CN104585133A

CN104585133A - 转基因鸡

Info

Publication number: CN104585133A
Application number: CN201410584876.5A
Authority: CN
Inventors: 玛丽-塞西尔·万·德·拉瓦尔; 菲利普·A·莱顿
Original assignee: Synageva Biopharma Corp
Current assignee: Synageva Biopharma Corp
Priority date: 2005-02-01
Filing date: 2006-02-01
Publication date: 2015-05-06
Also published as: US20060174363A1; CN101155509B; EP3090629A1; ES2615081T3; CN101155509A; US20060174362A1; NZ598769A; US20140127812A1; IL184775A0; US20170086431A1; JP2008529483A; US20140237633A1

Abstract

本发明涉及从鸟PGC长期培养物而获得的转基因鸡和其生产技术以及源于长期PGC培养物的转基因鸟。在一些实施方案中，这些PGC可用遗传构建体转染以修饰PGC的DNA，尤其是引入编码外源蛋白质的转基因。当通过已知方法与宿主鸟胚组合时，那些修饰PGC通过种系传递从而产生转基因后代。本发明包括包含可通过基因打靶进行遗传修饰的PGC的长期培养物的组合物，其可接受大量的外源DNA并向受体胚胎的种系作贡献。

Description

转基因鸡

本申请是申请日为2006年2月1日、申请号为“200680010896.5”、发明名称为“转基因鸡”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2006/003690的中国国家阶段申请。

相关信息

本发明在USDA SBIR 2003-09058和NIH R44 GM064261、R43GM073306-01、R44 HD 039583和R43 HD 047995-01之下通过政府资助而作出的。政府在本发明中具有某些权利。

背景技术

转基因动物在高价值药物产品比如抗体的可持续生产中提供可以推动极大进步的潜力。然而，转基因动物的生产涉及明显的技术障碍，这些障碍只在几种物种中得以克服。将编码蛋白质的遗传修饰掺入一种物种的DNA中以进行特异性表达的能力需要几种明显不同的技术，这些技术必须针对每个物种来开发。改变动物的遗传和身体特征的一种方法是将细胞引入动物的受体胚胎。这些细胞具有有利于从所述受体胚胎产生的动物的组织以及有利于所得动物转基因后代的基因组的能力。

人们已经花费了大量时间和资源致力于细胞系的研究和开发、细胞基因组的操作、以及使这些工程化细胞在培养中维持的细胞培养技术。尽管已作了很多尝试，在培养中保持工程化细胞多能性的能力只在几个物种中得以实现。如果可持续的细胞培养物易于获得并且易于被遗传工程处理同时保持多能性，新技术将可以得到广泛应用。

在某些情形中，可用含编码外源产物比如蛋白质或者抗体的DNA的转基因将细胞工程化改造。所述转基因包含产生所述蛋白质的蓝本并且包含足够的编码和调节元件以使该蛋白质能够从将所述细胞插入受体胚胎而产生的动物的组织中表达。在一些情形中，期望所述表达是普遍存在的以便于所述表达发生在所有组织类型中。然而，在另一些情形中，比如收集有价值的抗体，所述表达必须被限制于有利于收集所表达蛋白质的某些特定组织类型。例如，在牛中，在乳中表达蛋白质使得通过简单的收集牛乳和分离外源蛋白质能够很容易地收集所述蛋白质。在鸡中，在鸡卵白中大量生产抗体也提供用于表达和收集抗体的有吸引力的媒介。此外，在组织特异性表达特异性针对鸡输卵管的情形中，所述表达产生具有某些特异性期望化学性质的抗体，其可增加所述抗体在用于治疗人类患者时的治疗应用。因此，一个特别吸引人的研究和商业开发领域是在其卵中选择性表达抗体以便于分离和收集具有期望化学性质的蛋白质的经遗传改造的鸡。对于生产外源抗体而言，鸟类生物系统具有很多优点，这包括高效的农场饲养、快速生长和生产经济性。此外，对于大量合成抗体以及易于分离和收集产物，鸟卵提供理想的生物学设计。此外，如本发明下文所述，与例如脊椎动物、植物或细菌细胞系统相比，转基因鸡表达系统对于大量抗体生产的好处很容易证明并且可用于产生独具优势的化学性质。创建转基因鸡的目标科学家已寻找了许多年。尽管在其它物种，比如小鼠、牛和猪中已实现了该目标，但是除了采用逆转录病毒技术之外，还没有创建转基因鸡，而逆转录病毒技术对于可引入转基因动物DNA的转基因大小方面受到了与生俱来的限制。

然而，如果细胞培养物足够稳定使得大转基因整合于细胞的基因组中，那么可通过依赖于靶细胞和用作转基因的特定构建体的几种不同技术将编码组织特异性表达抗体的转基因传送入转基因生物。可通过细胞杂交转移整个基因组，通过微细胞转移完整染色体，通过染色体介导的基因转移来转移亚染色体片段，以及通过DNA介导的基因转移来转移千碱基范围的DNA片段(Klobutcher，L.A.and F.H.Ruddle，Annu.Rev.Biochem.，50：533-554，1981)。完整染色体的转移可通过微细胞介导的染色体转移(MMCT)来实施(Fournier，R.E.and F.H.Ruddle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74：319-323，1977)。转基因的特异性设计还必须考虑编码抗体的DNA序列的内含物、靶细胞系、在其中靶向表达的特异性组织、在其中发生表达的宿主生物以及待表达的抗体。设计用于组织特异性表达的转基因必须满足几个参数，从而使之能够成功地整合入细胞的基因组中并且确保在宿主生物的选定组织中成功地表达。

插入能实现组织特异性表达的转基因可能会威胁细胞的多能性，除非小心地设计转基因并优化培养条件。因此，当用遗传构建体转染细胞时，适用于转基因的细胞系必须在培养中是稳定的并保持多能性，所述遗传构建体足够大和复杂从而在期望时可包含组织特异性高水平表达必需的所有元件。在所得的转基因动物中，转基因可任选地在设计用来表达转基因的特定个体组织类型中选择性表达。根据转基因的遗传内含物，如果动物的存活性或者所得蛋白质的有利化学性质受到影响，该转基因可能不在其他组织中表达。

发明内容

本发明包括转基因鸡和实现遗传改造转基因鸟的技术，以及用来创建转基因鸡的PGC的长期培养物。本发明还涉及在鸡中生产的抗体以及它们的独特化学性质。具体说，这些抗体具有在某些应用中增强其治疗效用的有利化学性质。与在脊椎动物、植物或细菌细胞系统中产生的抗体相比，由鸡产生的抗体具有独特的化学修饰模式，使得在施用给患者以实现将毒素结合至靶组织比如肿瘤时，所治疗靶组织的治疗效果增加。在一个实施方案中，用专门设计的遗传构建体改造PCG的长期培养物以将遗传修饰引入鸟中，这包括插入产生外源蛋白质组织特异性表达的转基因。本发明的转基因鸟还可以在输卵管中表达源于转基因的抗体，该抗体大量沉积于卵中。在优选实施方案中，外源抗体蛋白质由人DNA序列编码，从而在鸡输卵管中表达天然的人抗体并且可从其卵中收集该抗体。

本发明包括表现出组织特异性表达抗体的鸟群体，能实现外源抗体表达的转基因构建体，由鸡产生的并且具有特定化学性质的抗体的分离组合物，以及用于创建所述鸟、生产所述抗体和它们在人类中治疗性应用的相关方法。本发明采用长期原始细胞培养物(primordial cell cultures)和专门技术来生产源于长期细胞培养物的嵌合体或者转基因鸟，其中PGC的基因组具有稳定整合的表达外源蛋白质的转基因，使得所述培养细胞的后代含有该稳定整合的转基因。当通过以下描述的方法将其引入宿主鸟胚时，那些修饰的供体细胞产生鸟，其将转基因表达于所得动物的特异性、选定的体细胞组织。

本发明还包括在转基因鸡中表达的并且与脊椎动物、植物或者细菌细胞系统相比具有某些期望化学性质的外源蛋白质的组合物。具体说，这些蛋白质，尤其是抗体，含有更低浓度的岩藻糖、半乳糖、N-乙酰神经氨酸、N-乙醇酰基神经氨酸以及更高浓度的甘露糖。当将具有一些或所有这些性质的抗体施用给人时，它们表现出治疗效用增加。具体来说，这些抗体组合物表现出增强的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。因此，本发明的方法包括，通过在转基因鸡中表达抗体而应用转基因鸡来增加抗体组合物基于ADCC作用的治疗效用。

本发明还包括在输卵管组织中表达外源抗体的转基因鸡，该外源抗体具有本文所定义的有利化学性质，使得外源抗体以确定的量集中于卵白中。在一个优选实施方案中，所述外源蛋白质是由掺入转基因鸟基因组的转基因构建体所编码的人序列单克隆抗体。编码该人单克隆抗体的多核苷酸序列包含在专门构建用于在输卵管中表达的转基因中，该转基因还包含适宜的启动子和调节序列以促进组织特异性表达。

本发明还涉及鸟原始生殖细胞(avian primordial germ cells，PGC)的长期培养物以及能够通过创建长期培养物而实现的另外几项发明，在其中鸟PGC增殖并且其中PGC培养物可通过多次传代而扩充，从而延长培养物的存活超过40天、60天、80天、100天或更长。本发明的PGC在长期培养物中增殖并且当其被注射入受体胚时产生种系嵌合体(germlinechimeras)。

附图说明

图1A：在培养物中维持54天的PGC。注意细胞没有附着并且保持圆形。箭头所指是在该培养物中可见的几个分裂细胞。

图1B：在培养物中维持234天的PGC。这些细胞培养在辐照处理的STO细胞的饲养层上。

图2：根据生殖细胞标记物CVH和Dazl的RT-PCR确定的基因表达。细胞培养32天。泳道1显示在PGC等分试样中CVH和Dazl的表达。如缺少肌动蛋白所确定的，泳道2中的第二样品没有足够的mRNA。也分析了CES细胞；表达肌动蛋白但是cES细胞不表达CVH而且仅弱表达Dazl。

图3：对维持培养166天的PGC进行Western分析。睾丸被用作阳性对照，肝被用作阴性对照。应用兔抗鸡CVH IgG作为第一抗体。

图4：端粒重复序列扩增方案(Telomeric Repeat Amplification Protocol，TARP)分析。维持培养两种不同PGC细胞系(13和16)的不同稀释度的细胞提取物146天。阳性对照由转化的人肾细胞系293组成，阴性对照仅是裂解缓冲液而未添加模板。在PGC和阳性对照的泳道中，重复序列是可见的，这指示端粒酶的存在。

图5A：源于维持培养的PGC的cEG细胞。5B：鸡胚胎干细胞。注意两种细胞类型中的小细胞，其具有大细胞核(浅灰色)和明显的核仁。

图6：从源于PGC的cEG细胞获得的嵌合体。EG细胞源于有黑羽毛的Barred Rock胚胎。用有白羽毛(White Leghorn)的胚胎作为受体。从黑色羽毛明显可知体细胞嵌合性。

图7：公鸡IV7-5和它的后代。White Leghorn在显性白色基因座上是纯合显性的(I/I)。当与Barred Rock母鸡(i/i)交配时，来自White Leghorn的所有后代将是白色(I/i)。黑色鸡证明所注射的PGC(源于Barred Rock胚胎(i/i))已进入White Leghorn公鸡的种系。

图8：在原始生殖细胞系(PGC)中cx-neo转基因的Southern分析。

图9：用抗鸡vasa同源物(chicken vasa homologue，CVH)和1B3的抗体染色，对DT40细胞(阴性对照群)、ES细胞、EG细胞和PGC进行FACS分析。DT40、ES和EG细胞对两种标记物都是阴性，而大部分PGC对CVH和1B3染色为阳性。所用的细胞系是PGC 102、ES 439和EG 455。

图10：在2个原始生殖细胞PGC系中对HS4-β-actin-neo转基因的Southern分析。

图11：Southern印迹分析，表明克隆性来源的转染PGC系可贡献给(contribute to)嵌合体鸡的种系并分化成EG细胞。上图：基因组DNA用限制性内切酶进行消化处理以检测转基因插入的内部(KpnI)和连接片段(NcoI，4flII)，所述基因组DNA来自用HS4bactin-eGFP-bactin-puro构建体转染的PGC、源于用所述转染PGC制得的嵌合体公鸡的三个胚胎、和源于转染PGC的EG细胞。消化后DNA在0.7％琼脂糖凝胶上分离，印迹到尼龙膜上，并用放射性标记的eGFP序列进行检测。杂交片段的大小在PGC、EG细胞和两个显示出绿色荧光的胚胎(GFP+胚胎)中是一致的。第三个无荧光的胚胎(WT胚胎)未显示杂交。下图：构建体的示意图，其中标出限制性位点的位置并在下面显示预期限制性片段的大小。有两个KpnI位点，产生5.3kb的片段。NcoI和AflII在构建体内切割一次，由此观测到的限制性片段是连接构建体与插入位置侧翼基因组DNA的连接片段。

图12：显示所有染色体为二倍体的G-09核型。在GGA2的一个拷贝中，p臂的大部分或者缺失或者易位至另一染色体。另一拷贝的CGA2是正常的。细胞是ZZ(雄性)。

图13：在发育18天时用DAPI染色的睾丸的切片。GFP阳性生殖细胞在生精小管中清晰可见。

图14：DAPI染色的图显示经过E18睾丸生精小管的切片。

图15：来自携带有与β肌动蛋白-GFP转基因一起稳定转染的PGC之嵌合体的转基因后代。胚胎表明从阶段x(EG&K)到阶段34(H&H)在所有组织中表达GFP。

图16：在步骤1中，经重组工程通过在大肠埃希氏菌中同源重组将抗-IL-2RαIgL/IgH盒插入Ov BAC。随后抗体处在Ov调节元件的转录控制之下。在步骤2中，用Flp重组酶去除在重组工程中所用的卡那霉素基因。

图17显示设计用来相互退火以产生如所示全长轻链V区的轻链V基因寡聚体的设计。每个寡聚体用指向3’方向的箭头表示。

图18显示具有Ov结构基因5’端110kb序列和Ov结构基因3’端30kb侧翼序列的OvBAC构建体。

发明详细说明

本文所用的术语“鸡胚胎干(cES)细胞”表示表现出ES细胞形态的细胞，并且其贡献给源于阶段X(E-G&K)胚胎透明区(area pellucida)(大致相当于小鼠胚泡)的受体胚胎中的体细胞组织。CES细胞共享小鼠ES细胞的几种体外特征比如SSEA-1+、EMA-1+和端粒酶+。ES细胞具有定居(colonized)于所有体细胞组织的能力。

本文所用的术语“原始生殖细胞(PGC)”表示表现出PGC形态的细胞，并且其完全贡献给受体胚胎的种系，PGC可以来源于采自阶段12-17(H&H)胚胎的全血。PGC表型可通过以下方法来确立：(1)种系特异性基因CVH和Dazl在该细胞系中强烈转录，(2)所述细胞强烈表达CVH蛋白质，(3)当把所述细胞注入阶段X而非阶段12-17(H&H)的受体胚胎时，所述细胞并不对体细胞组织有贡献，(4)所述细胞产生EG细胞(见下)，或者(5)当把所述细胞注入阶段12-17(H&H)的胚胎时，所述细胞经种系传递PGC基因型(Tajima et al-(1993)Theriogenology 40，509-519；Naito et al.，(1994)Mol.Reprod.Dev.，39，153-161；Naito et al.，(1999)J Reprod.Fert.117，291-298)。

本文所用的术语“鸡胚胎生殖(cEG)细胞”表示源于PGC并且在功能上与鼠EG细胞类似的细胞。cEG细胞的形态与cES细胞相似并且当cEG细胞注入阶段X(E-G&K)受体时其对体细胞组织有贡献。

本文所用的术语“转基因动物”表示在其体细胞和生殖细胞中编码转基因并且能将转基因性状传递给其后代的动物。

尽管本文的实施例是针对鸡来说明的，但在试验中可用其它鹑鸡类(gallinaceous)物种比如鹌鹑、火鸡、雉等替换鸡，并且可以合理预期将能成功地实施本文公开的方法。

通过插入设计用于在培养ES细胞中进行组织特异性表达的DNA构建体，产生在其卵白(egg white)中表达有价值药物产品比如单克隆抗体的鸡。见PCT US03/25270 WO 04/015123Zhu et al.。实现这种动物的关键技术是建立并维持真正长期的ES细胞培养物，以使其保持存活足够长的时间，用于在培养中工程化改造克隆细胞的基因型。

然而不同于ES细胞，原始生殖细胞(PGC)只能短期培养。一旦延长培养时间超出了较短天数，这些细胞就丧失仅贡献给种系的能力。典型地，用当前的培养技术维持培养的PGC不能增殖和倍增。在缺少健壮(robust)生长的情形中，培养物是“终极的(terminal)”并且不能无限期维持。随着时间推移，这些终极的细胞培养物发生退化并且这些细胞丧失它们独特的PGC形态并回复到EG细胞。在注入早期阶段的发育胚胎时，胚胎生殖细胞获得不同于PGC的形态，失去作为种系的限制性，并获得贡献于体细胞组织的能力。为向受体胚胎的种系引入预定基因型，由此使动物能将期望基因型传递给未来的世代，PGC具有特别的吸引力，这是因为已知它们是精子和卵的始祖。

PGC的长期培养物提供几种重要的优点，比如维持禽肉蛋生产工业中所依赖的重要鸡繁殖系(breeding line)的有价值遗传特征。目前，采用特别的措施以防止由于突发事件或者疾病造成有价值繁殖系丧失。这些措施需要保持大量的种系成员作为繁殖种禽并在全世界很多地方复制这些繁殖种禽。以储备为目的维持大量有价值动物是必需的，因为在繁殖系中保持遗传多样性也是重要的。通过在PGC细胞培养物中保持这些遗传特征，可使得大规模储备繁殖种群的花费得以避免。

PGC的长期培养物对于从遗传改造鸡的卵生产药物产品也具有极高的价值。应用PGC生产遗传改造的鸡需要在培养物中维持PGC的同时将遗传修饰引入PGC的基因型。许多遗传操作培养物中靶细胞的技术是众所周知的。然而，主要的一个困难是，为了改变培养物中PGC的基因型，培养物必须保持存活足够长的时间，以引入遗传修饰并成功选择转化细胞，并且被转染细胞在培养物中生长和增殖。能够增殖的成功转化细胞通过在克隆或接近克隆衍生之后的几天至几周内产生大量细胞(例如10⁴至10⁷个细胞)的能力来区分。创始细胞(founder cells)将是携带期望遗传修饰的稀有细胞。典型地，在应用公知的遗传修饰技术(例如脂质体转染法或电穿孔法)之后这些细胞在培养物中以10^-4至10^-7的频率产生。因此，在培养物中生产细胞需要细胞传代，为细胞增殖和产生足量细胞提供空间和营养，以允许选择稀少的、经遗传修饰的培养细胞。

此外，培养条件必须足够健壮(robust)以允许细胞从单个遗传修饰细胞生长成10⁴至10⁷个细胞的集落，从而用于体外遗传分析和用于生成嵌合体。因此，如果培养的时间长度可以被延长，而同时保留与真正PGC一样的细胞基因型和表型，在当具种系嵌合能力的细胞(germlinecompetent cells)迁移入生殖腺时在胚胎发育的某一点上所述细胞就可以被工程化并且引入受体胚胎。在成熟时这些工程化的PGC将完全贡献给所得动物中的精原细胞或者卵原细胞(即，精子和卵)的新生类群。在所得的这种动物中，全部体细胞组织将源于受体胚胎并且种系将包含来自供体细胞和受体胚胎的贡献。由于对种系的混合贡献，这些动物被称为“种系嵌合体”。根据嵌合性程度，种系嵌合体的后代将或者源于供体细胞或者源于受体胚胎。

鸡种系起始是从进入新生内胚层的阶段X(E-G&K)胚胎的外胚层而来的细胞(Kagami et al.，(1997)Mol Reprod Dev 48，501-510；Petitte，(2002)J Poultry Sci 39，205-228)。随着内胚层向前进，前原始生殖细胞被向前推入生殖新月(germinal crescent)，在此它们可以被鉴定为大糖原装载细胞(large glycogen laden cells)。根据这些形态标准在种系中对细胞的最早鉴定是在孵育开始后约8小时(阶段4，由Hamburger和Hamilton，(1951)J Morph 88，49-92所建立的分阶段系统)。原始生殖细胞居于来自阶段4(H&H)的生殖新月，直至它们在阶段12-17(H&H)期间迁移通过脉管系统。在此时，原始生殖细胞是约200个细胞的小群体。从脉管系统，原始生殖细胞迁移入生殖脊并且随着生殖腺分化而被并入卵巢或者睾丸(Swift，(1914)Am.J.Anat.15，483-516；Meyer，(1964)Dev Biol.10，154-190；Fujimoto et al.(1976)Anat.Rec.185，139-154)。

在迄今为止所有检测过的物种中，原始生殖细胞还没有在培养中长期增殖却不分化成EG细胞。为了产生足量的细胞以便于通过传统的电穿孔或者脂质体转染法引入遗传修饰，需要长期培养。典型地，这些方法需要10⁵至10⁷个细胞，并且因此从单个前体生成这些细胞需要17-24次倍增，假定所有细胞分裂是(1)同步的并且(2)产生两个活的子细胞。向细胞基因组引入遗传修饰是偶发事件，通常在1×10⁴至1×10⁶个细胞中有一个会发生。在遗传修饰之后，细胞必须能够从携带和/或表达遗传修饰的单个细胞建立集落。该集落必须能够扩大为10⁵至10⁷个细胞的群体，其可以通过PCR或者Southern分析以评估转基因的忠实度并且提供随后将注入受体阶段13-15(H&H)胚胎的足量细胞。因此，需要另外17-24次细胞分裂以产生所述细胞群体并且需要总共34-58次倍增以产生遗传修饰细胞的群体。假定细胞周期是24小时，需要最少34天和通常58天培养以产生用于注入阶段13-15(H&H)受体胚胎的遗传修饰原始生殖细胞。随后所注入的细胞必须能够定居于种系，形成功能性配子并在受精后发育成新个体。

为了建立鸡PGC的长期培养细胞系的几次尝试已经被报道过，但是没有一次尝试产生了可以持续的细胞系。在所有这些情况中，PGC的培养物已分化成EG细胞，见WO 00/47717；WO 99/06533；WO 99/06534；Parket al.，(2003)Mol.Reprod.Dev.65，389-395；Park and Han，(2000)Mol.Reprod.Dev.56，475-482，或者具有ES细胞表型的细胞，见WO 01/11019。在另外一些情况中，PGC培养物只能维持5天(Chang et al.，(1997)CellBiology International 21，495-499；Chang et al.，(1995)Cell BiologyInternational 19，569-576)或者10天(Park et al.，(2003)Biol.Reprod.68，1657-1662)。在另一情况中，PGC被维持培养了2个月，但是该细胞仅非常缓慢地增殖并且培养物不能传代(Han et al.，(2002)Theriogenology 58，1531-1539)。PGC培养物的传代能力是用于PGC遗传修饰和用于最有价值的农业和繁育技术的长期培养物的关键性质。

PGC细胞培养物的增殖能力对于选择已通过转基因的随机整合或者通过位点特异性修饰而改变其基因组的细胞是必需的。在这两种类型的遗传修饰中，细胞获得作为稳定整合入培养细胞基因组的遗传修饰的比例非常低，其介于一万至一亿个细胞中有一个细胞(即1×10^-4至1×10^-8)的数量级上。由此，为了获得来源于在培养细胞基因组中创建所述遗传修饰的稀有事件的足够细胞群体，需要建立快速生长培养物的能力。

在从阶段11-15胚胎分离后几个小时内采用逆转录病毒载体已经遗传修饰了鸡原始生殖细胞(Vick et al.，(1993)Proc.R.Soc.Lond.B 251，179-182)。然而，转基因的大小一般被限制在小于约15kb，通常小于10kb并且最常见是小于8kb，并且使用此技术不能建立基因组的位点特异性改变。在此之前还没有报道过需要向培养鸟PGC基因组中插入大于15kb外源DNA的稳定遗传修饰。

对于可以稳定引入长期培养PGC细胞培养物的外源DNA转基因大小的任何限制是对于在培养PGC基因组中实现有价值遗传修饰之能力的关键限制，并且进而限制可通过种系传递给受体胚胎后代的遗传修饰的类型。例如，向转基因鸡的基因组中引入编码蛋白质的外源DNA是非常期望的遗传修饰。如果可以创建成群的这种转基因鸡，则可以在这些鸡中表达并从卵中收集大量有价值的蛋白质。鸟卵提供了生物活性蛋白质的理想贮藏所，并且提供了可以从中分离蛋白质的方便的环境。对于大量的转基因技术，鸟类动物也是有吸引力的候选者。然而，对于鸟类物种应用全部的哺乳动物转基因技术还没有成功，这是由于缺少可以向其引入基因修饰并且传递入种系的培养细胞群体。在最近的论文中，Sang et al.声称“PGC能够在培养中维持并且在对鉴定基因打靶事件所必需的长时间中增殖而不在转移后丧失其迁移至发育中生殖腺的能力是不可能的。”Prospects for Transgenesis in the Chick，Mechanisms of Development，121，1179-1186，(2004).因此，至今为止，还没有创建遗传转染的PGC并且还没有证明将引入鸟PGC的遗传修饰传递至成熟的活动物。

原始生殖细胞(PGC)是精子和卵的前体并且在大多数动物中在发育早期阶段与体细胞组织分离。根据本发明，分离、培养并遗传修饰鸡PGC，同时维持它们定型至种系。此外，诱导PGC分化成胚胎生殖细胞(EGC)，其类似于定型于体细胞组织的鸡胚胎干细胞(ESC)。这些PGC定型于体细胞组织和种系并且提供有关鸡基因组遗传修饰的独特来源。

在本文所述的培养物中维持的PGC在维持培养时保持了特征性PGC形态。可以通过直接观察来观察PGC形态，并且通过常规技术来评估培养细胞的生长以确保细胞在培养中增殖。增殖的细胞培养物被定义为非终极的(non-terminal)并且在两个不同时间点的后者上观察到具有更大量的培养细胞。本发明培养物中的PGC在任何特定培养物中可以具有1×10⁵或者更多的细胞并且可以观察到此数字随着时间而增加。因此，本发明包括增殖中的PGC培养物，与培养期较早时间点相比，其在几天、几周或者几个月之后含有更多数目的细胞。理想地，所述培养物包含有至少1×10⁵个细胞并且在培养任何时间长度之后可以观察到更高数目。而且，可以观察到在培养物中PGC是优势种，使得当考虑由非鸡的饲养细胞所作的最小贡献时，细胞培养物的增殖组分基本由鸡原始生殖细胞组成，从而基本排除了其它的鸡源细胞。

所述培养物还表现出允许通过传代而增殖的特性，使得可以从现有培养物分离细胞样品或者等分试样并且当其置于新培养基中时将表现出健壮的生长。通过定义，细胞培养物传代的能力是指细胞培养物正在生长和增殖并且是非终极的。此外，本发明的细胞证明了在几次传代后建立种系嵌合体并且保持PGC形态的能力。如本文所述，这样的增殖是适于稳定整合外源DNA序列的任何细胞培养物的基本特征。

本发明的PGC可通过任何公知技术获得并且可以在本文所述的培养条件下生长。然而，优选地是，从阶段15胚胎中获取全血并将其直接置于下文所述的培养基中。这种方法不同于文献中所描述的其它方法，在这些文献所描述的方法中PGC在培养之前须经处理和分离步骤。不象常规的培养技术，为了在此描述的培养中提供大群的PGC，本发明的培养物和方法依赖于在来自全血的PGC和其它细胞之间的稳健的差异生长，这些细胞初始时可以在培养基中共存。因此，本发明提供直接源于全血的PGC培养物，其在培养中生成很大的细胞浓度，并且可以进行无限量的传代，还表现出稳健的生长和增殖，使得培养中的PGC基本上是仅有的生长和增殖细胞。这些培养条件提供了本发明重要的优点，由此使得培养PGC的收集、保存和维持特别简单和有效，并且提供供体细胞的易于获得的来源，以建立将培养PGC细胞的基因型传给后代的种系嵌合体。

由本发明人在培养中维持的PGC已经证明了非终极培养物的存在并且目前其在培养中已存在了至少327天。在40、60、80或100天(和其中所有的整数值天数)观察这些细胞时，它们以相同方式生长和增殖并且这些细胞如下所述继续贡献于种系嵌合体，并且因此，显示出真实PGC的主要区别特征，即，当引入受体胚胎时全部贡献于种系。本发明的培养方法包括采用全血，其包含红细胞和其它的代谢活性细胞类型，将细胞混合物连同原始生殖细胞一起置于培养物中，以及让培养物发展至基本由表现出本文所述长期培养物特征的鸟PGC所组成。本文所述的细胞培养技术避免了任何的细胞分离过程或技术并且仅仅依赖于差异生长条件以在培养中产生PGC优势。在建立所述培养物和应用所述细胞用于农业或者转基因目的的效率和效用方面，采用全血作为所建立和培养的PGC细胞的来源提供了有实用价值的优点。因此，在本发明的一个方面中，培养基用BRL细胞(布法罗大鼠肝，Buffalo Rat Liver cells)条件化处理，包含有成纤维细胞生长因子、干细胞因子和鸡血清。以下将更加详细地说明所述培养基的具体特征。

在本发明的一个方面中，建立了具有大量PGC的培养物，这些PGC遗传一致的并且其增殖产生长期细胞培养物。通过将PGC从增殖的长期培养物引入受体胚胎可以反复使用这些PGC建立种系嵌合体。在之前尝试应用PGC来建立种系嵌合体中，能够建立的嵌合体的数目受到根本性限制，这是因为不能培养保持PGC表型的真正PGC的长期培养物。因为通过本发明能够实现长期培养物，就可以从同样的细胞培养物建立任何数量的种系嵌合体并且可以建立具有遗传一致性、源于PGC种系的完整群体的种系嵌合体。因此，本发明的一个方面是建立大量的，包括大于3、大于4、大于5、10、15和20个种系嵌合体动物，它们全都在其种系中具有遗传一致性的PGC源的细胞。本发明的另一方面是建立在其种系中具有遗传一致性PGC源的细胞的种系嵌合体群体，其在所述群体中具有龄期差异，这反应了使用相同的长期细胞培养物来建立种系嵌合体。龄期差异超出了在一段时间中培养原始生殖细胞的目前可达到的能力并且无需冷冻就可以高达190天。因此，本发明包括在其种系中具有一致的PGC源细胞的两种或者更多种种系嵌合体，其龄期差异超过40天、60天、80天、100天、190天等或者其中任何的整数值天数，而无需冷冻细胞。本发明还包括存在性成熟的种系嵌合体，所述嵌合体在其种系中具有遗传一致的PGC源的细胞，以及存在用来建立这些种系嵌合体的非终极PGC培养物，并且从中可以建立另外的种系嵌合体。

因为可以以绝对稳定的方式在培养中维持PGC，所以也可以冷冻保藏和解冻细胞，从而建立用于建立种系嵌合体的长期贮藏方法，这些种系嵌合体有能力产生由在培养中保持的PGC表型所定义的后代。

产生大量种系嵌合体的能力还提供了将PGC源的基因型传给种系嵌合体后代的能力。因此，本发明不仅包括在种系中具有遗传一致性的PGC源细胞的种系嵌合体群体，还包括所述种系嵌合体的后代，其基因型和表型完全由在培养中生长的PGC的基因型所决定。PGC源的表型通过种系传递已在超过20种鸟中被观察到，传递百分率高达86％。因此，本发明包括通过在培养中保持的原始生殖细胞的基因型的种系传递所建立的种系嵌合体的后代。因此，本发明包括以下每种都存在：含有规定表型之PGC的原始生殖细胞培养物、具有同样原始生殖细胞作为其种系一部分的种系嵌合体，和具有由培养PGC规定之基因型和表型的种系嵌合体的后代。

如之前已描述的，长期PGC培养物的存在使得有能力用编码外源蛋白质的或者引入其它期望的遗传操作比如转基因动物的基因插入和敲除的DNA稳定转染培养细胞。因此，所有的上述培养PGC群体、种系嵌合体和种系嵌合体的后代也可以包含DNA构建体，所述DNA构建体稳定整合入原始生殖细胞基因组、传递给种系嵌合体的种系、以及传递给包含种系嵌合体后代的未来世代。

原始生殖细胞可以包含几乎任何工程化的遗传构建体并且可以用来将超过当前由逆转录病毒技术所规定之大小限制的遗传修饰引入鸟，包括对基因组的位点特异性修饰和/或插入编码全长外源蛋白质比如单克隆抗体的转基因。在一个优选实施方案中，遗传工程化鸡以组织特异性方式在输卵管中表达外源蛋白质，从而在卵中表达外源蛋白质。

本发明的PGC培养物是足够稳定的从而使转基因稳定地整合入PGC的基因组，从而在培养物中从未修饰的细胞中分离出遗传修饰的细胞，以及从而将修饰细胞引入受体胚胎，而同时保持培养PGC贡献于所得嵌合体中种系的能力。在由组织特异性启动子控制转基因表达的情况下，在PGC中将不表达所述转基因。在这些情况中，转基因将在种系嵌合体的转基因后代的选定组织中进行表达。通过细胞杂交可以转移整个基因组，通过微细胞可以转移完整的染色体，通过染色体介导的基因转移可以转移亚染色体片段，以及通过DNA介导的基因转移可以转移千碱基范围内的DNA片段(Klobutcher，L.A.and F.H.Ruddle，Ann.Rev.Biochem.，50：533-554，1981)。通过微细胞介导的染色体转移(MMCT)可以转移完整的染色体(Fournier，R.E.and Ruddle，F.H.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA74：319-323，1977)。

产生遗传工程化鸡的PGC的稳定长期培养物对于在鸟转基因中的几种应用来说是必需的，这几种应用包括生产用于制药工业的蛋白质，生产在其卵中沉积有人单克隆抗体的鸡，以及对鸟基因组进行位点特异性改变用于任何的其他应用包括人序列多克隆抗体。

可以改变在受体胚胎中供体源和受体源PGC的比率以有利于种系在PGC源嵌合体中的定居。在发育中的鸡和鹌鹑胚胎中，随着原始生殖细胞群体从生发新月向生殖腺脊的迁移，暴露于白消安将或者极大降低或者消除原始生殖细胞的群体(Reynaud(1977a)Bull Soc.Zool.Francaise 102，417-429；Reynaud(1981)Arch Anat.Micro.Morp.Exp.70，251-258；Aige-Gil and Simkiss(1991)Res.Vet.Sci.50，139-144)。当在孵育24至30小时后将白消安注入卵黄和在孵育50-55小时后将原始生殖细胞重引入脉管系统时，种系中重新群聚供体源的原始生殖细胞并且随后产生供体源的配子(Vick et al.(1993)J.Reprod.Fert.98，637-641；Bresler et al.(1994)Brit.Poultry Sci.35241-247)。

本发明的方法包括：从鸡中比如从阶段15胚胎的全血中获取PGC，培养PGC，增殖PGC以增加它们的数量并使其大量传代，从这些长期细胞培养物中建立种系嵌合体，以及获得具有由培养PGC所提供基因型的种系嵌合体的后代。本发明的方法还包括在培养PGC群体中插入遗传修饰以建立稳定转染的PGC，从携带稳定整合转基因的群体中选择细胞，向受体胚胎注射携带该稳定整合转基因的遗传修饰细胞，使胚胎发育成在种系中含有该遗传修饰的种系嵌合体，饲养该种系嵌合体至性成熟，以及繁殖该种系嵌合体以获得转基因后代，其中遗传修饰是源于培养PGC。

以下描述的是意想不到的发现：可以从阶段12-17(H&H)胚胎的血中分离PGC，细胞将快速增殖并保持它们的PGC表型，PGC可以以每天或者每2天或者每3天的间隔进行传代，在培养至少110天后PGC将定居于种系而不是体细胞组织，可从已培养110天的细胞中获得活的后代，通过用转基因转染可以遗传修饰PGC，以及可以分离经遗传修饰的PGC并且繁殖成遗传修饰PGC的集落。

根据本发明，已从采自具有大、圆形的阶段14-16(H&H)胚胎(图1)的血中获得鸡PGC细胞系。通过它们长期培养后的形态以及它们产生PGC源后代的能力证实这些细胞是鸡PGC。此外，该PGC培养物表达种系特异性基因Dazl和CVH(图2)并且培养细胞产生CVH蛋白质(图3)。培养的PGC还表达端粒酶(图4)，这表明它们具有永生化表型。此外，PGC在适宜的培养条件下将产生胚胎生殖(EG)细胞(图5)。通过类比，当以类似方式进行处理时，小鼠和人的PGC将产生EG细胞。小鼠EG细胞将贡献于体细胞组织以及鸡EG细胞也贡献于体细胞组织，如在嵌合体中黑色羽毛着色所示(图6)。鸡PGC已经过遗传修饰，如Southern分析所示(图7)。在此实施方案中，CX启动子稳定地整合入PGC基因组并且被用来促进编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因的表达，该基因也被整合于PGC基因组中并且被用来赋予对添加到培养基中以便于选择遗传修饰PGC的新霉素的抗性。

实施例1.鸡PGC培养物的来源

采自阶段14-17(H&H)胚胎终窦(sinus terminalis)的2-5μL血被培育在96孔板的培养基中，所述培养基含干细胞因子(SCF；6ng/ml或者60ng/ml)、人重组成纤维细胞生长因子(hrFGF；4ng/ml或者40ng/ml)、10％胎牛血清和80％KO-DMEDM条件培养基。优选地，从阶段15-16(H&H)胚胎的脉管系统取1-3μL。用辐照处理的STO细胞以3×10⁴个细胞/cm²的浓度接种96孔板的孔。

通过在补充有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸、1×核苷、1×非必需氨基酸和0.1mMβ-巯基乙醇并含有5％胎牛血清的DMEM中培养BRL细胞3天直至汇合，来制备KO-DMEM条件培养基。24小时后，取出培养基并且条件处理新批次培养基3天。这被重复3次并且合并这3个批次来制备PGC培养基。

培养约180天后，在包含40％KO-DMEM条件培养基、7.5％胎牛血清和2.5％鸡血清的培养基中培育一个PGC细胞系。在这些条件下，PGC的倍增时间约为24-36小时。

当开始培养时，优势细胞类型是胎儿红细胞。在三周内，优势细胞类型是PGC类型。从个体胚胎起始的18种培养物中获得两种PGC细胞系。

PGC系已经培养超过9个月，其保持圆形形态，并且保持不贴壁(图1A&B)。在含有10％血清和10％DMSO的非CO₂依赖性培养基中超低温保藏之后，已成功地解冻了PGC。

实施例2.培养PGC表达CVH和Dazl

CVH(其是在果蝇中种系特异性基因VASA的鸡同源物)的表达只限于鸡的种系内的细胞并且由生殖新月中约200个细胞所表达(Tsunekawaet al.，2002)。对于雄性种系的正常功能来说，CVH表达是必需的；丧失CVH功能在雄性小鼠中引起不育(Tanaka et al，2002)。Dazl的表达在蛙(Houston and King，2002)、蝾螈(Johnson et al.，2001)、小鼠(Schrans-Stassen et al.，2001)、大鼠(Hamra et al.，2002)和人(Lifschitz-Mercer et al.，2000)中限于种系。缺失Dazl导致在转基因小鼠中的精子发生缺陷(Reijo et al.，1995)。

32天后，用PBS清洗PGC，并沉淀，用Oligotex Direct mRNA试剂盒(Qiagen)从组织样品中分离mRNA。随后采用用于第一链cDNA合成的SuperScript RT-PCR System(Invitrogen)从9μl的mRNA合成cDNA。在随后的PCR反应中使用2μl的cDNA。源于CVH序列(登记号AB004836)、Dazl序列(登记号AY211387)或者β-肌动蛋白序列(登记号NM_205518)的引物序列是：

应用引物V-1和V-2扩增CVH转录物的751bp片段。应用引物Dazl-1和Dazl-2扩增Dazl转录物的536bp片段。应用Act-RT-1和Act-RT-R扩增内源性鸡β-肌动蛋白转录物的597bp片段。用AmpliTaq Gold(AppliedBiosystems)依照使用说明书实施PCR反应。

实施例3.PGC表达CVH蛋白

应用T-Per组织蛋白质提取试剂盒(Pierce)从新分离的PGC中提取蛋白质。通过在1％NP₄O；0.4％脱氧胆酸盐化的66mM EDTA；10mM，Tris，pH7.4中裂解细胞提取来自细胞的蛋白质。在4-15％Tris-HCl预制胶(Bio-Rad)上对样品进行跑胶。转移到膜上之后，如说明书所示用SuperSignal West Pico化学发光底物试剂盒(Pierce)实施Western印迹。用兔抗-CVH抗体作为第一抗体(1∶300稀释度)和用HPR-结合的山羊抗-兔IgG抗体(Pierce，1∶100,000)作为第二抗体(图3)。

实施例4.培养的PGC表达端粒酶

沉淀并用PBS清洗原始生殖细胞，在分析之前将其冷冻在-80℃下。制备细胞提取物，并应用TRAPeze端粒酶检测试剂盒(SerologicalsCorporation)根据使用说明进行分析，该试剂盒是基于端粒重复序列扩增方案(TRAP)(Kim et al.，1994)，图4。

实施例5.可以从PGC培养物获得胚胎生殖(EG)细胞

通过让细胞附着于板子，去除FGF、SCF和鸡血清并在用于培养ES细胞的相同条件下培养所述细胞，已从PGC中获得鸡EG细胞(van deLavoir et al.，2006High Grade Somatic Chimeras from ChickenEmbryonic Stem Cells，Mechanisms of Development 12，31-41；van deLavoir and Mather-Love(2006)Chicken Embryonic Stem Cells；Cultureand Chimera Production，Methods in Enzymology，in press)。cEG细胞的形态与cES细胞的形态非常相似(图5A、B)。当把cEG细胞注射入阶段X(E-G&K)胚胎时，它们具有定居于体细胞组织的能力并且产生嵌合体，作为幼体，其看起来与用cES细胞制得的嵌合体相一致(图6)。在新衍生的和克隆衍生的转基因PGC系中观察到鸡EG细胞。对源于GFP阳性PGC的EG细胞的Southern分析(图11)表明EG细胞源于PGC。

实施例6.培养的雄性PGC在公鸡中产生功能性配子

从个体Barred Rock胚胎中获得雄性原始生殖细胞系。所述细胞系建立后，将细胞注射入阶段13-15(H&H)的胚胎中。在表型上，孵出的鸡类似于White Leghorns。将雄性鸡饲养至性成熟并且让其与Barred Rock母鸡交配(表1)。黑色后代表现出注射PGC的种系传递。公鸡种系传递率从＜1％至86％变化(表1)。

表1：注射入阶段14-15(H&H)胚胎脉管系统的雄性原生殖细胞的种系传递

*每个值表示一个嵌合体的种系传递率

也可以将PGC注射入阶段X胚胎的胚下腔。在培养209天后将1000或5000个PGC注射入经辐照处理的胚胎。使孵出的雄性小鸡生长至性成熟并让其繁殖以用于检测种系传递。在用来检测种系传递的4只公鸡中，观察到3只的频率在0.15-0.45％之间变化。这指示当在原肠胚形成之前注射PGC时，其可以定居于种系。在14只雌性嵌合体的1625只后代中，没有观察到雄性PGC的种系传递。

实施例7.培养的雌性PGC在母鸡中产生功能性配子

来自培养了66天的Barred Rock胚胎的雌性PGC被注射入阶段13-16(H&H)White Leghorn胚胎中，并且所有孵出的鸡具有White Leghorn的表型。将母鸡饲养至性成熟并且让其与Barred Rock公鸡交配(表1)。雌性PGC以最高为69％的频率通过雌性嵌合体传递。(表1)。

表2：注射入阶段14-15(H&H)胚胎脉管系统的雄性原生殖细胞的种系传递

*每个值表示一个嵌合体的种系传递率

也将雌性PGC注射入雄性受体White Leghorn胚胎中。将雄性嵌合体饲养至性成熟并让其与Barred Rock母鸡交配。在所检测3只公鸡的506只后代中没有观察到雌性PGC的种系传递。

实施例8.源于PGC的后代在生殖上是正常的

三只雄性和4只雌性非转基因PGC源的后代在一起交配。有53至100％的卵有生育力(表3)并且有79至100％的受精卵产生孵化的胚胎(表3)，这表明PGC源的后代在生殖上是正常的。

表3：从种系嵌合体公鸡获得的PGC后代的生殖参数

实施例9.PGC对新霉素和嘌呤霉素的敏感性

确定PGC对新霉素和嘌呤霉素的敏感性，以确定允许在CX-启动子控制下表达抗生素抗性的细胞生长所必需的新霉素和嘌呤霉素浓度，所述CX-启动子在所有组织中都强烈表达(Origen Therapeutics，未发表)。这些试验证明，为了排除所有非转染细胞，300μg/ml浓度的新霉素维持10天时间是必需的。0.5μg/ml浓度的嘌呤霉素在7-10天内足以排除PGC。

实施例10.PGC的遗传修饰

将20微克(20μl)的NotI线性化cx-neo转基因(见图8)加入5.8×10⁶已培养167天的PGC群体中。将细胞和DNA重悬于800μl电穿孔缓冲液中，并且施加8个672伏持续时间为100微秒的方波脉冲。10分钟后，将细胞重悬于培养基中并等分于24孔板中。电穿孔后2天，每毫升培养基添加300μg新霉素以选择表达cx-neo转基因的细胞。细胞在选择条件下保持19天。19天后，从选择物中取细胞并扩增用于分析。一部分PGC在300μg/ml条件下再保持31天，这证明该PGC在功能上对所述抗生素具有抗性。

参考图8，对于质粒对照而言，cx-neo质粒DNA用NotI线性化，接着用EcoRI或者BamHI消化以产生片段，该片段比用HindIII消化所呈现的完整质粒稍小(5kb)。通过用StyI或NcoI消化释放cx-neo质粒的约2kb内部片段。通过用EcoRI和KpnI消化释放约2.6kb的较大内部片段。用EcoRI、BamHI和HindIII消化来自PGC系的基因组DNA显示大于6kb的带，这表明cx-neo转基因掺入到PGC基因组中。在用StyI、NcoI和EcoRI与KpnI消化之后，在质粒DNA中所揭示的内部片段也存在于PGC的基因组DNA中，这指示cx-neo转基因没有变化地整合于PGC基因组中。采用常规转基因构建技术，可以掺入另外的元件比如实例有调控元件、组织特异性启动子和编码蛋白质的外源DNA。单克隆抗体是由外源DNA编码的蛋白质的优选实例并且人单克隆抗体是其中优选的。

如上所述，只在非常少的物种中证明了在PGC中实施遗传修饰来产生转基因动物。通过参照在小鼠中应用ES细胞所实现的，可以在鸡PGC中实现类似的遗传操作。在小鼠中，为了产生嵌合体和转基因后代，独立应用同源重组然后将染色体转移至胚胎干(mES)细胞中是众所周知的。现已研发出位点特异性同源重组或者基因打靶的强大技术(见Thomas，K.R.and M.R.Capecchi，Cell 51：503-512，1987；综述见Waldman，A.S.，Crit.Rev.Oncol.Hematol.12：49-64，1992)。插入克隆的DNA(Jakobovits，A.，Curr.Biol.4：761-763，1994)和通过Cre-IoxP系统技术操作和选择染色体片段(见Smith，A.J.et al.，Nat.Genet.9：376-385，1995；Ramirez-Solis，R.etal.，Nature 389：720-724，1995；US Patents 4,959,317；6,130,364；6，130,364；6,091,001；5,985,614)可用于操作和转移基因至mES细胞中以产生稳定的遗传嵌合体。如果能获得所必需的培养物的话，已证明可用于哺乳动物系统的许多这样的技术将可用于鸡PGC。

通常认为原始生殖细胞基因组处于静息状态并因此染色质可处于高度凝聚的状态。对常规电穿孔方法的大量试验表明需要专门的方法将遗传修饰引入到PGC的基因组中。如下所述，可以用源于鸡β-珠蛋白基因座的绝缘元件(insulator element)围绕转基因以增强表达。β-珠蛋白绝缘元件内含物通常产生可以进行生长、分析和注射入受体胚胎的克隆。

用来驱动表达抗生素(例如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、his-D、杀稻瘟菌素、zeocin和gpt)抗性基因的常规启动子被普遍地表达。典型地，所述启动子是源于“管家”基因比如β-肌动蛋白、CMV、或者泛素。尽管因为组成型启动子通常在所有细胞中都以高水平表达而使得它们是可用的，但是它们在鸡的整个一生中，如果不是全部的话也是在大部分组织中持续表达。一般来说，表达应当被仅限于需要表达的组织和发育阶段中。为了选择原始生殖细胞，需要表达的期间是培养基中存在有抗生素而它们居于体外的时候。一旦细胞被插入胚胎，优选终止选择标记(即抗生素抗性基因)的表达。为限制抗生素抗性基因的表达，采用“神经诱导早期应答”(early response to neural induction，ERNI)启动子。ERNI是一种在发育早期阶段(例如阶段X(E-G&K))和在培养期间选择性表达的基因，因此应用该启动子来驱动抗生素抗性基因的表达以选择携带有遗传修饰的PGC。因为ERNI只在发育的早期阶段表达，所以赋予抗生素抗性的基因不在成熟动物中表达。

实施例11.长期性PGC细胞培养物的同质性

为了在长期培养后确定PGC培养物的同质性，用抗-CVH抗体(一种抗鸡vasa同源物的抗体)和1B3抗体对ES、EG、DT40(鸡B细胞系)和PGC进行染色(Halfter，W.，Schurer，B.，Hasselhorn，H.M.，Christ，B.，Grmpel，E.，and Epperlein，H.H.，An ovomucin-like protein on the surfaceof migrating primordial germ cells of the chick and rat.Development 122，915-23.1996)。抗CVH抗体的表达被限制于生殖细胞，因此对于它们而言抗CVH抗体是可靠的标记物。1B3抗原识别在鸡PGC迁移并定居生殖腺期间存在于鸡PGC表面上的卵粘蛋白样蛋白质。

在CMF/2％FBS中清洗细胞，在4％低聚甲醛中固定5分钟，并再次清洗。用0.1％TritonX-100对有待进行vasa染色的细胞等分试样进行透化处理1-2分钟。加入第一抗体20分钟后，清洗细胞两次并与第二抗体(针对CVH和对照的Alexa 488抗兔IgG以及针对1B3的Alexa 488抗兔IgM)一起孵育15分钟。作为对照，细胞的等分试样只用第二抗体进行染色。在另外清洗2次后，制备细胞用于FACS分析。

参照图9，当用CVH和1B3 Ab染色时，DT40、ES和EG细胞都显示背景。然而，对于PGC而言，用CVH和1B3抗体染色则强得非常多。有一小群PGC，其不染色CVH或者1B3，这表明这一小群细胞不显示PGC表型。用vasa和1B3抗体对两个亲代PGC系(PGC13和102)和源于PGC13亲代细胞系的4种转染细胞系(G-09、P84、P97/6和P97/33)进行染色。它们都显示出同样的模式，这表明各种PGC培养物包含同样高比例的表达PGC表型的细胞。

实施例12：原始生殖细胞的遗传修饰

用环状CX-GFP质粒实施电穿孔揭示在PGC中的瞬时转染率在1-30％间变化。应用100微秒和800v的8个方波脉冲，我们获得携带有CX-neo构建体的PGC细胞系，其被命名为G-09。见图8。采用Southern印迹分析评估构建体的整合。然而，此稳定转染细胞系的分离是不真实的事件，在接下来的试验中没有重现。除了G-09之外，在应用方波和指数式衰减脉冲的37个转染试验中，在用线性化构建体电穿孔17×10⁷个PGC之后，没有实现PGC的稳定转染。在每个试验中，PGC的量从1×10⁶至10×10⁶变化。对以下被广泛地应用于小鼠、鸡和人的ES细胞研究中的启动子进行检测：CX启动子，也称为CAG(Niwa，H.，Yamamura，K.，andMiyazaki，J.，Efficient selection for high-expression transfectants with anovel eukaryotic vector.Gene 108，193-9.1991)，其包括具有CMV增强子的鸡β-肌动蛋白启动子；PGK启动子；MC1启动子和Ubc启动子。这些启动子中没有一个可以增加转染效率。为允许表达选择标记以及遗传修饰细胞系的克隆衍化，已经将绝缘子与整合构建体一起使用。

绝缘子是DNA序列，其将活动的与不活动的染色质结构域分开并且使基因对邻近增强子的活化效应、或者邻近凝聚染色质的沉默效应绝缘。在鸡中，位于β-珠蛋白基因座5’的5’HS4绝缘子已经由Felsenfeld和其同事充分表征(Burgess-Beusse，B.，Farrell，C.，Gaszner，M.，Litt，M.，Mutskov，V.，Recillas-Targa，F.，Simpson，M.，West，A.，and Felsenfeld，G.(2002)The insulation of genes from external enhancers and silencingchromatin.Proc.Natl.Acad.Sd.USA 99Suppl.4，16433-7)。该绝缘子保护β-珠蛋白基因座避免组成型凝聚染色质上游区的影响。我们用驱动新霉素抗性的鸡β-肌动蛋白启动子并采用鸡β-珠蛋白5’HS4序列作为鸡β-肌动蛋白-neo-盒的5’和3’端的绝缘子来装配转基因。

用以下引物组PCR扩增鸡β-珠蛋白基因座的超敏位点4的250bp核心序列：

HS4-Bam-F：AGGATCCGAAGCAGGCTTTCCTGGAAGG(SEQ ID.NO.7)

HS4-Bg1-R：AAGATCTTCAGCCTAAAGCTTTTTCCCCGT(SEQ ID.NO.8)

将PCR产物克隆至pGEM-T并测序。通过用BamHI和BglII消化处理pGEM克隆中的HS4来制备HS4位点的串联重复以释放插入序列，并用BglII使载体线性化。将HS4片段连接至含有HS4绝缘子拷贝的载体。筛选克隆并挑选出其中两拷贝HS4取向相同的一个克隆。它被命名为2XHS4。

实施例13：应用HS4β-肌动蛋白-neo的大批量选择

从Buerstedde(克隆574)获得β-肌动蛋白neo并转染至pBluescript。随后在β-肌动蛋白neo的5’和3’端克隆2X HS4以产生HS4-β-肌动蛋白neo。应用此构建体实施8次转染。对于每次转染，将5×10⁶个PGC重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并加入20μg线性化DNA。施加一个指数式衰减(ED)脉冲(200V，具有900-1100μF)或者8个方波(SW)脉冲(250-350V，100微秒)。转染后，在添加新霉素(300μg/ml)进行选择之前，让细胞生长几天。每次转染生长为一个库(pool)。从8次转染的5次中分离到抗性细胞。

对2个库的转染细胞实施Southern分析(图10)。对来自PGC系P84和P85的2μg基因组DNA和20pg质粒(HS4-β-肌动蛋白neo)进行消化处理。在0.7％凝胶上对消化产物进行跑胶，通过10×SSC毛细管转移将其过夜转移至尼龙膜，并在Rapid Hyb(Amersham)中用放射性标记neo基因序列探针处理2小时。清洗后，印迹膜对胶片在-80℃曝光过夜。参照图10，泳道1是P84，泳道2是P85和道3是质粒。对于质粒对照，用Notl使HS4-β-肌动蛋白-neo质粒DNA线性化。为获得2.3Kb内部片段，用BamH1消化PGC DNA和线性化质粒DNA。P84和P85都显示出大小为2.3Kb的内部片段。通过HindIII消化释放约2.6Kb的较大内部片段。该内部片段也出现在P84和P85消化产物中。如果转基因被整合于基因组的话，用EcoRl和BglII消化P84和P85的基因组DNA应当显示大于2.9Kb的条带。在P84中，没有见到连接片段，这表明P84是几个不同克隆的复合物。在P85中，4.5-5kb的连接片段出现在EcoRl消化中并且5Kb的连接片段出现在BglII消化中，这表明P85被整合入基因组中并且该培养物基本上来自于一个克隆。这个实例表明绝缘子作为构件体的优选元件用于在原始生殖细胞中可靠表达选择标记的效用。

实施例14：经遗传修饰的PGC的克隆衍生

以下实施例表明原始生殖细胞的遗传修饰系可以经克隆衍生。

首先，制备β-肌动蛋白-eGFP。用XmnI和KpnI从CX-eGFP-CX-puro释放eGFP基因，用EcoRI和XmnI从HS4-β-肌动蛋白puro释放β-肌动蛋白基因，并以3-段连接(3-way ligation)将这两个基因克隆至用EcoRI和KpnI消化的pBluescript中从而产生β-肌动蛋白EGFP。随后，用BamHI和KpnI释放β-肌动蛋白eGFP(用T4DNA聚合酶产生平端)并将其克隆至用BglII和EcoRV消化的HS4-β-肌动蛋白puro中。

应用此构建体实施5次转染。对于每次转染，5×10⁶个PGC被重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并添加20μg线性化DNA。施加ED脉冲(150-200V；900μF)或者SW(350V，8脉冲，100微秒)脉冲。转染后，细胞被接种于独立的48孔中并在进行选择(0.5μg/ml)之前让其生长几天。在5次转染的4次中观察到总共5个克隆。通过Southern分析一个克隆TP103(图11)。参照图11，用NotI使质粒对照DNA线性化。通过用KpnI消化DNA释放内部片段。在TP103和所述质粒中，释放了同样大小的片段。用NcoI、MfeI和SphI消化TP103的基因组DNA应当显示出大于消化质粒DNA对应泳道的条带。在MfeI消化的TP103基因组DNA的泳道中没有观察到条带，这可能是由于条带太大的缘故。在代表NcoI和SphI消化的泳道中，在TP103基因组DNA中释放的片段显著大于在质粒DNA中释放的片段，这表明转基因被掺入TP103细胞系的基因组中。

HS4-β-肌动蛋白-puro的克隆衍生

首先，通过对来自CX-EGFP-CX-puro(XmnI-EcoRI)的puro、来自pBS中β-肌动蛋白neo(见上)(Sal-XmnI)的β-肌动蛋白和pBluescript(SalI-EcoRI)的3-段连接来制备β-肌动蛋白puro。接下来，通过把BamHI消化的β-肌动蛋白puro连接至BamHI/SAP处理的2X HS4载体，从而将β-肌动蛋白puro克隆至包含两拷贝2X HS4的pBS中。

应用此构建体实施三次转染。对于每次转染，4-5×10⁶个PGC被重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并添加20μg线性化DNA。施加200V、900μF的ED脉冲。转染后，将细胞接种于独立的48个孔中，并在进行选择(0.5μg/ml)前让其生长几天。在2次转染中没有观察到克隆。从第三次转染中分离到两个克隆。

HS4-cx-eGFP-cx-Pruo的克隆衍生

用HS4-cx-eGFP-cx-Puro实施3次转染。5×10⁶个PGC被重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并添加20μg线性化DNA。对每次转染施加350V持续100微秒的8个SW脉冲。转染后，将细胞接种于独立的48个孔中，在进行嘌呤霉素选择(0.5μg/ml)之前让其生长几天。从2次转染中分离到总共16个克隆。

cx-neo的克隆衍生

用携带cx-neo选择标记的质粒电穿孔PGC13细胞系。在暴露于新霉素之后，得到对新霉素具有抗性的细胞系(G-09)。确定此细胞系的核型并且所有细胞在染色体2的p-臂中都表现出缺失(表3和图12)。这些数据证明G-09是从携带有染色体2的p-臂中标记缺失的PGC克隆衍生而来。

表3：G-09细胞系的染色体分析

实施例15：PGC中选择标记的组织特异性表达

基因ERNI从鸡胚的前原条期(pre-primitive streak stage)开始表达并且其是对来自亨森结信号的早期应答基因(Streit，A.，Berliner，A.J.，Papanayotou，C，Sirulnik，A.，and Stem，C.D.(2000)Initiation of neuralinduction by FGF signalling before gastrulation.Nature 406，74-8)。而且ERNI在鸡ES细胞中表达(Acloque，H.，Risson，V.，Birot，A.，Kunita，R.，Pain，B.，and Samarut，J.(2001).Identification of a new gene familyspecifically expressed in chicken embryonic stem cells and early embryo.Mech Dev 103，79-91)。除了独特的5’和3’UTR序列之外，ERNI基因(也称为cENS-1)具有特殊的结构，其中单一长开放读码框旁侧有486bp直接重复序列。基于认为此结构是逆转录病毒LTR-样结构的想法，Acloqueet al.2001分析了所述cDNA序列不同部分的启动子/增强子活性，并发现在3’UTR中一个独特的序列区域可作为启动子。基本如所述(Acloque et al.，2001)设计PCR引物以扩增ERNI基因3’UTR的822bp片段。扩增ERNI序列之后，它们被克隆至新霉素抗性基因的上游，具有SV40多聚A位点，从而产生ERNI-neo(1.8kb)。随后将2X HS4绝缘子克隆至ERNI-neo选择标记物盒的任一侧。

用HS4-Erni-neo实施两次转染。5×10⁶个PGC被重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并添加20μg线性化DNA。在第一次转染中，施加175V、900μF的单ED脉冲；在第二次转染中，施加100微秒和350V的8个SW脉冲。转染后，将细胞接种于独立的48个孔中，在进行新霉素选择(300μg/ml)之前让其生长几天。在第一次转染中(ED脉冲)分离到5个集落，在第二次转染中(SW脉冲)分离到11个集落。

分离到稳定转染的克隆表明在PGC中表达了ERNI并且其可被用作组织特异性启动子。

实施例16：转染PGC对种系的贡献

用HS4-β肌动蛋白-GFP转染PGC并将其注射入阶段13-15(H&H)胚胎中。在第18天，获取生殖腺，并对其固定、切片以及用CVH抗体染色以鉴定生殖细胞。随后分析染色的切片，分析在生殖腺中是否存在GFP阳性细胞。在雄性(图13)和雌性生殖腺中均发现GFP阳性生殖细胞。对这些胚胎的脑、心肌和肝的组织学制备物的检测表明在一个载玻片中只有4个绿色细胞。这些数据证明有些培养PGC被发现于某些异常位置中，但是绝大多数培养PGC优先定居于种系。

为确定GFP阳性细胞是生殖细胞，切片用抗CVH抗体进行染色。如图14中可以见到的，GFP阳性细胞也表现出针对CVH蛋白质的染色，这表明所述GFP阳性细胞是生殖细胞。

参照图14，GFP阳性细胞存在于此切片中并且DAPI/GFP图表明这些GFP阳性细胞定位在生精小管内。当用抗CVH抗体染色生殖细胞时，它们显示出强烈的红染色圈，其勾画出生殖细胞的细胞质。DAPI/CVH图表明这些细胞定位在生精小管内。最后一张图表明GFP阳性细胞也染色CVH以及生精小管含有GFP阴性的CVH阳性生殖细胞。

实施例17.遗传修饰PGC的种系传递

用以下转基因之一转染Barred Rock的PGC：β肌动蛋白-neo、β肌动蛋白-eGFP-β肌动蛋白-puro、cx-eGFP-cx-puro，转染后PGC被注射入阶段13-14(H&H)胚胎的脉管系统。孵化鸡，使公鸡生长至性成熟并让其与Barred Rock母鸡交配以确定转基因的种系传递。所有黑色后代是源于PGC的并且检测其中转基因的存在(表5)。通过用黑色鸡的数目除以进行羽毛颜色评分的鸡只总数来计算种系传递率(表5)。

表5：遗传修饰的原生殖细胞的种系传递

实施例18.转基因以孟德尔方式遗传

在携带有经遗传修饰而包括β肌动蛋白-neo、β肌动蛋白-GFP或cx-GFP之一的Barred Rock PGC的嵌合体公鸡之间进行交配，对交配黑色后代分析其中转基因存在的信息。如表6中所示，PGC后代的约50％遗传了转基因，这表明是孟德尔遗传。

表6：转基因的孟德尔分离

*经卡平方分析与转基因：非转基因后代的预期1∶1比率没有显著差异

实施例19.在携带有遗传修饰PGC的嵌合体后代中转基因的普遍表达

带有β肌动蛋白-GFP稳定整合于基因组的PGC的嵌合体与野生型母鸡进行交配并且对胚胎进行GFP表达的评分。在胚胎中表达的实例显示在图15中，该图显示直至发育阶段34(H&H)在转基因后代的所有组织中表达GFP。在较年长的动物中，采用冷冻切片制备组织用于组织学检查。来自1-2周龄鸡的胰、皮肤、肺、脑、卵巢、肾、囊(bursa)、十二指肠、胸、肝和脾的组织证明在孵化后动物中仍保持广泛表达。

实施例20：单克隆抗体在转基因鸡的卵白中的表达

如上所示，此单克隆抗体只是可以采用本发明转基因构建体表达的几种类型单克隆抗体产物的一个实例。此外，作为一类蛋白质的单克隆抗体只是可以根据本文所述方法和技术以组织特异性方式表达的许多类蛋白质产物的一个实例。以下实施例可用来表达具有已知编码序列的任何蛋白质或者抗体。

被用来在鸡输卵管的管状腺细胞中表达单克隆抗体的载体被称作OvABC。该载体包含来自鸡卵清蛋白基因座的完整BAC克隆，其中包括卵清蛋白结构基因和5’和3’侧翼序列。将单克隆抗体盒(含有编码人IgL的基因和编码人IgH的基因，通过IRES序列连接)插入BAC上卵清蛋白基因中，使得卵清蛋白翻译起始密码子被融合于IgL起始密码子，驱使在输卵管中高水平表达单克隆抗体。在输卵管中表达的抗体被分泌出来并沉积在卵白中。

设计单克隆抗体的模块式盒，为了容易地插入编码任何期望单克隆抗体可变区的重链和轻链可变区基因而使得表达全长人IgGk，而在其中策略性置入独特的限制酶位点。此盒一旦经感兴趣的可变区修饰，随后就将其插入OvBAC用于在输卵管中表达MAb。该盒包含人Ck恒定区、人Cγ1恒定区以及人κJ-C内含子和人Cγ1上游内含子的部分区域。还存在VH基因的信号肽和下游小内含子；然而，不存在VL信号肽。IRES序列存在于IgL和IgH基因之间，从而从单个转基因表达完整的抗体。可变区基因插入一个独特限制性位点(比如对于VL的SnaBI或SrfI；对于VH的NruI或PmeI)，它们位于恒定区基因上游的内含子中。可变区基因必需包含剪接供体序列，从而它们被剪接至恒定区基因用于正确的表达。通过对来自杂交瘤基因组DNA或者来自源于所述杂交瘤的重组DNA经PCR扩增重排的被表达可变区基因。轻链的信号肽前导序列必须在扩增轻链V时添加；在所述盒中存在重链信号肽，所以当插入重链V时这是不需要的。对于VL基因而言，设计包括以下的PCR引物。在VL基因上游侧的5’引物将包括：SnaBI限制酶的识别位点；Kozak共有ATG和信号肽；和用于引发PCR反应的与感兴趣V区同源的约20bp序列。如果在PCR中cDNA克隆被用作模板，那么信号肽外显子应当已经被融合至VL基因的其余部分；否则，应当设计引物，以将人VL信号肽按照读码框添加至成熟可变区的N-末端。此步骤可能要求两轮巢式PCR以添加必需的序列，因为如果一步添加信号肽的话，引物将很长。在VL基因的3’端上，设计PCR引物，其包括：SgfI限制酶的识别位点；与感兴趣V区3’端同源的约20bp序列；和约20bp的J-Cγ内含子序列，包括用于剪接至下游Cγ基因的剪接供体。对于VH基因来说，用于PCR扩增的5’引物包括NruI酶的识别位点，约20bp的存在于信号肽序列的VH内含子(包括用于在模块式盒中剪接至VH信号肽剪接供体的剪接受体)，11bp的VH信号肽编码序列，以及与感兴趣VH基因5’端同源的约20bp序列。所述3’引物包括与感兴趣VH基因3’端同源的约20bp序列(对应J区)，约20bp的J-Cμ内含子(包括用于剪接至Cγ1基因下游的剪接供体)和NruI酶的识别位点。在插入模块式MAb盒载体之前，克隆VL和VH的PCR产物并测序。

通过重组工程将MAb盒插入卵清蛋白序列来修饰OvBAC克隆，如下文所述：Copeland，N.G.，Jenkins，N.A.，Court，D.L(2001).Recombineering：a powerful new tool for mouse functional genomics.NatRev Genet 2，769-79。通过翻新(retrofit)将选择标记(新霉素或者嘌呤霉素抗性)添加至OvBAC，Wang，Z.，Engler，P.，Longacre，A.，Storb，U.(2001).An efficient method for high-fidelity BAC/PAC retrofitting with aselectable marker for mammalian cell transfection.Genome Res.11，137-42。

实施例21：在转基因鸡卵白中的抗-IL-2Rα

表达人IL-2Rα受体特异性MAb的整体策略如下(见图16和18)。在步骤1中，通过重组工程在大肠埃希氏菌中经过同源重组将抗-IL-2RαIgL/IgH盒插入Ov BAC。随后抗体处于Ov调节元件的转录控制之下。在步骤2中，通过Flp重组酶去除在重组工程中使用的卡那霉素基因。将来自人源化抗-IL-2Rα抗体的V编码序列克隆至含有Cκ和Cγl恒定区的盒中。用IRSE序列连接Igκ和IgH基因，使得从单个转基因构建体中表达这两个基因，并且由此只需要单一BAC转染。通过同源重组将抗体盒插入BAC上的Ov基因(Lee and Copeland，2001)。为了有效翻译，将Igκ基因融合于Ov Kozak翻译起始序列。最后，将在PGC中作为选择标记的ERNI-puro添加至BAC，用于PGC克隆的转染和选择。

图16显示OvABC-抗-IL-2Rα的构建。为获得重链和轻链可变区基因，对于每个基因，合成4个长寡核苷酸(有约20bp的重叠)并相互退火。用DNA聚合酶(来自细菌噬菌体T4)填充间隙。随后，为了克隆至MAb盒中，用限制酶消化合成基因。

用于构建人源化抗-IL-2RαMab(MAb序列来自专利5,585,089)的寡核苷酸如以下所示。

轻链V基因(寡聚体1-4)：

寡聚体1：ctc TCTAGA caactcagagttcaccatg gagaccga taccctcctg ctatgggtcc tcctgctatgggtcccagga tcaaccggag//atattcagat gacccagtct ccatctaccc tctctgctag cgtcggggat(SEQ ID.NO.9)

寡聚体2：ataaattaga agcttgggag ctttgcctgg cttctgctgg taccagtgca tgtaacttat acttgagctggcagagcagg ttatggtgac cctatccccg acgctagcag agag(SEQ ID.NO.10)

寡聚体3：gctcccaagc ttctaattta taccacatcc aacctggctt ctggagtccc tgctcgcttc agtggcagtg gatctgggaccgagttcacc ctcacaatca gctctctgca gccagatgat ttc(SEQ ID.NO.11)

寡聚体4：ctc GCGATCGC caatagtgaaaaattac gtttgac ctccaccttg gtcccctgac cgaacgtgagtgggtaagta ctcctttgat ggcagtaata agtggcgaaa tcatctggct gcagagagct ga(SEQ ID.NO.12)

参照图17，寡聚体1具有用于克隆的XbaI位点(大写字母)，接着是VL信号肽(没有内含子)。Ov Kozak翻译起始序列加下划线；最后三个核苷酸是起始密码子。由双斜线指示信号肽切割位点(在相应的蛋白质序列中)。寡聚体4具有用于克隆的SgfI位点(大写字母)，接着是用于剪接至Ck(下划线)的人5’J4-Ck内含子的17bp序列。剪接供体G核苷酸用双下划线表示。

寡聚体5：ctc TCGCGA tctctctgttcacag //cagg tccagcttgt ccagtctggg gctgaagtcaagaaacctgg ctcgagcgtg aaggtc(SEQ ID.NO.13)

寡聚体6：cccagtcgac ggattaatat atccaatcca ttccagaccc tgtccagggg cctgccttac ccagtgcatcctgtagctag taaaggtgta gccagaagcc ttgcaggaga ccttcacgct cgagccagg(SEQ ID.NO.14)

寡聚体7：tatattaatc cgtcgactgg gtatactgaa tacaatcaga agttcaagga caaggcaaca attactgcagacgaatccac caatacagcc tacatggaac tgagcagcct gagatctgag gaca(SEQ ID.NO.15)

寡聚体8：ctc TCGCGA ggccattcttac t gaggagactg tgaccagggt tccttggccc cagtagtcaa agacccccccccctcttgca cagtaataga ctgcggtgtc ctcagatctc aggctgct(SEQ ID.NO.16)

寡聚体5含有用于克隆的NruI位点(大写字母)，接着是人VH信号肽内含子3’端的15bp序列(下划线)，接下来是来自人源化抗-IL-R2αVH基因的VH信号肽外显子序列的11bp序列(双下划线)。由双斜线指示信号肽的切割位点(在相应的蛋白质序列中)。

寡聚体8含有NruI位点(大写字母)，接着是人J-Cμ内含子5’端的12bp序列(下划线)。剪接供体C核苷酸由双下划线指示。

混合寡聚体1-4，混合寡聚体5-8，在装有沸水并让其缓慢冷却至室温的烧瓶中使这两种混合物退火。用DNA聚合酶修补互补链中的间隙。

参照图18，随后利用设计入Vs的5’和3’端中的独特限制性位点(在此实例中，NruI用于重链V和XbaI/SgfI用于轻链V)，将Igκ和IgH Vs克隆至含有Cκ和Cγ1基因的盒中。

还参照图18，在其上部显示OvBAC，其具有Ov结构基因5’的110kb序列，以及Ov结构基因3’的30kb侧翼序列。在3’端显示ERNI-puro选择标记。MAb盒显示具有以下元件(从左至右)：用于通过同源重组插入OvBAC的5’Ov同源臂；Ov Kozak和ATG；人VL信号肽(SiGVL)；来自MAb的插入人轻链可变区基因(VL)；J-Cκ内含子；Cκ基因；用于翻译下游IgH基因的IRES；人重链信号肽(SiGVH)；来自MAb的插入重链可变区基因(VH)；J-Cγ内含子；包括其内部内含子的Cγ1基因；和用于插入OvBAC的3’Ov同源臂。(用于在细菌中选择的卡那霉素基因未显示。)

为了将抗体盒插入OvBAC，通过向Igκ-IRES-IgH盒添加同源臂制得重组工程靶向载体。所述同源臂是来自Ov基因座的片段，其作用在于使所述抗体盒靶向于BAC中的Ov基因，这其中利用了在携带所述BAC的EL250大肠埃希氏菌菌株中实施的同源重组机制(Lee and Copeland，2001)。所述5’Ov同源臂是124bp的卵清蛋白序列，其对应位于Ov基因中Ov Kozak翻译起始序列紧接上游的HincII-XbaI片段，并且具有以下序列：

5’-gttaacatttaattgcctaaaaactgctcgtaatttactgttgtagcctaccatagagtaccctgcatggtactatgtacagcattccatccttacattttcactgttctgctgtttgctctaga-3’(SEQ ID.NO.17)

应用以下引物从鸡的基因组DNA或者克隆的Ov DNA经PCR扩增5’同源序列：

K8HincII-F 5’-GGA TAT AGC AAC AGA CAC ATT AC-3’(SEQ ID.NO.18)

K8-TTT NotIXbaI-R 5’-TTT GCG GCC GCT CTA GAG CAA ACA GCA GAA C-3’(SEQID.NO.19)

所述的3’Ov同源臂是125bp的卵清蛋白序列，其位于卵清蛋白翻译终止密码子的紧接下游，该3’Ov同源臂具有以下序列：

5’-aaagaagaaagctgaaaaactctgtcccttccaacaagacccagagcactgtagtatcaggggtaaaatgaaaagtatgttatctgctgcatccagacttcataaaagctggagcttaatctaga-3’(SEQ ID.NO.20)

获得的3’Ov同源序列为使用以下引物从鸡基因组DNA或者克隆的Ov DNA扩增的152bp PCR产物：

NotI OV(3’TAA)-F 5’-AAAAGCGGCCGCAAAGAAGAAAGCTGAAAAAC-3’(SEQ ID.NO.21)

3’OVTAA-R2 5’-CTCCGCGGCTCGAGTCTAGATTAAGCTCCAGCTT-3’(SEQ ID.NO.22)

扩增5’和3’同源片段之后，将PCR产物克隆至质粒载体比如pBluescript并通过测序验证。随后，将同源臂置于MAb盒的任一侧；5’Ov同源序列被置于IgL基因的5’侧，3’Ov同源序列被置于IgH基因的3’侧。通过同源重组将MAb盒插入OvBAC导致Ov结构基因缺失。用于靶向插入Ov BAC的MAb盒的最终结构也在图17中显示。

在用MAb盒转化之后，需要选择标记比如编码卡那霉素抗性的基因，用于在携带OvBAC的大肠埃希氏菌中选择同源重组体。因此，靶向载体还包含侧翼有FRT位点的卡那霉素抗性基因。例如，通过XmaI和BglI(Nt4644-6131)从pIGCN21(包含IRES-eGFPcre-FRT-kan-FRT盒的载体，从NCI的Neal Copeland实验室获得)释放1.5Kb FRT-Kan盒并被平端处理。随后此片段被插入在侧翼有Ov同源序列的MAb盒中的平端化Not I位点。经电穿孔使靶向载体进入携带野生型OvBAC的细菌中并选择卡那霉素抗性菌落。通过克隆的限制性图谱分析来评估正确靶向。大部分卡那霉素抗性菌落应当被正确靶向。随后，通过在EL250菌株中经阿拉伯糖诱导Flp基因而瞬时表达Flp重组酶来去除抗性盒，由此得到OvBAC-抗-IL-2Rα。筛选卡那霉素敏感性克隆并通过限制性图谱分析来验证。

为了选择BAC转化的PGC细胞，在PGC中有活性的选择标记随后被加到BAC。我们已经使用由ERNI启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因来获取稳定转化的PGC系。ERNI是一种在早期鸡胚胎中特异性表达的基因，所以在成年转基因鸡中ERNI-puro标记将不表达。我们还发现在选择标记侧翼添加来自鸡β-珠蛋白基因座的绝缘子元件将增加在转染后所获得PGC集落的数量。被称为HS4的此元件随后被克隆至ERNI-puro的任一侧。通过翻新(retrofit)将HS4-ERNI-puro添加至BAC(Wang et al.，2001)。在转染之前，用AscI将最后的OvMAb抗-IL-2RαBAC线性化。

实施例22.在转基因鸡卵白中所产生抗体的化学性质

在转基因鸡管状腺细胞中产生的抗体的化学性质将展现出独特的性质。美国专利申请NO.11/049,229和(Zhu，L.，et al.Nat.Biotech.23：1159-1169 2005)以引用方式具体地并入本文。明确地说，对在嵌合体鸡中所产生抗体的单糖分析揭示了在碳水化合物组成上的差异并且显示有N-乙酰葡萄糖胺残基、甘露糖残基和非常低含量的半乳糖残基的存在。转基因鸡将展示出同样的性质。

在N-连接寡糖分布特征上的最大差异是，在由鸡所产生的抗体中，存在高甘露糖型N-聚糖，缺少岩藻糖，和半乳糖残基的含量非常低。这些特性由于几个原因是很重要的。首先，没有已知有抗原性的α1-3Gal连接的证据。半乳糖浓度的降低，通常低于约2％的水平，这显著降低了由含半乳糖的连接所产生的抗原性。第二，没有已知也具有抗原性的N-乙醇酰神经氨酸残基的证据。第三，在鸡管状腺细胞中产生的抗体基本上没有岩藻糖基残基，其增强抗体的ADCC活性。在本文中，“基本上没有”被定义为低于0.1％。第四，鸡产生的抗体具有高甘露糖含量，通常大于40％，当在Balb/c小鼠中使用在CHO细胞中产生的抗体作为标准评估清除时，其增加了此抗体的清除率。连同这些有利的化学性质一起，预期抗体以在转基因随机整合入鸡基因组或者不以组织特异性方式表达的条件下所观察不到的浓度存在于卵白中。优选的浓度是在每个卵中抗体大于1mg，每个卵大于2mg，每个卵大于3mg，以及每个卵高达6mg。因为每个卵包含约25ml卵白，所以优选的浓度是大于40μg/ml，大于80μg/ml，大于120μg/ml，以及高达240μg/ml。

为从卵白中提取和纯化抗体，卵白首先以低剪切速率在室温下混合30分钟，接下来通过先前所述的改进方法沉淀卵粘蛋白。1体积均质化卵白悬液加入3体积的反渗透水中并搅拌30分钟。用0.5M磷酸将稀释后悬液调至pH 6.0并随后在12,100g离心20分钟。将上清液用0.5M磷酸氢二钠调至pH 7.4并用结晶盐调至150mM氯化钠浓度。在Protein A-Sepharose FF柱(Amersham Biosciences)上，以120cm/h线性流速纯化人IgG。用5体积的加样缓冲液(PBS，pH7.4)清洗吸附的人IgG，随后用3mM磷酸进行洗脱。使用含230mM NaCl的60mM磷酸钠(pH 7.5)将洗脱的人IgG组分调至pH 7.5，以达到40mM磷酸钠和150mM NaCl的终浓度。随后通过0.2mm注射器式过滤器(Pall)过滤样品。

实施例23：结合亲和性分析

用LNCaP细胞(ATCC)上的PSMA作为抗原来分析结合。20万个细胞/孔，一式两份，与50μl指定浓度的抗体等分试样一起孵育30分钟。清洗细胞两次，然后以1∶200稀释度、50μl/孔加入山羊抗人IgGPE标记抗体(Jackson ImmunoResearch)，在4℃下保持30分钟。在含1％BSA的PBS中清洗细胞两次并进行FACS分析。应用GraphPadPrism 3.0(GraphPad Software)从结合曲线中确定MAb结合LNCaP细胞上PSMA的EC₅₀值。在添加10％FBS、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的PRMI 1640培养基中培养细胞。在鸡管状腺细胞中产生的MAbF1的抗原结合特性与在CHO细胞中产生的MAbF1的抗原结合特性进行比较。这两种抗体制备物产生对在LNCaP细胞上表达的PSMA几乎相同的结合曲线并具有相似的EC₅₀值。数据证明尽管鸡源和CHO源的抗体有糖基化差异，但它们等效地识别和结合抗原。

实施例24：抗体内化分析

MAbF1结合PSMA导致抗体内化。在一个潜在应用中。MAb可以与细胞毒素偶联，从而靶向和破坏表达PSMA的肿瘤细胞。通过用MAb和Hum-Zap(Advanced Targeting Systems)与细胞一起孵育来确定与LNCaP细胞上PSMA结合之抗体的内化。HumZap是与核糖体失活蛋白-皂草毒蛋白(saporin)偶联的山羊抗-人IgG抗体。当MAbF1/Hum-Zap复合体结合细胞表面上的PSMA并被内化时细胞就被杀死，然而单独的抗体或者Hum-Zap对LNCaP细胞没有毒性。在150μl含300ng Hum-Zap和300ng F1MAb或者对照MAb的培养基中，一式三份，在37℃下孵育LNCaP细胞(10，000/孔)48小时。用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)确定细胞增殖和存活。还通过在4℃下将抗体的细胞培养基稀释液与10,000个贴壁LNCaP细胞/孔一起孵育2小时来进行内化分析。温和地移除抗体溶液并用150μl含200ng HumZap的培养基替换。在37℃下孵育48小时后，确定细胞存活性。用Prism 3.0(GraphPad Software)作图确定对于抗体内化的EC₅₀值。这两种抗体制备物的内化具有相似的效率。当在一定抗体浓度范围内进行检测时，鸡源和CHO源的MAbF1内化的EC₅₀值是0.49nM。

实施例25：MAb在BALB/c小鼠中的清除

通过静脉内注射放射性标记的抗体，平行分析鸡产生的MAbF1和CHO产生的抗体在BALB/c小鼠体内的半衰期。采用Iodobead方法(Pierce)用¹²⁵I轻微碘化处理(每个抗体少于1个I)10μg的MAb蛋白质。在试验之前，用溶有0.1mg/ml碘化钾的饮用水持续1周喂饲6周龄雌性BALB/c小鼠(Taconic Farms，Germantown，NY)。每种蛋白质用4只小鼠，将约600,000cpm的带标记MAb静脉注射入小鼠尾静脉中，并且用整体γ计数仪(具有Ludlum计数器的Wm.B.JohnsonNaI晶体检测器)在选定时间测量整体放射性。通过对残余放射性的指数回归分析来计算半衰期。由鸡管状腺细胞产生的MAbF1在清除时的半衰期(t_1/2)为102.4±0.9小时，而由CHO细胞产生的MAbF1清除得更慢，其半衰期为207.5±18.3小时。

实施例26：ADCC分析

用改进的⁵¹Cr ADCC分析检验LNCaP-C42B细胞。通过标准的Ficoll-paque分离法，从肝素化全血中纯化人外周血单个核细胞。细胞被重悬(1×10E6个细胞/mL)于含10％FBS和10U/ml人IL-2的RPMI1640培养基中并在37℃下孵育过夜。在第二天，收集细胞并在培养基中清洗一次并以2×10⁷个细胞/ml的浓度重悬。在1ml总体积中，2百万靶LNCaP-C42b细胞与200uCi ⁵¹Cr一起在37℃下孵育1小时。清洗靶细胞一次，并重悬于1ml培养基中，然后在37℃下再孵育30分钟。在最终的孵育之后，靶细胞被清洗一次并调至1×10⁵个细胞/ml的终体积。对于最终的ADCC分析来说，100μl标记的LNCaP细胞与50μl效应细胞和50μl抗体一起孵育。选择1∶100的最终靶∶效应比率。在所有研究中，用人IgG1亚型作对照并与CHO源抗-PSMA MAbF1抗体进行比较。所包括的其它对照有：a)靶细胞和效应细胞，但是没有抗体，b)靶细胞，没有效应细胞以及c)靶细胞和效应细胞，存在有3％TritonX-100。在37℃下孵育4小时之后，收集上清液并在具有240-400keV读值窗的γ计数仪(来自Packard Instruments的Cobra IIauto-gamma)上对其进行计数。每分钟的计数作为抗体浓度的函数进行绘图，并采用Prism软件(San Diego，CA)通过非线性回归，s形曲线剂量效应(可变斜率)来分析数据。根据以下等式确定裂解百分率：裂解％＝(样品CPM-无抗体CPM)/TritonX CPM-无抗体CPM)×100在所有研究中监测EC₅₀值和裂解％。例如，在比较两种抗体时可能在EC₅₀或裂解％方面之一有变化或者两者都有变化。

用以下的改进方法用抗-CD16抗体阻断ADCC。在缺少或者存在5μg/ml抗-CD16抗体3G8或同型对照抗体的情况下，将细胞与1或0.01μg/ml由CHO产生的或者由鸡产生的MAbF1抗体一起孵育。

CHO源MAb诱导剂量依赖性细胞裂解，其在38％裂解达到平台，与IL-2刺激的效应细胞一起EC₅₀值为0.11μg/ml。相比之下，鸡卵源的MAb具有更强且更有效。用所述抗体的两种不同制备物，鸡卵源MAb的最大裂解百分率是60％。还证明了其超过CHO源MAb的更强效能，因为该材料的EC₅₀值为0.018μg/ml。最后，正如所料，同型对照抗体不诱导细胞裂解。在未刺激的效应细胞(新鲜PBMC)的情况下，ADCC在EC50值上显示出更大的差异，但是总细胞杀伤更低。

CD16(FCgRIII)是介导ADCC的一种关键受体。通过使用抗CD16单克隆抗体阻断靶细胞和效应细胞的相互作用证明了ADCC应答的特异性。在此研究中，使用两种剂量的MAbF1抗体，这两种剂量为饱和剂量(1μg/ml)和亚最优剂量(0.01μg/ml)。1μg/ml的MAbF1抗体，在缺少抗-CD16抗体的情况下，CHO源的和鸡源的抗体分别诱导约15％和38％的裂解。在存在抗-CD16抗体的情况下此裂解百分率被降至～4％，而同型对照抗体没有作用。

实施例27：CD16结合

使用由Biacore提供的胺偶联试剂盒，经由伯胺将CHO和鸡源的MAbF1固定至Biacore传感器芯片(CM5)的羧甲基葡聚糖基质表面。这两种抗体被包被至密度约为10,000RU。通过在固定化抗体表面上流过几种浓度的蛋白质使这两种抗体与CD16-Phe和CD16-Val结合。通过研究空白表面和空白缓冲液结合循环可以解释非特异性结合作用。HBS-EP缓冲液被用于稀释并且作为工作缓冲液(running buffer)。在Biacore-3000仪器上，在25℃下实施该试验。用GraphPad Prism软件分析数据并将数据拟合至单结合位点模型上以评估平衡解离常数。

基于平衡结合试验而不是速率常数来评估解离常数，因为快速动力学是FcR结合抗体的特有性质。与相应的CHO源的抗体相比，鸡源抗体的解离常数K_D对于两种FcR都要低约10倍。鸡源抗体的较高亲和性可以归因于Fc区中的糖基化差异，尤其是由于缺少岩藻糖，其存在于CHO源的抗体中。

实施例28：治疗效用

本发明提供具有特异性确定糖基化模式和其它化学性质的抗体，并且其已经应用上述遗传修饰的鸡而生产出来。为了在靶组织中结合抗原特异性靶的目的而施用于患者时，这些特性就提供了治疗性质的改进。具体说，如上所述，对于某些临床适应症来说，所述抗体显示出抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)增强并且这种作用在某些临床适应症中提供了重要的益处。

非偶联(unconjugated)单克隆抗体(mAbs)用于治疗一些类型癌症的临床试验已经产生了令人鼓舞的结果。Dillman，1997，CancerBiother.&Radiopharm.12：223-225；Deo et al.，1997，ImmunologyToday 18：127。一种嵌合的、非偶联的IgG1已经获批用于治疗低级或者滤泡性B细胞非何杰金氏淋巴瘤(Dillman，1997，同上)，而另一种非偶联的mAb，一种靶向实体乳腺肿瘤的人源化IgG1在III期临床试验中也显示出有希望的结果。Deo et al.，1997，同上。这两种MAbs的抗原在它们各自的靶组织中高度表达。对于这些应用，尤其是在抗体通过ADCC介导强力肿瘤破坏时的肿瘤细胞中，本发明的抗体在施用给患者时就可以提供治疗优势。

对于治疗用途，本发明的抗体还可以功能性连接(例如，化学键合、遗传融合、非共价键结合等)至一种或多种其它分子实体，比如另一抗体(例如，为了产生双特异性或者多特异性抗体)、细胞毒素、细胞配体或者抗原(例如，为了产生免疫缀合物，比如免疫毒素)。本发明的抗体可以连接至其它治疗性结构，例如，放射性同位素，小分子抗癌药，消炎剂，细胞毒素或者免疫抑制剂。因此，本发明涵盖这些抗体组合物，其具有能通过鸡表达系统而实现之化学性质，并且与用于治疗目的的基本所有已知抗体缀合、连接和相关技术相结合。

因此，本发明的抗体可被用来治疗和/或预防涉及在对治疗敏感的靶组织中表达抗原之细胞的多种疾病，尤其是在靶组织中展示出ADCC机制时。可以治疗(例如改善)或者预防的疾病的实例包括，但不限于实体瘤、淋巴瘤、扩散瘤和所有类型的癌性组织。

在本发明的一个治疗实施方案中，将本发明的抗体施用给患者，尤其是根据通过表现出ADCC特性模式而对待治疗病况的诊断。在这样的临床条件下，施用本发明的抗体并在治疗之后确定治疗的细胞毒性作用以确定在靶组织中的ADCC作用。除了本发明的治疗组合物之外，患者还可以用化疗剂、辐射、或者调节例如增强或者抑制Fc受体表达或者活性的试剂比如细胞因子进行额外的治疗。典型地，在治疗期间施用的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。典型的治疗剂包括抗致瘤剂比如阿霉素、顺铂、博来霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥和环磷酰胺。

在另一方面中，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其包含本发明的鸡表达抗体的一种或者组合。本发明的组合物可以用本领域中许多公知方法给药。本领域的技术人员应当理解，给药的途径和/或模式将根据所期望的结果而变化。药物可接受载体包括无菌水溶液或者分散系，并且这些介质和试剂对于药物活性物质的应用在本领域中是已知的。可以通过在适当溶剂中掺入所需量的活性化合物以及一种成分或者成分组合，接着灭菌和/或微滤，来制备无菌注射溶液。一般来说，通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和任何其它成分的无菌载体中来制备分散系。

调整给药方案以提供最佳的期望ADCC作用。例如，可以使用单次推注，可以在一段时间内分几次给药剂量或者根据治疗情形的紧急情况按比例缩减或者增加剂量。特别有利的是，为了方便给药和统一剂量可以以剂量单位形式配制胃肠外组合物。如本文使用的剂量单位形式表示适用作单元剂量用于待治疗对象的物理分离的单位；每一单位包含预定量的活性化合物，经计算该量的活性化合物与需要的药物载体一起可以产生期望的治疗效果。对于本发明剂量单位形式的规格受以下因素控制并且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和期望达到的具体治疗效果，以及(b)配合这种活性化合物对于治疗个体中敏感性的内在限制。

在本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，从而获得对于特定患者、组合物和给药模式而言可有效实现期望治疗反应并且对患者没有毒性的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于许多药物动力学因素，包括本发明所用特定组合物的活性、给药途径、给药时间、正施用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病况、整体健康和先前病史，以及在医学领域中公知的其他因素。

因为本发明抗体的给药效果可以在靶组织比如肿瘤中客观地观察，所以本发明的治疗方法包括诊断需要治疗的患者，尤其包括采用ADCC治疗，鉴定期望治疗所作用的靶组织，给有此需要的患者施用本发明的组合物，以及测量患者中的治疗效果，比如通过确定ADCC在患者靶组织中的功效。通过分析靶组织特性随时间的变化，比如细胞死亡、靶组织的收缩、肿瘤大小的缩减以及在医学领域中已知的任何其它诊断技术来确定治疗效果。

还可以应用对于本领域技术人员可用的有关ADCC的许多任何公知模型来检验本发明抗体的ADCC活性。为了确定本发明抗体的治疗或者诊断用途的效用，可以独立地或者与其它哺乳动物、非哺乳动物、植物或者细菌细胞表达系统相比较来测量ADCC。因此，本发明的方法包括，通过使用本发明的抗体并与前述系统所产生的另一抗体直接或者间接地比较，确定它们在实现ADCC目标的效用方面的差异。具体地说，本发明的方法包括比较在上述鸡表达系统中所产生抗体的ADCC作用以鉴定ADCC增强从而鉴定对于鸡表达系统来说理想的候选抗体。

如上所述，为增强治疗效用，本发明的抗体可以与一种或者多种其它治疗剂例如细胞毒性剂、放射毒性剂或者免疫抑制剂一起给药。可以将抗体连接至所述试剂(作为免疫复合体)上或者与所述试剂分开给药。在后者情形中(分开给药)，可以在所述试剂之前、之后或者同时给药所述抗体，或者与其它已知治疗共同实施，例如，抗癌疗法，例如放疗。这样的治疗剂包括抗致瘤剂等，比如阿霉素、顺铂、博来霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥和环磷酰胺。本发明抗体与化疗剂的共给药提供了两种抗癌剂，它们通过对人肿瘤细胞产生细胞毒作用的不同机制来发挥作用。这样的共给药可以解决由于产生药物抗性或者由于肿瘤细胞产生抗原性变化使得它们对抗体没有反应性而引起的问题。

以下实施方案内容对应于原申请的权利要求书：

1.转基因鸡，其包含：

由遗传修饰的原始生殖细胞定居的种系组织，所述原始生殖细胞包含编码大于15kb大小的外源DNA的转基因。

2.实施方案1的转基因鸡，其中所述转基因被稳定地整合。

3.实施方案1的转基因鸡，其中所述外源DNA编码蛋白质。

4.实施方案3的转基因鸡，其中蛋白质是单克隆抗体。

5.实施方案1的转基因鸡，其中所述转基因包含人多核苷酸序列。

6.实施方案1的转基因鸡，其中所述外源DNA的侧翼有至少一个绝缘子。

7.实施方案1的转基因鸡，其中所述转基因包含选择标记。

8.实施方案1的转基因鸡，其中所述转基因包含ERNI启动子。

9.转基因鸡，其基因组包含转基因，所述转基因包含大于10kb的外源DNA。

10.实施方案7的转基因鸡，其中所述转基因被稳定地整合。

11.实施方案7的转基因鸡，其中所述外源DNA编码蛋白质。

12.实施方案7的转基因鸡，其中蛋白质是单克隆抗体。

13.实施方案7的转基因鸡，其中所述转基因包含人多核苷酸序列。

14.实施方案7的转基因鸡，其中所述外源DNA的侧翼有至少一个绝缘子。

15.实施方案1的转基因鸡，其中所述转基因包含选择标记。

16.实施方案1的转基因鸡，其中所述转基因包含ERNI启动子。

17.一种产生转基因鸡的方法，其包括：

将大于10kb的转基因掺入原始生殖细胞，

将该原始生殖细胞插入受体胚胎，

孵化转基因鸡。

18.实施方案17的方法，其中所述转基因被稳定地整合。

19.实施方案17的方法，其中所述外源DNA编码蛋白质。

20.实施方案17的方法，其中蛋白质是单克隆抗体。

21.实施方案17的方法，其中所述转基因包含人多核苷酸序列。

22.实施方案17的方法，其中所述外源DNA侧翼有至少一个绝缘子。

23.实施方案17的方法，其中所述转基因包含选择标记。

24.实施方案17的方法，其中所述转基因包含ERNI启动子。

25.鸡原始生殖细胞的克隆性来源细胞培养物，其中所述鸡原始生殖细胞携带有稳定整合于该原始生殖细胞基因组的外源DNA。

26.实施方案25的培养物，其中所述培养基包含来自布法罗大鼠肝(BRL)细胞的条件培养基。

27.实施方案25的培养物，其中所述培养基包含成纤维细胞生长因子(FGF)。

28.实施方案25的培养物，其中所述培养基包含干细胞因子。

29.实施方案25的培养物，其中所述培养基包含鸡血清。

30.实施方案25的培养物，其中所述培养物包含至少1×10⁵个细胞。

31.实施方案25的培养物，其中所述外源DNA侧翼有至少一个绝缘子。

32.种系嵌合体鸡，其包含：

由遗传修饰的原始生殖细胞定居的种系组织，以及

基本没有遗传修饰细胞的体细胞组织。

33.实施方案32的种系嵌合体，其中所述遗传修饰是稳定整合外源DNA。

34.实施方案33的种系嵌合体，其中所述外源DNA编码蛋白质。

35.实施方案34的种系嵌合体，其中蛋白质是单克隆抗体。

36.实施方案35的种系嵌合体，其中所述单克隆抗体具有人多核苷酸序列。

37.实施方案34的种系嵌合体，其中所述外源DNA侧翼有至少一个绝缘子。

38.原始生殖细胞，其包含稳定整合的转基因，该转基因具有可表达的神经诱导早期应答(ERNI)启动子，该启动子操作性地连接所述转基因的编码区。

Claims

1.一种产生转基因鸡的方法，其包括：

通过传代将阶段12-17鸡胚胎的全血培养在培养基中一段时间，所述时间足够所述全血中所含的原始生殖细胞在培养物中相对于其他鸡细胞更具优势地生长，所述培养基用布法罗大鼠肝(BRL)细胞条件化处理并且含有成纤维细胞生长因子(FGF)、干细胞因子、鸡血清、胎牛血清和STO细胞，由此产生能够定居于受体鸡胚胎种系的经培养的原始生殖细胞，其中所培养的能够定居于受体鸡胚胎种系的原始生殖细胞表达CVH和Dazl mRNA；

将大于10kb的转基因稳定掺入培养的原始生殖细胞的基因组中，

将所述原始生殖细胞插入12-17阶段受体鸡胚胎，以及

孵化转基因鸡。

2.权利要求1的方法，其中所述转基因包含大于10kb的外源DNA。

3.权利要求2的方法，其中所述外源DNA编码蛋白质。

4.权利要求3的方法，其中蛋白质是单克隆抗体。

5.权利要求1的方法，其中所述转基因包含人多核苷酸序列。

6.权利要求2的方法，其中所述外源DNA侧翼有至少一个绝缘子。

7.权利要求1的方法，其中所述转基因包含选择标记。

8.权利要求1的方法，其中所述转基因包含ERNI启动子。

9.权利要求1的方法，其中所述经培养的能够定居于受体鸡胚胎种系的原始生殖细胞维持圆形形态。

10.权利要求1的方法，其中所述经培养的能够定居于受体鸡胚胎种系的原始生殖细胞保持不贴壁。

11.权利要求1的方法，其中所述经培养的能够定居于受体鸡胚胎种系的原始生殖细胞当允许其贴壁并从所述培养物移除(FGF)、干细胞因子和鸡血清时产生胚胎生殖细胞。

12.权利要求1的方法，其中所述经培养的能够定居于受体鸡胚胎种系的原始生殖细胞表达端粒酶。

13.培养物，其包含至少1×10⁵个克隆性原始生殖细胞(PGC)，所述原始生殖细胞的基因组稳定包含并表达编码外源蛋白质的外源DNA序列，其中所述培养的PGC来源于12-17阶段鸡胚胎的全血，其中所述PGC的培养物已经在体外维持至少19天。

14.权利要求13的培养物，其中所述培养基包含来自布法罗大鼠肝(BRL)细胞的条件化培养基。

15.权利要求13的培养物，其中所述培养物包含成纤维细胞生长因子(FGF)。

16.权利要求13的培养物，其中所述培养物包含鸡血清。

17.权利要求13的培养物，其中所述外源DNA侧翼有至少一个绝缘子。

18.权利要求13的培养物，其中所述12-17阶段鸡胚胎的全血被培养至少40天、60天、80天或100天。

19.根据权利要求1产生的转基因鸡的后代。