DE69233051T2 - Antikörper gegen CD40-L - Google Patents

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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen CD40-L.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Cytokine mit einer "Interleukin"-Kennzeichnung sind jene Proteinfaktoren, welche Immuneffektorzellen beeinflussen. Es wird von Cytokinen berichtet, die mit Interleukin-1 bis Interleukin-12 bezeichnet werden, und als ein Interleukin benannt werden. Andere bekannte Cytokine umfassen den Tumornekrosefaktor (TNF), den Granulocyten-Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (GM-GSP), den Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), den Mastzellenwachstumsfaktor (MGF), den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den von Blutblärtchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), den Nervenwachstumsfaktor (NGF), Erythropoietin (EPO), γ-Interferon (γ-IFN) und andere.
  • DNAs für zwei unterschiedliche TNF-Rezeptoren (Typ I und Typ II) wurden geklont (Smith et al., Science 248: 1019, 1990; und Schall et al., Cell 61: 361, 1990). Beide Formen des TNF-Rezeptors sind miteinander verwandt und gehören zu einer Familie von Rezeptoren, deren Mitglieder den Nervenwachstumsfaktorrezeptor (Johnson et al., Cell 47: 545, 1986), das B-Zellen-Antigen CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989), das T-Zellen-Antigen OX40 (Mallett et al., EMBO J. 9: 1063, 1990), das menschliche Fas-Antigen (Itoh et al., Cell 66: 233, 1991) und den Mäuse-Rezeptor 4-IBB (Kwon et al., Cell. Immunol. 121: 414, 1989 [Kwon et al.I] und Kwon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1963, 1989 [Kwon et al. II]) umfassen.
  • Das menschliche CD40-Protein (CD40) ist ein Peptid von 277 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 30.600, und einem Sekretionssignalpeptid mit 19 Aminosäuren, das hauptsächlich hydrophobe Aminosäuren umfasst (Stamenkovic et al.). Das Molekulargewicht (ohne Glykosylation) des reifen menschlichen CD40-Proteins beträgt 28.300. Ein cDNAcodierendes menschliches CD40 wurde aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, welche aus der Burkitt Lymphzellenlinie Raji hergestellt worden war. Das von der CD40 cDNA codierte putative Protein enthält eine putative Leader-Sequenz, eine transmembranische Domäne und zahlreiche andere Merkmale, welche membangebundenen Rezeptorproteinen eigen sind. Es hat sich gezeigt, dass CD40 an B-Lymphozyten, Epithelzellen ud einigen Krebszelllinien exprimiert wird.
  • Es wurde gezeigt, dass ein gegen CD40 gerichteter monoklonaler Antikörper (mAb) verschiedene funktionale Effekte der menschlichen B-Zellen vermittelt. Zu diesen Effekten gehören: (a) homotypische Adhäsionen (Gordon et al., J. Immunol. 140: 1425, 1988 [Gordon et al. I]); (b) erhöhte Zellgröße (Gordon et al. I und Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989); (e) Proliferation von B-Zellen, die mit Anti-IgM, Anti-CD20 mAb, Phorbolester allein (Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; und Paulie et al., J. Immunol. 142: 590, 1989) oder Phorbolester kombiniert mit Interleukin-4 (Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987 [Gordon et al. II]; und (d) Produktion von IgE (Jabara et al., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Zhang et al., J. Immunol. 146: 1836, 1991) und IgM (Gascan et al., J. Immunol. 147: 8, 1991) von mit Interleukin-4 (IL-4) stimulierten T-verarmten Kulturen aktiviert wurden.
  • Es wurde gefunden, dass ein solcher Antikörper mit der Bezeichnung mAb 89 von Banchereau et al., Clin. Immunol. Spectrum 3: 8, 1991 [Banchereau et al. I] eine Proliferation von menschlichen B-Zellen bei einer relativ niedrigen Antikörperkonzentration (30 ng/ml oder etwa 10–10 M induziert. Die Proliferation dauerte zwei bis drei Wochen und führte zu einem zehnfachen Anstieg der Population der menschlichen B-Zellen. Eine optimale Stimulation der B-Zellen trat dann auf, wenn das CD40 Oberflächenmolekül durch IgM quervernetzt wurde. Fab-Fragmente eines anderen Anti-CD40 mAb induzierten nur eine schwache Prolifationsreaktion. Banchereau et al., Science 152: 70, 1991 [Banchereau et al. II] berichten, dass ruhende menschliche B-Zellen in eia Stadium fortwährender Proliferation eintraten, als sie mit einer fibroplastischen Ltk-Mäusezelllinie, welche mit menschlichem Fc-Rezeptor transfektiert wurde, und mit einem für menschliches CD40 spezifischen monoklonalen Antikörper inkubiert wurden. Banchereau et al. Π fand heraus, dass eine Quervernetzung von CD40 für die klonale Expansion von B-Zellen notwendig ist.
  • CD23 ist ein IgE-Rezeptor mit geringer Affinität, von dem man herausgefunden hat, dass er auf den meisten reifen IgM/IgD B-Zellen, aber nicht auf T-Zellen exprimiert wird. CD23 wurde sequenziert, und diese Sequenz ist in Kikutani et al., Cell 47: 657, 1986, beschrieben. Es wurde gefunden, dass das lösliche CD23 (sCD23) eine pyrogene Reaktion in Kaninchen hervorruft, und dass diese Reaktion durch Verabreichung von menschlichem IgE (Ghaderi et al., Immunology 73: 510, 1991) beseitigt wurde. Daher kann CD23 ein geeigneter Marker für die Auswirkungen von löslichem CD40 oder CD40-L sein.
  • Vor der vorliegenden Erfindung war kein Ligand für CD40 bekannt. Es besteht daher ein Bedarf in diesem Bereich, einen CD40-Liganden (CD40-L) zu finden und zu charakterisieren.
  • ZUSSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte monoklonale Antikörper nach Anspruch 1 und Anspruch 2.
  • Ein Cytokin, das im folgenden als "CD40-L" bezeichnet wird, wurde isoliert und charakterisiert. Die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz der repräsentativen Mäuse-CD40-L cDNA ist in der SEQ-ID Nr. 1 und 1 offenbart, und die Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ-ID Nr. 2 angeführt. Die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der representativen menschlichen CD40-L cDNA sind in der SEQ-ID Nr. 11 und in 2 offenbart, und die Aminosäuresequenz ist ebenfalls in der SEQ-ID Nr. 12 angeführt. Weitere CD40-L Polypeptide können von Nucleotidsequenzen codiert werden, welche unter mäßig oder stark stringenten Bedingungen zu Sonden hybridisieren, die durch die SEQ-ID Nr. 11 definiert werden (die codierende Region des menschlichen CD40-L), wobei sich Fragmente der Sequenz vom Nucleotid 46 zum Nucleotid 828 der SEQ-ID Nr. 11 erstrecken, oder zu DNA- oder RNA-Sequenzen, welche komplementär zu 2 (SEQ-ID Nr. 11) oder Fragmenten davon sind.
  • CD40-L ist ein Membranpolypeptid vom Typ II mit einer extrazellulären Region am C-Terminus, sowie einer transmembranen Region und einer intrazellulären Region am N-Terminus. Eine lösliche Version des Mäuse-CD40-L wurde in Überständen von EL-4-Zellen sowie EL-4-Zellen, welche auf der Grundlage eines hierin beschriebenen biotinylierten CD40/Fc Fusionsproteins sortiert wurde, gefunden. Lösliches CD40-L umfasst eine extrazelluläre Region von CD40-L oder einem Fragment davon. Die Proteinsequenz von Mäuse-CD40-L ist in 1 und in der SEQ-ID Nr. 2 beschrieben, und menschliches CD40-L ist in 2 und der SEQ-ID Nr. 12 beschrieben. Die extrazelluläre Region des Mäuse-CD40-L erstrreckt sich von der Aminosäure 47 bis zur Aminosäure 260 in 1 und SEQ-ID Nr. 2, und jene des menschlichen CD40-L erstreckt sich von der Aminosäure 47 bis zu Aminosäure 261 in 2 und der SEQ-ID Nr. 12. Die biologische Aktivität von CD40-L wird durch Anbindung dieses Cytokins an CD40 ermöglicht und umfasst eine B-Zellen-Proliferation und eine Induktion einer Antikörper-Abscheidung, einschließlich einer IgE-Sekretion.
  • Die Erfindung schafft CD40-L Peptidfragmente, welche einer Proteinsequenz von mindestens 10 Aminosäuren entsprechen, die aus der durch die SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 11 codierten Aminosäuresequenz ausgewählt werden, welche als Immunogene wirken können, um Antikörper für die CD40-L Immunogene zu erzeugen. Solche CD40-L Immunogenfragmente können als Antigen-Determinanten bei der Schaffung monoklonaler Antikörper für CD40-L dienen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt Nucleotid- und Aminosäuresequenzen, welche dem Mäuse-CD40-L entsprechen. Dieses Protein ist ein Polypeptid vom Typ II, dessen N-Terminus seine intrazelluläre Domäne ist, gefolgt von einer transmembranen Region, und einer extrazellulären Domäne am C-Terminus des Polypeptids. Die extrazelluläre Domäne, welche länger ist als entweder die intrazelluläre Domäne oder die transmembrane Region, enthält eine potentielle Nverlinkte Glycosylationsstelle und zwei potentielle Disulfidbindungen bei vier Cystein-Rückständen (Cys).
  • 2 zeigt Nucleotid- und Aminosäuresequenzen, welche dem menschlichen CD40-L entsprechen. Dieses Protein ist ein Polypeptid vom Typ II, dessen N-Terminus sich an seiner intrazellulären Domäne befindet, gefolgt von einer transmembranen Region, und einer extrazellulären Domäne am C-Terminus des Polypeptids. Die extrazelluläre Domäne, welche länger ist als entweder die intrazelluläre Domäne oder die transmembrane Region, enthält eine potentielle N-verlinkte Glycosylationsstelle und 2 potentielle Disulfidbindungen bei 5 Cystein-Rückständen (Cys).
  • 3 zeigt einen Vergleich von Proteinsequenzen des CD40-L von Menschen und von Mäusen, der eine Homologie von 77,7% auf der Aminosäureebene zeigt.
  • 4 zeigt die Proliferation von einkernigen Zellen (PBMC) des peripheren Blutes, welche von T-Zellen entleert wurden, wobei die Proliferation durch die Inkubation mit CV1-Zellen verursacht wurde, transfektiert mit Mäuse-CD40-L cDNA voller Länge (SEQ-ID Nr. 1) und welche gebundenes CD40-L (CD40-L-CV1 Zellen) exprimieren, im Vergleich zu CV1 Zellen, die mit leerem Vektor (HA VEO) transfektiert wurden und kein gebundenes Mäuse-CD40-L exprimieren. Die Ergebnisse der Proliferation am Tag 7 zeigen, dass CD40-L-CV1-Zellen die Proliferation von T-Zellen entleertem PBMC bei Vorhandensein oder Fehlen von Interleukin-4 (IL-4) wesentlich erhöhen.
  • 5 zeigt eine zweite Bestimmung der Proliferation von T-Zellen entleertem PBMC mit Zugabe von gebundenem Mäuse-CD40-L und 10 ng/ml IL-4. Diese Daten zeigen keinen co-mitogenen Effekt von IL-4, sondern einen fortwährenden starken mitogenen Effekt des gebundenen CD40-L.
  • 6 zeigt, dass gebundenes CD40-L die IgE-Sekretion verstärkt.
  • 7 zeigt, dass membranengebundenes CD40-L den CD23-Ausfall bei Vorhandensein von IL-4 stimuliert.
  • 8 zeigt die Proliferation von B-Zellen der Mäusemilz, verursacht durch membranengebundenes CD40-L oder 7A1-Zellen, wobei es sich um einen Helfer-T-Zellen-Klon handelt.
  • 9 zeigt einen Vergleich zwischen Mäuse-EL40.9-Zellen, einer gereihten Zelllinie, welche auf der Basis der Expression von Mäuse-CD40-L und T-Zellen-7A1 für die Induktion einer Antigen-spezifischen Reaktion, angezeigt durch Plaque-bildende Zellen (PFC) durch rote Anti-Schaf-Blutzellen (SCBC) sortiert wurden.
  • 10 zeigt einen Vergleich zwischen der Proliferationsaktivität von B-Zellen von membranengebundenem CD40-L und anderen mit unterschiedlichen cDNAs transfektierten Zelltypen. Membranengebundenes CD40-L wies eine wesentlich höhere B-Zellen-Proliferationsaktivität auf als ein Helfer-Zellklon oder andere Kontrollzellen.
  • 11 zeigt, dass 7C2-Zellen (ein Helfer-T-Zellen-Klon) und CV1-Zellen, welche mit Mäuse-CD40-L cDNA transfektiert wurden, Plaque-bildende Anti-SRBC-Zellen induzieren.
  • 12 zeigt einen Vergleich zweier Helfer-T-Zellen-Klone mit Zellen, welche membranengebundenes CD40-L exprimieren, zum Induzieren einer Mäuse-B-Zellen-Proliferation.
  • 13 zeigt die Induktion Antigen-spezifischer Plaque-bildender Zellen durch membranengebundenes CD40-L und einen Helfer-T-Zellen-Klon bei Vorhandensein oder Fehlen von zugefügtem Interleukin-2 (IL-2).
  • 14 zeigt Effekte der membranengebundenen, CD40-L stimulierenden B-Zellen-Proliferation und IgE-Sekretion. Die Effekte des membranengebundenen CD40-L wurden durch den CD40-Rezeptor, nicht aber durch den TNF-Rezeptor verhindert.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Polypeptide, die als Ligand für CD40 von Mäusen oder Menschen dienen können, wurden isoliert und sequenziert. Insbesondere wurden cDNAs, welche diese Liganden codieren, geklont und sequenziert. Des weiteren werden Methoden zum Exprimieren von rekombinanten CD40-L-Polypeptiden geschaffen. CD40-L Polypeptide umfassen andere Formen von Säugetier-CD40-L, wie zum Beispiel Derivate oder Analoge von menschlichem oder Mäuse-CD40-L. CD40-L von Mäusen oder Menschen umfasst eine extrazelluläre Region mit 214 bzw. 215 Aminosäuren am e-Terminus des membranengebundenen Polypeptids voller Länge. Die extrazelluläre Region enthält die Domäne, welche CD40 bindet. CD40-L von Mäusen oder Menschen umfasst weiters eine homologe, hydrophobe transmembrane Region mit 24 Aminosäuren, welche durch beladene Aminosäuren auf einer von beiden Seiten und eine intrazelluläre Region mit 22 Aminosäuren an ihren N-Termini skizziert wird. In diesem Dokument beschrieben werden CD40-L Polypeptide voller Länge oder Fragmente davon, welche die ganze oder eine teilweise extrazelluläre Region oder Derivate der extrazellulären Region sowie Säugetierzellen umfassen, die mit einem cDNA-codierenden CD40-L von Mäusen oder Menschen transfektiert wurden und menschliches oder Muse CD40-L als membranengebundenes Protein exprimieren.
  • Bei dem hierin offenbarten Cytokin handelt es sich um einen Liganden für CD40, einen Rezeptor, der ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Überfamilie ist. CD40-L ist daher wahrscheinlich verantwortlich für die Übertragung von Signalen über CD40, das bekanntermaßen zum Beispiel durch B-Lymphozyten exprimiert wird. Bei CD40-L mit voller Länge handelt es sich um ein membranengebundenes Polypeptid mit einer extrazellulären Region an seinem C-Terminus, einer transmembranen Region, und einer intrazellulären Region an seinem N-Terminus. Eine lösliche Version von CD40-L kann aus der extrazellulären Region oder einem Fragment davon hergestellt werden, und ein lösliches CD40-L wurde in Kulturberständen von Zellen gefunden, welche eine membranengebundene Version von CD40-L exprimieren. Die Proteinsequenz der extrazellulären Region von Mäuse-CD40-L erstreckt sich von der Aminosäure 47 bis zur Aminosäure 260 in 1 und SEQ-ID Nr. 2. Die Proteinsequenz der extrazellulären Region des menschlichen CD40-L erstreckt sich von der Aminosäure 47 bis zur Aminosäure 261 in 2 und der SEQ-ID Nr. 12. Die biologische Aktivität von CD40-L wird durch Anbindung an CD40 oder ein Spezies-spezifisches Homolog davon ermöglicht und umfasst die Proliferation von B-Zellen und die Induktion einer Immunglobulin-Sekretion von aktivierten B-Zellen. CD40-L (einschließlich löslicher monomerer und oligomerer Formen, sowie membranengebundener Formen) kann eine B-Zellen-Proliferation und eine Immunglobulinsekretion (außer einer IgE-Sekretion) ohne Vorhandensein von hinzugefügtem IL-4 bewirken, was im Gegensatz zu Anti-CD40-Antikörpern steht, welche IL-4 sowie eine Quervernetzung benötigen, um eine Aktivität zu bewirken.
  • CD40-L bezieht sich auf einen Genus von Polypeptiden, welche CD40 binden können, oder Säugetier-Homologe von CD40. In diesem Dokument umfasst der Begriff "CD40-L" lösliche CD40-L-Polypeptide, welchen die transmembranen und intrazellulären Regionen fehlen, Säugetier-Homologe von menschlichem CD40-L, Analoge von menschlichem oder Mäuse-CD40-L oder Derivate von menschlichem oder Mäuse-CD40-L.
  • CD40-L kann auch durch Mutationen von Nucleotidsequenzen erhalten werden, welche führ ein CD40-L-Polypeptid codieren. Ein CD40-L-Analog, wie es in diesem Dokument verwendet wird, ist ein Polypeptid, das im wesentlichen homolog zu einer Sequenz von menschlichem oder Mäuse-CD40-L ist, welches aber eine Aminosäuresequenz besitzt, die sich vom CD40-L-Polypeptid (von Menschen oder Mäusen) mit nativer Sequenz auf Grund einer oder mehrerer Löschungen, Einfügungen oder Substitutionen unterscheidet. Analoge von CD40-L können von DMA-Konstrukten künstlich hergestellt werden, welche durch Oligonucleotidsynthese und Ligation oder durch stellenspezifische Mutagenesetechniken hergestellt wurden.
  • Die primäre Aminosäurestruktur von menschlichem oder Mäuse-CD40-L kann modifiziert werden, um CD40-L-Derivate durch Bildung kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen chemischen Komponenten, wie zum Beispiel Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphaten, Acerylgruppen und ähnlichem, zu erzeugen, oder durch Erzeugung von Aminosäuresequenzmutanten. Covalente Derivate von CD40-L werden durch Quervernetzung bestimmter funktionaler Gruppen mir CD40-L Aminosäure-Seitenketten oder am N-Terminus oder C-Terminus eines CD40-L-Polypeptids oder der extrazellulären Domäne davon hergestellt. Andere Derivate von CD40-L, die im Umfang dieser Erfindung liegen, umfassen covalente oder aggregative Konjugate von CD40-L oder dessen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie zum Beispiel durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-Terminus- oder C-Terminus-Fusionen. Zum Beispiel kann das Konjugat eine Signal- oder Leader-Polypeptidsequenz an der N-Terminus-Region oder der C-Terminus-Region eines CD40-L-Polypeptids umfassen, welches auf co-translationale oder post-translationale Weise den Transfer des Konjugats von seinem Platz der Synthese weg zu einem Platz innerhalb oder außerhalb der Zellmembrane oder Zellwand leitet (z. B. der α-Faktor-Leader von Saccharomyces). CD40-L-Polypeptidfusionen können Polypeptide umfassen, die hinzugefügt werden, um die Reinigung und Identifizierung von CD40-L zu ermöglichen (z. B. Poly-His), oder Fusionen mit anderen Cytokinen, um neuartige polyfunktionale Einheiten zu schaffen. Andere Cytokine umfassen zum Beispiel beliebige Interleukine-1 bis 13, TNF (Tumornekrosefaktor), GM-CSF (Granulocyten-Makrophagen-Kolonie stimulerender Faktor), G-CSF (Granulocyten-Kolonie stimulierender Faktor), MGF (Mastzellenwachstumsfaktor), EGF (epidermaler Wachstumsfaktor), PDGF (von Blutblättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor), NGF (Nervenwachstumsfaktor), EPO (Erythropoietin), γ-IFN (Gamma- Interferon), 4-IBB-L (4-IBB Ligand) und andere Cytokine, welche das Immunzellenwachstum sowie die Differentiation oder Funktion beeinflussen.
  • Die biologische Aktivität von CD40-L kann zum Beispiel bestimmt werden durch eine Konkurrenz um die Bindung an die Ligandenbimdungsdomäne von CD40 (d. h. kompetitive Bindungsassays). Sowohl das CD40-L von Mäusen als auch das menschliche CD40-L binden an das menschliche CD40. Die Bindungsaffinität von Mäuse-CD40-L (exprimiert an sortierten Mäuse-EL-40,9 Zellen) für menschliches CD40 betrug ungefähr 1,74 × 109 M–1. Auf ähnliche Weise betrug die Bindungsaffinität von Mäuse-CD40-L (exprimiert an unsortierten Mäuse-EL-46.1 Zellen) für menschliches CD40 ungefähr 2,3 × 109 M–1. Beide Bindungsaffinitätsmessungen liegen innerhalb eines Bereiches, der typisch ist für die Cytokin-/Cytokin-Rezeptorbindung.
  • Eine Konfiguration eines kompetitiven Bindungsassays für CD40-L Polypeptid verwendet ein radioaktiv markiertes, lösliches Mäuse-CD40-L gemäß 1 (SEQ-ID Nr. 1) oder ein menschliches CD40-L gemäß 2 (SEQ-ID Nr. 11), sowie intakte Zellen, welche D40 exprimieren (wie z. B. menschliche B-Zellen). Anstelle intakter Zellen könnte man lösliches CD40 (wie zum Beispiel ein CD40/Fc-Fusionsprotein) verwenden, das durch eine Protein A- oder Protein G-Interaktion mit der Fc-Region des Fusionsproteins an eine feste Phase gebunden ist. Eine zweite Konfiguration eines kompetitiven Bindungsassays verwendet radioaktiv markiertes, lösliches CD40, wie zum Beispiel ein CD40/Fc-Fusionsprotein, und intakte Zellen, welche CD40-L exprimieren. Alternativ dazu könnte lösliches CD40-L an eine feste Phase gebunden werden.
  • Kompetitive Bindungsassays können mir Standardmethoden durchgeführt werden. Zum Beispiel kann radioaktiv markiertes Mäuse-CD40-L für den Wettbewerb mir einem putativen CD40-L-homolog verwendet werden, um die Bindungsaktivität im Vergleich zu oberflächengebundenem CD40 zu testen. Qualitative Ergebnisse können durch kompetitive autoradiographische Plattenbindungsassays erzielt werden, oder es können Scatchard-Plots verwendet werden, um quantitative Ergebnisse zu erzeugen.
  • Kompetitive Bindungsassays mit intakten Zellen, welche CD40 exprimieren, können auf zwei Arten durchgeführt werden. Bei der ersten Art werden B-Zellen entweder in Suspension oder durch Anhaftung an Gewebekulturplatten gezüchtet. Anhaftende Zellen können durch eine zehn Minuten dauernde und bei 37°C durchgeführte 5 mM EDTA-Behandlung entfernt werden. Bei der zweiten Art können transfektierte COS-Zellen, welche membranengebundenes CD40 exprimieren, verwendet werden. COS-Zellen oder eine andere Säugetierzelle können mit menschlicher CD40 cDNA in einem geeigneten Vektor transfektiert werden, um CD40 voller Länge mit einer extrazellulären Region, die außerhalb der Zelle liegt, zu exprimieren.
  • Alternativ dazu kann lösliches CD40 an eine feste Phase, wie zum Beispiel eine Säulenchromatographiematrix, oder ein Rohr oder ein ähnliches Substrat, das für die Analyse im Hinblick auf das Vorhandensein einer erkennbaren Komponente, wie zum Beispiel 125I geeignet ist, verwendet werden. Die Bindung an eine feste Phase kann zum Beispiel durch Erhalt eines CD40/Fc-Fusionsproteins und Anbindung desselben an eine Protein A- oder Protein G-Oberfläche erzielt werden.
  • Ein weiteres Mittel zum Messen der biologischen Aktivität von CD40-L und Homologen davon besteht darin, konjugiertes, lösliches CD40 (zum Beispiel 125I-CD40/Fc) in kompetitiven Assays zu verwenden, die jenen ähneln, welche oben beschrieben wurden. In diesem Fall werden jedoch intakte Zellen, welche CD40-L oder lösliches CD40-L exprimieren, das an ein festes Substrat gebunden ist, verwendet, um den Wettbewerb zur Anbindung von konjugiertem, löslichem CD40 oder CD40-L durch eine Probe zu messen, welche ein putatives CD40-Homolog enthält.
  • CD40-L kann auch durch Messen der biologischen Aktivität in einem B-Zellen-Proliferationsassay getestet werden. Menschliche B-Zellen können von menschlichen Mandeln mittels Reinigung durch negative Selektion und Percoll-Dichtesedimentation erhalten werden, wie dies von Defrance et al., J. Immunol. 139: 1135, 1987, beschrieben ist. Burkitt Lymphom-Zellinien können verwendet werden, um die Zellproliferation als Reaktion auf CD40-L zu messen. Beispiele für Burkitt Lymphom-Zellinien umfassen zum Beispiel Raji (ATCC CCL 86), Daudi (ATCC CCL 213) und Namalwa (ATCC CRL 1432). Membranengebundenes CD40-L hat die B-Zellen-Proliferation stimuliert. Oligomeres, vorzugsweise dimeres CD40-L kann die B-Zellen-Proliferation stimulieren. CD40 (Rezeptor) wirkt der CD40-L-Proliferation von B-Zellen entgegen.
  • Ein weiterer Assay zur Bestimmung der Biologischen Aktivität von CD40-L besteht darin, das durch B-Zellen als Reaktion auf die Aktivierung durch CD40-L oder ein Derivat oder Analog davon produzierte Immunglobulin zu messen. Die polyklonale Immunglobulinsekretion kann zum Beispiel durch Inkubation mir 5 × 105 B-Zellen/ml in einer Kultur über einen Zeitraum von mindestens sieben Tagen gemessen werden. Die Produktion von Immunglobulin (Ig) kann durch einen ELISA-Assay getestet werden, wie er zum Beispiel von Maliszewski et al., J. Immunol. 144: 3028, 1990 [Maliszewski et al. I] oder Maliszewski et al., Eur. J. Immunol. 20: 1735, 1990 [Maliszewski et al. II], beschrieben wird. B-Zellen von Mäusen können zum Beispiel von Mäusen erhalten und gemäß den in Grabstein et al., J. Exp. Med. 163: 1405, 1986 [Grabstein et al. 1], Maliszewski et al. I und Maliszewski et al. II enthaltenen Anleitungen erhalten werden.
  • CD40-L kann in einem Bindungsassay verwendet werden, um exprimierendes CD40 zu erkennen. Zum Beispiel kann Mäuse-CD40-L gemäß 1 (SEQ-ID Nr. 1) oder menschliches CD40-L gemäß 2 (SEQ-ID Nr. 11) oder eine extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon zu einer erkennbaren Komponente konjugiert werden, wie zum Beispiel zu 125I. Die radioaktive Markierung mit 125I kann mit Hilfe mehrerer Methoden durchgeführt werden, welche ein funktionales 125I-CD40-L Molekül ergeben, das für eine hochspezifische Aktivität geeignet ist. Alternativ dazu kann jede beliebige andere erkennbare Komponente, wie zum Beispiel ein Enzym, welches eine kolorimetrische oder fluormetrische Reaktion katalysieren kann, wie Biotin oder Avidin, verwendet werden. Zellen, welche CD40 exprimieren, können mit konjugiertem CD40-L in Kontakt gebracht werden. Nach der Inkubation wird nicht gebundenes, konjugiertes CD40-L entfernt, und die Bindung wird mit Hilfe der erkennbaren Komponente gemessen.
  • CD40-L-Polypeptide können als Oligomere vorhanden sein, wie zum Beispiel in Form von Dinieren oder Trimeren. Oligomere sind durch Disulfidbindungen miteinander verbunden, welche zwischen Cysteinrückständen an unterschiedlichen CD40-L-Polypeptiden gebildet werden. Alternativ dazu können zwei lösliche CD40-L-Domänen mit einer Gly4SerGly5Ser-Linkersequenz oder einer anderen Linkersequenz verbunden werden, welche im US-Patent 5,073,627 beschrieben ist und welche hiermit durch Referenz hierin aufgenommen wird. CD40-L Polypeptide können auch durch Fusion des C-Terminals von löslichem CD40-L (extrazelluläre Domäne) mit der Fc-Region von IgG1 (z. B. SEQ-ID Nr. 3) gebildet werden, wie dies für das CD40/Fc-Fusionsprotein beschrieben wurde. CD40-L/Fc-Fusionsproteine können ähnlich wie schwere Ketten eines Antikörpermoleküls zusammengebaut werden, um divalentes CD40-L zu bilden. Wenn Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch mit leichten Ketten eines Antikörpers gebildet werden, kann ein CD40-L Oligomer mit bis zu vier extrazellulären CD40-L-Regionen gebildet werden.
  • Fusionsproteine können mit Hilfe herkömmlicher Techniken des enzymatischen Auseinanderschneidens und Ligation von Fragmenten gewünschter Sequenzen hergestellt werden. Mit Hilfe von PCR-Techniken, welche synthetische Oligonucleotide verwenden, können gewünschte Fragmente hergestellt und/oder verstärkt werden. Überlappende synthetische Oligonucleotide, welche die gewünschten Sequenzen repräsentieren, können ebenfalls für die Herstellung von DNA-Konstrukten verwendet werden, welche Fusionsproteine codieren. Fusionsproteine können auch CD40-L und zwei oder mehrere weitere Sequenzen einschließlich einer Leader- (oder Signalpeptid-) Sequenz, Fc-Region, Linker-Sequenz und Sequenzen umfassen, welche stark antigene Komponenten codieren, die ein Mittel zur leichten Reinigung oder raschen Erkennung eines Fusionsproteins schaffen.
  • Signalpeptide ermöglichen die Sekretion von Proteinen von Zellen. Ein beispielhaftes Signalpeptid sind die endständigen 25 Aminosäuren der Leader-Sequenz des menschlichen Interleukin-7 (IL-7; Goodwin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 302, 1989; 2B). Auch andere Signalpeptide können verwendet werden. So können zum Beispiel bestimmte Nucleotide in der IL-7 Leader-Sequenz geändert werden, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern. Zusätzlich können Aminosäureänderungen vorgenommen werden, welche keine Auswirkungen auf die Fähigkeit der IL-7 Sequenz als Leader-Sequenz haben.
  • Das Flag®-Octapeptid (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) verändert die biologische Aktivität von Fusionsproteinen nicht, hat eine stark antigene Wirkung und schafft ein Epitop, das reversibel durch einen bestimmten monoklonalen Antikörper gebunden ist, wodurch eine rasche Erkennung und leichte Reinigung des exprimierten Fusionsproteins ermöglicht wird. Die Flag®-Sequenz wird auch spezifisch durch Rinderschleimhaut-Enterokinase am Rückstand unmittelbar nach dem Asp-Lys-Paar gespalten; Fusionspeptide, welche mit diesem Peptid gekappt sind, können auch resistent gegen eine intrazelluläre Degradation in E. coli sein. Ein monoklonaler Mäuse-Antikörper, der die Flag®-Sequenz bindet, wurde mir dem ATTC unter der Zugriffsnummer HB 9259 abgelegt; Verfahren zur Verwendung des Antikörpers bei der Reinigung von Fusionsproteinen, welche die Flag®-Sequenz umfassen, sind im US-Patent Nr. 5,011,912 beschrieben, welches hierin durch Referenz aufgenommen wird.
  • Geeignete Fc-Regionen sind als Fc-Regionen definiert, welche eine Anbindung an Protein A oder Protein G vornehmen können oder alternativ dazu von einem Antikörper erkannt werden, der bei der Reinigung oder Erkennung eines Fusionsproteins, welches die Fc-Region umfasst, verwendet werden kann. Bevorzugte Fc-Regionen umfassen die Fc-Region des menschlichen IgG1 oder des Mäuse-IgG1. Ein Beispiel ist die in der SEQ-ID Nr. 3 gezeigte menschliche IgG1 Fc-Region; ein anderes Beispiel ist eine Fc-Region, die von einer cDNA codiert wird, welche duch PCR von Oligonucleotidprimeren aus der SEQ-ID Nr. 9 und der SEQ-ID Nr. 10 mit menschlicher cDNA als Vorlage erhalten wird. Abschnitte einer geeilmeten Fc-Region können ebenfalls verwendet werden, wie zum Beispiel eine Fc-Region des menschlichen IgG1, von welchem eine Sequenz von Aminosäuren gelöscht wurde, die zum Anbinden an das Protein A verantwortlich sind, so dass sich die daraus ergebende Fc-Region an das Protein G, nicht aber an das Protein A anbindet.
  • Die [Gly4Ser]3 Wiederholungs-Sequenz schafft eine Linker-Sequenz, welche die extrazelluläre Region des CD40-L vom Fc-Abschnitt des Fusionsproteins durch einen Abstand trennt, der ausreicht, um sicherzustellen, dass sich das CD40-L in korrekter Weise in seine sekundären und tertiären Strukturen faltet. Geeignete Linker-Sequenzen (1) nehmen eine flexible erweiterte Konformation an, (2) weisen keine Neigung zur Entwicklung einer geordneten sekundären Struktur auf, welche mit den funktionalen Domänen von Fusionsproteinen interagieren könnte, und (3) besitzen minimale hydrophobe oder geladene Eigenschaften, welche eine Interaktion mit den funktionalen Proteindomänen fördern könnten. Typische Oberflächenaminosäuren in flexiblen Proteinregionen umfassen Gly, Asn und Ser. Scheinbar jede beliebige Permutation von Aminosäuresequenzen, welche Gly, Asn und Ser enthalten, würde erwarteterweise die obigen Kriterien für eine Linker-Sequenz erfüllen. Andere beinahe neutrale Aminosäuren, wie Thr und Ala, können auch in der Linker-Sequenz verwendet werden. Die Länge der Linker-Sequenz kann schwanken, ohne dass dies einen wesentlichen Einfluss auf die biologische Aktivität des Fusionsproteins hätte. Linker-Sequenzen sind dort unnötig, wo die verschmelzenden Proteine unwesentliche N- oder Cterminale Aminosäureregionen besitzen, welche zum Trennen funktionaler Domänen verwendet werden können und sterische Interferenzen verhindern.
  • CD40-L Polypeptide können als lösliche Polypeptide vorhanden sein, welche die in 1 (SEQ-ID Nr. 1) und 2 (SEQ-ID Nr. 11) gezeigte extrazelluläre Domäne von CD40-L umfassen können, oder als membranengebundene Polypeptide, welche die extrazelluläre Domäne, eine transmembrane Region und eine kurze intrazelluläre Domäne umfassen, wie sie in 1 (SEQ-ID Nr. 1) und 2 (SEQ-ID Nr. 11) für die Mäuse- bzw. menschlichen Sequenzen gezeigt sind. Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung Oligomere von extrazellulären CD40-L Domänen oder Fragmente davon, verknüpft durch Disulfidinteraktionen, oder exprimiert als Fusionspolymere mit oder ohne Spacer-Aminosäureverknüpfungsgruppen. Zum Beispiel kann ein dimeres CD40-L-Molekül dwch eine Verlinkungsgruppe einer IgG Fc-Region verbunden werden.
  • Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, können sowohl membranengebundenes CD40-L als auch oligomeres CD40-L eine aktivitätsstimulierende Ig-Formation und Proliferation von B-Zellen erzielen, die zuvor nur von einem quervernetzten Anti-CD40-Antikörper in Gegenwart von IL-4 erzielt wurden. Weiters scheint es sehr wahrscheinlich zu sein, dass monomores, lösliches CD40-L, welches nur die extrazelluläre Domäne von CD40-L umfasst und in der Lage ist, an einen Cd40-Rezeptor zu binden, dazu dient, der Aktivität von membranengebundenem und oligomerem CD40-L und/oder quervernetzten Anti-CD40- Antikörpern entgegenzuwirken. Weiters scheint es wahrscheinlich zu sein, dass die Interaktion von membranengebundenem CD40-L mit CD40 die wichtigste molekulare Interaktion ist, welche für eine vom T-Zellenkontakt abhängige Induktion von B-Zellen-Wachstum und Differentiation sowohl gegenüber einer Antigen-spezifischen Antikörper-Produktion als auch einer polyklonalen Ig-Sekretion verantwortlich ist. In dieser Hinsicht kann eine Säugetierzelle, welche mit einer cDNA transfektiert wurde, die eilt CD40-L voller Länge codiert (d. h. die membranengebunden ist und eine intrazelluläre Domäne, eine transmembranische Region und eine extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon besitzt) T-Zellen in ihrer Fähigkeit, das B-Zellen-Wachstum, sowie die Differenzierung und Stimulation der Produktion von Antigenspezifischen Antikörpern zu induzieren, nachahmen. Es scheint, dass die Aktivitäten von oligomerem, löslichem CD40-L, vorzugsweise ein Dimer von extrazellulären Regionen, die biologischen Aktivitäten von membranengebundenem CD40-L nachahmen kann. Darüber hinaus kann lösliches, monomeres CD40-L (umfassend die extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon) an den CD40-Rezeptor anbinden, um eine T-Zellen-Interaktion mit B-Zellen zu verhindern und daher eine ähnliche Aktivität aufweisen wie die extrazelluläre CD40 (Rezeptor) Domäne, welche selbst in monomerer oder oligomerer Form vorliegen kann. Alternativ dazu kann CD40-L oligomer sein (vorzugsweise ein Dimer), um als löslicher Faktor zu wirken, der in der Lage ist, das B-Zellenwachstum, sowie die Differenzierung und Stimulation der Produktion von Antigen-spezifischen Antikörpern zu induzieren. Demgemäß scheinen membranengebundenes CD40-L und oligomeres CD40-L als CD40-Agonisten zu wirken; während lösliches (monomeres) CD40-L und lösliches CD40 als CD40-Antagonisten wirken, indem sie CD40-Rezeptorstellen ohne wesentliche Signaltransduktion blockieren, oder indem sie eine Anbindung an CD40-Stellen bei B-Zellen und anderem Targetzellen verhindern.
  • Sowohl CD40-Agonisten als auch CD40-Antagonisten besitzen nutzbringende therapeutische Aktivitäten. So können zum Beispiel CD40-Agonisten (d. h. membranengebundenes CD40-L und oligomeres CD40-L) erfolgreich als Impihilfsmittel sowie zum Stimulieren der mAb-Produktion aus Hybridzellen verwendet werden. CD40-Antagonisten (d. h. CD40-Rezeptor, CD40/Fc und möglicherweise lösliches, monomeres CD40-L) sind hilfreich bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, welche sich durch das Vorhandensein von hohen Mengen an Antigen-Antikörper-Komplexen auszeichnen, wie zum Beispiel Allergien, Lupus, rheumatische Arthritis, insulinabhängiger Diabetes Mellitus (IDDM), Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion (GVHD) und andere.
  • Die IgE-Sekretion von menschlichen B-Zellen kann durch IL-4 bei Vorhandensein von T-Zellen induziert werden (Vercelli et al., J. Exp. Med. I 69: 1295, 1989). Weiters kann die IgE-Produktion von T-Zellen abgereicherten PBM (mononukleare Zellen von peripherem Blut) durch Zugabe eines Anti-CD40 mAb (Jabara et al., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990 und Zhang et al., J. Immunol. 146: 1836, 1991) induziert werden. Die vorliegende Erfindung umfasst weiters ein Verfahren zum Hemmen der IgE-Produktion von aktivierten B-Zellen, aktiviert durch IL-4 in Gegenwart von T-Zellen oder durch CD40-L (vorzugsweise membranengebundenes CD40-L), umfassend die Verarbreichtung einer wirkungsvollen Menge eines CD40/Fc-Fusionsproteins, wie dies hierin beschrieben wird, oder eines löslichen CD40, codiert durch die in der SEQ-ID Nr. 3 beschriebene cDNA-Sequenz. Auf ähnliche Weise können auch CD40-Rezeptoren und möglicherweise lösliches CD40-L (nur monomer) die Sekretion von anderen Antikörper-Isotypen blockieren.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst weiters CD40-L Polypeptide mit oder ohne dazugehörige Glycosylierung mit nativem Muster. In Hefe- oder Säugetierexpressionssystemen (z. B. COS-7-Zellen) exprimiertes CD40-L kann hinsichtlich Molekulargewicht und Glycosylierungsmuster ähnlich sein wie ein natives CD40-L-Polypeptid oder sich wesentlich davon unterscheiden, was letztlich von der Wahl des Expressionssystems abhängt. Die Expression von CD40-L Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen, wie zum Beispiel E. coli, erzeugt nicht glycolysierte Moleküle.
  • Es können DNA-Konstrukte hergestellt werden, welche verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäurerückständen oder Sequenzen oder Deletionen von terminalen oder internen Rückständen oder Sequenzen codieren, welche nicht für die biologische Aktivität oder Bindung benötigt werden. Zum Beispiel kann die extrazelluläre CD40-L N-Glycosylierungsstelle entsprechend modifiziert werden, um eine Glycosylierung auszuschließen, während die Expression eines homogenen, reduzierten Kohlenhydratanalogs mit Hilfe von Hefeexpressionssystemen ermöglicht wird. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind gekennzeichnet dwch ein Aminosäuretriplett Asn-X-Y, wobei X eine Aminosäure außer Pro und Y ein Ser oder Thr ist. Entsprechende Modifikationen an der Nucleotidsequenz, welche dieses Triplett codiert, führen zu Substitutionen, Additionen oder Deletionen, welche das Anhängen von Kohlehydratrückständen an der Asn-seitigen Kette verhindern. In einem anderen Beispiel können Sequenzen, welche Cys-Rückstande codieren, verändert werden, um die Cys-Rückstände zu löschen oder durch andere Aminosäuren auszutauschen, wodurch eine Bildung falscher intramolekularer Disulfidbrücken bei der Renaturierung verhindert wird. Menschliches CD40-L umfasst fünf Cys-Rückstände in seiner extrazellulären Domäne. Somit kann mindestens einer der fünf Cys-Rückstände ohne Beeinträchtigung der tertiären Proteinstruktur oder der Disulfidbindungsbildung durch eine andere Aminosäure ersetzt oder gelöscht werden.
  • Andere Ansätze zur Mutagenese umfassen die Modifizierung von Sequenzen, welche dibasische Aminosäurerückstände codieren, um die Expression in Hefesystemen zu verstärken, in denen eine KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist. Subeinheiten eines CD40-L-Polypeptids können durch Löschen von Sequenzen konstruiert werden, welche terminate oder interne Rückstände oder Sequenzen codieren.
  • CD40-L-Polypeptide werden durch Multi-Exon-Gene codiert. Die vorliegende Erfindung umfasst alternative mRNA-Konstrukte, welche unterschiedlichen mRNA-Splicingereignissen nach der Transkription zugeordnet werden können, und welche gemeinsame Identitätsregionen oder Ähnlichkeiten mit den hierin offenbarten cDNAs besitzen.
  • Die Sequenz der CD40-L Mäuse-cDNA wurde durch direkte Expressionstechniken erhalten. Die Sequenz des menschlichen CD40-L wurde durch Spezies übergreifende Hybridisationstechniken unter Verwendung der CD40-L Mäuse-cDNA als Probe erhalten.
  • Wir haben Mäuse-CD40-L geklont, indem wir zuerst einen Klon der extrazellulären Region von menschlichem CD40 (der Rezeptor) durch Polymerasekettenreaktionstechniken (PCR) mit Hilfe von Primern basierend auf einer in Stamenkovic et al. (SEQ-ID Nr. 4) veröffentlichten Sequenz erhalten haben. Ein stromaufwärts gelagerter Oligonucleotid-Primer 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (SEQ-ID Nr. 5) führt eine Sal 1-stelle stromabwärts vom Initiator-Methionin des CD40 ein, und ein stromabwärts gelegener Oligonucleotid-Primer 5'-CGGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3' (SEQ-ID Nr. 6) führt ein Terminationscodon nach der Aminosäure 192 des CD40 ein, gefolgt von Xba:1 und Sal l Stellen. Die verlängerte cDNA wurde mit Sal 1 digeriert und in pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991) geklont, um pDC406/s CD40 zu konstruieren.
  • Ein zweites CD40-Rezeptorfragment (SEQ-ID Nr. 4) wurde mit Hilfe von PCR-Techniken für die Fusion zur Fc-Domäne von menschlichem IgG1 (SEQ-ID Nr. 3) erhalten. Kurz gesagt waren der stromaufwärts gelegene Oligonucleotid-Primer (SEQ-ID Nr. 5) und die Fusionsmatrize (SEQ-ID Nr. 4) die selben wie zuvor. Der stromabwärts gelegene Oligonucleotid-Primer war 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGCrAC-3' (SEQ-ID Nr. 7), welcher die Aminosäuren Tyr Val Glu Pro Arg (SEQ-ID Nr. 8) nach der Aminosäure 193 von CD40 einfügt. Glu und Pro sind die ersten zwei Aminosäuren einer Hingeregion des menschlichen IgG1, wobei hinter ihnen eine Bgl II-Restriktionsstelle liegt. Die Bgl II- Restriktionsstelle wurde zur Verschmelzung der extrazellulären Domäne von CD40 mit dem Rest der Fc-Region des menschlichen IgG1 verwendet.
  • Andere Fusionsproteine, welche Ligandenbindungsdomänen von anderen Rezeptoren umfassen, können durch Schaffung einer DNA-Sequenz für die Ligandenbindungsdomäne eines Rezeptors und Verschmelzung dieser Sequenz mit einer DNA-Sequenz erhalten werden, welche eine Fc-Region eines Antikörper-Moleküls codiert, das sich an Protein A oder Protein G anbindet, oder ein anderes Polypeptid, das eine Affinitätsreinigung durchführen kann, wie zum Beispiel Avidin oder Streptavidin. Das sich daraus ergebende Genkonstrukt kann in Säugetierzellen induziert werden, um ein Fusionsprotein transient zu exprimieren. Rezeptor/Fc-Fusionsproteine können durch eine Affinitätsreinigung mit Protein A oder Protein G gereinigt werden. Rezeptor-/Avidin-Fusionsproteine können durch eine Biotinaffinitätschromatographie gereinigt werden. Das Fusionsprotein kann später durch Auswaschung mir einer starken Salzlösung oder einem anderen entsprechenden Puffer von der Säule entfernt werden.
  • Wir haben eine cDNA-codierende menschliche IgG1 FC-Region durch PCR-Verstärkung mit Hilfe von cDNA von menschlichen Zellen als Matrix und einem stromaufwärts gelegenen Oligonucleotid-Primer 5'-TATTAATCATTCAGTAGGGCCCAGATCTTGTGACAAAACTCAC-3' (SEQ-ID Nr. 9) und einem stromabwärts gelegenen Oligonucleotid-Primer 5'-GCCAGCTTAACTAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA-3" (SEQ-ID Nr. 10) erhalten. Die PCR-verstärkte cDNA führte eine Bgl II-Stelle in der Nähe des Anfangs der Hingeregion ein, welche verwendet wurde, um die extrazelluläre CD40-Region zu ligieren, um eine CD40/Fc-Fusions-cDNA zu konstruieren, welche in pDC406 ligiert wurde, um pDC406/CD40/Fc zu konstruieren. Andere geeignete Fc-Regionen werden als eine beliebige Region definiert, welche mir hoher Andere an das Protein A oder das Protein G binden kann, und die Fc-Region von menschlichem IgG1 oder von Mäuse-IgG1 umfasst. Ein Beispiel ist die in der SEQ-ID Nr. 3 gezeigte Fc-Region des menschlichen IgG1, oder die cDNA, welche mit Hilfe van PCR aus den Oligonucleotid-Primern von der SEQ-ID Nr. 9 und der SEQ-ID Nr. 10 mit menschlicher cDNA als Matrix erhalten wurde.
  • Rezeptor/Fc-Fusionsmoleküle werden vorzugsweise in rekombinanter Säugetierzellenkultur syntherisiert, da sic im allgemeinen zu groß und zu komplex sind, um durch prokaryotische Expressionsmethoden synthetisien werden zu können. Beispiele für geeignete Säugetierzellen zum Exprimieren eines Rezeptor-/Fc-Fusionsproteins umfassen CV- 1 Zellen (ATCC CCL 70) und COS-7 Zellen (ATCC CRL 1651), welche beide von Affennieren stammen.
  • Das DNA-Konstrukt pDC406/CD40/Fc wurde in die Affenniern-Zelllinie CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) transfektiert. Das pDC406 Plasmid umfasst Regulationssequenzen, die von SV40, dem menschlichen Immunschwächenvirus (HIV), und dem Epstein-Barr Virus (EBV) abgeleitet sind. Die CV-1/EBNA-Zelllinie wurde durch Transfektion der CV-1 Zelllinie mit einem Gen abgeleitet, welches das Kem-Antigen-1 (EBNA-1) des Epstein-Barr Virus codiert und auf konstitutive Weise EBNA-1 exprimiert, gesteuert vom sofortigen/frühen Verstärker/Förderer des menschlichen CMV. Ein EBNA-1 Gen ermöglicht die episomale Replikation von Expressionsvektoren, wie zum Beispiel pDC406, welche den EBV-Replikadonsursprung enthalten.
  • Transfektanten, welche das CD40/Fc-Fusionsprotein exprimieren, werden anfänglich mit bot-Blots oder Western-Blots identifiziert. Die Überstände werden danach einer Dot Blotoder Gel-Elektrophorese unterzogen, gefolgt vom Transfer der mit Elektrophorese behandelten Proteine zum Anbinden an G28-5 mAb (ein Antikörper, der an den menschlichen CD40 Rezeptor anbindet). Die geblotteten Proteine wurden danach mit radioaktiv markiertem 125I-Protein A inkubiert, gewaschen, um ungebundenen Marker zu entfernen, und im Hinblick auf die Expression von Fc überprüft. Monoklonaler Antikörper G28-5 wurde gemäß Clark et al., supra, produziert.
  • Nachdem Zellen, welche das Fusionskonstrukt exprimieren, identifiziert wurden, wurden im Großmaßstab Kulturen transfektierter Zellen gezüchtet, um Überstände von Zellen anzusammeln, welche CD40/Fc exprimieren. Das CD/Fc-Fusionsprotein im Überstand wurde mittels Affinitätsreinigung gereinigt. Kurz gesagt wurde ein Liter des Kulturüberstands, welcher das CD40/Fc-Fusionsprotein enthielt, durch Filtern von Säugetierzellenüberständen (z. B. in einem 0,45 μ Filter) und Anwenden einer Filtriegung an einer Protein A/G Antikörperaffinitätssäule (Schleicher und Schuell, Keene, NH) bei 4°C und einer Durchflussleistung von 80 ml/h für eine 1,5 cm × 12,0 cm große Säule gereinigt. Die Säule wurde mit 0,5 M NaCl in PBS gewaschen, bis kein freies Protein mehr in der Waschpufferlösung gefunden werden konnte. Schließlich wurde die Säule mit PBS gewaschen. Gebundenes Fusionsprotein wurde mit 25 mM Citratpuffer, pH 2,8, eluiert und mit 500 mM Hepes-Puffer, pH 9,1, auf einen pH-Wert von 7 gebracht. Silbergefärbte SDS-Gele des eluierten CD40/Fc-fusionsproteins zeigten eine Reinheit von >98%.
  • Lösliches CD40 (sCD40) und CD40/Fc-Fusionsproteine wurden wie hierin beschrieben hergestellt. Die Überstände wurden durch eine G28-5 (Anti-CD40 mAb) Affinitätssäule gereinigt, um das durch die transfektierten CV-1/EBNA-Zellen exprimierte sCD40 durch Affinität zu reinigen. Proteinhaltige Fraktionen wurden vereinigt, und aliquote Anteile für G28-5 Bindungsassays und die Analyse durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese) in Gegenwart von 1 mM Dithiothreitol als Reduktionsmittel entfernt. Eine einzelne Bande mir einem Molekulargewicht von 28.100 Daltons wurde erkannt. Bei Fehlen eines Reduktionsmittels offenbarte die SDS-PAGE Analyse von sCD40 zwei Banden, und zwar eine größere Bande mit einem Molekulargewicht von 56.000, und eine kleinere Bande mit einem Molekulargewicht von 28.000. Das Bandenmuster zeigt an, dass die Mehrzahl von sCD40 als Disulfid-verlinktes Homodimer in Lösung vorhanden ist. Bei der 28.000 Bande handelt es sich um ein freies Monomer.
  • CD40-Proteine wurden durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Probenproteinkonzentrationen wurden mit Hilfe eines BCA-Assays (Pierce) mit ultrareinem Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Reinheit und die Proteinkonzentration von löslichem CD40 wurden durch die Aminosäureanalyse bestätigt. Gereinigtes, Lösliches CD40 wurde auf PVDF-Papier absorbiert, und das Papier wurde einer automatisierten Edman-Degradation auf einem Proteinsequenzer, Modell 477A, von Applied Biosystems gemäß den Anweisungen des Herstellers für die N-terminale Proteinsequenzierung unterzogen. Mit Hilfe dieser Prozedur wurde die Proteinsequenz von sCD40 überprüft.
  • Lösliches CD40 und CD40/Fc-Fusionsprotein waren in der Lage, die Reaktionen von menschlichen B-Zellen bei Nichtvorhandensein von Anti-CD40 mAb (G28-5) zu modulieren. Gereinigte Mandel-B-Zellen wurden mit Anti-IgM und menschlichem IL-4 kultiviert, und es wurde entweder sCD40 oder CD40/Fc-Fusionsprotein zugegeben. Keine der beiden CD40-Formen hatte einen hemmenden Einfluss auf die B-Zellen-Proliferation (gemessen mit Hilfe der Aufnahme von tritiummarkierten Thymidin). Der IL-4-Rezeptor hingegen hemmte die IL-4-induzierte B-Zellen-Proliferation auf konzentrationsabhängige Weise.
  • Lösliches CD40 und CD40/Fc wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die IL-4-induzierte IgE-Sekretion in einem 2-Spender-MLC-System (gemischte Lymphozytenkultur) zu hemmen. In drei Experimenten wurde der Grad der IgE-Produktion reduziert, als die Konzentration von CD40 erhöht wurde. Lösliches CD40, hinzugefügt bei einer Konzentration von 10 μg/ml, konnte die IgE-Sekretion in diesem Allergiemodell vollkommen hemmen. Weiters hatte CD40/Fc ähnliche Auswirkungen wie das lösliche Gegenstück. Eine Zugabe eines IL-7-Rezeptor-Fc-Fusionsproteins (hergestellt durch ähnliche Prozeduren mit einer veröffentlichten IL-7-Rezeptorsequenz) hatte allerdings keinen Einfluss auf die Sekretion von IgE in diesem Modell.
  • Die Pegel von CD23 wurden ebenfalls im selben MLC als Reaktion auf sCD40 oder CD40/Fc Fusionsproteine gemessen. Lösliches CD40 führte zu einer geringen, aber reproduzierbaren Abnahme des sCD23-Pegels am Tag 6 im Vergleich zu Kulturen, die nur mir IL-4 stimuliert wurden, wobei jedoch ein stärkerer Hemmungseffekt am Tag 12 in den selben Kulturen erkennbar war. Die Induktion von löslichem CD23 durch IL-4-stimulierte, Tabgereicherte PBM (Peripherblutmakrophagen) E-Zellen wurde auf ähnliche Weise durch Zugabe von sCD40 beeinflusst, was zu einer geringen Zunahme der sCD23-Pegel am Tag 6 und einer stärkeren Hemmung am Tag 12 führte. In jedem Kultursystem waren die Ergebnisse mir dem CD40/Fc-Fusionsprotein im wesentlichen die selben wie mir sCD40.
  • Bei dem Versuch, eine cDNA für ein CD40-L zu isolieren, wurde gereinigtes CD40/Fc Fusionsprotein mir 125I unter Anwendung eines kommerziell verfügbaren Festphasenmittels (IODO-GEN, Pierce) mit radioaktivem Jod versetzt. Bei diesem Vorgang wurden 5 μg IODO-GEN am Boden eines 10 × 75 mm großen Glasröhrchens ausplattiert und zwanzig Minuten bei 4°C mir 75 μl 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, und 20 μl (2 mCi) Na125I inkubiert. Die Lösung wurde danach in eine zweites Glasröhrchen übertragen, welches 5 μg CD40/Fc in 45 μl PBS (Phosphatpuffersalzlösung) enthielt, und diese Reaktionsmischung wurde zwanzig Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde durch Gelfiltration auf einem 2 ml Bettvolumen Sephadex® G-25 (Sigma) fraktioniert und danach in einem RPMI 1640 Medium äquilibriert, das 2,5% (v/v) Rinderserumalbumin (BSA), 0,2% (v/v) Natriumazid und 20 mM Hepes, pH 7,4, als Bindemedium enthielt. Der endgültige Pool von 125I CD40/Fc wurde auf eine Arbeitsstammlösung von 1 × 10–7 M im Bindemedium verdünnt und bis zu ein Monat lang bei 4°C ohne erkennbaren Verlust einer Rezeptorbindungsaktivität gelagert.
  • Eine cDNA-Bibliothek wurde aus einer EL4-Zelllinie hergestellt, welche gemäß der FACS-Sortierung (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung) auf der Basis der Bindung eines biotinylierten CD40/Fc-Fusionsproteins sortiert wurde. Die Zellen wurden fünf Mal sortiert, bis eine wesentliche Änderung der Fluoreszenzaktivität basierend auf der Expression eines Liganden für CD40 durch die sortierten EL-4-Zellen auftrat. Die fünf Mal sortierten Zellen wurden EL-40,5 Zellen genannt, und diese Zellen wurden zum Zweck der Erstellung einer cDNA-Bibliothek aus der EL-40,5 mRNA kultiviert. Kurz gesagt wurde die cDNA synthetisiert, in einen leeren pDC406-Vektor eingeführt und in E. coli transformiert. Die Transformanten wurden vereint, und die DNA aus den Pools wurde isoliert und in CV 1-EBNA-Zellen transfektiert, um eine Expressionsklonungsbibliothek zu erstellen. Transfektierte CV1-EBNA-Zellen wurden drei Tage lang auf Objektträgern kultiviert, um eine transiente Expression von CD40-L zu ermöglichen. Die Objektträger mit den transfektierten Zellen wurden danach mit CD40/Fc, das mit radioaktivem Jod behandelt worden war, inkubiert, danach gewaschen, um ungebundenes CD40/Fc zu entfernen, und mit Gluteraldehyd fixiert. Die fixierten Objektträger wurde in eine flüssige photographische Emulsion getaucht und im Dunkeln belichtet. Nach der Entwicklung der Objektträger wurden sie einzeln mit einem Mikroskop überprüft, und Zellen, welche CD40-L exprimierten, wurden durch das Vorbandensein von autoradiographischen Silberflecken gegen einen hellen Hintergrund identifiziert.
  • Die Expressionsklonungsbibliothek von EL-40,5-Zellen wurde gescreent, und ein Pool, der ungefähr 2000 einzelne Klone enthielt, wurde als für die Bindung von 125I-markiertem Cd40/Fc-Fusionsprotein positiv identifiziert. Dieser Pool wurde in kleinere Pools mit ungefähr 200 Kolonien aufgeteilt. Die kleineren Pools wurden wie oben beschrieben gescreent. Einer der kleineren Pools war für CD40-L positiv.
  • Ein einzelner Klon wurde isoliert und mir Standardtechniken sequenziert, um die cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Mäuse-CD40-L zu schaffen, wie in 1 und der SEQ-ID Nr. 1 dargestellt.
  • Die menschliche homologe CD40-L cDNA wurde mittels Spezies übergreifender Hybridisationstechniken gefunden. Kurz gesagt wurde eine cDNA-Bibliothek aus menschlichen Peripherblutlymphozyten (PBL) aus Peripherblutlymphozyten hergestellt, welche mit OKT3 Antikörper (ATCC, Rockville MD), das an CD3 (10 ng/ml) bindet, und Interleukin-2 (IL-2, 10 ng/ml) sechs Tage lang behandelt wurden. Die PBL-Zellen wurden gewaschen und anschließend 4 Stunden lang mit 10 ng/ml PMA (Phorbolmyristatacetat, Sigma St. Louis) und 500 ng/ml Ionomycin (Calbiochem) stimuliert. Die Messenger-RNA wurde aus stimulierten PBL-Zellen isoliert, die cDNA gebildet und die cDNA in Eco R1 Linker ligiert.
  • Die ligierte cDNA wurde in die Eco R1 Stelle des λgt10-Phagen-Klonungshilfsmittel (Gigapak® Stratagene, San. Diego, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers eingefügt. Der Phage wurde angereichert, mit Dichten von ungefähr 20.000 Phagen pro 15 cm Platte aus Platten aufgetragen, und es wurden Plaque-Hybridisierungen durchgeführt, wie sie in Maniatis et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, Seiten 316–328, beschrieben sind. Eine Mäuse-Sonde wurde entsprechend der codierenden Region von Mäuse-CD40-L vom Nucleotid 13 bis Nucleotid 793 der SEQ-ID Nr. l und 1 konstruiert. Diese Sonde wurde unter mäßig bis stark stringenten Bedingungen zu den Plaque-Hybridisierungen der PBL-Bibliothek hybridisiert. Kurz gesagt waren die Hybridisierungsbedingungen 6 × SSC, 1 × Denhard-Lösung, 2 mM EDTA, 0,5% Np40 (Nonidet P-40 Detergensmittel) bei 63°C über Nacht Danach wurde eine Waschung in 3 × SSC, 0,1% SDS für drei Stunden bei 55°C durchgeführt, gefolgt von einer Belichtung über Nacht auf Röntgenstrahlfilm. Positive Plaques wurden mit einer Häufigkeit von ungefähr 1 pro 1000 Plaques identifiziert. Positive Plaques wurden zweimal gereinigt, und es wurde eine cDNA aus verstärkten Kulturen hergestellt.
  • Man kann die hierin offenbarten cDNA-Sequenzen des menschlichen oder Mäuse-CD40 dazu verwenden, um durch Spezies übergreifende Hybridisierungstechniken cDNAs zu erhalten, welche andere Säugetierhomologe von menschlichem oder Mäuse-CD40-L codieren. Kurz gesagt wird eine Oligonucleotid-Sonde aus der Nucleotidsequenz der extrazellulären Region des Mäuse-CD40-L hergestellt, wie dies in 1 (SEQ-ID Nr. 1) beschrieben ist, oder aus dem menschlichen CD40-L, wie dies in 2 (SEQ-ID Nr. 11) beschrieben ist. Diese Sonde kann mittels Standard-Techniken hergestellt werden, wie zum Beispiel durch jene, die in Maniaris et al., supra, beschrieben ist. Die menschliche oder Mäuse-Sonde wird zum Screenen einer Säugetier-cDNA-Bibliothek oder Genombibliothek unter mäßig stringenten Bedingungen verwendet. Beispiele für eine Säugetier-cDNA oder Genombibliotheken umfassen für die cDNA eine Bibliothek, die aus peripheren Blutlymphozyten aus Säugetieren hergestellt wird. Alterternativ dazu können verschiedene cDNA-Bibliotheken oder mRNAs, welche von verschiedenen Zelllinien isoliert wurden, mittels Northern-Hybridisierung gescreent werden, um eine geeignete Quelle für die Säugetier-CD40-L-DANN oder mRNA zu bestimmen.
  • Rekombinante Expressionsvektoren für die Expression von CD40-L durch rekombinante DNA-Techniken umfassen eine CD40-L-DNA-Sequenz einschließlich eines synthetischen oder von einer cDNA-abgeleiteten DNA-Fragments, welches ein. CD40-L-Polypeptid codiert, auf operable Weise mit einer geeigneten transkriptionalen oder translationalen Regulationsnucleotidsequenz verlinkt ist, wie zum Beispiel einer, welche von einem Säugetiergen, einem mikrobiellen Gen, einem viralen Gen oder einem Insektengen abgeleitet ist. Beispiele für Regulationssequenzen umfassen Sequenzen, welche eine regulierende Rolle bei der Genexpression spielen (z. B. ein transkriptionaler Promoter oder Verstärker), gegebenenfalls eine Operatorsequenz zur Steuerung der Transkription, eine Sequenz, welche eine mRNA-Ribosomenbindungsstelle codiert, und entsprechende Sequenzen, welche den Beginn und das Ende einer Transkription und Translation steuern. Nucleotidsequenzen sind auf operable Weise verlinkt, wenn die Regulationssequenz auf funktionale Weise mit der CD40-L DNA-Sequenz in Beziehung steht. Somit ist eine Promoter-Nucleotidsequenz auf operable Weise mit einer CD40-L DNA-Sequenz verlinkt, wenn die Promoter-Nucleotidsequenz die Transkription der CD40-L DNA-Sequenz steuert. Weiten kann eine Ribosomen-Bindungsstelle auf operable Weise mit einer Sequenz für ein CD40-L-Polypeptid verlinkt sein, wenn sich die Ribosomen-Bindungsstelle innerhalb des Vektors befindet, um die Translation zu unterstützen. Zusätzlich können Sequenzen, welche Signalpeptide codieren, in Expressionsvektoren aufgenommen werden. So kann zum Beispiel eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) auf operable Weise mit einer CD40-L DNA-Sequenz verlinkt werden. Das Signalpeptid wird als Vorläufer-Aminosäuresequenz exprimiert, welche eine verbesserte extrazelluläre Sekretion des translatierten Fusionspolypeptids durch eine Hefewirtszelle ermöglicht,
  • Zu den geeigneten Wirtszellen für die Expression von CD40-L Polypeptiden gehören Prokaryote, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Prokaryote umfassen gramnegative oder grampositive Organismen, wie zum Beispiel E. coli oder Bacilli. Zu den geeigneten prokaryotischen Wirtszellen für die Transformation gehören zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, und verschiedene andere Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas. Strepromyces und Staphylococcus. Höhere eukaryotische Zellen umfassen etablierte Zelllinien von Säugetieren. Zellfreie Translationssysteme könnten ebenso verwendet werden, um CD40-L Polypeptide mit Hilfe von RNAs zu erzeugen, welche von DNA-Konstrukten abgeleitet sind, die in diesem Dokument offenbart werden. Entsprechende Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit bakteriellen, Plz-, Hefe- und Säugetierzellwirten werden zum Beispiel in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985) beschrieben.
  • In einer prokaryotischen Wirtszelle, wie zum Beispiel E. coli, kann ein CD40-L Polypeptid oder ein Analog einen N-terminalen Methioninrückstand aufweisen, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu ermöglichen. Das N-terminale Met kann vom exprimerten rekombinanten CD40-L Polypeptid abgespalten werden. Prokaryotische Wirtszellen können für die Expression von CD40-L Polypeptiden verwendet werden, welche keine extensive proteolytische oder Disulfidverarbeitung benötigen.
  • Die Expressionsvektoren, welche die rekombinante CD40-L DNA-Sequenz tragen, werden in eine im wesentlichen homogene Kultur eines geeigneten Wirtsmechanismus oder einer Säugetierzelllinie transfektiert oder transformiert. Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Nucleotidsequenzen transformiert oder transfektiert wurden, welche CD40-L Polypeptide codieren und CD40-L Polypeptide exprimieren. Exprimierte CD40-L Polypeptide werden innerhalb der Wirtszelle angeordnet und/oder in Kulturüberstandsflüssigkeit sekretiert, und zwar abhängig von der Art der Wirtszelle und dem in die Wirtszelle eingeführten Genkonstrukt.
  • In prokaryotische Wirtszellen transfektierte Expressionsvektoren umfassen im allgemeinen einen oder mehrere phänotypisch, auswählbare Marker. Ein phänotypisch, auswählbarer Marker ist zum Beispiel ein Gen, welchies ein Protein codiert, das eine Antibiotikaresistenz überträgt oder das eine autotrophe Anforderung liefert, und einen vom Wirt anerkannten Replikakonsstartpunkt, um die Verstärkung innerhalb des Wirts zu gewährleisten. Andere nützliche Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen umfassen einen wählbaren Marken bakteriellen Ursprungs, abgeleitet von kommerziell erhältlichen Plasmiden. Dieser auswählbare Marken kann genetische Elemente des Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. PBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit ein einfaches Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen dar. Die pBR322 "Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem entsprechenden Promoter und einer CD40-L DNA-Sequenz kombiniert. Zu anderen kommerziellen Vektoren gehören zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGFM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
  • Promotersequenzen werden allgemein für rekombinante prokaryotische Wirtszellen-Expressionsvektoren verwendet. Allgemeine Promotersequenzen umfassen β-Lactaraase (Penicillinase), Lactosepromotersystem (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), Tryptophan (trp)-Promotersystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und EP-A-36776} und tac-Promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 412, 1982). Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszellen-Expressionssystem verwendet einen Phage λ PL Promoter und eine thermolabile cI857ts Repressorsequenz. Zu den Plasmidvektoren von der American Type Culture Collection, welche Derivate des λ PL Promoters umfassen, gehören unter anderem Plasmid pHUB2 (resident im E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092)) und pPLc28 (resident in E. coli RR1 (ATCC 53082)).
  • CD40-L kann in Hefe-Wirtszellen exprimiert werden, die vorzugsweise von der Gattung Saccharomyces (z. B. S. cerevisiae) stammen. Andere Hefegattungen, wie zum Beispiel Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden oft einen Ursprung der Replikationssequenz von einem 2μ Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promoterregion, Sequenzen für Polyadenylation, und Sequenzen für die Transkriptionstermination enthalten. Vorzugsweise umfassen Hefevektoren einen Ursprung der Replikationssequenz und einen auswählbaren Marker. Geeignete Promotersequenzen für Hefevektoren umfassen Promoter für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzemann et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem 17: 4900, 1978), wie zum Beispiel Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruktokinase, Glucose-6-Phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase, und Glucokinase. Andere geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung bei der Hefeexpression werden in Hitzemann, EPA-73, 657, näher beschrieben.
  • Hefevektoren können zum Beispiel mit Hilfe von DNA-Sequenzen aus pBR322 für die Auswahl und Replikation in E. coli (Ampf Gen und Ursprung der Replikation) verwendet werden. Andere Hefe-DNA-Sequenzen, welche in einem Hefeexpressionskonstrukt enthalten sein können, umfassen einen Glucose-reprimierbaren ADH2-Promoter und einen α-Faktor-Sekretionsleader. Der ADH2-Promoter wurde von Russell et al. (J Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300: 724, 1982) beschrieben. Die Hefe-α-Faktor-Leadersequenz leitet die Sekretion heterologer Polypeptide. Die α-Faktor-Leadersequenz wird oft zwischen die Promotersequenz und die strukturelle Gensequenz eingeführt. Siehe dazu z. B. Kurjan et al, Cell 30: 933, 1982, und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. Weitere Leadersequenzen, welche dazu geeignet sind, die Sekretion rekombinanter Polypeptide von Hefewirten zu ermöglichen, sind den Fachleuten dieses Bereiches gut bekannt. Eine Leader-Sequenz kann in der Nähe ihres 3' Endes modifiziert werden, um eine oder mehr Restriktionsstellen zu erhalten. Dadurch wird die Fusion der Leadersequenz mit dem strukturellen Gen erleichtert.
  • Hefetransformationsprotokolle sind den Fachleuten dieses Bereichs gut bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc Natl. Sci, USA 75: 1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen et al. Protokoll wählt für die Trp+-Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefe-Stickstoffbase, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
  • Hefe-Wirtszellen, welche durch Vektoren transformiert wurden, die eine ADH2-Promotersequenz enthalten, können zum Induzieren der Expression in einem "reichen" Medium gezüchtet werden. Ein Beispiel für ein reiches Medium wäre eines, das aus 1% Hefeextrakt 2% Peptone und 1% Glucose besteht, ergänzt durch 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil. Eine Dereprimierung des ADH2-Promoters tritt auf, wenn die Glucose aus dem Medium vollständig verbraucht ist.
  • Säugetier- oder Insekten-Wirtszellenkultursysteme könnten ebenfalls verwendet werden, um rekombinante CD40-L Polypeptide zu exprimieren. Beispiele für geeignete Säugetier-Wirtszellenlinien umfassen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Eierstockzellen (CHO) vom chinesischen Hamster, HeLa-Zellen, und BHK (ATCC CRL 10) Zelllinien. Geeignete Säugetier-Expressionsvektoren umfassen nicht transkribierte Elemente, wie zum Beispiel einen Replikationsstartpunkt, eine Promotersequenz, einen mir dem Strukturgen verlinkten Enhancer, andere flankierende, nichttranskribierte 5' oder 3' Sequenzen, wie zum Beispiel Ribosomen-Bindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleißspender- und -akzeptorstellen, und transkriptionale Terminationssequenzen.
  • Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen für Säugetier-Wirtszellenexpressionsvektoren können von viralen Genomen entnommen werden. Zum Beispiel werden allgemein verwendete Säugetierzellen-Promotersequenzen und Enhancersequenzen vom Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Simina-Virus 40 (SV40) und vorn menschlichen Cytomegalovirus abgeleitet. Vom viralen SV40-Genom abgeleitete DNA-Sequenzen, wie z. B. SV40 Ausgangspunkt, früher und später Promoter, Enhancer, Splice- und Polyadenylierungsorte, können zum Beispiel verwendet werden, um die anderen genetischen Elemente bereitzustellen, welche für die Expression einer Strukturgensequenz in einer Säugetierwiriszelle benötigt werden. Frühe und späte virale Promoter sind von besonderem Nutzen, da beide leicht aus einem viralen Genom in Form eines Fragments erhalten werden können, welches auch einen viralen Replikationsstartpunkt enthalten kann (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, sofern die ungefähr 250 bp große Sequenz, die sich von der Hind III-Stelle zur Bgl I Stelle am Replikationsstartpunkt des SV40 Virus erstreckt, enthalten ist.
  • Beispielhafte Säugetier-Expressionsvektoren können wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) offenbart konstruiert werden. Ein nützlicher Vektor mir starker Expression, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312: 768, 1984, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säugetierexpressionsvektoren sind in EP-A-0367566 sowie in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 071701,415, eingereicht am 16. Mai 1991, beschrieben, welche hiermit durch Referenz aufgenommen sind. Für die Expression einer extrazellulären Proteinregion vom Typ II, wie zum Beispiel CD40-L, sollte eine heterologe Signalsequenz hinzugefügt werden, wie zum Beispiel die Signalsequenz für Interleukin-7 (II-7), welche im US-Patent 4,965,195 beschrieben ist, oder die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor, der in der US-Patentanmeldung 06/626,667, eingereicht am 2. Juli 1984, beschrieben ist.
  • Menschliches oder Mäuse-CD40-L kann in membranengebundener Form hergestellt werden, wenn intrazelluläre oder transmembrane Regionen enthalten sind oder in löslicher Form nur mit der extrazellulären Domäne vorhanden sind Wir haben das Mäuse-CD40-L in voller Länge in Säugetierzellen exprimiert, um Zellen zu erhalten, welche membranengebundenes Mäuse-CD40-L exprmieren. Es wurden CV1-Zellen mit einer in 1 (SEQ-ID Nr. 1) gezeigten cDNA im HAVEO-Vektor transfektiert, oder es wurden CV1-Zellen mir Hilfe der im hierin enthaltenen Beispiel 6 beschriebenen Techniken mit einem leeren HAVEO-Vektor transfektiert. Dies führte zu transfektierien CV1-Zellen, welche membranengebundenes Mäuse-GD40-L exprimieren. Diese Zellen wurden als Quelle des membranengebundenen Mäuse-CD40-L für die im folgenden beschriebenen Beispiele 10–13 verwendet.
  • Reinigung rekombinanter CD40-L-Polypeptide
  • CD40-L Polypeptide können durch Kultivierung transformierter Wirtszellen unter Bedingungen hergestellt werden, wie sie zum Exprimieren von CD40-L-Polypeptide erforderlich sind. Die sich daraus ergebenden exprimierien Polypeptide können danach vom Kulturmedium oder von Zellextrakten gereinigt werden. Ein CD40-L-Polypeptid kann, soferne dies gewünscht wird, mit einem kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilter, wie zum Beispiel einer Amicron oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix aufgebracht werden, wie zum Beispiel auf ein Gelfiltrationsmedium. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauscherharz verwendet werden, wie zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit angehängten Diethylaminethylgruppen (DEAE). Bei den Matrizen kann es sich um Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder ander bei der Proteinreinigung allgemein verwendete Typen handeln. Alternativ dazu kann ein Kationenaustauschschritt verwendet werden. Zu den geeigneten Kationenaustauschern gehören verschiedene unlösliche, Sulfopropyl- oder Garboxymethylgruppen aufweisende Matrizen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt.
  • Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographieschritte (RP-HPLC) unter Anwendung von hydrophobem RP-HPLC- Medium (z. B. Silicagel mit angehängten Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) durchgeführt werden, um das CD40-L weiter zu reinigen, Einige oder alle der zuvor genannten Reinigungsschritte können in unterschiedlichen Kombinationen ebenfalls verwendet werden, um ein im wesentlichen homogenes, rekombinantes Protein zu schaffen.
  • Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule mit einer CD40-Ligandenbindungsdomäne für die Affinitätsreinigung von exprimierten CD40-L-Polypeptiden zu verwenden. CD40-L-Polypeptide können von einer Affinitätssäule in einer starken Satzelutionspufferlösung entfernt und danach für den Gebrauch in eine schwache Salzpufferlösung dialysiert werden.
  • In Bakterienkultur hergestelltes rekombinantes Protein wird für gewöhnlich durch anfangliche Zerstörung der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion von den Zellenpellets, wenn es sich um ein unlösliches Polypeptid handelt, oder von der Überstandsflüssigkeit, wenn es sich um ein lösliches Polypeptid handelt, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrationen-, Aussatz-, Ionenaustausch-, Affinitätsreinigungs- oder GröBenausschlußchromatographie-Schritten, isoliert. Schließlich kann RP-FYPLC für die letzten Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen können durch jedes beliebige herkömmliche Verfahren zerstört werden, einschließlich Einfrier- und Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanische Zerstörung, oder Verwendung von Zeltabbaumitteln.
  • Transformierte Hefe-Wirtszellen werden vorzugsweise verwendet, um CD40-L als sekretieres Polypeptid zu exprimieren. Dies vereinfacht die Reinigung. Sekretiertes rekombinantes Polypeptid von einer Hefe-Wirtszellenfermentation kann mit Methoden gereinigt werden, die jenen entsprechen, welche von Urdal et al. (I. Chromatog. 296: 171, 1984) offenbart werden. Urdal et al. Beschreiben zwei sequentielle HPLC-Umkehrphasenschritte für die Reinigung von rekombinantem menschlichem IL-2 auf einer preparativen HPLC-Säule.
  • Die folgenden Beispiele sollen spezielle Ausführungsformen veranschaulichen und keinesfalls den Umfang der Erfindung beschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines CD40/Fc-DNA-Konstrukts zum Exprimieren eines löslichen CD40/Fc-Fusionsproteins zum Erkennen von cDNA-Klonen, welche einen CD40-Liganden codieren. Die cDNA-Sequenz der extrazellularen Region oder Ligandenbindungsdomäne der vollständigen menschlichen CD40-Rezeptorsequenz wurde mir Hilfe von Polymerasekettenreaktionstechniken (PCR-Techniken) erhalten und basiert auf der Sequenz, dic in Stamenkovic et al., supra, veröffentlicht wurde. Ein CD40-Plasmid (CDM8) wurde als Vorlage für die PCR-Verstärkung verwendet. CDMS wird in Stamenkovic et al. beschrieben und wurde von den Autoren erhalten. Eine PCR-Technik (Sarki et al., Science 239: 487, 1988) wurde mit 5' (stromaufwärts) und 3' (stromabwärts) Oligonucleotidprimeren verwendet, um die DNA-Sequenzen zu amplifizieren, welche die extrarelluläre CD40-Ligandenbindungsdomäne codieren. Der stromaufwärts gelagerte Oligonucleotidprimer 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (SEQ-ID Nr. 5) führt eine Sal I-Stelle stromaufwärts von einem Initiator-Methionin des CD40 sowie einen stromabwärts gelagerten Oligonucleotidprimer 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (SEQ-ID Nr. 7) ein, der die Aminosäuren Tyr Val Glu Pro Arg (SEQ-ID Nr. 8) hinter der Aminosäure 193 von CD40 einfügt. Glu und Pro sind die ersten zwei Aminosäuren einer Hingeregion des menschlichen IgG1; ihnen folgt eine Bgl II Restrktionsstelle, die für die Fusion der extrazellulären Domäne von CD40 mir der verbliebenen menschlichen IgG1 Fc-Region verwendet wurde.
  • Das DNA-Konstrukt pDC406/CD40/Fc wurde in die Affennierenzelllinie CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) transfektiert. Das pDC406 Plasmid umfasst Regulationssequenzen, die von SV40, dem menschlichen Immunschwächevirus (HIV), und dem Epstein-Barr-Virus (EBV) abgeleitet sind. Die CV-1/EBNA-Zelllinie wurde durch Transfektion der CV-1 Zelllinie mit einem Gen abgeleitet, welchse das Epstein-Barr-Virus-Kernantigen-1 (EBNA-1) codiert, das auf konstitutive Weise EBNA-1 exprimiert, gesteuert vom menschlichen CMV-Zwischen-/Früh-Enhancer bzw. -promoter. Das EBNA-1 Gen ermöglicht die episomale Replikation von Expressionsvektoren, wie zum Beispiel pDC406, welche den EBV Replikationsstartpunkt enthalten.
  • Nachdem Zellen identifiziert wurden, welche das Fusionskonstrukt exprimieren, wurden in großem Maßstab Kulturen transfektierter Zellen gezüchtet, um einen Überstaud aus Zellen zu sammeln, welche CD40/Fc exprimieren. Das CD40/Fc-Fusionsprotein in der Überstandsflüssigkeit wurde mittels Affinitätsreinigung gereinigt. Kurz gesagt wurde ein Liter des Kulturüberstands mit dem CD40/Fc-Fusionsprotein durch Filtrierung der Säugetierzellen-Überstände (z. B. in einem 0,45 μ Filter) gereinigt und es wurde das Filtrat auf eine Protein A/G Antikärperaffinitätssäule (Schleicher und Schuell, Keene, NH) bei 4°C und einer Dwchflussrate von 80 ml/h für eine 1,5 cm × 12,0 cm große Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 0,5 M NaCl in PBS (Phosphatpuffersalzlösung) gewaschen, bis kein freies Protein mehr in der Waschpufferlösung gefunden werden konnte. Schließlich wurde die Säule mit PBS gewaschen. Das gebundene Fusionsprotein wurde mit 25 mM Citratpuffer, pH 2,8, aus der Säule eluiert und mit 500 mM Hepes-Pufferlösung, pH 9,1, auf einen Wert von pH 7 gebracht. Silbergefärbte SDS-Gele des eluierten CD40/Fc-Fusionsproteins wiesen eine Reinheit von >98% auf.
  • Gereinigtes CD40/Fc-Fusionsprotein wurde mit 125I unter Anwendung eines kommerziell verfügbaren Festphasenmittels (IODO-GEN, Pierce) iodiert. Bei diesem Vorgang wurden 5 μg IODO-GEN auf den Boden eines 10 × 75 mm großen Glasröhrchens aufgetragen und zwanzig Minuten lang bei 4°C mit 75 μl 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, und 20 μl (2 mCi) Na125I inkubiert. Die Lösung wurde anschließend in ein zweites Glasröhrchen mit 5 μg CD40/Fc in 45 μl PBS übertragen, und diese Reaktionsmischung wurde zwanzig Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde durch Gelfiltration auf einem 2 ml Bettvolumen Sephadex® G-25 (Sigma) fraktioniert und anschließend in RPMI 1640 Medium mir 2,5% (v/v) Rinderserumalbumin (BSA), 0,2% (v/v) Natriumazid und 20 mM Hepes, pH 7,4, Bindemedium äquilibriert. Der endgültige Pool des 125I CD40/Fc wurde auf eine Arbeitsstammläsung von 1 × 10–7 M im Bindemedium verdünnt und bis zu ein Monat bei 4°C gelagert, ohne dass es zu einem erkennbaren Verlust der Rezeptorbindungsaktivität gekommen wäre.
  • Es wurde eine Markeraufnahme von ungefähr 50% bis 60% beobachtet. Die Radioiodation führte zu bestimmten Aktivitäten im Bereich von 1 × 1015 bis 5 × 1015 cpm/nmol (0,42–2,0 Atome des radioaktiven Iods pro Proteinmolekül). Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zeigte ein einfach markiertes Polypeptid, das mit den erwarteten Werte übereinstimmte. Das markierte Fusionsprotein war um mehr als 98% Trichloressigsäure-ausfällbar (TCA), was darauf hindeutet, dass das 125I kovalent an das Protein gebunden wurde.
  • BEISPIEL 2
  • Dieses Beispiel beschreibt die Auswahl einer Zelllinie, welche auf putative Weise CD40-L exprimiert. Mehrere Zelllinien wurden mit dem im Beispiel 1 beschriebenen radioiodierten CD40/Fc-Fusionsprotein gescreent. Kurz gesagt wurde quantitative Studien gemäß der Standardmethodik durchgeführt, und es wurden Scatchard-Plots für die verschiedenen Zelllinien abgeleitet. Eine klonale Zelllinie (EL4, ATCC Katalog TIP 39), eine Mäusethymuszelllinie wurde identifiziert und sortiert. Vor dem Sortieren wurden EL-4Zellen gefunden, um ungefähr 450 Moleküle des CD40-L pro Zelle zu exprimieren. Die siebenten sortierten Zellen wurden als EL-40.7 bezeichnet und gezüchtet, und es wurde gefunden, dass sie etwa 10.000 Moleküle des CD40-L pro Zelle exprimieren. Schließlich wurden die neunten sortierten Zellen als EL-40.9 bezeichnet und gezüchtet und es wurde gefunden, dass sie ungefähr 15.000 Moleküle des CD40-L pro Zelle exprimieren.
  • BEISPIEL 3
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer cDNA-Bibliotliek für die Expressionsklonierung von Mäuse-CD40-L. Die Biblothek wurde von einem als fünften sortierten Klon einer Mäusethymuszelllinie EL-4 (ATCC TIB 39), genannt EL-40.5, hergestellt. FL-40.5 Zellen waren EL4-Zellen, welche fünf Mal mit biotinyliertem CD40/Fc-Fusionsprotein in einem FACS (fluoreszenzaktivierten Zellensortierer) sortiert wurden. Eine cDNA-Bibliothek wurde aus RNA hergestellt, die von EL-40.5 Zellen erhalten wurden, was im wesentlichen im US-Patent 4,968,607 beschrieben ist, das hiermit durch Referenz aufgenommen wird. Kurz gesagt wurde eine cDNA-Bibliothek durch Umkehrtranskriptian von Poly(A)+ mRNA konstruiert, welche von der Gesamt-RNA isoliert wurde, die aus der EL-40.5 Zelllinie extrahiert worden war. Die Bibliathekskonstruktionstechnik war im wesentlichen ähnlich wie jene, die von Ausubel et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 1, (1987), beschrieben wird. Poly(A)+ mRNA wurde durch Oligo(dT)-Cellulosechromatographie isoliert und eine doppelsträngige cDNA wurde im wesentllichen so hergestellt, wie dies von Gubler et al., Gene 25: 263, 1983, beschrieben wird. Poly(A)+ mRNA-Fragmente wurden mittels Umkehrtranskriptase unter Verwendung zufälliger Hexanucleotiden als Primere in RNA-cDNA-Hybriden konvertiert. Die RNA-cDNA-Hybriden wurden danach mir Hilfe von RNAase H in Kombination mit DNA Polymerase I in doppelsträngige cDNA-Fragmente konvertiert. Der dadurch entstehenden doppelsträngigen cDNA wurde mit T4 DNA-Polymerase ein stumpfes Ende verliehen.
  • Sal I Adaptoren
    Figure 00300001
  • Wurden an 5'-Enden der entstandenen cDNA mit stumpfem Ende ligiert, wie dies in Haymerle et al., Nucleic Acids Res. 14: 8615, 1986, beschrieben ist. Nicht ligierte Adaptoren wurden mittels Gelfiltrationschromatographie bei 68°C entfernt. Dadurch verblieben 24 nicht selbstkomplementäre Nucleotid-Überhänge an der cDNA. Der selbe Vorgang wurde verwendet, um 5' Sal I Enden des Säugetierexpressionsvektors pDC406 in 24 Nucleotidüberhänge zu konvertieren, die mit jenen komplementär sind, welche zur cDNA hinzugefügt wurden. Optimale Proportionen von angepasstem Vektor und cDNA wurden in Gegenwart von T4 Polynueleotidkinase ligiert. Dialysierte Ligationsmischungen wurden in einen E, coli Strang DH5α elektroporiert und Transformanten auf Ampicillinplatten ausgewählt.
  • Plasmid-DNA wurde von Pools bestehend aus ungefähr 2000 Klonen transformierten E. coli pro Pool isoliert. Die isolierte DNA wurde in eine subkonfluente Schicht von CV 1-EBNA-Zellen mittels DEAE-Dextran transfektiert, gefolgt von einer Chloroquin-Behandlung, die im wesentlichen den Anleitungen entspricht, wie sie in Luthman et al., Nucl. Acids Res. 11: 1295, 1983, und McCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41: 351, 1986, beschrieben sind.
  • CV1-EBNA-Zellen wurden in Vollmedium bewahrt (Dulbeccos modifziertes Eagle-Medium mit 10% (v/v) Kalbsfötusserum, 50 U/ml Penicillin, 50 U/ml Streptomycin, und 2 mM L-Glutamin) und mit einer Dichte von ungefähr 2 × 105 Zellen/Vertiefung auf in Kammern unterteilte Objektträger mit einer Vertiefung (Lab-Tek) aufgetragen. Die Objektträger wurden mit 1 ml menschlichem Fibronectin (10 μg/ml PBS) 30 Minuten lang vorbehandelt, gefolgt von einer einzigen Waschung mir PBS. Das Medium wurde von anhaftenden Zellen, welche in einer Schicht wachsen, entfernt, und durch 1,5 ml Vollmedium mit 66,6 μM Chloroquinsulfat ersetzt. Ungefähr 0,2 ml einer DNA-Lösung (2 μg DNA, 0,5 mg/ml DEAE-Dextran in Vollmedium, welches Chloroquin enthält) wurden den Zellen zugegeben, und die Mischung wurde bei 37°C ungefähr fünf Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden durch Zugabe eines Vollmediums mir 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) 2,5–20 Minuten lang abgeschreckt Nach dem Abschrecken wurde die Lösung durch ein frisches Vollmedium ersetzt. Die Zellen wurden in einer Kultur zwei oder drei Tage lang gezüchtet, um eine transiente Expression der eingefügten DNA-Sequenzen zu ermöglichen. Diese Bedingungen führten zu einer 30%- bis 80%-igen Transfektionsfrequenz in überlebenden CV1-EBNA-Zellen.
  • BEISPIEL 4
  • Dieses Beispiel beschreibt das Screening der in Beispiel 3 hergestellten Expressionsklonierungsbibliothek mit einem in Beispiel 1 hergestellten markierten CD40/Fc-Fusionsprotein. Nach 48 bis 72 Stunden wurden die in Beispiel 3 hergestellten transfektierten Monoschichten von CV1-EBNA-Zellen mittels Objektträgerautoradiographie auf ihre Expression von CD40-L unter Verwendung von radioiodiertem CD40/Fc-Fusionsprotein getestet, wie dies in Beispiel 1 hergestellt wurde. Transfektierte CV1-EBNA-Zellen wurden einmal mit dem Bindemedium (RPMI 1640 mit 25 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes pH 7,2 und 50 mg/ml magere Trockenmilch) gewaschen und 2 Stunden lang bei 4°C in einem Bindemedium inkubiert, welches 1 × 10–9 M 125I-CD40/Fc-Fusionsprotein enthielt. Nach der Inkubation wurden die Zellen in den in Kammern unterteilten Objektträgern drei Mal mit Bindepufferlösung gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen mit PBS pH 7,3), um ungebundenes radioaktiv markiertes Fusionsprotein zu entfernen.
  • Die Zellen wurden durch Inkubation in 10% Gluteraldehyd im PBS (30 Minunten bei Zimmertemperatur) fixiert, zweimal in PBS gewaschen und luftgetrocknet. Die Objektträger wurden in eine photographische Kodak GTNB-2 Emulsion getaucht (6x-Verdünung in Wasser) und im Dunkeln zwei bis vier Tage bei Zimmertemperatur in einer lichtundurchlässigen Schachtel belichtet. Die Objektträger wurden in Kodak D19 Entwickler entwickelt, mit Wasser abgespült und mit Agfa G433C Fixiermittel fixiert. Die Objektträger wurden einzeln unter einem Mikriskop mit 25- 40-facher Vergrölierung riberprüft. Positive Objektträger, welche Zellen aufwiesen, die CD40-L exprimierten, wurden durch das Vorhandensein autoradiographischer Silberflecken gegen einen hellen Hintergrund identifiziert.
  • Ein Pool mit ungefähr 2000 einzelnen Klons wurde als potentiell positiv für die Bindung des CD40/Fc-Fusionsproteins identifiziert. Der Pool wurde getitert und auf Platten aufgetragen, um Platten mit jeweils etwa 200 Kolonien zu erhalten. Jede Platte wurde abgeschabt, um eine gepoolte Plasmid-DNA für die Transfektion in CV1-EBNA-Zellen gemäß der oben beschriebenen Prozedur zu erhalten. Die kleineren Pools wurden wie zuvor beschrieben mittels Objektträgerautoradiographie gescreent. Einer der kleineren Pools enthielt Klone, die positiv für CD40 waren, wie dies durch das Vorhandensein eines exprimierten Genprodukts angezeigt wurde, welches in der Lage war, das CD40/Fc-Fusionsprotein zu binden.
  • Der positive kleinere Pool wurde getitert und auf Platten aufgetragen, um einzelne Kolonien zu erhalten. Ungefähr 400 einzelne Kolonien wurden aufgenommen und in einzelnen Vertiefungen der 96er-Platte in das Kulturmedium eingeimpft. Die Kulturen wurden durch das Poolen von Zeilen und Spalten vermischt, und die vermischten Kulturen wurden verwendet, um eine DNA für eine Endrunde der Transfektion und des Screenings zu bereiten. Ein Schnitt zwischen einer positiven Zeile und einer positiven Spalte bedeutete eine potentiell positive Kolonie. Zehn potentiell positive Kolonien (d. h. Kandidatenklone) wurden identifiziert. Von jedem Kandidatenklon wurde DNA isoliert, erneut transfektiert und erneut gescreent. Fünf Kandidatenklone waren durch Bindung an CD40/Fc positiv. Alle fünf positiven Kandidatenklone enthielten ein cDNA-Insert von 1468 Nucleotiden, was mittels Dideoxynucleotidsequenzierung bestimmt wurde. Die cDNA-codierende Region des CD40-L-Klons entspricht der Sequenz von 1 und der SEQ-ID Nr. 1.
  • Ein Klonierungsvektor, der eine Mäuse-CD40-L-Sequenz enthält und als pDC406-mCD40-L bezeichnet wird, wurde bei der American Type Culture Collection in Rockville, MD (ATCC) am 6. Dezember 1991 unter der Zugriffsnummer 68872 hinterlegt. Die Nucleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz dieses Klons sind in der SEQ-ID Nr. 1 und in 1 dargestellt.
  • BEISPIEL 5
  • Dieses Beispiel zeigt eine Spezies übergreifende Hybridisationstechnik, die verwendet wurde, um menschliches CD40-L-Homolog mit Hilfe einer Sonde aus der Sequenz des Mäuse-CD40-L zu isolieren. Eine Mäuse-CD40-L-Sonde wurde durch Herausschneiden der codierenden Region aus dem Mäuse-CD40-L-Klon pDC406-CD40-L (Nucleotid 13 bis 793) und 32P-Markierung des Fragments mit Hilfe von Zufallsprimern (Boehringer-Mannheim) hergestellt.
  • Eine cDNA-Bibliothek von menschlichen Peripherieblutlymphozyten wurde in einem λ Phage Vektor mir Hilfe von λgt10-Armen konstruiert und in vitro mit Hilfe einer kommerziell erhältlichen Ausrüstung (Gigapak® Stratagene, San Diego, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verpackt. Die PBL-Zellen wurden von normalen menschlichen Freiwilligen erhalten und mit 10 ng/ml OKT3 (einem Anti-CD3-Antikörper) sowie 10 ng/ml menschlichem IL-2 (Immunex, Seattle, WA) sechs Tage lang behandelt. Die PBL-Zellen wurden gewaschen und mit 500 ng/ml Ionomycin (Calbiochem) und 10 ng/ml PMA (Sigma) vier Stunden lang stimuliert. Eine Messenger-RNA und cDNA wurden von den stimulierten PBL-Zellen erhalten und in λgt10 Phage Vektoren (Gigapak® Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers verpackt.
  • Die Mäusesonde wurde bei 63°C über Nacht in Phage cDNA in 6 × SSC (15 mM Trinatriumcitrat, und 165 mM Natriumchlorid), 1 × Denhardt-Lösung, 2 mM EDTR, 0,5% Np40 hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde eine extensive Waschung in 3 × SSC, 0,1% SDS bei ungefähr 55°C drei Stunden lang durchgeführt. Spezifische Banden wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • Ein Klonierungsvektor mit menschlicher CD40-L-Sequenz mit der Bezeichnung hCD40-L wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC) am 6. Dezember 1991 unter der Zugriffsnummer 68873 hinterlegt. Die Nucleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz dieses Klons sind in der SEQ-ID Nr. 11 und in 2 dargestellt.
  • BEISPIEL 6
  • Dieses Beispiel zeigt die Expression von membranengebundenem Mäuse-CD40-L in CV1-EBNA-Zellen. cDNA von Mäuse-CD40-L in HAVEO-Vektor oder leerem HAVEO-Vektor wurde mittels Standardtechniken, wie sie in McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991 und im hierin enthaltenen Beispiel beschrieben sind, in CV1 EBNA-Zellen transfektiert. Kurz gesagt wurden CV1 EBNA-Zellen mit einer Dichte von 2 × 106 Zellen pro 10 cm Schale in 10 ml Dulbeccos Minimal Essential Medium, ergänzt durch 10% Kalbsföttusserum (Medium), aufgetragen. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C stehengelassen, um anhaften zu können. Das Medium wurde durch 1,5 ml des Mediums mir 66,7 μm Chloroquin und einer DNA-Mischung mit 5 μg cDNA, welche mCD40-L codiert, ersetzt. Auch ein Medium mit 175 μl und 25 μl DEAE-Dextran (4 mg/ml in PBS) wurde den Zellen zugegeben. Die Zellen und die cDNA wurden 5 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die cDNA-Mischung wurden entfernt, und die Zellen wurden 2,5 Minuten lang mit 1 ml frischem Medium mit 10% DMSO abgeschreckt. Das Medium wurde durch frisches Medium ersetzt, und die Zellen wurden mindestens 3 Tage lang gezüchtet.
  • BEISPIEL 7
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von monoklonalen Antikörpern für CD40-L. Die Herstellung von gereinigtem Mäuse-CD40-L oder menschlichem CD40-L erfolgt mittels COS-Zellenexpression und CD40/Fc-Affinitätsreinigung, wie dies in diesem Dokument beschrieben wurde. Gereinigtes CD40-L kann mit Hilfe herkömmlicher Techniken, wie zum Beispiel jenen Techniken, die im US-Patent 4,411,993 beschrieben sind, monoklonale Antikörper gegen CD40-L erzeugen. Kurz gesagt werden Mäuse mit CD40-L als Immunogen immunisiert, das in vollständigem Freund'schem Adjuvans emulgiert worden war, und das ihnen in Mengen von 10–100 μg subcutan oder intraperitonal injiziert worden war. Zehn bis zwölf Tage später wurde die Dosis in den immunisierten Tieren mit zusätzlichem CD40-L aufgefrischt, das in unvollständigem Freund'schem Adjuvans emulgiert worden war. Danach wird die Immunisierung der Mäuse wöchentlich bis zweiwöchentlich aufgefrischt. Serumproben werden in regelmäßigen Zeitabständen durch retro-orbitale Blutung oder Schwanzspitzenexzision entnommen, um einen Dot Blot-Test oder ELISA (Enzym gebundene Immununadsorptionsbestimmung) auf CD40-L-Antikörper durchzuführen.
  • Nach Erkennung eines entsprechenden Antikörper-Titers wird positiven Tieren eine letzte intravenöse Injektion von CD40-L in Salzlösung verabreicht. Drei bis vier Tage später werden die Tiere getötet, um Milzzellen zu ernten, und die Milzzellen werden zu einer Mäusemyelomzelllinie (e. g. NSI oder Ag 8.653) verschmolzen. Durch die Fusionen werden Hybridzellen erzeugt, welche in mehreren Mikrotiter-Platten in einem selektiven HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) aufgetragen werden, um die Proliferation nicht verschmolzener Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhydriden zu hemmen.
  • Die Hybridzellen werden mittels ELISA auf ihre Reaktionsfähigkeit gegen gereinigtes CD40-L gescreent, wobei die in Engvall et al., Immunochem. 8: 871, 1971, und im US-Patent 4,703,004 offenbarten Techniken angepasst wurden. Positive Hybridzellen können intraperitonal in syngeneische BALB/c Mäuse injiziert werden, um Aszites mit hohen Konzentrationen von monoklonalen Anti-CD40-L-Antikörpern zu erzugen. Alternativ dazu können Hybridzellen in vitro in Flaschen oder Rollflaschen durch verschiedene Techniken gezüchtet werden. In Mäuse-Aszites erzeugte monoklonale Antikörper können durch Ammaniumsulfarausfällung und anschließender Gelexklusionschromatographie gereinigt werden. Alternativ dazu kann auch eine Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung von Antikörpern an das Protein A oder Protein G verwendet werden, ebenso wie auch die Affinitätschromatographie basierend auf der Bindung an CD40-L.
  • BEISPIEL 8
  • Dieses Beispiel zeigt die therapeutischen Anti-Allergieeffekte des sCD40 und CD40/Fc Fusionsproteins. lösliches CD40 und CD40/Fc wurde auf deren Fähigkeit hin überprüft, eine IL-4 (5 ng/ml) induzierte IgE-Sekretion in einem MLC-System mit zwei Spendern zu hemmen. Die Daten aus drei Experimenten sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00360001
  • Die IgE-Pegel wurden nach l2 Tagen in der Kultur mittels ELISA getestet. Kurz gesagt wurden Microtiter-Schalen (Corning) mit flachem Boden und 96 Vertiefungen mit MäusemAb Anti-Mensch-IgE (Zymed) mit einer Verdünnung von 1 : 500 in PBS (Phosphatpuffersalzlösung) beschichtet. Nach 3-maligem Waschen wurde ein Blockierungsschritt mit 5% magerer Trockenmilch durchgefürt, gefolgt von einer Titration von menschlichen IgE-Standards oder Testüberständen. Nach 3-maligem Waschen wurde biotinyliertes Anti-Mensch-IgE von der Ziege (Kiregaard und Perry) zu einer 1 : 500 Verdünnung hinzugefügt. Danach wurde eine weitere Waschung durchgefiihrt und Streptavidin-HRP (Zymed) mit einer 1 : 500 Verdünnung zugegeben. Nach einer weiteren Waschung wurde die Reaktion mit einem TMB-Substrat (Kirkegaard und Perry) entwickelt und die Extinktion bei 520 nm gemessen. Alle Waschschritte wurden in PBS plus 0,05% Tween durchgeführt. Alle Inkubationsschritte wurden bei Volumina von 100 μl/Vertiefung für eine Stunde bei Raumremperatur durchgeführt. Die Empfindlichkeit dieses Assays beträgt 100 pg/ml.
  • BEISPIEL 9
  • Dieses Beispiel zeigt die Wirkung von sCD40 und CD40/Fc Fusionsprotein zum Hemmen einer Abspaltung von löslichem CD23 von durch IL-4 (S ng/ml) stimulierten B-Zellen Lösliches CD40 und CD40/Fc wurden auf ihre Fähigkeit hin überprüft, die IL-4 induzierte sCD23-Abspaltung in einem MLC-System mit zwei Spendern zu hemmen. Die Daten von drei Experimentem sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Tabelle 2
    Figure 00370001
  • Die Pegel von löslichem CD23 wurden nach 6 und 12 Tagen in Kultur durch eine kommerziell verfügbare sCD23 ELISA Erkennungsausrüstung (Bioding Site, San Diego, CA) gemessen. Die Empfindlichkeitsgrenze lag bei 500 pg/ml. Ungefähr 1 × 105 Zellen pro Vertiefung wurden in dreifacher Ausführung in Microtiter-Platten und 96 Rundboden-Vertiefungen (Intermountain Scientific, Bountiful UT) für die angegebene Zeit bei Vorhandensein oder Fehlen von Additiven kultiviert, wie dies in Tabelle 2 dargestellt ist. Die Ergebnisse zeigen Anti-Allergieeffekte von sCD40. Ähnliche Studien wurden mir CD40/Fc (Daten nicht angegeben) anstelle von sCD40 durchgeführt, und es wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Daher veranschaulichen diese Daten in den Beispielen 8 und 9 eine Anti-Allergeneigenschaft für CD40.
  • BEISPIEL 10
  • Dieses Beispiel zeigt die B-Zellen-Proliferationsaktivität von membranengebundenem CD40-L für menschliche B-Zellen. Mononucleare Zellen (PBMC) vom menschlichen Peripherieblut wurden aus dem Peripherieblut normaler Freiwilliger mittels Dichtegradientementrifugation über Histopaque® (Sigma, St. Louis, MO) isoliert. T-Zellenabgereicherte Präparate von Zellen (E-) wurden durch Entferner der T-Zellen mittels Rosettierung mit 2-Aminethylisothioruoniumbromid-behandelten SRBC (rote Blutzellen vom Schaf) erhalten, und es wurde eine weitere Dichtegradientenzentrifugadon über Histopaque® durchgeführt. B-Zellen-Proliferationsassays wurden mit E--Präparaten in RPMI-Medium mit hinzugefügtem 10%-igem wärmeinaktivierten Rinderfötusserum (FBS) bei 37°C in einer 10%igen CO2-Atmosphäre durchgeführt. Ungefähr 1 × 105 E- Zellen pro Vertiefung wurden in dreifacher Ausführung in Flachboden Microtiter-Platten (Corning) mit 96 Vertiefungen 7 Tage lang in Gegenwart von transfektierten CV1 EBNA-Zellen (beschrieben im Beispiel 6) kultiviert. Die CV1 EBNA-Zellen wurde mit Mäuse-CD40-L cDNA oder leerem Vektor transfektiert. Die Zellen wurden mit 1 μCi/Vertiefung tritiertem Thymidin (25 Ci/nmol Amersham, Arlington Heights, II,) über die letzten acht Stunden der Kultur gepulst. Die Zellen wurden auf Glasfaserscheiben mit einer automatisierten Zellerntevorrichtung geerntet, und die aufgenommene cpm-Menge wurde mittels Flüssigkeitsszintillationsspektrometrie gemessen.
  • 4a zeigt einen Vergleich zwischen der Proliferation von menschlichen B-Zellen von CV1 EBNA-Zellen, die mit leerem Vektor (HAVEO) transfektiert wurden, und Mäuse-CD40-L cDNA in HAVEO Vektor. Diese Daten zeigen, dass membranengebundenes CD40-L die menschliche B-Zellen-Proliferation bei Fehlen eines Co-Mitogens stimuliert. 4b zeigt ein ähnliches Experiment, jedoch mit dem Unterschied, daß 10 ng/ml von menschlichem IL-4 zu den Kulturen hinzugegeben wurde. Bei diesem Experiment verstärkt IL-4 die mitogene B-Zellen-Aktivität von membranengebundenem Mäuse-CD40-L leicht. 5 ist eine Wiederholung des in 4b gezeigten Experiments. Als das Experiment jedoch wiederholt wurde, gab es keine Anzeichen für eine co-mitogene IL-4-Aktivität. Es gab wiederholten Hinweis auf eine mitogene CD40-L-Aktivität. Demgemäß stimuliert membranengebundenes CD40-L die Proliferation von menschlichen B-Zellen.
  • BEISPIEL 11
  • Dieses Beispiel zeigt die Auswirkungen von membranengebundenem Mäuse-CD40-L auf die Stimulation der IgE-Produktian und die CD23-Abspaltung von E- Zellen, die in Beispiel 10 isoliert wurden. Ungefähr 1 × 105 Zellen/Vertiefung wurden in dreifacher Ausführung in Nune Microtiter-Platten (Intermountain Scientific, Bountiful UT) mit 96 Rundboden-Vertiefungen in Iscoves Modified Dulbecco Medium (IMDM) plus 10% FCS in einer angefeuchteten Atmosphäre von 10% CO2 kultiviert. Das Medium wurde durch 50 μg/ml menschlichem Transferrin (Sigma), 0,55 Rindeneruaialbumin (Sigma) und jeweils 1 μg/ml Oleinsäuxe, Linolsäure und Palmitinsäure (Sigma) ergänzt. Die E- Zellen wurden 10 Tage mit Mäuse-CD40-L oder leerem Vektor in Gegenwart von 5 ng/ml menschlichem IL-4 kultiviert. Eine Titration von CV1 EBNA-Zellen, transfektiert mit Mäuse-CD40-L oder leerem Vektor, wurde zugegeben. Nach zehn Tagen wurden die Kulturüberstände mittels der in Beispiel 8 beschriebenen ELISA-Prozedur auf IgE und mittels der in Beispiel 9 beschriebenen Prozedur auf CD23-Abspaltung überprüft.
  • 6 zeigt einen Vergleich zwischen der IgE-Produktion in den Überständen (in ng/ml) für die Kulturen der E- Zellen und CV1 EBNA-Zellen, welche mir leerem Vektor (HAVEO) oder mit CD40-L transfektiert wurden. Mit bis zu 3000 CV1 EBNA-Zellen wurden keine Unterschiede erkannt, während es zu einer signifikanten IgE-Produktion mit der Zugabe von 10000 oder 30000 CD40-L-transfektierten CV1 EBNA-Zellen kam. Als vergleichsweise E- Zeilen mit Medium alleine, 5 ng/ml EL-4 oder 5 ng/ml IL-4 plus 400 ng/ml G28-5 Antikörper inkubiert wurden, betrug die IgE-Produktion 4,7 bzw. 2,9 bzw. >600 ng/ml. Als die CD23-Abspaltung in 7 gemessen wurde, zeigten 10000 und 30000 CV1 FBNA-Zellen, transfektiert mit CD40-L, eine erhöhte CD23-Abspaltung im Vergleich zu den CV1 EBNA-Kontrohzellen mit leerem Vektor. Als im Vergleich dazu E- Zellen mit Medium alleine, 5 ng/ml IL-4 oder 5 ng/ml IL-4 plus 500 ng/ml G28-5 Antikörper inkubiert wurden, betrug die CD23-Abspaltung <0,1 bzw. 2,4 bzw. 11,2 ng/ml. Diese Daten zeigen, dass sowohl die IgE-Produktion als auch die CD23-Abspaltung biologische Aktivitäten sind, welche mit membranengebundenem CD40-L im Zusammenhang stehen.
  • BEISPIEL 12
  • Dieses Beispiel zeigt die B-Zellen-Proliferationsaktivität, die polyklonale Immunglobulin (Ig)-Produkton, die antigen-spezifische Antikörperbildung und verschiedene Methoden zur Anwendung von membranengebundenem und löslichem CD40-L in klinischen Applikationen. Wir erhielten Mäusemilz-B-Zellen gemäß den in Grabstein et al. I supra, Maliszewski et al. I supra und Maliszewski et al. II supra beschriebenen Prozeduren. Kurz gesagt wurde die vermischte Zellkultur mittels T-Zellen-Abreicherung unter Anwendung des T-Zellen-Antiserums und des Komplements gereinigt, und die Abreicherung von anhaftenden Zellen erfolgte durch die Passage von Sephadex® G10 Säulen und durch positive B-Zellen Selektion mittels Verteilung auf Petrischalen, die mit Anti-Mäuse-IgM von Ziegen beschichte waren. Gereinigte B-Zellen wurden in RPMI,. Kalbsfötusserum (5% für die B-Zellen Proliferationsassays und 20% für Assays für Plaque bildende Zellen oder Assays für polyclonale Antikörper), 2-Mercaptoethanol, Antibiotika, Aminosäuren und Pyruvat kultiviert. Die B-Zellen-Proliferation wurde gemäß dem in Beispiel 10 und in Grabstein et al. I supra, Maliszewski et al. I supra und Maliszewski et al. II supra beschriebenen Assay gemessen. Die antigen-spezifische Antikörperbildung wurde gemäß der in Grabstein et al., J. Mol. Cell. Immunol. 2: 199, 1986 [Grabstein et al., II] gemessen. Kurz gesagt wurden für die antigenspezifische Antikörperbildung rote Blutzellen vom Schaf (SRBC) als Antigen (0,03% v/v) in 2,0 ml Kulturen mit 1 × 106 Mäuse-B-Zellen pro Kultur verwendet. Die B-Zellen-Kulturen wurden 5 Tage lang inkubiert, und Plaque bildende Zellen wurden mittels des hämolytischen Jerne Plaque-Assays bestimmt, der in Grabstein et al. II supra beschrieben ist. Die Zellanzahl wurde in einem Partikelzählgerät bestimmt. Die Sekretion von polyklonalem IgE wurde durch isotopenspezifische ELISA-Assays in Sieben-Tage-Kulturen mit 1 × 106 B-Zellen pro 2,0 ml Kultur bestimmt, wie dies in Maliszewski et al. I supra und Maliszewski et al. II supra beschrieben ist.
  • Die Ergebnisse der B-Zellen-Prolferation durch CV1 EBNA-Zellen, welche mit CD40-L oder leerem Vektor transfektiert wurden, oder 7A1 Zellen (einem T-Zellen-Helferklon) sind in den 8, 10 und 12 dargestellt. Diese Daten zeigen, dass die stärkste B-Zellen-Proliferation durch CD40-L verursacht wurde. Die T-Zellen-Helferzellen 7A1 und 7C2 hatten minimale Auswirkungen auf die B-Zellen-Proliferation.
  • Die Auswirkungen verschiedener Zellen auf die antigen-spezifische Antikörperbildung sind in den 9 und 11 dargestellt. 9 zeigt einen Vergleich von Plaque bildenden Zellen mit den T-Zellen-Helferklon 7A1 und Mäuse-EL40.9-Zellen, die ein lösliches CD40-L sekretieren. Die EL40.9-Zellen scheinen einen hemmenden Effekt auf die antigen-spezifische Antikörperbildung zu haben. 11 zeigt PFC (Plaque bildende Zellen) für die T-Zellen-Helferzellen 7C2 und CV1 EBNA-Zellen, die entweder mit leerem Vektor oder CD40-L transfektiert wurden. Sowohl die 7C2-Zellen als auch membranengebundenes GD40-L stimulierten die antigen-spezifische Antikörperbildung (PFC). 13 vergleicht die antigenspezifische Antikörperbildung von CD40-L und den 7A1-Zellen in Gegenwart oder Fehlen von 10 ng/ml) Interleukin-2 (IL-2). IL-2 verstärkte PFC für 7A1-Zellen, während PFC durch membranengebundenes CD40-L nicht verstärkt wurde.
  • Die polyklonale Ig-Produktion durch Mäuse-B-Zellen wurde im Hinblick auf die Stimulation oder Hemmung mit membranengebundenem CD40-L, CV1 EBNA-Kontrollzellen und Helfer-T-Zellen 7A1 in Gegenwart von Cytokinen IL-4 (10 ng/ml) und IL-5 (1 : 40 Verdünnung von COS-Zellenüberständen) oder ohne hinzugefügte Cytokinen verglichen. Die Mengen an IgA, IgG3, IgE, IgG2b, IgM und IgG1 sind in den Tabellen 3 bis 8 dargestellt.
  • Tabelle 3
    Figure 00410001
  • Tabelle 5
    Figure 00420001
  • Tabelle 6
    Figure 00420002
  • Tabelle 7
    Figure 00430001
  • Tabelle 8
    Figure 00430002
  • Diese Daten zeigen, dass die Interaktion von CD40 mit seinen Liganden die wichtigste molekulare Interaktion ist, welche für den T-Zellenkontakt abhängig von der Induktion des B-Zellenwachstums und der Differenzierung zwischen antigen-spezifischer Antikörper-Produktion und polyklonaler Ig-Sekretion verantwortlich zeichnet. Daher belegen diese Daten, dass die Antagonisten dieser Interaktion, nämlich lösliches CD40, CD40/Fc-Fusionsprotein und möglicherweise lösliches L (monomer), in wesentlicher Weise in die Entwicklung der Antikörper-Reaktionen eingreifen, Daher umfassen klinische Situationen, in denen CD40, CD40/Fc-Fusionsproteine und lösliches CD40-L hilfreich sind, Allergien, Lupus, rheumatische Arthritis, insulinabhängigen Diabetes Mellitus und beliebige andere Krankheiten, bei denen Autoimmun-Antikörper- oder Antigen-/Antikörper-Komplexe verantwortlich für die klinische Pathologie der Krankheit sind. Darüber hinaus ist membranengebundenes CD40-L oder oligomeres lösliches CD40-L nützlich zur Stimulation der B-Zellen-Proliferation und der Antikörper-Produktion. Aus diesem Grund sind diese Formen von CD40-L höchst nützlich für Impfhilfsmittel und als Slimulationsmittel für die mAb-Sekretion von Hydridzellen.
  • BEISPIEL 13
  • Dieses Beispiel zeigt die Auswirkung von membranengebundenem CD40-L auf die Proliferation und die IgE-Sekretion von mononuclearen Peripherieblutzellen (E-). E- Zellen wurden gemäß der in Beispiel 10 beschriebenen Prozedur erhalten und 1 bis l0 Tage lang in Gegenwart von CV1 EBNA Zellen inkubiert, welche mit leerem Vektor oder mCD40-L cDNA transfektiert wurden. Zusätzlich dazu wurde CD40/Fc-Fusionsprotein (beschrieben in Beispiel 1) oder TNF Rezeptor/Fc-Fusionsprotein (beschrieben in WO 91/03553) zu einigen Präparaten hinzugefügt, wie dies in 14 dargestellt ist. Die IgE-Sekretion wurde gemäß der in Beispiel 8 beschriebenen Prozedur gemessen, und die B-Zellen-Proliferation wurde gemäß der in Beispiel 10 beschriebenen Prozedur gemessen.
  • Die Ergebnisse für die B-Zellen-Proliferation und die IgE-Sekretion sind in 14 für fünf unterschiedliche Konzentrationen von transfektierten CV1 EBNA-Zellen dargestellt. Sowohl die B-Zellen-Proliferation als auch die IgE-Sekretion erhöhten sich in Gegenwart von membranengebundenem CD40-L. Durch die Zugabe von CD40/Fc-Fusionsprotein wurde sowohl die B-Zellen-Proliferation als auch die IgE-Sekretion abladiert. Das TNF Rezeptor/Fc-Fusionsprotein hat keine Wirkung. Als Vergleich für die IgE-Sekretion erzeugte die Zugabe von IL-4 als Kontrollmittel (ohne transfektierte CV1 EBNA-Zellen) kein IgE in diesem Assay, und die Zugabe von IL-4 plus G28-5 Anti-CD40 mAb führte zu 29,7 ng/ml IgE in diesem Assay.
  • BEISPIEL 14
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines CD40-L/Fc DNA-Konstrukts zum Exprimieren eines löslichen CD40-L/Fc-Fusionsproteins, das als CD40-L/FC2-Konstrukt bereichnet wird. DNA-codierendes CD40-L/FC2 umfasst Sequenzen, welche ein Leader- (oder ein Signal-) Peptid codieren, eine hydrophile Sequenz mit acht Aminosäuren, welche von Hopp et al. beschrieben ist (Hopp et al., BioTechnology 6: 1204, 1488; bezeichnet als Flag®), eine geeignete Fc-Region eines Immunglobulins, eine [Gly4Ser]3 Wiederholsequenz (beschrieben im US-Patent 5,073,627, welches hierin durch Referenz aufgenommen wird) oder andere geeignete Linkersequenzen, und die extrazelluläre Region des menschlichen CD40-L von der Aminosäure 50 bis zur Aminosäure 261 (SEQ-ID Nr. 11). Ein pDC406 Expressionsvektor, der eine Leadersequenz, Flag®, sowie menschliches IgG1 Fc enthält, wird mit herkömmlichen Techniken des Enzymschneidens und der Ligation von Fragmenten hergestellt, welche eine Leadersequenz, Flag®, und menschliches IgG1 Fc codieren und mit Nsi 1 und Not 1 geschnitten werden.
  • Eine PCR-Technik (Sarki et al., Science 239: 487, 1988) wurde mit 5' (stromaufwärts) und 3' (stromabwärts) Oligonucleotidprimeren verwendet, um die DNA-Sequenzen zu verstärken, welche eine extrazelluläre CD40-Ligandenbindungsdomäne von einem Klonungsvektor codieren, der menschliches GD40-L (ATCC 68873; SEQ-ID Nr. 11) enthält, um ein PCR-Fragment zu bilden. Der stromaufwärtige Oligonucleotidprimer (SEQ-ID Nr. 13) führte eine Nsi 1 Stelle stromaufwäris von einer Linkersequenz ([Gly4Ser]3SerSer) ein, hinter der 21 Nucleotide der extrazellulären Domäne von CD40-L (Aminosäuren 51 bis 57 der SEQ-ID Nr. 11) kamen. Ein stromabwärtiger Oligonucleotidprimer (SEQ-ID Nr. 14) führte eine Not I Stelle unmittelbar stromabwärts vom Terminationscodon des CD40-L ein. Das PCR-Fragment wurde danach in den pDC406 Expressionsvektor ligiert, der eine Leadersequenz, Flag®, und menschliches IgG1 Fc enthielt. Das Nucleotid und die vorhergesagte Aminosäwesequenz von CD40-L/FC2 sind in der SEQ-ID Nr. 15 und der SEQ-ID Nr. 16 dargestellt. Das sich daraus ergebende DNA-Konstrukt (CD40-L/FC2) wurde in die Affennierenzelllinie CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) transfektiert. Das Konstrukt codierte ein lösliches CD40-L, welches CD40 binden konnte, was durch die Bindung veranschaulicht wurde, welche bei der fluoreszenzaktivierten Sortierungsanalyse (FACS) beobachtet wurde, bei der Zellen verwendet wurden, welche CD40 exprimierten.
  • Es wurden Großmaßstabs Kulturen von aus menschlichen Embryonieren 293 Zellen (ATCC CRL 1573), transfektiert mit dem Konstrukt, welches CD40-L/FC2 codierte, gezüchtet, um einen Überstand zu sammeln, der CD40-L/FC2 enthielt. Die 293 Zelllinie, eine permanente Linie der primären menschlichen Embryoniere, transformiert durch menschliche Adenovirus 5-DNA, ermöglicht die Expression von rekombinanten Proteinen, ligiert in den pCD406-Vektor. Das CD40-L/FC2 Fusionsprotein in der Überstandsflüssigkeit wurde durch Affinitätsreinigung gereinigt. Kurz gesagt wurde der Kulturüberstand, der das CD40-L/FC2 Fusionsprotein enthielt, durch Filtrierung der Säugetierzellenüberstände (z. B. in einem 0,45 μ Filter) gereinigt, und das Filtrat wurde bei 4°C bei einer Durchflussleistung von etwa 60 bis 80 ml/h für eine 1,5 cm × 12,0 cm große Säule auf eine Antikörper-Affinitätssäule aufgetragen, welche biotinyliertes Anti-Menschen-IgG von Ziegen (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Westgrove, PA, USA) umfasste, gekoppelt an Streptavidin-Agarose (Pierce Chemical, Rockford, IL, USA). Die Säule wurde mit ungefähr 20 Säulenvolumina PBS (Phosphatpuffersalzlösung) gewaschen, bis kein freies Protein mehr in der Waschlösung gefunden werden konnte. Gebundenes Fusionsprotein wurde mit 12,5 mM Citratpuffer, 75 mM NaCl, pH 2,8, aus der Säule eluiert und mit 500 mM Hepespuffer, pH 9,1, auf einen pH-Wert von 7 gebracht. Das gereinigte, oligomere CD40-L/FC2-Peptid induzierte die menschliche B-Zellen-Proliferation unter Abwesenheit jeglichen Co-Stimulansmittels und führte (in Verbindung mit dem geeigneten Cytokin) zur Produktion von IgG, IgE, IgA und IgM, wie dies im Beispiel 12 für membranengebundenes CD40-L beschrieben ist.
  • BEISPIEL 15
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines CD40-L DNA-Konstrukts zum Exprimieren eines löslichen CD40-L Fusionsproteins, das als trimeres CD40-L bezeichnet wird. Trimeres CD40-L enthält eine Leadersequenz, eine 33 Aminosäuresequenz, die als "Leuzinzipper" (SEQ-ID Nr. 17) bezeichnet wird, und eine hydrophile Acht-Aminosäuresequenz, die von Hopp et al. (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988; bezeichnet als Flag®) beschrieben wird, gefolgt von der extrazellulären Region des menschlichen CD40-L von der Aminosäure 50 bis zur Aminosäure 261 (SEQ-ID Nr. 1 L). Die Verwendbarkeit der Leader- und der Flag®-Sequenzen wurden in der detaillierten Beschreibung beschrieben. Die in der SEQ-ID Nr. 17 präsentierte 33 Aminosäuresequenz trimerisiert spontan in Lösung. Fusionsproteine, welche diese 33 Aminosäuresequenz umfassen, bilden daher erwartungsgemäß spontan Trimere oder Multimere.
  • Das Konstrukt wird durch Synthetisierung von Oligonucleotiden hergestellt, welche eine Leadersequenz, nämlich die oben beschriebene 33 Aminosäuresequenz, und die Flag®-Sequenz repräsentieren. Danach wird das fertige Produkt in ein DNA-Fragment ligiert, welches die Aminosäuren 51 bis 261 der SEQ-ID Nr. 11 codieren, hergestellt gemäß der im Beispiel 14 enthaltenen Beschreibung.
  • Das resultierende Ligationsprodukt im Expressionsvektor pDC406 wurde in die Affennierenzelllinie CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) transfektiert. Das pDC406 Plasmid umfasst Regulationssequenzen, welche von SV40, dem menschlichen Immunschwächevirus (HIV) und dem Epstein-Barr-Virus (EBV) abgeleitet sind. Die CV-1/EBNA-Zelllinie wurde durch Transfektion von der CV-1 Zelllinie mit einem Gen abgeleitet, welches das Kernantigen-1 (EBNA-1) des Epstein-Barr-Virus codiert, das auf konstitutive Weise EBNA-1 exprimiert gesteuert vom menschlichen CMV Zwischen-/Früh-Enhancer bzw. Promoter. Das EBNA-1 Gen ermöglicht die episomale Replikation von Expressionsvektoren wie zum Beispiel pDC406, welche den EBV-Replikationsstartpunkt enthalten.
  • Nachdem Zellen, welche das Fusionsprodukt exprimiereq identifiziert wurden, wurden Großmaßstab Kulturen von transfektierten Zellen gezüchtet, um Überstand von Zellen zu sammeln, welche trimeres CD40-L exprimieren. Das trimere CD40-L Fusionsprotein in der Überstandsflüssigkeit wird mittels Affinitätsreinigung gereinigt, wie dies im wesentlichen im US-Patent 5,011,912 beschrieben ist. Silbergefärbte SDS-Gele des eluierten CD40-L Fusionsproteins können zur Bestimmung der Reinheit hergestellt werden.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00480001
  • Figure 00490001
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  • Figure 00690001
  • Figure 00700001

Claims (2)

  1. Isolierter, mit CD40-L immunreaktiver monaklonaler Antikörper, ausgewählt aus: (a) dem durch die Aminosäuren 1 bis einschließlich 261 definierten Polypeptid der in der SEQ-iD Nr. 11 angeführten Sequenz; (b) dem durch die Aminosäuren 47 bis einschließlich 261 definierten Polypeptid der in der SEQ-ID Nr. 11 angefühhrten Sequenz; und (c) einem Polypeptid, das durch eine Sequenz beginnend mit einer Aminosäure im der Sequenz zwischen Aminosäure 47 und einschließlich Aminosäure 51 bis einschließlich einer Aminosäure in der Sequenz zwischen Aminosäure 239 und einschließlich Aminosäure 261, einschließlich der in der SEQ-ID Nr. 11 angeführten Sequenz definiert wird.
  2. Isolierter, mit Ratten-CD40-L immunreaktiver monoklonaler Antikörper, wobei das Ratten-CD40-L ausgewählt wird aus: (a) dem durch Aminosäuren 1 bis einschließlich 260 definierten Polypeptid der in der SEQ-ID Nr. 1 angeführten Sequenz; (b) dem durch Aminosäuren 47 bis einschließlich 260 definierten Polypeptid der in der SEQ-ID Nr. 1 angeführten Sequenz.
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