FI116850B - CD40-L-polypeptidiä koodaavia nukleiinihappoja ja niiden käyttö - Google Patents

CD40-L-polypeptidiä koodaavia nukleiinihappoja ja niiden käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI116850B
FI116850B FI941837A FI941837A FI116850B FI 116850 B FI116850 B FI 116850B FI 941837 A FI941837 A FI 941837A FI 941837 A FI941837 A FI 941837A FI 116850 B FI116850 B FI 116850B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
protein
dna
seq
sequence
cells
Prior art date
Application number
FI941837A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI941837A0 (fi
FI941837A (fi
Inventor
Richard J Armitage
William C Fanslow
Melanie K Spriggs
Subhashini Srinivasan
Original Assignee
Immunex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27120174&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI116850(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunex Corp filed Critical Immunex Corp
Publication of FI941837A0 publication Critical patent/FI941837A0/fi
Publication of FI941837A publication Critical patent/FI941837A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI116850B publication Critical patent/FI116850B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

11 CD40-L-polypeptidiä koodaavia nukleiinihappoja j; käyttö
Keksinnön tekninen alue 5 Esillä oleva keksintö liittyy sytokiiniin.
sesti keksintö koskee rottaeläimen ja ihmisen s CD40-L-polypeptidin kloonausta, joka sitoutuu ihmis proteiiniin, jolla polypeptidillä on sekä agonis antagonistiaktiivisuutta liukoisessa ja membraanii 10 tuneessa muodossa. Keksinnön kohteena on polypepti daava DNA, rekombinanttiekspressio vektori, isänt oligonukleotidi. Keksinnön kohteena on lisäksi n CD40-L-polypeptidin valmistamiseksi sekä menetelm polypeptidiä käytetään hybridoomasolujen stimuloimi 15 Keksinnön tausta
Sytokiinit, joita merkitään nimellä "inte nit", ovat niitä proteiinitekijöitä, jotka vaikutt muunivaikuttajasoluihin. On julkaistu sytokiinit merkitään nimillä interleukiini-1 - interleukiini-3 20 on nimetty interleukiiniksi. Muut tunnetut sytoki *·. sältävät kasvaimen nekroositekijän (TNF) , granu] • * · I. . makrofaagin pesäkkeen kasvua stimuloivan tekijän < \ ;* granulosyytin pesäkkeen kasvua stimuloivan * * * *·’·] (G-CSF) , mastosolun kasvutekijän (MGF) , epidermaali * * 25 vutekijän (EGF), verihiutaleista peräisin olevan ke jän (PDGF), hermosolun kasvutekijän (NGF) , erytropc « * V : (EPO), y-interferonin (γ -IFN) ja muut.
DNA: t kahdelle eri TNF-reseptorilie (tyj • ;*: ja tyypille II) on kloonattu (Smith et ai., ····· 30 248:1019, 1990 ja Schall et ai., Cell 61:361, 1990) • · » • mah TKTT? - r OQonh r\r i mnAHnh nvaf en iiri is f η-ί σι 1 1 αλπ ·ί a m 2 11 ai., Cell 66:233, 1991) ja rottaeläimen 4-lBB-r« (Kwon et ai., Cell. Immunol. 121:414, 1989 [Kwon e ja Kwon et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:19 [Kwon et ai. II]) .
5 Ihmisen CD40-proteiini (CD40) on 277 aminot tuinen peptidi, jonka molekyylipaino on 30 600 ja 19 aminohapon pituinen erityssignaalipeptidi, joka pääasiassa hydrofobisia aminohappoja (Stamenkovic Ihmisen kypsän CD40-proteiinin (glykosyloitumattorric 10 kyylipaino on 28 300. Ihmisen CD4 0-proteiinia ke cDNA eristettiin cDNA-kirjastosta, joka oli va] Burkittin lymfoomasolulinjasta Raji. CD40-cDNA:n ke mahdollinen proteiini sisältää mahdollisen sekvenssin, membraanin läpi menevän domeenin ja use 15 ta ominaisuuksia, jotka ovat yleisiä membraaniin si reseptoriproteiineilla. CD40-proteiinin on havail pressoituvan B-lymfosyyteissä, epiteelisoluissa ja karsinoomasolulinjoissa.
CD40-proteiinia vastaan olevan monoklonaali 20 ta-aineen (mAb) on osoitettu välittävän useita toin •*e siä vaikutuksia ihmisen B-soluissa. Nämä vaikutukse • ·· . tävät: (a) homotyyppiset adheesiot (Gordon • · · J. Immunol. 140:1425, 1988 [Gordon et ai. I]; (b) • * · ***** neen solukoon (Gordon et ai. I ja Valle et a.
‘ * 25 J. Immunol. 19:1463, 1989); (c) sellaisten B-soli sääntymisen, jotka on aktivoitu anti-IgM-proteiini ·.· · ti-CD20-mAb-proteiinilla, forboliesterillä yksinää et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:4494, 1986 j : **i et ai., J. Immunol. 142:590, 1989) tai forboliestez *** · 30 dessä interleukiini-4-proteiinin kanssa (Gordon **· • Rii-r .T TmmiinAl Π . 1 CT O C 1 QQ1 λ4- -n 1 ττΊ 3 11
Erään sellaisen vasta-aineen, jota kutsuta; lä mAb 89, jonka ovat kuvanneet Banchereau et ai Immunol. Spectrum 3:8, 1991) [Banchereau et ai. I] , t i in indusoivan ihmi sen B-soluj en kasvua suhteel1 5 tiaisilla vasta-ainekonsentraatioilla (30 ng/ml tai 10 M) . Lisääntyminen kesti 2-3 viikkoa ja se jc menkertaiseen ihmisen B-solupopulaation laajenemi solujen optimaalinen stimulaatio tapahtui, ku pintamolekyyli ristisidottiin IgM-proteiinin kanss; 10 anti-CD40-mAb-proteiinin Fab-fragmentit indusoivat taan heikon lisääntymisvasteen. Lisäksi, Banchereai Science 251:70, 1991) [Banchereau et ai. II] jull että lepotilassa olevat ihmisen B-solut saavuttivat lisääntymistilan, kun niitä inkuboitiin sekä rott 15 fibroblast isen Ltk’solulinjan, joka oli trai tu ihmisen Fc-reseptorilla, että ihmisen CD40-prot spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa. B; et ai. II havaitsivat, että CD40-proteiinin ristii 011 tarpeen B-solujen kloonalista ekspansiota varte 20 CD23 on IgE-reseptori, jolla on matala aff: •1# ja jonka on havaittu ekspressoituvan useimmissa . IgM"/IgD" B-soluissa, mutta ei T-soluissa. CD23 on • 1 1 2 soitu ja sen sekvenssin kuvasivat Kikutani et a • # 2 aa1 2 *·'·' 47:657, 1986. Liukoisen CD23-proteiinin (sCD23) he ‘ · 25 indusoivan pyrogeenisen reaktion kaneissa ja tämä ..ΙΓ kumoutui annettaessa ihmisen IgE-proteiinia (Ghe 5,5 5 ai., Immunology 73:510, 1991). Sen vuoksi CD23 voi piva merkki liukoisen CD40- tai CD40-L-proteiinin λ • 2· sista.
• M 1 .···. 30 Ennen esillä olevaa keksintöä CD40-protei a a a • λ! i hnnh Ama f Λη Cδπ mi ΐ ί -¾ Ί Ί -¾ λπ , > edustavan CD40-L-cDNA:n nukleotidisekvenssi ja ei
aminohapposekvenssi on kuvattu sekvenssissä SEQ ID
ja kuviossa 1, ja aminohapposekvenssi on myös listi venssissä SEQ ID numero 2. Ihmisen edustavan CD4 0- 5 nukleotidisekvenssi ja ennustettu aminohapposekv kuvattu sekvenssissä SEQ ID numero 11 ja kuviosi aminohapposekvenssi on myös listattu sekvenssissä numero 12. Tässä esitetään lisäksi muita CD40-L- tidejä, joita koodattavat sellaiset nukleotidisei 10 jotka hybridisoituvat keskinkertaisissa tai ankard suhteissa sekvenssin SEQ ID numero 11 määrittelemd timiin (ihmisen CD40-L-proteiinia koodittava alu venssifragmenttien ulottuessa nukleotidista 46 nuk] 828 sekvenssissä SEQ ID numero 11, tai kuvion 2 s« 15 (SEQ ID numero 11) tai sen fragmenttien kanssa k< taarisiin DNA- tai RNA-sekvensseihin. Keksintö sis£ saksi nukleiinihapposekvenssit, jotka johtuen ger koodin degeneraatiosta koodittavat polypeptideje ovat oleellisesti identtisiä tai oleellisesti sar 20 niiden polypeptidien kanssa, joita yllä kuvatut m ..e happosekvenssit koodittavat, ja niiden komplemei • * # I.. sekvenssit. Keksinnön mukaiselle eristetylle DNi « * \ ·* tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1, 3, • * · **’·* esitetään. Keksinnön mukaiselle rekombinanttiekspre • * 25 torille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimu ..ΙΓ tai 7 esitetään, ja isäntäsolulle se, mitä patent * * · V * muksessa 8 tai 9 esitetään. Keksinnön mukaiselle mälle CD40-L-polypeptidin valmistamiseksi on tunm ; se, mitä patenttivaatimuksessa 10 tai 11 esitetään **· t 30 netelmälle hybridoomasolujen stimuloimieksi in viti • · *
• 55 1 ΠΟ-ηνΊ ti r\r 00η Ί ΐ a m ! «λΪτπ ^ «λ ^ ^ aw*· 4- J J
5 laisten EL-4-solujen, jotka on lajiteltu tässä kuv; tinyloidun CD40/Fc-fuusioproteiinin perusteella, tanteista. Liukoinen CD40-L-proteiini sisältää proteiinin solunulkoisen alueen tai sen fragmentii 5 eläimen CD40-L-proteiinin proteiinisekvenssi on ku1 viossa 1 ja sekvenssissä SEQ ID numero 2, ja ihmii L-proteiinin sekvenssi kuviossa 2 ja sekvenssiss. numero 12. Rottaeläimen CD40-L-proteiinin solu] alue ulottuu aminohaposta 47 aminohappoon 260 kuvi< 10 sekvenssissä SEQ ID numero 2, ja ihmisen proteiinissa aminohaposta 47 aminohappoon 261 kuvi( sekvenssissä SEQ ID numero 12. CD40-L-proteiinin b. aktiivisuutta välittää tämän sytokiinin sitoutumii proteiinin kanssa ja se sisältää B-solujen lisääni 15 vasta-aineiden, sisältäen IgE-vasta-aineen, erittyi duktion.
Esillä oleva keksintö koskee lisäksi antis< sense-oligonukleotideja {deoksiribonukleotidit tai leotidit), jotka vastaavat sekvenssiä, joka on ain< 20 12 nukleotidin pituinen, jotka on valittu
.. nukleotidisekvenssistä tai DNA- tai RNA-sekvesseisI
• « • · · . ovat komplementaarisia sille CD40-L-nukleotidisekv< * · *
** joka on kuvattu sekvensseissä SEQ ID numero 1 ja SI
• · i *«V mero 11 ja kuvioissa 1 ja 2. Sellaiset antisense- *:**s 25 se-oligonukleotidit estävät CD40-L-mRNA:n tai poly] transkription tai translaation. Keksinnön mukaiset :#ί : nukleotidille on tunnusomaista se, mitä patenttia sessa 13 tai 14 esitetään.
• ·*; Lisäksi tässä esitetään CD40-L-peptidifr; ·*· i *···. 30 jotka vastaavat proteiinisekvenssiä, joka on ai: Γ 6 geenideterminantteinä muodostettaessa CD40-L-prot spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita.
Edelleen tässä esitetään ihmisen fuusioproteiini ja liukoinen CD40-proteiini (sCD4C 5 sisältävät ihmisen CD40-proteiinin solunulkoisen
Sekä sCD40-proteiini että CD40/Fc-fuusioproteiin; inhiboida CD40-L-proteiinin tai monoklonaalisen ai vasta-aineen indusoiman B-solun stimulaation, proteiinin indusoiman IgE-stimulaation ja IL-4-p] 10 indusoiman CD23-proteiinin induktion B-soluissa.
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 kuvaa nukleotidi- ja aminohapposel· jotka vastaavat rottaeläimen CD40-L-proteiinin seki Tämä proteiini on tyypin II polypeptidi, jonka N-pi 15 solunsisäinen domeeni, jota seuraa membraanin läpi alue ja solunulkoinen domeeni polypeptidin C-pää lunulkoinen domeeni, joka on pitempi kuin joko so] nen domeeni tai membraanin läpi kulkeva alue, sisä den mahdollisen N-sidoksellisen glykosylaatiokohdar 20 si mahdollista disulfidisidosta neljän kysteiinije (Cys) vuoksi.
• *· I. . Kuvio 2 kuvaa nukleotidi- ja aminohapposel· \ \ jotka vastaavat ihmisen CD40-L-proteiinin sekvensse * * · ’·*·* proteiini on tyypin II polypeptidi, jonka N-pää on ' * 25 lunsisäinen domeeni, jota seuraa membraanin läpi ...Γ alue ja solunulkoinen domeeni polypeptidin C-pää V : lunulkoinen domeeni, joka on pitempi kuin joko so] nen domeeni tai membraanin läpi kulkeva alue, sisä jj‘: den mahdollisen N-sidoksellisen glykosylaatiokohdar 3 0 si mahdollista disulf idisidosta viiden kysteiinijä ·*· • (C\rci \ imnlrai 7 misen, jonka aiheutti inkubaatio sellaiste solujen kanssa, jotka oli transfektoitu täyspitkäl] eläimen CD40-L-CDNA:11a (SEQ ID numero 1) ja jotka soivat sitoutunutta CD40-L-proteiinia (CD40-L+C^ 5 verrattuna sellaisiin CVl-soluihin, jotka oli trans tyhjällä vektorilla (HAVEO) ja jotka eivät eks neet sitoutunutta rottaeläimen CD40-L-proteiinia. ^ den 7 lisääntymistulokset osoittavat, että CD40-L+( kohottavat merkittävästi T-soluista tyhjennettyj< 10 solujen lisääntymistä interleukiini-4-proteiinin läsnä- tai poissaollessa.
Kuvio 5 kuvaa toisen T-soluista tyhjei PBMC-solujen lisääntymisen määrityksen, jossa oli sitoutunutta rottaeläimen CD40-L-proteiinia ja 10 15 proteiinia/ml. Nämä tulokset eivät osoita mitään 3 togeenista IL-4-proteiinin vaikutusta, mutta sit CD40-L-proteiinin jatkuvan vahvan mitogeenisen vail· Kuvio 6 kuvaa, että sitoutunut CD40-L-proteiini li proteiinin eritystä.
20 Kuvio 7 kuvaa, että membraaniin sitoutunut .. proteiini stimuloi CD23-proteiinin erittymistä \e ** proteiinin läsnä ollessa.
• * * • ·* Kuvio 8 kuvaa rottaeläimen pernan B-solujer • t * *·*.' tymisen, jonka aiheuttivat membraaniin sitoutunui ***** 2 5 eläimen CD4 0-L-proteiini tai 7Al-solut, joka on au * ··* soluklooni.
···· ΓΓ: Kuvio 9 kuvaa rottaeläimen EL40.9-solujen, lajiteltu solulinja, joka lajiteltiin sen perusteel • /. se ekspressoi rottaeläimen CD40-L-proteiinia, ja 1 ··* · .···. 30 7A1 vertailun antigeenispesifisen vasteen indusoi m "i lra λγά σ h" oon nam 4-1- i tra 4- t^l aL-b-Q-i ^ mi 8 11 osoitti merkittävästi suuremman B-solun lisääntym hostavan aktiivisuuden kuin auttajasoluklooni t kontrollisolut.
Kuvio 11 kuvaa, että rottaeläimen CD40-L-5 transfektoidut 7C2- (auttaja-T-soluklooni) ja CVl-s dusoivat anti-SCBC-plakkeja muodostavia soluja.
Kuvio 12 kuvaa kahden auttaja-T-solukloonii lun, jotka solut ekspressoivat membraaniin site CD40-L-proteiinia, rottaeläimen B-solujen lisääntyr 10 dusoimisessa.
Kuvio 13 kuvaa membraaniin sitoutuneen proteiinin ja auttaja-T-solukloonin aiheuttaman ant pesifisten plakkeja muodostavien solujen induktior interleukiini-2-proteiinin (IL-2) läsnä- tai poissa 15 Kuvio 14 kuvaa membraaniin sitoutuneen proteiinin vaikutukset B-solujen lisääntymisen proteiinin erityksen stimuloimisessa. Membraaniin neen CD40-L-proteiinin vaikutukset inhiboituiva reseptorilla, mutta eivät TNF-reseptorilla.
20 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ·· Uudet polypeptidit, jotka voivat toimia ] • ·· . rottaeläimen ja ihmisen CD40-proteiinilie, on eris ees ·* sekvensoitu. Erikoisemmin, näitä ligandeja ko< * · e *·*·* cDNA:t on kloonattu ja sekvensoitu. Lisäksi on esit * • ! 25 netelmät CD40-L-rekombinanttipolypeptidien ekspress e si. CD40-L-polypeptidi sisältää muut nisäkkään i muodot, kuten ihmisen tai rottaeläimen CD40-L-pi johdannaiset tai analogit. Rottaeläimen ja ihmiser • ·*· proteiini sisältää 214 ja 215, vastaavasti, amino! ·«« i 1 ··· 0 tuisen solunulkoisen alueen C-päässä täyspitkässä 9 Tässä kuvataan myös täyspitkät CD40-L-polypeptidit den fragmentit, jotka sisältävät solunulkoisen alu< naan tai osan siitä, tai solunulkoisen alueen job ja nisäkässolut, jotka on transfektoitu cDNA:lla, ; 5 dittaa rottaeläimen tai ihmisen CD40-L-proteiinia, ekspressoivat ihmisen tai rottaeläimen CD40-L-p; membraaniin sitoutuneena proteiinina.
Esillä oleva keksintö sisältää eristet sekvenssit, jotka koodittavat CD40-L-polypeptidejä 10 tai RNA-sekvenssit, jotka ovat komplementaarisia s< le eristetyille DNA-sekvensseille. Eristetyt DNA-s< ja niiden komplementit valitaan ryhmästä, joka sis; nukleotidit 184 - 828, nukleotidit 193 - 828 tai i dit 193 - 762 kuviossa 2 kuvatusta DNA-sekvenssistä 15 numero 11) ja niiden komplementit, (b) DNA-sekvens! ka hybridisoituvat DNA-sekvensseihin (a) tai niide] mentteihin keskinkertaisen ankaruuden olosuhteissa koodittavat CD40-L-polypeptidiä, niiden analogit dannaiset ja (c) DNA-sekvenssit, jotka johtuen ge] 20 koodin degeneraatiosta koodittavat niitä polypeptide ja, joita edellä mainitut DNA-sekvens s i1 • 1» *., den komplementit koodittavat. Lisäksi, esillä olev; * 1 1 ;1 tö sisältää vektorit, jotka sisältävät DNA-sekvensi « « 4 ka koodittavat CD40-L-polypeptidejä ja analogeja, · 25 täsolut, jotka on transfektoitu sellaisilla vektore * Tässä kuvattu uusi sytokiini on liganc ί proteiinille, joka on reseptori, joka on TNF-resej suurryhmän jäsen. Sen vuoksi CD40-L-proteiini on • köisesti vastuussa signaalin kuljettamisesta .1··. 3 0 proteiinin kautta, jonka tiedetään ekspressoituvar 10 11 solujen viljelysupernatanteista, jotka ekspressoi\ L-proteiinin membraaniin sitoutunutta muotoa. Rott CD40-L-proteiinin solunulkoisen alueen proteiinii ulottuu aminohaposta 47 aminohappoon 260 kuviossa : 5 venssissä SEQ ID numero 2. Ihmisen CD40-L-protei lunulkoisen alueen proteiinisekvenssi ulottuu amii 47 aminohappoon 261 kuviossa 2 ja sekvenssissä SEQ ro 12. CD40-L-proteiinin biologisen aktiivisuuden sen sitoutuminen CD40-proteiiniin tai sen lajispc 10 homologiin ja se sisältää B-solujen lisääntymisen noglobuliinin erityksen induktion aktivoiduista B-i CD40-L-proteiini (sisältäen liukoiset monomeeriset gomeeriset muodot kuin myös membraaniin sitoutuneet voi vaikuttaa B-solujen lisääntymiseen ja immunoglc 15 eritykseen {lukuunottamatta IgE-proteiinin erityst lisätyn IL-4-proteiinin läsnäoloa, joka on päim anti-CD40-vasta-aineille, jotka vaativat IL-4-prot€ ristisitomista aktiivisuuden välittämiseksi.
CD40-L viittaa polypeptidien lajiin, joka 20 sitoutumaan CD40-proteiiniin tai nisäkkään CD40-pj •-e homologeihin. Tässä käytettynä termi "CD40-L" sisä] • ·* !, . koiset CD40-L-polypeptidit, joista puuttuu membraa • * * ·, l kulkevat ja solunsisäiset alueet, nisäkkäiden homo] • · *·*·* misen CD40-L-proteiinille, ihmisen tai rottaeläimer • * 25 analogit tai ihmisen tai rottaeläimen CD40-L-johdan ••ΙΓ CD40-L-proteiini voidaan myös saada sellaie ··· I leotidisekvenssien mutaatiolla, jotka koodittavat polypeptidiä. CD40-L-analogi, kuten tässä viitataar • ·*: lypeptidi, joka on oleellisesti homologinen ihm: ··· · ."** 30 rottaeläimen CD40-L-proteiinin sekvenssille, mutta *·*
• Δ y· 1 *1 3 Ί ΤΊ Δη svn 1 ΙΛλΊ^ ^ TOTI n Ί 1»··» « 4 w Tn mnm A Π H 4 a A A A
11 lä ja ligaatiolla tai kohdennetulla mutageneesime lä.
Ihmisen tai rottaeläimen CD40-L-proteiinii rista aminohapporakennetta voidaan modifioida 5 johdannaisten luomiseksi muodostamalla kovalentt aggregoituvat konjugaatit muiden kemiallisten ryhm sa, kuten glykosyyliryhmien, lipidien, fosfaatin, ryhmien ja niiden kaltaisten kanssa, tai luomalla posekvenssimutantit. CD40-L-proteiinin kovalentti 10 dannaiset on valmistettu liittämällä tietyt toimi: ryhmät CD40-L-proteiinin aminohappojen sivuketju CD40-L-polypeptidin N-päähän tai C-päähän tai sen koiseen domeeniin. Muut esillä olevan keksinnön kuuluvat CD40-L-johdannaiset sisältävät CD40-L-p 15 tai sen fragmenttien kovalenttiset tai aggregoituv gaatit muiden proteiinien tai polypeptidien kansi syntetisoimalla rekombinanttiviljelmässä N-pään ti fuusioina. Konjugaatti voi sisältää esimerkiksi tai leader-polypeptidisekvenssin CD40-L-polypeptid; 20 tai C-pään alueella, joka sekvenssi translaation a -.e translaation jälkeen ohjaa konjugaatin siirtymistä * «· , teesikohdasta solumembraanin tai soluseinän sisä- • · * \ puolella olevaan kohtaan (esim. Saccharomyces-h • * · ***·| tekijän leader-sekvenssi) . CD40-L-polypeptidifuusii • · 25 sisältää polypeptidejä, jotka on lisätty CD40-L-p: ,.ΙΓ puhdistuksen ja tunnistuksen tehostamiseksi (esi V 2 His), tai fuusiot muiden sytokiinien kanssa uusi funktionaalisten kokonaisuuksien saamiseksi. Muut ; ·*· nit sisältävät esimerkiksi mitkä tahansa interleuk: ·«« · .*··* 30 13, TNF-proteiinin (kasvaimen nekroosi tekijä) , 12 ropoietiini), γ -IFN-proteiinin (γ -interferoni), proteiinin (4-lBB-ligandi) ja muut sytokiinit, jc kuttavat immuunisolujen kasvuun, lisääntymiseen ta: taan.
5 Esillä olevan keksinnön piiriin kuuluvat m happosekvenssit sisältävät DNA- ja/tai RNA-sekvensi ka hybridisoituvat sekvenssin SEQ ID numero 1 ta numero 11 nukleotidisekvenssiin tai niiden kömpiei siin juosteisiin keskinkertaisissa tai ankarissa 10 teissä. Keskinkertaisen ankaruuden sisältävät hy] tio-olosuhteet viittaavat olosuhteisiin, jotka or esimerkiksi teoksessa Sambrook et ai., Molecular C.
Laboratory Manual, 2. painos, osa 1, sivut 1.10
Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Kesk: 15 sen ankaruuden sisältävät olosuhteet, kuten Sambro< ovat ne määritelleet, sisältävät sellaisen esipesi
käytön, joka on 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA
ja hybridisaatio-olosuhteet 50 °C:ssa, 5 x SSC -1: yli yön. Ankarat olosuhteet sisältävät korkeammat 20 lat hybridisaatiossa ja pesussa.
·· CD40-L-proteiinin biologinen aktiivisuus • «· l. , määrittää esimerkiksi antamalla kilpailla sitoul • * » “e ; CD40-proteiinin ligandia sitovaan domeeniin (se tai • « · ***** kompetetiiviset sitomistestit) . Sekä rottaeläimen
•••»S
• · 2 5 misen CD4 0 -L-protenni sitoutuu ihmisen CD40 -prot ,.*;* Rottaeläimen CD40-L-proteiinin (ekspressoitu lajit : rottaeläimen EL-40.9-soluissa) sitoutumisaffiniteet sen CD40-proteiiniin oli noin 1,74 x 109 M"1. Samal] • ·*; la, rottaeläimen CD40-L-proteiinin (ekspressoitu le
• M I
,···, 30 mattomissa rottaeläimen EL-46.1-soluissa) sitoutum: ***** ...... .... ..... _ . . o 13 (SEQ ID numero 1) tai kuvion 2 mukaista ihmiser proteiinia (SEQ ID numero 11) ja CD40-proteiinia soivia koskemattomia soluja (esim. ihmisen B-solu; kemattomien solujen tilalla voidaan käyttää liukoii 5 proteiinia {kuten CD40/Fc-fuusioproteiinia), joka < tu kiinteään faasiin proteiini A tai prot -interaktiolla fuusioproteiinin Fc-alueen väli Toisessa kompetetiivisen sitoutumistestin muodoss tään radioaktiivisesta leimattua liukoista CD40-pr< 10 kuten CD40/Fc-fuusioproteiinia, ja koskemattomia jotka ekspressoivat CD40-L-proteiinia. Liukoinen proteiini voi vaihtoehtoisesti olla sidottu kiint< siin.
Kompetetiiviset sitoutumistestit voidaan : 15 käyttäen standardimenetelmiä. Radioaktiivisesti rottaeläimen CD40-L-proteiinia voidaan esimerkiksi kilpailemaan mahdollisen CD40-L-homologin kanssa sidottua CD40-proteiinia vastaan olevan sitoutumii suuden testaamiseksi. Kompetetiivisilla autoradio1 2 3 20 vytesteillä voidaan saada kvalitatiivisia tulo]
Scatchard-kaaviota voidaan käyttää kvantitatiivista • ·» *. . ten muodostamiseksi.
» ft » .···* 3 0 toituja COS-soluja, jotka ekspressoivat membraanii ··♦ 4 i Kompetetiiviset sitoutumistestit CD40-p] * · « 2 ***** ekspressoivien koskemattomien solujen kanssa void * · 25 rittaa kahdella menetelmällä. Ensimmäisessä menete^ ..ΙΓ solut kasvatetaan joko suspensiossa tai kiinnittyr 3 I,! · dosviljelymaljoihin. Kiinnittyneet solut voidaa taa käsittelemällä 5 mM EDTA-liuoksella 10 r • ·1; 37 °C:ssa. Toisessa menetelmässä voidaan käyttää t **· » 14 11
Vaihtoehtoisesti liukoinen CD40-proteiini sitoa kiinteään faasiin, kuten pylväskromatografi siin tai putkeen tai sen kaltaiseen substraattiin, sopiva sellaisen tunnistettavan ryhmän, kuten 125I:r 5 olon analyysiä varten. Sitominen kiinteään faasiir saada aikaan esimerkiksi ottamalla CD40/Fc-fuusioi ja sitomalla se proteiini A tai proteiini G -pintaa
Muita menetelmiä CD40-L-proteiinin ja sen gien biologisen aktiivisuuden mittaamiseksi on kor 10 liukoisen CD40-proteiinin (esimerkiksi 125I-CD40/Fc sikäyttö samanlaisissa kilpailutesteissä kuin yli; vattu. Tässä tapauksessa kuitenkin käytetään kos mia soluja, jotka ekspressoivat CD40-L-proteiinia, koista CD40-L-proteiinia, joka on sidottu kiinte 15 straattiin, konjugoidun liukoisen CD40-proteiinin teen, joka mahdollisesti sisältää CD40-homologin, proteiiniin tapahtuvan sitoutumisen kilpailun mitt si.
CD40-L-proteiinia voidaan myös testata mit 20 biologista aktiivisuutta B-solun lisääntymistestill sen B-solut voidaan saada ihmisen risoista puhdd • ·« I. . negatiivisella selektiolla ja Percoll-tiheys • · m taatiolla, kuten ovat kuvanneet Defrance et ai., • ♦ · *·*·| nol. 139:1135, 1987. Burkittin lymfoomasolulinjoja * · 25 käyttää CD40-L-proteiinin aiheuttaman soluiisäykser ..ΙΓ miseksi. Esimerkit Burkittin lymfoomasolulinjoista
•m· ϊ vät esimerkiksi Raji- (ATCC CCL 86), Daudi- (ATCC
ja Namalwa-soluiinjat (ATCC CRL 1432) . Membraaniin : nut CD40-L-proteiini stimuloi B-solun lisääntymistä .···. 3 0 meerinen, mieluummin dimeerinen, CD40-L-proteiini * * * mi i T ai H D_onl iiri 1 i oS anf a Γ*Τ\Α A A A 4 ( 15 proteiinin tai sen johdannaisen tai analogin aihei aktivaatiolle. Polyklonaalisen immunoglobuliinin voidaan mitata esimerkiksi inkuboimalla 5 x 105 B-viljeltnässä ainakin seitsemän vuorokautta. Immunoc 5 nin (Ig) tuotto voidaan mitata ELISA-testillä, ku laisella, jonka ovat kuvanneet Maliszewski et ai.# nol. 144:3028, 1990 [Maliszewski et ai. I] tai Ma* et ai., Eur. J. Immunol. 20:1735, 1990 [Maliszewsk II]. Rottaeläimen B-solut voidaan saada esimerkiksi 10 ta ja niitä voidaan viljellä niiden menetelmien mu) jotka ovat kuvanneet Grabstein et ai., J. Es 163:1405, 1986 [Grabstein et ai. I], Maliszewski ja Maliszewski et ai. II.
CD40-L-proteiinia voidaan käyttää sitout 15 teissä CD40-proteiinia ekspressoivien solujen tui seksi. Esimerkiksi rottaeläimen kuvion 1 mukainen proteiini {SEQ ID numero 1) tai ihmisen kuvion 2 CD40-L-proteiini (SEQ ID numero 11) tai niiden so' nen domeeni tai fragmentti voidaan konjugoida tuni 20 vaan ryhmään, kuten 125I. Radioaktiivinen leimaus .. voidaan suorittaa millä tahansa useasta standard: • » • ·« . mästä, joilla saadaan aikaan toiminnallinen korkeaa * t * :t ;* fiseen aktiivisuuteen leimattu 125I-CD40-L-molekyyl • · · *·*·* toehtoisesti voidaan käyttää muuta tunnistettavaa ! ’* 2 5 kuten entsyymiä, joka voi katalysoida kolorimetr fluorimetrisen reaktion, biotiinia tai avidiinii : proteiinia ekspressoivat solut voidaan saattaa kosl· konjugoidun CD40-L-proteiinin kanssa. Inkubaation ; sitoutumaton konjugoitu CD40-L-proteiini poistetaa ··· i ·*··. 30 toutuminen mitataan käyttäen tunnistettavaa ryhmää.
·♦· λ r*T\A r\ t j- z 16 11 kvenssillä, jotka on kuvattu US-patenttiju‘ 5 073 627, joka on liitetty tähän viitteeksi L-polypeptidit voidaan myös muodostaa fuusioimalle sen CD40-L-proteiinin C-pää (solunulkoinen domeen 5 proteiinin Fc-alueeseen (esimerkiksi sekvenssi SEQ ro 3)/ kuten on kuvattu CD40/Fc-fuusioproteiinille, Fc-fuusioproteiinien annetaan rakentua hyvin paljoi tavalla kuin vasta-ainemolekyylin raskasketjujen c tisten CD40-L-proteiinien muodostamiseksi. Jos fuu£ 10 iinit valmistetaan vasta-aineen sekä raskas- että \ jun kanssa, on mahdollista muodostaa CD40-L-ol: jossa on jopa neljä CD40-L-proteiinin solunulkoist ta.
Fuusioproteiinit voidaan valmistaa halutui 15 vensseistä käyttäen tavanomaisia entsyymin katk< fragmenttien ligaatiomenetelmiä. PCR-menetelmiä, käytetään synteettisiä oligonukleotideja, voidaan haluttujen fragmenttien valmistamiseksi ja/tai amp] seksi. Päällekkäin meneviä synteettisiä oligonukle 20 jotka edustavat haluttuja sekvenssejä, voidaan myös .. fuusioproteiineja koodittavien DNA-rakenteiden va] / seksi. Fuusioproteiinit voivat myös sisältää * * · • ·' proteiinin ja kaksi tai useamman lisäsekvenssin, j '•V sältävät leader-sekvenssin (tai signaalipeptidi 25 alueen, linkkerisekvenssin ja sekvenssit, jotka koe 9 erittäin antigeenisiä ryhmiä, jotka muodostavat kei :T: sioproteiinin helppoon puhdistukseen ja nopeaan ti.
seen.
* Signaalipeptidit helpottavat proteiinien *·· · .·*** 30 soluista. Esimerkki signaalipeptidi on ihmisen inte ··· 17 11 tokset, jotka eivät vaikuta IL-7-sekvenssin kykyy leader-sekvenssinä.
FlagR-oktapeptidi (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-ei muuta fuusioproteiinien biologista aktiivisui 5 erittäin antigeeninen ja muodostaa epitoopin, jok siibelisti sitoo spesifisen monoklonaalisen vaste joka mahdollistaa ekspressoidun fuusioproteiinii tunnistuksen ja helpon puhdistuksen. FlagR-sekvens kaisee myös spesifisesti naudan limakalvon ente] 10 jäännöksestä, joka sijaitsee juuri Asp-Lys-parin fuusioproteiinit, joiden päähän tämä peptidi on voivat myös olla resistenttejä solunsisäiselle dec olle E. coli -bakteerissa. Rottaeläimen monoklc vasta-aine, joka sitoutuu FlagR-sekvenssiin, on ti 15 ATCC-kokoelmaan koodinumerolla HB 9259; menetelmä aineen käyttämiseksi FlagR-sekvenssin sisältävien proteiinien puhdistuksessa on kuvattu US-päti kaisussa 5 011 912, joka on liitetty tähän viitteek Sopivat Fc-alueet määritellään Fc-alueiks 20 sitoutuvat proteiini A:hän tai proteiini G:hen, tai .. ehtoisesti ne tunnistaa vasta-aine, jota voidaan
# I
• · · ·. „ Fc-alueen sisältävän fuusioproteiinin puhdistuks * « · : ·* tunnistukseen. Suositeltavat Fc-alueet sisältävät t · • · · *·"·* IgGi- tai rottaeläimen IgGi-proteiinin Fc-alueen. Έ ***** 25 merkki on ihmisen IgGi-Fc-alue, joka on esitetty „*·’ sissä SEQ ID numero 3; toinen esimerkki on Fc-al SS : koodit taa cDNA, joka on saatu PCR-menetelmällä oli
otidialukkeilla sekvensseistä SEQ ID numero 9 ja SE
• mero 10 käyttäen ihmisen cDNArta templaattina. Os *·· * .*··, 3 0 vasta Fc-alueesta voidaan myös käyttää, esimerkiksi ♦ ·· Λ T _ Tx“1 Π 1 Λ A ^ ^ ^ /-'fc i—I 4“ rtyi λ 1 λ 4— ^ ^ M /S «fc VM m «a aVh a A a S* 18 proteiinin Fc-alueesta sellaisella etäisyydellä, riittävä varmistamaan sen, että CD40-L-proteiini I oikein sekundaariseen ja tertiääriseen rakenteesee piva linkkerisekvenssi (1) sisältää joustavan p: 5 rakenteen, (2) ei sisällä taipumusta sellaisen jär; sekundaarirakenteen muodostumiseksi, joka voisi fuusioproteiinien toiminnallisten domeenien kanssa sisältää minimaalisen hydrofobisen tai varautuneer suuden, joka voisi edesauttaa reaktiota toimini 10 proteiinidomeenien kanssa. Tyypilliset pinta-ar joustavilla proteiinialueilla sisältävät Gly-, Asn-jäännökset. Käytännössä minkä tahansa aminohapposel permutaation, joka sisältää Gly-, Asn- ja Ser-jä! voidaan odottaa tyydyttävän yllä olevat kriteerit 15 risekvenssille. Muita lähes neutraaleja aminohappo: Thr ja Ala, voidaan myös käyttää linkkerisekvc Linkkerisekvenssin pituus voi vaihdella ilman, ett! kittävästi vaikuttaa fuusioproteiinin biologiseen suuteen. Linkkerisekvenssit ovat tarpeettomia sill 20 fuusioitavilla proteiineilla on sellaiset ei-kesk ·· tai C-pään aminohappoalueet, joita voidaan käyttää
• M
*. . nallisten domeenien erotukseen ja ehkäisemään s, • » • ·* häiriö.
• * · *·**! CD40-L-polypeptidit voivat esiintyä liukoi • * 25 lypeptideinä, jotka sisältävät kuviossa 1 (SEQ ID r 4.ΙΓ ja kuviossa 2 (SEQ ID numero 11) esitetyn CD40-L-p2 ·«· 5,5 ; solunulkoisen domeenin, tai membrääniin sitoutunei peptideinä, jotka sisältävät solunulkoisen domeen • ·*; braanin läpi kulkevan alueen ja solunsisäisen domee *·· # ·*·*. 3 0 ten on esitetty kuviossa 1 (SEQ ID numero 1) ja ku • ti • (.QT7Pl T Π m 1 1 1 £ i man -i λ H "hm-i a an a a^rar 19 nen CD40-L-molekyyli voidaan liittää yhteen IgG-liitosryhmällä.
Ilman, että sitoudutaan teoriaan, membraa toutunut CD40-L-proteiini ja oligomeerinen CD40-L-; 5 voivat saavuttaa aktiivisuuden, joka stimu muodostusta ja B-solujen lisääntymistä, joka aiemm tettiin ainoastaan ristisidotulla anti-CD40-vasta IL-4-proteiinin läsnä ollessa. Lisäksi tunt van todennäköistä, että monomeerinen liukoinen 10 proteiini, joka sisältää ainoastaan CD40-L-proted lunulkoisen domeenin ja kykenee sitoutumaa] reseptoriin, toimisi vastustaen membraaniin sitout oligomeerisen CD40-L-proteiinin ja/tai ristisidott ti-CD40-vasta-aineiden aktiivisuutta. Edelleen tur 15 van todennäköistä, että membraaniin sitoutuneen proteiinin interaktio CD40-proteiinin kanssa on panen molekylaarinen interaktio, joka on vasti solukontaktista riippuvaisessa B-solun kasvun ja s< geenispesifisen vasta-aineen tuoton ja polyklonaa] 20 erityksen induktiossa. Tässä suhteessa nisäkässolu transfektoitu cDNArlla, joka koodittaa täyspitkäs • ·· *. . proteiinia (se tarkoittaa, että se on membraaniin
J · J
·, ; nut ja sisältää solunsisäisen domeenin, membraa » · a *·'·* kulkevan alueen ja solunulkoisen domeenin tai sen • * 2 5 tin), voi matkia T-soluja niiden kyvyssä indusoidc kasvua, erilaistumista ja antigeeni spesifi sen vasi • aa ί tuoton stimulaatiota. Tuntuu, että oligomeerisen ! CD40-L-proteiinin, suositeltavasti solunulkoisten • dimeerien, aktiivisuudet voivat matkia membraaniin aa* * ·*·*· 30 neen CD40-L-proteiinin biologisia aktiivisuuksia.
aa# 20 11
Vaihtoehtoisesti, CD40-L-proteiini voi olla olig< (suositeltavasti dimeeri) toimien liukoisena tekijä kykenee indusoimaan B-solun kasvun, erilaistumiser muloimaan antigeenispesifisen vasta-aineen tuoton.
5 kaisesti tuntuu, että membraaniin sitoutunut proteiini ja oligomeerinen CD40-L-proteiini toimi\ proteiinin agonisteina, kun taas liukoinen (monor CD40-L-proteiini ja liukoinen CD40-proteiini toimii proteiinin antagonisteina blokeeraten CD40-protei 10 septorikohdat ilman, että ne merkittävästi kuljetti naalia, tai ehkäisemällä CD40-L-proteiinin site CD40-kohtiin B-soluissa ja muissa kohdesoluissa.
Sekä CD40-proteiinin agonisteilla että ai teillä on käyttökelpoista terapeuttista aktiivisuut 15 merkiksi CD40-proteiinin agonistit (se tarkoittaa, niin sitoutunut CD40-L-proteiini ja oligomeerinen proteiini) ovat käyttökelpoisia rokoteadjuvantteine muloimaan monoklonaalisten vasta-aineiden tuottoa 1 masoluista. CD40-proteiinin antagonistit (se tai 20 CD40-reseptori, CD40/FC- ja mahdollisesti liukoin •*e meerinen CD40-L-proteiini) ovat käyttökelpoisia ho: • »v I, „ sa autoimmuunitauteja, joille on ominaista korkeic • · * \ *" geeni-vasta-aine-kompleksien tasojen läsnäolo, kute « · * ***** gia, ihohukka, nivelreuma, insuliinista riippuvair * · 25 ritauti (IDDM), käänteishyljintätauti (GVHD) ja muu ••ΙΓ Ihmisen B-solujen IgE-eritys voidaan indus #* V 5 4-proteiinilla T-solujen läsnä ollessa (Vercelli et
Exp. Med. 169:1295, 1989). Lisäksi, IgE-tuotto voi • ·’· dusoida T-soluista tyhjennetyistä PBM-soluista (pe ··· » ····. 30 sen veren mononukleaariset solut) lisäämällä monoki «f· • ha anh Ί - ΡΓΐΔ Γϊ noh ha T ttv 21 1 L-proteiini), joka menetelmä sisältää vaiheen, jos taan tehokas määrä CD40/Fc-fuusioproteiinia, kuten kuvattu, tai liukoista CD40-proteiinia, jota kood cDNA-sekvenssi, joka on kuvattu sekvenssissä SEQ ] 5 3. Samalla tavalla CD40-reseptorit ja mahdollisest] nen CD40-L-proteiini (ainoastaan monomeeri) voi1 blokeerata muiden vasta-aine-isotyyppien erityksen.
Edelleen tässä esitetään CD40-L-polypeptid hin on liittynyt luonnollinen glykosylaatiosisält< 10 ei ole liittynyt. Hiiva- tai nisäkäsekspressiosyst (esim. COS-7-solut) ekspressoitu CD40-L-proteiini samanlainen tai merkittävästi erilainen kuin luoi CD40-L-polypeptidi molekyylipainon ja glykosylaatic suhteen riippuen valitusta ekspressiosysteemistä. 15 polypeptidien ekspressio bakteeriekspressiosystc kuten E. coli -bakteerissa, muodostaa glykosylod molekyylejä.
DNA-rakenteet, jotka koodittavat erilaisi happojäännösten tai -sekvenssien lisäyksiä tai subs 20 oita tai päässä olevien tai sekvenssin sisäisten j! 2*^ tai sekvenssien deleetioita, joita ei tarvita bic * *· U . aktiivisuuteen tai sitoutumiseen, voidaan valmist • · » \ * merkiksi CD40-L-proteiinin solunulkoista N-gl} * « · *·*·* tiokohtaa voidaan modifioida niin, että glykosylaat * * 25 samalla, kun sallitaan homogeenisen pelkistetyn l „.T raattianalogin ekspressio käyttäen hiivan ekspressj ··· V : mejä. Eukaryoottisten polypeptidien N-glykosylaatic
on ominaista aminohappotripletti Asn-X-Y, jossa X
I tahansa aminohappo paitsi Pro ja Y on Ser tai Thr.
«·· · ·***· 3 0 modifikaatiot tätä triplettiä koodi ttavaan nukle *·· A 1^4 m A rt 1 ^ «rt rt aVk rt«V>S k rt rt Ί Ί «rt -1 n J m M rt< · 1«. rt^ J ^ 4- J « J J u 1 -! 22 kyylien välisten väärien disulfidisidosten muod< renaturaation aikana. Ihmisen CD40-L-proteiini viisi Cys-jäännöstä sen solunulkoisessa domeenis ollen ainakin yksi viidestä Cys-jäännöksestä voida* 5 ta toisella aminohapolla tai se voidaan deletoid että vaikutetaan proteiinin tertiaariseen rakentee di sulf idis idosten muodostumi seen.
Toiset lähestymistavat mutageneesiä varten vät niiden sekvenssien modifikaatiot, jotka koe 10 kaksiemäksisiä aminohappojäännöksiä niin, että tel ekspressiota hiivasysteemeissä, joissa KEX2-pi aktiivisuus on läsnä. CD40-L-polypeptidin alayksi daan rakentaa deletoimalla ne sekvenssit, jotka ko< päissä olevia tai sekvenssin sisäisiä jäännöksiä 15 venssejä.
CD40-L-polypeptidejä koodittavat moniekson] nit. Esillä oleva keksintö sisältää lisäksi vaihte mRNA-rakenteet, jotka voivat johtua erilaisist silmukointitapahtumista transkription jälkeen ja j 20 yhteisiä alueita, jotka ovat identtisiä tai saman} ·. tässä kuvattujen cDNA:den kanssa.
• #· I. # Antisense- ja sense-oligonukleotidit sisält * * » :e sijuosteisen nukleiinihapposekvenssin {joko RN£ t I « ***** DNA:ta) , joka kykenee sitoutumaan kohde-CD40-L- **** 25 (sense) tai CD40-L-DNA-sekvensseihin (antisense) * olevan keksinnön mukaiset antisense- tai i oligonukleotidit sisältävät sekvenssin SEQ ID nume
SEQ ID numero 11 fragmentin tai sekvenssin SEQ ID
j ·*; tai SEQ ID numero 11 DNA- tai RNA-komplementin. £
····. 3 0 fragmentti sisältää ainakin noin 14 nukleotidia. S
*·· * f- iiTraah ί öä Ί T ^ f vrs 4- ΐ ^ ·! λ ίΑ 1 ^ ΐ « Ί a 23 11
Antisense- tai sense-oligonukleotidien sit< kohdenukleiinihapposekvensseihin johtaa sellaister sien muodostumiseen, jotka blokeeraavat translaati tai transkription (DNA) yhdellä useista eri tavoist 5 täen tehostuneen dupleksien degradaation, transkrij translaation enneaikaisen terminaation tai muut te pivat polymeraasipromoottorit sisältävät minkä tat polymeraasin promoottorin, tai minkä tahansa DNA pc sin promoottorin. Antisense- tai sense-oiigonukleot 10 sältävät lisäksi oligonukleotidit, joissa on moc sokerifosfodiesterirungot (tai muut sokerisidokse ne, jotka on kuvattu julkaisussa W091/06 629) j sellaiset sokerisidokset ovat resistenttejä endogc nukleaaseille. Sellaiset resistentit sokerisidokse 15 tävät oligonukleotidit ovat stabiileja in vivo (se taa, ne kykenevät vastustamaan entsymaattista degi ta) , mutta niissä on jäljellä sekvenssispesifisyy ne kykenevät sitoutumaan kohdenukleotidisekvensseil sense- tai antisense-oiigonukleotidiesimerkit sisäl 20 oligonukleotidit, jotka on kovalenttisesti sidottu s iin ryhmiin, kuten ne, jotka on kuvattu ju' I. . WO91/10 448, ja muihin ryhmiin, jotka kohottavat c * * * •9 i leotidin affiniteettia kohdenukleiinihapposekvenss « · · e*V ten poly-(L-lysiini). Edelleen, interkalatoivia 25 kuten elliptisiiniä, ja alkyloivia aineita tai metc „*·* lekseja voidaan kiinnittää sense- tai ai ··· ί^ϊ : oiigonukleotideihin niiden sitoutumisspesifisyyksi fioimiseksi kohdenukleotidisekvenssiä kohtaan. Ai • ·** tai sense-oligonukleotidit voidaan viedä sisälle se ·*· · .···. 30 soluun, joka sisältää kohdenukleiinihapposekvenss! * n a n ώ n o a ΛΔΛη i e ^ i v4“ Λτηβη ä ^ ä I *v* alla m «1 ^ a Λνι λ « ^ wa vnIj· 24 retrovirusvektoriin, sitten saattamalla solu kosi halutun insertoidun sekvenssin sisältävän retrovii rin kanssa joko in vivo tai ex vivo. Sopivat retro1' torit sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, rc 5 men retroviruksen M-MuLV, N2 (retrovirus, joka on M-MuLV-viruksesta) tai kaksoiskopiovektorit, joid ovat DCT5A, DCT5B ja DCT5C (katso PCT-patenttiha 90/02656). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita torisekvenssejä oligonukleotidin ekspressoimiseksi. 10 Sense- tai antisense-oiigonukleotidit void viedä sisään soluun, joka sisältää kohdenukleotid: sin, muodostamalla konjugaatti ligandia sitovan mc kanssa, kuten on kuvattu julkaisussa WO 91/04 753. ligandia sitovat molekyylit sisältävät, mutta eivät 15 joittuneet, solupintareseptorit, kasvutekijät, mu kiinit tai muut ligandit, jotka sitoutuvat solupii toreihin. Ligandia sitovan molekyylin konjugoiminer siteltavasti oleellisesti häiritse ligandia sitov kyylin kykyä sitoutua sen vastaavaan mo] 20 tai reseptoriin tai blokeeraa sense- tai ar oligonukleotidin tai sen konjugoidun muodon saapun * ·· U . luun.
• * * •e J Sense- tai antisense-oligonukleotidi voida « i « *·*·* toehtoisesti viedä sisään soluun, joka sisältää koi: • · 25 iinihapposekvenssin, muodostamalla oiigonukleotidd * kompleksi, kuten on kuvattu julkaisussa W0 90/10 4 5,5 5 se- tai anti sense-oi igonukleotidi-lipidi-kompleksir toisistaan suositeltavasti solun sisällä oleva endc | ·*· lipaasi.
*·· I
·*··. 3 0 Rottaeläimen CD40-L-CDNA-sekvenssi saatiin • * *·«
• ne l λϊιπλ naf a 1 m -5 T Ί ώ T Vitvi ί Λ Λ T λ λΊ<·« « _< « J
25 alukkeita, jotka perustuivat sekvenssiin, jonka c kaisseet Stamenkovic et ai. (SEQ ID numero 4). "! oiigonukleot idialuke 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC ID numero 5) muodostaa Sali-kohdan CD40-proteiinin 5 metioniinin yläpuolelle ja alavirran oligonukleol 5'-CCGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3' (SEQ ID numero < toi terminaatiokodonin CD40-proteiinin aminohapon keen, jota seuraa Xbal- ja Sali-kohdat. Amplific digestoitiin Sali-entsyymillä ja se kloonattiin i 10 pDC406 (McMahan et ai., EMBO J. 10:2821, 1991) i pDC406/s CD40 rakentamiseksi.
Toinen CD40-reseptorifragmentti (SEQ II
4) saatiin PCR-menetelmillä ihmisen domeeniin (SEQ ID numero 3) fuusioimista varten. 15 ti, ylävirran oi igonukleot idialuke (SEQ ID nui ja fuusiotemplaatti (SEQ ID numero 4) oi iva kuin aiemmin. Alavirran oiigonukleotidialuk 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (SE mero 7), joka insertoi aminohapot Tyr Vai Glu Pro 20 ID numero 8) CD40-proteiinin aminohapon 193 jälkeer Pro ovat ensimmäiset kaksi aminohappoa ihmise * »· I. . proteiinin sarana-alueella ja niitä seuraa * * · "e · restriktiokohta. Bglll-restriktiokohtaa käytettii « I « *·*·* proteiinin solunulkoisen domeenin fuusioimiseksi * · 25 olevaan ihmisen IgGl-Fc-alueeseen.
* .«Γ Muut fuusioproteiinit, jotka sisältävät mt *«* V * septoreiden ligandia sitovat domeenit, voidaan λ saamalla reseptorin ligandia sitovan domeenin DNA-£ * :*; ja fuusioimalla tämä sekvenssi sellaiseen DNA-sek\ .··*. 3 0 joka koodit taa vasta-ainemolekyyl in Fc-domeenia, • Ή /“M if 1H1 ö Ί *i Ί 7V · Viillä ^ Ώ Ί A A A 1 -! Λ . Uavh 4-^-1 -mi i 26 proteiini G -affiniteettipuhdistuksella.
ri/avidiinifuusioproteiinit voidaan puhdistaa hiot: niteettikromatografiällä. Fuusioproteiinit voidaan myöhemmin pylväästä eluoimalla korkeasuolaisella 1: 5 tai muulla sopivalla puskurilla.
Saimme ihmisen IgGl-Fc-aluetta koodittava PCR-amplifikaatiolla käyttäen ihmisen soluista olevaa cDNA:ta templaattina ja ylävirran oligoi dialuketta 5'-TATTAATCATTCAGTAGGGCCCAGATCTTGTGACA; 10 3' (SEQ ID numero 9) ja alavirran oligonukleotidj 5 1 -GCCAGCTTAACTAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA-3 1 (SEQ ] 10). PCR-amplifioitu cDNA muodosti BglII-kohdan Iät rana-alueen alkukohtaa, jota käytettiin CD40-proted
lunulkoisen domeenin ligaatiossa sCD40/Fc-fuusio-cI
15 kentamiseksi, joka ligoitiin plasmidiin pDC406 j pDC406/CD40/Fc rakentamiseksi. Muiden sopivien Fc- määritellään olevan mitä tahansa alueita, jotka vc toutua korkealla affiniteetilla proteiini A:hän ta iini G:hen, ja sisältää ihmisen IgGl- tai rott
20 IgGl-Fc-alueet. Yksi esimerkki on sekvenssissä SEQ
,.e ro 3 esitetty ihmisen IgGl-Fc-alue tai cDNA, joka
*.\ PCR-menetelmillä oligonukleotidialukkeilla SEQ ID
• * * ·' ** ja SEQ ID numero 10 käyttäen ihmisen cDNA:ta templa * * * *·*·* Reseptori/Fc-fuusiomolekyylit syntetisoidaa 25 teltavasti rekombinanttinisäkässoluviljelmässä, k „*·* ovat yleensä liian suuria ja kompleksisia syntetisc iV: prokaryoottiekspressiomenetelmillä. Esimerkit sopisi säkässoluista reseptori/Fc-fuusioproteiinin ekspi • ·*· seksi sisältävät CV-1-solut (ATCC CCL 70) ja CO£ *« * .··*. 30 (ATCC CRL 1651) , jotka molemmat ovat peräisin apin *·· • Λ 7 α ί e-h a 11< 27 kaan transfektoimalla CV-l-solulinja geenillä, joke ti Epstein-Barr-viruksen tuma-antigeenia 1 (EBNA-1) stitutiivisesti ekspressoi EBNA-1-proteiinia ihmi viruksen erittäin aikaisen tehostaja/promoottorin 5 dessa. EBNA-l-geeni sallii ekspressiovektoreidei pDC406, jotka sisältävät EBV-repiikaatio-origon, < lisen replikaation.
CD40/Fc-fuusioproteiinia ekspressoivat trai tit tunnistetaan aluksi käyttäen dot-blot- tai 10 blot-analyysiä. Sitten supernatantit altistetaan c käsittelylle tai geelielektroforeesille, jota seurc roforeesissa ajettujen proteiinien siirto monoklc G28-5 vasta-aineen sitoutumista varten (vasta-ai sitoutuu ihmisen CD40-reseptoriin). Sitten siirrett 15 teiineja inkuboitiin radioaktiivisesti leimati proteiini A:n kanssa, pestiin sitoutumattoman lein tamiseksi ja tutkittiin Fc-proteiinin ekspression
Monoklonaalinen vasta-aine G28-5 tuotettiin sen mu) kuten on kuvattu julkaisussa Clark et ai., yllä.
20 Kun solut, jotka ekspressoivat fuusioral .. oli tunnistettu, transfektoitujen solujen suurimitt • *· *# . set viljelmät kasvatettiin supernatanttien akkumule • * * * ·* niistä soluista, jotka ekspressoivat CD40/Fc-prc • * * “V Supernatant tine s teessä oleva CD40/Fc-fuusioprotei:
««••S
***** 25 distettiin af f initeettipuhdistuksella. Lyhyesti, yl· *
viljelmäsupernatanttia, joka sisälsi C
·** ί fuusioproteiinia, puhdistettiin suodattamalla nd lu supernatant it (esim. 0,45 μτη suodatin) ja lad • ·*· suodos proteiini A/G -vasta-aineaf f initeettip} *·# * .···, 3 0 (Schleicher ja Schuell, Keene, NH) 4 °C:ssa virte *·« • HpI 1 Λ ftO ml 1 _ ^ r*m γ 1 0 Π nm nvlvSSflöön 28 fuusioproteiinin hopeavärjätyt SDS-geelit osoitt olevan > 98 % puhdas.
Liukoiset CD40 (sCD40) ja CD40/Fc-fuusiop: valmistettiin, kuten tässä on kuvattu. Supernatar 5 distettiin G28-5-affiniteettipylvään (monoklonaali: CD40-vasta-aine) läpi transfektoitujen CV-l/EBNi ekspressoiman sCD40-proteiinin puhdistamiseksi. P: sisältävät fraktiot yhdistettiin ja pienet määrät ti in G28-5-sitoutumistesteihin ja SDS-PAGE-analyyi 10 riumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektrc varten niin, että läsnä oli 1 mM ditiotreitoli peL aineena. Yksi rintama, jonka molekyylipaino oli 28 töniä, havaittiin. Pelkistävän aineen poissaollesi proteiinin SDS-PAGE-analyysi osoitti kaksi rintan 15 asiallisen rintaman molekyylipainon ollessa 56 00 häisemmän rintaman ollessa molekyylipainoltaan 28 < tamakuviot osoittavat, että pääosa sCD40-proteii liuoksessa disulfidisidoksellisena homodimeerinä. lipainoltaan 28 000 rintama on monomeeri.
20 CD40-proteiinit tehtiin silmin nähtäviksi ] jäyksellä. Näytteen proteiinikonsentraatiot mää:
• * B
. käyttäen mikro-BCA-testiä (Pierce) ultrapuhtaan nai • · · • » \ * rumialbumiinin ollessa standardina. Liukoisei * * * *·*·| proteiinin puhtaus ja proteiinikonsentraatio varm: * · 25 aminohappoanalyysillä. Puhdistettu liukoinen CD40-] ..ΙΓ absorboitiin PVDF-paperilie ja paperi altistettiir • · · V * tisoidulle Edman-degradaatiolle käyttäen Applied B: model 477A -proteiinisekvenaattoria valmistajan • mukaan proteiinin N-pään sekvensoitiin. Tällä meni *** .**. 3 0 tarkistettiin sCD40-proteiinin proteiini sekvenssi.
29 proteiinimuodolla ei ollut inhibitorista vaikutusta lisääntymiseen (mitattuna tritioidun tymidiinin inl tiolla). Päinvastaisesta, IL-4-reseptori inhibc indusoitua B-solun lisääntymistä konsentraatiosta 5 vaisella tavalla.
Liukoinen CD40- ja CD40/Fc-proteiini t* niiden kyvyn suhteen inhiboida IL-4-indusoitua IgE-kaksoisluovuttaja-MLC-systeemissä (seoslymfosyytt mä). Kolmessa kokeessa IgE-proteiinin tuottotaso a] 10 CD40-proteiinin konsentraatio kohosi. Liukoine proteiini, joka lisättiin konsentraationa 10 Mg/ml inhiboimaan täysin IgE-erityksen tässä allergiar Lisäksi, CD40/FC-proteiinilla on samanlaiset va: kuin sen liukoisella vastineella. IL-7-resej 15 fuusioproteiinin (valmistettu samanlaisella men* kuin julkaistu IL-7-reseptorisekvenssi) lisäys ei kaan vaikuttanut IgE-eritykseen tässä mallissa.
CD23-proteiinin tasot mitattiin myös sama testissä vasteena sCD40-proteiinille tai 2 0 fuusioproteiinille. Liukoinen CD4 0 tuotti pienei toistettavan alenemisen sCD23-proteiinin tasossa λ • t* I. . tena 6 verrattuna viljelmiin, jotka oli stimuloi • * · :# l proteiinilla yksinään, kuitenkin vahvempi inhik * * * '·*·* vaikutus oli selvä vuorokautena 12 samoissa vilj * * 25 Liukoisen CD23-proteiinin induktioon IL-4-proteiini muloiduissa T-soluista tyhjennetyissä PBM-E"soluise »i* V · feerisen veren makrofaagit) vaikutti samalla tavail proteiinin lisäys, joka aiheutti pienen alenemise • ·'· proteiinin tasoissa vuorokautena 6 ja paljon selve * ** · .·*·. 30 hibition vuorokautena 12. Kussakin viljelmäsysteern • Ί aL·· oab PFl/l Π / T?rt _ finiei ArwAf· λί Ί tm* 1 1 -¾ λΊ ·! ττ^+· λ! λλΊ 1 4 ^ Λί- 30 DO-GEN-ainetta laitettiin 10 x 75 mm lasiputken pol sitä inkuboitiin 20 minuuttia 4 °C:ssa niin, että I 75 μΐ 0,1 M natriumfosfaattia, pH 7,4 ja 20 μΐ Na125I:a. Sitten liuos siirrettiin toiseen lasiputki 5 sisälsi 5 Mg CD40/Fc-proteiinia 45 Ml:ssa PBS:ää tiliä puskuroitu suolaliuos), ja tätä reaktioseos boitiin 20 minuuttia 4 °C:ssa. Reaktioseos fra] geelisuodatuksella 2 ml:n patsaan tilavuudella G-25:ttä (Sigma) ja sitten tasapainotettiin R 10 -alustassa, joka sisälsi sitomisalustaa, jossa o'. (v/v) naudan seerumi albumiini a (BSA) , 0,2 % (v/v) atsidia ja 20 mM Hepes-puskuria, pH 7,4. Lopulli CD40/Fc-pooli laimennettiin työskentelyvarastolii joka oli 1 x 10"7 M sitomisalustassa, ja sitä säi! 15 korkeintaan yksi kuukausi 4 °C:ssa ilman havaittava torisitoutumisaktiivisuuden häviämistä.
cDNA-kirjasto valmistettiin EL4-solulinjas oli lajiteltu FACS-laitteella (fluoresenssiaktivoi lajittelija) biotinyloidun CD40/Fc-fuusioproteiini 20 tumisen perusteella. Solut lajiteltiin viisi kertac fluoresenssin voimakkuudessa oli merkittävä sii] • ·· I. . joka perustui CD40-proteiinin ligandin ekspressio * * * *t · telluissa EL-4-soluissa. Viisi kertaa lajiteltuja « * # ***** kutsuttiin nimellä EL-40.5-solut ja näitä soluja vd • : 25 cDNA-kirjaston muodostustarkoitusta varten ,,ΙΓ mRNA:sta. Lyhyesti, cDNA syntetisoitiin, insertoit *** V ! jään pDC406-vektoriin ja transformoitiin | -bakteeriin. Transformantit yhdistettiin ja pooleis • ·*: tettiin DNA ja transfektoitiin CV-1-EBNA-soluihin
Ml * .···. 3 0 siokloonauskirjaston valmistamiseksi. Transfektoiti.
«·« * RRNÄ - i H λ v*i Hplhi in nhn ί 1 λορί 1 1 λ lrn>l mö ^mr 31 lä. Kiinnitetyt objektilasit kastettiin nestemäise kuvausemulsioon ja niitä valotettiin pimeässä. Obj< en kehityksen jälkeen ne tutkittiin yksittäin mikrc la ja solut, jotka ekspressoivat CD40-L-proteiinia, 5 tettiin vaalealla taustalla olevien autoradiografi peakiteiden läsnäolon perusteella.
EL-40.5-solujen ekspressiokloonauskirjasto ti in ja yksi pooli, joka sisälsi noin 2 00 0 yks kloonia, tunnistettiin positiiviseksi 125I-leimatun 10 fuusioproteiinin sitoutumisen suhteen. Tämä pooli pienemmiksi pooleiksi, joissa oli noin 200 pesäket nemmät poolit seulottiin, kuten yllä on kuvattu, ϊ nemmistä pooleista oli positiivinen CD40-L-proteid teen.
15 Yksittäinen klooni eristettiin ja sekv« standardimenetelmillä rottaeläimen CD40-L-proteiin sekvenssin ja ennustetun aminohapposekvenssin sac kuten on esitetty kuviossa 1 ja sekvenssissä SEQ 1 1.
20 Ihmisen homologin CD40-L-CDNA löydettiin li lisellä hybridisaatiomenetelmällä. Lyhyesti, ihmis • »* *, . feerisen veren lymfosyyttien (PBL) cDNA-kirjasto Vc • · · •e ** tiin perifeerisen veren lymfosyyteistä, joita oli l· "·*·* OKT3-vasta-aineella (ATCC, Rockville, MD) , joka * * 25 CD3-proteiiniin (10 ng/ml), ja interleukiini-2-prot „[\m (IL-2, 10 ng/ml) kuusi vuorokautta. PBL-solut pe ·*· : sitten ne stimuloitiin 4 tuntia PMA:lla (forbolim^ tiasetaatti, Sigma, St. Louis), jonka konsentraati • ng/ml, ja jonomysiinillä (Calbiochem), jonka konse ··· · .···. 30 oli 500 ng/ml. Lähetti-RNA eristettiin stimulc *** • PRT .-αηΐιιί ai" a ρΤΊιΗΙ mi ι ο/Ηησ t-at- hiin -ia 1 -i πλι +--!-! 32 teoksessa Maniatis et ai.f Molecular Biology: A Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, £ - 328. Rakennettiin sellainen rottaeläimen koet vastasi rottaeläimen CD40-L-proteiinia koodittavas 5 nukleotidista 13 nukleotidiin 793 sekvenssissä SEQ ro 1 ja kuviossa 1. Tämä koetin hybridisoit: kirjaston faagisiirtoihin keskinkertaisissa - c olosuhteissa. Lyhyesti, hybridisaatio-oiosuhteet o] SSC, 1 x Denhardtin liuos, 2 mM EDTA, 0,5 % NP4 0 10 P-40 -detergentti) 63 °C:ssa yli yön. Tätä seur liuoksessa, joka oli 3 x SSC, 0,1 % SDS, kolmen tui 55 °C:ssa, jota seurasi yli yön valotus röntgenj Positiiviset plakit tunnistettiin frekvenssillä, noin l/l 000. Positiiviset plakit puhdistettiin kai 15 cDNA valmistettiin amplifioiduista viljelmistä.
Tässä kuvattuja rottaeläimen tai ihmisen cDNA-sekvenssejä voidaan käyttää lajienvälisessä saatiomenetelmässä sellaisten cDNA:den saamiseks: koodittavat nisäkkään muita homologeja rottaeläimer 20 misen CD40-L-proteiinille. Lyhyesti, muodostetaan c leotidikoetin kuviossa 1 (SEQ ID numero 1) kuvatu • *· I.# eläimen CD40-L-proteiinin tai kuviossa 2 (SEQ ID ni • · · ·, ·’ kuvatun ihmisen CD40-L-proteiinin solunylkoisen ali • · * *·*·* leotidisekvenssistä. Tämä koetin voidaan tehdä star "25 netelmillä, kuten niillä, jotka on kuvattu teoks * ..!Γ niatis et ai., yllä. Rottaeläimen tai ihmisen koetd *·* ί tetään seulottaessa nisäkkään cDNA-kirjastoa tai c kirjastoa keskinkertaisen ankaruuden olosuhteissa. • ·*; kit nisäkkään cDNA- tai genomisista kirjastoista si *»i e ····. 30 cDNA:n osalta kirjaston, joka on tehty nisäkkään pe • G ΩΥΊ T ΓΔ ν*ΛΠ 1 Λ i M Γ Λβ ΙΠΤ^ Q T 5 ΤΓ·η ·Ί Li Ψ- ^ n λ rt 4— π λ 33 CD40-L-DNA-sekvenssin, joka sisältää synteetti cDNA:sta peräisin olevan DNA-fragment in, joka 1 CD40-L-polypeptidiä, joka on toiminnallisesti liit pivaan transkription tai translaation säätelysefo 5 kuten sellaiseen, joka on peräisin nisäkkään, mikrc ruksen tai hyönteisen geenistä. Esimerkit säätely seistä sisältävät sekvenssit, joilla on saatele geenin ekspressiossa (esim. transkription promoot tehostajasekvenssi), vaihtoehtoisesti operaattorisi 10 transkription säätelemiseksi, mRNA:n ribosomin sit kohtaa koodittavan sekvenssin ja sopivat sekvenss: säätelevät transkription ja translaation aloitusta minaatiota. Nukleotidisekvenssit liitetään toiminne silloin, kun säät e ly sekvenssi on toiminnan isesi 15 CD40-L-DNA-sekvenssille. Näin ollen promoottorii disekvenssi on toiminnallisesti liitetty CD^ sekvenssiin, jos promoottorinukleotidisekvenssi CD40-L-DNA-sekvenssin transkriptiota. Vielä edell bosomin sitoutumiskohta voi olla toiminnallisesti 20 CD40-L-polypeptidin sekvenssiin, jos ribosomin sit .. kohta on sijoitettu vektoriin translaation tehoste * *, , Lisäksi sekvenssit, jotka koodittavat signaalipa • 1 9 • ·1 voidaan sisällyttää ekspressiovektoreihin. Esimerk: · · *·1’ sekvenssi signaalipept idille (erittävä leader-se 25 voidaan liittää toiminnallisesti CD40-L-DNA-sek\ „1·1 Signaalipeptidiä ekspressoidaan esiasteaminohappose nä, joka mahdollistaa transloituneen fuusiopolypept rantuneen erityksen solun ulkopuolelle hiivaisäntäs • Sopivat isäntäsolut CD40-L-polypeptidien el·
Ml · .···. 30 olle sisältävät prokaryootit, hiivan tai korkeamm rvnnf.ti fiph finlnt1 . Prnlr^rvnnt· i t" ei gSI häväh nram-n^ni 34 cus-sukujen joukossa. Korkeammat eukaryoottiset s sältävät nisäkäsalkuperää olevat vakiintuneet so! Soluvapaita translaatiosysteemejä voidaan myös CD40-L-polypeptidien tuottamiseksi käyttäen RNA: t 5 ovat peräisin tässä kuvatuista DNA-rakenteista, kloonaus- ja ekspressiovektorit bakteeri-, home-, 1 nisäkäsäsoluisännillä käytettäviksi ovat kuvanneet kiksi Pouwels et ai., Cloning Vectors: A Laboratory Elsevier, New York (1985).
10 Prokaryoottisessa isäntäsolussa, kuten -bakteerissa, CD40-L-polypeptidi tai sen analogi vc tää N-pään metioniinijäännöksen rekombinanttipol] ekspression tehostamiseksi prokaryoottisessa isänte N-pään Met voidaan katkaista ekspressoidusta 15 rekombinanttipolypeptidistä. Prokaryoottisia isäi voidaan käyttää CD40-L-polypeptidien ekspresso: jotka eivät vaadi laajaa proteolyyttistä tai disu! sessointia.
Rekombinantti-CD40-L-DNA-sekvenssin sisältä 20 pressiovektorit transfektoidaan tai transformoidaar .·β isäntämikro-organismin tai nisäkässolulinjan olee • Il . homologiseen viljelmään. Transformoidut isäntäso! • * * ·' soluja, jotka on transformoitu tai transfektoitu i * * * “·*·* disekvensseillä, jotka koodittavat CD40-L-polypept • * 25 jotka ekspressoivat CD4 0-L-polypeptidejä. Ekspa CD40-L-polypeptidit sijaitsevat isäntäsolun sisäll !#ί · ne eritetään viljelmän supernatanttinesteeseen isäntäsolun ja isäntäsoluun insertoidun geenii • ;’j luonteesta.
·«« φ .···, 3 0 Prokaryoottisiin isäntäsoluihin transfektoi ··# • nroeei AVöVhnr-i h σ-i cal haväf \rl ööti e?ä +- a A nes^arrm 35 1 ryoottisten isäntäsolujen käyttökelpoiset ekspresi rit sisältävät bakteerialkuperää olevan selektiome] ka on peräisin kaupallisesti saatavista plasmideis selektiomerkki voi sisältää kloonausvektorin pBR3 5 37017) geneettiset elementit. Plasmidi pBR322 sisä! nit ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssille muodostaa helpot keinot transformoituneiden solujei tamiseksi. Plasmidin pBR322 "runko"-alueet yhdiste pivan promoottorin ja CD40-L-DNA-sekvenssin kans 10 kaupallisesti saatavat vektorit sisältävät es: plasmidit pKK22 3 -3 (Pharmacia Fine Chemicals,
Ruotsi) ja pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA) Promoottorisekvenssejä käytetään yleisest ryoottisten isäntäsolujen rekombinanttiekspressiove 15 sa. Yleiset promoottorisekvenssit sisältävät β-lc (penisiliinaasi) -laktoosipromoottorisysteemin (( ai., Nature 275:615, 1978 ja Goeddel et ai., 281:544, 1979), tryptofaanipromoottoris (trp) (Goeddel et ai., Nucl. Acids Res. 8:4057, ! 20 julkaisu EP-A-36 776) ja tac-promoottorin (Mania lecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Sprin I.’* Laboratory, sivu 412, 1982). Erikoisen käyttökelpod • · * • ·* karyoottisen isäntäsolun ekspressiosysteemi • * * *·*·* λ-faagin PL-promoottoria ja lämpölabiilia *” 5 25 repressorisekvenssiä. Kokoelmasta American Type
Collection saatavat plasmidivektorit, joihin sisä] :Τί promoottorin johdannaiset, sisältävät plasmidit pHt
nä E. coli -kannassa JMB9 (ATCC 37092}) ja pPLc28 I
• .*« coli -kannassa RR1 (ATCC 53082)) .
··· ♦ .···. 30 CD40-L-proteiinia voidaan ekspressoida hi *** il i * fafiAl oca aiiAflifalf Oa/i^Via _mnmn^-L i 4 36 transkription terminaatiota varten. Hiivavektorit vät suositeltavasti replikaatio-origosekvenssin j tiomerkin. Sopivat hiivavektoreiden promoottorisi sisältävät metallotioneiinipromoottorin, 3-fosfog! 5 attikinaasipromoottorin (Hitzeman et ai., J. Bio 255:2073, 1980) tai muiden glykolyyttisten entsyyn moottorit (Hess et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149,
Holland et ai., Biochem. 17:4900, 1978), kuten ei glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin, heksol 10 pyruvaattidekarboksylaasin, fosfofruktokinaasin, < 6- fosfaatti-isomeraasin, 3 -fosfoglyseraattimutaasi
vaattikinaasin, trioosifosfaatti-isomeraasin, J
koosi-isomeraasin ja glukokinaasin promoottorit. Mi
vat vektorit ja promoottorit hiivaekspressiossa J
15 vaksi on edelleen kuvattu julkaisussa Hitzeman, EP£
Hiivavektorit voidaan koota esimerkiksi plasmidista pBR322 peräisin olevia DNA-sekvenssejä -bakteerissa tapahtuvaa selektiota ja replikointi (Ampr-geeni ja replikaatio-origo) . Muut 20 DNA-sekvenssit, jotka voidaan sisällyttää hiiv< .. siorakenteeseen, sisältävät glukoosin repressoim; ! *·* e promoottorin ja Of-tekijän eritys-leader-sekvenssi * * * ·* promoottorin ovat kuvanneet Russell et ai. (J. Bic 258:2674, 1982) ja Beier et ai. (Nature 300:724 *·**· 25 Hiivan a-tekijän leader-sekvenssi ohjaa heterologi lypeptidien eritystä, α-tekijän leader-sekvenssi ΓΓ: insertoitu promoottorisekvenssin ja rakennegeenin sin väliin. Katso esim. Kurjan et ai., Cell 30:933, : Bitter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:533 ··· · .···, 30 Muut leader-sekvenssit, jotka ovat sopivia rekombir . 1 a-r- -i Ι-ΛτΊτββ-τ» folnnah am-ΐ oal-ni V. -I « 4 37
Hiivan transformaatyömenetelmät ovat alan tijoiden tuntemia. Yhden sellaisen menetelmän ov< neet Hinnen et ai. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1978. Hinnen et ai. kuvaamassa menetelmässä sei 5 Trp+-transformantit selektiivisessä alustassa, jos tiivinen alusta sisältää 0,67 % hiivan typpiemäst kasaminohappoja, 2 % glukoosia, 10 Mg adeniinia/ml urasiilia/ml.
Hiivaisäntäsoluja, jotka on transformoit 10 reillä, jotka sisältävät ADH2-promoottorisekvenss daan kasvattaa ekspression indusoimiseksi "rikkaas tässä. Esimerkki rikkaasta alustasta on eräs, joka 1 % hiivauutetta, 2 % peptonia ja 1 % glukoosia, lisätty 80 Mg adeniinia/ml ja 80 Mg urasiilia/r 15 promoottorin depressio tapahtuu, kun glukoosi on loppuun alustasta.
Nisäkäs- tai hyönteissoluviljelmäsysteemej myös käyttää CD40-L-rekombinanttipolypeptidien ek miseksi. Esimerkit sopivista nisäkässoluisäntälinj 20 sältävät apinan munuais solujen COS-7-linjan (i 1651)(Gluzman et ai., Cell 23:175, 1981), L-soli · " ** solut, 3T3-solut (ATCC CCL 163) , kiinanhamsterin m
·' solut (CHO) , HeLa-solut ja BHK-solui in jät {ATCC
• * * ‘•V Sopivat nisäkäsäekspressiovektorit sisältävät tran * 2 5 mattomia elementtejä, kuten repiikaatio-origon, p risekvenssin, tehostajasekvenssin liitettynä ra ··· !e: : niin, muut 5'- tai 31-paan viereiset transkripto sekvenssit, kuten ribosomin sitoutumiskohdat, poly • ·'; tiokohdan, silmukoinnin luovuttaja- ja vastaanotti
Mt * ,··*, 30 ja transkription terminaatiosekvenssit.
• * * ( m | ^ ( 1 · 38 viruksen genomista peräisin olevia DNA-sekvenssejä kiksi SV40-origon/ aikaisen ja myöhäisen promoott< hostajan, silmukoinnin ja polyadenylaatiokohtien s» jä voidaan käyttää niiden muiden geneettisten eli 5 muodostamiseksi, joita tarvitaan rakennegeenis* ekspressoimiseksi nisäkäsisäntäsolussa. Viruksen ja myöhäinen promoottori ovat erikoisen käyttök koska molemmat on helppo saada viruksen genomista tina, joka voi myös sisältää viruksen replikaat 10 (Fiers et ai., Nature 273:113, 1978). Pienempiä ta pia SV40-fragmentteja voidaan myös käyttää edellyt tä noin 250 emäsparin pituinen sekvenssi, joka ulo dlII-kohdasta kohti SV40-viruksen replikaatio-oric jaitsevaa Bgll-kohtaa, sisältyy siihen.
15 Nisäkkään esimerkkiekspressiovektorit voi kentaa, kuten ovat kuvanneet Okayama ja Berg (Mc Biol. 3:280, 1983). Käyttökelpoisena korkean eksp: son vektorina plasmidi PMLSV N1/N4, jonka ovat ] Cosman et ai., Nature 312: 768, 1984, on talletetti 20 maan koodinumerolla ATCC 39890. Muita käyttökelpoi: käsekspressiovektoreita on kuvattu julkaisuss * ·* !. . 0 367 566 ja US-patent ti hakemuksessa, jonka sarjar 07/701 415, joka on rekisteröity 16.5.1991, joka oi • * * **'·] ty tähän viitteeksi. Tyypin II proteiinin, kuten • · 25 proteiinin, solunulkoisen alueen ekspressoimiseks ..ΙΓ lisätä heterologinen signaali sekvenssi, kuten int< *«· ·,· ί ni- 7-proteiinin (IL-7) signaali sekvenssi, joka on US-patenttijulkaisussa 4 965 195, tai interlei • ;** reseptorin signaalisekvenssi, joka on ··· · .···, 3 0 US-patenttihakemuksessa 06/626 667, joka on rek: ·«· 39 L-proteiinia nisäkässoluissa niin, että saatiin so ka ekspressoivat rottaeläimen membraaniin sit· CD40-L-proteiinia. CV1-solut transfektoitiin ku esitetyllä cDNA:lla (SEQ ID numero 1) HAVEO-vekto: 5 CV1-solut transfektoitiin tyhjällä HAVEO-vektorill.
en menetelmiä, jotka on kuvattu tässä olevassa es 6. Tämä antoi sellaiset transfektoidut CVl-solu ekspressoivat rottaeläimen membrääniin sitoutunutt proteiinia. Näitä soluja käytettiin rottaeläimen 10 niin sitoutuneen CD40-L-proteiinin lähteenä sarjas ta, jotka on kuvattu alla esimerkeissä 10 - 13.
CD40- L-rekombinanttipolypeptidien puhdistui CD40-L-polypeptidit voidaan valmistaa vil transformoituja isäntäsoluja viljelyososuhteissc 15 ovat tarpeellisia CD40-L-polypeptidien ekspresso
Tuloksena syntyneet ekspressoidut polypeptidit voii ten puhdistaa viljelyalustoista tai solu-uutoksis1 L-polypeptidi voidaan, jos halutaan, konsentroida kaupallisesti saatavaa proteiinin konsentraatiosu 20 esimerkiksi Amicon- tai Millipore Pellicon ultra ;.e yksikköä. Konsentraatiovaiheen jälkeen konsentraa • ** I. . daan laittaa puhdistusmatriksiin, kuten geelisuod.
• * * \ l taan. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää anioninvaii « · · *-*·* niä, esimerkiksi matriksia tai substraattia, jossa * * 25 ni dietyyliaminoetyyliryhmiä (DEAE) . Matriksit voi ..'Γ akryyliamidia, agaroosia, dekstraania, selluloosaa V ϊ ta tyyppejä, joita yleisesti käytetään proteiinir tuksessa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kation: • ·*· vaihetta. Sopivat kationinvaihtajat sisältävät lii **» * .··*. 30 tomat matriksit, jotka sisältävät sulfopropyyli- 40 11
Joitakin tai kaikkia edellä mainittuja puhdistui voidaan myös käyttää eri yhdistelminä oleellises geenisen rekombinanttiproteiinin saamiseksi.
On myös mahdollista käyttää affiniteettii 5 joka sisältää CD40-proteiinin ligandia sitovan c ekspressoitujen CD40-L-polypeptidien affiniteettii miseksi. CD40-L-polypeptidit voidaan poistaa affii pylväästä korkeasuolaisessa eluutiopuskurissa jc dialysoida matalampisuolaiseen puskuriin käyttöä va 10 Bakteeriviljelmässä tuotettu rekombinanttii eristetään tavallisesti isäntäsolujen alkuhajot sentrifugaatiolla, uuttamalla solupelleteistäf jos kenematon polypeptidi, tai supernatanttinesteestä, liukoinen polypeptidi, jota seuraa yksi tai usea 15 sentraatio-, suolanpoisto-, ioninvaihto-, affinite distus- tai kokoerotukseen perustuva kromatograj
Lopuksi voidaan käyttää RP-HPLC:ta loppupuhdistusve
Mikrobisolut voidaan hajottaa millä tahansa sopiva] telmällä sisältäen jäädytys-sulatus-syklit, son: 20 mekaanisen hajotuksen tai soluja lyysaavien ainei .. tön.
• · « ·« I.. Transformoituja hiivasoluja käytetään sue • * « ·β l vasti erittyvän CD40-L-polypeptidin ekspressoimisel· * * · '·*·* yksinkertaistaa puhdistusta. Erittynyt rekombinar 25 peptidi hiivaisäntäsolufermentaatiosta voidaan j menetelmillä, jotka ovat analogisia niille, jotka * · · : vanneet Urdal et ai. (J. Chromatog. 296: 171, 1984 et ai. kuvaavat kaksi peräkkäistä käänteisfac i vaihetta ihmisen IL-2-rekombinanttiproteiinin pui »*· * 3 0 seksi preparatiivisessa HPLC-pylväässä.
* · * /”1 ΓΐΑ Λ Τ. AH 4· tftoanJ HMWt 41 ti aktiivinen analogi annetaan potilaalle, suosit* ihmiselle, indikaatiolle sopivalla hoitotavalla. N< esimerkiksi farmaseuttiset CD40-L-koostumukset (es: liukoisen solunulkoisen domeenin tai sen fragmentii 5 sa) , jotka annetaan halutun terapeuttisen vaikutu kaansaamiseksi, voidaan antaa yhtenä isona injekti< kuvalla infuusiolla, siirteistä tapahtuvalla jatkua pautumisella tai muulla sopivalla menetelmällä. Tei nen CD40-L-aine annetaan tyypillisesti sellaisi 10 maseuttisena koostumuksena, joka sisältää puhe CD40-L-polypeptidiä yhdessä fysiologisesti hyväki kantajien, täyteaineiden tai laimentimien kanssa. £ kantajat ovat potilaalle myrkyttömiä käytettyinä i ja konsentraatioina. Sellaisten koostumusten valmii 15 tii tavallisesti CD40-L-polypeptidin yhdistämisen i den, antioksidanttien, kuten askorbiinihapon, mata] kyylipainon sisältävien polypeptidien (vähemmän k 10 jäännöstä), proteiinien, aminohappojen, hiilih] en, jotka sisältävät glukoosin, sakkaroosin tai c 20 nit, kelatoivien aineiden, kuten EDTA:n, glutat ·. muiden stabiloivien aineiden ja täyteaineiden kans£ ·. raalit puskuroidut suolaliuokset tai suolaliuos, * * * ·* sekoitettu epäspesifisen seerumialbumiinin kanssa, * i » *·*.* pivia esimerkkilaimentimia. CD40-L-sense- tai ar 25 oligonukleotidit voidaan antaa in vivo antamalla „*·* määrä vektoria, joka sisältää nukleiinihapposekveng : V: ka koodittaa tehokasta antisense- tai « oligonukleotidia. Lisäksi CD40-L-sense- tai ar j **. oligonukleotidit voidaan antaa ex vivo poistamalla »»· » .···. 30 tä solut, jotka sisältävät CD40-L-DNA:ta tai -mRNA: • · • 9 · i( * mä 11a enlinViin an a iä ϋ m anti ean oa. ^ a -i — n rrnm 42
Esimerkki 1 Tämä esimerkki kuvaa CD4O/Fc-DNA-rakenteen misen, joka rakenne ekspressoi liukoista fuusioproteiinia, käytettäväksi niiden cDNA-kloon 5 nistamiseen, jotka koodittavat CD40-ligandia. Ihm: dellisen CD40-reseptorisekvenssin solunulkoisen a] ligandia sitovan domeenin cDNA-sekvenssi saatiin polymeraasiketjureaktiomenetelmiä (PCR) ja se peru; venssiin, jonka ovat julkaisseet Stamenkovic et a! 10 CD40-plasmidia (CDM8) käytettiin templaattir amplifikaatiossa. Plasmidin CDM8 ovat kuvanneet St; et ai. ja se saatiin kirjoittajilta. PCR-menetelm; et ai., Science 239: 487, 1988) käytettiin käyttäi (ylävirta) ja 3'-puoleisia (alavirta) oligonukleo 15 keitä niiden DNA-sekvenssien amplifioimiseksi, jc dittavat CD40-proteiinin ligandia sitovaa solunulk< meenia. Ylävirran oligonukleotidi* CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (SEQ ID numero 5) i
Sali-kohdan CD40-proteiinin aloitusmetioniinin yli 20 ja alavirran oligonukleo*
.* 5 ' -ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC- 3 ' (SI
·. , mero 7) insertoi aminohapot Tyr Vai Glu Pro Arg (SI
• · · •e ·* mero 8) CD40-proteiinin aminohapon 193 jälkeen. G] • * * *·*.* ovat ensimmäiset kaksi aminohappoa ihmisen igGl-p: * *·**· 25 sarana-alueella ja niitä seuraa Bglll-restriktiokol ,.*** käytettiin CD40-proteiinin solunulkoisen domeenin miseen jäljelle jääneeseen ihmisen IgGl-Fc-alueesee DNA-rakenne pDC406/CD40/Fc transfektoitii i munuaisen solulinjaan CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478) .
• M · .···. 30 pDC406 sisältää SV40-viruksesta, ihmisen immuunij *#· 43 11 dessa. EBNA-1-geeni sallii sellaisten ekspressio' den, jotka sisältävät EBV-replikaatio-origon, kute: episomaalisen replikaation.
Kun fuusiorakennetta ekspressoivat solut 5 nistettu, transfektoituneiden solujen suurimitta! viljelmät kasvatettiin sellaisten solujen supern akkumuloimiseksi, jotka ekspressoivat CD40/Fc-pr Supernatanttinesteessä oleva CD40/Fc-fuusioprotei distettiin affiniteettipuhdistuksella. Lyhyesti, y 10 viljelysupernatanttia, joka sisälsi fuusioproteiinia, puhdistettiin suodattamalla n lusupernatantit (esim. 0,45 μτη suodatin) ja la suodos proteiini-A/G-vasta-ainepylvääseen (Schle: Schuell, Keene, NH) 4 °C:ssa virtausnopeudella 80 15 1,5 x 12,0 cm pylvääseen. Pylväs pestiin PBS:ssa tiliä puskuroitu suolaliuos) olevalla 0,5 M NaCl:! nes vapaata proteiinia ei voitu tunnistaa pesupui Lopuksi pylväs pestiin PBS:lla. Sitoutunut fuusio] eluoitiin pylväästä 25 mM sitraattipuskurilla, 20 ja pH säädettiin 7:ään 500 mM Hepes-puskuri11a, Eluoidun CD40/Fc-fuusioproteiinin hopeavärj ätyt S] * ·« I, „ osoittivat sen olevan > 98 % puhdas.
• i · l Puhdistettu CD40/Fc-fuusioproteiini jodi *·*·' 1:11a käyttäen kaupallisesti saatavaa kiinteän f; • · 25 netta {IODO-GEN, Pierce). Tässä menetelmässä 5 Mg ! * ,,]·* ainetta laitettiin 10 x 75 mm lasiputken pohjalle ΓΓ: inkuboitiin 2 0 minuuttia 4 °C:ssa niin, että läsr μΐ 0,1 M natriumfosfaattia, pH 7,4, ja 20 μΐ • ;*· Na125I:a. Sitten liuos siirrettiin toiseen lasiputki *#* « /*·; 30 sisälsi 5 Mg CD40/Fc-proteiinia 45 Ml:ssa PBS:sta, 11 ( 44 pooli 125I-CD40/Fc-proteiinia laimennettiin työski rastoliuokseksi, joka oli 1 x 10"7 M sitomisalust sitä säilytettiin korkeintaan yksi kuukausi 4 °C:S£ että tapahtui havaittavaa häviämistä reseptorin 5 mi sakt i ivi suudes sa.
Havaittiin noin 50 - 60 % leiman inkorpora< diojodeeraus antoi spesifiset aktiivisuudet, jotka x 101S - 5 x 1015 cpm/nmooli {0,42 - 2,0 atomia rac vista jodia per molekyyli proteiinia). SDS-polyak] 10 digeelielektroforeesi (SDS-PAGE) paljasti yhden polypeptidin, joka oli odotettujen arvojen mukain mattu fuusioproteiini oli yli 98 % saostettavissa rietikkahapolla CTCA) , joka osoitti, että 125I oli 1 tisesti sitoutunut proteiiniin.
15 Esimerkki 2 Tämä esimerkki kuvaa CD40-L-proteiinia mahc ti ekspressoivan solulinjan selektion. Useita so] seulottiin käyttäen radiojodeerattua CD40/Fc-fi teiinia, joka on kuvattu esimerkissä 1. Lyhyesti, s 20 tiin kvantitatiiviset sitomiskokeet standardien mer .. mukaisesti ja eri solulinjoille saatiin Scatchardi
!. ** ot. Rottaeläimen klonaalinen thymoomasolulinja (EI
• * * • * luettelo TIP 39) tunnistettiin ja lajiteltiin. Enne • m » V.* telua EL-4-solujen havaittiin ekspressoivan noin 4 25 kyyllä CD40-L-proteiinia per solu. Seitsemännen le „*·' soluja kutsuttiin nimellä EL-40.7 ja niitä kasvate l*Vi niiden havaittiin ekspressoivan noin 10 000 molekyyliä per solu. Lopuksi, yhdeksännen lajittelu 2 kutsuttiin nimellä EL-40.9 ja niitä kasvatettiin j ··> ! .···. 3 0 havaittiin ekspressoivan noin 15 000 CD40-L-moleky du 11' 45 nimellä EL-40.5. EL-40.5-solut olivat EL-4-soluj oli lajiteltu biotinyloidulla CD40/Fc-fuusiopro viisi kertaa FACS-laitteessa (fluoresenssiaktivoit· jittelija). cDNA-kirjasto valmistettiin mRNArsta, 5 tiin EL-40.5-soluista oleellisesti, kuten on ku\ patenttijulkaisussa 4 968 607f jonka kuvaus on lii hän viitteeksi. Lyhyesti, cDNA-kirjasto rakennett laisen poly (A)+-mRNA:n käänteistranskriptiolla, j oli eristetty siitä kokonais-RNA:sta, joka oli uul 10 4 0.5-soluiinjasta. Kirjaston rakennusmenetelmä oli sesti samanlainen kuin se, jonka ovat kuvanneet Ai ai., toim., Current Protocols In Molecular Biologi (1987). Poly (A)+-mRNA eristettiin oligo-dT-se kromatografiällä ja kaksijuosteinen cDNA valm 15 oleellisesti, kuten ovat kuvanneet Gubler et a 25:263, 1983. Poly (A)+-mRNA fragmentit muutettiin : hybrideiksi käänteiskopioijaentsyymillä käyttäen s, heksanukleotideja alukkeina. RNA-cDNA-hybridit m sitten kaksijuosteisiksi cDNA-fragmenteiksi käytti 2 0 H -entsyymiä yhdessä DNA polymeraasi I -entsyymir .. Tuloksena syntynyt kaksijuosteinen cDNA muutettiin • « |β I* seksi T4 DNA polymeraasilla.
# · * • ·* Sali-adapt or it • · - :.V 5 ' -TCG ACT GGA ACG AGA CGA CCT GCT -3' 25 GA CCT TGC TCT GCT GGA CGA -5' ligoitiin tuloksena syntyneen tasapäisen cDNA:n 5 ί[5*: kuten ovat kuvanneet Haymerle et ai. , Nucleic Ac 14:8615, 1986. Ligoitumattomat adaptorit poistett : lisuodatuskromatografiällä 68 °C:ssa. Tämä jätti .···. 30 24 nukleotidin pituiset itsensä kanssa ei-kompleme] 46 11 tioseokset vietiin elektroporaatiolla sisään E. kantaan DH5a ja trans formant it selektoitiin ampii maljoilla.
Plasmidi-DNA eristettiin pooleista, jotka 5 vät noin 2 000 transformoitunutta E. coli -kloonia li. Eristetty DNA transfektoitiin CVl-EBNA-solujen fluenttiin solukerrokseen käyttäen DEAE-dekstraan seurasi klorokiinikäsittely oleellisesti niiden mei mukaisesti, jotka ovat kuvanneet Luthman et ai. , t 10 ids Res. 11:1295, 1983 ja McCutchan et ai., J. Nat! Inst. 41:351, 1986.
CV1-EBNA-soluja pidettiin yllä täydelliseg tässä (Dulbecco's modified Eagle -alusta, joka sisc (v/v) naudan sikiön seerumia, 50 U penisilliiniä/ 15 streptomysiiniä/ml ja 2 itiM L-glutamiinia) ja ne m; tiheyteen, joka oli noin 2 x 105 solua/kuoppa yk£ kammio-objektilaseille (Lab-Tek). Levyjä esikäsit ml:11a ihmisen fibronektiiniä (10 Mg/ml 30 minuutin ajan, jota seurasi yksi pesu PBS:lla 20 poistettiin kiinnittyneiltä kerroksena kasvavilta ;·β ja se korvattiin 1,5 ml :11a täydellistä alustaa, l, m saisi 66,6 mM klorokiinisulfaattia. Soluille lisätt • * * \ * 0,2 ml DNA-liuosta (2 Mg DNArta, 0,5 mg DEAE-dekstn · » '•V täydellistä alustaa, joka sisälsi klorokiinia) j * 25 inkuboitiin 37 °C:ssa noin viisi tuntia. Inkubaat ♦ ..*·* keen alusta poistettiin ja soluille tehtiin sokki ] l lä täydellistä alustaa, joka sisälsi 10 % DMSO:ta i lisulfoksidi), 2,5 - 20 minuutin ajan. Sokin jälke • ·** korvattiin tuoreella täydellisellä alustalla. Soluj «** · .*··. 3 0 tettiin viljelmässä 2-3 vuorokautta insertoitu
* ΓΛτΊ Gai an f vane 1 nn t- i ti alrenvAee -S λπ 1 ί m-ί n λΙ-π -ί K
47 11 fuusioproteiinilla, jonka on valmistettu esimer 48-72 tunnin kuluttua esimerkissä 3 valmistetut toituneet CV1-EBNA-solujen yksisolukerrokset testa jektilasin autoradiografiällä CD40-L-proteiinin ek 5 suhteen käyttäen radiojodeerattua CD40/Fc-fuusiopr< joka valmistettiin esimerkissä 1. Transfektoidut i solut pestiin kerran sitomisalustalla (RPMI 1640, sältää 25 mg naudan seerumialbumiinia (BSA)/ml, 2 i umatsidia/ml, 20 mM Hepes-puskuria, pH 7,2 ja 50 i 10 tonta kuivamaitoa/ml) ja inkuboitiin 2 tuntia 4 °< tomisalustassa, joka sisälsi 1 x 10"s M 125I fuusioproteiinia. Inkubaation jälkeen objektilaseilla olevat solut pestiin kolme kertaa puskurilla, jota seurasi kaksi pesua PBS:lla (pH 15 toutumattoman radioaktiiviseksi leimatun fuusiop: poistamiseksi.
Solut kiinnitettiin inkuboimalla PBS:ssa 10 % glutaraldehydissä (30 minuuttia huoneenlämpö-pestiin kahdesti PBSrssa ja ilmakuivattiin. Obj< 20 kastettiin Kodak GTNB-2 -valokuvausemulsioon (6 x ! ;.e vedessä) ja niitä valotettiin pimeässä 2-4 vu< i ·< I., huoneenlämpötilassa valolta suljetussa laatikossa.
• · * \ * lasit kehitettiin Kodak D19 -kehitteessä, huuhdel * · * *·** della ja kiinnitettiin Agfa G433C -kiinnitteellä.
* · 25 lasit tutkittiin yksittäin mikroskoopissa 25 - 40 : nuksella. Positiiviset objektilasit, jotka osoitti'' !βϊ ! L-proteiinia ekspressoivat solut, tunnistettiin ai grafisten hopeakiteiden läsnäolona vaaleassa tausta • ·* Yksi pooli, joka sisälsi noin 2 000 yki .*·*. 3 0 kloonia, tunnistettiin mahdollisesti posit: 48 11 lasiautoradiografiällä, kuten aiemmin on kuvattu. ’ nemmistä pooleista sisälsi kloonit, jotka olivat pi siä CD40-L-proteiinin suhteen, jonka osoitti sella: pressoidun geenituotteen läsnäolo, joka kykeni si 5 CD40/Fc-fuusioproteiiniin.
Positiivinen pienempi pooli titrattiin ja jättiin erillispesäkkeiden saamiseksi. Noin 400 pesäkettä poimittiin ja ne ympättiin viljelyalusta; täisiin kuoppiin 96-kuoppaiselle levylle. Viljelmä 10 tettiin yhdistämällä vaaka- ja pystyrivit ja se] ja viljelmiä käytettiin DNA:n valmistamiseksi 1 transfektio- ja seulontakierrosta varten. Positiiv: karivin ja positiivisen pystyrivin risteämäkohta mahdollisen positiivisen pesäkkeen. Kymmenen ma] 15 positiivista pesäkettä (se tarkoittaa, kandidaatt: tunnistettiin. Kustakin kandidaattikioonista er: DNA, se transfektoitiin ja seulottiin uudelleen. V: didaattikloonia oli positiivisia CD40/Fc-proteiini: tumisen suhteen. Kaikki viisi positiivista kandida; 20 nia sisälsivät 1468 nukleotidin pituisen cDNA-inse] ·» ka määritettiin dideoksinukleotidisekvensoinnilla.
• * • ·« „ kloonin koodittava cDNA-alue vastaa kuvion 1 sekv? • * * ·* sekvenssiä SEQ ID numero 1.
• t · “•V Kloonausvektori, joka sisältää rottaeläimei 25 sekvenssin, joka on nimeltään pDC406-mCD40-L, tai! * 6.12.1991 kokoelmaan American Type Culture Co! : Rockville, MD (ATCC) koodinumerolla 68872. Tämän nukleotidisekvenssi ja ennustettu aminohapposekvi • ·"· kuvattu sekvenssissä SEQ ID numero 1 ja kuviossa 1.
·***· 3 0 Esimerkki 5 • s »«· 49 11 leimaamalla fragmentti 32P-leimalla käyttäen satun: keitä (Boehringer-Mannheim) .
Ihmisen perifeerisen veren lymfosyytti* cDNA-kirjasto rakennettiin λ-faagivektoriin 5 λ-gtlO-käsivarsia ja ne pakattiin in vitro käyttäe: lisesti saatavaa käyttöpakkausta (GigapakR Stratac Diego, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. PBL-s< tiin normaaleista vapaaehtoisista ihmisistä ja ni: teitiin 10 ng OKT3-vasta-ainetta/ml (anti-CD3-va, 10 ja 10 ng ihmisen IL-2-proteiinia/ml (Immunex, Seal kuusi vuorokautta. PBL-solut pestiin ja ne stimulo ng jonomysiiniä/ml (Calbiochem) ja 10 ng PMA:ta/rri neljä tuntia. Stimuloiduista PBL-soluista saatiin RNA ja cDNA ja pakattiin X-gtlO-faagivektoreihin 15 Stratagene) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Rottaeläimen koetin hybridisoitiin faagi liuoksessa, joka oli 6 x SSC (15 mM trinatriumsiti 165 mM natriumkloridi) , 1 x Denhardtin liuos, 2 0,5 % Np40, 63 °C: ssa yli yön. Hybridi säätiön jäll 20 rasi perusteellinen pesu liuoksessa, joka oli : 0,1 % SDS, noin 55 °C:ssa kolmen tunnin ajan. S] I, ** rintamat tehtiin silmin nähtäviksi autoradiografia] I » · \ ·* Kloonausvektori, joka sisälsi ihmisen • · e *·**· sekvenssin, jota merkitään nimellä hCD4 0-L, tai! 25 6.12.1991 kokoelmaan American Type Culture Co!
Rockville, MD (ATCC) koodinumerolla 68873. Tämän :T: nukleotidisekvenssi ja ennustettu aminohapposekv kuvattu sekvenssissä SEQ ID numero 11 ja kuviossa 2 • Esimerkki 6 »e» # 3 0 Tämä esimerkki kuvaa rottaeläimen membraa • · *·» 50 teen 2 x 106 solua per 10 cm malja 10 mlraan Dulbec nimal Essential Medium -alustaa, johon oli lisät naudan sikiön seerumia (alusta). Solujen annettiin tyä yli yön 37 °C:ssa. Alusta korvattiin 1,5 ml:l 5 taa, joka sisälsi 66,7 μΜ klorokiiniä ja DNA-seos sisälsi 5 Mg cDNA:ta, joka kooditti mCD40-L-prc Alustaa, joka sisälsi 175 μΐ ja 25 /il DEAE-dekstr mg/ml PBS:ssa), lisättiin myös soluille. Soluja ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 tuntia. cDNA-seos poiste 10 soluille tehtiin sokki 1 ml:11a tuoretta alustaa, sälsi 10 % DMSOrta, 2,5 minuuttia. Alusta korvatt reellä alustalla ja soluja kasvatettiin 3 vuorokautta.
Esimerkki 7 15 Tämä esimerkki kuvaa CD40-L-proteiinia vast vien monoklonaalisten vasta-aineiden valmistuksen eläimen puhdistetun CD40-L-proteiinin tai ihmisen j tun CD40-L-proteiinin valmisteet valmistetaa soluekspressiolla ja CD40/Fc-affiniteettipuhdist 20 kuten tässä on kuvattu. Puhdistettua CD40-L-proteid daan käyttää muodostamaan monoklonaalisia vaste / CD40-L-proteiinia vastaan käyttäen tavanomaisia mer • * * ·* esimerkiksi niitä menetelmiä, jotka on kuva ••V patenttijulkaisussa 4 411 993. Lyhyesti, hiiret in ***** 25 daan käyttäen CD40-L-proteiinia immunogeenina emuls ft na Freundin täydelliseen adjuvanttiin ja injektoid sTs rinä, jotka vaihtelevat välillä 10 - 100 /xg, ihonc tai vatsaonte 1 oon. 10 - 12 vuokauden kuluttua in f /· duille eläimille annetaan tehosteannos
··! I
3 0 lisäproteiinilla, joka on emulsifioitu Freundin ep 1 1 «<son arin l liranf- Ί— π -ί -n Hi ί r-i Π o annal-aan ροπ -i ä 1 Ι,οα 51 testillä tai ELISA-testillä (entsyymi välittei: muunitesti).
Sopivan vasta-ainetiitterin tunnistuksen positiivisille eläimille annetaan yksi viimeinen I 5 sisäinen injektio CD40-L-proteiinia suolaliuoksess vuorokauden kuluttua eläimet lopetetaan, pernasol tään ja pernasolut fuusioidaan rottaeläimen myelc linjan kanssa (esim. NS1 tai Ag 8.653). Fuusiot muc hybridoomasoluja, jotka maljataan useille mikroti: 10 vyille selektiiviseen HAT-alustaan (hypoksantiini pteriini ja tymidiini) niin, että inhiboidaan fuus: tornien solujen, myeloomahybridien ja pernasoluhybrj sääntyminen.
Hybridoomasolut seulotaan ELISA-testillä pi 15 tua CD40-L-proteiinia vastaan olevan aktiivisuuder niiden menetelmien mukaelmilla, jotka on kuvattu ji sa Engvall et ai., Immunochem. 8: 871, 1971 patenttijulkaisussa 4 703 004. Positiiviset hybridc voidaan injektoida vatsaonteloon syngeenisiin 20 hiiriin sellaisen askitesnesteen tuottamiseksi, jol· .. tää korkeat konsentraatiot monoklonaalisia anti • * ·. . vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti hybridoomasoluja • · » • ·’ kasvattaa in vitro pulloissa tai pyörivissä pullo • a · V·* menetelmillä. Hiiren askitesnesteessä tuotetut mor • · 25 liset vasta-aineet voidaan puhdistaa ammoniumsulfac ,.*·* tuksella, jota seuraa geeliekskluusiokromatografia.
l*Vi ehtoisesti af f initeettikromatografiaa, joka perusti.
aineen sitoutumiseen proteiini A:hän tai proteiin ί /; voidaan myös käyttää, kuten voidaan käyttää affir «·* # .···. 3 0 kromatograf iaa, joka perustuu sitoutumiseen » Δ ί η n ί ί rt 52 proteiinin eritys kaksoisluovuttaja-MLC-systeemiss; set kolmesta kokeesta on esitetty taulukossa l.
Taulukko 1
IgE (ng/ml) ^ Lisäys Koe 1 Koe 2 alusta <0,1 <0,1 IL-4 24 47 10 IL-4 + SCD40 (0.1 μ^ιηΐ) 19 ei tehty DL-4 + sCD40 (0.3 μ^ιηΐ) 14 29 IL-4 + sCD40 (1 μ^πύ) 10 24 IL-4 + sCD40 (3 μ^ιηΐ) 7 19 IL-4 + IL-7R/Fc (10ug/ml) 21 ei tehty 15
IgE-tasot mitattiin 12 vuorokauden viljely] ELISA-menetelmällä. Lyhyesti, tasapohjaiset 96-ki mikrotiitterilevyt (Corning) päällystettiin hiiren naalisen anti-ihmis-IgE-vasta-aineen (Zymed) PBS:s 20 faatilla puskuroitu suolaliuos) olevalla 1:500 1; sella. Kun oli pesty kolme kertaa, suoritettiin bl< • · *β ^ vaihe käyttäen 5 % rasvatonta kuivamaitoa, jota sei * * * : ·’ misen IgE-standardien tai koesupernatanttien titi > · V·· oli pesty kolme kertaa, lisättiin biotinyloitu vuo] *·**2 25 ihmis-IgE-proteiinia (Kirkegaard and Perry) laiiru ee*j* 1:500. Tätä seurasi lisäpesu ja sitten lisättiin si diini-HRP-proteiinia (Zymed) laimennoksena 1:500 . ] jälkeen reaktio kehitettiin käyttäen TMB-substraatl : .·. kegaard and Perry) ja mitattiin absorbanssi aallon] *·· * /··. 30 la 520 nm. Kaikki pesuvaiheet suoritettiin PBS: se • · • et _ , — ^ , .........
53
Esimerkki 9 Tämä esimerkki kuvaa sCD4O-proteiinin ja fuusioproteiinin vaikutukset liukoisen CD23-p erittymisen inhiboimisessa IL-4-proteiinilla {5 ng 5 muloiduista B-soluista. Liukoinen CD40 ja CD4 0/F' tiin niiden kyvyn suhteen inhiboida IL-4-proteiini soidun sCD23-proteiinin erittymistä kaksoisluovuttajasysteemissä. Kolmen kokeen tul esitetty taulukossa 2.
10 Taulukko 2 sCD23 (ng/ml)
Lisäys Koe 1 Koe 2 Ke vuoro- vuoro- vuoro- vuoro- vi kausi kausi kausi kausi ke 15 6 12 6 12 6 E’ + alusta 55 <0,5 24 10 + IL-4 115 55 96 62 + IL-4 + sCD40 (1 μβ/ιπΐ) tehty 61 tehty 88 36 + IL-4 + sCD40 (3 μgΛlll) 97 4 82 31 20 + n^4 + SCD40 (10μ|/πι1) flhty ei tehty 72 28 ei + IL-4 + IL-7R/Fc (3 μ^πιΐ) 111 48 103 67 ·» · * · * • » PBM + alusta 12 <0^5 15 5 V\ +IL-4 39 255 47 22 "2 25 + IL-4 + sCD40(1 μ^ιηΐ) ^hty ei tehty 44 18 “l\ + IL-4 + sCD40 (3 μ^ηιΐ) 24 6 37 11
Vs +IL-4 + sCD40<KWml)ghty ei tehty 28 5 ei' + IL-4 + IL-7R/Fc (3 μς/ιηΐ) 35 26 43 20 • · « · a _ -------- _ - ----- • · » I - *·» · .*··. 30 Liukoisen CD23-proteiinin tasot mitattiin 54 11 taulukossa 2 osoitetut lisäaineet tai ilman niitä, osoittavat sCD40-proteiinin anti-allergiavaikutuk manlaiset tutkimukset suoritettiin CD40/Fc-prot sCD40-proteiinin sijasta (tuloksia ei esitetty) jc 5 samanlaiset tulokset. Sen mukaisesti nämä esimerkk 9 tulokset osoittavat anti-allergiaominaisuude proteiinille.
Esimerkki 10 Tämä esimerkki kuvaa rottaeläimen membraa 10 toutuneen CD40-L-proteiinin B-solujen lisääntymistä tavan aktiivisuuden ihmisen B-soluilla. Ihmisen pe sen veren mononukleaariset solut (PBMC) eristetti feerisestä verestä normaaleilta vapaaehtoisilta t: dienttisentrifugaatiolla HistopaqueR: ssa (Sigma, St 15 MO). T-soluista tyhjennetyt soluvalmisteet (E') poistamalla T-solut muodostamalla rosetit 2-amii isotiouroniumbromidilla käsiteltyjen SRBC-solujen punasolut) kanssa ja lisäksi tiheysgradienttisentrj olla HistopaqueR: ssa. B-solujen lisääntymistestit £ 20 tiin E'valmisteilla RPMI-alustassa, johon oli lisi lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) , *. . 10 % C02-ilmakehässä. Noin 1 x 105 E'solua per kuc • * * ·* jeltiin kolmena rinnakkaisena tasapohjaisis * * * *·*·* kuoppaisissa mikrotiitterilevyissä (Corning) 7 vuc
25 ajan niin, että läsnä oli transfektoidut CV1-EI
(kuvattu esimerkissä 6) . CVl-EBNA-solut transfe V 2 rottaeläimen CD40-L-cDNA:11a tai tyhjällä vektori luille tehtiin pulssileimaus tritioidulla tymidiind
• rällä 1 MCi/kuoppa (25 Ci/nmooli, Amersham, I
··· · *···. 30 Heights, IL) viljelmän viimeisen kahdeksan tunnin a • Ί n f· Irja T" ia H" ί i n 1 aei Vi n fiiVi λΙγλ -ϊ 1 "I c anf <-Ν,τη = = -1-1--10011¾ r~> r- 1 55 vektorissa olevalla rottaeläimen CD40-L-cDNA:lla. lokset osoittavat, että membraaniin sidottu CD40-L ihmisen B-solujen lisääntymistä komitogeenin poiss< Kuvio 4b esittää samanlaisen kokeen paitsi, että s: 5 jelmiin lisättiin 10 ng ihmisen IL-4-proteiinia/rr kokeessa IL-4-proteiini tehostaa hiukan rottaeläi braaniin sitoutuneen CD40-L-proteiinin B-soluja olevaa mitogeenista aktiivisuutta. Kuvio 5 on ku'v kuvatun kokeen toisto. Kuitenkin, kun koe toistet 10 havaittu mitään todistetta IL-4-proteiinin komitogi aktiivisuudesta. Oli havaittavissa toistettava CD40-L-proteiinin mitogeenisesta aktiivisuudesta, kaisesti membraaniin sitoutunut CD40-L stimuloi B-solujen lisääntymistä.
15 Esimerkki 11 Tämä esimerkki kuvaa rottaeläimen membraa toutuneen CD40-L-proteiinin vaikutuksen IgE-proteid ton stimuloitumiseen ja CD23-proteiinin erittymis merkissä 10 eristetyistä E"soluista. Noin 1 x 20 lua/kuoppa viljeltiin kolmena rinnakkaisena pyöri ..e sissa 96-kuoppaisissa Nunc-mikrotiitterilevyissä • · · . mountain Scientific, Bountiful, UT) Iscove's Modif « « e ;* becco's Medium -alustassa (IMDM) , johon oli lisäi * · · *·’·* FCS:ia, kosteutetussa 10 % CO2-ilmakehässä. Alustaa * * 25 tiin 50 Mg ihmisen transferriiniä/ml (Sigma), 0,5 « ..If seerumialbumiinia (Sigma) ja oleiini-, linoleiini- • ·· · mitiinihappoa (Sigma) , 1 Mg/ml kutakin. E*soluja vd 10 vuorokautta niin, että läsnä oli 5 ng ihmis< • ;*: proteiinia/ml. Lisättiin CV1-EBNA-solujen tiitter ·*· e .*··. 3 0 oli transfektoitu rottaeläimen CD40-L-sekvenssillä • · ·*«
Λ “1 ra 1 1 «k t Ί T ^ ΙΓ» j λ «n t ^i« J a «a 1». . Ί ..1.^.. A
11( 56
Kuvio 6 esittää vertailun IgE-tuotosta suj teissä (ng:na/ml) E"solujen ja CV1-EBNA-solujen v: lä, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla (Hi CD40-L-sekvenssillä. Mitään eroja ei havaittu 3 5 EBNA-soluun asti, merkittävä IgE-tuotto kuitenkin loksena lisättäessä 10 000 tai 30 000 CD40-L-seta transfektoitua CV1-EBNA-solua. Vertailun vuoki E"soluja inkuboitiin niin, että läsnä oli ainoasta taa, 5 ng IL-4-proteiinia/ml tai 5 ng IL-4-proteiii 10 500 ng G28-5-vasta-ainetta/ml, IgE-tuotto oli 4,7, 600 ng/ml, vastaavasti. Kun CD23-proteiinin erittyr tattiin kuviossa 7, 10 000 ja 30 000 CVl-EBNA-soli oli transfektoitu CD40-L-sekvenssillä, osoittivat CD23-proteiinin erittymisen, kun niitä verrattiin 15 vektorilla transfektoituihin CV1-EBNA-kontrollis
Vertailun vuoksi, kun E'soluja inkuboitiin niin, et oli ainoastaan alustaa, 5 ng IL-4-proteiinia/ml 1 IL-4-proteiinia/ml ja 500 ng G28-5-vasta-ainetta/n proteiinin erittyminen oli < 0,1, 2,4 ja 11,2 ng/ 20 taavasti. Nämä tulokset osoittavat, että IgE-ti ··' CD23-proteiinin erittyminen ovat molemmat biologisi • ** I. . visuuksia, jotka liittyvät membraaniin sitoutuneese • 9 * \ l L-proteiiniin.
***** Esimerkki 12 « * " 25 Tämä esimerkki kuvaa B-solujen lisääntymis .ΙΓ suuden, polyklonaalisen immunoglobuliinin (Ig) tue V : tigeenispesifisen vasta-aineen tuoton ja eri me membraaniin sitoutuneen ja liukoisen CD40-L-pi • ;*: käyttämiseksi kliinisissä sovelluksissa. Saimme rc ··» i 1 0 men pernan B-solut niiden menetelmien mukaisesti, • «e • Vi iT7a h h 11 ·ίιι11τ3ΐαπιοα3 i-ι ai T Ί ä lV/r-s Ί s, 11 petrimaljoilla, jotka oli päällystetty vuohen ani
IgM-vasta-aineella. Puhdistettuja B-soluja viljelt: alustassa, jossa oli naudan sikiön seerumia solulisääntymistesteissä ja 20 % plakkimuodostus 5 teissä tai polyklonaalisissä vasta-ainetei 2-merkaptoetanoliaf antibiootteja, aminohappoja vaattia. B-solujen lisääntyminen mitattiin esimer ja julkaisuissa Grabstein et ai. I, yllä, Malisz ai., I, yllä ja Maliszewski et ai. II, yllä, kuvat 10 telmän mukaisesti. Antigeenispesifisen vasta-aineei
tus mitattiin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet C
et ai. J. Mol. Cell. Immunol. 2:199, 1986 [Grab ai., II]. Lyhyesti, antigeenispesifisessä vasta-aii dostuksessa käytettiin lampaan punasoluja (SRBC) ai 15 na (0,03 % v/v) 2,0 ml:n viljelmissä, joissa oli rottaeläimen B-solua/viljelmä. B-soluviljelmiä in) 5 vuorokautta ja plakkeja muodostavat solut mää: hemolyyttisellä Jeme-plakkitestillä, kuten ovat }
Grabstein et ai., II, yllä. Solumäärät määritetti 20 ter-laskijalla. Polyklonaalisen Ig:n eritys määi ;.e isotyyppispesifisillä ELISA-testeillä seitsemän vuc \a . ikäisistä viljelmistä, joissa oli 2 x 10 B-solua * * * \ l ml:n viljelmä, kuten ovat kuvanneet Maliszewski et * * · ’·*·* yllä ja Maliszewski et ai., II, yllä.
• · 25 Tulokset B-solujen lisääntymisestä C
soluilla, jotka oli transfektoitu CD40-L-sekvenss V*: tyhjällä vektorilla, tai 7A1-soluilla auttajasoluklooni), on esitetty kuvioissa 8, 10 ja • ·*· tulokset osoittavat, että suurimman B-solujen lisää ·«· · .*··. 30 aiheutti CD40-L. T-auttajasoluilla 7A1 ja 7C2 oli ** Λ Ί Ί VI rt W V V —N -m l^i Π rt· rt, 1 ^ rt rt Ί « M n. rt «rt 4« · ! rt rt M « 58 11 soluilla tuntuu olevan inhibitorinen vaikutus ani pesifisen vasta-aineen muodostukseen. Kuvio 11 PFC:t (plakkeja muodostavat solut) T-auttajasoluil] CV1-EBNA-soluille, jotka on transfektoitu joko 5 vektorilla tai CD40-L-sekvenssillä. Sekä 7C2-so! membrääniin sitoutunut CD40-L-proteiini stimuloiv geenispesifisen vasta-aineen muodostuksen (PFC). 13 vertaillaan CD40-L-solujen ja 7Al-solujen ant pesifistä vasta-aineen muodostusta silloin, kun las 10 ng interleukiini-2-proteiinia (IL-2)/ml tai ilman s 2-proteiini kohotti PFC:tä 7Al-soluille, mutta se e tanut PFC:tä, jonka aiheutti membraaniin sitoutunut proteiini.
Rottaeläimen B-solujen polykionaalisen Ig:r 15 verrattiin stimulaation tai inhibition suhteen mer
sitoutuneella CD40-L-proteiinilla, C
kontrollisoluilla ja T-auttajasoluilla 7A1 niin, et oli sytokiinit IL-4 (10 ng/ml) ja IL-5 (1:40 laimer solusupernatanteista) tai ilman lisättyjä sytokiine 20 , IgG3-, IgE-, IgG2b-, IgM- ja IgGl-määrät on esite ·* lukoissa 3-8, vastaavasti.
I, . Taulukko 3 • · · • · • · : V: IgA, ng/ml ·:··: 25 Solujen .·. määrä Alusta +IL- • Mi sT: CD40-L 2X10(5) 666,275 ± 174,444 64,639 1 X10(5) 288,085 ± 20,773 291,831 1X10(4) 53,750 ± 36,531 910,072 • · rt.’ HAVEO 2X10(5) 0 628,190 : : 30 IX 10(5) 0 477,755 . i v inm n 70s Ain ,59 .
Taulukko 4
IgG3t ng/ml 5 Solujen määrä Alusta h CD40-L 2 X 10(5) 108,427 ± 14,359 1 X 10(5) 118,079 + 8,021 1 X 10(4) 127,591 ± 6;268 467, ln HAVEO 2X10(5) 0 29, 10 1 X10(5) 11,205 ± 4,434 66, 1X10(4) 26,389 ± 10,221 34,< 7A1 (2C11) 1 X10(6) 33.420 ± 9,972 820, 2 X 10(5) 0 436.
1X 10(5) 0 239, 15 Alusta 2L808 ± 7,107 64,) LPS 816,697 ± 43,553 103,
Taulukko 5
IgE* ng/ml
Solujen määrä Alusta +1 .. CD40-L 2X10(5) 0 64,1 : *·· 1X 10(5) 0 83.4 1X 10(4) 0 461,1 • * :V: HAVEO 2X10(5) 0 25 1X 10(5) 0 4,2 * · 1X10(4) 0 « ·::: 7ai ccid 1x10(6) o 208,1 ::: 2 X 10(5) 0 32,3 1X 10(5) 0 15,8 : Alusta 0 12,6 ::!.s lps o 408,: • · ♦ I «*« 60 1 1 1 1
Taulukko 6
IgG2b, ng/ml
Solujen
määrä Alusta +U
5 CD40-L 2 X 10(5) 0 1X 10(5) 0 6,2! 1 X 10(4) 0 47,4 HAVEO 2X10(5) 0 7,00 1X 10(5) 0 6,23 10 1X 10(4) 0 9,62 7A1 (201) 1 X 10(6) 0 189,3 2 X 10(5) 0 22,4! 1X 10(5) 0 7,20'
Aiusta 0 7,42; 15 LPS 0 33;2i
Taulukko 7
IgM^g/ml
Solujen määrä Alusta +1 20 CD40-L 2 X 10(5) 1.805 ± 0.639 0.4: 1X 10(5) 2,237 ± 0J83 5 8' 1X 10(4) 2,293 ± 0,595 96;7: m :v: HAVEO 2X10(5) 0 10.8 M IX 10(5) 0 13,3 \V 25 1X 10(4) 0,624 ± Or178 22,5 7A1 (2C11) 1 X10(6) 0.769 ± 0.124 104,8 :· 2 X 10(5) 0.3 42 ± 0.052 27,0 1X 10(5) 0,126 ± 0,048 13,0
AlUSta ' 0,231 ± 0,057 36,8' . . LPS 53.302 ± 9,668 41.9' • · · ' ' ' III fr fr fr · «#· • fr • fr • fr» fr 61 11
Taulukko 8
IgGl, ng/ml
Solujen +jL
5 määrä Alusta CD40-L 2X10(5) 0 130,.18 1X 10(5) 0 310,58 1X 10(4) 0 270,72' HAVEO 2X10(5) 0 187,66:
10 1X 10(5) 0 43,32C
IX 10(4) 0 1363,4< 7A1 (2C11) 1X10(6) 0 145,652 2 X 10(5) 0 365,56: 1X 10(5) 0 449,475
Alusta 0 133,66C
15 LPS 0 246,21: Nämä tulokset osoittavat, että CD40-protej teraktio ligandinsa kanssa on pääasiallinen molek] interaktio, joka on vastuussa T-solun kontaktista 20 vaisesta B-solun kasvun ja erilaistumisen induktic antigeenispesifiseen vasta-ainetuottoon että poly] • *· I.. sen Ig:n eritykseen. Sellaisenaan nämä tulokset ani « « · \ ** dottaa, että tämän interaktion antagonistit liukoii • * · '·*·* proteiinin, CD40/Fc-fuusioproteiinin ja mahdollise *·*·* • · 25 koisen CD40-L-protennin (monomeeri) muodossa hä: merkittävästi vasta-ainevasteiden kehittymistä. Se ···
ϊ kliiniset tilanteet, joissa CD40-proteiini, CE
fuusioproteiinit ja liukoinen CD40-L-proteiini s: • ·*· allergian, ihohukan, nivelreuman, insuliinista riij ·»· · .·*·. 30 sokeritaudin ja mitkä tahansa muut taudit, joissa 62 11 rokoteadjuvantteinä ja stimuloivina aineina monok! ten vasta-aineiden erityksessä hybridoomasoluista.
Esimerkki 13 Tämä esimerkki kuvaa membraaniin sitoutune 5 L-proteiinin vaikutuksen perifeerisen veren mononui ten solujen (E") lisääntymiseen ja IgE-eritykseen saatiin esimerkissä 10 kuvatun menetelmän mukai niitä inkuboitiin 7 - 10 vuorokautta sellaisten ( solujen läsnä ollessa, jotka oli transfektoitu 10 vektorilla tai mCD40-L-cDNA:11a. Lisäksi fuusioproteiinia {kuvattu esimerkissä 1 TNF-reseptori/Fc-fuusioproteiinia (kuvattu julkai, 91/03 553) lisättiin joihinkin valmisteisiin, kute vattu kuviossa 14. IgE-eritystä mitattiin esimerkis 15 vatun menetelmän mukaisesti ja B-solujen lisääntyn tattiin esimerkissä 10 kuvatun menetelmän mukaisest
Tulokset B-solujen lisääntymisestä j erityksestä on kuvattu kuviossa 14 viidelle eri koi tiolle transfektoituja CVl-EBNA-soluja. Sekä B-sol 20 sääntyminen että IgE-eritys kohosi, kun läsnä oli ·· niin sitoutunutta CD40-L-proteiinia.
* »* *. . fuusioproteiinin lisääminen poisti sekä B-solujen ] t * · i misen että IgE-erityksen. TNF-resej t t t ***** fuusioproteiinilla ei ollut mitään vaikutusta, λ ·*’· 25 vuoksi IgE-eritykselle, IL-4-proteiinin lisääminen liaineena (ilman transfektoituja CVl-EBNA-soluja) V · tanut yhtään IgE-proteiinia tässä testissä j proteiinin lisääminen yhdessä monoklonaalisen G2£ * ;*j CD40-vasta-aineen kanssa johti tässä testissä IgE- *·· · -···. 3 0 joka oli 2 9,7 ng/ml.
**#
* 1 A
63 peptidiä (tai signaalia)f joka on kahdeksan aminohi rofiilinen sekvenssi, jonka ovat kuvanneet Hopp (Hopp et ai., Bio/Technology 6:1204, 1988, jota n: nimellä FlagR) , immunoglobuliinin sopivaa Fc 5 [Gly4Ser] 3-toistosekvenssiä (kuvattu US-patenttiju! 5 073 627, joka on liitetty tähän viitteeksi) tai r pivaa linkkerisekvenssiä ja ihmisen CD40-L-protei lunulkoista aluetta aminohaposta 50 aminohappoon ID numero 11). Ekspressiovektori pDC406, joka sisä' 10 der-sekvenssin, FlagR-sekvenssin ja ihmisen IgGi-Ft valmistetaan käyttäen tavanomaisia sellaisten fra< entsyymikatkaisu- ja ligaatiomenetelmiä, jotka ko<
leader-sekvenssiä, FlagR-sekvenssiä ja ihmisen IgG
ja jotka fragmentit katkaistaan Nsil- ja NotI-ents> 15 PCR-menetelmiä (Särki et ai., Science 1988) käytettiin käyttäen 5'- (ylävirta) ja 3'- (< oligonukleotidialukkeita CD40-proteiinin solunulkc meenia koodit tavi en DNA-sekvenssien amplifioimisek nausvektorista, joka sisälsi ihmisen CD40-L-S1 20 (ATCC 68873; SEQ ID numero 11) PCR-fragment in muc seksi. Ylävirran oligonukleotidialuke (SEQ ID nu j. / muodosti Nsil-kohdan ylävirtaan linkkeriseta • · · * l ( [Gly4Ser] 3SerSer) , jota seurasi 21 nukleotidia * · 1 *·1·1 proteiinin solunulkoista domeenia (aminohapot 51 - ***** 25 venssistä SEQ ID numero 11) . Alavirran oligonukleot „1·1 (SEQ ID numero 14) muodosti NotI-kohdan juuri a] *·· . .
: CD40-L-protennm terminaatiokodomsta. Sitte: fragmentti ligoitiin pDC406-ekspressiovektoriin, • ·1· sälsi leader-sekvenssin, FlagR-sekvenssin ja ihmis » .···. 3 0 Fc-alueen. CD40-L/FC2-rakenteen nukleotidisekvenss • ♦ ··· nnchpfhn ami nnh^nnnaolrvonaGi λπ οοί eöWcncscsä 11 64 valttiin fluoresenssilla aktivoidussa solulajitte! sissä (FACS), jossa käytettiin soluja, jotka eksp] CD40-protei inia.
Suurimittakaavaiset ihmisen embryonaalist 5 aissolujen 293 (ATCC CRL 1573), jotka oli trani CD40-L/FC2-rakennetta koodittavalla rakenteella, ^ kasvatettiin sellaisen supernatantin akkumuloimisei sisälsi CD40-L/FC2-proteiinia. 293-solulinja, joka vä ihmisen primaaristen embryonaalisten munuaisso] 10 lulinja, joka on transfektoitu ihmisen adenov: DNA:11a, sallii sellaisten rekombinanttiproteiin pression, jotka on ligoitu pCD406-vektoriin. Sup< tinesteessä oleva CD40-L/FC2-fuusioproteiini puhd: affiniteettipuhdistuksella. Lyhyesti, CD< 15 fuusioproteiinia sisältävä viljelmäsupernatantti pi tiin suodattamalla nisäkässolujen supernatantit {es
Mm suodattimena) ja laittamalla suodos aineaffiniteettipylvääseen, joka sisälsi biotinyloj hen anti-ihmis-IgG-vasta-ainetta (Jackson Immune 20 Laboratories, Inc., Westgrove, PA, USA), joka oli
tetty streptavidiini-agaroosiin (Pierce Chemical, I
** , IL, USA), 4 °C:ssa virtausnopeudella, joka oli noir * 1 1 ml/tunti 1,5 x 12,0 cm pylväässä. Pylväs pestiin • 1 1 *·1·1 pylvään tilavuudella PBSrsta (fosfaatilla puskuroit 1 25 liuos), kunnes vapaata proteiinia ei voitu havaita * kurissa. Sitoutunut fuusioproteiini eluoitiin j 11 65
Esimerkki 15 Tämä esimerkki kuvaa sellaisen CD40-L-DNA-3 rakentamisen, joka ekspressoi liukoista fuusioproteiinia, jota kutsutaan nimellä trimeerir 5 L. Trimeerinen CD40-L sisältää leader-sekvenssin, 1 hapon pituisen sekvenssin, jota kutsutaan nimellä ni-zipper" (SEQ ID numero 17) ja kahdeksan aminob t ui sen hydrofiilisen sekvenssin, jonka ovat kuvani: et ai. (Hopp et ai., Bio/Technoloqy 6:1204, 1988, j 10 sutaan nimellä FlagR) , jota seuraa ihmisen proteiinin solunulkoinen alue aminohaposta 50 amir 261 {SEQ ID numero 11) . Leader- ja FlagR-sekvenssi! kelpoisuus on kuvattu yksityiskohtainen kuvaus -l· Sekvenssissä SEQ ID numero 17 kuvattu 33 aminoha 15 venssi trimerisoituu spontaanisti liuoksessa. Tämär nohapon sekvenssin sisältävien fuusioproteiinien aj näin ollen muodostavan spontaanisti trimeereitä ta meerej ä.
Rakenne valmistetaan syntetisoimalla oligor 20 dit, jotka edustavat leader-sekvenssiä, 33 aminoh .. tuista sekvenssiä, joka on kuvattu yllä ja • *· . sekvenssiä, sitten ligoimalla lopullinen tuoi • · * ** fragmenttiin, joka koodit taa sekvenssin SEQ ID n * « · *·*·* aminohappoja 51 - 261, joka fragmentti on valmiste ·*** 25 ten on kuvattu esimerkissä 14.
Tuloksena syntynyt ligaatiotuote ekspress ♦βί : rissa pDC406 transfektoitiin apinan munuaisen soi CV-l/EBNA (ATCC CRL 10478). Plasmidi pDC406 sisält •·*· viruksesta, ihmisen immuunipuutosviruksesta (HIV) *** · ·*··. 30 stein-Barr-viruksesta (EBV) peräisin olevat säätely
• M
• s it- . PV-1 /ΈΤ^ΝΤΑ-ηπΊ ni i ni a saatiin transfAlftnimal 1 66 r ekspressiovektoreiden, jotka sisältävät EBV-rep! origon, kuten pDC406, episomaalisen replikaation.
Kun solut, jotka ekspressoivat fuusiorakem tunnistettu, kasvatetaan transfektoitujen solujen £ 5 takaavaiset viljelmät niiden solujen supernatanttd muloimiseksi, jotka solut ekspressoivat trimeeristi proteiinia. Supernatantissa oleva trimeerinen fuusioproteiini puhdistetaan affiniteettipuhd: la oleellisesti, kuten on kuvattu US-patenttiju^ 10 5 011 912. Eluoidun CD40-L-fuusioproteiinin hope< SDS-PAGE-geelit voidaan valmistaa puhtauden määrit si.
·· • · • ♦· ♦ · * • · · » · « · • · · • ♦ · * « « * · * » · *··· * · · • * « m * ♦ ♦ · • · · ··* » · 9 • 9 • * h 67
1J
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT: ARMITAGE, RICHARD FANSLOW, WILLIAM SPRIGGS, MELANIE
{ii) TITLE OF INVENTION: NOVEL CYTOKINE
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 17 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:
(A) ADDRESSEE: IMMUNEX CORPORATION
(B) STREET: 51 UNIVERSITY STREET
(C) CITY: SEATTLE
(D) STATE: WASHINGTON
(E) COUNTRY: USA {F) ZIP: 98101 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1*0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: PCT/US92/08990 fB) FILING DATE: 23 October 1992 (C) CLASSIFICATION: .
(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Perkins, Patricia A.
(B) REGISTRATION NUMBER: 34,693
(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 2802-WO
(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: {A) TELEPHONE: 2065870430 (B> TELEFAX: 2065870606 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: I. . (A) LENGTH: 783 base pairs i * : (B) TYPE: nucleic acid \ I iC) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: CDNA *:* (iii) HYPOTHETICAL: NO
i««« • t«
: (iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE:
. . (A) ORGANISM: MOUSE
• · · • · · '**.* (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: CD40-L
68 CTT CCA GCG AGC ATG AAG ATT TTT ATG TAT TTA CTT ACT GTT TTC CTT Leu Pro Ala Ser Met Lys lie Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 ATC ACC CAA ATG ATT GGA TCT GTG CTT TTT GCT GTG TAT CTT CAT AGA Ile Thr Gin Met He Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 AGA TTG GAT AAG GTC GAA GAG GAA GTA AAC CTT CAT GAA GAT TTT GTA Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 TTC ATA AAA AAG CTA AAG AGA TGC AAC AAA GGA GAA GGA TCT TTA TCC Phe He Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser 65 70 75 80 TTG CTG AAC TGT GAG GAG ATG AGA AGG CAA TTT GAA GAC CTT GTC AAG Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gin Phe Glu Asp Leu Val Lys 85 90 95 GAT ATA ACG TTA AAC AAA GAA GAG AAA AAA GAA AAC AGC TTT GAA ATG Asp He Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met 100 105 110 CAA AGA GGT GAT GAG GAT CCT CAA ATT GCA GCA CAC GTT GTA AGC GAA Gin Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gin He Ala Ala His Val Val Ser Glu 115 120 125 GCC AAC AGT AAT GCA GCA TCC GTT CTA CAG TGG GCC AAG AAA GGA TAT Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 140 TAT ACC ATG AAA AGC AAC TTG GTA ATG CTT GAA AAT GGG AAA CAG CTG Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu 145 150 155 160 ACG GTT AAA AGA GAA GGA CTC TAT TAT GTC TAC ACT CAA GTC ACC TTC Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gin Val Thr Phe 165 170 175 TGC TCT AAT CGG GAG CCT TCG AGT CAA CGC CCA TTC ATC GTC GGC CTC Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gin Arg Pro Phe He Val Gly Leu ., 180 185 190 J «
, TGG CTG AAG CCC AGC ATT GGA TCT GAG AGA ATC TTA CTC AAG GCG GCA
: ' : Trp Leu Lys Pro Ser Ile Gly Ser Glu Arg He Leu Leu Lys Ala Ala \ : 195 200 205 • · · * a a
*. AAT ACC CAC AGT TCC TCC CAG CTT TGC GAG CAG CAG TCT GTT CAC TTG
J··; Asn Thr His Ser Ser Ser Gin Leu Cys Glu Gin Gin Ser Val His Leu , 210 215 220 a a a «
'!!! GGC GGA GTG TTT GAA TTA CAA GCT GGT GCT TCT GTG TTT GTC AAC GTG
::: Gly Gly Val Phe Glu Leu Gin Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val * 225 230 235 240
. . ACT GAA GCA AGC CAA GTG ATC CAC AGA GTT GGC TTC TCA TCT TTT GGC
: Thr Glu Ala Ser Gin Val He His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly ..·* 245 250 255 • · • ·
*** TTA CTC AAA CTC TGA
69L
(ii> MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
Met lie Glu Thr Tyr Ser Gin Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly 15 10 15
Leu Pro Ala Ser Met Lys lie Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 lie Thr Gin Met lie Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45
Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60
Phe lie Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser 65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gin Phe Glu Asp Leu Val Lys 85 90 95
Asp lie Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met 100 105 110
Gin Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gin He Ala Ala His Val Val Ser Glu 115 120 125
Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gin Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 140
Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu 145 150 155 160
Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gin Val Thr Phe 165 170 175
Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gin Arg Pro Phe He Val Gly Leu 180 185 190
Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg He Leu Leu Lys Ala Ala .. 195 200 205 • ft • «* ·· . Asn Thr His Ser Ser Ser Gin Leu Cys Glu Gin Gin Ser Val His Leu • V 210 215 220 • ft :.V Gly Gly Val Phe Glu Leu Gin Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val . 225 230 235 240 ft * • Thr Glu Ala Ser Gin Val He His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly .J·· 245 250 255 • ftft ·,· · Leu Leu Lys Leu 260 « · : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: *·· ϊ.,,ί (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • fAi T.TCWCTW· 74Π nairs 70
(A) ORGANISM: HUMAN
(vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: IgGl Fc (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
CGGTACCGCT AGCGTCGACA GGCCTAGGAT ATCGATACGT AGAGCCCAGA TCTTGTGACP AAACTCACAC ATGCCCACCG TGCCCAGCAC CTGAACTCCT GGGGGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCC TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC ACGTACCGGG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAC TACAAGTGCi AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TGCAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG GCACATCGCC GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAATGA
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 519 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear *« • (ii) MOLECULE TYPE: CDNA ** *
; (iii) HYPOTHETICAL: NO
uv) anti-sense: no *:**: (vi) ORIGINAL SOURCE:
. (A) ORGANISM: HUMAN
«M
* ‘III (vii) IMMEDIATE SOURCE:
:,: : (B) CLONE: CD40 EXTRACELLULAR REGION
. ^ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: • * *
CAGAACCACC CACTGCATGC AGAGAAAAAC AGTACCTAAT AAACAGTCAG TGCTGTTCTT
• ♦
•M
71 11
AATGTCACCC TTGGACAAGC TGTGAGACCA AAGACCTGGT TGTGCAACAG GCAGGCACAi ACAAGACTGA TGTTGTCTGT GGTCCCCAGG ATCGGCTGA
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 base pairs (B) TYPE: nucleic acid <C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
{vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: PCR PRIMER
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: CD40 5' PRIMER
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:
CCGTCGACCA CCATGGTTCG TCTGCC
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 28 base pairs (B) , TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: CDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
• ft
; 1·< (iv) ANTI-SENSE: NO
·· 1 • (vi) ORIGINAL SOURCE:
• ! (A) ORGANISM: PCR PRIMER
« · · · · (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: CD40 3' PRIMER
ft ftftft ft (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:
i · I X
• ft ft
CCGTCGACGT CTAGAGCCGA TCCTGGGG
· : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: a 1 ft (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : ft ίΑΐ Τ.Ϊ?Μί3ΤΐΙ» ΔΠ hae ö λλϊγρ 72 (vii) IMMEDIATE SOURCE: 1 1
(B) CLONE: CD40 3' DOWNSTREAM PRIMER
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:
ACAAGATCTG GGCTCTACGT ACTCAGCCGA TCCTGGGGAC
{2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 5 amino acids (B) TYPE: amino acid {D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(v) FRAGMENT TYPE: internal (vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: PENTAPEPTIDE
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8:
Tyr Val Gly Pro Arg 1 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 43 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D} TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: CDNA
.. (iii) HYPOTHETICAL: NO
• · • ** I1 . (vi) ORIGINAL SOURCE:
ί 1 : (A) ORGANISM: PCR PRIMER
* 1 • t Γ (vii) IMMEDIATE SOURCE:
J1 \ (B) CLONE: HUMAN IGG1/FC 5' PRIMER
• Φ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: ···
:,: : TATTAATCAT TCAGTAGGGC CCAGATCTTG TGACAAAACT CAC
· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10: • · · • · · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ·,,,· (A) LENGTH: 38 base pairs • (B) TYPE: nucleic acid 73 11 (vii) IMMEDIATE SOURCE:
{B> CLONE: HUMAN IGG1/FC 3' DOWNSTREAM PRIMER
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:
GCCAGCTTAA CTAGTTCATT TACCCGGAGA CAGGGAGA
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 840 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: CD40-L
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 46..831 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:ll:
TGCCACCTTC TCTGCCAGAA GATACCATTT CAACTTTAAC ACAGC ATG ATC GAA
Met He Glu 1 ACA TAG AAC CAA ACT TCT CCC CGA TCT GCG GCC ACT GGA CTG CCC ATC ·· Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly Leu Pro He • “·· 5 10 15 ·· ·
• V AGC ATG AAA ATT TTT ATG TAT TTA CTT ACT GTT TTT CTT ATC ACC CAG
4· · Ser Met Lys He Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu He Thr Gin 20 25 30 35 • ATG ATT GGG TCA GCA CTT TTT GCT GTG TAT CTT CAT AGA AGG TTG GAC • Met He Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp ...: 40 45 50 ···
V : AAG ATA GAA GAT GAA AGG AAT CTT CAT GAA GAT TTT GTA TTC ATG AAA
Lys He Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys 55 60 65 • *
:.: : ACG ATA CAG AGA TGC AAC ACA GGA GAA AGA TCC TTA TCC TTA CTG AAC
.···, Thr He Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn ·...· 70 75 80 74 11 AGT AAA ACA ACA TCT GTG TTA.CAG TGG GCT GAA AAA GGA TAC TAC ACC Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gin Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr 135 140 145 ATG AGC AAC AAC TTG GTA ACC CTG GAA AAT GGG AAA CAG CTG ACC GTT Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin Leu Thr Val 150 155 160 AAA AGA CAA GGA CTC TAT TAT ATC TAT GCC CAA GTC ACC TTC TGT TCC Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr lie Tyr Ala Gin Val Thr Phe Cys Ser 165 170 175 AAT CGG GAA GCT TCG AGT CAA GCT CCA TTT ΑΤΑ GCC AGC CTC TGC CTA Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro Phe lie Ala Ser Leu Cys Leu 180 185 190 195 AAG TCC CCC GGT AGA TTC GAG AGA ATC TTA CTC AGA GCT GCA AAT ACC Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg lie Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr 200 205 210 CAC AGT TCC GCC AAA CCT TGC GGG CAA CAA TCC ATT CAC TTG GGA GGA His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser lie His Leu Gly Gly 215 220 225 GTA TTT GAA TTG CAA CCA GGT GCT TCG GTG TTT GTC AAT GTG ACT GAT Val Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp 230 235 240 CCA AGC CAA GTG AGC CAT GGC ACT GGC TTC ACG TCC TTT GGC TTA CTC Pro Ser Gin Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu 245 250 255 AAA CTC TGAACAGTGT CA Lys Leu 260 (2} INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 261 amino acids ,1 2 3 (B) TYPE: amino acid : (D) TOPOLOGY: linear :V: (ii) MOLECULE TYPE: protein * · • ·
• 1 I
* \ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: • •••a * a . Met He Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly ·:· 15 10 15 •at1 * aa ί i I Leu Pro He Ser Met Lys lie Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu * 20 25 30 . lie Thr Gin Met He Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 2 ::: 35 40 45
Μι I
3 : : Arg Leu Asp Lys He Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val V 50 55 60 75 115 120 125 ^
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gin Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin 145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr lie Tyr Ala Gin Val Thr 165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro Phe lie Ala Ser 180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg He Leu Leu Arg Ala 195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser lie His 210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gin Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu 260 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 73 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D> TOPOLOGY: linear
tii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
·· {iv> ANTI-SENSE: NO
* *·· * •t · S V (5C± > SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: * * '.V TGGTGGCGGA GGGTCAGGCG GAGGTGGGTC CGGAGGCGGG GGTTCAAGTT CTGACAAGAl ft
AGAAGATGAA AGG
ft • ftft e» ft .·· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14: • « ♦ <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: {A) LENGTH: 21 base pairs • #·. {B) TYPE: nucleic acid :.: : (O STRANDEDNESS: single .···. (D) TOPOLOGY: linear • ft »•ft 76 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :15: 1 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1425 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
{ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vii) IMMEDIATE SOURCE: (B) CLONE: Human CD40-L/FC2 {soluble CD40-L) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 4..1422 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: mat_peptide (B) LOCATION: 79..1422 (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: sig_peptide (B) LOCATION: 4..78 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:
TAT ATG TTC CAT GTT TCT TTT AGA TAT ATC TTT GGA ATT CCT CCA CTG
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr lie Phe Gly lie Pro Pro Leu -25 -20 -15
ATC CTT GTT CTG CTG CCT GTC ACT AGC TCT GAC TAC AAA GAT GAC GAT
lie Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp -10 -5 15
GAT AAA AGA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA
Asp Lys Arg Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala .. 10 15 20 • · • 1«
!. . CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC
! 1 ί Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro .I 25 30 35 • · * · ·
*, AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG
*:1·! Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val . 40 45 50 ···
*::: GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG
ί,ί 5 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 55 60 65 70
. · GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG
1.: 1 AsP Gly Val Glu Val His Asn Ala bys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin β·.·β 75 80 85 • · ···
TAC AAC AGC ACG TAC CGG GTG GTC AGC GTC CTC arc GTC CTG ran caG
77
CGA G AA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC
Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 135 140 145 150
AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC
Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 155 160 165
GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC
Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 170 175 180
AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC
Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 185 190 195
AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC
Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe 200 205 210
TCA TGC TCC GTG ATG CAT GGT GGC GGA GGG TCA GGC GGA GGT GGG TCC
Ser Cys Ser Vai Met Hxs Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 215 220 225 230
GGA GGC GGG GGT TCA AGT TCT GAC AAG ATA GAA GAT GAA AGG AAT CTT
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu 235 240 245
CAT GAA GAT TTT GTA TTC ATG AAA ACG ATA CAG AGA TGC AAC ACA GGA
His Glu Asp Phe Vai Phe Met Lys Thr Ile Gin Arg Cys Asn Thr Gly 250 255 260
GAA AGA TCC TTA TCC TTA CTG AAC TGT GAG GAG ATT AAA AGC CAG TTT
Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gin Phe 265 270 275
GAA GGC TTT GTG AAG GAT ATA ATG TTA AAC AAA GAG GAG ACG AAG AAA
Glu Gly Phe Vai Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys 280 285 290
GAA AAC AGC TTT GAA ATG CAA AAA GGT GAT CAG AAT CCT CAA ATT GCG
Glu Asn Ser Phe Glu Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin Ile Ala .. 295 300 30S 310 * · • ··
I. . GCA CAT GTC ATA AGT GAG GCC AGC AGT AAA ACA ACA TCT GTG TTA CAG
; Ala His Vai Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Vai Leu Gin . . 315 320 325 » » · • t ·
* \ TGG GCT GAA AAA GGA TAC TAC ACC ATG AGC AAC AAC TTG GTA ACC CTG
***** Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Vai Thr Leu . 330 335 340 GAA AAT GGG AAA CAG CTG ACC GTT AAA AGA CAA GGA CTC TAT TAT ATC *,1 · Glu Asn Gly Lys Gin Leu Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr Ile 345 350 355
TAT GCC CAA GTC ACC TTC TGT TCC AAT CGG GAA GCT TCG AGT CAA GCT
· Tyr Ala Gin Vai Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala 360 365 370 ♦ · ·«· 78
TCG GTG TTT GTC AAT GTG ACT GAT CCA AGC CAA GTG AGC CAT GGC ACT
Ser Vai Phe Vai Asn Val Thr Asp Pro Ser Gin Val Ser His Gly Thr 425 430 435
GGC TTC ACG TCC TTT GGC TTA CTC AAA CTC TGA
Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 440 445 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 473 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:
Met Phe His Vai Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly He Pro Pro Leu He -25 -20 -15 -10
Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp -5 1 5
Lys Arg Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 10 15 20
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 25 30 35
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 40 45 50 55
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 60 65 70
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 75 80 85 ··. Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp : ·· 90 95 100 ·1 · : V Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu .V. 105 110 115 • · · * ·
Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg • · 120 125 130 135 ..I:" Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 140 145 150 • · ·
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 155 160 165 * 1 · I.: : He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys .···. 170 175 180 • · ··· Φίιν1 fPVi-v- D>1a Tfal T a1i A aa Caa A aa Pi .f nUA r - m /-a - 79 1
Glu Asp Phe Vai Phe Met Lys Thr lie Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu 250 255 260
Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu lie Lys Ser Gin Phe Glu 265 270 275
Gly Phe Val Lys Asp lie Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu 280 285 290 295
Asn Ser Phe Glu Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin lie Ala Ala 300 305 310
His Val lie Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gin Trp 315 320 325
Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu 330 335 340
Asn Gly Lys Gin Leu Thr Val Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr lie Tyr 345 350 355
Ala Gin Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro 360 365 370 375
Phe lie Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg lie 380 385 390
Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin 395 400 405
Gin Ser lie His'Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser 410 415 420
Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gin Val Ser His Gly Thr Gly 425 430 435
Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 440 445 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ,, (A) LENGTH: 33 amino acids : \. (B) TYPE: amino acid ;, . (D) TOPOLOGY: linear • · · • » \ ; (ii) MOLECULE TYPE: peptide • · · • · e ’ (xi> SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17: • * . Arg Met Lys Gin Ile Glu Asp Lys He Glu Glu He Leu Ser Lys ] ·:· 15 10 15
• · · Tyr His Ile Glu Asn Glu He Ala Arg He Lys Lys Leu Ile Glv C
20 25 30 . . Arg
• I I
• » * *·« · 1 · • # • · • 99

Claims (14)

1. Eristetty DNA, joka koodittaa CD40-L-tidiä, joka sitoutuu CD40-proteiiniin, t u n r 5 siitä, että DNA on: (a) DNA, joka sisältää sekvenssin SEQ ID r nukleotidit 46 - 828, sekvenssin SEQ ID numero 11 tidit 184 - 828, sekvenssin SEQ ID numero 11 nul· 193 - 762 tai sekvenssin SEQ ID numero 1 nukleotidit 10 tai niiden komplementaariset säikeet; (b) DNA, joka koodittaa sekvenssin SEQ IE 12 aminohapot 1 - 261, sekvenssin SEQ ID numeron 1 hapot 47 - 261, tai sekvenssin SEQ ID numeron 12 pot 51 - 261; 15 (c) DNA, joka koodittaa sekvenssin SEQ ID 2 aminohapot 1 - 260 tai sekvenssin SEQ ID numero nohapot 47 - 260; (d) DNA, joka koodittaa fragmentin, mistä sekvenssin SEQ ID numeron 12 aminohapoista 1-2 20 venssin SEQ ID numeron 12 aminohapoista 47 - 261, .. sin SEQ ID numeron 12 aminohapoista 51 - 261; se ·.. SEQ ID numeron 2 aminohapoista 1 - 260 tai sekven * 1 1 • ·1 ID numeron 2 aminohapoista 47 - 260; * · 1 ***** (e) DNA, joka on komplementti DNA: lie, jok *·"· 25 disoituu kohdan (a) DNA:hän keskinkertaisen ankari t „1·1 suhteissa (esipesuolosuhteissa 5 x SSC, 0,5 % SDS : EDTA (pH 8,0) ja hydridisaatio-olosuhteissa 50 SSC, yli yön); • 2: (f) DNA, joka johtuen geneettisen koodin li· « 3. raatiosta koodittaa minkä tahansa edellä olevan DN • ♦ ··· H1i hhs itiä λ nnl i H ί 5 · 2 (i) kohdan (a) - (f) mukainen DNA, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa immunoglc Fc-alueen; tai (j) kohdan (g), (h) ja/tai (i) mukainen se 5 jossa DNA koodittaa molekyyliä, joka sisältää \ kaksi CD40-L-polypeptidiä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eriste tunnettu siitä, että se koodittaa liukois L-polypeptidiä.
3. Eristetty DNA, joka koodittaa ihmisen polypeptidiä, tunnettu siitä, että se hCD40-L-nimisen sekvenssin, joka on talletettu t laitokseen American Type Culture Collection t numerolla 68873.
4. Eristetty DNA, joka koodittaa rott CD40-L-polypeptidiä, tunnettu siitä, ett sittää pDC406-mCD40-L-nimisen sekvenssin, joka o: tettu talletuslaitokseen American Type Culture Cc talletusnumerolla 68872.
5. Eristetty DNA, joka koodittaa .. polypeptidiä, tunnettu siitä, että se k ·
9. Isäntäsolu, tunnettu siitä, et transformoitu tai transfektoitu patenttivaatimuks kaisella ekspressiovektorilla.
10. Menetelmä CD40-L-polypeptidin valmisti 5 tunnettu siitä, että viljellään patenttia sen 8 mukaista isäntäsolua olosuhteissa, jotka e CD40-L-polypeptidin ekspressiota ja CD40-L-po] otetaan talteen viljelmästä.
11. Menetelmä CD40-L-polypeptidin valmiste 10 tunnettu siitä, että viljellään patenttia sen 9 mukaista isäntäsolua olosuhteissa, jotka i CD4Q-L-polypeptidin ekspressiota ja CD40-L-po] otetaan talteen viljelmästä.
12. Menetelmä hybridoomasolujen stimuloimj 15 vitro monoklonaalisen vasta-aine-erityksen lisää tunnettu siitä, että annetaan tehokas mää agonistia, joka sisältää jonkin patenttivaatimuks mukaisen DNA:n koodittamaa CD40-L-polypeptidiä.
13. Antisense- tai sense-oiigonukleotidi, 2 0 n e t t u siitä, että se sisältää patenttivaati mukaisen DNA:n ainakin noin 12 perättäistä nukleot . sen DNA- tai RNA-komplementin, joka oligonukleo • · * • ·* inhiboida patenttivaatimuksen 1 mukaisen CD40-L- •V tidiä koodittavan DNA:n transkriptiota tai transla
14. Eristetty oi igonukleot idi, t u n r ,.*·* siitä, että se sisältää sekvenssin SEQ ID numero :T: kin noin 12 perättäistä nukleotidia tai sen kompJ joka hybridisoituu patenttivaatimuksen 1 mukaiseer • ·*· keskinkertaisen ankaruuden olosuhteissa (esipes .···! 30 teissä 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA {pH 8,0) j *·· • disaati π-nl nfliihfpi Rn °C. ς v fiSf vrl-i vAni 11
FI941837A 1991-10-25 1994-04-20 CD40-L-polypeptidiä koodaavia nukleiinihappoja ja niiden käyttö FI116850B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78370791A 1991-10-25 1991-10-25
US78370791 1991-10-25
US80572391A 1991-12-05 1991-12-05
US80572391 1991-12-05
US9208990 1992-10-23
PCT/US1992/008990 WO1993008207A1 (en) 1991-10-25 1992-10-23 Novel cytokine

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI941837A0 FI941837A0 (fi) 1994-04-20
FI941837A FI941837A (fi) 1994-05-30
FI116850B true FI116850B (fi) 2006-03-15

Family

ID=27120174

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI941837A FI116850B (fi) 1991-10-25 1994-04-20 CD40-L-polypeptidiä koodaavia nukleiinihappoja ja niiden käyttö
FI981765A FI116828B (fi) 1991-10-25 1998-08-17 Menetelmä vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka ovat immunoreaktiivisia CD40-L-proteiinin kanssa

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI981765A FI116828B (fi) 1991-10-25 1998-08-17 Menetelmä vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka ovat immunoreaktiivisia CD40-L-proteiinin kanssa

Country Status (13)

Country Link
EP (2) EP0667901B2 (fi)
JP (2) JP3308534B2 (fi)
KR (1) KR100283541B1 (fi)
AT (2) ATE274055T1 (fi)
AU (1) AU661360B2 (fi)
CA (2) CA2312667C (fi)
DE (2) DE69233051T2 (fi)
DK (3) DK0822199T3 (fi)
ES (2) ES2198025T3 (fi)
FI (2) FI116850B (fi)
HK (1) HK1019343A1 (fi)
NO (2) NO317625B1 (fi)
WO (1) WO1993008207A1 (fi)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7405270B2 (en) 1991-10-25 2008-07-29 Immunex Corporation CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation
US5981724A (en) * 1991-10-25 1999-11-09 Immunex Corporation DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40
US5962406A (en) * 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US5716805A (en) * 1991-10-25 1998-02-10 Immunex Corporation Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
US7070777B1 (en) * 1991-11-15 2006-07-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein
US5474771A (en) 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
US6472510B1 (en) 1992-02-14 2002-10-29 Bristol-Myers Squibb Company CD40 receptor ligands
US5874082A (en) * 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
AU5098493A (en) * 1992-08-21 1994-03-15 Schering Corporation Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40
US5540926A (en) * 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation
AU676227B2 (en) * 1993-01-22 1997-03-06 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Therapeutic agent for NIDDM
CA2153806C (en) * 1993-01-22 2005-11-08 Melanie K. Spriggs Detection and treatment of mutations in a cd40 ligand gene
CN1137726C (zh) * 1993-09-02 2004-02-11 达特茅斯学院理事 延长体液免疫抑制的方法
ATE188487T1 (de) * 1993-09-02 2000-01-15 Dartmouth College Anti-gp39 antikoerper und deren verwendungen
US5869049A (en) * 1993-09-02 1999-02-09 Trustees Of Dartmouth College Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists
KR100398819B1 (ko) 1993-09-02 2004-02-05 트러스티스 오브 다트마우스 칼리지 gp39길항제를포함하는약제조성물
AU1059095A (en) * 1993-11-24 1995-06-13 Australian National University, The Treatment of viral disease with cd40l peptide
ATE267607T1 (de) * 1993-12-23 2004-06-15 Immunex Corp Verwendung von löslichen oligomerischen cd40 liganden oder monoklonalen antikörpern zur herstellung eines arzneimitells zur vorbeugung oder behandlung von neoplastischen krankheiten
US5683693A (en) * 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
MX9605088A (es) 1994-04-28 1997-08-30 Boehringer Ingelheim Pharma Metodos para proliferar y diferenciar celulas b y sus usos.
JP3657271B2 (ja) * 1995-03-01 2005-06-08 イミュネックス・コーポレーション 病原性または日和見感染性生物に感染した哺乳動物の治療のための組成物
WO1996028568A1 (en) 1995-03-13 1996-09-19 The Regents Of The University Of Michigan Cd40 binding compositions and methods of using same
AU693713B2 (en) * 1995-06-07 1998-07-02 Immunex Corporation CD40L mutein
CA2224812A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 Biogen, Inc. Crystals of fragments of cd40 ligand and their use
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6440418B1 (en) 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
US6340459B1 (en) 1995-12-01 2002-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients
JP2000512541A (ja) * 1996-06-14 2000-09-26 ユニバーシティ オブ ワシントン 吸収力が向上した差違抽出装置
KR20000022445A (ko) * 1996-07-10 2000-04-25 크리스토퍼 엘. 와이트, 스코트 지. 홀퀴스트, 스티븐 엘. 말라스카 수상돌기 세포의 활성화 방법
US6017527A (en) * 1996-07-10 2000-01-25 Immunex Corporation Activated dendritic cells and methods for their activation
US7070771B1 (en) * 1996-12-09 2006-07-04 Regents Of The University Of California Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells
DE69740107D1 (de) 1996-12-23 2011-03-10 Immunex Corp Rezeptor aktivator von nf-kappa b, rezeptor is mitglied der tnf rezeptor superfamilie
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
AU762574B2 (en) 1998-05-14 2003-06-26 Immunex Corporation Method of inhibiting osteoclast activity
HU228582B1 (en) 1998-10-23 2013-04-29 Kirin Amgen Inc Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity
US7300774B1 (en) 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
EP1067194A1 (en) * 1999-04-16 2001-01-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Vectors containing a gene coding for CD40 and/or CD40L under the control of a cytokine-inducible promoter which is a human acute phase amyloid A gene promoter. Methods for their production and uses thereof
CA2369820A1 (en) * 1999-04-16 2000-10-26 Frank Dicker Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof
WO2001016180A2 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd40 agonist compositions and methods of use
GB9927757D0 (en) * 1999-11-25 2000-01-26 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of autoimmune diseases
AU2001251612A1 (en) 2000-04-14 2001-10-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Roles of jak/stat family members in tolerance induction
AU6158501A (en) 2000-05-12 2001-11-26 Beth Israel Hospital Compositions and methods for achieving immune suppression
AU2001296507A1 (en) 2000-10-02 2002-04-15 Chiron Corporation Human anti-cd40 antibodies
AU2002221780A1 (en) * 2000-10-31 2002-05-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof
US6586245B2 (en) 2001-07-18 2003-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of CD40 ligand expression
US20050054565A1 (en) * 2001-07-31 2005-03-10 John Lucas Agonists and antagonists of moxifin for the treatment of metabolic disorders
EP3467117B1 (en) 2001-09-20 2020-07-15 Immunex Corporation Selection of cells expressing heteromeric polypeptides
US7786282B2 (en) 2001-12-06 2010-08-31 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain
US7495090B2 (en) 2002-05-23 2009-02-24 The Regents Of The University Of California Nucleic acids encoding chimeric CD154 polypeptides
KR20050101554A (ko) 2003-02-14 2005-10-24 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 외인성 분자를 일시적으로 또는 안정하게 발현하기 위한발현 카세트 및 발현 벡터
KR20070047327A (ko) 2004-07-26 2007-05-04 비오겐 아이덱 엠에이 아이엔씨. 항-ｃｄ154 항체
US8513008B2 (en) 2004-10-07 2013-08-20 Argos Therapeutics, Inc. Mature dendritic cell compositions and methods for culturing same
CN101080487B (zh) 2004-10-07 2012-11-14 阿戈斯治疗公司 成熟树突细胞组合物及其培养方法
NZ554520A (en) 2004-10-22 2010-03-26 Amgen Inc Methods for refolding of recombinant antibodies
SG174804A1 (fi) 2006-09-13 2011-10-28 Abbott Lab
EP2500415A1 (en) 2006-09-13 2012-09-19 Abbott Laboratories Cell culture improvements
CN101522210B (zh) 2006-09-18 2017-03-22 阿肯色大学评议会 增强免疫应答的组合物和方法
AU2008298904B2 (en) 2007-09-14 2014-10-16 Amgen Inc. Homogeneous antibody populations
NZ585776A (en) 2007-10-30 2012-07-27 Univ Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium
PL2214701T3 (pl) 2007-11-01 2017-01-31 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Kompozycje i sposoby wzmacniania odpowiedzi odpornościowych na Eimeria
KR20100113112A (ko) 2008-01-15 2010-10-20 아보트 러보러터리즈 개선된 포유동물 발현 벡터 및 이의 용도
HUE035508T2 (en) 2009-11-17 2018-05-02 Squibb & Sons Llc Procedures for Increased Protein Production
UA110024C2 (uk) 2010-01-21 2015-11-10 Вакцинний вектор і спосіб посилення імунної відповіді
KR102007132B1 (ko) 2010-06-09 2019-08-05 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 아칸소 캄필로박터 감염을 감소시키기 위한 백신 및 방법
NZ711019A (en) 2013-02-14 2019-07-26 Univ Arkansas Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria or limiting eimeria infection
US10023608B1 (en) 2013-03-13 2018-07-17 Amgen Inc. Protein purification methods to remove impurities
EP2968423A4 (en) 2013-03-15 2016-11-09 Univ Arkansas COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING IMMUNE REACTIONS AGAINST ENTERAL PATHOGENES
KR20180063881A (ko) 2015-07-16 2018-06-12 바이오카인 테라퓨틱스 리미티드 암 치료용 조성물 및 방법
WO2017024146A1 (en) 2015-08-05 2017-02-09 Janssen Biotech, Inc. Anti-cd154 antibodies and methods of using them
WO2017083604A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Amgen Inc. Triazine mediated pharmacokinetic enhancement of therapeutics
BR112018072592A2 (pt) 2016-05-03 2019-04-16 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas vetor de vacina de levedura que inclui polipeptídeos imunoestimulantes e antigênicos, e métodos de uso dos mesmos
MX2018013882A (es) 2016-05-11 2019-03-14 Amgen Inc Seleccion directa de celulas que expresan niveles altos de proteinas heterodimericas usando vectores de complementacion intragenica de glutamina sintetasa.
EP3585409A4 (en) * 2017-02-27 2020-12-02 Shattuck Labs, Inc. CHEMERICAL PROTEINS BASED ON CSF1R
AU2018223821B2 (en) 2017-02-27 2022-05-19 Shattuck Labs, Inc. TIGIT- and LIGHT-based chimeric proteins

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2089229C (en) * 1992-02-14 2010-04-13 Alejandro A. Aruffo Cd40cr receptor and ligands therefor
US5540926A (en) * 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation

Also Published As

Publication number Publication date
NO317625B1 (no) 2004-11-29
CA2121798A1 (en) 1993-04-29
CA2312667C (en) 2002-11-19
FI941837A0 (fi) 1994-04-20
ATE239790T1 (de) 2003-05-15
DK0897983T3 (da) 2003-08-11
HK1019343A1 (en) 2000-02-03
FI981765A (fi) 1998-08-17
NO941422L (fi) 1994-06-27
DK0822199T3 (da) 2004-12-27
AU661360B2 (en) 1995-07-20
EP0667901B2 (en) 2008-10-15
FI116828B (fi) 2006-03-15
ES2227513T3 (es) 2005-04-01
DE69233402T2 (de) 2005-09-15
DE69233051D1 (de) 2003-06-12
DK0667901T4 (da) 2008-11-10
EP0667901B1 (en) 2004-08-18
ATE274055T1 (de) 2004-09-15
ES2227513T5 (es) 2009-04-01
JPH07504083A (ja) 1995-05-11
DE69233402D1 (de) 2004-09-23
EP0667901A1 (en) 1995-08-23
WO1993008207A1 (en) 1993-04-29
FI981765A0 (fi) 1998-08-17
EP0897983A3 (en) 1999-03-17
EP0897983A2 (en) 1999-02-24
JP3308534B2 (ja) 2002-07-29
NO980030D0 (no) 1998-01-05
CA2121798C (en) 2007-07-24
JP2877788B2 (ja) 1999-03-31
NO980030L (no) 1998-01-05
NO320073B1 (no) 2005-10-17
DK0667901T3 (da) 2004-12-27
FI941837A (fi) 1994-05-30
EP0897983B1 (en) 2003-05-07
DE69233051T2 (de) 2004-03-11
EP0667901A4 (en) 1995-06-22
NO941422D0 (no) 1994-04-19
CA2312667A1 (en) 1993-04-29
JPH10150994A (ja) 1998-06-09
DE69233402T3 (de) 2009-06-25
KR100283541B1 (ko) 2001-03-02
AU3122693A (en) 1993-05-21
ES2198025T3 (es) 2004-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI116850B (fi) CD40-L-polypeptidiä koodaavia nukleiinihappoja ja niiden käyttö
US6391637B1 (en) Use of CD40 ligand, a cytokine that binds CD40, to stimulate hybridoma cells
US6264951B1 (en) Methods of inhibiting CD40L binding to CD40 with soluble monomeric CD40L
US5961974A (en) Monoclonal antibodies to CD40 ligand, pharmaceutical composition comprising the same and hybridomas producing the same
AU693713B2 (en) CD40L mutein
ES2229264T3 (es) Receptor il-17.
DE69132306T2 (de) Menschlicher und Murin-Interleukin-5-Rezeptor
FI103987B (fi) Interleukiini-7
US20040006006A9 (en) CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation
US5726036A (en) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor and derivatives thereof
US5925548A (en) Modified receptors that continuously signal
US5629283A (en) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor and derivatives thereof
ES et al. NEUE CYTOKINE NOUVELLE CYTOKINE
Larson Functional effects of CD40 stimulation on fetal bone marrow B cell precursors: Inhibition or enhancement of growth depending on the developmental stage and the interleukin costimulus

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 116850

Country of ref document: FI