这些生长因子包括：
白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、胰岛素-样生长
因子(IGF-I)和碱性成纤维细胞生长因子。
一般来说，本发明的培养方法包括以下步骤：
(i)从供体鸟胚胎中分离PGCs；和
(ii)在含有有效促进其在组织培养中增殖更长时间，即至少14天的相对量LIF、bFGF、SCF和IGF-I的培养基中培养所述分离的鸟PGCs。上述更长时间指培养时间为14天或更长。
从供体鸟胚胎中分离原始生殖细胞的方法已在文献中报道过并且可由本领域中的技术人员来完成。(参见，例如，1993年9月7日公开的JP 924997，公开号05-227947；Chang等，Cell Biol.Int.，19(2)：143-149(1992)；Naito等，分子生殖&发育，39：153-161(1994)；Yasuda等，生殖&受精杂志，96：521-528(1992)；和Chang等，细胞生物学国际报告，16(9)：853-857(1992)，在此全文引入作为参考)。
本发明人选择从已温育大约53小时的家鸡卵(胚胎发育的12-14期)中分离鸟PGCs，从中取出胚胎，从其背主动脉收集胚胎血液并将其转入适当的细胞培养基(M199培养基中)。然后通过菲可(ficoll)密度离心、并且重悬于10μl含有生长因子的本发明培养基中纯化这些PGCs。然而，如上所述，分离PGCs的其它方法是已知的并且可选择性地加以使用。
然后计数并手工分离(例如，用吸管)分离的PGCs。之后，合并从这些不同的鸟胚胎中收集到的PGCs(以增加PGC数目)并且在含有受试生长因子的培养基中温育。
此培养基，下文称为“完全”培养基含有LIF、bFGF、SCF和IGF-I以及其它一般包括在PGC和胚胎干细胞培养基中的取代成分。更具体地说，该受试“完全”培养基将优选包括α-MEM，一种众所周知的商业上可得到的细胞生长培养基，其中加入四种以上生长因子并且还包括10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、0.56％抗生素/抗有丝分裂素、34.56mM 2-β巯基乙醇、1.0U/μl LIF、40.0pg/μlbFGF、60.0pg/μl IGF-I和80.0pg/μl SCF。
根据目前所进行的实验，认为这些成分与这些生长因子的优选浓度相对应。然而，如上文所述，这些生长因了的量可随成功保持于组织培养中PGCs而变化。特别是，已知这些生长因子各自的量可以增加而无副作用。此外，这些优选的量，例如，如果培养其它鸟的PGCs时可以改变。
正如所述，本发明人用α-MEM，一种众所周知的商业上可得到的组织培养作为基本培养基。然而，只要这四种必需生长因子也存在的话，预计可以代之以其它培养基。申请人尤其考虑到对受试“完全培养基”的修饰从而去掉胎牛血清，因为其未确定和可变的组成。
同样，虽然申请人在无饲养细胞存在下培养PGCs，但他们进一步考虑到饲养细胞可能也会是有用的。特别是，只要四种必须生长因子存在，使用成纤维细胞，优选鸟成纤维细胞，并且最为优选鸡属成纤维细胞(更为优选家鸡成纤维细胞)将在组织培养中提供对PGCs的保持。此外，这些饲料细胞可用编码这些生长因子的基因转染，由此排除在培养过程中外源性添加这些生长因子的必要。本质上，这些细胞将提供这些生长因子的持续来源。(这将通过将这些生长因子基因和提供其分泌的序列置于组成型强启动子控制之下来完成，因此使培养的PGCs可得到这些生长因子)。
正如所述，这些因子的量指能够在组织培养中有效使鸟PGCs，优选鸡属PGCs，并且最为优选家鸡或火鸡PGCs培养更长时间的相对量。
优选，这些生长因子的相对量将位于下面的范围内：
LIF 0.1U/μl到100.0U/μl，更优选1.0到10U/μl并且最优选1.0到2.0U/μl；
IGF-I 6.0pg/μl到6000.0pg/μl，更优选60.0pg/μl到600.0pg/μl的重量并且最优选60.0pg/μl到120.0pg/μl的重量；
SCF  80.0pg/μl到8000pg/μl重量，更优选80.0pg/μl到800.0pg/μl并且最优选80.0pg/μl到160.0pg/μl的重量；和
bFGF 4.0pg/μl到4000.0pg/μl，更优选40.0pg/μl到400.0pg/μl重量且最优选40.0pg/μl到80.0pg/μl的重量。
在上述的范围中，范围的上限对于本发明不是关键并且主要由费用所决定(如果与生长因子制备有关的明显费用)。
然而，预计，例如，如果α-MEM由别的培养基所取代并且如果培养其它类型的鸟PGCs，则这些优选的范围可能会变化。
正如所讨论的，这些PGCs可在培养中保持较长的时间而成功制备出嵌合的鸟。到目前为止，这些细胞已在组织培养中保持达大约4个月，显然无副作用。同样，测试达25天细胞在鸟胚胎性腺中有效建群并产生嵌合鸟的能力。然而，预计这些细胞可无限培养，且保留产生嵌合鸟的能力。
由上文所述的现有技术表明，用PGCs制备嵌合体的方法在本领域中是众所周知的。优选，PGCs将根据下面实施例中公开的方法转入到受体鸟胚胎中。之后，根据PGCs在性腺中的迁移与建群，PGC表型的维持或通过孵化和生育后寻找供体PGCs在性腺中的存在而评估成功的嵌合体产量。
在该实施例中，发明人挑选易于跟踪且影响颜色形成的基因型。供体鸟为白色烤鸡(broiler)型且受体鸟分别为黑色羽毛的鸟，具有特异性潜在的基因型。推断的嵌合体为黑色羽毛并且与黑色鸟交配时产生黑色/白色子代。由此，根据推断的嵌合鸟与别的黑色羽毛鸟交配后产生的黑色/白色羽毛后代的产量证明成功的嵌合体。
在第二个策略中，条形石(Bar Rock)鸟用作受体，且白色羽毛的鸟用作供体。根据具有一些条形羽毛的白色羽毛子代的产量来证明推断的嵌合鸟。
然而，该受试方法应该适用于通过嵌合化而导入任何所需的特征。当然，这将依赖于转移PGCs的基因型特征。
正如所述，可在培养中保持长时间的该受试PGCs的重要应用是用于嵌合鸟的制备。这将通过导入所需的DNA序列到培养的PGCs中来完成。将DNAs导入受体细胞中的方法是已知的并且包括脂质体转染、转染、显微注射、转化、微粒技术等，特别地，本发明人最初选择通过脂质体转染导入含有报告基因的载体。然而，虽然短暂转染的PGCs得到制备，但仍未分离到稳定的转染细胞系。然而，预计这可用此受试PGCs通过已知的技术完成。
优选，将导入编码所需基因，例如，治疗多肽，生长因子、酶等并且在鸟可操作序列调控下的DNA。优选地，这些调控序列将是真核来源，最优选为鸟，例如家鸡调控序列。鸟细胞中的可操作启动子，例如，源自鸟基因或病毒的启动子在本领域中是已知的。
起初，将分离产生所需蛋白的稳定细胞系并用于嵌合体制备。同样，导入的DNA含有标记DNA是理想的，该DNA的表达容易测定，从而更容易鉴定含有此插入DNA的细胞。这种可选择标记是众所周知的并且包括β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶、新霉素磷酸转移酶等。
注射得到的转基因PGCs至鸟胚胎中将然后导致转基因嵌合鸟的产生。优选地是，所需的蛋白将然后从这些转基因鸟卵中得到回收，由此提供该蛋白的连续供应。作为选择，可直接从嵌合鸟中回收此蛋白，例如，从全身性循环系统中分离该蛋白。
实施例
下面的材料和方法用于下述的实验中。材料与方法
动物
白色(E/E和I/I)烤鸡型家鸡用作PGCs的供体以开发长期PGCs培养系统。两种类型的鸟用作受体胚胎，显性黑色羽毛(E/-和i/i)家鸡品系和条形石(E/E和i/i)品系。用白色烤鸡(WB)型PGCs注射的显性黑色鸟称为E/-(WB)并且用白色烤鸡型PGCs注射的条形石鸟称为BR(WB)。
PGCs的提取
选择13到14期胚胎用于PGCs提取。按Naito等，分子生殖&发育，37：167-171(1994)中所述用细的吸管从背主动脉收集PGCs。来自20只胚胎PGCs合并于补充了10％胎牛血清的Hanks’液中并且通过Ficoll密度梯度离心加以浓缩(Naito等，分子生殖&发育，39：153-171 1994)。计数PGCs并且以每滴大约100PGCs分散于10μl的培养基液滴中(DMEM，含有不同量的生长因子)。培养液滴用无菌轻矿物油加以覆盖。注射PGCs至受体胚胎中
将14-15期胚胎用作受体胚胎。将卵置于适当的表面上后，允许一定时间用于胚胎发育以将其本身定位于安静卵的上侧。用细小的镊子在卵壳中制作一个大约10mm的小“窗口”或更小的孔。通过加入具有4％抗生素的磷酸缓冲盐混合物而将胚胎靠近该表面。调整胚胎以观察其心脏后，可容易地鉴定出边缘静脉和/或背主动脉。将2μl含有0.04％台盼蓝培养基中的200个供体PGCs吸入微量吸管中。将PGCs注射入受体胚胎的背主动脉中。台盼蓝，一种惰性细胞染料，当被运送时允许观察PGC悬液。注射卵壳后用外科绷带封闭开口并以石蜡加固。将卵在监视下于加湿的CO2孵化器中保持24小时且然后转移到规则的孵化器中直至孵化。PGCs的活体荧光染色
为了评估转移的成功性和/或PGCs迁移到性腺中的能力，用DiI荧光染料染色PGCs。转移后24小时收集胚胎，置于培养皿上并在装配用于表面-荧光分析的倒置显微镜下进行观察。
                     PGC培养条件
已测试了多种浓度的人白血病抑制因子(Lif)。人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，人胰岛素样生长因子(IGF-I)和人干细胞因子(SCF)。同样，也测试了丝裂霉素处理的家鸡成纤维细胞和小鼠STO细胞饲养层。PGCs长期细胞培养基
在下面的实验中，该完全细胞培养基包括下面的成分：α-MEM(BioWhittaker，Walkersville，MD，Cat# 12-169F)、10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT，Cat# 30070.03)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma，St.Louis，MO，Cat#G7513)，0.48％抗生素/抗有丝分裂素(Sigma，St.Louis，MO，Cat# A7292)，132μM 2β巯基乙醇(GIBCO-BRL，Grand Island，NY，Cat 2195-023)、0.00625U/μl白血病抑制因子(LIF)、0.25％pg/μl碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、0.5625pg/μl胰岛素样生长因子(IGF-I)和4.0pg/μl干细胞因子(SCF)(Genzyme，Cambridge，MA，对于LIF、bFGF、IGF-1和SCF分别为Cat#′s 1999-01，1208-00，FG1211-1和1833-01)。每隔一天通过去除5μl培养基并添加5μl 2X新培养基对培养基进行更换。后来认为生长因子在连续培养一定时间后将不稳定。然而，净结果是生长因子的浓度加倍。因此，最后的培养基现含有下面的生长因子浓度：0.0125U/μl白血病抑制因子(LIF)，0.5pg/μl碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1.125pg/μl胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和8.0pg/μl干细胞生长因子(SCF)。在此所述的生长因子浓度范围促进PGCs在连续培养中的保持与增殖。此外，后来发现这些细胞在上文鉴定的浓度中存活且任选增殖。(同样，后来证明这些生长因子可在上面的培养基中变化。特别是，如上文所述，一种尤为优选的用于保持原始生殖细胞培养物的培养基将包括与上面相同的取代组分，其中LIF、IGF-I、SCF和bFGF的量如下：
LIF：1.0单位/μl
bFGF：40.0pg/μl
SCF：80.0pg/μl
IGF-I：60.0pg/μl.)
用这些培养条件，发现PGCs在收集后的3到4天内形成大、密、松散粘附的细胞团(部分细胞团中具有数百个细胞)。在第7天末时，细胞团开始具有大量的死细胞和围绕它们的细胞碎片。在它们变成细胞单层之前PGC团存活达到四周。在第1、2和3周，将细胞团解离，用活体染料DiI染色并且转移入受体胚胎中。在所有三个时间点，这些细胞均见于部分受体胚胎的性腺中。显示性腺中染色PGCs的细胞数目和胚胎数目与PGCs培养物的年龄呈负相关。PGCs转移入受体胚胎中
为了PGC转移，将受体卵水平置于解剖镜下。向卵的气囊中刺入一只小孔以降低该卵的内压并且防止破裂。在该卵的腹表面开一个10mm的窗口并通过该孔注射-1ml具有4％抗生素/抗有丝分裂素的PBS从而将胚胎带到上面直至其略微低于卵壳  窗口而不溢出。为了注射PGCs，将30μm的吸管倾斜且然后用微锻炉(microforge)拉长从而形成具有光滑边缘的细端。用针头-吸管和抽吸管(suctiontube)手工挑取按下述解离的每次胚胎转移200个的PGCs。转移前，并还位于吸管中时，将PGCs与0.04％的台盼蓝染料混合。每只胚胎的总注射体积为2μl。最后一步，固定受体胚胎从而露出边缘静脉部分。插入具有PGCs的针头吸管并细心地打出内容物。将针头-吸管维持合适位置数秒后取出。受体卵用2层外科绷带封闭后用石蜡涂布整个区域。然后将卵放回旋转孵化器中并孵育直到孵化。PGC表型的评估
家鸡PGCs用周期性酸性Schiff染色(PAS)为阳性并且称为是碱性磷酸酶阳性。然而，对于后者家鸡PGCs为阳性还没有确信的证据。在缺乏候选酶促或分子标记方法对家鸡PGCs进行特征分析时，其表型通过将细胞转移到受体胚胎中并且在发育的胚胎性腺中评估其存在而加以评估。该方法需要在α-MEM培养基中的100μg/ml DiI中培养PGCs并且在转移到受体胚胎中前冲洗。转移后24小时取出受体胚胎并置于倒置显微镜下。在性腺中观察到的DiI标记的细胞解释为成功的PGC迁移入性腺中并且证实保留了PGC特征。评估PGC表型保留的第二种方法是让受体胚胎继续孵育并且然后在生育后评估供体PGCs在其性腺中而进行。用于PGC评估的生育策略
遵循2种生育策略，第一种策略用具有可能基因型i/i、E/E、s/s、b/b的受体黑色羽毛的鸟和具有基因型I/I、E/E、S/S、B/B的供体白色羽毛的烤鸡型鸟。为了证实受体动物为嵌合的，即是说在其性腺中含有其自己的PGCs和供体PGCs，将其与纯黑色羽毛的鸟交配。如果得到的子代均为黑色羽毛，则认为该动物为非嵌合的。然而，如果部分子代为白色羽毛且具有一些黑色羽斑，则该受体动物将会是嵌合的。对于第二种生育策略，用条形石鸟作为受体胚胎而白色羽毛的烤鸡型鸟继续用作供体。在此后一种情形中，当推断的嵌合鸟与纯种条形石鸟交配时，具有部分条形羽毛的白色羽毛子代的存在将鉴定为阳性嵌合鸟。在对其嵌合状态下结论前从每种推断的嵌合鸟获得了50只子代。子代测试
推断的嵌合E/-(WB)鸟当来源于供体(WB)PGC时，与WB鸟杂交时产生纯白色家鸡并且，当它们来源于(E/-)PGC时产生白色但具有黑色斑状羽毛的家鸡。类似地，当BR(WB)与WB鸟杂交时，当来源于供体(WB)PGC时产生纯白色家鸡并且当来源于(BR)PGCs时产生白斑状黑色家鸡。同时进行推断的BR嵌合鸟间的杂交。对于后者，当受精在2种(WB)PGCs间发生时产生白色家鸡并且黑色家鸡是2种(BR)PGC间受精的结果。具有斑块状黑色羽毛的居间型白色家鸡仅仅在(BR)PGC与(WB)PGC受精时发生。超过25天的长期培养物
连续培养25天后，PGC块迅速形成铺展的单细胞层。这些单细胞层共用一平的粘附基础并且在上表面具有更松散的PGC样细胞团和链。这些单细胞层的有些细胞保持PAS阳性。从这些单层细胞获得的DiI染色的细胞转入受体胚胎中。有些胚胎在其性腺中几乎未显示出细胞。细胞单层成功地传代。一般来说，这些细胞在开始降低其增殖、老化且变得看起来象成纤维细胞前能够进行3到5次传代。在连续培养大约四个月时几乎没有细胞系经历数轮传代而继续旺盛生长且无明显分化。
冷冻从细胞单层获得的2个细胞系，P102896和P110596。前者没有显示出明显的分化并且为碱性磷酸酶边缘阳性而后者显示出神经细胞的形态并且为碱性磷酸酶强烈阳性。有待按这里所述对PGC细胞单层作进一步特征分析从而评估其全能性及多能性。
结果小结
从新鲜和冷冻保藏的PGCs中产生嵌合家鸡。用新鲜PGCs转移产生的34只推断的嵌合家鸡中的25只(74％)在子代测试后证明是真正的嵌合动物。用冷冻保藏的PGCs产生的34只推断的嵌合鸟中的30只(88％)证明是真正的嵌合家鸡。在所有情况中，产生至少40只子代并且每只嵌合鸟受精供体PGCs的数目在1.4％到100％间变化，其中主要位于30％到60％的范围。假定后者是反映注射后迁移到性腺中PGCs的数目，那么每次注射的成功范围是不同的。然而，其它机制可能起作用，它们可能影响在受体性腺中建群的PGCs的数目。在本研究中没有评估这些机制。同样，一般来说，我们没有观察到嵌合鸟子代中性比例的任何显著改变。
PGC培养条件
在本研究中评估的细胞饲养层中没有一种改善PGCs的长期培养条件。在任何研究过的浓度，没有一种生长因子单独能够在体外维持PGCs而无分化。同时测试了2种及3种生长因子的组合而几乎没有成功。根据我们的结果，似乎上述的所有生长因子(LIF、BFGF、IGF-I和SCF)对于PGCs的长期培养是必须的。我们继续测试上述生长因子的不同浓度及组合从而定义PGCs长期培养的最佳可能条件。根据对PGCs的DiI染色，我们观察到在我们的培养条件下，来自14日龄连续培养物的PGCs注射后迁移到受体胚胎的性腺中。我们也将在培养中保持25天的PGCs转移到三只受体胚胎中。通过子代测试证明这些胚胎中的一只为嵌合的。
长期培养条件下的PGC表型
收集后，通过其大小和细胞质中脂滴的存在而识别PGCs。收集后约48小时，由细胞团块大小的增长和胰蛋白酶解离团块后观察到的细胞数目证明PGCs聚集到一起并开始分裂。只有形成团块的PGCs存活，所有其它PGCs死亡。一般，以100个PGCs起始的培养物在7天内将以平均600到800PGCs而结束。显然一些PGCs分裂，虽然不是以有效的速率进行。然而，如上所述，这些PGCs维持其迁移到性腺的能力。超过25天的长期培养物
25天连续培养后，PGC团块迅速形成铺展的细胞单层。这些细胞单层具有一平的粘附基础并且在上表面具有更为松散的PGC样细胞团块和链。这些细胞单层的有些细胞保持PAS阳性。将来自这些细胞单层获得的DiI染色的细胞转移到受体胚胎中。部分胚胎几乎没有显示出位于其性腺中的细胞。细胞单层成功传代。一般，这些细胞在开始延缓增殖而老化并且变得成纤维细胞样表像之前能够经历3到5次传代。在连续培养大约四个月时几乎没有细胞系经历数次传代且继续旺盛生长而无明显分化。
获自细胞单层的2种细胞系，P102896和P110596已经冷冻。前者未显示明显的分化并且为碱性磷酸酶边缘阳性而后者显示神经细胞形态并且为碱性磷酸酶强烈阳性。有待对上述的PGC细胞单层进一步特征分析以评估其全能性和多能性。
特别是，已经显示用上面四种生长因子培养至少25天的PGCs可成功地在性腺中建群并且产生嵌合家鸡。同样，我们已在培养中保持PGC细胞达四个月。这些培养物仍然似乎包括具有所需PGC表型的细胞。虽然没有根据其表型而测试这些细胞产生嵌合鸟的能力，预期它们应当因此是有用的。
PGC转染
含有绿色荧光蛋白报告基因载体的脂质体转染用于PGCs的转染。平均1/50的PGCs得到暂时转染，然而，还未开发出稳定的转染细胞系。
总之，这些结果表明PGCs可保持更长时间并可成功用于嵌合鸟的制备。对生长因子浓度的进一步改变以及其它生长因子的使用可进一步优化培养条件。为了有用，PGC培养系统应该允许对PGCs的转染和筛选而同时维持PGC迁移到性腺中的能力。同样，与相关申请(于对等的日期提交)中更为详尽的细节中公开的一样，延长培养后，家鸡PGCs，于1998年8月3日回复至ES细胞表型，与小鼠PGCs出现的一样(Matsui等，细胞，70：841-847，1992)。因此，注射分散的ES细胞至受体囊胚层中应该提供其它产生嵌合和转基因家鸡的方法。

Claims (20)

1.一种提供更长期保持鸟原始生殖细胞的培养方法，包括以下步骤：
(i)从所需鸟中分离原始生殖细胞；和
(ii)在含有足以在组织培养中更长期维持所述PGCs量的至少以下生长因子的培养基中培养所述的原始生殖细胞更长的时间：
(1)白血病抑制因子(LIF)，
(2)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，
(3)干细胞因子(SCF)和
(4)胰岛素-样生长因子(IGF-I)。
2.权利要求1的方法，其中所述生长因子的最低量优选范围为：
(1)LIF 0.1U/μl到100.0U/μl
(2)bFGF 4.0pg/μl到4000pg/μl
(3)IGF-I6.0pg/μl到6000.0pg/μl，并且
(4)SCF 8.0pg/μl到8000pg/μl。
3.权利要求2的方法，其中所述生长因子的量更为优选的范围为
(1)LIF 0.1U/μl到10.0U/μl
(2)bFGF 4.0pg/μl到400.0pg/μl
(3)IGF-I 60.0pg/μl到600.0pg/μl，并且
(4)SCF 80.0pg/μl到800.0pg/μl。
4.权利要求1的方法，其中所述的鸟PGCs获自鸡属的鸟。
5.权利要求4的方法，其中所述的PGCs为家鸡PGCs或火鸡PGCs。
6.权利要求1的方法，其中所述的PGCs保持于培养中至少14天。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的PGCs保持于培养中至少25天。
8.根据权利要求7的方法，其中所述的PGCs保持于培养中至少四个月。
9.权利要求1的方法，其进一步包括：
(iii)用所需的核酸序列转染或转化得到的PGCs。
10.权利要求9的方法，其中所述的核酸序列编码治疗多肽。
11.一种改进的制备嵌合鸟的方法，包括：
(i)从鸟中分离原始生殖细胞；
(ii)在含有至少下面生长因子的组织培养基中保持这些PGCs；
(1)白血病抑制因子(LIF)，
(2)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，
(3)干细胞因子(SCF)和
(4)胰岛素-样生长因子(IGF-I)；
(iii)将所述的PGCs转入受体鸟胚胎中；和
(iv)筛选具有所需PGC表型的嵌合鸟。
12.根据权利要求11的方法，其中所述的PGCs源自鸡属鸟的胚胎。
13.根据权利要求12的方法，其中所述的鸟胚胎为火鸡或家鸡胚胎。
14.根据权利要求11的方法，其中所述的PGCs在转入受体鸟胚胎之前以所需的核酸序列转染或转化。
15.根据权利要求14的方法，其中所述的核酸序列编码治疗多肽。
16.根据权利要求15的方法，其进一步包括从步骤(iv)中产生的嵌合鸟卵中纯化所述的治疗多肽。
17.根据权利要求11的方法，其中的PGCs注射入受体鸟胚胎的背主动脉和/或边缘静脉或注射入受体囊胚层中。
18.通过权利要求1的培养方法而获得的鸟PGC细胞系。
19.权利要求18的细胞系，其为家鸡或火鸡PGC细胞系。
20.权利要求18的细胞系，其含有插入的核酸序列。
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