JP2001517924A - 抗体媒介性拒絶反応を低減させた異種移植のためのトランスジェニック動物 - Google Patents

抗体媒介性拒絶反応を低減させた異種移植のためのトランスジェニック動物

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Abstract

(57)【要約】 抗体媒介性拒絶反応（超急性拒絶反応を含む）を低減させるかまたは阻止する器官、組織、細胞、または非生存成分の異物移植の方法が提供され、ここで抗原性Galα(1,3)Galまたはgalエピトープをマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの酵素、ならびに少なくとも１つの補体インヒビター（例えば、CD59、DAF、および/またはMCP）を発現するトランスジェニック動物が作製される。galエピトープ減少酵素および補体インヒビターの両方を発現するトランスジェニック動物は、galエピトープがマスクされているかまたはそのレベルが低下しており、そして移植後に抗体媒介性拒絶反応を発生する可能性がずっと低く、そしてまた補体インヒビターの発現によって相補活性化が抑制され、そしてこのように作製されたトランスジェニック動物由来のドナー器官、組織、細胞、または非生存成分の移植後の重篤な免疫反応がさらにもっと低減する。さらに、単一の組み込み部位で複数の補体インヒビターまたは遺伝子の遺伝子座由来の他のタンパク質を発現するトランスジェニック動物が提供される。従って、本発明は、以前は可能ではなかった程度まで抗体媒介性拒絶反応を低減または消去しつつ、安全かつ効果的にヒトに移植され得、そしてヒトまたは霊長類ドナー由来のドナー器官、組織、細胞、または非生存成分を得る必要性を有意に低下させる、異種の器官、組織、細胞、および非生存成分を提供し得る点で有利である。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体媒介性拒絶反応を低減させた異種移植のためのトランスジェニック動物 本出願は、1995年９月27日に出願された米国特許仮出願第60/004461号、およ び1996年６月３日に出願された米国特許出願第08/675,773号からの優先権を請求 する。発明の分野 本発明は、一般に、異種移植後の抗体媒介性拒絶反応および補体媒介性拒絶反 応（超急性拒絶反応を含む）を低減または阻止するためのトランスジェニック動 物および組換え異種細胞の調製および使用に関し、そして特に異種移植後の抗体 媒介性拒絶反応および補体媒介性拒絶反応を低減または阻止するための方法に関 する。本方法は、細胞および組織が、酵素（例えば、α(1,2)フコシルトランス フェラーゼ、α(2,6)シアリルトランスフェラーゼ、β(1,3)N-アセチルグルコサ ミニルトランスフェラーゼ、または抗原性galエピトープをマスクするかまたは そのレベルを低下する他の適切なグリコシルトランスフェラーゼ）をコードする 遺伝子を、補体阻害タンパク質（例えば、CD59、DAF、および/またはMCP、ある いは他の補体インヒビター）を発現し得る遺伝子とともに発現し、そうして異種 移植後の抗体媒介性拒絶反応または補体媒介性拒絶反応を低減または消去する器 官、組織、細胞、および非生存成分を産生するトランスジェニック動物の調製を 包含する。本発明はまた、複数の補体阻害タンパク質を発現する本方法により作 製されたトランスジェニック器官、組織、細胞、および非生存成分、ならびに本 発明に従って調製されたトランスジェニック動物からの器官、組織、細胞、およ び非生存成分を用いた異種移植の方法に関する。発明の背景 器官および組織移植に関してはここ数年改善されてきたにもかかわらず、この 分野での進歩は、使用可能なヒトドナー器官および組織が極めて不足しているた めに制限され続けている。過去数年において、非常に多くの移植手順が、同種移 植組織（すなわち、レシピエントと同一の種のドナー動物からの組織）を用いて 行われてきた。しかしいずれの年についても、適切なドナー組織の欠如のために このような手術を得られなかった患者の数は、移植を受ける患者の数を大きく上 回る。例えば、1993年には、18,164人の患者がドナー器官を受けたのに対し、全 部で33,394人の患者がその年の終わりまでドナー器官を待つリストに載ったまま であった。多くの場合、例えば、不運にも、心臓疾患の患者にとって、移植手順 に関連する合併症の結果よりも、適切なドナー器官が入手できるのを待っている 間にその患者が死亡する可能性が高いという場合がある。 さらに、器官がいつ入手できるかが予測不可能であるので、移植手術は、しば しば日常的な手術のようにはかなり前から予定を組むことができない。あまりに も頻繁であるが、外科チームおよび病因経営者らは、適切なドナー器官の所在が 決まればすぐに反応しなければならず、それにより経営的な困難および他の困難 が生じている。心臓、肝臓、および肺の移植の場合、例えば、拒絶反応が起これ ば、別の適切なドナー器官が短期間以内に見つからなければ（そして、見つかる ことは極めてありそうにないが）通常再移植することは不可能である。 適切なドナー組織の不足の結果として、科学および医学の団体は、異種移植の 可能性を長年考慮してきた。異種移植は、ある種から異なる種の個体への組織の 移植である。器官または組織を特定の非常に近縁の種（例えば、チンパンジーお よびヒヒ）からヒトへ首尾良く移植することが数多く試みられてきたが、これら の手術は、問題を伴わなかったことがない。そのような問題には種々のレベルの 拒絶反応および広範な免疫抑制処置（困難でかつ費用がかかり得、そしてしばし ば望まれない副作用を伴う）の必要性が含まれる。さらに、潜在的に適切なドナ ー霊長類の供給はまた、他の因子（利用し得る霊長類数が比較的少数であること 、多くの潜在的に受容可能な種が絶滅の危機に瀕している種のリスト上にあると いう事実、および他の倫理的な考慮を含む）により制限される。 従って、適切な動物ドナーの探求は、絶滅の危機に瀕していないが、比較的豊 富に供給される、例えばブタのような動物に集中してきた。不運にも、ヒトと最 もあり得るドナー動物であるブタとの間の異種移植は、ヒトにおいて異種器官ま たは組織の移植後に即座に起こる重篤な抗体媒介性拒絶反応のために極めて制限 されてきた。この抗体媒介性拒絶反応は、その急速な初期の段階では超急速拒絶 反応（すなわちHAR）として知られ、少なくともブタと霊長類との間の移植に関 しては、抗体媒介性補体活性化を通して起こる（例えば、Dalmassoら、Amer ．J ．Pathol． 140:1157-1166(1992)に記載される）と考えられる。少なくとも１つ の論文が補体調節タンパク質は種特異的であり得ることを示唆しているが、補体 の別経路は、他の種の組み合わせについてこの様式で活性化される可能性もまた ある。Miyagawaら、Transplantation 46:825-830(1988)を参照のこと。 ブタからヒトまたは他の霊長類への器官の移植における超急性拒絶反応に関し て、この抗体媒介性拒絶反応の初期の段階は、通常、血栓症、出血、および水腫 によって特徴づけられ、そして移植後数分間から数時間以内にほぼ確実に移植片 機能の減退および不可逆的な拒絶反応が生じる。異種反応性自然抗体（すなわち 、XNA）の移植片の内皮細胞上に存在する炭水化物構造への結合によってこの過 程が開始され、次いでこれが補体カスケードの活性化を導くことが一般に観察さ れている。例えば、Plattら、Transplantation 50:817-822(1990)を参照のこと 。 普及している科学的考察は、HARのような抗体媒介性拒絶反応は、XNAによる開 始の後に宿主の補体の防御系によって引き起こされるさらなる拒絶反応を最終的 に生じるということである。補体およびその活性化は、今や周知であり（Roitt ，Essential Immunology（第15版、1994）Blackwell Scientific Publications ，Oxfordを参照のこと）、そして補体（C'）に基づく活性化は、協力して作用す る９つのタンパク質補体（C1〜C9）の働きに依存し、このうちC1は、C1q、C1r、 およびC1sと名付けられた３つの主要なサブ画分からなる。補体は、古典経路ま たは別経路により活性化され得、その両方がここで簡単に記載される。 古典経路において、C1は抗体に結合する。C1sサブユニットは、エステラーゼ 活性を獲得し、そして活性になり、そして膜上、または最初にC4次いでC2の免疫 複合体の部位へ移る。この複合体は、「C3コンバターゼ」活性を有し、そしてC3 を溶液中で分裂ざせ、小さいペプチドフラグメントC3aおよび残りの分子C3b（こ れらは、極めて異なる機能を有する）を産生する。C3aは、補体媒介性損傷に貢 献するが、それ以外は補体増幅カスケードにおいては何らのさらなる役割も果た さないアナフィラトキシン活性を有する。C3bは、膜に結合していて、抗原抗体C 3b複合体の免疫付着を生じ得、そうしてその後の食作用を容易にする。 別経路において、C3コンバターゼ活性は、C3bB（この活性化は、抗体とは独立 して作用する外因性の因子によって誘発され得る）によって行われる。このコン バターゼは、C3bの複合体上の因子Ｄ、および因子Ｂの作用により形成される。 これはポジティブフィードバックループを形成し、C3分解の産物（C3b）がより 多くの切断酵素を形成するのが助けられる。 古典経路および別経路の両方において、C3bレベルは、C3b不活化因子（Ｉ因子 ）の作用により維持される。C3bは、因子Ｈと容易に組み合わさり複合体を形成 する(この複合体は、Ｉ因子により分解され、そしてその溶血特性および免疫付 着特性を失う)。古典経路および別経路は、C3段階の後は共通である。C5は、分 裂してC5aおよびC5bフラグメントを生じる。C5aは、アナフィラトキシン活性を 有し、そして多形の走化性を生じる。C5bは、複合体としてC6およびC7に結合し 、膜上に熱安定性部位を形成し、これは最終成分C8およびC9を補充して膜侵襲複 合体（MAC）を生成する。これは、膜に挿入されそしてそこから突出した環状の 構造であり、これは電解質および水に対しては完全に透過性の膜貫通チャネルを 形成する。高い内部膠質浸透圧のために、ナトリウムイオンおよび水が正味に流 入し、細胞の溶解を導く。 補体阻害因子または制限因子は同定されている。これらは、補体カスケードの 溶解活性を低減または阻止するような様式で補体カスケードの作用を干渉する； これらは、他の種由来の補体に対して比較的効力がない点でしばしば種特異的で ある。これらの因子は細胞膜に結合しているか、または血清中に遊離し得る。最 もしばしば、これらは両方の補体活性化経路に共通の段階の１段階に介入するが 、いくつかの因子は、古典経路または別経路のいずれかに特異的であり得る。 ブタから霊長類への移植において、宿主の補体（C'）は、最初に古典補体経路 を通して活性化される。宿主の血流中を循環している予め形成された異種反応性 自然抗体（XNA）は、ドナー器官、特に血管内皮の管腔表面を認識してそこに結 合する。XNAの結合は宿主の補体系を誘発するように働く。この攻撃により、移 植後数分から数時間以内で内皮細胞活性化、血小板および白血球の付着、血栓症 、 および異種移植片器官の最終的な壊死が導かれる。移植された器官の毛細血管床 は、宿主の補体活性による攻撃に対して最も感受性の高い部位であるようである 。 補体活性化は、例えば、Gerwurzら、Translantation 5:1296(1967)において実 証されるように、HARのような抗体媒介性拒絶反応において重要な役割を演じる 。より最近では、抗体媒介性拒絶反応の過程における補体の関与が、異種移植前 の宿主補体活性の外因的な阻害によって劇的に実証された。例えば、いくつかの グループは、宿主における異種自然抗体のレベルを枯渇させることにより補体を 阻害する、実験的な方法を開発した。異種自然抗体は、宿主の血液をブタ腎臓の ようなドナー器官を通して灌流することによるか、または血液をイムノアフィニ ティーカラム（これは、免疫グロブリン分子を除去する）を通過させることによ るかのいずれかで除去される。例えば、Mobergら、Trans ．Proc．3:538-541(197 1);Fiscelら、Trans ．Proc．24:574-575(1992);Yeら、Trans ．Proc．24:563-565 (1992);Agashiら、Trans ．Proc．24:557-558(1992)を参照のこと。不運にも、こ れらの方法は、臨床的な移植の設定における日常的な使用に容易に移行し得ない 。 または、コブラ毒因子（Gerwurzら、1967、上記を参照のこと）または可溶性 補体レセプター（例えば、Pruittら、Trans ．Proc．24:477-478，1992を参照の こと）の大量の投与は、補体活性を低減するのに効果的であることが示されてい る。これらの方法を用いて、少なくとも２つの独立したグループが、移植前の宿 主の補体の阻害により、異種移植片の生存の延長が導かれることを示した。例え ば、Platteら、Immunol ．Today 11:450-456(1990);Lexerら、Trans ．Proc．19:1 153-1154(1987)を参照のこと。宿主補体が連続的に抑制されるならば、通常数時 間で拒絶される異種移植片は、何日もそして何週間も維持されている。さらに、 Miyagawaら、Transplantation 46:825-830(1988)において、その筆者らは、補体 調節タンパク質は種特異的であり得ることを示唆したが、モルモット−ラット心 臓移植片モデルを用いた不調和な異種移植片拒絶反応の機構が、別経路による補 体の一次活性化により起こることが観察された。補体調節タンパク質または相同 な補体制限因子は、以前に、例えば、Imutran Limitedに発行されたPCT出願WO 9 1/05855に記載されている。 この分野での他の調査は、Plattら（1990、上記）によって行われた。彼らは 、ブタの内皮細胞の膜においてヒト崩壊促進因子（DAF）（そしておそらく他の 補体調節タンパク質）を直接発現するトランスジェニックブタを作製することが 可能であり得ることを推測した。彼らは、このような動物がドナー動物として用 いられた場合、ヒト補体インヒビターが、ヒト補体からこの移植片を保護するよ うに働くと考えた。Plattらは、この目的を達成するためのいかなる特定の遺伝 子的構築物も記載しなかった。 Dalmassoら（Tlansplantation 52:530-533，1991）は、異種移植片の内皮細胞 において対応するタンパク質の高レベルの発現を達成するために、トランスジェ ニックドナー動物（例えば、ブタ）をヒト膜結合補体インヒビター遺伝子で操作 することを示唆した。 このストラテジーに一致して、Whiteら（WO 91/05855）は、ヒトメンブレンコ ファクタータンパク質（MCP）（CD46としても知られる）またはヒト崩壊促進因 子（DAF）をコードするトランスジーンを有するトランスジェニックマウスを調 製した。トランスジーンは、補体インヒビターをコードするcDNAに連結したフレ ンド脾臓フォーカス形成ウイルス5'長末端反復から構成される。しかし、彼らは 、これらの遺伝子が発現されたかどうか、そしてもし発現されたなら、どの組織 において、またはトランスジェニック動物からの移植片が不調和な動物において HARを誘発するかどうかを決定しなかった。 同様に、Yannoutsosら、First Int'l Congr ．Xenotr.，Abstracts，７頁(1991 )は、ヒトDAFおよびMCPを発現するトランスジェニックマウスの開発を記載した 。この研究において、一連の広範囲のプロモーターが使用され、その結果全補体 インヒビターの発現のいくらかが内皮細胞において起こることが可能である。彼 らの動物のほとんどは、非常に低レベルの補体インヒビター発現を有するようで あった。さらに、彼らは内皮細胞における発現が達成されたことを確認しなかっ たし、トランスジェニックで発現したCRPの生物学的機能も示さなかった。 ヒトDAF遺伝子を含むトランスジェニックマウスおよびブタは、部分的ゲノムD NAフラグメントを使用して作製されてきた(Caryら、Trans ．Proc．25:400-401， 1993:Cozziら、Trans ．Proc．27:319-320，1995)。これらの動物は、伝えられ るところによると、造血組織においてはほとんど発現しないようであるが、広範 なDAFの発現を示した。最も一定した発現は血管平滑筋において観察されたが、 内皮においては不定の発現が観察された。トランスジェニック器官は移植条件下 で試験されておらず、むしろPBMC細胞がELISAおよびRIAの両方を用いて分析され たことに留意すべきである。従って、これらのトランスジェニック器官が移植状 態においてHARを阻止し得たことを示唆するデータは示されていない。 Oldhamらは、1993年に、第２回International Congress on Xenotransplantat ionで、講演をした。ここでは、ヒトCD59ミニ遺伝子の作製、ならびに２つのcDN A配列をこのミニ遺伝子に挿入するのを可能にするためのミニ遺伝子の改変が発 表された。トランスジェニックマウスにおけるこのミニ遺伝子(CD59のcDNAのみ を含む)の発現は、ヒト組織でみられるのと類似する、CD59タンパク質発現の細 胞型分布を示した。しかし、このミニ遺伝子に関してはその有用性が厳しく制限 されるという問題が存在した。 Foderら、Proc ．Nat．Acad．Sci．USA，91:11153-57(1994)は、マウス主要組 織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI遺伝子H2Kbのプロモーターの制御下でCD59を発 現することによって補体インヒビターCD59を産生するトランスジェニックマウス およびブタを作製しようと努めた。後者の遺伝子は、優勢な内皮細胞表面抗原で ある抗原をコードする。CD59 cDNAは、MHC遺伝子の9.0kb EcoRIゲノム制限フラ グメントのエキソンＩにクローニングされた。このフラグメントは、大きな５' 配列、８個のエギソン全て(および介在配列)、およびより小さな３'配列を含ん でいた。著者らは、マウスの心臓、ならびにマウスおよびブタの両方の尾部にお けるCD59の存在を示した；他の場所でのその発現は議論されなかった。発現は、 内皮細胞および内皮細胞でない細胞の両方で観察された。 18頭の仔ブタをDNAスロットブロット分析により分析し、そして１頭の動物は1 0〜20コピーのこの遺伝子を有することが見出された一方で、他の２頭はこの遺 伝子の１コピーしか含まず、そして末梢血単核細胞(PBMC)において発現を示さな いかまたは非常に低くかつ不定なレベルの発現を示した。低レベルのCD59が、種 々の組織および細胞型(線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、および平滑筋細 胞を含む)で見られた。CD59の発現は、サイトカイン(これは、MHCクラスＩプ ロモーターを誘導することが知られる)で刺激すると増加した。さらに、トラン スジェニック器官を移植状態で試験しなかったので、この器官が補体媒介性拒絶 反応を受けやすいか否かは未知である。上記のプロモーターの他に、いくつかの 他のプロモーターを使用して、トランスジェニック動物の内皮細胞におけるトラ ンスジーンの発現を達成している。しかし、これらの先の例では、トランスジー ンは補体インヒビターではなかった。 Airdら、Proc ．Nat．Acad．Sci．USA，92:4567-71(1995)は、487bpの５'隣接 配列およびE．coli lacZ遺伝子にインフレームで融合したヒトフォンビルブラン ト因子遺伝子の第１エキソンを含むキメラ構築物を保有する、トランスジェニッ クマウスを作製した。成人組織の組織化学的分析によって、LacZ発現は脳の血管 の内皮細胞において存在するが、活性は、脾臓、肺、肝臓、腎臓、精巣、心臓、 および大動脈の血管床には存在しないことが示された。ある後者の床は高レベル の内因性フォンビルブラント因子を含む。このことは、クローニングされた配列 以外の配列が、フォンビルブラント因子の完全に確実な発現に必要であることを 示唆した。１つの系統は脳組織においてLacZ活性を示さなかった。そしてこの知 見についての１つの説明は、トランスジーンの組込み部位またはその付近のゲノ ム配列が発現のパターンに影響し得ることである。 AirdのVWFプロモーターは、その発現が脳組織に限定されているので、内皮細 胞へ発現を導くためには限られた価値しかない。比較目的のために、Airdらは、 E．coli lacZ遺伝子を、相同組換えによって内因性トロンボモジュリン遺伝子の プロモーターに融合した。得られたトランスジェニックマウスは全ての器官(脳 、脾臓、肺、肝臓、心臓、腎臓、および大動脈を含む)の内皮細胞においてLacZ 活性を示した。 Haratsら、J ．Clin．Invest.，95:1335(1995)は、マウスプレプロエンドセリ ン-１プロモーターを使用して、遺伝子発現をトランスジェニックマウスにおけ る血管壁へ標的化した。彼らの構築物は、5.9kbの５'隣接領域、第１エキソン( 非コード領域に、おけるBglII部位にクローニングされたルシフェラーゼレポー ター遺伝子を有する)、および0.9kbの第１イントロンを含んでいた。全てのマウ スにおいて、最高レベルの発現は大動脈においてであり、そして高レベルの発現 は、 また他の大きな動脈において、小さな筋性動脈においても示され、そして毛細管 においては程度がより低かった。静脈における発現のレベルはより低かった。血 管での発現は、肝臓および脾臓よりも心臓、腎臓、および肺で高かった。同一の 器官でさえも、血管での発現は実質的な変化があった。血管以外でのいくらかの 発現もまた観察された。 Dumontら、Genes and Development，8:1897-1909(1994)は、内皮レセプターチ ロシンキナーゼプロモーター(tek)の制御下でlacZレポーター遺伝子を発現する トランスジェニックマウスを作製した。このプロモーターは、制限された用途を 有する様式(すなわち、プロモーターは胚の発達の間はオンになり、その後成体 ではオフになる)で調節される(Dumontら、1994)。 マウスH2Kbクラス１プロモーターは、サイトカインにより刺激されない限りは 、内皮細胞での発現を可能にし、より高いレベルの発現を生じ得る(Foderら、19 94、上記引用)。 上記のプロモーター以外に、内皮細胞の表面に発現されるタンパク質をコード する遺伝子に関連する遺伝子は他に多く存在する。目的の遺伝子の内皮発現を特 にトランスジェニック動物において達成するためにどのプロモーターが最も適し ているかについでは、当該分野での同意はない。 移植可能な器官へのＣ-インヒビターの送達へのなお別のアプローチは、Byrne ら、PCT/US93/08889により開拓された。補体インヒビターは、トランスジェニッ クの赤血球に特に発現し、これは次いでタンパク質をこの動物の器官および組織 の血管内皮へ輸送する。意図するレシピエントにおいて、一旦目的の器官が活性 な補体インヒビターで「ペイント」されると、この器官は安全に移植され得る。 このアプローチは有望であるようだが、一方、血管内皮の全適用範囲を達成す るには時間がかかり、その結果この器官が移植に使用され得る前に遅れが存在す る。さらに、一旦ドナー組織がトランスジェニック動物から採取されると、ドナ ー組織の表面上のタンパク質の置き換えは、器官それ自身がこのタンパク質を産 生しないので起こらない。この器官は、高発現を維持するためにトランスジェニ ック動物の血液で日常的に再灌流されなければならない。従って、このアプロー チは有望であるが特定の制限を有する。例えば、このアプローチは、内皮細胞組 織におけるタンパク質の発現が不可能であるような状況、または発現レベルを補 うために使用される場合には、有益であり得る。そしてこれは、移植後の最初の 数週間において有益であることを証明し得る。 Thorleyら、Transplant ．Proc.，27:2177-78(1995)は、CD46(メンブレンコフ ァクタープロテイン、MCP)ミニ遺伝子の構築物を報告した。CD46遺伝子は45kb長 を超え、プラスミドベクターにおける全長挿入物の使用は除外している。このミ ニ遺伝子は、ゲノムおよびcDNAの供給源に由来した。これは、7.5kbのゲノム配 列(エキソン１の５'側の450からイントロン３)、およびエキソン３〜14に対応す るcDNA配列から構成されていた。このミニ遺伝子はトランスジェニックマウスの 調製において使用されたが、しかし、これらのマウスにおけるこの遺伝子の発現 パターンは決定されなかった。 従って、補体阻害タンパク質の遺伝子を適切なレベルで発現し、その結果トラ ンスジェニック動物の器官および組織は超急性拒絶反応を低減または消去した異 種移植に有用であり得るトランスジェニック動物が作製される、満足な方法は開 発されていない。さらに、ブタからヒトへのような遠縁種からの異種移植後に生 じる超急性拒絶反応の問題に立ち向かうために使用し得る、同一の遺伝子座に複 数の補体インヒビター遺伝子を含むDNA構築物は１つも製造されていない。 さらに、上述したように、最近の他の研究から、抗体媒介性拒絶反応(超急性 拒絶反応を含む)は、移植片の内皮細胞に存在する炭水化物構造への異種反応性 自然抗体(すなわちXNA)の結合により開始され、これは補体カスケードの活性化 を導くことが現在示されている。Plattら、Transplantation 50:817-822（1990 ）を参照のこと。従って、XNAに認識され従って主に抗体媒介性拒絶反応の原因 である異種移植片上の優勢な炭水化物エピトープは、ガラクトースα(1,3)ガラ クトース(galエピトープまたはGalα(1,3)Galともいわれる)であることが示され ている。例えば、Sandrinら、P．N．A．S．90:11391-11395(1993)およびTranspl antation Reviews ，8:134-149(1994)を参照のこと。このエピトープは霊長類で ある旧世界ザルおよびヒトには存在しない。Goodら、Transplant Proc ．24:559- 562(1992)およびGaliliら、P ．N．A．S．84:1369-1373(1987)を参照のこと。gal エピトープは、N-アセチルラクトサミン(N−lac)コアへのガラクトースの付加を 触媒する酵素Galβ1,4GlcNAc3-α-D-ガラクトシルトランスフェラーゼ(すなわち 「α(1,3)GT」；EC2.4.1.51)によってトランスゴルジにおいて合成されると考え られる。Blankenら、J ．Biol．Chem．260:12927-12934(1985)を参照のこと。ヒ トは、サル(ape)および他の旧世界ザルと同様に、例えば、Galiliら、J ．Biol． Chem． 263:17755-17762(1988)およびLarsenら、J ．Biol．Chem．265:7055-7061( 1990)に示されるように、機能的なα(1,3)GT遺伝子を欠くのでgalエピトープを 有さない。 XNAの特異性、およびHARのような抗体媒介性拒絶反応の特定の局面がこれらの 抗体の涸渇によって遅延し得ることを示す以前の研究の前提で、この分野の研究 者らは、galエピトープを欠くかまたはこのエピトープのレベルが顕著に減少し ているのでこの組織をヒト患者へ移植した際にHARを導かないという、非ヒトド ナー組織を達成ずる方法を開発することを試みた。しかし、異種移植に適切な組 織の作製を可能にするための、galエピトープの減少を達成する適切かつ有効な 方法の開発は、異種組織において炭水化物エピトープの産生を導く酵素経路をと りまく複雑さのために、困難な仕事であることが証明された。 例えば、Galβ2-α-L-フコシルトランスフェラーゼ(α(1,2)フコシルトランス フェラーゼ、ずなわち「α(1,2)FT」;EC 2.4.1.69としても知られる)酵素は、ヒ ト患者においで一般に受け入れられかつヒトＡＢＯ血液型系の前駆体分子である 血液型「Ｏ」の特徴的構造である、Fucα1,2Galβエピトープ(Ｈ抗原としても知 られる)の形成に関与している。α(1,2)FTの基質分子の１つはN-lacであり、こ れはまた、ガラクトースのアクセプターとしてα(1,3)GTによって利用される。L owe，Semin ．Cell Biol．2:289-307(1991)およびPaulsonら、J ．Biol．Chem．26 4:17615-17618(1989)を参照のこと。インビトロでの基質特異性の研究で、フコ シル化(またはシアル化)N-lacはα(1,3)GTについて乏しい基質であることが示さ れた。Blankenら、J ．Biol．Chem．260:12927-12934(1985)を参照のこと。しか し、公知であるいくつかのフコシルトランスフェラーゼが存在するが、各酵素の 酵素経路における差異によって、任意の個々の酵素が異種組織において発現した ときにどのように機能するかについて、幾分予測不能になる。 アクセプターとしてN-lacも使用する別のグリコシルトランスフェラーゼはβ −ガラクトシドα(2,6)シアリルトランスフェラーゼ(α(2,6)シアリルトランス フェラーゼ、すなわち「α(2,6)ST」；EC2.4.99.1としてもまた知られる)であり 、これはシアル酸残基を糖タンパク質のＮ結合型炭水化物基に転移する。例えば 、Lowe，Semin ．Cell Biol．2:289-307(1991)を参照のこと。酵素α(2,6)STはヒ ト内皮細胞、Ｂ細胞などに発現し、従って抗原性ではないはずである。Dorkenら 、Leukocyte Typing IV ，White Cell Differentlation Antigens，Knappら編、O xford University Press，109-110頁、(1989)およびHanasakiら、J ．Biol．Chem ． 269:10637-10643(1994)を参照のこと。実際、その陰電荷のために、シアル酸 は時にヒト補体の副経路の活性を阻害することが示されている。Fearon，P ．N． A．S． 75:1971-1975(1978)を参照のこと。しかし、再度、シアリルトランスフェ ラーゼの間には大きな相違が存在し、そして任意の特定のシアリルトランスフェ ラーゼの有効性は相互に異なり得る。 α(1,3)GT酵素経路と競合し得る経路に関与し得るなお別のグリコシルトラン スフェラーゼは、β1,3N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(すなわち 、「β(1,3)NAGT」)であり、これはKornfieldら、Ann ．Rev．Biochem．54:631-6 64(1985)に記載される。しかし、β(1,3)NAGTに関連する複雑な酵素経路は解明 にはほど遠く、そしてこのような酵素が異種移植に有用な異種ドナーの組織、器 官、細胞、または非生存成分におけるgalエピトープのレベルを低下させる方法 において有用であることは開示も示唆もされていない。 さらに、XNA結合(および続く補体活性化)の低減を達成し、そしてトランスジ エニック動物から、ヒト患者に移植した際の抗体媒介性拒絶反応が低減している かまたは消失している、使用し得るドナー組織または器官の大規模な作製を可能 にするために、ブタおよびマウスのようなトランスジェニック動物において、任 意の他のグリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ヒトのα(1,2)FTまたはα(2,6 )ST)の発現によって複数の器官の内皮細胞上に適切な抗原を産生し得ることは、 まだ、以前に示されていない。さらに、以前の研究者らは、galエピトープの発 現が変更されており、異種移植に有用であるトランスジェニック動物を作製する ために、シアリルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼのよう な糖構造の使用に関与する技術は見込みがないと考えていた。Cooperら、Immuno logical Reviews 141:31-57(1994)を参照のこと。さらに、シアリルトランスフ ェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼの複雑さ、ならびにこれらの群の個 々のメンバー間の実質的な差異のために(例えば、Kitagawaら、J ．Biol．Chem. ，269:17872-17878，1994を参照のこと)、これらの群の任意の特定のメンバーの 潜在的な有用性は不確実または予測不能なままであり、そして実際これらの酵素 の多くは異種移植には望ましくないかもしれない。 さらに、抗原性galエピトープを有効にマスクするかまたはそのレベルを低下 させ得る一方で、同時に異種移植後の補体カスケードを活性化する可能性または 見込みを低減させる複数のタイプの遺伝子を発現するトランスジェニック動物が 調製され得ることは示されていない。同様に、補体インヒビターの遺伝子が、移 植での使用に適切なトランスジェニック動物を作製するために、galエピトープ をマスクするかまたはそのレベルを低下させる遺伝子と組み合わせて使用され得 ることもまた、以前には示されていない。最後に、ドナー動物からの器官、組織 、細胞、または非生存成分がヒト患者に移植される際の抗体媒介性拒絶反応に対 する防御のレベルの上昇を提供するために、ドナー動物にトランスフェクトされ そして発現され得る１つのDNA構築物上に複数の遺伝子を配置することは、以前 に達成されていない。発明の要旨 従って、本発明の目的は、galエピトープをマスクするかまたはそのレベルを 低下させ得る酵素および補体インヒビターの両方を発現し、そして従って、抗原 性galエピトープのレベルの低下、およびそれに続くこれらのトランスジェニッ ク動物からの器官、組織、細胞、または非生存成分の移植によって引き起こされ る補体活性化の減少の両方を達成し得る、トランスジェニック動物(例えばブタ 、(またはマウス))を開発することである。 本発明の目的はまた、移植後のXNA結合およびそれに続く補体活性化の両方を 実質的な低減を達成し、従ってヒト患者に移植した際の超急性拒絶反応のような 抗体媒介性拒絶反応および補体媒介性拒絶反応を低減または阻止する能力のため に、異種移植において有用である、トランスジェニック動物を提供することであ る。 本発明の目的はまた、少なくとも１つの酵素(α(1,2)フコシルトランスフェラ ーゼ、α(2,6)シアリルトランスフェラーゼ、β(1,3)N-アセチルグルコサミニル トランスフェラーゼ、またはgalエピトープをマスクし得るかまたはそのレベル を低下させ得る他の適切なグリコシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限 定されない)、ならびに少なくとも１つの補体インヒビター(CD59、DAF、および ／またはMCPを含むがこれらに限定されない)を発現するトランスジェニック動物 を得るための方法を、ヒト移植レシピエントにおける抗体媒介性拒絶反応または 補体媒介性拒絶反応を低減または消去するために、本発明によって作製されたト ランスジェニック動物からのドナーの器官、組織、細胞、または非生存成分を利 用する異種移植を達成するための方法と共に、提供することである。 本発明のさらなる目的は、グリコトランスフェラーゼまたは内皮細胞における galエピトープをマスクし得るかまたはそのレベルを低下させ得る他の適切な酵 素を発現し得るトランスジェニック動物を作製することによって、galエピトー プがマスクされるかまたはそのレベルが低下しておりそしてヒト患者に移植した 際に抗体媒介性拒絶反応を生じる可能性がより少ない、適切なドナー器官、組織 、細胞、または非生存成分の豊富な供給源を得るための方法を提供することであ る。 本発明のなおさらなる目的は、galエピトープをマスクし得るかまたはそのレ ベルを低下させ得る少なくとも１つの酵素(α(1,2)FT、α(2,6)ST、またはβ(1, 3)NAGTのような酵素を含むがこれらに限定されない)を、補体インヒビター(CD59 、DAF、および／またはMCPを含むがこれらに限定されない)をコードする少なく とも１つの遺伝子と共に両方発現する、異種の器官、組織、細胞、または非生存 組織を提供することである。従って、これは、Galα(1,3)Galエピトープがマス クされているかまたはそのレベルが低下しており、そしてヒト患者への移植後の 抗体媒介性拒絶反応または補体媒介性拒絶反応を引き起こす見込みが大いに減少 している。 本発明のなおさらなる目的は、２つ以上の補体インヒビタータンパク質をコー ドする複数の遺伝子座をコードする核酸構築物を発現し、そして好ましくはこれ らの補体インヒビター全てを高レベルで発現するトランスジェニックブタを作製 することである。 本発明のなおさらなる目的は、単一のDNA構築物中に、galエピトープをマスク し得るかまたはそのレベルを低下させ得る少なくとも１つの酵素(α(1,2)フコシ ルトランスフェラーゼ、α(2,6)シアリルトランスフェラーゼ、またはβ(1,3)N- アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない)、 および少なくとも１つの補体インヒビター(CD59、DAF、および／またはMCPを含 むがこれらに限定されない)をコードする核酸を提供すること、およびヒトへの 移植のためのドナーの器官、組織、細胞、または非生存成分を提供することに有 用なこのDNA構築物を発現し得るトランスジェニック動物を作製するための方法 を提供することである。 本発明のこれらおよび他の目的は、本発明において、抗原性Galα(1,3)Galま たはgalエピトープをマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１ つの酵素(α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ(「α(1,2)FT」)、α(2,6)シアリ ルトランスフェラーゼ(「α(2,6)ST」)、および／またはβ(1,3)N-アセチルグル コサミニルトランスフェラーゼ(「β(1,3)NAGT」)のようなグリコシルトランス フェラーゼを含むがこれらに限定されない）を、少なくとも１つの補体阻害タン パク質(CD59、DAF、および／またはMCPのようなタンパク質を含むがこれらに限 定されない)と共に両方を発現するトランスジェニック動物の作製によって、達 成される。従って、本発明によって作製されたトランスジェニック動物は、酵素 α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼと競合し、従ってgalエピトープ(これ は、さもなければヒトにおいて異種反応性自然抗体(XNA)によって認識され、そ れにより抗体媒介性拒絶反応を導く)の産生をマスクするかまたは低減させる少 なくとも１つの酵素を発現する。 さらに、本発明によれば、補体インヒビタータンパク質の３つの遺伝子座のよ うな複数の補体インヒビターをコードする核酸構築物を発現しそして好ましくは これらの３つ全での補体インヒビターを高レベルで発現する、トランスジェニッ ク動物が提供される。本発明のこの局面によるトランスジェニック動物の構築に よって、ドナー器官、組織、細胞、および非生存成分が、XNAによる外来組織の 認識後に生じる補体の活性化を抑制するように作用する補体調節タンパク質を発 現するこれらのトランスジェニック動物から得られ得る。そしてヒトへのこれら の移植後に生じる免疫拒絶反応は、大いに低減するかまたは消去される。 従って、本発明の方法は、それゆえ、安全かつ有効にヒトに移植され得、そし てそれゆえヒトまたは霊長類ドナーからの器官、組織、細胞、および非生存成分 を得る必要性を低減するかまたは消失させる、異種の器官、組織、細胞、および 非生存成分を提供することにおいて有用である。さらに、本発明は、以下に提供 される発明の詳細な説明に記載されるかまたはそこから明らかであるように、ga lエピトープをマスクするかまたはそのレベルを低下させ得る酵素をコードする 核酸も含むようにまた調製され得る、単一のDNA構築物に、補体阻害タンパク質 の複数の遺伝子座を提供する。図面の簡単な説明 本発明は、ここでその好ましい実施態様に関して詳細に記載され、これは添付 の図面とひとまとめに考えられるべきである。ここで： 図１は、本発明によるCD59ミニ遺伝子の構築に関する。ヒトCD59遺伝子座のゲ ノム構造を上の図に示す。下の図は、構築された２つのCD59ミニ遺伝子(CD59ミ ニ遺伝子１およびCD59ミニ遺伝子２)、およびCD59ミニ遺伝子カセットであり、 これはCD59ミニ遺伝子２に基づく。点線は、各ミニ遺伝子構築物から割愛された ヒト遺伝子における配列を示す。下の図の各ミニ遺伝子構築物は、CD59遺伝子の それぞれの部分の何キロベースがこのミニ遺伝子の各部分に存在するかを示す； 図２は、トランスジェニックマウス赤血球補体媒介性溶解に関する。図面から 観察されるように、ヒトCD59の発現によって、ヒト血清に曝露した際の補体媒介 性溶解に対する防御が細胞に与えられる。ヒト血清の種々の希釈物とのインキュ ベーション後、赤血球の溶解の際のヘモグロビンの吸光度を測定することによっ て、この防御活性を検出し得る。非トランスジェニックC57BL/6マウスの赤血球 の50％が約３％ヒト血清で溶解するが、一方、CD59ミニ遺伝子２マウス由来の赤 血球の50％溶解は約27％ヒト血清で観察される。これは、約９％ヒト血清で溶解 するCD59 P1マウス赤血球の50％溶解とは対照的である。従って、CD59ミニ遺伝 子２マウス赤血球は、補体媒介性溶解に対して、非トランスジェニックマウス赤 血球と比較して約10倍耐性であり、そしてCD59 P1マウス赤血球よりも約３倍耐 性である； 図３は、本発明に従って作製したCD59トランスジェニックマウスのノーザン分 析を示す。示したヒト組織、トランスジェニックCD59 P1マウス組織、CD59ミニ 遺伝子番号２マウス組織、およびCD59ミニ遺伝子番号１マウス組織由来のRNAを 、ノーザンブロットによって分析した。ここまでで分析した全てのCD59ミニ遺伝 子番号２マウス組織は、ミニ遺伝子構築物におけるポリアデニル化に利用可能で あるものに基づいで、可能な0.7、1.3、1.9、または2.1Kbメッセージと比較して 、3.1kb CD59メッセージをコードする。本発明者らは、このメッセージはインタ クトなコード領域を含み、そして既知のポリアデニル化部位を利用することを示 した。転写物のサイズの変化は、イントロン１内の異常なスペーシングによるよ うである。しかし、機能的なヒトCD59タンパク質はこの転写物から産生される； 図４は、P1組立のための新しいYACクローニングベクターに関し、そしてMCP、 CD59、およびDAFを(この順で)含む構築物を作製するために使用される適切な制 限部位の全てを含むYACを示す； 図５は、P1クローンに関し、そしてこれは、３つの全ての補体調節タンパク質 を１つのYACに組込むために用いられる別のストラテジーの図である。このスト ラテジーを用いて、３連遺伝子クローンは、相同組換えおよび適切な組換え体を 選択するための栄養要求性マーカーを用いて連続的に組み立てられる(より詳細 には実施例Ｖを参照のこと)； 図６は、本発明に従って使用されるcDNA発現構築物番号876の概略図である； 図７は、本発明に従って使用されるcDNA発現構築物番号881の概略図である； 図８は、本発明に従って使用されるcDNA発現構築物番号882の概略図である； 図９は、レクチン結合アッセイで測定したときの、トランスフェクトされてい ないCHO細胞(すなわち、CHO-N細胞、■と示す)、α(1,3)GT遺伝子でトランスフ ェクトしたCHO細胞(すなわち、CHO/GT細胞、○と示す)、およびα(1,2)FT遺伝子 でトランスフェクトしたCHO/GT細胞(CHO/GTFT細胞、□と示す)へのUEA-IまたはG S-1B4レクチンの結合のグラフである； 図１０は、SDS-PAGE(８％ゲル)で分離しそして膜に移した、CHO-N細胞、CHO/G T細胞、およびCHO/GTFT細胞の膜糖タンパク質へ結合しているUEA-IおよびGS-1-B4 レクチンのSDS-PAGE表示である； 図１１は、本発明によるトランスジェニックマウスで産生されたα(1,2)FT mR NAのノーザン分析の表示である； 図１２Ａ〜Ｄは、FITC結合レクチンで染色した、トランスジェニックマウスお よび非トランスジェニックマウスの心臓切片の顕微鏡蛍光分析の顕微鏡写真であ る。これは、本発明によるα(1,2)FT遺伝子の発現のおかげのgalエピトープの減 少を証明する。ここで、ＡおよびＢは、それぞれ、UEA-Iで染色した、非トラン スジェニックの心臓およびトランスジェニックの心臓である。そしてＣおよびＤ は、それぞれ、GS-1-B4で染色した、非トランスジェニックの心臓および非トラ ンスジェニックの心臓である； 図１３Ａは、本発明に従って作製されたα(1,2)FTトランスジェニックマウス の内皮細胞への異種反応性自然抗体の結合の減少の、非トランスジェニックマウ スと比較した際のフローサイトメトリー分析である； 図１３Ｂは、本発明に従って作製されたα(1,2)FTトランスジェニックマウス の内皮細胞と共にウサギ血清をインキュベートした後の補体媒介性溶解のレベル の、非トランスジェニックマウスと比較した際の低下のグラフである；そして 図１４Ａ〜Ｄは、α(1,2)FTトランスジェニックブタおよび非トランスジェニ ックブタの尾部切片の顕微鏡蛍光分析の顕微鏡写真である。これは、本発明によ るα(1,2)FT遺伝子の発現によるgalエピトープの減少を証明する。ここで、Ａお よびＢは、それぞれ、UEA-Iで染色した、非トランスジェニックブタの尾部およ びトランスジェニックブタの尾部であり、そしてＣおよびＤは、それぞれ、GS-1 -B4で染色した、非トランスジェニックブタの尾部およびトランスジェニックブ タの尾部である。好ましい実施態様の詳細な説明 本発明に従って、超急性拒絶反応のような抗体媒介性拒絶反応および補体媒介 性拒絶反応を低減させるか、または阻止する１つの方法が、器官、組織、細胞ま たは非生存成分をヒト患者に異種移植するために提供される。そしてこの方法は 、 好ましくは、トランスジェニック動物を作製する工程を含む。トランスジェニッ ク動物は、抗原性galエピトープ抗原のような異種反応性抗原のレベルを低下し 得る少なくとも１つの酵素（α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ(「α(1,2)FT 」)、α(2,6)シアリルトランスフェラーゼ(「α(2,6)ST」)、および／またはβ( 1,3)N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(「β(1,3)NAGT」)のような グリコシルトランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない）、および少なく とも１つの補体阻害タンパク質（CD59、DAF、および／またはMCPを含むがこれら に限定されない）を発現する。さらに、本発明は、宿主中で免疫システムの拒絶 反応を低減するか、または排除する異種移植の方法において有用であり得る、適 切なドナー器官、組織、細胞、および非生存成分の大量供給を提供するためにこ のように作製されたトランスジェック動物を利用する方法を含む。 本発明は、ドナー組織のレシピエント中の異種反応性自然抗体(XNA)の結合お よびそれに続く補体活性化によって引き起こされる、異種移植に関するこれまで の問題を克服するために、および抗体媒介性拒絶反応を低減するか、または排除 する異種移植において有用な、適切なドナー器官、組織、細胞、および非生存成 分の大量供給を提供するために展開されてきた。特に、本発明の発明者らは、α (1,2)FT、α(2,6)ST、および／またはβ(1,3)NAGTを含む、α(1,3)GT酵素と競合 し得る特異的な酵素が、これらの特異的な酵素を発現している器官、組織、細胞 、および非生存成分中で、galエピトープをマスクするかまたはそのレベルを低 下することにおいて有用であり得ることを決定した。さらに、異種移植後に生じ る重篤な免疫反応を低減するか、または回避するための試みにおいて、補体阻害 タンパク質を用いることが以前から望まれていたという事実にもかかわらず、従 来の方法は以前から、組織移植後の補体活性の有意な低下を達成し、そして抗体 媒介性拒絶反応および補体媒介性拒絶反応を低減させるために、内皮細胞中の十 分なレベルの補体インヒビターを発現し得る適切な様式を提供することにおいて 効果がなかった。特に、内皮細胞上のＣインヒビターを使用するための以前の試 みは、ドナー器官の内皮細胞で、一定の、高レベルな補体インヒビターの発現を 維持することができなかった。 本発明においで、出願人はここで初めて、トランスジェニック動物およびDNA 構築物を調製した。それらのDNA構築物は同一の組み込み部位に、内皮細胞中の 抗原性galエピトープのレベルを低下し得る少なくとも１つの酵素および少なく とも１つの補体インヒビタータンパク質または補体調節タンパク質をコードする 核酸を含む。特に、これは酵母人工染色体(すなわちYAC)の手段によって達成さ れ得る。YACは、特に好ましい実施態様において、galエピトープのレベルを低下 し得る酵素をコードする多くの遺伝子を多くの補体阻害タンパク質をコードして いる遺伝子とともに含む、大きなDNA断片を構成し得る。本発明のYACを使用する ことによって、明確な利点が得られる。なぜなら、所望の１つまたは複数の酵素 をコードする複数の遺伝子は、所望の補体阻害タンパク質をコードする複数の遺 伝子と結合し、そして全ての所望の酵素およびタンパク質をコードする単一のDN A構築物が得られ得る。 このように、YACは好ましくは、多くのインヒビター遺伝子を含むように操作 される。全ての遺伝子を単一のYAC上に配置することによって、全ての遺伝子を 、以前は得られなかった様式で同じ部位へ組み込むことが確実であり、そしてこ れらの遺伝子は、増殖の際に互いに分離しない。YACは、他の従来のクローニン グベクターと比べてその高い挿入能力のために使用されている。本発明に記載の これら大きなYACの使用は、適切なトランスジェニック動物を得る効率を大きく 改善した。なぜなら、２つの所望の型のタンパク質（特に、上記の所望の酵素お よび補体阻害タンパク質）の発現を得るため、および以前に得られたいずれのト ランスジェニック動物よりも異種移植に対してさらにより適切なトランスジェニ ック動物を作製するために、この単一のYAC構築物を所望の動物へトランスフェ クトさせることのみを必要とするからである。 本発明の他の好ましい実施態様において、所望の遺伝子は、１つの構築物上に 全ての所望の遺伝子を含み得るミニ遺伝子の形で調製されるか、またはここでい くつかがgalエピトープのレベルを低下し得るか、またはマスクし得る少なくと も１つの特異的な所望の酵素をコードする核酸を含み、そしていくつかが、少な くとも１つの所望の補体阻害タンパク質をコードする核酸をを含む、多くのミニ 遺伝子が構築される。この後者の場合、galエピトープのレベルを低下させ得る 少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つのミニ遺伝子が、少なくとも １つの補体インヒビターをコードする少なくとも１つのミニ遺伝子とともにトラ ンスフェクトされ、その結果、本発明に記載の所望の酵素と所望の補体インヒビ ターの両方を発現するトランスジェニック動物が得られる。 本発明に記載のなお別の工程において、バクテリオファージP1クローンの形態 の構築物もまた使用される。好ましい実施態様において、CD59 P1クローン(およ び他の補体調節タンパク質P1クローン)が産生され得る。このクローンは、理想 的にはCD59、MCPおよびDAFの完全なゲノム調節システムを含み、それによって直 接的にまたは遺伝物質の供給源としてのいずれかで、有用であることが証明され 得る。構築物の大きさのために、P1構築物中のCD59遺伝子の発現は、組み込み部 位、すなわち緩衝剤として作用するインサートの末端部位によってわずかに影響 を受けているようである。 本発明に記載のトランスジェニック動物を作製する工程で使用するために適切 な、上記に記載の好ましい工程において、１つまたはそれ以上のヒト補体調節タ ンパク質（CD59、DAFおよび／またはMCPを含むがこれらに限定されない）の高度 な発現は、超急性拒絶反応を含む抗体媒介性拒絶反応または補体媒介性拒絶反応 の開始を低減または妨げ得る、galエピトープのレベルを低下させる酵素の発現 との組合せにおいてドナー器官の内皮のために常に達成される。これらの発現ベ クターが少なくども１つの補体阻害タンパク質(CD59、MCPまたはDAFのような)を 含むことが好ましいが、特に好ましい構築物においては、多数の補体インヒビタ ーが単一のクローン中で使用される。これらの動物は、内皮細胞中で、構成的な 高いレベルの補体インヒビター発現を有しており、従って、観察された超急性拒 絶反応の低減が達成される。さらに、以下に示すように、本発明に従って形成さ れた、１つまたはそれ以上の補体阻害タンパク質を発現する核酸構築物は、トラ ンスジェニックマウスおよびトランスジェニックブタの両方の内皮細胞中のgal エピトープのレベルを低下させ得る酵素を発現する核酸構築物と組み合わされ得 る。 従って、本発明は、タンパク質（α(1,2)FT、α(2,6)STおよびβ(1,3)NAGTの ようなグリコシルトランスフェラーゼ酵素を含むがこれらに限定されない）の発 現に関する。これらのタンパク質は、補体阻害タンパク質（CD59、DAF、MCPおよ び／または本明細書中で記載されているさらなる補体インヒビターを含むがこれ に限定されない）の発現とともに、これらのタンパク質および酵素を産生する遺 伝子を含むように遺伝子操作されたかあるいは繁殖させたトランスジェニック動 物の内皮細胞の表面上で、抗原性Galα(1,3)Galまたはgalエピトープのレベルを マスクするか、または低下させる。 上記のように、本発明の１つの好ましい局面は、少なくとも１つの補体阻害タ ンパク質(CD59、DAF、および／またはMCPを含むがこれらに限定されない)を発現 するための、内皮細胞の表面上の抗原性galエピトープのレベルを低下させる酵 素を伴う、ミニ遺伝子の調製と使用である。本発明のトランスジェニック動物の 調製において、抗原性Galα(1,3)Galまたはgalエピトープのレベルを低下するか 、またはマスクする酵素をコードするDNAコードのような核酸が、ミニ遺伝子の 形態におけるように、単一の核酸構築物中に組み込まれることが好ましい。この ミニ遺伝子はまた、CD59、ならびに／またはDAFおよびMCPを含む以下に記載され るような他の補体インヒビターのような、少なくとも１つの補体インヒビタータ ンパク質をコードする核酸を含む。あるいは、galエピトープのレベルを低下さ せ得る酵素を一方でコードし、そして他方で１つまたはそれ以上の補体阻害タン パク質をコードする分離ミニ遺伝子がまた調製され得、そして本発明のこの様式 において、２つのタイプのミニ遺伝子が、本発明に記載の両方の所望のタイプの 遺伝子を有する子孫を得るために、トランスジェニック動物へ同時に注入され得 る。本発明のミニ遺伝子の構築はここでより詳細に記載される。 Ａ．CD59 ミニ遺伝子 コード配列は、適切な条件下でメッセンジャーRNAに転写され、そしてポリペ プチドに翻訳される配列である。遺伝コードの縮重のために、同じポリペプチド をコードする多くの異なるDNA配列が存在し、それらの全てが同じペプチドのコ ード配列であるど考えられる。用語「コード配列」は、必要に応じて変更を加え て、「アンチセンスRNA」に転写されるDNA配列に適用するためにまた使用される 。アンチセンスRNAは単に標的メッセンジャーRNAにハイブリダイズすることが予 想されるメッセンジャーRNA転写物であり、それによってポリペプチドへの標的 メ ッセージの翻訳を阻害する。「アンチセンスRNA」がポリペプチドに翻訳される ことは必要ではない。 「調節配列」はまた、コード配列の転写及び翻訳に影響すると定義され得る。 プロモーターは５’側（コード配列の上流）に位置する調節領域であり、そして DNA特異的RNAポリメラーゼが結合するための部位を含み、それによって翻訳を開 始する。用語「プロモーター」はしばしば、結合部位だけではなくコード配列の ５’側の調節エレメントの複合体に関してもまた使用され、しばしばコード配列 が発現される環境を決定するエレメントを含んでいる。調節DNAはまた、「ター ミネーター」のような、コード配列の３’側に位置する配列を含む。 哺乳動物ゲノムにおいて、特定の遺伝子のコード配列は、「仲介配列」または 「イントロン」ど呼ばれる非コード配列によって分断される。このように、コー ド配列は、多くの「エキソン」へと分割されていると言われている。このような 遺伝子のゲノムDNAは、プレメッセンジャーRNAに転写される。次いで、プレメッ センジャーRNAはプロセスされて、イントロンを取り除かれ、成熟RNA転写物を生 じる。次いで、後者はポリペプチドへ翻訳される。特定の遺伝子については、イ ントロンは、遺伝子の転写または翻訳に影響し得る調節エレメントを含む。例え ば、ヒトトロンポスポンジン遺伝子の最初のイントロンの除去が転写活性の４倍 の損失を生じることを報告している、LahertyらJ ．Biol．Chem.，264:11222-27( 1989)を参照のこと。 完全な遺伝子が直接ゲノムから単離される場合、もし存在するなら、それはイ ントロンを含む。しかし、コード配列は、細胞から成熟メッセンジャーRNAを単 離し、次いで相補DNA(cDNA)を合成することによって得ることができる。cDNAの コード配列は、イントロンによって分断されない。 ミニ遺伝子は、オーセンティックなゲノム配列とは、１つ以上のイントロンの 少なくとも一部が欠失されている点で異なるが、対応するcDNAとは、それが１つ 以上のイントロンの少なくとも一部を有する点で異なる遺伝子である。ミニ遺伝 子は、ゲノムフラグメント由来の遺伝子材料を欠失することにより、遺伝子材料 をcDNA中に挿入することにより、または直接的合成により構築され得る。 CD59遺伝子の構造は、Petrankaら、Proc ．Nat．Acad．Sci．(USA)89:7876-79 (1992)および90.5878(1993)、ならびにImutran Limitedに対して発行されたPCT 出願国際公開第WO 96/12804号に記載されている。CD59遺伝子は、約20kbに広が る４つのエキソンを含む。第１のエキソンは長さが45bpであり、そして全体が翻 訳されない。これはエキソン２からイントロン（もとは5.4kbであると記載され たが、後に19kbであると決定された）により分離されている。エキソン２は85bp 長であり、そして18bpの非翻訳領域、およびそれに続くこのタンパク質の疎水性 シグナル配列の大部分をコードする配列を含む。エキソン２とエキソン３とは、 約５kbのイントロンにより分離されている。エキソン３は長さが102bpであり、 そしてリーダー配列の残りおよび成熟タンパク質の最初の31アミノ酸をコードす る。エキソン４は７kbのイントロンの後に始まる。エキソン４は翻訳配列の残り および少なくとも1438bpのUT配列を含む。 CD59ミニ遺伝子の構築を、トランスジェニック動物中で異種プロモーターによ り駆動されるcDNAの使用に固有な欠陥に取り組むために着手した。このような構 築物についての一般的な観察は、誘導されたトランスジェニック動物系統間での トランスジーンの発現の不一致、および内因性遺伝子について見られる発現と一 致しない組織および細胞型発現であった。さらに、トランスジーン発現のレベル はしばしば至適ではない。同種プロモーターの使用がこれらの問題を克服すると 推論された。レベルおよび組織／細胞型特異性に関してそれぞれの遺伝子の適切 な発現を指向させるために必要かつ十分であるCRPの領域は、公に開示されてい ない。さらに、これまでにマッピングされた各々の遺伝子は非常に大きく、少な くとも40Kbである。それゆえ、CD59ミニ遺伝子の構築に着手した。CD59を、いく つかの理由で原型として選択した。CD59は、それが４つのエキソンのみ（DAFに おける11エキソンおよびMCPにおける14エキソンに比較して）を有するという点 で、Ｃインヒビター遺伝子のなかで最も単純である。CD59は、オルタナティブな ポリアデニル化部位を用いるが、ディファレンシャルなスプライシングは利用し ないようである。MCPおよびDAF遺伝子の転写は、ディファレンシャルなスプライ シングに起因ずるいくつかのRNAイソ型を生じ、このことは最終的な構築物中に どのエキソンを含むかを選択することを困難にする。さらに、CD59は、本発明者 らが関心を持つすべての関連する細胞型において高レベルで発現されるが、例 えばMCPはそうではない。 いくつかの考慮がCD59 Minigene 1の設計に寄与した。２つ以上のミニ遺伝子 またはミニ遺伝子カセットの同時組み込みの可能性を開拓するためには、CD59 M inigeneの大きさを制限することが重要であった。大部分のイントロン配列を省 略し得、イントロン１の一部（4.5kb）をインタクトに保って、スプライシング をさせ得ることを決定した。通常少なくとも１つのスプライス部位が、効率的な トランスジーン発現のために重要である。エキソン１は非コードエキソンであり 、そしてイントロン１は遺伝子発現の調節のために重要でありそうであると最も 考えられたので、イントロン１を選択した。なぜなら、遺伝子のこのような大き な非コード領域のその保存は、それがなんらかの局面（すなわち、遺伝子調節） において機能性であるために選択されたかもしれないからである。 遺伝子発現を担うプロモーター配列は規定されておらず、そして転写開始部位 の5'側の遺伝子の領域の解析では、転写開始部位のすぐ上流の２つのSp1部位以 外のいかなる転写因子結合部位も明らかとならなかった。一般に、そのサイズの 領域は遺伝子調節領域を含むに十分大きいはずであるが、それがCD59の5'側に存 在し得、そしてCD59と向かい合わせの（head-to-head）方向で配置され得る遺伝 子のための調節領域も含むほど大きくはないという経験に基づいて、6.5Kbの領 域を、プロモーター配列として使用するために選択した。もしそのようなことが 起これば、遺伝子発現の調節の干渉を経験し得る。 3'非翻訳配列の約4.7KbをCD59 Minigene 1中に含めて、５つのポリアデニル化 部位のうち４つが存在することを確実にした。第５の部位（これは相対的に低い 頻度で使用される）はマッピングされていないが、最も頻繁に使用される部位の さらに少なくとも３Kb下流である。3'非翻訳領域が、mRNAに安定性を与える配列 を含むということがいくつかの遺伝子において示され、そしてCD59がその場合で あれば、4.7Kbはそのような領域を含むはずであるということが感じられた。 CD59のコード領域を、cDNAとして、エキソン２の5'側に付加される合成スプラ イスアクセプター部位とともに構築物中に挿入した。これは最も単純なアプロー チであった。なぜなら、もしあれば、どの残りのイントロンが遺伝子発現の調節 に対して影響を発揮し得るかを決定するための先験的な方法が存在しなかったか らである。 Mini-Gene 2において、CD59遺伝子転写の低レベルに取り組むために、内在性 イントロンの部分を各エキソンを取り囲むように付加した。このことは、プレRN Aの分岐点（これは、スプライシングのために重要である）、ならびに２次構造 を維持するために必要であり得る周囲の配列およびスプライシングのために必要 とされるタンパク質の結合部位が、各スプライスアクセプター部位に含まれるこ とを確実にした。これらの領域を組み込むためには、各エキソンの5'側および3' 側の両方の、少なくとも200bpのイントロンが、新たなミニ遺伝子中に含まれる べきであることが推論された。しかし、当業者は、本明細書に照らして、より少 ないまたはより多い量のイントロンの近接部分を含めて実験し得る。各イントロ ンの3'末端および5'末端において保持される量は同じであり得るか異なり得、そ してイントロン毎に変動し得る。 CD59 Minigene 2の3'非翻訳領域を、4.7Kbから1.7Kbに減少させた。以前に記 載したように、本発明者らはミニ遺伝子の大きさを最小に保つことに関心を有し 、そして1.7Kbは４つの最も頻繁に使用されるポリアデニル化部位を含んだ。さ らに、可能な安定化配列を含むように、より大きな3'領域をCD59 Minigene 1に おいて使用したが、遺伝子の3'末端に不安定化配列が存在する可能性もまた存在 した。しかし、本明細書により導かれるように、当業者は、より多いまたはより 少ない量の3'領域を含むこと、あるいは選択される、中立の、または不安定化す る3'領域内の配列を欠失させ、次いでその領域の以前は非連続的であった配列を 連結することの効果を試験し得る。 CD59 Minigene 2の5'側を、いくつかの観察に基づいて6.5Kbから4.6Kbに減少 させた。共同研究者からの連絡により、DNase I高感受性部位が、転写開始部位 のかなり近くのCD59 5'領域に存在することが明らかとなり、このことは、これ が転写調節のために必要な領域であり、そしてさらなる配列は不要であることを 示した。上記のように、ミニ遺伝子を最小の大きさに削り込むことが、複数の遺 伝子を同時注入するために、本発明者らが最も関心を有することである。第２に 、CD59 Minigene 1において使用した6.5Kb 5'領域のクローニングが、5'側の大 部分の領域の再編成および欠失をしばしば生じたことが観察された。この領域 が不安定であり、それゆえトランスジーンとして所望されないという可能性が存 在した。後に、２つの異なるゲノムP1クローンの解析に由来する予備的かつ後に 立証されていないデータは、CD59のより小さい5'領域が、実質的により高いレベ ルの遺伝子発現を生じたことを示した。もちろん、本明細書により導かれるよう に、読者は、より多いまたはより少ない量の5'領域を含めて、そしてその中立ま たは不安定化領域の選択的な欠失を有して実験し得る。 CD59 Minigene 2を発現カセットとして利用するために、多数の変更を履行し た。第１に、CD59 Minigene 1を、cDNAの非翻訳エキソン１中のXho I部位中への 挿入により発現カセットに変換するという試みは、挿入されたcDNAの発現が希で あり、そして存在したとしても極めて低かったという点で成功しなかった。プロ モーター領域へのさらなる研究は、これが、CD59プロモーター（これは無TATAプ ロモーターである）が転写エレメントの結合のためのイニシエーターエレメント （代表的にはInrという）を最も利用しそうであったからであると信じるように 導いた。Inrは、通常、転写開始部位に非常に近位に位置する。挿入部位として 使用したXho I部位はまた、転写開始部位に非常に近く、それゆえこの領域の破 壊は転写開始を危うくしたかもしれない。さらに、CD59 Minigene 1構築物を発 現カセットとしで使用した方法は、CD59コード領域をインタクトなままにした。 このことは、CD59対挿入されたcDNAの発現についての競合を引き起こし得る。 上記に取り組むために、エキソン２中の開始メチオニンをコードするATGを変 異させ、そしてその位置に２つの唯一の制限酵素部位であるKpn IおよびXho Iを 挿入した。これらの部位は、任意の目的の遺伝子を導入するためのクローニング 部位として作用する。CD59 Minigene 2に対する第２の改変は、協同研究者から 受けたさらなる連絡に基づいた。第２のDNase I高感受性部位が、エキソン２の 上流約0.9Kbに位置付けられたことが明らかとなった。DNase I高感受性部位は、 しばしば、遺伝子調節において重要な領域と相関する。この潜在的に重要なDNA の領域をCD59 Minigene 2カセット中に含めるために、さらなる0.83KbのDNAを、 既存の0.5Kbのイントロン１（これはエキソン２の直接5'側であった）に付加し て、全部で1.3Kbのイントロン配列を得た。 Minigene 2 Cassetteに対するいくつかの変更が可能である。いくつかを以下 に概説する。異なるプロモーター DNAの種々の断片の構築の順序は、最後の工程として付加されるべきプロモー ターエレメントを必要とする。これは、異なるプロモーターがCD59のプロモータ ーと交換されることを可能にする。この理由を以下に示す。いくつかの場合にお いて、発現のタイミング（例えば、胎児発生の間の）は、特定の遺伝子について 重要であり、そしてもし不適切であれば致死性を誘導し得る。それゆえ、トラン スジェニック動物の発生の間のそれらの発現を制御するために、いくつかの遺伝 子のために異なるプロモーターを使用することが重要であり得る。同じ線に沿っ て、CD59はRBCに、おいて高レベルで発現される。動物にとってRBCにおいて発現 される特定の他の遺伝子を有することは有害であり得、それゆえ致死的な構築物 を作製することになる。それゆえ、わずかに異なるレパトアの細胞および組織型 特異性を有するプロモーターを、カセット中に有することが重要であり得る。好 ましい代替プロモーターは、DAFおよびMCPプロモーターを含む。誘導性エレメント 異なるレベルで発現のタイミングを制御するために、転写開始部位の5'側に誘 導性エレメントを付加することもまた興味深くあり得る。例えば、異種移植片の 再灌流直後の時間、これは移植物の生存に重大であり、CRP発現を「超誘導」し 得る。このようなものの例は、例えば、γインターフェロンに応答性のエレメン トを含む。さらに、「応答」エレメントを有するサプレッサーエレメントを付加 し得る。応答エレメントはサプレッサーエレメントにより制御され、その結果、 転写はサプレッサーが取り去られるまで常にオフ状態にある。このシナリオの例 は、それによって発現がテトラサイクリンの投与により抑制され、そして抑制が テトラサイクリンの撤去により除去される、tetリプレッサーエレメントの使用 である。非コード配列の除去 さらなるイントロン配列の多くの除去は、ミニ遺伝子２の発現レベルまたは組 織および細胞型特異性に影響することなく可能である。これは、十分な転写を達 成するために、多くのトランスジーンが有するような一般的な必要条件を満たす 少なくとも１つのインタクトなイントロンを保ちながら、各イントロンを系統的 に除去することにより経験的に試験され得る。得られる構築物は、CD59プロモー ターがほとんどのマウス腺維芽細胞株において機能すると仮定した場合、組織培 養でアッセイされ得る。機能しない場合、各イントロンの必要性を試験するため に、SV40プロモーター／エンハンサーエレメントのような一般的なプロモーター に交換され得る。あるいは、各構築物は、マウスのトランスジーンとして試験さ れ得る。系統的なプロモーターの欠失分析はまた、上記のリードアウト（readou t）系を用いて可能である。3'領域のさらなる欠失は、予想される1.9／2.1kbメ ッセージと比較して、約3.1kbのmRNAを与える、文献に記載される部位よりもさ らに3であるような、おそらく現在使用されているポリアデニル化部位に突き当 たり得る。依然として生物学的活性および適切な発現を維持しながら、ミニ遺伝 子および／またはカセットのサイズを最小のサイズに減少することは、ミニ遺伝 子カセットの同時組込みの可能性を増大させるために所望され得る。一方、ミニ 遺伝子のサイズの増大は、発現を改善し得るさらなる配列を取り込むために所望 され得る。好ましくは、ミニ遺伝子は、約６〜15kbのサイズである。シグナル配列の付加 CD59ミニ遺伝子２カセットへの別の潜在的な改変は、挿入されたcDNAが、発現 に対抗して、膜タンパク質として分泌されるようなシグナル配列の付加である。 さらに、所望すれば、DNAが非GPIタンパク質をコードする場合、GPI結合シグナ ルが付加され得る。Byrne、PCT/US93/08889を参照のこと。 本発明による組換えDNAおよびRNA分子を構築するための基本的な手順は、以下 に開示される：例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 、第２版、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY（1999）、およ びAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience （1995）。Coliganら、Current Protocols in Protein Science（1995）もまた 参照 のこと。補体インヒビター 異種移植に関して、最も関心の高いタンパク質は、通常、「補体インヒビター 」である。補体溶解系を有するすべての種において、通常補体を阻害するように 機能する種々の分子が存在し、そしてこれらの補体インヒビターは、宿主内での 自己細胞溶解を制限するために必要であるようである。いくつかの補体インヒビ ターは、種特異的である。すなわち、ヒトの補体インヒビター（例えば、DAF） は、ヒトの補体、およびいくつかの非常に近縁の霊長類種の補体を阻害するが、 マウスまたはブタのようなより遠縁の種の補体に対しては無効である。実際、種 特異的な補体阻害のこの形式は、異種移植片が一致するか一致しないかどうかを 決定する際の主要な寄与因子のひとつであると考えられる。 従って、補体阻害活性を有することが決定されるタンパク質はどれも、本発明 のミニ遺伝子での使用に適する。特に、少なくとも３つのヒト補体インヒビター （DAF、MCPおよびCD59）は、それらのすべてが、補体媒介性細胞溶解から宿主細 胞を保護するために単独で機能すると考えられているので、興味深い。Kinoshit a、Immunol ．Today 12:291-295，(1991)を参照のこと。これらの分子は、C3およ びC5コンバターゼ（MCPおよびDAF）を妨害すること、または末端の膜侵襲複合体 （CD59）の形成を妨げることにより補体を阻害する。しかし、上記のように、本 発明は、DAF、MCPおよびCD59に限定されず、任意の補体阻害タンパク質に広げら れる。これらは、Ｉ因子、Ｈ因子、C4結合タンパク質（すなわち、C4bp）、CR1 、CR2、C8結合タンパク質、HRF、MIP、P-18、HRF-20およびMIRLを含むが、これ らに限定されない。 これらの分子の多くまたはすべては、赤血球および内皮細胞で見出されており 、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）結合により細胞表面に固定さ れている。このタンパク質レベルで、すべての３つの補体インヒビターは、広く 分布し、そして一般的には、補体活性と接触している任意の組織で見出されてい る。 CR1、CR2、DAF、MCP、C4bpおよびＨ因子に対応する相補的なDNAは、クローニ ングされ、そしで配列決定されている。その結果として、これらのタンパク質は 、 「短コンセンサス反復（SCR）」と呼ばれる、長さが約60〜70アミノ酸のタンデ ムに反復したモチーフから大部分がなることが知られている。いくつかの病原体 は、構造的に関連するタンパク質をコードする遺伝子を有する。35kワクシニア タンパク質は、４つのSCRが続くシグナル配列を有し、そしてC4bpのアミノ末端 の半分に対してアミノ酸レベルで38％の相同性である。HSVの糖タンパク質のC-1 は、典型的なSCR構造を欠くが、それにもかかわらず、種々のC-インヒビターの 実質的に相同的な短い領域を含み、そしてDAF様活性を示す。 DAF配列に関しては、Medofら、Proc ．Nat．Acad．Sci．USA，84:2007-11(1987 )；Carasら、Nature，325:545-9(1987)を参照のこと。MCP配列については、Purc ellら、Immunogenetics，33:335-344(1991)を参照のこと。CD59の配列は、前に 議論した。 本発明はまた、遺伝子操作された動物の内皮細胞で発現することが好都合であ る任意のタンパク質を発現するために使用され得る。従って、CD59ミニ遺伝子カ セットを使用して、補体インヒビター以外のさらなるタンパク質、および上記の galエピトープを低下させるかマスクする酵素をコードする遺伝子を発現するこ とが所望され得る。本発明の好ましい態様において、以下にさらに記載されるよ うに、補体インヒビターをコードする遺伝子をすでに含有する上記のように調製 されたミニ遺伝子で発現されるさらなるタンパク質は、このミニ遺伝子を発現す るトランスジェニック動物の細胞内でのgalエピトープをマスクし得るか、その レベル低下させる得る酵素である。しかし、一般に、トランスジェニック動物の 内皮細胞内で好都合に発現する任意の適切なタンパク質が、本発明において意図 される。そしてこのようなタンパク質は、上記のような技術を使用して上記のミ ニ遺伝子に組み込まれる。 本発明に有用なそのようなタンパク質の１つのクラスは、一般的には免疫調節 剤として呼ばれ、トランスフォーミング増殖因子-β（TGF−β）、ニュークレア ファクターκb（NFκb）インヒビター、インターロイキン-4（IL-4）、IL-10、 またはIL-12を含み得る。これらの分子は、免疫細胞の発達に影響する。別のク ラスのタンパク質は、血栓または抗凝固の調節剤として呼ばれ、アンチトロンビ ンIII、組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）、ウロキナーゼプラスミノ ー ゲンアクチベーター（UPA）、トロンボモジュリン、または組織ファクターイン ヒビターを含む。発現に関心が向けられ得る第３のクラスのタンパク質は、抗炎 症性タンパク質に記載される群に属する。プロスタグランジンＥ2およびその合 成を担う酵素（プロスタヅランジンシンセターゼ）において誘導したいこのよう なタンパク質の例は、CD59ミニ遺伝子カセットにより局所的に発現され得る。こ れらのタンパク質の多くは、膜結合ではなく、分泌される。分泌のためのシグナ ルは、目的の挿入遺伝子の一部として組み込まれ得るので、CD59ミニ遺伝子カセ ットを使用する膜結合タンパク質に限定されない。変異型 本発明で使用されるタンパク質は、例えば本発明により構築されるミニ遺伝子 においては、天然に存在するタンパク質であり得、このようなタンパク質の任意 の対立遺伝子形態を含み、あるいは天然のタンパク質と同じ程度である必要はな いが、所望の生物学的活性を有する変異体型であり得る。 目的のタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、「実質的に対応する」アミノ酸 配列を有する変異タンパク質を得るために、対応する遺伝子の部位特異的変異誘 発または準ランダム変異誘発により改変され得る。 配列が「実質的に対応する」とみなすべきかどうかを決定する際には、以下の 事項を考慮すべぎである：配列が標準的なアルゴリズムに従って最良の適合のた めにアライメントされる場合の配列類似性の程度、任意の架橋（例えば、ジスル フィド結合）の連結性パターンにおける類似性、タンパク質が類似した３次元構 造を有する程度（例えば、Ｘ線回折分析またはNMRにより示される）、および配 列決定されたタンパク質が類似した生物学的活性を有する程度。この文脈におい て、セリンプロテアーゼインヒビターの中で、少なくとも30％の配列相同性を有 するメンバーの対が存在する、相同的であると認識されるタンパク質のファミリ ーが存在することに注意すべきである。 好ましくは、成熟タンパク質の配列は、その天然に存在する同族体の配列と、 少なくとも50％同一、より好ましくは少なくとも80％同一である。 ３次元構造を用いて、内部および表面の残基を同定し得る；一般的に述べれば 、 表面残基（レセプター結合部位以外）で変異させたタンパク質は、機能性を維持 している可能性がより高い。しかし、Creightonら、Nature，339:14(1989)は、 埋没した残基での変異の寛容を議論している。構造はまた、柔軟な表面「ループ 」およびドメイン間の境界を決定するために使用され得る；タンパク質は、その ような領域内での欠失および挿入に対してより寛容である。一般的に、NMRによ り解明がより困難であるタンパク質のセグメントは、より自由に移動することが でき、従って変異に対してより寛容なセグメントであるらしい。 挿入および欠失は、好ましくは、アミノ末端またはカルボキシ末端で、ループ （ヘリックス-ヘリックス、ヘリックス-シート、およびシート-シートを連結す る配列）で、およびドメイン間の境界で存在する。末端において、内部挿入およ び欠失は、好ましくは、連続した３アミノ酸以下、より好ましくは１アミノ酸の みである。 好ましくは、変異は置換である。行われ得る置換の種類に関して、異なる生物 の相同的なタンパク質間でのアミノ酸変化の頻度の分析が注目され得る。このよ うな分析に基づいて、本発明者らは、以下に示すグループ内での置換として保存 的な置換を定義する： Ｉ 小さな脂肪族、非極性、または微極性残基−Ala、ser、Thr（Pro、Gly） II 負荷電残基およびそのアミド−Asn、Asp、Glu、Gln III 正荷電残基−His、Arg、Lys IV 大きな脂肪族非極性残基−Met、Leu、Ile、Val（Cys） Ｖ 大きな芳香族残基−Phe、Tyr、Trp ３つの残基は、タンパク質構造におけるその特殊な役割のために括弧に入れて いる。Glyは、側鎖を有さない唯一の残基であり、従って鎖に柔軟性を与える。P roは、鎖に堅く拘束される例外的な幾何学を有する。Cysは、タンパク質を特定 のフォールディングに保つジスルフィド結合に関係し得る；bGHの４つのシステ インは、高度に保存されている。いくつかの先例（authority）は、上記のＩお よびIIが一緒である。水素結合の可能性により、Tyrは、Ser、Thrなどとある程 度類縁関係を有することにも注意すること。 許容可能な置換はまた、目的のタンパク質と生物学的活性および配列において 類似するタンパク質の出現の結果として、寛容であり得ると既に知られている置 換を包含する。例えば、スーパーオキシドジスムターゼ活性を有する場合、目的 のタンパク質は、天然に存在するSODと同一のタンパク質を使用する代わりに、 いくつかの天然に存在するSODのキメラであり得る。 自然にGPI結合するタンパク質である場合、GPIアンカーの結合を防止し得る変 異ならびに所望の活性を減少させ得る変異は、避けるべきである。活性部位残基 は、既知でない場合、ChungおよびReid（1985）によりC4bpについて行われたよ うに、活性について組織的にフラグメントを試験することにより、あるいは変異 体の系統的な試験により決定され得る。 目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在する配列と同 一であり得るが、同一である必要はない。「サイレント」変異は、転写または翻 訳の効率の改善、制限部位の導入または削除、あるいは組換え確率の減少のため に行われ得る。さらに、コードされたアミノ酸配列の変化をもたらす変異が、前 記のように行われ得る。 変異、特に保存変異が最も寛容であるらしい部位は、理論的および実験的な方 法の組合せにより決定され得る。 一般的に、残基は、表面または内部のいずれかの残基であるように分類され得 る。残基の位置は、例えばＸ線回折または親和性標識のような技術により実験的 に決定され得る。相同的なタンパク質が、公知の３次元構造を有する場合、その 相同的なタンパク質を指針として使用することにより、目的タンパク質のモデル を構築することが可能である。すべてが失敗した場合、位置はまた、荷電した残 基は特に表面に存在するようなので、残基の親水性に基づいて予測され得る。 タンパク質のほとんどの残基は、ある程度の変異に寛容であり得る。タンパク 質は、内部残基、目的の結合部位から離れた表面残基、あるいは目的の結合部位 の一部または結合部位に影響するに十分近い表面残基で改変され得る。 内部残基の改変は、タンパク質の正しいフォールディングを、特異的に、従っ て、間接的に、結合表面の正しい存在を妨げなければ、結合活性に影響し得ない 。一般的に述べれば、内部のグリシンの変異は、それらがポリペプチド鎖の局所 的 な柔軟性を与えるために必要であり得るために、所望されない。システインの変 異は、それらが特定のコンフォメーションにタンパク質を保つために必要とされ るジスルフィド結合にしばしば関連しているので、通常、有害である。一般に、 本来の残基より、実質的に大きいまたはより親水性である残基の内部残基との置 換を避けることが最善である。しかし、これらの規則はいずれも、変更されない ことはない。 一般的に、タンパク質の安定性は、表面残基の変異によるよりも、内部残基の 変異により影響を受ける可能性がより高い。 いくつかの表面残基は結合部位に属し、そしてこれらの残基の変異は、結合活 性を、好都合にまたは不都合に影響する可能性がより高い。結合部位は、結合活 性について、フラグメントまたは単一置換変異体の系統的な試験を含む種々の方 法で、あるいは複合体の形成、次いで、複合体により吸収されない残基をアフィ ニティー標識することにより同定され得る。 相同的なタンパク質が公知である場合、変異に寛容であり得る位置は、どの残 基位置が相同的なタンパク質のファミリー内で最大の変異を示すかどうかを決定 することにより同定され得る。（相同的なタンパク質は、配列データーバンク内 の他の配列に対し，て参照配列のコンピューター比較により同定され得る。） GPI結合タンパク質の場合、変異は、GPI結合シグナルの不活性化を回避するよ うに選択すべきである。あるタンパク質の結合シグナルは、別のタンパク質の結 合シグナルに置換され得る。キメラシグナルもまた、構築され得る。 上記の補体阻害タンパク質に関して、DAFおよびMCPの場合、例えば、SCRは活 性に重要である可能性があり、そして非SCR領域を変異することがより安全であ る。SCRを変異させ得る場合、目的のタンパク質において見出されたSCRの最大の 変異を示す残基を変異すること、そしてむしろ観測された変化に対応する置換を 取ることがより安全である。 CD59に関して、ヒトCD59は、他の哺乳動物種におけるそのホモログと比較され 得る。より大きく変化し得るコドンの変異が好ましい。しかし、CD59が種特異的 である程度に、そのような変異は、変異タンパク質の種特異性の変化をもたらし 得、従って注意して行われるべきである。この警告は、CD59の種特異性が不明で 、 そしておそらく変化する場合に適するにちがいない。Van Den Bergら、J ．Immun ol． 152:4095(1994)によれば、ヒト、ラット、ヒツジ、およびブタ由来のCD59は 、いくらかの交差種活性（cross-species activity）を有する。 CD59は、Ly-6と呼ばれるマウスタンパク質のファミリーに対して24〜30％類似 性を示す。この類似性は、アミノ末端領域およびカルボキシ末端領域で最大であ る。成熟CD59およびLy-6の10個のシステインは、容易にアライメントされる。CD 59の好ましい変異は、これらの保存されたシステインを乱さない変異であり、そ して作製された変化がLy-6ファミリー内で見られ、そしてLy-6ファミリーの１つ またはメンバーの対応する位置で見出された残基を導入する位置に指向する。他 の相同的なタンパク質（例えば、ヒトウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベー ターレセプター）の配列を参照することはまた、有利であり得る。Ｂ．複数の補体インヒビターを含有するYACの産生 本発明の好ましいプロセスの１つにおいて、人工酵母染色体（すなわち、YAC ）が調製される。これは、本明細書中で詳細に記載されるように、１つの座にお いて複数の補体阻害タンパク質を含有する。多重遺伝子YACの産生 P1ゲノムのCD46、CD55、およびCD59遺伝子について記載されたフラグメントの ような大きなDNAフラグメントは、しばしば適切な組織特異性とともに、高レベ ルの遺伝子発現をもたらす。いくつかの適用（例えば、異種移植）において、複 数のトランスジーンを利用することは重要であり得る。しかし、大きなDNAフラ グメントに関しで、１つ以上の遺伝子を有するトランスジェニック動物の作製の 単純な同時注入ストラテジーを用いることは困難であり得る。トランスジェニッ ク胚のゲノム内の単一部位へ高頻度で同時組込みされる、より小さなDNAフラグ メント（＞50kbp）と異なり、より大きなゲノム遺伝子の同時注入は、しばしば 、複数の独立した組込み部位および高頻度の遺伝子再配置をもたらす。 本プロセスにより得られるトランスジェニック動物は、複数のトランスジーン 組込み部位を含有する。繁殖の際、これらのトランスジェニック動物は、独立し て、トランスジーンをその子孫に分離する。その結果、ほとんどの子孫は、同時 注入されたトランスジーンの総数のほんの一部を受け継ぐ。さらに、各組込み部 位は、有害な変異を生じる可能性を増大させる正常なゲノム構造の破壊を示す。 潜在的な変異は、異種移植のような適用に特に関連する。この場合、トランスジ ェニック器官は、ヒトレシピエントにおいて長期間生存することが予想される。 これらの問題を回避し、そして異種移植に関連したさらなる遺伝子が付加され 得る枠組みを作製するために、本発明者らは、CD46、CD55およびCD59をコードす る、３つの大きなヒトゲノムDNAフラグメントからなる特徴的なヒト補体調節座 を組み立てるプロトコルを設計した。最初の座は、CD46、CD55およびCD59遺伝子 からなり、200kbを越える。 近年、数百キロベースまでの大きなDNAフラグメントが、受精卵に首尾良くマ イクロインジェクションされ得ること、およびこれらの非常に大きなDNAフラグ メントが、インタクトなままであり、そして合理的な頻度で機能的であることが 明らかとなっている。Schedlら、Nuc ．Acids Res．20:3073-3077(1992)；Gaensl erら、Proc ．Nat．Acd．Sci．90:11381-85(1993)；Schedlら、Nature，362:258- 261(1993)；およびGnirkeら、Genomics 15:659-667(1993)。次いで、このことは 、一連のP1サイズのゲノムフラグメントが、単一のDNA片内に一緒にされ、次い でマイクロインジェクションされ得ることを示唆する。このストラテジーは、複 数のP1サイズのゲノムフラグメントからなるトランスジーン遺伝子座が規定され た構造からなること、およびその座内のすべてのP1遺伝子が単一のゲノム部位内 に組み込まれることを確実にする。遺伝子は物理的に連鎖しているので、このス トラテジーはまた、トランスジーン遺伝子座を構成する多重遺伝子のそれぞれが 、１ユニットとしてその後の世代へ忠実に伝わることを確実にする。ヒトCRP座の組立て P1クローニングシステムは、100kbまでのDNAをパッケージするのみであるので 、酵母（YAC）クローニングシステム（Burkeら、Science 236:806-812，1987） を用いてこのサイズを越える座を組立てる必要がある。本明細書中で、本発明者 らは、CD59、CD46およびCD55をコードするP1ゲノムフラグメントを記載する。と も に、３つのP1遺伝子は、200kbのDNAにまとめられる。このサイズは、YACクロー ニングシステムにより容易に収容され得る。各P1ゲノムフラグメントの末端は、 特徴的な対の制限酵素部位（表10）により規定される。これらの３つの遺伝子の 組立てを容易にするために、本発明者らは、これらの制限部位を含有する複数の クローニング部位を含むように、pYAC4クローニングベクターを改変した（図４ ）。複数のクローニング部位内の制限酵素部位の順は、３つのP1遺伝子からなる 遺伝子座の連続的な組立てを可能にする。最初の工程は、Mlu1が隣接する60kbの CD46 P1遺伝子を、pSRY-1のMlu1部位にクローニングすることである。これによ り、MCP遺伝子を含有するYACが作製される。P1挿入物は、MCPの転写がTRPアーム 部位から生じるように配置されることが好ましい。同様に、70kbのSflI CD59 P1 遺伝子をSnaB1部位にクローニングし、CD59遺伝子を含有する第２のYACを作製す る。最後に、NotI消化したMCP-YACおよびSfiI消化したCD59-YACを、NotI、SfiI CD59 P1遺伝子と一緒に連結する。YAC-MCP の産生 P1 MCPクローンからなる高分子量のプラスミドDNAを、アルカリ溶解により単 離し、続いてQiagen-50カラム（Chatsworth，CA）で精製した。DNAを制限酵素Ml u1で完全に消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し（Rileyら、Techniques for the Analysis of Complex Genomes 、59-79頁、1992）、そしてTE（10mM Tri s(pH7.5)、1mM EDTA）に対してスポット透析した。プラスミドpSRY-1をMlu1およ びBamHIで消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、そして6.0 kb Trpアームおよび3.4kb Uraアームをゲル精製した。次いで、消化したP1 DNA を、10モル過剰のpSRY-1アームに一晩連結し、そしてBurgersら（Analytical Bi ochem ． 163:391-397(1987)）により記載されるように、AB1380スフェロプラスト に形質転換した。形質転換体を、最初に、ura-プレート、次いでura-trp-プレー トで選択した。続いて、ゲノムDNAプラグを、urea+trp+コロニーから作製し、そ してPFGEおよびサザンブロットハイブリダイゼーションによりMCP含有YACの存在 について分析した。クローニング部位でのMCP DNAの同一性および挿入物の方向 を、プラスミドレスキューを用いてさらに決定した。YAC-CD59 の産生 SfiI制限部位は５つのランダムな塩基を含有するので、CD59 P1遺伝子を規定 するSfiI消化により、SRY-1プラスミドのSfiI部位へ直接的にクローニングされ 得ない不適合の３塩基対突出を得る。この理由のために、本発明者らは、CD59 P 1遺伝子のpSRY-1 YACへのクローニングについて２つの方法を記載する。第１の 方法は、単に、70kbのCD59挿入物を、平滑端連結として、pSRY-1のSnaB1部位へ クローニングすることである。P1 CD59クローンからなる高分子量プラスミドDNA を、アルカリ溶解により単離し、続いてQiagen-50カラム（Chatsworth，CA）で 精製した。DNAを制限酵素で完全に消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑にし、フ ェノール／クロロホルムで抽出し（Rileyら、1992、上記）、そしてTE（10mM Tr is(pH7.5)、1mM EDTA）に対してスポット透析した。プラスミドpSRY-1をSnaB1お よびBamHIで消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、そして6 .0kb Trpアームおよび3.4kb Uraアームをゲル精製した。次いで、消化したP1 DN Aを、10モル過剰のpSRY-1アームに一晩連結し、そしてBurgersら（1987、上記） により記載されるように、AB1380スフェロプラストに形質転換した。形質転換体 を、最初に、ura-プレート、次いでura-trp-プレートで選択した。続いて、ゲノ ムDNAプラグを、urea+trp+コロニーから作製し、そしてPFGEおよびサザンブロッ トハイブリダイゼーションによりMCP含有YACの存在について分析した。クローニ ング部位でのMCP DNAの同一性および挿入物の方向を、プラスミドレスキューを 用いてさらに決定した。このアプローチは、平滑端連結を必要とするので、本発 明においては困難であることが明らかとなった。さらに、特定のクローンは成長 が遅く、CD59 P1挿入物の十分な量を得ることを困難にする。これらの理由のた めに、本発明者らは、以下に概略を記載する別のストラテジーを開発した。YAC-DAF の産生 P1 DAFクローンからなる高分子量プラスミドDNAを、アルカリ溶解により単離 し、その後Qiagen-500カラム（Chatsworth，CA）で精製する。DNAを制限酵素Not 1およびSfiIで完全に消化し、フェノール／クロロホルム（Rileyら，1992，上記 に引用）で抽出し、そしてTE（10mM Tris(pH7.5)、1mM EDTA）に対してスポット 透析する。プラスミドpSRY-1を、Not1、SfiI、およびBamHIで消化し、仔ウシ腸 アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、そして6.0kbのTrpアームおよび3.4kb のUraアームをゲル精製した。次いで、消化したP1 DNAを、10モル過剰のpSRY-1 アームに一晩連結し、そしてBurgersら（1987、上記）により記載されるようにA B1380スフェロプラスト中に形質転換した。形質転換体は、最初にura-プレート で、次いでura-、trp-プレート上で選択した。続いて、ゲノムDNAプラグを、ure a+、trp+コロニーから作製し、DAF含有YACの存在についてPFGEおよびサザンブロ ットハイブリダイゼーションにより分析した。クローニング部位でのDAF DNAの 完全性および挿入の方向は、プラスミドレスキューを用いてさらに決定され得る 。３つの遺伝子座の組立 ３つの遺伝子座を組立てるために、YAC-MCP染色体を、PFGEを用いて酵母細胞 からゲル精製し、そして単離されたバンドをNot1で消化する。同様に、YAC-CD59 染色体を、PFGEを用いて酵母からゲル精製し、そして単離されたバンドをSfiIで 消化する。次いで、これらの消化された染色体フラグメントを、等モル量のゲル 精製された70kd Not1、SfiI DAF P1挿入物に連結し、そしてAB1380スフェロプラ スト中に形質転換する。形質転換体は、最初にura-プレートで、次いでura-およ びtrp-プレートで選択する。続いて、ゲノムDNAプラグを、ura+、trp+コロニー から作製し、そして３つすべての遺伝子を含有する200kd YACの存在についてPFG Eおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析する。別のクローニングスキーム CD59-YACの形成は、特に困難であった。この工程は、ずっと効率が低い工程で ある平滑末端連結を包含する。さらに、特定のCD59 P1クローンは増殖が不充分 であるので、平滑末端連結のための充分量のCD59挿入物を精製することは困難で ある。これらの問題点のために、本発明者らはまた、CD59含有YACを産生する別 の方法（例えば、Ketnerら，1994，Proc.Nat.Acad.Sci ．91：6186-90に開示され る方法）を用いた。このアプローチは、酵母において生じる高頻度の相同組換え を頼みにする。要するに、酵母スフェロプラストを、これらの３片のDNA（CD59 挿入物全体、CD59挿入物の最も5'側の領域の一部を含有するYAC-Trpアーム、お よびCD59挿入物の最も3'側の領域の一部を含有するYAC-Uraアーム）でトランス フェクトする。CD59-YACは、２つの相同組換え事象から生じる。１つは、Trp-YA Cアーム中の5’CD59配列とCD59 P1遺伝子の相同な5'領域との間、そして２つ目 の事象はUra-YACアーム中の3’CD59配列とCD59 P1遺伝子の相同な3'領域との間 （図５）である。このアプローチを使用するために、本発明者らは、CD59 P1挿 入物の5'および3'の末端部分をプラスミドレスキューにより単離し、そしてこれ らのサブクローンを部分的に配列決定した。この分析から、PCRのための一連の オリゴヌクレオチドプライマーを作製した（表12）。プライマー対CH-1およびCH -2はNot1、SfiI（CH-1）、およびBamHI制限部位を含み、そしてCD59 P1遺伝子の 5'末端から1.4kbフラグメントを増幅する。このフラグメントをNot1、BamHIフラ グメントとしてpSRY-1中にクローンニングする。得られるプラスミドは、1.4kb の5’CD59挿入物とともに6kbのTrp-CEN-ARS YACアームを含有する。CD59 P1挿入 物の3'末端については、SnaB1およびHincIIを有する1.2kbのPCR産物を、プライ マーED-1およびED-2を用いて増幅した。このPCR産物を、SRY-1のSnaB1部位中に 平滑末端切断した。1.2kbの3'フラグメントの方向を、挿入物の連結部を配列決 定することにより確認した。最後のCD59 YACを組み立てるために、３片のDNAをA B 1380中にトランスフェクトした。Not1で線状化したCD59 P1 DNAを、BamHI消化 した5’CD59-Trp-YACアームおよびSnaBLBamHI消化した3’CD59-Ura-YACアームの 等モル量で同時トランスフェクトした。形質転換体を、最初にura-プレートで、 次いでura-、trp-プレートで選択した。続いて、ゲノムDNAプラグをura+、trp+ コロニーから作製し、そしてCD59を含有するYACの存在についてPFGEおよびサザ ンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。YAC内のCD59 DNAの完全性 および方向を、サザンブロット分析、プラスミドレスキュー、または5'および3' の連結ドメインを横切るPCR増幅を用いてさらに決定し得る。正しい構造を有す る形質転換体を高頻度で単離した（表11）。相同組換えによる組立て YACベクターへP1遺伝子をサブクローニングするための相同組換えの使用は、M CPおよびDAFを含有するYACを産生するため、および３つすべての補体調節遺伝子 または任意の他のさらなる遺伝子を含有する３遺伝子YACの連続的な組立てを容 易にするために使用され得る、一般的なアプローチである。図５は、どのように して３遺伝子YACが連続的に組立てられ得るかの概要を示す。このアプローチの ために、P1ゲノムCRP遺伝子の最も5'側のフラグメントおよび最も3'側のフラグ メントを、例えば、プラスミドレスキュー、サブクローニング、PCR増幅、また は任意の多くの標準的な技術により単離しなければならない（図5A）。酵母にお ける相同組換えを容易にするために、これらのフラグメントは、繰り返しエレメ ントを欠いた唯一の配列であり、そして約500〜2000塩基対の長さであるべきで ある。CD59、MCP、およびDAFの末端フラグメントの特徴を、表13に示す。３つの 遺伝子のYACの連続的組立てはまた、３つの栄養要求性酵母選択マーカー遺伝子 の使用を必要とする。本発明者らの目的のために、本発明者らは、栄養要求性マ ーカーのUra3、Trp1、およびLys2を使用したが、使用される酵母の株の遺伝子型 に依存して、マーカーの他の組合せが可能である。Ura3およびTrp1マーカーのア ームは、pSRY1に由来する。Lys2マーカーは、pDP6の4.5kbのHind3サブクローン （Fleigら，Gene 46:237-245，1986）である。本発明者らは、これに、pSRY-1の 700bpのHind3、BamHIテロメアシード配列を付加して機能的Lys2-YACアームを産 生した。 ３つすべてのヒトの補体調節ゲノム遺伝子を含有するYAC染色体の連続的な組 立ては、上記のCD59-YACへの、MCP遺伝子由来の5'末端フラグメントの付加で開 始する。この付加を行なうために、CD59の3'末端フラグメントおよびMCPの5'末 端フラグメントを相互に結合させ、そしてLys2 YACアーム中に挿入した。この3' CD59-5'MCP-Lys2 YACアームにおいて、3’CD59配列は、相同組換えの標的部位と して作用して、その結果、このDNAがCD59-YAC含有酵母株中にトランスフェクト された場合、3’CD59配列間の相同組換え事象は効果的にUra3マーカーを欠失し 、そしてこれはLys2-YACアームで置換される（図5B）。形質転換体は、最初にly s-培地を用いて機能的Lys2遺伝子について選択される。次いで、クローンは、5- フ ルオロオロット酸（FOA）を含有するlys-、trp-培地を用いて３重選択下に置か れる。この培地ば、機能的Trp1およびLys3遺伝子の存在を同時に選択し、そして FOAの添加により機能的Ura3マーカーが選択される。酵母クローンを、PFGE、な らびにTrp1、Lys2、CD59、および5’MCPに対するプローブを用いるディファレン シャルサザンブロットハイブリダイゼーション分析によりさらに特徴付ける。ほ んの数個のクローンを分析しただけであったが、正しい構造および遺伝子行動を 有する形質転換体は、高頻度で単離された（表11）。 MCPゲノムDNAの残りを新たなCD59-5'MCP-Lys2-YACに付加するために、MCP遺伝 子の1.3kbのNco1、Mlul3'末端をUra3-YACアームに平滑末端連結した。この構築 物を制限消化によ、り線状化し、そしてMlul1消化したMCP-P1 DNAでCD59-5'MCP- Lys2-YAC含有酵母株中に同時トランスフェクトした（図5C）。形質転換体を、最 初にura-培地を用いて機能的Ura3遺伝子について選択する。次いで、クローンを α-アミノアジペート（α-Ap）もまた含有するura-、trp-培地を用いて３重選択 の下に置いた。この培地は、機能的Trp1およびUra3遺伝子の存在について同時に 選択し、そしてα-Apの添加により機能的Lys2マーカーが選択される。5'および3 'のMCP配列内の相同組換え事象により、Trp1およびUra3栄養要求性マーカーに隣 接した、CD59およびMCPの補体調節遺伝子の両方を含有する新たな染色体が生じ る。酵母クローンを、PFGE、ならびにTrp1、Ura3、CD59、およびMCPに対するプ ローブを用いるディファレンシャルサザンブロットハイブリダイゼーション分析 によりさらに特徴付ける。正確な構造を有する形質転換体は、高頻度で単離され た（表11）。 ３番目の遺伝子DAFの付加は、類似の方法において達成される（図5D）。MCPゲ ノム遺伝子の1.3kbの3'部分を、EcoRIフラグメントとしてプラスミドに付加した 。このプラスミドは、ゲノムDAF遺伝子の2.2kbの5'部分を含有していた。次いで 、これらの２つの遺伝子フラグメントを、Lys2-YACアームに付加し、そしてCD59 -MCP-YAC ２重遺伝子YAC中にトランスフェクトした。lys-選択およびその後のly s-、trp-、FOAの３重選択を通して、本発明者らはCD59-MCP-5'DAF-Lys-YACクロ ーンを誘導した。DAFゲノム遺伝子の残りを組み込んで、70KbのNot1-SfiI DAFゲ ノムDNAをUra3 YACアームに結合させた0.8kbの3'DAFフラグメントとともに同時 トラ ンスフェクトすることにより、３重遺伝子YACを産生した。適切な選択工程の後 、酵母クローンを、PFGEおよびディファレンシャルサザンブロットハイブリダイ ゼーションにより分析した。 この３つの遺伝子座を使用して、高レベルの３つすべてのヒト補体調節遺伝子 を発現するトランスジェニックブタを作製し得る。この新しい座は、個々に注入 されたP1遺伝子に対して有利である。なぜなら、３つすべての遺伝子は、ここで 、注入の前に物理的に連結され、従って、単一の座として組み込まれると期待さ れるからである。さらに、この単独の座は、YACとして増殖され、上記の相同組 換え技術は座にさらなる付加を行うために使用され得る。例えば、galエピトー プの合成を低下またはマスクする遺伝子（α(1,2)FT、α(2,6)ST、またはβ(1,3 )NAGTを含むがこれらに限定されない）は付加され得、主要な異種抗原のレベル を低下し得、そしてヒトの補体活性化を制御し得る座をもたらす。さらに、ブタ の異種器官ドナーの発達が進行するにつれて座への付加が行われ得る。例えば、 血管の拒絶に影響を与えるさらなるヒト遺伝子（例えば、トロンボモジュリン、 プロテインＣ、Ｈ因子、組織因子、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータ ー、ectoATPase、NFkbのインヒビター）もしくは細胞の拒絶に影響を与え得るヒ トの遺伝子（例えば、IL-4、IL-10、TGF-β、同時刺激分子CD28およびCD40をブ ロックする因子、可溶性IL-2のようなサイトカイン作用をブロックするための可 溶性レセプター、またはIFNgレセプター）、またはブタ抗原提示細胞を破壊する ために使用され得る遺伝子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼをコードす る、CD2またはCD45に調節される遺伝子）はまた、上記の方法を用いてこの座に 付加され得る。これらの遺伝子はすべて、大きなゲノムDNAである必要はなく、 充分に特徴付けられたミニ遺伝子または任意の他の遺伝的構築物であり得る。トランスジェニック動物の作製 YAC構築物を、周知の方法を用いてマイクロインジェクションのために調製す る。YAC構築物を含有する酵母染色体を、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE ）を用いて分離する。PFGEは、非常に大きなDNA分子を分離するために設計され る。160kbのYACを単離するために、１％ SeaPlaque GTG低融点アガロース（FMC Corp.）パルスフィールドゲル、120°のスイッチ角および２〜10秒間の切り替え 時間で、14℃、６ボルト/cm2で20時間の泳動を用いる。単離されたYAC染色体を 、ゲルから切り出し、そしてアガロースゲルスライスを注射緩衝液（10mM Tris( pH7.5)、0.1mM EDTA、100mM NaCl、30μMスペルミン、および70μMスペルミジン ）中で平衡化する。アガロースゲルスライスを65℃で融解し、そしてゲラーゼ（ Epicenter Technology）で37℃で３時間消化する。次いで、消化したアガロース を、口広のピペットチップを用いてMicron10コンセントレーター（Amicon）（こ こで、DNAは、最初のゲルスライスの全量が20〜50μlの容量まで減少するまで、 5,000gで15分間にて繰り返し遠心分離することにより濃縮される）に移す。YAC DNAの完全性は、マイクロインジェクションの前に、パルスフィールドゲルで検 査され得る。 次いで、DNA構築物のマイクロインジェクションは、本出願において先に記載 したように行われる。トランスジェニック動物およびその子孫の分析は、本出願 において先に記載の方法に従って実施される。 Ｃ．P1 クローンを利用するトランスジェニック動物の作製 本発明による他の好ましいプロセスでは、トランスジェニック動物は、以下に 詳細に記載されるようにバクテリオファージP1クローンの構築およびトランスフ ェクションを通して作製され得る。 一般に、以前に公開された配列データから設計され、そしてCD59およびCD46の 5'領域および3'領域に相当するオリゴヌクレオチド対（表７）を用いて、ポリメ ラーゼ連鎖反応により、バクテリオファージP1（Genome Systems．St．Louls，M O）において構築されたヒトのゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。両 方のセットのプライマーを用いて、クローンを同定し得る。高分子量プラスミド DNAを、アルカリ溶解によりEscherichia coliのNS3529株から単離し得、その後 、Qiagen-500カラム（Chartsworth，CA）で精製し得る。挿入物を、制限酵素消 化、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）、およびサザンブロット分析により マッピングする。 マイクロインジェクションのための候補フラグメントを、各クローンに存在す る5'および3'の隣接領域の量に基づいて選択する。すべてのプローブは、ゲル単 離し、［α-32Ｐ］デオキシ-CTPを用いてランダムプライミング（Pharmacia Bio tech，Milwaukee，WI）により放射性標識したフラグメントであった。 マイクロインジェクションのためのフラグメントを調製するために、クローン を、SfiIまたはMluIで制限処理し、そして消化混台物をPFGEによりサイズ分画し た。エチジウムブロミド染色により可視化した後、クローンを含有するフラグメ ントをゲルから切り出し、精製し、濃縮し、そして完全性について分析した。トランスジェニックマウスの作製 精製の際、上記で得たフラグメントを、受精したマウス卵母細胞中に個々にマ イクロインジェクションし得る。創始動物（C57BL/6×SJL F2）を、サザンブロ ット分析により同定し、そして戻し交配により系統を樹立した。２つのトランス ジーンを有する動物は、子孫（例えば、CD59およびCD46 F1動物）を交配するこ とにより作製し得る。実際の実施例では、27個体の可能性のある創始動物のうち 、５個体（19％）がCD59について陽性であった。MCPゲノムクローン（60kbおよ び80kbの両方）では、それぞれ13個体のトランスジェニック創始動物が作製され 、これは、それぞれ29％および15％のトランスジェニック率を示した。DAFにつ いての90kbの構築物では、19個体のＧ0マウスから６個体の陽性トランスジェニ ックが作製された。70kbのDAF構築物では、18個体のトランスジェニック創始動 物のうち３個体（17％）が作製された。Ｇ1世代への遺伝子伝達は、CD59、60kb MCP、および80kb MCPフラグメントについて、それぞれ、50％（2/4）、83％（10 /12）、および69％（9/13）であった（表８）。６個体のDAF創始動物のうちの５ 個体もまた、Ｇ1子孫に遺伝子を伝達した。これらのデータから、トランスジェ ニックマウスが、大きなゲノムフラグメントをマイクロインジェクションするこ とにより首尾良く作製され得ること、およびこれらの遺伝子が続く世代に伝達さ れ得ることが示される。トランスジェニックマウスにおける発現分析 ヘテロ接合体Ｇ1動物を、ノーザン分析、免疫化学、およびFACS分析により発 現について分析した。FACS 分析および定量 マウス末梢血血球（赤血球および白血球）の表面でのタンパク質発現を、間接 的免疫蛍光により評価した。この検出のために使用した一次抗体は、CD59につい てはラットのmAbであるYTH 53.1（Herman Waldman，Oxford，UKから贈与された ）、そしてCD46についてはマウスmAb695（Serotec,Washington，D.C.）であった 。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合マウス抗ラットIgG2b（ICN， Costa Mesa，CA）またはFITC結合ヒツジ抗マウス（Bindingsite，Birmingham，U K）を用いて、それぞれ、CD59およびCD46へ結合している特異的な抗体を検出し た。DAFを、Biodesignから購入したマウスモノクローナル抗体を用いて検出した 。細胞表面での発現を、標準的な技術を用いてフローサイトメトリーにより測定 した。１細胞あたりのCD59またはCD46分子の相対数を、製造者のプロトコルに従 ってQuantum Simply Cellular Kit（Flow Cytometry Standards Corp.，San Jua n，PR）で決定した。ノーザン分析 全細胞RNAを組織、血液、またはその両方から単離し、そしてノーザンブロッ トを行なった。すべてのプローブは、ランダムプライミングにより［−32Ｐ］デ オキシ-CTPで放射性標識したフラグメントであった。ヒトの全RNAサンプルを陽 性コントロールとして供し、そしてClontech（Palo Alto，CA）から購入した。免疫組織学的分析 免疫蛍光研究のための組織を、O.C.T.（LabTak，Elkhart，IN）中に包埋し、 イソペンタン中で急激に凍結し、そして加工するまで−80℃で保存した。凍結組 織サンプルを、低温保持装置（Leica，Heldelberg，Germany）中で調製した。切 片を風乾し、アセトンで固定し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄 した。各切片をモノクローナル抗体（mAb）と共にインキュベートし、そしてmAb をアフィニティー単離したFITCに結合したF(ab)'2の２次抗体および３次抗体か らなる二重蛍光色素層で検出した。組織切片を、インキュベーション後にPBS緩 衝液で洗浄し、そしてp-フェニレンジアミンおよびグリセロール溶液でマウント した。先に記載されたように切片を調製し、そして一次抗体を省略することによ り、バックグラウンドの免疫蛍光を評価した。ラットmAbであるYTH 53.1および マウスmAbであるMCA 695（Serotec，Washington，DC）を、それぞれ、CD59およ びCD46を検出するために用いた。さらに、A.F.Michaels（Universlty of Minnes ota）より提供されたローダミンに結合した抗体を利用して、基底構造を例示し た。組織を、Leitz DMRB近蛍光（epifluoresence）顕微鏡（Wetzlar，Germany） を用いて検査し、そして写真撮影を行った（40×）。 CD59 mRNAならびにこのタンパク質を発現する５つのトランスジェニック系統 を同定した。肝臓組織、心臓組織、および腎臓組織において、ヒトにおいて観察 されるのと基本的に同様であるmRNAレベルの範囲は、70kbゲノムフラグメントを 有する系統において観察された（詳細は実施例ＩおよびII）。トランスジェニッ クマウスは、免疫細胞化学により評価したところ、肝臓、心臓、および腎臓にお ける内皮細胞の表面上に、およびFACS分析によれば赤血球上に、CD59を発現した 。これらの結果から、大きなゲノムCD59クローンを利用することにより、組織特 異的な発現が達成され得ることが実証される。 60kb MCPゲノムフラグメントを有する８つの独立したトランスジェニック系統 は、RNAおよびタンパク質のトランスジーン発現について陽性であった。RNA発現 は、腎臓で最高であり、そして心臓および肝臓においてわずかに低かった。３つ のトランスジェニック系統では、RNAレベルは、それぞれのヒト組織において見 出される内生レベルに匹敵した。タンパク質は、肝臓、心臓、および腎臓の内皮 細胞上に発現し、肝臓において最高の発現がみられた。さらに、FACS分析により 、白血球の表面上でのMCPの存在が実証された。CD59およびDAFとは対照的に、ヒ トの循環血球におけるMCPタンパク質発現は、赤血球上では存在しない。MCPトラ ンスジーンは、マウス赤血球がヒトMCP発現について陰性という点で、同様に挙 動する。同様のシナリオは、分析した５つの系統がヒトMCP RNAおよびタンパク 質発現について陽性であった、80kb MCPゲノムフラグメントについて観察された 。２つの構築物についての組織分布は、同様であった。これらの結果から、これ ら の特定のMCPゲノムクローンを利用することにより、細胞型および組織特異的発 現がヒトにおいで内生的に検出されるレベルに匹敵するレベルで達成され得るこ とが暗示される（２つのトランスジェニックマウス系統からの種々の組織におけ るタンパク質発現の詳細については表９を参照のこと）。機能的分析 トランスジェニックヒトCD59タンパク質の機能を、血球に提供される、ヒト血 清への曝露の際の補体媒介性溶解からの保護を測定することにより評価した。複数のヒト補体調節ゲノムクローンを有するトランスジェニックマウス 複数のヒト補体調節ゲノムクローンを有するトランスジェニックマウスを作製 した。これは、異なる補体調節タンパク質を発現する個々の系統を交雑育種する ことにより、ならびに以下のクローンを同時注入することにより達成された：a ）70Kb CD59+60Kb MCP、b）70Kb CD59+90Kb DAF、c）60Kb MCP+90Kb DAF、およ びd）70Kb CD59+60Kb MCP+90KbDAF（三重注入）。P1クローンの二重注入および 三重注入からの動物の分析から、P1遺伝子の同時組込みが生じなかったことが示 される。CD59およびMCP P1遺伝子の両方を有するマウスは、２つの別々のP1系統 を交雑育種することにより得られた。これらのマウスの分析は、トランスジェニ ック動物における２つの補体調節タンパク質発現の相加的または相乗的な効果を 扱うために経験する。このようなトランスジェニックマウスは、遺伝子の座をコ ードする最終的なDNA構築物（例えば、上記のYAC構築物）において、どのサイズ の補体インヒビターをコードする核酸フラグメントが最も有用であるかを決定す るのに有用である。P1 クローンを含有するトランスジェニックブタ系統の作製 トランスジェニックブタ系統を、トランスジェニックマウス系統とほとんど同 様の方法で開発した。CD59、DAF、およびMCPの二重および三重のマイクロインジ ェクションを行なった。セ百九十（790）個体の潜在的な創始ブタが、1994年３ 月から1995年３月の間に誕生した。単一のトランスジーンについて陽性のブタの うち、９個体がMCPについて陽性であった；２個体がCD59について陽性であった ；そして７個体がDAFについて陽性であった。３個体のブタは、CD59およびDAFに ついて陽性であり、１個体のブタはMCPおよびCD59について陽性であり、そして １個体のブタはMCPおよびDAFについて陽性であった。創始ブタの部分集合を、血 液サンプル、筋肉生検、またはその両方を利用して分析した。 mRNAの検出方法の最も感度の高い方法（すなわち、RT-PCR）を使用して、分析 した3/3のMCP陽性ブタがMCP mRNAについて陽性であり、分析した1/1のCD59陽性 ブタがCD59 mRNAについて陽性であり、そして分析した5/5のDAF陽性ブタがDAF m RNAについて陽性であった。これらの動物からの血液のノーザン分析（感度の劣 る検出方法）では、それぞれのメッセージは検出されなかった。MCP+CD59陽性動 物は、RT-PCRにより検出可能なMCPおよびCD59のメッセージを有し、そしてこの メッセージはノーザン分析によってのみ検出可能であった。２個体のCD59+DAF陽 性動物は、RT-PCRにより検出可能なレベルで両方のメッセージを有し、１個体は ノーザン分析によっても検出可能なDAF mRNAおよびCD59 mRNAを有していた。第 ３のCD59+DAF動物は、両方の方法により検出不可能なメッセージを有していた。 MCP+DAF創始ブタは、RT-PCRによってのみ検出可能なMCP mRNAを有していた。以 下の要約を参照のこと： 上記で得たデータは、創始動物がしばしばモザイクであるという観察によって 限定されることを必要とする。創始動物においてはしばしば検出不可能であるが 、トランスジーンに特異的なRNAは子孫へのトランスジーンの伝達に際してしば しば検出可能である。P1トランスジェニックマウスでは、血液サンプルについて これが特に真実であるというのが本発明者らの経験である。分析のための血液採 取は、潜在的に貴重な創始動物に利用し得る、侵襲が最も少ない手順であり、従 って、これは現在用いられている分析方法である。上記に列挙したブタに加えて 、さらに31個体のブタが誕生し、そして試験されるのを待っている。 Ｃ．GAL エピトープをマスクするかまたはそのレベルを低下させ得る酵素をコー ドする核酸の発現 本発明の別の好ましい局面において、抗原galエピトープのレベルをマスクま たはそのレベルを低下させ得る酵素（α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ（「 α(1,2)FT」、α(2,6)シアリルトランスフェラーゼ（「α(2,6)ST」、またはβ( 1,3)N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（「β(1,3)NAGT」））のよ うなグリコジルトランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない）をコードす る核酸は、好ましくは、これらの酵素の少なくとも１つがトランスジェニック動 物の器官、組織、細胞、および非生存成分中の少なくとも１つの補体インヒビタ ーとともに産生され、従って異種移植にさらに適切なそれらの動物を作製するこ とにおいて有用であるように、本発明のトランスジェニック動物に組み込まれる 。１つの好ましい実施態様において、α(1,2)FT、α(2,6)ST、またはβ(1,3)NAG Tのような酵素をコードするcDNAが発現ベクターの形態で調製され、そして、こ れらの酵素の１つ以上を発現して、低減または除去された抗体媒介性超急性拒絶 反応を伴う異種移植における使用に適切である、本発明のトランスジェニック動 物の調製において使用される。本発明の特に好ましい実施態様において、galエ ピトープをマスクするかまたはそのレベルを低下させ得る酵素をコードする核酸 は、以下でさらに考察されるように、補体阻害タンパク質を発現するために上記 で調製された核酸構築物に直接的に組み込まれるか、あるいは他の様式が、gal エピトープのレベルを低下させ得る酵素および補体阻害タンパク質の両方を発現 するトランスジェニック動物を得るために使用され得る。 本発明の１つの好ましい様式において、galエピトープを低下またはマスクす るための１つ以上の酵素（例えば、α(1,2)FT、α(2,6)ST、またはβ(1,3)NAGT ）をコードする核酸を含有し、そして本発明に従うトランスジェニック動物また は異種器官、組織、細胞および非生存成分を調製するのに利用され得る発現ベク ターが調製される。好ましくは、所望の酵素のヒト形態を使用する核酸構築物は 、適切な発現ベクター（例えば、プラスミド）を用いて調製され、そしてこのベ クターは、例えば、所望の酵素を最終的に発現するブタまたはマウス由来の卵母 細胞の前核へのベクターの注入によって、トランスジェニック動物を調製するた め、または本発明に従うトランスフェクトされた異種器官、組織、細胞もしくは 非生存成分を調製するために最終的に使用される。本発明において有用である所 望の核酸を発現ベクターにクローニングする多数の適切な方法が、当業者に周 知であるが、好ましいプロセスにおいて、ヒトα(1,2)FT、α(2,6)ST、またはβ (1,3)NAGTcDNAは、Larsenら、P.N.A.S ．87:6674-6678(1990)に開示されるように 、適切な細胞株（例えば、A431細胞株）由来の総RNAを用いたRT-PCR技術によっ てクローニングされる。 好ましい構築物において、ヒトα(1,2)FT、α(2,6)ST、またはβ(1,3)NAGT cD NAは、A431のような適切な細胞株由来の総RNAを用いたRT-PCR技術を介してクロ ーニングされる。クローニングされたcDNAにおいて、センスプライマー（好まし くは、ATG開始コドンにより隣接され、そしてBamHI部位を含む配列TTTGGATCC-TC GGCCATGTGGCTCCGGAGCCATCG（配列番号１）を有する）が調製される。好ましくは 、配列AAAGTCGAC-TCAAGGCTTAGCCAATC（配列番号２）（これは、TGA停止コドンに 隣接し、そしでSalI部位を含む）を有するアンチセンスプライマーが調製される 。トランスフェクトした組織培養細胞中でα(1,2)FTを発現するために、この1.1 kbのcDNAは、プラスミドpRex 10（pRex10/FT）にクローニングされた。 本発明に従うトランスジェニック動物における発現のために、適切なプロモー ター（例えば、ニワトリβ-アクチンプロモーターまたはH2Kbプロモーター）が 、適切な酵素をコードするcDNAを含む発現ベクターに含まれることが好ましい。 エンハーサーはまた、DNA構築物に添加され得る。特に好ましいプロセスにおい て、トランスジェニック動物に最終的に注入され、そしてトランスジェニック動 物によって発現される酵素（例えば、α(1,2)FT、α(2,6)ST、またはβ(1,3)NAG T）由来のcDNAは、500bpのニワトリβ-アクチンプロモーター（#876）（配列番 号３）または4.3kbのH2Kbプロモーター（#881）（配列番号４）のいずれかを含 むベクターにクローニングされる。さらに、スプライス配列およびポリアデニル 化配列は、第２エキソンから下流の配列を含む900bpのヒトαグロビン遺伝子のH indIII/KpnIフラグメント中のベクターに提供され得る。 さらに、以下に、詳細に記載されるようなα(1,3)GT遺伝子の発現に関する実 験のために、α(1,3)GT cDNAを含有するブタの構築物が、ブタの大動脈内皮細胞 由来の総RNAおよびFirst strand cDNA合成キットを用いたRT-PCRによって得られ た。 本発明の好ましい様式において、１つ以上のグリコトランスフェラーゼ（例え ば、α(1,2)FT、α(2,6)ST、およびβ(1,3)NAGT）をコードするDNAを発現するト ランスジェニック動物が調製される。これは、Galα(1,3)Gal）エピトープのマ スクされたかまたは低下されたレベルを有し、そして前記トランスジェニック動 物由来の組織または器官がヒト患者に移植された場合、抗体媒介性拒絶反応を低 減させるかまたは排除し得る。好ましくは、上記のように調製されたcDNA構築物 は、当業者に現在公知の任意の種々の適切な方法における所望のトランスジェニ ック動物の調製において使用される。以下にさらに記載のように、本発明の特に 好ましいプロセスにおいて、トランスジェニック動物は、所望のgalエピトープ 低下酵素をコードするDNAを、ドナー動物由来の受精卵母細胞の前核に注入する ことにより得られる。注入工程後、次いで、受精卵は、卵が出産予定日（term） まで保持される偽妊娠の雌に移植される。妊娠した雌からの動物の誕生後、いず れの子孫が所望の酵素（例えば、α(1,2)FT、α(2,6)ST、またはβ(1,3)NAGT） をコードする遺伝子を含有するかを決定するために従来のスクリーニング試験が 行われ得る。好ましいプロセスにおいて、子孫動物由来の細胞が得られ、そして いずれの動物が導入された遺伝子を含有するかを同定するためにPCR技術を用い て分析し、そしてこれらの試験は他の適切な方法（例えば、サザンDNA分析）に よって確認され得る。 本発明の方法において、Galα(1,3)Galエピトープを正常に発現する任意の異 種動物を利用し、本発明のトランスジェニック動物または異種細胞を調製し得る 。本発明に従う所望のgalエピトープ低下酵素を発現するために操作する場合、 ブタは本発明における使用に特に適切であり、抗体媒介性反応を生じることなく ヒト患者に移植され得る器官および組織を調製するために使用され得る。さらに 、本発明に従ってトランスジェニックマウス（例えば、C57BL/6マウス）が調製 され、そして以下に記載のように、α(1,2)FT遺伝子を発現する器官、組織、細 胞、および非生存成分を含み、そしてヒト異種反応性抗体によって認識されるga lエピトープのレベルにおいて付随するマスクまたは低下を達成する。 異種移植における使用、またはこの分野におけるさらなる研究における使用の ための組織または器官を産生するために、本発明において有用な他の動物は、研 究室のラットまたは他の適切な動物のような標準的な市販供給源由来のこれらの 動物を含むことも意図される。さらに、当業者に公知の技術を用いて遺伝子操作 され得る他の家畜化された動物（ウシ、ヒツジ、およびヤギを含む）はまた、本 発明において有用であり得る。 本発明に従っで産生された、トランスフェクトされた異種器官、組織、細胞、 および非生存成分はまた、低減されたかまたは除去された抗体媒介性拒絶反応（ 例えば、超急性拒絶反応）を供う移植におけるそれらの使用に加えて、異種移植 に関するさらなる実験において有用であり得る。これらの方法において、本発明 に従って作製されたトランスジェニック動物は、異種反応性抗体によって認識さ れるエピトープを有しさもなければヒト患者において拒絶される、天然または人 工のドナー組織または器官に直接配置され得るか、またはこれらを完全に取り囲 むために作製され得る、受容可能な異種細胞または組織の表面マスクまたはエン ベロープを生成するために使用されることが意図される。この様式において、抗 原galエピトープをマスクするかまたはそのレベルを低下させ得る１つ以上の酵 素を発現する本発明に従って調製された異種細胞が、超急性拒絶反応および通常 起こる他の抗体媒介性拒絶反応をブロックまたは低減させることによって潜在的 に有用なドナー組織および器官の供給をさらに増加させるために利用され得る点 で、本発明は有用であり得る。 以下に示すように、galエピトープのレベルを低下させ得る酵素をコードする 核酸を含有する発現ベクターは、補体インヒビターをコードする核酸もまた含有 するトランスジェニック動物を作製するために利用されること、そしてこのよう に作製されたトランスジェニック動物におけるこれらの酵素および補体インヒビ ターの両方の発現は、異種移植に非常に適していること、そしてヒト患者に移植 された場合、これらのトランスジェニック動物由来の器官、組織、細胞、または 非生存成分が超急性拒絶反応を生じる可能性をさらに減少させることが意図され る。 Ｄ.GAL エピトープのレベルを低下させ得る酵素および補体インヒビターの両方を コードするDNAを発現する動物の獲得 本発明の特に好ましいプロセスにおいて、抗体媒介性拒絶反応および補体媒介 性拒絶反応（超急性反応を含む）を低減または排除する、組織または器官をヒト 患者に異種移植する方法が提供される。ここで、１つ以上の補体阻害タンパク質 （CD59、DAF、MCP、および/または上記のような他の補体インヒビターを含むが 、これらに限定されない）とともに、その細胞中のgalエピトープのレベルを低 下させる１つ以上の酵素（例えば、α(2,6)ST、α(1,2)FT、またはβ(1,3)NAGT ）を発現するトランスジェニック動物が作製され、そして非常に低減されたかま たは排除された抗体媒介性拒絶反応または補体媒介性拒絶反応を有する前記トラ ンスジェニック動物由来の所望の組織または器官が、ヒト患者に移植される。好 ましい様式において、最初に核酸構築物（例えば、YAC）は、少なくとも１つの 補体インヒビター遺伝子を組み込むために上記の様式において調製され得、そし て好ましくは、galエピトープをマスクするかまたはそのレベルを低下させる酵 素をコードするcDNAのような核酸は、同じ位置でこのYACに付加され、それによ り酵素および補体インヒビターの両方は、この構築物がトランスジェニック動物 にトランスフェクトされると同時に発現される。あるいは、別々の構築物（例え ば、１つ以上の補体インヒビターおよび１つ以上のgalエピトープ低下酵素をコ ードする個々のミニ遺伝子）がまた調製され、そして同時注入、育種、または以 下に記載のような他の適切な技術を介して本発明のトランスジェニック動物を調 製するために最終的に使用され得る。理想的には、別々の構築物が使用される場 合、適切なトランスジェニック動物は、少なくとも１つの補体インヒビターをコ ードするミニ遺伝子と、galエピトープのレベルを低下させ得る少なくとも１つ の酵素をコードするミニ遺伝子とを同時注入することによって得ることが出来る 。 複数の遺伝子の受精ブタ卵母細胞への首尾の良い同時注入は、DNA濃度およびD NA構築物の長さのようないくつかの変数（variable）に依存する。大きな構築物 はより小さな構築物の首尾の良い組み込みを妨げ得るので、両方が一緒に注入さ れる場合、各構築物の長さを考慮すべきである。この種の操作は、マイクロイン ジェクションの分野における当業者に周知である。一旦子孫が誕生すると、それ らの組織および／または血液は、二重の（double）トランスジーン動物を同定す るために免疫組織化学的分析および機能的分析の両方に供される。次いで、これ らの創始動物（founder animal）は、両方のトランスジーンを日常的に発現する ブタ系統を確立するために当該分野に周知の手順に従って交配される。 さらに、galエピトープをマスクするかまたはそのレベルを低下させ得る少な くとも１つの酵素（α(1,2)FT、α(2,6)ST、またはβ(1,3)NAGTを含むがこれら に限定されない）をコードする核酸を発現するトランスジェニック動物世代を最 初に作製し、そして同時に、少なくとも１つの補体インヒビタータンパク質（CD 59、MCP、DAF、および／または他の補体インヒビターを含むがこれらに限定され ない）をコードする核酸を発現し得るトランスジェニック動物世代を作製するこ とによって、本発明に従う最終的なトランスジェニック動物（例えば、ブタ（ま たはマウス））を作製することが可能である。本発明のこの様式において、本発 明に従う所望のトランスジェニック動物の作製は、育種の周知のそれらの方法（ 例えば、所望の遺伝子の１つを発現する雄と、他の所望の遺伝子を発現する雌と を配置し、そして自然の成り行きに任せる）によって達成されるように、トラン スジェニック動物のこれらの２つの型の交雑育種によって得ることができ、そし てこの様式において、所望の酵素および補体インヒビターの両方をコードする核 酸を含有する第２世代のトランスジェニック動物を得ることができる。通常の場 合において、得られる第２世代の子孫由来の組織および／または血液サンプルは 、所望の遺伝子の両方を発現するそれらの子孫を同定するために、免疫組織化学 的分析および機能的分析の両方に供され得る。一旦両方の特徴を発現するとして 同定されると、これらのトランスジェニック動物は、galエピトープを低下させ 得る酵素および補体インヒビターの両方を日常的に発現する動物（例えば、ブタ ）の系統を確立するために利用され得る。 本発明のさらに別の実施態様において、本発明に従うトランスジェニック動物 は、galエピトープのレベルを低下させる酵素および補体阻害タンパク質をコー ドする遺伝子またはDNAの同時注入によって得ることができる。以下にさらに考 察されるように、本発明の方法のこの局面において、トランスジェニック動物は 、この場合においで、補体インヒビター（CD59、MCPおよび／またはDAFを含むが 、これらに限定されない）をコードするDNAと共に、酵素（例えば動物の内皮細 胞中のgalエピトープの存在を低下させ得る、α(1,2)FT、α(2,6)ST、および／ またはβ(1,3)NAGT）をコードするDNAを含む所望のDNAを、ドナー動物由来の受 精 卵母細胞の前核に注入することによって得られる。注入工程の後、次いで、受精 卵は、それらが出産予定日まで保持される偽妊娠雌に移植される。妊娠した雌か らの動物の誕生後、いずれの子孫が所望の酵素および補体阻害タンパク質の両方 をコードする遺伝子を含有するかを決定するために、従来のスクリーニング試験 が行われ得る。好ましいプロセスにおいて、細胞は、子孫動物から得られ、そし ていずれの動物が導入された遺伝子の両方を含むかを同定するためにPCR技術を 使用して分析され、そしてこれらの試験が他の適切な方法（例えば、サザンDNA 分析）によって確認され得る。 本発明に従う好ましい実施態様において、少なくとも１つの補体インヒビター 、およびgalエピドープのレベルを低下するかまたはgalエピトープをマスクさせ 得る少なくとも１つの酵素をコードするトランスジェニック動物を作製するため に、上記方法の任意の１つが使用される。しかし、１つより多い補体インヒビタ ー、および抗原galエピトープのレベルを低下させ得る１つより多い酵素をコー ドする核酸を含む発現ベクターが構築されることが一般に好ましい。 本発明に従うトランスジェニック動物を得るための技術は、以下にさらに記載 される。標的動物 本発明の目的のタンパク質の発現のための標的動物は、好ましくは、脊椎動物 （すなわち、哺乳動物、鳥類、爬虫類、魚類、または両生類）である。本発明の ために好ましい標的動物である哺乳動物では、好ましくは、標的動物は、Artida ctyla目（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）、ネズミ目またはウサギ 目（例えば、ウザギ、マウス、ラット）、ネコ目（例えば、ネコ、イヌ）に属す る。他の動物が本発明の方法の用途のために考慮されるべきであり、好ましくは 、標的動物は、鳥類では、カモ目（例えば、アヒル、ガチョウ、ハクチョウ）ま たはキジ目（例えば、ウズラ、ライチョウ、キジ、シチメンチョウ、およびニワ トリ）、そして魚類では、好ましくは、標的動物はニシン目（例えば、サーディ ン、ニシンダマシ、カタクチイワシ、ホワイトフィッシュ、サケ、およびマス） である。種々のトランスジェニック脊椎動物の調製は、以下の論文に考察されて い る：哺乳動物 ：Hammerら、J.Anim.Sci.，63:269-78(1986)；Hammerら、Nature，315: 680-683(1985)；Simons，Bio/technology，6:179-183(1988)；Murrayら、Reprod .Fertil.Dev. ，1:147-55(1989)；Rexroadら、Molec.Reprod.Dev.,1:164-69(1989 )；Vizeら、J.Cell Sci.，90:295-300(1988)；Wieghartら、J.Reprod.Fertll ． （補刊.41）89-96(1990)；Orenら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:5061-65(1990)； Brinsterら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 92:4438-42(1985)。鳥類 ：Salterら、Virology，157:236-40(1987)；Bosselmanら、Science，243:53 3-35(1989)；Bosselmanら、J.Virol ．63:2680-89(1989)；Crittendenら、Theor. Appl ．Genet. ，77:505-15(1989)。両生類 ：Rusconiら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78:5051-55(1981)。魚類 ：Zuoyanら、Kexye Tongbau，31:988-90(1986);Macleanら、Bio/Technology ，5:257-61(1987)。 １つの実施態様において、標的動物は、非ヒト哺乳動物であり、それに由来す る器官または組織がヒト被験体に移植される。標的動物はトランスジェニックで あり、そして好ましくは、赤血球、および被験体に引き続いて移植される意図さ れた器官移植片または組織移植片（集合的に、「標的組織」）に位置する内皮細 胞において上記のようなタンパク質および酵素を発現する。上記のように、好ま しい様式において、これらのタンパク質は、galエピトープをマスクするかまた はそのレベルを低下させる少なくとも１つの酵素および補体調節タンパク質を含 む。 器官移植片のドナーとして特異的に使用するための非ヒト哺乳動物を作製する ことは、レシピエントがこの器官または組織を受容すれば、多くの利点有する。 最初に、慎重に作製された非ヒト動物は、ヒトドナーよりも損傷していないか、 あるいは病原性ウイルスまたは新生物を保有していないと思われる。死が、寄付 される器官を理想より少なくさせ得る原因をもたらし、ヒトドナーが頻繁に減少 することに留意のこと。第２に、ヒトの器官ドナーのランダムな選択と比較して 、サイズおよび年齢が異種移植を用いて慎重に制御され得る。第３に、寄付され る器官が利用可能になるまで、潜在的なレシピエントは、しばしば長期間待つこ とができない。非ヒト哺乳動物由来の器官は、より多い量で、かつより確固たる 根拠において、同種のヒト器官より利用可能であると思われる。移植が失敗した 場合、予備の器官もまた容易に利用可能であるべきである。最後に、現在、器官 およびレシピエントは、MHC適合性において主として適合している。拒絶反応が より少なく考慮されれば、より多い注意が他の考慮（例えば、サイズマッチング ）に与えられ得る。 本発明に従って、ヒトおよび他の動物における器官移植および組織移植のため のドナーとして、種々の不調和な動物が使用され得る。動物の選択は、所望の特 定の器官または組織、サイズ、およびレシピエントの性に依存する。一般に、ヒ トレシピエントのために、ブタは、そのサイズ、類似した生理学、遺伝子操作の 簡便さ、再生産速度、および便利さのために好ましい。他の動物（例えば、ヒツ ジ、ヤギ、ウシなど）もまた使用され得る。レシピエントがヒトでないならば、 動物の選択は変化し得るが、同一の選択基準を用いることにより当業者は適切な ドナー動物を選択し得る。 研究室マウスは、多数の系統が利用可能なので、トランスジェニック動物の開 発における使用のための最も評判のよい宿主動物である。勿論、マウスは、最も 広範に利用可能な研究動物であり、そして多数の系統が利用可能である。Geneti c Variants and Strains of the Laboratory Mouse （Gustav Fischer Verlag，1 981）を参照のこと。しかし、このような研究にける他の研究室種または家畜種 の用途に対する実質的な限定はない。高等動物の間では、ブタが好ましい。 トランスジェニック動物の作製のための技術は周知であり、そして多数の雑誌 論文に記載されたそれらの技術を包含する。これらには、Gordonら、Meth.Enzym lo. ，101:411(1983)；Brinsterら、Proc.Nat.Acad.Sci.(USA),82:4438-42(1985) ；Palmiterら、Ann ．Rev.Genet．20:465(1996)；Brinsterら、The Harvey L ectures ，Series 80 ，1-38(1986)；Scangosら、Adv.Genet.，24:285(1987)；Cut hbertsonら、Lab.Investig.，58:484(1988)；およびCamper、BioTechniques，5: 638(1987)を含む。さらに、このような技術は、Honganら、Manipulating the Mo use Embryo:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab．1986)；およびLevi neら、「生殖系列への遺伝子移入」、Kucherpati編、Gene Transfer(Plenum Pre ss 1986)；Palmiterら、Cell．41:343-45(1985)に記載されている。 本発明に従うトランスジェニック動物を調製するためのプロセスにおいて、ト ランスジーンが、トランスジェニック動物に発生されるべき宿主細胞中に導入さ れる前に、原核生物ベクターDNA（より詳細には、任意の原核生物レプリコン） が取り除かれるべきである。例えば、初期β-グロビントランスジーン構築物中 のλDNAの大きな隣接配列の含有が、トランスジェニックマウスにおけるトラン スジーンの発現を明らかに阻害した。Wagnerら、Molecular and Cellular Aspec ts of Reproduction ，319-349(1996)を参照のこと。トランスジェニック動物、キメラ動物、および遺伝子操作された動物 トランスジェニック動物において、トランスジーンは、それが動物の子孫に伝 達し得るように本質的に全ての動物細胞（生殖細胞を含む）に含まれる。キメラ 動物において、動物に対して内因性の少なくともいくつかの細胞はトランスジー ンを保有するが、しかし生殖細胞系列の伝達は、必ずしも可能ではない。トラン スジーンは特定の体細胞に限定され得る。用語「遺伝子操作された動物」は、ト ランスジェニック動物およびキメラ動物の両方を含む。それは、初めに作製され る動物だけでなく、トランスジーンを保持しそして発現するそれらの子孫もまた 拡大することが意図される。 しかし、トランスジーンの生殖細胞系列の伝達が通常都合が良いので、トラン スジェニック動物の作製が通常好ましい。従って、以下の考察では、「トランス ジェニック」動物をいう。しかし、このような言及は、必要な変更を加えてキメ ラ動物に適用する。 トランスジーンを動物の遺伝物質へ導入するために、多数の技術（レトロウイ ルス感染、エレクトロポレーション、トランスジーンの受精卵の前核へのマイク ロインジェクション、および例えば、本明細書中で参考として援用される、Wagn erおよびHoppeによる米国特許第4,873,191号に記載される胚性幹細胞の操作を含 むが、これらに限定されない）が使用され得る。さらに、他の適切な技術として Palmiterら、Ann.Rev.Genet ．20:465-499(1986)および1987年８月７日に公表さ れたフランス国特許出願第2593827号に報告された技術が挙げられる。 最近作製されたトランスジェニック動物（および全てのトランスジェニック家 畜）の圧倒的大多数が、DNAの前核マイクロインジェクションから得られている 。この技術は、溶液中のDNAの、受精卵の前核の１つへの送達を包含する。受精 卵の前核は、微分干渉光学顕微鏡（differential interference contrast optic ）下で200×で観察され得る。ブタ、ウシ、およびヒツジ由来の卵の場合におい て、最初に卵を、前核の視覚化を困難にする細胞質性脂質を沈殿させるために遠 心分離すべきである。Hammerら、Nature 315:680-683(1985)を参照のこと。 マイクロインジェクションプロセスに利用されるホールディングおよびマイク ロインジェクションピペットは、ホウケイ酸のガラスキャピラリー（外径１mm、 内径0.78mm）から製造されている。好ましくは、キャピラリーはマイクロホージ (microforge)中で加熱され、そしてマイクロインジェクション端またはホールデ ィング端を作製するために引っ張られる。マイクロインジェクション後、生き残 った卵は、適切な発情期のレシピエント雌に移入される。 マイクロインジェクションの別の方法（例えば、Jaenisch、Proc.Nat.Acad.Sc i.(USA) 73:1260-1264(1976)に記載のような遺伝子操作されたレトロウイルスで の移植前の胚（１〜８個の細胞）の感染）が存在する。この場合において、透明 帯が取り除かれ、そして感染プロセスの間、胚は線維芽細胞とともに同時培養さ れる。次いで、感染された胚は、透明帯に戻され、そして適切なレシピエントへ 移入され得る。 トランスジェニック動物を作製するための別のアプローチは、エレクトロポレ ーションを含む。この技術において、１つの細胞である卵がDNAの溶液を有する エレクトロポレーションチャンバーに置かれる。脈動する電場は、卵へDNAを駆 動するためにチャンバーを通して生成される。 胚性幹（ES）細胞株は、哺乳動物（例えば、マウスおよびハムスター）の胚盤 胞の内部細胞集団の細胞に由来する。ES細胞は、例えば、初期胚線維芽細胞また は胚線維芽細胞株STOのフィーダー層上の増殖により幹細胞の状態で維持される 。ES細胞は、インビトロ哺乳動物細胞培養に適切な任意の技術によって遺伝子改 変され、次いで胚盤胞に注入され得る。次いで、それらは、動物の全ての組織で なくとも、ほとんど（生殖細胞系列を含む）に分化し、そしてコロニーをつくる 。FirstおよびHaseltine、Transgenic Animals（Butterworth-Heinemann:1988） のDeutschman、「胚性幹細胞における遺伝ターゲッティング」、第４章、89-100 頁を参照のこと。 ほとんどの研究がトランスジェニックマウスに関するが、トランスジェニック 動物の他の種（例えば、ウサギ、ヒツジ、およびブタ（Hammerら、1985、上記） 、ニワトリ（Salterら、Virol ．157:236-240，1987）、ラット（Mullinsら、Nat ure 344:541-544，1990）、ヤギ（Denmanら、Bio/Tech ．9:839-843（1991）、お よびウシ（Krimpenfortら、Bio/Tech ．9:844-847，1991））もまた作製されてい る。 E．本発明に従って作製されたトランスジェニック動物から得られた組織および 器官の移植 当業者には容易に明らかなように、本発明に従って一旦トランスジェニック動 物が作製されると、この動物の器官、組織、細胞、および非生存成分が、当業者 に周知であるこの分野において現在利用される任意の多くの方法で適切なヒトレ シピエントに移植され得る。移植され得る器官のリストは、非常に長く、そして 外科的技術がこのような器官を移植し得る程度に限定されるのみである。特定の 組織、細胞、または器官の一部もまた移植され得る。添付の請求の範囲の目的の ために、用語「器官」は、全器官、器官の一部、および種々雑多な組織を包含す る。例として、腎臓、眼、心臓、心弁、皮膚、肝臓、骨髄、腸、血管、関節もし くはその一部、膵臓もしくは島を含む部分、肺、気管支、脳組織、筋肉、および 任意の他の血管新成組織が挙げられる。しかし、血液またはその血液成分の輸血 は、器官移植と同様に解釈されるべきではない。 移植は、損傷、遺伝的欠陥、疾患、毒素反応などの結果として不都合に機能す る器官を修正するために行われ得る。レシピエントは、例えば、火傷の処置のた めに皮膚組織を、糖尿病のために膵臓の島を、またはパーキンソン病の処置のた めに脳組織を用いて、既存の組織を補充するための移植器官を受け得る。あるい は、レシピエントの欠陥器官は、完全に除去され得、そして異種移植片（例えば 、腎臓、心臓、肝臓、肺、または関節の移植物）を用いて置換され得る。いくつ かの器官移植物について、肝硬変および肝臓新生物ならびに感染を処置するため に、例えば、ダイバー（diver）移植物を共に使用されるいずれの技術も可能で ある。 従って、本発明は、トランスジェニック動物の細胞中の抗原galエピトープの レベルをマスクまたは低下させる、少なくとも１つの酵素（例えば、α(2,6)ST 、α(1,2)FT、またはβ(1,3)NAGT）、ならびに少なくとも１つの補体インヒビタ ータンパク質（例えば、CD59、MCP、DAF、および/または上記の任意の多くの補 体阻害タンパク質）の両方を発現する、適切なドナー器官、組織、細胞、および 非生存成分を提供し，得、そしてこれらの組織、器官、および細胞は、抗体媒介 性免疫応答または補体媒介性免疫応答を発生する可能性が非常に低減されて、ヒ ト移植において使用され得る。本発明の好ましい態様において、トランスジェニ ック動物（例えば、ブタまたはマウス）は上記の工程に従って調製され、そして 好ましくは、トランスジェニック動物から所望の器官および組織が単離され、取 り出され、そして現在公知の従来の移植方法を用いてヒト患者への移植のために 利用され得る。上記のタンパク質または酵素をコードするDNAを発現する器官お よび組織の使用により、重篤な抗体媒介性拒絶反応または補体媒介性拒絶反応（ 例えば、超急性拒絶反応）の危険性が非常に低減され、そして通常このような方 法に付随する広範なまたは厳密な免疫抑制を必要とせずに、異種移植を達成する ことが可能であり得る。もちろん、それぞれの特定の状況について、移植時およ びその後の移植後回復時に、免疫抑制処置が必要か否かが適切な医療人員により 決定されるが、いずれの事象においても、免疫拒絶反応は上記に詳細に記載した ように本発明のプロセスにより非常に減少される。 従って、本発明は、現在利用可能な異種個体の組織および器官よりも異種移植 における使用に適切であるドナー器官、組織、および細胞を提供する点において 極めて有利であり、従って、本発明は、異種移植治療の範囲および有効性を重篤 に制限するドナー器官および組織のおびただしい備蓄(backlog)を減少させるこ とを非常に補助する。 本発明の好ましい実施態様および他の特徴は、本発明の例示または例証となる ように設計され、そして本発明を限定することを意図しない、以下の実施例に記 載されるかまたはそれから明らかである。特定の実施態様の前述の記載は本発明 の一般的な性質を明らかにする。その結果、現在の知識を適用することにより一 般的な概念から逸脱することなく、種々の適用のためのこのような特定の実施態 様を容易に改変および/または適合させ得る。従って、このような適合および改 変は、開示された実施態様の等価物の意味および範囲内に含まれることが意図さ れるべきであり、そして意図される。本明細書中に使用される語法または用語法 は、記載の目的のためであり、そして限定の目的のためではないことが理解され るべきである。実施例 実施例I：CD59 Minigene No.1 1.1 CD59 Minigene No.1の構築 エキソン２、エキソン３、エキソン４配列を含むヒトCD59 cDNAの部分、およ び667bp 3'非翻訳(UT)配列を、5'(5'-ACCGGGAATTCTTCCTTCCAGGTTCTGTGGACAATCAC AATGGG-3')および3'(5'-CACGGGAGCTCGCTATTACACTTTTCCAGTGG-3')プライマーを用 いて、予め決定された条件下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて増幅した。5 'プライマーは、EcoRI部位（太字）に隣接し、イントロン１の3'末端に対応する 10塩基（イタリック）を含み、そして開始メチオニン（下線）の下流の２塩基ま で伸長した。3'プライマーは、SacI部位(太字)に隣接させた。得られたPCR産物 は、5'末端および3'末端にそれぞれ導入されたEcoRIおよびSacI部位と共に、エ キソン２のスプライスアクセプター部位を含む1072bpのCD59 cDNAを含んだ。 遺伝子の3'隣接領域の1033bp配列を、5'末端および3'末端にそれぞれ導入され たSacIおよびXhoI部位（太字）と共に、プライマー(5'-CACGGGAGCTCATACATCAATG GTGTGTTAAAGC-3')および(5'-CACGCTCGAGGCTCCTGGCTTTCTGGAGTTGG-3')を用いてPC Rにより増幅した。これらのPCR産物を連結して、2105bp EcoRI/XhoIフラグメン トを得た。CD59の連続3'UT領域を含む3.0Kb SalI/BamHIフラグメントをラムダク ローンから単離し、そして上記のPCT産物のXhoI部位に連結した。得られたフラ グメントを、CD59遺伝子の5'隣接領域、エキソン１およびエキソン１の4Kb 3'隣 接領域を含む10.5Kb SalIフラグメントの下流に導入した。配列解析により、cDN Aがアミノ酸76でThrからAlaへの置換を有する改変タンパク質をコードすること が示された。得られたフラグメントは、15.5Kb長であった（図１を参照のこと） 。1.2 トランスジェニックマウスの作製 6.5KbのヒトCD59遺伝子の5'非翻訳部分、エキソン１、4.0Kbのイントロン１の 5'末端、cDNAとしてのエキソン２、３、および４、ならびに4.7Kbの５つ全ての 特徴付けられたポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳部分を含む15.5Kb DNAフ ラグメントを構築した。このミニ遺伝子を、ベクターポリリンカーのNotI部位を 用いて切り出し、そしてマウスの受精卵にマイクロインジェクトしてトランスジ ェニックマウスを得た。始祖（founder）マウスは、C57BL/6×SJL F2交配であっ た。誕生したマウスの63匹のうち19匹（30％）がCD59ミニ遺伝子構築物について トランスジェニックであった。C57BL/6マウスとの戻し交配によりポジティブマ ウス由来の系統を樹立した。トランスジェニックマウス系統の13匹のうち５匹（ 38％）が、それらの肝臓、心臓、および腎臓においてCD59 mRNAを発現した。最 も高レベルのCD59 mRNAを発現した5-2系統を、詳細な分析のために選択した。1.3 トランスジェニックマウスにおける発現分析 1.3.1 ノザンブロット分析 肝臓、心臓、腎臓、肺、脳、筋肉、血液、および脾臓由来のRNAを抽出し、そ してノザンブロット分析を用いて分析した。２つの転写物、1.9Kbおよび2.1Kbを 、ヒト組織において観察されたものより少なくとも10倍低いと評価されたレベル で、血液および脾臓を除いて全ての組織において検出した。1.3.2 免疫組織学分析 ヒトCD59に特異的なモノクローナル抗体を用いて免疫組織学による5-2系統由 来の種々の組織の分析を行い、トランスジェニック動物におけるヒトCD59ミニ遺 伝子の組織および細胞型特異性を決定した。CD59、ヒトC5b、ヒトC3d、および膜 攻撃複合体に特異的な抗体を免疫染色のために使用した。組織上のヒトIgMの検 出を、μ鎖特異的FITC結合ヤギ抗ヒトIgMモノクローナル抗体を用いることによ り達成した。凍結切片を４μmの厚さに切り、そして最適条件を用いて抗体で染 色した。この分析の結果により、トランスジェニックマウス系統におけるタンパ ク質が、ヒトのCD59の発現と一致する心臓の細静脈および毛細血管を内層する内 皮細胞で発現したことが示された。非トランスジェニック同腹子由来の心臓は、 ヒトCD59についで染色した場合ネガティブであった。高レベルのCD59を、トラン スジェニックマウスの胎盤、ならびに肺の上皮細胞および内皮細胞、および皮膚 上皮上で観察した。低レベルのCD59タンパク質を、トランスジェニックマウスの 肝臓の門脈三管を内層する内皮細胞上で、骨格筋ならびに膵臓内皮および上皮中 に検出した。トランスジェニックマウスの腎臓、脾臓、および脳組織は、ヒトCD 59タンパク質発現についてネガティブであった。1.3.3 FACS分析 ヒト循環血液細胞上に観察された高レベルのCD59の発現とは対照的に、トラン スジェニックマウスは、フローサイトメトリーで分析すると、赤血球でも白血球 でもこのタンパク質を発現しなかった。このことを、トランスジェニックマウス の脾臓におけるCD59タンパク質の非存在、およびトランスジェニックマウスの血 液および脾臓における検出不可能なレベルのCD59 mRNAにより確認した。従って 、ミニ遺伝子は、ヒトにおいてCD59を発現する組織のサブセットにおいてヒトCD 59の発現を指向し得た。1.4 トランスジェニックマウスにおける機能的分析 トランスジェニックマウスにおいて発現したヒトCD59が、膜攻撃複合体の形成 を阻害し得るか否かを確認するために、心臓灌流実験を、６匹のマウスで灌流し た。３匹のトランスジェニックマウスおよび３匹の非トランスジェニック同腹子 由来の心臓を、ヒト血漿を用いてエクスビボで灌流した(Langendorff，Pflugers Arch ． 61:291-332，1995を参照のこと）。特定の実験条件下で、ヒトIgMはマ ウスの内皮細胞に結合し、そして補体は、C4の同時沈着(codeposition)により証 明されるように、古典的経路により部分的に活性化される。灌流後の６匹のマウ ス心臓で行われた、心臓生検でのヒトIgMの免疫病理学的検出は、コントロール およびトランスジェニックの心臓組織の両方で同様の分布および染色強度を示し た。このことは、全ての心臓が、ヒト血液で等しく十分に灌流されたこと、およ びヒトIgM抗体が、マウス内皮細胞を認識して結合したことを示唆する。 ヒトCD59を発現するマウス心臓とネガティブの同腹子との間の膜攻撃複合体沈 着を比較すると、トランスジェニックの心臓上でのMAC沈着の実質的な減少が示 される。おもしろいことに、ヒトC3dおよびC5bの沈着はまた、コントロールと比 較して、トランスジェニックマウスの心臓の灌流後に実質的に減少した。異種移 植片拒絶反応のこのモデルにおいて、トランスジェニックマウスの心臓において 発現したヒトCD59が、ヒト補体の活性化を阻害し得ることは明らかである。1.5 トランスジェニックブタの作製 トランスジェニックブタ系統を、トランスジェニックマウス系統と同様に開発 した。CD59ミニ遺伝子をブタ受精卵にマイクロインジェクトして始祖ブタを得た 。ブタの分析を、各ブタ由来の尾サンプルを用いて達成した。尾サンプルを、ト ランスジェニック動物を同定するためにサザンブロット分析に供した。産まれた 49匹のブタのうち、２匹（４％）を、ヒトミニ遺伝子についてのトランスジェニ ックとして同定した。両方の始祖動物を交配させ、組織分析のためのヘテロ接合 性G1トランスジェニック系統を得た。1.6 トランスジェニックブタにおける発現分析 1.6.1 ノザンブロット分析 肝臓、心臓、腎臓、肺、筋肉、皮膚、および脾臓由来のRNAを抽出し、そして ノザンブロット分析を用いて分析した。1.9Kbおよび2.1Kbの２つの転写物を、ヒ ト組織において観察されたものより少なくとも10倍低いと評価されたレベルで、 全ての組織において検出した。1.6.2 免疫組織学分析 ヒトCD59に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫組織学分析を、トランス ジェニック動物におけるヒトCD59ミニ遺伝子の組織および細胞型特異性を決定す るために行った。凍結切片を４μmの厚さに切り、そして最適条件を用いて抗体 で染色した。この分析の結果により、CD59タンパク質が、トランスジェニックブ タ由来の心臓の大きな血管を内層する内皮細胞上で発現するが、この器官の微小 血管上では検出不可能であることが示された。ヒト心臓組織で観察された内因性 発現（ここでは、タンパク質が高レベルで存在しそして全ての血管を内層する細 胞上で均一に検出された）とは対照的である。トランスジェニックブタのRBCと ヒトCD59に特異的なモノクローナル抗体とのインキュベーション、およびFACSに よる分析は、ブタ赤血球上のヒトCD59の発現を証明したが、ヒトRBCにおいて発 現したレベルまで発現しなかった。タンパク質発現レベルは、ヒト組織における 内因性レベルよりも低かったが、トランスジェニックタンパク質発現にポジティ ブな組織のスペクトルは、ヒトにおいて示されたものを反映した。これは、腎臓 細胞および血液細胞がCD59トランスジーン発現について一貫してネガティブであ ったトランスジェニックマウスの場合ではなかった。1.7 トランスジェニックブタにおける機能的分析 1.7.1 PAECを用いる分析 発現したヒトCD59トランスジェニックタンパク質を特徴付け、そして機能的活 性を測定するために、ブタ大動脈内皮細胞(PAEC)を、トランスジェニックブタお よび非トランスジェニックブタの両方の心臓から単離し、そしてFACSで分析した 。トランスジェニックブタ心臓のPAECは、ヒトCD59を発現した。ヒトCD59/細胞 の総5670個の分子を、トランスジェニックブタからのPAECで検出した。これは、 CD59/HUVEC細胞（ヒト臍静脈内皮細胞）の41,515個の分子と比較すると、発現に おいて約５倍の差異を生じた。1.7.2 GPI結合の分析 CD59ミニ遺伝子タンパク質が、GPIテイルで適切にプロセスされるか否かを決 定するために、PAECおよびHUVECをPIPLC(ホスファチジルイノシトールホスホリ パーゼC)とともにインキュベートした；GPI結合テイルの特異的な切断は、PIPLC を用いて証明され得る。トランスジェニックPAECおよびHUVECを、PIPLCとのイン キュベーションの前または後に、第VIII因子（膜貫通内皮細胞特異的マーカー） およびヒトCD59についての二重染色を用いるFACSにより分析した。予想されるよ うに、PIPLCとの処理の前後で検出される第VIII因子に対するポジティブなPAEC またはHUVECの割合は変化しなかった。しかし、直接的な定量により、PIPLCとの インキュベーション後に、CD59タンパク質を発現するPAECにおける実質的な低下 （81％）が示された。これは、ヒトCD59トランスジェニックタンパク質がGPI結 合の付加について正確にプロセスされることを示す。HUVECをPIPLCと処理した場 合、FACS分析により測定されたように、79％の細胞がCD59タンパク質発現につい てネガティブになった。さらに、非トランスジェニックPAECは、第VIII因子につ いてポジティブであり、ヒトCD59についてネガティブであり、そしてPIPLC処理 の前後で同一のプロフィールを示した。1.7.3 機能的CD59の分析 ブタ大動脈内皮細胞でのヒトCD59の機能を、ヒト血清への曝露の際の、補体媒 介性細胞傷害性に対するPAECの感受性を試験することにより測定した。トランス ジェニックおよび非トランスジェニック同腹子由来のPAECを、ヒト血清の漸増希 釈物と共にインキュベートし、そして細胞毒性を、ヨウ化プロピジウムの取り込 みによりモニターした。トランスジェニックブタ（ヒトCD59を発現する）由来の PAECは、それらの非トランスジェニック同腹子に比較されるように、補体媒介性 細胞傷害性から保護された。非トランスジェニックPAECを溶解するために必要な 量と比較して４倍高い濃度のヒト血清が、40％のトランスジェニックPAECを溶解 するするために必要であった。ヒトCD59に特異的なモノクローナル抗体由来のF( ab')2フラグメントと、PAECとのプレインキュベーションが、トランスジェニッ クPAECの保護を無効にしたが、非トランスジェニックPAECに対する効果を有さな かったので、トランスジェニックPAECに付与される保護は、ヒトCD59タンパク質 に対して特異的であることをが証明された。 全器官の内皮細胞上に発現するヒトCD59タンパク質の生物学的機能を評価し、 そして低レベルのトランスジェニックタンパク質の内因性CRPに対する寄与を調 べるために、各トランスジェニック系統由来の１匹のG1ブタを用いて、トランス ジェニックブタの心臓のヒヒへの従属栄養性移植を行った。再灌流後、移植され た心臓は、非トランスジェニックブタの心臓（0.5〜1.5時間）よりもわずかに長 く、それぞれ2.25時間および３時間拍動し続けた。移植生存はわずかに延長した のみであったが、トランスジェニック異種移植片は、補体媒介性損傷に対する耐 性の証拠を示した。非トランスジェニックブタの心臓は、明らかな内皮細胞損傷 、心筋構造の欠損、浮腫、出血、および再灌流１時間後の血栓の均一な存在を証 明する。しかし、トランスジェニックブタの心臓は、移植再灌流後の２時間、比 較的正常であると思われる。内皮細胞は、損傷していないように思われ（関節は なおインタクトであった）、心筋損傷の証拠はほとんどなく、そしていくつかの 血小板血栓があるのみであった。トランスジェニック心臓が再灌流の３時間後に 拒絶された場合、大部分が超急性拒絶反応に典型的な所見を示したが、損傷して いないと思われる組織の領域がなお存在した。これは、拒絶した正常なブタの心 臓において典型的に観察される、均一な組織学的変化とは対照的であった。 IgMおよび補体成分C3の沈着についてのトランスジェニックおよび非トランス ジェニックの心臓の免疫組織化学的染色は、同様の程度のヒヒ血清での再灌流お よび全てのブタ心臓における抗体の沈着を示し、そして補体の活性化が起きたこ とを示す。トランスジェニックブタの心臓由来の組織は、再灌流後１時間でのヒ ヒに移植された非トランスジェニックブタの心臓に普通に見られたものと比較し て、２時間生検サンプルにおける膜攻撃複合体(MAC)の沈着の著しい減少を示す 。従って、ヒトCD59レベルは、ヒト組織において見られたよりもブタ組織におい て数倍低く、そして検出可能な発現がトランスジェニック心臓に焦点があるが、 タンパク質の存在は、MAC形成を阻害する能力により測定されるように機能的活 性を証明するのに十分であり、そして異種個体設定における組織損傷に対する保 護を付与し得た。MAC形成を阻害する低レベルのヒトCD59の能力が、おそらく高 レベルの内因性ブタCRP発現のバックグラウンドに対して測定されたので、観察 された活性は、これらのタンパク質が確かに種特異的である見解と一致した。 CD59ミニ遺伝子(CD59 Minigene No.1)を発現したトランスジェニックマウスお よびブタの分析により、ヒトCD59タンパク質は、内因性ヒトCD59の発現が観察さ れる細胞のサブセットにおいて発現し、そして発現レベルは内因性ヒトレベルよ りも実質的に（少なくとも、10倍）低かったことが示された。しかし、本発明者 らは、タンパク質が適切にプロセスされ、そしてより重要には、膜攻撃複合体ア センブリの阻害により証明されたように、その生物学的機能が保持されたことを 示した。CD59 Minigene １の欠陥のいくつかを改善する試みにおいて、改変バー ジョンであるMinlgene ２を構築した。実施例II：CD59 Minigene No.２ 2.1 CD59 Minigene No.２の構築 CD59 Minigene No.２の構築を以下のように行った。最初に、CD59エキソン２ を、プライマーEX2-5(5'-TACCCCGGGCATGTCCCCAAAGAGAGC-3')およびEX2-3C(5'-CC GCTCGAGGCTGCTGTCACTATGACC-3')を用いてPCR増幅して、エキソン２の5'側の0.52 Kbおよびエキソン２の3'側の0.43Kbを含む1048bpのPCR産物を得た。エキソン２ および周囲の塩基(85bpのエキソン２の5'側の125bpおよび3'側の125bp)を配列分 析により確認した。PCR増幅は、クローニングの目的のために、PCR産物の5'末端 にSmaI部位およびPCR産物の3'末端にXhoI部位を導入した。次の工程は、プライ マーEX3-5(5'-CACAGGAGCTCCAGTTGCAGGTTAGGAGG-3')およびEX3-3C(5'-CGCAGGAATT CAGCTTGAGTCTCCTCAGG-3')を用いてCD59エキソン３をPCR増幅して、エキソン３の 5'側の0.27Kbおよびエキソン３の3'側の0.53Kbを含む913bpのPCR産物を得た。エ キソン３および周囲の塩基(98bpのコード配列の5'の50bpおよび3'の50bp)を配列 決定により確認した。PCR増幅は、クローニングプロセスのために、PCR産物の5' 末端にSstI部位およびPCR産物の3'末端にEcoRI部位を導入した。次いで、CD59エ キソン４を、エキソン４の5'側の0.61Kbおよびエキソン４の3'側の1.7Kbを含む2 .5EcoRIフラグメントとして、13.11bL(Toneら、J.Mol.Biol.227:971-976,1992) と称されるλクローンから単離した。最後に、CD59エキソン１を、CD59 Minigen e No.1由来の8.5KbのXbaI/SalIフラグメントとして単離し（最初にλクローン13 .11bLから単離した）、そしてエキソン１の5'側の4.5Kbおよびエキソン１ の3'側の4.0Kbを含んだ。 ベクターを、以下の部位がこの順番：KpNI、NotI、XbaI、SmaI、XhoI、SstI、 EcoRI、SalI、NotIで存在するように、オリゴヌクレオチドを用いて作製した特 異的に設計したポリリンカーを用いて構築した。ポリリンカーを、pGem(Promega )骨格に導入した。上記のゲノムフラグメントを以下のようにクローニングした 。最初に、913bpのSstI/EcoRIエキソン３のPCR産物を、ベクターのSstI/EcoRI部 位にクローニングした。次いで、1048bpのSmaI/XhoIエキソン２PCR産物を、上記 のSmaI/XhoI部位にクローニングした。次の工程は、エキソン４を含む2.5Kb Eco RIフラグメントの上記のEcoRI部位へのクローニングであった。次に、エキソン １を含む8.5KbのXbaI/SalIフラグメントをSalI部位でフィルインして平滑末端を 作製し、そして上記のXbaI/SmaI部位にクローニングした。最後に、全ての連結 産物を、方向および単一コピー挿入について複数の制限酵素消化により確認した 。最終的な13Kb産物を、NotI消化により単離した（図１を参照のこと）。 2.2 トランスジェニックマウスの作製 13Kbフラグメントをマウス受精卵にマイクロインジェクトして、トランスジェ ニックマウスを得た。始祖マウスはCS7BL/6 SJL F2交配であった。７匹の始祖マ ウスが産まれ、そして全てが種々の組織の内皮細胞上でヒトCD59を発現した。次 いで、全ての系統由来の子孫について大規模な分析を行った。2.3 トランスジェニックマウスにおける発現分析 2.3.1 FACS分析 FACS分析により、系統9-1由来の85〜99％のRBCが、ヒトCD59タンパク質につい て陽性であった。この知見は、分析した１つ以外すべてのマウス系統において一 致した。対照的に、第１のCD59ミニ遺伝子構築物（CD59 Minigene No.1）を使用 して誘導されたトランスジェニック動物は、いずれもRBC上でヒトCD59を発現し なかった。9-1 CD59トランスジェニックマウス系統由来のRBC上でのヒトCD59の 発現のピーク平均値は、ヒトRBC上で見られる値と同等であるかまたはそれより 高かった。FACS分析は、ヒトRBC上で見られるレベルに匹敵するレベルを実証し た。2.3.2 ノーザンブロット分析 トランスジェニックマウス系統9-1子孫から得た組織（肝臓、心臓、腎臓、筋 肉、皮膚、脾臓および胸腺）のRNA分析は、CD59 RNA発現レベルが、CD59 Minige ne No．1について見られたレベルより少なくとも15〜20倍高く、そしてヒト組織 において見られるレベルに近づくレベルにあることを示した（図１および表４を 参照のこと）。2.3.3 免疫組織学分析 肝臓、心臓、および腎臓上のヒトCD59タンパク質の検出のための免疫組織学は 、発現レベルならびに細胞および組織型特異性が、ヒト組織において見られるそ れを反映したことを示した。これは、CD59 Minigene No.1を使用して観察された こと（ここで発現は、腎臓中および循環血球上においては存在せず、そして肝臓 において非常に限定されていた）と対照的であった。2.4 トランスジェニック動物における機能分析 トランスジェニックヒトCD59タンパク質の機能を、ヒト血清に対する曝露に際 しての補体媒介性溶解からの、RBCにもたらされる防御を測定することにより評 価した。顕著な防御が検出された。これはCD59 Minigene No.1とは比較し得なか った。なぜなら、そのRBC上には発現が検出され得なかったからである。しかし 、系統9-1を使用して検出された防御は、研究室において利用可能であるCD59 P1 陽性マウスを使用して見られる防御を超える（図２を参照のこと）。 ５つの他の創始体（founder）由来の子孫に対するRNAおよび免疫組織学的分析 は、トランスジェニックマウス系統9-1について見られる結果に匹敵する結果を 与える。１つの系統は、RNAとタンパク質の両方の増加した発現レベルを有し、 そして他は、ヒトCD59発現のわずかにより低いレベルを有する。 マウスCD59 Minigene No.2トランスジェニック系統の分析は、第２のミニ遺伝 子がCD59 Minigene No．1より非常に優れており、そしてCD59 P1より好ましいこ とを示した。トランスジェニック率は、おそらくそれぞれの構築物の大きさに基 づいて、P1クローンに比較してミニ遺伝子構築物について高かった。それぞれの 遺伝子の子孫への伝達は類似していたが、CD59 Minigene No.2は、CD59 Minigen e No.1またはCD59 P1のいずれよりもずっと良好な浸透度を示した。CD59 Mingen e No.2を使用して発達させたすべての系統（６／６）は、一貫した様式でトラン スジーンを発現した。 CD59 Minigene No.1トランスジェニックマウスに比較した場合、CD59 Minigen e No.2マウスにおけるCD59発現レベルは、一貫してそして有意により高く、そし て組織および細胞型特異性は、内因的に見られる特異性を反映した。CD59 Minig ene No.1を使用して発達させたトランスジェニックマウスの５匹の系統はヒトCD 59を検出可能なレベルで発現したが、これらの系統の４匹は極めて低レベルのRN Aおよびタンパク質を有した。最高レベルで発現するマウス系統をさらに特徴付 け、そしてこれが、CD59 Minigene No．2を使用して発達させたマウス系統に対 するすべての比較において表される系統である。ノーザン分析（図３）およびこ のデータのデンジトメータースキャン（表４）において示されるように、CD59 M inigene No．2マウス組織におけるmRNAレベルは、Minigene No．1マウス組織に おいて見られるレベルよりも15〜20倍高い。CD59 P1マウスまたはヒト組織にお いて見られるmRNAに対するCD59 Minigene No.2マウス組織mRNAレベルの比較は、 発現レベルが全く同様であることを示す。しかし、最高発現P1マウス系統および 最高発現CD59 Minigene No．1マウス系統を、中間発現CD59 Minigene No．2マウ ス系統に対して比較したことを考慮するべきである。 異なるトランスジェニックマウス系統（P1、CD59 Minigene No．1およびCD59 Minigene No．2）におけるヒトCD59タンパク質レベルならびにヒト組織において 見られるヒトCD59タンパク質レベルの比較（表５）は、CD59 Minigene No．2マ ウス由来の組織上で検出されるタンパク質のレベルが、CD59 Minigene No．1マ ウス由来の同じ組織上で見られるレベルをずっと超え、そしてP1マウスおよびヒ トにおいて見られるレベルに匹敵することを示す。 ヒトCD59の生物学的活性は、ヒト血清に対する曝露に際しての、RBCのような 細胞に与えられる防御の関数として測定され得る。細胞溶解は、この場合、ヘモ グロビン放出として測定される。CD59 Minigene No．2トランスジェニックマウ スのRBC上およびCD59 P1トランスジェニックマウス上で発現されるヒトCD59の機 能分析を、図２に示す。CD59 Minigene No．2 RBCは、C57BL/6マウス由来の非ト ランスジェニックRBCよりも、補体媒介性溶解に対して約10倍耐性であり、そし てCD59 P1トランスジェニックマウス由来のRBCより約３倍耐性である。これらの 図は、RBCの50％を溶解するために必要とされるヒト血清％に基づく。 マウスおよびブタ中への構築物の同時注入から編纂したデータの要約を表６に 示す。CD59 Minigene No.1構築物をMCPおよびDAF（エキソン１中の唯一のXho I 部位においてcDNAとして挿入した）の発現のためのカセットとして使用すること を試みた。しかし、CD59 Minigene No.1／CD59 Minigene No.1（カセットとして ）の同時注入はマウスにおいて行わなかった。異種プロモーターにより駆動され るcDNAを利用する補体調節タンパク質（CRP）構築物のマウスへの同時注入は、M CPおよびDAF P1クローンで同時注入したCD59 P1クローンに比較され得る。見ら れるように、種々のP1クローンのマウスへの同時注入は、3.4％の頻度で、２つ の異なるトランスジーンについて陽性であるマウスを与えた。しかし、すべての 場合において、繁殖に際して、トランスジーンは分離され、このことは、異なる トランスジーンの組み込みが異なる染色体上で起こったことを示す。しかし、よ り小さい構築物のマウスへの同時注入の分析は、予想される頻度の二重トランス ジェニックがCD59 P1クローンに比較して得られるが、すべての場合において、 より小さいトランスジーンの二重組み込みは忠実に伝達されたことを示し、この ことは、同時組み込みが起こったことを示す。 種々のP1クローンのブタへの同時注入は、0.64％のみの頻度で、２つの異なる P1遺伝子についでトランスジェニックである動物を与える。これまでに、４匹中 １匹の創始動物が、２つのP1遺伝子構築物を単位として子孫に忠実に伝達した。 CD59 minigene No．1とCD59 Minigene No．1（カセットとして）とのブタへの同 時注入は、２／49（4.1％）のトランスジェニック動物を生じさせた。これらの 動物の両方は、両方の遺伝子についてトランスジェニックであり、そして両方の 動物は、両方の遺伝子をすべての子孫に伝達した。それゆえ、CD59 Minigene構 築物が両方の場合において同時組み込みされたと結論され得る。 結論として、CD59 Minigene No．2構築物は、トランスジェニック動物におけ る機能的ヒトCD59タンパク質の、高レベルの、組織および細胞型特異的な発現を 指向させ、これはCD59 Minigene No．1を使用して見られる発現よりずっと優れ ている。CD59 Minigene No．2構築物についての全体のデータは、CD59 P1ゲノム クローンを使用して見られるデータより良くないにしても、それに匹敵する。さ らに、同時注入データの分析は、CD59 Minigene構築物が、他の遺伝子（すなわ ち、他のCRP）を発現させ、次に、２つまたは３つの異なるトランスジーン（そ のすべてが、子孫に伝達される）を有する動物を得るためにこれらの構築物を同 時注入するための、カセットとして有用となることを示す。現在まで、４匹のブ タはヒトCD59を発現することが示された。RBCに対するFACS分析および筋肉バイ オプシーの免疫組織学的分析の両方が、CD59発現について陽性であった。実施例III：CD59ミニ遺伝子カセット 3.1 CD59ミニ遺伝子カセットの構築 1.3Kb産物を、ゲノムDNAをテンプレートとして使用して、エキソン２の5'側約 1.34Kbおよびエキソン２中のATGの3'側16bpを含むようにPCR増幅した。3'プライ マーを操作して、XbaI部位を導入することによりエキソン２中のATGをノックア ウトした。SmaI部位およびKpNI部位をそれぞれ5'末端および3'末端に導入した。 使用したプライマーは以下のとおりであった：5'AGGTGCACGGCCCACCGTGGCCACTAGT ACTTACCCGGGGACCTCAGACCAC-3'（太字のSmaI部位を有する）（イタリックのSfiT 部位を、可能な次のクローニング工程のために含めた）および5'-CGGGGTACCCGTT AGTCTAGAAATGTGATTGTCCACAGAAC-3'（太字で示すKpNI部位、イタリックで示すXba I部位、およびCD59に相補的なヌクレオチドに対応する下線を付した配列を有す る）。 第２の0.512Kb産物を、CD59 minigene No．2をテンプレートとして使用してPC R増幅した。産物は、エキソン２中のATGのすぐ3'側に生じるGで開始し、そして エキソン２の末端を過ぎてイントロン２中へ3'側に0.43Kb伸長する。KpNI部位お よびXhoI部位を、プライマーの一部としてそれぞれ5'末端および3'末端に付加し た。使用したプライマーは、5'-GGGGTACCAAGGAGGGTCTGTCCTGTTCG-3'（太字のK pNI部位を有する）および5'-CCGCTCGAGGCTGCTGTCACTATGACC-3'（太字のXhoI部位 を有する）であった。 第３の3.5Kb XhoI/NotIフラグメントを、CD59 minigene No．2から単離し、こ れはエキソン３の5'側0.27Kb、エキソン３、イントロン３の5'側の0.53Kb、イン トロン３の3'側の0.61Kb、エキソン４、および1.7Kbの3'非翻訳配列を含む。 ３つすべての上記フラグメントを、この順序で連結して：1.35Kb SmaI/KpNI− −−0.512Kb KpNI/XhoI−−−3.5Kb XhoI/NotI、エキソン２のATGにおいて挿入 されたKpNI部位およびXbaI部位を含む5.5SmaI/NotI産物を作製し、開始メチオニ ンの破壊を生じた。この部位は、内皮細胞上での発現のためのcDNAを導入するた めのクローニング部位として作用する。一旦cDNAが挿入されると、CD59エキソン １を含む5'を8.5Kb XbaI/SalIフラグメントとして付加し、SalI部位をフィルイ ンして、SmaI部位への連結のための平滑末端を与えた。3.2 トランスジェニックマウスの作製 DAF（またはMCP）のcDNAをCD59ミニ遺伝子カセットのKpNI XbaI部位において 挿入した。そして得られた構築物を受精マウス卵にマイクロインジェクトして、 トランスジェニックマウスを得る。サザンブロット分析によりトランスジェニッ クとして同定される創始体マウスは、C57BL/6×SJL F2交配である。次いで、十 分な分析を創始体マウス由来の子孫に対して実施する。3.3 トランスジェニックマウスにおける発現分析 3.3.1 ミニ遺伝子カセットを使用するDAF発現 DAF発現カセットを使用して作製された創始体トランスジェニックマウスの５ 匹すべてはRBC上のDAFを発現し、そして２匹の創始体はFACSにより測定すると、 ヒトに匹敵するレベルの発現を有した。DAFタンパク質は、トランスジェニック マウスRBCを補体媒介性溶解から防御する能力により測定すると、機能的であっ た。ヒトDAFのRNAおよびタンパク質レベルは、ヒトにおける内在性レベルに比較 して、トランスジェニックマウス組織において数倍低かった。3.3.2 ミニ遺伝子カセットを使用するMCP発現 MCP発現カセットのマイクロインジェクションは、50匹の潜在的な創始体を生 じた。これら50匹中８匹のマウス（16％）が、トランスジェニックとして同定さ れた。心臓mRNAのノーザンブロット分析は、これら８匹の創始体系統のうち５匹 が適切な大きさの転写物を発現し；その５匹のうち、１つの系統が、ヒト心臓サ ンプル中で内在性に観察されるレベルに匹敵するレベルで、MCP mRNAを発現した ことを示した。実施例IV：P1クローンを利用して作製されたトランスジェニック動物 4.1 P1クローンの同定および精製 オリゴヌクレオ゛チド対（表７）（これは、以前に公開された配列データから 設計し、そしてCD59およびCD46の5'および3'領域に対応する）を使用して、ポリ メラーゼ連鎖反応により、バクテリオファージP1中に構築されたヒトゲノムライ ブラリー（Genome Systems．St．Louis，MO）をスクリーニングした。両方の組 のプライマーを使用して、クローンを同定した。高分子量プラスミドDNAを、ア ルカリ溶解によりESCherichia coliのNS3529株から単離し、次にQiagen-500カラ ム（Chatsworth，CA）で精製した。挿入物を、制限酵素消化、パルスフィールド ゲル電気泳動（PFGE）、およびサザンブロット分析によりマッピングした。 マイクロインジェクションのための候補フラグメントを、各クローン中に存在 する5'および3'フランキング領域の量に基づいて選択した。 マイクロインジェクションのためのフラグメントを調製するために、クローン をSfiIまたはMluIで制限し、そして消化混合物をPFGEによりサイズ分画した。エ チジウムブロミド染色により可視化した後、クローンを含むフラグメントをゲル から切り出し、精製し、濃縮し、そして完全性について分析した。4.2 トランスジ、ェニックマウスの作製 精製して、フラグメントを個々に受精マウス卵母細胞中にマイクロインジェク トした。創始動物（C57BL/6×SJL F2）をサザンブロット分析により同定し、そ して系統を戻し交配により樹立した。２つのトランスジーンを有する動物を、子 孫を交配することにより（例えば、CD59およびCD46 F1動物）、作製した。27匹 の潜在的な創始体から、５匹（19％）がCD59について陽性であった。MCPゲノム クローン（60kbおよび80kbの両方）は、各々13匹のトランスジェニック創始体を 生じ、それぞれ29％および15％のトランスジェニック率を表した。DAFについて の90kb構築物は、19匹のG0マウスから６匹の陽性トランスジェニックを生じた。 70kbのDAF構築物は、18匹中３匹のトランスジェニック創始体を生じた（17％） 。G1世代への遺伝子伝達は、CD59、60kb MCP、および80kb MCPフラグメントそれ ぞれについて、50％（２／４）、83％（10／12）、および69％（９／13）であっ た（表８）。６匹中５匹のDAF創始体はまた、遺伝子をG1子孫に伝達した。これ らのデータは、トランスジェニックマウスが大きなゲノムフラグメントをマイク ロインジェクトすることによりうまく作製され得ること、およびこれらの遺伝子 が次の世代に伝達され得ることを示す。4.3 トランスジェニックマウスにおける発現分析 ヘテロ接合体G1動物を、ノーザン分析、免疫化学、およびFACS分析により、発 現について分析した。4.3.1 FACS分析および定量 マウス末梢血球（赤血球および白血球）の表面上のタンパク質発現を、間接免 疫蛍光法により評価した。細胞表面発現を、標準的な技術を使用するフローサイ トメトリーにより測定した。4.3.2 ノーザン分析 全細胞RNAを、組織、血液、または両方から単離し、そしてノーザンブロッテ ィングを実施した。すべてのプローブは、ランダムプライミングにより[-32P]デ オキシ-CTPで放射標識したフラグメントであった。ヒト全RNAサンプルをポジテ ィブコントロールとして作用させ、そしてこれをClontech（Pala Alto，CA）か ら購入した。4.3.3 免疫組織学分析 免疫蛍光法研究のための組織を、O.C.T．(Lab Tak，Elkhart，IN)中に包埋し 、イソペンタン中で急速凍結（snap frozen）させ、そして処理まで-80℃で保存 した。凍結組織サンプルをクリオスタット（Leica，Heidelberg，Germany）中で 調製した。切片を風乾し、アセトンで固定し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（ PBS）で洗浄した。各々の切片をモノクローナル抗体（mAb）とインキュベートし 、そしてmAbを、FITC結合親和性単離F(ab)'2二次および三次抗体からなる二重蛍 光色素層を用いて検出した。インキュベーション後、組織切片をPBSで洗浄し、 そしてp-フェニレンジアミンおよびグリセロール溶液を用いてマウントした。バ ックグラウンド免疫蛍光を、切片を以前に記載したように調製し、そして一次抗 体を省略することにより、評価した。ラットmAbであるYTH 53.1およびマウスmAb であるMCA 695（Serotec，Washington，DC）を、それぞれCD59およびCD46を検出 するために使用した。さらに、ローダミン結合抗体（A.F.Michaels（University of Minnesota）により提供された）を、基底構造を例証するために利用した。 組織を、Leitz DMRB epifluoresence microscope（Wetzlar，Germany）を使用し て検査し、そして写真撮影（40×）した。 CD59 mRNAおよびタンパク質を発現する５匹のトランスジェニック系統を同定 した。肝臓、心臓、および腎臓組織におけるmRNAレベルの範囲を、ヒトにおいて 見られるフラグメントと基本的に同様である70kbゲノムフラグメント（実施例Ｉ およびIIにおいて詳細に記載した）を有する系統において観察した。トランスジ ェニックマウスは、免疫細胞化学により評価すると、肝臓、心臓、および腎臓中 の内皮細胞の表面上で、そしてFACS分析により評価すると、RBC上で、CD59を発 現していた。これらの結果は、大きなゲノムCD59クローンを利用することにより 、組織特異的発現が達成され得ることを実証する。 60kb MCPゲノムフラグメントを有する８匹の独立トランスジェニック系統は、 RNAおよびタンパク質のトランスジーン発現について陽性であった。RNA発現は、 腎臓において最高であり、そして心臓および肝臓においてはわずかにより低かっ た。３匹のトランスジェニック系統において、RNAレベルは、それぞれのヒト組 織において見出される内因性レベルに匹敵した。タンパク質は肝臓、心臓、およ び腎臓の内皮細胞上で発現され、最高の発現は肝臓において見られた。さらに、 FACS分析は、白血球の表面上のMCPの存在を実証した。CD59およびDAFとは対照的 に、ヒト循環血球におけるMCPタンパク質の発現は、RBC上では存在しない。マウ スRBCがヒトMCP発現について陰性であったという点で、MCPトランスジーンは同 様に挙動した。同様のシナリオが、80kb MCPゲノムフラグメントについて観察さ れた。ここで、分析した５匹の系統は、ヒトMCPのRNAおよびタンパク質の発現に ついて陽性であった。２つの構築物についての組織分布は同様であった。これら の結果は、これらの特定のMCPゲノムクローンを利用することにより、細胞型お よび組織特異的発現が、ヒトにおいて内因性に検出されるレベルに匹敵するレベ ルで達成され得ることを意味する（トランスジェニックマウス系統の２匹由来の 種々の組織上でのタンパク質発現の詳細については、表９を参照のこと）。4.4 機能分析 トランスジェニックヒトCD59タンパク質の機能を、血球に提供される、ヒト血 清への曝露に際しての補体媒介性溶解からの防御を測定することにより評価した 。4.5 複数のヒト補体調節ゲノムクローンを有するトランスジェニックマウス 複数のヒト補体調節ゲノムクローンを有するトランスジェニックマウスを作製 した。これを、異なる補体調節タンパク質を発現する独立系統を交配繁殖される ことにより、および以下のクローンの同時注入により達成した：a）70Kb CD59＋ 60Kb MCP、b）70Kb CD59＋90Kb DAF、c）60Kb MCP＋90Kb DAF、およびd）70Kb C D59＋60Kb MCP＋90Kb DAF（三重注入）。P1クローンの二重および三重注入由来 の動物の分析は、P1遺伝子の同時組み込みが起こらなかったことを示す。CD59お よびMCP P1遺伝子の両方を有するマウスは、２匹の別々のP1系統を交配繁殖する ことにより得られた。これらのマウスの分析は、トランスジェニック動物におけ る２つの補体調節タンパク質の発現の相加効果または相乗効果に取り組むために 進行中である。4.6 P1クローンを含むトランスジェニックブタ系統の作製 トランスジェニックブタ系統を、トランスジェニックマウス系統とほとんど同 じ方法で開発した。CD59、DAF、およびMCPの二重および三重マイクロインジェク ションを実施した。790匹の潜在的な創始体ブタが1994年３月〜1995年３月に誕 生した。単一のトランスジーンについて陽性のブタのうち、９匹はMCPについて 陽性であり；２匹はCD59について陽性であり；そして、７匹はDAFについて陽性 であった。３匹のブタがCD59およびDAFについて陽性であり、１匹のブタがMCPお よびCD59について陽性であり、そして１匹のブタがMCPおよびDAFについて陽性で あった。創始体ブタのサブセットを、血液サンプル、筋肉バイオプシーまたはそ の両方を利用して分析した。 最も高感度のmRNAの検出方法（すなわち、RT-PCR）を使用して、分析したMCP 陽性ブタの３／３がMCP mRNAについて陽性であり、分析したCD59陽性ブタの１／ １がCD59 mRNAについて陽性であり、そして分析したDAF陽性ブタの５／５が、DA F mRNAについて陽性であった。動物由来の血液のノーザン分析（より低感度の検 出方法）は、それぞれのメッセージを検出しなかった。MCP+CD59陽性動物は、RT -PCRにより検出可能なMCPおよびCD59メッセージを有し、そしてノーザン分析に より検出可能なメッセージのみを有した。２匹のCD59＋DAF陽性動物は、RT-PCR により検出可能なレベルの両方のメッセージを有し、１匹の動物は、ノーザン分 析によっても検出可能なDAF mRNAおよびCD59 mRNAを有した。第３のCD59＋DAF動 物は、両方の方法によって検出不能のメッセージを有した。MCP＋DAF創始体ブタ は、RT-PCRにより検出可能なMCP mRNAのみを有した。以下の要約を参照のこと： 上記のデータは、創始動物が頻繁にモザイクであるという観察により修正され る必要がる。しばしば創始動物においては検出不能であるが、トランスジーンに 特異的なRNAは、トランスジーンの子孫への伝達に際して頻繁に検出可能である 。これは血液サンプルで特に真であるということが、本発明者らのP1トランスジ ェニックマウスでの経験であった。分析のための血液の採集は、潜在的に価値の ある創始動物について利用可能な最も侵襲性の低い手順を表し、それゆえこれが 現在使用される分析方法である。上記に列挙するブタに加えて、さらに31匹のブ タが誕生し、そしで試験を待っている。発現レベルおよび組織特異性を決定する ために、十分な分析が創始体ブタのすべての子孫に対して実施されなければなら ない。実施例Ｖ：YACを使用するヒトCRP遺伝子座の産生およびその使用 5.1 多重遺伝子YAC（multi-gene YAC）の産生 P1ゲノムCD46、CD55、およびCD59遺伝子について記載したような大きなDNAフ ラグメントは、適切な組織特異性を有する高レベルの遺伝子発現を頻繁に生じる 。いくつかの適用において（例えば、異種移植）、複数のトランスジーンを利用 することが重要であるかもしれない。しかし、大きなDNAフラグメントについて 、１つより多い遺伝子を有するトランスジェニック動物の作製のための単純な同 時注入ストラテジーを使用することは困難である。トランスジェニック胚のゲノ ム中の単一の部位中に高頻度で同時組み込みするより小さいDNAフラグメント（ ＞50kb）とは異なり、より大きなゲノム遺伝子の同時注入は、複数の独立した組 み込み部位および遺伝子再編成の頻度の増加を頻繁に生じる。このプロセスを通 して作製されたトランスジェニック動物は、複数のトランスジーン組み込み部位 を含む。繁殖に際して、これらのトランスジェニック動物は、子孫にトランスジ ーンを独立して分離し、その結果、大部分の子孫には、同時注入されたトランス ジーンの総数の一部のみが遺伝する。さらに、各々の組み込み部位は、正常ゲノ ム構造の破壊を表し、これは有害な変異を作り出す可能性を増加させる。潜在的 な変異は、異種移植（ここで、トランスジェニック器官は、ヒトレシピエント中 で延長された期間生存することが期待される）のような適用において特に問題で ある。 これらの問題を回避するために、そしてその上に異種移植に関連する追加の遺 伝子が付加され得る枠組みを作製するために、本発明者らは、CD46、CD55、およ びCD59をコードずる３つの大きなヒトゲノムDNAフラグメントからなる、独特の ヒト補体調節遺伝子座を組み立てるためのプロトコルを設計した。CD46、CD55、 およびCD59に対する遺伝子からなる最初の遺伝子座は200kbを超える。 最近、数百キロベースまでのDNAの大きなフラグメントが受精卵にうまくマイ クロインジェクトされ得ること、およびこれらの非常に大きなDNAフラグメント が、合理的な頻度でインタクトかつ機能的なままであることが明らかとなってい る。Schedlら、Nuc ．Acids Res．20:3073-3077(1992);Gaenslerら、Proc ．Nat． Acad．Sci． 90:11381-85(1993);Schedlら、Nature 362:258-261(1993);およびGn irkeら、Genomics 15:659-667（1993）を参照のこと。次いで、このことは、一 連のP1サイズのゲノムフラグメントが、DNAの単一の断片に組み合わされ得、次 いでマイクロインジェクトされ得ることを示唆する。このストラテジーは、複数 のP1サイズのDNAフラグメントからなるトランスジーン遺伝子座が規定された構 造からなったこと、およびこの遺伝子座中のすべてのP1遺伝子が単一のゲノム部 位中に組み込まれることを保証する。遺伝子は物理的に連結されているので、こ のストラテジーはまた、トランスジーン遺伝子座を構成する複数の遺伝子の各々 が、単位として次の世代に忠実に伝達されることを保証する。5.1.1 ヒトCRP遺伝子座のアセンブリ P1クロニーング系がDNAを100Kbまでしかパッケージし得ないので、酵母(YAC) クロニーング系(Burkeら、Science 236:806-812，1987)を使用して、このサイズ を越える遺伝子座をアセンブリする必要がある。本発明者らは、CD59、CD46およ びCD55をコードするP1ゲノムフラグメントを記載した。一緒にして、これらの３ つのP1遺伝子は、合計200KbのDNAになる。このサイズは、YACクロニーング系に より容易に供給され得る。各P1ゲノムフラグメントの末端は、制限酵素部位の独 特な対により定義される(表10)。これらの３つの遺伝子のアセンブリを容易にす るために、本発明者らは、これらの制限部位を含有する複数のクロニーング部位 を含むようにpYAC4クロニーングベクターを改変した(図４)。複数のクロニーン グ部位中の制限酵素部位の順位は、３つのP1遺伝子からなる遺伝子座の連続的ア センブリを可能にする。最初の工程は、隣接する60KbのCD46 P1遺伝子をpSRY-1 のMlu1部位にクローン化することである。これによって、MCP遺伝子を含有するY ACを産生する。P1挿入物は、TRPアーム側からMCPの転写が起こるように配置され ることが好ましい。同様に、70KbのSfiI CD59 P1遺伝子は、SnaB1部位にクロー ン化されて、CD59遺伝子を含有する第２のYACを産生する。最終に、Not1消化MCP -YACおよびSfiI消化CD59-YACは、Not1、SfiI CD55 P1遺伝子と一緒に連結され得 る。5.1.2 YAC-MCPの産生 P1 MCPクローンからなる高分子量のプラスミドDNAを、アルカリ溶解により単 離し、続いてQiagen-500カラム上で精製する(Chatsworth，CA)。DNAを制限酵素M lu1で完全に消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し(Rileyら、Techniques for the Analysis of Complex Genomes ，59-79頁，1992)、そしてTE(10mM Tris( pH7.5)，1mM EDTA)に対してスポット透析する。プラスミドpSRY-1をMlu1およびB amH1で消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、そして6.0kb のTrpアームおよび3.4kbのUraアームをゲル精製した。次いで、消化したP1 DNA を10モル過剰のpSRY-1アームになるまで一夜連結し、そしてBurgersら(Analytic al Biochem ．163:391-397，1987)の記載のように、AB1380スフェロプラストに形 質転換した。形質転換体を最初にura-プレート上、次いでura-、trp-プレート上 で選択した。続いて、ゲノムDNAプラグを、urea+、trp+コロニーから作製し、そ してPFGEおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより、YACを含有するM CPの存在について分析した。クロニーング部位におけるMCP DNAの完全性および 挿入物の配向は、プラスミドレスキューを用いてさらに決定され得る。5.1.3 YAC-CD59の産生 SfiI制限部位が５ランダム塩基を含有するので、CD59 P1遺伝子を規定するSfi I消化は、不適合の３塩基対オーバーハングを産生する。この３塩基対オーバー ハングは、SRY-IプラスミドのSfiI部位に直接クローン化され得ない。このため に、本発明者らは、CD59 P1遺伝子をpSRY-1 YACにクローン化するための２つの 方法を記載する。第１の方法は、単にpSRY-1のSnaB1部位に70KbのCD59挿入物を 平滑連結としてクローン化することである。P1 CD59クローンからなる高分子量 のプラスミドDNAをアルカリ溶解により単離し、続いてQiagen-500カラム(Chatsw orth，CA)で精製する。DNAを、制限酵素末端で完全に消化し、T4 DNAポリメラー ゼで充填し、フェノール／クロロホルムで抽出し(Rileyら、1992、上記を参照) 、そしてTE(10mM Tris(pH7.5)，1mM EDTA)に対してスポット透析する。プラスミ ドpSRY-1をSnaB1およびBamH1で消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リ ン酸化し、そして6.0kbのTrpアームおよび3.4kbのUraアームをゲル精製した。次 いで、消化したP1 DNAを10モル過剰のpSRY-1アームになるまで一晩連結し、そし てBurgersら(1987、上記を参照)に記載のようにAB1380スフェロプラストに形質 転換した。形質転換体を最初にura-プレート上、次いでura-、trp-プレート上で 選択した。続いて、ゲノムDNAプラグを、urea+、trp+コロニーから作製し、そし てPFGEおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより、YACを含有するMCP の存在について分析した。クロニーング部位におけるCD59 DNAの完全性および挿 入物の配向は、プラスミドレスキューを用いてさらに決定され得る。このアプロ ーチは、平滑連結が必要であるため、この場合では困難であることが証明された 。さらに、特定のクローンの増殖が不十分であるため、十分量のCD59 P1挿入物 の単離は困難である。これらの問題のため、本発明者らは、以下に概説する別の ストラテジーを開発した(5.2章)。5.1.4 YAC-DAFの産生 P1 DAFクローンからなる高分子量のプラスミドDNAをアルカリ溶解により単離 し、続いてQiagen-500カラム(Chatsworth，CA)で精製する。DNAを、制限酵素Not 1およびSfiIで完全に消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し(Rileyら、199 2、上記で引用)、そしてTE(10mM Tris(pH7.5)，1mM EDTA)に対してスポット透析 する。プラスミドpSRY-1をNot1、SfiI、およびBamH1で消化し、仔ウシ腸アルカ リホスファターゼで脱リン酸化し、そして6.0kbのTrpアームおよび3.4kbのUraア ームをゲル精製した。次いで、消化したP1 DNAを10モル過剰のpSRY-1アームにな るまで一夜連結し、そしてBurgersら(1987、前出)に記載のようにAB1380スフ ェロプラストに形質転換した。形質転換体を最初にura-プレート上、次いでura- 、trp-プレート上で選択した。続いて、ゲノムDNAプラグを、urea+、trp+コロニ ーから作製し、そしてPFGEおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより 、YACを含有するDAFの存在について分析した。クロニーング部位におけるDAF DN Aの完全性および挿入物の配向は、プラスミドレスキューを用いてさらに決定さ れ得る。5.1.5 ３つの遺伝子座のアセンブリ ３つの遺伝子座をアセンブリするために、YAC-MCP染色体を、PFGEを用いて酵 母細胞からゲル精製し、そして単離したバンドをNot1で消化する。同様に、YAC- CD59染色体を、PFGEを用いて酵母からゲル精製し、そして単離したバンドをSfiI で消化した。次いで、これらの消化した染色体フラグメントを、等モル量のゲル 精製70kd Not1、SfiI DAF P1挿入物に連結し、そしてAB1380スフェロプラストに 形質転換する。形質転換体を最初にura-プレート上、次いでura-およびtrp-プレ ート上で選択した。続いて、ゲノムDNAプラグを、urea+、trp+コロニーから作製 し、そしてPFGEおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより、３つの全 ての遺伝子を含有する200kdのYACの存在について分析した。5.2 別のクロニーングスキーム CD59-YACの形成は、特に困難であった。この工程は、かなり低い効率のプロセ スである平滑連結を包含する。さらに、特定のCD59 P1クローンの増殖が不十分 であるため、平滑連結のための十分量のCD59挿入物の精製は困難である。これら の問題のため、本発明者らはまた、YACを含有するCD59を産生するための別の方 法を使用してきた(Ketnerら、1994、Proc ．Not．Acad．Sci．91:6186-90)。この アプローチは、酵母に発生する高頻度の相同的組換えに依存する。簡潔に述べれ ば、酵母スフェロプラストを、３部分のDNA(すなわち、全CD59挿入物、CD59挿入 物の極度な5'領域の一部を含有するYAC-Trpアーム、およびCD59挿入物の極度な3 '領域の一部を含有するYAC-Uraアーム)でトランスフェタトする。CD59-YACは、 ２つの相同的組換え事象によって生じる。第１の事象は、Trp-YACアーム中の5'C D59配列とCD59 P1遺伝子の相同5'領域との間の組換えであり、第２の事象は、Ur a-YACアーム中の3'CD59配列とCD59 P1遺伝子の相同3'領域との間の組換えである (図５)。このアプローチを利用するために、本発明者らは、プラスミドレスキュ ーおよびこれらのサブクローンを部分的に配列決定することにより、CD59 P1挿 入物の5'末端部分および3'末端部分を単離した。この分析から、PCRのための一 連のオリゴヌクレオチドプライマーを産生した(表12)。プライマー対CH-1および CH-2は、Not1、SfiI(CH-1)およびBamHI制限部位を含有し、そしてCD59 P1遺伝子 の5'末端から1.4kbのフラグメントを増幅する。このフラグメントをNot1、BamH1 フラグメントとして、pSRY-Iにクローン化する。得られるプラスミドは、1.4kb の5'CD59挿入物と共に6kbのTrp-CEN-ARS YACアームを含有する。CD59 P1挿入物 の3'末端についで、SnaB1およびHincIIを有する1.2kbのPCR産物を、プライマーE D-1およびED-2を用いて増幅した。このPCR産物を、SRY-1のSnaB1部位に平滑に消 化した。1.2kbの3'フラグメントの配向を、挿入物の接合部を配列決定すること により確認した。最終のCD59 YACをアセンブリするために、３部分のDNAをAB 13 80にトランスフェクトした。Not1で直線化されたCD59 P1 DNAを、等モル量のBam HI消化5'CD59-Trp-YACアームおよびSnaB1、BamHI消化3'CD59-Ura-YACアームで同 時トランスフェクトした。形質転換体を最初にura-プレート上、次いでura-、tr p-プレート上で選択した。続いて、ゲノムDNAプラグを、urea+、trp+コロニーか ら作製し、そしでPFGEおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより、YA Cを含有するCD59の存在について分析した。YAC中のCD59 DNAの完全性および配向 は、サザンブロット分析、プラスミドレスキュー、または5'および3'連結ドメイ ンを横切るPCR増幅を用いてさらに決定され得る。正確な構造を有する形質転換 体を、高頻度で単離した(表11)。5.2.1 相同的組換えによるアセンブリ P1遺伝子をYACベクターにサブクローン化するための相同的組換えの使用は、Y ACを含有するMCPおよびDAFを産生するために、および３つの全ての補体調節遺伝 子、または任意の他のさらなる遺伝子を含有する三重遺伝子YACの連続的アセン ブリを容易にするために使用され得る一般的アプローチである。図５は、どの様 にして三重遺伝子YACを連続的にアセンブリし得るかを概説する。このアプロー チのために、P1ゲノムCRP遺伝子の極度な5'および3'フラグメントが単離されな ければならない(図5A)。これらのフラグメントを、プラスミドレスキュー、サブ クロニーング、PCR増幅または任意の多くの標準的技術により単離し得る。酵母 における相同的組換えを容易にするために、これらのフラグメントは、独特な配 列、反復のエレメントの欠損、および約500〜2000塩基対の長さであるべきであ る。CD59、MCPおよびDAFの末端フラグメントの特徴を、表13に示す。３遺伝子の YACの連続的アセンブリはまた、３つの選択可能な栄養性酵母マーカー遺伝子の 使用を必要とする。この目的のために、本発明者らは、栄養性マーカーUra3、Tr p1およびLys2を使用したが、使用されている酵母株の遺伝子型に依存して、他の 組み合わせのマーカーも可能である。Ura3およびTrp1マーカーアームはpSRY1に 由来した。Lys2マーカーは、pDP6の4.5kb Hind3サブクローンである(Fleigら、1 986，Gene 46:237-245)。これは、機能的Lys2-YACアームを産生するために、本 発明者らがpSRY-1の700bp Hind3、BamHIテロメアシード配列に付加した。 ３つの全てのヒト補体調節ゲノム遺伝子を含有するYAC染色体の連続的アセン ブリは、上記のMCP遺伝子からCD59-YACまで、5'末端フラグメントの付加で開始 する。この付加を行うために、CD59の3'末端フラグメントおよびMCPの5'末端フ ラグメントを互いに接合し、そしてLys2 YACアームに挿入した。この3'CD59-5'M CP-Lys2 YACアームにおいて、3'CD59配列は、相同的組換えの部位を標的にする ために作用し、その結果、このDNAが酵母株を含有するCD59-YACにトランスフェ クトされる場合、3'CD59配列間の相同的組換え事象は、Ura3マーカーを効果的に 欠失させ、そしてこれをLys2-YACアームで置換する(図5B)。形質転換体を、lys- 培地を用いて機能的Lys2遺伝子について最初に選択する。次いで、クローンを、 5-フルオロオロト酸(FOA)を含有するlys-、trp-培地を用いる三重選択下に置く 。この培地は、機能的Trp1およびLys3遺伝子の存在について同時に選択し、そし てFOAの添加は、機能的Ura3マーカーに対して選択する。さらに、酵母クローン を、Trp1、Lys2、CD59および5'MCPのプローブ用いてPFGEおよび差動サザンブロ ットハイブリダイゼーションにより特徴づける。少量のクローンしか分析しなか ったが、正確な構造および遺伝的挙動を有する形質転換体を高頻度で単離した( 表11)。 MCPゲノムDNAの残りを新しいCD59-5'MCP-Lys2-YACに加えるために、MCP遺伝子 の1.3kbのNco1、Mlu1 3'末端をUra3-YACアームに平滑に連結した。この構築物を 制限消化により直線化し、そしてMlu11消化MCP-P1 DNAで酵母株を含有するCD59- 5'MCP-Lys2-YACに同時トランスフェクトした(図5C)。形質転換体を、ura-培地を 用いて機能的Ura3遺伝子について最初に選択する。次いで、クローンを、α-ア ミノアジペート(α-Ap)をも含有するura-、trp-培地を用いる三重選択下に置く 。この培地は、機能的Trp1およびUra3遺伝子の存在について同時に選択し、そし てα-Apの添加は、機能的Lys2マーカーに対して選択する。5'および3'MCP配列中 の相同的組換え事象により、CD59、ならびにTrp1およびUra3栄養性マーカーに隣 接するMCP補体調節遺伝子の両方を含有する新しい染色体が生じる。さらに酵母 クローンを、Trp1、Ura3、CD59およびMCPのプローブを用いてPFGEおよび差動サ ザンブロットハイブリダイゼーション分析により特徴づける。正確な構造を有す る形質転換体を高頻度で単離した(表11)。 第３の遺伝子であるDAFの付加は、類似な方法で達成される(図5D)。MCPゲノム 遺伝子の1.3kbの3'部分をEcoR1フラグメントとして、ゲノムDAF遺伝子の2.2kbの 5'部分を含有したプラスミドに付加した。次いで、これらの２つの遺伝子フラグ メントをLys2-YACアームに付加し、そしてCD59-MCP-YAC二重遺伝子YACにトラン スフェクトした。lys-選択および続くlys-、trp-、FOAの三重選択により、本発 明者らは、CD59-MCP-5'DAF-Lys-YACクローンを誘導した。DAFゲノム遺伝子の残 りを、70KbのNot1-SfiI DAFゲノムDNAをUra3 YACアームに接合した0.8kbの3'DAF フラグメントと共に同時トランスフェクトすることにより取り込んで、三重遺伝 子YACを産生した。適切な選択工程の後、酵母クローンをPFGEおよび差動サザン ブロットハイブリダイゼーションにより分析した。 この３つの遺伝子座を使用して、高レベルの３つのヒト補体調節遺伝子の全て を発現するトランスジェニックブタを作製し得る。この新しい遺伝子座は、個々 に注入したP1遺伝子より優れている。なぜなら、３つの遺伝子の全ては、注入前 に物理的に連結されており、それによって単一の遺伝子座として取り込まれるこ とが期待されるからである。さらに、この独特な遺伝子座は、YACとして増殖さ れるため、上記の相同的組換え技術を用いて、この遺伝子座へのさらなる付加が 行われ得る。例えば、galエピトープ（α(1,2)FT、α(2,6)SLまたはβ(1,3)NAGT をコードする核酸を含むが、これらに限定されない）のレベルをマスクするかま たは減少させる遺伝子を付加し得て、主要異種抗原のレベルを低下させ得、かつ ヒト補体活性化を制御し得る遺伝子座が得られる。この遺伝子座へのさらなる付 加は、ブタの異種器官ドナーの開発の進歩につれて行われ得る。例えば、血管拒 絶反応に影響を及ぼす付加的なヒト遺伝子(例えば、トロンボモジュリン、タン パク質Ｃ、Ｈ因子、組織因子、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター、ec toATPase、NFkbのインヒビター)、または細胞拒絶反応に影響を及ぼすヒト遺伝 子(例えば、IL-4、IL-10、TGF-β、共刺激分子CD28およびCD40をブロックする薬 剤、サイトカイン作用をブロックする可溶性レセプター(例えば、可溶性のIL-2 レセプターまたはIFNgレセプター))、またはブタの抗原提示細胞を破壊するため に使用され得る遺伝子(例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼをコードするCD2 またはCD45調節遺伝子)もまた、上記の方法を用いて、この遺伝子座に付加され 得る。これらの遺伝子の全ては、大きなゲノムDNAである必要がないが、良好に 特徴づけられたミニ遺伝子または他の任意の遺伝子構築物であり得る。5.3 トランスジェニック動物の作製 マイクロインジェクションのために、YAC構築物を周知の方法を用いて調製す る。YAC構築物を含む酵母染色体を、非常に大きなDNA分子を解明するために設計 されたパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)を用いて分離する。160kbのYACを単 離するために、１％のSeaPlaque GTG低融点アガロース(FMC Corp.)パルスフィー ルドゲル(14℃、６ボルト／cm2で20時間泳動、120°のスイッチ角度および２〜1 0秒のスイッチ時間)を用いる。単離されたYAC染色体をゲルから消化し、アガロ ースゲルスライスを注入緩衝液(10mM Tris(pH7.5)、0.1mM EDTA、100mM NaCl、3 0μMスペルミンおよび70μMスペルミジン)中で緩衝化した。アガロースゲルスラ イスを65℃で融解し、そしてゲラーゼ(Eplcenter Technology)で37℃で３時間消 化する。次いで、消化したアガロースを、大口径のピペットチップを用いてMicr on 10コンセントレータ(Amicon)に移し、そこで、元のゲルスライスの全容量が2 0〜50μlの容積に減少するまで、DNAを5,000ｇで15分間繰り返し遠心分離す ることにより濃縮する。YAC DNAの完全性を、マイクロインジェクションの前に パルスフィールドゲルにより検査し得る。 次いで、DNA構築物のマイクロインジェクションを、この出願において先に記 載されるように行う。トランスジェニック動物およびそれらの子孫の分析を、こ の出願において先に記載された方法に従って行う。実施例VI： Gal エピトープレベルを低下させるためのグリコシルトランスフェ ラーゼの使用 最近の研究により、抗体媒介性拒絶反応が異種活性天然抗体(XNA)のGalエピト ープへの結合により開始されることが示されている。例えば、Sandrinら、P.N.A .S ． 90:11391-11395(1993)を参照のこと。Galエピトープは、グリコシルトラン スフェラーゼ、特にα(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ(すなわち、α(1,3 )GT)により産生される。本発明者らは、このエピトープの産生を導く経路を操作 することにより、Galエピトープの発現を改変しようと努めた。特に、本発明者 らは、α(1,3)GTによって利用される基質の競合を作製し、これによってGalエピ トープの発現を低下させるために、他のグリコシルトランスフェラーゼをクロニ ーングし、そしてこれらを動物および／または組織培養細胞で発現した。6.1 組織培養細胞におけるα(1,2)FTのクロニーングおよび発現 ブタのα(1,3)GT cDNA(1.1kb)を、ブタの大動脈内皮細胞由来の全RNAおよび一 本鎖cDNA合成キット(Pharmacia)を用いるRT-PCRにより得た。変性PCRプライマー は、例えば、Larsenら、J ．Biol．Chem．265:7055-7061(1990)およびJoziasseら 、J ．Biol．Chem．264:14290-14297(1989)に記載されるように、マウスおよびウ シのGT配列に基づいた。cDNAを、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復(RSV-LTR)由 来のエンハンサーおよびプロモーター配列ならびにネオマイシン耐性遺伝子を含 有する真核生物発現ベクターpRex10(pRex10/GT)にクローン化した。ヒトα(1,2) FTcDNAを、Larsenら、P.N.A.S ．87:6674-6678(1990)に記載されるように、A431 細胞株由来の全RNAを用いるRT-PCRによりクローン化した。センスプライマー(TT TGGATCCTCGGCCATGTGGCTCCGGAGCCATCG)(配列番号１)は、ATG開始コドンに隣接し 、 そしてBamH I部位を含んだ。アンチセンスプライマー(AAAGTCGACTCAAGGCTTAGCCA ATC)(配列番号２)は、TGA停止コドンに隣接し、そしてSal I部位を含んだ。1.1k bのcDNAをpRex 10(pRex10/FT)にクローン化して、組織培養細胞においてα(1,2) FTを発現した。α(1,2)FTを発現するトランスジェニック動物の作製のために、 α(1,2)FT cDNAを500bpのニワトリアクチンプロモーター(＃876)(図６を参照)、 または4.3kbのH2kbプロモーター(＃881)(図７を参照)を含有するベクターにクロ ーン化した。スプライスおよびポリアデニル化配列を、第２のエキソンから下流 の配列を含有するヒトグロビン遺伝子の900bpのHindIII/KpnIフラグメントによ り提供した。 本発明に従っで、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ(すなわち、α(1,2)FT) 遺伝子を含有するトランスジェニック動物の作製前に、チャイニーズハムスター 卵巣(CHO)細胞をモデル系として用いて、α(1,2)FTが、糖タンパク質および糖脂 質の改変についでα(1,3)GTと競合するかどうかを決定した。これらの細胞は、 α(1,3)GTおよびα(1,2)FTの両方に欠損であるが、これらの酵素の両方のアクセ プターとして作用し得るN-lacを発現する。CHO細胞を、ブタのα(1,3)GT cDNA(p Rex10/GT)でトランスフェクトした。ブタのα(1,3)GT cDNA(1.1kb)を、ブタの大 動脈内皮細胞由来の全RNAおよび一本鎖cDNA合成キット(Pharmacia)を用いるRT-P CRにより得た。 細胞培養およびトランスフェクション工程について、細胞培養およびトランス フェクション試薬をGibco BRLから入手した。チャイニーズハムスター卵巣(CHO- K1)細胞(ATCC、CCL-61)を、10％ウシ胎児血清で補足したglutamax-1を含有するF -12(HAM)培地に維持した。トランスフェクションを、リポフェクタミンで１〜２ μgのスーパーコーイルのプラスミドDNA(pRex10/GTまたはpRex10/FT)を用いて製 造者の指示に従って行った。 細胞表面抗原発現についてのアッセイを、Collinsら、Xenotrans ．1:36-46(19 94)に記載されるように行った。要するに、96ウェルプレート中の細胞を、１％ グルタルアルデヒドで固定し、次いで異なる濃度のレクチン-ビオチンコンジュ ゲート接合体(E.Y．labs)と室温で１時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄 し、そして1:1000希釈のストレプトアビジン-HRP(Pierce)と１時間インキュベー トした。プレートを150ul/ウェルのHRP-基質溶液を用いて暗黒中で５〜10分間展 開した。反応を、50ulの２M H2SO4で中止した。プレートを、Molecular Devices Vmaxマイクロプレートリーダーで505nmにおいて読み取った。 これらの実験を合わせて得られた全細胞タンパク質抽出物を、Hanasakiら、J ．Biol．Chem． 269:10637-10643(1994)に記載されるように調製した。要するに 、５×106の細胞を、0.8mlの細胞溶解緩衝液(0.16M NaCl、1mM EDTA、１％NP4O 、2.5mMデオキシコール酸塩、0.1％SDS、10μg/mlアプロトニン、10μg/mlロイ ペプチンおよび20mM Tris-HCl、pH8.0)にて４℃で10分間インキュベートした。 細胞をEppendorfチューブ中にかき集め、そして12000×gで５分間回転し、上清 を除去し、そしてタンパク質濃度を決定した。 トランスフェクトされた細胞中のα(1,3)GTの発現を、XNAによって認識される ように同じ末端構造Galα(1,3)Galを認識するレクチンGriffonia simplicifolia 1イソレクチンB4(GS-1-B4)を用いるレクチン結合アッセイにより評価した。１ つの代表的なクローン(CHO/GT)の分析を図８に示す。トランスフェクトされてい ないCHO細胞はレクチンGS-1-B4を結合しないが、CHO/GT細胞は明らかにレクチン を結合し、従ってgalエピトープを生じる。 α(1,2)FTがN-lacについてα(1,3)GTと競合する程度を決定するために、CHO/G T細胞をpRex10/FTでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞(CHO/G TFT)のプールを選択し、そしてレクチン結合アッセイにより、α(1,3)GTおよび α(1,2)FTの発現について分析した。α(1,2)FTの発現を、Ｈ抗原を検出するレク チンUlex europaeus I(UEA-I)の結合に基づいて決定した。図８に示されるよう に、高レベルのＨ抗原を発現するCHO/GTFT細胞は、CHO/GTに比べて、GS-1-B4結 合の70％までの減少を示す。CHO/GT細胞株とCHO/GTFT細胞株との間にはα(1,3)G T mRNAのレベルまたは遺伝子コピー数の差が観察されなかった。これは、減少し たGS-1-B4の結合(およびこれによる低いα(1,3)GT活性)が酵素レベルでの競合に よることを示唆する。 次に、膜タンパク質のグリコシル化(これは、異種移植では糖脂質よりも重要 であるかもしれない)(plattら、Transplantation 57:327-332(1994)を参照)を、 レクチンブロッティングにより調べた。レクチンブロッティングを、小さな改変 を加えながら、Hanasaklら、J ．Biol．Chem．269:10637-10643(1994)に記載され るように行った。使用の方法において、タンパク質試料(10μg)を、試料緩衝液( 50mM Tris-HCl、pH6.8、100mM 2-メルカプトエタノール、２％SDS、0.2％ブロモ フェニル、および10％グリセロール)に再懸濁し、100℃で３分間加熱し、そして 7.5％のSDSゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質を、100ボルトで２時間I mmobilon-P膜(Millipore)に移した。移した後、膜を、Tris-緩衝生理食塩水(TBS :150mM NaCl、1mM CaCl(2)、1mM MgCl(2))、1mM MnCl(2)および20mM Tris-HCl、 pH7.5)／0.1％Tweenで２回リンスした。１％オボアルブミン／TBSで１時間ブロ ッキングした後、膜を１％オボアルブミン／TBS／0.1％Tween中で３μg/mlのレ クチン-ビオチンコンジュゲートと４℃で１時間インキュベートした。膜をTBS／ Tweenで３回洗浄し、そして１％オボアルブミン／TBS中で１μg/mlのストレプト アビジン-HRPと１時間インキュベートした。洗浄後、化学発光検出キット(ECL W estern Blotting Detection Kit、Amersham Corp.)を用いて製造者の指示に従っ て、膜を展開した。 CHO細胞中のブタのα(1,3)GT(CHO/GT)の発現により、ほとんど60kDaを越える 範囲のタンパク質のガラクトシル化を生じた(図９、GS-1-B4パネルを参照)。CHO /GT細胞中のα(1,2)FT(CHO/GTFT)の発現は、GS-1-B4のこれらのタンパク質との 結合を排除し、かわりに、Ｈ抗原(フコシル化タンパク質)の発現をもたらした。 これらの結果は、明らかに、α(1,2)FTがブタの(1,3)GTと競合し得ること、お よびα(1,2)FTがトランスジェニック動物においてgalエピトープのレベルを低下 させるために使用される得ることを示唆する。6.2 α(2,6)STのクローニング α(2.6)シアリルトランスフェラーゼを、Weinstelnら、J ．Biol．Chem．262:1 7735-43（1987）に開示されるように、ラット肝臓由来の全RNAを用いるRT-PCRに よってクローン化した。ヒト配列はラット配列と80％同一である。センスプライ マー（AATATTAGCCAGAAGCAG）はSsp1部位を含んだ。アンチセンスプライマー（TC GAGTACTCAACAACGAATGTT）はTGA終止コドンに隣接し、そしてSca1部位を有する。 1.3kbのcDNAをpRex10にクローン化して（pREX10／RST）、先の6.1節に記載した 方法と同様の方法を用いて、組織培養細胞中で発現させた。類似の分析を行った 。6.3 トランスジェニック動物中でのα(1,2)FTの発現 内皮細胞上およびサイログロブリン、フィブリノーゲンなどのような分泌され る糖タンパク質上のgalエピトープを正常に発現するマウス中のα(1,3)GTと競合 させるためにα(1,2)FTを用いる概念を、適切なプロモーターを用いて試験した 。ニワトリβ-アクチン（AcFT#876）およびマウスH2kbプロモーター（H2FT、#88 1）を用いて、内皮細胞上でのα(1,2)FT cDNAの発現を駆動した（図６および７ で観察される）。これらのプロモーターは、トランスジェニックマウスおよびブ タ中でヒトCD59およびDAFを発現させるために以前の実験において用いられ、内 皮細胞を含むが、それに限定されない広範囲な組織発現をもたらしている。Byrn eら、Transplantation 60:1149-1156(1995)。 トランスジェニックマウスを、Loganら、Meth ．Enzym．231:364-373（1994） に示されるように、受精したマウス卵母細胞（C57BL/6）の雄性前核に適切なDNA を注入することによって調製した。次いで、トランスジェニックマウスを得るた めに、卵を偽妊娠させた雌に移した。 PCRおよびサザン分析によって、このプロセスによって産生された３／29およ び７／30のマウスが、それぞれ構築物#876（AcFT）および#881（H2FT）をそれら のゲノムに組み込んだ。構築物#881を有するトランスジェニックマウスを、α(1 ,2)FT遺伝子の発現について分析した。さらに、ノーザンブロット分析を行った 。ここで、RNA STAT-60（TEL-TEST）を製造者の説明書に従って用いて動物組織 から全RNAを調製した。RNA（10μg）を、ホルムアルデヒドを含む１％アガロー スゲル上で分画し、そしてナイロンメンブレン（ICN Biomedical）に移した。プ ローブをReady To Go Kit（Pharmacia）を用いて調製し、そしてハイブリダイゼ ーションを行った。 ノーザンブロット分析は、図10に観察されるように、α(1,2)FT mRNAが心臓お よび腎臓を含む検討した全ての組織に存在することを示した。正常なマウス由来 組織では、α(1,2)FTシグナルは検出されなかった。短縮トランスジーンを含む マウス1-2由来のRNAもまた、α(1,2)FTメッセージについてネガティブであった 。 トランスジェニックマウス中でのＨ抗原の発現を、組織切片のレクチン染色お よび蛍光顕微鏡によって分析した。免疫組織化学的染色のためのサンプルの調製 において、予め冷却したイソペンタン中での急激な凍結後、組織サンプルを使用 するまで−80℃で保存した。次いで、FITCレクチンでの免疫組織化学的染色を、 Plattら、J ．Exp．Med．155:17-30（1982）に記載されるように行った。図11A〜 Dに示すように、トランスジェニックマウス（1-4）は、心臓の筋細胞および内皮 細胞へのUEA-Iの結合により示される、Ｈ抗原の高レベルの発現を示したが（図1 1のパネルＣを参照）、正常なマウスの組織では結合は観察されなかった（パネ ルＡを参照）。同様の結果が、正常なマウスに対してトランスジェニックマウス 由来の腎臓、肺、肝臓、および脾臓で観察され、発現は排他的ではないが、主に 実際内皮であった。 トランスジェニックマウス由来の組織中でのα(1,2)FTの発現がgalエピトープ の低下と関連するかどうかを決定するために、α(1,2)FTトランスジェニックマ ウスおよびコントロールマウスの組織切片をレクチンGS-1-B4で染色した。図11C に示すように、コントロールマウスと比較して、α(1,2)FTトランスジェニック マウスの心臓において、GS−1-B4結合のレベルにおける劇的な減少が存在した（ 図11Bを参照）。この結果は、α(1,2)FT遺伝子の発現がGalα(1,3)Galのレベル の劇的な低下を引き起こすことを示唆する。6.4 トランスジェニック動物におけるα(2,6)STの発現 内皮細胞上およびサイログロブリン、フィブリノーゲンなどのような分泌され る糖タンパク質上のgalエピトープを正常に発現するマウス中のα(1,3)GTと競合 させるためにα(2,6)STを用いる概念を、適切なプロモーター（詳細には、ニワ トリβアクチンプロモーター）を用いて試験した。図８に示すように、トランス ジェニック動物中でのα(2,6)STの発現を、ニワトリβアクチンプロモーター（# 882）の500bpを含む構築物を用いて得た。 トランスジェニックマウスを、Loganら、Meth ．Enzym．231:364-373（1994） に示されるように、受精したマウス卵母細胞（C57BL/6）の雄性前核に適切なDNA を注入することによって調製した。トランスジェニックマウスをサザン分析によ って同定した；103匹のマウスのうち17匹がトランスジーンについてポジティブ であった。次いで、トランスジェニックマウスを互いに交配し、そしてF1子孫（ または創始動物）を、組織RNAのノーザン分析によってα(2,6)ST mRNAについて 分析した。１つの系統において、(9-8×14-8)骨格筋および心臓での高レベルの 発現が観察された。α(2,6)STの発現がGalエピトープのダウンレギュレーション および結合の減少を生じたかどうかを決定するために、内皮細胞を正常な心臓お よびα(2,6)STトランスジェニック心臓から調製し、そしてGS-1-B4またはXNAで 染色し、そしてFACSによって分析した。ECを抗CD31抗体で標識した。実験的に決 定されたように、トランスジェニック心臓のEC由来のECへの、GS-1-B4およびXNA の両方の結合の減少が存在する。さらに、トランスジェニックECはまた、正常な マウスと比較して減少した補体媒介性溶解を示した。6.5 トランスジェニックマウスにおけるα(1,2)FTの発現分析 α(1,2)FTの発現が異種反応性抗体の減少した結合を生じるかどうかを決定す るために、正常マウスおよびFTトランスジェニックマウスの心臓由来の内皮細胞 （EC）を単離し、XNAとともにインキュベートし、そしてフローサイトメトリー によって分析した。この分析を行うために、新たに採集した器官（心臓および肝 臓）を細かく刻み、そしてディスパーゼ（dispase）溶液（Becton Dickinson La bware）中で90分間、37℃で穏やかに振盪しながら消化した。生じた細胞懸濁物 を洗浄し、そしてCoulter Z1 Analyzerを用いて計数した。４×106細胞のアリコ ートを、３工程の手順を利用する免疫蛍光染色に使用した。最初に、細胞を、Pa rkerら、J ．Immunol．53:785-794（1994）に記載のように単離した10μgの異種 反応性天然抗体とともに、5mMのGalactobiose（V-Labs）を添加して、または添 加しないで、氷上で30分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、そして５μ gのビオチン化マウス抗ヒトIgM（Pharminigen）とともに氷上で30分間インキュ ベートした。また、10μgのFITC標識ヒツジ抗ヒト第VIII因子（Serotec）を全て のチューブに添加して、懸濁物中の内皮細胞を標識した。細胞を２回洗浄し、そ してCyChrome結合ストレプトアビジン（Pharminigen）とともに氷上で15分間イ ンキュベートした。全ての工程のためのコントロールは、適合した種およびイソ 型のコントロール抗体（Pharminigen）を含み、そして第２工程バックグラウン ド染色を行った。最後に、細胞を２回洗浄し、２％のパラホルムアルデヒド／PB 内皮細胞を、FLI-FITC(第VIII因子）対側方散乱（Side Scatter）のプロットを 用いて同定し、そしてゲートした。このゲートを使用して、XNA結合の分析のた めのFL1対FL3（CyChrome）のプロットを作製した。 図12Ａに示すよ、うに、トランスジェニックマウス由来の内皮細胞は、正常な マウス由来のECと比較してXNA（IgM）結合のレベルにおける有意な低下を示した 。二糖類ガラクトビオースであるGalα(1,3)GalとのXNAのインキュベーションは 、トランスジェニックマウスと同様に正常なマウスのECへの結合を完全になくし 、このことは、galエピトープに対するXNAの特異性を示す。 次いで、トランスジェニックマウス由来のECの補体媒介性溶解に対する減少し たXNA結合の効果を測定した。補体媒介性溶解を測定するために、上記の消化し た懸濁物由来の4×106細胞のアリコートをまた上記のように、20μgのヒトXNAで 予め感作し、そして同時に第VIII因子で染色した。細胞を洗浄し、そしてウサギ 血清（Sigma）の漸増濃度とともに、37℃で45分間インキュベートした。全ての チューブは、細胞溶解のレポーターとして作用するように、最終濃度10μg/mlの ヨウ化プロピジウムを含んだ。インキュベーション後、上記のようにフローサイ トメトリー分析を行って、内皮細胞をゲートし、そしてFL3チャンネルにおいて ポジティブに染色される溶解した細胞の割合を評価するために、FL1-FITC(第VII I因子)対FL3-ヨウ化プロピジウムのプロットを構築した。コントロールは、ウサ ギ血清およびヨウ化プロピジウムを含まないアリコート、ならびに溶解細胞に対 するウサギ血清および第VIII因子抗体の能力を評価するためにPNAで予め感作さ れていないアリコートから構成された。 図12Bに示すように、補体の供給源として添加されたウサギ血清を有するXNAと の、コントロール動物由来の内皮細胞のインキュベーションは、細胞の14％の溶 解を生じた。対照的に、FTトランスジェニックマウスのECの５％未満の溶解が観 察され、これは第VIII因子抗体、およびXNAなしのウサギ血清とともにインキュ ベートした正常ECまたはトランスジェニックECの溶解のレベルと同様である。6.6 α(1,2)FTトランスジェニックブタの作製 トランスジェニックマウスで得た結果に基づいて、トランスジェニックブタを 、受精したブタ卵の前核に２つのα(1,2)FT構築物（#876および#881）を同時注 入することによって作製した。全部で656匹の注射した卵を偽妊娠させた雌に移 し、そして58匹（33Ｍ，25Ｆ）が生まれた。５匹のトランスジェニックブタ（３ Ｍ、２Ｆ）をPCRによって同定し、そして尾DNAのサザン分析によって確認した。 １匹のブタは構築物#876（AcFT）を含み、１匹のブタは#881（H2FT）を含み、そ して３匹のブタは両方についてポジティブであった。6.7 α(2,6)STトランスジェニックブタの作製 トランスジェニックブタの作製を、ほとんど本願中で上記した様式で行った。 トランスジェニックブタ中でのα(2,6)ST mRNAの発現を、筋肉の生検由来の全RN Aのノーザン分析によって測定した。18匹中７匹のブタが転写レベルでトランス ジーンを発現した。6.8 α(1,2)FTトランスジェニックブタにおけるＨ抗原発現の分析 ブタにおいてGalα(1,3)Gal合成を抑制することにおける本発明のアプローチ の有効性の予備的なの分析として、構築物#876（AcFT）を含むトランスジェニッ クブタから得た組織を分析した。β-アクチンプロモーターは、Hanasakiら、J ． Biol．Chem． 269:10637-10643（1994）に示されるように、内皮細胞および筋肉 において高レベルの広範な発現を生じることが示されている。マウスにおけると 同様に、Ｈ抗原の高レベルの発現が、非トランスジェニック同腹子と比較して、 トランスジェニックブタの尾切片へのレクチンUEA-Iの結合によって検出された （図13を参照、Ｃ対Ａ）。同時に、GS-1-B4での染色によって示されるGalα(1,3 )Galの発現は、顕著に減少した（図12を参照、Ｂ対Ｄ）。これらのデータは、異 種galエピトープレベルが競合するグリコシルトランスフェラーゼの発現によっ て低下され得ることを強く示唆する。 本発明は、上記の実施態様に関して記載しているが、上記の本発明の特定の改 変および変更が本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得ることが、 当業者に直ちに明らかである。従って、全てのこのような改変は、本明細書に添 付される請求の範囲によって定義される、本発明の範囲内に入る。 表のリスト 表１ ヒト組織におけるCD59の分布 表２ いくつかの内皮遺伝子／プロモーターのリスト 表３ トランスジェニックマウスの作製に使用される遺伝子／プロモーターのリ スト 表４ CD59ノーザンのデンシトメトリー(densiometoric)スキャン 表５ CD59 P1ゲノムクローン、CD59 Minigene #1およびCD59の比較 表６ ２つまたは３つのトランスジーンのマイクロインジェクション 表７ ヒトゲノムDNAライブラリーのスクリーニングに利用されるオリゴヌクレ オチド 表８ マウス中での、CD59、CD46(MCP)、およびDAF P1フラグメントのトランス ジェニック率および浸透度 表９ トランスジェニックマウス組織中でのCD59およびCD46タンパク質の発現 表10 P1遺伝子の末端構造 表11 相同組換えによるアセンブリ 表12 YAC4のためのポリリンカーを産生するために使用されるオリゴヌクレオチ ドの配列 表13 CD59末端の増幅のためのPCRプライマーの配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/10 5/00 Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ロガン，ジョン エス. アメリカ合衆国 ニュージャージー 08691，ロビンズビル，オールド ヨーク ロード 1285 (72)発明者 バイルン，ジュラルド ダブリュー. アメリカ合衆国 ニュージャージー 08501，アレンタウン，ルート539 86 (72)発明者 シャルマ，アジェ アメリカ合衆国 ニュージャージー 08648，ロウレンスビル，フェイレル コ ート 24 【要約の続き】 能ではなかった程度まで抗体媒介性拒絶反応を低減また は消去しつつ、安全かつ効果的にヒトに移植され得、そ してヒトまたは霊長類ドナー由来のドナー器官、組織、 細胞、または非生存成分を得る必要性を有意に低下させ る、異種の器官、組織、細胞、および非生存成分を提供 し得る点で有利である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．抗体媒介性拒絶反応を低減させるかまたは消去させて、器官、組織、細胞、 または非生存成分をヒト患者に異種移植する方法であって、（a）異種反応性抗 原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの酵素、および 少なくとも１つの補体インヒビターを発現するトランスジェニック動物を作製す る工程；（b）該トランスジェニック動物から器官、組織、細胞、または非生存 成分を単離する工程；ならびに（c）該トランスジェニック動物由来の所望の器 官、組織、細胞、または非生存成分をヒト患者に移植する工程を包含する、方法 。 ２．前記トランスジェニック動物によって発現された前記酵素が、α(1,3)ガラ クトシルトランスフェラーゼ酵素と競合し得るグリコシルトランスフェラーゼを 含む、請求項１に記載の方法。 ３．前記トランスジェニック動物が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ、α( 2,6)シアリルトランスフェラーゼ、β(1,3)N-アセチルグルコサミニルトランス フェラーゼ、および上記の組み合わせからなる群より選択される１つ以上の酵素 を発現する、請求項１に記載の方法。 ４．前記トランスジェニック動物が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼおよ びα(2,6)シアリルトランスフェラーゼの両方を発現する、請求項１に記載の方 法。 ５．前記トランスジェニック動物が、CD59、DAF、MCP、および上記の組み合わせ からなる群より選択される１つ以上の補体インヒビターを発現する、請求項１に 記載の方法。 ６．前記トランスジェニック動物が、CD59、DAF、およびMCPを発現する、請求項 １に記載の方法。 ７．前記トランスジェニック動物が、CD59およびDAFを発現する、請求項１に記 載の方法。 ８．前記トランスジェニック動物が、CD59およびMCPを発現する、請求項１に記 載の方法。 ９．前記トランスジェニック動物が、DAFおよびMCPを発現する、請求項１に記載 の方法。 １０．前記トランスジェニック動物が、Ｉ因子、因子Ｈ、C4結合タンパク質、CR 1、CR2、C8結合タンパク質、HRF、MIP、P-18、HRF-20、MIRL、および上記の組み 合わせからなる群より選択される１つ以上の補体インヒビターを発現する、請求 項１に記載の方法。 １１．前記トランスジェニック動物が、前記異種反応性抗原のレベルを低下させ る少なくとも１つの酵素をコードする核酸、および少なくとも１つの補体阻害タ ンパク質をコードする核酸を、標的動物に導入することによって作製される、請 求項１に記載の方法。 １２．前記核酸が、ミニ遺伝子の形態で導入される、請求項１１に記載の方法。 １３．前記核酸が、ミニ遺伝子カセットの形態で導入される、請求項１１に記載 の方法。 １４．前記核酸が、酵母人工染色体（YAC）の形態で導入される、請求項１１に 記載の方法。 １５．前記核酸が、バクテリオファージP1クローンの形態で導入される、請求項 １１に記載の方法。 １６．前記トランスジェニック動物が、前記異種反応性抗原をマスクするかまた はそのレベル低下させる少なくとも１つの酵素をコードする核酸を、少なくとも １つの補体インヒビターをコードする核酸とともに、標的動物に同時注入するこ とによって作製される、請求項１に記載の方法。 １７．請求項１６に記載の方法であって、前記同時注入が、異種反応性抗原をマ スクするかまたはそのレベルを低下させる酵素および補体インヒビターの両方を 発現するトランスジェニック動物を作製するために、異物反応性化抗原をマスク するかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの酵素をコードする核酸を 、少なくとも１つの補体インヒビターをコードする核酸とともに、適切な動物の 授精卵母細胞の前核中へ同時注入し、そして該卵母細胞を偽妊娠した雌に移して 、妊娠満期まで宿させることによって行われる、方法。 １８．前記トランスジェニック動物が、発現ベクターにクローニングされる核酸 を用いて作製される、請求項１に記載の方法。 １９．前記発現ベクターが、プラスミドである、請求項１８に記載の方法。 ２０．前記発現ベクターが、真核生物発現ベクターpRex 10を含む、請求項１８ に記載の方法。 ２１．前記発現ベクターが、プロモーターをさらに含む、請求項１８に記載の方 法。 ２２．前記プロモーターが、ニワトリβ-アクチンプロモーターを含む、請求項 ２１に記載の方法。 ２３．前記プロモーターが、H2kbプロモーターを含む、請求項２１に記載の方法 。 ２４．前記発現ベクターが、エンハンサーをさらに含む、請求項１８に記載の方 法。 ２５．前記トランスジェニック動物が、RT-PCRによりクローニングされた異種反 応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる酵素をコードする核酸を 発現する、請求項１に記載の方法。 ２６．前記トランスジェニック動物が、A431細胞株由来の全RNAを用いてクロー ニングされた前記異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる 酵素をコードする核酸を発現する、請求項１に記載の方法。 ２７．前記トランスジェニック動物が、ブタである、請求項１に記載の方法。 ２８．前記トランスジェニック動物が、マウスである、請求項１に記載の方法。 ２９．異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも １つの酵素、および少なくとも１つの補体インヒビターを発現し得る、異種移植 において有用なトランスジェニック動物。 ３０．前記発現された酵素が、α(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素と 競合し得るグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項２９に記載のトランス ジェニック動物。 ３１．α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ、α(2,6)シアリノレトランスフェラ ーゼ、β(1,3)N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、および上記の組 み合わせからなる群より選択される１つ以上の酵素を発現する、請求項２９に記 載のトランスジェニック動物。 ３２．異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下し得る前記酵素お よび補体インヒビターが、内皮細胞において発現される、請求項２９に記載のト ランスジェニック動物。 ３３．前記トランスジェニック動物が、CD59、DAF、MCP、および上記の組み合わ せからなる群より選択される１つ以上の補体インヒビターを発現する、請求項２ ９に記載のトランスジェニック動物。 ３４．前記トランスジェニック動物が、CD59、DAF、およびMCPを発現する、請求 項２９に記載の方法。 ３５．前記トランスジェニック動物が、Ｉ因子、Ｈ因子、C4結合タンパク質、CR 1、CR2、C8結合タンパク質、HRF、MIP、P-18、HRF-20、MIRL、および上記の組み 合わせからなる群より選択される１つ以上の補体インヒビターを発現する、請求 項２９に記載の方法。 ３６．前記動物が、ブタである、請求項２９に記載のトランスジェニック動物。 ３７．前記動物が、マウスである、請求項２９に記載のトランスジェニック動物 。 ３８．ヒト患者に移植された際に、抗体媒介性拒絶反応を低減または消去するド ナー器官、組織、細胞、または非生存成分を提供する方法であって、（a）異種 反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下する少なくとも１つの酵素、 および少なくとも１つの補体インヒビターを発現するトランスジェニック動物を 作製する工程、ならびに（b）該トランスジェニック動物からドナー器官、組織 、細胞、または非生存成分を得る工程を包含する、方法。 ３９．前記ドナー器官、組織、細胞、または非生存成分が、ブタから得られる、 請求項３８に記載の方法。 ４０．抗体媒介性拒絶反応を低減させるかまたは消去して、器官、組織、細胞、 または非生存成分をヒト患者に異種移植する方法であって、（a）異種反応性抗 原をマスクするかまたはそのレベルを低下させるα(2,6)シアリルトランスフェ ラーゼを発現するトランスジェニック動物を作製する工程；（b）該トランスジ ェニック動物から所望の器官、組織、細胞、または非生存成分を単離する工程； ならびに（c）該所望の器官、組織、細胞、または非生存成分をヒト患者に移植 する工程を包含する、方法。 ４１．抗体媒介性拒絶反応を低減させるかまたは消去して、器官、組織、細胞、 または非生存成分をヒト患者に異種移植する方法であって、（a）異種反応性抗 原をマスクするかまたはそのレベルを低下させるβ(1,3)N-アセチルグルコサミ ニルトランスフェラーゼを発現するトランスジェニック動物を作製する工程；（ b）該トランスジェニック動物から所望の器官、組織、細胞、または非生存成分 を単離する工程；ならびに（c）該所望の器官、組織、細胞、または非生存成分 をヒト患者に移植する工程を包含する、方法。 ４２．抗体媒介性拒絶反応を低減させるかまたは消去して、異種移植に有用なト ランスジェニック動物を作製する方法であって、核酸を標的動物に導入する工程 を包含する、方法。 ４３．請求項４２に記載の方法であって、前記トランスジェニック動物が、異種 反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる酵素および補体インヒ ビタータンパク質の両方を発現するトランスジェニック動物を作製するために、 前記異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１ つの酵素をコードする核酸、および少なくとも１つの補体インヒビターをコード する核酸を、所望の動物の授精卵母細胞の前核中に同時注入し、そして該卵母細 胞を偽妊娠した雌に移して、妊娠満期まで宿させることにより作製される、方法 。 ４４．請求項４２に記載の方法であって、前記トランスジェニック動物が、前記 異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの 酵素をコードする核酸を発現するトランスジェニック動物、および少なくとも１ つの補体インヒビターをコードする核酸を発現するトランスジェニック動物を別 々に作製し、そして繁殖された動物のトランスジェニック子孫が作製され、これ らが異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１ つの酵素および少なくとも１つの補体インヒビターを発現するように、該２つの トランスジェニック動物を繁殖させることにより作製される、方法。 ４５．請求項４２に記載の方法であって、前記トランスジェニック動物が、前記 異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの 酵素および少なくとも１つの補体インヒビタータンパク質をコードする核酸を含 む単一のYAC構築物を調製し、そして該動物およびその子孫が該異種反応性抗原 をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの酵素、ならびに 少なくとも１つの補体インヒビタータンパク質を発現するように、該YAC構築物 を動物に導入することによって作製される、方法。 ４６．請求項４２に記載の方法であって、前記トランスジェニック動物が、前記 異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの 酵素、および少なくとも１つの補体インヒビタータンパク質をコードする核酸を 含む単一のミニ遺伝子を調製し、そして該動物およびその子孫が該異種反応性抗 原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの酵素、ならび に少なくとも１つの補体インヒビタータンパク質を発現するように、該ミニ遺伝 子を動物に導入することによって作製される、方法。 ４７．請求項４２に記載の方法であって、前記トランスジェニック動物が、前記 異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの 酵素をコードする核酸を含む１つ以上のミニ遺伝子、および少なくとも１つの補 体インヒビタータンパク質をコードする核酸を含む１つ以上のミニ遺伝子を調製 し、そして該動物およびその子孫が該異種反応性抗原をマスクするかまたはその レベルを低下させる少なくとも１つの酵素、ならびに少なくとも１つの補体イン ヒビタータンパク質を発現するように、両方の型のミニ遺伝子を動物に導入する ことによって作製される、方法。 ４８．請求項４２に記載の方法であって、前記トランスジェニック動物が、前記 異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの 酵素、および少なくとも１つの補体インヒビタータンパク質をコードする核酸を 含むP1クローンを調製し、そして該動物およびその子孫が該異種反応性抗原をマ スクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも１つの酵素、ならびに少な くとも１つの補体インヒビタータンパク質を発現するように、該P1クローンを動 物に導入することによって作製される、方法。 ４９．異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させる少なくとも １つの酵素、および少なくとも１つの補体インヒビターを単一の組み込み部位で コードする、核酸フラグメント。 ５０．酵母人工染色体の形態である、請求項４９に記載の核酸フラグメント。 ５１．ミニ遺伝子の形態である、請求項４９に記載の核酸フラグメント。 ５２．バクテリオファージP1クローンの形態である、請求項４９に記載の核酸フ ラグメント。 ５３．少なくとも２つの補体インヒビターをコードする、核酸フラグメント。 ５４．少なくともCD59、DAF、およびMCPをコードする核酸を含む、請求項５３に 記載の核酸フラグメント。 ５５．酵母人工染色体の形態である、請求項５３に記載の核酸フラグメント。 ５６．ミニ遺伝子の形態である、請求項５３に記載の核酸フラグメント。 ５７．バクテリオファージP1クローンの形態である、請求項５３に記載の核酸フ ラグメント。 ５８．単一の組み込み部位で補体インヒビターをコードする少なくとも２つの遺 伝子の遺伝子座を含む、請求項５３に記載の核酸フラグメント。 ５９．単一の組み込み部位でさらなる遺伝子を含む、請求項５８に記載の核酸フ ラグメント。 ６０．単一の組み込み部位で遺伝子の遺伝子座由来の複数の補体インヒビターを 発現する、トランスジェニック動物。 ６１．前記複数の補体インヒビターが、CD59、DAF、MCP、および上記の組み合わ せからなる群より選択される、請求項６０に記載のトランスジェニック動物。 ６２．前記複数の補体インヒビターが、CD59、DAF、およびMCPを含む、請求項６ ０に記載のトランスジェニック動物。 ６３．前記複数の補体インヒビターが、CD59およびDAFを含む、請求項６０に記 載のトランスジェニック動物。 ６４．前記複数の補体インヒビターが、CD59およびMCPを含む、請求項６０に記 載のトランスジェニック動物。 ６５．前記複数の補体インヒビターが、DAFおよびMCPを含む、請求項６０に記載 のトランスジェニック動物。 ６６．Ｉ因子、因子Ｈ、C4結合タンパク質、CR1、CR2、C8結合タンパク質、HRF 、MIP、P-18、HRF-20、MIRL、および上記の組み合わせからなる群より選択され る複数の補体インヒビターを発現する、請求項６０に記載のトランスジェニック 動物。 ６７．前記補体インヒビターをコードする遺伝子の遺伝子座を含む同一の組み込 み部位由来のさらなる遺伝子を発現する、請求項６０に記載のトランスジェニッ ク動物。 ６８．前記補体インヒビターが内皮細胞において発現される、請求項６０に記載 のトランスジェニック動物。 ６９．異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させるα(2,6)シ アリルトランスフェラーゼを発現する、異種移植において有用なトランスジェニ ック動物。 ７０．異種反応性抗原をマスクするかまたはそのレベルを低下させるβ(1,3)N- アセチルグルコザミニルトランスフェラーゼを発現する、異種移植において有用 なトランスジェニック動物。
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