CN101868144A - 具有失活的内源基因座的转基因鸡 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及自鸟类PGC长期培养物获得的转基因鸡，以及产生来源于长期PGC培养物的转基因鸟类的方法。在一些实施方案中，可以用基因构建体转染这些PGC，以修饰所述PGC的DNA，特别是引入编码外源蛋白质的转基因。当通过已知方法与宿主禽类胚胎结合时，这些修饰的PGC通过种系传递，产生转基因后代。本发明包括包含PGC长期培养物的组合物以及来自遗传修饰的PGC的后代。引入到PGC中以实现基因失活的遗传修饰还可包括但不仅限于将转基因随机整合进基因组，将转基因插入基因的启动子区中，将转基因插入到基因组的重复元件中，使用整合酶引入基因组位点特异性改变，通过同源重组引入基因组位点特异性改变，以及通过切除侧翼为lox位点的DNA或作为位点特异性重组的底物的其他序列而引入基因组的条件性突变。

Description

具有失活的内源基因座的转基因鸡
背景技术
转基因动物提供了在有价值药物产品(如抗体)的可持续生产中实现巨大进步的可能性。然而，转基因动物的产生还存在重大的技术障碍，这些障碍仅在少数物种中得以克服。需要若干不同技术才能将编码外源蛋白质的基因修饰整合进另一物种的DNA中，这些技术必须针对每个物种而进行开发。改变动物的遗传和物理特征的一种方法是将细胞引入动物的受体胚胎中。这些细胞能够对来自该受体胚胎之动物的组织有所贡献，并且能够对所得到动物之转基因后代的基因组有所贡献。
在某些情况下，所述细胞可以用包含编码外源产物(例如蛋白质或抗体)之DNA的转基因进行改造。转基因包含作为产生蛋白质之蓝本的DNA，并包含足够的编码和调节元件，以使蛋白质能在通过将细胞插入受体胚胎而产生的动物的组织中表达。在一些情况下，期望该表达是普遍性的，使得该表达在所有组织类型中发生。然而，在大多数需要有价值蛋白质的情况下，例如收集有价值的抗体情况下，表达必须限制在便于收集所表达蛋白质的某些特定组织类型中。例如，在奶牛中，蛋白质在奶中表达使蛋白质的收集简单易行，仅通过收集该奶牛的奶并分离该外源蛋白即可。在鸡中，卵白中大量产生抗体也为表达和收集有价值的蛋白质提供了有吸引力的载体。而且，当组织特异性表达特异性针对鸡的输卵管时，该表达产生具有某些特定的所期望化学特性的抗体，即用于人类患者的治疗时具有提高的抗体治疗效用。因此，在研究和商业开发中的一个特别吸引人的领域是经遗传改造的鸡，其在卵白或卵黄中选择性表达抗体，以便于分离和收集具有所期望化学特性的蛋白质。
就外源抗体的产生而言，鸟类生物系统提供了许多优点，包括高效的农场养殖、快速生长以及经济的生产。并且，鸟卵提供了理想的生物学设计，既可以大量地合成抗体，又易于分离和收集产物。另外，如下文的本发明内容所述，转基因鸡表达系统与诸如脊椎动物、植物或细菌细胞系统相比的优势已被充分证明，并且可用于对大量抗体产物产生独特的有利化学特性。科学家们追求产生转基因鸡这一目标已经有许多年了。尽管该目标已经在其他物种(例如小鼠、牛和猪)中实现，但是除了通过使用逆转录病毒技术或直接注射技术之外还未产生转基因鸡，而逆转录病毒技术或直接注射技术在可引入转基因动物DNA中的转基因大小和/或缺乏表达方面具有固有的局限性。另外，病毒载体不适用于需要对基因组进行位点特异性改变的应用，例如同源重组所提供的应用。
此外，在一些情况下，动物自身的内源基因可干扰有价值蛋白质的生产，所述蛋白质的生产是引入为表达这些蛋白质而特别设计的基因构建体所引起的。在这种情况下，理想的解决方案是使动物的内源基因失活。遗憾的是，由于遗传工程在鸡中的独特挑战，因此尚未描述过具有导致内源基因座失活的位点特异性修饰的转基因鸡。再者，位点特异性基因失活的引入产生缺乏内源性基因功能的动物，这样的动物可以与具有引入基因组中的互补特异性基因修饰的不同动物配种。例如，可建立缺乏特定基因的动物家族，并通过配种与含有特定人基因的动物相组合。在这种情况下，将产生这样的动物群，其既具有内源基因失活，又引入了用于产生特定动物表型或产生插入内源基因所编码蛋白质的基因组修饰。目前尚不存在这样的动物，这是因为病毒载体不允许对内源基因组进行位点特异性靶向，也没有对整合事件进行选择的能力。因此，病毒载体不提供可实现内源基因座活化的机制。
如果细胞培养物足够稳定，允许大转基因整合进细胞基因组或者允许将位点特异性改变引入基因组，那么可以根据靶细胞和用作转基因的特定构建体而通过多种不同技术将编码任何组织特异性表达蛋白质的转基因传递到转基因生物中。同样的技术可用于使具有失活的内源基因的生物体永续下去。可通过细胞杂交转移整个基因组，通过微细胞转移完整染色体，通过染色体介导的基因转移来转移亚染色体片段，以及通过DNA介导的基因转移来转移千碱基范围的DNA片段(Klobutcher，L.A.和F.H.Ruddle，Annu.Rev.Biochem.，50：533-554，1981)。可通过微细胞介导的染色体转移(microcell-mediated chromosome transfer，MMCT)来转移完整染色体(Fournier，R.E.和F.H.Ruddle，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74：319-323，1977)。任何这些携带外源基因或基因失活的转基因的具体设计还必须考虑外源基因的内容、任何基因失活的性质以及在动物中所得表型的特征。
除非该转基因被小心地设计，否则失活内源基因座或允许组织特异性表达的转基因的插入可能威胁到细胞的多能性。因此，合适的细胞系必须在培养物中稳定存在，并且必须在用遗传构建体转染该细胞时保持多能性，所述遗传构建体既大又复杂，足以使基因失活或者含有组织特异性高水平表达所需的所有元件。在所得转基因动物中，该转基因可任选地选择性表达于设计表达该转基因的特定个别组织类型中。根据转基因的基因内容，如果动物的存活力或者所得蛋白质的有利化学性质受到损害，那么该转基因可不在其他组织中表达。
已经用逆转录病毒载体在将鸡原始生殖细胞从11-15期胚胎中分离出来之后的数小时内对其进行了基因修饰(Vick等，(1993)Proc.R.Soc.Lond.B 251，179-182)。然而，所得修饰是随机整合的，并且所述转基因的大小一般限于小于约15kb，通常小于10kb，最常见小于8kb，无法使用这一技术产生基因组的位点特异性改变，也无法对转移的细胞进行选择以鉴定位点特异性修饰，从而排除随机整合。以前没有报道过需要将大于15kb的外源DNA插入到培养的鸟类PGC基因组中的稳定基因修饰。
对于可稳定引入到长期PGC细胞培养物中的DNA转基因或构建体的大小或位点特异性的任何限制是在培养物中PGC基因组中实现有价值基因修饰的关键性限制因素，继而也限制了可通过种系传递到受体胚胎后代的基因修饰的类型。例如，将失活载体或编码蛋白质的外源DNA序列引入转基因鸡的基因组中是非常期望的基因修饰。如果可以产生这样的转基因鸡群体，那么就可以在鸡中表达大量有价值的蛋白质并且从其卵中进行收集。鸟类的卵为生物活性蛋白质提供了理想的贮藏室，并且提供了可从其中分离蛋白质的便利环境。鸟类动物也是许多转基因技术的诱人候选。然而，将整套哺乳动物转基因技术应用到鸟类物种未曾获得成功，这是由于缺少可将基因修饰引入其中并传递到种系中的培养细胞群。在最近的论文中，Sang等人称：“PGC不太可能在培养中在鉴定基因靶向事件所需的长时间中维持并增殖，而不丧失其在转移后迁移到发育中的生殖腺的能力″Prospects for Transgenesis in the Chick，Mechanisms of Development，121，1179-1186，(2004)。因此，迄今为止，尚未产生经遗传转染的PGC，也未证明将引入鸟类PGC中的基因修饰传递到成熟的活体动物。
原始生殖细胞(primordial germ cell，PGC)是精子和卵的前体，在大多数动物中其在发育的早期与体细胞组织分离。根据本发明，分离、培养鸡PGC并对其进行基因修饰，而同时保持其定向分化为生殖细胞的能力。另外，诱导PGC分化为胚胎生殖细胞(embryonic germ cell，EGC)，其在定向分化为体细胞组织的能力上类似于鸡胚胎干细胞(ESC)。这些PGC定向分化为体细胞组织和生殖细胞，提供了对鸡的基因组进行基因修饰的独特资源。
转基因动物尤其是小鼠的产生对于阐明哺乳动物基因功能来说十分重要。传统方法是将转基因随机整合进基因组中或者通过同源重组将转基因靶向插入特定基因座中。
转基因的随机插入有两个缺点。第一个缺点(也是主要的缺点)是许多基因在不同发育阶段具有必需的功能，消除这些基因的转录常常导致胚胎死亡。使用赋予组织特异性和受发育调节之基因表达的启动子控制之下的位点特异性重组酶例如Cre-loxP或Flp-FRT可以避免胚胎死亡。在这些情况下，使用位点特异性重组在其他方面均正常的动物背景下在离散的细胞中和/或在发育过程中的离散时间点使基因失活(称为条件性基因修饰)。例如，Cre-loxP系统用于在β细胞中特异性失活胰岛素受体基因，以产生类似于II型糖尿病中的胰岛素分泌缺陷(Kulkarni等.1999Tissue-specific knockout of the insulin receptor in pancreatic beta cellscreates an insulin secretory defect similar to that in type 2 diabetes.Cell96：329-39)。最初，显示DNA聚合酶β的无效等位基因在纯合时是胚胎致死的。为了分析抗原受体基因排列的可能需求，使用条件性敲除方法来产生T细胞中的DNA聚合酶β缺陷(Gu等，1994，Deletion of a DNApolymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific genetargeting.Science 265：103-106)。
随机和靶向插入转基因都无法从转基因动物的转基因中切除阳性选择盒。选择盒的存在可导致许多问题，比如由于通常存在于选择盒中的强转录调节元件而导致临近基因座之基因的表达被破坏(Lerner等1993 CD3zeta/eta/theta locus is colinear with and transcribed antisense to the geneencoding the transcription factor Oct-1.J Immunol.151：3152-62；Ohno等1994 Targeted disruption of the CD3 eta locus causes high lethality in mice：modulation of Oct-1 transcription on the opposite strand.EMBO J.13：1157-65)。可通过使用组织特异性启动子控制下的位点特异性重组酶来去除阳性选择盒。
Cre是催化两个loxP位点之间发生重组(34个碱基对的DNA元件)的重组酶。当两个loxP位点以相同方向整合进基因组时，Cre催化的重组将其间的DNA切除。可在转基因随机插入到基因组中之前将loxP位点整合到转基因中，或者可使用靶向载体将loxP位点插入到基因组的精确位置。在切除间插DNA之后，侧翼的loxP位点被转化为单个loxP位点。有突变的loxP位点可供使用，其产生在Cre切除后不易被识别的产物。Flp重组酶(位点特异性重组酶的λ整合酶超家族的另一个成员)具有与Cre重组酶相同的DNA重组机制。类似于Cre，Flp重组酶在两个确定的34碱基对靶标位点(FRT位点)处使DNA重组。在切除间插DNA之后，侧翼的FRT位点也被转化为单个FRT位点。
条件性敲除的用途之一是在精确的发育阶段对特定组织中被切除的细胞中的致死产物进行表达。例如，Grieshammer等(1998Muscle-specificcell ablation conditional upon Cre-mediated DNA recombination intransgenic mice leads to massive spinal and cranial motoneuron loss.DevBiol.197：234-47)使用Cre-loxP系统在肌细胞中特异性表达白喉毒素A片段，以研究小鼠中的骨骼肌发育。也已开发出Cre的配体调节形式，目的是增加对Cre-loxP系统的时序控制，以允许在胚胎发生的晚期和/或成体组织中在体外或体内精确地诱导遗传变化。
染色体重排是遗传性疾病和胎儿死亡的主要原因，并已将其与癌症的发展和维持相关联(Ramirez-Solis等1995Chromosome engineering inmice.Nature 378：720-4；Rabbitts等2001 Mouse models of humanchromosomal translocations and approaches to cancer therapy.Blood CellsMol Dis.27：249-59)。染色体易位经常导致异常的基因融合，因此，肿瘤特异性mRNA和蛋白质成为基因治疗的诱人靶标。所以，通过使用位点特异性重组酶改造具有特异性断点的染色体重排的能力已用于制备人类疾病的小鼠模型。例如，已经在小鼠中成功地诱导了对应于人重排t(8：21)(q22；q22)和t(9：11)(p22q23)的易位(Buchholz等2000Alteration ofCre recombinase site specificity by substrate-linked protein evolution.NatBiotechnol.19：1047-52；Collins等2000Inter-chromosomal recombinationof Mil and Af9 genes mediated by cre-loxP in mouse development.EMBORep.l：127-32)以建立急性白血病模型。可通过在基因组的随机位置插入loxP位点然后表达Cre重组酶来产生随机染色体缺失(Zhu等2007.Efficient generation of random chromosome deletions，Biotechniques 42，572-575)。
条件性修饰已经是在对细胞谱系的描述中操纵基因表达的有效工具，对细胞命运的分析有助于了解正常的发育。Cre-loxP系统已用于在小鼠中在遗传上活化谱系示踪物，例如用于确定来源于中脑-后脑缩窄(midbrain-hindbrain constriction)的表达EN-2(engrailed 2)之细胞的成体命运(Zinyk等1998Fate mapping of the mouse midbrain-hindbrainconstriction using a site-specific recombination system.Curr Biol.8：665-8)。该方法包括相互杂交的两个小鼠品系。一种Cre重组酶小鼠，其表达En-2基因组调节片段控制下的Cre，所述调节片段指导在胚胎的中脑-后脑缩窄区域进行表达，还有指示物/报告物小鼠，其带有“指示”重组发生的转基因，并且通过将其转变为可遗传谱系标志物来提供对该事件的永久记录。该指示物谱系具有由来自广泛表达的鸡β肌动蛋白基因的调节序列驱动的loxP-转录/翻译终止-loxP-终止盒。在En2-Cre小鼠和指示物小鼠杂交后，双转基因小鼠携带有每个转基因的一个拷贝。仅有表达En2调节元件控制下的Cre的细胞发生报告构建体的loxP之间的重组，切除终止子并允许lacZ表达。由于Cre介导的切除是可在细胞中遗传的，所以带有标志物的细胞及其所有后代均在后期表达lacZ，甚至在Cre不再表达之后也是如此。因此，成年双转基因动物脑中的lacZ的染色显示出在发育过程中在中脑-后脑缩窄中瞬时表达Cre的所有细胞的后代。
发明简述
本发明包括转基因鸡和实现转基因鸟类遗传工程的技术，还包括用于产生带有失活内源基因座的转基因鸡的PGC长期培养物，所述转基因鸡通过将靶向构建体同源整合进原始生殖细胞而产生。这些转基因鸡具有通过同源重组整合到鸡原始生殖细胞基因组中的转基因，其导致由于内源基因座中至少一部分缺失所引起的基因失活。本发明包括转基因构建体，带有转基因(有时称为敲除载体、靶向载体、敲除构建体等等)的原始生殖细胞稳定培养物，其中将设计用于内源基因失活的转基因稳定整合入在培养物中维持的原始生殖细胞的基因组中达足够时间，以实现重组事件，并选择转染细胞。
本发明还包括原始生殖细胞和所得转基因鸡，其基因组已经通过失活内源基因座而被修饰，包括但不限于对内源基因表达所需基因一部分进行位点特异性缺失。对于所有上述实施方案，本发明还包括对内源基因组位点进行特异性修饰而产生的转基因鸡。本发明还涉及在鸡中产生的抗体，其具有在某些应用中提高其治疗效用的有利化学特性。在鸡中产生的抗体与在脊椎动物、植物或细菌细胞系统中产生的抗体相比具有独特的化学修饰模式，从而在以将毒素结合至靶组织(如肿瘤)为目的而向患者给药时，以提高的治疗效用治疗靶组织。在一个实施方案中，用特殊设计的遗传构建体改造PCG的长期培养物，从而向鸟类中引入基因修饰，包括插入获得外源蛋白质组织特异性表达的转基因。通过对同样的多能细胞中失活的基因座进行改造，或者通过对带有失活内源基因座的离散转基因鸡群体进行改造，随后与带有利于外源蛋白质表达的插入转基因鸟类进行配种，带有编码蛋白质表达的外源DNA组合的转基因鸟类与带有失活内源基因座的转基因鸡相组合，提供了表达外源蛋白质的独特而有利的动物群体。
带有失活内源基因座的转基因鸡还提供了对于研究基因表达和选择独特基因功能而言有价值的动物模型，这在所选内源基因座不能失活的情况下是不可能的。类似地，可以在内源免疫球蛋白基因座的特定部分(包括V、D或J区)进行内源性鸡基因座失活，从而破坏免疫球蛋白基因重排并使内源抗体表达失活。因此，本发明的一个实施方案包括基本上缺乏内源免疫球蛋白基因表达和内源免疫球蛋白的蛋白质产生的转基因鸡，其是由于对内源鸡免疫球蛋白基因座中选定部分进行位点特异性基因修饰而产生的。在一个优选实施方案中，将转基因构建成使编码内源免疫球蛋白产生的轻链和重链进行靶向失活。本发明的转基因鸟类还可在输卵管中表达转基因来源的抗体，并且在卵中累积大量抗体。在一些优选的实施方案中，外源抗体蛋白由在缺乏内源抗体产生之背景下表达的人DNA序列编码，以使在不产生内源鸟类抗体的情况下在鸡的输卵管中表达天然人抗体，由此获得从卵中仅收集人抗体的能力。
本发明包括表现出抗体组织特异性表达的鸟类种群、赋予外源抗体表达的转基因构建体、在鸡中产生且具有特定化学特性的分离的抗体组合物，以及产生所述鸟类、产生所述抗体及其在人类中治疗用途的相关方法。本发明使用长期原细胞培养物(primordial cell culture)和特殊技术产生来自长期PGC细胞培养物的嵌合或转基因鸟类，其中所述PGC的基因组中具有稳定整合的表达外源蛋白的转基因，从而该培养细胞的后代中含有该稳定整合的转基因。当通过下文所述方案引入宿主鸟类胚胎时，修饰的供体细胞产生在所得动物中特定的选定体细胞组织中表达该转基因的鸟类。
本发明还包括在转基因鸡中表达的并且与脊椎动物、植物或者细菌细胞系统相比具有某些期望化学特性的外源蛋白质的组合物。具体说，这些蛋白质(尤其是抗体)含有更低浓度的岩藻糖、半乳糖、N-乙酰神经氨酸、N-乙醇酰基神经氨酸以及更高浓度的甘露糖。当将具有一些或所有这些特性的抗体对人给药时，它们表现出增强的治疗效用。具体来说，这些抗体组合物表现出增强的抗体依赖性细胞毒效应(ADCC)。因此，本发明的方法包括，通过在转基因鸡中表达抗体而应用转基因鸡来增加抗体组合物基于ADCC作用的治疗效用。
本发明还包括在输卵管组织中表达外源抗体的转基因鸡，该外源抗体具有本文所定义的有利化学特性，使得外源抗体以确定的量富集于卵白中。在一个优选实施方案中，所述外源蛋白质是由整合进转基因鸟基因组的转基因构建体所编码的人序列单克隆抗体。编码该人单克隆抗体的多核苷酸序列包含在专门构建用于在输卵管中表达的转基因中，该转基因还包含合适的启动子和调节序列以有利于组织特异性表达。
本发明还涉及鸟类原始生殖细胞(avian primordial germ cell，PGC)的长期培养物以及能够通过产生长期培养物而实现的另外几项发明，在其中鸟PGC增殖并且其中PGC培养物可通过多次传代而扩充，从而延长培养物的存活超过40天、60天、80天、100天或更长。本发明的PGC在长期培养物中增殖并且当其被注射入受体胚时产生种系嵌合体(germline chimera)。
本发明还涉及将遗传物质引入PGC基因组中以获得所需结局。在一个实施方案中，将周围为HS4元件的遗传构建体整合进本发明的PGC中，以确保转基因产物的产生。在另一个实施方案中，使用整合酶进行基因修饰，以指导构建体插入到鸡基因组的重复元件中。在另一个实施方案中，将编码选择标记的DNA插入鸡基因组的区域中，以阻止基因产物的产生。
已经在鸡细胞中获得了条件性突变，但是与已经制备出表达Cre的转基因品系的小鼠不同，尚未制备出表达普遍、组织特异性或发育调节启动子控制下的Cre重组酶的转基因鸡品系。在小鼠细胞中，Cre重组酶的瞬时表达(Araki等1997 Efficiency of recombination by Cre transientexpression in embryonic stem cells：comparison of various promoters.JBiochem 122：977-82)和可穿透细胞的Cre重组酶的表达(Jo等2001Epigenetic regulation of gene structure and function with a cell-permeableCre recombinase.Nat Biotechnol.19：92933)已用于切割loxP位点之间的DNA。但是，在鸡DT40细胞系中，Cre重组酶的瞬时表达无法去除loxP位点之间的DNA(Fukagawa等1999The chicken HPRT gene：a counterselectable marker for the DT40 cell line.Nucleic Acids Research 27，1966-1969)。因此，将Cre转基因整合入DT40细胞的基因组，以切割loxP和/或突变loxP位点之间的DNA序列(Fukagawa等1999The chickenHPRT gene：a counter selectable marker for the DT40 cell line.NucleicAcids Research 27，1966-1969；Arakawa等2001 Mutant loxP vectors forselectable marker recycle and conditional knockouts BMC biotechnology 1，7-14；Dhar等2001 DNA repair studies：experimental evidence in supportof chicken DT40 cell line as a unique model.J.Environ Pathol ToxicolOncol 20，273-83；Kanayama等，2005 Reversible switching ofimmunoglobulin hypermutation machinery in a chicken B cell line.Biochem.Biophys.Res.Commun.327，70-75)。
在鸡中产生条件性突变的能力是有利的。例如，有可能使用遍在启动子(ubiquitous promoter)控制下的凋亡诱导基因来产生基本上来源于胚胎干细胞的鸡，所述遍在启动子由于存在侧翼为loxP位点的终止密码子而被抑制。当此品系的鸡与带有在明区中表达之启动子控制下的Cre重组酶编码基因的鸡品系杂交时，胚胎不会发育。如果于凋亡诱导基因表达的同时将胚胎干细胞注射进胚胎中，则该胚胎可以基本上来源于胚胎干细胞。
在另一项应用中，含有编码选择标记之序列的转基因的侧翼可以是loxP位点。带有这些转基因的转基因鸟类可以与表达Cre重组酶的鸟类杂交，所述Cre重组酶受在谱系中表达的启动子控制。在切除选择标记之后，会孵化出此杂交所产生的鸟类。
附图说明
图1A：在培养物中维持54天的PGC。注意细胞未贴壁并且保持圆形。箭头所指是在该培养物中可见的几个分裂细胞。
图1B：在培养物中维持至少136天时显示稳定的PGC。这些细胞培养在经照射的STO细胞的饲养层上。
图2：根据生殖细胞标记物CVH(Vasa)和Dazl的RT-PCR而确定的基因表达。将细胞培养32天。泳道1显示在PGC等分试样中CVH和Dazl的表达。如缺少肌动蛋白所确定的，泳道2中的第二样品没有足够的mRNA。也分析了CES细胞；表达肌动蛋白但是cES细胞不表达CVH，而且仅弱表达Dazl。
图3：对维持培养166天的13号及16号PGC培养物样品进行Western分析。使用睾丸作为阳性对照，肝作为阴性对照。应用兔抗鸡CVH IgG作为第一抗体。
图4：端粒重复序列扩增方案(Telomeric Repeat AmplificationProtocol，TRAP)分析。将两种不同PGC细胞系(13号和16号)的不同稀释度的细胞提取物维持培养146天。阳性对照由转化的人肾细胞系293组成，阴性对照仅是裂解缓冲液而未添加模板。在PGC和阳性对照的泳道中，重复序列是可见的，这指示端粒酶的存在。
图5A：源于维持培养的PGC的cEG细胞。5B：鸡胚胎干细胞。注意两种细胞类型中的小细胞，其具有大细胞核(浅灰色)和明显的核仁。
图6：原始生殖细胞(PGC)系中cx-neo转基因的Southern分析。
图7：DT40细胞(阴性对照细胞群)、EG细胞、ES细胞和PGC的FACS分析，用抗鸡vasa同源物(CVH)和1B3的抗体染色。DT40、ES和EG细胞对这两种标志物都是阴性，而大多数PGC的CVH和1B3染色均为阳性。所用的细胞系是PGC 102、ES 439和EG 455。
图8：两种原始生殖细胞PGC系中HS4-β-肌动蛋白-neo转基因的Southern分析。
图9：原始生殖细胞(PGC)系TP 103中HS4β-肌动蛋白-eGFP-β-肌动蛋白-puro转基因的Southern分析。用NotI将质粒对照DNA线性化。用KpnI消化DNA，以释放内部片段。在TP 103和所述质粒中都释放出相同大小的片段。用NcoI、MfeI和SphI消化TP 103的基因组DNA应显示出大于消化质粒DNA所对应泳道的条带。在MfeI消化的TP 103基因组DNA的泳道中未见条带，这可能是由于条带太大。在代表NcoI和SphI消化的泳道中，TP 103基因组DNA释放出片段，其显著大于质粒DNA中释放的片段，表明转基因已整合入TP 103细胞系的基因组中。
图10：G-09核型分析显示所有染色体均为二倍体。在GGA 2的一个拷贝中，大多数p臂丢失或易位至另一染色体。CGA 2的另一个拷贝是正常的。细胞为ZZ(雄性)。
图11：用DAPI染色的发育第18天的睾丸切片。GFP阳性生殖细胞在生精小管中清晰可见。
图12：DAPI染色的图显示E18睾丸生精小管的切片。表达GFP的细胞位于生精小管内，并被抗CVH抗体所染色。
图13：发育到X期(EG&K)至34期(H&H)的转基因后代，其来自于带有稳定转染有β-肌动蛋白-GFP转基因之PGC的嵌合体。这些照片中所有的组织均显示GFP的表达。
图14.来自于稳定转染有β-肌动蛋白-GFP转基因之PGC的嵌合体的组织，其是为组织学检查而制备的。蓝色DAPI染色显示细胞核的存在，绿色荧光表明所有的组织均表达GFP转基因。
图15：Southern印迹分析显示，克隆衍生的转染PGC系可在嵌合鸡中对谱系作出贡献并分化为EG细胞。上图：用限制性酶对以下进行消化以检测转基因插入物的内部片段(KpnI)和连接片段(NcoI、AflII)：来自转染了HS4b肌动蛋白-eGFP-b肌动蛋白-puro构建体的PGC的基因组DNA、来源于转染PGC所产生嵌合公鸡的三个胚胎、来源于转染PGC的EG细胞。在0.7％琼脂糖凝胶上分离经消化的DNA，转印到尼龙膜，用放射性标记的eGFP序列探针进行检测。PGC、EG细胞和显示绿色荧光的两个胚胎(GFP+胚胎)中杂交片段的大小相同。第三个无荧光胚胎(WT胚胎)显示无杂交。下图：显示了构建体示意图，其中示出限制性位点的位置，其下显示预计限制性片段的大小。有两个KpnI位点，得到5.3kb的片段。NcoI和AflII在所述构建体中切割一次，于是观察到的限制性片段是在插入位点将所述构建体与侧翼基因组DNA相连的连接片段。
图16A.用于本研究的随机整合构建体的示意图。使用两种基本类型的构建体：强启动子驱动的选择标记盒(抗药性标记和EGFP)，以及侧翼是两组HS4隔离区的类似构建体。所用的启动子是小鼠PGK、鸡β-肌动蛋白、β-肌动蛋白加CMV增强子(CAG)或ERNI。所述构建体如下：由驱动neo或puro抗性基因表达的启动子组成的药物选择标记盒(最上面一项)；加入的CAG-EGFP基因(第二项)；仅有被隔离的药物选择标记(第三项)；添加了EGFP基因的相同的被隔离选择标记盒(第四项)；和CAG-EGFP CAG-neo构建体，其在所述选择标记和专有目的基因的侧翼具有loxP位点(加星号的框)。用NotI对所述构建体进行线性化，然后转染，得到所示的载体结构。
图16B.用于本研究的整合酶构建体的示意图。左边是含有attB的质粒，其中将attB位点加入到上述HS4-β-肌动蛋白-puro构建体中。右边是用于通过CAG启动子在细胞中表达整合酶的质粒。两种质粒均以环形DNA的形式转染。
图17.将attB与从转染的PGC获得的attL序列进行比对。显示了来源于整合酶介导转染的attB质粒与PGC克隆中基因组序列之间的连接。最上面一项是野生型attB位点，其具有下划线显示的通常作为重组交叉点的核心TTG。下面显示的是来自PGC中整合酶介导插入的attL序列。为了确定质粒上attB和基因组中假attP位点之间的剪接发生在何处，将PGC序列与attB进行比较。在PGC序列中，所述质粒提供的attB序列为小写，基因组假attP序列为大写粗体。
图18A.将来自PGC插入位点的PO41样重复与PO41共有序列进行比对。将插入到PO41样重复中的来自所有克隆的PGC侧翼序列彼此进行比对，并与PO41共有序列进行比对。前21个核苷酸是所述载体提供的attB序列(如比对上方所示)，然后是来自各个克隆的基因组侧翼序列。被至少一半序列所共有的核苷酸以黑色框显示。B.attP与PO41序列的比对。将attP位点的100bp与PO41的100bp(或41bp重复的大致2.5个拷贝)进行比对。attP中的核心交叉TTG以上划线显示。
图19.对鸡IgL基因的靶向。
图20A.第一项是用于鸡IgL基因的靶向载体IgL pKO5的示意图。其被设计成用侧翼为HS4隔离区的3.1kb HS4-ERNI-puro选择标记取代IgL基因的2.3kb J-C区域。两条同源臂长度为2.3和6.3kb。3′端的β-肌动蛋白-EGFP基因允许通过绿色荧光筛选puro抗性克隆，以富集被靶向的克隆。末端的虚线是pKO载体骨架(Stratagene)。中间项是IgL基因种系构型野生型等位基因的示意图，其具有单个可变区(V)、连接区(J)和恒定区(C)基因。显示了用于对靶向克隆进行Southern分析的限制性位点(S，SacI；B，BstEII)，在下方用双箭头显示野生型片段大小。下面一项是突变等位基因的结构，其中J区和C区缺失，被HS4-ERNI-puro所代替。显示了限制性图谱，下方显示了突变体片段大小。用于Southern分析的探针都在靶向载体的外部，并显示出它们的位置。比例尺＝1kb。
图20B.4个克隆的Southern印迹分析。分析了四个嘌呤霉素抗性克隆，其中两个不是绿色的(克隆1和2)，两个是绿色的(克隆3和4)。左图中，用SacI消化来自PGC克隆的基因组DNA，与探针A杂交，以分析对IgL基因5′侧的靶向。右图中，用BstEII消化DNA，与探针B杂交，用于对对IgL基因3′侧的靶向。克隆2显示杂合靶向克隆的预计大小片段。
图21.ERNI-puro的PCR，其为带有IgL敲除的PGC所产生的G0公鸡的精液中免疫球蛋白轻链基因失活的标志物。将从精液样品制备的10纳克基因组DNA用于对IgL敲除等位基因中所存在ERNI-puro选择标记进行的PCR。包括内源鸡β-肌动蛋白基因的引物，作为对照。使用具有IgL敲除等位基因的PGC作为ERNI-puro PCR的阳性对照。
图22：BN鸟中的ALDH3A2表达。上图显示用分离自两只纯合BN鸟(BN/BN)、一只杂合BN鸟(BN/+)和一只野生型鸟(+/+)的RNA进行的针对ALDH3A2的RT-PCR。另外，显示了RT反应的阴性对照(-RT对照)、阳性基因组对照和用于PCR反应的两个阴性对照(-PCR对照)。544bp和680bp条带分别显示存在在外显子5和6之间不带有和带有未剪接内含子的醛脱氢酶mRNA。下图中的597bp条带证实所有样品中RNA的存在。RT-PCR显示ADH在杂合BN鸟中表达，而不在纯合BN鸟中表达，表明转基因的插入终止了该基因的转录。
图23.来自醛脱氢酶3家族成员A2转录本野生型等位基因的RT-PCR产物的序列。产物A和B分别来自于在外显子5和6之间没有和有136bp未剪接内含子的转录本。
图24：带有UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper转基因的鸡。A.3个UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper转基因品系的Southern印迹分析(6-03，6-51和9-51)。使用SpHI或BclI消化来自G1鸟的基因组DNA样品和UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper载体。在0.7％琼脂糖凝胶上分离消化的DNA，转印到尼龙膜上，用放射性标记的Reaper特异性探针杂交，以鉴定连接片段。基因组DNA的杂交片段大小大于载体，表明所述转基因已整合。B.UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper构建体的示意图。该转基因由UbC-启动子和loxP-终止子-loxP-Reaper转基因组成。将SV40多腺苷酸化信号(SV40)和杀稻瘟菌素抗性盒(bsd)插入到UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper转基因的3′端。该构建体侧翼是5′和3′LTR。标出了限制性位点的位置并显示了预计限制性片段的大小。
图25：带有pLenti-ERNI-Cre转基因的鸡，A.8个ERNI-Cre品系的Southern印迹分析。用BglII消化基因组DNA样品。在0.7％琼脂糖凝胶上分离所消化的DNA，转印到尼龙膜，用放射性标记的Cre探针进行检测。如预计地，杂交片段大小为4.6kb。B.ERNI-Cre转基因的示意图。该转基因由ERNI启动子和Cre转基因组成。将SV40多腺苷酸化信号(SV40)和杀稻瘟菌素抗性盒(bsd)插入到ERNI-Cre转基因的3′端。该构建体的侧翼是5′和3′LTR。标出了BglII限制性位点的位置并显示预期的限制性片段大小。
图26：来自Doc-2细胞系的GFP阳性细胞和GFP阴性细胞的FACS分选。通过用含有ERNI-Cre转基因的环形质粒转染Doc-2细胞系而产生两类细胞，所述转基因在PGC中表达Cre重组酶。GFP阴性细胞是带有CX-eGFP基因的停泊位点载体上的LoxP位点之间序列被切除的结果。
图27：显示10652bp转基因整合进Doc-1品系的PGC和鸡的两只鸡的Southern分析。用BglII或EcoRI消化来自DOC1PGC品系的基因组DNA(标记为P的泳道)和DOC1 PGC所产生的G0嵌合体进行配种得到的两只鸡(标记为C1和C2的泳道)。在琼脂糖凝胶上分离消化产物，转移到尼龙膜，用放射性标记的EGFP序列进行杂交。该分析检测到了含有停泊位点载体的连接片段，其与载体整合位点的侧翼基因组序列相连接。这些连接片段的大小根据整合位点的不同而不同，对于PGC中每个转基因插入事件来说具有特征性。在这种情况下，BglII片段大约12kb，EcoRI片段大于12kb。PGC中的片段大小与来源于它们的鸡中相同，表明这些鸡来自于带有DOC1插入的PGC。
图28：在10个不同的pLenti-ERNI-Cre转基因鸡品系中进行的针对Reaper转基因Cre介导重组的Southern印迹测定。A.对从来自双转基因胚胎的脑(b)和肌肉(m)中分离的DNA进行Southern印迹分析，所述胚胎带有一个拷贝的Cre转基因和一个拷贝的loxP转基因。用SacI消化基因组DNA样品。在0.7％琼脂糖凝胶上分离消化后的DNA，转印到尼龙膜，与由Reaper基因和一部分慢病毒载体骨架(杀稻瘟菌素基因和SV40序列)组成的探针杂交。该探针与全长和重组loxP-Reaper转基因同等杂交。全长(非重组)和重组转基因的条带强度比值代表了Cre品系的活性。B.Cre介导的loxP-Reaper转基因重组的示意图。全长loxP-Reaper转基因含有1.4kb序列，称为终止子盒，其侧翼是方向相同的loxP位点。两个loxP位点之间的重组导致所述1.4kb间插序列从染色体上被切除，留下单个loxP位点。切除之后，重组loxP-Reaper转基因的大小减少1.4kb。标出了探针和SacI限制性位点的位置并显示了预计的限制性片段大小。
图29：通过Cre4品系进行的三个不同Reaper loxP盒转基因的重组(6-03、6-51和9-51)。A：对于三个不同loxP-Reaper品系(6-03、6-51和9-51)，仅带有一个拷贝loxP-Reaper转基因的转基因胚胎(R)或者带有一个拷贝Cre4转基因和一个拷贝loxP-Reaper转基因的双转基因胚胎(C+R)的Southern印迹分析。用SacI消化基因组DNA样品。在0.7％琼脂糖凝胶上分离消化后的DNA，转印到尼龙膜，与由Reaper基因和一部分慢病毒载体骨架(杀稻瘟菌素基因和SV40序列)组成的放射性标记探针杂交。如预计地，全长(非重组)loxP-Reaper片段的杂交片段的大小是2.8kb，重组loxP-Reaper片段则为1.4kb。B：Cre介导的loxP-Reaper转基因重组的示意图。全长loxP-Reaper转基因含有1.4kb的序列，称为终止子盒，其侧翼是方向相同的loxP位点。两个loxP位点之间的重组导致所述1.4kb间插序列从染色体上被切除，留下单个loxP位点。切除之后，重组loxP-Reaper转基因的大小减少1.4kb。标出了探针和SacI限制性位点的位置并显示了预计的限制性片段大小。
图30：未切除的GFP阳性Doc2细胞系(泳道1)和cx-GFP-cx-neo序列已缺失的Doc2细胞(泳道2)的Southern分析。通过FACS分析根据绿色荧光的表达对细胞进行分选。制备来自两个细胞群体的基因组DNA，用HindIII限制性内切酶消化，将DNA与来自嘌呤霉素抗性基因的放射性标记序列杂交。GFP阳性(未切除细胞)细胞中存在5521bp的预计片段，切除的细胞中存在1262bp的预计片段。该结果表明，Cre-lox重组导致整合到DOC2细胞中的停泊位点构建体中位于两个loxP位点之间的CX-EGFP-CX-neo序列缺失。
图31：IgL pKO5B靶向载体示意图。最上面一项显示靶向载体IgLpKO5B的结构。该项显示包括loxP和attP位点的5′同源区以及3′同源区的载体结构。第二项显示靶向载体与鸡野生型IgL等位基因的关系。第三项显示J基因和C基因的缺失或基因破坏所产生的突变体等位基因。
图32：Southern印迹分析，其显示KO-07敲除克隆中的IgL基因座缺失。左图：当用SacI消化来自用IgL pK05B转染的5个克隆PGC系的DNA并用0.5kb SacI-BstEII片段探针检测时，所得5′同源区的杂交。野生型IgL基因座约为10kb，具有靶向缺失的突变体片段约为4kb。右图：使用来自相同的5个克隆的DNA所得的3′同源区杂交。用BstEII消化基因组DNA，与3′1.7kb NsiI-MfeI片段杂交，该片段也在靶向载体外部。
图33：Southern印迹分析，其显示IgL敲除被传递到7个鸡胚胎中的5个(胚胎2、3、4、6和7)。胚胎1和5是野生型胚胎，其从杂合的靶向KO-07敲除PGC中遗传了野生型IgL等位基因。
发明详述
本文所用的术语“鸡胚胎干细胞(cES cell)”表示这样的细胞，其表现出ES细胞的形态，并且其对源于X期(E-G&K)胚胎明区(areapellucida)(大致相当于小鼠胚泡)的受体胚胎中的体细胞组织作出贡献。CES细胞与小鼠ES细胞共有几种体外特征比如SSEA-1+、EMA-1+和端粒酶+。ES细胞具有定居(colonized)于所有体细胞组织的能力。
本文所用的术语“原始生殖细胞(PGC)”表示这样的细胞，其表现出PGC的形态，并且其完全贡献给受体胚胎的种系，PGC可以来源于采自12-17期(H&H)胚胎的全血。PGC表型可通过以下方法来确立：(1)种系特异性基因CVH和Dazl在该细胞系中强烈转录，(2)所述细胞强烈表达CVH蛋白质，(3)当把所述细胞注入X期而非12-17期(H&H)的受体胚胎时，所述细胞并不对体细胞组织有贡献，(4)所述细胞产生EG细胞(见下)，或者(5)当把所述细胞注入12-17期(H&H)的胚胎时，所述细胞经种系传递PGC基因型(Tajima等(1993)Theriogenology 40，509-519；Naito等，(1994)Mol.Reprod.Dev.，39，153-161；Naito等，(1999)J Reprod.Fert.117，291-298)。
本文所用的术语“鸡胚胎生殖(cEG)细胞”表示源于PGC并且在功能上与鼠EG细胞类似的细胞。cEG细胞的形态与cES细胞相似并且当cEG细胞注入X期(E-G&K)受体时其对体细胞组织有贡献。
本文使用的术语“转基因体(transgenic)”指在其体细胞和生殖细胞中编码转基因并能够将该转基因赋予的性状传递给后代的动物。术语“转基因体”也指含有内源基因座中选定的特异性基因失活位点的动物，包括但不限于内源基因座中确定的基因片段的缺失，其利用整合进原始生殖细胞基因组中的转基因或靶向构建体来实现，所述转基因或靶向构建体通过基因序列的缺失、功能性破坏、插入终止密码子或无义序列、attP位点或其他通过位点特异性基因修饰产生基因座功能性失活的人工产物而导致基因失活。因为现有的逆转录病毒技术不允许进行位点特异性修饰和对转化细胞进行选择，也不具有维持PGC细胞长期培养物以及改造位点特异性基因修饰(例如基因失活)的能力，所以术语“转基因体”将逆转录病毒系统排除在外。
但是，其包括带有位点特异性基因改变的动物，所述改变使得选定基因的功能发生改变，并从该基因修饰获得期望的表型。这些转基因和来自于它们的动物通常称为“敲入”。所述转基因可插入至少10kb的内源DNA缺失，优选10-25kb，或者更多，这取决于选择用来靶向的基因大小和组织。在一个优选实施方案中，转基因鸟类缺乏与用于进行全部或部分缺失或其他功能性破坏之内源基因靶标相对应的任何内源基因。
尽管本文的实施例是针对鸡来说明的，但在试验中可用其它鸟类物种比如鹌鹑、火鸡、雉等替换鸡，并且可以合理预期将能成功地实施本文公开的方法。
通过将设计用于组织特异性表达的DNA构建体插入培养的ES细胞中，产生在其卵白中表达有价值药物产品(比如单克隆抗体)的鸡。见PCTUS03/25270 WO 04/015123 Zhu等。实现这种动物的关键技术是建立并维持真正长期的ES细胞培养物，以使其保持存活足够长的时间，用于在培养中改造克隆细胞的基因型。
然而不同于ES细胞，原始生殖细胞(PGC)只能短期培养。一旦延长培养时间超出了较短天数，这些细胞就丧失仅贡献给种系的能力。典型地，用当前的培养技术维持培养的PGC不能增殖和倍增。在缺少健壮(robust)生长的情形中，培养物是“终末的(terminal)”并且不能无限期维持。随着时间推移，这些终末细胞培养物发生退化并且这些细胞丧失它们独特的PGC形态并回复成胚胎生殖细胞(embryonic germ cell，EGcell)。在注入早期阶段的发育胚胎时，胚胎生殖细胞获得不同于PGC的形态，失去作为种系的限制性，并获得贡献于体细胞组织的能力。为向受体胚胎的种系引入预定基因型，由此使动物能将期望基因型传递给未来的世代，PGC具有特别的吸引力，这是因为已知它们是精子和卵的始祖。
带有或不带有基因失活或外源DNA插入的PGC的长期培养物提供几种重要的优点，比如维持禽肉蛋生产工业中所依赖的重要鸡繁殖系(breeding line)的有价值遗传特征。目前，采用特别的措施以防止由于突发事件或者疾病造成有价值繁殖系丧失。这些措施需要保持大量的种系成员作为繁殖种禽并在全世界很多地方复制这些繁殖种禽。以储备为目的维持大量有价值动物也是必需的，因为在繁殖系中保持遗传多样性也是重要的。通过在PGC细胞培养物中(而不是在活的原种中)保持有价值繁殖系的遗传特征，可使得大规模储备繁殖种群的花费得以避免。
PGC长期培养物描述于van de Lavoir，M-C，Diamond J.，Leighton，P.，Heyer，B.，Bradshaw，R.，Mather-Love，C，Kerchner，A.，Hooi，L.，Gessaro，T.，Swanberg，S.，Delany，M.和Etches，R.J.(2006).Germlinetransmission of genetically modified primordial germ cells.Nature 441，766-769。
使用PGC产生基因改造的鸡需要将基因修饰引入到PGC的基因型中，分离发生基因修饰的稀少细胞，并扩增基因修饰细胞群以用于分析和引入受体胚胎而形成G0嵌合体。多种对培养物中靶细胞进行遗传操作的技术是公知的。然而，一个主要的困难是，为了改变培养物中PGC的基因型，培养物必须保持存活足够长的时间，以引入遗传修饰并成功选择转化细胞，并且被转染细胞在培养物中生长和增殖。能够增殖的成功转化细胞通过在克隆或接近克隆衍生之后的几天至几周内产生大量细胞(例如104至107个细胞)的能力来区分。初始细胞(founder cells)将是携带期望遗传修饰的稀少细胞。典型地，在应用公知的遗传修饰技术(例如脂质体转染法或电穿孔法)之后这些细胞在培养物中以10-4至10-7的频率产生。因此，在培养物中成功产生PGC需要将细胞传代，为细胞增殖和产生足量细胞提供空间和营养，以允许选择稀少的、经遗传修饰的培养细胞。
为了提供这些群体，培养条件必须足够健壮(robust)以允许细胞从单个遗传修饰细胞生长成104至107个细胞的集落，从而用于体外遗传分析和用于生成嵌合体。在成熟时这些经改造的PGC将完全贡献给所得动物中的精原细胞或者卵原细胞(即，精子和卵)的新生类群。在所得的这种动物中，全部体细胞组织将源于受体胚胎并且种系将包含来自供体细胞和受体胚胎的贡献。由于对种系的混合贡献，这些动物被称为“种系嵌合体”。根据嵌合性程度，种系嵌合体的后代将或者源于供体细胞或者源于受体胚胎。
鸡种系起始自进入新生内胚层的X期(E-G&K)胚胎的外胚层而来的细胞(Kagami等，(1997)Mol Reprod Dev 48，501-510；Petitte，(2002)JPoultry Sci 39，205-228)。随着内胚层向前进，前原始生殖细胞被向前推入生殖新月区(germinal crescent)，在此它们可以被鉴定为大糖原装载细胞(large glycogen laden cells)。根据这些形态标准在种系中对细胞的最早鉴定是在孵育开始后约8小时(4期，由Hamburger和Hamilton，(1951)JMorph 88，49-92所建立的分期系统)。原始生殖细胞居于来自4期(H&H)的生殖新月区，直至它们在12-17期(H&H)期间迁移通过脉管系统。在此时，原始生殖细胞是约200个细胞的小群体。从脉管系统，原始生殖细胞迁移入生殖脊并且随着生殖腺分化而被并入卵巢或者睾丸(Swift，(1914)Am.J.Anat.15，483-516；Meyer，(1964)Dev Biol.10，154-190；Fujimoto等(1976)Anat.Rec.185，139-154)。
在迄今为止所有检测过的物种中，生殖细胞还没有在培养中长期增殖却不分化成EG细胞。为了产生足量的细胞以便于通过常规的电穿孔或者脂质体转染法引入遗传修饰或失活，需要长期培养。典型地，这些方法需要105至107个细胞，并且因此从单个前体生成这些细胞需要17-24次倍增，假定所有细胞分裂是(1)同步的并且(2)产生两个活的子细胞。向细胞基因组引入遗传修饰是偶发事件，通常在1×104至1×106个细胞中有一个会发生。在遗传修饰之后，细胞必须能够从携带和/或表达遗传修饰的单个细胞建立集落。该集落必须能够扩大为105至107个细胞的群体，其可以通过PCR或者Southern分析以评估转基因的忠实度并且提供随后将注入受体13-15期(H&H)胚胎的足量细胞。因此，需要另外17-24次细胞分裂以产生所述细胞群体并且需要总共34-58次倍增以产生遗传修饰细胞的群体。假定细胞周期是24小时，需要最少34天和通常58天培养以产生用于注入13-15期(H&H)受体胚胎的遗传修饰原始生殖细胞。随后所注入的细胞必须能够定居于种系，形成功能性配子并在受精后发育成新个体。
在本文所述的培养物中维持的PGC在维持培养时保持了特征性PGC形态。可以通过直接观察来观察PGC形态，并且通过常规技术来评估培养细胞的生长以确保细胞在培养中增殖。增殖的细胞培养物被定义为非终末的(non-terminal)并且在两个不同时间点的后者上观察到具有更大量的培养细胞。本发明培养物中的PGC在任何特定培养物中可以具有1×105或者更多的细胞并且可以观察到此数字随着时间延长而增加。因此，本发明包括增殖中的PGC培养物，与培养期较早时间点相比，其在几天、几周或者几个月之后含有更多数目的细胞。理想地，所述培养物包含有至少1×105个细胞并且在培养任何时间长度之后可以观察到更高数目。而且，可以观察到在培养物中PGC是优势种，使得当考虑由非鸡的饲养细胞所作的最小贡献时，细胞培养物的增殖组分基本由鸡原始生殖细胞组成，从而基本排除了其它的鸡源细胞。
所述培养物还表现出允许通过传代而增殖的特性，使得可以从现有培养物分离细胞样品或者等分试样并且当其置于新培养基中时将表现出健壮的生长。通过定义，细胞培养物传代的能力是指细胞培养物正在生长和增殖并且是非终末的。此外，本发明的细胞证明了在几次传代后建立种系嵌合体并且保持PGC形态的能力。如本文所述，这样的增殖是适于稳定整合外源DNA序列的任何细胞培养物的基本特征。
PGC可通过任何公知技术获得并且可以在本文所述的培养条件下生长。然而，优选的是，从15期的胚胎中获取全血并将其直接置于下文所述的培养基中。这种方法不同于文献中所描述的其它方法，在这些文献所描述的方法中PGC在培养之前须经处理和分离步骤。来自全血的最初可能共存于培养基中的PGC与其他细胞之间稳健的差异性生长提供了本文所述培养物中的大量PGC群体。因此，直接来源于全血并在培养物中培养至高细胞密度的PGC可经受不受限制的传代数，并且显示健壮的生长和增殖，使得培养物中的PGC基本上是仅有的生长和增殖的细胞。
本发明的一个方面是建立大量的，包括大于3、大于4、大于5、10、15和20个种系嵌合体转基因动物，它们全都在其种系中具有遗传一致性的PGC源的细胞。本发明的另一方面是建立在其种系中具有遗传一致性PGC源的细胞的种系嵌合体群体，其在所述群体中具有龄期差异，这反应了使用相同的长期细胞培养物来建立种系嵌合体。龄期差异超出了在一段时间中培养原始生殖细胞的目前可达到的能力并且无需冷冻就可以高达190天。因此，本发明包括在其种系中具有一致的PGC源细胞的两种或者更多种种系嵌合体，其龄期差异超过40天、60天、80天、100天、190天等或者其中任何的整数值天数，而无需冷冻细胞。本发明还包括存在性成熟的种系嵌合体，所述嵌合体在其种系中具有遗传一致的PGC源的细胞，以及存在用来建立这些种系嵌合体的非终末PGC培养物，并且从中可以建立另外的种系嵌合体。
因为所述PGC可以极其稳定的形式在培养物中维持，所以所述细胞也可以冷冻保藏和解冻，以建立用于产生种系嵌合体的长期保存方法，所述嵌合体能够产生通过在培养物中维持的PGC的表型所定义的后代。
产生大量种系嵌合体的能力还提供了将PGC来源基因型传递给所述种系嵌合体的后代的能力。因此，本发明既包括在其种系中具有包含失活内源基因座的遗传相同PGC来源细胞的种系嵌合体群体，也包括所述种系嵌合体的后代，其基因型和表型完全由培养物中培养的PGC基因座所决定。已经观察到种系中整合了PGC来源的敲除表型。因此，本发明包括通过对包含失活内源基因座之原始生殖细胞的基因型进行种系传递而产生的种系嵌合体后代。因此，本发明包括存在下列每一个：含有包含位点特异性基因失活的PGC的原始生殖细胞培养物，含有相同的原始生殖细胞作为其种系一部分的种系嵌合体，以及具有敲除基因型和表型的种系嵌合体的后代。
可以改变在受体胚胎中供体源和受体源PGC的比率以有利于种系在PGC源嵌合体中的定居。在发育中的鸡和鹌鹑胚胎中，随着原始生殖细胞群体从生殖新月向生殖腺脊的迁移，暴露于白消安将极大降低或者消除原始生殖细胞的群体(Reynaud(1977a)Bull Soc.Zool.Francaise 102，417-429；Reynaud(1981)Arch Anat.Micro.Morp.Exp.70，251-258；Aige-Gil和Simkiss(1991)Res.Vet.Sci.50，139-144)。当在孵育24至30小时后将白消安注入卵黄和在孵育50-55小时后将原始生殖细胞重引入脉管系统时，种系中重新群聚供体源的原始生殖细胞并且随后产生供体源的配子(Vick等(1993)J.Reprod.Fert.98，637-641；Bresler等(1994)Brit.Poultry Sci.35241-247)。
本发明的方法包括：从鸡中获得PGC，例如从15期胚胎的全血中获得；对所述PGC进行培养；改造获得内源基因座的失活；使经改造的PGC增殖以增加其数量并实现多次传代；从经改造PGC的长期培养物中产生种系嵌合体；以及获得具有在PGC中显示经改造之基因失活的基因型和表型的种系嵌合体后代。本发明的方法还包括将基因失活或基因“敲除”插入到培养物中的PGC群体中，以产生稳定转染的带有失活或功能性破坏内源基因座的PGC；从该群体中选择带有稳定整合转基因的细胞；将带有稳定整合转基因的基因修饰细胞注射到受体胚胎中；使所述胚胎发育成在种系中含有失活基因座的种系嵌合体；饲养所述种系嵌合体至性成熟；以及将所述种系嵌合体配种以获得其中所述基因失活来自培养的PGC的转基因后代。引入PGC以实现基因失活的基因修饰可包括但不仅限于将转基因随机整合进基因组、将转基因插入到基因的启动子区、将转基因插入到基因组的重复元件中、使用整合酶引入基因组中的位点特异性改变、通过同源重组引入基因组中的位点特异性改变，以及通过切除侧翼为lox位点或其他序列的DNA而引入基因组的条件性突变，所述其他序列是位点特异性重组的底物。
如下所述，根据本发明，已从采自具有大、圆形的14-16期(H&H)胚胎(图1)的血中获得鸡PGC细胞系。通过它们经长期培养后的形态以及它们产生PGC源后代的能力证实这些细胞是鸡PGC。此外，该PGC培养物表达种系特异性基因Dazl和CVH(图2)并且培养物中的细胞产生了CVH蛋白质(图3)。培养的PGC还表达端粒酶(图4)，这表明它们具有永生化表型。此外，PGC在适宜的培养条件下将产生胚胎生殖(EG)细胞(图5)。通过类比，当以类似方式进行处理时，小鼠和人的PGC将产生EG细胞。小鼠EG细胞将贡献于体细胞组织，鸡EG细胞也贡献于体细胞组织，如在嵌合体中黑色羽毛着色所示。鸡PGC已经过遗传修饰，如Southern分析所示(图6)。在此实施方案中，CX启动子稳定地整合入PGC基因组并且被用来促进编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因的表达，该基因也被整合于PGC基因组中并且被用来赋予对添加到培养基中以便于选择遗传修饰PGC的新霉素的抗性。
实施例1.鸡PGC培养物的产生
将采自14-17期(H&H)胚胎终窦(sinus terminalis)的2-5μL血孵育在96孔板的培养基中，所述培养基含干细胞因子(SCF；6ng/ml或者60ng/ml)、人重组成纤维细胞生长因子(hrFGF；4ng/ml或者40ng/ml)、10％胎牛血清和80％KO-DMEM条件培养基。优选地，从15-16期(H&H)胚胎的脉管系统取1-3μL。用辐照处理的STO细胞以3×104个细胞/cm2的浓度接种96孔板的孔。
通过在补充有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸、1×核苷、1×非必需氨基酸和0.1mM β-巯基乙醇并含有5％胎牛血清的DMEM中培养BRL细胞3天直至汇合，来制备KO-DMEM条件培养基。24小时后，取出培养基并且条件处理新批次培养基3天。这被重复3次并且合并这3个批次来制备PGC培养基。
培养约180天后，在包含40％KO-DMEM条件培养基、7.5％胎牛血清和2.5％鸡血清的培养基中培育一个PGC细胞系。在这些条件下，PGC的倍增时间约为24-36小时。
当开始培养时，优势细胞类型是胎儿红细胞。在三周内，优势细胞类型是PGC类型。从个体胚胎起始的18种培养物中获得两种PGC细胞系。
PGC系已经培养超过9个月，其保持圆形形态，并且保持不贴壁(图1A&B)。在含有10％血清和10％DMSO的非CO2依赖性培养基中冻存之后，已成功地解冻了PGC。
实施例2.培养的PGC表达CVH和Dazl
CVH(果蝇中种系特异性基因VASA的鸡同源物)的表达仅限于鸡种系中的细胞，并且由生殖新月区中约200个细胞所表达。(Tsuuekawa，N.，Naito，M.，Sakai，Y.，Nishida，T.&Noce，T.Isolation of chicken vasahomolog gene and tracing the origin of primordial germ cells.Development127，2741-50.(2000))。在雄性中，CVH的表达是种系正常发挥功能所必需的，CVH功能的丧失造成雄性小鼠不育。(Tanaka，S.S.等The mousehomo log of Drosophila Vasa is required for the development of male germcells.Genes Dev 14，841-53.(2000)。在蛙(Houston，D.W.&King，M.L.Acritical role for Xdazl，a germ plasm-localized RNA，in the differentiationof primordial germ cells in Xenopus.Development 127，447-56，2000)、蝾螈(Johnson，A.D.，Bachvarova，R.F.，Drum，M.&Masi，T.Expression ofaxolotl DAZL RNA，a marker of germ plasm：widespread maternal RNAand onset of expression in germ cells approaching the gonad.Dev Biol 234，402-15，2001)、小鼠(Schrans-Stassen，B.H.，Sannders，P.T.，Cooke，H.J.&de Rooij，D.G.Nature of the spermatogenic arrest in Dazl-/-mice.BiolReprod 65，771-776，2001)、大鼠(Hamra，F.K.等Production of transgenicrats by lentiviral transduction of male germ-line stem cens.Proc Natl AcadSci U S A 99，14931-6，2002)和人类(Lifschitz-Mercer，B.等Absence ofRBM expression as a marker of intratubular(in situ)germ cell neoplasiaof the testis.Hum Pathol 31，1116-1120，2000)中，Dazl的表达仅限于种系中。转基因小鼠中Dazl的缺失导致精子发生缺陷(Reijo，R.等Diversespermatogenic defects in humahs caused by Y chromosome deletionsencompassing a hovel RNA-binding protein gene.Nat Genet 10，383-93，1995)。
32天后，用PBS清洗PGC，并沉淀，用Oligotex Direct mRNA试剂盒(Qiagen)从组织样品中分离mRNA。随后采用用于第一链cDNA合成的SuperScript RT-PCR System(Invitrogen从9μl的mRNA合成cDNA。在随后的PCR反应中使用2μl的cDNA。源于CVH序列(登记号AB004836)、Dazl序列(登记号AY211387)或者β-肌动蛋白序列(登记号NM_205518)的引物序列是：
V-1       GCTCGATATGGGTTTTGGAT(SEQ ID NO.1)
V-2       TTCTCTTGGGTTCCATTCTGC(SEQ ID NO.2)
Dazl-1    GCTTGCATGCTTTTCCTGCT(SEQ ID NO.3)
Dazl-2    TGC GTC ACA AAG TTA GGC A(SEQ ID NO.4)
Act-RT-1  AAC ACC CCA GCC ATG TAT GTA(SEQ ID NO.5)
Act-RT-2  TTT CAT TGT GCT AGG TGC CA(SEQ ID NO.6)
应用引物V-1和V-2扩增CVH转录物的751bp片段。应用引物Dazl-1和Dazl-2扩增Dazl转录物的536bp片段。应用引物Act-RT-1和Act-RT-R扩增内源性鸡β-肌动蛋白转录物的597bp片段。用AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)依照使用说明书实施PCR反应(图2)。
实施例3.PGC表达CVH蛋白
应用T-Per组织蛋白质提取试剂盒(Pierce)从新分离的PGC中提取蛋白质。通过在1％NP4O；0.4％脱氧胆酸盐化的66mM EDTA；10mM，Tris，pH7.4中裂解细胞提取来自细胞的蛋白质。在4-15％Tris-HCl预制胶(Bio-Rad)上对样品进行电泳。转移到膜上之后，如说明书所示用SuperSignal West Pico化学发光底物试剂盒(Pierce)实施Western印迹。用兔抗-CVH抗体作为第一抗体(1∶300稀释度)以及用HPR缀合的山羊抗兔IgG抗体(Pierce，1∶100,000)作为第二抗体(图3)。
实施例4.培养的PGC表达端粒酶
沉淀并用PBS清洗原始生殖细胞，在分析之前将其冷冻于-80℃的温度下。制备细胞提取物，并应用TRAPeze端粒酶检测试剂盒(SerologicalsCorporation)根据使用说明进行分析，该试剂盒基于端粒重复序列扩增方案(TRAP)(Kim，N.等Specific association of human telomerase activitywith immortal cells and cancer.Science 266，2011-2014，1994)。见图4。
实施例5.可从PGC培养物产生胚胎生殖细胞(EG cell)
通过让细胞在平板上贴壁，去除FGF、SCF和鸡血清并在用于培养ES细胞的相同条件下培养所述细胞，已从PGC中获得鸡EG细胞(van deLavoir等，2006High Grade Somatic Chimeras from Chicken EmbryonicStem Cells，Mechanisms of Development 12，31-41；van de Lavoir和Mather-Love(2006)Chicken Embryonic Stem Cells；Culture and ChimeraProduction，Methods in Enzymology，出版中)。cEG细胞的形态与cES细胞的形态非常相似(图5A、B)。当把cEG细胞注射入X期(E-G&K)胚胎时，它们具有定居于体细胞组织的能力并且产生嵌合体，作为幼体，其看起来与用cES细胞制得的嵌合体相一致。在新衍生的和克隆衍生的转基因PGC系中观察到鸡EG细胞。对源于GFP阳性PGC的EG细胞的Southern分析表明EG细胞源于PGC(图15)。
实施例6.培养的雄性PGC在公鸡中产生功能性配子
从个体横斑芦花鸡胚胎中获得雄性原始生殖细胞系。所述细胞系建立后，将细胞注射入13-15期(H&H)的胚胎中。在表型上，孵出的鸡类似于白来亨鸡。将雄性鸡饲养至性成熟并且使其与Barred Rock母鸡交配(表1)。黑色后代表现出经注射PGC的种系传递。公鸡种系传递率为＜1％至86％不等(表1)。
表1：注射入14-15期(H&H)胚胎脉管系统的雄性原生殖细胞的种系传递
  细胞系   性别   龄期   细胞注射数   公鸡检测数 种系传递*
  PGC13   M   40   1200   3 0.1，1.5，17
  110   2500-3000   5 1，1，1.5，3，84
  PGC21   M   44   1500   3 10，16，21
  细胞系   性别   龄期   细胞注射数   公鸡检测数 种系传递*
  PGC34   M   47   3000   3 42，74，80
  PGC35   M   35   3000   7 15，23，47，61，80，85，86
  PGC51   M   47   3000   1 11
  PGC54   M   47   3000   4 0.5，2，20，24
  PGC80   M   29   3000   1 55
  PGC84   M   50   3000   1 70
*每个值表示一个嵌合体的种系传递率
也可以将PGC注射入X期胚胎的胚下腔。在培养209天后将1000或5000个PGC注射入经照射处理的胚胎。使孵出的雄性小鸡生长至性成熟并让其繁殖以用于检测种系传递。在用来检测种系传递的4只公鸡中，观察到3只的频率为在0.15-0.45％不等。这指示当在原肠胚形成之前注射PGC时，其可以定居于种系。在14只雌性嵌合体的1625只后代中，没有观察到雄性PGC的种系传递。
实施例7.培养的雌性PGC在母鸡中产生功能性配子
将培养了66天的来自横斑芦花鸡(Barred Rock)胚胎的雌性PGC注射到13-16期(H&H)白来亨鸡(White Leghorn)胚胎中，所有孵化的小鸡都是白来亨鸡表型。饲养母鸡至性成熟，使之与横斑芦花鸡公鸡交配。雌性PGC以最高为69％的频率通过雌性嵌合体传递(表2)。
表2：注射入14-15期(H&H)胚胎脉管系统的雌性原生殖细胞的种系传递
Figure GPA00001096868300281
*每个值表示一个嵌合体的种系传递率
还将雌性PGC注射到雄性受体白来亨鸡胚胎中。饲养雄性嵌合体至性成熟，与横斑芦花鸡母鸡配种。所测试的三只公鸡的506个后代中未观察到雌性PGC的种系传递。
实施例8.来自于PGC的后代在生殖上是正常的
三只雄性和4只雌性非转基因PGC源的后代在一起交配。有53至100％的卵有生育力(表3)并且有79至100％的受精卵产生孵化的胚胎(表3)，这表明PGC源的后代在生殖上是正常的。
表3：从种系嵌合体公鸡获得的PGC后代的生殖参数
Figure GPA00001096868300282
实施例9.
原始生殖细胞已经从14-17期胚胎中分离出来，并显示对种系有贡献(参见实施例1-8)。此时，PGC循环于脉管系统中。在脉管系统形成之前，PGC位于生殖新月区，其位于胚胎的前部。对生殖新月区中PGC前体的了解不多，但是通常认为PGC来自于X期(Eyal-Giladi和Kochav)胚胎的明区(Petitte，J.N.2002.The Avian germline and Strategies for theProduction of Transgenic Chickens.Journal of Poultry Science 39，205-228)。在其位于X期胚胎期间，不能使用其在生殖新月区中时对其进行鉴定所用的经典形态学标准鉴定出PGC。出人意料地，来自X期横斑芦花鸡胚胎的离散细胞的放置显示出产生PGC，并且对种系有贡献。我们通过单个收集囊胚层并通过在巴斯德吸管中研磨将其机械性分散，从而证实了这一原理。清洗细胞，并将其铺于48孔板中，所述48孔板之前用含有实施例1中所述培养基的经照射BRL细胞接种。接种后6-10天，对所述培养基进行第一次传代。之后，传代根据PGC的浓度来进行。建立起两株雄性细胞系(PGC-A12和PGC-B11)，分别在培养45和36天之后如实施例6中所述将其注射到受体胚胎中。每个细胞系产生5个雄性嵌合体。如表4所示，在10个雄性里的3个中，通过种系传递了横斑芦花鸡表型，这表明将会成为功能性PGC的细胞可以在所提供的培养基中培养。
Figure GPA00001096868300301
实施例10.PGC对新霉素和嘌呤霉素的敏感性
测定PGC对新霉素和嘌呤霉素的敏感性，以确定允许在CX启动子控制下表达抗生素抗性的细胞生长所必需的新霉素和嘌呤霉素浓度，所述CX启动子在所有组织中都强烈表达。这些试验证明，为了排除所有非转染细胞，300μg/ml浓度的新霉素维持10天时间是必需的。0.5μg/ml浓度的嘌呤霉素在7-10天内足以消除PGC。
实施例11.PGC的基因修饰
将20微克(20μl)的NotI线性化cx-neo转基因(见图6)加入5.8×106个已培养167天的PGC群体中。将细胞和DNA重悬于800μl电穿孔缓冲液中，并且施加8个672伏持续时间为100微秒的方波脉冲。10分钟后，将细胞重悬于培养基中并等分于24孔板中。电穿孔后2天，每毫升培养基添加300μg新霉素以选择表达cx-neo转基因的细胞。细胞在选择条件下保持19天。19天后，从选择物中取细胞并扩增用于分析。一部分PGC在300μg/ml条件下再保持31天，这证明该PGC在功能上对所述抗生素具有抗性。
参考图6，对于质粒对照而言，将cx-neo质粒DNA用NotI线性化，接着用EcoRI或者BamHI消化以产生片段，该片段比用HindIII消化所呈现的完整质粒稍小(5kb)。通过用StyI或NcoI消化释放cx-neo质粒的约2kb内部片段。通过用EcoRI和KpnI消化释放约2.6kb的较大内部片段。用EcoRI、BamHI和HindIII消化来自PGC系的基因组DNA显示大于6kb的带，这表明cx-neo转基因整合到PGC基因组中。在用StyI、NcoI和EcoRI与KpnI消化之后，在质粒DNA中所揭示的内部片段也存在于PGC的基因组DNA中，这指示cx-neo转基因没有变化地整合到PGC基因组中。采用常规转基因构建技术，可以掺入另外的元件比如实例有调控元件、组织特异性启动子和编码蛋白质的外源DNA。
如上所述，只在非常少的物种中证明了在PGC中实施遗传修饰来产生转基因动物。通过参照在小鼠中应用ES细胞所实现的，可以在鸡PGC中实现类似的遗传操作。在小鼠中，为了产生嵌合体和转基因后代，独立应用同源重组然后将染色体转移至胚胎干(mES)细胞中是众所周知的。现已研发出位点特异性同源重组或者基因打靶的强大技术(见Thomas，K.R.和M.R.Capecchi，Cell 51：503-512，1987；综述见Waldman，A.S.，Crit.Rev.Oncol.Hematol.12：49-64，1992)。插入克隆的DNA(Jakobovits，A.，Curr.Biol.4：761-763，1994)以及通过Cre-loxP系统技术操作和选择染色体片段(见Smith，A.J.等，Nat.Genet.9：376-385，1995；Ramirez-Solis，R.等，Nature 378：720-724，1995；US专利4,959,317；6,130,364；6,130,364；6,091,001；5,985,614)可用于操作和转移基因至mES细胞中以产生稳定的遗传嵌合体。
通常认为原始生殖细胞基因组处于静息状态并因此染色质可处于高度凝聚的状态。对常规电穿孔方法的大量试验表明需要专门的方法将遗传修饰引入到PGC的基因组中。如下所述，可以用源于鸡β-珠蛋白基因座的绝缘子(insulator element)围绕转基因以增强表达。包含β-珠蛋白绝缘子通常产生可以进行生长、分析和注射入受体胚胎的克隆。
用来驱动表达抗生素(例如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、his-D、杀稻瘟菌素、zeocin和gpt)抗性基因的常规启动子被普遍地表达。典型地，所述启动子是源于“管家”基因比如β-肌动蛋白、CMV或者泛素。尽管因为组成型启动子通常在所有细胞中都以高水平表达而使得它们是可用的，但是它们在鸡的整个一生中，如果不是全部的话也是在大部分组织中持续表达。一般来说，表达应当被仅限于需要表达的组织和发育阶段中。为了选择原始生殖细胞，需要表达的期间是培养基中存在有抗生素而它们居于体外的时候。一旦细胞被插入胚胎，优选终止选择标记(即抗生素抗性基因)的表达。为限制抗生素抗性基因的表达，采用“神经诱导早期应答”(early response to neural induction，ERNI)启动子。ERNI是一种在发育早期阶段(例如X期(E-G&K))和在培养期间选择性表达的基因，因此应用该启动子来驱动抗生素抗性基因的表达以选择携带有遗传修饰的PGC。因为ERNI只在发育的早期阶段表达，所以赋予抗生素抗性的基因不在成熟动物中表达。
实施例12.长期PGC细胞培养物的同质性
为了确定长期培养后PGC培养物的同质性，用抗CVH抗体(一种抗鸡vasa同源物的抗体)和1B3抗体对ES、EG、DT40(鸡B细胞系)和PGC进行染色(Halfter，W.，Schurer，B.，Hasselhorn，H.M.，Christ，B.，Gimpel，E.和Epperlein，H.H.，An ovomucin-like protein on the surface ofmigrating primordial germ cells of the chick and rat.Development 122，915-23.1996)。抗CVH抗体的表达被限制在生殖细胞中，因此对于它们而言抗CVH抗体是可靠的标记物。1B3抗原识别在鸡PGC迁移并定居生殖腺期间存在于鸡PGC表面上的卵粘蛋白样蛋白质。
在CMF/2％FBS中清洗细胞，在4％多聚甲醛中固定5分钟，并再次清洗。用0.1％TritonX-100对有待进行vasa染色的细胞等分试样进行透化处理1-2分钟。加入第一抗体20分钟后，清洗细胞两次并与第二抗体(针对CVH和对照的Alexa 488抗兔IgG以及针对1B3的Alexa 488抗兔IgM)一起孵育15分钟。作为对照，细胞的等分试样只用第二抗体进行染色。在另外清洗2次后，制备细胞用于FACS分析。
参照图7，当用CVH和1B3抗体染色时，DT40、ES和EG细胞都显示出背景。然而，对于PGC而言，用CVH和1B3抗体染色则强得非常多。有一小群PGC，其CVH或者1B3不染色，这表明这一小群细胞不显示PGC表型。用vasa和1B3抗体对两个亲代PGC系(PGC13和102)和源于PGC13亲代细胞系的4种转染细胞系(G-09、P84、P97/6和P97/33)进行染色。它们都显示出同样的模式，这表明各种PGC培养物包含同样高比例的表达PGC表型的细胞。
实施例13.原始生殖细胞的基因修饰
用环状CX-GFP质粒实施电穿孔显示在PGC中的瞬时转染率在1-30％间变化。应用100微秒800V的8个方波脉冲，我们获得携带有CX-neo构建体的PGC细胞系，其被命名为G-09。见图6。采用Southern印迹分析评估构建体的整合。然而，此稳定转染细胞系的分离是无法再现的事件。除了G-09之外，在应用方波和指数式衰减脉冲的37个转染实验中，在用线性化构建体电穿孔17×107个PGC之后，没有实现PGC的稳定转染。在每个试验中，PGC的量从1×106至10×106变化。对以下被广泛地应用于小鼠、鸡和人的ES细胞研究中的启动子进行检测：CX启动子，也称为CAG(Niwa，H.，Yamamura，K.和Miyazaki，J.，Efficient selectionfor high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.Gene 108，193-9.1991)，其包括具有CMV增强子的鸡β-肌动蛋白启动子；PGK启动子；MC1启动子和Ubc启动子。这些启动子中没有一个可以增加转染效率。为允许表达选择标记以及遗传修饰细胞系的克隆衍化，已经将隔离区与整合构建体一起使用。
隔离区是DNA序列，其将有活性与无活性的染色质结构域分隔开并且使基因对邻近增强子的活化效应、或者邻近凝聚染色质的沉默效应隔离开。在鸡中，位于β-珠蛋白基因座5’的5’HS4隔离区已经由Felsenfeld和其同事充分表征(Burgess-Beusse，B.，Farrell，C.，Gaszner，M.，Litt，M.，Mutskov，V.，Recillas-Targa，F.，Simpson，M.，West，A.和Felsenfeld，G.(2002)The insulation of genes from external enhancers and silencingchromatin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99 Suppl.4，16433-7)。该隔离区保护β-珠蛋白基因座避免组成型凝聚染色质上游区的影响。我们用驱动新霉素抗性均鸡β-肌动蛋白启动子并采用鸡β-珠蛋白5’HS4序列作为鸡β-肌动蛋白-neo-盒的5’和3’端的隔离区来装配转基因。
使用下列引物组对来自鸡β-珠蛋白基因座的超敏位点4的250bp核心序列进行PCR扩增：
HS4-Bam-F：AGGATCCGAAGCAGGCTTTCCTGGAAGG(SEQ ID.NO.7)
HS4-Bgl-R：AAGATCTTCAGCCTAAAGCTTTTTCCCCGT(SEQ ID.NO.8)
将PCR产物克隆至pGEM-T中并测序。通过用BamHI和BglII消化处理pGEM克隆中的HS4来制备HS4位点的串联重复以释放插入片段，并用BglII使载体线性化。将HS4片段连接至含有HS4隔离区拷贝的载体。筛选克隆并挑选出其中两拷贝HS4取向相同的一个克隆。它被命名为2×HS4。
实施例14.使用HS4β-肌动蛋白-neo的大批量选择
从Buerstedde(克隆574)获得β-肌动蛋白neo并转染至pBluescript。随后在β-肌动蛋白neo的5’和3’端克隆2X HS4以产生HS4-β-肌动蛋白neo。应用此构建体实施8次转染。对于每次转染，将5×106个PGC重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并加入20μg线性化DNA。施加一个指数式衰减(ED)脉冲(200V，具有900-1100μF)或者8个方波(SW)脉冲(250-350V，100微秒)。转染后，在添加新霉素(300μg/ml)进行选择之前，让细胞生长几天。每次转染生长为一个库(pool)。从8次转染的5次中分离到抗性细胞。
对2个库的转染细胞实施Southern分析(图8)。对来自PGC系P84和P85的2μg基因组DNA和20pg质粒(HS4-β-肌动蛋白neo)进行消化处理。在0.7％凝胶上对消化产物进行电泳，通过10×SSC毛细管转移将其过夜转移至尼龙膜，并在Rapid Hyb(Amersham)中用放射性标记neo基因序列探针处理2小时。清洗后，对胶片上的印迹在-80℃曝光过夜。参照图8，泳道1是P84，泳道2是P85和泳道3是质粒。对于质粒对照，用Notl使HS4-β-肌动蛋白-neo质粒DNA线性化。为获得2.3Kb内部片段，用BamH1消化PGC DNA和线性化质粒DNA。P84和P85都显示出大小为2.3Kb的内部片段。通过HindIII消化释放约2.6Kb的较大内部片段。该内部片段也出现在P84和P85消化产物中。如果转基因被整合于基因组中的话，用EcoRI和BglII消化P84和P85的基因组DNA应当显示大于2.9Kb的条带。在P84中，没有见到连接片段，这表明P84是几个不同克隆的复合物。在P85中，4.5-5kb的连接片段出现在EcoRl消化中并且5Kb的连接片段出现在BglII消化中，这表明P85被整合入基因组中并且该培养物基本上来自于一个克隆。这个实例表明隔离区作为构建体的优选元件用于在原始生殖细胞中可靠表达选择标记的效用。
实施例15.基因修饰的PGC的克隆衍生
下列实施例显示，可以克隆产生出经基因修饰的原始生殖细胞系。
首先，制备β-肌动蛋白-eGFP。用XmnI和KpnI从CX-eGFP-CX-puro释放eGFP基因，用EcoRI和XmnI从HS4-β-肌动蛋白puro释放β-肌动蛋白基因，并以3-段连接(3-way ligation)将这两个基因克隆至用EcoRI和KpnI消化的pBluescript中从而产生β-肌动蛋白EGFP。随后，用BamHI和KpnI释放β-肌动蛋白eGFP(用T4DNA聚合酶产生平末端)并将其克隆至用BglII和EcoRV消化的HS4-β-肌动蛋白puro中。
应用此构建体实施5次转染。对于每次转染，5×106个PGC被重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并添加20μg线性化DNA。施加ED脉冲(150-200V；900μF)或者SW(350V，8脉冲，100微秒)脉冲。转染后，细胞被接种于独立的48孔中并在进行选择(0.5μg/ml)之前让其生长几天。在5次转染的4次中观察到总共5个克隆。通过Southern分析一个克隆TP103(图9)。参照图11，用NotI使质粒对照DNA线性化。通过用KpnI消化DNA释放内部片段。在TP103和所述质粒中，释放了同样大小的片段。用NcoI、MfeI和SphI消化TP103的基因组DNA应当显示出大于消化质粒DNA对应泳道的条带。在MfeI消化的TP103基因组DNA的泳道中没有观察到条带，这可能是由于条带太大的缘故。在代表NcoI和SphI消化的泳道中，在TP103基因组DNA中释放的片段显著大于在质粒DNA中释放的片段，这表明转基因被整合入TP103细胞系的基因组中。
HS4-β-肌动蛋白-puro的克隆衍生
首先，通过对来自CX-EGFP-CX-puro(XmnI-EcoRI)的puro、来自pBS中β-肌动蛋白neo(见上)(Sal-XmnI)的β-肌动蛋白和pBluescript(SalI-EcoRI)进行3段连接来制备β-肌动蛋白puro。接下来，通过把BamHI消化的β-肌动蛋白puro连接至BamHI/SAP处理的2×HS4载体，从而将β-肌动蛋白puro克隆至包含两拷贝2×HS4的pBS中。
应用此构建体实施三次转染。对于每次转染，4-5×106个PGC被重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并添加20μg线性化DNA。施加200V、900μF的ED脉冲。转染后，将细胞接种于独立的48个孔中，并在进行选择(0.5μg/ml)前让其生长几天。在2次转染中没有观察到克隆。从第三次转染中分离到两个克隆。
HS4-cx-eGFP-cx-puro的克隆衍生
用HS4-cx-eGFP-cx-Puro实施3次转染。5×106个PGC被重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并添加20μg线性化DNA。对每次转染施加350V持续100微秒的8个SW脉冲。转染后，将细胞接种于独立的48个孔中，在进行嘌呤霉素选择(0.5μg/ml)之前让其生长几天。从2次转染中分离到总共16个克隆。
cx-neo的克隆衍生。
用携带cx-neo选择标记的质粒电穿孔PGC13细胞系。在暴露于新霉素之后，得到对新霉素具有抗性的细胞系(G-09)。确定此细胞系的核型并且所有细胞在2号染色体的p-臂中都表现出缺失(表5和图10)。这些数据证明G-09是从携带有2号染色体的p-臂中标记缺失的PGC克隆衍生而来。
表5：G-09细胞系的染色体分析
Figure GPA00001096868300371
实施例16.PGC中选择标记的组织特异性表达
基因ERNI从鸡胚的前原条期(pre-primitive streak stage)开始表达并且其是对来自亨森结信号的早期应答基因(Streit，A.，Berliner，A.J.，Papanayotou，C，Sirulnik，A.和Stern，C.D.(2000)Initiation of neuralinduction by FGF signalling before gastrulation.Nature 406，74-8)。而且ERNI在鸡ES细胞中表达(Acloque，H.，Risson，V.，Birot，A.，Kunita，R.，Pain，B.和Samarut，J.(2001).Identification of a new gene familyspecifically expressed in chicken embryonic stem cells and early embryo.Mech Dev 103，79-91)。除了独特的5’和3’UTR序列之外，ERNI基因(也称为cENS-1)具有特殊的结构，其中单一长开放读码框侧翼有486bp同向重复序列。基于认为此结构是逆转录病毒LTR-样结构的想法，Acloque等，2001测定了所述cDNA序列不同部分的启动子/增强子活性，并发现在3’UTR中一个独特的序列区域可作为启动子。基本如所述(Acloque等，2001放计PCR引物以扩增ERNI基因3’UTR的822bp片段。扩增ERNI序列之后，它们被克隆至新霉素抗性基因的上游，具有SV40多聚腺苷酸位点，从而产生ERNI-neo(1.8kb)。随后将2×HS4隔离区克隆至ERNI-neo选择标记物盒的任一侧。
用HS4-Erni-neo实施两次转染。5×106个PGC被重悬于400μl电穿孔缓冲液(Specialty Media)并添加20μg线性化DNA。在第一次转染中，施加175V、900μF的单ED脉冲；在第二次转染中，施加100微秒和350V的8个SW脉冲。转染后，将细胞接种于独立的48个孔中，在进行新霉素选择(300μg/ml)之前让其生长几天。在第一次转染中(ED脉冲)分离到5个克隆，在第二次转染中(SW脉冲)分离到11个集落。
分离到稳定转染的克隆表明在PGC中表达了ERNI并且其可被用作组织特异性启动子。
实施例17.经转染PGC对种系的贡献
用HS4-β肌动蛋白-GFP转染PGC并将其注射入13-15期(H&H)胚胎中。在第18天，获取生殖腺，并对其固定、切片以及用CVH抗体染色以鉴定生殖细胞。随后分析染色的切片，分析在生殖腺中是否存在GFP阳性细胞。在雄性(图11)和雌性生殖腺中均发现GFP阳性生殖细胞。对这些胚胎的脑、心肌和肝的组织学制备物的检测表明在一个载玻片中只有4个绿色细胞。这些数据证明有些培养PGC被发现于某些异常位置中，但是绝大多数培养PGC优先定居于种系。
为确定GFP阳性细胞是生殖细胞，切片用抗CVH抗体进行染色。如图12所见，GFP阳性细胞也表现出针对CVH蛋白质的染色，这表明所述GFP阳性细胞是生殖细胞。
参照图12，GFP阳性细胞存在于此切片中并且DAPI/GFP图表明这些GFP阳性细胞定位在生精小管内。当用抗CVH抗体染色生殖细胞时，它们显示出强烈的红染色圈，其勾画出生殖细胞的细胞质。DAPI/CVH图表明这些细胞定位在生精小管内。最后一张图表明GFP阳性细胞也发生CVH染色以及生精小管含有GFP阴性的CVH阳性生殖细胞。
实施例18.经基因修饰PGC的种系传递
用以下转基因之一转染横斑芦花鸡的PGC：β肌动蛋白-neo、β肌动蛋白-eGFP-β肌动蛋白-puro、cx-eGFP-cx-puro，转染后PGC被注射入13-14期(H&H)胚胎的脉管系统。孵化鸡，使公鸡生长至性成熟并让其与横斑芦花鸡母鸡交配以确定转基因的种系传递。所有黑色后代是源于PGC的并且检测其中转基因的存在(表6)。通过用黑色鸡的数目除以进行羽毛颜色评分的鸡总数来计算种系传递率(表6)。
表6：基因修饰的原始生殖细胞的种系传递
实施例19.转基因以孟德尔遗传方式遗传
在携带有经遗传修饰而包括β肌动蛋白-neo、β肌动蛋白-GFP或cx-GFP之一的横斑芦花鸡PGC的嵌合体公鸡之间进行交配，对黑色后代分析其中转基因存在的信息。如表7中所示，PGC后代的约50％遗传了转基因，这表明是孟德尔遗传。
表7：转基因的孟德尔分离
  构建体   黑色后代数   非转基因后代数   转基因后代数
  β-肌动蛋白-neo   3   1   2*
  β-肌动蛋白-GFP   176   93   83*
  cx-GFP   23   9   14*
*经卡方分析与转基因：非转基因后代的预期1∶1比率没有显著差异
实施例20.带有基因修饰的PGC的嵌合体后代中转基因的普遍表达
将带有β肌动蛋白-GFP稳定整合于基因组的PGC的嵌合体与野生型母鸡进行交配，并对胚胎的GFP表达进行评分。在胚胎中表达的实例显示在图13中，该图显示，GFP在转基因后代的全部组织中表达，直至发育的34期(H&H)。在更年长的动物中，采用冷冻切片制备组织用于组织学检查。来自1-2周龄鸡的胰、皮肤、肺、脑、卵巢、肾、腔上囊(bursa)、十二指肠、胸、心、肝和脾的组织证明，在孵化后的动物中仍保持广泛表达(图14)。
实施例21.将含有HS4的转基因插入鸡基因组的启动子区中
为了研究含有HS4的构建体是否优先插入会避免沉默并允许表达选择标记的基因组特定区域中，鉴定了我们克隆的转染PGC系中的转基因插入位点。从转染的PGC系中提取基因组DNA，用不切割所述转基因或者仅在HS4元件中切割一次的限制性酶将其消化。将DNA自我连接，并转化进大肠杆菌中。将细胞铺于氨苄青霉素平板上，以分离含有amp基因的集落，所述amp基因来自与载体侧翼的基因组序列相连的质粒。
从31个HS4构建体转染的PGC系中纯化质粒并测序。我们进行BLAT(UCSC Chicken Genome Browser Gateway)和BLAST(NCBI)检索以定位每个插入的基因组位置。引人注意的是，31个含HS4构建体中的25个插入到CpG岛中，其通常存在于启动子区附近，尤其是看家基因的启动子区附近。在CpG岛中的插入里，可发现其中大多数与基因相关联(23/25)，或者是已知基因或者是EST定义的新基因(表8)。CpG岛经常从转录起始位点上游数百个碱基对开始，经过第一外显子，延伸到第一内含子中，在所有这些区域中都发现了插入。在载体相对于内源基因的转录方向方面没有偏好。根据其已知的作为看家基因的功能，预计这些基因中的许多在PGC中表达，例如异柠檬酸脱氢酶、醛脱氢酶以及线粒体溶质载体。插入中有七个处于EST所定义的新基因中。这些EST中的五个最初克隆自生殖腺或PGC文库，表明这些基因也可能在我们的PGC细胞系中表达。基因中的三个插入不存在于CpG岛中，而是在更远端的内含子中。五个插入在没有任何明显基因的区域中。这些插入中的三个与LINE或卫星重复非常接近。
表8：含有HS4序列的转基因插入到PGC中
  克隆   构建体   染色体位置   基因   位置   CpG岛   登录号
  TP85   HS4BN   Chr19：6,414,674   醛脱氢酶3家族成员A2   启动子   是   NM_001006223.1
  TP97/6   HS4BP   ND(多个独特命中结果)   ESTs(输卵管和睾丸)   启动子   是   BM440655；CN231463
  TP97/33   HS4BP   Chr9：2,454,254   UDP-葡萄糖神经酰胺葡糖苷样1同源物   启动子   是   NM_001025777.1(人)
  TP103/19   HS4BGBP   Chr6：11,740,309   溶质载体家族25成员16同源物   启动子   是   NM_152707.2(人)
  TP103/38   HS4BGBP   Chr8：24,797,493   EST(PGC和睾丸)   内含子1外显子1   是   CO769951DR419065
  TP104/48   HS4BGBP   Chr1：61,953,438   跨膜和含三十四肽重复结构(tetratricopeptide)的1同源物   内含子15   否   NM_175861.2(人)
  TP112/4   HS4CGCP   Chr4：10,145,183   EST(生殖腺)   内含子1   否   DT659505
  克隆   构建体   染色体位置   基因   位置   CpG岛   登录号
  TP112/8   HS4CGCP   Chr12：10,967,325   锌指X连锁二倍化A(ZXDA)，ZXDB，或ZXDC同源物   启动子   是   NM_007156.3，NM_007157.3，NM_025112.4和NM_001040653.1(人)
  TP112/11   HS4CGCP   ChrZ：72,904,646.   无(靠近LINE重复)   否
  TP112/21   HS4CGCP   Chr8：4,203,691   Notch2   内含子1   是   NM_024408.2(人)
  TP112/44   HS4CGCP   ChrUn：25,214,782.   无(靠近卫星重复)   是
  TP114/7   HS4CGCP   Chr3：16,791,492   无   是
  TP114/35   HS4CGCP   Chr1：169,944,410   无(LINE重复)   否
  DOC1   HS4loxPCGCN   ND(多个独特命中结果)   ND   否
  DOC2   HS4loxPCGCN   Chr21：1,818,407   蛋白激酶Cζ同源物和EST(睾丸)   启动子启动子   是   NM_002744(人Prkcz)；CN237692(EST)
  DOC3   HS4loxPCGCN   ChrUn：29,847,677   EST(睾丸)   启动子   是   CO773920；CO772454
  DOC4   HS4loxPCGCN   无命中结果   ND   是
  DOC5   HS4loxPCGCN   Chr4：70,149,012   EST(胚胎)   内含子1   是   BX933586
  DOC6   HS4loxPCGCN   Chr3：56,244,635   EST(垂体和下丘脑)   启动子   是   CO420386
  DOC7   HS4loxPCGCN   Chr8：5,252,310   SCYL1样3   外显子1   是   NM_001012595.1
  DOC8   HS4loxPCGCN   Chr10：4,731,544   异柠檬酸脱氢酶3(NAD+)α   启动子   是   NM_005530.2(人)
  DOC10   HS4loxPCGCN   Chr14：14,812,671   Noggin同源物   启动子   是   NM_001039604
  DOC13   HS4loxPCGCN   Chr24：5,764,120   EST(垂体、下丘脑、松果体)   外显子1   是   BI391861
  DOC17   HS4loxPCGCN   无命中结果   EST(胚胎、肌肉、脑)   外显子或3′   是   CR523327，BX932892，BX934965
  克隆   构建体   染色体位置   基因   位置   CpG岛   登录号
  DOC21   HS4loxPCGCN   Chr7：23,302,240   RNA结合基序，单链相互作用蛋白1   内含子2   否   NM_205024.1
  DOC26   HS4loxPCGCN   Chr3：78,546,391   富脯氨酸核受体共激活子1   内含子1   是   NM_001012291.1
  DOC28   HS4loxPCGCN   Chr26：3,781,825   接合丝复合物蛋白1   启动子   是   NM_003176.2(人)
  DOC29   HS4loxPCGCN   无命中结果   ND   是
  DOC30   HS4loxPCGCN   Chr3：83,370,785   SUMO1/sentrin特异性蛋白酶6   内含子1   是   NM_015571.1(人)
  DOC31   HS4loxPCGCN   Chr5：60,554,646   肝脏糖原磷酸化酶   外显子1   是   NM_204392.1
  DOC33   HS4loxPCGCN   Chr2：110,491,134   无   是
实施例22.使用phiC31整合酶进行有效整合
我们也使用了phiC31整合酶系统，其催化attB位点和attP位点之间的位点特异性重组，从而将外源DNA插入到鸡基因组中。phiC31 attB和attP位点之间的重组是不可逆的，使得带有attB位点的环形构建体在基因组中的插入是稳定的，不会被环化切除(looped out)，甚至在整合酶持续存在的情况下亦如此。在爪蟾(Allen和Weeks 2005Nature Methods 2，975-9.Transgenic Xenopus laevis embryos can be generated using phiC31integrase.)、小鼠(Olivares等2002 Nature Biotechnology 20，1124-8.Site-specific genomic integration produces therapeutic Factor IX levels inmice；Belteki等2003Nature Biotechnology 21，321-4.Site-specific cassetteexchange and germline transmission with mouse ES cells expressingphiC31 integrase)和人细胞(Groth等2000Proc Natl Acad Sci USA.97，5995-6000.A phage integrase directs efficient site-specific integration inhuman cells；Thyagarajan等2001，Mol Cell Biol.21，3926-34.Site-specificgenomic integration in mammalian cells mediated by phagephiC31integrase)中，已经显示出phiC31整合酶可介导含有attB的质粒整合到未修饰的基因组中，表明这些物种的基因组中含有假attP位点，其与细菌attP位点之间具有足以被该整合酶识别的序列同源性。还显示，为了有效整合，进入质粒必须带有attB位点，而不是attP位点(Belteki等2003；Thyagarajan 2001)。加入attB位点以隔离HS4β-肌动蛋白EGFP β-肌动蛋白puro(HS4BGBP)构建体，得到attB HS4BGBP。参照图16B的左图，本研究所用的整合酶构建体显示包含含有att-B的质粒，其中att-B位点被加入到HS4β-肌动蛋白EGFPβ-肌动蛋白puro构建体中。参照图16B的右图，显示了用于在细胞中从CAG启动子表达整合酶的质粒。制备了两个形式的整合酶，其中一个具有SV40核定位信号，另一个没有。将attB HS4BGBP和CAG整合酶质粒DNA作为环形质粒共转染进PGC中。相比于无整合酶的线性化HS4BGBP，观察到集落形成大量增加，从使用20微克线性DNA时的约0.3个集落/106个细胞增加到仅使用5微克DNA时的5-10个集落/106个细胞，表示每单位DNA中的集落增加了20倍以上。相比于非NLS形式，整合酶的NLS形式产生略微少一些的集落。这些数据提示，所述整合酶可识别鸡基因组中的假attP位点，并且它可用于PGC中有效的稳定转染。
实施例23.鉴定整合酶克隆中的插入位点
使用该整合酶和含attB质粒使得稳定转染的效率提高，这提示鸡基因组中含有可以被phiC31整合酶识别的假attP位点。为了证明attB HS4BGBP质粒是通过整合酶介导的反应而不是通过所述载体的随机断裂来整合的，对来自5个独立PGC克隆的基因组DNA进行Southern印迹分析，在每一个中均观察到了全长转基因，其结构与通过attB位点的整合相一致(数据未显示)。为了进一步在核苷酸水平上表征重组断裂点以鉴定假attP位点并鉴定插入的染色体位置，在12个我们的整合酶PGC系中克隆了所述载体与基因组插入位点之间的连接并对其测序。对于非整合酶系，如上所述进行质粒回复。我们观察到克隆所述连接片段的效率极大的降低；所获得大肠杆菌菌落的数量从非整合酶PGC系的平均每次转化69个菌落下降到整合酶介导的PGC系的每次转化3.1个菌落。此现象的原因尚不清楚，但是一种可能性是所述整合酶克隆侧翼的重复DNA(参见下文)更难以被限制性酶消化。从所述菌落纯化质粒DNA，测序，确定attL和侧翼序列(见下文表9)。因为已经用在转基因内部进行切割的酶消化了基因组DNA，所以用该方法仅可鉴定载体骨架上临近amp基因的侧翼基因组DNA；未分析所述转基因插入的另一侧的侧翼DNA。
参照图17，显示了来源于整合酶介导转染的PGC克隆中attB质粒与基因组序列之间的连接。最上面一项是野生型attB位点，其具有下划线显示的通常是重组交叉点的核心TTG，SEQ ID No：9，下面是来自整合酶介导插入物的attL序列，SEQ ID No：10-21。为了确定质粒上attB与基因组中假attP位点之间发生剪接的位置，将PGC序列与attB SEQ IDNo：9进行比较。在PGC序列中，所述质粒提供的attB序列以小写字母显示，基因组假attP序列是大写字母并为粗体。
发现在所有情况下由所述质粒上约一半attB序列构成的attL序列与基因组中的假attP位点相连，提示所述整合酶介导了该重组反应。所述质粒来源attB与基因组之间的重组不是精确的，并且通常不在attB的核心TTG核苷酸处发生。BLAT和BLAST检索定位了每个插入的基因组位置。出人意料的是，可被定位的十一个插入中的七个在重复DNA序列中。使用RepeatMasker Web Server(Institute for Systems Biology)和ClustalW序列比对来分析重复，发现所述序列可归类为之前鉴定的PO41重复(Wicker等)。参照图18A，显示了来自PGC插入位点的PO41样重复与PO41共有序列SEQ ID NO：29的比对。将插入到PO41样重复中的来自所有克隆的PGC侧翼序列彼此进行比对，并与PO41共有序列进行比对(Wicker等2004)。前20个核苷酸是所述载体提供的attB序列(如比对上方所示)，然后是来自各个克隆的基因组侧翼序列。在超过一半的序列中共有的核苷酸以黑色框显示。所述序列的比对显示两个PGC系(2-47SEQ ID No：23和18-5-36-2SEQ ID No：22)在相同基因组位点带有attBHS4BGBP插入。这两个插入是独立的，如下所显示：attB-假attP连接处的核苷酸序列在两者之间是不同的。除了20bp的插入之外，另一个序列(18-3-12SEQ ID No：24)与前两者相同。所述插入中鉴定出的PO41重复无一是所述共有序列的精确拷贝，PO41共有序列与所述插入位点重复之间的序列同源性水平为47％(18-3-43)至77％(1-30)的核苷酸同一性。参照图18B，100bp PO41共有重复与100bp attP的比对显示出约46％的序列同一性，其高于针对人细胞中的假attP位点所观察到的(Thyagarajan2001)。认为所述PO41重复位于基因组的259个位置(Wicker等)，每个位置由数kb的41bp重复单元组成。一些侧翼基因组片段为10-12kb大小；在对这些片段的两端进行测序时，两者都是重复的，提示所述重复的总大小很大。因此，PO41序列是鸡基因组中phiC31整合酶优选的大靶标。
剩下的4个整合酶介导插入在独特的DNA序列中。所述序列之一(19-1-1SEQ ID No：12)位于21号染色体上具有独特序列的基因间区域，另一个(1-41SEQ ID No：10)插入在5号染色体上Wilm肿瘤(WT1)基因的鸡直系同源物的启动子区中。一个序列(5-7SEQ ID No：11)位于1号染色体的多个位置，其可代表局部基因家族或低拷贝数重复。一个序列(18-4-11SEQ ID No：13)不匹配鸡基因组或通用“非冗余”数据库中的现有序列，因此有可能位于尚未测序的基因组区域中。最后一个插入(2-38SEQ ID No：21)仅产生非常短的由假attP位点组成的序列，无法在数据库中对其进行鉴定。
Figure GPA00001096868300461
实施例23.鉴定基因修饰的染色体
我们还关注了在我们可以指定其位置的独特序列中含有插入之品系的染色体。在PGC中的28个独立插入中，我们在鸡核型中38条染色体中的17条不同染色体中观察到插入(表8和9)。大约一半的插入物位于大染色体(1-6号染色体；13个插入)中，另一半位于小染色体(738号染色体；14个插入)中，一个插入位于Z染色体中。插入到大染色体和插入到小染色体的比例与它们对基因组的物理贡献成正比，表明整合没有区域偏好。
实施例24.基因靶向
设计了靶向载体，以在通过同源重组插入内源基因座时用HS4ERNI-puro选择盒取代免疫球蛋白轻链基因的J区和C区(图19)。如上所述，ERNI启动子(驱动嘌呤霉素盒)在早期胚胎中特异性表达(Acloque等2001，见上文)，并预计以类似于其他启动子的频率在PGC中产生抗药性集落。参照图20，最上面一项是针对鸡IgL基因的靶向载体图，IgLKO5。其设计用来使用31kb的HS4ERNI-puro选择标记(显示为I和HS4隔离区)来取代IgL基因的J C区(23kb)。两个同源臂长23和63kb。在3′端，β-肌动蛋白EGFP允许通过绿色荧光对puro抗性克隆进行筛选，以富集被靶向的克隆。最后的虚线是pKO载体骨架(Stratagene)。中间一项是IgL基因种系构造的野生型等位基因的示意图，其具有单个可变区(V)、连接区(J)和恒定区(C)基因。显示了用于对靶向克隆进行Southern分析的限制性位点(S，SacI；B，BstEII)以及下方用双箭头显示的野生型片段大小。下面一项是突变体等位基因的结构，其中J区和C区缺失，被HS4ERNI-puro所代替。显示了限制性图谱，以及下方显示的突变体片段大小。用于Southern分析的探针在靶向载体的外部，并显示了其位置。
使用1.05×108个细胞和210微克线性化DNA，从21个转染中分离出四个克隆。克隆中的两个表达GFP，表明它们在基因组中随机整合并保留GFP基因。使用来自整合序列两侧的探针对这四个克隆进行的Southern印迹分析显示，非绿色克隆之一(克隆2)就靶向突变而言是杂合的。参照图20，通过Southern分析来分析四个嘌呤霉素抗性克隆。克隆1和2不是绿色的，而克隆3和4表达GFP。左图中，用SacI消化来自PGC克隆的基因组DNA，将其与探针A杂交，以分析对IgL基因5′侧的靶向。右图中，用BstEII消化DNA，将其与探针B杂交，以分析对IgL基因3′侧的靶向。克隆2显示了杂合靶向克隆的预计大小片段。
实施例25.带有J-C敲除载体的G0嵌合体。
将实施例24中所述的带有J-C敲除的PGC注射到13-15期(H&H)白色来亨鸡受体胚胎的脉管系统中。从表型上来看，孵化的小鸡类似于白色来亨鸡。将雄性饲养至性成熟，通过腹部按摩收集精液。使用正向引物ERNI-133F：5’-TTGCTCAAGCCCCCAGGAATGTCA-3’SEQ ID No：32和反向引物Puro-8R：5’-CGAGGCGCACCGTGGGCTTGTA-3’SEQID No：33进行的PCR分析在图21中显示。参照图21，在来自至少两个G0嵌合体的精液中存在预计被扩增出的248bp大小的DNA，表明经基因修饰的原始生殖细胞已经进入种系中。
实施例26.将β-肌动蛋白-neo插入到醛脱氢酶基因座中
培养来自亲本细胞系13的PGC，利用198V、900μF的指数衰减脉冲，使用20微克线性化β-肌动蛋白-neo构建体对400μl中的5×106个细胞进行电穿孔，并铺板到48个一平方厘米的孔中，以获得单克隆。在新霉素存在下培养细胞，使得新霉素抗性克隆生长，将其转移到新孔中进行扩增。通过Southern分析细胞，以确定转基因的稳定整合，测序显示所述构建体整合到19号染色体中醛脱氢酶基因(参与醛代谢的酶)的启动子区。
培养带有β-肌动蛋白-neo构建体的PGC，将其注射到13-16期(H&H)受体胚胎中。将所述胚胎孵化，饲养4只公鸡至性成熟，检测种系传递。所述公鸡的种系传递率分别为0、0、0.5和0.5％。使来自这些公鸡之一的杂合后代生长至性成熟，并交配以获得纯合后代。
表10.带有β-肌动蛋白-neo(BN)的杂合鸡交配所得后代
Figure GPA00001096868300481
w/w：野生型，w/tg：杂合鸟，tg/tg：纯合鸟
五对交配的杂合公鸡和母鸡产生总共73只小鸡，对所述小鸡中BN转基因的存在情况进行评价。共有10只野生型小鸡(14％)、46只杂合小鸡(63％)、17只纯合小鸡(23％)(表10)。其分布与孟德尔分离的预计分布18.25/36.5/18.25没有显著差异(P＞0.01)(卡方＝6.55)。孵化前后死亡的小鸡比例在各基因型之间类似。这些结果表明BN转基因的插入不诱导致死表型。
将纯合公鸡饲养至性成熟，检测其生育力。将五只公鸡与野生型母鸡交配，计算其生育力、胚胎死亡和孵化百分比(表11)。尽管两只公鸡的生育力相对较低，但是这些鸟的精液产生较差，因此每次输精的精子数目也较低。两只鸟的生育力很好(＞90％)，一只鸟类的生育力中等。所有鸟类的受精卵孵化率都在正常范围内。综上，这些数据表明BN/BN鸟类的生殖功能是正常的。
表11.纯合BN公鸡的生育力
Figure GPA00001096868300491
因为BN转基因整合到醛脱氢酶基因中，没有见到对纯合鸟类的存活力有影响，因此我们对醛脱氢酶信息的转录进行评价。
使用Oligotex Direct mRNA试剂盒(Qiagen)从来自两只BN/BN纯合鸟、一只BN/+杂合鸟以及一只野生型鸟(+/+)的血中制备mRNA。然后，使用第一链cDNA合成Thermo-Script RT-PCR系统(Invitrogen)由5ml RNA合成cDNA。在后续PCR反应中使用1ml cDNA，其使用下列引物：
ALDH3A2-3     AGTGGTCACCGGGGGAGT SEQ ID No：34
ALDH3A2-4     TCACAGACACAATGGGCAGG SEQ ID No：35
Actin RT-1    AAC ACC CCA GCC ATG TAT GTA SEQ ID No：36
Actin RT-2    TTT CAT TGT GCT AGG TGC CA SEQ ID No：37
针对醛脱氢酶3家族成员A2转录本，ALDH3A2-3和A2-4引物SEQID No：34、35扩增出544和680bp PCR产物。对于肌动蛋白转录本，使用肌动蛋白RT-1和RT-2引物SEQ ID No：36、37扩增出597bp PCR产物。如图22所示，在杂合(BN/+)和野生型鸟(+/+)中检测到醛脱氢酶3家族成员A2转录本，但在纯合BN鸟(BN/BN)中未检测到，表明β肌动蛋白-neo转基因的插入产生醛脱氢酶3基因的插入性敲除，其不具有形态学表型。
通过对544bp和680bp PCR产物进行测序，证实所述引物扩增了醛脱氢酶3家族成员A2转录本。544bp产物完全包含在680bp PCR产物中，后者还含有外显子5和6之间136bp未剪接的内含子(图23)。将这些序列与公开的鸡基因组进行比较显示它们是相同的。
实施例27.将β-肌动蛋白-gfp-β-肌动蛋白-puro插入到未知EST中
培养来自亲本细胞系54的PGC，使用20微克线性化β-肌动蛋白-GFP-β-肌动蛋白-puro构建体对5×106个细胞进行电穿孔，铺板于48孔1cm2孔中，以获得单克隆。在嘌呤霉素存在下培养细胞，使得仅有嘌呤霉素抗性克隆生长。将抗性克隆转移至新孔进行扩增。通过Southern分析对细胞进行分析，以确定所述转基因的稳定整合，对其进行测序显示所述构建体整合在8号染色体上的新基因(EST C0769951)中。
培养PGC构建体，将其注射到13-16期(H&H)受体胚胎的脉管系统中。将所述胚胎孵化，饲养8只公鸡至性成熟，检测种系传递。所述公鸡的种系传递率分别为0、1、11、12、13、16、28和92％。将来自这些公鸡的杂合后代培养至性成熟，使之交配以获得纯合后代(表12)。
表12.使携带β肌动蛋白-GFP-β肌动蛋白-puro(BGBP)的杂合鸡配种得到的后代
Figure GPA00001096868300511
w/w：野生型，w/tg：杂合鸟，tg/tg：纯合鸟
八对交配的杂合公鸡和母鸡共产生298只小鸡，评价其中BGBP转基因的存在情况。共有90只小鸡(30％)是野生型，128只小鸡(46％)是杂合的，80只小鸡(25％)是纯合的。这些结果符合25％野生型、50％杂合以及25％纯合后代的预计，表明该转基因以孟德尔遗传的形式遗传。大多数的纯合后代在孵化时或孵化前后死亡，所有小鸡中95％在6周龄前死亡。这些结果表明插入BGBP转基因产生了存活必需基因的功能性敲除。
为了克服这一问题，有利地将转基因插入预定位置而不是非受控随机插入。插入转基因到基因组中已知位置的能力相比于随机插入还有其它潜在的优点。以蛋白质产物过表达为目的而插入的转基因可以插入到已知允许高水平表达并且不被侵入的异染色质所沉默的位置。另外，可预计该转基因的插入在杂合或纯合状态下不对动物或细胞系造成有害作用。因此，不再需要筛选大量不同的随机插入来寻找具有高水平表达并且不破坏重要内源基因的插入。
实施例28.产生带有条件性凋亡诱导基因(Reaper)的转基因鸟类。
设计Reaper转基因
按照如下所述产生Reaper转基因(loxP-终止子-loxP-Reaper构建体)。通过使用果蝇(D.melanogaster)胚胎多聚(A)+RNA和REAPERF1(CAC CAG AAC AAA GTG AAC GA SEQ ID No：38)以及REAPERF2(TGT TTG ACA AAA AAT TGA TGC)引物SEQ ID No：39的RT-PCR来克隆Reaper cDNA。将Reaper cDNA插入CX骨架的RI位点，产生CX-Reaper构建体。通过定点诱变将KpnI位点插入到Reaper cDNA起始密码子的3’。将来自pBS302(Gibco/BRL)的1.5kb loxP-终止子-loxP盒克隆到KpnI位点，产生CX-LoxP-终止子-loxP-Reaper。使用RI和NotI位点，将loxP-终止子-loxP-Reaper片段插入到pENTRB2克隆(Invitrogen)。然后，将loxP-终止子-loxP-Reaper片段重组进pLenti6/UbC/V5-DEST(pLenti Gateway载体Invitrogen)，产生UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper构建体。
使用ViraPower慢病毒表达系统产生转基因鸟类
为了产生带有loxP-终止子-loxP-Reaper转基因的慢病毒，使用ViraPower慢病毒表达系统(Invitrogen)，产生高达4.8×109cfu/ml的高慢病毒效价。为了产生病毒，使用Lipofectamine用UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper构建体和包含VSV-G编码质粒的virapower包装混合物共转染293T细胞。转染后24小时收集病毒上清液，离心浓缩。通过用病毒上清液转导HT1080细胞来测定病毒效价。产生高效价以确保高转导和种系传递效率。
为了用病毒感染鸡胚胎，将1.5微升浓缩的病毒溶液注射进X期胚胎的胚下腔。在37.5-38℃下孵育3天后，将胚胎转移到另一代用壳，在37.5-38℃和50％湿度下继续孵育直至孵化。用带有UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper转基因的病毒共注射398个胚胎。孵化出155只鸟，通过对分离自鸡冠组织的DNA进行的PCR来分析其转基因的存在和性别。13只公鸡是UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper转基因阳性的。通过对分离自精液的DNA进行的PCR分析，其中10只也是UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper转基因阳性的。3只公鸡(6-03，6-51和9-51G0初始公鸡)将转基因传递到下一代。6-03、6-51和9-51的传递率分别为0.32％、0.26％和0.16％(表13)。
表13.6-03、6-51和9-51G0公鸡的种系传递率
Figure GPA00001096868300531
将G0期始雄性(6-03、6-51和9-51，带有不同的插入)与原种母鸡交配，分析其G1后代的转基因存在情况和转基因整合位点。通过Southern印迹分析对来自各个鸟的基因组DNA进行分析。用SphI或BclI消化基因组样品和UbC-loxP-终止子-loxP-Reaper载体(对照)。在0.7％琼脂糖凝胶上分离消化的DNA，转印至尼龙膜，用放射性标记的Reaper特异性探针进行检测，以鉴定连接片段。如图24所示，杂交基因组片段的大小大于对照，表明转基因已整合于其中。对于6-03、6-51和9-51品系，杂交的基因组片段具有不同的大小，表明6-03、6-51和9-51是独立的品系。
实施例29.产生带有Cre重组酶的鸡
Cre转基因的设计和组装
为了在鸡中表达Cre重组酶，构建转基因，其中将Cre基因置于鸡ERNI启动子的转录控制之下。ERNI基因(也称为cENS-1)在早期鸡胚胎(约X期，新产下卵的阶段，此时胚胎是原肠胚形成之前的未分化细胞层)和神经组织中表达。这样，Cre转基因被设计成在早期胚胎中表达，其中它将催化置于基因组中的loxP-Reaper转基因或者其他含有loxP之转基因中的loxP位点的重组。因为Cre在早期表达，因此所得的发育而成的鸡应该在每个胚层以及其身体的每个细胞中都带有重组的转基因。
为了将Cre转基因引入鸡种系，采取慢病毒载体方法。基于Invitrogen pLenti6-V5 Dest慢病毒载体构建慢病毒转基因。将pLenti6-V5Dest的慢病毒载体元件与ERNI-Cre基因相组合，产生pLenti-ERNI-Cre构建体。产生慢病毒并将其用于感染早期胚胎，在其中它稳定整合到基因组中。产生了约20个带有pLenti-ERNI-Cre转基因的转基因初始鸟。
使用下列引物对鸡ERNI启动子进行PCR扩增：
ERNI-738：5’-ATGCGTCGACGTGGATGTTTATTAGGAAGC-3’SEQ ID No：40
ERNI+83：5’-ATGCGCTAGCTGGCAGAGAACCCCT-3’SEQ ID No：41
将822bp的PCR产物克隆到pGEMT-easy(Promega)中并测序。然后，通过使用SacII(然后用T4DNA聚合酶产生平末端)和SpeI进行消化将ERNI启动子从所述载体中释放。通过使用ClaI(然后用T4DNA聚合酶产生平末端)和SpeI进行消化将CMV启动子从慢病毒载体pLenti6V5-Dest(Invitrogen)中去除。然后，将ERNI启动子与pLenti6V5-Dest慢病毒载体骨架相连接，用ERNI启动子替代其中的CMV启动子，得到pLenti-ERNI。
使用下列引物对在N端具有SV40核定位序列并且还具有方便用于克隆的限制性位点(5′端的BglII和3′端的EcoRI)的Cre基因进行PCR扩增：
Cre-C：5’-CCG CCG GAG ATC TTA ATG CCC AAG AAG AAG AGG AAG CTG TCCAAT TTA CTG ACC GTA CAC-3’SEQ ID No：42
Cre-R1：5’-TCGAATTCGAATCGCCATCTTCCAGCAGGCG-3’SEQ ID No：43
用BglII和EcoRI消化1040bp PCR产物，然后进行凝胶纯化。用BamHI和EcoRI消化穿梭载体pENTR 2B(Invitrogen)，对载体骨架进行凝胶纯化。将Cre PCR产物与pENTR 2B载体相连接，获得克隆。对克隆测序，确定Cre基因与预计一致并且在PCR扩增期间未获得任何突变。
为了将Cre基因重组进pLenti-ERNI构建体并将其置于ERNI启动子的转录控制之下，使用pENTR 2B-Cre克隆作为Cre基因来源以及pLenti-ERNI载体作为受体进行LR克隆酶反应(Invitrogen)。由此获得最终的构建体，pLenti-ERNI-Cre(8408bp)，其用于产生带有ERNI-Cre转基因的慢病毒。
产生带有pLenti-ERNI-Cre转基因的转基因鸟类
在293FT细胞中产生pLenti-ERNI-Cre慢病毒。对转染到293FT细胞中以产生慢病毒的每个转染而言，使用Lipofectamine试剂(Invitrogen)，用3微克环形pLenti-ERNI-Cre质粒DNA转染75％汇合的八百万个293FT细胞。使用Virapower packaging mix(Invitrogen)来表达在293FT细胞中制备慢病毒所需的病毒蛋白质。转染2天后收获含有慢病毒的细胞培养上清液，过滤除去细胞碎片，通过在48000g下离心90分钟浓缩慢病毒颗粒。在1/200起始体积的培养物上清液中重悬病毒沉淀，以40微升等分试样冷冻于-80摄氏度。
用HT1080细胞通过下列步骤确定每批慢病毒储液的感染效价：将病毒储液系列稀释至10-4至10-8，添加到含有1微升聚凝胺的HT1080培养物中。加入慢病毒后两天，开始进行杀稻瘟菌素选择(5微克/毫升)。由于细胞死于杀稻瘟菌素毒性，因此每隔一天更换培养基。开始杀稻瘟菌素选择之后10天，用结晶紫对集落进行染色，计数并计算效价。获得108至2×109的效价。为了使用病毒感染鸡胚胎，将1.5微升浓缩的病毒溶液注射到X期胚胎的胚下腔中。在37.5-38℃孵化3天后，将胚胎转移到另一代用壳中，在37.5至38℃和50％湿度下继续孵育直至孵化。总共用带有Erni-Cre转基因的病毒注射了310个胚胎。孵化出96只小鸡，通过对分离自鸡冠组织的DNA进行PCR来对转基因的存在和性别进行分析。8只小公鸡是Erni-Cre转基因阳性的。通过对分离自精液的DNA进行PCR，另有13只雄性也是Erni-Cre转基因阳性的。所测试的6只雄性中的4只将Erni-Cre转基因传递到下一代。Erni-Cre G0公鸡的种系传递率为0.24至1.32％不等(表14)。
表14.Erni-Cre G0公鸡的种系传递率
Figure GPA00001096868300551
分析带有pLenti-ERNI-Cre转基因的转基因鸡
为了证实pLenti-ERNI-Cre转基因完整地整合进了鸡基因组，使用了Southern印迹分析。从已经先通过PCR鉴定为带有Cre转基因的鸡中提取基因组DNA，用切割病毒5′和3′LTR序列的酶(BglII)进行消化，从而观察全长的完整转基因。选择具有不同的独立转基因插入的鸟进行分析。用BglII酶消化基因组DNA，转印至尼龙膜，使用放射性标记的Cre基因进行检测。图25显示8个ERNI-Cre品系的代表性Southern结果。在所测试的11个品系中，有10个含有预计的4.6kb ERNI-Cre转基因条带，表明该转基因完整整合进基因组中。有一个品系具有较小的条带，表明转基因发生了缺失或重排。
实施例30.建立允许转基因发生位点特异性整合的细胞系。
有两种主要的方式将外源DNA插入到宿主基因组的预定位置：同源重组(基因打靶)或者位点特异性重组到识别位点例如attP。同源重组在大多数脊椎动物细胞类型中效率很低，为了鉴定一个或几个具有期望插入的克隆通常需要筛选许多克隆。位点特异性重组是一种高保真、高效率的方法，其可用于将外源DNA插入到预定位点，而无需筛选大量克隆。位点特异性插入依赖于使用phiC31整合酶将含有attB的构建体插入到置于基因组中的独特attP位点，或者插入到假attP位点。为了使用置于基因组中的真attP位点作为停泊位点，attP位点必须被置于优选的预定位置。通过随机插入或同源重组将attP位点置于基因组中这样的优选位置。如果通过随机插入将识别位点置于基因组中，那么必须验证插入的位置以确保没有破坏重要基因。然后将置于基因组中的识别位点作为“停泊位点”用于使用phiC31整合酶插入转基因。
为了对整合酶介导的转基因特异性地插入到停泊位点进行选择，使用选择标记系统来选择正确的插入。将停泊位点设计成使得attP位点邻近不带启动子的药物选择标记(例如嘌呤霉素抗性基因)。因此，带有停泊位点的细胞对使用嘌呤霉素进行的药物选择敏感。待插入到所述停泊位点的转基因含有邻近其attB位点的启动子，但不含选择标记。所述转基因在所述停泊位点的插入使得所述启动子置于所述选择标记的上游，活化其转录并赋予嘌呤霉素抗性。所述转基因插入到基因组中的其他位置不导致抗药性，这样的插入被药物选择所淘汰。
attP停泊位点构建体由邻近无启动子药物选择标记(例如嘌呤霉素抗性)的attP位点组成。因为所述嘌呤霉素抗性基因不表达，所以必须再包含另外一种选择标记，例如β-肌动蛋白启动子驱动的新霉素选择标记。还可包含EGFP基因。这些元件的每一侧是两个拷贝的β-珠蛋白HS4隔离区，将所述构建体与相邻染色质隔离开。为了将来去除所述构建体的β-肌动蛋白neo和EGFP部分，将loxP位点置于这些元件的侧翼。所述构建体的所有这些部分用作递送真attP位点到基因组中的载体。DNA元件的顺序是：HS4；attP；无启动子嘌呤霉素抗性基因；loxP；β-肌动蛋白或CAG启动子；EGFP；β-肌动蛋白或CAG启动子；新霉素抗性基因；HS4；质粒骨架(pBluescript)。将所述构建体线性化，转染到培养的PGC中，获得药物抗性集落。扩增这些集落用于进一步分析。
因为知道停泊位点在基因组中的什么位置是非常重要的，所以测定每个克隆中所述停泊位点构建体的染色体插入位置。获得侧翼基因组DNA，测序，将其与鸡基因组数据库进行比较。发现大多数克隆插入在CpG岛中，其为通常与基因(尤其是看家基因或遍在基因)启动子区相关联的基因组区域。此外，测得大部分插入位于基因的启动子区域、第一外显子或者第一内含子中。因此，预计许多插入破坏了这些基因的功能(参见实施例29；表8)。这些基因是已知基因或者根据表达序列标签(EST)序列预测的基因。优选的细胞系是看来不破坏基因的细胞系，例如DOC1或DOC33。
可通过Cre-lox重组使停泊位点的CAG-EGFP-CAG-neo部分缺失。Cre-lox重组之后，所述停泊位点中仅有HS4隔离区、attP位点以及无启动子puro基因。这减少了细胞和转基因鸡中所产生的外源蛋白的量，外源蛋白可能对健康有影响，特别是在以强启动子(例如CAG或β-肌动蛋白)普遍表达时。可以通过用环形Cre表达载体瞬时转染停泊位点克隆，在细胞培养物中进行Cre-lox重组。数天后，监测培养物由于CAG-EGFP基因切除而导致的EGFP表达丧失。约50％的细胞不再表达EGFP，可通过流式细胞术分选这些细胞从而对其进行纯化(图26)。
或者，可通过将带有停泊位点构建体的转基因鸡与带有ERNI-Cre转基因的鸡(Cre4鸟)进行杂交进行Cre重组。
当制得整合有这些停泊位点的转基因鸡时，所得纯合鸡可以是健康且可生育的，尽管其具有基因中的插入。这样的品系的一个例子是TP85品系(也称为BN；参见实施例26)，其在鸡19号染色体上的编码醛脱氢酶3家族成员A2的基因中具有插入。所述构建体是HS4-隔离的β-肌动蛋白neo转基因，其插入在基因转录起始位点约10bp内的启动子区域中。纯合插入的鸟是健康且可生育的。
但是，在一些情况下，插入可造成有害影响，例如发育缺陷、解剖学或生理学缺陷、不育等等。参见实施例27。因此，验证随机插入的停泊位点插入以确保它不在动物中造成任何有害影响是非常重要的。
实施例31.建立由超过10.5kb表达的DNA组成的停泊细胞系(docking cellline)
Doc-1细胞系带有由下列组成的转基因：HS4；attP；无启动子嘌呤霉素抗性基因；loxP；CAG启动子；EGFP；CAG启动子；新霉素抗性基因；HS4(参见实施例29)。将所述构建体线性化，转染到培养的PGC中，获得药物抗性集落。扩增这些集落用于进一步分析。将Doc-1细胞系注射到受体胚胎中，孵化G0嵌合小鸡。将公鸡培养至性成熟，通过FACS分析分析其精子中GFP阳性精子的存在情况。选择两只公鸡进行配种，种系传递率为3％和8％。从GFP阳性小鸡中取血，通过Southern进行分析，以确定停泊位点的存在(图27)。
实施例32.停泊位点的靶向插入
为了避免将真attP位点置于基因的CpG岛中，可以使用基因打靶将attP位点置于鸡基因组的预定位点中。选择基因组的区域，通过高保真PCR或在质粒载体中通过基因组克隆制备同源臂，用选择标记组装靶向载体，用于转染和选择PGC克隆。
实施例33.位点特异性插入到带有停泊位点的细胞系中
为了插入到停泊位点中，构建含有attB位点的环形构建体。含有attB的构建体类似于上述实施例中所用的构建体，其重要区别在于没有选择标记。取而代之地，将启动子(例如ERNI启动子)置于attB位点附近，使得在整合到所述停泊位点中之后，所述启动子处于驱动停泊位点中选择标记表达的位置。
启动子-attB骨架可用于选择插入到attP-无启动子puro停泊位点中的插入。attB构建体带有其他目的基因，例如驱动编码药物蛋白质(如抗体)之基因表达的组织特异性启动子。
在含所述停泊位点的PGC细胞系中测试所述停泊位点的功能和在停泊位点中的整合效率。用0.5微克含有Erni-attB的构建体以及0.5微克表达整合酶的环形构建体共转染5×106个细胞。电穿孔之后，将细胞重新铺板于48个1平方厘米孔中，以获得单集落。在48个孔的42个中，观察到集落。
通过扩增由于attB与attP重组而产生的attL位点的PCR显示，ERNI-attB构建体正确整合到停泊位点中。一个引物在ERNI序列中，一个引物在嘌呤霉素序列中，扩增仅在ERNI启动子整合到嘌呤霉素基因上游时发生。使用三组引物，均产生了阳性结果：
ERNI-37F+puro-8R产物大小152bp
ERNI-133F+puro-8R产物大小248bp
ERNI-342F+puro-83R产物大小522bp
引物序列：
ERNI-37F    ACCACGGCAACGGGAGAGGCTTAT SEQ ID No：44
ERNI-133F   TTGCTCAAGCCCCCAGGAATGTCA SEQ ID No：32
ERNI-342F   TGGGCAAAGGCAGAGGAATC SEQ ID No：45
puro-8R     CGAGGCGCACCGTGGGCTTGTA SEQ ID No：33
puro-83R    GCGTGGCGGGGTAGTCG SEQ ID No：46
通过PCR测试来自将ERNI-attB转染进DOC2细胞的四个独立克隆，所有四个克隆用所有三组引物均显示得到正确大小的扩增产物。克隆使用ERNI-133F SEQ ID No：32+puro-8R SEQ ID No：33引物产生的PCR产物，并测序以验证PCR产物的正确性。该序列完美地匹配预计的attL序列(attB和attP的组合)并且含有预计的部分ERNI和嘌呤霉素序列。因此，在attB和attP位点中正确的核心核苷酸处发生整合酶介导的重组交叉事件，验证为真。
实施例34.在鸡胚胎中Cre使loxP位点有效重组
对10个具有完整pLenti-ERNI-Cre转基因的Cre品系(以及具有重排ERNI-Cre转基因的1个品系)的Cre重组酶活性进行检测。尽管预计ERNI启动子在早期胚胎中驱动高水平的Cre重组酶表达，但如果它们恰好整合进基因组的不利区域的话，则转基因可能是沉默的(被称为″位置效应″的现象)。因此，在我们所有的Cre系中确定Cre重组酶活性以选择具有所需活性水平的品系是非常重要的。
为了确定我们的Cre转基因的活性水平，通过Southern印迹来分析双转基因胚胎中Cre催化loxP-Reaper转基因重组的能力，所述双转基因胚胎带有一个拷贝的Cre转基因和一个拷贝的loxP转基因。所述loxP-Reaper转基因含有1.4kb序列，称为STOP盒(终止子盒)，其侧翼是相同方向的loxP位点。两个loxP位点之间的重组导致所述1.4kb插入序列从染色体上被切下，留下单个loxP位点。然后，间插序列不再与染色体连接而发生丢失。切除之后，loxP-Reaper转基因的大小减少了1.4kb。进行Southern印迹测定，其中使用loxP-Reaper转基因大小的减少来测量Cre重组酶的活性。在与Reaper基因和一部分慢病毒载体骨架(杀稻瘟菌素基因和SV40序列)组成的探针杂交时，用限制性酶SacI进行消化产生约2.8kb的全长(非重组)loxP-Reaper片段。在Cre介导重组和切除1.4kbSTOP序列之后，在与相同探针杂交时，Reaper片段的大小减少约1.4kb。所述探针与不受Cre重组影响的序列杂交，因此它等同地与全长和重组的loxP-Reaper转基因杂交。
为了估计多种pLenti-ERNI-Cre转基因品系所表达的Cre活性水平，测定全长(非重组)和重组转基因的条带强度比。如果Cre无活性，则观察到很少或没有重组Reaper，仅观察到全长的。如果Cre具有中等活性，则观察到两种SacI片段，表明在一些细胞中发生重组而在另一些细胞中没有。如果Cre活性很高，则仅观察到重组Reaper条带，因为loxP-Reaper转基因在每个细胞中都已发生重组。
表28中给出了Cre系活性的数据总结。在所测试的11个品系中Cre活性在品系之间变化很大，有时在品系内也变化很大。11个品系中仅有一个品系催化100％的loxP-Reaper转基因重组(Cre4品系)。在该品系中，所测试的每个胚胎(18个中的18个)均显示100％的重组。在其他品系中，重组水平范围为约5％至最高约80％。对于这些品系中的几个(Cre1、Cre2、Cre11和Cre20)，重组的水平在不同胚胎之间变化很大。例如，Cre11和Cre20在一些胚胎中仅催化约10％的重组，但是在另一些胚胎中则高达60％。对于大多数胚胎，分析了脑和骨骼肌组织，在每个情况下两种组织中的重组水平都类似。因为认为ERNI启动子在神经组织中有活性，预计脑有可能会显示出重组水平增加，但是在脑和肌肉中的重组总是大致相同的。尚不清楚所观察到的Cre重组酶活性变化是Cre表达水平变化还是Cre活性表达时间长度变化所造成的。例如，在Cre4品系中，可能是Cre以低水平持续表达，导致累积重组在第15天发展为100％，而其他的品系可能在每个细胞中发生重组之前的时间使Cre表达沉默。或者，Cre4可能表达非常高水平的Cre蛋白，但是仅在发育早期表达，催化100％的重组。
不显示重组的唯一的品系是具有重排或者缺失转基因的品系。
实施例35.三个带有不同reaper插入的鸡品系的成功重组
为了显示pLenti-ERNI-Cre转基因鸡中Cre重组酶能够催化不同loxP底物的重组，将Cre4品系与三个不同的loxP-Reaper品系(称为6-03、6-51和9-51)杂交。选择Cre4品系，因为它之前显示100％重组。选择遗传了loxP-Reaper转基因之一和一个Cre4转基因拷贝的胚胎。
为了确定三个loxP-Reaper转基因的重组水平，通过Southern印迹分析双转基因胚胎中Cre催化重组的能力，所述双转基因胚胎带有一个拷贝的Cre4转基因和一个拷贝的loxP-Reaper转基因。所述loxP-Reaper转基因含有1.4kb序列，称为STOP盒(终止子盒)，其侧翼是相同方向的loxP位点。两个loxP位点之间的重组导致所述1.4kb间插序列从染色体上被切下，留下单个loxP位点。然后，间插序列由于不再与染色体连接而发生丢失。切除之后，loxP-Reaper转基因的大小减少了1.4kb。进行Southern印迹测定，其中使用loxP-Reaper转基因大小的减少来测量Cre重组酶的活性。在与Reaper基因和一部分慢病毒载体骨架(杀稻瘟菌素基因和SV40序列)所组成的探针杂交时，用限制性酶SacI进行消化产生约2.8kb的全长(非重组)loxP-Reaper片段。在Cre介导重组和切除1.4kb STOP序列之后，在与相同探针杂交时，Reaper SacI片段的大小减少约1.4kb。所述探针与不受Cre重组影响的序列杂交，因此它等同地与全长和重组的loxP-Reaper转基因杂交。
为了估计每个loxP-Reaper系中Cre-lox重组的量，测定全长(非重组)和重组转基因的条带强度比。如果Cre4能够切除所有三个Reaper系中的STOP盒，则仅会观察到重组Reaper条带，这是因为loxP-Reaper转基因在每个细胞中都已发生重组。图29所示结果表明，在Cre4转基因存在下所有三个Reaper品系发生100％的STOP盒切除。
实施例37.Cre介导的对来自鸡基因组中所整合停泊位点的EGFP和neo的切除
可以在培养的PGC中体外进行Cre重组，以及在转基因鸟中进行Cre重组。为了在培养的PGC中实施Cre-lox重组，用Cre表达载体瞬时转染细胞。
使用DOC2细胞进行Cre表达载体的转染。该PGC品系带有停泊位点构建体，其整合进21号染色体上与Prkz和几个EST连锁的CpG岛中。所有起始DOC2培养物中的所有细胞均发出绿色荧光，因为它们在所述停泊位点构建体中带有CX-EGFP基因。使用两种Cre表达载体：pBS185，其具有人CMV启动子转录控制之下的Cre基因，或者ERNI-Cre构建体，其中ERNI启动子驱动Cre表达。
将Cre表达构建体瞬时转染进DOC2细胞。数天后，监测培养物的绿色荧光丧失，其作为细胞摄入Cre构建体、表达Cre以及Cre造成停泊位点载体上loxP位点之间序列(包括CX-EGFP-CX-neo)切除的指示。Cre转染之后，所述培养物由绿色和非绿色细胞组成。为了纯化这两个群体，通过流式细胞术根据绿色荧光分选所述培养物。收集每个群体数百万个细胞(绿色和非绿色)。
为了证明非绿色细胞群中EGFP基因已被切除，使用Southern印迹分析(参见图30)。制备来自两个细胞群的基因组DNA(绿色和非绿色)，用HindIII限制性酶消化。在琼脂糖凝胶分离DNA，转移至尼龙膜，使用来自所述停泊位点中存在的嘌呤霉素抗性基因的放射性标记序列进行杂交。puro基因位于所述停泊位点构建体中未被Cre-lox重组切除的区域中，因此puro探针将在来自DOC2切除及未切除细胞的基因组DNA中均检测到片段。HindIII片段预计大小为：EGFP+(未切除)，5521bp；EGFP-(切除)，1262bp。观察到预计的片段，表明在非绿色细胞中，Cre-lox重组导致整合到DOC2细胞中的停泊位点构建体中位于两个loxP位点之间的CX-EGFP-CX-neo序列缺失。
实施例38.制备IgL pKO5B靶向载体
为了靶向鸡IgL基因座，制备在靶向整合后缺失所述基因座中内源J区和C区的靶向载体(图31)。除了改变了选择标记之外，所述载体与之前描述的IgL pKO5相同。所述载体的5′同源区由IgL V区邻近的2327bp片段组成，3′同源区由C区下游的6346bp片段组成。从得自靶向转染所用细胞系的同基因DNA中克隆同源臂。所述靶向构建体含有一个或多个破坏表达的手段，例如终止密码子、无义序列、attP位点或其组合。所述载体还含有选择标记基因和位点特异性重组位点。
HS4ERNI-neo：将804bp新霉素抗性基因置于800bp ERNI启动子的转录控制之下以便在PGC中表达。鸡中ERNI表达仅限于非常早期的胚胎，因此选择标记应不在成年鸡中表达。来自鸡β-珠蛋白基因座的250bp核心HS4隔离区元件是串联二联体，二联体隔离区位于ERNI-neo选择标记的两侧。将单个loxP位点(用于Cre介导的重组)克隆到HS4-ERNI-neo的上游。
loxP＝ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT(SEQ ID.No.47)
attP-puro：600bp puro基因与43bp attP位点相连(用于phiC31介导的重组)，没有启动子。然后将attP-puro克隆到HS4-ERNI-neo的下游。loxP-HS4-ERNI-neo-attP-puro选择标记盒共4089bp。
attP＝ACGCCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGC(SEQ ID.No.48)
5′同源臂：通过将来自PGC35 IgL SacI克隆的1994bp NcoI-BamHI片段与从PGC35基因组DNA扩增的333bp NotI-NcoI PCR产物(使用引物5′-NotI
TTCTTGCGGCCGCAGGGAGCCATAGCCTGCTCCCATCATGCCC(SEQ ID.No.49)和3’-NcoI，AGAGGAGCCCAGGCCATGGCGGAAT)(SEQ ID.No.50))连接产生2327bp片段。
PCR片段含有重叠的基因组NcoI位点以连接所述两个片段。
使用NotI和BamHI释放所得2327bp片段，用以克隆进入pKO载体骨架中HS4ERNI-puro的上游。所述基因组中不存在NotI位点，但通过PCR添加。
3′同源臂：通过连接下列三个片段产生6346kb SpeI-BglII片段：来自SacI基因组克隆的SpeI-EcoRI片段，加来自EcoRI-MfeI基因组克隆的EcoRI-ApaLI克隆，加从EcoRI-MfeI克隆扩增的300bp ApaLI-BglII PCR片段(引物5′ApaL
AGTGCAGCTGCAGTGCACGGTA(SEQ ID.No.51)和3′-BglII
TTCTTAGATCTGTGACAAGCAGTCTCCGGTTAACA(SEQ ID.No.52))。所述基因组中不存在BglII位点，而是通过PCR添加。将3′同源臂克隆进pKO载体骨架上HS4ERNI-puro和HS4β-肌动蛋白EGFP之间。
HS4b-肌动蛋白EGFP：使用1.3kb鸡β-肌动蛋白启动子来驱动700bp EGFP基因的表达。在末端加入双HS4隔离区的一个拷贝，从而将随机插入的靶向载体与位置效应隔离开，允许EGFP表达。
最终的IgL pKO5B靶向载体的大小为17681bp，在转染进PGC之前用NotI进行线性化。
实施例39.转染PGC和产生KO-07IgL敲除PGC细胞系
对38个等分试样的100微升电穿孔缓冲液(来自Amaxa的V缓冲液)中的5×106个细胞用各10微克DNA进行转染。用Amaxa核酸转染仪脉冲A33(Amaxa)对所有等分试样进行电穿孔。获得九个克隆，其中四个是GFP阳性的，不进行进一步研究。扩增五个非GFP表达克隆用于Southern分析，命名为KO-07、08、09、10和11。
实施例40.Southern印迹分析
对于5′侧同源重组，用SacI限制性酶消化来自IgL pKO5B转染的五个克隆PGC品系的基因组DNA，在0.7％琼脂糖凝胶上分离。将DNA转移到尼龙膜上，用来自鸡IgL基因座上游用作同源臂之区域的探针杂交(即外部探针)。该探针是0.5kb SacI-BstEII片段，其检测约10kb的野生型片段和约4kb的突变片段。(图32，左图)对于3′侧的靶向，用BstEII消化基因组DNA，用3′1.7kb NsiI-MfeI片段杂交印迹，其也在所述靶向载体的外部(图32，右图)。
实施例41.产生种系嵌合体
将3000个PGC注射进每个15-16期的胚胎(Hamburger&Hamilton)的背主动脉中。在代用壳中孵育胚胎。孵化的小鸡生长至性成熟。
通过人工授精将嵌合公鸡与野生型横斑芦花母鸡交配。从9只公鸡中收集精液用于使母鸡受精。公鸡中的6只将黑色羽毛表型传递给后代，显示了IgL敲除PGC的种系传递(表1)。公鸡中的1只(IV75-41)以高于50％的比例传递。
表15.由IgL敲除PGC产生的9只嵌合公鸡中的IgL敲除的种系传递率。列出了每只公鸡所产生的黑色后代数(表示敲除PGC的种系传递)和白色后代数(来自宿主PGC)。产生黑色后代的公鸡以粗体显示。
  公鸡   黑色数   白色数   种系传递百分比
  IV75-26   3   30   9％
  IV75-28   0   40   0
  IV75-41   23   19   55％
  IV75-42   1   47   2.1％
  IV75-48   1   53   1.8％
  IV75-49   1   72   1.4％
  IV75-58   0   9   0
  公鸡   黑色数   白色数   种系传递百分比
  IV75-59   0   60   0
  IV75-81   3   13   19
实施例42.对敲除胚胎的Southern印迹分析
处死发育14天的黑色羽毛胚胎，从骨骼肌制备基因组DNA。进行Southern印迹，显示敲除被传递到实验中所测试的7个胚胎中的5个中(胚胎2、3、4、6和7)。胚胎1和5是野生型胚胎，其从杂合的靶向KO-07敲除PGC中遗传了野生型IgL等位基因(图33)。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.转基因鸡，其包含内源基因座中选定部分的缺失。
2.根据权利要求1的转基因鸡，其中被破坏的内源基因是免疫球蛋白基因座。
3.根据权利要求2的转基因鸡，其中被破坏的内源基因是免疫球蛋白重链基因座。
4.根据权利要求2的转基因鸡，其中被破坏的内源基因是免疫球蛋白轻链基因座。
5.根据权利要求2的转基因鸡，其中被破坏的内源基因包含对基因片段的检测，所述基因片段选自：V基因片段、J基因片段和C基因片段及其组合。
6.根据权利要求1的转基因鸡，其中被破坏的内源基因座包含靶向构建体。
7.根据权利要求1的转基因鸡，其中所述靶向构建体将终止密码子、att-p位点、无义序列或其组合插入到所述内源基因座中。
8.根据权利要求6的转基因鸡，其中所述靶向构建体包含与所述内源基因座同源的两个区域以及位于所述同源区域之间的选择标记。
9.根据权利要求2的转基因鸡，其包含对重链内源免疫球蛋白重链基因和内源免疫球蛋白轻链基因二者的功能性破坏。
10.根据权利要求1的转基因鸡，其中所述内源基因座的缺失部分至少包含10kb。
11.产生转基因鸡的方法，其包括：
将靶向构建体引入鸡原始生殖细胞中，使得所述靶向构建体通过稳定整合进所述细胞的基因组中而破坏内源基因的至少一部分，将所述原始生殖细胞插入鸡胚胎中，以及从所述胚胎孵化出转基因鸡，其中所述鸡包含对所述内源基因的功能性破坏。
12.根据权利要求11的方法，其中所述内源基因是免疫球蛋白基因。
13.根据权利要求12的方法，其中所述免疫球蛋白基因是轻链基因。
14.根据权利要求12的方法，其中所述免疫球蛋白基因是重链基因。
15.根据权利要求12的方法，其中所述靶向构建体使选自下列的片段缺失：V基因片段、J基因片段和C基因片段及其组合。
16.根据权利要求11的方法，其中所述靶向构建体将终止密码子、无义序列、att-p位点或其组合插入。
17.根据权利要求11的方法，其中所述靶向构建体包含至少两个与所述内源基因同源的区域。
18.根据权利要求17的方法，其中所述靶向构建体向所述细胞基因组中的整合将位于所述两个同源区域之间的选择标记置于所述靶向构建体与所述内源基因之间。
19.根据权利要求11的方法，其中所述靶向构建体包含阳性选择标记。
20.根据权利要求11的方法，其中所述靶向构建体包含阴性选择标记。

Claims (20)

1.转基因鸡，其包含内源基因座中选定部分的缺失。
2.根据权利要求1的转基因鸡，其中被破坏的内源基因是免疫球蛋白基因座。
3.根据权利要求2的转基因鸡，其中被破坏的内源基因是免疫球蛋白重链基因座。
4.根据权利要求2的转基因鸡，其中被破坏的内源基因是免疫球蛋白轻链基因座。
5.根据权利要求2的转基因鸡，其中被破坏的内源基因包含对基因片段的检测，所述基因片段选自：V基因片段、J基因片段和C基因片段及其组合。
6.根据权利要求1的转基因鸡，其中被破坏的内源基因座包含靶向构建体。
7.根据权利要求1的转基因鸡，其中所述靶向构建体将终止密码子、att-p位点、无义序列或其组合插入到所述内源基因座中。
8.根据权利要求6的转基因鸡，其中所述靶向构建体包含与所述内源基因座同源的两个区域以及位于所述同源区域之间的选择标记。
9.根据权利要求2的转基因鸡，其包含对重链内源免疫球蛋白重链基因和内源免疫球蛋白轻链基因二者的功能性破坏。
10.根据权利要求1的转基因鸡，其中所述内源基因座的缺失部分至少包含10kb。
11.产生转基因鸡的方法，其包括。
12.产生转基因鸡的方法，其包括：
将靶向构建体引入鸡原始生殖细胞中，使得所述靶向构建体通过稳定整合进所述细胞的基因组中而破坏内源基因的至少一部分，将所述原始生殖细胞插入鸡胚胎中，以及从所述胚胎孵化出转基因鸡，其中所述鸡包含对所述内源基因的功能性破坏。
13.根据权利要求11的方法，其中所述内源基因是免疫球蛋白基因。
14.根据权利要求12的方法，其中所述免疫球蛋白基因是轻链基因。
15.根据权利要求12的方法，其中所述免疫球蛋白基因是重链基因。
16.根据权利要求12的方法，其中所述靶向构建体使选自下列的片段缺失：V基因片段、J基因片段和C基因片段及其组合。
17.根据权利要求11的方法，其中所述靶向构建体将终止密码子、无义序列、att-p位点或其组合插入到所述免疫球蛋白基因中。
17.根据权利要求11的方法，其中所述靶向构建体包含至少两个与所述内源基因同源的区域。
18.根据权利要求17的方法，其中所述靶向构建体向所述细胞基因组中的整合将位于所述两个同源区域之间的选择标记置于所述靶向构建体与所述内源基因之间。
19.根据权利要求11的方法，其中所述靶向构建体包含阳性选择标记。
20.根据权利要求11的方法，其中所述靶向构建体包含阴性选择标记。
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