DE69832883T2

DE69832883T2 - Transgene schweine

Info

Publication number: DE69832883T2
Application number: DE69832883T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tsukuba-shi MURAKAMI; Tatsuya Tsukuba-shi FUJIMURA; Yoichi Tsukuba-shi TAKAHAGI; Koji Tsukuba-shi TOYOMURA; Tamotsu Tsukuba-shi SHIGEHISA
Original assignee: Nippon Meat Packers Inc
Current assignee: NH Foods Ltd
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: EP1004238B1; ATE313256T1; EP1004238A4; WO1999003336A1; US6825395B1; DE69832883D1; AU7935598A; CA2297105A1; EP1004238A1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung stellt transgene Schweine bereit. Insbesondere stellt die Erfindung die transgenen Schweine bereit, welche das menschliche Komplement-Inhibitor-(hDAF/CD55)-Gen tragen. Genauer stellt die Erfindung Haus- und Versuchstiere bereit, welche das hDAF-Gen tragen.
Hintergrund der Erfindung
Vor kurzem sind hauptsächlich in Europäischen Ländern und in den Vereinigten Staaten Studien zur Tier-zu-Mensch-Organtransplantation (Xenotransplantation) durchgeführt worden. Wegen der engen Verwandtschaft mit Menschen können Menschenaffen bevorzugte Spender sein, aber die Verwendung ihrer Organe kann aufgrund der Knappheit dieser Tiere und ihrer hohen Intelligenz inpraktikabel sein. Jedoch weisen Haustiere, insbesondere Schweine, die Vorteile auf, daß die Größe und Form ihre Organe denen des Menschen ähnlich sind, daß sie aufgrund Massenaufzucht leicht verfügbar sind und daß etablierte elementare Techniken zur Verfügung stehen. Folglich ist vorwiegend die Organtransplantation vom Schwein zum Menschen untersucht worden.
Falls ein Schweineorgan in einen Menschen transplantiert wird, wird es sofort (innerhalb von Minuten) und heftig abgestoßen (hyperakute Abstoßung), was den Verlust seiner Funktionen zur Folge hat.
Man nimmt an, daß diese Phänomene durch eine Reihe von Reaktionen hervorgerufen werden: (1) Menschliches Blut enthält endogene Antikörper, welche gegen Schweinezellen gerichtet sind (bezeichnet als natürliche Antikörper). Falls ein Schweineorgan in einen Menschen transplantiert wird, erkennen diese Antikörper das Schweineorgan und bilden Antigen-Antikörper-Komplexe. (2) Die Antigen-Antikörper-Komplexe aktivieren das Komplement im menschlichen Serum und lösen die Komplement-Kaskadenreaktion aus. Die Anlagerung von C1 an die Antigen-Anti körper-Komplexe löst Reaktionen von C4 und C2 aus, woraus die Bildung der C3-Konvertase resultiert, welche C3 aktiviert und in C3b und C3a spaltet. Die Anlagerung von C3b an die Zelloberfläche des Schweineorgans resultiert in der Bildung der C5-Konvertase, welche C5 aktiviert und in C5b und C5a spaltet. Die Anlagerung von C5b an die Zelloberfläche hat die aufeinanderfolgenden Anlagerungen von C6, C7, C8 und C9 zur Folge. (3) Als Folge der Komplement-Kaskadenreaktion wird der Membranangriffskomplex (MAC) gebildet (bezeichnet als der klassische Komplementweg). Der MAC lagert sich an das transplantierte Organ an und ruft eine Thrombose hervor. (4) Der alternative Komplementweg löst nach dem C3-Schritt bekanntermaßen dieselbe Kaskadenreaktion, wie vorstehend beschrieben, und schließlich die Bildung des MAC's aus.
Miyagawa S. et al. (Transplantation, Bd. 46 (6), 825–830, 1988) berichteten das Folgende: (1) die Komplement-Kaskadenreaktion löste eine hyperakute Abstoßung von Xenograften über den klassischen und/oder alternativen Weg aus; (2) keine hyperakute Abstoßung trat auf, wenn die Empfänger vorher mit CVF (dem Kobragift-Faktor) behandelt worden waren, um einen Entzug von C3 zu bewirken. Aufgrund solcher Erkenntnisse war es lange wünschenswert, transgene Tiere zu erzeugen, welche einen membrangebundenen DAF und/oder MCP exprimieren, insbesondere solche, welche zu der Empfängerspezies homolog sind, welche die Kaskadenreaktion bei dem C3-Schritt inhibieren können.
Es ist versucht worden, transgene Schweine zu erzeugen, welche den Komplement-Inhibitor hDAF (CD55) exprimieren, um die menschliche C3-Konvertase in den Schweineorganen abzubauen (Rosengard A. M. et al., Transplantation, Bd. 59 (9), 1325–1333, 1995; Byrne G. et al., Transplantation Proceedings, Bd. 28 (2), 759, 1996).
Jedoch ist niemals aufgeklärt worden, ob diese transgenen Schweine die hyperakute Abstoßung vollständig unterdrücken. Daher sollten Fragen wie die folgenden beantwortet werden: 1) Exprimieren diese transgenen Schweine ausreichende Mengen an hDAF in den Zielorganen? 2) Ist es. notwendig, irgendwelche anderen Komplement-Inhibitoren zu coexprimieren? 3) Ist es überflüssig, ein Zucker-Transferase-Gen zu exprimieren, um das Antigen (Zuckerketten-Antigen) zu verringern, welches auf den Schweinezellen exprimiert wird und an das menschliche natürliche Antikörper binden? 4) Ist es überflüssig, das vorstehend beschriebene Gen und andere Gene, welche das einer Thrombose vorbeugende Protein und dergleichen codieren, zu coexprimieren? Folglich müssen noch viele Probleme gelöst werden, um die hyperakute Abstoßung zu überwinden.
Um diese Probleme zu lösen, ist es dringend erforderlich, Schweine und/oder andere kleine Versuchtiere, welche einfacher als Schweine gehandhabt werden können, zu erzeugen und diese Tiere unter verschiedenen Gesichtspunkten zu untersuchen. Insbesondere, um Studien auf diesem Gebiet durchzuführen und/oder um klinische Anwendungen zu entwickeln, ist es vorteilhaft, transgene Schweine und/oder kleine, einfach zu handhabende Versuchstiere zu erzeugen, deren Gewebe und Organe hDAF in Mengen exprimieren, welche mindestens so hoch oder größer als die in einem Menschen exprimierten Mengen sind.
Daher ist versucht worden, transgene Schweine zu erzeugen, welche die menschlichen Komplement-Inhibitoren, wie vorstehend beschrieben, exprimieren. Die Expression wurde durch Methoden wie die folgenden untersucht: (1) eine immunhistologische in-vitro-Untersuchung, (2) eine ex-vivo-Untersuchung, indem die Gewebe eines transgenen Schweins direkt mit menschlichem Blut in Kontakt belassen werden, oder (3) eine in-vivo-Untersuchung durch Transplantieren der Gewebe eines transgenen Schweins in Primaten. Anhand der ex-vivo- und in-vitro-Untersuchungen wurde bestätigt, daß die Gewebe aus den transgenen Schweinen [–] überlebten und [länger] funktionsfähig waren als solche aus nichttransgenen Schweinen.
Jedoch ist nicht notwendigerweise aufgeklärt worden, ob die Mengen der menschlichen Komplement-Inhibitoren, welche in den Geweben des transgenen Schweins exprimiert werden, zumindest äquivalent zu oder größer als die in einem Menschen exprimierten Mengen waren.
Um transgene Schweine zu erzeugen, welche die menschlichen Komplement-Inhibitoren exprimieren, sind die folgenden als Promotoren für Transgene beschrieben worden: (1) der nicht von Schweinen abstammende Promotor (Langford G. A. et al., Transplant. Proc. 26 (1994), 1400; Fodor W. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 11153–11157; Byrne G. W. et al., Transplantation 63 (1997), 149–155) und/oder (2) der mit Molekülen, welche im gesamten Körper von Tieren verteilt sind (z.B. beta-Aktin, H2K^b), in Beziehung stehende Promotor.
Transgene Mäuse, welche ein hDAF exprimieren, sind ebenfalls erzeugt worden (Cary N. et al., Transplant. Proc., Bd. 25 (1), 400–401, 1993; Kagan D. et al., Transplant. Proc., Bd. 26 (3), 1242, 1994). Die Regionen und die Mengen an hDAF, welche in diesen transgenen Mäusen exprimiert werden, variierten jedoch von Bericht zu Bericht. Genaugenommen ist niemals eine transgene Maus erzeugt worden, welche den menschlichen Komplement-Inhibitor in dem vorgesehenen Organ, damit es ausgebildet wird (insbesondere vaskuläre Endothelzellen), in einer Menge exprimiert, welche größer als die in dem menschlichen Organ exprimierte Menge ist.
Um die vorstehenden Probleme zu lösen, haben die hierin genannten Erfinder transgene Schweine erzeugt, welche einen oder mehrere Komplement-Inhibitoren in den vorgesehenen Organen, Geweben und Zellen, insbesondere in den vaskulären Endothelzellen, in denen die Komplement-Inhibitoren im Wesentlichen exprimiert werden sollen, exprimieren. Den Erfindern gelang die Erzeugung von transgenen Tieren, welche diesen Zwecken genügen, mit dem Promotor des Schweine-Komplement-Inhibitor-(pMCP)-Gens, welcher bereits durch die Erfinder entwickelt wurde (vgl. Japanische Patentanmeldung Nr. 142961/1997), durch Einführen des Transgens, welches konstruiert wurde, um den einen oder die Komplement-Inhibitoren in den vorgesehenen Organen, Geweben und Zellen, insbesondere in den vaskulären Endothelzellen, in denen die Komplement-Inhibitoren im Wesentlichen exprimiert werden sollen, zu exprimieren, in befruchtete Eier der Tiere, Einpflanzen der Eier in den Uterus von Empfängertieren und Erhalten der Jungen.
Die nachstehend beschriebenen Beispiele zeigen, daß die transgenen Mäuse den hDAF in verschiedenen Organen, Geweben, Endothelzellen, Erythrocyten sowie zentralen und peripheren Nerven in Mengen exprimierten, welche größer als die in menschlichen Zellen exprimierten Mengen waren. Außerdem wurde die Expression von hDAF in den Erythrocyten und den Nerven der transgenen Schweine der Erfindung bestätigt.
Diese Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnisse vollendet. Der Zweck der Erfindung war die Bereitstellung von transgenen Tieren, welche auf den Gebieten der Medizin und der Pharmakologie nützlich sind.
EP-A1 0 940 467 beschreibt viele Varianten von Schweine-MCP-Gen-Promotoren, welche in vitro in der Expression eines menschlichen DAF in Schweineendothelzellen in Kultur wirksam sind. In Übereinstimmung mit der Lehre von EP-A1 0 940 467 wurde erwartet, daß eine 5,4 kb- sowie eine 0,9 kb-Variante der MPCP-Promotoren bei der Erzeugung von transgenen Tieren nützlich sein können.
Offenbarung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Schweine, welche das menschliche Komplement-Inhibitor-(DAF/CD55)-Gen tragen und den Inhibitor in ihren Organen und Geweben exprimieren. Insbesondere tragen die erfindungsgemäßen transgenen Schweine das Gen des menschlichen Komplement-Inhibitors (DAF/CD55) und einen Promotor des Schweine-Komplement-Inhibitor-(pMCP)-Gens in einem stromaufwärts des menschlichen Komplement-Inhibitor-(DAF/CD55)-Gens gelegenen Lokus, wobei der Promotor ein 0,9 kb-Promotor ist, welcher die Sequenz von Base 4498 bis Base 5397 von SEQ ID NO: 1 umfaßt. Die Erfindung betrifft außerdem transgene Schweine, welche das menschliche Komplement-Inhibitor-(DAF/CD55)-Gen in ihren vaskulären Endothelzellen von Organen und/oder Geweben des gesamten Körpers exprimieren.
Die transgenen Schweine dieser Erfindung sind als Haus- und Versuchstiere nützlich.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 veranschaulicht die Struktur des Transgens, welches einen pMCP-Promotor (5,4 kb) und die hDAF-cDNA umfaßt.
2 veranschaulicht die Struktur des Transgens, welches einen pMCP-Promotor (0,9 kb) und die hDAF-cDNA umfaßt.
3 veranschaulicht die Struktur des zum Vergleich verwendeten Transgens, welches den hDAF-Promotor und die hDAF-cDNA umfaßt.
4 zeigt die PCR-Profile, welche durch Untersuchen der transgenen und der nichttransgenen Säugetiere mit hDAF-cDNA-spezifischen Primern erhalten wurden.
Die Bahnen (1) und (3) von 4 zeigen die PCR-Profile des Schweins bzw. der Maus, welche bezüglich der hDAF-cDNA positiv sind. Die Bahnen (2) und (4) zeigen diejenigen für ein Schwein bzw. eine Maus aus dem gleichen Wurf, welche bezüglich der hDAF-cDNA negativ sind.
5 zeigt die Expression der mRNA von hDAF in verschiedenen Organen einer TgF1-Maus, einer für Vergleichszwecke erzeugten transgenen Maus und einer normalen Maus (nichttransgenen Maus).
Die Expression der mRNA in verschiedenen Organen der TgF1-Maus ist in 5(A) gezeigt; diejenige der transgenen Maus für Vergleichszwecke (erzeugt durch Einführen von Transgen (3), umfassend den hDAF-Promotor und die hDAF-cDNA) (vgl. 3) ist in 5(B) gezeigt; diejenige der nichttransgenen Maus ist in 5(C) gezeigt; und diejenige von menschlichen Lymphocyten (K562) ist auf der rechten Seite von 5(C) gezeigt. B, H, K, Li, Lu, S und T in jeder Figur stehen für das Gehirn, das Herz, die Niere, die Leber, die Lunge, die Milz bzw. die Hoden.
6 zeigt FACS-Analyse-Profile, welche durch die Behandlung von Erythrocyten aus einem transgenen Schwein und einem nichttransgenen Schwein aus dem gleichen Wurf mit monoclonalen anti-hDAF-Antikörpern erhalten wurden. 6(A) zeigt, daß die Erythrocyten aus dem transgenen Schwein hDAF exprimierten, während 6(B) zeigt, daß diejenigen aus einem nichttransgenen Schwein aus dem gleichen Wurf keine Expression zeigten.
7 zeigt Hämolyse-Profile, welche durch die Behandlung von Erythrocyten aus den transgenen (•) und normalen (
) Tieren mit menschlichem Serum erhalten wurden. Die Figuren (a) und (b) zeigen die Hämolyse-Profile der Mäuse- bzw. der Schweine-Erythrocyten. Die horizontalen und die vertikalen Achsen der Figuren geben die Komplement-Konzentration in dem menschlichen Serum bzw. den Grad der Hämolyse an.
Beste Art und Weise für die Anwendung der Erfindung
Wie vorstehend beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung nichtmenschliche, transgene Schweine bereit, welche den menschlichen Komplement-Inhibitor (nachstehend bezeichnet als hDAF) tragen und den Inhibitor in ihren Organen und Geweben, insbesondere in den vaskulären Endothelzellen, exprimieren.
Die erfindungsgemäßen transgenen Schweine können durch die folgenden Verfahren erzeugt werden:
Zuerst wird ein Transgen hergestellt, indem ein Promotor mit der hDAF-cDNA verknüpft wird. Ein Teil eines geeigneten Vektors (z.B. der pGL-3-Basisvektor, pBluescript und dergleichen) wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen ausgeschnitten, und die Enden des gespaltenen Vektors werden verkürzt.
Die den hDAF codierende Basensequenz wird aus der hDAF-cDNA (vgl. zum Beispiel Medof M. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2007) an einem stromaufwärts des Initiationscodons gelegenen Lokus und an einem stromabwärts des Terminationscodons gelegenen Lokus mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen ausgeschnitten, verkürzt und auf herkömmliche Weise in den vorstehend beschriebenen Vektor inseriert. Ein geeigneter Promotor wird ebenfalls inseriert und zwar in einen Lokus, welcher sich stromaufwärts des Lokus befindet, in den die hDAF-cDNA eingeführt wurde.
Die Erfinder stellten fest, daß ein Promotor des Schweine-Komplement-Inhibitor-(pMCP)-Gens effizienter arbeitete. Die Basensequenz des Promotors des pMCP-Gens ist definiert als Sequenz Nr. 1 (vgl. Japanische Patentanmeldung Nr. 142961/1997).
Aus dem auf diese Weise hergestellten Vektor (ringförmiges Gen) wird das Transgen durch Schneiden der Region, welche den Promotor und die hDAF-Gene einschließt, mit einem oder mehreren geeigneten Restriktionsenzymen hergestellt.
Die Methoden zur Durchführung der vorstehend beschriebenen Verfahren sind den Fachleuten im Allgemeinen bekannt. Die Verfahren können auf herkömmliche Weise durchgeführt werden.
Transgene Säugetiere können herkömmlicherweise durch Einführen der vorstehend beschriebenen Transgene mittels Mikroinjektion in befruchtete Eier der Säugetiere (solche in der Vorkernphase), Einpflanzen der Eier in den Eileiter von weiblichen Säugetieren (Empfänger-Säugetieren) nach einer weiteren Inkubation oder direkt in den auf eine Scheinschwangerschaft synchronisierten Uterus und Erhalten der Jungen erzeugt werden. Falls die Vorkerne aufgrund des Vorhandenseins vieler Fettgranula in den Eiern schwer zu erkennen sind, können sie auf herkömmliche Weise abzentrifugiert werden.
Um festzustellen, ob die erzeugten Jungen transgen sind, können die nachstehend beschriebenen Dot-Blot-, PCR-, immunhistologischen und Komplement-Inhibition-Analysen und dergleichen angewendet werden.
Die auf diese Weise erzeugten transgenen Säugetiere können durch herkömmliche Paarung und Erhalten der Jungen oder durch Übertragen von Kernen (Nucleustransfer) aus somatischen Zellen des transgenen Säugetieres, welche initialisiert worden waren oder nicht, in befruchtete Eier, aus denen die Kerne vorher entfernt wurden, Einpflanzen der Eier in den Eileiter oder den Uterus der Empfänger-Säugetiere und Erhalten der Clon-Jungen vermehrt werden.
Wie in den nachstehend beschriebenen Beispielen gezeigt, wurde bestätigt, daß die erfindungsgemäßen transgenen Säugetiere das hDAF-Gen trugen, den hDAF in den Endothelzellen aller Organe exprimierten und gegen das menschliche Komplement resistent waren.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung ist auf den Gebieten der Medizin und Pharmakologie nützlich und hat die folgenden Effekte:

(1) Falls solche Organe wie das Herz, die Leber und die Niere der erfindungsgemäßen transgenen Schweine mit menschlichem Blut in Kontakt gebracht werden oder in Primaten transplantiert werden, kann bestätigt werden, daß hDAF einer durch die Xenotransplantation hervorgerufenen hyperakuten Abstoßung wirksam vorbeugt.
(2) Falls das Xenotransplantationsmodell durch Inkontaktbringen solcher Organe wie dem Herz, der Leber und der Niere der erfindungsgemäßen transgenen Schweine mit menschlichem Blut oder durch Transplantieren der Organe in Primaten entwickelt wird, ist das Modell nicht nur für die Entwicklung von Arzneimitteln, Hilfsmitteln und dergleichen zur Verhinderung einer hyperakuten Abstoßung nach einer Xenotransplantation nützlich, sondern auch von solchen, welche einer akuten oder chronischen Abstoßung nach der hyperakuten Abstoßung vorbeugen.
(3) Diese Erfindung ermöglicht die Untersuchung von Problemen in Beziehung mit einer hyperakuten Abstoßung, welche durch die Expression der Komplement-Inhibitoren selbst nur schwer zu lösen sind. Und zwar kann die Erfindung die Fragen beantworten, ob es erforderlich ist, Zucker-Transferasen einzubringen, um die Expression der Zuckerketten-Antigene zu verringern, an welche menschliche natürliche Antikörper binden, und/oder um Faktoren einzubringen, um die Homö ostase der vaskulären Endothelzellen aufrechtzuerhalten (z.B. Thrombomodulin, etc.).
(4) Falls die erfindungsgemäßen transgenen Schweine mit solchen gepaart werden, die einen anderen Komplement-Inhibitor (menschliches MCP oder menschliches CD59) exprimieren, können synergistische Effekte der Inhibitoren untersucht werden.
(5) Falls die Organe (z.B. das Herz, die Lunge, Leber, Niere, Bauchspeicheldrüse, etc.), deren unterstützende Gewebe (z.B. die Koronararterie, die harte Hirnhaut, etc.) oder Zellen (z.B. Insulin produzierende Langerhans-Inseln, Dopamin produzierende nigrostriatale Zellen, etc.) aus den erfindungsgemäßen transgenen Schweinen in menschliche Patienten, deren Organe geschädigt worden sind und ihre Funktionen verloren haben, transplantiert werden, ergänzen oder ersetzen sie die Funktionen der Patientenorgane.
(6) Falls die Zellen aus den Organen der erfindungsgemäßen transgenen Schweine (z.B. Zellen aus der Leber, Niere und dergleichen; Insulin produzierende Langerhans-Inseln, Dopamin produzierende nigrostriatale Zellen, etc.) in Kultur genommen, in eine geeignete Vorrichtung eingebracht und mit den menschlichen Patienten ex vivo verbunden werden, ergänzen oder ersetzen sie die Funktionen der geschädigten Organe der Patienten.

Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im Einzelnen anhand von tatsächlichen Beispielen spezifisch erläutert, aber der Schutzumfang der Erfindung ist nicht auf diese Beispiele begrenzt. Jedoch sind andere Beispiele als die transgenen Schweine der Erfindung als veranschaulichende Beispiele anzusehen.
Beispiel 1
(1) Konstruktion eines Transgens
Das Transgen, welches das Promotor-Gen von pMCP und die hDAF-cDNA umfaßt, wird wie folgt hergestellt:
Aus dem pGL-3-Basisvektor (Promega) wurde das luc-Gen an den NcoI- und XbaI-Stellen ausgeschnitten. Die beiden Enden des gespaltenen Vektors wurden mit der T4-DNA-Polymerase verkürzt. Anschließend wurde die hDAF-cDNA, welche das erste Intron enthält, an einer AscI-Stelle des stromaufwärts des Initiationscodons ATG gelegenen Lokusses und an einer AccI-Stelle des stromaufwärts des Terminationscodons TAG gelegenen Lokusses ausgeschnitten, mit der T4-DNA-Polymerase verkürzt und in den vorstehend beschriebenen verkürzten Vektor inseriert. In ähnlicher Weise wurde eine etwa 5,4 kb große Region, welche dem Promotor-Gen entspricht, an den EcoRI- und FspI-Stellen aus der Schweine-Phagen-Genombank, enthaltend das pMCP-Gen (Japanische Patentanmeldung Nr. 142961/1997), ausgeschnitten und in die EcoRI- und EcoRV-Stellen des pBluescript-Vektors inseriert.

(1) Eine in den pBluescript-Vektor inserierte, etwa 5,4 kb große Promotor-Region wurde an den BstEII- und EcoRI-Stellen (die Sequenz von der zweiten bis zur 5392sten Base von Sequenz Nr. 1) ausgeschnitten, mit der T4-DNA-Polymerase verkürzt (die Sequenz von der zweiten bis zur 5397sten Base von Sequenz Nr. 1) und dann in eine SmaI-Stelle an einem stromaufwärts [–] des vorstehend beschriebenen Vektors mit der inserierten hDAF-cDNA [gelegenen Lokus] inseriert. Die den Promotor und die hDAF-cDNA enthaltende Region wurde an den NotI- und Eco47III-Stellen ausgeschnitten und als Transgen (1) verwendet (vgl. 1).
(2) Eine 1,7 kb große Promotor-Region wurde an den BstEII- und BssH2-Stellen der stromaufwärts des ATG-Initiationscodons von pMCP gelegenen Lokusse ausgeschnitten, mit der T4-DNA-Polymerase verkürzt und dann in die SmaI-Stelle des vorstehend beschriebenen Vektors, enthaltend die hDAF-cDNA, inseriert. Der Vektor wurde an den BstXI- und SpeI-Stellen des pBluescript-Vektors an weiteren stromaufwärts des Promotors gelegenen Lokussen ausgeschnitten und linearisiert. Die linearisierte Sequenz wurde mit einem Deletionskit für Kilo-Sequenzen (Takara) geschnitten, um eine Deletionsmutante zu erhalten, welche den 0,9 kb-Promotor (die Sequenz von der 4498sten bis zur 5397sten Base von Sequenz Nr. 1) besitzt. Die den vorstehend beschriebenen Promotor und die hDAF-cDNA enthaltende Region wurde an den NotI- und Eco47III-Stellen ausgeschnitten und als Transgen (2) verwendet (vgl. 2).
(3) Das Transgen (3), welches den hDAF-Promotor und die hDAF-cDNA umfaßt, wurde wie folgt hergestellt: Der hDAF-Promotor wurde hergestellt, indem eine etwa 3,8 kb große Region, welche dem Promotor entspricht, an den HindIII- und AscI-Stellen ausgeschnitten, verkürzt und in eine SmaI-Stelle an einem stromaufwärts [–] des Vektors mit der inserierten hDAF-cDNA [gelegenen Lokus] inseriert wurde. Eine Region, enthaltend den vorstehend beschriebenen Promotor und die hDAF-cDNA, wurde an den NotI- und Eco47III-Stellen ausgeschnitten und als Transgen (3) verwendet (vgl. 3).

Jedes Transgen wurde vor der Verwendung in einer Menge von 5 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst.
(2) Erzeugung von transgenen Säugetieren (Mäusen)
Die Transgene wurden in befruchtete Eier der Maus eingeführt, und die transgenen Mäuse wurden wie folgt erzeugt.
Männliche CBA- oder C3H-Mäuse und weibliche C57BL/6-Mäuse wurden gepaart, um Mäusejungen zu erhalten, wobei die weiblichen Mäuse davon (Spendermäuse) für die Bereitstellung der befruchteten Eier verwendet wurden. Die Spendermäuse wurden nach Induktion des Eisprungs (durch Verabreichung von PMSG und hCG) mit männlichen ICR-Mäusen gepaart. Die befruchteten Eier (in der Vorkernphase) wurden gewonnen. Das vorstehend beschriebene Transgen (1) oder (3) wurde mittels Mikroinjektion in die Vorkerne eingeführt, bis eine Schwellung nachgewiesen wurde. Die Eier in der Vorkernphase mit dem injizierten Transgen wurden unmittelbar nach der Transduktion in den Uterus der Empfängermäuse oder nach einer weiteren Inkubation für 3 Tage in den Eileiter davon eingepflanzt, und anschließend wurden die Mäusejungen erhalten. Bei den Empfängermäusen wurde eine Scheinschwangerschaft hervorgerufen, indem sie mit männlichen Mäusen gepaart wurden, deren Samenleiter unterbunden worden war.
(3) Erzeugung von transgenen Säugetieren (Schweinen)
Die Transgene wurden in befruchtete Eier von Schweinen eingeführt, und die transgenen Schweine wurden wie folgt erzeugt.
Die befruchteten Eier wurden aus weiblichen Hybridschweinen (Spenderschweinen) von Landrace, Large White und Duroc gewonnen. Nach der Induktion des Eisprungs bei den Spenderschweinen (durch Verabreichung von entweder PMSG oder FSH und hCG) und der künstlichen Befruchtung mit den Samen eines männlichen Duroc-Schweines wurden die befruchteten Eier (solche in der Vorkernphase) gewonnen. Nach dem Abzentrifugieren (für 8 min bei 12.000 × g) der Eier in der Vorkernphase wurde das Transgen (2) in die Vorkerne eingeführt, bis eine Schwellung nachgewiesen wurde. Die Eier mit dem injizierten Transgen wurden unmittelbar in den Eileiter der Empfängerschweine eingepflanzt, und anschließend wurden die Ferkel erhalten. Die Empfängerschweine waren entweder Schweine, deren Fortpflanzungszyklus mit demjenigen der Spenderschweine durch die vorstehend beschriebene Ovulationsbehandlung synchronisiert worden war, oder solche, aus denen die befruchteten Eier gewonnen worden waren.
(4) Identifizierung der transgenen Säugetiere
Die genomische DNA wurde aus den Schwänzen der Jungen, welche von den Empfängersäugetieren erhalten wurden, extrahiert und einer Identifizierung und Selektion der transgenen Säugetiere mittels der zwei folgenden Verfahren unterzogen:

(1) Dot-Blot-Verfahren: Die genomische DNA (10 μg) aus den Jungen wurde auf ein Membranstück aufgetragen und mit einem Gen hybridisiert, welches einen Teil der biotinmarkierten hDAF-cDNA umfaßt. Die transgenen Säugetiere wurden durch Nachweis des eingeführten Transgens mittels einer von alkalischer Phosphatase abhängigen, Photonen erzeugenden Reaktion (Sumalight, Sumitomo Metal, Inc.) identifiziert.
(2) PCR-Verfahren: Die PCR wurde mit der genomischen DNA aus den Jungen als Matrize, der Sequenz 5'-GGCCTTCCCCCAGATGTACCTAATGCC-3' aus der hDAF-cDNA als ein Sense-Primer und der Sequenz 5'-TCCATAATGGTCACGTTCCCCTTG-3' als ein Antisense-Primer durchgeführt (Bedingungen: Denaturierung für 30 sec bei 94°C und Aneinanderlagerung für 2 min und 30 sec bei 68°C; 30mal). Die transgenen Säugetiere wurden durch Nachweis des eingeführten Transgens identifiziert. Die in 4 gezeigten Ergebnisse bestätigten, daß einige der Jungen, welche von den Empfänger-Säugetieren erhalten wurden, die hDAF-cDNA in ihrem Genom trugen. Die Bahnen 1 und 3 von 4 zeigen die Ergebnisse für das Schwein bzw. die Maus, welche die hDAF-cDNA tragen. Die Bahnen 2 und 4 von 4 zeigen diejenigen für ein Schwein bzw. eine Maus aus dem gleichen Wurf, welche die hDAF-cDNA nicht tragen.

(5) Vermehrung der transgenen Säugetiere (Mäuse)
Die Mäuse, für welche nachgewiesen wurde, daß sie transgen sind, wurden mit ICR-Mäusen gepaart, und anschließend wurden Mäusejungen erzeugt, welche das Transgen tragen (bezeichnet als TgF1-Mäuse).
(6) Bestätigung der Expression des Transgens (Transkription der mRNA) in den transgenen Säugetieren (Mäusen
Mit Hilfe des herkömmlichen RT-PCR-Verfahrens wurde die mRNA aus verschiedenen Organen der TgF1-Mäuse auf eine Transkription der hDAF-cDNA untersucht. Zum Vergleich wurde die mRNA aus den Organen der transgenen Mäuse, welche mit Transgen (3), umfassend den hDAF-Promotor und die hDAF-cDNA, erzeugt wurden, und die mRNA aus den Organen von normalen Mäusen (nichttransgenen Mäusen) in ähnlicher Weise auf eine Transkription der hDAF-cDNA untersucht. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. B, H, K, Li, Lu, S und T in 5 stehen für das Gehirn, das Herz, die Niere, die Leber, die Lunge, die Milz bzw. die Hoden.
Bei den transgenen Mäusen, welche durch Einführen des Transgens (1), umfassend den pMCP-Promotor und die hDAF-cDNA (vgl. 1), erzeugt wurden, wurden in allen untersuchten Organen (Gehirn, Herz, Niere, Leber, Lunge, Milz und Hoden) starke Signale nachgewiesen, welche die Transkription der mRNA von hDAF anzeigen (5A).
Bei den transgenen Mäusen, welche durch Einführen des Transgens (3), umfassend den hDAF-Promotor und die hDAF-cDNA (vgl. 3), erzeugt wurden, wurde nur in den Hoden ein Signal der mRNA von hDAF beobachtet, während in den anderen Organen kein oder nur ein schwaches Signal beobachtet wurde (5B).
Bei den nichttransgenen Mäusen wurde in keinem Organ eine Transkription der mRNA von hDAF beobachtet (5C).
Mit Hilfe einer Zelllinie von menschlichen Lymphocyten (K562) wurde die Transkription der mRNA von hDAF bestätigt (auf der rechten Seite von 5C).
(7) Bestätigung der Expression des Transgens in den transgenen Säugetieren (Mäusen) (Bestätigung der Expression des hDAF-Proteins durch ein immunhistologisches Verfahren)
Von den Organen der TgF1-Maus wurden Gefrierschnitte hergestellt und mit biotinmarkierten, monoclonalen anti-hDAF-Antikörpern und dann mit Peroxidasemarkiertem Streptavidin behandelt. Nach der Umsetzung mit einem chromogenen Substrat (Diaminobenzidin; DAB) wurden die Schnitte mikroskopisch auf die Intensität und den Lokus des exprimierten hDAF-Proteins untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Bei den transgenen Mäusen, welche durch Einführen des Transgens (1), umfassend den pMCP-Promotor und die hDAF-cDNA, erzeugt wurden, wurde bestätigt, daß alle untersuchten Organe eine starke Expression von hDAF zeigten. Zu den Organen, welche den hDAF exprimieren, gehörten das atriale und ventrikuläre Myokard und das Endothel von mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäßen des Herzens, der Glomerulus, die Nierenkanälchen und das Endothel von mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäßen der Niere, Hepatocyten, das Epithel der Gallenwege und das Endothel von mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäßen der Leber, die Alveolarwand, das Bronchiolenepithel und das Endothel von mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäßen der Lunge, das Darmschleimhautepithel und das Endothel von mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäßen der Eingeweide, die exokrinen Drüsen, die Langershans-Inseln, das Epithel und Endothel von mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäßen der Bauchspeicheldrüse, die weiße und rote Pulpa, die Trabeculae lienis und das Endothel von mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäßen der Milz, der (die) cerebrale und cerebellare Cortex und Medulla sowie das Endothel von mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäßen des Gehirns, das Samen produzierende Epithel, die Interstitialzellen, die Spermien und das Endothel von mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäßen der Hoden sowie die peripheren Nerven.
Bei den transgenen Mäusen, welche durch Einführen des Transgens (3), umfassend den hDAF-Promotor und die hDAF-cDNA, erzeugt wurden, wurde die Expression von hDAF nur in den Hoden, aber nicht in den Endothelzellen der Hoden nachgewiesen.
Tabelle 1
(8) Bestätiqunq der Expression des Transgens in den transgenen Säugetieren (Schweinen) (Bestätigung der Expression des hDAF-Proteins durch ein immunhistologisches Verfahren)
Die Expression des hDAF-Proteins wurde in den Schweinen beobachtet, welche mit Hilfe des PCR-Verfahrens, wie in (4) beschrieben, als transgen identifiziert worden waren.
Aus den Schwänzen der Schweine wurden Gefrierschnitte hergestellt und mit biotinmarkierten, monoclonalen anti-hDAF-Antikörpern und dann mit Peroxidasemarkiertem Streptavidin, wie in (7) beschrieben, behandelt. Nach der Umsetzung mit dem chromogenen Substrat (Diaminobenzidin; DAB) wurden die Schnitte mikroskopisch auf die Intensität und die Region des exprimierten hDAF-Proteins untersucht.
Die Expression von hDAF wurde für die mittleren, kleinen und kapillaren Blutgefäße der transgenen Schweine, welche durch Einführen des Transgens (2), umfassend das Gen des pMCP-Promotors und die hDAF-cDNA, erzeugt wurden, bestätigt. Daneben wurde eine Expression von hDAF auch für solche Organe wie die peripheren Nerven, die Skelettmuskeln und das mehrschichtige Plattenepithel der Haut bestätigt.
(9) Bestätiqunq der Expression des Transgens in den transgenen Säugetieren (Schweinen) (Bestätiqunq der Expression des hDAF-Proteins durch eine FACS-Analyse
Für die Untersuchung auf eine Expression des hDAF-Proteins wurden die Organe aus den transgenen Schweinen, welche mit Hilfe des PCR-Verfahrens, wie in (4) beschrieben, und durch das immunhistologische Verfahren, wie in (7) beschrieben, als transgen identifiziert worden waren, einer FACS-Analyse (einem Sortiergerät für fluoreszenzaktivierte Zellen, Becton Dickinson-FACScan) mit monoclonalen anti-hDAF-Antikörpern unterzogen.
Aus dem Blut des transgenen Schweins wurde eine Erythrocytenfraktion hergestellt, mit biotinmarkierten, monoclonalen Antikörpern und dann mit Phycoprobe PE-Streptavidin (Biomeda) behandelt und einer FACS-Analyse unterzogen. Die Ergebnisse sind in 6(A) gezeigt. Eine ähnliche Analyse, wie vorstehend beschrieben, wurde mit einem nichttransgenen Schwein aus dem gleichen Wurf durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 6(B) gezeigt. Die horizontalen und vertikalen Achsen geben die Fluoreszenzintensität, welche die exprimierte Menge an hDAF angibt, bzw. die Zellzahl wieder.
Wie in 6 gezeigt, wurde bestätigt, daß die Erythrocyten aus dem transgenen Schwein, das durch PCR und die immunhistologischen Verfahren identifiziert worden war, sehr große Mengen an hDAF exprimierten, aber daß diejenigen aus dem nichttransgenen Schwein keine Expression zeigten.
6 zeigt auch, daß die transgenen Schweine in diesem Beispiel sowohl Erythrocyten, die hDAF exprimieren, als auch Erythrocyten, die hDAF nicht exprimieren, aufwiesen (bezeichnet als Mosaik). Es ist bereits gezeigt worden, daß die erste Generation der transgenen Tiere (Gründer), welche mit Hilfe des Mikroinjektionsverfahrens erzeugt wurden, zuweilen ein Mosaik entwickeln, und daß ein solches Mosaik durch solche herkömmliche Methoden wie Paarung und Züchtung verschwinden kann.
Die in (8) und (9) gezeigten Ergebnisse bestätigten, daß die transgenen Schweine, welche durch Einführen des Transgens, umfassend den pMCP-Promotor und die hDAF-cDNA, erzeugt wurden, den hDAF durch die hDAF-cDNA in verschiedenen Organen und Geweben einschließlich Endothelzellen exprimieren.
(10) Bestätigung der Expression des Transgens in den transgenen Säugetieren (Bestätigung der Funktion des hDAF-Proteins)
Es wurde bestätigt, daß das hDAF-Protein, welches auf den Zellen der transgenen Säugetiere exprimiert wurde, die wesentliche Funktion des hDAF-Proteins, d.h. die Suppression der Komplement-Kaskadenreaktion, aufwies. Der Nachweis erfolgte durch die Bestimmung der Hämolyse, welche nach Behandlung der Erythrocyten des transgenen Säugetieres mit menschlichem Serum auftrat. Die Erythrocyten wurden einer solchen Analyse unterzogen, da die Komplement-Kaskadenreaktion durch die Beobachtung einer Hämolyse (1) ohne weiteres aufgrund der Bildung eines Membranangriffkomplexes und (2) eindeutig aufgrund der fragileren Membranstruktur der Erythrocyten als bei anderen Zellen (z.B. Leukocyten, Endothelzellen und dergleichen) identifiziert werden konnte.
Die Erythrocytenfraktionen wurden aus Blutproben hergestellt, welche aus den Schwänzen einer transgenen und einer nichttransgenen Maus sowie aus der Ohrvene eines transgenen und eines nichttransgenen Schweins entnommen wurden. Nach Verdünnen der Fraktionen mit PBS wurden 30 μl jeder Fraktion in eine Vertiefung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (1 × 10⁷ Zellen/Vertiefung) eingebracht; anschließend wurden 70 μl menschliches Serum mit einer eingestellten Komplement-Konzentration (welches durch Vermischen von menschlichem Normalserum [HNS] und vorher inaktiviertem Serum (durch Erwärmen während 30 min bei 56°C) [HIS] hergestellt worden war) dazu zugetropft und dann damit reagieren gelassen (für 1,5 h bei 37°C). Die optische Dichte des Überstands jeder Vertiefung wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad) bei 405 nm abgelesen, und die prozentuale Hämolyse, welche durch die Komplement-Kaskadenreaktion hervorgerufen wurde, wurde berechnet.
Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt, wobei die Figuren (a) und (b) die Ergebnisse für die Mäuse- bzw. die Schweine-Erythrocyten zeigen. Die horizontalen und die vertikalen Achsen geben die HNS-Konzentration in dem menschlichen Serum bzw. den Grad der Hämolyse an. Die Symbole • und
in 7 zeigen die Hämolyse der Erythrocyten aus den transgenen bzw. den nichttransgenen Tieren.
Eine solche Hämolyse tritt auf, (1) weil das gleichzeitige Vorhandensein von tierischen Erythrocyten und menschlichem Serum aufgrund der Anwesenheit der natürlichen Antikörper und dem Komplement in dem menschlichen Serum sofort den klassischen Komplementweg auslöst, und (2) weil tierische Erythrocyten (mit Ausnahme der erfindungsgemäßen transgenen Säugetiere) die menschliche Komplement-Kaskadenreaktion aufgrund der Speziesspezifität des Komplement-Inhibitors nicht inhibieren können.
Wie in 7 gezeigt, machen die Erythrocyten aus den nichttransgenen Tieren ungeachtet der Komplement-Konzentration in dem menschlichen Serum eine Hämolyse durch, während diejenigen aus den transgenen Säugetieren die Hämolyse inhibierten. Diese Erkenntnisse bestätigen, daß die Erythrocyten, welche den hDAF exprimieren, aus den transgenen Säugetieren gegen das menschliche Komplement resistent waren. Obwohl die Erythrocytenpopulation in den transgenen Schweinen dieser Erfindung ein Mosaik aufwies, war sie gegen das menschliche Komplement resistent.
Sequenzprotokoll

Claims

Transgenes Schwein, welches das Gen des menschlichen Komplement-Inhibitors DAF/CD55 und einen Promotor des Schweine-Komplement-Inhibitor-pMCP-Gens in einem stromaufwärts des menschlichen Komplement-Inhibitor-DAF/CD55-Gens gelegenen Lokus trägt, wobei der Promotor ein 0,9-kb-Promotor umfassend die Sequenz von Base 4498 bis Base 5397 von SEQ ID NO: 1 ist.
Transgenes Schwein nach Anspruch 1, das den menschlichen Komplement-Inhibitor DAF/CD55 in seinen Endothelzellen exprimiert.
Transgenes Schwein nach Anspruch 1 oder 2, welches den menschlichen Komplement-Inhibitor DAF/CD55 in seinen Endothelzellen von Organen und/oder Geweben des gesamten Körpers exprimiert.
Transgenes Schwein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das ein Haustier oder ein Versuchstier ist.
Xenograft umfassend ein Organ, sein(e) Verbundgewebe oder Zellen des transgenen Schweins nach einem der Ansprüche 1 bis 4.