DE69534227T2

DE69534227T2 - Stoffe und verfahren zur beherrschung der hyperakuten abstossung von menschlichen transplantaten

Info

Publication number: DE69534227T2
Application number: DE69534227T
Authority: DE
Inventors: Martin J. Pearse; Robert J. Crawford; Allan J. Robbins; Peter D. Rathjen; Anthony J.F. D'apice
Original assignee: Bresagen Ltd; St Vincents Hospital Melbourne Ltd
Current assignee: St Vincents Hospital Melbourne Ltd; Hospira Adelaide Pty Ltd
Priority date: 1994-01-27
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2015-01-28
Also published as: BR9506652A; US5849991A; US6849448B1; CA2181433C; AU1544595A; CA2181433A1; US20040171155A1; AU695373B2; DE69534227D1; EP0755451A1; EP0755451B1; EP0755451A4; ATE296349T1; ES2247588T3; US7201899B2

Description

Bereich der Erfindung
Die Erfindung betrifft im allgemeinen das Feld der Xenotransplantation. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren und Stoffe zur Reduzierung oder Eliminierung der hyperakuten Abstoßungsantwort in Menschen. Vor allem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Humanserum zur Reduzierung oder Eliminierung der hyperakuten Abstoßung. Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren und Stoffe zur Erzeugung nicht humaner Organe mit fehlender oder reduzierter α-1,3-Galactosyltransferase-Aktivität.
Hintergrund der Erfindung
Es weitgehend anerkannt, daß es einen akuten weltweiten Mangel an humanen Organen zur Transplantation gibt. Dies ist trotz legislativer Änderungen und Schulungssprogrammen, um das öffentliche Bewusstsein für das Problem zu steigern. Zum Beispiel gibt es in den Vereinigten Staaten ein geschätztes jährliches Defizit von ungefähr 18.000 Nieren pro Jahr. Ebenso haben in Australien 1992 nur 41% der auf eine Transplantation wartenden Nierenpatienten ein Transplantat erhalten. In Japan ist das Ungleichgewicht zwischen Angebot und Nachfrage aufgrund der religiösen Verbote bei der Verwendung von Organen von toten Spendern sogar noch größer.
Die Vorteile einer Transplantation werden bei dem Vergleich der Rehabilitationsrate von Transplantationspatienten mit der von Dialysepatienten ersichtlich. In Australien und in Neuseeland ist die Mehrheit der Transplantationspatienten (60%) für Vollzeitarbeit oder Schule geeignet und weitere 10% für Teilzeitarbeit, während nur 7% nicht zur Arbeit geeignet sind. Demgegenüber sind 23% der Dialysepatienten für eine Vollzeitarbeit oder Schule geeignet, 15% beteiligen sich an Teilzeitarbeit und 20% sind nicht zur Arbeit geeiget. Der Rest ist im "Ruhestand". Fifteenth Report of the Australia and New Zealand Dialysis and Transplant Registry (ANZDATA), Queen Elizabeth Hospital, Woodville, S.A., APS Disney, ed. (1992).
Die direkten finanziellen Kosten von Dialyse in Australien und Neuseeland ist ungefähr $A 45.000/Patient/Jahr. Zusätzlich sind die indirekten Kosten aufgrund von Arbeitslosigkeit und Krankheit bei Dialysepatienten höher und die sozialen Kosten sind beträchtlich. Eine Transplantation erzeugt einen Aufwand von ca. $A 30.000/Patient in dem ersten Jahr und danach $A 14.000/Patient/pro Jahr. Diese Statistik zeigt, daß a) Transplantation ist die optimale Therapie für das Endstadium bei Nierenversagen; b) es gibt eine Unterversorgung von Spendernieren; und c) momentane Strategien zum gezielten Ausstieg der Transplantationsrate waren weniger erfolgreich. Zusätzlich gibt es ernsthafte Defizite bei anderen transplantationsfähigen Organen, Herz, Leber, Lunge und Pankreas eingeschlossen.
Die Verwendung von Xenotransplantaten (Transplantationen zwischen Spezies) ist eine Möglichkeit zur Überwindung des knappen Vorrates von humanen Organen zur Transplantation. Nicht-lebensfähige, nicht-antigene Xenotransplantate werden in der vaskulären Rekonstruktion (Rinderarterien) und in der Herzchirurgie (Schweineherzklappen) allgemein verwendet. Dennoch haben immunologische Barrieren die allgemeine Verwendung von lebensfähigen Xenotransplantaten, trotz ihrer gelegentlichen Verwendung in der Vergangenheit, verhindert. Zwischen 1964 und 1991 wurde von insgesamt 27 nicht-Humanprimaten zu Humanen-Organ Xenotransplantat berichtet; das am längsten berichtete Überleben eines Patienten war neun Monate. Vor kurzem wurden zwei Lebertransplantationen vom Pavian zum Menschen durchgeführt mit der Erwartung, daß moderne immunsuppressive Therapien die wahrscheinlich bei Xenotransplantationen vorkommenden ernsten Abstoßungsprobleme bewältigen können. Bis heute wurde der Verlauf von einem dieser Patienten berichtet und in diesem Fall war die Abstoßung nicht die direkte Ursache des Todes. Starzl et al., Baboon-to-Human Liver Transplantation. Lancet 341: 65–71 (1993). Diese klinische Erfahrung zeigt, daß a) nicht-humane Organe funktionieren können und das menschliche Leben unterstützen; b) Abstoßungsvorfälle durch konventionelle, Anti-Abstoßungstherapien aufgehoben werden können; und c) die Mechanismen der Abstoßung im Prinzip denen bei der Allotransplantationsabstoßung ähnlich sind.
Es ist unwahrscheinlich, daß Primaten eine befriedigende Bezugsquelle von Organen für Xenotransplantationen sind. Die Meisten sind vom Aussterben bedrohte Arten, die sich langsam in der Wildnis und schlecht in der Gefangenschaft fortpflanzen. Der Pavian ist eine Ausnahme zu diesen Verallgemeinerungen, aber andere Nachteile limitieren die Brauchbarkeit dieser Spezies. Paviane haben Einzelschwangerschaften, lange Gestationszeiten, sind schwierig und teuer zum Aufrechterhalten und können mit human-pathogenen Organismen, zum Beispiel Viren, entweder infiziert sein oder mit sich tragen. Bei Herz und Leber, bei denen die Organgröße ein Gesichtspunkt sein kann, sind die kleinen Primaten als Spender ungenügender als menschliche Erwachsene. Letztendlich wird die Verwendung von Primaten einen wahrscheinlich beträchtlichen Widerstand seitens der Öffentlichkeit hervorrufen.
Diese Schwierigkeiten führten zu einem erneuten Interesse in der Verwendung von nicht Primatenspezies als Organspender für menschliche Patienten. Das Schwein ist eine weitgehend anerkannte Wahl zur Xenotransplantation beim Menschen. Der Schweine-Erythrocytendurchmesser (6,5 μm) und als Folge seine Kapillargröße sind dem Menschen ähnlich, welches die Verbindung von Xenotransplantaten mit dem menschlichen Kreislaufsystem erleichtern. Das Schwein pflanzt sich in der Gefangenschaft gut fort, besitzt eine kurze Gestationszeit und erzeugt große Würfe. Zusätzlich können Schweine in wenig pathogenen Einrichtungen gezüchtet und gehalten werden, können bis zu einer beliebigen Größe aufgezogen werden und rufen nicht den Level an Öffentlichkeitsreaktionen verbunden mit Primaten hervor.
Die immunologischen Barrieren bei der Verwendung von Schweineorganen in Humanpatienten beinhalten a) ein sofortiges ernstes („hyperakutes") Abstoßungsphänomen, daß sich in Minuten bis Stunden nach einer Transplantation entwickelt, und b) eine vorgeschlagene akute Abstoßung, die sich in Tagen bis Wochen entwickelt. Sobald das hyperakute Abstoßungsphänomen bewältigt wurde, wird erwartet, daß eine normale akute Abstoßung folgt. Man glaubt das diese Form der Abstoßung der erfahrenen Allotransplantation (Transplantate zwischen Individuellen der gleichen Spezies) ähnlich und den normalen suppressiven Therapien zugänglich ist.
Man nimmt an das beide, der vorgeformt "natürliche Antikörper" (Xenoantikörper) und die Komplementregulationsfaktoren in Humanserum im Prozeß der hyperakuten Abstoßung involviert sind. Man glaubt, daß die hyperakute Abstoßung durch binden der Xenoantikörper an den Epitopen auf dem Endothelium des Spenderorgans initiiert wird und dadurch den klassischen Komplementweg aktivieren.
Sandrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 11391–11395 (1993) teilt mit, daß Antikörper im Humanserum vorzugsweise mit den Gal (α-1,3)-Galepitopen reagiert, die auf der Oberfläche von Schweinezellen gefunden werden, und die Isolierung von muriner α-1,3-Galactosyltransferase.
Zusammenfassung der Erfindung
Gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung umfassend, die Schweine-Nukleinsäuresequenz dargestellt in 4 (SEQ ID NO:7) die ein Schweine-Polypeptid mit einer α-1,3-Galactosyltransferasenaktivität kodiert. Variationen dieser Sequenz, die routinemäßig durch eine Fachperson generiert werden können, beinhalten diese Sequenzen entsprechend nach 4, sind aber unterschiedlich innerhalb des Bereiches der Degeneration des genetischen Codes. Natürlich beinhaltet die vorliegende Erfindung Varianten der Sequenz dargelegt in 4, die leicht durch eine Fachperson ermittelt werden kann, die für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren die durch die Sequenz dargestellt in 4 verschlüsselt ist. Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem ein gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Schweine-α-1,3-Galactosyltransferase kodiert und das unter hohen Srigenz-Bedingungen mit einer Sequenz, die komplementär zu der Sequenz dargestellt in 4 ist oder mit einer Sequenz komplementär zu einer Variation der Sequenz dargestellt in 4, innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes hybridisiert. Die komplementären Stränge zu den oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen sind mit Standardmethoden leicht ermittelbar und liegen auch innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Innerhalb der Kenngrößen, dargelegt in den vorausgehenden Paragraphen, beinhaltet die vorliegende Erfindung Varianten der für Schweine-α-1,3-Galactosyltransferase kodierenden Sequenz, die die funktionellen Charakteristika des nativen Genprodukts bewahren. Zum Beispiel beinhalten solche Varianten kleine Nukleotidvariationen in der 5' nicht-translatierten Region oder in verschiedenen kodierenden Regionen der offenbarten Sequenz. Innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung sind kleine Aminosäurevariationen von Änderungen in den kodierenden Regionen abgeleitet, die eine funktionelle α-1,3-Galactosyltransferase-katalytische Seite hinterlassen, Membranverankerungsdomänen und Stammregionen wie nachgehend beschrieben. Solche Routinevariationen von Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzenm, kön nen durch Personen mit herkömmlichem Fachwissen identifiziert werden, die sich aufstützen der Sequenz und strukturellen Informationen hier zur Verfügung gestellt.
Wie nachstehend verwendet sind "hohe Stringenz-Bedingungen" solche Hybridsierungs-Bedingungen, die durch eine Fachperson allgemein verständlich beim reflektieren der Standardbedingungen für hohe Stringenz, wie in allgemein weit anerkannten Protokollen von Nukleinsäurehybridisierungen dargestellt. Siehe, z.B. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Seiten 1.101–1.104; 9.47–9.58 und 11.45–11.57. Im allgemeinen spiegeln diese Konditionen mindestens einmal Waschen der Hybridisierungsmembran mit 0,05x bis 0,5x SSC mit 0,1 % SDS bei 65°C oder Waschbedingungen bei äquivalenter Stringenz dar. Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem eine Wirtszelle, die mit einem der oben beschriebenen gereinigten und isolierten Nukleinsäuremolekülen transformiert ist, als auch eine Schweine-α-1,3-Galactosyltransferase, die kodierend durch solche transformierenden Nukleinsäuremoleküle kodiert und von einer Wirtszelle exprimiert wird. Verfahren zur Transformierung adäquater Wirtszellen und zum Exprimieren von Polypeptiden von solchen Wirtszellen sind im Fach bekannt und zum Beispiel in Sambrook et al., (1984), Seiten 12.2.–12.44; 16.3–17.44 beschrieben.
Des weiteren beinhaltet die Erfindung ein DNA-Konstrukt das zum Inaktivieren des α-1,3-Galactosyltransferasegens durch Einfügen einer erwünschten DNA-Sequenz in eine Einfügungsstelle des Gens nützlich ist. Wie nachstehend verwendet beinhaltet der Ausdruck "α-1,3-Galactosyltransferasegen" die Exones, die die α-1,3-Galactosyltransferase kodieren oder potentiell kodieren, die mit diesen Exonen kontinuierlichen Introne und die regulierenden Elemente, die mit solchen Exonen und Intronen verbunden sind. Das DNA-Konstrukt beinhaltet die gewünschte DNA-Sequenz die von den ersten und zweiten Homologiesequenzen flankiert wird. Diese erste und zweite Homologiesequenz sind zu der ersten und zweiten genomischen Sequenz hinreichend homolog, welche die Insertionsstelle flankieren um eine homologe Rekombination des DNA-Konstrukts mit dem α-1,3-Galactosyltransferasegen aus dem Schwein ermöglichen, wenn das DNA-Konstrukt in eine Zielzelle mit dem α-1,3-Galactosyltransferasegen aus dem Schwein eingeführt wird. Vorzugsweise ist die Insertionsstelle innerhalb von Exon 4, Exon 7, Exon 8 oder Exon 9 des Schweine-α-1,3-Galactosyltransferasegens. Die erwünschte DNA-Sequenz ist vorzugsweise ein selektierbarer Marker, der ohne Limitierung das neo^R-Gen, das Hydromycinresistenz (hyg^R)-Gen und das Thymidinkinase-Gen einschließt. Die erwünschte DNA-Sequenz kann an beiden Enden durch FRT DNA-Elemente mit Stop-Codons, die für jedes der drei Leseraster 3' zu der erwünschten DNA-Sequenz inseriert werden, eingegrenzt werden. Die Anwesenheit der FRT-Elemente erlaubt dem selektierbaren Marker aus der Zielzelle dezimiert zu werden und die Stop-Codons garantieren, daß das α-1,3-Galactosyltransferasegen als Folge der Dezimierung des selektierbaren Markers inaktiviert bleibt.
Die Erfindung beinhaltet des weiteren ein DNA-Konstrukt, das zum Inaktivieren des murinen α-1,3-Galactosyltransferasegens durch Insertion einer erwünschten DNA-Sequenz in eine Insertionsstelle des Gens nützlich ist. Das DNA-Konstrukt beinhaltet die erwünschte DNA-Sequenz die von den ersten und zweiten Homologiesequenzen flankiert wird. Diese erste und zweite Homologiesequenz sind zu der ersten und zweiten genomischen Sequenz hinreichend homolog, welche die Insertionsstelle flankieren um eine homologe Rekombination des DNA-Konstrukt mit dem murinen α-1,3-Galactosyltransferasegen zu ermöglichen, wenn das DNA-Konstrukts in eine Zelle mit dem murinen α-1,3-Galactosyltransferasegen eingeführt wird. Vorzugsweise ist die Insertionsstelle innerhalb von Exon 4, Exon 7, Exon 8 oder Exon 9 des murinen α-1,3-Galactosyltransferasegens. Die erwünschte DNA-Sequenz ist vorzugsweise ein selektierbarer Marker, der ohne Limitierung neo^R-Gen, das hyg^R-Gen und das Thymidinkinase-Gen einschließt. Die erwünschte DNA-Sequenz kann an beiden Enden durch FRT-DNA-Elemente mit Stop-Codons, die für jedes der drei Leseraster 3' zu der erwünschten DNA-Sequenz inseriert werden, eingegrenzt werden. Die Anwesenheit der FRT-Elemente erlaubt dem selektierbaren Marker aus der Zielzelle dezimirt zu werden und die Stop-Codons garantieren, daß das α-1,3-Galactosyltransferasegen als Folge der Dezimierung des selektierbaren Markers inaktiviert bleibt.
Die Erfindung beinhaltet auch ein Verfahren zum Erzeugen einer totipotenten Säugetierzelle mit mindestens einem inaktivierten (nicht-funktionelle) α-1,3-Galactosyltransferase-Allel, wobei die totipotente Zelle aus einer Säugetierspezies, in der Allele für das α-1,3-Galactosyltransferasegen normalerweise vorhanden und funktionell sind, stammt. Ein "funktionelles" Allel ist zur Transkription und Translation zur Herstellung eines Polypeptids, mit der gleichen oder im wesentlichen gleichen Aktivität zu dem nativen α-1,3-Galactosyltransferase, geeignet. Die Verfahren beinhalten Bereitstellen einer Vielzahl von Zellen, die als totipotenten Zellen der oben erwähnten Säugetierspezies charakterisiert sind, Einführen eines Nukleinsäurekonstrukts, das wirksam ist um das α-1,3- Galactosyltransferasegen durch homologe Rekombination, mittels Insertion einer erwünschten DNA-Sequenz in eine Insertionsstelle, zu inaktivieren in die totipotenten Zellen, und anschließende Identifizierung einer totipotenten Zelle mit wenigstens einem inaktivierten α-1,3-Galactosyltransferase-Allel.
Die totipotenten Zellen können ohne Limitieren embryonale Stamm-(ES)-Zellen, primoridale Keimzellen (PGC's) und Eizellen einschließen. Die Zellen können aus einer Vielzahl von Säugetierspezies entnommen werden, in denen Allele für das α-1,3-Galactosyltransferasegen vorhanden und funktional sind, einschließlich und ohne Limitierung Mäuse- und Schweinespezies.
Die Erfindung beinhaltet des weiteren Verfahren zum Erzeugen eines Säugetiers, dem ein funktionelles α-1,3-Galactosyltransferasegen fehlt, wobei das Säugetier zu einer Spezies mit einem funktionellen α-1,3-Galactosyltransferasegen gehört. Das Verfahren beinhaltet Bereitstellen einer totipotenten Säugetierzelle mit wenigstens einem inaktivierten α-1,3-Galactosyltransferase-Allel, wobei die totipotente Zelle aus einer der oben erwähnten Säugetierspezies mit einem funktionellen α-1,3-Galactosyltransferasegen stammt, Manipulieren der totipotenten Zellen, so daß Mitoseabkömmlinge von der Zelle den gesamten sich entwickelnden Embryo oder einen Teil davon ausmachen, Erlauben des Embryos sich bis zur Geburt zu entwickeln, Gewinnen eines Neugeborenen individuell aus dem Embryo stammend, und Aufziehen und Züchten des Neugeborenen um ein Säugetier, das für ein inaktiviertes α-1,3-Galactosyltransferase-Allel homozygot ist, zum Beispiel, ein Säugetier in dem beide α-1,3-Galactosyltransferase-Allele inaktiviert sind, zu erhalten.
Die totipotenten Zellen können ohne Limitierung ES-Zellen, PGC's und Eizellen einschließen. Die Zellen können aus einer Vielzahl von Säugetieren entnommen werden in denen Allele für die α-1,3-Galactosyltransferasegene vorhanden und funktionell sind, einschließlich und ohne Limitierung Mäuse- und Schweinespezies. ES-Zellen und PGC's sind auf verschiedene Arten manipuliert, so daß ihre Mitose-Abkömmlinge im entwickelten Embryo gefunden werden. Diese Manipulierungen können ohne Limitierung einschließen, Injektion in Blastocysten oder Morula, Co-Kultur mit einer Morula mit zerstörter Zona Pellucida und Fusion mit einer entkernten Zygote. Zellen, die in ein in Blastocysten- oder Morula-Stadium befindlichen Embryo injiziert werden, werden in die innere Zelhmasse eines Blastocysten-Embryos eingeschlossen, daß eine Vielzahl an differenzierten Zelltypen des entstehenden Embryos auslöst, in einigen Fällen einschließlich Keimzellen. Das Embryo das sich aus solchen Manipulationen entwickelt ist ein Chimär, gebildet aus normalen embryonalen Zellen sowie mitotischen Abkömmlingen aus den eingeführten ES-Zellen oder PGC's. Alternativ dazu können chimäre Embryonen durch Co-Kultivierung von wenigstens einer ES-Zelle oder PGC mit einem Morula-Embryo erhalten werden, wobei die Zona Pellucida ausreichend zerstört sein maß, um einen direkten Kontakt zwischen den ES-Zell/PGC und wenigstens einer Zelle der Morula zu gewährleisten. Das Embryo mit zerstörter Zona Pellucida kann ein Embryo sein, das komplett frei von einer Zona Pellucida ist. Letztendlich kann das Genom einer ES-Zelle oder PGC in einem Embryo durch Fusionieren der ES-Zelle/PGC mit einer entkernten Zygote eingeschlossen werden. So ein Verfahren ist für die Entwicklung eines nicht-chimären Embryo geeignet, wie zum Beispiel, ein Embryo, in dem alle Kerne mitotische Abkömmlinge aus den fusionierten ES-Zellen/PGC-Kernen sind. Das entstehende Embryo wird in einen weiblichen Empfänger oder in einer Ersatzmutter implantiert und erlaubt sich bis zur Geburt zu entwickeln.
Werden Eizellen, im Gegensatz zu ES-Zellen oder PGC's, direkt mit einem Nukleinsäure-Konstrukt, welches zur Inaktivierung der α-1,3-Galactosyltransferasegens geeignet ist, injiziert, können die Eizellen durch Implantieren in einen weiblichen Empfänger manipuliert werden um einen Embryo zu bilden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein durch menschliche Intervention erzeugtes Säugetier, dem ein funktionelles α-1,3-Galactosyltransferasegen fehlt. Das Säugetier gehört zu einer Spezies mit dem normalerweise vorhandenen und funktionellen α-1,3-Galactosyltransferasegen. Das Säugetier kann, ohne Limitierung, eine Maus oder ein Schwein sein.
Die Erfindung beinhaltet des weiteren ein gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül umfassend, eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (1) Nukleinsäuresequenz darlegt in 26 (SEQ ID NO: 25), (2) Sequenz korrespondierend zu der Sequenz (1) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes, und (3) Sequenz, die das murine T-LIF kodiert und die unter hohen Standardstringenzbedingungen mit einer komplementären Sequenz zu den Sequenzen von (1) oder (2) hybridisiert. Die komplementären Stränge von den oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen sind mittels Standardmethoden leicht ermittelbar und befinden sich im Bereich der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Wirtszelle, die mit einem der gereinigten oder isolierten Nukleinsäuremolekülen, wie im vorstehenden Absatz beschrieben transportiert wird, sowie ein T-LIF-Polypeptid, das durch solche transformierten Nukleinsäuremolekülen kodiert und in Wirtszellen exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül umfassend, eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (1) Nukleinsäuresequenz darlegt in 27 (SEQ ID NO:31), (2) Sequenz korrespondierend zu der Sequenz (1) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes, und (3) Sequenz, die das humane T-LIF kodiert und die unter hohen Standardstringenzbedingungen mit einer komplementären Sequenz zu den Sequenzen von (1) oder (2) hybridisiert. Die komplementären Stränge von den oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen sind mittels Standardmethoden leicht ermittelbar und befinden sich auch im Bereich der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Wirtszelle, die mit einem der gereinigten und isolierten Nukleinsäuremolekülen, wie in den vorstehenden Absätzen beschriebenen, transformiert wird, sowie ein T-LIF-Polypeptid, das durch solche transformierten Nukleinsäuremolekülen kodiert und in Wirtszellen exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur Eliminierung oder Reduzierung der hyperakuten Abstoßung von Nicht-Primaten-Säugetierzellen durch Humanserum umfassend, Zugabe zu dem Humanserum einer physiologisch akzeptablen Menge an Galactose oder Saccharid, wobei das terminale Carbohydrat eine an Position 1 verknüpftes α-Galactose ist, bevor das Humanserum den Nicht-Primatenzellen ausgesetzt wird. Die Menge an zugesetzte Galactose oder Saccharid ist ausreichend um die hyperakute Abstoßungsantwort zu reduzieren oder zu eliminieren. Die Saccharide können, ohne Limitierung, Melibiose, Galactose α-1-3-Galactose oder Stachyose sein. Alternativ dazu kann das humane Serum so behandelt werden, daß es im wesentlichen frei von Imunoglobulin, IgM-Antikörpern, anti-GAL IgM und IgG-Antikörpern oder anti-GAL IgM-Antikörpern ist. Die Erfindung betrifft des weiteren Affinitäts-behandeltes humanes Serum, das im wesentlichen frei von anti-GAL-Antikörpern oder anti-GAL IgM-Antikörpern ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine graphische Darstellung der Fluoreszenzintensität, hervorgerufen durch die immunfluoreszente Färbung der Schweine-Herz-Endothelzellen mit anti-GAL-Antikörpern alleine oder mit anti-GAL-Antikörper, die zuvor mit selektierten Sacchariden inkubiert wurden,
2 zeigt die Ergebnisse von einem Experiment in dem die Lyse von Schweine-Herz-Endothelzellen, durch Humanserum und durch gereinigte anti-GAL-Antikörper, mittels einem ⁵¹CR-Freisetzungsassay ermittelt wurde.
3 stellt die physiographische Überwachung der perfundiertem Ratten-Herz-Kontraktionen in Gegenwart von Humanserum mit oder ohne selektierten Sacchariden dar.
4 ist ein Vergleich der α-1,3-Galaktosyltransferase-cDNA-Sequenz aus dem Schwein mit der korrespondierenden Sequenzen aus Maus und Rind. PGTCD = Sequenz vom Schwein. BOVGSTA = Sequenz von Rind. MUSGLYTNG = Sequenz von Maus.
5 ist ein Vergleich der α-1,3-Galaktosyltransferase-Aminosäuresequenz aus dem Schwein mit den korrespondierenden Aminosäuresequenzen aus Maus und Rind. PGT = Sequenz vom Schwein. BGT = Sequenz vom Rind. MGT = Sequenz von Maus.
6 stellt die Sall-Restriktionsseiten in vier überlappenden Phagen-Klonen, das die einen Teil der murinen α-1,3-Galaktosyltransferase genomischen Region übergreifen.
7 ist eine detaillierte Restriktionsmappe des murinen α-1,3-Galaktosyltransferase-Subklons pαGT-S5.5.
8 ist eine detaillierte Restriktionsmappe des murinen α-1,3-Galaktosyltransferase-Subklons pαGT-S4.0.
9 ist eine detaillierte Restriktionsmappe des murinen α-1,3-Galaktosyltransferase-Subklons pαGT-S11.
10 ist eine detaillierte Restriktionsmappe des murinen α-1,3-Galaktosyltransferase-Subklons pαGT-S13.
11 ist eine zusätzliche detaillierte Restriktionsmappe des murinen α-1,3-Galaktosyltransferase-Subklons pαGT-S5.5.
12 ist eine zusätzliche detaillierte Restriktionsmappe des murinen α-1,3-Galaktosyltransferase-Subklons pαGT-S4.0.
13 ist ein Diagramm des Knockout-Konstrukts zeigend die 4.0 und 5.5 kb SalI-Fragmente von pαGT-S5.5 und pαGT-54.0, welches die Exon 9 Sall-Seite flankiert.
14 zeigt die 8.3 kb und 6.4 kb BglII-Fragmente, die Diagnostisos für das nicht-unterbrochene α-1,3-Galaktosyltransferasegen und das gezielte (inaktiviertes) α-1,3-Galaktosyltransferasegen sind, durch die Verwendung der Proben, die im Text identifiziert sind.
15 ist eine schematische Darstellung der Generation von Knockout-Konstrukten die den Vektor pαGT-S5.5 als Startvektor verwenden.
16 legt die Nukleotidsequenz einer Neomycin-resistenten Kassette dar, die zur Konstruktion eines DNA-Konstrukts zur Unterbrechung des α-1,3-GalT-Gens in Mäusen verwendet wurde.
17 ist ein Diagramm von einem Beispiel eines letztendlichen Knockout-Konstrukt-Beispiel, das zur Bestätigung der Intensität, Duplikatanzahl und Orientierung der vielen Einführungen sequenziert wurde.
18 ist ein Southern Blot der genomischen DNA aus vielen murinen ES-Zelllinien, die mit dem Knockout-Konstrukt aus 16 transformiert und zur Offenbarung der diagnostischen Fragmente, dargestellt in 14, untersucht wurden.
19 stellt die „langen" PCR-Produkte dar, die unter Verwendung der vorgesehenen Primer aus Wildtyp und unterbrochenen α-1,3-GalT-Genen hergestellt wurden.
20 ist ein Southern Blot der langen PCR-Produkte, die aus Wildtyp- und Knockout-Mäusen erhalten wurden.
21 stellt die PCR-Produkte dar, die zur Identifizierung der unterbrochenen (gezielten) galT-Lokuse verwendet wurden.
22 zeigt PCR-Produkte, die aus Mäusen mit unterbrochenen (inaktivierten) galT-Allelen hergestellt wurden.
23 stellt die aus der PCR-Analyse zu erwartenden PCR-Produkte an cDNA dar, die aus α-1,3-GalT-mRNA von normalen und Knockout-Mäusen hergestellt wurden. Die Ferrochelat-Primer und das PCR-Fragement repräsentieren eine Kontrolle der stattgefundenen cDNA-Synthese.
24 zeigt die aus cDNA hergestellten PCR-Fragmente, dieaus RNA erhalten wurden, die aus Niere (N), Herz (H) und Leber (L) einer Wildtyp-Maus (+/+), einem Maus-Heterozygot für unterbrochenen α-1,3-GalT-Allele (+/–) und einem Maus-Homozygot für das unterbrochene α-1,3-GalT-Allel (–/–) isoliert wurden.
25 ist eine graphische Darstellung des relativen Schutzes von Milzzellen, die durch die Lyse durch Humanserum aus GalT-Knockout-Mäusen erhalten wurden.
26 ist eine Darstellung der Nukleotidsequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von murinem T-LIF.
27 ist eine Darstellung der Nukleotidsequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz von humanen T-LIF.
28 ist ein Western Blot von LIF-Polypeptide, die von transfizierten COS-Zellen exprimiert wurden.
29 ist ein Diagramm des Expressionsplasmids, das zur Transfektion der COS-Zellen nach 27 verwendet wurde.
30 ist ein Southern Blot der PCR-amplifizierten cDNA aus murinen ES-Zellen unter Verwendung einer LIF-spezifischen Probe.
Detaillierte Bechreibung
Die hier präsentierten Beweise etablieren, daß ein beträchtlicher Anteil der humanen vorgeformten, anti-Schwein-Xeno-Antikörper eine spezifische terminale Galactose-Verbindung auf der Oberfläche von Schweine-Endothelzellen erkennen. Wie durch die Experimente der gegenwärtigen die Erfinder bewiesen, ist es möglich den Titer der vorgeformten Xeno-Antikörper durch Adsorption an immobilisierten Antigenen, die die passenden Epitope enthalten, zu reduzieren. Das führt zur Reduzierung oder Eliminierung der zellulären Antwort, die mit der hyperakuten Abstoßungsantwort verbunden ist. Umgekehrt wird gezeigt, daß es möglich ist, diese Antikörper durch das Zugeben von entsprechenden Carbohydrat-Antigenen zum Humanserum zu neutralisieren. Zur Demonstration der Nützlichkeit dieser Ansätze war es nötig die relevanten Carbohydrat-Reste zu identifizieren und ihre Effizienz in kultivierten Zellsystemen und vor allem im gesamten Organ zu demonstrieren. Dadurch wurde ein Ansatz zur Reduzierung oder Eliminierung der hyperakuten Abstoßungsantwort identifiziert, für die Behandlung des Empfängers durch Eliminierung oder Neutralisierung der relevanten Antikörper-Populationen.
Ein alternativer Ansatz zur Xeno-Transplantation wäre die Eliminierung der relevanten Epitope im Spenderorgan. Dies könnte zum Beispiel, durch die Reduzierung oder Eliminierung der exprimierten Gene erreicht werden, die für die metabolische Maschinerie kodieren und für die Formation der Epitope verantwortlich sind. Das Epitop, das durch die α-1,3-Galactoseverbindung (genannt das GAL-Epitop) definiert ist, wird durch das Enzym UDP-Galactose:β-D-galaktosyl-1,4-N-acetyl-D-glucosaminid-α-1,3-galaktosyl-transferase ("α-1,3-Galaktosyltransferase" oder "α-1,3-GalT") hergestellt. Dieses Enzym transferiert Galactose auf den terminalen Galactose-Rest von N-Acetyllactosamin-Arten-Carbohydrat-Ketten und Laktosaminoglycanen. Die Reaktion wird durch α-1,3-GalT katalysiert und wie folgt zusammengefaßt: UDP-Gal + Galβ-1,4-GlcnAc-R → Galα-1,3-Galβ-1,4-GlcNAc-R + UDP
Das α-1,3-GalT-Enzym wird in den meisten Säugetieren gefunden, ist aber nicht in den Alten Welt Affen und Menschen präsent. Für den Zweck der Xenotransplantation ist es wichtig, daß Menschen und Alte Welt Affen natürlich vorkommende Xenoantikörper, die gegen die GAL-Epitope gerichtet sind, aufweisen. Die Verwendung von Schweineorganen denen das GAL-Epitop fehlt, kann die hyperakute Abstoßung eines solchen Organs durch den humanen Empfänger reduzieren oder eliminieren. Der Nutzen eines solchen Ansatzes wird durch die von den gegenwärtigen Erfindern vorliegende Demonstration unterstützt, daß tatsächlich das GAL-Epitop zentral bei den hyperakuten Abstoßungsphänomen in Zellen und ganzen Organen ist. Ein Ansatz zur Erhaltung solcher Organe wäre die Generierung von Schweinen, in denen das Gen, das das α-1,3-GalT-Enzym kodiert, durch homologe Rekombination "ausgeknockt" ist.
Die Rolle der GAL-Epitope in der hyperakuten Abstoßung
Die gegenwärtigen Erfinder haben Affinitäts-gereinigte Antikörper gegen das GAL-Epitop (anti-GAL-Antikörper) aus humanen Serum gerichtet. Dies wurde durch Affinitätssäulen erreicht, die die entsprechenden Epitope (z. B. Galaktosyl-Galactose oder Melibiose) an der festen Phase gebunden, umfassen. Gesamt-anti-GAL IgG und IgM wurden in einem Satz an Experimenten erhalten. In einem alternativen Ansatz wurde anti-GAL IgG durch die Passage von Serum über eine Affinitätssäule, die für alle Proteine außer Albumin und IgG spezifisch ist, erhalten. Der Durchwasch dieser Säule wurde anschließend einer Galaktosyl-Galactose-Affinitätssäule zugeführt und gereinigtes anti-GAL IgG wurde als Eluat gesammelt. Das erhaltene anti-GAL IgG kann weiter gereinigt werden, durch die Passage über eine Protein G-Säule, die spezifisch IgG aber nicht andere Antikörperisotope bindet. Umgekehrt kann der Durchwasch der oben beschriebenen Säulen als Quelle für Gesamt-anti-GAL (IgG + IgM) dezimiertes Serum oder anti-GAL IgG dezimiertes Serum in weiteren Experimenten verwendet werden. Wünschenswerterweise sind die anti-GAL-Antikörperpräparationen charakterisierend für den Proteininhalt, das Molekulargewicht und die Reinheit und für die Antikörperklassen und -Isotypen.
Um die Rolle des GAL-Epitops in der hyperakuten Abstoßungsantwort zu demonstrieren, ist es zunächst nötig festzustellen, dass IgG- und IgM-anti-GALAntikörper mit Zellen und Gewebe aus dem Schwein reagieren. Die gegenwärtigen Erfinder untersuchten das Bindrn von humanen anti-GAL-Antikörpern an Zellen und Gewebe aus dem Schwein mittels immunfluo reszierender Färbung. Bei dieser Technik reagieren selektierte Humanantikörperpräparationen mit den intakten Schweine-Zellen und anschließend mit den Signalantikörpern, die nicht-humanes anti-humanes IgG oder IgM, die mit Fluoreszinisothiocyanat (FITC) markiert sind, umfassen. Die gefärbten Zellen können mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellensortierer (FACS) oder mit anderen entsprechenden Nachweismitteln detektiert und quantifiziert werden. Andere Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von auf einer Zelloberfläche gebundenen Antikörpern verwenden zum Beispiel Enzym-markierte Antikörperreagenzien, die dem Fachmann bekannt sind.
Gesamt-anti-GAL (IgM und IgG), sowie gereinigtes anti-GAL IgG färbt Zellen aus einer epithelialen Zelllinie aus dem Schwein (PK₁), sowie Zellen aus einer aortischen Endothelzelllinie aus dem Schwein (PAE). Weder anti-GAL (Gesamt IgM + IgG) Antikörper-dezimiertes Serum, noch anti-GAL IgG-dezimiertes Serum zeigen eine nachweisbare Färbung. Um die Spezifizität der Antwort weiter zu untersuchen, ist es wünschenswert festzustellen, ob oder ob nicht die Reaktivität der Antikörper mit Schweine-Zellen vermindert oder eliminiert werden kann, durch eine vorherige Aussetzung zu einem oder mehreren Molekülen, von denen man erwartet, daß sie die fraglichen Epitope umfassen. In diesem Zusammenhang haben die gegenwärtigen Erfinder festgestellt, daß die Antikörperbindung durch Galactose und Disaccharide, die einen terminalen Galactose-Rest in der α-1-Konfiguration aufweisen, inhibiert wird. Die Färbung wurde nicht durch Zucker mit einer terminalen Galactose in der β1→4-Konfiguration inhibiert. Diese Ergebnisse zeigen die Spezifität der Antikörperbindung und die Fähigkeit entsprechender Zuckern eine solche Bindung zu inhibieren.
Die Reaktivität von anti-GAL-Antikörpern mit kultivierten Schwein-Zellen wurde mittels der Gewebesektionen von Schweineorganen bestätigt. Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Signalantikörpersystems wurde wieder die Färbung von Gesamt-anti-GAL IgM + IgG und gereinigtem anti-GAL IgG, aber nicht mit dem anti-GAL-Antikörper-dezimierten Serum gesehen. Die Färbung war vor allem mit Niere-, Herz- und Leberendothelium, mit Herzendocardium und mit Gallen-Ductusepithelium ausgeprägt. Die Gewebebindung wurde durch Melibiose, aber nicht durch andere Disaccharide, die nicht-repräsentativ für das GAL-Epitop sind, inhibiert.
Diese Daten zeigen klar, daß das GAL-Epitop auf einem hohen Level auf endothelialen Zellen von Arterien, Venen und Kapillaren von Niere, Herz und Leber aus dem Schwein expri miert wird. In einer Xenotransplantat-Situation kommen die endothelialen Zellen dieser Gefäße in den direkten Kontakt mit den anti-GAL-Antikörper aus dem humanen Serum. Die obigen Ergebnisse sind beweiskräftig, daß die Bindung dieser Antikörper (mit anwesender Komplement-Aktivierung) ein Hauptbestandteil der hyperakuten Abstoßungsantwort ist.
Um weiter die Genauigkeiten der natürlich vorkommenden Xenoantikörper aus Humanserum, die gegen Schwein-Antigene gerichtet sind, zu untersuchen, wurde die Fähigkeit von Humanserum untersucht, eine Agglutination von roten Blutzellen aus dem Schwein hervorzurufen. Diese Untersuchungen zeigten das Vorkommen solcher Antikörpern in einem hohen Level im Humanserum. Darüber hinaus wurde gefunden, daß Zucker, wie zum Beispiel Melibiose, Stachyose, Galactose und Fucose, die einen terminalen Rest in der α1-6-Konfiguration aufweisen, die Agglutination in einem Bereich von μM zu mM inhibieren. Zucker mit anderen Konfigurationen inhibierten nur bei sehr hohen Dosen, wobei der erhaltene Effekt wahrscheinlich durch den einfachen Wechsel der Osmolarität oder anderen nicht-spezifischen Mechanismen stattgefunden hat.
Die obigen Untersuchungen etablieren die potentielle Rolle der natürlich vorkommenden humanen anti-GAL-Xenoantikörpern bei der zugrundeliegenden komplementvermittelten Destruktion der hyperakuten Abstoßung. Dennoch wird die komplementvermittelten Destruktion von Schweine-Zellen vorzugsweise direkt untersucht, um die Spezifität der GAL-Epitopen und der anti-GAL-Antikörpern bei der Lyse zu bestätigen. Zu diesem Zweck haben die gegenwärtigen Erfinder die Fähigkeit von Humanserum die Lyse von Schweine-Zellen hervorzurufen untersucht.
Um die komplementvermittelte Destruktion von Zellen zu untersuchen ist es nötig, einen oder mehrere Assays anzuwenden die quantitative Daten der Zell-Lyse bereitstellen. Vorzugsweise messen solche Assays einen aus Zellen abgesonderten Bestandteil, der während der komplementvermittelten Zell-Lyse in das Medium freigesetzt wird. Solche Experimente sollten die Beteiligung des Komplements bei der induzierten Lyse, durch das Anwenden von sowohl nativen Komplement-Proteinen als auch Hitze-inaktivierten Komplementen, kontrollieren. Die gegenwärtigen Erfinder haben einen ⁵¹CR-Freisetzungsassay und einen Lactatdehydrogenase (LDH)-Freisetzungsassay verwendet um die komplementvermittelte Lyse von epithelialen und endothelialen Schwein-Zellen durch Humanserum zu untersuchen.
Bei dem ⁵¹CR-Freisetzungsassay werden Zellen aus dem Schwein mit ⁵¹CR vormarkiert und dann in Gegenwart von Hitze-inaktiviertem Humanserum und Phasenkomplement (PAE's) oder humanem Komplement in nicht Hitze-inaktiviertem normalem Humanserum (PK₁'s) inkubiert. Die Freisetzung von ⁵¹CR in das Medium wurde mit einem Gamma-Messer, nach der Zugabe von Scintillationsflüssigkeit, gemessen. Bei dem LDH-Freisetzungsassay werden die Zellen mit LDH gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers (Promega, USA) markiert. Die Freisetzung von LDH in das Medium wurde mittels einem ELISA-Format, mit einer Absorbitionsbande bei 492 nm, gemessen. Bei beiden Assays wurde die Fähigkeit von verschiedenen Zuckern, die komplementinduzierte Lyse zu verhindern, getestet.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit den beiden unverwandten Zelllinien aus dem Schwein, PAE und PK₁, bei der Verwendung von beiden Assay-Typen erhalten. Die Ergebnisse zeigen klar, daß die natürlich vorkommenden Xenoantikörper (NXAb's) für die Initiierung der komplementinduzierten Lyse von Schweine-Zellen verantwortlich sind. Die gegenwärtigen Erfinder haben außerdem gezeigt, daß IgM- und nicht IgG-Antikörper für die Lyse in diesem System verantwortlich sind. Mehr noch, die Hitze-Inaktivierung von den Komplement-Präparationen verhinderte die Lyse, welches weitere Beweise liefert, daß die Lyse von Schweine-Zellen ein komplementabhängiges Phänomen ist. Die gegenwärtigen Erfinder haben außerdem gezeigt, daß Melibiose, aber nicht Lactose, Schweine-Zellen vor Lyse schützen. Bedeutend ist, daß die Konzentrationen an Zucker, die in diesen Studien als effektiv gefunden wurden, enthalten den physiologischen Bereich von Blutzucker, zum Beispiel ca. 10 mM.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das anti-GAL-NXAb's in normalem humanen Serum vornehmlich für die Lyse von Schweine-Zellen verantwortlich sind. Das Binden von anti-GAL-NXAb's an die endothelialen Zellen, die die Blutgefäße eines Schweine-Xenotransplantat belegen und mit der gefolgten Aktivierung der Komplement-Kaskade, scheint ein Schüsselschritt der hyperakuten Abstoßung von Schweine-Xenotransplantaten zu sein. Das wäre auch mit anderen Organen von anderen uneinigen Spezies der Fall, sowie Nagern, Schafen, Kühen und Ziegen, wobei alle ein aktives α1,3-GalT-Gen in ihrem Genom tragen.
Diese Ergebnisse werden zusätzlich durch eine Gesamtorganstudie unterstützt, die von den gegenwärtigen Erfindern durchgeführt wurde. In dieser Studie wurden isolierte und perfundierte Rattenherzen verwendet, um die Beteiligung von anti-GAL-Xenoantikörpern in der hyperakuten Abstoßung weiter zu demonstrieren. Die Rattenherzen wurden dabei an eine Langendorf-Perfusionsapparatur verbunden, wie es in Doring und Dehnert beschrieben ist, The Isolated Perfused Heart According to Langendorf, Bionessttechnik-Verlag March GmbH, D7806, Westdeutschland. Die verbundenen Herzen wurden durch Perfusion mit einem physiologischen Puffersystem stabilisiert und mit dem gleichem Puffer, der entweder Melibiose oder Lactose (10 mM) enthält, perfundiert. Anschließend wurde humanes Plasma bis zu einer Endkonzentration von 13% zugegeben und der Effekt von den zugegebenen Zuckern auf Herzrate, Kontraktionsstärke und Ausstoß gemessen.
Diese Ergebnisse im Gesamtorgansystem zeigten, daß:

1) die Perfusion mit einem unmodifizierten humanen Plasma zu einem schnellen Verlust der Funktion führt.
2) die Perfusion eines Rattenherzens mit humanem Plasma, in Gegenwart von Melibiose, welches für die Bindung mit den anti-GAL-Antikörpern in Konkurrenz tritt, das Herzüberleben und Ausstoß verlängert. Lactose, das nicht zur Bindung mit dem anti-GAL-Antikörper konkurriert, verlängert jedoch nicht die Herzüberlebensrate.
3) die Perfusion eines Rattenherzens mit anti-GAL-Antikörper-dezimierten Plasma verlängert das Herzüberleben und Ausstoß.
4) wenn, gereinigte anti-GAL-Antikörper zurück zu dem anti-GAL-Antikörper-dezimierten Plasma zugeführt werden, das Herz schnell seine Funktion verliert.

Die Experimente der gegenwärtigen Erfinder mit kultivierten Zellen, Gewebe oder ganzen Organen liefern wichtige Bestätigungen, daß anti-GAL-Antikörper ein kritisches Element bei der hyperakuten Abstoßungsantwort sind. Darüber hinaus zeigen die offenbarten Ergebnisse eine Vielzahl von Ansätzen die zur Eliminierung oder Reduzierung der hyperakuten Abstoßung von xenogenetischen Säugetierorganen beim Menschen angewendet werden können.
Zum Beispiel wird die intravenöse Verabreichung von spezifischen Disaccharid-Galactose α-1-3-Galactose, die natürlich vorkommenden anti-GAL-Antikörper aller Klassen blockieren und deren Bindung an ihren spezifischen Epitopen auf der Oberfläche der endothelialen Zellen von dem Xenotransplantat unterbinden, so daß sie davon abgehalten werden eine hyper akute Abstoßung zu initiieren oder daran teilzunehmen. Die Ergebnisse der gegenwärtigen Erfinder zeigen, daß die Konzentration an Galactose α 1-Galactose, die nötig ist um diesen Effekt zu erzielen, in einem physiologisch tolerierbaren Bereich liegt. Die Experimente zeigen außerdem, daß viele andere Carbohydrate für die spezifischen Disaccharide substituiert werden können. Diese beinhalten die Monosaccharid-Galactose und viele andere Di-, Tri- oder Tetrasaccharide, bei denen ein terminales α-Galactose mit dem nächsten Zucker über Position 1 verbunden ist. Diese anderen Zucker können, ohne Limitierung, Melibiose und Stachyose einschließen.
Ebenso können vor einer Xenotransplantation alle oder ein wesentlicher Teil von Gesamt-IgM (das ist IgM von allen Spezifitäten) von dem Patienten-Serum durch extrakorporale Immunabsorption entfernt werden. Alternativ können anti-GAL-Antikörper von allen Klassen durch extrakorporale Immunabsorption entfernt werden. Am meisten bevorzugt können die vom Patienten vorgeformten anti-GAL-IgM-Antikörper entfernt werden. Auf diese Art und Weise werden viele oder die meisten der primären immunologischen Stoffe der hyperakuten Antwort eliminiert, das in einer Reduzierung oder Eliminierung der bei einer Xenotransplantation folgenden Antwort resultiert.
Das α-1,3-GalT-Gen als ein Ziel für die Unterdrückung für die GAL-Epitope.
Die gegenwärtigen Erfinder waren bei der Klonierung der vollständig-kodierenden Region des Schweine-α-1,3-GalT-Genes erfolgreich. Das ist für die vollständige Ausnutzung des Gens in der Genmanipulation bei Schweinen zum Zwecke humaner Xenotransplantation wünschenswert. sind Bisherige Versuche die vollständig-kodierende Region des Schweine-Gens zu entschlüsseln, sind zu Kenntnis der Erfinder, bei der Generierung der 5'-kodierenden Regionen fehlgeschlagen. Siehe zum Beispiel, Dabkowski et al., Transplant. Proc. 25: 2921 (1993). Die gegenwärtigen Erfinder haben einen PCR-basierenden Ansatz zur Generierung der vollständigen Sequenz angewendet. Beim Entwerfen der Primer und der experimentellen Bedingungen, die nötig sind um die 5'- und 3'-Regionen des Gens zu erhalten mussten die gegenwärtigen Erfinder signifikante theoretische und praktische Hindernisse überwinden.
Die Primer wurden auf Basis der sorgfältigen Analyse publizierter Sequenzen für das Maus-, Rind- und Human-α-1,3-GalT-Gen analysiert, die die einzigen publizierten und zur Verfügung stehenden Sequenzen in diesem Fall waren. Die Analyse der gegenwärtigen Erfinder zeigte, daß in den berichteten Sequenzen der Rinder-cDNA das Exon 3 (welches in der 5'-untranslatierten Region liegt) fehlt. Dies wurde nicht in der Literatur erwähnt. Um die entsprechenden Regionen einer brauchbaren Primersequenz zu erhalten, mußten die Maus- und Rindersequenzen abgeglichen werden. Sogar mit einer entsprechenden Neuanordnung zeigte nur eine Insel von ca. 20 Basenpaaren (bp) in der 5'-untranslatierten Region die gewünschten Homologie (19 aus 20 bp) zum Design der PCR-Oligonukleotide. Die Tatsache, daß die 5'-untranslatierte Region aus dem Maus- oder Rinder-Gen sogar bei optimaler Anordnung im wesentlichen nicht miteinander verwandt zu sein scheinen, würde von dem normalen Fachmann gewöhnlicherweise nicht erkannt werden. Das liegt daran, daß die 5'-untranslatierte Region häufig nicht gut konserviert zwischen den Spezies ist. So zum Beispiel würde die natürliche Inklination eine weniger erfolgreiche Analyse liefern und das Design eines PCR-Oligonukleotids, das auf die Homologie dieser Region basiert, wäre wahrscheinlich nicht erfolgreich.
In der Stromabwärts-3'-untranslatierten Region ist die Homologie wiederum weniger offensichtlich. Viele Insertionen und Deletionen mußten gemacht werden, um einen sauberen Ableich von den Maus- und Rindersequenzen zu erhalten. Darüber hinaus war es nötig, eine Region mit ungefähr 200 bp stromabwärts bis zum Stop-Codon zu selektieren, um eine Region entsprechender Homologie für das Design von PCR-Oligonukleotiden zu erhalten. Letztendlich fanden die gegenwärtigen Erfinder die Anlagerungs-Temperatur auf 9°C zu senken, damit die 5'- und 3'-Primer sauber arbeiten. Diese technischen und theoretischen Hürden für die erfolgreiche Verwendung eines PCR-basierenden Ansatzes wurden durch die gegenwärtigen Erfinder überwunden und erlaubten die vollständig kodierenden Sequenzen zu entschlüsseln.
Die Analyse der Nukleotidsequenz zeigte, daß ein Gegenpart des murinen Exon 3 in der 5'-untranslatierten Region nicht im Schweine-Gen gefunden wurde. Die Schwein-Sequenz in diesem Punkt der Rinder-Sequenz sehr ähnlich. Die Analyse der Aminosäuresequenz zeigte, daß die Struktur der Schweine-α-1,3-GalT der von anderen Glycosyltransferasen ähnlich ist und vor allem nahe verwandt der α-1,3-GalTs aus Rind und Maus. In jedem dieser Enzyme geht eine kurze zytoplasmatische amino-terminale Domäne von ca. 6 Resten einer hydrophobischen, membranverankerten Domäne voran (erweitert von 7 bis 22 Resten). Die Stammregion, die als flexibler Spielraum dient und die katalytische Domäne, die die Synthese von α-1,3-GAL-Bindungen katalysiert, sind im Lumen des Golgis lokalisiert und erstrecken sich von Aminosäure 23 bis zum Carboxylterminus bei Aminosäure 371. Die genaue Grenze zwischen der Stamm- und der katalytischen Domäne ist nicht exakt definiert. Basierend auf den angenommenen Charakteristika der Stammregion scheint es die am wenigsten konservierte Region zu sein und ist reich an Glycin- und Prolinresten zu sein. Paulson und Colley, J. Biol. Chem. 264: 17615 (1989); Jozasse t al., J. Biol. Chem. 267: 5534 (1992). Die Stammkatalytische Grenze könnte um Aminosäure 60 liegen.
Um Konstrukte für Inaktivierungs-Gene durch homologe Rekombinationen zu generieren, wird das Gen vorzugsweise innerhalb eines entsprechenden kodierenden Exons durch die Insertion eines zusätzlichen DNA-Fragments unterbrochen. Durch die Analyse der gesamten Schweine-Nukleinsäuresequenz haben die gegenwärtigen Erfinder Exon 4, 7, 8 und 9 als bevorzugte Region zur Unterbrechung des Gens mittels homologe Rekombination identifiziert. Dennoch sollte die Identifizierung von diesen Exonen als bevorzugte Seite und nicht als limitierender Bereich der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden, denn Unterbrechungen in Exon 5 und 6 können bei einigen Zelltypen oder Situationen, in denen eine weniger vollständige Inhibition von der α-1,3-GalT-Expression erwünscht ist, nützlich sein. Darüber hinaus können regulatorische Elemente, die mit der kodierenden Sequenz verbunden sind, ebenso als nützliche Ziele zur Inaktivierung dienen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine SalI-Seite, die innerhalb von Exon 9 des α-1,3-GalT-Gens bei Codon 221–222 aus der Maus lokalisiert ist, als Seite zur Unterbrechung der murinen kodierenden Sequenz gewählt. Zur Unterbrechung der Schweine-Sequenz sollte erwähnt werden, daß die Aminosäure, die durch das konespondierende Nukleotid aus dem Schwein kodiert wird, konserviert ist, aber die SalI-Seite nicht. In einer bevorzugten Ausführungsform zur Inaktivierung des Schweine-Gens wird die SalI-Seite in die korrespondierende Region der Schweine-Sequenz, für eine überzeugende Konstruktion einer Knockout-Sequenz, eingebaut. SalI schneidet nur spärlich in genomischer DNA. Multiple Restriktionsseiten können ein Problem beim Manipulieren großer DNA-Fragmente sein, daher ist die Anwesenheit einer Sal1-Seite in dem Exon sehr nützlich, denn es ist unwahrscheinlich, daß andere SalI-Seiten an anderen Regionen in dem Knockout-Konstrukt vorhanden sind.
Im allgemeinen wird ein Gen das für einen selektierenden Marker kodiert verwendet, um die Ziel-Exon-Seite durch homologe Rekombination zu unterbrechen. Der selektierbare Marker ist vorzugsweise durch Sequenzen flankiert, die zu den Sequenzen der gewünschten Inserti onsseiten flankiert sind. Thomas and Capecchi, Cell 51: 503–12 (1987); Capecchi, Trends in Genetics 5: 70–76 (1989). Für die flankierten Sequenzen ist es nicht notwendig an den gewünschten Insertionsseiten sofort anzuschließen. Die Gen-vermittelte Antibiotika-Resistenz zu G418 (ein Neomycinderivat) wird häufig benutzt, obwohl andere Antibiotika-Resistenz-Marker (zum Beispiel Hygromycin) auch angewendet werden können. Andere Selektionssysteme schließen negativ-selektive Marker, wie zum Beispiel das Thymidinkinase (TK) – Gen von Herpes Simplex, ein. Jeder selektierbare Marker, der zum Einschluss in einem Knockout-Vektor geeignet ist, liegt im Bereich der vorliegenden Erfindung.
Dennoch ist es möglich, daß es in einigen Fällen nicht wünschenswert ist, ein exprimiertes antibiotika-resistentes Gen in den Zellen des transplantierten Organs zu haben. Aus diesem Grund wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein oder mehrere genetische Elemente in das Knockout-Konstrukt einbezogen, das es dem antibiotika-resistenten Gen erlaubt ausgeschnitten zu werden, sobald das Konstrukt eine homologe Rekombination mit α-1,3-GalT-Gen durchgeführt hat.
Das FLP/FRT-rekombinante System aus der Hefe repräsentiert so einen Satz an genetischen Elementen. O'Gorman et al., Science 251, 1351–1355 (1991). FLP-Rekombinase ist ein Protein von ungefähr 45 kD Molekulargewicht. Es wird durch das FLP-Gen von den 2 Micron-Plasmiden der Hefe Saccharomyces cerevisiae kodiert. Das Protein agiert durch die Bindung an die FLP-Rekombinase-Zielseite oder FRT; die Herzsregion der FRT ist eine DNA-Sequenz von ca. 34 bp. FLP kann verschiedene Formen von Rekombinationsreaktionen hervorrufen einschließlich Ausschneiden, Einfügen und Inversion, in Abhängigkeit zu den relativen Orientierungen der flankierten FRT-Seiten. Wenn eine DNA-Region durch direkte Wiederholungen der FRT flankiert ist, wird FLP die intervenierende DNA ausschneiden und ein einzelnes FRT hinterlassen. Es wurde gezeigt, daß FLP in einem weiten Bereich von Systemen funktioniert, einschließlich in den kultivierten Säugetierzelllinien CV-1 und F9, O'Gorman et al., Science 251: 1351 (1991), und in Maus-ES-Zellen, Jung et al., Science 259: 984 (1993).
Die Zielzellen, die eine genomische Kopie eines antibiotischen Resistenzgens tragen, das durch direkte Wiederholungen der FRT flankiert ist, sind unterstützt durch FLP-Rekombinase durch 1) Einführen von teilweise gereinigtem FLP-Protein in die Zellen mittels Elektroporation, oder 2) Transfektion mit Expressionsplasmiden, die das FLP-Gen enthalten. Auf diese Weise werden die antibiotischen Resistenzgene durch die Aktion der FLP-Rekombinase dezimiert und es werden Zellen generiert, die das inaktivierte α-1,3-GalT-Gen enthalten und frei an exogenen Antibiotika-Resistenzgenen sind.
Aufgrund der relativen Infrequenz der homologen Rekombination der Zielzellen werden die meisten solcher Zellen nur ein inaktiviertes Allel von dem Zielgen tragen. Zumindest wird eine große Anzahl an Zellen, die nur durch eine Einzelrunde von Transformation mit einem entsprechenden Knockout-Konstrukt getragen wurden, heterozygot sein. Der hier verwendete Ausdruck "transformiert" wird als die Einführung exogener DNA in die Zielzelle durch jegliche Mittel, die dem Fachmann bekannt sind, definiert. Die Methoden der Einführung können, ohne Limitierung, Transfektion, Mikroinjektion, Infektion (mit zum Beispiel retroviralbasierten Vektoren), Elektroporation und Mikroballistik einschließen. Der Ausdruck "transformiert", soweit nicht anders erwähnt, ist nicht gedacht, Änderungen im Zellverhalten und Wachstumsparameter begleitend mit Verewigung, Dichte-abhängiges Wachstum, maligne Transformationen oder ähnlich erworbene Stadien in Kulturen, anzuzeigen.
Obwohl heterozygote Zellen bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können viele Manipulationen zur Generierung von homozygoten Zellen in Kultur angewendet werden. Zum Beispiel können homozygote Zellen durch die Durchführung einer zweiten homologen Rekombinationsprozedur auf Zell-Heterozygoten für die inaktivierten Allele durchgeführt werden. Wenn das Knockout-Konstrukt, das bei der initialen Transformation das neo^R-Gen trägt, verwendet wird, kann ein zweites Konstrukt ist in einer zweiten Transformationsrunde verwendet werden, bei der das neo^R-Gen durch eine Gen ersetzt wird, dass die Resistenz auf ein separates Antibiotika überträgt (z. B. Hydgromycin). Die Zellen, die zu beidem G418 und Hygromycin resistent sind können zur Detektierung jeglicher "Double Knockouts" (z. B. Homozygoten) durch Southern Blots gescreent werden. Beide Antibiotika-Resistenz-Gene können schrittweise bei Einzelverfahren mittels FLP-Rekombinase entfernt werden. Bei Aufrechterhaltung der Selektierung mit G418 sichert dieser Ansatz, daß das zweite Konstrukt kein einfaches Ersetzen der vorhergehenden Knockout-Allele ersetzt und die Zellen bleiben heterozygot.
Alternativ dazu, kann das neo^R-Gen von den originalen heterozygoten Zellen mittels FLP-Rekombinase und einer zweiten Knockout-Prozedur mittels des originalen neo^R-Gen-enthaltenden Konstrukts entfernt werden. Doppelte Knockouts können durch Southern Analy sen nachgewiesen werden. Das neu eingeführte neo^R-Gen kann dann durch FLP-Rekombinase dezimiert werden. Dieser alternative Ansatz erlaubt es nicht, daß das Knockout-Konstrukt spezifisch zu dem nicht-aktivierten Allel dirigiert wird. Nichtsdestotrotz kann das Screenen einer entsprechenden Anzahl von Zielzellen zur Identifikation von homozygoten Zellen für den inaktivierten Lokus führen.
Zelluläre Vehikel für die Inkorporation von Knockout-Konstrukten
Um Tiere zu erzeugen, bei denen ein bestimmtes Gen in allen Zellen inaktiviert ist, ist es notwendig, ein Knockout-Konstrukt in die Keimzellen (Sperma oder Eier, d.h. die „Keimlinie") der gewünschten Spezies einzuführen. Gene oder andere DNA-Sequenzen können durch Mikroinjektion in die Pronuklei der befruchteten Eier eingeführt werden. Nach der Pronuklear-Fusion kann der sich entwickelnde Embryo das eingeführte Gen in alle seine somatischen und Keimzellen übertragen, weil die Zygote der mitotische Vorläufer aller Zellen im Embryo ist. Da die gezielte Insertion eines Knockout-Konstruktes ein relativ seltenes Ereignis ist, ist es erwünscht, eine große Anzahl von Tieren zu generieren und zu screenen, wenn ein solcher Ansatz angewendet wird. Daher kann es vorteilhaft sein, mit großen Zellpopulationen und Selektionskriterien zu arbeiten, die charakteristisch für die kultivierten Zellsysteme sind. Jedoch ist es für die Produktion von Knockout-Tieren aus einer Anfangspopulation von kultivierten Zellen notwendig, daß eine kultivierte Zelle, die das gewünschte Knockout-Konstrukt enthält, in der Lage ist, ein gesamtes Tier zu generieren. Das wird im allgemeinen durch das Plazieren der Zelle in eine entwickelnde Embryo-Umgebung irgendeiner Art erreicht.
Zellen, die in der Lage sind, zu mindestens einigen differenzierten Zelltypen zu führen, werden hiernach als „pluripotente" Zellen bezeichnet. Pluripotente Zellen, die in der Lage sind, zu allen Zelltypen eines Embryo, einschließlich Keimzellen, zu führen, werden hiernach als „totipotente" Zellen bezeichnet. Totipotente murine Zelllinien (embryonische Stamm- oder „ES"-Zellen) wurden durch Kultivierung von Zellen isoliert, die von sehr jungen Embryonen (Blastocysten) abgeleitet wurden. Solche Zellen sind nach der Einführung in einen Embryo fähig, in alle Zelltypen, einschließlich Keimzellen, zu differenzieren, und können verwendet werden, um Tiere zu generieren, denen ein funktionelles α-1,3-GalT-Gen fehlt. Kultivierte ES-Zellen können mit einem Knockout-Konstrukt transformiert werden und Zellen können selektiert werden, in denen das α-1,3-GalT-Gen durch Insertion des Konstrukts innerhalb eines geeigneten Exons inaktiviert ist. Tatsächlich wurden ES-Zelllinien von Mäusen und Schweinen abgeleitet. Siehe z. B., Robertson, Embryo-Derived Stem Cell Lines. In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (E. J. Robertson, ed.), IRL Press, Oxford (1987); PCT-Publikation Nr. WO/90/03432; PCT-Publikation Nr. 94/26884. Im allgemeinen müssen diese Zelllinien in einem Medium vermehrt werden, das einen Differenzierungs-inhibierenden Faktor (DIF) enthält, um spontane Differenzierung und Verlust der mitotischen Fähigkeit zu verhindern. Leukämie-inhibitorischer Faktor (LIF) ist insbesondere nützlich als ein DIF. Andere DIFs, die nützlich für die Verhinderung von ES-Zell-Differenzierung sind, schließen ohne Limitation Oncostatin M (Gearing and Bruce, The New Biologist 4: 61–65 (1992); persönliche Mitteilung von A. Smith), Interleukin 6 (IL-6) mit löslichem IL-6-Rezeptor (sIL-6R) (Taga et al.; Cell 58: 573–81 (1989); persönliche Mitteilung von A. Smith), und ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF) (Conover et al., Development 19: 559–65 (1993) ein. Andere bekannte Cytokine können ebenso als geeignte DIFs fungieren, allein oder in Kombination mit anderen DIFs.
Als einen nützlichen Fortschritt zum Erhalten von ES-Zellen in einem undifferenzierten Stadium haben die vorliegenden Erfinder eine neue Variante von LIF identifiziert. Im Gegensatz zu den zuvor identifizierten Formen von LIF, welche extrazellulär sind, ist diese neue Form von LIF (hiernach T-LIF) intrazellulär lokalisiert. Das Transkript wurde von murinen ES-Zellen unter Verwendung der RACE-Technik kloniert, Frohmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998–9002 (1988), und einer Sequenzanalyse unterzogen. Die Analyse der erhaltenen Nukleinsäuresequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenz zeigt an, daß T-LIF eine gestutzte Form der LIF-Sequenz ist, die zuvor in der Literatur berichtet wurde.
Die Expression der T-LIF-Nukleinsäure in einer geeignten Wirtszelle führt zu einem 17 kD Protein, das nicht glycosyliert ist. Dieses Protein ist für die Inhibierung der Differenzierung von murinen ES-Zellen in Kultur nützlich. Von dem Protein wird erwartet, daß es eine ähnliche Aktivität mit Schweinezellen hat, da murines D-LIF in der Inhibierung von murinen und Schweine-ES-Zell-Differenzierung wirksam ist. Die vorliegenden Erfinder haben auch die Sequenz der humanen Form von T-LIF bestimmt.
Um ein Knockout-Tier zu generieren, werden ES-Zellen, die mindestens ein inaktiviertes α-1,3-GalT-Allel haben, identifiziert und in einen sich entwickelnden Embryo eingeführt. Dies kann durch Injektion in die Blastocysten-Kavität eines murinen Embryos im Blastocysten-Stadium, durch Injektion in einen Embryo im Morula-Stadium, durch Co-Kultivierung von ES-Zellen mit einem Embryo im Morula-Stadium oder durch Fusion der ES-Zelle mit einer entkernten („enucleated") Zygote erreicht werden. Der resultierende Embryo wird bis zur sexuellen Reife aufgezogen und fortgepflanzt, um Tiere zu erhalten, deren gesamte Zellen (einschließlich Keimzellen) das inaktivierte α-1,3-GalT-Allel tragen. Wenn die ursprüngliche ES-Zelle heterozygot für das inaktivierte α-1,3-GalT-Allel war, müssen mehrere dieser Tiere miteinander fortgepflanzt werden, um Tiere zu generieren, die homozygot für das inaktivierte Allel sind.
Obwohl direkte Mikroinjektion von DNA in Eier nicht die große Zahl an Rekombinationsereignissen generiert, die durch die Transfektion einer großen Zahl von kultivierten Zellen erreicht wird, kann dennoch die direkte Injektion von Eiern ein nützlicher Ansatz sein, da dieser die speziellen Manipulationen (siehe oben), die notwendig sind, um eine kultivierte Zelle in ein Tier umzuwandeln, vermeidet. Dem ist so, weil befruchtete Eier natürlich vollkommen „totipotent" sind, d.h. sie sind fähig, sich außer der Implantation in eine Ersatzmutter ohne weitere substantielle Manipulation in einen Erwachsenen zu entwickeln. Um die Möglichkeit der homologen Rekombination zu verstärken, wenn Eier direkt mit Knockout-Konstrukten injiziert werden, ist es nützlich, mindestens ungefähr 8 kb homologe DNA in das abzielende Konstrukt einzufügen. Es ist zusätzlich ebenso nützlich, die Knockout-Konstrukte von isogener DNA herzustellen. Zum Beispiel ist es für die Injektion von Schweineeiern nützlich, die Konstrukte aus DNA zu präparieren, die aus dem Eber isoliert wurde, dessen Sperma zur Befruchtung der Eier, die für die Injektion verwendet wurden, verwendet wurde.
Embryonen, die von mikroinjizierten Eiern abgeleitet werden, können auf homologe Rekombinationsereignisse auf verschiedene Weise überprüft werden. Wenn zum Beispiel das GalT-Gen durch eine kodierende Region unterbrochen ist, die ein detektierbares (z. B. fluoreszierendes) Genprodukt produziert, dann werden die injizierten Eier bis zum Blastocysten-Stadium kultiviert und auf die Anwesenheit des Indikator-Polypeptids analysiert. Embryonen mit zum Beispiel fluoreszierenden Zellen werden dann in eine Ersatzmutter implantiert und es wird ihnen erlaubt, sich zu entwickeln („develop to term"). Alternativ dazu wird injizierten Eiern erlaubt, sich zu entwickeln und die resultierenden Schweinchen werden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder reverse Transkription-PCR (RT/PCR) auf Nachweise homologer Rekombination analysiert.
Charakterisierung von Knockout-Tieren
Tiere, die entweder eine (heterozygot) oder zwei (homozygot) inaktiverte GalT-Gene haben, werden charakterisiert, um die erwarteten Veränderungen in der Genexpression und im phänotypischen Effekt zu bestätigen. Zum Beispiel sollte GalT-mRNA von homozygoten Knockout-Tieren abwesend sein. Das kann zum Beispiel durch reverse Transkription-PCR (RT/PCR) unter der Verwendung von geeigneten GalT-spezifischen Primern bestätigt werden. Zusätzlich können verschiedene Tests durchgeführt werden, um die Expression des GAL-Epitops in homozygoten Knockout-Tieren zu evaluieren. Zum Beispiel können anti-GAL-Antikörper und IB₄-Lectin (welches eine exklusive Affinität für terminale α-D-Galactosyl-Reste hat) in verschiedenen Assay- oder immunohistologischen Formaten verwendet werden, um auf die Anwesenheit eines GAL-Epitops in einer Reihe von Geweben zu testen. Als eine andere Indikation des GAL-Epitop-Status kann die Lyse von Zellen durch humanes Serum durch die Verwendung eines ⁵¹Chrom-Freisetzungsassays getestet werden.
BEISPIEL 1
Affinitäts-Reinigung von humanen anti-GAL-Antikörpern
Anti-GAL-Antikörper wurden von normalem Hitze-inaktiviertem AB-Serum (von CS1, Parkville, Victoria, Australien) unter der Verwendung der folgenden Prozeduren gereinigt.
A. Präparation von Gesamt-anti-GAL (IgG + IgM)-Antikörpern
Die folgenden Prozeduren wurden bei 4°C durchgeführt.

1. 15–30 ml Serum (in 3 ml Mengen) durch Passage durch eine prä-equilibrierte (20 ml Applikationspuffer: 20 mM K₂HPO₄, 30 mM NaCl, pH 8) Econo Pac 10 DG (Bio-Rad, Richmond, USA)-Säule entsalzen. Alternativ dazu für Präparationen in großem Maßstab durch erschöpfende Dialyse gegen Applikationspuffer entsalzen.
2. Säule mit 4 ml Aliquoten von Applikationspuffer waschen. Säuleneluate sammeln und zusammenführen.
3. Vereinigtes entsalztes Serum auf eine prä-equilibrierte (20 ml Applikationspuffer) Synsorb 115 (Galactosyl-Galactose; Chembiomed, Alberta, Kanada) oder D(+) Melibiose-Agarose (Sigma)-Affinitätssäule auftragen (5 ml – 50 ml in Abhängigkeit von der benötigten Ausbeute).
4. Durchfluß (teilweise anti-GAL-dezimiert) sammeln und wieder auf die Säule auftragen. Prozeß dreimal wiederholen, um vollständige Entfernung der anti-GAL-Antikörper sicherzustellen. Die Durchwasch-Lösung der dritten Passage durch die Synsorb-Säule wird gesammelt und das Volumen auf das Ursprungsvolumen des Serums mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) pH 7 + 0,05% Azid eingestellt. Dies wird als eine Quelle für anti-GAL-Antikörper-dezimiertes Serum verwendet.
5. Säule mit PBS pH 8 waschen, bis das Eluat proteinfrei ist (O.D. 280 nm = 0).
6. Anti-GAL-Antikörper mit 3,5 M KSCN, pH 7,5 eluieren. 4 ml Fraktionen sammeln, O.D. 280 bestimmen und Peak-Fraktionen (gewöhnlich 1–6) zusammenführen.
7. Anti-GAL-Antikörper unter der Verwendung von CF25-Ultrafiltrations-Konen („ultrafiltration cones") (Amicon, Danvers, USA) konzentrieren. 7 ml der zusammengeführten Fraktionen, enthaltend anti-GAL-Antikörper, hinzufügen, um den Konus zu zentrifugieren (2.000 U/Minute, 10 Minuten, 4°C). Konus wieder befüllen und wieder zentrifugieren, bis das Volumen auf 3–5 ml reduziert ist.
8. Um den KSCN zu verdünnen, Volumen auf 7 ml mit PBS einstellen und zentrifugieren (2.000 U/Minute, 10 Minuten, 4°C). Prozeß weitere zehnmal wiederholen.
9. Probe, enthaltend anti-GAL-Antikörper, vom Konus unter der Verwendung einer Plastikpipette entfernen, Konus mit PBS pH 7 + 0,05% Azid spülen. Herstellung von IgG anti-GAL-Antikörpern

Die folgenden Verfahren wurden bei 4°C durchgeführt.

1. Entsalze 15–30 ml Serum (in 3 ml Chargen) durch Passage durch eine prääquilibrierte (20 ml Auftragungspuffer) Econo Pac 10DG (Bio-Rad, Richmond, USA) Säule. Alternativ, für Präparationen in großem Maßstab, entsalze durch erschöpfende Dialyse gegen Auftragungspuffer.
2. Wasche Säule mit 4 ml Aliquots Auftragungspuffer, sammle und vereinige die Säuleneluate.
3. Trage entsalztes Serum auf eine prä-äquilibrierte (30 ml Auftragungspuffer) Affi-Blue-Säule (Bio-Rad, Richmond, USA) auf (Affi-Blue bindet alle Proteine mit der Ausnahme von Albumin und IgG).
4. Wasche die Säule mit 20 ml Auftragungspuffer, um die IgG angereicherte Fraktion zu eluieren.
5. Trage IgG-angereicherte Fraktion auf eine prä-äquilibrierte (20 ml Auftragungspuffer, pH 8,0) Synsorb 115 (Galactosyl-Galactose; Chembiomed, Alberta, Kanada) Affinitätssäule (5 ml).
6. Sammle den Durchlauf und trage erneut auf die Säule auf. Wiederhole Verfahren dreimal, um ein vollständiges Entfernen von anti-GAL-Antikörpern sicherzustellen. Das durchgewaschene auf der dritten Passage durch die Synsorb-Säule wird gesammelt und das Volumen auf das Ausgangsvolumen des Serums mit PBS pH 7 +0,05% Azid eingestellt. Dies wird als eine Quelle von Kontroll-anti-GAL-depletiertem IgG verwendet.

In einigen Fällen wurde anti-GAL IgG weiter unter der Verwendung einer Protein-G-Säule gereinigt, die effizient IgG bindet, jedoch keine anderen Antikörperisotypen. Das IgG wurde dann aus der Protein-G-Säule unter der Verwendung von Glycin pH 2,4 eluiert.
Alle anti-GAL-Antikörperpräparationen wurden auf das Folgende hin analysiert:

a. Proteingehalt wurde unter der Verwendung des Bradford-kolorimetrischen Verfahrens bestimmt (Bradford, M.M 1976, Anal. Biochem. 72:248–254, unter der Verwendung von gereinigtem menschlichen IgG als Standard.
b. Molekulargewicht und Reinheit wurden unter der Verwendung von Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemäß dem durch Laemli, Nature (London) 227:680 (1970) beschriebenen Verfahren bestimmt und das Protein wurde in den Gelen durch Silberfärbung unter der Verwendung von Standard-Kitreagenzien (Amersham, UK) nachgewiesen.
c. Antikörperklasse und Isotyp wurden durch radiale Immundiffusion unter der Verwendung von Standardverfahren, wie in Rose et al. (Herausgeber), Manual of Clinical Laboratory Immunology, American Society for Microbiology, Washington, D.C., bestimmt. Von den IgG-anti-GAL-Präparationen wurde gefunden, daß sie alle Subklassen enthalten, wobei IgG2 vorherrschte.

BEISPIEL 2
Reaktivität von IgG- und IgM-anti-GAL-Antikörpern und depletiertem Serum mit Schweinzellen und -geweben
I. Zellen
Die Reaktivität von IgG- und IgM-anti-GAL-Antikörpern wurde unter der Verwendung von entweder Schweineaorta-Endothelzellen (durch die Erfinder präpariert wie unten beschrieben) oder Schweine-Epithelzellinie LLC PK₁ (PK₁), erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC), Zugangsnummer CRL1392, ermittelt.
A. Isolierung und Kultur von Schweineaorta-Endothelzellen (PAE's)
Die Schweine wurden Blut-typisiert (unter der Verwendung von menschlichen Typisierungsreagenzien) um "0-Typ"-Schweine zu identifizieren, d.h. Schweine, die mit Antikörpern gegen A oder B menschlichen roten Blutzellantigenen nicht reaktiv waren. Aorten wurden aus "0-Typ"-Schweinen ausgeschnitten, dann auf Eis vom Schlachthof zum Labor transportiert. PAE's wurden durch Kollagenasebehandlung wie durch Gimbrone et al., J. Cell Biol. 60: 673–84 (1974). Die PAE's wurden in RPMI Medium enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS), ergänzt mit 150 μg/ml Endothelzell-Supplement (Sigma) und 50 μg/ml Heparin (Sigma) kultiviert. Die Zellen wurden als Endothelzellen durch ihre typische Kopfsteinpflaster-Morphologie und durch ihre Immunreaktivität mit Faktor VIII-Antikörpern, wie durch unter der Verwendung von Immunfluoreszenz identifiziert, identifiziert. In all den unten beschriebenen Tests, wurden die PAE's zwischen der 8. und 12. Passage verwendet.
B. Gewebekultur: Hälterung von PK-1 und PAE-Zellinien
Alle Gewebekultur wurde in einer Laminarfluß-Abzugshaube unter der Verwendung von geeigneter Gewebekultur-Steriltechnik durchgeführt. Alle Gewebekulturreagenzien, wenn nicht anders angegeben, wurden von CSL, Melbourne, Australien, erworben. Die Medien waren wie folgt zusammengesetzt: PK-1-Kulturmedium:

DMEM (Cytosystems, Castle Hill, Australien) 500 ml

FCS (CSL, Melbourne, Australien) 37,5 ml

Glutamin (200 mM) (Cytosystems) 5 ml

Hepes (1M) (CSL) 7,5 ml

Penicillin (CSL) 0,5 ml (10⁵U/ml final)

Streptomycin (CSL) 0,5 ml (10⁵μg/ml final)

PAE-Kulturmedium:

RPMI (CSL) 90 ml

FCS (CSL) 10 ml

Endothelzell-Supplement (3 mg/ml) (Sigma) 1,5 ml

Heparin (10 mg/ml) (CSL) 0,5 ml
Endothelzell-Supplement wurde von Sigma Chem. Co. (St. Louis, Missouri, USA) als ein lyophilisiertes Pulver erworben, in sterilem HBBS resuspendiert und 3 ml Aliquots bei 4°C gelagert.

Heparin (Sigma, Missouri, USA) (10 mg/ml) – gelöst in PBS

(10 mg/ml)

– Filter-sterilisiert

(0,22 μm)

Hanks-Puffer – gekauft von Cytosystems
Die folgenden allgemeinen Verfahren wurden bei der Vermehrung der Zellinien verwendet.

1) Gieße altes Medium ab
2) Spüle Zellen zweimal mit sterilem PBS
3) Füge 3 ml TED (0,05 M Trypsin, 0,53 M EDTA, Gibco, NY, USA) hinzu
4) Inkubiere 10 Minuten in CO₂-Inkubator bei 37°C
5) Füge 7 ml RPMI mit 10% FCS hinzu
6) Resuspendiere die Zellen und Transferiere in ein steriles 10 ml-Röhrchen
7) Zentrifugiere für 5 Minuten bei 1200 U/Minute, Gieße Überstand ab
8) Resuspendiere Zellen in RPMI mit 10% Neugeborenen-Rinderserumalbumin (NBS) und wiederhole Zentrifugation
9) Resuspendiere Zellen in 1 ml DMEM (PK-1's) oder RPMI (PAE's) (mit Zusatzstoffen, wie oben beschrieben)
10) Füge 10 ml Medium und das geeignete Volumen von Zellsuspension hinzu, um die gewünschte Verdünnung für jede 75 cm² Gewebekulturflasche zu erhalten und Stelle in den befeuchteten CO₂-Inkubator zurück.

C. Antikörperfärbung und FRCS-Anal

1) Füge 2 ml TED zu einer 75 cm² Kulturflasche enthaltend PK-1 oder PAE's und inkubiere bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
2) Füge RPMI plus 10% FCS (5 ml) hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
3) Pelletiere die Zellen durch Zentrifugation (700 g, 5 Minuten, 4°C).
4) Wasche die Zellen durch Resuspension und Zentrifugation in Hanks-Puffer (×2).
5) Pelletiere die Zellen durch Zentrifugation (700 g, 5 Minuten, 4°C).
6) Resuspendiere das Zellpellet in Hanks-Puffer enthaltend gereinigte anti-GAL-Antikörper, GAL-depletiertes Serum oder GAL-depletiertes IgG und inkubiere depletiertes IgG und inkubiere bei 4°C für 60 Minuten. Alle Antikörper wurden unverdünnt verwendet oder 1:2 oder 1:4 in Hanks-Puffer verdünnt.
7) Füge 1 ml Hanks-Puffer hinzu, Pelletiere Zellen durch Zentrifugation und Blase Überstand ab.
8) Resuspendiere Pellet FITC-markiertem Schaf-anti-Mensch IgG Fab2 oder IgM Fab2 (Silenus, Hawthorn, Australien), verdünnt 1:80 in Hanks-Puffer.
9) Inkubiere für 30 Minuten bei 4°C.
10) Wasche dreimal mit Hanks-Puffer, repuspendiere Pellet aus finaler Waschung in 0,5 ml Hanks-Puffer.
11) Analysiere gefärbte Proben unter der Verwendung eines FACScan II (Becton Dickinson), gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Die Spezifität der anti-GAL-Antikörperbindung an Schweinezellen wurde durch Untersuchen der Fähigkeit von Zuckern verschiedener Strukturen bestimmt, die Antikörperbindung zu inhibieren. In diesen Kompetitionsstudien wurden die anti-GAL-Antikörper mit Zucker (0,1 M) bei 37°C für 30 Minuten vorinkubiert, bevor sie zu den Zellen hinzugefügt wurden.
B. Ergebnisse
Unter der Verwendung von Immunfluoreszenz wurde gefunden, daß gesamtes anti-GAL (IgM und IgG) und gereinigtes anti-GAL-IgG sowohl PK-1- und PAE-Zellen färbte. Auf der anderen Seite ergab weder das Gesamt-anti-GAL-Antikörper-depletierte Serum, noch das anti-GAL-IgG-depletierte Serum nachweisbare Färbung über den Hintergrund hinaus. Die Färbung mit anti-GAL-IgM und/oder -IgG wurde durch gereinigte Galactose und durch Disaccharide inhibiert, wie terminale Galactosereste in der α-1-Konfiguration aufweisen, wie zum Beispiel Melibiose (6-O-α-D-Galactopyranosyl-D-Glucose) und Stachyose (α-D-Gal-[1->6]-α-D-Glc-[1->2]-β-D-Fru). Die Färbung wurde nicht durch Zucker wie zum Beispiel Lactose (4-O-β-D-Galactopyranosyl-α-D-Glycose) inhibiert, das einen terminalen Galactoserest aufweist, jedoch in der β1->4-Konfiguration. Die Ergebnisse eines solchen Experiments sind in 1 dargestellt. Die PAE's wurden mit anti-GAL-Antikörper allein (GAL-PBS) oder mit anti-GAL-Antikörper gefärbt, der mit entweder Melibiose (GAL:MELIBIOSE), Galactose (GAL:Galactose) oder Lactose (GAL:LACTOSE) prä-inkubiert wurde. Die anti-GAL-Antikörperfärbung war in den Proben, die Melibiose und Galactose enthielten ungefähr 10-fach niedriger, war jedoch nicht signifikant durch Lactose beeinträchtigt.
II. GEWEBE
A. Verfahren
Schweinniere wurde in Formalin fixiert und vor Einbettung in Paraplast dehydriert. Schweineherz und -leber wurden in Paraformaldehyd-Lysin-Perjodat-Fixativ fixiert und in O.C.T. Einbettungsverbindung (10,24% w/w Polyvinylalkohol, 4,26% w/w Polyethylenglycol, 85,50% w/w nicht reaktive Inhaltsstoffe; Tissue Tek^®, Miles, Inc., Elkhart, Indiana, USA) schnell gefroren. Vier μm-Dicke Schnitte von Schweineherz und -leber und 2 μm-Dicke Schnitte von Nieren wurden mit gereinigten anti-GAL-Antikörpern (unverdünnt, 1:2 und 1:4) für 60 Minuten inkubiert und dann mit einem Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierten Schaf-anti-Mensch-Immunglobulin F(ab'); Fragment (Silenus Laboratories, Hawthorn, Australien) (1:100) für 30 Minuten oder einem Peroxidase-konjugierten Kaninchen-antimenschlichen IgG (Dakopatts, Glostrup, Dänemark) (1:50) für 60 Minuten inkubiert. Kontrollschnitte wurden auf Autofluoreszenz mit dem sekundären Antikörper allein analysiert oder mit dem anti-GAL-depletierten IgG oder normalen Schweineserum als dem primären Antikörper. Keine Färbung wurde nachgewiesen. Die Spezifität der anti-GAL-Antikörper wurde durch prä-inkubieren von Schnitten von Schweine-renalem Cortex mit einer Auswahl von Zuckern, einschließlich Melibiose, Lactose, Saccharose und Glucose bei 0,1 M getestet.
B. Ergebnisse
Wie bei den Analysen die mit den Schweinezellen unter der Verwendung von Immunfluoreszenz durchgeführt wurden, färbte gesamt-anti-GAL IgM + IgG, gereinigtes anti-GAL IgG, jedoch nicht die anti-GAL IgM- und/oder IgG-depletierten Seren, alle untersuchten Schweinegewebe. Die einzelnen Färbungsparameter variierten von Organ zu Organ, wie im folgenden ausgeführt:
Immunfärbung von Schweinegeweben mit anti-GAL-Antikörpern:
Die Spezifität der Bindung von anti-GAL-Antikörpern wurde an Schnitten von Schweine-Renalkortex durch Inhibierung mit 0,1 M Melibiose, Lactose, Saccharose und Glucose getestet. Die Reaktivität der anti-GAL-Antikörper mit proximalen Tubulusbürstensäumen war nahe auf den Hintergrund verringert, durch prä-Inkubation von Antikörper mit Melibiose, wurde jedoch nicht durch die anderen Saccharide inhibiert.
BEISPIEL 3
Hämagglutination von Schweine-RBC durch menschliches Serum:
Zucker-inhibierende Studien
Die dazu verwendeten Verfahren, um die Hämagglutination von Schweine-roten Blutzellen (RBC's) durch menschliches Serum zu untersuchen wurden von den durch Galili, J. Exp. Med. 160: 1579–81 (1984) und Severson, Immunol. 96: 785–789 (1966) beschriebenen Verfahren angepasst.
I. Verfahren
A. Medien/Lösungspräparation

1. Menschliches Serumalbumin (HSA) (CSL, Melbourne, Australien) (5 mg/ml) wurde in PBS gelöst, Filter-sterilisiert und bei 4°C gelagert.

2. Präparation von Zuckern: – 1 M Stammlösung von Zucker wurde durch Lösen der angegebenen Menge in 100 ml PBS hergestellt. Natriumazid wurde hinzugefügt (0,02%) und die Lösungen bei 4°C gelagert.

α-Lactose (4-O-β-D-galactopyranosyl-α-D-glucose)	36,0 g
D-(+)-Galactose	18,0 g
Stachyose (α-D-Gal-[1->6]-α-D-Glc-[1->2]-β-D-Fru)	66,6 g
Melibiose (6-O-α-D-galactopyranosyl-D-glucose)	34,2 g
Saccharose (α-D-glucopyranosyl-β-D-fructofuranosid)	34,2 g
D-(+)-Glucose	18,0 g
α-D-(+)-Fucose-(6-desoxy-D-galactopyranose)	16,4 g

Alle Zucker wurden von Sigma (St. Louis, Missouri, USA) erworben. Die Zuckerlösungen wurden in PBS auf die geeignete Konzentration wie erforderlich verdünnt.
B. Herstellung von Schweine-RBC's

1. Heparinisiertes Schweineblut (Animal Resources, Clayton, Australien) wird bei 800 U/Minute für 10 Minuten zentrifugiert, um die RBC zu pelletieren.
2. Das RBC-Pellet wird durch Resuspension in PBS (10 ml) und prä-Zentrifugation (3 mal wiederholt) gewaschen. Nach der finalen Waschung wird das RBC-Pellet in 10 ml PBS resuspendiert.
3. Eine 0,5%-Lösung von RBC wird durch hinzufügen von 50 μl RBC-Lösung (von Schritt 2, oben) zu 10 ml PBS enthaltend 0,5 g/100 ml HSA präpariert.

C. Präparation von 96-Well-Mikrotiterplatten (Titretek, USA)

1. Füge 25 μl von PBS zu jedem Well hinzu.
2. Füge 25 μl von vereinigtem menschlichen AB-Serum (CSL, Melbourne, Australien) zu Spalte 1 hinzu und Verdünne seriell durch Entfernen von 25 μl aus Spalte 1 und Hinzufügen zu Spalte 2, dann Wiederholen durch aufeinander folgendes Entfernen und Hinzufügen von 25 μl aus und zu jedem Well über die Platte hinweg, wobei zuletzt 25 μl aus Spalte 11 verworfen werden und kein Serum zu Spalte 12 hinzugefügt wird.
3. Füge 25 μl Zuckerlösung zu jeder Reihe in abnehmenden Konzentration in untereinander liegenden Reihen hinzu. Keine Zuckerlösung wird zur letzten Reihe hinzugefügt.
4. Inkubiere bei 4°C über Nacht und dann bei 37°C für 30 Minuten.
5. Füge 50 μl 0,5% Schweine-RBC zu jedem Well hinzu; vortexe und inkubiere bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Bestimme die Agglutination visuell.

II. ERGEBNISSE
Menschliches Serum verursachte die Agglutination von Schweine-RBC's bei einem Titer von zwischen 1/32–1/64, was mit der Anwesenheit von hohen Spiegeln von natürlich austretendem Xenoantikörper (NXAb) in menschlichem Serum konsistent ist. Um die Spezifität der NXAb-Antwort zu untersuchen, wurden Zuckerinhibierungsstudien durchgeführt. Zucker, wie zum Bespiel Melibiose, Stachiose, Galactose und Fucose, die terminale Galactosereste in der α1-6-Konfiguration aufweisen, wurden als die Agglutination im μM bis mM-Bereichs inhibierend gefunden. Zucker mit anderen Strukturen, wie zum Bespiel Lactose und Saccharose waren nur inhibitorisch, wenn sehr hohe Konzentrationen verwendet wurden. Bei diesen hohen Konzentrationen sind die beobachteten Effekte am wahrscheinlichsten nicht-spezifisch, aufgrund, zum Beispiel von Veränderungen der Osmolarität. Die Ergebnisse sind unten zusammengefasst:
Schweine-RBC-Hämagglutination durch menschliche Seren: Zuckerinhibierung
BEISPIEL 4
Inhibierung von menschlicher Serum-induzierter Lyse von Schweinezellen durch Zucker
Die Fähigkeit von menschlichen Serum die Lyse von Schweinezellen zu verursachen wurde unter der Verwendung von sowohl Schweineepithel (PK₁) und Aortaendothel (PAE's)-Zellen untersucht, deren Isolierung und Kultur in Beispiel 2 beschrieben ist. Die Zellyse wurde unter der Verwendung entweder des ⁵¹Chrom-Freisetzungstests wie beschrieben durch Cerottini und Brunner, Nature New Biol. 237:272, 1972 oder dem Cytotox LDH-Freisetzungstest gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega, USA) durchgeführt.
I. VERFAHREN
A. ⁵¹CR-Freisetzungstest

1. Präparation von Zellen: a) Trypsinisiere eine konfluente Flasche von Zellen. Im Durchschnitt werden ungefähr 3 × 10⁶ PAE's und ungefähr 3 × 10⁷ PK₁-Zellen pro 10 ml Flasche erhalten. Ungefähr 1 × 10⁵-Zellen sind für jeden Well in dem ⁵¹CR-Freisetzungstest erforderlich. b) Wasche die Zellen 4 mal in 10 ml RPMI (kein FCS); zentrifugiere 1200 U/Minute für 12 Minuten. c) Resuspendiere die Zellen in 100 μl RPMI (mit 10% Hitze-inaktiviertem FCS; siehe unten).
2. Markieren von Zellen mit ⁵¹CR: a) Kombiniere in 10 ml-Röhrchen: Zellen in 195 μl RPMI/10% FCS (Hitzeinaktiviert); 5 μl 51 CR (120 μCi). b) Inkubiere bei 37°C für 2 Stunden. c) Füge 2 ml RPMI/10% FCS (Hitze-inaktiviert) hinzu. d) Zentrifugiere die Zellen durch eine Lage von FCS (Hitze-inaktiviert), um überschüssigen Marker zu entfernen. e) Überschichte sanft die markierten Zellen auf ein 4 ml-Polster von FCS unter der Verwendung einer Pasteur-Pipette. f) Zentrifugiere bei 700 g für 5 Minuten bei 4°C. g) Entferne Überstand, wobei darauf acht gegeben wird, nicht das Zellpellet zu stören. h) Resuspendiere das Pellet in RPMI/10% FCS (Hitze-inaktiviert) bei ungefähr 3×10⁷-Zellen/ml.
3. Testbedingungen: a) Für PAE's wurde Kaninchenkomplement als die Komplementquelle verwendet, da der ⁵¹CR-Freisetzungstest nicht ausreichend sensitiv war, um eine Lyse nachzuweisen, wenn menschliches Komplement, eine weniger "aktive" Quelle, verwendet wurde. Im Gegensatz wurde mit dem LDH-Test, der signifikante sensitiv ist, normales menschliches Serum (NHS) als die Quelle an Komplement verwendet. b) Zu jedem Test-Well einer 96-Well V-Bodenplatte, füge hinzu: – 100 μl markierte Zellen – 10–50 μl NHS (Hitze-inaktiviert) (5–25% final) – Komplement: PAE's: 50 μl absorbiertes Kaninchenkomplement (25% final) PK₁: 10–40 μl NHS (5–25% final) – 50 μl Antikörper (gesamt-anti-GAL (IgG + IgM, anti-GAL IgG, anti-GAL-Antikörper-depletiertes Serum oder anti-GAL-Antikörper-depletiertes IgG). c) Stelle Volumen auf 200 μl mit RPMI/10% FCS (Hitze-inaktiviert) ein, falls erforderlich. d) Inkubiere Platten bei 37°C für 3 Stunden. e) Zentrifugiere Platten bei 1000 U/Minute für 5 Minuten, um Zellen zu pelletieren. f) Entferne 100 μl Überstand aus jedem Well und transferiere in ein Gammazähler-Röhrchen. g) Füge 3 ml Szintillationsflüssigkeit hinzu und Messe die ⁵¹CR-Freisetzung unter der Verwendung eines Gammazählers (Packard Instrument Company, I1-linois, USA). (Um die maximale Freisetzung zu bestimmen, füge 100 μl 8% Triton X-100, hergestellt in RPMI/10% FCS (Hitze-inaktiviert) zu 100 μl markierten Zellen hinzu). (Anmerkung: Jede Reaktion wird in 4-fachen Ansätzen angesetzt)
4. Berechnung der %-Lyse:
5. Zuckerinhibierung von Komplement-induzierter Zellcytotoxizität: In einer 96-Well-Testplatte, Mische das folgende: – 50 μl markierte Zellen – 50 μl Komplement (PAE's: Schweinemilzzellen absorbiertes Komplement; PK₁'s: NHS) – x μl Zucker (finale Konzentration von Zucker: 10^–1 bis 10^–3 M – y μl NHS (Hitze-inaktiviert) – finale Konzentration 5–20% – Stelle Volumen auf 200 μl mit RPMI ein

B. LDH-Freisetzungtest

1. Allgemeine Verfahren: a) Präpariere Zellen mit wie für den ⁵¹CR-Freisetzungstest und Markiere mit LDH gemäß den Anweisungen des Herstellers (Cytotox nicht-radioaktiver LDH-Freisetzungstest, Promega, USA) b) zu jedem Well einer 96-Wellplatte füge hinzu (jede Reaktion in 4-fachen Ansätzen): – 25 μl markierte Zellen – 5–20 μl NHS – x μl Zucker (finale Konzentration von Zucker: 10^–1 bis 10^–3 M) – RPMI/10% FCS (Hitze-inaktiviert), zu einem Gesamtvolumen von 100 μl c) Inkubiere Platten bei 37°C für 1 Stunde d) Zentrifugiere Platten bei 1500 U/Minute für 5 Minuten e) Entferne 50 μl Überstand aus jedem Well (wobei dabei acht gegeben wird, keine Zellen zu entfernen) und Transferiere in eine ELISA-Platte, die 50 μl Substratmix enthält (hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers) f) Decke Tablett zu und inkubiere im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten. g) Füge 50 μl Stopplösung zu jedem Welt hinzu unter der Verwendung einer Multikanalpipette h) Lese Absorption bei 492 nm.
2. Kontrollen: a) Spontane Freisetzung (kein Antikörper oder Komplement) – 25 μl markierte Zellen – 75 μl RPMI/10% FCS (Hitze-inaktiviert) b) Maximale Freisetzung – 25 μl markierte Zellen – 50 μl 16% Triton X-100 – 25 μl RPMI/10% FCS (Hitze-inaktiviert)
3. Berechnung von %-Lyse:
4. Experimenteller Aufbau:
5. Herstellung von Schweinemilz-absorbiertem Kaninchenkomplement: a) Schneide Schweinemilz (erhalten aus einem örtlichen Schlachthof) in kleine Stücke und präpariere eine Einzel-Zellsuspension durch Passage durch ein feines Metallnetz b) Pelletiere Zellen durch Zentrifugation bei 700 g, 7 Minuten bei 4°C c) Resuspendiere Zellpellet in RPMI/10% FCS und Wiederhole Zentrifugation d) Resuspendiere in RPMI/10% FCS/10% Dimethylsulfoxid (DMSO) e) Zähle Zellen und Lagere gefrorene Aliquots (3 × 10⁹-Zellen/Aliquot) – Verwende ein Aliquot für jede Absorption f) Für die Absorption, Taue und Zentrifugiere bei 600 g, 5 Minuten bei 4°C und entferne den Überstand, der das DMSO enthält g) Wasche zweimal mit RPM/10% FCS (10 ml) h) Resuspendiere das Zellpellet in Kaninchenkomplement; mische (Drehrad) 2 Stunden bei 4°C i) Zentrifugiere 600 g, 5 Minuten bei 4°C und entferne den Überstand, der das Kaninchenkomplement enthält; lagere bei 4°C.

2. ERGEBNISSE
Mit beiden Zelltypen (PAE's und PK₁'s) wurden unter der Verwendung beider Lysetests vergleichbare Ergebnisse erhalten. Die Ergebnisse eines typischen Lyseexperiments sind in 2 dargestellt, worin die Lyse von PAE's durch menschliches Serum und durch gereinigte anti-GAL-Antikörper unter der Verwendung des ⁵¹CR-Freisetzungstests bestimmt wurde. Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit PK₁-Zellen unter der Verwendung des ⁵¹CR-Freisetzungstests und mit beiden Zellinien unter der Verwendung des LDH-Freisetzungstests erhalten. Die Ergebnisse dieser Tests können wie folgt zusammengefasst werden:

1. Xenoantikörper (NXAb) in menschlichen Serum in Anwesenheit von Komplement sind in der Lage, Schweinezellen zu lysieren. Die Lyse steigt mit ansteigenden Konzentrationen von Serum an.
2. Prä-Absorption von NHS mit Schweinemilzzellen (was die NXAb entfernt): keine Lyse.
3. Verwendung von Hitze-inaktiviertem Komplement: keine Lyse.
4. Verwendung von NHS, depletiert von anti-GAL-Antikörpern: keine Lyse.
5. Verwendung von gereinigten gesamten anti-GAL-Antikörpern (IgG + IgM): Lyse.
6. Verwendung von gereinigtem anti-GAL IgG: keine Lyse.
7. Verwendung von gereinigten gesamt-anti-GAL-Antikörpern (IgG + IgM) und Dithiothreitol (DTT): keine Lyse. (DTT ist ein reduzierendes Mittel, das die multimere Struktur von IgM-Antikörpern unterbricht, ohne die IgG zu beeinträchtigen.)

Zusammen betrachtet zeigen diese Ergebnisse, daß die anti-GAL-Antikörper für die beobachtete Lyse verantwortlich sind. Gereinigtes anti-GAL IgG und DTT-behandelte gesamt-(IgG + IgM)-anti-GAL-Antikörper versagten dabei, eine Lyse hervorzurufen, was anzeigt, daß IgM, jedoch nicht IgG, Antikörper die verursachenden Mittel in diesem System sind. Vorhergehende Versuche, diese Beobachtung unter der Verwendung von gereinigtem IgM, präpariert entweder in roher Form durch Euglobulin-Fraktionierung oder durch α-IgM- Affinitätschromatographie zu verifizieren, waren nicht erfolgreich. Die Erfinder glauben, daß dies eine Inaktivierung des IgM während der Präparation widerspiegelt, anders als ein wirkliches widerspiegeln der Fähigkeit von anti-GAL IgM, eine Lyse von Schweinezellen zu verursachen. Hitzeinaktivierung des Komplements verhindert eine Lyse, was anzeigt, daß die Lyse von Schweinezellen ein Komplement-abhängiges Phänomen ist.
Der Effekt der Hinzufügung der Disaccharidzuckermelibiose (Gal α1→6 Gal) und Lactose (Gal β1→4 Glu) auf die Lyse von PAE's durch menschliches Serum, wurde unter der Verwendung des Cytotox-nicht-radioaktiven LDH-Freisetzungstests ermittelt. Die PAE's wurden in der Anwesenheit von 50% menschlichen Serum als der Quelle von Xenoantikörper und Komplement inkubiert, zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von jedem Zucker (1 mM bis 100 mM). Unter diesen Bedingungen schützte Melibiose, daß die Gal α1→6 Gal-Konfiguration aufweist, jedoch nicht Lactose, die die terminale Gal-Gruppe in einer Gal α1→4-Konfiguration aufweist, die Schweinezellen vor der Lyse.
BEISPIEL 5
Inhibierung von menschlichen Serum-induzierter Beschädigung von Rattenherzen durch Zucker
Das Langendorf-isolierte perfundierte ex vivo Herzmodell wurde verwendet, um weiter die Beteiligung von anti-GAL-Xenoantikörpern in hyperakuter Abstoßung zu demonstrieren.
I. VERFAHREN
A. Präparation und Lagerung von menschlichen Plasma

1. Zentrifugiere frisches menschliches Blut bei 3000 U/Minute, 10 Minuten, 4°C, um rote Blutzellen zu entfernen (RBC's).
2. Entferne das Plasma
3. Zentrifugiere das Plasma bei 10000 U/Minute, 10 Minuten, 4°C, um jegliche verbleibende Zellen zu entfernen; dekantiere das Plasma
4. Füge 2,5 ml 0,1 M EDTA pH 7,30 für jede 50 ml Plasma hinzu
5. Lagere 50 ml Aliquots bei –70°C
6. Für Hitze-inaktiviertes Plasma, erhitze auf 56°C für 60 Minuten, dann zentrifugiere bei 2500 U/Minute für 10 Minuten

B. Ermittlung der Komplementaktivität
Vor der Verwendung im ex vivo-Modell wurde sowohl Hitze-inaktiviertes und Kontrollplasma auf Komplementaktivität hin getestet. Die klassische Komplementaktivität wurde durch Hämolyse unter der Verwendung von sensitivierten Schaf-RBC's, beschrieben durch Harrison and Lachman, in: Weir et al. (Herausgeber), Handbook of Experimental Immunology and Immunochemistry, 4. Auflage, Blackwell Scientific Publications (1986) beschrieben, bestimmt. Die Alternative Komplement-Reaktionswegaktivität wurde unter der Verwendung des Kaninchen-hämolytischen Tests bestimmt, wie beschrieben durch Serrais et al., J. Immunol. Meth.. 140: 93–100 (1991). Der Test wurde in einem Puffer durchgeführt, der EGTA und MgCl₂ enthielt. Das EGTA chelatiert das Ca⁺⁺, wodurch der klassische Reaktionsweg inhibiert wird. Das Mg⁺⁺ ist für die Aktivierung und die Zusammensetzung von CdbBb erforderlich, der alternativen Reaktionsweg-c3-Convertase.
C. Präparation von Plasma für Herznerfusionen
Plasma, das aus verschiedenen Blutpacks präpariert wurde, wird auf 37°C aufgetaut, vereinigt und filtriert (nacheinander 100 μm Stahlsieb, 8,0 μm und 4,5 μm Millipore-Filter). CaCl₂ wird bei 0,58 mg/ml Plasma hinzugefügt und das Plasma bis zur Perfusion auf Eis gehalten.
D. Ex vivo isoliertes perfundiertes Nager-Herzmodell

1. Betäube Ratten mit Nembutal (1 μl Natriumpentobarbiton (60 mg/ml)/g Körpergewicht) und Mäuse mit Ether.
2. Lege chirurgisch das Herz frei und Injiziere Heparin (Schweinemucosa, 10000 U/ml) in die femorale Vene (Ratten: 0,3 ml injiziert)
3. Entferne Herz und Plaziere in eiskaltem Krebs-Henseleit-Puffer, enthaltend Heparin (0,2 ml/50 ml Puffer). Krebs-Henseleit-Puffer: – 119 mM NaCl – 25 mM NaHCO₃ – 4,6 mM KCl – 1,2 mM MgSO₄·7H₂O – 1,3 mM CaCl₂·2N₂O – 1,2 mM KH₂PO₄ – 11 mM Glucose – 0,25% (v/v) BSA - Stelle auf pH 7,4 ein; lagere bei 4°C
4. Verbinde die Aorta mit der Kanüle des Langendorf-Perfusionsapparats und Binde fest zusammen. Der Apparat wurde durch die vorliegenden Erfinder gemäß den experimentellen Erfordernissen des Langendorf-Herzmodells wie beschrieben in Doring & Dehnerrt, The Isolated Perfused Heart According to Langendorf, Biomesstechnik-Verlag March GmbH, D7806, Westdeutschland, zusammengebaut.
5. Perfundiere mit Krebs-Henseleit-Puffer (frisch jeden Tag hergestellt), der kontinuierlich mit Carbogen (95% O₂, 5% CO₂) bei einem Druck von 100 mmHg bei 37°C begast wird.
6. Bringe einen Haken an, der an einen Transducer (Physiograph MK-111-5, Narco Bio-Systems), am Apex des Herzens.
7. Perfundiere das Herz für 20 Minuten mit Krebs-Henseleit-Puffer um es dem Herzen zu erlauben sich zu stabilisieren (Reservoir-Volumen: 270 ml).
8. Füge Plasma wie folgt hinzu (vorgewärmt auf 37°C): – bei 20 Minuten – Füge 10 ml Plasma hinzu (=5% Plasma) – bei 25 Minuten – Füge 10 ml Plasma hinzu (=9% Plasma) – bei 30 Minuten – Füge 10 ml Plasma hinzu (=13% Plasma)
9. Verfolge Herz für weitere 30 Minuten und Zeichne Herzfluß- und Konzentrationsrate auf.

E. Zuckerperfusion

1. Stabilisiere das Herz im Krebs-Henseleit-Puffer für 30 Minuten wie oben beschrieben.
2. Füge 2,5 ml einer 1,08 M Stock Zuckerlösung zum Reservoir hinzu; Gesamtvolumen = 270 ml; finale Zuckerkonzentration = 10 mM.
3. Erlaube es dem Herzen, sich für 10 Minuten zu restabilisieren, dann Füge Plasma hinzu (Kontrolle oder Hitze inaktiviert), gemäß dem oben beschriebenen Schema.
4. Zeichne Herzschlag und Flußrate auf.

F. Präparation von anti-GAL-Antikörper-depletiertem Plasma (Alle Bearbeitungsschritte wurden bei 4°C durchgeführt)

1. Starte mit 200 ml frisch präparierten menschlichen Plasma; 100 ml werden einer Depletion unterzogen; 100 ml werden als eine nicht-behandelte Kontrolle, von demselben Patient am selben Tag abgenommen, verwendet; lagere bei 4°C.
2. Filtere das Plasma nacheinander durch 100 μm, 8 μm Metallsiebe und zuletzt durch einen 0,45 μm Millipore-Filter; Verdünne mit PBS, pH 8,0, auf 1000 ml.
3. Konzentriere auf 200 ml unter der Verwendung einer Amicon spiralförmig gewundenen Kartusche (entfernt Salz).
4. Äquilibriere Melibiose-Sepharosesäule (40 ml) mit PBS, pH 8,0 (10 Säulenvolumen).
5. Passagiere das Plasma durch die Melibiose-Sepharosesäure; Sammle den Durchfluß und lagere bei –70°C (= teilweise depletiertes Plasma).
6. Wasche Säule mit PBS, pH 8,0 (10 Säulenvolumen) bis die O.D. (280 nm) des Eluats ungefähr 0 ist.
7. Kombiniere das teilweise depletierte Plasma und das Eluat aus der Waschung; Konzentriere auf 200 ml (Amicon Spiralkonzentrator).
8. Eluiere die anti-GAL-Antikörperfraktion mit 4 M Guanidium HCl pH 6,4 (2 Säulenvolumen).
9. Regeniere die Säule mit PBS (10 Säulenvolumen).
10. Wiederhole den gesamten Prozess für weitere zwei Mal, d.h. re-passagiere das Plasma durch die Melibiosesäule, wasche, eluiere die anti-GAL-Antikörperfraktion und regeneriere die Säule.
11. Für die anti-GAL-Antikörper-depletierte Fraktion: – Kombiniere das Eluat aus der Melibiose-Sepharosesäule mit Durchlauf aus der finalen Waschung – Stelle das Volumen auf 5 Liter mit Krebs-Henseleit-Puffer ein und Füge EDTA auf 10 mM hinzu; Stelle pH auf 7,0 ein. – Konzentriere zurück auf das Ausgangsvolumen (Amicon Spiralkonzentrator); Aliquotiere (35 ml) und Lagere bei –70°C.
12. Für die anti-GAL-Antikörperfraktion: – Kombiniere die eluierten anti-GAL-Antikörperfraktionen, Verdünne auf 5 Liter mit Krebs-Henseleit-Puffer und Füge EDTA auf 10 mM hinzu – Konzentriere zurück auf 10 ml (Amicon Spiralkonzentrator); aliquotiere (1 ml) und lagere bei –70°C
13. Die anti-GAL-Antikörper-depletierte Fraktion und die gereinigte anti-GAL-Antikörperfraktion werden getestet auf a) anti-GAL-Reaktivität: Verwende als primäre Reagenzien, um Schweinezellen zu färben (PK₁). Weise Färbung wie in Beispiel 2 oben beschrieben, nach. Analysiere gefärbte Proben unter der Verwendung eines FACScan II (Becton Dickinson), gemäß den Anweisungen des Herstellers. b) Proteingehalt: Bestimme unter der Verwendung des kolorimetrischen Verfahrens von Bradford, Anal. Biochem. 72: 248–54 (1976), mit gereinigtem menschlichen IgG als dem Standard. c) Elektrolytkonzentration: Am Tag der Perfusion wird das anti-GAL-Antikörper-depletierte Plasma auch getestet, um die Kalzium-, Magnesium- und Kaliumspiegel zu bestimmen, unter der Verwendung eines Elektrolyt-Autoanalysers (Olympus); die Spiegel eines jeden werden auf normal wie erforderlich eingestellt.

II. ERGEBNISSE
Die Rattenherzen wurden an die Langendorf-Vorrichtung angeschlossen und dann durch Perfusion mit Krebs-Henseleit-Puffer für 10 Minuten stabilisiert und dann für weitere 10 Minuten mit demselben Puffer, enthaltend entweder Melibiose oder Lactose (10 mM). Menschliches Plasma wurde dann in Abschnitten wie oben beschrieben bis zu einer finalen Konzentration von 13% hinzugefügt und der Effekt des hinzugefügten Zuckers auf die Herzfunktion wurde ermittelt. Die gemessenen Parameter waren Herzrate, Amplitude (Stärke) der Kontraktion und Ausstoß (3).
In der Anwesenheit von menschlichen Serum allein (untere Spur) stoppte der Herzschlag im wesentlichen innerhalb von Minuten. Dasselbe Ergebnis wurde erhalten, wenn Lactose hinzu gefügt wurde. In der Anwesenheit von Melibiose (obere Spur) oder anti-GAL-Antikörper depletiertem Plasma war das Herz jedoch in der Lage, einen starken Herzschlag beizubehalten. Wenn der gereinigte anti-GAL-Antikörper zurück in das anti-GAL-Antikörper-depletierte Plasma hinzugefügt wurde, stoppte der Herzschlag wiederum innerhalb von Minuten.
BEISPIEL 6
Charakterisierung des Schweine-α-1,3-GalT-Gens
cDNA's, die für Schweine α-1,3-GalT kodieren, wurden durch Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Technologie erzeugt. Gesamt-RNA von Schweineleber wurde durch Homogenisieren von Leberscheiben in 7 M Guanidiumthiocyanat isoliert, beschrieben durch Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156–159 (1987); Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben. 16 μg der RNA wurden zusammen mit 1 μg oligo-dT-Primer für 5 Minuten bei 65°C Hitze-denaturiert, bevor sie in cDNA unter der Verwendung von Vogel-Myeloblastosevirus (AMV) reverser Transkriptase in einer 100 μl Reaktion, die bei 37°C für 90 Minuten durchgeführt wurde, transkribiert wurde. 3 μl der cDNA-Synthesereaktion wurden in den anschließenden PCR-Amplifikationen verwendet. Allgemeine Verfahren, die zur Erzeugung von cDNA verwendet wurden, werden in Sambrook et al. (1989), supra, zur Verfügung gestellt.
Primer für PCR wurden unter der Verwendung der Phosphoramidit-Technologie auf einem Applied Biosystems DNA-Synthesizer synthetisiert. Die Sequenz der PCR-Primer wurde auf der Identifizierung von konservierten Bereichen innerhalb der publizierten Sequenzen für Maus und Rinder α-1,3-GalT basiert. Joziazze et al., J. Biol. Chem 264: 14290-97 (1989); Joziazze et al., Biol. Chem 267: 5534–5541 (1992). Alle Primer wurden mit EcoR1 Linkern am 5' Ende für eine erleichterte Klovierung synthetisiert. In der folgenden Auflistung der Primar, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, sind Nukleotid-Positionen, die zwischen Rinder und Maus Sequenzen variieren einfach unterstrichen; Nukleotid-Positionen, die zwischen Rinder und menschlichen Sequenzen variieren sind doppelt unterstrichen:

Exxon 2 Primer (vorwärts):
5'-GTGAATTCAGCCCTGCCTCCTCCTTCTGCAG-3'
(Seq. ID NR.: 1)
Bezeichnung: GTE2F--28-mer – ein Unterschied zwischen Rinder und Maus – keine Sequenz für menschliches Exon 2 erhältlich
Exxon 4 Primer (vorwärts):
5'-GTGAATTCAGGAGAAAATAATGAATGTC-3'
(Seq. ID Nr.: 2)
Bezeichnung: GTE4F--28-mer – keine Unterschiede zwischen Rind, Maus und Mensch Exxon 9 Primer (Revers):
5'- GTGAATTCGGGATCTGCCTTGTACCACC-3'
(Seq. ID Nr.: 3)
Bezeichnung : GTE9R--28-mer – 3 Unterschiede zwischen Rind und Maus – 1 Unterschied zwischen Rind und Mensch
3'-UTR Primer (revers).
5'-GTGAATTCGAAATCACTGGGAATTTACA-3'
(Seq. ID Nr.: 4)
Bezeichnung: GT3UR--28-mer – keine Unterschiede zwischen Rind und Maus – keine Unterschiede zwischen Rind und Mensch
Exxon 9 Primer (vorwärts):
5'AGGAATTCAGCATGATGCGCATGAAGAC-3'
(Seq. ID Nr.: 5)
Bezeichnung: GTE9F--28-mer – keine Unterschiede zwischen Rind und Maus – 3 Unterschiede zwischen Rind und Mensch
PolyA Primer (revers): 5'TTGAATTCTTTTTTTTTTTTV*N**-3'
(Seq. ID Nr.: 6) *V = A oder C oder G; **N = A oder C oder G oder T
(Der Primer schließt alle Nukleotid-Varianten für V und N ein)
Bezeichnung: APATR--23-mer

Die verwendeten PCR Bedingungen, um Schweine α-1,3-GalTcDNA Fragmente zu erzeugen waren wie folgt:

1) Für GTE2F + GTF)R und GTE$F + GTE9R: erhitzt auf 94°C (60 Sekunden); dann Verfahren mit 35 Widerholungen (Zyklen) der folgenden 3 Schritte fort: (1) 94°C, 40 Sekunden, (2) 57°C, 50 Sekunden und (3) 72°C, 80 Sekunden.
2) Für GTE9F + GT3UR: erhitzt auf 94°C (120 Sekunden); dann Verfahren mit 35 Zyklen von; (1) 94°C, 40 Sekunden, (2) 48°C, 45 Sekunden und (3) 72°C, 60 Sekunden fort.

Die PCR Fragmente wurden in EcoR1-verdautem pBluescript II KS+ (Stratagene, Cat., #212206) subkloniert und die DNA Sequenz wurde unter der Verwendung der Kettenabbruchmethode bestimmt. Die DNA Sequenz wurde zusammengesetzt und unter der Verwendung von DNASIS-Mac v2.01 (Hitachi) analysiert.
Die Nukleotidsequenz von Schweinen α-1,3-GalT (Seq. ID Nr.: 7) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq. ID Nr.: 10) des Enzyms sind in 4 und 5 gezeigt. Ein einzelner, großer offener Leserahmen erstreckt sich von dem Startmethionin an Nukleotid 91 zu einer Stoppkodon, das bei Nukleotid 1204 lokalisiert ist. Die Sequenz, die das putative Startmethionin umgibt, entspricht der Konsensus-eukaryontischen Startsequenz. Kozak, Cell 44, 283–92 (1986).
Die Schweine-cDNA Sequenz wird mit der entsprechenden Maus- (Seq. ID Nr.: 9) und Rinder- (Seq. ID Nr.: 8) Sequenz in 4 verglichen. Die Positionen von Introns innerhalb des murinen Gens sind auch gezeigt. Joziazze et at., J. Biol. Chem 267: 5534 (1992). Diese Anordnung zeigt, daß Exon 3, das innerhalb der 5' nicht translatierten Regionen des Mausgens lokalisiert ist, weder in den Schweine- oder Rinder-cDNAs gefunden wird. Die gesamten Sequenzidentitäten zwischen den kodierenden Sequenzen sind wie folgt:

a) Schwein verglichen zu Maus: –75,02% (Exon 3 nicht berücksichtigt)
b) Schwein verglichen zu Rind: –85,15%

Die Aminosäuresequenzen der Schweine- (Seq. ID Nr.: 10), Maus- (Seq. ID Nr.: 12) und Rinder-(Seq. ID Nr.: 11) α-1,3-GalT Enzyme sind in 5 dargestellt. Die Positionen von Introns sind auch gezeigt, basierend auf Ihren Positionen innerhalb des Mausgens (Joziazze et al., 1992). Die Anordnung verdeutlicht, daß die Gesamtaminosäurehomologien sind:

a) Schwein verglichen mit Maus: 71,98%
b) Schwein verglichen mit Rind: 81,87%
c) Rind verglichen mit Maus: 73,72%

BEISPIEL 7
Identifikation von potentiellen Stellen, um das α-1,3-GalT Gen zu unterbrechen
Die Wahl der Stelle zur Unterbrechung des α-1,3-GalT Gens der vorliegenden Erfinder wurde durch verschiedene Charakteristika des Gens und seiner Expression beeinflusst. Insbesondere wurden mehrere mRNAs für α-1,3-GalT in der Maus nachgewiesen. Joziazze et al., J. Biol. Chem. 267: 5534 (1992). Diese mRNAs sind Produkte von alternativen Splice-Ereignissen, in denen Exons 5 oder 6 deletiert werden können. Daher sind diese Exons keine geeigneten Unterbrechungsstellen der Maus, da ein Transkript, das für ein funktionelles α-1,3-GalT Enzym kodiert, möglicherweise gebildet werden könnte, wenn Exons 5 oder 6 herausgespliced sind. Darüber hinaus haben die vorliegenden Erfinder die zwei verschiedene Klassen α-1,3-GalT Klone aus dem Schwein isoliert – eine die Exon 5 einschließt und eine, wobei Exon 5 deletiert ist. Es ist auch möglich, daß mRNAs mit oder ohne Exon 6 auch durch alternatives Splicing im Schwein gebildet werden. Daher haben die vorliegenden Erfinder diese Exon für die Ausgangsexperimente nicht als Stellen zur Unterbrechung ausgewählt.
Die Insertion eines unterbrechenden DNA Fragments in Exon 4 (das für die cytoplasmatische NH₂-terminale Domäne und die Membran-Verankerungsdomäne kodiert; siehe 5) würden die Produktion eines Transkripts stören, das für ein aktives α-1,3-GalT kodiert. Daher ist dieses Exon eine geeignete Stelle, um das α-1,3-GalT Gen zu unterbrechen. Ähnlich sind Exon 7 und 8, die für die NH₂-terminale Region der katalytischen Domäne kodieren, geeignete Unterbrechungsstellen. Die Insertion eines unterbrechenden DNA Fragments innerhalb dieser Exons würde die Synthese einer aktiven katalytischen Domäne verhindern.
Eine bevorzugte Stelle zur Unterbrechung des Mausgens ist an einer SalI-Stelle lokalisiert, die innerhalb von Exon 9 des Maus α-1,3-GalT Gens gefunden wird, bei Codons 221+ 222 (siehe 5). Diese Stelle ist 150 Aminosäuren vom COOH-Terminus innerhalb der katalytischen Domäne positioniert. Das Mausgen innerhalb der Konstrukte der vorliegenden Erfinder zur homologen Rekombination wird an dieser SalI-Stelle unterbrochen. Die Aminosäuren, die durch Nukleotide an dieser SalI Stelle kodiert werden, sind in den Schweine- und Rinder-Sequenzen konserviert, obwohl dies die SalI Stelle selber nicht ist. Die Konstruktion einer SalI Stelle an dieser Position in den Schweinegenen (z.B. durch in vitro Mutagenese), stellt ein brauchbares Konstrukt zur Verfügung, um das Gen zu inaktivieren.
BEISPIEL 8
Auswahl eines DNA Fragments, um das α-1,3-GalT zu unterbrechen Die vorliegenden Erfinder haben sowohl das Neomycinresistenz (neo^R)-Gen und das Hygromycinresistenz-Gen (hyg^R) verwendet, um das α-1,3-GalT Gen zu unterbrechen. In einem Set von „knockout" Konstrukten sind die neo^R und hyg^R Gene mit dem Maus Phosphoglyceratkinase-(PGK) Promotor (Adra et al., Gene 60: 67–74 (1987) gekoppelt und sind beide durch Polylinker-Sequenzen umgrenzt, die Restriktionsstellen für EcoRV und ClaI enthalten.
In einem anderen Konstrukt wird die Expression des neo^R Gens durch einen veränderten Polyoma Virus Promotor (PMC1; Thomas und Cappechi, Cell 51: 503–12 (1987)) gesteuert. In diesem Konstrukt haben die vorliegenden Erfinder das Problem des Einschließens eines Antibiotikum-Resistenzgens innerhalb des Genoms von Transplantatorganen berücksichtigt. Dies bedeutet, daß es in einigen Fällen es nicht wünschenswert sein kann, daß Gene, die Resistenz gegen Antibiotika übertragen, in dem zu transplantierten Organ vorhanden sind. Das FLP/FRT Rekombinasesystem der Hefe wurde verwendet, um das neo^R Gen aus der Sequenz zu beseitigen, die das α-1,3-GalT Gen unterbricht.
In einem Konstrukt der vorliegenden Erfindung wird das neo^R Gen an sowohl den 5' und 3' Enden durch FRT DNA Elemente umgrenzt. Zusätzlich wurden Stoppkodons für alle drei Leserahmen 3' zu den neo^R Gen eingefügt, und diese Stoppkodons, zusammen mit einer einzelnen FRT Sequenz, werden innerhalb des α-1,3-GalT Gens verbleiben, nachdem das neo^R Gen durch FLP ausgeschnitten wurde. Wirtszellen, die eine genomische Kopie des neo^R Gens, flankiert von direkten Wiederholungen des FRTs, tragen, können mit FLP Rekombinase auf zwei Wegen versorgt werden:

1) Einführung von teilweise gereinigten FLP Proteinen in Zellen: FLP Protein (01 – 10 μg) wird eingeführt („transfiziert") in ungefähr 10⁷ Zellen unter der Verwendung von Standard Elektroporations-Bedingungen. Die Zellen werden in gelatinisierten Gewebekulturschalen in geeignetem Medium bei einer ausreichenden Verdünnung, um Einzelkolonien zu ergeben, ausplattiert. Ungefähr 200 dieser Kolonien werden dann für die weitere Analyse aufgenommen.
2) Transfektionen mit Plasmiden, die das FLP Gen enthalten: Ein Plasmid, das das FLP Gen unter der Kontrolle eines Promotors enthält, der in der Lage ist, die FLP Expression anzutreiben, z. B. dem menschlichen Interferon-induzierbaren 6–16 Promotor, wird gemäß Standardverfahren konstruiert. Porter et al., EMBO J. 7: 85 (1988).

Ungefähr 10 μg FLP Expressionsplasmid wird in ungefähr 10⁷ Zellen unter der Verwendung von Standard-Elektroporationsbedingungen transfeziert. Mit einem Plasmid, das den menschlichen 6–16 Promotor enthält, wird Interferon bei ungefähr 500 Einheiten/ml hinzugefügt, um die Expression von FLP zu induzieren. Die Zellen werden dann wie in (1) oben behandelt.
Das Verfahren, um das α-1,3-GalT Gen in ES Zellen unter der Verwendung eines FRT-enthaltenden Konstrukts auszuschalten, ist:

a) Elektroporiere das vollständige Konstrukt in ES Zellen
b) Selektiere neo^R Zellen und identifiziere diejenigen ES Zellen, die ein unterbrochenes α-1,3-GalT Gen aufweisen
c) Deletiere das neo^R Gen unter der Verwendung von FLP Rekombinase, wie oben beschrieben; die Zellen werden auf das Herausschneide-Ereignis wie folgt getestet: Zuerst werden Proben von jeder ausgewählten Zelllinie auf das Fehlen des neo^R Gens durch Behandlung mit der Chemikalie G418 getestet. Die Zellen werden in Anwesenheit von ungefähr 200 μg/ml G418 sterben, solange nicht das neo^R Gen immer noch in Genom vorhanden ist. Zelllinien, die G418-sensitiv sind, werden dann weiter getestet, um zu bestätigen, daß ein Herausschneiden von neo^R aufgetreten ist. Dies wird durch Southern-Analyse oder PCR Analyse durchgeführt, beide beschrieben in Sambrook et al. (1989). Für die Southern-Analyse wird genomische DNA aus den Zellen isoliert, mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und die verdaute DNA auf eine Membran transferiert. Die DNA wird mit einer markierten Probe hybridisiert, der Marker wird nachgewiesen (z.B. mit einem Röntgenfilm oder einer Farbentwicklung) und das Bandenmuster zeigt an, ob ein Herausschneide-Ereignis in der Zelllinie aufgetreten ist, oder nicht. Für die PCR Analyse wird genomische DNA aus den Zellen isoliert und einer PCR Reaktion mit geeigneten Oligonukleotid-Primern unterzogen.
d) im Anschluss an die Bestätigung des neo^R Herausschneidens werden die manipulierten ES Zellen oder PGCs dazu verwendet, chimäre Tiere zu erzeugen.

BEISPIEL 9
Präparation von DNA Konstrukten, um das α-1,3-GalT Gen in Mäusen zu unterbrechen Eine Gen-Abzielung (homologe Rekombination) ist effizienter, wenn die für das Abzielen verwendeten klonierten cDNA Fragmente aus der Zelllinie isoliert werden, die für das Gen-Knockout verwendet wird. (d.h. die DNA ist „isogenisch") Demzufolge wurde DNA aus den E14 ES Zellen isoliert (Hooper et al., Nature 326: 292–95 (1987)) und dazu verwendet, um eine Maus-genomische Bibliothek zu konstruieren. Die DNA wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3A verdaut, und Fragmente mit einer Größe von 12 kb – 20 kb wurden durch Glyceringradienten Fraktionierung isoliert. Die Größen-fraktionierte DNA wurde in die Bam H1 Stelle von λEMBL3 (Sambrook et al. 1989, supra) ligiert und in vitro verpackt, um Lambda-Phagenpartikel zu bilden. Die Lambda Bibliothek wurde durch Infektion des E.coli Stamms PMC103 (Doherty et al., Gene 124: 29–35 (1993)) bei einer Dichte von 4 × 10⁴ Faden pro Platte plattiert. Ein Rinder cDNA Klon, ungefähr 900 bp lang und einen Teil des α-1,3-GalT Gens entsprechend den Exons 7 – 9 enthaltend, wurde verwendet, um eine gesamte Zahl von 5,6 × 10⁵ unabhängige rekombinante Phagen zu sondieren. Vier überlappende Klone, die α-1,3-GalT Gensequenzen enthielten, wurden isoliert und gereinigt. Die SalI Restriktionsstellen innerhalb dieser Klone wurden kartiert (6) und die 4,0 kp, 5,5 kb, 11 kb und 12 kb SalI-Fragmente aus zweien der Klone (Lambda 3 und Lambda 5) wurden in pBluescript KS+ (Stratagene) oder pUBS (pUC 19, welches den pBluescript KS+ Polylinker trägt) subkloniert, um eine weitere detaillierte Kartierung von Restriktionsstellen zu erleichtern.
Diese vier Subklone (bezeichnet als pαGT-S4.0, pαGT-S5.5, pαGT-S11 und pαGT-S13) wurden mit den Restriktionsenzymen Bam H1, EcoRI, HindIII, YbaI, XhoI, KpnI, SacI, SacII, EcoRV, PstI, SamI, NotI und BgII auf Restriktionsstellen kartiert. pαGT-S4.0 und pαGT-S5.5 wurde auch auf PvuI, PvuII, NdeI und SphI Restriktionsstellen hin überprüft. Detaillierte Restriktionskarten der Subklone wurden aus diesen Daten ermittelt (7 bis 12): Auf der Basis dieser Karten wurde eine Knockout-Strategie erstellt. Im wesentlichen ist die Strategie, ein Resistenzgen (entweder neo^R oder hyg^R) in die SalI Stelle einzufügen, die innerhalb von Exon 9 positioniert ist. Das Knockout Konstrukt trägt die 4.0 und 5.5 kb SalI Fragmente aus pαGT-S4.0 und pαGT-S5.5, die die Exon 9 SalI Stelle flankieren (13). Ein Screening auf homologer Rekombinationsereignisse kann dann unter der Verwendung eines DNA Fragments durchgeführt werden, das die genomische Region repräsentiert, jedoch außerhalb der DNA liegt, die in dem Knockout Konstrukt enthalten ist, d. h. außerhalb der 9,5 kb, die durch pαGT-S4.0 und pαGT-S5.5 abgedeckt werden. Ein 0,7 kb EcoR1/XmnI Fragment aus pαGT-S11 wird dazu verwendet, um Southern Block von BglII verdauter ES-Zell DNA auf homologe Rekombinationsereignisse hin zu screenen. Eine 8,3 kb Bande sollte auf diesem Southerns auftreten, wenn das nicht unterbrochene α-1,3-GalT Gen mit diesen EcoR1/XmnI Fragment sondiert wird (14). Die Insertion des neo^R Gens nach einem homologen Rekombinationsereignis wird eine 6,4 kb Bande entstehen lassen, aufgrund der An wesenheit einer BglII Stelle, die die Exon 9 SalI Stelle innerhalb des Knockout Konstrukts dicht flankiert. Daher ist die Anwesenheit 6,4 kb Bande diagnostisch für ein homologes Rekombinationsereignis.
Um diese Strategie durchzuführen, stellten die vorliegenden Erfinder eine Reihe von Knockout Konstrukten her. Die Erzeugung eines solchen Konstrukts ist genau in 15 dargestellt. Der Vektor pαGT-S5.5, der das 5,5 kb Fragment unmittelbar 3' zu der Exon 9 SalI-Stelle trägt, wurde als der Ausgangsvektor ausgewählt. pαGT-S5.5 wurde mit EcoRV und ClaI vedaut, was einen Vektor mit einem stumpfen Ende und ein ClaI kompatibles Ende erzeugte. Ein 1,3 kb Fragment, das das PMC1 Promotor-angetriebene neo^R Gen, flankiert durch FRT Stellen, trägt, wurde aus Plasmid pNeo2FRT (durch die vorliegenden Erfinder früher konstruiert) durch Verdau mit Bam H1, Auffüllen der Restriktionsstelle und dann Verdau mit ClaI ausgeschnitten, um ein Fragment mit einem stumpfen Ende und einem ClaI kompatiblen Ende zu erzeugen. Die Nukleotidsequenz dieses 1,3 kb Fragments wird in 16 zur Verfügung gestellt. (Seq. ID Nr.: 13). Dieses Fragment wurde dann in ClaI/EcoRV verdauten pαGT-S5.5 legiert, das Ligationsmix transformiert und Kolonien auf Rekombinante gescreent. Eine Kolonie wurde erhalten, die das neo^R Fragment insertiert in EcoRV/ClaI von pαGT-S5.5 enthielt, basierend auf dem Restriktionsmuster nach Verdau mit den diagnostischen Restriktionsenzymen ClaI, EcoRV, XbaI und EcoRI. Dieses Konstrukt wurde als pNeoαGT6.8 bezeichnet.
pNeoαGT6.8 wurde mit SmaI verdaut, was einen Vektor mit stumpfen Enden erzeugte. Das 4,0 kb SalI Fragment wurde aus pαGT-S4.0 ausgeschnitten und die Enden aufgefüllt. Dieses Fragment wurde dann in den SmaI verdauten pαGT-S5.5 ligiert, das Legationsgemisch transformiert und Kolonien auf Rekombinante hin gescreent. Vier Kolonien wurden erhalten, die das 4,0 kb SalI Fragment insertiert in die SmaI Stellen von pNeoαGT6.8 enthielten, wobei der 5' Teil von Exon 9 nahe dem 3' Teil des Exons in dem nahe gelegenen SalI 5,5 kb Fragment liegt. Die Identität und Orientierung des Inserts wurde durch das Restriktionsmuster nach Verdau mit dem diagnostischen Restriktionsenzymen XbaI, EcoRI, HindIII, BamHI; EcoRV und anderen bestätigt. Dieses Konstrukt wurde als pNeoαGT10.8 bezeichnet.
pNeoαGT10.8 wurde mit ClaI verdaut, was einen Vektor mit ClaI-kompatiblen Enden erzeugte. Zwei komplementäre Oligomere wurden synthetisiert, die, wenn angelagert, einen Linker erzeugten, der Translations-Stoppkodons in allen drei Leserahmen und eine BglII Stelle enthielt. Der Linker weist ClaI-kompatible Enden auf. Der Linker wurde in das ClaI verdaute pNeoαGT10.8 ligiert, das Legationsgemisch transformiert und Kolonien auf Rekombinante hin gescreent. Viele Kolonien wurden erhalten, die den Linker insertiert in die ClaI Stellen innerhalb von pNeoαGT10.8 enthielten, basierend auf dem Restriktionsmuster nach Verdau mit den diagnostischen Restriktionsenzymen BglII, ClaI und BglII/NotI. Dieses Konstrukt wurde sequenziert, um die Identität, Kopienzahl und Orientierung des Inserts zu bestätigen. Dieses Konstrukt wird pNeoαGT10.8B genannt (17).
BEISPIEL 10
ES Zellen – Allgemeine Materialien und Verfahren
Arbeitsbedingungen
Verfahren zur Isolierung und der Kultivierung von allen Zelllinien (embryonale Stammzellen, primordiale Keimzellen und fötale Fibroblasten-Zelllinien) erfordern aseptische Bedingungen, um das Wachstum von kontaminierenden Organismen zu verhindern:

1. Alle Laborbankoberflächen und Ausrüstungsgegenstände werden mit 70% Ethanol vor der Verwendung gewischt.
2. Alle chirurgischen Instrumente werden vor der Verwendung autoklaviert.
3. Wasser für Medienpräparation und der Reinigung von Glasmaterialien ist von hoher Qualität (z.B. Milli-Q Wasser, hergestellt durch Passage durch ein Milli-Q ultrareines Wassersystem (Millipore)).
4. Die Glasmaterialien werden entweder mit trockener Hitze sterilisiert oder autoklaviert, gefolgt von extensiver Reinigung in Milli-Q Wasser vor der Verwendung.
5. Alle Gewebekulturarbeit wird unter laminaren Flußbedingungen durchgeführt (Hepa, filtrierte horizontale Laminarfluß-Arbeitsstation).
6. Alle Medien werden Filter-sterilisiert (22 μm Einwegfilter), vor der Verwendung.
7. Antibiotika werden verwendet, um das Risiko von bakterieller Kontamination zu minimieren (Penicillin, Streptomycin und Gentamicin für Bakterien; Nystatin für Pilze)

10.0g	DMEM Pulver – Gibco
(die niedrig-Glukose oder hoch-Glukose Formulierung, mit oder ohne Pyruvat kann verwendet werden; L-Glutamin ist enthalten)
1,0 Liter	Mitti-Q-Wasser

3,7 g	NaHCO₃
Rühre langsam bis gelöst
Stelle pH ~ 7,2
Filter – sterilisiere (nach der Filtersterilisation steigt der pH auf 7,4)
Lagere bei 4°C.

83.0 ml	DMEM
15,0 ml	15% fötales Rinderserum (FBS); die Charge wird vor der Verwendung gettestet
1,0 ml	Pen/Strep 1:100
1,0 ml	Glutamin 1:100 (falls benötigt) (siehe Anmerkung unten)
Filter – sterilisiere und lagere bei 4°C

Anmerkung:

Ergänze das komplette Medium (DMEM Medium) (STO oder ES) mit Glutamin

* Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn das Medium älter als eine Woche- 10 Tage ist, da das Glutamin nach dieser Zeit zersetzt ist. ES ZELLMEDIUM MIT ODER OHNE LIF

bis zu 100,0 ml DMEM 15,0 ml	15% FBS (Batch vor Gebrauch getestet; siehe unten)
1,0 ml (aus 0,01M Stammlösung)	β-Mercaptoethanol (0,1 mM Endkonzentration)
1,0 ml	PenStrep 1:100
0–1,0 ml	Glutamin 1:100 (falls erforderlich)
1,0 ml	Nystatin 1:100
0 – 2,5 ml	Rekombinantes LIF aus der Maus (aus 4 × 10⁴ U/ml; 1.000 U/ml Stammlösung); aktivitätgetestet unter Verwendung eines LIF-Tests (siehe unten)
0,4 ml	Gentamicin
1,0 ml	Nukleotide
1,0 ml	nicht-essentielle Aminosäuren

PENICILLIN/STREPTOMYCIN-ANTIBIOTIKUM-LÖSUNG (1:100)

Commonwealth Serum Laboratories, Australien, Kat.-Nr. 05081901
Penicillin G – 5.000 U/ml
Streptomycin-Sulfat – 5.000 μg/ml.

MITOMYCIN-C-LÖSUNG

2,0 mg Mitomycin-C (Sigma Chemical Co. ("Sigma"); Kat.-Nr. M0503)
200,0 ml STO-Zellmedium
Man sterilisiere über einen Filter, teile auf in 20 × 10 ml-Aliquots und lagere bei –20°C.

PHOSPHAT-GEPUFFERTE KOCHSALZLÖSUNG (PBS)
Für 100 ml Milli-Q-Wasser:

Man stelle auf pH 7,4 ein und sterilisiere über einen Filter
(Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-freies PBS wird bezogen von ICN Cell Biology and Tissue Culture, Kat.-Nr. 18-604-54)

TRYPSIN/VERSENE (TV)-ARBEITSLÖSUNG (TV × 1)

In PBS (Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-frei):
0,25% (Gew./Vol.) Trypsin (lyophilisiert)
0,04% (Gew./Vol.) EDTA oder EGTA
oder: Zu einem Liter Milli-Q-Wasser füge man das folgende hinzu:

Trypsin-Pulver (Schwein, Difco) 2,5 g

EDTA oder EGTA 0,4 g

NaCl 7,0 g

Na₂HPO₄ 12H₂O 0,3 g

KH₂PO₄ 0,24 g

KCl 0,37 g

D-Glukose 1,0 g

Tris 3,0 g

Phenolrot 1,0 ml

Man stelle einen pH-Wert von 7,6 ein, sterilisiere über einen Filter, aliquotiere und lagere gefroren.
EGTA: Ethylenglykol-bis (β-aminoetyhläther) N,N,N',N'-tetraessigsäure [Ethylen-bis-(oxyethylennitrilo)]-tetraessigsäure.
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
Man verwende entweder EDTA oder EGTA. EGTA wird bevorzugt, da es auf die ES/PGC-Zellen weniger schädigend wirkt.

GELATINE-ARBEITSLÖSUNG

0,1% Gelatine in Milli-Q-Wasser
Man löse Gelatine durch Erhitzen auf 60°C. Man sterilisiere, während die Gelatine noch warm ist.

Zum Gelatinisieren von Gewebekulturplatten:

1. Man bedecke eine Schale mit Lösung, lasse sie 30 Minuten stehen.
2. Man aspiriere die Gelatine und lasse die Schale lufttrocknen.

Milli-Q-Wasser	100 ml
Adenosin (Sigma)	80 mg

Guanosin (Sigma)	85 mg
Cytidin (Sigma)	73 mg
Uridin (Sigma)	73 mg
Thymidin (Sigma)	24 mg

1. Man löse durch Erwärmen auf 37°C.
2. Man sterilisiere über einen Filter und aliquotiere, während die Lösung warm ist.
3. Man lagere bei 4°C oder –20°C.
4. Man taue Nukleotide auf zur Verwendung in ES-Zellmedien (a) Nukleotide fallen nach dem Auftauen aus der Lösung aus; (b) Man erwärme auf 37°C, um sie vor der Verwendung wieder in Lösung zu bringen.

NICHT-ESSENTIELLE AMINOSÄUREN (1:100)

Commonwealth Serum Laboratories; Kat.-Nr. 09751301
100x Konzentrat für minimal-essentielles Medium (Eagle): (1,0 ml wird 100 ml ES-Zellmedium zugesetzt)

mg/10 ml Milli-Q-H₂O

Glycin 7,5

L-Alanin 8,9

L-Asparagin × H₂O 15,0

L-Asparaginsäure 13,3

L-Glutaminsäure 14,7

L-Prolin 11,5

L-Serin 10,5

KULTURMEDIUM NACH WHITTEN

KCl 0,0356

KH₂PO₄ 0,0162

MgSO₄ × 7H₂O 0,0294

NaCl 0,4

NaHCO₃ 0,2106

Glukose 0,1

Na-Pyruvat 0,0036

Ca-Laktat 5H₂O 0,0527

Na-Laktat 0,2416 ml

Milli-Q-H₂O 100 ml

Die Lösung wird auf eine Endmilliosmolarität von 250 – 280 durch Zugabe von H₂O oder NaCl eingestellt.

Man sterilisiere über einen Filter und lagere zwei Wochen bei 4°C.

Arbeitslösung:

10 ml Whitten-Medium
1,5 g BSA, Fraktion V (Miles Pentex, Diagnostic Division, Kankakee, I1., USA; Code-Nr. 81-001-4)
Man sterilisiere über einen Filter und äquilibriere in 5% O₂ : 5% CO₂ : 90% N₂ bei 39,5°C, 95% Luftfeuchtigkeit.

FBS-BATCH-VERSUCHE
Batches von FBS variieren in der Fähigkeit, das Wachstum von ES-Zellen zu fördern, und in der Fähigkeit, den undifferenzierten Zustand solcher Zellen zu erhalten. Das folgende Verfahren wird verwendet, um geeignete Batches von FBS zu identifizieren.
Man verwende ES-Zellen aus 2 – 20 Passagen:

Tag 1 Man teile ES-Kolonien und plattiere in Schalen ohne Fütterungszellen, aber mit LIF aus. Man inkubiere 3 Tage lang.
Tag 4 Man trypsinisiere, um Kolonien und Zellen abzulösen. Man zähle Zellen und verteile sie in gelatinisierten, 6cm-Schalen, die ES-Zellmedium und LIF enthalten (keine Zugabe von Serum) wie folgt:

Jede Behandlung wurde als Doppelbestimmung durchgeführt.

Man inkubiere Schalen mit geringer Zelldichte 5 Tage lang.
Man inkubiere Schalen mit hoher Zelldichte 3 Tage lang.
Tag 7: Man fixiere Zellen mit hoher Dichte und färbe mit Hämatoxylin.
Tag 9: Man fixiere Zellen mit geringer Dichte und färbe auf alkalische Phosphatase.

LIF-TEST
Dieses Verfahren wird verwendet, um die Wirksamkeit des Leukaemic Inhibitory Factor (LIF) zu testen.

Tag 1: Man teile eine 10 cm-Schale mit konfluenten STO-Zellen auf fünf Schalen auf. Man inkubiere 2 – 3 Tage in STO-Medium.
Tag 3 – 4: Wenn die Zellen konfluent sind, ersetze man das Medium mit DMEM + 10% FBS. Man inkubiere 3 Tage lang.
Tag 6 – 7: Man gewinne konditioniertes Medium (conditioned medium, CM) und lagere bei 4°C.
* Man präpariere ES-Zellkulturen mit geringer Dichte, wie oben beschrieben.

Jede Behandlung wurden als Dreifachbestimmung durchgeführt.

Man fixiere und färbe auf alkalische Phosphatase.

Herstellung von Fibroblasten-Fütterungszellagen
Embryonische pluripotente Zellen werden in vitro auf einer Lage fötaler Fibroblastenzellen kultiviert. Die Fibroblastenzellen stellen einen weiten Bereich von Faktoren zur Verfügung, die zum Wachstum von pluripotenten embryonischen Zellen notwendig sind (z. B. Wachstumsfaktoren, Zytokine, Faktoren, die zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz von ES-Zellen wesentlich sind).
ISOLIERUNG FÖTALER SCHWEINE-FIBROBLASTEN:

1. Man entferne sich entwickelnde Schweineföten (vorzugsweise am Tag 16 – 30 der Entwicklung) aus einem Uterus durch aseptische Präparation.
2. Man entferne eine Hautschicht von dem Fötus.
3. Man präpariere Weichteilgewebe unter Vermeidung sich entwickelnder Viscera. Das weiße (Fibroblasten-enthaltende) Gewebe wird direkt unter der Hautschicht gefunden.
4. Man wasche präpariertes Gewebe in PBS (Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-frei). Man zentrifugiere 5 Minuten bei 1.000 Upm.
5. Man entferne den Überstand.
6. Man inkubiere das Gewebe mit Trypsin/Versene-Arbeitslösung für 20 Minuten.
7. Man vereinzelne Zellen durch heftiges Pipettieren. Man zentrifugiere bei 1.000 Upm für 5 Minuten.
8. Man entferne den Überstand.
9. Man resuspendiere die Zellen in STO-Zellmedium. Man lasse große Zellklumpen sich absetzen.
10. Man plattiere Zellen in dem Überstand (d. h. große Zellklumpen sind nicht enthalten) auf gelatinisierten Gewebekulturplatten aus. Man inkubiere die Zellen in einer Atmosphäre von 5% CO₂, 95% Luft (37,5°C, 95% Luftfeuchtigkeit), bis eine konfluente Lage aus Fibroblastenzellen erscheint (~4 – 5 Tage).
11. Das Passagieren von Zellen kann fortgesetzt werden, um die Zellzahlen zu steigern oder die Zellen können eingefroren oder zur weiteren Verwendung inaktiviert werden.

KULTUR AUS FÖTALEN FIBROBLASTEN-FÜTTERUNGSLAGEN AUS GEFRORENEN STAMMKULTUREN:
Mehrere verschiedene Arten von Mausfütterungszellen (STO-Zellen) und fötalen Fibroblasten aus Schwein und Rind können verwendet werden, um Fütterungslagen zu bilden. Diese schließen folgende ein:

(1) Bradley/Baylor-Mäuse-STO-Fütterungszellen, die modifiziert worden sind, um menschliches LIF zu exprimieren (ein Geschenk von Allan Bradley, Institute for Molecular Genetics, Baylor College of Medicine, Texas Medical Center, Houston, Texas, USA).
(2) Robertson/Columbia-Mäuse-STO-Fütterungszellen, die modifiziert worden sind, um Mäuse-LIF zu exprimieren (ein Geschenk von Elizabeth Robertson, Columbia University, New York, USA).
(3) Mehrere fötale Schweine-Fibroblastenlinien.
(4) Mehrere fötale Rinder-Fibroblastenlinien.

Das Verfahren zum Herstellen von Fütterungsschichten ist wie folgt:

1. Man spüle eine 10 cm-Gewebekulturschale (tissue cure) mit Gelatine-/Milli-Q-Wasser-Lösung für 30 Minuten. Man aspiriere die Gelatinelösung und lasse die Schale lufttrocknen.
3. Man gebe 10 ml STO-Zellmedium in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen.
4. Man entneme Fütterungszellen, die in Einfriermedium eingefroren sind, aus einem Behälter mit flüssigem N₂.
5. Man taue Zellen auf durch Erwärmen des Fläschchens in den Händen oder in einem 37°C warmen Wasserbad.
6. Man transferiere STO-Zellen in Medium in einem Zentrifugenröhrchen.
7. Man zentrifugiere bei 1.000 Upm für 5 Minuten.
8. Man resuspendiere die Zellen in 10 ml Medium und transferiere sie in eine Gelatinebehandelte Gewebekulturschale.
9. Man inkubiere 3 Tage bei 37°C.

AUFTEILEN DER FÜTTERUNGSLAGE STO-ZELLEN/FÖTALEN FIBROBLASTEN:
Dieses Verfahren wird verwendet, um die Anzahl an Zellen aus einer einzelnen konfluenten Platte/Schale zu expandieren. Die Zellen werden von der konfluenten Platte abgelöst und auf frische Platten in sub-konfluenten Dichten transferiert.

1. Man gelatinisiere fünf 10 cm-Gewebekulturschalen.
2. Man untersuche die inkubierten STO-Zellen unter dem Mikroskop und überprüfe sie auf Konfluenz.
3. Falls die STO-Fütterungsschicht (Monolayer) konfluent ist (die Zellen bedecken den Schalenboden oder bedecken ihn fast), wasche man vorsichtig mit PBS (Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-frei) für eine Minute.
4. Man aspiriere PBS und setze 1 ml Trypsin/Versene-Arbeitslösung für 1 Minute zu (oder bis die Zellen beginnen, sich abzulösen). Man überprüfe unter dem Mikroskop.
5. Man löse die Zellen durch heftiges Pipettieren ab, setze 1,0 ml STO-Zellmedium zu (d. h. ein Verhältnis von 1:1 STO-Zellmedium : Trypsin/Versene-Arbeitslösung), um Trypsin zu neutralisieren, und transferiere die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen, das 10 – 15 ml STO-Zellmedium enthält. Man wasche die Zellen, die auf der Schale verblieben sind, mit etwas STO-Zellmedium aus dem Röhrchen. Man zentrifugiere 5 Minuten bei 1.000 Upm, aspiriere den Überstand, resuspendiere das Pellet in 1 ml STO-Zellmedium. Man resuspendiere die Zellen, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Man fülle auf 50 ml mit STO-Zellmedium auf.
6. Man verteile 10 ml in jedes von der Gewebekulturplatten und inkubiere bis zur Konfluenz (~3 Tage).

INAKTIVIERUNG VON FÜTTERUNGSSCHICHTEN:
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung verwenden zwei alternative Verfahren zum Inaktivieren von Fütterungsschichten, welche die Teilung der Zellen stoppt:
(1) Mitomycin-Behandlung:

1. Man überprüfe die Schalen auf Konfluenz der STO-Zellen/fötalen Fibroblasten.
2. Man taue eine Mitomycin-C-Lösung auf und verwende sie unverdünnt.
3. Man aspiriere STO-Zellmedium von der Fütterungszellplatte.
4. Man gebe ein 10 ml-Aliquot von Mitomycin-C zu der Platte und inkubiere bei 37°C für 1 – 3 Stunden.
5. Man aspiriere Mitomycin-C, wasche die Zellen in 1x PBS (ohne Ca⁺⁺ oder Mg⁺⁺) für eine Minute.
6. Man aspiriere PBS und gebe 1 ml Trypsin-Lösung für eine Minute dazu.
7. Man löse die Zellen durch heftiges Pipettieren ab und transferiere sie in STO-Zellmedium in einem Zentrifugenröhrchen.
8. Man zentrifugiere 5 Minuten bei 1.000 Upm.
9. Man resuspendiere das Zellpellet in 1 ml ES-Zellmedium.
10. Man plattiere als Vorbereitung zur Zugabe von ES-Zellen aus.

(2) Gamma-Bestrahlung:

1. Man überprüfe die Schalen auf Konfluenz der STO-Zellen/fötalen Fibroblasten.
2. Man trypsinisiere die Zellen zu einer Einzelzellsuspension.
3. Man bestrahle die Zellen (3.000 rad) in STO-Zellmedium.
4. Man zentrifugiere 5 Minuten bei 1.000 Upm.
5. Man resuspendiere das Pellet in 1 ml ES-Zellmedium.
6. Man transferiere die Zellen auf gelatinisierte Gewebekulturplatten mit ES-Zellmedium und stelle sie in einen Inkubator bei 37°C, bis die Zellen an die Schale adhärieren. BEMERKUNG: Wenn die Zellen nicht konfluent sind, zähle man unter Verwendung eines Hämocytometers und säe die Zellen in einer Dichte von 5×10⁴ in 1 ml Medium pro Vertiefung einer 4-well-Platte von Nunc aus. Eine 10 cm-Schale inaktivierter Zellen kann wie folgt aufgeteilt werden: Zehn 4-well-Platten (Nunc tissue culture plates), oder acht 3,5 cm-Gewebekulturplatten oder drei 6 cm-Gewebekulturplatten oder zwei 20 cm-Gewebekulturplatten.

Nachweis der Totipotenz:
A. Blastozysteninjektion
Die Fähigkeit embryonaler Zellinien, Keimbahn-chimäre Tiere zu bilden, ist ein schlüssiger Test auf deren Totipotenz. Das kann erreicht werden durch Blastozysteninjektionsexperimente unter Verwendung von Techniken für verschiedene Säugetierspezies, im wesentlichen dieselben wie jene, die für die Maus etabliert wurden. Siehe Beispiel 14 unten. Siehe auch z. B. Bradley, Production and Analysis of Chimeric Mice, in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (E.J. Robertson, Hrsg.), IRL Press, Oxford, S. 113 – 152 (1987). Bei Manipulationen am Schwein allerdings muß die Haltepipette etwas länger sein, da Schweineembryos größer sind als Mäuseembryos.
B. Co-Kultur von ES-Zellen/PGCs und Morula-Embryos
Embryos im Morula-Stadium der Entwicklung werden chirurgisch aus superovulierenden Tieren gewonnen. Bei Schweineembryos beispielsweise wird die Zona pellucida dann aufgebrochen unter Verwendung einer sauren Tyrodes-Lösung, und die ES-Zellen/PGCs werden in Gegenwart der Morulae mit zerstörter Zona pellucida kultiviert. ES/PGC-Zellen adhärieren an die exponierten Morula-Zellen und nach einer Übernachtkultur in Whitten-Medium werden die Embryos auf synchronisierte Empfänger übertragen. Vorzugsweise ist die Morula mit zerstörter Zona pellucida vollständig frei von Zona pellucida. Allerdings muß dies nicht der Fall sein, solange die ES-Zellen/PGCs direkten Zugang zu mindestens einigen der Morula-Zellen erlangen können.
C. Morula-Injektion
ES-Zellen und PGCs können vor der Bildung der Blastozystenhöhle in einen Morula-Embryo injiziert werden. Die Technik ist ähnlich wie die der Blastozysteninjektion. ES-Zellen oder PGCs werden in eine Injektionspipette gezogen, die unterhalb der Zona pellucida eingeführt ist. Dann werden die Zellen ausgestoßen, damit sie mit den Zellen des Morula-Embryos in Kontakt sind. Die injizierte Morula wird dann über Nacht in Whitten-Medium (Schwein) oder einem anderen geeigneten Medium kultiviert, um eine Blastozystenbildung zu ermöglichen.
D. Kerntransfer und Embryo-Klonierung
ES-Zellen und PGCs können zu entkernten Zygoten fusioniert werden, die durch Reifung in vitro, Kultur in vitro, Fertilisation in vitro abgeleitet oder chirurgisch gewonnen worden sind. Nach einer erfolgreichen Fusion können die Embryos auf synchronisierte Empfänger übertragen werden. In vitro- oder in vivo-gewonnene Schweineoozyten werden beispielsweise in Whitten-Medium, supplementiert mit 1,5% BSA, Fraktion V, und 7 μg/ml Cytochalasin B (Sigma) manipuliert. Eine abgeschrägte Mikropipette wird verwendet, um die Metaphaseplatte aus der Oozyte zu entfernen. Eine einzelne ES-Zelle oder PGC (nach Trypsin-Behandlung, um eine Einzelzellsuspension herzustellen) wird durch die Zona unter Verwendung einer abgeschrägten Mikropipette eingeführt, derart daß die Zelle mit der Oozytenplasmamembran in Kontakt kommt. Eine Fusion wird in einem Feld von 28 V/cm für 5 Sekunden, gefolgt durch einen Puls von 80 V/cm Wechselspannung von 100 μsek Dauer erreicht. Nachdem eine Fusion beobachtet wurde, werden Embryos bei 37°C in 5% CO₂, 5% O₂, 90% N₂ in Mikrotropfen von Whitten-Medium, supplementiert mit 1,5% BSA, inkubiert bis zum Transfer auf einen synchronisierten Empfänger.
BEISPIEL 11
Mäuse-ES-Zellkultur
ES-Zellen sind in der Lage, sich spontan zu vielen verschiedenen Zelltypen zu differenzieren, und Kulturbedingungen, die diese Differenzierung verhüten, sind in Bezug auf eine kontinuierliche Passage dieser Zellen in einem undifferenzierten Zustand entscheidend, da sie in der Lage sind, zu chimären Mäusen beizutragen.
I. KULTURBEDINGUNGEN
ES-Zellen werden in Zellkulturschalen aus Polystyrol, behandelt mit 0,1 % Gelatine (hergestellt in PBS oder Milli-Q-Wasser) 10 Minuten wachsen gelassen. Eine Fütterungslage von mitotisch inaktiven Fibroblasten stellt eine Quelle von Zytokinen zur Verfügung. Die Fibroblasten sind entweder primäre Embryofibroblasten aus der Maus (primary mouse embryo fibroblasts (PMEFs)) oder STO-Fibroblasten, eine immortale Linie.
Das verwendete Medium ist DMEM, supplementiert mit Glukose, Aminosäuren und Nukleosiden. Robertson, Embryo-Derived Stem Cell Lines. In: Teratocarcinomas and Embryonic Stern Cells: A Practical Approach (E.J. Robertson, Hrsg.), IRL Press, Oxford (1987). Diesem Medium wird LIF (Endkonzentration 10³U/ml, Esgro, AMRAD) zugesetzt. FBS wird zugesetzt, so daß eine Endkonzentration von 15% erreicht wird. Der Batch von FBS wird ausgewählt auf der Grundlage seiner Fähigkeit, ein ES-Zellwachstum mit geringem Ausmaß an Differenzierung zu erreichen (d. h. nur wenige individuelle Zellen machen eine Differenzierung durch). Die ES-Zellen werden in einer Atmosphäre von 5 – 10% CO₂ bei 37°C wachsen gelassen.
II. ROUTINE PASSAGE
ES-Zellen müssen häufig passagiert werden, um zu verhindern, daß die Kolonien zu groß werden und sich differenzieren. Dies wird erreicht, indem die Zellen in einem Verhältnis von 1:10 bis 1:40 alle zwei bis vier Tage aufgeteilt werden.
BEISPIEL 12
Genetische Manipulation von Zellen
Die allgemeinen Verfahren, die in diesem Beispiel ausgeführt werden, stellen Richtlinien zur Verfügung, die leicht an individuelle experimentelle Situationen angepaßt werden können, wie beispielsweise differenzierte Zelllinien oder eine Ausstattung, die durch verschiedene Hersteller angeboten wird, eingesetzt werden können. Dieses Beispiel stellt auch spezielle verwendete Verfahren und erhaltene Ergebnisse beim Erzeugen eines Satzes von Mäuse-ES-Zellinien zur Verfügung, bei denen das α-1,3-Galaktosyltransferase-Gen durch homologe Rekombination gestört ist. Die allgemeinen Verfahren, die in diesem Beispiel verfügbar gemacht werden, werden an Mäuse-ES-Zellen angepaßt. Allerdings sind diese Verfahren auf Schweine-ES-Zellen im wesentlichen ähnlich anwendbar.
F. EINFÜHREN VON DNA IN ES-ZELLEN DURCH ELEKTROPORATION

A. Man beschichte eine erforderliche Anzahl von Platten mit 0,1 % Gelatine (in PBS oder Milli-Q-Wasser). (Gewöhnlich 2 × 6-well-Platten und eine 8-well-Platte).
B. Man taue 10⁷ embryonische Fibroblasten in DMEES auf (entspricht ES-Zellmedium); man inaktiviere durch Bestrahlung mit 3.000 Rad.
C. Man zähle die bestrahlten Zellen, zentrifugiere ab und resuspendiere in DMEES, so daß die Endkonzentration 10⁶ Zellen/ml beträgt.
D. Man aspiriere die Gelatine von den Platten und plattiere die Zellen bei 7 × 10⁵ Zellen/Vertiefung (6-well-Platte) in 2,5 ml Medium, 7 × 10⁴ Zellen/Vertiefung (24-well-Platte) in 1 ml Medium aus. Man inkubiere bei 37°C, 5 – 10% CO₂ für 3 – 4 Stunden.
E. Man wasche die ES-Zellen in 5 ml (250 ml-Kolben) PBS-EGTA und lasse sie bei Raumtemperatur 3 Minuten lang absitzen.
F. Man entferne PBS und gebe 5 ml Trypsin (CSL) hinzu und lasse bei Raumtemperatur 2 – 4 Minuten stehen. Man wasche die Zellen ab, gebe 10 ml DMEES dazu und zähle. Ungefähr 5 × 10⁶ bis 2 × 10⁷ ES-Zellen werden für die Experimente benötigt.
G. Man zentrifugiere die Zellen und resuspendiere in 10 ml PBS. Man zentrifugiere wieder und resuspendiere 540 μl PBS. Man verdünne 50 μl in 10 ml DMEES und kultiviere, um die Plattiereffizienz zu bestimmen.
H. Man gebe 5 – 10 μg DNA zu den Zellen in 10 μl PBS (500 μl Gesamtvolumen) hinzu und übertrage sie in eine sterile Elektroporationsküvette (z. B. Biorad).
I. Man behandele durch Elektroporation bei 0,22 kV, 500 μF (die Zeitkonstante sollte ~8,4 betragen). Dies wird erreicht unter Verwendung einer Biorad Gene Pulser-Einheit (Biorad Kat.-Nr. 1652078) mit Kapazitätserweiterer (Biorad Kat.-Nr. 1652087) oder einer ähnlichen Vorrichtung.
J. Man resuspendiere in 10 ml DMEES unter konstantem Pipettieren, um Klumpen von DNA aus lysierten Zellen aufzubrechen.
K. Man zentrifugiere die Zellen und resuspendiere in 5 ml DMEES.
L. Man nehme 50 μl, gebe 50 μl Trypanblau-Lösung hinzu und zähle zur Beurteilung der Lebensfähigkeit.
M. Man kultiviere durch Ausplattieren nach Verdünnungsreihe, um die Plattiereffizienz zu bestimmen.

II. SELEKTIONSBEDINGUNGEN
ES-Zellen, die kein Neomycinresistenzgen exprimieren, werden durch Behandlung mit G418 bei 200 – 500 μg pro ml Medium selektiv abgetötet. Medium, das Antibiotikum enthält, wird täglich gewechselt. Eine Zellpopulation, die nicht durch Elektroporation behandelt worden ist, wird ebenfalls behandelt, um festzustellen, wie empfindlich die Zellen natürlicherweise auf eine G418-Behandlung antworten. Nach 6 – 10 Tagen werden Zellen, die gegen das Antibiotikum resistent sind, als gesunde Kolonien erkennbar sein. Diese Zellen werden dann durch das Ziel-Konstrukt zu transformieren sein und können in bezug auf eine homologe Rekombination durchgemustert werden (d. h. auf eine gezielte Transformation des Gens versus eine zufällige Integration durchgemustert werden).
Resistente Kolonien werden von der Selektionsschale mit einer Mundpipette abgenommen („gepickt") und zu einer Einzelzellsuspension dispergiert. Die Hälfte dieser Zellen wird weggefroren, während die andere Hälfte expandiert und verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine homologe Rekombination aufgetreten ist. Falls diese Kolonien klein sind, ist es manchmal zu bevorzugen, die gesamte Kolonie in einer 24-well-Schale zu expandieren und dann die Hälfte einzufrieren, während die andere Hälfte für eine genetische Analyse expandiert wird.
III. PICKEN VON ES-ZELLKOLONIEN ZUR GENETISCHEN ANALYSE NACH SELEKTION
A. Verfahren 1: Einfrieren der Hälfte der Kolonien

1. Am Tag vor dem Picken der Kolonien: a) Man beschichte eine erforderliche Anzahl an Platten mit 0,1% Gelatine (in PBS). Zwei Platten pro zu pickende 24 Kolonien: eine Platte dient zum Einfrieren und eine Platte dient zur Klonexpansion. Man beginne mit 20 × 24-well-Platten. b) Man zähle bestrahlte Fibroblasten, zentrifugiere ab und resuspendiere in DMEES. c) Man aspiriere die Gelatine von 10 Platten und plattiere ~ 10⁵ Zellen/Vertiefung in 1 ml DMEES aus (es können so wenige Zellen wie 5 × 10⁴ verwendet werden). Man inkubiere bei 37°C, 10% CO₂ über Nacht (oder mindestens eine Stunde). d) Man aspiriere die Gelatine von den anderen 10 Platten.
2. Am Tag des Pickens der Kolonie: a) Man wechsle das Medium der ES-Zellen vor und regelmäßig während des Pickens (um flotierende Zellen zu entfernen). b) Man ziehe verstopfte Pasteur-Pipetten. Man verwende eine frische Pipette jeweils nach 24 Kolonien. Die gewünschte Spitze weist einen Durchmesser auf, der ungefähr halb so groß ist wie der einer Kolonie, wobei sich die Einengung über 1 – 2 cm erstreckt. Die Spitze sollte senkrecht und einwandfrei sein. Anmerkung: Nach dem Ziehen der Pipette ritze man das Glas an der gewünschten Bruchstelle mit frisch gezogenem Glas ein und ziehe dann aus. c) Man markiere Multi-Spitzen-Reservoirs für: 1 PBS-EGTA 2 Trypsin-Versene 3 DMEES 4 2 x Einfriermischung (20% DMSO in FCS) d) Man verwende einen Multipipettor, gebe 50 μl PBS-EGTA in 24 Vertiefungen einer 96-well-Platte. e) Am Mikroskop: Man verbinde eine sorgfältig gezogene Pasteur-Pipette mit einem Mundpipettenschlauch. Man nehme eine Kolonie von der Platte ab und übertrage sie (in einem minimalen Volumen) in eine Vertiefung einer 96-well-Platte. Man blase den Inhalt der Pipette aus, die Blasen dienen als eine Lokalisationshilfe. Man picke 24 Kolonien oder so viele wie möglich in < 10–15 Min. (vorzugsweise eine Vielzahl von 6). f) An der Sterilbank: Man gebe 100 μl Trypsin zu jeder Vertiefung unter Verwendung eines Multipipettors und lasse bei Raumtemperatur 2 Minuten stehen. g) Man pipettiere 10 – 15 Mal auf und ab, um die Zellen zu dispergieren und gebe dann 100 μl DMEES dazu. (Dies sollte innerhalb von 4 – 6 Minuten nach Trypsin-Zugabe erfolgen.) i) Man teile die Zellsuspension zwischen den Platten zum Einfrieren und zur Expansion unter Verwendung einer 12-Kanalpipette auf, wobei jeder zweite Kanal mit einer Spitze bestückt ist. Man übertrage 125 μl auf eine gelatinisierte 24-well-Platte (zum Einfrieren); die restlichen ~ 125 μl werden auf eine 24-well-Platte mit Fütterungslage transferiert (für die DNA). Die Platten werden markiert und sorgfältig ausgerichtet, um sicherzustellen, daß ein Klon in dieselbe Vertiefung eines jeden Trägers wandert. j) Man gebe 125 μl 2× Einfriermischung zu jeder Vertiefung der Einfrierplatte und mische gut durch Aufwirbeln. k) Man verschließe in einer Tasche mit Reißversehluß oder eine Kunststoffumhüllung und plaziere sie in einen Gefrierschrank bei –70°C in einer äquilibrierten Styroporbox und verschachtele die Platten mit Styropor. l) Man inkubiere die Expansionsplatten, bis genügend Zellen für eine Genotyp-Analyse vorhanden sind.

A. Methode 2: Einfrieren nach Expansion zu 24 Vertiefungen

1. Am Tag vor dem Picken der Kolonien: a) Man beschichte eine erforderliche Anzahl an Platten mit 0,1 % Gelatine (in PBS). Man beginne mit 10 × 24-well-Platten. b) Man zähle bestrahlte Fibroblasten, zentrifugiere ab und resuspendiere in DMEES. c) Man aspiriere die Gelatine von den Platten und plattiere ~ 10⁵ Zellen/Vertiefung in 1 ml DMEES aus. Man inkubiere bei 37°C, 10% CO₂ über Nacht (oder einem Minimum von 1 Stunde).
2. Am Tag des Pickens der Kolonien: a) Man picke Kolonien, wie für die Hälfte der Kolonien beschrieben (Verfahren 1, oben), anstatt jedoch die Zellsuspension zwischen Einfrier- und Expansionsplatten aufzuteilen, wandert die gesamte Zellsuspension in die Expanssionsplatte. b) Nach 3 – 4 Tagen (wobei täglich Medium gewechselt wird) werden die Zellen ausreichend gewachsen sein, um eingefroren zu werden. Man arbeite an einer Platte zu einer Zeit (mit Erfahrung können zwei bearbeitet werden), aspiriere Medium aus jeder Vertiefung. Man überflute mit PBS/EGTA für 4 Minuten. In der Zwischenzeit setze man Pipettenspitzen auf, um einen 12-Kanal-Multipipettor zu beschicken. Man aspiere PBS. c) Man gebe 100 μl Trypsin (unter Verwendung eines Multipipettors und alternierender Kanäle) zu und lasse 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen. d) Man pipettiere 10 – 15x auf und ab, um die Zellen der ersten Reihe zu dispergieren, wechsle die Spitzen, gebe dann 100 μl DMEES dazu. Man wiederhole für jede Reihe. (Dies sollte innerhalb von 6 Minuten nach Trypsin-Zugabe erfolgen). e) Unter Verwendung einer 12-Kanal-Pipette, bei der jeder zweite Kanal mit einer Spitze beschickt ist, übertrage man 125 μl auf eine gelatinisierte 24-well-Platte (zum Einfrieren). Die restlichen Zellen werden zur DNA-Gewinnung expandiert. Es ist besonders wichtig, daß die Platten markiert und sorgfältig ausgerichtet werden, um sicherzustellen, daß der Einfrierträger mit dem Expansionsträger zusammenpaßt. f) Man gebe 125 μl 2× Einfriermischung in jede Vertiefung der Einfrierplatte und mische gut durch Aufwirbeln. g) Man verschließe in einer Reißverschlußtasche oder Kunststoffumhüllung und plaziere sie in einem Gefrierschrank bei –70°C in einer äquilibrierten Styroporbox. Man verschachtele die Platten mit Styropor. h) Man gebe 1 ml DMEES zu dem Expansionsträger. (Es werden ausreichend Fütterungszellen vorhanden sein, um eine gute Plattiereffizienz zu ergeben). Man inkubiere 3 – 4 Tage, bis ausreichend Zellen zur Genotyp-Analyse vorhanden sind.

IV. AUFTAUEN VON AUF 24-WELL-PLATTEN EINGEFRORENEN ESZELLKLONEN
Zellen, für die festgestellt worden ist, daß sie die gewünschte genetische Änderung aufweisen, werden von einer Platte, die bei –70°C eingefroren ist, geerntet, wobei die Platte als Doppelbestimmung angelegt wurde. Die Platte wird unter die Sterilbank genommen und die Kunststofftasche entfernt. Jede Vertiefung wird mit warmem Medium gefüllt, und die Fütterungszellen werden zu einer oder mehreren interessierenden Vertiefung(en) gegeben. Die Platte wird in einen Inkubator bei 37°C für 60 Minuten plaziert, dann wird das Medium ausgetauscht. Nach zwei oder drei Tagen werden Kolonien auftreten. Diese Kolonien werden zum Etablieren neuer gefrorener Stammkulturen expandiert und folgendermaßen getestet: 1) Karyotyp-Analyse, 2) Bestätigung der gewünschten genetischen Veränderung, 3) Mykoplasma-Infektion und 4) Fähigkeit, Chimären zu bilden.
BEISPIEL 13
Herstellung von Mäuse-ES-Zell-Knockouts unter Verwendung des pNEOαGT10.8B-Konstrukts
I. TRANSFORMATION
Insgesamt 1×10⁷ E14-ES-Zellen wurden mit 5 μl von 1 μg/μl pNEOαGT10.8B-DNA (linearisiert durch XhoI-Verdau) durch Elektroporation behandelt (siehe Beispiel 9 und 17). Die Elektroporation wurde in 600 μl in einer breiten Küvette bei 25 μF, 350 für V 0,5 msek durchgeführt. Die Zellen wurden in 6 ml komplettem ES-Medium geerntet und in 6 × 100 mm Petrischalen ausplattiert, wobei jede eine Fütterungslage von Neo^R-STO-Zellen enthielt.
Die Zellen wurden im kompletten ES-Medium 3 Tage kultiviert, und dann wurde Medium mit 200 – 350 μg/ml G418 ausgetauscht. Dieses Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Nach 9 Tagen waren einzelne Neo^R-Kolonien ausreichend groß, um identifiziert und geerntet zu werden. Die Kolonien wurden in 20 μl PBS gepickt, und 20 μl Trypsin-Lösung wurden zugesetzt. 40 μl eines 60%igen konditionierten BRL-Mediums in komplettem ES-Medium wurden dann zugegeben. Aliquots von 40 μl wurden in einzelne Vertiefungen von jedem der beiden 24-well-Platten übertragen. Eine Platte enthielt eine Fütterungslage von STO-Zellen in 100 μl komplettem ES-Medium. 140 μl 2× DMSO-Einfriermischung wurde dieser Platte zugegeben, die bei –80°C gelagert wurde. Jede der Vertiefungen der zweiten 24-well-Platte enthielt 1 ml 60%iges konditioniertem BRL-Medium in komplettem ES-Medium. Diese Platte wurde bei 37°C inkubiert, bis die Kolonien konfluent waren.
II. BESTÄTIGUNG DER HOMOLOGEN REKOMBINATION
Das Medium wurde von den konfluenten Kolonien abgesaugt, und 400 μl Lysepuffer (10 mM Tris pH 7,8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % SDS und 500 μg/ml Proteinase K) wurden zugesetzt. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C lysiert, mit 400 μl Phenol/Chloroform 1:1 extrahiert und auf Eppendorf-Röhrchen übertragen, die 1 ml 95% Ethanol und 0,2 M NaAc enthielten. Die DNA wurde durch Zentrifugation bei 13.000 Upm in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, das Pellet wurde zweimal mit 80% Ethanol gewaschen und in 30 μl Wasser wieder gelöst.
Eine Southern-Analyse (siehe z. B. Sambrook et al., supra) wurde verwendet, um ES-Zellklone zu identifizieren, bei denen eine homologe Rekombination am 3'-Ende des Konstrukts aufgetreten war. Aliquots von 15 μl DNA wurden mit 20 Units des Restriktionsenzyms BglII nach Angaben des Herstellers verdaut. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurde die DNA einer Elektrophorese durch ein 0,8% Agarose-Gel (in einem Tris-Acetat, EDTA-Puffer) bei 1 – 2 V/cm über Nacht unterzogen, wobei 750 ng einer mit HindIII-verdauten lambda-DNA als Marker verwendet wurden. Die DNA wurde auf eine Zetaprobe-Nylonmembran unter Verwendung eines Hybaid-Vakuumblotters bei einem Vakuum von 80 cm Hg während 1 Stunde transferiert.
Die Membran wurde in einer Hybaid-Hybridisierungsflasche in 10 ml der folgenden Hybridisierungsmischung 3 Stunden bei 65°C prähybridisiert:

0,25 M Na₂HPO₄ pH 7,2
7% SDS
1 mM EDTA
100 μg/ml Lachsspermien-DNA
10% PEG

Radioaktiv markierte Sonden-DNA wurde unter Verwendung eines BRESATEC Gigaprime Oligo Labeling-Kit (Kat.-Nr. GPK-1) nach Angaben des Herstellers markiert.
Ungefähr 50 ng eines 0,7 kb EcoRI/XmnI-DNA-Fragments von jenseits des 3'-Terminus des Konstrukts pNeoαGT10.8B (siehe Beispiel 9 und 17) wurden mit ³²P-dATP markiert, wobei eine spezifische Aktivität von 5 × 10⁸ cpm/μg erreicht wurde. Die denaturierte Sonde wurde zu der Prähybridisierungsmembran in eine Hybaid-Flasche gegeben und über Nacht bei 65°C inkubiert.
Die Membran wurde aus der Hybaid-Flasche entfernt, mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS, vorgewärmt auf 65°C, gespült und dann 2 – 3mal mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für jeweils 30 Minuten gewaschen. Ein Feuchtigkeitsüberschuß wurde dann abgestreift, die Membran in einer Kunststoffverpackung verpackt und gegenüber einem Phospho-Imager-Schirm 16 Stunden bis zu 3 Tagen exponiert. Das Bild wurde in einem Imagequant-Phospho-Imager sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse werden in 18 gezeigt, wobei es sich um einen Southern-Blot von DNA von 15 ES-Zelllinien handelt, wobei die Sonde das oben und in Beispiel 9 beschriebene 0,7kb EcoRI/XmnI-DNA-Prüffragment ist. Die 6,4 kb-Bande, die ein homologes Rekombinationsereignis in dem α-1,3-Galaktosyltransferasegen (α-1,3-Gal T) (siehe Beispiel 9) anzeigt, wird in 6 von 15 untersuchten ES-Zellinien beobachtet. Alle 6 Knockout-Zellinien schienen heterozygot im Hinblick auf das inaktivierte Allel zu sein, da die 8,3 kb-Bande, welche das inaktivierte α-1,3-Gal T-Gen (siehe Beispiel 9) anzeigt, ebenfalls in allen 6 Spuren vorhanden war.
Zwei Zelllinien, hier mit „8D1" und „7C2" bezeichnet, wurden zur weiteren Analyse auswählt. Für die Zellinien 8D1 und 7C2 wurde durch Southern-Analyse festgestellt, daß sie ein α-1,3-Gal T-Allel enthalten, wobei eine homologe Rekombination an dem 3'-Ende des Konstrukts aufgetreten ist.
Long-range PCR wurde dann verwendet, um zu bestimmen, ob eine homologe Rekombination am 5'-Ende des Konstrukts in diesen Zelllinien aufgetreten ist. Zwei Sätze von Primern wurden in getrennten PCR-Experimenten verwendet:
1. Wildtyp-Primer:
MGT-KOex8F und MGT-KOR1 überspannen das Intron zwischen den Exons 8 und 9 und amplifizieren ein 5,5 kb großes Fragment des α-1,3-Gal T-Wildtyp-Gens. (19)
SEQUENZEN:

MGT-KOex8F
5'TGCTGGAAAAGTACTACGCCACACAGAAACTCA-3'
(SEQ ID Nr. 14)
(Nukleotide 1014–1046 in 4)
MGT-KOR1
5'AGCCAGAGTAATAGTGTCAAGTTTCCATCACAA-3'
(SEQ ID Nr. 15)
Nukleotide 1779–1811 in 4)

2. Knockout-Primer:
MGT-KOex8F und MGT-KONeoR überspannen das Exon 8 zu der Neo^R-Gen-Kassette in dem „knock-out"-Allel und amplifizieren ein 5,5 kb großes Fragment aus dem „knock-out"-Allel (19).
SEQUENZ:

MGT-KONeoR
5'-GCCACACGCGTCACCTTAATATGCCAAGTGGAC-3'
(SEQ ID Nr. 16)
(Nukleotide 323–355, 16)

Jede Reaktionsmischung enthielt ~ 100 ng genomische DNA als Matrize in einem Reaktionsvolumen von 50 μl und enthielt 25 mM Tris-HCl (pH 9,1), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 250 μM dNTPs, 3,5 mM MgCl₂, jeweils 100 ng Primer, 2 Units Taq-Polymerase und 0,025 Units Pfu-Polymerase. Die Reaktionsmischungen wurden bei 94°C 1 Minute erhitzt, dann folgten 45 Zyklen bei 94°C für 15 Sekunden, 68°C für 6 Minuten, gefolgt durch einen einzelnen Schritt von 72°C für 10 Minuten.
Genomische DNAs von putativen „knock-out"-ES-Zellinien aus CBA/C-Mäusen (homozygot in bezug auf das α-1,3-Gal T-Wildtyp-Allel) wurden in getrennten Reaktionen unter Verwen dung jedes Satzes von Primern amplifiziert. Ein Aliquot von 10 μl von jeder PCR wurde durch Southern-Blot analysiert (Sambrook et al., 1989).
Die Ergebnisse werden in 20 veranschaulicht:
Knockout-Primer:
Ein 5,5 kb großes Fragment, das mit der 1,3 kb Neo^R-Gen-Kassette (16) hybrisierte, wurde aus 7C2-DNA (20, Spur 4) und 8D1-DNA (nicht gezeigt) erzeugt. Diese Bande wurde nicht durch CBA/cDNA (20, Spur 3) erzeugt.
Wildtyp-Primer:
Ein 5,5 kb großes Fragment, das mit der α-1,3-Gal T-Gen-Sonde (isoliert durch SalI-Verdau von pαGT-54.0) hybrisierte, wurde aus 7C2 und CBA/cDNA (20, Spuren 1 bzw. 2) und 8D1-DNA (nicht gezeigt) erzeugt. Dieses Produkt hybridisierte nicht mit der Neo^R-Gen-Sonde.
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine homologe Rekombination an dem 5'-Ende des Konstrukts in den Zelllinien 8D1 und 7C2 aufgetreten ist.
BEISPIEL 14
Erzeugung von ein ES-Zellgenom tragenden Tieren
Die Verfahren, die in diesem Beispiel zur Verfügung gestellt werden, werden an Mäuse-ES-Zellen angepaßt. Allerdings ist die Hauptstrategie im wesentlichen dieselbe bei Schweine-ES-Zellen und PGCs.
I. HERSTELLUNG VON ES-ZELLEN ZUR INJEKTION
ES-Zellen werden auf Vertiefungen einer 24-well-Platte mit Zelldichten von 1:2, 1:4, 1:8 und 1:16, bezogen auf die anfängliche Dichte, zwei und drei Tage vor einer Injektion aufgeteilt.
Die kräftigsten und am wenigsten differenzierten Kulturen wurden auf der Grundlage ihrer Morphologie ausgewählt.
II. EMBRYO-INJEKTION UND PRODUKTION VON CHIMÄREN MÄUSEN
Embryos der Maus wurden aus entweder superovulierenden oder sich natürlicherweise paarenden Mäuseweibchen ungefähr 3,5 Tage nach der Paarung geerntet. Nach Übernachtkultur in M16-Medium (Bradley, Production and Analysis of Chimaeras. In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach (E.J. Robertson, Hrsg.) IRL Press, Oxford, S. 113 – 152 (1987)), wobei jene, die eine Höhle gebildet haben, um Blastozysten zu bilden, mit ungefähr 12 – 20 ES-Zellen mikroinjiziert werden. Dieses mikrochirurgische Verfahren wird durchgeführt mit Instrumenten, die aus Kapillarglas gezogen werden, und die Injektion wird gesteuert durch auf eine Mikrometerspritze gestützte hydraulische Vorrichtungen. Ein mit Differential-Interferenz-Kontrast ausgerüstetes Umkehrmikroskop wird verwendet, um das Verfahren zu beobachten.
Nach der Injektion werden die Blastozysten auf den Uterus eines pseudoträchtigen Mäuseweibchens übertragen. Chimäre Mäuse werden auf der Grundlage des Beitrags der Hüllfarbe durch die ES-Zellen identifiziert. Chimäre Mäuse zeigen Agouti-Hüllfarbe, die von der Wirts-Blastozyste stammt, und Chinchilla, zu dem die ES-Zellen beitragen.
Chimäre Mäuse wurden aus ES-Zellen, die das gestörte α-1,3-Gal T-Allel (einschließlich 8D1-, 7C2-Zellen) tragen, durch Injektion in C57B1/6J x CBA F2-Blastozysten erzeugt. Die Fähigkeit individueller chimärer Mäuse, die Charakteristika der ES-Zellen durch die Keimbahn zu übertragen, wurde durch Glukosephosphatisomerase(Gpi)-Analyse von Spermien bestimmt (Bradley, supra, (1987)); Mann et al., J. Reprod & Fert. 99, 505 – 512 (1993). Glukosephosphatisomerase katalysiert die Umwandlung von Glukose-6-Phosphat zu Fruktose-6-Phosphat. Die Mäuse weisen einen einzelnen strukturellen Gpi-Lokus mit zwei Hauptalleln Gpi 1A und Gpi 1B auf. Gpi 1A kodiert ein Protein, das als eine langsam kathodisch wandernde Bande während der Elektrophorese erscheint und in Stämmen wie etwa BALB/c und C 129 auftritt.
(Die hier verwendeten ES-Zellen wurden vom Mäusestamm 129 abgeleitet). Gpi 1B bestimmt ein Enzym, das sich schneller bewegt als Gpi 1A und tritt im Wildtyp und in Stämmen wie etwa C57 und CBA (hier verwendet, um Wirtsblastozysten abzuleiten) auf.
Heterozygote weisen zwei elterliche Banden plus eine Zwischenbande auf, welche auf die dimere Struktur des Enzyms hinweist. Multiple elektrophoretische Formen, die zufällig beobachtet werden, sind auf eine Oxidation von Sulfhydryl-Gruppen zurückzuführen und nicht auf eine gewebespezifische Expression. In chimären Mäusen zeigt das Verhältnis von Gpi 1A (abgeleitet von Stamm 129) zu Gpi 1B (abgeleitet von der Wirtsblastozyste) das Verhältnis von Zellen mit dem ES-Zellgenotyp innerhalb verschiedener Gewebe an. Das Erscheinen von Gpi 1A (abgeleitet von den ES-Zellen) in den Spermien legt nahe, daß die Maus in der Lage ist, den ES-Zell-Genotyp über die Keimbahn zu übertragen.
III. ERZEUGUNG VON MÄUSEN, DIE IN BEZUG AUF DIE IN ES-ZELLEN EINGEFÜHRTE ÄNDERUNG HOMOZYGOT SIND
Chimäre Mäuse mit Spermien, die von ES-Zellen abgeleitet wurden, wurden mit BALB/c-Mäusen gepaart. Nachkommen vom 129-Ola × BALB/c-Genotyp (d. h. heterozygot in bezug auf den ES-Zellgenotyp) sind grau. Es wurde erwartet, daß die Hälfte dieser grauen Mäuse das gestörte Allel tragen. Mäuse, die in bezug auf das gestörte Allel heterozygot waren, wurden durch PCR-Analyse von aus dem Blut gewonnener genomischer DNA identifiziert.
Um Mäuse zu erzeugen, die in bezug auf das inaktivierte α-1,3-Gal T-Gen homozygot waren, wurden die heterozygoten Mäuse miteinander gepaart. Es wurde erwartet, daß ein Viertel der Nachkommen in bezug auf das gestörte Gen homozygot waren. Die Homozygoten wurden durch PCR-Analyse von aus dem Blut gewonnener genomischer DNA identifiziert. Die PCR-Strategie beruhte auf der Insertion eines Neo^R-Gens in der SalI-Schnittstelle von Exon 9 des α-1,3-Gal T-Gens (13).
Wildtypprimer:

E9F: 5'TCAGCATGATGCGCATGAAGAC3'
(SEQ ID Nr. 17)
(homolog zu der Sequenz von ungefähr 40 bis 60 bp 5' zu der SalI-Schnittstelle von Exon 9, entsprechend den Nukleotiden 1257–1278; 4)
E9R2: 5'TGGCCGCGTGGTAGTAAAAA 3'
(SEQ ID Nr. 18)
(homolog zu einer Region von ungefähr 175 bis 195 bp 3' zu der Sal I-Schnittstelle von Exon 9, entsprechend den Nukleotiden 1511–1492; 4).

Die erwartete Fragmentgröße, die aus dem Wildtyp-Allel erzeugt wurde, beträgt 255 bp (21). Diese Primer können potentiell auch ein 1596 bp PCR-Fragment aus dem gestörten Allel erzeugen. In der Praxis wurde dieses Fragment nicht erzeugt, wenn sowohl die Wildtyp-Allele als auch die gestörten Allele vorhanden waren, wahrscheinlich weil das kleinere 255 bp Produkt vorzugsweise amplifiziert wird.
Knockout-Primer:

NeoF1: 5'TCTTGACGAGTTCTTCTGAG 3'
(SEQ ID Nr. 19)
(entsprechend den Nukleotiden 1170–1189; 16)
E9R2: (derselbe Primer, wie oben beschrieben, um das Wildtyp-Allel nachzuweisen).

Die erwartete Größe des Fragments beträgt 364 bp (21).
Die Mäuse wurden bis zum Entwöhnungsalter wachsen gelassen, und es wurde am Schwanz Blut abgenommen. Natrium-Heparin wurde zugesetzt, wobei eine Konzentration von ungefähr 10 U/ml erreicht wurde. Eine PCR-Amplifikation wurde mit 1 μl heparinisiertes Blut (~ 10⁴ kernhaltige Zellen) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt, das 100 mM Tris-Azetat pH 8,8, 3,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs und 2 Units Tth-DNA-Polymerase enthielt. Jede Reaktionsmischung enthielt sowohl die Wildtyp-Primer als auch die Knockout-Primer in einer Konzentration von jeweils 2 ng/μl. Um sicherzustellen, daß die Tth-Polymerase nicht durch das heparinisierte Blut gehemmt wurde, wurde jede Reaktion mit Doppelbestimmungen durchgeführt.
Eine der Reaktionsmischungen wurde mit zwei DNA-Proben versetzt („Spike-Reaktion")

i) 10 fg (~ 600 Moleküle) linearisiertes KO-Plasmid pNeoαGT10.8B.
ii) 1 fg (~ 1.000 Moleküle) eines 983 bp großen RT-PCR-Produkts, das Exon 9 einschließt.

Die andere Reaktionsmischung enthielt diese Zugabe nicht. Folglich wurden zwei getrennte PCR-Reaktionen für jede Blutprobe angesetzt. Zusätzlich wurden Kontroll-PCR-Reaktionen ohne genomische DNA-Matrize und mit oder ohne Zusatz durchgeführt. Jede Reaktionsmischung wurde bei 94°C 3 Minuten erhitzt, dann für 40 Zyklen bei 94°C 40 Sekunden, bei 53°C 40 Sekunden und bei 72°C 40 Sekunden inkubiert. Aliquots von 5 μl aus jeder Reakti onsmischung wurden einer Elektrophorese an einem 3%igen Agarose-Gel unterzogen, und die DNA-Fragmente wurden in einer UV-Licht-Box nach Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. HpaII-verdaute pUC19-Plasmid-DNA wurde als Marker verwendet.
Die Ergebnisse der PCR-Analyse bei drei Mäusen und einer Kontrolle ohne DNA werden in 22 gezeigt. Bei der Maus Nr. 42 zeigten die erzeugten KO-Primer eine 364 bp große Bande nur bei der + Spike-Reaktion. Die Wildtyp-Primer erzeugten eine 255 bp große Bande in den + Spike – und – Spikee-Reaktionen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Maus Nr. 42 homozygot ist in bezug auf das Wildtyp-Allel. Bei der Maus Nr. 43 erzeugten die Wildtyp-Primer eine 255 bp große Bande nur in der + Spike-Reaktion. Die KO-Primer erzeugten eine 364 bp große Bande in den + Spike- und – Spike-Reaktionen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Maus Nr. 43 homozygot ist in Bezug auf das gestörte Allel. Bei der Maus Nr. 44 erzeugten die KO-Primer eine 364 bp große Bande in den + Zugabe- und – Zugabe-Reaktionen. Die Wildtyp-Primer erzeugten eine 255 bp große Bande in den + Spike- und – Spike-Reaktionen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Maus Nr. 44 heterozygot in bezug auf das gestörte Allel ist. In den Kontroll-PCR-Reaktionen war kein Produkt erkennbar, wenn keine Matrize vorhanden war. PCR-Produkte von 364 bp und 255 bp waren offensichtlich, wenn RT-PCR-DNA von pNeoαGT10.8B und Exon 9 die einzigen in den Kontrollreaktionen enthaltenen Sonden waren.
BEISPIEL 15
Charakterisierung von homozygoten Knockout-Mäusen
I. ABWESENHEIT VON Gal T-mRNA IN Gal T-KNOCKOUT-MÄUSEN
A. RNA-Isolierung
Die Gesamt-RNA wurde extrahiert unter Verwendung des RNAzol^TMB-Kits (BIOTECX Laboratories, Inc., 6023 South Loop East, Houston, Texas 77033, USA), angeboten von Bresatec. Dieses Extraktionsverfahren beruht auf dem von Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162: 156 – 159 (1987) beschriebenen Verfahren und umfaßt die Homogenisierung in einer Guanidinium/Phenol-Lösung, eine Chloroform-Extraktion, 2 Isopropanolpräzipitationen und Waschschritte mit 75% EtOH. Die RNA wurde als ein EtOH-Präzipitat bei –20°C gelagert und durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm in Wasser quantifi ziert. Die Integrität und Menge wurde durch Elektrophorese in Agarose/Formaldehyd-Gelen bestätigt. Sambrook et. al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2. Auflg. (1989).
B. RT-PCR
Die Synthese des ersten cDNA-Strangs umfaßt:

– Annealing von 2 μg Gesamt-RNA aus Niere, Herz oder Leber mit 120 ng Oligo-dT-Primer (Gibco BRL, M-MLV Reverse Transcriptase Kit) bei 65°C 5 Minuten in 5 μl 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8).
– Reverse Transkription bei 37°C 1 – 2 Stunden in einem Reaktionsendvolumen von 20 μl unter Verwendung des M-MLV Reverse Transcriptase Kits (Gibco BRL). Jede Reaktionsmischung enthielt 5 mM DTT, 0,1 μg/ μl BSA, 1 mM dNTPs, 40 U RNAse-Inhibitor aus menschlicher Plazenta (Bresatec), 200 U M-MLV Reverse Transkriptase und den entsprechenden RTase-Puffer in 1 × Konzentration.

C. PCR-Analyse von cDNA
α-1,3-Gal T-cDNA wurde durch PCR-Amplifikation von mit Oligo-dT „geprimeter" cDNA-Matrize nachgewiesen. In Verbindung mit den Kontroll-PCR-Ergebnissen zeigte ein Versagen, dieses PCR-Fragment zu erzeugen, daß α-1,3-Gal T-mRNA in der RNA-Präparation fehlte. Um zu zeigen, daß die α-1,3-Gal T-Primer eine Amplifikation der α-1,3-Gal T-Matrize förderten, wurde jede Reaktion als Doppelbestimmung vorgesehen, und eine der Reaktionsmischungen erhielt eine Zugabe mit 0,1 fg (~ 100 Moleküle) eines 983 bp großen α-1,3-Gal T-cDNA-Produkts aus der Maus (erzeugt durch die Primer 7F und MGT-3UR, die Exon 7 bis zu der 3'-untranslatierten Region überspannen). Als eine zweite Kontrolle, um zu zeigen, daß eine cDNA-Synthese erfolgt ist, wurde ein Fenochelatase-PCR-Fragment an der cDNA-Matrize erzeugt.
1. Primer:

Primer zum Nachweis von α-1,3-Gal T-cDNA:
7F: 5'- TGGAGATCGCATTGAAGAGC 3'
(SEQ ID Nr. 20)
(entspricht den Nukleotiden 889–911 im
Exon 7 (4))
9R2: 5'- TGGCCGCGTGGTAGTAAAAA 3'
(SEQ ID Nr. 21)
(entspricht den Nukleotiden 1492–1511 im
Exon 9 (4))

Es wurde erwartet, daß die Primer 7F und 9R2 ein Fragment von ~ 619 bp (23) an der cDNA-Matrize erzeugen. Diese Primer würden kein Fragment an einer genomischen DNA erzeugen, die möglicherweise in der cDNA-Präparation vorhanden ist, da die Primer zu große Introns überspannen.

mGT-3UR:
5'- GGGTTTTGGTTTTGATTGTT 3'
(SEQ ID Nr. 22)
(entsprechend den Nukleotiden 1866–1888 in der 3'-untranslatierten Region; 4).

Dieser Primer wurde mit dem Primer 7F verwendet, um das DNA-Fragment zu erzeugen, das in den Kontroll-PCR-Reaktionen mit Zusatz („Spike-PCT")verwendet wird.
Primer zum Nachweis von Ferrochelatase-cDNA aus der Maus (EcoRI-Linker sind unterstrichen):

FC-F:
5'- CTGAATTCATGTTAAACATGGGAGGCCCC 3'
(SEQ ID Nr. 23)
(entsprechend den Nukleotiden 215–235, Taketani et al., J. Biol. Chem. 265: 19377–80 (1990)).
gFC-R:
5'-CTGAATTCTGCCCACTCCCTGCCGATG 3'
(SEQ ID Nr. 24)
(entsprechend den Nukleotiden 888–908, Taketani et al., J. Biol. Chem. 265: 19377–80 (1990)).

Von diesen Primern wurde erwartet, daß sie ein 709 bp großes Fragment (23) erzeugen. Diese Primer werden kein Fragment an einer genomischen DNA erzeugen, die möglicherweise in der cDNA-Präparation vorhanden ist, da diese Primer fünf Introns überspannen.
Die Reaktionsvolumen betrugen 50 μl, bestehend aus 4 μl Reaktionsmischung aus der cDNA-Synthese des ersten Strangs, 100 ng je Primer, 2 mM MgCl₂, 0,3 mM dNTPs, 2 U Taq-Polymerase (Bresatec) und Taq-Reaktionspuffer (Bresatec) in einer 1× Konzentration. Die Reaktionsmischungen wurden bei 94°C 2 Minuten erhitzt, dann folgten 29 Zyklen bei 94°C für 15 Sekunden, bei 58°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 1 Minute, gefolgt durch einzelne Schritte bei 72°C für 4 Minuten und bei 4°C für 5 Minuten. Ein Aliquot von 10 μl von jedem PCR-Ansatz wurde einer Elektrophorese an einem 2%igen Agarose-Gel unterzogen, und die DNA-Fragmente wurden in einer UV-Licht-Box nach Färbung des Gels mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
24 zeigt die PCR-Fragmente, die an RNA erzeugt wurden, die aus Niere (kidney, K), Herz () und Leber (L) einer Wildtyp-Maus und Mäusen, die heterozygot oder homozygot in bezug auf das gestörte α-1,3-Gal T-Allel waren, isoliert wurde. 24 (i) zeigt, daß das 709 bp große Ferrochelatase-Fragment in jeder der cDNA-Präparationen erzeugt wurde, was zeigt, daß die cDNA-Matrize in der reversen Transkriptionsreaktion erzeugt wurde und für die α-1,3-Gal T-Gen-Primer verfügbar war. Das 619 bp große α-1,3-Gal T-Fragment war in jeder der Reaktionsansätze, die eine Zugabe des 983 bp großen α-1,3-Gal T-cDNA-Produkts (24 (ii)) erhalten hatten, vorhanden, was zeigt, daß eine Amplifikation der α-1,3-Gal T-cDNA („Spike")-Matrize erfolgt war.
In den Reaktionsmischungen, die keine Zugabe erhalten hatten (24 (iii)), wurde das 619 bp große α-1,3-Gal T-Fragment in cDNAs nachgewiesen, die an den Wildtyp- und heterozygoten RNAs synthetisiert wurden. Dies zeigt, daß α-1,3-Gal T-mRNA in der Niere, dem Herzen und der Leber der Wildtyp- und heterozygoten Mäuse vorhanden ist. Das 619 bp große Fragment wurde in den homozygoten KO-Reaktionsmischungen ohne Zugabe nicht nachgewiesen, was zeigt, daß α-1,3-Gal 7-mRNA in den homozygoten KO-Mäusen nicht synthetisiert wird.
II. TEST AUF EXPRESSION DES GAL-EPITOPS IN HOMOZYGOTEN KNOCKOUTMÄUSEN UNTER VERWENDUNG VON ANTI-GAL ANTIKÖRPERN MIT DEM FLUORESZENZ-AKTIVIERTEN ZELLSORTIERVERFAHREN (FACS)
A. Lösungen
Die Lösungen 1 bis 5 sind 10× isotonisch.

1. 1,68 M NaCl (948,21 g/l) Vor dem Wiegen trockne man die Salze über Nacht in einem Wärmeschrank.
2. 1,68 M KCl (125 g/l) Vor dem Wiegen trockne man die Salze über Nacht in einem Wärmeschrank.
3. 1,12 M CaCl₂ (165 g/l CaCl₂2H₂O). Vor dem Wiegen trockne man die Salze über Nacht in einem Wärmeschrank.
4. 1,68 M MgSO₄ (414 g/l MgSO₄7H₂O). Nicht im Wärmeschrank trocknen.
5. Kaliumphosphatpuffer pH 7,2: a) 1,68 M KH₂PO₄ (229 g/l) b) 1,12 M K₂HPO₄ (226 g/l K₂HPO₄ 3 H₂O oder 195 g/l K₂HPO₄) Der Kaliumphosphatpuffer wird hergestellt, indem gleiche Volumen der Lösungen a) und b) zusammengemischt werden. Um den pH-Wert des Puffers einzustellen, entnehme man eine kleine Probe, verdünne sie 1:50 und lese das pH-Meter ab.
6. Hepes-Puffer 1 M (CSL, Melbourne, Australien)
7. KDS BSS: Man gebe die Stammlösungen in der folgenden Reihenfolge zu doppelt-destilliertem Wasser (DDW) zu:

Stammlösung: Verhältnis der Lösungen

DDW 1210

NaCl 121

KCl 3

CaCl₂ 3

MgSO₄ 1

Kaliumphosphatpuffer 2

Hepes 20

Man sterilisiere über einen Filter, lagere bei 4°C.
8. KDS/BSS/2% HSA/0,02% Azid:

KDS/BSS 244,5 ml

Humanes Serumalbumin 5 ml

(CSL, Melbourne, Australien)

10% Na-Azid in MT-PBS 0,5 ml
9. FITC-Verdünnung: Man verdünne 7,5 μl FITC-IgG auf 600 μl mit KDS/BSS
10. Puffer zur Lyse roter Blutzellen: 0,168 M NH₄Cl in doppelt destilliertem Wasser
11. 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösungen:

A. NaH₂PO₄2H₂O 22,6 g/l

B. NaOH 25,2 g/l

C. 40% Paraformaldehyd:

1) 4 g Paraformaldehyd (BDH, Kilsyth, Australien, Nr. 29447), gelöst in 10 ml doppelt destilliertem Wasser. Man erhitze auf 70°C 2 Stunden auf einem Rührer unter einem Abzug, und ein paar Tropfen 2M NaOH werden zugesetzt, bis die Lösung klar wird. 2) 0,54 g Glukose werden dann zugesetzt. 3) Man lagere bei Raumtemperatur in einer lichtgeschützten Flasche. D. Man gebe 83 ml von A + 17 ml von B zusammen. E. 4 % PFA End-Fixierlösung: 90 ml von D + 10 ml von C, pH 7,4 bis 7,6; man stelle den pH-Wert mit 1M HCl ein.
12. Hanks Balanced Salt Solution (HBBS) (Ca- und Mg-frei)

KCl 400 mg

KH₂PO₄ 60 mg

NaCl 8 g

NaHCO₃ 350 mg

Na₂HPO₄2H₂O 68 mg

Glukose 1 g

H₂O ad 1 Liter

Man stelle den pH-Wert auf 7,0 ein; man sterilfiltriere.
13. Schaf-anti-Mensch IgG und IgM-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) F(ab)₂-Fragmente (Silenus, Hawthorn, Australien):

B. Verfahren

1. Man entnehme Mäusen Blut aus dem Auge, sammle 300 – 400 μl in einem vorgekühlten Eppendorf-Röhrchen, man lagere auf Eis, gebe EDTA 20 mg/ml dazu, um eine Endkonzentration von 2 mg/ml zu erreichen.
2. Man übertrage das Blut (einschließlich geeigneter menschlicher Kontrollen) in ein klares 10 ml-Röhrchen und gebe 10 ml rote-Zellen-Lysepuffer (0,168M NH₄Cl), vorgewärmt auf 42°C, dazu; man inkubiere mehrere Minuten oder bis die Zellen lysiert sind.
3. Man pelletiere die Zellen durch Zentrifugation (800 × g, 7 Minuten, 4°C).
4. Man resuspendiere die Zellen in 10 ml KDS/BSS/2% HSA/0,02% NaN₃)
5. Man pelletiere die Zellen wie oben; man wiederhole die Schritte 4 und 5.
6. Man resuspendiere die Zellen in 1.000 μl KDS/BSS/2% HSA/0,1% 40 NaN₃; man überführe Aliquots in V-Boden-FACS-Röhrchen.
7. Man pelletiere die Zellen wie oben.
8. Man resuspendiere die Zellen in 100 μl KDS/BSS/2% HSA/0,1% NaN₃.
9. Man gebe 50 μl gereinigten Anti-Gal-Körper (siehe Beispiel 1, oben), normales menschliches Serum (normal human serum, NHS) oder HBBS/2% HSA/0,1% NaN₃ hinzu und inkubiere 45 Minuten.
10. Man gebe 2 ml KDS/BSS/2% HSA/0,2% NaN₃ hinzu; man zentrifugiere die Zellen wie oben.
11. Man gebe 50 μl einer Verdünnung von 1:80 von Schaf-anti-Mensch-IgG oder -IgM-FITC F(ab)₂-Fragment (Silenus) hinzu.
12. Man gebe 2 ml KDS/BSS/2% HSA/0,02% NaN₃ hinzu; man zentrifugiere die Zellen wie oben.
13. Man resuspendiere die Zellen in 300 μl KDS/BSS/2% HSA/0,02% NaN₃.
14. Man übertrage Proben auf Rundboden-FACS-Röhrchen aus Kunststoff und gebe 3 μl Propidiumjodid (100 μg/ml) hinzu; die Proben sind jetzt bereit zur Analyse; man halte sie auf Eis.
15. Man führe eine Analyse mit einem Beckmann-FACS-Scan unter Verwendung der Einstellungen für periphere Blutlymphozyten durch.

C. Ergebnisse
Die Ergebnisse dieser Experimente sind unten angegeben:
Die Ergebnisse der humanen anti-Gal-Bindung an humane periphere Blutlymphozyten (negative Kontrolle) sind nicht gezeigt, waren aber negativ. Diese Experimente demonstrieren, daß humane anti-Gal (IgG und IgM)-Antikörper an periphere Blutzellen der homozygoten α1,3-Galactosyltransferase-Knockout-Maus (Maus 21 und Maus 9) sehr schwach, wenn überhaupt, binden. Dies bestätigt den erwarteten Mangel an Galactose-α1,3-galactose (GAL)-Epitop in solchen Mäusen. Im Gegensatz dazu zeigen periphere Blutzellen von normalen Mäusen (Maus 129 und Maus 19) desselben Stammes eindeutige Bindung der anti-Gal-Antikörper.
III. TEST AUF EXPRESSION DES GAL-EPITOPS IN HOMOZYGOTEN KNOCK OUT-MÄUSEN UNTER DER VERWENDUNG VON IB₄-LECTIN MIT FACS:
IB₄-Lectin hat eine exklusive Affinität für terminale α-D-Galactosyl-Reste und ist, wie unten demonstriert, nützlich für die Charakterisierung der Knockout-Mäuse.
A. Lösungen

1. 4 % Paraformaldehyd (siehe oben)
2. Maus-Tonizität-PBS (MT-PBS)

Na₂HPO₄ 2,27 g

NaH₂PO₄2H₂O 0,62 g

NaCl 8,7 g

auf 1 l mit DDW auffüllen
3. Tote Zellen-Entfernungspuffer (DCRB). –4,5 g Sorbitol –7,6 g Glucosemonohydrat (6,93 g wenn wasserfrei) –12,5 ml KDS/BSS –auf 100 ml mit DDW auffüllen –Filtrieren, Lagern bei 4°C –nur unter sterilen Bedingungen öffnen
4. KDS/BSS (Maustonizität, Hepes-gepufferte balancierte Salzlösung pH 7,2) (siehe oben)
5. Roter Zell-Lysepuffer (siehe oben)
6. KDS/BSS/2%HSA/0,02 % Azid (siehe oben)
7. Hanks Balanced Salzlösung (Ca- und Mg-frei) (siehe oben)

B. Methoden

1. Milz entfernen, mit gebogener Zange halten und Splenocyten durch Injizieren mit einer 27 Gauge-Nadel, gebogen bei 90°C, sammeln, 100–200 μl Puffer zwei- oder dreimal in die Milz injizieren (2,5 ml Spritze). Unter Verwendung der flachen Oberfläche der gebogenen Nadel Zellen aus Löchern, die in die Milz gemacht sind, massieren. Injektionen wiederholen und Zellen entfernen, bis keine Zellen in der Kapsel verbleiben.
2. Splenocyten in 10 ml Röhrchen transferieren und zentrifugieren, um Zellen zu pelletieren. (500xg, 7 Minuten., 4°C).
3. Überstand entfernen und 3 ml Roter Zell-Lysepuffer, vorgewärmt auf 42°C addieren; für einige Minuten inkubieren oder bis die Zellen lysiert sind. Mit 1 ml HIFCS (Hitze-inaktiviertes fötales Kalbserum) unterschichten und auf Eis für 5 Minuten stehen lassen. Auf 10 ml mit KDS BSS/10 % HIFCS auffüllen.
4. Wie oben zentrifugieren.
5. Zellen in 3 ml Tote Zellen-Entfernungspuffer resuspendieren; mit Pipette gut mischen.
6. Durch eine Glaspipette, die mit Baumwolle gestopft ist, passagieren und Zellen in einem 10 ml Röhrchen sammeln. Die Zellen nicht hindurchzwingen, Abfluß der Schwerkraft folgend erlauben.
7. Zellen mit 1 ml BSS/10 % HIFCS unterschichten.
8. Wie oben zentrifugieren.
9. Überstand entfernen.
10. Wie oben zentrifugieren; Schritte 4 und 5 wiederholen.
11. 0,5 ml kaltes 4 % Paraformaldehyd (PFA) addieren.
12. Auf Eis für 5 Minuten. mit periodischem Mischen inkubieren.
13. 2 ml Eis-kaltes HBBS addieren und wie oben zentrifugieren.
14. Waschschritte mit 2 ml und danach 1 ml HBBS wiederholen.
15. Zellen in 100 μl KDS/BSS/2 % HSA/0,1 % NaN₃ resuspendieren; in V-Boden FACS-Röhrchen transferieren.
16. FITC-IB4-Lectin (Sigma, Katalog Nr. L 2895) addieren, 50 μl bei 20 μg/ml oder 50 μl HBBS; auf Eis für 30 Minuten. inkubieren.
17. 2 ml KDS/BSS/2 % HSA/0,1 % NaN₃ addieren, Zellen wie oben zentrifugieren.
18. Zellen in 300 μl KDS/BSS/2 % HSA/0,1 % NaN₃ resuspendieren.
19. Proben in plastik Rundboden-FACS-Röhrchen transferieren; die Proben sind jetzt für die Analyse bereit; auf Eis halten.
20. Analyse am FACS-Scanner unter der Verwendung der peripheren Blutlymphocyten-Einstellung.

C. Proben

1. Maus 129 Splenocyten allein
2. Maus 129 Splenocyten + IB4-Lectin
3. humane PBL allein
4. humane PBL + IB4-Lectin

D. Ergebnisse
Die Ergebnisse dieser Experimente sind unten angegeben:
Die Ergebnisse demonstrieren, daß IB₄-Lectin Milzzellen der homozygoten α1,3-Galactosyltransferasegen-gezielten (GAL KO) Maus (Maus 21) sehr schwach, wenn überhaupt, bindet. Dies bestätigt den erwarteten Mangel an Glactose-α1,3-Galactose (GAL)-Epitop in solchen Mäusen. Im Gegensatz dazu binden periphere Blutzellen einer normalen Maus (Maus 19) desselben Stammes IB₄-Lectin stark.
IV. IMMUNOHISTOLOGISCHE BEWERTUNG VON MAUSGEWEBEN AUF DIE ANWESENHEIT DES GAL-EPITOPS UNTER DER VERWENDUNG VON ANTI-GAL-ANTIKÖRPERN:
A. Reagenzien

1. TBS: Tris-gepufferte Saline

NaCl 8 g

KCl 0,2 g

Tris Base 3 g

–in 800 ml destilliertem Wasser lösen. pH auf 8,0 mit 1 M HCl einstellen. Volumen auf 1 l einstellen. Durch Autoklavieren sterilisieren. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
2. Blockierpuffer: –TBS + 2 % Rinderserumalbumin (BSA) + 10 % Kaninchenserum.
3. Peroxidase-Konjugate: DAKO (Dänemark)-Peroxidase (POD) konjugiert an Kaninchen-anti-humanes IgG (Fragment) und DAKO (Dänemark)-Peroxidase (POD) konjugiert an Kaninchen-anti-humanes IgM (Fragment). Beide Konjugate wurden separat auf 10 % Mäuseleberpulver bei 4°C über Nacht prä-absorbiert, dann bei 18.000xg für 10 Minuten. in einer Biofuge zentrifugiert und dann bei 30 psi für 30 Minuten in einer Beckman Airfuge zentrifugiert. Konjugierte Antisera wurden 1:50 in 2 % Blockierpuffer (TBS + 2 % BSA + 2 % Kaninchenserum) mit 16 % normalem Mausserum verdünnt.
4. Mausleberpulver-Präparation: Wie nach Antibodies, a Laboratory Manual, Ed Harber and David Lane, Cold Spring Harbour Laboratories (1988), Seite 663 modifiziert: a) Eine feine Suspension von Mausleber in Maustonizität-Phosphat-gepufferter Saline (MT-PBS) herstellen. Leber durch ein Sieb mit einem 5 ml-Kolben zerstampfen. Jedes fibröse Materialgewebe verwerfen. Ein Gramm Gewebe sollte in ungefähr 1 ml MT-PBS resuspendiert werden. b) Die Gewebe/Saline-Suspension auf Eis für 5 Minuten transferieren. c) 8 ml Aceton (–20°C) (Univar 6, Ajax Chemicals) für 10 Minuten addieren. Energisch mischen. Auf Eis für 30 Minuten mit gelegentlichem energischen Mischen inkubieren. d) Den Niederschlag durch Zentrifugation bei 10.000 g (9.000 U/Minute in Sorvall RC-5B, gekühlte Superspeed-Zentrifuge) sammeln. Für 10 Minuten zentrifugieren. e) Das Pellet mit frischem Aceton (–20°C) resuspendieren und enrgisch mischen. Erlauben, für 10 Minuten auf Eis zu bleiben. f) Bei 10.000 g für 10 Minuten zentrifugieren. Das Pellet auf ein sauberes Stück Filterpapier transferieren. Das Präzipitat ausbreiten und ihm erlauben, bei Raumtemperatur Luft zu trocknen. g) Nachdem das Pellet trocken ist, es in einen luftgeschlossenen Behälter transferieren. Jedes große Stück entfernen, was nicht in ein feines Pulver zerfällt. Trocknen (dessicate) und bei 4°C lagern. Die Ausbeute ist ungefähr 10 bis 20 % des ursprünglichen Feuchtgewichts. Um Acetonpulver zu verwenden, auf eine Endkonzentration von 1 % addieren. Für 30 Minuten bei 4°C inkubieren. Bei 10.000 g für 10 Minuten zentrifugieren (13.000 U/Minute in Biofuge).
5. DAB/H₂O₂/Imidazol: Peroxidase-Substrat: 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) (Sigma, Missouri). – 1 Tablette DAB (10 Minuten vor der Verwendung aus dem Kühlschrank nehmen) – 1 Tablette Harnstoff H₂O₂ (Sigma, Missouri) – zu 15 ml Tris HCL, pH 7,6 + 0,01 M Imidazol (0,0102 g), (Sigma, Missouri) addieren – unmittelbar vor der Verwendung herstellen.
6. Tris HCl: 1,211 g Tris in 200 ml zweifach destilliertem Wasser pH 7,6
7. Herkunft der Tiersera: Maus- und Kaninchen-Sera wurden im Haus erhalten (St. Vincent's Hospital, Department of Clinical Immunilogy). Schafserum wurde von der University of Melbourne Veterinary Clinic and Hospital, Werribee, Australia, erhalten.
8. Harns Haematoxylin:

Haematoxylin C.I. 75290 (BDII, Poole, U.D. #34037) 10 g

Absolutes Ethanol 200 ml

Kalziumalaun 200 g

zweifach destilliertes Wasser 2000 ml

Eisessig 80 ml

Herstellung: 1. Haematoxylin in absolutem Ethanol lösen 2. Erhitzen, um Alaun in zweifach destilliertem Wasser zu lösen 3. Lösung 1 und 2 mischen 4. Unmittelbar vor der Verwendung 80 ml 1 % Natriumjodat und 80 ml Eisessig addieren.
9. Scott's Leitungswassser (Scott's Tap Water)

Natriumhydrogencarbont 14 g

MgSO₄ 80 g

Leitungswasser 41

B. Methoden

1. 4 μm Ausschnitte des entsprechenden Gewebes am Cryostat schneiden
2. das Gewebe sollte frei von Brüchen sein
3. Objektträger für 30 Minuten lufttrocknen
4. 10 % Blockierpuffer bei Raumtemperatur in Feuchtkammer aufbringen, 60 Minuten
5. den Blockier-Antikörper mit feinem Papiertuch entfernen ("tissue made to fine point")
6. ersten Antikörper, anti-GAL, oder 2 % Blockier-Puffer als Kontrolle, 50 μl, aufbringen, sicherstellen, daß es keine Luftblasen gibt und bei Raumtemperatur in Feuchtkammer für 30 Minuten inkubieren.
7. mit Tris-gepufferter Saline (TBS) dreimal 2 Minuten abwaschen, 2-Minuten-Waschschritte
8. zweiten Antikörper 1:50 Peroxidase (POD)-konjugierter Kaninchen-antihuman-IgG und IgM (DAKO, Dänemark) aufbringen; 30 Minuten bei Raumtemperatur in Feuchtkammer inkubieren.
9. mit Tris-gepufferter Saline (TBS) dreimal abwaschen, 3 Minuten-Waschschritte
10. mit TBS wie oben abwaschen
11. DAB/H₂O₂/Imidazol für 10 Minuten inkubieren
12. in Wasser waschen
13. mit Haematoxylin C färben – 10 Sekunden
14. in Wasser waschen
15. in Scott's Leitungswasser (Scotts tap water) für 15 Sekunden geben
16. in Wasser waschen
17. in absolutem Alkohol (×3) (Univar 214, Ajax Chemicals) waschen
18. in absolutem Xylol (×3) (Univar 577, Ajax Chemicals) waschen
19. mit Deckgläschen abdecken unter der Verwendung einer automatischen Deckgläschen-Maschine (Tissue Tek)

Kontrollen:

1. Puffer allein + POD konjugierter Kaninchen-anti-human-IgM (negativ)
2. Puffer allein + POD konjugierter Kaninchen-anti-human-IgG (negativ)
3. humane Niere (negativ)
4. renaler Cortex, Schwein (positiv)

Proben:
C. Ergebnisse
Diese Ergebnisse zeigen an, daß humane anti-Gal IgG- und IgM-Antikörper Nierengewebe von α1,3-Galactosyltransferase-Gen-abgezielten (Gal KO)-Mäusen (Maus 21 und Maus 9) nicht binden. Dies bestätigt den Mangel an Galactose-α1,3-Galactose (GAL)-Epitop in den Gen-abgezielten (KO) Mäusen. Im Gegensatz dazu reagieren diese Antikörper stark mit dem Endothelium der Blutgefäße und den Glomeruli einer normalen Maus desselben Stammes (129).
V. IMMUNOHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG VON MAUSGEWEBEN UNTER DER VERWENDUNG VON IB₄-LECTIN
A. Reagenzien

1. Blockierpuffer: TBS + 2 % BSA + 10 % Schafserum
2. FITC-IB₄ (Sigma, Missouri, USA Nr. L-2895) 1 mg verdünnt in 1 ml HBBS, um die Stammlösung zu ergeben, danach auf Endvolumen von 20 μg/ml in TBS + 2 % BSA + 2 % Schafserum verdünnen
3. Peroxidase anti-FITC Boehringer anti-Fluorescein-POD Fab-Fragmente; 1:300 in 2 % Blockier-Puffer verdünnen
4. DAB/H₂O₂/Imidazol – siehe oben
5. Tris-HCl – siehe oben
6. Herkunft der Tiersera – siehe oben
7. Harns Haematoxylin – siehe oben
8. Scott's Leitungswasser – siehe oben

B. Methoden

1. Präparation von Ausschnitten; wie oben in Sektion 4B, Schritte 1 bis 7.
2. 50 μl FITC-konjugiertes IB4 (Sigma Nr. 1-2894) 20 μg/ml aufbringen, in einer Feuchtkammer für 30 Minuten inkubieren.
3. mit TBS waschen, 3 Minuten (×3)
4. 50 μl Peroxidase-konjugierte anti-FITC Fab-Fragmente (Boehringer Mannheim) aufbringen, verdünnt 1–3 mit TBS + 2 % BSA + 2 % Schafserum. Für 30 Minuten in Feuchtkammer inkubieren.
5. mit TBS waschen, 3 Minuten (×3).
6. für Mikroskopie vorbereiten, wie oben in Sektion IVB, Schritte 14–22.

Kontrollen
Proben 1. Experiment
Proben 2. Experiment
C. Ergebnisse Niere
Leber
Herz
Lunge
Diese Ergebnisse zeigen an, daß IB₄-Lectin nicht an Nieren-, Herz-, Leber- oder Lungengewebe von α1,3-Galactosyltransferase-Gen-abgezielten (Gal KO) homozygoten Mäusen (Maus 21 und Maus 9) bindet. Dies bestätigt den Mangel an Galactose-α1,3-Galactose (GAL)-Epitop in den Gen-abgezielten (KO) Mäusen. Im Gegensatz dazu reagieren diese Antikörper stark mit den Geweben einer normalen Maus und heterozygoten KO-Mäusen (Maus 129, Maus 6, Maus 7, Maus 19, Maus 20) desselben Stammes.
VI: RESISTENZ DER MILZZELLEN VON KNOCKOUT-MÄUSEN GEGENÜBER DER LYSE DURCH HUMANES SERUM
Die Lyse von Milzzellen durch humanes Serum wurde durch die Verwendung eines ⁵¹Chrom-Freisetzungsassays getestet. Siehe im allgemeinen Beispiel 4, oben.
A. Präparation von Maus-Splenocyten

– Shortman, K. J. et al., Immunological Methods. 1:273–287 (1972): – Milz sezieren, Beschädigung der äußeren Membranen vermeiden und vorsichtig Mesenteri- um-Gewebe und Fett entfernen. – in Petrischale mit 1 ml RPMI 1640 (Gibco BRL)/10 % Hitze-inaktiviertem fötalem Kalbserum (HI-FCS) geben. (Hitze-Inaktivierung = 40 Minuten bei 56°C). – vorsichtig Zellen in die Petrischale herausbringen, sammeln und zentrifugieren 500xg, 5 Minuten, 4°C. – RPMI/10% HIFCS entfernen, Zellen in 3 ml 0,9 % NH₄Cl(0,168M), unter der Verwendung einer Pasteur-Pipette vorsichtig resuspendieren (Pasteur-Pipetten oder Pipetten mit weiter Öffnung (wide-bore pipettes) für alle Resuspendierungs- und Transfer-Prozeduren verwenden.) – in 10 ml Röhrchen transferieren, mit 1 ml HIFCS unterschichten, auf Eis stehen lassen, 5 Minuten. – Überstand in sauberes Röhrchen transferieren, zentrifugieren 500xg, 7 Minuten, 4°C. – Überstand verwerfen, Zellen in 3 ml Tote Zellen-Entfernungspuffer resuspendieren, mit Pipette gut mischen. – durch Baumwollpfropf in Glaspipette passagieren (mit der Schwerkraft, nicht hindurchdrücken), Zellen in 10 ml Röhrchen sammeln. – Zellen mit 1 ml HI-FCS unterschichten. – zentrifugieren 500xg, 7 Minuten, 4°C. – Überstand entfernen, Zellen in 50 μl RPMI, 10 % HI-FCS resuspendieren. Zellen auf Eis lagern.

B. Präparation des Serums:

Human – Vollblut von einem Pool von normalen Spendern sammeln; Erlauben, bei Raumtemperatur für 2 Stunden zu stehen. Das Gerinnsel mit einem "Orange Stick" auswringen; zentrifugieren Serum entfernen und vereinigen. Die Hälfte bei –70°C in 3 ml Aliquoten (normales humanes Serum) lagern; die andere Hälfte Hitze-Inaktivieren, siehe unten.
Fötales Kalbserum – gekauft von Gibco BRL und bei –20°C aufbewahrt.

C. Zellen zählen:

1. 5 μl Zellen zu 95,0 μl RPMI, 10 % HI-FCS addieren
2. 10 μl Zellen entfernen, 10 μl Acridin Orange/EtBr-Lösung addieren (Lee, S. K. et al., Eur. J. Immunol. 1975 5 : 259–262)
3. Zellen zählen (lebensfähig = grün, tot = orange).
4. Zell-Viabilität sollte ungefähr 90–100 % sein.
5. Zellzahl berechnen.

D. ⁵¹Chrom-Markierung
Markieren:

Vereinigen:
– Zellen (2 × 10⁷)
– (⁵¹Cr) Natriumchromat in 0,9% NaCl-Lösung (das addierte Volumen hängt vom Zelltyp, wie oben angezeigt, und von der spezifischen Aktivität des (⁵¹Cr) Natriumchromats ab.)
– RPMI/2% HIFCS bis zu einer Gesamtmenge von 200μl

Bei 37° C für die oben angezeigte Zeit inkubieren, mit schonender Bewegung aller 15 Minuten.
E. Waschen

– 4 ml HI-FCS in 10 ml Röhrchen geben und vorsichtig die Markierungsreaktion mit einer wirbelnden Bewegung obenauf schichten; 5 Minuten zentrifugieren, 500 × g, 4°C.
– Die zwei oberen Schichten mit einer vorsichtigen kreisförmigen Bewegung unter der Verwendung einer Glaspipette entfernen.
– Zellen in 1 ml RPMI/2% HI-FCS resuspendieren
– Zellsuspension durch weitere 4 ml HI-FCS pelletieren
– Zellpellet in 1 ml RPMI/2% HI-FCS rsuspendieren, auf Eis aufbewahren.

F. Freisetzungsassay:

– Assay in 96-Well Mikrotiterplatte (ICN-FLOW) durchführen.
– Assay sollte in 4facher Ausfertigung angesetzt werden.
– Assay wird in einem Gesamtvolumen von 180 μl durchgeführt.

Assay:

*HI = Hitze inaktiviert

– Alle angezeigten Volumen sind in μl
– Reaktionskomponenten werden zu der Platte in der Reihenfolge RPMI, Serum und ⁵¹Cr-markierte Zellen addiert
– Platte mit Platten-Versiegler abdecken
– inkubieren, 4 Stunden, 37° C
– Platte zentrifugieren, 1500 U/Minute, 5 Minuten.
– Platten-Versiegler entfernen, 80 μl von jedem Well entfernen, freigesetztes Chrom am Gamma-Zähler zählen.
– Spezifische Lyse für jedes Well berechnen gemäß der Formel:

Mittlere- und Standardabweichung für jeden experimentellen Punkt berechnen. % humanes Serum (X-Achse) gegen % spezifische Lyse (Y-Achse) für jeden Zelltyp (Wildtyp, heterozygot KO und homozygot KO) graphisch darstellen.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 25 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen an, daß Milzzellen einer homozygoten Knockout-Maus relativ resistent sind gegenüber der Lyse durch humanes Serum im Vergleich zu Milzzellen, die von Mäusen, die heterozygot für das unterbrochene Allel sind, oder von Wildtyp-Mäusen abgeleitet sind.
BEISPIEL 16
Erzeugung von Knockout-Tieren durch Mikroinjektion von Eiern
Transgene Tiere werden routinemäßig durch Mikroinjektion von DNA in die Pronuclei von befruchteten Eiern erzeugt. Im Allgemeinen führt diese Technologie zur zufälligen Integration des Transgens in das Genom. Jedoch hat konventionelle transgene Technologie zur homologen Rekombination zwischen dem injizierten Transgen und dem endogenen Gen geführt. Siehe z.B. Brinster et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 1087–91 (1989). Unten sind Verfahren für die Inaktivierung des α-1,3-Gal T-Gens in Schweinen durch Mikroinjektion von Eiern mit Gen-abzielenden Konstrukten beschrieben.
I. GEN-ABZIELENDE KONSTRUKTE
Die Frequenz von homologer Rekombination in Embryos wird verbessert, wenn Gen-abzielende Konstrukte mit isogener DNA präpariert werden. Daher werden die „Knockout" Konstrukte aus DNA hergestellt, die aus dem Eber isoliert wurde, der für die Befruchtung der Oozyten verwendet wurde, die für die Mikroinjektion verwendet wurden. DNA wird aus dem Schwanz- oder Ohrgewebe isoliert und genomische Fragmente von beiden α-1,3-Gal T-Allelen des Ebers umfassend Exons 8 und 9 werden kloniert unter der Verwendung von Long Range-PCR oder konventionellen genomischen Bibliotheks-Methoden. Klone für jedes der α-1,3-Gal T-Allele werden identifiziert unter der Verwendung von Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus-Identifizierung und DNA-Sequenzierung. Konstrukte zum Abzielen auf beide Allele werden durch Unterbrechung der kodierenden Sequenz von Exon 9 hergestellt, entweder durch Deletion oder durch Insertion eines heterologen DNA-Fragments. Die Konstrukte beinhalten mindestens 8 kb homologer DNA, um effiziente homologe Rekombination zu fördern.
In Abhängigkeit von den Strategien, die beim Entwerfen der Knockout-Konstrukte verwendet wurden, können verschiedene Ansätze verwendet werden, um Gen-abzielende Ereignisse zur detektieren. Verschiedene solcher Ansätze und die korrespondierenden Strategien für die Konstruktion der Konstrukte werden unten zur Verfügung gestellt:
a) PCR von genomischer DNA:
Homologe DNA auf einer Seite des unterbrechenden DNA-Fragmentes ist konstruiert, daß sie kleiner als 1 kb ist, um PCR-Amplifizierung eines kleinen diagnostischen Fragments zu erlauben. (Die Amplifizierung von kleinen Fragmenten ist im Allgemeinen relativ effizient)
b) Reverse Transkription/PCR:
Eine Deletion von ungefähr 100 bp innerhalb Exon 9 wird gemacht, um die Synthese einer verkürzten α-1,3-GalT-mRNA in korrekt abgezielten Zellen zu erlauben. Die verkürzte mRNA wird durch RT/PCR detektiert, unter der Verwendung von Primern, die ein Fragment amplifizieren, das von Exon 8 verlängert wird und die Deletionsstelle umfaßt.
c) Expression von grünem fluoreszierendem Protein (GFP)-Gen:
GFP ist ein Protein der biolumineszierenden Qualle Aequorea victoria. Es absorbiert blaues Licht (395 nm) und fluoresziert, um grünes Licht zu emittieren (509 mm). GFP ist ein nützlicher Marker für Genexpression. Chafie et al., Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression. Science 263: 802–5 (1994). Das α-1,3-Gal T-Gen wird innerhalb Exon 9 durch im-Rahmen-Insertion der GFP-kodierenden Region unterbrochen. Expression des GFP-Gens (mit resultierender Fluoreszenz bei 509 nm) wird durch den α-1,3-Gal T-Gen-Promoter in korrekt abgezielten Zellen angetrieben.
II. ERZEUGUNG VON EMBRYOS FÜR MIKROINJEKTION
Befruchtete Embryos werden, wie von Nottle et al., (1993) Pro Aust Soc for Reproductive Biol 26, 33 beschrieben, erzeugt. Das Protokoll beinhaltet:

a) Sperma des Ebers, der DNA für das abzielende Konstrukt zur Verfügung gestellt hat, wird gesammelt und gefroren in flüssigem Stickstoff gelagert.
b) Superovulation von Donor-Jungsäuen: Jungsäue werden im zweiten Östrus gepaart und zwischen den Tagen 25–40 der Schwangerschaft abgetrieben, um die nachfolgenden Östrus-Zyklen zu synchronisieren. Die Abtreibung wird durch intramuskulare Injektion von 1 mg Cloprostenol (ein Prostaglandin-F2 α-Analogon) gefolgt durch eine zweite 0,5 mg Injektion 24 Stunden später erreicht. Jungsäue werden superovuliert durch Injektion von 1000 i.u. pferdeartigem Choriongonadotropin (eCG) oder Gonadotropin von schwangeren Stutenserum zum Zeitpunkt der zweiten Clopro stenol-Injektion und einer nachfolgenden Injektion, 72 Stunden später, von 500 i.u. humanem Choriongonadotropin (hCG).
c) Fertilisation: Superovulierte Jungsäue werden 20–30 Stunden nach der hCG-Injektion künstlich befruchtet gefolgt durch eine zweite Befruchtung 2–4 Stunden später, mit Samen des Ebers, der die DNA für die abzielenden Konstrukte zur Verfügung gestellt hat.
d) Embryo-Kollektion: Embryos werden operativ 50–56 Stunden nach der hCG-Injektion vor der Fusion der Pronuclei gesammelt. Eileiter werden mit 15–20 ml Phosphat-Saline-Puffer, enthaltend 1 % fötales Kalbserum, gespült. Einzellige Embryos werden zurückbehalten/entdeckt, indem die Eileiter-Spüllösungen mittels Mikroskopie mit geringer Vergrößerung untersucht werden.

III. MIKROINJEKTION VON EMBRYOS
Embryos werden bei 12000 × g für 8 Minuten zentrifugiert, um das Cytoplasma zu schichten und den Pronuclei zu erlauben, sichtbar zuwerden, und in Dulbeccos's minimalem essentiellen Medium mit 25 mM Hepes und 5 mg/ml Rinderserumalbumin aufbewahrt. Pronuclei werden injiziert unter der Verwendung von Differential-Interferenz-Kontrastoptik (differential interference contrast optics) mit 4–10 picoliter DNA (10 ng/μl) in PBS. Gen-Abbzielung mit isogener DNA wird durch Co-injizieren beider Konstrukte, die von dem Eber abgeleitet sind, in den männlichen Pronucleus maximiert.
IV. TRANSFER VON INJIZIERTEN EMBRYOS IN DIE EMPFÄNGER-JUNGSÄUE
Die Östrus-Zyklen der Empfänger-Jungsäue werden mit denen der Donoren synchronisiert. Die Empfänger werden gepaart und abgetrieben unter der Verwendung des oben beschriebenen Protokolls und mit 500 i.u. eCG injiziert. Injizierte Embryos werden operativ (20–40 pro Eileiter) in die Empfänger an dem selben Tag, an dem sie von den Donor-Jungsäuen gesammelt wurden, transferiert.
V. SCREENING FÜR HOMOLOGE REKOMBINATION
Homologe Rekombinanten können durch die Analyse des Gewebes von geborenen Ferkeln detektiert werden. Screening-Prozeduren beinhalten PCR-Technologie, wobei die genaue Strategie vom Design des Gen-abzielenden Konstrukts abhängt. Weil viele α-1,3-Gal T-mRNA-Moleküle aus einem einzelnen α-1,3-Gal T-Gen in exprimierenden Zellen synthetisiert werden, kann der RT/PCR-Anzsatz sensitiver sein als PCT-Amplifizierung genomischer DNA. Die RT/PCR-Screening-Strategie ist angewiesen auf eine erfolgreiche Transkription des unterbrochenen Gens und die relative Stabilität der verkürzten mRNA.
Alternativ dazu erlauben Konstrukte, die die Expression der hetrologen Gene (z.B. GFP) in korrekt abgezielten Zellen fördern, das Embryos im Blastocyst-Stadium auf Markergen-Expression untersucht werden (d.h. GFP-Expression kann durch Messung der Fluoreszenz innerhalb der Blastocysten bei 509 nm detektiert werden). Die mikroinjizierten Embryos werden in vitro kultiviert bis zur Blastocysten-Entwicklung, auf Fluoreszenz untersucht und fluoreszierende Embryos werden in die Empfänger transferiert.
BEISPIEL 17
Eine neue Variante von Leukämie-inhibierendem Faktor (LIF)
Bisherige Berichte haben die Existenz von zwei Formen des murinen LIF demonstriert. Die originale Form (vom D-Transkript) wurde exprimiert und von der AMRAD Corporation LTD (Kew Victoria, Australia) kommerzialisiert. Das Proteinprodukt, das von diesem Transkript abgeleitet wird (hierin danach „D-LIF") wird kommerziell durch AMRAD als „ESGRO^TM" verkauft. Eine andere Form von LIF (hierin danach „M-LIF"), abgeleitet von einem alternativen Transkrip, wird in US Patentanmeldung Nr. 07/994,099 und in Rathjen et al., Cell 62: 1105–14 (1990) beschrieben. Die vorliegenden Erfinder haben nun ein drittes Transkript von LIF (hierin danach „T-LIF") gefunden, welches in ES-Zellen und in humanen Teratokarzinom-abgeleiteten Zelllinien, wie z.B. den GCT 27 Teratokarzinom-abgeleiteten Zelllinien, die von Pera et al., Differentiation 42: 10 (1989) beschrieben sind, gefunden wird.
Das T-LIF protein wird intrazellulär gefunden im Gegensatz zu den anderen beiden Formen von LIF, welche beide extrazellulär sind. Das Transkript wurde unter der Verwendung der RACE-PCR-Technik (siehe unten) aus murinen ES-Zellen und humanen GCT 27 Teratokarzinom-abgeleiteten-Zelllinien kloniert und unter der Verwendung von Standard-Methoden sequenziert. Die Anwesenheit des T-LIF-Transkripts wurde durch PCR-Analyse von ES-Zell- mRNA und RNase-Schutz von GCT27-RNA bestätigt. Das Transkript umfaßt ein neues erstes Exon, das sich im ersten Intron des LES-Gens befindet und an die bekannten Exon 2- und Exon 3-Sequenzen gespleißt ist. Die Maus-Nukleotidsequenz (SEQ. ID. NO. 27) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NO. 26) sind in 26 dargestellt. Die humane Nukleotidsequenz (SEQ. ID. NO. 31) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ. ID. NO. 32) sind in 27 dargestellt.
Wenn das murine T-LIF-Transkript in einem COS-Zell-Expressionssystem expremiert wird, produziert es ein 17kD-Protein, das nicht glycosiliert ist (D-LIF ist glycosyliert im Golgi während des Sekretionsprozesses) (28). Die Translation von T-LIF startet am ersten im-Rahmen-Startcodon (ATG) in Exon 2, um ein Protein von 158 Aminosäuren zu produzieren. Das Protein ist 45 Aminosäuren kürzer als das unprozessierte D-LIF Protein und 22 Aminosäuren kürzer als das reife D-LIF-Produkt, das durch die Spaltung der Signalsequenz erzeugt wird. Da das 7-LIF-Protein keine Signalsequenz besitzt, verläßt es die Zelle nicht und ist nicht glycosyliert. Die T-Form von LIF ist wirksam bei der Verhinderung der Differenzierung von ES-Zellen in Kultur.
METHODEN
RACE cDNA-Klonierung
Cytoplasmatische RNA (10 μg) von CP1 murinen ES-Zellen (Bradley et al., Nature 309: 255–56 (1984)) wurde revers transkribiert von dem Oligonucleotid 5'ACACGGTACTTGTTGCA-3' (SEQ. ID. NO. 27), welches an die Reste von 500-484 der murinen LIF-cDNA hybridisiert. Die RNA wurde zu 20 pmol des Primers und 2 μl 10x Anlagerungspuffer (500 mM Tris-HCl (pH 8,0), 60 mM MgCl₂, 400 mM KCl) in einem Gesamtvolumen von 16 μl addiert, auf 85°C für 5 Minuten erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Verlängerungsreaktion wurde, wie von Frohman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998–9002 (1988)) beschrieben, durchgeführt. Überschuß Oligonukleotid wurde durch Gelfiltration durch eine 2 ml Sephacryl S-400 (Pharmacia)-Säule, equilibriert mit 0,05 × TE (TE = 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1,0 mM EDTA) entfernt. Fraktionen von 50 μl, korrespondierend zum cDNA radioaktiven Peak, wurden zusammengeführt, durch Vakuumzentrifugation konzentriert und in 23 μl H₂O resuspendiert. Für Tailing des 3'-Endes der cDNA mit dG-Resten wurden 3 μl 10 mM dGTP und 6 μl 5 × Tailing-Puffer (Bethesda Research Laboratories) addiert und die Mischung wurde bei 37°C für 60 Minuten und danach bei 70°C für 15 Minuten inkubiert. Nach der Ethanol-Präzipitation wurde das cDNA-Templat in 500 μl H₂O resuspendiert.
PCR wurde mittels eines Maus-LIF-spezifischen Oligonukleotids, 5'-TTCTGGTCCCGGGTGATATTGGTCA-3' (Reste 389–365) (SEQ. ID. NO. 28) und eines Anker-Oligonukleotids, 5'-CCATGGCCTCGAGGGCCCCCCCCCCCCCC-3' (SEQ. ID. NO. 29) durchgeführt. Die PCR wurde in einem Endvolumen von 50 μl enthaltend 7 μl des cDNA-Templats und 34 pmol von jedem Oligonucleotid durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren wie von Perkin-Elmer Cetus empfohlen, mit einer Endkonzentration von 1,5 mM MgCl₂. Die DNA wurde vor der Addition von Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus) durch Erhitzen der Reaktionsmischung auf 94°C für 5 Minuten denaturiert. Jeder PCR-Zyklus (insgesamt 35) bestand aus Denaturierung für 2 Minuten bei 94°C, Anlagerung (annealing) für 2 Minuten bei 55°C und Verlängerung für 3 Minuten bei 72°C. Nach der finalen Verlängerung (30 Minuten bei 72°C) wurden die Proben mit Ethanol präzipitiert, mit SmaI und XhoI verdaut und durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Die DNA wurde aus Agarosegelen unter der Verwendung von Genclean gereinigt und in SalI- und SmaI-verdauten TST7 19U (Stratagene) kloniert. Geeignete rekombinante Plasmide wurden durch die schnelle Kochmethode (rapid boiling method) gereinigt.
Doppelstrang-Sequenzierung wurde mit Sequenase Version 2.0 (USB) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
BIOLOGISCHER ASSAY FÜR LIF-AKTIVITÄT
Eine undifferenzierte murine ES-Zellkultur (MBL5; Pease et al., Dev. Biol. 141: 344–52 (1990), zwischen Passagen 15 und 30) wird trypsiniert und daraus eine Einzelzell-Suspension gemacht. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und in komplettes ES-Zellmedium ohne LIF (DMEM (ohne Hepes), 10% FCS, 1mM βME, 1 mM Glutamin) resuspendiert. Die Zellen werden danach auf 24-Well Microtiterplatten bei 5×10² Zellen/16 mm Well enthaltend 1 ml von ES-Zellmedium ohne LIF, ausgesät.
Der vollständige offene Leserahmen von T-LIF wurde aus dem PCR-Produkt wiederhergestellt und in den COS-Zell-Expressionsvektor pXMT2 inseriert, wie von Rathjen et al., Cell 62: 1105–14 (1990) beschrieben. Das Plasmid, das für die Transfektion von COS-Zellen ver wendet wurde, ist in 29 gezeigt. Die COS-Zellen werden durch Elektroporation transfiziert. Überstände von COS-Zellen, die T-LIF exprimieren, wurden zu den obigen ES-Zellen in verschiedenen Verdünnungen (1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:50, 1:1000) addiert und für 4 Tage in einem Inkubator mit 10% CO₂ inkubiert. Die Kontrollen verwendeten Überstände von COS-Zellen, die D-LIF exprimieren (pDR1, Rathjen et al., Cell 62: 1105–14 (1990)).
LIF-Aktivität wird auf Anwesenheit untersucht, wenn die Zellen nach 4 Tagen morphologisch ES-Zellen gleichen und verschieden zu den Kontrollen sind, die ohne eine Form von LIF inkubiert wurden. Die ES-Zellen werden auch auf alkaline Phosphatase gefärbt, da differenziert ES-Zellen positiv für diesen Marker sind.
Obwohl T-LIF intrazellulär produziert wird, lysieren eine ausreichende Zahl von Zellen, um signifikante Mengen von LIF-Aktivität in den Kulturüberstand abzugeben. Wenn die COS-Zellen, die T-LIF exprimieren, lysiert werden, wird mehr LIF-Aktivität freigesetzt.
PCR-DETEKTION DES T-LIF-TRANSKRIPTS
PCR wurde an ES-Zell-cDNA durchgeführt (präpariert, wie oben beschrieben, außer daß die cDNA nicht mit dG „getailt" wurde). PCR-Bedingungen sind, wie oben beschrieben, außer daß 2 mM MgCl₂ in den Reaktionen verwendet wurde. Die Oligonukleotide 5'-CACCTTTCGCTTTCCT-3' (SEQ. ID. NO. 30) und 5'-TTCTGGTCCCGGGTGATATTGGTCA-3' (SEQ. ID. NO. 28) wurden bei 80 pico-gram/Reaktion verwendet. Die Produkte der PCR-Reaktion wurden mit Ethanol präzipitiert, wie oben beschrieben, elektrophoretisch auf einem 2% Agarosegel separiert und auf eine Nylonmembran zur Detektion mittels Southern Hybridisierung transferiert (30). Die Sonde war das Vollängen-D-LIF-Transkript, isoliert von pDR1 (Rathjen et al., Cell 62: 1105–14 (1990). Das Kontrollexperiment ist angelegt, um alle LIF-Transkripte unter der Verwendung der internen Primer 5'-TTCTGGTCCCGGGTGATATTGGTCA-3' (SEQ. ID. NO. 28) und 5'-CTGTTGGTTCTGCACTGGA-3' (SEQ. ID. NO. 33) zu detektieren.

Claims

DNA-Konstrukt, das zum Inaktivieren des α-1,3-Galactosyltransferase-Gens von Schweinen durch Insertion einer erwünschten DNA-Sequenz in eine Insertionsstelle besagten Gens nützlich ist, umfassend besagte erwünschte DNA-Sequenz, die von ersten und zweiten Homologie-Sequenzen flankiert wird, wobei besagte erste bzw. zweite Homologie-Sequenz zu ersten und zweiten genomischen Sequenzen hinreichend homolog ist, die besagte Insertionsstelle flankieren, um eine homologe Rekombination besagten DNA-Konstrukts mit besagtem α-1,3-Galactosyltransferase-Gen aus dem Schwein zu ermöglichen, wenn besagtes DNA-Konstrukt in eine Schweinezelle mit besagtem α-1,3-Galactosyltransferase-Gen eingeführt wird.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei besagte Insertionsstelle innerhalb von Exon 4, Exon 7, Exon 8 oder Exon 9 des α-1,3-Galactosyltransferase-Gens von Schweinen ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei besagte erwünschte DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem neo^R-Gen, dem hyg^R-Gen und dem Thymidinkinase-Gen.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 3, wobei besagte erwünschte DNA-Sequenz an dem 5'- und 3'-Ende von FRT-DNA-Elementen eingegrenzt wird, und wobei Stop-Codons für jedes der drei Leseraster 3' zu der erwünschten DNA-Sequenz inseriert worden sind.
Verfahren zum Erzeugen einer nicht-humanen totipotenten Säugetierzelle mit wenigstens einem inaktivierten α-1,3-Galactosyltransferase-Allel, wobei besagte totipotente Zelle aus einer nicht-humanen Säugetierspezies mit einem funktionellen α-1,3-Galactosyltransferase-Gen stammt, umfassend: (a) Bereitstellen einer Vielzahl von Zellen, die als totipotente Zellen besagter nicht-humaner Säugetierspezies charakterisiert sind; (b) Einführen eines Nukleinsäurekonstrukts in besagte totipotente Zellen, das wirksam ist, um besagtes α-1,3-Galactosyltransferase-Gen durch Insertion einer erwünschten DNA- Sequenz in eine Insertionsstelle besagten Gens durch homologe Rekombination zu inaktivieren; (c) Identifizieren einer totipotenten Zelle mit wenigstens einem inaktivierten α-1,3-Galactosyltransferase-Allel.
Verfahren nach Anspruch 5, in dem besagte totipotente Zelle eine ES-Zelle aus einem Schwein ist.
Verfahren nach Anspruch 5, in dem besagte totipotente Zelle eine PGC aus einem Schwein ist.
Verfahren nach Anspruch 5, in dem besagte totipotente Zelle eine Eizelle aus einem Schwein ist.
Verfahren zum Erzeugen eines nicht-humanen Säugetiers, dem ein funktionelles α-1,3-Galactosyltransferase-Gen fehlt, wobei besagtes nicht-humane Säugetier zu einer Spezies mit einem funktionellen α-1,3-Galactosyltransferase-Gen gehört, umfassend: (a) Bereitstellen einer nicht-humanen totipotenten Säugetierzelle mit wenigstens einem inaktivierten α-1,3-Galactosyltransferase-Allel, wobei besagte totipotente Zelle aus einer nicht-humanen Säugetierspezies mit einem funktionellen α-1,3-Galactosyltransferase-Gen stammt; (b) Manipulieren besagter totipotenter Zelle, so daß Mitose-Abkömmlinge besagter Zelle den gesamten sich entwickelnden Embryo oder einen Teil davon ausmachen; (c) Gewinnen eines Neugeborenen, das aus besagtem Embryo stammt; und (d) Aufziehen und Züchten von besagtem Neugeborenen, um ein nicht-humanes Säugetier zu erhalten, das für besagtes inaktiviertes α-1,3-Galactosyltransferase-Allel homozygot ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei besagte totipotente Zelle eine ES-Zelle aus einem Schwein ist und besagtes Manipulieren das Injizieren besagter ES-Zelle in die Blastocystenhöhle einer Schweine-Blastocyste und Implantieren besagter injizierter Blastocyste in ein weibliches Empfängerschwein umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei besagte totipotente Zelle eine ES-Zelle aus einem Schwein ist und besagtes Manipulieren das Injizieren besagter ES-Zelle in eine Schweine-Morula umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei besagte totipotente Zelle eine ES-Zelle aus einem Schwein ist und besagtes Manipulieren ein Kultivieren besagter ES-Zelle zusammen mit einer Schweine-Morula mit zerstörter Zona Pellucida umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei besagte totipotente Zelle eine ES-Zelle aus einem Schwein ist und besagtes Manipulieren das Fusionieren besagter ES-Zelle mit einer entkernten Schweine-Zygote umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei besagte totipotente Zelle eine Eizelle aus einem Schwein ist und besagtes Manipulieren das Implantieren besagter Eizelle in ein weibliches Empfängerschwein umfaßt.
Nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles α-1,3-Galactosyltransferase-Gen fehlt, wobei besagtes Säugetier zu einer Spezies mit einem funktionellen α-1,3-Galactosyltransferase-Gen gehört, wobei besagtes nicht-humane Säugetier durch das Verfahren nach Anspruch 9 erzeugt worden ist.
Nicht-humanes Säugetier nach Anspruch 15, wobei besagtes Säugetier ein Schwein ist.
Nicht-natürlich-vorkommendes, nicht-humanes Säugetier, dem ein funktionelles α-1,3-Galactosyltransferase-Gen fehlt, wobei besagtes nicht-humane Säugetier zu einer Spezies mit einem funktionellen α-1,3-Galactosyltransferase-Gen gehört.
Säugetier nach Anspruch 17, wobei besagtes Säugetier ein Schwein ist.