CN1273599A - 通过对PGCs更长时间的培养而产生鸟胚生殖(EG)细胞系,其在克隆和嵌合化中的应用 - Google Patents
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Abstract
提供一种通过在组织培养中培养PGCs更长时间而制备PGCs或EG细胞的培养系统。此培养系统使用LIF、bFGF、IGF和SCF。得到的EG细胞对转基因和嵌合鸟,特别是家鸡和火鸡的生产是有用的,并且也用于克隆的目的。
Description
发明领域
本发明提供了一种在组织培养中保持鸟原始生殖细胞(PGCs)，特别是家鸡PGCs更长时间的新方法，其导致产生胚原基(EG)。这些EG细胞可用于所需DNA序列，例如，人基因的插入。这些EG细胞和从中得到的转基因EG细胞可用于制备嵌合鸟，尤其是嵌合家鸡，并可用于克隆。
发明背景
近年来有许多研究集中于嵌合、克隆和转基因动物的制备。
特别地，在过去的二十年中对饲养动物品种基因组的改造是一个活跃的领域，取得了不同程度的成功。例如，这类研究集中于产生转基因猪、母牛和家鸡。到目前为止，可得到转基因动物的大多数是通过直接显微注射具有带有目的基因DNA构建体的单细胞胚胎而产生。然而，尽管显微注射技术已获成功，但这些方法也是有缺陷的因为它们价格昂贵且经常效率低下。
最近，用于制备“敲除”小鼠的胚胎干(ES)细胞技术的成功导致研究集中于对饲养动物品种ES细胞和原始生殖细胞(PGCs)组织培养系统的开发。在连续培养中保持未分化细胞的能力使得能够在体外转染这些细胞并理想地，在其转入发育胚胎的内细胞团中从而产生嵌合动物之前对含有所需基因的转染细胞进行筛选。理想地，至少部分得到的嵌合动物将能够通过精子系分离DNA构建体，并且因而产生转基因子代。然而，截止目前，靶向(定点)整合仅仅在小鼠中得到成功。目前，在其它动物品种中进行靶向DNA整合的能力是有限的。然而，该方向中的工作正在取得进展并且应该很快得到实现。
特别地，由于其相当大的经济重要性，故有许多研究旨在改进鸡属和家鸡的基因组。产生转基因家鸡方面研究的一个十分完整的综述已在三年前发表(Sang，生物技术趋势，12：415-420(1994))。如其中所述，目前正在研究的用于制备转基因家鸡的可选途径基本上有2条。这些方法可根据基因组操作完成的时间，即，产卵前或产卵后而加以区分。后一种方面包括转移供体ES和PGC至受体胚胎中。此外，在两条途径中，工作的内容均通过用含有目的基因的反转录病毒载体感染供体细胞而完成。
包括产卵前对基因组操作的第一种方法产生了混合和/或无效的效果。例如，感染卵巢中的卵母细胞(Shuman和Shoffner，家禽科学，65：1437-1494(1986))并且将精子与质粒DNA预温育(Gruenbaum等.，细胞，生化杂志增刊，15：194(1991))是无效的并且没有得到重复。同样，通过脂质体转染用质粒构建体转染精子细胞已得到证实(Squires和Drake，动物生物技术.，4：71-78 1993)。然而，生殖细胞系传递没有报道。
同样，已报道直接显微注射DNA至胚盘后进行胚胎培养从而产生0.1％成活的转基因嵌合鸟(Sang，W.，生物技术趋势.，12：415-42(1994))，其中一只鸟将该转基因传递至3.4％的子代(Love等.，生物/技术，12：60-63(1994))。Naito等采用了相同的方法(生殖。受精杂志.，102：321-325(1994))。然而，类似地，其中没有报道该转基因的生殖细胞系传递。
包括产卵后基因组操作的第二种方法产生了更好的结果。以复制感受态的反转录病毒载体注射产下的卵而产生的嵌合鸟已显示出生殖细胞系传递至1％到11％的子代(Salter等.，鸟基因组操作中，Etches，RJ等.，编.pp 138-150 CRC出版社(1993))。用复制-缺陷型反转录病毒载体并注射入产下卵中更为鼓舞的结果产生8％的嵌合雄性鸟，其以2到8％的频率将该载体传递至其子代(Bosselman等.，科学，243：535-535(1989))。
然而，在已知促进转染的试剂存在下，用质粒构建体注射产下的卵未能产生稳定整合的构建体或转基因鸟(Rosenblum和Cheng，J.，细胞生化杂志增刊.，15E 208(1991))。一般，由于与之有关的显著缺陷，故用反转录病毒载体产生转基因家鸡没有得到普遍应用。这些缺陷包括可稳定导入其中克隆插入子大小的限制以及可能诱导与内源性病毒座位或其它鸟白血病病毒间的重组事件的更为严重的潜在缺陷。
所有这些方法的一个显著问题是相对难以建立家鸡ES和PGC长期培养系统的事实。据发明人最新了解的知识，认为培养的最长时间的鸟PGCs，其嵌合鸟的成功制备不到5天。
以前的PGC培养方法包括生长因子，尤其是LIF或IGF的使用。然而，正如所述，这些方法没有能够提供更长的培养时间，这是一个普遍关心的问题因为它将有利于转基因PGCs的制备。
然而，虽然在完成长期培养中的众多问题，但ES与PGC细胞均通过用复制感受态和非感受态反转录病毒载体感染这些细胞而成功用于产生嵌合体。此外，如上述，将新鲜获取的囊胚层细胞注射入受体胚胎，得到具有嵌合性腺的鸟(Carsience等.，发育.，117：669-6751993))。囊胚层细胞可通过脂质体转染而有效地转染并且然后转入受体胚胎中。然而，转染细胞的生殖细胞系传递未有报道。
同样，Pain等.，发育.，122：2329-2398(1996)已在近年来证明了获自囊胚层细胞的推断性家鸡ES细胞的存在。他们进一步报道在培养中保持这些细胞35代而宣称无ES表型的丢失(由小鼠ES细胞的单克隆抗体所定义)。(出处同上)这些细胞显然在转入鸟胚胎中时形成PGCs，它们在此胚胎中建群于性腺中。然而，他们没有确切地确立这些细胞实际上是ES细胞。
小鼠ES单克隆抗体与家鸡ES细胞间的定义反应性可能有利于不同品种间ES细胞受体的保护。同样，这些研究人员也能够用注射7天龄的囊胚层细胞培养物产生2只嵌合家鸡的事实将有利地表明ES细胞在其系统中的存在。然而，这些研究人员没有排除PGCs存在于其复合培养系统中的可能性。因此，应该进一步测试此长期ES培养系统的多能性和生殖细胞系传递(出处同上)。
制备ES细胞的一个候选途径包括PGCs。已开发出从供体分离和转移PGCs至受体胚胎中的方法并且已成功地产生具有供体基因型生殖细胞系传递的嵌合家鸡(Vick等.，London Ser.B.，251：179-182(1993)，Tajime等.，动物系谱学(Theriogenology)，40：509-519(1993))。此外，PGCs已冷冻保藏且后来融化以产生嵌合鸟(Naito等.，生殖。受精杂志.，102：321-325(1994))。然而，此系统很费力并且仅仅平均每只胚胎产生50到80个PGCs。用反转录病毒载体感染PGCs也已报道过。然而，截止目前，在培养基中培养PGCs更长时间从而促进转染PGCs的筛选还未成功。
因此，根据前述，显然培养PGCs的改进方法包括本领域中的显著必要性。同样，另一种显著的必要性包括制备鸟胚胎干细胞(ES)或胚生殖(EG)细胞的新方法，因为它们应用于克隆鸟的制备和嵌合鸟及其转基因形式的制备。
发明目的
解决现有技术中的问题是本发明的一个目的。
提供在组织培养中培养鸟原始生殖细胞(PGCs)更长的时间的新方法从而导致胚生殖(EG)细胞系的制备是本发明一个更为具体的目的。
提供在组织培养中培养鸡属，尤其是家鸡或火鸡原始生殖细胞(PGCs)更长时间的新方法从而制备胚生殖(EG)细胞系是本发明一个更为具体的目的。
用通过在组织培养中培养PGCs更长时间而获得的鸟胚生殖细胞制备嵌合鸟，优选家禽，且最优选为家鸡是本发明的另一个目的。
导入所需的核酸序列至通过在组织培养中培养鸟原始生殖细胞更长时间而获得的胚生殖细胞中是本发明的另一个目的。
用通过在培养中培养原始生殖细胞更长时间而制备的、其中导入有所需核酸序列的鸟生殖细胞制备转基因嵌合鸟，优选转基因嵌合家鸡是本发明的另一个目的。
用得到的转基因嵌合鸟，优选鸡属并且最为优选家鸡或火鸡，优选通过从这些转基因鸟，尤其是转基因嵌合家鸡及其子代的卵中回收蛋白来制备由导入其中的细胞含有的核酸序列所编码的异源蛋白是本发明另一个目的。作为选择，可直接从转基因嵌合鸟，例如，从循环系统(血液或淋巴)或其它组织或体液中回收这些蛋白。
用通过更长时间培养鸟原始生殖细胞而获得的鸟生殖细胞，优选家鸡胚生殖细胞克隆鸟，例如，克隆的家鸡(可能为转基因的)是本发明的另一个目的。
附图简述图1.小鼠ES细胞的EMA-1抗体染色。A图和B图表示两种不同的培养物。A1与B1-小鼠ES细胞团的DAPI染色图像。A2和B2-小鼠ES细胞团的相差图像。A3与B3-小鼠ES细胞的阳性FITC信号。图2.98-天龄PGC培养物的EMA-1抗体染色。A图与B图表示两种不同的培养物。A1与B1-98日龄PGC团的DAPI染色图像。A2与B2-PGC团的相差图像。A3与B3-PGCs的阳性FITC信号。图3.新鲜收集到家鸡PGCS的EMA-1抗体染色。A图与B图表示2种不同的处理。A1与B1-新鲜PGCs的DAPI染色图像。A2与B2-PGCs的阳性FITC信号。注意相应于PGCs的A1中DAPI染色的PGCs的箭头显示A2中的阳性FITC信号。图4.对家鸡初级成纤维细胞的EMA-1抗体染色。A图与B图表示2种不同的培养物。A1与B1-家鸡成纤维细胞的DAPI染色图像。A2与B2-家鸡成纤维细胞的相差图像。A3与B3-家鸡成纤维细胞的FITC图像(阴性)。图5.小鼠ES细胞的MC-480抗体染色。A图与B图表示2种不同的培养物。A1与B1-ES细胞团DAPI染色图像。A2与B2-小鼠ES细胞的相差图像。A3与B3-小鼠ES细胞的阳性FITC信号。图6.对98-日龄的PGC培养物一个处理物的MC-480抗体染色。A1-98-日龄PGC团的DAPI染色的图像。A2-PGC团的相差图像。A3-98-日龄PGCs的阳性FITC信号。图7.新鲜收集的家鸡PGCs的MC-480抗体染色。A图与B图表示2种不同的处理。A1与B1-DAPI染色的新鲜PGCs。A2与B2-PGCs的阳性FITC信号。参见相应于A2中阳性FITC信号的A1中DAPI染色PGCs的箭头。图8.家鸡初级成纤维细胞的MC-480抗体染色。A图与B图表示2种不同的培养物。A1与B1-家鸡成纤维细胞的DAPI染色图像。A2与B2-家鸡成纤维细胞的相差图像。A3与B3-家鸡成纤维细胞的FITC图像(阴性)。
发明简述
正如所述，本发明提供了一种在组织培养中保持鸟(家鸡)原始生殖细胞(PGCs)更长时间，即，至少14天，更为优选至少25天且理想是无限长时间的新方法。我们现在达到4个月的连续培养并且大约经过32次细胞传代。
本发明之前，还没有报道在组织培养中提供其保持长于5天的保持鸟PGCs的任何方法(由其产生嵌合鸟的能力所证实)。通过明断的实验，本发明人惊奇地发现用含有至少以下生长因子的培养基：白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)和胰岛素-样生长因子(IGF)能够使鸟原始生殖细胞，特别是家鸡原始生殖细胞在组织培养中保持和增殖更长的时间，即至少14天，以及实质上更长时间。此外，这些PGCs已证明在产生嵌合家鸡中是有用的。
这些PGCs对于可用于产生转基因嵌合鸟的转基因鸟PGCs的制备是有用的。预计这些转基因嵌合鸟对于异源蛋白的回收将是有用的，这些蛋白优选可直接从这些嵌合转基因鸟卵，或从组织及其它体液中回收。例如，这些鸟可用于制备和回收治疗性蛋白及其它多肽。
然而，本发明的基础是进一步观察到这些PGCs，在更长时间培养后，即大约25天后去分化并且显然导致胚生殖(EG)细胞的产生。
具体地说，25天后，培养的PGCs(细胞团块)迅速形成铺展的细胞单层，它们具有一个平的粘附基础。在其表面上为更为松散的“PGC-样”细胞。此外，这些细胞中部分PAS染色阳性。同样，获自这些细胞单层的DiI染色的细胞当转入受体鸟胚胎中时定位于性腺中。此外，这些细胞单层理论上可无限传代。
也观察到经过大约3到5次传代后，部分细胞延缓其增殖作用并且表现出成纤维细胞样外形。然而，有些细胞系已传代数次，并且甚至在四个月连续组织培养后继续旺盛生长而无任何分化的迹像。同时观察到，随着这些细胞集落中细胞数目的增加，该细胞单层变得更为“紧密”，得到多层细胞集落的表像。
如上所述，从其中已获得两种细胞系，其中一种是碱性磷酸酶阳性并且显然没有分化。同样，其还表达多能与全能细胞类型特征性的其它标记。因此，认为这个细胞系为胚生殖细胞系。因此，本发明是基于PGCs在培养中可去分化从而产生EG细胞的发现。
如上文所述，这是一个非常重要的发现因为这些细胞可用于克隆鸟，并且用于制备嵌合鸟。同样，这些胚生殖细胞可用于在体外研究鸟胚生殖细胞系的分化。更进一步，这些细胞可(通过导入所需的核酸序列)而变成转基因型并且用于制备转基因嵌合或克隆鸟，优选为鸡属的鸟，且最优选为家鸡或火鸡。
发明详述
因此，本发明避开了与前面的鸟PGC培养方法有关的问题，以前方法不能够使这些PGCs在组织培养中保持长于大约5天的时间。如上文所详述的，本发明人惊奇地发现通过使用含有至少下面四种生长因子的培养基，鸟PGCs，优选鸡属PGCs，并且最优选为家鸡PGCs可在组织培养中保持更长的时间，至少14天，更优选至少25天，且优选更长时间：
白血病抑制因子(LIF)，
干细胞因子(SCF)，
胰岛素-样生长因子(IGF)和
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
一般，这种培养方法包括以下步骤：
(i)从供体XII期到XIV期鸟胚胎中分离PGCs；和
(ii)在含有有效促进其在组织培养中增殖更长时间，即一般在28天后从而制备EG细胞的相对量LIF、bFGF、SCF和IGF的培养基中培养所述分离的鸟PGCs。此外，如上文所述，本发明基于这样的发现，即这些PGCs在此培养基中培养更长时间，平均至少约25天后明显去分化从而产生鸟胚生殖细胞。在这方面，较早期报道在LIF和bFGF存在下保持于STO饲养细胞单层上的小鼠PGCs导致细胞类似于胚生殖细胞(Resnick等，自然，359：550-551，1992；Matsui等，细胞，70：841-843，1992)。Resnick等(Id.)提议这种细胞名为胚生殖(EG)细胞从而暗示其源于体外的PGCs，虽然此时还不清楚EG细胞是否与传统的ES细胞明显不同。
因此已显示至少在小鼠胚胎细胞系中，EG细胞与ES细胞在某些基因的甲基化状态中有所不同(Labosky等.，发育，120：3197-3204，1994；Piedra hita等.，生殖生物学，58：1321-1329，1998)。然而，与ES细胞一样，当注射入宿主胚泡中时，显示EG细胞在培养中强烈分化并有助于嵌合体，因此显示其多能及全能性质。还未显示是否鸟EG和ES细胞也将在基因甲基化中具有差异。尽管没有希望支持该假设，但认为本发明细胞为EG细胞因为它们来自PGC′s而不是与ES细胞一样来自囊胚层。
这些细胞显然是胚生殖细胞的事实得到不同测试的支体。特别地，组织细胞为碱性磷酸酶(Pain等，发育，122：2339-2432，1996)和小鼠特异性抗原1和3(根据与SSEA-1和SSEA-3特异性单克隆抗体间的反应性)阳性。这些特征为多能和全能细胞的标记。因此，鸟(家鸡)和小鼠多能与全能干细胞显然具有其未分化状态特征性的有关表位。因此，这些抗体对于筛选用该受试培养系统更长时间培养鸟PGCs而产生的细胞集落中产生的鸟胚生殖细胞是有用的。
这些EG细胞的全能性与多能性可通过转化成X期家鸡的胚胎而得到证实(Etches等，家禽科学，72：882-887，1993中所述)。这将提供这些鸟EG细胞能够得到不同发育时期特征性的不同组织(多能性)以及迁移到性腺的证据，证明了生殖细胞系的传递。因此，转化后，这些EG细胞应该得到体细胞及生殖细胞系嵌合鸟。
从供体鸟胚胎中分离原始生殖细胞的方法已在文献中报道过并可由本领域的技术人员完成。(参见，例如，JP 924997，1993年9月7日发表Pub.No.05-227947；Chang等.，Cell Biol.Int.，19(2)：143-149(1992)；Naito等.，分子.生殖.发育.，39：153-161(1994)；Yasuda等.，生殖.受精杂志.，96：521-528(1992)；和Chang等.，细胞生物学国际报告，16(9)：853-857(1992)，在此掺入所有这些文献供参考其完整性)。
本发明人选择从已孵育约53小时的家鸡卵(胚胎发育的12-14期)中分离鸟PGCs，从中取出胚胎，从其背主动脉中收集胚胎血液并将其转入适当的细胞培养基(M199培养基)中。这些PGCs然后通过ficoll密度离心加以纯化，并且重悬于10μl含有生长因子的本发明培养基中。然而，如上所述，分离PGCs的其它方法是已知的并可选择性使用。
然后手工计数和分离分离的PGCs(例如，用吸管)。之后，合并从这些不同鸟胚胎中收集的PGCs并且在含有生长因子的受试培养基中温育。
该培养基，下文称为“完全”培养基含有LIF、bFGF、SCF和IGF以及其它一般包括在PGC和胚生殖细胞培养基中的取代组分。更为具体地，该受试“完全”培养基将优选包括α-MEM，一种众所周知的商业上可得到的细胞培养基，其中加入了上述四种生长因子并且还包括10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，0.48％抗生素/抗有丝分裂素，132μM2-β巯基乙醇，1U/μl LIF，0.40pg/μl bFGF，60pg/μl IGF-I及80pg/μl SCF。
根据目前进行的实验，认为这些浓度相应于这些生长因子的最低浓度。然而，如上文所述，这些生长因子的量已被加倍，其中PGCs成功地保持于组织培养中。因此，已知这些生长因子的各自量可以增加而无副作用。此外，甚至这些最低量可以变化。例如如果培养基它鸟的PGCs。
如所述，本发明人用α-MEM，一种众所周知的商业上可得到的组织培养基作为基本培养基。然而，如果这四种必需生长因子也存在，则预期其它培养基可以取代之。申请人特别考虑到对该受试“完全培养基”的修饰从而排除致命的胎牛血清，因为其成分未确定且是可变的。
本发明特别的优势是EG细胞可在无饲养细胞层时保持，这在制备嵌合或充隆动物时提供了更为纯化的集落和更为清洁的制备。EG细胞制品增加的纯度反过来导致制备嵌合和克隆动物成功可能性增加。然而，如果这些细胞以编码公开的生长因子基因转染，则本发明也可用饲养细胞层进行，由此排除了培养过程中外源性添加这些因子的必要，基本上，这些细胞将提供这些生长因子的连续来源。(这将通过将这些生长因子基因以及提供其分泌的序列置于组成性强启动子控制下得以完成，由此使培养的PGCs可得到这些生长因子)。
如所述，这些生长因子的量指能够有效地使鸟PGCs，优选鸡属PGCs，并且最优选家鸡或火鸡PGCs在组织培养中培养更长时间的其相对量。在本发明中，这进一步指导致培养的PGCs去分化成EG细胞的量。
优选地，这些生长因子的相对量将位于下面的范围中：
LIF 1U/μl到100U/μl，更优选1到10U/μl且最优选1到5U/μl；
IGF-I 0.60pg/μl到60.00pg/μl，更优选0.60pg/μl到6.0pg/μl的重量并且最为优选为0.60pg/μl到1.0pg/μl的重量；
SCF 80pg/μl到8000pg/μl的重量，更优选80pg/μl到800pg/μl且最优选为80pg/μl到160pg/μl的重量；并且
bFGF 0.40pg/μl到40pg/μl，更优选0.40pg/μl到4.0pg/μl重量并且最优选0.40pg/μl到0.80pg/μl的重量。
在上述的范围中，范围的上限对本发明不是关键并且主要由费用所决定(如果给定了与生长因子制备有关的显著费用)。
然而，预期例如，如果α-MEM由其它培养基所替代并且如果培养其它类型鸟PGCs时，这些优选的范围可能会改变。
如所述，这些PGCs可在培养中长期保持而成功制备嵌合鸟。截止目前，这些细胞保持于组织培养中达大约4个月、且明显无副作用。同样，测试达25天细胞在胚胎性腺中有效建群并且产生嵌合鸟的能力。然而，预计这些细胞可无限地培养而保留产生嵌合鸟的能力。
由上述本领域表明用PGCs制备嵌合体方法在本领域中是已知的。优选，EG细胞将根据在后面实施例中公开的方法被转入到受体鸟胚胎中。之后，根据PGCs的迁移以及在性腺中的建群、PGC表型的维持或评估在孵化和生育后性腺中供体PGCs的存在而评估成功嵌合体的制备。
在该实施例中，本发明人选择了着色后易于跟踪的基因型。(供体鸟分别是具有特异性潜在基因型的白色烤鸡型且受体鸟为黑色羽毛的鸟)。推断的嵌合体为黑色羽毛并且当其与黑色羽毛的鸟交配时产生黑色/白色子代。由此，成功的嵌合体由含有黑色/白色羽毛的鸟的产量而得到证实。
在第二种策略中，柱形石(Bar Rock)鸟用作受体，且白色羽毛的鸟用作供体。推断的嵌合鸟根据具有部分柱形羽毛子代的产量而得到证实。
然而，该受试方法应该可适用于通过嵌合化而导入任何所需的特征。这将理所当然依赖于转移PGCs的基因型特征。
正如所述，可在培养中保持长时间的该受试PGCs的显著应用是嵌合鸟的制备。这将通过导入所需的DNA序列到培养的PGCs中而得以完成。将DNAs导入受体细胞的方法是已知的并且包括脂质体转染、转染、显微注射、转化、微粒技术等。特别地，本发明人起初选择通过脂质体转染而导入含有报告基因的载体。然而，虽然短暂转染的PGCs得到制备，但仍未分离到稳定转染的细胞系。然而，预期这可通过用该受试PGCs通过已知的技术完成。
优选地，将导入编码在鸟可操作序列调控下的所需基因，例如，治疗多肽、生长因子、酶等。优选地，这些调控序列将为真核细胞来源，最优选为鸟，例如，家鸡的调控序列。在鸟细胞中可操作的启动子，例如，源自鸟基因或病毒的启动子在本领域中是已知的。
起初，将分离产生所需蛋白的稳定细胞系并且用于嵌合体制备。该导入的DNA含有标记DNA(其表达易于检测)从而更为容易地鉴定出含有插入DNA的细胞。这种可选择的标记是众所周知的并且包括β-内酰胺酶(lactamase)、β-半乳糖苷酶、新霉素磷酸转移酶等。
得到的转基因PGCs注射入鸟胚胎中将然后导致转基因嵌合鸟的制备。优选然后将从这些转基因鸟的卵，体液中等回收所需的蛋白，由此提供该蛋白的持续供应。
正如所述，本发明包括从按上述培养的PGCs中制备EG细胞。
这些EG细胞将根据其特征性“ES”抗原或标记、特别是碱性磷酸酶和时相特异性胚胎抗原的表达而得到鉴定。例如，SSEA-1和SSEA-3特异性的单克隆抗体可用于鉴定在组织培养中培养更长时间，一般至少25天的PGCs中的多能与全能细胞。例如，MC-480为SSEA-1抗原特异性的单克隆抗体(Solter与Knowles(1978))。
同样，另一种单克隆抗体，EMA-1为小鼠和家鸡PGCs特异性的并且因此应该允许对维持PGC-特异性表位的PGC培养物的鉴定。(该抗体结合同时在小鼠与家鸡原始生殖细胞上表达的特异性表位)。因此，EMA-1应该对鸟EG细胞进一步种系特征分析是有用的，因为这些表位在非常不同的品种(鸟与哺乳动物)中显然是保守的。
正如所述，这些EG细胞的全能性与多能性可通过，例如转入X期家鸡胚胎(Etches等，家禽科学，72：882-889，1993中所述)和上述的XII-XIV期胚胎中而得到测试。这将提下面的实验证据，即这些EG细胞分化成发育胚胎中见到的不同组织类型(多能性)并且同时它们成功迁移并建群于性腺中(证明这些细胞将转递至生殖细胞系)因此，这些细胞将导致体细胞和生殖细胞系嵌合鸟，例如，嵌合家鸡。转基因家鸡的产生：
支持PGCs增殖并且进一步允许其去分化成EG细胞的培养系统的开发增加了我们用带有外源基因的DNA载体构建体转染细胞的能力从而用于在家鸡中系统性制备外源蛋白。类似地，产生定点(同源重组)，也称为“敲除”和“敲入”(Knock-ins)转基因家鸡将是可能的因为该方法促进转染后EG细胞的筛选和增殖。
用于家鸡克隆的EG细胞的使用：
哺乳动物的克隆已获成功。鸟的克隆可用PGCs和EG细胞以及可能分化胚胎细胞(家鸡胚胎成纤维细胞，CEF)来完成。这可按如下完成：
1.将通过对新产下的卵进行γ辐射的方式从而胚胎细胞受到损伤而制备家鸡嵌合体。这将通过以大致相当于该损伤囊胚层中所含细胞的数目显微注射克隆的EG细胞而进行。γ辐射的最佳水平和注射细胞的数目可根据本领域中的讲义容易地加以测定(Carsience等.，发育(1993)117：659-675；Etches等.，家禽科学，(1993)73：882-889)。
2.将通过提取未受精的卵母细胞后γ辐射，电刺激卵母细胞、注射和融合EG、PGC或CEF而从新鲜产下的未受精卵中而产生家鸡克隆。融合后，将卵母细胞转入含有胚胎培养基的培养皿中(Ono等，发育生物学，161：126-130，1994)或移回未受精的卵中。
实施例
下面的材料与方法用于下述的实验中。材料与方法。
单克隆抗体
从爱荷体大学的发育研究杂交瘤库(DSHB)中获取初级抗体EMA-1和MC-480(抗-SSEA-1抗体)。EMA-1抗体：
单充隆抗体EMA-1为Hahnel和Eddy(1986)开发的小鼠原始生殖细胞(PGCs)特异性的细胞表面标记。此试剂开发成针对NulliSCCI小鼠胚癌(EC)细胞的细胞表面标记。通过融合NS-1骨髓瘤细胞与用Nulli SCCI EC细胞免疫的C57BI/6J小鼠脾细胞而制该抗体。EMA-1单克隆抗体为IgM同型(isotype)(Addendum#1)。由该抗体所识别的抗原是细胞表面糖蛋白。在发育的小鼠胚胎中EMA-1抗原在小鼠PGCs上的表达限于8到13天。EMA-1与早期胚胎中大多数但非所有的多能细胞反应(Hahnel和Eddy，1987)。根据Hahnel和Eddy(1986)，PGCs仅仅是在9.5到11-日龄胚胎的尾部为EMA-1染色强烈阳性的细胞。其显示与雄性小鼠13-日龄胚胎切片后半部分区域尿生殖嵴中的PGCs具有反应性。其没有显示出与14-日龄小鼠胚胎切片中PGCs的反应性。EMA-1与PGCs中存在的周边与细胞质颗粒体结合。Nulli细胞上带有EMA-1决定簇的抗原对EDTA和胰蛋白酶处理不敏感。MC-480(抗-SSEA-1)抗体：
单克隆抗体MC-480识别时相特异性的小鼠胚胎抗原SSEA-1。该抗体是Solter与Knowles(1978)所述的同型IgM。由此抗体鉴定出的细胞表面抗原SSEA-1由位于包括岩藻糖化2型血型糖脂和糖蛋白上的碳水化合物表位(addendum#2)所组成。该抗体通过融合小鼠骨髓瘤细胞与用F9畸胎瘤细胞免疫的小鼠的脾细胞而形成。用放免分析(RIA)测试该抗体对一系列小鼠和人细胞系的特异性。该抗体与小鼠畸胎瘤细胞及两种人畸胎瘤来源的细胞系反应(Selter与Knowles，1978)，源自该相同肿瘤与畸胎瘤干细胞系的所有分化细胞系对该抗原均为阴性。对小鼠胚胎进一步测试该杂交瘤的上清液。该抗体没有显示出与未受精卵、受精卵与2到4细胞期胚胎间的反应性。该抗体以逐渐增加的效率结合晚期8-细胞期胚胎和桑椹胚。用互补依赖性裂解的测试显示出类似的趋势。8-细胞期前没有观察到胚胎的裂解。观察到8-细胞期胚胎的适度裂解(10-20％)而桑椹胚、胚泡和内细胞团以高效率裂解(Solter和Knowles，1978)。用间接免疫荧光分析的结果也类似，其中未受精卵，受精卵和2-与4-期胚胎为阴性。在体外培养达3天的大多数内细胞团(ICM)为该抗原阳性。通过去除体外培养ICM内皮的外层而暴露的外胚层总是完全阳性。Solter与Knowles(1978)争论说在早期植入前和胚胎发育过程中可能有数种时相-特异性糖基转移酶合成或活化并存在于细胞表面。
动物
白色(E/E和I/I)烤鸡型家鸡用作PGCs的供体以开发长期PGC培养系统。2种鸟用作受体胚胎，显色黑色(E/-和i/i)家鸡系与柱形石(E/E和i/i)品系。用白色烤鸡(WB)型PGCs注射的显性黑色鸟称为E/-(WB)并且用白色烤鸡型PGCs注射的柱形石鸟称为BR(WB)。
PGCs的提取
选择12到14期胚胎用于PGC提取。按Naito等.，分子.生殖.发育.，37：167-171(1994)中所述用的小的微吸管从背主动脉中收集PGCs。来自20只胚胎的PGCs合并于补充以10％胎牛血清的Hanks′液中并通过Ficoll密度梯度离心加以浓缩(Naito等.，分子.生殖.发育.，39：153-171 1994)。将PGCs计数并以每滴约100到600个PGCs而分散于10μl的培养基液滴中(DMEM，含有不同量的生长因子)。用无菌轻矿物油覆盖培养滴。注射PGCs至受体胚胎中
13-14期的胚胎用作受体胚胎。将卵置于适当的表面上后，允许一定时间用于发育的胚胎将其本身定位于安静卵的上侧。用细小的镊子在卵壳上制作一小的10mm或更小的开口(“窗口”)。通过加入具有4％抗生素的磷酸缓冲盐混合物而将胚胎靠近此表面。调整该胚以观察到其心脏后，可容易地鉴定背主动脉和/或边缘静脉。将含有0.04％台盼蓝的2μl培养基中的200个供体PGCs吸收微吸管中。将PGCs注射入受体胚胎的背主动脉中。台盼蓝，一种惰性细胞染料，当被转运时允许对PGC悬液的观察。注射后，用手术绷带封闭卵壳开口并用石蜡加固。在加湿的CO2孵化器中在监视下保持24小时且后来转入规则的孵化器中直至孵化。PGCs的活体荧光染色
为了评估转移的成功性和/或PGCs迁移到性腺中能力，用DiI荧光染料对PGCs染色。转移24小时后收集胚胎，置于培养皿上并在装配用于表面-荧光分析的倒置显微镜下观察。
PGC培养条件.
已测试了数个浓度的人白血病抑制因子(Lif)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人胰岛素-样生长因子(IGF)和人干细胞因子(SCF)。同样，也测试了丝裂霉素处理的家鸡成纤维细胞和小鼠STO细胞饲养层。PGC长期细胞培养基
完全细胞培养基由以下成分所制成，包括α-MEM、10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、0.56％抗生素/抗有丝分裂素(antimitotic)、34.56mM 2-β巯基乙醇、0.00625U/μl白血病抑制因子(LIF)、0.25pg/μl基本成纤维细胞生长因子(bFGF)、0.5625pg/μl胰岛素样生长因子(IGF)和4.0pg/μl干细胞因子(SCF)。每隔一天通过取出5μl培养基并且加入5μl 2X新培养基而完成培养基更新。后者认为经一定时间的连续培养后生长因子将不稳定。然而，净结果是生长因子浓度加倍。因此，最终的培养基现含有以下的生长因子浓度：0.0125U/μl的白血病抑制因子(LIF)、0.5pg/μI的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1.125pg/μl的胰岛素样生长因子(IGF)和8.0pg/μl的干细胞因子(SCF)。在此所述的生长因子浓度范围促进PGCs在连续培养中的保持与增殖。然而，在所述生长因子浓度的最上限PGCs存活和增殖更好。
用这些培养条件，PGCs在收集后的3到4天内形成大、密、松散粘附的细胞团(有些细胞团中具有数百个细胞)。到第7天末时，这些细胞团开始具有大量的死细胞和围绕它们的细胞废物。PGC细胞团在变成细胞单层之前存活达四周。在1、2和3周时，解离细胞团，用活体染料DiI染色并转入受体胚胎中。在所有三个时间-点，在部分受体胚胎的性腺中发现了这些细胞。在性腺中显示染色PGCs的细胞数目和胚胎数目与PGCs培养物的年龄呈负相关。抗体测试方法和对照细胞系的培养
以大约70到80％的汇合在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM；SIGMA，Cat#D-5523)中将γ辐射的(8000镭)STO饲养层细胞(美国典型培养物保藏中心，Cat#1503-CRL)接种于4-孔室玻片上。8到10小时后将用作阳性实验对照的小鼠ES细胞接种于STO饲养细胞层中。
DMEM完全培养基通过补充基本培养基以下终浓度的组分而加以制备，包括4.5g/l葡萄糖(SIGMA，Cat#G-7021)、1.5g/l碳酸氢钠(SIGMA，Cat#S-4019)、1mM丙酮酸钠(GIBCO，Cat#11360-070)、0.1mM 2β-巯基乙醇(GIBCO，Cat# 21985-023)、10％胎牛血清(Hyclone，Cat#SH 30070-03)和1％抗生素/抗有丝分裂素(SIGMA，Cat# A-7292)。
接种于4-孔室玻片中DMEM完全培养基中的家鸡成纤维细胞用作阳性对照。当小鼠ES细胞形成可见的集落时将细胞于37℃且6％CO2中孵育3天，倒出培养基，用磷酸缓冲盐(PBS)冲洗并将细胞固定于4℃冷的4％多聚甲醛(SIGMA，Cat#P-6148)中15分钟。
将98-日龄家鸡PGC的体外培养物的细胞团转入4-孔室玻片中并于冷的4％多聚甲醛中固定，而新鲜的家鸡PGCs固定于规则的玻片上。用封闭剂(PBS中的1mg/ml牛血清蛋白，Fisher，Cat# BP1605-100)封闭30分钟。
将抗体用封闭剂以5μg/ml的比例加以稀释，并将200μl应用于各自的玻片上并且于4℃孵育18小时过夜。将200微升的二级抗体(荧光素交联的亲和纯(affinipure)羊抗鼠IgM，Jackson实验室，Cat 9115-015-020)以封闭剂中5μg/ml的比例应用于每只玻片上并于37℃进一步孵育一小时。用4×含有0.1％Tween-20(Fisher，Cat#BP337-100)的柠檬酸钠盐(SSC)在37℃洗玻片3次，每次5分钟。将细胞用含有400ng/ml DAPI(SIGMA，Cat#D-9542)的2×SSC在室温染色10分钟，含有0.05％Tween-20的2×SSC冲洗3分钟并固定于DABCO(SIGMA，Cat#D-2522)抗褪色剂(antifade)中。
玻片用Nikon Eclipse E800光学显微镜下加以观察，该显微镜装配有明视野、DIC、相位和荧光镜片，包括100-瓦汞灯表面荧光照明，其中具有标准的激发/隔栅滤镜。在适当的滤镜设备下观察细胞以检测FITC信号和DAPI染色的细胞核。也获得了细胞的相差图像。用Coolcam液相冷却CCD相机(Cool相机公司，Decatur，GA)以Image ProPlus 3.0版软件(Media Cybernetics，Silver Springs，NM)获取数码图像并且贮存于Iomega ZIP驱动器中。图像用Photoshop 4.0(Adobe)软件处理并用Epson Stylus-800打印机在光泽的图像用高质量纸上打印。PGC转移入受体胚胎中
为了PGC转移，将受体卵水平置于解剖镜下。向该卵的气室中剌入一小孔从而降低卵的内压并且防止泄漏。在该卵的腹面上打开一10mm的开口并径此开口注射～1ml具有4％抗生素/抗有丝分裂素的PBS从而将胚胎带上来直到其略微低于溢出卵壳开口。为了注射PGCs，将30μM的吸管倾斜并且然后用微锻炉拉伸以形成具有光滑边缘的细端。用针头-吸管和吸管手工挑取按下述解离的每次胚胎转移200个PGCs。转移之前且还位于吸管中时，将PGCs与0.04％的台盼蓝染料溶液混合。每只胚胎的总注射体积为2μl。最后一步，将受体胚胎固定从而暴露出边缘静脉部分。将具有PGCs的针头-吸管插入并且细心地打出内容物。将此针头-吸管固定于原位几秒钟且然后取出。受体卵用2层手术绷带封闭后用石蜡涂布整个区域。然后将受体卵放回旋转孵化器中并孵育至孵化为止。PGC表型的评估
家鸡PGCs为周期性酸性Schiff染色(PAS)阳性并且声称为碱性磷酸酶阳性。然而，还没有家鸡PGCs对后者为阳性的确信证据。在缺乏候选酶促或分子标记方法对家鸡PGCs进行特征分析时，通过将这些细胞转入受体胚胎中并且评估其在发育胚胎性腺中的存在而评估其表型。该方法需要在100μg/ml DiI的α-MEM培养基中培养PGCs并且在转移至受体胚胎前加以冲洗。转移24小时将受体胚胎取出并置于倒置显微镜下。性腺中观察到的DiI标记细胞解释为成功的PGC迁移到性腺中并证实PGC特征的维持。评估PGC表型维持的第二种方法通过使受体胚胎继续孵化且然后在生育后评估其性腺中供体PGCs的存在来完成。用于PGC评估的生育策略
进行2种育种策略。第一种策略使用具有可能基因型i/i、E/E、s/s、b/b的受体黑色羽毛的鸟和具有基因型I/I/、E/E、S/S、B/B的供体白色羽毛的烤鸡型鸟。为了证实受体动物是嵌合的，即在其性腺中含其自身PGCs和供体PGCs，将它们与纯黑色羽毛鸟交配。如果得到的子代均为黑色羽毛，那么该动物认为是非嵌合型的。然而，如果部分子代为白色羽毛且具有部分黑色羽毛斑块，那么该受体动物将是嵌合的。对于第二种生育策略，将柱形石鸟用作受体胚胎而白色羽毛的烤鸡型鸟继续用作供体。在后一种情形中当推断的嵌合鸟与纯种柱形石鸟交配时，具有部分柱形羽毛的白色羽毛子代的存在将鉴定为阳性嵌合鸟。在对其嵌合地位下结论之前从每只推断的嵌合鸟中获得50只子代。子代测试
当与WB鸟杂交时，如果它们来源于供体(WB)PGC时推断的嵌合E/-(WB)鸟产生纯白色鸟，如果它们来源于(E/-)PGC时则产生白色但具有黑色斑点羽毛的家鸡。类似地，当BR(W/B)与WB鸟杂交时，如果来源于供体(WB)PGC时产生纯白色家鸡且如果它们来源于(BR)PGCs时产生白色斑点状的黑色家鸡。同时进行推断BR嵌合鸟间的杂交。对于后者，当受精在2种(WB)PGCs间发生时，产生白色家鸡并且黑色家鸡为与2种(BR)PGC受精的结果。具有斑点状的黑色羽毛的居间白色家鸡仅仅在(BR)PGC与(WB)PGC受精时才发生。超过25天的长期培养物(EG细胞)
25天连续培养后，PGC细胞团迅速形成铺展细胞单层。这些细胞单层具有平的粘附基础并且在上表面上具有更松散的细胞块和PGC样细胞链。这些细胞单层的部分叠堆(packets)保持PAS阳性。从这些细胞单层中获得的DiI染色细胞被转移至受体胚胎中。有些胚胎显示其性腺中几乎无这些细胞存在。细胞单层成功传代。一般，这些细胞在其开始延缓其增殖、老化和变成成纤维细胞表像之前能够经历3到5次传代。有多个细胞系经历多次传代并且在连续培养中培养大约4个月时继续旺盛生长而无明显的分化。获自细胞单层的2种细胞系，P102896和P110596已被冷冻。前者没有显示出明显的分化并且为碱性磷酸酶边缘阳性而后者显示出神经细胞形态并且为碱性磷酸酶强烈阳性。如上所述，按这里所述对PGC单层(具体为推断的EG细胞)的进一步特征分析将进一步证实其全能性和多能性。
结果小结
从新鲜和冷冻保藏的PGCs中产生嵌合家鸡。用新鲜PGCs转移产生的34只推断嵌合家鸡中的25(74％)只在子代测试后证明为真正的嵌合动物。用冷冻保藏的PGCs产生的34只推断嵌合鸟中的30只(88％)证明为真正的嵌合家鸡。在所有情况中，至少产生40只子代并且每只嵌合鸟受精的供体PGCs的数目从1.4％到100％间变化，其中大多数范围在30％到60％之间。假设该后者是注射后迁移到性腺中PGCs数目的反映，那么每次注射成功的范围是变化的。然而，其它机制可能起作用，其可能影响要确立于受体性腺中PGCs的数目。这些机制在该研究中没有作出评估。同样，一般地，我们在嵌合鸟的子代中没有观察到性比例的任何显著改变。
PGC培养条件
在本研究中评估的细胞饲养层中没有一种改进了PGCs的长期培养条件。在任何研究过的浓度时仅仅这些生长因子中没有一种能够在体外保持PGCs而无分化。也测试了2种及3种生长因子的组合而几乎没有得到成功。根据我们的结果，似乎上述所有的生长因子(LIF、BFGF、IGF和SCF)对于PGCs的长期培养是必需的。根据对PGCs的DiI染色，我们观察到在我们的培养条件下，源自14日龄连续培养物的PGCs注射后迁移到受体胚胎的性腺中。我们也将在培养中保持25天的PGCs转移到要进行孵化的三只受体胚胎中。根据子代测试结果测定这些胚胎中的一只为嵌合性的。长期培养条件下的PGC表型
收集后，通过其大小和其膜及细胞质中脂质微滴的存在而识别PGCs，收集后约48小时后，由细胞团大小的增长和胰蛋白酶解离此细胞团后观察到的细胞数目表明PGCs凝集到一起并开始分裂。仅仅形成细胞团的PGCs存活下来，而所有其它PGCs死亡。一般，以100个PGCs起始的培养物将在7天内以平均600到800只PGCs而结束。显然部分PGCs分裂，虽然不以有效的速率进行。然而，如上述，这些PGCs维持其迁移到性腺中的能力。
超过25天的长期培养物
25天连续培养后，PGC细胞团迅速形成铺展细胞单层。这些细胞单层具有平的粘附基础并且在上表面上具有更为松散的细胞团和PGC样细胞链。这些细胞单层的有些叠堆保持PAS阳性。从这些细胞单层获得的DiI染色细胞转移到受体胚胎中。有些胚胎显示几乎设有这些细胞位于其性腺中。细胞单层成功传代。一般，这些细胞在开始延缓其增殖、老化和变得成纤维细胞表像之前能够经历3到5次传代。少数细胞系经历多次传代并在连续培养中培养大约4个月后继续旺盛生长而无明显的分化。
特别地获自细胞单层的2种细胞系已被冷冻并命名为P102896和P110596，虽然许多具有类似特征的细胞系已经确立。前者没有显示出明显的分化并且为碱性磷酸酶边缘阳性而后者显示出神经细胞形态并为碱性磷酸酶强烈阳性。
特别地，已显示用上述四种生长因子培养至少25天的PGCs可成功地在性腺中建群并且产生嵌合家鸡。同样，我们在培养中维持PGC细胞达四个月。根据这里所述的测试结果，这些培养物仍然似乎包括具有所需PGC表型的细胞。虽然没有根据其表像而测试这些细胞产生嵌合鸟的能力，但预期他们也因此是有用的。EMA-1和MC-480抗体对长期培养物中家鸡PGCs的检测
用单克隆抗体EMA-1和MC-480测试小鼠ES细胞(阳性对照)、培养98天的家鸡PGCs、新鲜收集的家鸡PGCs以及家鸡成纤维细胞(阴性对照)。
EMA-1抗体以高亲和性结合小鼠ES细胞(图1)、98-日龄PGC培养物中的细胞(图2)和大多数新鲜的家鸡PGCs(图3)。EMA-1不结合家鸡成纤维细胞(图4)。这些结果与Hahnel和Eddy(1987)的结果一致，后者报道该抗体检测到存在于大多数多能小鼠胚胎细胞以及PGCs上存在的细胞表面标记。他们同时报道EMA-1沿着成体组织以及早期胚胎的尿生殖道上皮显示出反复阳性的细胞。他们没有报道在任何其它成年组织上检测到此表位。根据胚生殖细胞的存在而该抗体在成年尿生殖嵴上检测到表位是可能的。Pain等(1996)报道用EMA-1鉴定培养中的家鸡ES细胞。他提议EMA-1表位可能是鉴定非分化胚生殖细胞的有用标记。在我们的实验中，与小鼠ES细胞以及新鲜PGCs相类似，EMA-1对98-日龄家鸡PGC培养物产生了很强的阳性信号。然而，该抗体没有区分出PGC与ES表型；它简单地显示其多能与全能的潜能。这表明长期培养中的PGCs或者保持为PGCs，或者去分化为多能ES细胞。
MC-480抗体与小鼠EG细胞(图5)及培养中的98-日龄PGCs(图6)上的细胞表面抗原强烈反应，很少的新鲜PGCs为该抗原阳性(图7)而家鸡成纤维细胞总是阴性(图8)。这些结果表明长期体外培养中的PGCs去分化成多能EG细胞。有些新鲜PGCs用该抗体得到阳性信号的事实表明剖分新鲜PGCs在其迁移到胚胎性腺中的过程中仍然保留部分ES抗原。这些抗原可能后来丢失。然而，也可能在其表面上显示出EG抗原的PGCs在我们的长期培养中最终继续存活更好。这2个结果加起来表明在我们的长期培养物中PGCs去分化而变成多能干细胞。此发现与小鼠PGCs在培养中去分化并变成EG细胞的报道(Matsui等，1992)类似。
这些结果显示我们的家鸡PGC细胞培养基影响家鸡PGCs去分化成EG细胞。这是在制备用于有效产生转基因动物和鸟克隆的多能家鸡细胞中重要的步骤。
PGC转染
含有绿色荧光蛋白报告基因载体的转染用于转染PGCs。平均1/50的PGCs得到短暂转染，然而，至今还未开发出稳定转染的细胞系。
总之，这些结果显示PGCs可长期保持并且成功用于嵌合鸟的制备。生长因子浓度的进一步改变和其它生长因子的使用可能进一步优化培养条件。为了是有用的，PGC培养系统应该允许转染和筛选PGCs同时维持PGC迁移至性腺中的能力。同样，这些结果表明与小鼠PGCs一样(Matsui等.，细胞，70：841-847，1992)，鸟(例如，家鸡)PGCs回复至EG细胞表型。因此，注射分散的EG细胞至受体囊胚层中应该能够使嵌合和转基因家鸡的产生成为可能。同样，这些细胞对于产生可用于制备转基因嵌合且克隆鸟的转基因EG细胞系可能是有用的。
Claims (24)
1.一种用于鸟PGC和生殖(EG)细胞制备的培养方法，包括以下步骤：
(i)从所需的鸟中分离原始生殖细胞；和
(ii)在含有足以在组织培养中保持所述PGCs更长时间量的至少以下生长因子的培养基中培养所述原始生殖细胞更长时间从而足以制备具有紧密多层样外观的培养物：
(1)白血病抑制因子(LIF)，
(2)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，
(3)干细胞因子(SCF)和
(4)胰岛素样生长因子(IGF)；
(iii)鉴定其中含有的EG细胞。
2.权利要求1的方法，其中最低量的所述生长因子是：
(1)LIF(0.00625U/μl)，
(2)bFGF(0.25pg/μl)，
(3)IGF(0.5625pg/μl)，和
(4)SCF(4.0pg/μl)。
3.权利要求2的方法，其中所述生长因子的最大量范围为从大约2倍到100倍所述最低量。
4.权利要求1的方法，其中所述鸟PGCs获自鸡属的鸟。
5.权利要求4的方法，其中所述的PGCs为家鸡PGCs或火鸡PGCs。
6.权利要求1的方法，其中所述的PGCs在培养中保持至少25天。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的PGCs在培养中保持长于25天。
8.根据权利要求7的方法，其中所述的PGCs在培养中保持至少4个月。
9.权利要求1的方法，其中的鸟EG细胞根据其小鼠时相特异性抗原1的表达，和/或与EMA-1或MC-480单克隆抗体的反应性而加以鉴定。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞的EG表型通过将此细胞转入适当的鸟胚胎中而进一步证实。
11.权利要求10的方法，其中所述的胚胎的X期家鸡胚胎。
12.权利要求1的方法，其进一步包括：
(iv)用所需的核酸序列转染或转化得到的EG细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述的核酸序列编码治疗多肽。
14.一种制备嵌合鸟的改进方法，包括：
(i)从鸟中分离原始生殖细胞；
(ii)在含有至少以下生长因子的组织培养基中保持这些PGCs足够长时间以制备胚生殖(EG)细胞；
(1)白血病抑制因子(LIF)，
(2)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，
(3)干细胞因子(SCF)和
(4)胰鸟素样生长因子(IGF)
(iii)将所述的EG细胞转入受体鸟胚胎中；和
(iv)筛选具有所需PGC表型的嵌合鸟。
15.根据权利要求14的方法，其中所述的PGCs源自鸡属鸟胚胎。
16.根据权利要求15的方法，其中所述的鸟胚胎为火鸡或家鸡胚胎。
17.根据权利要求14的方法，其中所述的EG细胞在转入受体鸟胚胎中前用所需的核酸序列转染或转化。
18.根据权利要求17的方法，其中所述的核酸序列编码治疗性多肽。
19.根据权利要求18的方法，进一步包括从根据步骤(iv)制备的嵌合鸟卵中，或从全身循环系统或体液或组织中纯化所述的治疗性多肽。
20.根据权利要求14的方法，其中的PGCs注射入受体鸟胚胎的背主动脉或受体囊胚层中。
21.一种通过权利要求1的培养方法而获得的鸟EG细胞系。
22.权利要求21的细胞系，它是家鸡或火鸡EG细胞系。
23.权利要求21的细胞系，它含有插入的核酸序列。
24.权利要求22的细胞系，它是P102896。
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