DE69433745T2

DE69433745T2 - Modifizierte, verkürzte regulatoren des komplementsystems

Info

Publication number: DE69433745T2
Application number: DE69433745T
Authority: DE
Inventors: John P. Atkinson; Dennis Hourcade; Malgorzata Krych
Original assignee: St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 1994-09-23
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2014-09-24
Also published as: EP0730469A1; AU7842494A; JPH09506764A; EP0730469A4; ATE265221T1; CA2171953C; CA2171953A1; WO1995008343A1; AU691525B2; EP0730469B1; DE69433745D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft modifizierte und/oder verkürzte Formen von Komplementregulatoren, abgeleitet von regulatorischen Proteinen der Komplementaktivierung (RCA), insbesondere CR1.
Das Komplementsystem dient zur Unterstützung bei der Entfernung von Fremdsubstanzen und von Immunkomplexen von tierischen Wirten. Dieses System und seine Regulation werden von Hourcade, D., et al., Advances in Immunol. (1989) 45: 381–416 überblicksartig dargestellt. Kurz gefasst erzeugt das Komplementsystem entweder durch den "klassischen Weg" oder einen "alternativen Weg" C3b, das an Zielimmunkomplexe oder Fremdsubstanzen bindet und sie für ihre Zerstörung oder Clearance markiert. C3b wird aus dem Vorläufer C3 durch die proteolytischen Enzyme erzeugt, die allgemein als "C3-Konvertase" bezeichnet werden. Eine Form der C3-Konvertase wird auf dem klassischen Weg durch Assoziation der Proteine C4b und C2a erzeugt. Die andere Form wird auf dem alternativen Weg durch Assoziation von C3b und Bb erzeugt. Beide C3-Konvertasen können mit einer zusätzlichen C3b-Untereinheit zur Bildung von C5-Konvertasen, C3bBbC3b und C4bC2aC3b assoziieren, die beide aktiv bei der Produktion des C5-C9-Membranangriffkomplexes sind, der zu einer Zellyse führen kann und der Produktion von C5a, einem wichtigen proinflammatorischen Mittel.
Sowohl C3b als auch weniger direkt C4b sind im Komplementsystem Agonisten. Dies wird in dem Diagramm der 1 dargestellt.
Das Komplementsystem wird über eine Anzahl miteinander in Beziehung stehender Mechanismen reguliert. Es gibt zwei allgemeine Mechanismen für die Inhibition der destruktiven Bestandteile des Komplementsystems. Der erste Mechanismus ist allgemein umkehrbar, und erleichtert die Dissoziation der C3-Konvertasen, d. h. C3b von Bb und C4b von C2a.
Die Erleichterung der Dissoziation wird manchmal als Zerfallsbeschleunigung bezeichnet. Die Dissoziation kann auch eine reversible Bindung der antagonistischen Proteine zu C3b- oder C4b-Komponenten involvieren und so ihre Reassoziation verhindern. Der andere Mechanismus, der ein irreversibler Inaktivierungsvorgang ist, ergibt sich aus der proteolytischen Spaltung der C3-Konvertasebestandteile C3b oder C4b durch den Serin-Proteasefaktor I. Diese proteolytische Spaltung tritt nur in Gegenwart eines Cofaktors auf. Beide allgemein regulatorischen Mechanismen, die Erleichterung der Dissoziation von C3b und C4b und die Inaktivierung von C3b und C4b durch Spaltung durch Faktor I betreffen auch die Inhibition der alternativen Weg-C5-Konvertase (C3bBbC3b) und der C5-Konvertase des klassischen Wegs (C4bC2aC3b).
Die durch eine Region des Genoms kodierten Proteine, die als "Regulatoren der Komplementaktivierung" (RCA) Gencluster bekannt ist, sind an beiden vorstehenden Mechanismen beteiligt. Zur Zeit ist bekannt, dass mindestens sechs Komplementproteine durch diese Region kodiert werden. Sie sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1 RCA-Proteine: funktionelles Profil
Diese Proteine teilen sich bestimmte strukturelle Ähnlichkeiten, die unten weiter beschrieben werden.
Die reversible Bindung an C4b oder C3b zur Dissoziation der C3-Konvertasen wird durch zwei Plasmaproteine bewirkt, die als C4-Bindungsprotein (C4bp) und Faktor H bezeichnet werden und durch zwei Membranproteine, die als Zerfallsbeschleunigungsfaktor (DAF) und Komplementrezeptor 1 (CR1) bezeichnet werden. Die reversible Bindung an C4b wird durch C4bp, DAF und CR1 bewirkt, während die reversible Bindung an C3b durch Faktor H, DAF und CR1 bewirkt wird.
Die irreversible Inaktivierung der C3-Konvertasen, die sich aus der proteolytischen Spaltung der Konvertasekomponenten C3b oder C4b durch den Enzymfaktor I ergibt, kann durch eine Cofaktoraktivität auftreten, die durch den oben erwähnten Faktor H und C4bp im Plasma bewirkt wird und durch CR1 und das Membran-Cofaktorprotein (MCP) an der Zelloberfläche. Die Cofaktor-Aktivität zur Spaltung von C3b wird durch Faktor H, CR1 und MCP bewirkt, während die Cofaktoraktivität für die Spaltung von C4b durch C4bp, CR1 und MCP bewirkt wird. Es ist auch möglich, dass das sechste Protein, Komplementrezeptor 2 (CR2) diese Cofaktoraktivität auf der Zelloberfläche aufweist.
Zusammengefasst haben von den sechs Proteinen, die von dem RCA-Gencluster kodiert werden, Faktor H, C4bp und CR1 sowohl eine reversible Dissoziationsaktivität als auch eine irreversible Cofaktoraktivität; DAF hat nur eine reversible Dissoziationsaktivität und MCP und möglicherweise CR2 haben nur irreversible Cofaktoraktivitäten. CR1, DAF und MCP treten sowohl mit C3b als auch C4b in Wechselwirkung; C4bp tritt vorrangig mit C4b und Faktor H vorrangig mit C3b in Wechselwirkung.
Die zu CR1, CR2, DAF, MCP, C4bp und Faktor H korrespondierenden cDNAs wurden alle erhalten und sequenziert. Die Bewertung dieser Vergleichssequenzen hat zu der in 2A dargestellten Ausrichtung geführt, die die Organisation der RCA-Proteine in kurze Consensus-Repeats (SCR-haltige) und nicht-SCR-haltige Regionen mit den N-terminalen Enden zur linken Seite darstellt. In dieser Figur bezeichnet TM die Transmembrandomäne, C die cytoplasmatische Domäne, 0 die O-gebundene Glycosylierungsdomäne, G den Glycolipidanker, U eine Domäne mit unbekannter Bedeutung und D eine Disulfidbrücken-haltige Domäne.
Es gibt eine beträchtliche Einheitlichkeit unter der RCA-Familie der Proteine. Alle bestehen aus 60 bis 70 Aminosäuren langen sich wiederholenden Einheiten, die allgemein als Short (kurze)-Consensus-Repeats (SCRs) bezeichnet werden. Jedes SCR teilt sich eine Anzahl invariabler oder koch konservierter Aminosäurereste mit anderen SCRs in demselben Protein oder SCRs von anderen Familienmitgliedern. Diejenigen Mitglieder der Familie, die an Membranen gebunden sind, weisen außerdem an ihren C-Termini entweder Transmembranregionen oder intrazelluläre Regionen oder einen Glycolipidanker auf.
Die SCRs bilden die extrazellulären Bereiche derjenigen Mitglieder der Familie, die membrangebunden sind und fast die gesamte Proteinstruktur der sezernierten Mitglieder. Zwei covalent vernetzte Cysteinpaare etablieren zwei Schleifen innerhalb jedes SCRs. Die kleinsten Familienmitglieder sind DAF und MCP; jedes enthält 4 SCRs, gefolgt von einem O-gebundenen Glycosylierungsbereich. DAF endet auf einem Glycolipidanker, während MCP auf einem extracytoplasmatischen Segment unbekannter Bedeutung endet, einem Transmembranbereich und einer intrazellulären Domäne. Von den sezernierten Mitgliedern der Familie enthält Faktor H 20 SCRS, während die native Form. von C4bp eine Assoziation von sieben Untereinheiten von acht SCRs (den C4bp-α-Ketten) und einer Untereinheit von drei SCRs (der C4bp-β-Kette) ist. Beide C4bp-Ketten schließen auf Nicht-SCR-Domänen in Verbindung mit Kettendrähten durch Disulfidbindungen. CR2 enthält 16 SCRs, einen Transmembranbereich und eine intrazelluläre Domäne. Die häufigste polymorphe Form von CR1 enthält vier sich wiederholende Einheiten von sieben ähnlichen SCRs (langen homologen Repeats oder LHRS), nummeriert mit 1 bis 28, gefolgt von zwei zusätzlichen SCRs, bezeichnet als 29 und 30, einem Transmembranbereich und einem intrazellulären Bereich.
Klickstein, L. B., et al., J. Exp. Med. (1988) 168: 1699–1717 beschrieben die Identifikation von distinkten C3b- und C4b-Erkennungsstellen in CR1 unter Verwendung einer Deletionsmutagenese. Sie schlossen daraus, dass eine einzelne primäre C4b-Bindungsstelle in SCR 1–2 (SEQ ID NO: 1 und 3) lokalisiert ist, während zwei Haupt-C3b-Bindungsstellen in den SCRs 8–9 (SEQ ID NO: 2 und 4) und SCRs 15 bis 16 lokalisiert ist. Die C3b-Cofaktoraktivität war auf SCR 8–9 und SCR 15–16 lokalisiert. Kürzlich wurde gezeigt, dass die CR1-aktive Stelle, enthaltend SCR 8–9, sich auf SCR 10 erstreckt und durch Analogie die aktive Stelle, die SCR 15–16 enthält (die sich nur in einer Aminosäure von SCR 8–9 unterscheidet) sich auf SCR 17 erstrecken muss. (Kalli, et al., J. Exp. Med. 174, 1451–1460 (1991); Makrides, et al., J. Biol. Chem. 267, 24754–24761 (1992)). Die CR1-aktive Stelle, enthaltend SCR 1–2, erstreckt sich auf SCR 3 und/oder 4, wie von Makrides et al., (1992) berichtet.
Die murine C4bp-Bindungsstelle und vermutlich die C4b-Cofaktor- und C4bC2a-Zerfallsbeschleunigungs-aktiven Stellen erstrecken sich von den SCRs 1–3 in der α-Kette, berichtet von Ogata et al., J. Immunology 150, 2273–2280 (1993).
Die Faktor-H-Bindungsstelle und vermutlich die C3b-Cofaktor und C3bBb-Zerfallsbeschleunigungs-aktiven Stellen liegen innerhalb der ersten fünf SCRs. Die CR2-Bindungsstelle für die C3b-proteolytischen Produkte erstreckt sich durch die ersten beiden SCRs, Kalli et al., J. Immunology 147: 509–594 (1991); Carel, et al., J. Biol. Chem. 265: 12293–12299 (1990).
Die MCP-aktiven Stellen erstrecken sich durch alle vier SCRs: die SCRs 2–4 werden für die C3b- und C4b-Cofaktoraktivität benötigt. SCR1 scheint für die C3b-Cofaktoraktivität unnötig zu sein, ebenfalls wie für die Bindung, scheint jedoch für eine effiziente C4b-Cofaktoraktivität und Bindung notwendig zu sein, wie berichtet von Adams, et al., J. Immunology 147: 3005–3011 (1991). Die DAF-aktiven Stellen erstrecken sich durch SCRs 2–4, wie berichtet von Coyne, et al., J. Immunology 149: 2906–2913 (1992).
Hourcade, D., et al., J. Exp. Med. 168: 1255–1270 (1988) beschrieben einen cDNA-Klon, bezeichnet als CR1–4, der die ersten acht und einhalb aminoterminalen SCRs von CR1 kodiert. Diese cDNA wurde in COS-Zellen transfiziert, was zu der Synthese einer sezernierten abgekürzten Form von CR1 mit einem Molekulargewicht von 78 kd führt (Krych, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4353–4357 (1991). Diese abgekürzte Form des Proteins, wie hier unten dargestellt, bindet hauptsächlich C4b. Diese verkürzte Form wurde nun als eine C4b-Cofaktoraktivität enthaltend bestimmt, wie hier beschrieben.
Die multiplen Bindungsstellen von CR1 können in ihren Wechselwirkungen mit C3b-haltigen Zielen kooperieren. In vitro bindet CR1 C3b-C3b-Dimere sehr viel fester als C3b-Monomere, da die Bindung an Dimere simultan an zwei Stellen in demselben CR1-Molekül auftreten kann, wie berichtet von Wong und Farrell, (J. Immunol. (1991) 146: 656; Ross und Medof Adv. Immunol. (1985) 37: 217). Die Deletion von einer der beiden primären C3b-Bindungsstellen kann die Bindung von CR1 an C3b-C3b um den Faktor zehn reduzieren, wie berichtet von Wong und Farrell, J. Immunol. (1991) 146: 656. Es ist auch wahrscheinlich, dass die primäre C4b-Bindungsstelle ebenfalls mit den primären C3b-Bindungsstellen in Wechselwirkung mit Zielen kooperiert, die sowohl C3b als auch C4b enthalten. Diese Wirkungen haben in vivo wichtige Konsequenzen: CR1 hat eine höhere Affinität für Ziele, die dicht mit C3b beschichtet sind und für Ziele, die dicht mit C3b plus C4b beschichtet sind.
Die C5-Convertasen, die bei der Stimulierung der Entzündung und der Lyse von einigen Zielzellen wichtig sind, bestehen aus multiplen CR1-Liganden: die klassische C5-Konvertase enthält C3b und C4b (C4bC3bC2a), während die alternative C5-Konvertase zwei C3b-Proteine enthält (C3bC3bBb). Die Inaktivierung der C5-Konvertasen durch CR1 kann auch eine Kooperation zwischen mehr als einer CR1-Bindungsstelle involvieren. Wong und Farrell. J. Immunol. (1991) 146: 656 zeigten, dass mehr als eine CR1-C3b-Bindungsstelle für die effektive Inhibition der C3- und C5-Konvertasen des alternativen Wegs essenziell sein kann.
Die durch das RCA-Gencluster kodierten Proteine können rekombinant hergestellt und für die Diagnose und Therapie der Regulation des Komplementsystems verwendet werden. Die Probleme der Transplantation von Fremdtransplantaten werden von Platt, J. L., et al., in Immunology Today (1990) 11: 450–457 überblicksweise betrachtet. Es haben sich Beweise angesammelt, dass die hyperakute Abstoßung vom Direkttyp von discordanten Fremdtransplantaten durch die Komplementaktivität des Empfängers aufgelöst wird. Transgene Tiere, die humane Komplementregulatoren (wie z. B. DAF oder MCP) auf Zelloberflächen exprimieren, könnten eine große Quelle von Organen sein, die von der hyperakuten Abstoßung bei menschlichen Empfängern geschützt wären. Ein löslicher Komplement-Inhibitor könnte ebenfalls eine Rolle beim Schutz von Fremdtransplantaten vor der komplementvermittelten Abstoßung spielen.
Die Fähigkeit einer rekombinanten löslichen Form von CR1, die Entzündung bei der umgekehrten passiven Arthus-Reaktion bei Ratten zu inhibieren, wurde von Yeh, C. G., et al., J. Immunol (1991) 146: 250–256 beschrieben. Dieses lösliche CR1 wurde von den (CHO)-Zellen (aus Ovarien des chinesischen Hamsters) erhalten, die das CR1-genetische Konstrukt exprimieren, das mutiert wurde, um die Transmembran- und Cytoplasmadomänen zu entfernen. Die Fähigkeit eines ähnlichen löslichen CR1, rekombinant in CHO-Zellen erzeugt zur Inhibition einer Myocardentzündung postischämisch und Necrose bei Ratten wurde von Weissmann, H. F., et al., Science (1990) 249: 146–151 berichtet.
Es wurden ebenfalls Proteine gezeigt, die mit RCA-Proteinen verwandt sind, und die von Viren erzeugt werden, die vermutlich einen Mechanismus darstellen, wodurch eine Infektion durch das Virus erleichtert werden kann, wie berichtet von Kotwaal, J., et al., Nature (1988) 335: 176–178; McNearney, T. A., J Exp Med (1987) 166: 1525–1535.
EP-A-0 512 733 offenbart Komplement-Aktivierungs-Proteinanaloge.
Die vollständige Inhibition des Komplementsystems auf Langzeitbasis ist bei den meisten Individuen vermutlich nicht wünschenswert. In einigen Fällen von Autoimmunerkrankungen kann die Inhibition des klassischen Wegs allein ausreichen. Im Fall von Fremdtransplantaten kann jedoch eine stringente Inhibition beider Wege wichtig sein. Eine ähnliche Stringenz kann für andere Anwendungen notwendig sein. Dementsprechend würden alternative Modulatoren des Komplementsystems mit regulierbaren Bindungsaktivitäten wünschenswert sein.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, modifizierte Komplementregulatoren bereitzustellen, die in löslicher Form für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen oder für die Reduktion der Fähigkeit eines Individuums zur Abstoßung von Fremdmaterialien verabreicht werden können.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, modifizierte Komplementregulatoren bereitzustellen, die kürzer sind und die einfacher und ökonomischer erzeugt werden können als die komplexeren, natürlich auftretenden Proteine.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Komplementregulatoren bereitzustellen, die die Aktivitäten unterschiedlicher Komplementregulatoren kombinieren, um eine erhöhte Fähigkeit zur Inhibition der Komplementproteine bereitzustellen, in spezifischer Weise und in systemischer Weise, sowohl auf dem klassischen als auch auf dem alternativen Weg.
Zusammenfassung der Erfindung
Analoge von RCA-kodierten Proteinen, die in voller Länge oder in abgekürzter Form dieser regulatorischen Proteine modifiziert sind, werden beschrieben und es wird demonstriert, dass sie Komplement inhibieren. Diese Analoge beinhalten RCA-Proteine mit ortsspezifischen Mutationen, RCA-Proteinhybride, die ein oder mehr SCRs von mehr als einem RCA-Protein enthalten, Modifikationen von RCA-Rekombinanten, worin SCRs in unterschiedlichen Reihenfolgen angeordnet sind und abgekürzte Versionen von RCA-Proteinen, enthaltend so wenig wie drei SCRs. Die modifizierten Proteine erhalten sich die komplementinhibitorische Aktivität, die im Hinblick auf ihre Spezifität, Affinität oder den Mechanismus verändert werden kann.
Die modifizierten Proteine werden durch die ΔSCR11, subst1-Mutation von CR1–4(8, 9) demonstriert, die nur drei komplette SCRs (Aminosäuren 1–194, SCR 1–3) trägt und eine C3b-Aktivität aufweist; die 1ar,5r,8br-Mutation von CR1–4(8,9), die verstärkte C3b- und C4b-Aktivitäten aufweist; eine drei SCR-Form, bestehend aus den ersten 194 Aminosäuren von 1ar,5r,8br, Mutanten 10, 10, 10,11, 11c, 8a, 6b, 14 und 15, die Mutationen von CR1–4 mit erhöhten Aktivitäten sind und CR1–4 stop7, CR1–4(8, 9) stop7 und 1ar, 5r, 8br stop7, die alle kürzere (7 SCR) Formen ihrer jeweiligen Elternproteine (CR1–4, CR1–4(8, 9) bzw. 1ar, 5r, 8br) sind.
Diese Analoge sind für die Kontrolle des Komplementsystems nützlich und sie können bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, der Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten, bei der Diagnose und der Reduktion von Gewebsschaden, assoziiert mit Myocardinfarkten und cerebralen vaskulären Unfällen sein. Sie können auch eine Rolle bei der Diagnose von Zuständen spielen, die mit der Komplementaktivierung und einer Immunkomplexbildung assoziiert sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung des klassischen und alternativen Komplementwegs.
Die 2A und 2B zeigen schematisch die Strukturen und Beziehungen von RCA-kodierten Proteinen.
2A ist das kurze Consensus-Repeat, dargestellt mit hoch konservierten Resten.
2B ist eine schematische Darstellung der SCR-Organisation der RCA-Proteine: CR1, CR2, DAF, MCP, C4-Bindungsprotein und Faktor H.
Die 3A und 3B vergleichen die Aminosäuresequenzen von SCR-1 und SCR-8 (SEQ ID NO: 1 bzw. 2) (3A) und SCR-2 und SCR-9 (SEQ ID NO: 3 bzw. 4) (3B) des Gesamtlängen-CR1. Die Aminosäuresequenzen von SCR 15–16 sind identisch zu denjenigen von SCR 8–9 mit der Ausnahme eines T an Position 110. Die Aufzählung ist konsistent mit der von Hourcade et al., J. Exp. Med. (1988) 168: 1255–1270, wobei die erste Aminosäure (Q) des reifen Rezeptors als Aminosäure 1 bezeichnet wird. Die korrespondierende Position in CR1 SCR-8 wird ähnlich bezeichnet.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Hier beschrieben ist eine Familie von RCA-Proteinanalogen, die verwendet werden können, um das Komplementsystem zu modulieren. Die Analoge können verwendet werden, um die Bindungsspezifität der Mitglieder dieser Proteinfamilie sowohl in membrangebundenen als auch löslichen Formen zu verändern.
Wie hier verwendet, betrifft "RCA-Proteine" Proteine, die durch das Gencluster im genetischen Bereich lg32 kodiert werden, der sechs bekannte Proteine kodiert, die bei der Komplementregulation effektiv sind: Faktor H, C4bp, CR1, CR2, DAF und MCP. Zusätzlich wurden anscheinende Kodierungsregionen, die ähnlich zu der aminoterminalen Kodierungsregion des CR1-Gens und des MCP-Gens sind, in diesem Cluster lokalisiert, obwohl unklar ist, ob diese Sequenzen exprimiert werden (Hourcade, D., et al., J. Biol. Chem. 26574–980 (1990); Hourcade, D., et al., Genomics 12: 289–300 (1992)). Die Bezeichnung "RCA-Proteine" betrifft auch eine Gruppe von Proteinen, die kurze Consensus-Repeats (SCRs) enthalten, die homolog zu SCR in CR1, CR2, MCP, DAF, Faktor H und C4bp sind.
Die hier beschriebenen modifizierten Proteine werden allgemein als "modifizierte RCA-Proteine" bezeichnet. Diese beinhalten verkürzte, hybride und rekombinante Formen der RCA-Proteine. "Verkürzte" Proteine sind kürzere Versionen der RCA-Proteine, die im typischen Fall so modifiziert sind, dass die C-terminalen Bereiche entfernt sind, die eine Membranbindung oder Sekretion bewirken und die manchmal weiter durch Deletion von ein oder mehr SCRs modifiziert sind. "Hybrid"-Proteine sind RCA-Proteine, die aus Bereichen bestehen, d. h. den SCRs, von einem RCA-Protein, kombiniert mit SCRs und ein oder mehr anderen RCA-Proteinen. "Rekombinante" Formen sind diejenigen, worin die SCRs eines RCA-Proteins in neuer Reihenfolge angeordnet sind. Ebenfalls beinhaltet sind Proteine mit ortsspezifischen Substitutionen und Deletionen von ein oder mehr Aminosäuren. "Modifizierte RCA-Proteine" beinhalten Proteine, die sich aus Kombinationen dieser Veränderungen ergeben.
Die kurze Consensus-Repeat-Sequenz ist in 2A dargestellt. Wie in 2B schematisch dargestellt, enthält CR1 30 SCRs, gefolgt von Transmembran- und Cytoplasmaregionen. CR2 enthält 16 SCR, gefolgt von Transmembran- und Cytoplasmaregionen. DAF und MCP enthalten jeweils vier SCR, gefolgt von Glycolipidankerregionen. Das C4-Bindungsprotein ist ein komplexeres Protein mit sieben α-Untereinheiten und einer β-Untereinheit. Die α-Untereinheit besteht aus acht SCR und die β-Untereinheit besteht aus drei SCR. Faktor H besteht aus zwanzig SCR.
Bei einigen Ausführungsformen werden Modifikationen unter Verwendung von korrespondierenden SCRs des Proteins an Stellen für eine Veränderung durchgeführt. Unter "korrespondierendem SCR" wird das besonders hoch homologe SCR verstanden, bewertet durch die Aminosäuresequenzen des Proteins. Die Exonstruktur kann in einigen Fällen diese Zuordnung erleichtern. Wie oben festgehalten, korrespondieren die SCRs 1–3 von CR1 zur SCRs 2–4 von DAF. Die SCRs 1–3 von Faktor H, CR1, C4bp und MCP sind korrespondierende Sequenzen unter diesen Proteinen. CR1 ist in Reihen langer homologer Repeats (LHRS) organisiert, enthaltend 7 SCRs, so dass CR1 SCRs 1–7 zu CR1 SCRs 8–14; 15–21 und 22–28 korrespondieren. CR2 ist in Reihen langer homologer Repeats von 4 SCRs in der Länge organisiert. SCRs 1–2 von CR1 korrespondieren zu SCRs 3–4, SCRs 7–8, SCRs 11–12 und SCRs 15–16 von CR2.
Diese Proteine sind durch die C4b-Bindungsaktivität, C3b-Bindungsaktivität, C4b-Cofaktoraktivität und C3b-Cofaktoraktivität gekennzeichnet. Allgemein werden 2 bis 3 SCRs für jede Aktivität benötigt. Aktivitäten, die biologisch wichtig sind, beinhalten eine Zerfallsbeschleunigung oder Dissoziation, C3b-Cofaktoraktivität und C4b-Cofaktoraktivität. Die Cofaktoraktivität benötigt eine Bindung, jedoch kann die Bindung allein für die Cofaktoraktivität nicht ausreichen.
Es wird allgemein akzeptiert, dass die CR1 C4b-Bindungs- und Cofaktoraktivitäten die SCRs 1, 2 und 3, 8, 9 und 10 oder 15, 16 und 17 benötigen, die korrespondierende Regionen des Proteins sind. Die C3b-Bindungs- und Cofaktoraktivität benötigt die SCRs 8, 9 und 10 oder 15, 16 und 17, die korrespondierende Regionen des Proteins sind. Die MCP C4b-Bindungs- und Cofaktoraktivität benötigt die SCRs 1, 2, 3 und 4. Die MCP C3b-Bindung benötigt SCRs 3 und 4; die Cofaktoraktivität benötigt SCRs 2, 3 und 4. Die C4bp C4b-Bindungs- und Cofaktoraktivität benötigt die SCRs 1, 2 und 3.
Die DAF-Zerfallsbeschleunigungs-Aktivität benötigt SCRs 2, 3 und 4. Die Faktor H C3b-Bindungsaktivität wird durch die ersten fünf SCRs vermittelt.
Basierend auf diesen Entdeckungen ist es möglich, einen wirksameren löslichen Komplementinhibitor durch Modifikation korrespondierender Regionen zur Erhöhung der Affinität für C4b und C3b zu entwerfen oder lösliche Komplementinhibitoren zu entwerfen, die spezifisch einen Teil des Komplementsystems inhibieren. Diese Modifikationen können in Form spezifischer Substitutionen von Aminosäuren vorliegen, die die C3b- oder C4b-Bindung innerhalb korrespondierender SCRs von CR1 oder anderen RCA-Proteinen verändern oder eine Substitution von SCRs von einem Protein in ein anderes.
Substitution von SCR-Regionen von einem regulatorischen Protein in ein zweites regulatorisches Protein
Die Identifizierung der Aminosäuresequenzen, die für die Bindung an C4b und C3b und die C4b- und C3b-Cofaktoraktivität essenziell (oder refraktorisch) sind, ermöglicht die Transposition ähnlicher Sequenzen in korrespondierende Regionen desselben Proteins oder korrespondierende Regionen von anderen Familienmitgliedern oder eine Veränderung von Sequenzen, die C3b und C4b binden, um ihre Affinitäten zu verändern. Korrespondierende Regionen wurden durch ihren Grad der Aminosäuresequenz-Homologie identifiziert.
Im Fall von CR1 sind vier korrespondierende interessante Regionen die SCRs 1–3, SCRs 8–10, SCRs 15–17 und SCRs 22–24. Die mit 2 bis 4 markierten SCR-Bereiche in 2B für DAF korrespondieren zu den mit 1–3, 8–10, 15–17 und 22–24 markierten Bereichen für CR1 in 2B. Eine Substitution von Bereichen von DAF mit homologen CR1-Sequenzen stellt Formen von DAF mit einer Cofaktoraktivität und/oder Bindungsaktivität bereit, wie sie von CR1 ausgeübt wird. Auf ähnliche Weise stellen Substitutionen von Bereichen von MCP mit homologen Sequenzen Formen von MCP bereit, die eine erhöhte Bindungsaffinität und Cofaktoraktivität und/oder erhöhte Dissoziationsaktivität aufweisen.
Spezifische Aminosäuresubstitutionen
Addition von Bindungsstellen
Spezifische Aminosäuren werden für eine Substitution ausgewählt, basierend auf Studien, die ihre Rolle bei der Komplementregulierung in spezifischen aktiven Stellen erhellen. Die Substitution kann verwendet werden, um die Aktivität zusätzlicher RCA-aktiver Stellen in denselben oder anderen Proteinen zu verändern. Auf diese Weise können Bindungs- und Cofaktorstellen zu den SCRs zugefügt werden, die normalerweise nicht direkt zur Bindungskapazität beitragen.
Die üblichen Einbuchstabenabkürzungen für Aminosäuren werden hier verwendet.
Zum Beispiel kann die C3b- und C4b-Bindungs- und Cofaktorsequenz in CR1, N-A-A-H-W-S-T-K-P-P-I-C-Q (Aminosäuren 49–61 von SEQ ID NO: 4) zu korrespondierenden Stellungen transferiert werden oder zu Stellungen, bezogen auf konservierte Aminosäuren in alternativen SCRs, um eine C3b-Bindung zu verleihen. Demgegenüber kann die homologe Sequenz in SCR-2 von CR1, d. h. D-T-V-I-W-D-N-E-T-P-I-C-D (Aminosäuren 49–61 von SEQ ID NO: 3) durch Substitution auf andere Stellungen in den C3b-Bindungs-SCRs übertragen werden, um die C3b-Bindung und C4b-Bindung und Cofaktoraktivität zu erniedrigen. Die C4b-Bindungsregionen werden als mit drei unterschiedlichen kritischen Stellungen in SCR-1 und SCR-2 von CR1 in der Nähe der Aminosäuren 35, 64–65 und 92–94 assoziiert dargestellt. Veränderungen der Aminosäuresequenzen der korrespondierenden SCRs in CR1 oder in zusätzlichen RCA-Familienmitgliedern oder ihren verkürzten, Hybrid- oder rekombinanten Formen in diesen Positionen verändern die C4b-Bindungs- und Cofaktoraktivitäten und verändern in mindestens einem Fall die C3b-Bindungs- und Cofaktoraktivitäten.
Substitution ähnlicher Aminosäuren
Strukturell ähnliche Aminosäuren können in solchen Übertragungen für einige der spezifizierten Aminosäuren substituiert werden. Strukturell ähnliche Aminosäuren beinhalten: (I, L, V); (F, Y); (K, R); (Q, N); (D, E) und (G, A).
Deletion von Aminosäuren
Es kann auch vorteilhaft sein, Aminosäuren von spezifischen aktiven Stellen zu deletieren, um die komplementregulatorische Aktivität zu verändern oder zu verstärken.
Konstruktion verkürzter Formen
Es wird in einigen Fällen vorteilhaft sein, eine spezifische Aktivität durch Deletion eines Bereichs zu deletieren, von dem bekannt ist, dass er eine bestimmte Aktivität aufweist. Es kann ebenfalls wünschenswert sein, die Region des Proteins zu deletieren, die das natürlich auftretende Protein an der Zelloberfläche verankert, z. B. die Transmembran- und cytoplasmatischen Bereiche oder den Glycolipid-Ankerbereich.
Modifikationen, die die Cofaktoraktivität verstärken
Im Allgemeinen kann entweder die C3b- oder C4b-Cofaktoraktivität durch Substitutionen erhöht werden, die die Bindungsaktivität des anderen Faktors erhöhen, d. h. zur Erhöhung der C4b-Cofaktoraktivität werden Aminosäuren in das modifizierte Protein substituiert, die die C3b-Bindung erhöhen und umgekehrt. Dies wird in den Beispielen demonstriert, spezifisch durch die in Tabelle 2 dargestellten Mutanten. Ein Beispiel einer Einzelaminosäure-Substitution, die sowohl die C4b-Cofaktoraktivität als auch die C3b-Cofaktoraktivität erhöht, ist der CR1-Mutant 6b: die Veränderung des G an 79 zu D erhöht die C4b-Cofaktor- wie auch C3b-Bindungs- und Cofaktoraktivität.
Herstellung der Analoga
Die hier beschriebenen modifizierten Proteine werden günstigerweise unter Verwendung rekombinanter Techniken hergestellt, obwohl sie in einigen Fällen durch enzymatische Spaltung hergestellt werden können, z. B. um verkürzte oder lösliche Formen der natürlich auftretenden Proteine zu erhalten. Die Gene, die die verschiedenen Mitglieder der RCA-Proteinfamilie kodieren, sind von bekannter Sequenz und veröffentlicht.
cDNA, die CR1 kodiert, wurde von Klickstein, L. B., et al., J. Exp. Med. (1987) 165: 1095, Klickstein, L. B., et al., J. Exp. Med. (1988) 168: 1699; Hourcade, D., et al., J. Exp. Med. (1988) 168: 1255 beschrieben, deren Lehren hier durch Inbezugnahme inkorporiert sind.
Die cDNA, die CR2 kodiert, wurde von Moore, M. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 9194 und von Weiss, J. J., et al., J. Exp. Med. (1988) 167: 1047 beschrieben, deren Lehren hier durch Bezugnahme inkorporiert sind.
Die cDNA, die DAF kodiert, wurde von Caras, I. W., et al., Nature (1987) 325: 545 und von Medof, M. E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 2007 beschrieben, deren Lehren hier durch Inbezugnahme inkorporiert sind.
Die cDNA, die MCP kodiert, wurde von Lublin, D. M., et al., J. Exp. Med. (1988) 168: 181, beschrieben, deren Lehren hier durch Inbezugnahme inkorporiert sind.
Die cDNA, die C4bp α-Kette kodiert, wurde von Chung, L. P, et al., Biochem. J. (1985) 230: 133 und die cDNA, die die C4bp β-Kette kodiert, wurde von Hillarp, A., und Dahlback, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 1183 beschrieben, deren Lehren hier durch Inbezugnahme inkorporiert sind.
Die cDNA, die Faktor H kodiert, wurde von Ripoche, J., et al., Biochem. J. (1988) 249: 593 beschrieben, dessen Lehren hier durch Inbezugnahme inkorporiert sind.
Da die cDNAs, die diese Proteine kodieren, bekannt sind und da die Aminosäuresequenzen abgeleitet wurden, wurde ein Vergleich der korrespondierenden Regionen der verschiedenen Proteine der Mitglieder der Familien möglich. Zusätzlich macht es die Erhältlichkeit der cDNA-Sequenz möglich, genetische Konstrukte herzustellen, die verkürzte Formen kodieren sowie andere modifizierte Formen der Proteine unter Verwendung von standardisierten, ortsgerichteten Mutageneseverfahren, wie z. B. den von Kunkel, T. A., et al., Methods Enzymol. (1987) 154: 367–382 beschriebenen.
Dementsprechend benötigt der erste Schritt der Herstellung der Analoge die Identifizierung der korrespondierenden Region des Zielproteins durch Sequenzhomologie und ortsgerichtete Mutagenese in dieser Region des Gens, um die C4b- oder C3b-Bindungseigenschaften zu verändern.
Nachdem das Gen, das das Analog kodiert, hergestellt wurde, wurde das modifizierte Gen unter Verwendung von Standardrekombinanten Verfahren hergestellt. Die Gensequenz wird in einen geeigneten Expressionsvektor unter der Kontrolle von Sequenzen ligiert, von denen bekannt ist, dass sie für den gewünschten Wirt geeignet sind. Die Produktion rekombinanter Proteine in mikrobiellen Systemen, wie z. B. E. coli, B. subtilis, verschiedenen Stämmen von Hefen und anderen Pilzen, wie z. B. Aspergillus, ist wohlbekannt. Es kann vorteilhaft sein, die gewünschten Analoge in Zellen höherer Organismen ebenfalls herzustellen, wie z. B. dem Standard BPV/C127-System, dem Baculovirus/Insektenzellsystem, CHO-Zellen, COS-Zellen und anderen Säugerzellen oder in transgenen Tieren. Standard-Expressionssysteme in verschiedenen Zellinien sind wohlbekannt und auf dem Gebiet Standard.
Transgene Tiere können für verschiedene Arten konstruiert werden. Das Gen wird unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors gestellt, z. B. dem Metallothioninpromotor oder einen gewebsspezifischen Promotor und das Gen wird in einen Embryo mikroinjiziert, der dann in eine Ersatzmutter implantiert wird. Die Erzeugung in transgenen Tieren ist im Kontext der Herstellung von Transplantaten zur Verwendung in anderen Arten wichtig.
Konstruktion transgener Tiere
Tierquellen
Tiere, die für transgene Experimente geeignet sind, können von den üblichen kommerziellen Quellen erhalten werden. Diese beinhalten Tiere wie z. B. Mäuse und Ratten für die Überprüfung von genetischen Manipulationsverfahren wie auch größere Tiere wie z. B. Schweine, Kühe, Schafe, Ziegen und andere Tiere, die unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, genetisch manipuliert wurden. Diese Techniken werden unten kurz zusammengefasst, basierend im wesentlichen auf der Manipulation von Mäusen und Ratten.
Mikroinjektionsverfahren
Die Verfahren für die Manipulation des Embryos und für die Mikroinjektion von DNA werden im Detail von Hogan et al. Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986) beschrieben, dessen Lehren hier inkorporiert sind. Diese Techniken sind auf Embryos von anderen Tierarten ebenfalls anwendbar und obwohl die Erfolgsrate niedriger liegt, wird angenommen, dass es sich für den Fachmann um eine Routinepraxis handelt.
Transgene Tiere
Weibliche Tiere werden zur Superovulation induziert, unter Verwendung von Verfahrensweisen, die von den Standardverfahren angepasst sind, die für Mäuse verwendet werden, d. h. durch Injektion von schwangerem Stuten-Serum Gonadotropin (PMSG; Sigma), gefolgt 48 Stunden später von der Injektion von menschlichem Chorion-Gonadotropin (hCG; Sigma). Die Weibchen werden mit den Männchen direkt nach hCG-Injektion zusammengeführt. Ungefähr 1 Tag nach hCG werden die begatteten Weibchen geopfert und die Embryos werden aus den exzisierten Eileitern gewonnen und in Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung mit 0,5% bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma) platziert. Umgebende Cumuluszellen werden mit Hyaluronidase (1 mg/ml) entfernt. Pronukleäre Embryos werden dann gewaschen und in Earle's balancierte Salzlösung, enthaltend 0,5% BSA (EBSS) in einem 37,5°C Inkubator mit angefeuchteter Atmosphäre bei 5% CO₂, 95% Luft bis zum Zeitpunkt der Injektion platziert.
Willkürlich im Zyklus befindliche erwachsene Weibchen werden mit vasectomisierten Männchen zusammengeführt, um eine falsche Schwangerschaft zu induzieren, und zwar zum selben Zeitpunkt wie die Donorweibchen. Zur Zeit des Embryotransfers werden die Empfängerweibchen anästhesiert und die Eileiter werden durch Inzision durch die Körperwand direkt über dem Eileiter exponiert. Die Bursa ovariae wird eröffnet und die Embryos, die übertragen werden sollen, werden in das Infundibulum inseriert. Nach dem Transfer wird die Inzision durch Vernähen geschlossen.
Embryonische Stamm- (ES) Zellverfahren
Einführung von cDNA in ES-Zellen
Verfahren für die Kultivierung von ES-Zellen und die darauffolgende Produktion transgener Tiere, die Einführung von DNA in ES-Zellen durch eine Vielzahl von Verfahren wie z. B. Elektroporation, Calciumphosphat/DNA-Präzipitation und direkte Injektion sind im Detail in Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, Herausgeber E. J. Robertson, (IRL Press 1987) beschrieben, dessen Lehre hier inkorporiert ist. Die Auswahl des gewünschten Klons von transgenhaltigen ES-Zellen wird durch eins von mehreren Mitteln bewirkt. In Fällen, die eine sequenzspezifische Genintegration involvieren, wird eine Nukleinsäuresequenz für die Rekombination mit dem interessanten Gen oder die Sequenzen zur Kontrolle zu dessen Expression mit einem Gen copräzipitiert, das einen Marker kodiert, wie z. B. Neomycinresistenz. Die Transfektion wird durch eins von mehreren Verfahren durchgeführt, beschrieben im Detail bei Lovell-Badge, in Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, Herausgeber E. J. Robertson, (IRL Press 1987) oder bei Potter et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161 (1984). Die Calciumphosphat/DNA-Präzipitation, direkte Injektion und Elektroporation sind die bevorzugten Verfahren. Bei diesen Verfahren wird eine Anzahl von ES-Zellen, z. B. 0,5 × 10⁶, in Gewebskulturschalen ausplattiert und mit einer Mischung der linearisierten Nukleinsäuresequenz und 1 mg pSV2neo DNA transfiziert (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1: 327–341 (1982)), präzipitiert in Gegenwart von 50 mg Lipofectin in einem Endvolumen von 100 μl. Die Zellen werden mit Selektionsmedium gefüttert, enthaltend 10% fötales Rinderserum in DMEM, supplementiert mit einem Antibiotikum, wie z. B. G418 (zwischen 200 und 500 μg/ml). Kolonien von Zellen, die gegenüber G418 resistent sind, werden unter Verwendung von Klonierungsringen isoliert und expandiert. Die DNA wird von arzneimittelresistenten Klonen extrahiert und Southern-Blot-Experimente unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz als Sonde werden verwendet, um diejenigen Klone zu identifizieren, die die gewünschten Nukleinsäuresequenzen tragen. Bei einigen Experimenten werden PCR-Verfahren zur Identifikation der interessanten Klone verwendet.
DNA-Moleküle, die in ES-Zellen eingeführt wurden, können auch in das Chromosom unter Verwendung des Verfahrens der homologen Rekombination, beschrieben von Capecchi, (1989), integriert werden. Direkte Injektion führt zu einer hohen Effizienz der Integration. Die gewünschten Klone werden durch PCR von DNA identifiziert, hergestellt aus Pools von injizierten ES-Zellen. Positive Zellen in den Pools werden durch PCR identifiziert, folgend auf ein Zellklonieren (Zimmer und Gruss, Nature, 338, 150–153 (1989)). Die DNA-Einführung durch Elektroporation ist weniger effizient und. benötigt einen Selektionsschritt. Verfahren für die positive Selektion des Rekombinationsereignisses (d. h. Neoresistenz) und duale positiv-negative Selektion (d. h. Neoresistenz und Ganciclovirresistenz) und die darauffolgende Identifikation der gewünschten Klone durch PCR wurden von Joyner et al., Nature 338, 153–156 (1989) und Capecchi, (1989) beschrieben, deren Lehren hier inkorporiert sind.
Embryogewinnung und ES-Zellinjektion
Weibchen im natürlichen Zyklus oder solche, die superovulieren, gepaart mit Männchen, werden verwendet, um Embryos für die Injektion von ES-Zellen zu ernten. Embryos des geeigneten Alters werden nach einer erfolgreichen Paarung wiedergewonnen. Die Embryos werden von den Uterinhörnern der gepaarten Weibchen ausgespült und in Dulbecco's modifiziertem essenziellem Medium plus 10% Kälberserum für die Injektion mit ES-Zellen platziert. Ungefähr 10 bis 20 ES-Zellen werden in Blastozysten unter Verwendung einer Glas-Mikronadel mit einem inneren Durchmesser von ungefähr 20 μm injiziert.
Transfer von Embryos zu pseudoschwangeren Weibchen
Willkürlich sich im Zyklus befindende erwachsene Weibchen werden mit vasectomisierten Männchen gepaart. Empfängerweibchen werden so gepaart, dass sie sich 2,5 bis 3,5 Tage nach der Paarung (für Mäuse oder später für größere Tiere) befinden werden, wenn sie für die Implantation mit Blastozysten, die ES-Zellen enthalten, benötigt werden. Zum Zeitpunkt des Embryotransfers werden die Empfängerweibchen anästhesiert. Die Ovarien werden durch einen Einschnitt in die Körperwand direkt über dem Eileiter exponiert und Ovar und Uterus werden externalisiert. Ein Loch wird in das Uterus-Horn mit einer Nadel gemacht, durch die die Blastozysten transferiert werden. Nach dem Transfer werden Ovar und Uterus in den Körper zurückgeschoben und der Einschnitt wird durch Vernähen geschlossen. Dieses Verfahren wird auf der gegenüberliegenden Seite wiederholt, wenn zusätzliche Transfers gemacht werden sollen.
Identifikation von transgenen Tieren
Proben (1 bis 2 cm der Mausschwänze) werden von jungen Tieren entfernt. Für größere Tiere können Blut oder andere Gewebe verwendet werden. Um auf Chimären in den homologen Rekombinationsexperimenten zu testen, d. h. um nach einem Beitrag der Ziel-ES-Zellen zu den Tieren zu suchen, wurde bei Mäusen eine Fellfarbe verwendet, obwohl bei größeren Tieren Blut untersucht werden könnte. DNA wird hergestellt und sowohl durch Southern blot als auch PCR analysiert, um transgene Gründer- (F₀) Tiere und ihre Nachkommenschaft (F₁ und F₂) nachzuweisen.
Nachdem die transgenen Tiere identifiziert wurden, werden Linien durch konventionelles Züchten etabliert und als Donoren für eine Gewebsentfernung und Implantation unter Verwendung von Standardverfahren für Implantation in Menschen verwendet.
Reinigung von Analogen
Die in Kultur oder in Tieren rekombinant erzeugten Analogen können von der Zellkultur unter Verwendung von Standard-Reinigungstechniken gereinigt werden, wie z. B. Chromatographie, z. B. Immunaffinität oder Ionenaustauschchromatographie und Elektrophorese, allgemein unter Verwendung derelben Verfahren, die zur Verwendung bei der Reinigung des natürlich auftretenden Materials veröffentlicht wurden.
Während die rekombinante Produktion der Analoge das für die Herstellung der Proteine geeignetste und praktischste Verfahren ist, kann es auch wünschenswert sein, die Analoge unter Verwendung von Proteinsyntheseverfahren zu synthetisieren, wie z. B. der Standard-Festphasen-Peptidsynthese-Technologie. Dieser Ansatz kann insbesondere im Fall von verkürzten Formen der RCA-Proteinfamilie mit modifizierten Aminosäuresequenzen, insbesondere im Hinblick auf die Entdeckung geeignet sein, das Proteine, die so wenige wie drei SCRs enthalten, eine nützliche biologische Aktivität aufweisen.
Assaysysteme
Die Analoge werden im Hinblick auf die gewünschten biologischen Aktivitäten unter denjenigen getestet, die für die RCA-Familie charakteristisch sind und zwar unter Verwendung von in vitro oder in vivo Assays. In vitro Systeme wie die von Wong und Farrell (J. Immunol. (1991) 146: 656) beschriebenen, können verwendet werden, um die Wirkungen auf die Komplementwege zu messen. In vivo und allgemeine biologische Wirkungen können wie die von Weisman et al. (Science (1990) 249: 146); oder Yeh, et al. (J. Immunol. (1991) 146: 250) beschriebenen, bewertet werden, deren Lehren hier durch Inbezugnahme inkorporiert sind.
Bindungsassays
Affinitätschromatographiesäulen wurden wie von Krych, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4353–4357 beschrieben, hergestellt. Bindungsassays wurden unter Verwendung von 100 ml iC3-Sepharose (iC3-2) oder C4b-Sepharose (C4b-S) und 1,8 ml Medium, enthaltend das mutierte Protein, durchgeführt. Die Medien wurden auf gewünschte Konzentrationen von NaCl verdünnt. Nach 1 Stunde auf einem Rotator bei Raumtemperatur wurden die Proben zentrifugiert, die Medien entfernt und gebundenes Protein von der Sepharose unter Verwendung von 400 mM NaCl mit 1% NP-40 eluiert. Die eluierten Proteine wurden durch ELISA quantifiziert unter Verwendung zwei monoklonaler Anti-CR1-Antikörper, 3D9 und E11 (Hogg, et al., Eur. J. Immunol. 14, 236–240 (1984), O'Shea, et al., J. Immunol. 134, 2580–2587 (1985)). Da keiner der monoklonalen Antikörper mit CR1 SCRs-1, 2, 8 oder 9 reagiert, konnten alle Mutanten, abgeleitet von entweder CR1–4 oder CR1–4(8, 9) unter Verwendung dieses Assays quantifiziert werden. Für jedes mutierte Protein wurden mindestens drei Bindungsassays von unterschiedlichen Transfektionen durchgeführt.
Assay auf Cofaktoraktivität
C3 und C4 wurden gemäß dem Verfahren von Dykman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1698–1702 (1983), Dykman, et al., J. Exp. Med. 157, 2160–2165 (1983) gereinigt oder gekauft (Quidel, San Diego, CA), zu C3b und C4b umgewandelt und mit ¹²⁵I unter Verwendung von Iodogen beschichteten Kügelchen (Pierce) markiert. Cofaktorassays wurden unter Verwendung von 200 ng markiertem C3b oder C4b, 60 ng Faktor I (Quidel) und Medien mit mutierten Proteinen durchgeführt. Die Mengen der Cofaktorproteine wurden in einem ELISA-Assay, basierend auf einer Standardkurve von sezerniertem CR1 geschätzt (sCR1, Weisman, et al., Science 249, 146–151 (1990)). Um auf Spaltung von C3b zu testen, wurden Proben, enthaltend ungefähr 6 pg der mutierten Proteine eine Stunde bei 37°C inkubiert. Um auf Spaltung von C4b zu testen, wurden Proben für bis zu 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben durch Kochen in dem Puffer, enthaltend 2% SDS und 5% β-Mercaptoethanol in 0,25% TRIS, pH 6,8 reduziert und auf einem 4 bis 20% SDS-PAGE (Integrated Separations) oder auf einem 10%igen selbst hergestellten Gel elektrophoretisch behandelt. Nach dem Trocknen wurden die Gele bei –70°C unter Verwendung eines intensivierenden Screens autoradiographiert.
Herstellung und Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen
Die besonders potenten Analoge, basierend auf den in vitro Assays, werden in vivo getestet. Im allgemeinen werden die in vitro Assays als in hoher Korrelation mit der korrespondierenden in vivo Aktivität stehend akzeptiert. Die geeigneten Dosierungen werden durch Vergleich der in vitro Aktivität des natürlich auftretenden Proteins mit derjenigen des Analogs, Vergleich der in vitro Aktivität des natürlich auftretenden Proteins mit der in vivo Aktivität des natürlich auftretenden Proteins, dann Berechnung der erwarteten in vivo Aktivität des Analogs, Einstellung auf gemessene Unterschiede in der Halbwertszeit bestimmt.
Die Komplementaktivierung kann substantiellen Gewebs-Schaden in einer großen Vielzahl von Autoimmun/Immunkomplexvermittelten Symptomen ausmachen, wie z. B. systemischem Lupus erythematosus, rheumatoider Arthritis, hämolytischen Anämien, Myasthenia gravis und anderen. Die Inhibition des Komplementsystems ist in diesen Fällen eine gewünschte therapeutische Intervention. In einigen Fällen könnte eine spezifische Inhibition des klassischen Wegs allein durch RCA- Analoge vorzuziehen sein, da eine Langzeitinhibition des alternativen Wegs zu Nebenwirkungen führen könnte.
Die Inhibition der Komplementaktivierung könnte auch in den Fällen wünschenswert sein, die einen Gewebsschaden involvieren, der durch vaskuläre Verletzung zustande gekommen ist, wie z. B. Myocardinfarkt, cerebrale vaskuläre Unfälle oder akutes Schock-Lungensyndrom. In diesen Fallen kann das Komplementsystem zu der Zerstörung von teilweise geschädigtem Gewebe, wie bei der Reperfusionsverletzung, beitragen. Hoch stringente Inhibition von Komplement für relativ kurze Zeitspannen kann in diesen Fällen bevorzugt werden und lösliche RCA-Analoge, entwickelt für eine höhere Potenz, können sich als besonders nützlich erweisen.
Komplementinhibition kann sich auch bei der Verhinderung einer Fremdtransplantatabstoßung als wichtig erweisen. Organe, die von Tieren abstammen, die für menschliches DAF oder MCP transgen sind, können mindestens teilweise von einer komplementvermittelten hyperakuten Abstoßung durch Expression von transgenem DAF oder MCP auf den Zelloberflächen des Fremdtransplantats geschützt werden. Tiere, die für RCA-Analoge transgen sind, die für eine höhere Wirksamkeit entwickelt wurden, können erfolgreichere Fremdtransplantate bereitstellen. Lösliche RCA-Analoge können sich auch bei dem Schutz des Transplantats im Empfänger als nützlich erweisen.
Lösliche Analoge mit verminderter Aktivität können auch als kompetitive Inhibitoren der natürlichen Inhibitoren nützlich sein, in den Fällen, wo eine erhöhte komplementvermittelte Reaktion wünschenswert ist oder wo ein Individuum eine Störung hat, bei der die Immunität durch Überproduktion der natürlichen Inhibitoren kompromittiert ist.
Die Analoge können lokal oder systemisch in pharmazeutisch akzeptablen Trägern, wie z. B. Salzlösung, phosphatgepufferter Salzlösung oder in Formulierungen mit verzögerter Freisetzung, verabreicht werden. Das Dosierungsniveau und die Verabreichungsweise der Analoge hängt von der Natur des Analogs, der Natur der zu behandelnden Bedingung und der Anamnese des individuellen Patienten ab. Eine systemische Verabreichung wird allgemein notwendig sein, die durch Injektion oder transmucosale oder transdermale Zufuhr durchgeführt werden kann. Eine Verabreichung durch Injektion kann intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder subcutan geschehen. Formulierungen für die Injektion sind allgemein biokompatible Lösungen des aktiven Bestandteils wie z. B. Hank's Lösung oder Ringer-Lösung. Formulierungen für die transdermale oder transmucosale Verabreichung beinhalten allgemein penetrierende Mittel, wie z. B. Fusidinsäure oder Gallensalze in Kombination mit Detergentien oder Tensiden. Die Formulierungen können als Aerosole, Suppositorien oder Pflaster hergestellt werden. Eine orale Verabreichung wird allgemein nicht für protein- oder peptidaktive Bestandteile vorgezogen; wenn sie jedoch in geeigneter Weise formuliert ist, um von den Verdauungsenzymen geschützt zu sein, kann auch eine orale Verabreichung verwendet werden.
Geeignete Formulierungen für eine gewünschte Verabreichungsweise können in Remington's Pharmaceutical Sciences, letzte Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA gefunden werden. Die Dosierungsniveaus und präzisen Formulierungen werden durch Routine-Optimierungsverfahren erhalten, wie auf dem Gebiet allgemein bekannt.
Diagnostische Anwendungen
Die Analoge, die zur Bindung von C3b und/oder C4b fähig sind, sind als Diagnostika bei der Bewertung der Gegenwart, Abwesenheit oder Menge von C3b oder C4b oder C3b/C4b tragenden Immunkomplexen in biologischen Flüssigkeiten nützlich. Solche Assays bedienen sich der Fähigkeit des Analogs, spezifisch an C3b und/oder C4b zu binden und können in einer Vielzahl von Formaten, wie allgemein bekannt, angewendet werden. Formate für spezifische Bindungspartnerassays beinhalten direkte und kompetitive Formate, Sandwichassays und Agglutinationsassays. Eine Komplexbildung zwischen Mitgliedern des spezifischen Bindungspaars kann in Lösung oder auf einer festen Phase durchgeführt werden und kann unter Verwendung einer Vielzahl von Markierungstechniken nachgewiesen werden, einschließlich Fluoreszenz, Radioisotope, Chromophore und sichtbare Teilchen.
Typische Reagenzkits, die in den Assays nützlich sind, für C3b und/oder C4b und/oder C3b/C4b-tragende Immunkomplexe beinhalten die Analog-spezifische Bindung an den Analyten, optional gekoppelt an einen festen Träger und zusätzliche Markierungsreagenzien, die in dem Assay nützlich sind. Eins von vielen Formaten für den Assay kann z. B. die Behandlung der zu überprüfenden Probe mit einem festen Träger beinhalten, an den das Analog als spezifischer Bindungspartner gekoppelt ist, Waschen des Trägers, der mit der Probe behandelt wurde, von der angenommen wird, dass sie den Analyten enthält und dann Behandlung des gewaschenen Trägers mit Anti-C3b- oder Anti-C4b-Antikörper, markiert mit einem Enzym wie z. B. Meerrettich-Peroxidase. Die Gegenwart des markierten Enzyms auf einem Träger wird dann durch Addition einer Substratlösung nachgewiesen, was zu der Entwicklung einer Farbe in Gegenwart des Enzyms führt.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die folgenden nicht begrenzenden Beispiele verstanden werden.
Beispiel 1
Bindungsspezifität von verkürztem CR1
Die cDNA, die die ersten 543 Aminosäuren von reifem CR1 (SCR 1–8 und 1/2 von SCR-9) kodiert, wurde in COS-Zellen transfiziert, um ein sezerniertes Protein zu erhalten, das als CR1–4 bezeichnet wurde.
Zwei monoklonale Maus-anti-CR1-Antikörper wurden verwendet, um die Immunreaktivität von CR1–4 zu bestimmen und als Verfahren, um dieses Protein zu überprüfen. Antikörper E11 (Hogg, N., et al., Eur. J. Immunol. (1984) 14: 236–243) und 3D9 (O'Shea, J. J., et al., J. Immunol. (1985) 134: 2580–2587) erkannten CR1 und banden an das rekombinante CR1–4.
Die Bindung an C4b oder C3b wurde unter Verwendung von entweder C4b oder iC3 (C3, enthaltend aufgebrochene Thioesterbindungen analog in Reaktivität und Funktion zu C3b) banden an einen Sepharose-^TM-Träger, wie beschrieben von Dykman, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 1698–1702 und Cole, J. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 859–863. Die Bindung an diese festen trägergebundenen Substrate wurde durch Überprüfung mit einem ELISA für CR1 verifiziert.
Der C4b derivatisierte Träger war in der Lage, CR1–4 zu binden. Besonders effiziente Bindung trat zwischen 12,5 und 25 mM Salz auf.
Löslich gemachtes C4b inhibierte die Bindung des CR1–4-Proteins an den C4b-derivatisierten Träger, aber lösliches iC3 inhibierte diese Bindung nicht. Dies bestätigt, dass CR1–4 primär C4b, jedoch nicht iC3 (C3b) bindet.
Beispiel 2
Konstruktion von CR1–4-Analogen
Verschiedene mutierte Formen von CR1–4 wurden konstruiert und im Hinblick auf ihre Bindungsaktivität an C4b und iC3, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, überprüft. Tabelle 2 zeigt die konstruierten Analogen und die Bindungs- uns Cofaktoraktivitäten der Analoge. In Tabelle 2 sind die Modifikationen durch die Zahl der Aminosäure und die bewirkte Konversion dargestellt. Die Nummern korrespondieren zu denen in 3A und 3B dargestellten, die die Aminosequenzen von SCR-1 (SEQ ID NO: 1), SCR-2 (SEQ ID NO: 3), SCR-8 (SEQ ID NO: 2) und SCR-9 (SEQ ID NO: 4) in CR1 darstellen.
Die kombinierten Veränderungen, dargestellt in den verkürzten Formen, sollten die Aktivität eines modifizierten Gesamtlängenproteins vorhersagen. Es gibt starke Hinweise, die zur Verfügung stehen, und die etablieren, dass es drei primäre Bindungs- und Cofaktorstellen in den hauptpolymorphen Formen (30 SCRs) von CR1 gibt. Eine Stelle interagiert fast ausschließlich mit C4b (SCRs 1–4), während die beiden anderen Stellen, die in der Aminosäuresequenz fast identisch sind, mit sowohl C4b als auch C3b in Wechselwirkung treten (SCRs 8–11 und SCRs 15–18) [Klickstein, L. B., et al., J. Exp. Med. 168: 1699–1717 (1988); Kalli, et al., J. Exp. Med. 174: 1451–1460 (1991); Makrides, S. C., et al., J. Biol. Chem. 267: 24754–24761 (1992)].
Eine Elektronenmikroskopanalyse von CR1 legt nahe, dass CR1 ein halbfestes Stäbchen ist, bestehend aus individuellen globulären Domänen (den SCRs). So wird CR1 als elongiertes Protein dargestellt, das wohl getrennte aktive Stellen trägt. Diese Stellen könnten nicht cooperativ wirken. Ein Vergleich verschiedener polymorpher Formen, enthaltend die erste Stelle (SCRs 1–4) und 1, 2 und 3 Kopien der zweiten Stelle, demonstrierten wenig Unterschiede unter ihnen in Cofaktor- und Zerfallsbeschleunigungsassays, wie berichtet von Seya, T., et al., J. Immunology 135: 2661 (1985). Tatsächlich wurde nach Einreichung der Anmeldung, die hierfür die Priorität darstellt, gezeigt, dass modifizierte Membranformen von CR1, die eine einzelne aktive Stelle allein tragen (SCR 1–4 oder SCR 15–18) CHO-Zellen von menschlicher komplementvermittelter Lyse schützen konnten (Makrides, S. C., et al., J. Biol. Chem. 267: 24754–24761 (1992)). Dies stellt stützende Beweise bereit, dass eine einfache CR1-Form mit einer einzelnen aktiven Stelle biologisch aktiv sein könnte und dass Modifikation, die die Aktivität jeder primären Stelle in den Konstrukten verbesserten, zusammen in eine multiple Stellen-CR1-Form inkorporiert werden könnten und so einen verbesserten Regulator ergeben würden.
Wie in Tabelle 2 dargestellt, führt die Deletion von entweder SCR-1 oder SCR-2 zu einem Verlust der C4-Bindungsaktivität; so sind beide Regionen für die Bindung an C4b nötig. Die Bindung an C3b wird durch Insertion der SCR-9-Sequenz S-T-K-P-(P-I-C)-Q (Aminosäuren 54–61 von SEQ ID NO: 4) in SCR-2 (SEQ ID NO: 3) verliehen; die Deletion von SCR-1 (SEQ ID NO: 1) eliminiert jedoch teilweise die Bindung an C3b bei diesem Analog. So benötigt die effiziente Bindung an C3b nicht nur die relevante Sequenz in SCR-2 (SEQ ID NO: 3), sondern einen zusätzlichen Teil von SCR-1 (SEQ ID NO: 1). Die Fähigkeit zur Bindung von C3b, verliehen durch Veränderung der Sequenz in SCR-2 (SEQ ID NO: 3) beeinflusst die Bindung an C4b nicht.
Wie ebenfalls in Tabelle 2 dargestellt, ist es möglich, die Bindung an C4b durch Veränderung der Aminosäuren 35, 64–65 oder 94 zu schwächen oder zu zerstören. Es ist möglich, die C4b-Bindung durch Veränderung der Aminosäure 92 zu verstärken.
Diese Ergebnisse zeigen, dass durch Manipulation von C3B- und C4b-Bindungsstellen in CR1 die Affinität und Spezifität von CR1–4 verändert werden können. Ähnliche Veränderungen können an korrespondierenden Regionen bei zusätzlichen Mitgliedern der RCA-Proteinfamilie durchgeführt werden.
Beispiel 3
Konstruktion eines wirksameren löslichen CR1-Analog
Ein stringenter Inhibitor des Komplementsystems hat Anwendungen, bei denen eine höhere Wirksamkeit notwendig ist. In diesem Beispiel wird die sCR1-Sequenz als Ausgangsmaterial für eine Familie von Analogen mit höherer inhibitorischer Fähigkeit für sowohl den klassischen als auch den alternativen Weg verwendet. Andererseits könnte auch CR1 verkürzt, in der gesamten Länge, rekombiniert oder Hybridformen von CR1 ebenfalls verwendet werden.
Wie oben festgehalten, enthält das sCR1-Protein vier korrespondierende Regionen: SCRs 1–2 (SEQ ID NO: 1 bzw. 3), SCRs 8–9 (SEQ ID NO: 2 bzw. 4), SCRs 15–16 und SCRs 22–23. Die primäre C4b-Bindungsstelle liegt innerhalb der SCRs 1–2 (SEQ ID NO: 1 bzw. 3) und die zwei primären C3b-Bindungsstellen sind in SCRs 8–9 (SEQ ID NO: 2 bzw. 4) und SCRs 15–16. Von SCRs 22–23 wurde keine Bindungsaktivität berichtet, obwohl sie in der Aminosäuresequenz zu den anderen drei korrespondierenden Regionen hoch homolog sind.
Ein oder mehr Substitutionen werden in die korrespondierenden Positionen von löslichen CR1 SCRs 1–2, 8–9, 15–16 und 22–23 eingeführt. Spezifische Substitutionen, entworfen, um die C3b- und C4b-Cofaktoraktivität und Bindungsaktivität zu erhöhen, werden aus den Folgenden gewählt:
In einigen Fällen können einige dieser Aminosäuren bereits in der korrespondierenden Position vorliegen. In einigen Fällen können strukturell ähnliche Aminosäuren anstelle von den oben substituierten substituiert werden.
Die Verwendung dieser Substitutionen an einigen oder allen vier korrespondierenden Positionen wird eine Gesamtlängenlösliche CR1-Form ergeben mit wirksameren aktiven Stellen und mit einer zusätzlichen aktiven Stelle an SCR 22–24.
Die oben beschriebenen Substitutionen wurden in die vier korrespondierenden Regionen von Interesse eingeführt, um die Affinität von sCR1 für C3b- und C4b-haltige Ziele zu erhöhen. Diese Modifikationen wurden entwickelt, um die Verwendung von existierenden Coenzym- und Dissoziationsfunktionen zu erhöhen und potenziell neue Coenzyme und Dissoziationsfunktionen zu etablieren. Die Einführung von Aminosäuresequenzen, die für die C3b-Bindung signifikant sind, in die C4b-Bindungsregion, würde vermutlich nicht substanziell mit C4b-Aktivitäten interferieren, da eine solche Substitution in CR1–4 die C4b-Bindungseigenschaften von CR1–4 nicht nachweisbar verändern. Die Einführung von Aminosäuren, signifikant für die C4b-Bindung, in C3b-Bindungsregionen würde vermutlich nicht substanziell mit C3b-Bindungsaktivitäten interferieren, da eine substanzielle C3b-Bindung in dem CR1–4-Mutanten 11 auftritt, worin viele Aminosäuren, spezifisch für SCRs 1–2, einschließlich denen, die in der C4b-Bindung signifikant sind, bereits vorliegen.
Spezische Substitutionen, entwickelt zur Erhöhung der Affinität an C4b wurden in Beispiel 3 beschrieben: SCRs 1–2 (SEQ ID NO: 1 und 3), die primäre C4b-Bindungsstelle von CR1, modifiziert durch Ersatz von I (Aminosäure 32 von SEQ ID NO: 3) an Position 92 durch T (Aminosäure 32 von SEQ ID NO: 4); SCRs 8–9 (SEQ ID NO: 2 und 4) und die identischen SCRs 15–16, modifiziert durch Ersatz von E (Aminosäure 35 von SEQ ID NO: 2) an einer Position, korrespondierend zu 35 durch G (Aminosäure 35 von SEQ ID NO: 1) (oder A), H (Aminosäure 34 von SEQ ID NO: 4) an einer Position, korrespondierend zu 94 durch Y (Aminosäure 34 von SEQ ID NO: 3) (oder F), K (Aminosäure 4 von SEQ ID NO: 4) an einer Position, korrespondierend zu 64 durch R (Aminosäure 4 von SEQ ID NO: 3) und T (Aminosäure 5 von SEQ ID NO: 4) an einer Position, korrespondierend zu 65 durch N (Aminosäure 5 von SEQ ID NO: 3) (oder Q). SCRs 22–23 wurden ebenfalls durch Ersatz von G an einer Position, korrespondierend zu 64 durch R (Aminosäure 4 von SEQ ID NO: 3) (oder K) (Aminosäure 4 von SEQ ID NO: 4), P an einer Position, korrespondierend zu 65 durch N (Aminosäure 5 von SEQ ID NO: 3) (oder Q), E an einer Position, korrespondierend durch 92 durch T (Aminosäure 32 von SEQ ID NO: 4) und F an einer Position, korrespondierend zu 94 durch Y (Aminosäure 34 von SEQ ID NO: 3) modifiziert.
Zusammen resultieren diese Modifikationen in einer höheren Affinität für C4b und können auch neue Coenzym- oder Dissoziationsfunktionen etablieren oder die Kapazität der Coenzym- und Dissoziationsfunktionen, die in dem sCR1-Ausgangsmaterial vorliegen, verbessern.
Wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, verleiht die Substitution eines kurzen Abschnitts von Aminosäuren in die SCRs 1–2 (SEQ ID NO: 1 und 3) von CR1–4 durch die korrespondierenden Aminosäuren von SCRs 8–9 (SEQ ID NO: 2 und 4) eine C3b-Bindungsaktivität an CR1–4. Der Ersatz von D-N-E-T-P-I-C-D (Aminosäuren 54–61 von SEQ ID NO: 3) an Position 114–121 in SCR1, SCRs 1-2 durch S-T-K-P-P-I-C-Q (Aminosäuren 54–61 von SEQ ID NO: 4) erhöht die Affinität von SCR1 für C3b. Weiterhin erhöht der Ersatz von D-K-K-A-P-I-C-D (SEQ ID NO: 5) an Positionen 114–121 in SCRs 22–23 durch S-T-K-P-P-I-C-Q (Aminosäuren 54–61 von SEQ ID NO: 4) die Affinität von sCR1 für C3b. Einige strukturell ähnliche Aminosäuren können ebenfalls in S-T-K-P-P-I-C-Q (Aminosäuren 54–61 von SEQ ID NO: 4) substituiert werden.
Eine wirksamerer Komplementinhibitor stellt im Allgemeinen eine erhöhte C4b-Bindung und erhöhte C3b-Bindung bereit. Dies wird durch Einführung aller oben dargestellten Modifikationen erreicht.
Beispiel 4
Konstruktion von verkürzten CR1-Mutanten mit erhöhter Aktivität
Mehr als 25 Mutanten wurden im Hinblick auf ihre Cofaktoraktivität mit mehreren unterschiedlichen Salzkonzentrationen überprüft. Der Assay wurde durchgeführt wie beschrieben von Adams, E. M., Brown, M. C., Nunge, M., Krych, M., und Atkinson, J-P. (1991) J. Immunology, 147: 3005–3011.
Eine Anzahl von Mutationen der aktiven Stellen in den SCRs 1–3, der Stelle, die normalerweise mit C4b und nicht C3b in Wechselwirkung tritt, die die natürliche Aktivität dieser Stelle verbessern, sowohl für die C4b- als auch C3b-Cofaktoraktivität. Mindestens ein Mutant in den aktiven Stellen in SCR 8-11, wobei es sich offensichtlich um die wirksamere natürliche aktive Stelle handelt, der die Cofaktoraktivität dieser Stelle für sowohl C3b als auch C4b verbessert, wurde ebenfalls entdeckt.
Zusammengefasst wurden nun spezifische CR1-Proteine, die sowohl C3b- als auch C4b-Cofaktoraktivität aufweisen und auf einige Weisen eine Verbesserung gegenüber Gesamtlängenlöslichen CR1 sind, identifiziert. Diese Konstrukte sind weniger als 1/4 (sieben SCR-Konstrukte) bis 1/3 so groß wie lösliches CR1 (sCR1) und haben sowohl die C4b-Bindung als auch Cofaktoraktivität wie auch C3b-Bindungs- und Cofaktoraktivität. Konstrukte, beinhaltend so wenig wie drei SCRs scheinen eine C3b-Cofaktoraktivität zu haben, Indikativ für die C3b-Bindungsaktivität. In einigen Fällen legen die Daten nahe, dass die modifizierte aktive Stelle wirksamer zu sein scheint, als die natürlichen aktiven Stellen.
Diese Formen und ihre Aktivitäten sind in Tabelle 3 dargestellt:
Beispiel 5
DAF-Analoge
Der membrangebundene Komplementregulator DAF erleichtert die Dissoziation von C3b- und C4b-haltigen Convertasen, bindet jedoch nicht C3b oder C4b, noch dient er als Cofaktor für Faktor I-vermittelte proteolytische Inaktivierung von C3b oder C4b. Es wäre in bestimmten Situationen wünschenswert, die komplementregulatorische Aktivität von DAF oder von verkürzten, rekombinanten oder Hybridformen von DAF zu erhöhen.
Basierend auf einer Aminosequenzhomologie korrespondieren die DAF SCRs 2–3 zu den CR1-aktiven Regionen. Eine Homologie zwischen DAF SCRs 2–3 und CR1 SCRs 1–2 beträgt 40%, während die Homologie zwischen DAF SCRs 2–3 und CR1 SCRs 8–9 39% beträgt. Da es etliche nicht passende Aminosäuren in diesen Ausrichtungen gibt, entsprechen die Positionszahlen von DAF nicht exakt denjenigen von CR1.
Ein oder mehr Substitutionen werden in die DAF-SCRs 2–3 eingeführt. Spezifische Substitutionen, entworfen, um eine C3b- und C4b-Cofaktoraktivität und Bindungsaktivität zu verleihen, werden aus den Folgenden gewählt:
DAF-Position (Positionen), aufgewählt wie in Lublin und Atkinson, Ann. Rev. Immunol. 9: 431 (1991):
Der Ersatz von S-D-P-L-P-E-C-R (SEQ ID NO: 6) an DAF-Position 180–187 (unter Verwendung der Aufzählung von Lublin und Atkinson, Ann. Rev. Immunol. (1989) 7: 35–58) durch S-T-K-P-P-I-C-Q (Aminosäuren 54-61 von SEQ ID NO: 4) erhöht die Affinität von DAF für C3b. Der Ersatz von S-D-P-L-P-E-C (Aminosäuren 1–7 von SEQ ID NO: 6) durch S-T-K-P-P-I-C-Q (Aminosäuren 54–61 von SEQ ID NO: 4) läßt R am Ende dieser Sequenz, da R in den korrespondierenden Positionen von CR1 SCR 1–2 (SEQ ID NO: 1 und 3) und CR1 SCR 8–9 (SEQ ID NO: 2 und 4) angetroffen wird. Einige strukturell ähnliche Aminosäuren können in der S-T-K-P-P-I-C-Q- (Aminosäuren 54–61 von SEQ ID NO: 4) Sequenz substituiert werden.
Der Ersatz von P an DAF-Position 130 durch R erhöht die Affinität von DAF für C4b. Alle anderen Aminosäuren, die sich als wichtig bei den C4b-Wechselwirkungen in CR1 erwiesen haben, liegen in DAF SCRs 2–3 bereits vor.
Diese Substitutionen, durch Erhöhung der Affinität von DAF für C3b und möglicherweise C4b verstärken die jeweiligen fünf inhibitorischen Wirkungen von DAF auf die Komplementaktivierung.
Beispiel 6
Analoge von Faktor H
Faktor H ist ein Plasmaprotein, das nur aus 20 SCRs besteht. Faktor H zeigt eine C3b-Bindungs- und C3b-Cofaktor- und Dissoziationskapazität, aber keine anscheinende Fähigkeit, C4b zu inaktivieren oder zu binden. Da Faktor H bereits als Plasmaprotein sich entwickelt hat, könnte es vorteilhaft sein, dieses als Ausgangsmaterial für lösliche RCA-Analoge zu verwenden. Obwohl die aktiven Stellen von Faktor H nicht genau bekannt sind, zeigt ein proteolytisches Fragment, bestehend aus den ersten 5,5 SCRs von Faktor H eine C3b-Bindungs- und Cofaktoraktivität (Alsenz et al., Biochem. J. (1984) 389).
Um die Affinität von Faktor H für die C3b-Bindung zu erhöhen, wird N-A-A-H-W-S-T-K-P-P-I-C-Q (Aminosäuren 49–61 von SEQ ID NO: 4) in mehrere der SCRs eingeführt, von denen keins eine enge Ähnlichkeit mit CR1 SCR 8–9 aufweist. In einer Ausführungsform läßt man die ersten sechs SCRs nicht modifiziert und erhält so die ursprünglich aktive(n) Stelle (Stellen) und die verbleibenden 14 SCRs werden durch Substitution der N-A-A-H-W-S-T-K-P-P-I-C-Q (Aminosäuren 49–61 von SEQ ID NO: 4) in die zu CR1 homologe(n) Position (Positionen) modifiziert. Einige strukturell ähnliche Aminosäuren können in die N-A-A-H-W-S-T-K-P-P-I-C-Q- (Aminosäuren 4–61 der SEQ ID NO: 4) Sequenz substituiert werden. Homologe Positionen werden einfach identifiziert, da das W, das diesem C3b-Bindungssegment vorangeht, in den meisten SCRs angetroffen wird: in allen Faktor H SCRs außer SCR 10 und SCR 20, während das C innerhalb des C3b-Bindungssegments in allen bekannten SCRs angetroffen wird. Allerdings werden nicht alle Substitutionen notwendigerweise eine zusätzliche Bindungsaktivität verleihen, da diese Faktor H SCRs weniger monolog zu den CR1 SCR 1–2- und CR1 SCR 8–9-Regionen sind. Mindestens einige modifizierte H SCRs gewinnen jedoch eine C3b-Bindungskapazität, resultierend in einem Faktor H Analog mit einer deutlich höheren Affinität für C3b. Wie oben diskutiert, würde die höhere Affinität zu der größeren Verwendung der aktiven Stellen führen, die bereits in den ersten sechs H SCRs vorliegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

CR1-Analog, umfassend bis zu 7 SCRs (kurze Consensus-Repeats).
CR1-Analog gemäss Anspruch 1, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: CR1–4 stop7, verkürzt nach Aminosäure 449; und CR1–4 (8, 9) stop7, verkürzt nach Aminosäure 449.
CR1-Analog, worin der Carboxyterminus entfernt ist, um dem Protein die Sekretion zu ermöglichen, wobei das Analog eine Veränderung innerhalb eines kurzen Consensus-Repeats enthält, die zu einer Veränderung korrespondiert, gewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) 79: D; 37, 79: Y, D (b) CR1–4 mit den ersten 122 Aminosäuren (SCR1-2) ersetzt durch CR1-Aminosäuren 497–618 (SCR 8–9) unter Deletion von 194–253; Substitution der Aminosäuren 271–543 mit: T-R-T-T-F-H-L-G-R-K-C-S-T-A-V-S-P-A-T-T-S-E-G-L-R-L-C-A-A-H-P-R-E-T-G-A-L-Q-P-P-H-V-K CR1–4 (8, 9) mit den folgenden Substitutionen 110: T; 111: V; 112: I; 109: D; 114: D; 115: N; 121: D; 117: T; 1, 3: Q, N; 6–9: E-W-L-P; 52–54, 57, 59: T-G-A,R,R; 27, 29. Y, N; Substitutionen mit strukturell ähnlichen Aminosäuren und Kombinationen davon.
Analog eines zerfallsbeschleunigenden Faktors, wobei eine oder mehrere Substitutionen in die Region des Proteins eingeführt sind, korrespondierend zu den kurzen Consensus-Repeats SCRs 2–3 des Zerfallsbeschleunigungsfaktors, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus 175–187: S-T-K-P-P-I-C-Q-N-A-A-H; 145: D; 90–92: S-L-K, Substitutionen mit strukturell ähnlichen Aminosäuren und Kombinationen davon.
Analog gemäss einem der vorstehenden Ansprüche, weiterhin umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger für die Verabreichung an einen Patienten, der dieses benötigt.
Verfahren zur Herstellung eines Proteinanalogs eines Komplementrezeptors eins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die Herstellung einer geeigneten Veränderung in der DNA, codierend das Analog, und Expression des Analogs in einem geeigneten Expressionswirt.
Verfahren zur Herstellung eines Proteinanalogs eines zerfallsbeschleunigenden Faktors gemäss Anspruch 4, umfassend die Herstellung einer geeigneten Veränderung in der DNA, codierend das Analog, und Expression des Analogs in einem geeigneten Expressionswirt.
DNA-Sequenz, die die Analoge gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
DNA-Sequenz gemäss Anspruch 8 in einem Expressionssystem, das in der Lage ist, wenn es in eine kompatible rekombinante Wirtszelle transformiert wird, eine DNA zu exprimieren, die das Analog gemäss Anspruch 1 codiert; wobei das Expressionssystem eine DNA umfasst, die das Analog codiert, operabel gebunden an Kontrollsequenzen, die mit dem Wirt kompatibel sind.
Transgenes, nicht-menschliches Tier, enthaltend die DNA-Sequenz gemäss Anspruch 8 oder 9.
Verfahren zur Verstärkung der C4b- oder C3b-Co-Faktoraktivität eines Komplementregulationsproteins, wobei das Protein entweder den C3b- oder C4b-Co-Faktor aufweist, umfassend die Zugabe von Sequenzen zu dem Protein, die eine Bindung an den anderen Liganden, entweder C4b oder C3b, verleihen.
Verfahren gemäss Anspruch 11, wobei die Sequenzen aus denen gewählt sind, die in den Ansprüchen 1 bis 3 erwähnt werden.
Analog eines Proteins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines CR1-Analogs, dessen erste 122 Aminosäuren (SCR 1–2) durch CR1-Aminosäuren 497–618 (SCR 8–9) ersetzt sind, zur Herstellung eines Medikaments für die reversible Inhibition des klassischen Komplementsystemweges.
Verwendung eines CR1-Analogs, dessen erste 122 Aminosäuren (SCR 1–2) durch CR1-Aminosäuren 497–618 (SCR 8–9) ersetzt sind, als diagnostisches Mittel für die in-vitro-Bestimmung der Gegenwart, Abwesenheit oder Menge von C4b oder C4b tragenden Immunkomplexen in biologischen Flüssigkeiten.
Verwendung eines CR1-Analogs, einschliesslich der verkürzten, Hybrid- und der rekombinierten Form, unterschiedlich zu dem CR1 natürlich auftretenden Peptid zur Herstellung eines Mittels für die irreversible Inhibition des Komplementsystems.
Verwendung eines CR1-Analogs gemäss Anspruch 16, wobei das Analog eine C3b- und C4b-Co-Faktoraktivität aufweist.
Verwendung eines CR1-Analogs gemäss Anspruch 16 oder 17, wobei das Mittel für die Erniedrigung oder Unterdrückung der Transplantatabstossung verwendet wird.
Verwendung eines CR1-Analogs gemäss Anspruch 18, wobei ein nicht-menschlicher Tierdonor transgen für das CR1-Analog gemacht wird, um Organe für die Transplantation bereitzustellen.
Verwendung eines Analogs eines Proteins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines diagnostischen Mittels.
Verwendung eines Analogs eines Proteins gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Kontrolle des Komplementsystems.