DE69433399T2

DE69433399T2 - Detektion und behandlung von mutationen in einem gen für einen cd40-liganden

Info

Publication number: DE69433399T2
Application number: DE69433399T
Authority: DE
Inventors: K. Melanie SPRIGGS; J. Richard ARMITAGE; C. William FANSLOW; B. Michael WIDMER; L. Barry DAVISON; R. Blair RENSHAW
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 2004-10-14
Anticipated expiration: 2014-01-22
Also published as: DE69433399D1; EP0679191A4; EP0679191B1; WO1994017196A1; ATE256180T1; NZ262576A; ES2211876T3; PT679191E; CA2153806A1; US6613320B1; CA2153806C; US6106832A; AU6231394A; EP0679191A1; DK0679191T3; AU677995B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Liganden für das Zell-Oberflächen-Antigen CD40, den CD40-Liganden (CD40L). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion von Mutationen in einem CD40L-Gen und Verfahren zur Behandlung eines Syndroms, das aus erhöhten Pegeln an Serum-IgM und verringerten Pegeln an allen anderen Immunglobulin-Isotypen resultiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Humanes X-gekoppeltes Hyper-IgM-Syndrom ist durch einen erhöhten Pegel an Serum-IgM und verringerte (praktisch nicht detektierbare) Pegeln an anderen Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet. Betroffene Männer erfahren für gewöhnlich das Einsetzen wiederkehrender Infektion im ersten Lebensjahr. Der klinische Verlauf kann intermittierende Neutropenie und Pneumocystis-Pneumonie sowie Infektionen einschließen, die typischer für Hypogammaglobulinämie sind, wie bakterielle Otitis, Sinusitis und Pneumonie. Dieser Zustand ist ohne medizinische Intervention tödlich; Patienten reagieren jedoch typischerweise gut auf eine Erhaltungstherapie, die aus intravenösem Gammaglobulin besteht, insbesondere wenn mit der Therapie kurz nach der Geburt begonnen wird.
Betroffene Männer weisen eine normale Anzahl an zirkulierenden B- und T-Lymphozyten auf, obwohl eine Lymphknotenhyperplasie mit Abwesenheit von Keimzentren häufig ist (Notarangelo et al., Annu. Rev. Immunol. 10: 215, 1992). B-Zellen von Patienten scheinen insofern normal zu sein, als dass sie dazu gebracht werden können, sich einem Isotypen-Wechsel zu unterziehen, wenn sie in vitro mit einer T-Zelllinie gezüchtet werden, von der bekannt ist, dass sie in normalen B-Zell-Kulturen einen Klassen-Wechsel herbeiführt (Hendricks et al., Eur. J. Immunol. 20: 2603, 1990; Mayer et al., N. Engl. J. Med. 314: 409, 1986).
Erhöhte Pegel an Serum-IgM kommen in anderen Syndromen vor, einschließlich kombiniertem, variablem Immundefizit (CVID) und post-kongenitalen Röteln. Änderungen der T-Zell-Aktivierung, entweder als Folge primären genetischen Immundefizits oder erworbener CD4+ T-Zellen-Anomalie (z. B. AIDS) können ebenfalls einen Verlust von CD40L-induzierten B-Zellen-Aktivierungssignalen verursachen und somit teilweise die sekundären Anomalien der B-Zellen-Funktion erklären, die in diesen Zuständen beobachtet werden.
Es wurde nachgewiesen, dass das CD40-Zellenoberflächen-Antigen eine wichtige Rolle bei der B-Zellen-Proliferation und Differenzierung spielt. Humanes CD40-Protein (CD40), ein Zellenoberflächen-Antigen, das auf der Oberfläche von B-Zellen vorhanden ist, ist ein Peptid mit 277 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 30.600 und einem sekretorischen 19-Aminosäuren-Signalpeptid, das vorwiegend hydrophobe Aminosäuren aufweist. Eine cDNA, die humanes CD40 codiert, wurde von einer cDNA-Bibliothek isoliert, die aus der Burkitt-Lymphoma-Zelllinie Raji hergestellt wurde (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989).
Aktivierte CD4+ T-Zellen exprimieren hohe Pegel an einem Liganden für CD40 (CD40L). Humaner CD40L, ein membrangebundenes Glycoprotein, wurde vor kurzem aus peripheren Blut-T-Zellen kloniert, wie in Spriggs et al., J. Exp. Med. 176: 1543 (1992) und in der US-Patentanmeldung mit der Nummer 07/969,703, eingereicht am 23. Oktober 1992, beschrieben, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Das Klonieren von Mäuse-CD40L wird in Armitage et al., Nature 357: 80, 1992 beschrieben. CD40L induziert B-Zell-Proliferation und Sekretion von verschiedenen Immunglobulin-Isotypen (mit Ausnahme von IgE) in der Abwesenheit von irgendeinen Costimulus und kann auch die Produktion von IgE in der Gegenwart von Cytokinen herbeiführen.
CD40L scheint somit eine kritische Rolle in der kognaten Interaktion zwischen CD4+ T-Helferzellen und B-Zellen zu spielen. Eine detailliertere Analyse von Patienten mit X-gekoppeltem Hyper-IgM-Syndrom und seinen verwandten Syndromen wird wertvolle Informationen über die Interaktionen zwischen T-Zellen und B-Zellen bieten, zu denen es bei der humoralen Immunreaktion kommt. Früherkennung von X-gekoppeltem Hyper-IgM-Syndrom und seinen verwandten Syndromen wird einen sofortigen Beginn entsprechender Therapie erlauben. Daher besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf an der Entwicklung von Verfahren zum Detektieren und Bestätigen des X-gekoppelten Hyper-IgM-Syndroms und anderen Anomalien in den Interaktionen zwischen B-Zellen und T-Zellen, in denen CD40 und CD40L eine Rolle spielen. Alternative Verfahren zur Behandlung solcher Syndrome werden ebenfalls benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Detektieren einer Mutation oder von Mutationen in einem CD40L-Gen, welche das Isolieren von Nukleinsäure (RNA oder DNA) von einem Individuum, selektives Amplifizieren von Nukleinsäure, die aus dem CD40-Liganden-Gen gewonnen wurde, und Analysieren der amplifizierten Nukleinsäure aufweisen, um festzustellen, ob im CD40L-Gen Mutation (oder Mutationen) vorhanden ist (sind). Mutationen in diesem Gen führen zu Anomalien in der Interaktion von CD40L und CD40, was Veränderungen in den Interaktionen von T-Zellen und B-Zellen zur Folge hat. Solche Veränderungen in der Interaktion zwischen T-Zellen und B-Zellen spielen im X-gekoppelten Hyper-IgM-Syndrom in einem Menschen eine Rolle und können auch in anderen Syndromen vorkommen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereit, das ein Syndrom aufweist, in dem die Interaktion zwischen T-Zellen und B-Zellen beeinträchtigt ist (wie das X-gekoppelte Hyper-IgM-Syndrom), wobei das Verfahren das Verabreichen einer effektiven Menge eines löslichen CD40L aufweist. Lösliche Formen von CD40L weisen die extrazelluläre Region von CD40L auf und schließen zum Beispiel Fusionsproteine, welche die extrazelluläre Region von CD40L und eine Fc-Region eines humanen Immunglobulin enthalten, und CD40L-Multimere ein, welche durch Hinzugabe eines Multimer-bildenden Peptides zur extrazellulären Region von CD40L gebildet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Verwenden von Gentherapie bereit, um X-gekoppeltes Hyper-IgM-Syndrom und andere Syndrome zu korrigieren, in denen das CD40L-Gen nicht biologisch aktiven CD40L codiert. Gentherapie zum Korrigieren solcher Syndrome weist das Isolieren von CD4+ T-Zellen von einem betroffenen Individuum, das Transfizieren der isolierten T-Zellen mit einem Transfektionsvektor, der einen biologisch aktiven CD40L exprimiert, und das Verabreichen der transfektierten T-Zellen, welche den biologisch aktiven CD40L exprimieren, an das Individuum auf.
Ferner werden Tiere bereitgestellt, die durch Gentargeting-Technologie unter Verwendung von embryonalen Stammzellen nicht-funktionalen CD40-L in vivo exprimieren. Solche Tiere, die als Knockout-Tiere bezeichnet werden, stellen ein nichthumanes Modell dar, das für das Studieren der kognaten Interaktion von T- und B-Zellen in vivo nützlich ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Flussdiagramm, das die Konstruktion eines Targeting-Vektors zeigt, der zum Erzeugen von CD40-L-Knockout-Mäusen verwendet wird. Exons sind auf der Karte des CD40-L-Gens als durchgehende schwarze Kästchen dargestellt und von links nach rechts von 1 bis 5 nummeriert. Die durchgehenden schwarzen Pfeile stellen das PGK-Neo-Gen dar; die großen, offenen Pfeile stellen das HSV-TK-Gen dar.
2 stellt das Gen-Targeting-Schema für pHRV-mCD40L#3 dar.
3 stellt ein PCR-Schema für Genotypenbestimmung dar. Der PCR-Primer 3 entspricht SEQ ID NO: 13; der PCR-Primer 4 entspricht SEQ ID NO: 14; der PCR-Primer 1 entspricht SEQ ID NO: 15 und der PCR-Primer 2 entspricht SEQ ID NO: 16.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Syndrome oder Zustände, bei denen die Interaktion zwischen T-Zellen und B-Zellen aufgrund eines Defekts in einem Gen, das einen membrangebundenen Liganden für CD40 codiert, abnormal ist. CD40, ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Superfamilie, ist ein membrangebundenes Rezeptorprotein, bei dem festgestellt wurde, dass es auf B-Lymphozyten, Epithelialzellen und einigen Karzinoma-Zelllinien exprimiert wird. Monoklonale Antikörper, die gegen CD40 gerichtet sind, vermitteln verschiedene funktionale Effekte von humanen B-Zellen, einschließlich homotypischer Adhäsionen, angestiegener Zellgröße, Proliferation von mit Anti-IgM aktivierten B-Zellen Anti-CD20 monoklonalem Antikörper (mAb), Phorbolester alleine oder Phorbolester kombiniert mit Interleukin-4 (IL-4), und Herstellung von IgE und IgM aus IL-4 stimulierten, T-Zellen-abgereicherten Kulturen. Diese Ergebnisse lassen die Bedeutung von CD40 und CD40L bei der Proliferation und Differenzierung von B-Zellen vermuten.
CD40L ist ein membrangebundenes Polypeptid mit einer extrazellulären Region an seinem C-Terminus, einer Transmembranregion und einer intrazellulären Region an ihrem N-Terminus. Eine lösliche Version von CD40L kann aus der extrazellulären Region oder aus einem Fragment davon hergestellt werden. Die biologische Aktivität von CD40L wird durch Binden an CD40 vermittelt und weist Proliferation von B-Zellen und das Herbeiführen von Immunglobulin-Sekretion von aktivierten B-Zellen auf. CD40L (einschließlich löslicher oligomerer Formen und membrangebundener Formen) können B-Zellen-Proliferation und Immunglobulin-Absonderung (mit Ausnahme von IgE-Absonderung) ohne die Gegenwart von hinzugefügtem IL-4 ausüben, und dies im Gegensatz zu Anti-CD40-Antikörpern, welche IL-4 und Quervernetzung benötigen, um Aktivität zu vermitteln. Das Klonieren von CD40L und bestimmter seiner verschiedenen Aktivitäten werden in der US-Patentanmeldung mit der Nummer 07/969,703, eingereicht am 23. Oktober 1992, beschrieben.
Das Gen für CD40L wurde zur proximalen Region des Mäuse-X-Chromosoms kartiert, das mit dem Hprt-Locus verbunden ist. In-Situ-Hybridisierungsstudien von humanen Metaphase-Chromosomen, welche eine humane CD40L cDNA-Sonde verwendeten, bestätigten eine ähnliche Lage in Menschen, wobei die größte Anzahl an Körnern zu Bande q26 kartiert wurde. Die in vitro biologischen Daten bezüglich der Funktion des CD40L, gemeinsam mit seinem chromosomalen Standort, ließen vermuten, dass dieses Gen eine Rolle in einem X-gekoppelten Immundefizit spielen kann. Der Phänotyp von Patienten mit X-gekoppeltem Hyper-IgM-Syndrom und die Kopplungskartenposition dieses Syndroms stimmten insbesondere mit einem Defekt in der Expression eines funktionalen CD40L am meisten überein. X-gekoppeltes Hyper-IgM-Syndrom wurde zu Xq26 kartiert, in der Nähe von HPRT (Padayachee et al., Genomics 14: 551, 1992; Mensink et al., Hum. Genet. 76: 96, 1987).
Die Expression des CD40L-Gens wurde bei Patienten mit primärem X-gekoppelten Hyper-IgM-Syndrom untersucht, wobei periphere Blut-T-Zellen verwendet wurden, die durch Trennen über Ficol1-Hypaque gereinigt und anschließend mit immobilisiertem, monoklonalem Antikörper zu CD3 aktiviert wurden. Lösliches CD40-Protein (ein Fusionsprotein, das die extrazelluläre Domäne von humanem CD40 enthält, das an die Fc-Region von humanem IgG1 fusioniert ist; hierin als CD40Fc bezeichnet, das in USSN 07/969,703 und in Fanslow et al., J. Immunol. 149: 655, 1992 beschrieben ist) wurde verwendet, um die stimulierten T-Zellen durch fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS) zu analysieren. Kontrollzellen (gereinigte T-Zellen aus normalen Erwachsenen-Spendern und/oder einem Patienten, bei dem ein nicht verwandtes X-gekoppeltes Immundefizit diagnostiziert wurde) wurden auf dieselbe Weise analysiert. T-Zellen aus den X-gekoppelten Hyper-IgM-Patienten haben bei Aktivierung durch einen CD3-Antikörper keinen detektierbaren CD40L exprimiert (obwohl in einigen Experimenten aktivierte T-Zellen von einem Patienten scheinbar schwach an CD40 banden), aber haben die Alphakette des IL-2-Rezeptors (ein T-Zellen-Oberflächenaktivierungsmarker) mit Pegeln exprimiert, die mit jenen vergleichbar sind, die bei T-Zellen von Kontrollspendern festgestellt wurden. T-Zellen von Hyper-IgM-Patienten zeigten auch normale proliferierende Reaktionen auf PHA oder CD3 mAb plus IL-7.
RNA wurde aus Patienten- und Spenderzellen, die wie beschrieben stimuliert wurden, extrahiert und verwendet, um cDNA zu erzeugen, die als eine Matrize für PCR-Reaktionen diente. Nukleotidsequenzanalyse der resultierenden cDNAS zeigte, dass es zu Einzelpunkt-Mutationen in dem CD40L von drei der vier Hyper-IgM-Patienten kam. Jede Nukleotidveränderung war einzigartig und alle traten in der extrazellulären Domäne des CD40L auf. Die CD40L cDNA, die von einem vierten Patienten erzeugt wurde, schien keine Nukleotidveränderungen innerhalb der codierenden Region aufzuweisen, was vermuten lässt, dass ein anderer Mechanismus, der unter Umständen die 5'- oder 3'-nicht-codierenden Sequenzen einschließt, für die Abwesenheit des CD40L auf den T-Zellen von diesem Patienten verantwortlich sein muss.
Um sicherzustellen, dass diese Mutationen nicht nur natürlich auftretende Gen-Polymorphismen sind, wurden zwei der festgestellten Nukleotidveränderungen getrennt in einen Säugetier-Expressionsvektor eingeführt, der die vollständige codierende Region für den humanen CD40L enthält, wobei stellengerichtete Mutagenese verwendet wurde. Die Zellen wurden mit Vektoren, welche entweder die Wildtyp- oder die mutagenisierten CD40Ls trugen, transfiziert, metabolisch radioaktiv markiert und auf Expression des CD40L-Proteins durch Fällung mit einem polyklonalen Serum, das gegen CV1/EBNA-Zellen gerichtet war, die den humanen CD40L exprimieren, oder mit CD40.Fc geprüft. Zellen, die mit dem Wildtyp-CD40L transfiziert wurden, exprimierten ein 33-kD-Protein, das unter Verwendung von CD40.Fc nachgewiesen wurde. Im Gegensatz dazu haben Zellen, die mit einer der mutierten Formen von CD40L transfiziert wurden, kein Protein exprimiert, das durch CD40.Fc erkannt wurde. Immunfällung von identischen Lysaten, unter Verwendung des polyklonalen Antiserums, führte zur Erkennung eines 33-kD-Proteins von mutierten als auch Wildtyp-transfektierten Zellen, die mit dem CD40L-Protein co-migrierten, das durch CD40.Fc erkannt wurde. Eine Northern-Blot-Analyse zeigte ähnliche Pegel an CD40L-spezifischer RNA sowohl in Wildtyp- als auch mutierten, transfizierten Zellen. Zusätzlich waren Zellen, die mit einer der mutierten Formen von CD40L transfiziert wurden, in Bezug auf CD40.Fc-Bindung vollkommen negativ, während Zellen, welche den Wildtyp-CD40L exprimieren, eine starke CD40.Fc-Bindung zeigten. Zellen, die eine der Formen des mutagenisierten CD40L exprimierten, waren ebenfalls nicht imstande, eine B-Zellen-Proliferation oder IgE-Absonderung herbeizuführen, was die Abwesenheit von funktionalem CD40L auf deren Zelloberflächen bestätigt.
T-Zellen-abgereicherte periphere Blutmononuklearzellen (PBMC; B-Zellen angereicherte Populationen) von X-gekoppelten Hyper-IgM-Patienten zeigten eine proliferierende Reaktion auf CD40L, die mit jener vergleichbar ist, die bei ähnlich gereinigten PBMC von Kontrollspendern festgestellt wird. PBMC aus normalen Spendern erzeugten messbare Mengen an IgE, wenn sie mit IL-4 gezüchtet wurden, während in Zellen von einem der Hyper-IgM-Patienten, die unter denselben Bedingungen gezüchtet wurden, keine IgE-Produktion festgestellt wurde. Die Zugabe von rekombinantem CD40L oder einem CD40 mAb zu Kulturen, die PBMC von Hyper-IgM-Patienten enthielten, stellte bei drei von vier Patienten die Fähigkeit der PBMC, IgE zu sekretieren, wieder her.
Die Ergebnisse dieser Studien zeigen die kritische Rolle, die CD40L in der kognaten Interaktion zwischen CD4+ T-Helferzellen und B-Zellen zu spielen scheint. Diese Interaktion ist eine der wichtigsten Anforderungen einer erfolgreichen, humoralen Immunreaktion auf die meisten Antigene. Eine weiterführende Studie von Hyper-IgM-Syndrom und verwandten Syndromen wird weitvolle Informationen über die strukturelle/funktionale Beziehung von CD40 und CD40L und über Interaktionen der verschiedenen Zellen, die in die humorale Immunreaktion einbezogen sind, bereitstellen. Verfahren zum Erfassen von Anomalien in CD40L werden Klarheit über die verschiedenen putativen Formen (autosomal-rezessiv, autosomal-dominant) des Hyper-IgM-Syndroms sowie über andere Anomalien in den Interaktionen zwischen B-Zellen und T-Zellen schaffen, in denen CD40 und CD40L eine Rolle spielen.
Mutationen in CD40L können durch Isolieren von Nukleinsäure (DNA oder RNA) von einem Individuum, selektives Amplifizieren von Nukleinsäure, die aus einem CD40L-Gen gewonnen wird, und durch Analysieren der amplifizierten Nukleinsäure detektiert werden, um festzustellen, ob eine Mutation oder Mutationen in dem CD40L-Gen auftritt bzw. auftreten. Nukleinsäuren können von Zellen wie peripheren Blutzellen oder fötalen Zellen isoliert werden, die durch Amniozentese oder Chorionzottenbiopsie erhalten werden. Andere Quellen von Nukleinsäuren schließen Biopsiegewebe und andere Gewebeproben ein, in denen Nukleinsäuren vorhanden sind.
Nukleinsäuren können durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert werden, welche Oligonukleotidsonden verwendet, die für ein CD40L-Gen spezifisch sind, um selektiv zu jenen Nukleinsäuren zu hybridisieren und jene Nukleinsäuren zu amplifizieren, die aus dem CD40L-Gen gewonnen werden. Oligonukleotidsonden, die beim Amplifizieren von RNA nützlich sind, die aus dem CD40L-Gen gewonnen wird, schließen jene Sonden ein, die durch SEQ ID NO: 1 bis 4 definiert sind. Zusätzliche Oligonukleotidsonden, die aus der Sequenz des CD40L-Gens gewonnen werden, können verwendet werden, um die 5'- und 3'-Nichtcodierungsregionen der Nukleinsäure sowie die Sequenz von im CD40L-Gen vorhandenen Introns zu analysieren, die nicht in die mRNA transkribiert sind, aber die Expression eines funktionalen CD40L-Genprodukts beeinträchtigen können.
Nukleinsäure kann mit Hilfe einer Nukleotidsequenzanalyse analysiert werden, um festzustellen, ob in einem Gen eine Mutation auftritt oder Mutationen auftreten. Die Nukleotidsequenzanalyse kann manuell zum Beispiel durch eine Dideoxy-Analogkettenterminationstechnik ausgeführt werden. Alternativ dazu kann ein automatisierter Sequenzer verwendet werden, um die Nukleotidsequenzanalyse durchzuführen. Die Nukleotidsequenz der amplifizierten Nukleinsäure wird mit der veröffentlichten Sequenz von CD40L (SEQ ID NO: 7) verglichen, die auch in USSN 07/969,703 offenbart ist, wobei diese Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist, und in Spriggs et al., J. Exp. Med. 176: 1543 (1992) beschrieben wird.
Unterschiede bei der Nukleotidsequenz zwischen der amplifizierten Nukleinsäure und der veröffentlichen Sequenz von CD40L können zu Mutationen in einem CD40L-Peptid führen, das aus der Nukleinsäure exprimiert wird. Solche Mutationen schließen die Substitution einer anderen Aminosäure (oder anderen Aminosäuren) in dem CD40L-Peptid, Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren aus dem CD40L-Peptid, vorzeitige Termination des CD40L-Peptids und Zugabe von Aminosäuren zu dem CD40L-Peptid ein. Andere Arten von Mutationen können unsachgemäßes Spleißen von Exons, Rahmenverschiebungen, die zu unlesbaren (unsinnigen) Nukleinsäurecodons führen, verursachen oder andere Elemente beeinträchtigen, die für die Transkription und Translation eines biologisch aktiven CD40L erforderlich sind. Mutationen können somit entweder in der codierenden Region eines CD40L-Gens oder in den nicht-codierenden Regionen des CD40L-Gens sein.
Die Auswirkung einer Mutation oder von Mutationen auf die Expression eines biologisch aktiven CD40L kann durch Einführen der Mutation oder der Mutationen in einen Expressionsvektor evaluiert werden, der biologisch aktiven CD40L codiert. Ein Klonierungsvektor, der eine humane CD40L-Sequenz, die als hCD40-L bezeichnet wird, enthält, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) am 6. Dezember 1991 unter der Zugriffsnummer 68873 hinterlegt. Mutanten können zum Beispiel erzeugt werden, indem Gen-Spleißen durch das Überlappungsextensions (SOEing)-Verfahren (Horton et al., BioTechniques 8: 528, 1990) oder durch andere, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren durchgeführt wird. Der mutierte Expressionsvektor wird dann in Zellen exprimiert, und die biologische Aktivität von CD40L, der durch den Mutanten codiert ist, wird unter Verwendung von einer oder mehreren Analysen der biologischen Aktivität bestimmt, die im vorliegenden Dokument und in USSN 07/969,703, Armitage et al., Nature 357: 80, 1992, Fanslow et al., J. Immunol. 149: 655, 1992 und Spriggs et al., J. Exp. Med. 176: 1543 (1992) beschrieben sind.
Die Beobachtung, dass normale B-Zellen-Funktion durch die Zugabe von exogenem, biologisch aktivem CD40L wiederhergestellt werden konnte, unterstützt eine therapeutische Verwendung dieses Moleküls. Eine solche Therapie könnte das Verabreichen von gereinigtem CD40L in einer therapeutischen Zusammensetzung aufweisen, welche eine effektive Menge von CD40L in einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger enthält. Zur therapeutischen Verwendung werden CD40L oder ein biologisch aktives Analogum davon, einem Patienten zu einer der Indikation entsprechenden Behandlung verabreicht. CD40L pharmazeutische Zusammensetzungen (zum Beispiel in der Form einer multimeren, löslichen, extrazellulären Domäne oder eines Fragmentes davon) können durch Bolusinjektion, Dauerinfusion, Depot-Abgabe aus Implantaten oder andere, geeignete Techniken verabreicht werden.
Typischerweise wird ein CD40L therapeutisches Mittel in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, welche gereinigtes CD40L-Polypeptid in Verbindung mit physiologisch akzeptablen Trägern, Arzneimittelträgern oder Verdünnungsmitteln enthält. Solche Träger werden für Patienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sein. Normalerweise bringt die Herstellung solcher Zusammensetzungen das Kombinieren eines CD40L-Polypeptids mit Puffern, Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Polypeptiden mit geringem Molekulargewicht (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich Glucose, Sucrose oder Dextranen, chelatbildenden Mitteln wie EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Arzneimittelträgern mit sich. Neutrale, gepufferte Salzlösung oder Salzlösung gemischt mit konspezifischem Serumalbumin sind zum Beispiel geeignete Verdünnungsmittel.
Ein Gen, das biologisch aktives CD40L codiert, kann ebenfalls in die T-Zellen (vorzugsweise CD4+ T-Zellen) eingeführt werden, die von einem Individuum mit anomalem oder defektem CD40L unter Verwendung von Gentransfertechniken erhalten werden. Die Zellen werden isoliert und mit dem biologisch aktiven CD40L- Gen transfiziert; sie werden danach dem Individuum erneut verabreicht und werden dann die Symptome des Syndroms durch Erzeugen von biologisch aktivem CD40L korrigieren.
Zahlreiche Verfahren wurden für das Einführen von exogenen Genen in die Säugetierzellen entwickelt, zum Beispiel Transfektion oder Infektion. Diese Transduktionsverfahren können physikalischer Natur sein oder sie können auf der Verwendung von rekombinanten, retroviralen Vektoren beruhen, die DNA codieren, die zu RNA transkribiert, in infektiöse virale Partikel verpackt und verwendet werden kann, um Zielzellen zu infizieren und dadurch das gewünschte genetische Material bereitzustellen.
Es wurden viele verschiedene Arten von Säugetier-Gentransfer- und Expressionsvektoren entwickelt (siehe Miller und Calos, Hrsg., "Gene Transfer Vectors for mammalian Cells, "Current Comm. Mol. Biol., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987). Nackte DNA kann physikalisch in Säugetierzellen durch Transfektion unter Verwendung einer beliebigen Reihe von Techniken eingeführt werden, die – ohne darauf beschränkt zu sein – Kalziumphosphat-Transfektion (Berman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 81: 7176, 1984), DEAE-Dextran-Transfektion, Protoplastfusion (Deans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 81: 1292, 1984), Elektroporation (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 81: 7161, 1984), Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413, 1987), Polybrentransfektion (Kawai und Nishzawa, Mol. Cell. Biol 4: 1172, 1984) und direkten Gentransfer durch Lasermikropunktur von Zellmembranen (Tao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 84: 4180, 1987) einschließen.
Es wurden verschiedene Infektionstechniken entwickelt, welche rekombinante infektiöse Viruspartikel zur Genabgabe verwenden. Dies stellt einen bevorzugten Ansatz in Bezug auf die vorliegende Erfindung dar. Die viralen Vektoren, die auf diese Weise verwendet wurden, schließen Virusvektoren ein, die vom Simianvirus 40 (SV40; Karlsson et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 84 82: 158, 1985), Adenoviren (Karlsson et al., EMBO J. 5: 2377, 1986), adeno-assoziiertem Virus (LaFace et al., Virology 162: 483, 1988) und Retroviren (Coffin, 1985, Seiten 17–71, in Weiss et al (Hrsg)., RNA Tumor Viruses, 2. Ausgabe, Band 2, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) gewonnen wurden.
Somit gibt es zahlreiche Gentransfer- und -expressionsverfahren, die aber im Wesentlichen funktionieren, um genetisches Material in Säugetierzellen einzuführen und zu exprimieren. Mehrere der oben angeführten Techniken wurden verwendet, um blutbildende Zellen oder Lymphzellen zu transduzieren, einschließlich Kalziumphosphattransfektion (Berman et al., supra, 1984), Protoplastfusion (Deans et al., supra, 1984), Elektroporation (Cann et al., Oncogene 3: 123, 1988) und Infektion mit rekombinantem Adenovirus (Karlsson et al., supra; Ruether et al., Mol. Cell. Biol. 6: 123, 1986), adeno-assoziiertem Virus (LaFace et al., supra) und Retrovirusvektoren (Overell et al., Oncogene 4: 1425, 1989). Primäre T-Lymphozyten wurden erfolgreich durch Elektroporation (Cann et al., supra, 1988) und retrovirale Infektion (Nishihara et al., Cancer Res. 48: 4730, 1988; Kasid et al., supra, 1990) transduziert.
Gen-Targeting-Technologie, die embryonale Stammzellen verwendet, hat es ermöglicht, transgene Mäuse zu schaffen, die definierte Veränderungen in einem ausgewählten Gen aufweisen (Waldman A. S. 1992, Crit. Rev. Oncol. hematol. 12(1): 49–64; Huang M. T. 1993, Lab. Anim. Sci. 43(2): 156–159; Koller und Smithies, 1992, Annu. Rev. Immunol. 10: 705–730; Joyner A. L. 1991, Bioessays. 13(12): 649–656; Smithies O., 1993 Trends Genet. 9(4): 112–116). Zum Beispiel wird eine Sonde aus einer cDNA des gewünschten Gens hergestellt und dazu verwendet, das tatsächliche Gen in einer genomischen Bibliothek zu identifizieren. Die Struktur des Gens wird bestimmt und die gewünschte(n) Änderungen) wird (werden) entwickelt. Rekombinante DNA-Technologie wird verwendet, um einen Vektor herzustellen, der die gewünschte(n) Änderungen) in das Gen einer embryonalen Stammzelle durch homologe Rekombination einführt.
Die geänderten embryonalen Stammzellen werden dann in Blastozysten injiziert, in denen sie zur Bildung aller Gewebearten beitragen, einschließlich Keimzellen. Die Tiere, die sich aus solchen Blastozysten entwickeln, werden Chimäre genannt. Wenn die chimären Tiere gezüchtet werden, erzeugen Keimzellen, welche die Mutation enthalten, Tiere, denen das funktionale Gen fehlt. Solche Tiere werden als "Knockout" (KO)-Tiere bezeichnet. Viele Beispiele von KO-Mäusen sind bekannt; einige dieser Tiere weisen einen Phänotyp auf, der jenem ähnelt, der in bestimmten humanen genetischen Krankheiten festgestellt werden kann, und dienen somit als nützliche Tiermodelle.
CD40-L KO-Mäuse sind wahrscheinlich für Wissenschaftler, die die kognaten Interaktionen zwischen T- und B-Zellen in thymusabhängigen Antikörper-Reaktionen sowie verschiedene Aspekte des Wechsels des Immunglobulin-Isotyps untersuchen, von großem Interesse. Die Rolle von CD40-L im humanen X-gekoppelten hyper-IgM-Syndrom zeigt, dass CD40-L KO-Mäuse ein wertvoller Beitrag für das Testen möglicher Behandlungen (d. h. Verabreichung von löslichem, rekombinantem Liganden) für Hyper-IgM wären. Außerdem sind CD40-L-Knockout-Mäuse für viele verschiedene Arten von Untersuchungen von Interesse, da diese Tiere einen ausgezeichnet definierten genetischen Defekt aufweisen, von dem erwartet wird, dass er eine spezifische zelluläre Interaktion deaktiviert, die für eine Immunreaktion erforderlich ist. Somit geht man davon aus, dass CD40-L-KO-Mäuse als Modelle für das Testen von Impfzubereitungen oder Immunreaktionsmodifikatoren beim Definieren der Rolle von T-Zellen und B-Zellen in verschiedenen Krankheiten und Syndromen (einschließlich infektiöser Krankheit) und bei der Entwicklung von Behandlungen für das Hyper-IgM-Syndrom und andere Leiden nützlich sind, welche aus der Anomalie in der Interaktion von T- und B-Zellen resultieren oder mit dieser in Verbindung stehen.
Mit Hilfe der folgenden Beispiele sollen bestimmte Ausführungsformen gezeigt werden, wobei jedoch durch diese Beispiele der Schutzumfang der Erfindung nicht eingeschränkt wird. Die dazugehörige Offenbarung aller Bezugnahmen wird hierin durch Bezugnahme in dieses Dokument aufgenommen.
Beispiel 1: Kartieren des CD40L-Gens
Unter Verwendung einer cDNA, welche der codierenden Region des Mäuse-CD40L-Gens (Armitage et al., Nature 357: 80, 1992) entspricht, wurde die chromosomale Position des Mäuse-CD40-Locus durch interspezifische Rückkreuzungs-Analyse unter Verwendung von Nachkommen bestimmt, die durch das Paaren von [(C57BL/6J × Mus spretus)F1 X C57BL/6J]-Mäusen gewonnen wurden. Dieses interspezifische Rückkreuzungs-Kartierungspanel wurde für über 1100 Loci bestimmt, die unter allen Autosomen und dem X-Chromosom gut verteilt sind (Copeland und Jenkins, Trends Genet. 7: 113, 1991). C57B1/6J und Mus spretus DNAs wurden mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen aufgeschlossen und durch Southern-Blot- Hybridisierung für informative Restriktion-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLPs) unter Verwendung einer Maus-CD40L-cDNA-Sonde analysiert. Die Kartierungsergebnisse weisen darauf hin, dass das CD40L-Gen (CD401) in der proximalen Region des Maus-X-Chromosoms angeordnet ist, gekoppelt mit Hypoxanthin-Guanin-Phosphoriboxyl-Transferase (Hprt), knochenmorphogenetischem Protein 2b2 (Bmp-2b2) und Connexin-32 (Cnx-32). Eine Beschreibung der Sonden und RFLPs für die Loci, die mit dem Cd401 gekoppelt sind, einschließlich Hprt, Bmp-2b2 und Cnx-32, wurde bereits berichtet (M. E. Dickinson et al., Genomics 6: 505, 1990; J. A. Haefliger et al., J. Biol. Chem. 267: 2057, 1992). Rekombinationsdistanzen wurden wie beschrieben (E. L. Green, in Genetics and probability in Animal Breeding Experiments, Oxford University Press, New York, 1992, pp. 77–113) unter Verwendung des Computerprogramms SPRETUS MADNESS berechnet. Die Genreihenfolge wurde durch Minimierung der Anzahl an Rekombinationsereignissen bestimmt, die erforderlich sind, um die Allelverteilungsmuster zu erklären. Die bestimmten Rekombinationshäufigkeiten platzieren das Cd401-Gen 1,5 +/– 1,1 centiMorgan distal vom Hprt-Locus. HPRT lässt sich zur q26Region des humanen X-Chromosoms kartieren, was vermuten lässt, dass sich auch das humane Homolog des CD40L zu dieser Region kartieren ließe. Dies wurde durch die Situ-Hybridisierungsstudien von humanen Metaphasechromosomen unter Verwendung einer humanen CD40L-cDNA-Sonde bestätigt. Humane Metaphasechromosome wurden aus Lymphozyten von zwei normalen männlichen Spendern gewonnen. Hybridisierung wurde unter Verwendung einer humanen CD40L-Sonde durchgeführt, die mit ³H zu einer spezifischen Aktivität von 1 × 10⁶ cpm/μg wie beschrieben (J. D. Marth et al., Proc. natl. Acad. Sci. USA 83: 7400, 1986) markiert wurde. Die endgültige Sondenkonzentration lag bei 0,4 ng/μg der Hybridisierungsmischung. Die Objektträger wurden 5 bis 7 Wochen lang exponiert. Die Chromosome wurden durch Q-Banding gekennzeichnet. Von 115 erfassten Hybridisierungsstellen befanden sich 18 (16%) auf dem distalen Abschnitt des Langarms des X-Chromosoms. Die größte Anzahl an Körnern befand sich bei Band q26, ohne bedeutende Hybridisierung auf anderen humanen Chromosomen.
Beispiel 2: Analyse von CD40L-Expression auf T-Zellen von Hyper-IgM-Patienten
Bei vier heranwachsenden Patienten, deren klinische Befunde und Laborbefunde mit primärem X-gekoppeltem Hyper-IgM-Syndrom übereinstimmten, wurde die Expression von CD40L untersucht. Drei dieser Patienten stellten sporadische Fälle dar, ohne ähnlich betroffene männliche Verwandte. Der vierte Patient gehörte zu einer Familie mit einem dokumentierten, über drei Generationen verlaufenden Stammbaum, der eine klassische X-gekoppelte Vererbung des Hyper-IgM-Syndroms zeigte.
Die Expression von CD40L wurde direkt auf peripheren Blut-T-Zellen untersucht, die aus den vier Hyper-IgM-Patienten gereinigt wurden. Verbleibende periphere Blut-T-Zellen exprimieren nicht nachweisbare Pegel an CD40L mRNA und Protein, wobei jedoch eine 16 Stunden lange Stimulierung mit einem CD3-spezifischen Antikörper zu einem deutlichen Anstieg der Pegel von mRNA und Zelloberflächenprotein führt (Spriggs et al., J. Exp. Med. 176: 1543, 1992). Daher wurden periphere Blutleukozyten aus heparinisiertem Vollblut von Patienten oder Kontrollspendern durch Trennung über Ficoll-Hypaque gereinigt. T-Zellen wurden mit immobilisierten CD3 mAb aktiviert und durch Flusszytometrie unter Verwendung einer löslichen Form von CD40 analysiert. Dieses lösliche CD40-Protein (CD40.Fc), das in USSN 07/969,703 und in Fanslow et al., J. Immunol. 149: 655, 1992 beschrieben wurde, ist ein Fusionsprotein, das die extrazelluläre Domäne von humanem CD40 enthält, das an die Fc-Region von humanem IgG1 fusioniert ist. Alle Experimente schlossen Kontrollzellen von normalen Erwachsenenspendern ein, und im Fall der Patienten 1, 3 und 4 von nicht betroffenen, altersentsprechenden Männern. Kontrollzellen für Patient 2 schlossen einen altersentsprechenden, rassenentsprechenden Mann ein, bei dem X-gekoppelte Agammaglobulinämie (XLA), ein nicht verwandtes Immundefizit, diagnostiziert wurde. Im Gegensatz zu T-Zellen von Kontrollspendern haben T-Zellen von den Patienten 2, 3 und 4 keinen nachweisbaren CD40L bei Aktivierung durch einen CD3-Antikörper exprimiert. In einigen Experimenten schienen aktivierte T-Zellen von Patient 1 schwach an CD40 zu binden. Die Aktivierung von T-Zellen aus allen 4 Patienten mit immobilisierten CD3 mAb führte jedoch zur Expression der Alphakette des IL-2-Rezeptors (IL-2Rα), eines häufigen T-Zellenoberflächen-Aktivierungsmarkers, mit Pegeln, die mit jenen vergleichbar sind, die auf T-Zellen von Kontrollspendern festgestellt werden. Außerdem zeigten T-Zellen von Hyper-IgM-Patienten normale proliferierende Reaktionen auf PHA oder CD3 mAb plus IL-7. Diese Daten zeigen, dass die T-Zellen von Hyper-IgM-Patienten zwar auf Mitogene oder auf Aktivierung durch ihre T-Zellen-Rezeptoren normal reagieren, sie aber einen Wildtyp-CD40L auf ihren Zelloberflächen nicht exprimieren.
Beispiel 3: Nukleotidsequenzanalyse des CD40L von Hyper-IgM-Patienten
Die Nukleotidsequenz von cDNA aus den Hyper-IgM-Patienten von Beispiel 2 wurde analysiert. Periphere Blutleukozyten (PBL) aus Patienten oder Kontrollspendern wurden von heparinisiertem Vollblut auf Ficol1-Hypaque gereinigt. Danach wurden die Zellen stimuliert, indem sie über Nacht mit immobilisiertem CD3-Antikörper oder PHA immobilisiert wurden. RNA wurde aus der stimulierten PBL unter Verwendung von RNAzol (Biotecx, Houston, TX) extrahiert. Fünf bis zehn μg der Gesamt-RNA wurden in 10 μl Wasser verdünnt und fünf Minuten lang auf 68°C erhitzt. Diesem Gemisch wurden 1 μl RNasin, 2 μl 10X Perkin-Elmer PCR-Puffer, 1 μl 20 mM dNTPs, 2 μl Random-Hexamer-Primer (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und 100 U Reverse-Transkriptase hinzugefügt. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, danach 1 Minute lang bei 37°C und 5 Minuten lang bei 95°C deaktiviert. Die cDNA aus dieser Reaktion wurde als Modell in der PCR unter Anwendung folgender Reaktionsbedingungen verwendet: 5 μl 10X Perkin-Elmer-Puffer, 50 μM dNTPs, 1 μM Primer, 2 μl der cDNA-Reaktion und 1,25 U Taq-Polymerase (Perkin-Elmer) bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 95°C denaturiert, wobei nach der Zugabe der Taq-Polymerase 35 Zyklen von 55°C 1 Minute lang, von 72°C 1 Minute lang und von 94°C 1 Minute lang durchgeführt wurden. Es wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt, um die gesamte cDNA abzudecken. Die Primer, die verwendet wurden, um den 5'-Abschnitt der cDNA zu amplifizieren, waren 5'-CCAGAAGATACCATTTC-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-AGCCCACTGTAACACAG-3' (SEQ ID NO: 2). Die Primer für den 3'-Abschnitt der cDNA waren 5'-CATGTCATAAGTGAGGC-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-CATAAGGAGGATCCTAG-3' (SEQ ID NO: 4). PCR-Fragmente wurden mit Klenow (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgefüllt, auf 1,5% Agarosegels getrennt, und die gereinigten Fragmente wurden in SmaI-cut pTZ19R zur Sequenzierung verbunden. Doppelstrangsequenzierung wurde manuell mit einem Sequenase-Kit (USB, Cleveland, OH) durchgeführt. Automatisierte Sequenzierung wurde auf einem Applied Biosystems Modell 373A Sequenzierer durchgeführt. In diesen Experimenten wurden Kontrollzellen entweder durch nicht betroffene altersentsprechende Kontrollen oder – in allen Fällen – durch mindestens einen normalen Erwachsenenspender bereitgestellt. Außerdem wurde ein männlicher Heranwachsender mit diagnostizierter, X-gekoppelter lymphoproliferativer Erkrankung (XLP), ein nicht verwandtes Immundefizit, als Kontrolle für Patient 1 aufgenommen. Die Nukleotidsequenzanalyse der resultierenden cDNAs zeigte, dass Einzelpunkt-Mutationen in dem CD40L bei drei der vier Hyper-IgM-Patienten auftraten. Um sicherzustellen, dass es sich bei diesen Änderungen um keine während der PCR-Amplifizierung eingeführten Artefakte handelt, wurden alle Reaktionen, einschließlich der anfänglichen cDNA-Synthesereaktion, mindestens doppelt ausgeführt. Jede Nukleotidänderung ist einzigartig, und alle treten in der extrazellulären Domäne des CD40L auf. Diese Änderungen führen zu folgenden Aminosäureveränderungen: Glycin wird bei Position 227 für Patient 1 zu Valin; Leucin wird bei Position 155 für Patient 2 zu Prolin; und Threonin wird bei Position 211 für Patient 3 zu Asparagin. Die CD40L cDNA, die aus Patient 4 erzeugt wurde, schien keine Nukleotidänderungen innerhalb der codierenden Region aufzuweisen. Da die bei diesem Patienten durchgeführte biologische Analyse einen deutlichen Mangel an funktionalem CD40L zeigt, muss ein anderer Mechanismus, der möglicherweise die 5'- oder 3'-nichtcodierenden Sequenzen einschließt, für die Abwesenheit des CD40L auf den T-Zellen von Patient 4 verantwortlich sein. In den CD40L cDNAS der Kontrollproben, welche den XLP-Patienten einschlossen, wurden keine Nukleotidveränderungen festgestellt.
Beispiel 4: stellengerichtete Mutagenese der CD40L cDNA
Um zu überprüfen, ob die in Beispiel 3 nachgewiesenen Nukleotidveränderungen sich auf die Expression des CD40L oder seine Fähigkeit, an CD40 zu binden, ausgewirkt haben, wurden die zwei Nukleotidveränderungen, die in Patient 1 und Patient 2 von Beispiel 2 gefunden wurden, getrennt in einen Säugetier- Expressionsvektor, der die vollständige codierende Region des humanen CD40L enthielt, unter Verwendung von stellengerichteter Mutagenese eingeführt. Ein Klonierungsvektor, der humane CD40L-Sequenz enthält, mit der Bezeichnung hCD40L, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) am 6. Dezember 1991 unter der Zugriffsnummer 68873 hinterlegt. Mit Hilfe des Genspleißens durch Überlappungsextensions (SOEing)-Verfahren (Horton et al., BioTechniques 8: 528, 1990) wurden Mutanten erzeugt. Der Primer, der für die Wiedererschaffung der Mutation, die in Patient 1 gefunden worden war, verwendet wurde, war 5'-TGCGGGCAACAATCCATTCACTTGGGAGTATTTGAATTTGCAA (SEQ ID NO: 5). Der Primer, der für die Wiedererschaffung der Mutation, die in Patient 2 festgestellt worden war, verwendet wurde, war 5'-CCATGAGCAACAACTTGGTAACCCCGGAAAATGGGAAACAGC (SEQ ID NO: 6). Der Rest dieser notwendigen Primer wurde aus der CD40L-Sequenz erzeugt (beschrieben in USSN 07/969,703 und in Armitage et al., Nature 357: 80, 1992 und Spriggs et al., 7. Exp. Med. 176: 1543, 1992). Die resultierenden Vektoren wurden als Mutant 1 bzw. Mutant 2 bezeichnet. Die Einführung der entsprechenden Nukleotidänderung wurde in den tatsächlichen Expressionsvektoren durch Sequenzanalyse der gesamten codierenden Region bestätigt. Die humane embryonale Nieren-Zelllinie 293 wurde mit Vektoren transfiziert, welche entweder die Wildtyp- oder die mutagenisierten CD40Ls trugen, und am Tag 3 nach der Transfektion wurden die Zellen metabolisch mit ³⁵S Trans-Label (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) radioaktiv markiert. Zelllysate wurden hergestellt und auf Expression von CD40L-Protein durch Fällung mit einem polyklonalen Serum, das gegen CV1/EBNA-Zellen gerichtet war, welche den humanen CD40L exprimieren, oder mit CD40.Fc untersucht. Zellen, die mit dem Wildtyp-CD40L transfiziert wurden, exprimierten ein 33 kD-Protein, das leicht mit Hilfe von CD40.Fc gefällt werden kann. Im Gegensatz dazu exprimierten die Zellen, die mit einer der mutanten Form von CD40L transfiziert wurden, kein Protein, das von CD40.Fc erkannt wird. Die Immunfällung identischer Lysate mit Hilfe von polyklonalem Antiserum führte jedoch zur Erkennung eines 33 kD-Proteins aus mutierten und Wildtyp-transfizierten Zellen. Dieses Protein comigrierte mit dem CD40L-Protein, das durch CD40.Fc erkannt wird und war nicht in Lysaten vorhanden, die mit dem Vektor alleine transfiziert wurden. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigte die Northern-Blot-Analyse ähnliche Pegel an CD40L-spezifischer RNA sowohl in Wildtyp- als auch Mutanten-transfizierten Zellen.
Die transfizierten Zellen wurden auch durch Flusszytometrie-Analyse untersucht. Die Zellen, die mit einer der mutanten Formen von CD40L transfiziert wurden, waren für CD40.Fc-Bindung komplett negativ, während Zellen, welche den Wildtyp-CD40L exprimierten, eine starke CD40.Fc-Bindung aufwiesen. Um die biologische Aktivität der mutierten CD40L-Proteine zu adressieren, wurden mit Wildtyp- oder mutagenisierten CD40Ls transfizierte Zellen auf ihre Fähigkeit hin geprüft, Proliferation und IgE-Absonderung von gereinigten Tonsille-B-Zellen herbeizuführen, die mit IL-4 co-kultiviert wurden. Im Gegensatz zu Zellen, die mit einem Wildtyp-Liganden (Tabelle 1) transfiziert wurden, waren Zellen, die eine der Formen des mutagenisierten CD40L exprimieren, nicht imstande, B-Zellen-Proliferation oder IgE-Absonderung herbeizuführen, was die Abwesenheit von funktionalem CD40L auf deren Zelloberfläche bestätigt.
Tabelle 1: Mutagenisierte CD40-Liganden sind nicht biologisch aktiv
Beispiel 5: B-Zellen von Hyper-IgM-Patienten reagieren normal auf Wildtyp-CD40L
Um die Fähigkeit von X-gekoppelten Hyper-IgM-B-Zellen, auf Wildtyp-CD40L zu reagieren, zu adressieren, wurden Proliferations- und Isotypen-Absonderungstests durchgeführt. T-abgereicherte periphere Blutmononuklearzellen (PBMC) (B-Zellen angereicherte Populationen) von allen vier Patienten aus Beispiel 2 wiesen eine proliferierende Reaktion auf CD40L auf, die mit jener vergleichbar ist, die bei ähnlich gereinigten PBMC aus Kontrollspendern festgestellt wurde. Im Gegensatz dazu kam es bei den T-Zellen-abgereicherten Kulturen von PBMC, die von dem XLA-Patienten erhalten wurden, zu keiner solchen proliferierenden Reaktion, was mit dem Faktum übereinstimmt, dass die XLA-Erkrankung durch die praktische Abwesenheit von zirkulierenden, reifen B-Lymphozyten gekennzeichnet ist.
Vorhergehende Arbeiten haben gezeigt, dass die Kultur von Einzelspender-PBMC in der Gegenwart von IL-4 zur Erzeugung von IgE führt (IgE-Sekretion von 1 × 10⁵ unfraktionierten bis T-abgereichere PBMC wurde nach 10 Tagen Kultur mit 5 ng/ml IL-4 bestimmt, gemeinsam mit 200 ng/ml G28-5-Antikörper (monoklonaler Antikörper zu CD40, erhalten von Dr. E. A. Clark, University of Washington, Seattle, WA) oder von 1 × 10⁴ fixierten CV1/EBNA-Zellen, die nur mit einem Vektor oder humanem CD40L transfiziert wurden). Herstellung von PBMC und Bestimmung von sekretierten IgE-Konzentrationen wurde, wie in Fanslow et al., J. Immunol. 149: 655, 1992, beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind als mittlere +/– SEM von Dreifachkulturen ausgedrückt. PBMC von normalen Spendern (Kontrollgruppen 1, 3 und 4) ergaben messbare Mengen an IgE, wenn sie mit IL-4 (Tabelle 2) kultiviert wurden. Im Gegensatz dazu konnte bei den vier Hyper-IgM-Patienten, die unter denselben Bedingungen kultiviert wurden, keine IgE-Produktion nachgewiesen werden. Signifikanterweise hat in 3 von 4 Fällen (Patienten 1, 2 und 4) die Zugabe von rekombinantem CD40L oder des CD40 mAb, G28-5, zu Kulturen, welche die PBMC von Hyper-IgM-Patienten enthielten, deren Fähigkeit wiederhergestellt, IgE zu sekretieren. Ebenso sekretierten die T-abgereicherten PBMC (B-Zellen angereicherte Kulturen) von diesen drei Patienten und von allen geprüften Kontrollen IgE in der Gegenwart von IL-4, plus entweder rekombinantem CD40L oder G28-5 Antikörper (Tabelle 2). Im Fall von Patient 3 wurde in mit IL-4 und rekombinantem CD40L oder G25-8-Antikörper kultivierten PBMC kein IgE nachgewiesen. Der Grund für diese Ergebnisse ist unklar. Zusätzliche PBMC waren von diesem Patienten nicht verfügbar; daher war es nicht möglich, festzustellen, ob diese mangelnde Reaktion reproduzierbar oder auf experimentelle Schwankungen zurückzuführen war.
Tabelle 2: PBMC von Hyper-IgM-Patienten können IgE absondern
Beispiel 6: Nukleotidsequenzanalyse des CD40L-Gens
Die Nukleotidsequenz des CD40L-Gens wird mit Hilfe einer genomischen Bibliothek bestimmt, die aus humanen Zellen hergestellt wird. Klone aus der genomischen Bibliothek werden mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen, um Restriktionsfragmente zu bilden, die elektrophoretisch getrennt werden können. Die elektrophoretisch getrennten Restriktionsfragmente werden durch Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von Oligonukleotidsonden analysiert, die 30 bis 40 Oligonukleotide lang sind und aus verschiedenen Abschnitten der codierenden Region des CD40L hergestellt sind. Überlappende Fragmente werden bestimmt und sequenziert; die Sequenzierung wird auf ausreichenden Fragmenten durchgeführt, um die gesamte codierende Region des CD40L zu erfassen. PCR-Sonden können auf der Grundlage der Sequenzen der Regionen hergestellt werden, welche die Intron-Exon-Grenze für alle Exons flankieren. Die PCR-Sonden werden in einer Weise verwendet, die jener von Beispiel 3 ähnelt, um zu bestimmen, ob es in den Sequenzen einer nichtcodierenden Region, die in CD40L genomischem Material vorhanden ist, Anomalien gibt. Eine solche Analyse ist zum Beispiel beim Analysieren von genomischem Material aus Zellen nützlich, die durch Amniozentese oder Chorionzottenbiopsie von einem Fötus erhalten wurden. Die auf diese Weise erhaltenen PCR-Sonden werden auch bei der Analyse von genomischem Material nützlich sein, so wie dies erforderlich sein kann, wenn in der codierenden Region eines CD40L-Gens keine Anomalien nachgewiesen werden.
Beispiel 7: Erzeugung von CD40L-Knockout-Mäusen
Die Art des hergestellten DNA-Konstruktes wird als „Ersatztyp"-Vektor klassifiziert, wobei ein positiv selektierbarer Marker (das vom Maus-PGK-1-Promotor getriebene Neomycinresistenzgen) auf beiden Seiten von Regionen flankiert wird, die zum Zielgen (CD40-L) homolog sind. Solche Vektoren wurden gestaltet, um ein Wildtyp-Allel durch die geänderte Version mit Hilfe homologer Rekombination durch ein doppeltes reziprokes Crossover-Ereignis zu ersetzen, das die Vektorsequenzen involviert, die zum Ziel homolog sind. Im Gegensatz dazu geht man davon aus, dass eine Zufallsintegration das gesamte Molekül aufnimmt. Um die Effizienz des Targeting zu steigern, wurde daher ein negativer Selektionsmarker (das HSV-Thymidinkinase- oder TK-Gen) in den Vektor am Ende einer Homologieregion eingefügt.
Nachdem ein Targetingvektor in die embryonalen Stammzellen eingeführt wurde, wurde eine Positiv-Negativ-Auswahl (PNS) gestartet. Das Neomycinresistenzgen überträgt dem G418 Resistenz, während das Produkt des HSV-TK-Gens zur Transformation von Gancyclovir in eine toxische Verbindung führt. Auf diese Weise überlebten in der Theorie Zellen, welche einer homologen Rekombination unterzogen wurden, beide Selektionen. Dieses Schema für die Vektorkonstruktion und PNS ist gut eingeführt (Mansour et. al. 1988, Nature, 336: 348–352).
Um die Konstruktion eines Gentargeting-Vektors für den CD40L zu erleichtern, wurde eine genomische Maus-DNA-Bibliothek aus dem Strang 129SV (Stratagene, Cat#946305) mit einer radioaktiv markierten Maus-CD40L-cDNA-Sonde, welche die gesamte codierende Region enthielt, untersucht (Armitage et. al. 1992, Nature, 357: 80–82 und USSN 07/969,703). Sechs Klone wurden isoliert und zwei, die als λ₁ und λ₂ bezeichnet werden, wurden zur weiteren Analyse auf der Grundlage des Nachweises analysiert, dass sie überlappten und jeder einen beträchtlichen Abschnitt des Gens enthielt. Eine Restriktionskarte sowie die Exon-Position und Größen wurden mit Hilfe von Standardmethoden bestimmt und sind in 1 dargestellt.
Ein 6,8 Kb BamH1-Spe1-Fragment von λ2 wurde in pGEM11 subkloniert, das mit BamH1+Xba1 aufgeschlossen wurde. Das resultierende Plasmid, pλ2-6.8BS wurde mit BamH1 aufgeschlossen und die Enden durch Behandlung mit Klenow-Fragment abgestumpft. Ein abgestumpftes 1,5 Kb EcoR1-BamH1 Fragment von pPGK/Neo(WT)A- wurde eingefügt, wodurch p6.8Neo geschaffen wurde. Dieses Konstrukt wurde mit Xho1 aufgeschlossen, mit Klenow-Fragment abgestumpft, und ein 2,0 Kb abgestumpftes Hind3-Asp718 Fragment von λ1 wurde eingefügt. Das resultierende Plasmid p6.8NeoHA wurde mit Xho1 aufgeschlossen, und ein 2,0 Kb Xho1-Sal1 Fragment von pTGX105-9 (enthaltend das HSV-TK-Gen) wurde eingefügt, um pHRV-mCD40L#1 zu erzeugen.
pHRV-mCD40L#1 würde bei homologer Rekombination zu einem CD40L-Allel führen, dem nur Exon 4 fehlt. Eine weiterführende Analyse hat ergeben, dass diese Mutation unter Umständen die Funktion des CD40-L-Gens nicht vollständig abgeschafft hat. Daher wurde auch Exon 3 auf folgende Weise entfernt. pλ2-6.8BS wurde mit Spe1 + BamH1 aufgeschlossen, und ein resultierendes 7,7 Kb-Fragment wurde gereinigt. Dieses wurde mit einem 5,5 Kb BamH1-Xba1-Fragment von pHRV mCD40L#1 verbunden, um pHRV-mCD40L#2 zu schaffen. Dieser Vektor sollte bei homologer Rekombination zu einem mutierten CD40L-Allel führen, dem sowohl Exon 3 als auch Exon 4 fehlt.
pHRV-mCD40L#2 wurde in embryonale Stammzellen bei 200 V und 960 μF elektroporiert. Zellen wurden auf einer Zubringlage von gammabestrahlten, neomycinresistenten STO-Zellen, die den Leukämiehemmfaktor (LIF) exprimieren, kultiviert. Die Zellen wurden ungefähr 10 Tage lang in 175 μg/mL G418 + 2mM Gancyclovir selektiert. Danach wurden Klone einzeln plattiert und mittels PCR in Pools von 5 Klonen analysiert. PCR wurde mit dem CD40L-spezifischen Primer TGX106.19 (5'-GGCAAGGTCAAGCTCATCC-3'; SEQ ID NO: 9) in Verbindung mit dem Gegensinn-Neomycinresistenzgenprimer TGX63.20 (5'-GATATTGCTGAAGAGCTTGG-3'; SEQ ID NO: 10) ausgeführt. Insgesamt 800 doppelt resistente Klone (680 in der 129SV-abgeleiteten ES-Linie, AB1 und 120 in der C57BL/6-abgeleiteten ES-Linie B22) wurden so auf homologe Rekombinationsereignisse hin gescreent. Es wurden keine positiven Klone identifiziert.
Nach mehreren erfolglosen Versuchen mit pHRV-mCD40L#2 wurde ein drittes Plasmid mit einer längeren Homologieregion zum 3'-Ende des CD40-L-Gens hergestellt. pHRV-mCD40L#2 wurde mit Xba1 und Xho1 aufgeschlossen, und ein 4,7 Kb-Fragment wurde in pGEMl1 subkloniert, um pHRV2-4.7XX zu erzeugen. Ein 1,9 Kb Hind3-Sal1-Fragment wurde mit einem 2,7 Kb Hind3-Sal1-Framgent von λ2 ersetzt. Dieses Plasmid wurde pHRV2-5.5XS benannt. Ein 0,7 Kb Asp718-Sal1-Fragment wurde mit einem 10,3 Kb Asp718-Sal1-Fragment von λ1 ersetzt, um pHRV2-l5XS zu erzeugen. Dieses Plasmid wurde in der Folge mit Sal1 aufgeschlossen, und ein 2,0 Kb Xho1-Sal1-Fragment von pTGX105-9 (enthaltend das HSV-TK-Gen) wurde eingefügt. Dies führte zu pHRV-mCD40L#3, der bei der American Type Culture Collection (ATCC) gemäß den Bedingungen des Budapester Abkommens vom 19. Januar 1993 unter der ATCC-Zugriffsnummer hinterlegt wurde. Homologe Rekombination mit pHRV-mCD40L#3 führt zur selben Mutation wie pHRV-mCD40L#2, nämlich dem Entfernen von Exon 3 und Exon 4.
pHRV-mCD40L#3 wurde elektroporiert und ES-Zellen so wie zuvor beschrieben ausgewählt. PCR-Screening wurde mit Hilfe des CD40L-spezifischen Primers TGX124.19 (5'-GTATGTGGCTGAACACCTG-3'; SEQ ID NO: 11) und des Gegensinn-PGK/Neo-Primers TGX53.18 (5'-CTTGTGTAGCGCCAAGTG-3'; SEQ ID NO: 12) durchgeführt. Insgesamt 1191 doppelt resistente Klone (760 in AB1, 231 in B22 und 200 in einer 129SV-abgeleiteten ES-Linie D3) wurden erhalten. Mehrere positive wurden identifiziert und einer karyotypischen Analyse unterzogen, wobei ein Klon in der D3-Linie, D3 CD40L3#9-72, einen normalen Karyotyp aufwies.
Gerichtete Mutation des CD40L-Gens wurde durch genomische Southern-Blot-Analyse überprüft. Genomische DNAs von D3 CD40L3#9-72 und Wildtyp-D3 wurden mit Pst1 aufgeschlossen, in Agarose elektrophoresiert, zu Nitrozellulose geblottet und mit einem radioaktiv markierten 400bp Xba1-Pst1-Fragment sondiert, welches unmittelbar stromaufwärts des 5'-Terminus von pHRVmCD40L#3 liegt. Diese Sonde hybridisierte mit einem 9,0 Kb Pst1-Fragment in dem Wildtyp-D3-Genom. Gentargeting führte jedoch eine neue Pst1-Stelle (in PGK/Neo) 2,2 Kb 3' von der 5'-Pst1-Stelle ein. Somit hybridisierte nur ein 2,2 Kb Pst1-Fragment mit der Sonde in dem D3-CD40L3#9-72-Genom.
D3-CD40L3#9-72-Zellen wurden in Tag 3,5 Blastozysten von C57B1/6-Mäusen injiziert, die eine schwarze Fellfarbe aufweisen. Injizierte Blastozysten wurden in pseudoschwangeren weiblichen Schweizer-Webster-Mäusen zu Ende getragen. D3 CD40L3#9-72 wurden in ES-Zellen geschaffen, die vom 129SV-Strang abgeleitet wurden, der eine schwarze Agouti (braun) Fellfarbe hat. Chimäre Nachkommen wurden durch die Gegenwart einer gemischten Fellfarbe (schwarz und braun) identifiziert. Männliche Chimären wurden mit Wildtyp-C57BL/6-Weibchen gepaart. Keimlinienübertragung des mutierten CD40-L-Allels wurde durch die Gegenwart von weiblichen schwarz-agouti-Nachkommen identifiziert. Diese Weibchen sind am CD40-L-Locus heterozygot.
Heterozygote Weibchen wurden mit männlichen Wildtyp-C57BL/6-Mäusen gepaart. Gemäß den standardmäßigen Mendel'schen Gesetzen der Genetik, geht man davon aus, dass 50% aller männlichen Nachkommen für die CD40-L-Mutation hemizygot sind und somit erwartet würde, dass sie einen Hyper-IgM-Phänotyp aufweisen. Hemizygote Männchen werden mit heterozygoten Weibchen gepaart, um den Strang zu perpetuieren. Zusätzlich kann ein kongenetischer 129SV-Strang, der das mutierte CD40-L-Allel aufweist, zum Beispiel durch Rückkreuzung heterozygoter Weibchen zu Wildtyp-129SV-Männchen entwickelt werden. Alternativ dazu werden männliche Chimären, die das mutierte CD40-L-Gen effizient übertragen, mit 129SV-Weibchen gepaart. Keimlinienübertragung des mutierten X-Chromosoms würde zu heterozygoten 129SV-Weibchen führen, welche mit Wildtyp-129SV-Männchen gepaart werden, um hemizygote 129SV-Männchen zu erhalten, die den mutierten CD40-L aufweisen. Die hemizygoten männlichen 129SV-Mäuse werden mit heterozygoten 129SV-Weibchen gepaart, um homozygote Weibchen hervorzubringen.
Der Allelzustand (d. h. Wildtyp vs. heterozygot vs. homozygot mutiert (hemizygot mutiert in Männchen)) wird mit einem einfachen PCR-Schema bestimmt, das in 3 beschrieben ist. DNA aus einer Gewebeprobe (Blut- oder Ohrbiopsieprobe) wird einer PCR-Amplifizierung mit Hilfe von vier Primern unterzogen. TGX157.23 (5'-CCCAAGTGTATGAGCATGTGTGT-3'; SEQ ID NO: 13) und TGX156.23 (5'-GTTCCTCCACCTAGTCATTCATC-3'; SEQ ID NO: 14) sind für eine Region auf dem CD40-L-Gen nur 3' von Exon 4 spezifisch und amplifizieren ein 250bp-Fragment. Diese Region wurde in dem mutierten Allel gestrichen. Neo1 (5'-GCCCTGAATGAACTGCAGGACG-3'; SEQ ID NO: 15) und Neo2 (5'-CACGGGTAGCCAACGCTATGTC-3'; SEQ ID NO: 16) sind für das 3'-Ende des Neomycinresistenzgens spezifisch. Diese Primer amplifizieren ein 500bp-Fragment, das für das mutierte Allel spezifisch ist. Die Gegenwart des mutierten Allels wird durch Southern-Blot-Analyse, so wie im Wesentlichen oben beschrieben, bestimmt.
Ein heterozygotes Weibchen wurde erhalten und ihr Allel-Zustand gemäß dem oben beschriebenen und in 2 dargestellten PCR-Schema analysiert. Das Weibchen wurde mit einem Wildtyp-C57BL/6-Männchen gepaart, so wie zuvor beschrieben. Eine Probe von einem potentiell hemizygoten männlichen Nachkommen davon wurde, wie oben beschrieben und in 3 dargestellt, analysiert; die Ergebnisse der Analyse zeigten, dass Exon 3 und Exon 4 vom CD40-L-Gen abwesend waren, was darauf hindeutete, dass die Maus hemizygot war.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines löslichen, multimeren CD40-Liganden bei der Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe von Hyper-IgM, wobei das Hyper-IgM auf einem Defekt im Gen-codierenden CD40-Liganden beruht.
Verwendung eines löslichen, multimeren CD40-Liganden bei der Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe oder Behandlung erhöhter Pegel an Serum-IgM und verringerter Pegel anderer Immunglobulin-Isotypen, wobei die erhöhten Pegel an Serum-IgM auf einem Defekt im Gen-codierenden CD40-Liganden beruht.
Verwendung eines löslichen, multimeren CD40-Liganden bei der Herstellung eines Medikaments für die Propyhlaxe oder Behandlung eines kombinierten, variablen Immundefizitsyndroms, wobei das kombinierte, variable Immundefizitsyndrom auf einem Defekt im Gen-codierenden CD40-Liganden beruht.
Verwendung eines löslichen, multimeren CD40-Liganden bei der Herstellung eines Medikaments zur Herbeiführung der Absonderung von Immunglobulin-Isotypen von aktivierten B-Zellen in einem Individuum, das einen Defekt bei der Expression eines funktionalen CD40L aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, wobei es sich bei dem löslichen, multimeren CD40-Liganden um ein Fusionsprotein handelt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus einem Fusionsprotein besteht, das eine extrazelluläre Region des CD40-Liganden und eine Fc-Region eines menschlichen Immunglobulins aufweist, sowie aus einem Fusionsprotein, das eine extrazelluläre Region des CD40-Liganden und ein Multimer-bildendes Peptid aufweist.