NO317625B1 - Ligand til CD40 reseptoren, DNA, Vektor, Vertcelle, Fremgangsmate for fremstilling, Protein og Farmasoytisk preparat. - Google Patents
Ligand til CD40 reseptoren, DNA, Vektor, Vertcelle, Fremgangsmate for fremstilling, Protein og Farmasoytisk preparat. Download PDFInfo
- Publication number
- NO317625B1 NO317625B1 NO19941422A NO941422A NO317625B1 NO 317625 B1 NO317625 B1 NO 317625B1 NO 19941422 A NO19941422 A NO 19941422A NO 941422 A NO941422 A NO 941422A NO 317625 B1 NO317625 B1 NO 317625B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cells
- sequence
- polypeptide
- cell
- dna
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 50
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 13
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 5
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 title claims 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 title claims 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 39
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title description 13
- 108010069941 DNA receptor Proteins 0.000 title description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims abstract description 287
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims abstract description 287
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 227
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 75
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 58
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 43
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 42
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 36
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 30
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 14
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 3
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 2
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 80
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 description 55
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 51
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 51
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 46
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 41
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 32
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 27
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 27
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 26
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 23
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 22
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 22
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 19
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 15
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 15
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 14
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 101100099884 Homo sapiens CD40 gene Proteins 0.000 description 13
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 13
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 13
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 12
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 10
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 9
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 9
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 8
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 8
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 6
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 6
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 6
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 6
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 6
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- -1 Thr and Ala Chemical class 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 4
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 4
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 4
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 4
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 4
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 4
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 3
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 3
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 102220080600 rs797046116 Human genes 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 2
- PQPWEALFTLKSEB-DZKIICNBSA-N Tyr-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PQPWEALFTLKSEB-DZKIICNBSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 230000001642 comitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- CTSPAMFJBXKSOY-UHFFFAOYSA-N ellipticine Chemical class N1=CC=C2C(C)=C(NC=3C4=CC=CC=3)C4=C(C)C2=C1 CTSPAMFJBXKSOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 2
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N (1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-4a,7b,9,9a-tetrahydroxy-3-(hydroxymethyl)-1,1,6,8-tetramethyl-1,1a,1b,4,4a,7a,7b,8,9,9a-decahydro-5H-cyclopropa[3,4]benzo[1,2-e]azulen-5-one Chemical compound C1=C(CO)C[C@]2(O)C(=O)C(C)=C[C@H]2[C@@]2(O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@]3(O)C(C)(C)[C@H]3[C@@H]21 QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- OQPDPIPLWCUACY-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethylthiourea;hydrobromide Chemical compound [Br-].NCC[NH+]=C(N)S OQPDPIPLWCUACY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001479434 Agfa Species 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001007681 Candida albicans (strain WO-1) Kexin Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012983 Dulbecco’s minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- ZIXGXMMUKPLXBB-UHFFFAOYSA-N Guatambuinine Natural products N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C1C=CN=C(C)C1=C2 ZIXGXMMUKPLXBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010782 Interleukin-7 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038498 Interleukin-7 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010037274 Member 9 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Proteins 0.000 description 1
- 102000011769 Member 9 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Human genes 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108700005443 Microbial Genes Proteins 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- SUYXJDLXGFPMCQ-INIZCTEOSA-N SJ000287331 Natural products CC1=c2cnccc2=C(C)C2=Nc3ccccc3[C@H]12 SUYXJDLXGFPMCQ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009858 acid secretion Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Chemical class 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229960000803 chloroquine sulfate Drugs 0.000 description 1
- OJPWHUOVKVKBQB-UHFFFAOYSA-N chloroquine sulfate Chemical compound [H+].[H+].[O-]S([O-])(=O)=O.ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 OJPWHUOVKVKBQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003721 exogen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N linoleic acid group Chemical group C(CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC)(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Chemical class 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid group Chemical group C(CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)(=O)O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 150000002943 palmitic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N phorbol Natural products C[C@@H]1[C@@H](O)[C@]2(O)[C@H]([C@H]3C=C(CO)C[C@@]4(O)[C@H](C=C(C)C4=O)[C@@]13O)C2(C)C QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Description
Oppfinnelsens tekniske område
Foreliggende oppfinnelse vedrører ligand til CD 40-reseptoren, DNA, vektor, vertscelle, fremgangsmåte for fremstilling, protein og farmasøytisk preparat.
Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse kloningen av et murint og et humant cytokin som binder seg til et humant CD40 som har både agonist- og antagonistaktivitet i oppløselige og membranbundne former.
Oppfinnelsens bakgrunn
Cytokiner som har en "Interleukin"-betegnelse, er de proteinfaktorene som påvirker immuneffektorceller. Cytokiner betegner interleukin-1 til interleukin-12, er blitt rapportert og navngitt som et interleukin. Andre kjente cytokiner omfatter tumornekrosefaktor (TNF), granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), mastcellevekstfaktor (MGF), epidermal vekstfaktor (EGF), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), nervevekstfaktor (NGF), erytropoietin (EPO), Y-interferon (y-IFN) °9 andre.
DNA-er for to forskjellige TNF-reseptorer (type I og type II) er blitt klonet (Smith et al., Science 248:1019,
1990; og Schall et al., Cell 51:361, 1990). Begge formene av TNF-reseptor er beslektet med hverandre og tilhører en familie av reseptorer med medlemmer som omfatter nervevekstfaktorre-septor (Johnson et al., Cell 47:545, 1986), B-celleantigen CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403, 1989), T-celle antigen OX40 (Mallett et al., EMBO J. 5:1063, 1990), humant Fas-antigen (Itoh et al., Cell 66:233, 1991) og murin 4-1BB-reseptor (Kwon et al., Cell Immunol. 121:414, 1989 [Kwon et al. I] og Kwon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:1963,
1989 [Kwon et al. II]).
Humant CD40-protein (CD40) er et peptid med 277 aminosyrer som har en molekylvekt på 30.600, og et 19 aminosyrers sekresjonssignalpeptid som omfatter hovedsakelig hydrofobe aminosyrer (Stamenkovic et al.). Molekylvekten (uten glykosylering) til det ferdig utviklede, humane CD40-protein er 28.300. Det ble isolert en cDNA som koder for humant CD40, fra et cDNA-bibliotek fremstilt fra Burkitt lymfomcellelinje Raji. Det antatte protein som kodes for av CD40-cDNA-en, inneholder en antatt ledersekvens, et transmembranområde og en rekke andre trekk som er felles for membranbundne reseptor-proteiner. CD40 er blitt funnet å bli uttrykt på B-lymfocytter, epitelceller og noen karsinomcellelinjer.
Et monoklonalt antistoff (mAb) rettet mot CD40, er blitt påvist å mediere forskjellige funksjonelle effekter av humane B-celler. Disse effektene omfatter: (a) homotypiske adhesjoner (Gordon et al., J. Immunol. 140:1425, 1988 [Gordon et al. I]; (b) forøkt cellestørrelse (Gordon et al. I og Valle et al., Eur. J. Immunol. 19:1463, 1989); (c) proliferasjon av B-celler aktivert med anti-IgM, anti-CD20-mAb, forbolester alene (Clark et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:4494, 1986; og Paulie et al., J. Immunol. 142:590, 1989), eller forbolester kombinert med interleukin-4 (Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17:1535, 1987 [Gordon et al. II]; og (d) produksjon av IgE (Jabara et al., J. Exp. Med. 172:1861, 1990; Zhang et al., J. Immunol. 146:1836, 1991) og IgM (Gascan et al., J. Immunol. 147:8, 1991) fra T-uttømte kulturer stimulert med interleukin-4 (IL-4).
Ett slikt antistoff, kalt mAb 89 av Banchereau et al., Clin. Immunol. Spectrum 3:8, 1991 - [Banchereau et al. I], ble funnet å indusere proliferasjon av human B-celle ved for-holdsvis lav antistoff konsentrasjon (30 ng/ml eller ca. 10"<10 >M). Proliferasjon varte i to til tre uker og resulterte i en ti gangers forøkelse av populasjonen av human B-celle. Optimal stimulering av B-cellene inntrådte når CD40-overflatemolekylet ble kryssbundet ved hjelp av IgM. Fab-fragmenter av et annet anti-CD40-mAb induserte bare en svak proliferativ respons. Videre rapporterte Banchereau et al., Science 251:70, 1991 [Banchereau et al. II] at hvilende, humane B-celler kom inn i en tilstand av langvarig proliferasjon når de ble inkubert med både en murin fibroblast-Ltk"-cellelinje som var transfektert med human Fc-reseptor, og med et monoklonalt antistoff som er spesifikt for humant CD40. Banchereau et al. II fant at kryssbundet CD40 er nødvendig for klonal forøkelse av B-celler.
CD23 er en lavaffinitets IgE-reseptor som er blitt funnet å uttrykkes på de fleste IgM"/IgD" fullt utviklede B-celler, men ikke T-celler. CD23 er blitt sekvensert, og dens sekvens ble beskrevet i Kikutani et. al., Cell 47:657, 1986. Oppløselig CD23 (sCD23) ble funnet å indusere en pyrogen reaksjon hos kaniner, og denne reaksjonen ble motvirket ved administrering av humant IgE {Ghaderi et al., Immunology 73:510, 1991). CD23 kan derfor være en passende markør for effekter av oppløselig CD40 eller CD40-L.
Før foreliggende oppfinnelse var en ligand for CD40 ukjent. Det er derfor et behov innen teknikken for å identi-fisere og karakterisere en CD40-ligand (CD40-L).
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelsen omfatter isolert DNA-sekvens som koder for et CD4 0-L-polypeptid som bindes til CD40, kjennetegnet ved at DNA-sekvensen er valgt fra gruppen bestående av: (a) nukleotidene 46-828, 184-828, 196-828 eller 193-762 i SEQ ID NO: 11, (b) DNA-sekvenser som påviselig hybridiserer til én av sekvensene ifølge (a) eller deres komplementære tråder under moderate stringensbetingelser, som koder for et protein med tilsvarende biologisk aktivitet sammenlignet med proteinet som er kodet for av DNA-sekvensen ifølge (a), hvori hybridiseringsbetingelsene omfatter forvasking med 5 x SSC, 0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) og hybridiseringsinkubering over natt i 5 x SSC ved 50 °C, og (c) DNA-sekvenser som koder for aminosyrene 1-261 i SEQ ID NO: 12, aminosyrene 47-261 i SEQ ID NO: 12, aminosyrene 51-261 i SEQ ID NO: 12 og aminosyrene 50-239 i SEQ ID NO: 12. Videre omfatter oppfinnelsen rekombinant ekspresjonsvektor kjennetegnet ved at den omfatter en DNA-sekvens som koder for et CD40-L-polypeptid ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen omfatter også en vertscelle, kjennetegnet ved at den er transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor som angitt ovenfor. Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av et CD-40-L-polypeptid, kjennetegnet ved at vertscellen som angitt ovenfor, dyrkes under betingelser som fremmer ekspresjon, og CD40-L-polypeptidet utvinnes fra kulturen. Også omfattet av oppfinnelsen er renset, biologisk, aktivt CD40-L-polypeptid, kjennetegnet ved at det består av en
sekvens av aminosyrer som kodes for av en nukleotidsekvens ifølge oppfinnelsen. I en ytterligere utførelsesform omfatter oppfinnelsen oppløselig CD40-L-oligomer kjennetegnet ved at oligomeren omfatter to eller flere polypeptider ifølge oppfinnelsen. Også omfattet av oppfinnelsen er anvendelse av oppløselig CD40-L-polypeptid ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av allergi, en allergisk reaksjon, lupus, reumatoid artritt eller transplantat -mot -vert sykdom. Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av oppløselig CD4 0-L-polypeptid for fremstilling av et medikament for stimulering av polyklonal lg sekresjon fra B-celler, stimulering av antigenspesifikk antistoffproduksjon fra B-celler, stimulering av proliferasjon av B-celler, og som en vaksineadjuvans. Oppfinnelsen omfatter også CD40-L-fusjonsprotein, kjennetegnet ved at det omfatter et CD40-L-polypeptid som angitt ovenfor og et immunoglobulin-Fc-område. Videre omfatter oppfinnelsen CD4O-L-fusjonsprotein, kjennetegnet ved at det omfatter et CD40-L-polypeptid som angitt ovenfor og en lucin-zipper. Til slutt omfatter oppfinnelsen farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter et CD40-L-polypeptid, CD40-L-fusjonsprotein eller CD40-L-oligomer som angitt ovenfor og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærer eller eksipiens.
Et nytt cytokin, heretter henvist til som "CD40-L", er blitt isolert og karakterisert. Nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens til representativ, murin CD40-L-cDNA er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 1 og figur 1, og aminosyresekvensen er også angitt i sekvens med identifikasjonsnr. 2. Nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens til representativ, human CD40-L-cDNA er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 11 og figur 2, og aminosyresekvensen er også angitt i sekvens med identifikasjonsnr. 12. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre andre CD4O-L-polypeptider som kodes for av nukleotidsekvenser som hybridiserer under middels eller svært strenge betingelser, til prober definert med sekvens med identifikasjonsnr. 11 (det kodende område i human CD40-L), fragmenter av sekvensen som strekker seg fra nukleotid 46 til nukleotid 828 i sekvens med identifikasjonsnr. 11, eller til DNA- eller RNA-sekvenser som er komplementære til figur 2(sekvens med identifikasjonsnr. 11) eller fragmenter derav. Oppfinnelsen omfatter videre nukleinsyresekvenser som, på grunn av den genetiske kodes degenerasjon, koder for polypeptider som er i det vesentlige identiske eller i det vesentlige like med polypeptider som kodes for av nukleinsyresekven-sene beskrevet ovenfor, og sekvenser som er komplementære til dem.
CD40-L er et membranpolypeptid av type II med et ekstracellulært område i sin C-ende, et transmembranområde og et intracellulært område i sin N-ende. En oppløselig versjon av murin CD40-L er blitt funnet i supernatanter fra EL-4-celler og EL-4-celler sortert på grunnlag av et biotinylert CD40/Fc-fusjonsprotein beskrevet her. Oppløselig CD40-L omfatter et ekstracellulært område i CD40-L eller et fragment derav. Proteinsekvensen til murin CD40-L er beskrevet i figur 1 og sekvens med identifikasjonsnr. 2, og human CD40-L i figur 2 og sekvens med identifikasjonsnr. 12. Det ekstracellulære område i murin CD40-L strekker seg fra aminosyre 47 til aminosyre 260 i figur 1 og sekvens med identifikasjonsnr. 2, og i human CD40-L fra aminosyre 47 til aminosyre 261 i figur 2 og sekvens med identifikasjonsnr. 12. Biologisk aktivitet av CD40-L medieres ved binding av dette cytokinet til CD40 og omfatter B-celleproliferasjon og induksjon av antistoffsekresjon, inkludert IgE-sekresjon.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 illustrerer nukleotid- og aminosyresekvenser som tilsvarer murin CD4 0-L. Dette proteinet er et polypeptid av type II som har sin N-ende som sitt intracellulære domene, etterfulgt av et transmembranområde, og et ekstracellulært domene i C-enden til polypeptidet. Det ekstracellulære domene som er lenger enn enten det intracellulære domene eller transmembranområde t , inneholder ett potensielt N-bundet glykosyler-ingssete og to potensielle disulfidbindinger på grunn av fire cysteinrester (Cys). Figur 2 illustrerer nukleotid- og aminosyresekvenser som tilsvarer human CD4 0-L. Dette proteinet er et polypeptid av type II som har sin N-ende som sitt intracellulære domene, etterfulgt av et transmembranområde, og et ekstracellulært domene i C-enden til polypeptidet. Det ekstracellulære domene, som er lenger enn enten det intracellulære domene eller transmembranområde t, inneholder 1 potensielt N-bundet glykosyler-ingssete og 2 potensielle disulfidbindinger på grunn av 5 cysteinrester (Cys). Figur 3 illustrerer en sammenligning mellom protein-sekvenser til humant og murin CD40-L som oppviser 77,7% homo-logi på aminosyrenivå. Figur 4 illustrerer proliferasjon av T-celleuttømte, mononukleære celler fra humant, perifert blod (PBMC) forårsaket av inkubasjon med CV1-celler transfektert med fullengde murin CD40-L-CDNA (sekvens med identifikasjonsnr. 1) og som uttrykker bundne CD40-L (CD40-I</>CV1-celler) sammenlignet med CV1-celler transfektert med tom vektor (HAVEO) og som ikke • uttrykker bundet, murin CD40-L. Proliferasjonsresultåtene på dag 7 viser at CD40-I/CV1 -celler øker prolif erasjon av T-celleuttømt PBMC vesentlig i nærvær eller fravær av interleukin-4 (IL-4). Figur 5 illustrerer en andre bestemmelse av T-celle-uttømt PBMC-proliferasjon ved tilsetning av bundet, murin CD40-L og 10 mg/ml IL-4. Disse data oppviser ingen komitogen effekt av IL-4, men fortsatt sterk mitogen effekt av bundet CD40-L. Figur 6 illustrerer at bundet CD40-L øker IgE-sekresjon. Figur 7 illustrerer at membranbundet CD40-L stimulerer CD23-utgytelse i nærvær av IL-4. Figur 8 illustrerer proliferasjon av murine milt-B-celler forårsaket av membranbundet, murin CD40-L eller 7A1-celler, som er en hjelper-T-celleklon. Figur 9 illustrerer en sammenligning av murine EL40.9-celler, en utsortert cellelinje som ble utsortert på grunnlag av ekspresjon av murin CD40-L, og T-celler 7A1 for induksjon av en antigenspesifikk respons angitt ved hjelp av plakkdannende celler (PFC) ved hjelp av røde anti-saue-blodlegemer (SCBC). Figur 10 illustrerer en sammenligning av B-celleproliferativ aktivitet av membranbundet CD40-L og andre celle-typer transfektert med forskjellige cDNA-er. Membranbundet
CD40-L oppviste signifikant mer B-celleproliferativ aktivitet enn en hjelpercelleklon eller andre kontrollceller. Figur 11 illustrerer at 7C2-celler (en hjelper-T-celleklon) og CVl-celler transfektert med murin CD40-L-CDNA, in-duserer anti-SRBC-plakkdannende celler. Figur 12 illustrerer en sammenligning mellom to hjelper-T-cellekloner og celler som uttrykker membranbundet CD40-L for induksjon av murin B-celleproliferasjon. Figur 13 illustrerer induksjon av antigenspesifikke, plakkdannende celler ved hjelp av membranbundet CD40-L og en hjelper-T-celleklon i nærvær eller fravær av tilsatt interleukin-2 (IL-2). Figur 14 viser effekter av membranbundet CD40-L-sti-mulerende B-celleproliferasjon og IgE-sekresjon. Effektene av membranbundet CD40-L ble inhibert med CD40-reseptor, men ikke med TNF-reseptor.
Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen
Nye polypeptider som kan virke som en ligand for murint og humant CD40, er blitt isolert og sekvensert. Nærmere bestemt har cDNA-er som koder for disse ligandene, blitt klonet og sekvensert. Videre er det tilveiebrakt fremgangsmåter for ekspresjon av rekombinante CD40-L-polypeptider. CD4 0-L-polypeptid omfatter andre former av pattedyr-CD40-L, slik som derivater eller analoger av human eller murin CD40-L. Murin og human CD40-L omfatter henholdsvis et 214 og 215 aminosyrers ekstracellulært område i C-enden til fullengde, membranbundet polypeptid. Det ekstracellulære område inneholder domenet som bindes til CD40. Murin og human CD40-L omfatter videre et homologt, hydrofobt 24 aminosyrers transmembranområde som er delineært på hver side ved tilføyde aminosyrer og et 22 aminosyrers intracellulært område i sine N-ender. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fullengde CD40-L-polypeptider eller fragmenter derav som omfatter hele eller en del av det ekstracellulære område eller derivater av det ekstracellulære område og pattedyrceller transfektert med en cDNA som koder for murin eller human CD40-L og uttrykker human eller murin CD40-L som et membranbundet protein. Foreliggende oppfinnelse omfatter isolerte DNA-sekvenser som koder for CD40-L-polypeptider og DNA- eller RNA-sekvenser som er komplementære til slike isolerte DNA-sekvenser. De isolerte DNA-sekvenser og deres komplementer er valgt fra gruppen bestående av (a) nukleotidene 184-828, nukleotidene 193-828 eller nukleotid 193-762 i DNA-sekvensen angitt i figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11) og deres komplementer, (b) DNA-sekvenser som hybridiserer til DNA-sekvensene ifølge (a) eller deres komplementer under betingelser med middels strenghet og som koder for et CD40-L-polypeptid, analoger eller derivater derav, og (c) DNA-sekvenser som, på grunn av den genetiske kodes degenerasjon, koder for CD40-L-polypeptider som kodes for av hvilket som helst av de ovenfor nevnte DNA-sekvenser og deres komplementer. I tillegg omfatter foreliggende oppfinnelse vektorer som omfatter DNA-sekvenser som koder for CD40-L-polypeptider og analoger, og vertsceller transfektert med slike vektorer.
Det nye cytokinet som her er beskrevet, er en ligand for CD40, en reseptor som er et medlem i TNF-reseptorsuper-familien. CD40-L vil derfor sannsynligvis være ansvarlig for transduksjon av signal via CD40, som er kjent for å bli uttrykt f.eks. av B-lymfocytter. Fullengde CD40-L er et membranbundet polypeptid med et ekstracellulært område i sin C-ende, et transmembranområde og et intracellulært område i sin N-ende. En oppløselig versjon av CD40-L kan lages fra det ekstracellulære område eller et fragment derav, og en oppløselig CD40-L er blitt funnet i kultursupernatanter fra celler som uttrykker en membranbundet versjon av CD40-L. Proteinsekvensen i det ekstracellulære område av murin CD40-L strekker seg fra aminosyre 47 til aminosyre 260 i figur 1 og sekvens med iden-tif ikasjonsnr . 2. Proteinsekvensen i det ekstracellulære området av human CD40-L strekker seg fra aminosyre 47 til aminosyre 261 i figur 2, og sekvens med identifikasjonsnr. 12. Den biologiske aktivitet av CD40-L medieres ved binding til CD40 eller en artsspesifikk homolog derav og omfatter proliferasjon av B-celler og induksjon av immunglobulinsekresjon fra aktiverte B-celler. CD40-L (inkludert oppløselige monomer-og oligomerformer, samt membranbundne former) kan bevirke B-celleproliferasjon og immunglobulinsekresjon (bortsett fra IgE-sekresjon) uten tilstedeværelse av tilsatt IL-4, i motset-ning til anti-CD40-antistoffer som krever IL-4 og kryssbinding for å mediere aktivitet.
CD40-L henviser til en slekt polypeptider som er i stand til å binde CD40, eller pattedyrhomologer av CD40. Slik det her er brukt, omfatter uttrykket "CD40-L" oppløselige CD40-L-polypeptider som mangler transmembran- og intracellulære områder, pattedyrhomologer av human CD40-L, analoger av human eller murin CD40-L eller derivater av human eller murin CD40-L.
CD40-L kan også fås ved mutasjoner av nukleotidsekvenser som koder for et CD40-L-polypeptid. En CD40-L-analog slik den er henvist til her, er et polypeptid som i det vesentlige er homologt med en sekvens av human eller murin CD40-L, men som har en aminosyresekvens som er forskjellig fra naturlig forekommende sekvens CD40-L-polypeptid (human eller murin art) på grunn av én eller flere delesjoner, innføyelser eller utbyttinger. Analoger av CD40-L kan syntetiseres fra DNA-konstruksjoner fremstilt ved oligonukleotidsyntese og ligering eller ved teknikker med setespesifikk mutagenese.
Den primære aminosyrestruktur i human eller murin CD40-L kan modifiseres for å skape CD40-L-derivater ved å danne kovalente eller aggregasjonskonjugater med andre kjem-iske rester, slik som glykosylgrupper, lipider, fosfat, ace-tylgrupper og lignende, eller ved å skape aminosyresekvensmut-anter. Kovalente derivater av CD40-L fremstilles ved å binde bestemte, funksjonelle grupper til CD40-L-aminosyresidekjeder eller i N-enden eller C-enden til et CD40-L-polypeptid eller det ekstracellulære domene derav. Andre derivater av CD40-L innenfor omfanget av denne oppfinnelsen omfatter kovalente og aggregasjonskonjugater av CD40-L eller dens fragmenter med andre proteiner eller polypeptider, slik som en syntese i rekombinant kultur som N-ende- eller C-endefusjoner. Konjugatet kan således omfatte en signal- eller lederpolypeptidsekvens i N-endeområdet eller C-endeområdet i et CD40-L-polypeptid som kotranslasjonelt eller posttranslasjonelt styrer overføring av konjugatet fra dets syntesested til et sted innenfor eller utenfor cellemembranen eller celleveggen (f.eks. a-faktor-lederen til Saccharomycee). CD40-L-polypeptidfusjoner kan omfatte polypeptider tilsatt for å lette rensing og identifika-sjon av CD40-L (f.eks. poly-His), eller fusjoner med andre cytokiner for å tilveiebringe nye, flerfunksjonene enheter. Andre cytokiner omfatter f.eks. hvilke som helst av inter-leukinene 1-13, TNF (tumornekrosefaktor), GM-CSF (granulo-cyttmakrofag-kolonistimulerende faktor), G-CSF (granulocytt-kolonistimulerende faktor), MGF (mastcellevekstfaktor), EGF (epidermvekst-faktor), PDGF (blodplateavledet vekstfaktor), NGF {nervevekstfaktor), EPO (erytropoietin), y~ifn (gamma-interferon), 4-1BB-L (4-1BB-ligand) og andre cytokiner som påvirker immuncellevekst, differensiering eller funksjon.
Nukleinsyresekvenser innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse omfatter DNA- og/eller RNA-sekvenser som hybridiserer til nukleotidsekvensen ifølge sekvens med identifikasjonsnr. 1 eller sekvens med identifikasjonsnr. 11 eller de komplementære tråder, under middels eller svært strenge betingelser. Middels strenge hybridiseringsbetingelser henviser til betingelser beskrevet i f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., vol. 1, s. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Middels strenge betingelser omfatter, som definert av Sambrook et al., bruk av en forvaskoppløsning av 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) og hybridiseringsbetingelser på 50°C, 5 X SSC, over natten. Svært strenge betingelser omfatter høyere hybridiserings-og vasketemperaturer.
Biologisk aktivitet av CD40-L kan bestemmes f.eks. ved konkurranse med hensyn på binding til ligandbindingsdomenet i CD40 (dvs. kompetitive bindingsanalyser). Både murin CD40-L og human CD40-L bindes til humant CD40. Bindingsaffiniteten til murin CD40-L (uttrykt på utsorterte, murine EL-40.9-celler) for humant CD40 var omtrent 1,74 x IO<9> M"<1>. Likeledes var bindingsaffiniteten til murin CD40-L (uttrykt på usor-terte, murine EL-46.1-celler) for humant CD40 omtrent 2,3 x IO<9>M"<1>. Begge bindingsaffinitetsmålingene er innenfor et område som er typisk for binding mellom cytokin og cytokinresep-tor.
Ved én form for en kompetitiv bindingsanalyse for CD40-L-polypeptid anvendes en radioaktivt merket, oppløselig, murin CD40-L ifølge figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) eller human CD40-L ifølge figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11), og intakte celler som uttrykker CD40 (f.eks. humane B-celler). I stedet for intakte celler vil man kunne bytte ut oppløselig CD40 {slik som et CD40/Fc-fusjonsprotein) bundet til en fast fase gjennom en interaksjon mellom protein A eller protein G og Fc-området i fusjonsproteinet. Ved en annen form for en kompetitiv bindingsanalyse benyttes radioaktivt merket, oppløselig CD40, slik som et CD40/Fc-fusjonsprotein, og intakte celler som uttrykker CD40-L. Alternativt vil oppløselig CD40-L kunne bindes til en fast fase.
Kompetitive bindingsanalyser kan utføres ved å bruke standard metodikk. For eksempel kan radioaktivt merket murin CD40-L brukes til å konkurrere med en antatt CD4O-L-homolog for å analysere med hensyn på bindingsaktivitet mot overflate-bundet CD40. Kvalitative resultater kan oppnås ved hjelp av kompetitive bindingsanalyser med autoradiografisk plate, eller Scatchard-plottinger kan benyttes til å frembringe kvantitative resultater.
Kompetitive bindingsanalyser med intakte celler som uttrykker CD40, kan utføres ved hjelp av to metoder. Ved en første metode dyrkes B-celler enten i suspensjon eller ved festing til vevskulturplater. Festede celler kan fjernes ved behandling med 5 mM EDTA-behandling i 10 minutter ved 37°C. Ved en andre fremgangsmåte kan det brukes transfekterte COS-celler som uttrykker membranbundet CD40. COS-celler eller en annen pattedyrcelle kan transfekteres med human CD40-CDNA i en passende vektor for å uttrykke fullengde CD40 med et ekstracellulært område utenfor cellen.
Alternativt kan oppløselig CD40 bindes til en fast fase, slik som en kolonnekromatografimatriks, eller et rør eller et lignende substrat som er egnet for analyse med hensyn på tilstedeværelsen av en påvisbar rest, slik som <125>I. Binding til en fast fase kan for eksempel utføres ved å oppnå et CD40/Fc-fusjonsprotein og binde det til en protein A- eller protein G-overflate.
Et annet middel for å måle den biologiske aktivitet av CD40-L og homologer derav er å benytte konjugert, oppløse-lig CD40 (for eksempel 12<5>I-CD40/Fc) i lignende konkurranseana-lyser som de som er beskrevet ovenfor. I dette tilfellet anvendes imidlertid intakte celler som uttrykker CD40-L, eller oppløselig CD40-L bundet til en fast bærer, til å måle konkurranse med hensyn på binding av konjugert, oppløselig CD40 til CD40-L ved hjelp av en prøve som inneholder en antatt CD40-homolog.
CD40-L kan også analyseres ved å måle biologisk aktivitet i en B-celleproliferasjonsanalyse. Humane B-celler kan fås fra humane mandler ved rensing ved hjelp av negativ utvelgelse og Percoll-densitetssedimentasjon, som beskrevet av Defrance et al., J. Immunol. 239:1135, 1987. Burkitt lymfomcellelinjer kan brukes til å måle celleproliferasjon som respons på CD40-L. Eksempler på Burkitt lymfomcellelinjer omfatter for eksempel Raji (ATCC CCL 86), Daudi (ATCC CCL 213) og Namalwa (ATCC CRL 1432). Membranbundet CD40-L-stimulert B-cel-leprolif erasjon. Oligomer, fortrinnsvis dimer CD40-L, kan stimulere B-celleproliferasjon. CD40 (reseptor) antagoniserer CD40-L-proliferasjon av B-celler.
Nok en annen analyse for å bestemme CD40-L biologisk aktivitet er å måle immunglobulin produsert av B-celler som respons på aktivering ved hjelp av CD40-L eller et derivat eller en analog derav. Polyklonal immunglobulinsekresjon kan måles for eksempel ved å inkubere med 5 x 10s B-celler/ml i kultur i minst 7 dager. Immunglobulinproduksjon (Ig-produksjon) kan måles ved hjelp av en ELISA-analyse, slik som en som er beskrevet i Maliszewski et al., J. Immunol. 144:3028, 1990 [Maliszewski et al. I] eller Maliszewski et al., Eur. J. Immunol. 20:1735, 1990 [Maliszewski et al. II]. Murine B-celler kan for eksempel fås fra mus og dyrkes i henhold til fremgangsmåter beskrevet i Grabstein et al., J. Exp. Med. 263:1405, 1986 [Grabstein et al. I], Maliszewski et al. I, og Maliszewski et al. II.
CD40-L kan brukes i en bindingsanalyse for å påvise celler som uttrykker CD40. For eksempel kan murin CD40-L ifølge figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) eller human CD40-L ifølge figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11), eller et ekstracellulært domene eller et fragment derav, kon-jugeres til en påvisbar rest, slik som 125I. Radioaktiv merking med <125>I kan utføres ved hjelp av hvilken som helst av de mange standardmetodene som gir et funksjonelt <125>I-CD40-L-molekyl merket til høy spesifikk aktivitet. Alternativt kan det anvendes en annen påvisbar rest, slik som et enzym som kan katalys-ere en kolorimetrisk eller fluorometrisk reaksjon, biotin eller avidin. Celler som uttrykker CD40, kan bringes i kontakt med konjugert CD40-L. Etter inkubasjon fjernes ubundet, konjugert CD40-L, og binding måles ved å bruke den påvisbare rest.
CD40-L-polypeptider kan foreligge som oligomerer, slik som dimerer eller trimerer. Oligomerer er bundet sammen ved hjelp av disulfidbindinger dannet mellom cysteinreBter på forskjellige CD40-L-polypeptider. Alternativt kan man binde to oppløselige CD40-L-domener sammen med en Gly4SerGly5Ser-linkersekvens, eller en annen 1inkersekvens beskrevet i US patentskrift nr. 5 073 627. CD40-L-polypeptider kan også skapes ved fusjon av C-enden i oppløselig CD40-L (ekstracellulært domene) til Fc-området i IgGl (f.eks. sekvens med identifikasjonsnr. 3) som beskrevet for CD40/FC-fusjonsproteinet. CD40-L/FC-fusjonsproteiner får settes sammen omtrent som tunge kjeder i et antistoffmolekyl, hvorved det dannes toverdig CD40-L. Dersom fusjonsproteiner lages med både tunge og lette kjeder fra et antistoff, er det mulig å danne en CD4 0-L-oligomer med så mange som fire ekstracellulære CD4O-L-områder.
Fusjonsproteiner kan fremstilles ved å bruke konven-sjonelle teknikker med enzymkutting og ligering av fragmenter fra ønskede sekvenser. PCR-teknikker hvor det anvendes syntetiske oligonukleotider, kan anvendes for å fremstille og/eller amplifisere de ønskede fragmenter. Overlappende, syntetiske oligonukleotider som utgjør de ønskede sekvenser, kan også brukes til å fremstille DNA-konstruksjoner som koder for fusjonsproteiner. Fusjonsproteiner kan også omfatte CD40-L og to eller flere ytterligere sekvenser inkludert en ledersekvens (eller signalpeptidsekvens), Fc-område, linkersekvens og sekvenser som koder for svært antigene rester som gir et middel for å lette rensing eller hurtig påvisning av et fusjonsprotein.
Signalpeptider letter sekresjon av proteiner fra celler. Et eksempelvis signalpeptid er de 25 aminosyrene i aminoenden til ledersekvensen i humant interleukin-7 (IL-7; Goodwin et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A. 86:302, 1989; figur 2B). Andre signalpeptider kan også anvendes. For eksempel kan visse nukleotider i IL-7-ledersekvensen endres uten å endre aminosyresekvensen. I tillegg kan det lages aminosyre-endringer som ikke påvirker evnen til IL-7-sekvensen når det gjelder å virke som en ledersekvens.
"Flag"-oktapeptidet (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) endrer ikke den biologiske aktivitet av fusjonsproteiner, er svært antigent og gir en epitop som er reversibelt bundet av et spesifikt, monoklonalt antistoff, noe som muliggjør hurtig påvisning og letter rensing av det uttrykte fusjonsprotein. "Flag"-sekvensen spaltes også spesifikt ved hjelp av bovin slimhinneenterokinase i resten som følger umiddelbart etter Asp-Lys-paringen, fusjonsproteiner tildekket med dette pep-tidet, kan også være resistente overfor intracellulær nedbrytning i E. coli. Et murint, monoklonalt antistoff som binder "Flag"-sekvensen, er blitt deponert ved ATCC under deponeringsnr. HB 9259; fremgangsmåter for anvendelse av antistoffet ved rensing av fusjonsproteiner som omfatter "Flag"-sekvensen, er beskrevet i US patentskrift nr. 5 Oll 912.
Egnede Fc-områder er definert som Fc-områder som kan binde seg til protein A eller protein G, eller alternativt gjenkjennes av et antistoff som kan brukes ved rensing eller påvisning av et fusjonsprotein som omfatter Fc-området. Fortrinnsvis omfatter Fc-områder Fc-området i humant IgGi eller murint IgGi. Ett eksempel er det humane IgGi-Fc-område som er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 3; et annet eksempel er et Fc-område som kodes for av cDNA erholdt ved hjelp av PCR fra oligonukleotidprimere fra sekvens med identifikasjonsnr. 9 og sekvens med identifikasjonsnr. 10 med human cDNA som templat. Deler av et egnet Fc-område kan også anvendes, f.eks. et Fc-område i humant IgGi hvorfra det er blitt delert en sekvens av aminosyrer som er ansvarlig for binding til protein A, slik at det resulterende Fc-område bindes til protein G, men ikke
protein A.
[Gly4Ser] 3-gjentakelsessekvensen gir en linkersekvens som skiller det ekstracellulære område av CD40-L fra Fc-delen i fusjonsproteinet med en avstand som er tilstrekkelig til å sikre at CD40-L foldes korrekt i sine sekundær- og tertiær-strukturer. Egnede linkersekvenser (1) vil innta en fleksibel, forlenget konformasjon, (2) vil ikke utvise en tilbøyelighet
til å utvikle en ordnet sekundærstruktur som kunne virke inn på de funksjonelle domenene i fusjonsproteiner, og (3) vil ha minimal hydrofob eller ladet karakter som kunne fremme interaksjon med de funksjonelle proteindomenene. Typiske overflate-aminosyrer i fleksible proteinområder omfatter Gly, Asn og Ser. Praktisk talt enhver permutasjon av aminosyresekvenser som inneholder Gly, Asn og Ser, ville forventes å tilfreds-stille de ovenfor nevnte kriterier for en 1inkersekvens. Andre tilnærmet nøytrale aminosyrer, slik som Thr og Ala, kan også brukes i linkersekvensen. Lengden av linkersekvensen kan vari-ere uten i betydelig grad å påvirke den biologiske aktivitet av fusjonsproteinet. Linkersekvenser er unødvendige når pro-teinene som smeltes sammen, har ikke-essensielle N- eller C-endeaminosyreområder som kan brukes til å atskille de funksjonelle domenene og forhindre sterisk hindring.
CD40-L-polypeptider kan foreligge som oppløselige
polypeptider som omfatter det ekstracellulære domene i CD40-L, som vist i figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) og figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11), eller som membranbundne polypeptider som omfatter det ekstracellulære domene, et
transmembranområde og et kort, intracellulært domene, som vist i figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) og figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11) for henholdsvis den murine og den humane sekvens. Dessuten omfatter foreliggende oppfinnelse oligomerer av CD40-L ekstracellulære domener eller fragmenter derav, bundet ved hjelp av disulfidinteraksjoner, eller uttrykt som fusjonspolymerer med eller uten de mellomliggende aminosyresammenbindingsgrupper. For eksempel kan et dimert CD40-L-molekyl tilknyttes ved hjelp av en IgG-Fc-område-bin-dingsgruppe.
Uten å være bundet av teorien, kan membranbundet CD40-L og oligomer CD40-L oppnå aktivitet som stimulerer Ig-dannelse og proliferasjon av B-celler, noe som tidligere bare ble oppnådd ved hjelp av kryssbundet anti-CD40-antistoff i nærvær av IL-4. Det synes videre sannsynlig at monomer, opp-løselig CD40-L som omfatter bare det ekstracellulære domene i CD40-L, og som er i stand til å binde til CD40-reseptor, vil tjene til å antagonisere aktiviteten av membranbundet og oligomer CD40-L og/eller kryssbundne anti-CD40-antistoffer. Det synes videre sannsynlig at interaksjonen mellom membranbundet CD40-L og CD40 er den viktigste molekylære interaksjon som er ansvarlig for T-cellekontaktavhengig induksjon av B-cellevekst og differensiering både til antigen, spesifikk antistoffproduksjon og polyklonal lg-sekresjon. I dette henseende kan en pattedyrcelle transfektert med en cDNA som koder for full-lengde -CD4 O-L (dvs. som er membranbundet og har et intracellulært domene, et transmembranområde og et ekstracellulært domene eller et fragment derav), etterligne T-celler i deres evne til å indusere B-cellevekst, differensiering og stimulering av antigenspesifikk antistoffproduksjon. Det synes som om aktivitetene av oligomer, oppløselig CD40-L, fortrinnsvis en dimer av ekstracellulære områder, kan etterligne de biologiske aktivitetene av membranbundet CD40-L. Dessuten kan oppløselig, monomer CD40-L (som omfatter det ekstracellulære domene eller et fragment derav) binde til CD40-reseptor for å forhindre T-celleinteraksjon med B-celler og derfor ha lignende aktivitet som CD40 (reseptor) ekstracellulært domene som i seg selv kan være i monomer eller i oligomer form. Alternativt kan CD40-L være oligomer (fortrinnsvis en dimer) for å virke som en opp-løselig faktor som er i stand til å indusere B-cellevekst, differensiering og stimulering av antigenspesifikk antistoffproduksjon. Det synes således som om membranbundet CD40-L og oligomer CD40-L virker som CD40-agonister, mens oppløselig (monomer) CD40-L og oppløselig CD40 virker som CD40-antagonister ved å blokkere CD40-reseptorseter uten signifikant å overføre signal, eller ved å forhindre CD40-L-binding til CD40-seter på B-celler og andre målceller.
Både CD40-agonister og CD40-antagonister vil ha nyttig terapeutisk aktivitet. For eksempel kan CD40-agonister (dvs. membranbundet CD40-L og oligomer CD40-L) anvendes som vaksineadjuvanser og for å stimulere mAb-produksjon fra hybridomceller. CD40-antagonister (dvs. CD40-reseptor, CD40/Fc og eventuelt oppløselig, monomer CD40-L) kan anvendes til å be-handle autoimmunsykdommer som er kjennetegnet ved tilstedeværelse av høye nivåer av antigen-antistoff-komplekser, slik som allergi, lupus, reumatoid artritt, insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) , "graft versus host11-sykdom (GVHD) og andre. IgE-sekresjon fra humane B-celler kan induseres ved hjelp av IL-4 i nærvær av T-celler (Vercelli et al., J. Exp. Med. 169:1295, 1989). Videre kan IgE-produksjon induseres fra T-celleuttømt PBM (mononukleære celler fra perifert blod) ved tilsetning av et anti-CD40 mAb (Jabara et al., J. Exp. Med. 172:1861, 1990 og Zhang et al., J. Immunol. 146:1836, 1991). Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en fremgangsmåte for å inhibere IgE-produksjon fra aktiverte B-celler, aktivert ved hjelp av IL-4 i nærvær av T-celler, eller ved hjelp av CD40-L (fortrinnsvis membranbundet CD40-L), som omfatter å administrere en effektiv mengde av et CD40/Fc-fusjonsprotein som her beskrevet, eller en oppløselig CD40 som kodet for av cDNA-sekvensen beskrevet i sekvens med identifikasjonsnr. 3. Likeledes kan CD40-reseptorer og eventuelt oppløselig CD40-L (bare monomer) også blokkere utskillelse av andre antistoffisotyper.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre CD40-L-polypeptider med eller uten tilknyttet glykosylering av naturlig forekommende mønster. CD40-L uttrykt i gjær eller pattedyreks-presjonssystemer (f.eks. COS-7-celler), kan være like med eller klart forskjellig fra et naturlig forekommende CD40-L-polypeptid når det gjelder molekylvekt og glykosylerings-mønster, avhengig av valget av ekspresjonssystem. Ekspresjon av CD40-L-polypeptider i bakterieekspresjonssystemer, slik som E. coli, gir ikke-glykosylerte molekyler.
DNA-konstruksjoner som koder for forskjellige addisjoner eller utbyttinger av aminosyrerester eller -sekvenser, eller delesjoner av ende- eller indre rester eller sekvenser som ikke trengs for biologisk aktivitet eller binding, kan fremstilles. For eksempel kan det ekstracellulære CD40-L-N-glykosyleringssete modifiseres for å utelukke glykosylering samtidig som ekspresjon av homogen, redusert karbohydratanalog under anvendelse av gjærekspresjonssystemer muliggjøres. N-glykosyleringsseter i eukaryote polypeptider er kjennetegnet ved en aminosyretriplett Asn-X-Y, hvor X er hvilken som helst aminosyre bortsett fra Pro, og Y er Ser eller Thr. Passende modifikasjoner i nukleotidsekvensen som koder for denne trip-letten, vil resultere i utbyttinger, addisjoner eller delesjoner som forhindrer festing av karbohydratrester i Asn-side-kjeden. I et annet eksempel kan sekvenser som koder for Cys-rester, endres slik at Cys-restene fjernes eller erstattes med andre aminosyrer, noe som forhindrer dannelse av ukorrekte, intramolekylære disulfidbroer eller renaturering. Human CD40-L omfatter fem Cys-rester i sitt ekstracellulære domene. Minst én av de fem Cys-restene kan således erstattes med en annen aminosyre eller fjernes uten å påvirke proteintertiærstruktur eller disulfidbindingsdannelse.
Andre fremgangsmåter for mutagenese omfatter modifi-kasjon av sekvenser som koder for tobasiske aminosyrerester, for å øke ekspresjon i gjærsystemer hvor KEX2-proteaseaktivi-tet er til stede. Underenheter av et CD40-L-polypeptid kan konstrueres ved å fjerne sekvenser som koder for ende- eller indre rester eller sekvenser.
CD40-L-polypeptider kodes for av flereksongener. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre alternative mRNA-konstruksjoner som kan tilskrives forskjellige mRNA-spleisehen-delser etter transkripsjon, og som har områder med identitet eller likhet til felles med cDNA-ene som her er beskrevet.
Antisense- eller sense-oligonukleotider omfatter en entrådet nukleinsyresekvens (enten RNA eller DNA) som er i stand til å bindes til mål-CD40-L-mRNA- (sense) eller CD40-L-DNA- (antisense) sekvenser. Antisense- eller sense-oligonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et fragment av sekvens med identifikasjonsnr. 1 eller sekvens med identifikasjonsnr. 11, eller et DNA- eller RNA-komplement av sekvens med identifikasjonsnr. 11. Et slikt fragment omfatter minst ca. 14 nukleotider. Et slikt fragment omfatter fortrinnsvis fra ca. 14 til ca. 30 nukleotider. Evnen til å skape et antisense- eller et sense-oligonukleotid basert på en cDNA-sekvens for CD40-L, er beskrevet f.eks. i Stein og Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 og van der Krol et al., BioTechnigues 6:958, 1988.
Binding av antisense- eller sense-oligonukleotider til målnukleinsyresekvenser resulterer i dannelsen av duplek-ser som blokkerer translasjon (RNA) eller transkripsjon (DNA) på én av flere måter, inkludert forøkt nedbrytning av duplek-sene, for tidlig avslutning av transkripsjon eller translasjon, eller på andre måter. Egnede polymerasepromoterer omfatter promoterer for hvilken som helst RNA-polymerase, eller promoterer for hvilken som helst DNA-polymerase. Antisense-eller sense-oligonukleotider omfatter videre oligonukleotider med modifiserte sukker-fosfodiester-skjeletter (eller andre sukkerbindinger, slik som de som er beskrevet i WO91/06629) og hvor slike sukkerbindinger er motstandsdyktige overfor endo-gene nukleaser. Slike oligonukleotider med motstandsdyktige sukkerbindinger er stabile in vivo (dvs. i stand til å motstå enzymatisk nedbrytning), men bibeholde sekvensspesifisitet for å være i stand til å binde seg til målnukleotidsekvenser. Andre eksempler på sense- eller antisense-oligonukleotider omfatter de oligonukleotidene som er kovalent bundet til or-ganiske rester, slik som de som er beskrevet i WO 90/10448, og andre rester som øker affinitet av oligonukleotidet til en målnukleinsyresekvens, slik som poly(L-lysin). Enda ytterligere kan slike innføyningsmidler som elliptisin, og alkyler-ingsmidler eller metallkomplekser, festes til sense- eller antisense-oligonukleotider for å modifisere bindingsspesifisi-teter til antisense- eller sense-oligonukleotidet for målnukleotidsekvensen. Antisense- eller sense-oligonukleotider kan innføres i en celle som inneholder målnukleinsyresekvensen, ved hjelp av hvilken som helst genoverføringsmetode, inkludert f.eks. CaP04-mediert DNA-transfeksjon, elektroporasjon eller andre genoverføringsvektorer, slik som Epstein-Barr-virus. Antisense- eller sense-oligonukleotider innføres fortrinnsvis i en celle som inneholder målnukleinsyresekvenser, ved innføy-else av antisense- eller sense-oligonukleotidet i en egnet retrovirusvektor, og så bringe cellen i kontakt med retrovirusvektoren som inneholder den innføyde sekvens, enten in vivo eller ex vivo. Egnede retrovirusvektorer omfatter, men er ikke begrenset til, det murine retrovirus M-MuLV, N2 (et retrovirus avledet fra M-MuLV), eller dobbeltkopivektorene betegnet DCT5A, DCT5B og DCT5C (se PCT-søknad US 90/02656). Alternativt kan andre promotersekvenser brukes til å uttrykke oligonukleotidet.
Sense- eller antisense-oligonukleotider kan også inn-føres i en celle som inneholder målnukleotidsekvensen, ved dannelse av et konjugat med et ligandbindingsmolekyl, som beskrevet i WO 91/04753. Egnede ligandbindingsmolekyler omfatter, men er ikke begrenset til, celleoverflatereseptorer, vekstfaktorer, andre cytokiner eller andre ligander som binder seg til celleoverflatereseptorer. Fortrinnsvis virker konjuga-sjon av ligandbindingsmolekylet ikke vesentlig inn på evnen til ligandbindingsmolekylet når det gjelder å binde seg til sitt tilsvarende molekyl eller reseptor, eller blokkere inn-treden av sense- eller antisense-oligonukleotidet eller dets konjugerte versjon i cellen.
Alternativt kan et sense- eller et antisense-oligonukleotid innføres i en celle som inneholder målnukleinsyresekvensen, ved dannelse av et oligonukleotid-lipid-kompleks, som beskrevet i WO 90/10448. Sense- eller antisense-oligonukleotid-lipid-komplekset dissosieres fortrinnsvis i cellen ved hjelp av en endogen lipase.
Sekvensen til murin CD40-L-cDNA ble erholdt ved dir-ekte ekspresjonsteknikker. Sekvensen til human CD40-L ble erholdt ved kryssartshybridiseringsteknikker under anvendelse av den murine CD4 0-L-cDNA som en probe.
Vi klonet murin CD4 0-L ved først å oppnå en klon av det ekstracellulære området til humant CD40 (reseptoren) ved hjelp av teknikker med polymerasekjedereaksjon (PCR) under anvendelse av primere basert på en sekvens publisert i Stamenkovic et al. (sekvens med identifikasjonsnr. 4). En oppstrøms oligonukleotidprimer 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (sekvens med identifikasjonsnr. 5) innfører et Sal 1-sete oppstrøms fra et initiatormetionin i CD40, og en nedstrøms oligonukleotidprimer 5'-CCGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3' (sekvens med iden-tif ikasjonsnr. 6) innføyer et avslutningskodon etter aminosyre 192 i CD40, etterfulgt av Xba 1- og Sal 1-seter. Den amplifiserte cDNA ble fordøyd med Sal 1 og klonet inn i pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991) for å konstruere pDC406/s CD40.
Et andre CD40-reseptorfragment (sekvens med iden-tif ikasjonsnr. 4) ble erholdt ved hjelp av PCR-teknikker for fusjon til Fc-domenet i humant IgGi (sekvens med identifikasjonsnr. 3). I korte trekk var den oppstrøms oligonukleotidprimer (sekvens med identifikasjonsnr. 5) og fusjonstemplatet (sekvens med identifikasjonsnr. 4) de samme som tidligere. Den nedstrøms oligonukleotidprimer var 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATC-TCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (sekvens med identifikasjonsnr. 7) som innføyer aminosyrer Tyr Val Glu Pro Arg (sekvens med identifikasjonsnr. 8) etter aminosyre 193 i CD40. Glu og Pro er de to første aminosyrene i et leddområde i humant IgGi og etter-følges av et Bgl II-restriksjonssete. Bgl II-restriksjonssetet ble brukt til å smelte sammen det ekstracellulære domene i CD40 med det gjenværende av humant IgGl-forbindelsesområde.
Andre fusjonsproteiner som omfatter ligandbindings-domener fra andre reseptorer, kan lages ved oppnå en DNA-sekvens for ligandbindingsdomenet i en reseptor og smelte denne sekvensen sammen med en DNA-sekvens som koder for et Fc-område i et antistoffmolekyl, og som binder seg til protein A eller protein G, eller et annet polypeptid med evne til affinitetsrensing, f.eks. avidin eller streptavidin. Den resulterende genkonstruksjon kan innføres i pattedyrceller for forbigående å uttrykke et fusjonsprotein. Reseptor/Fc-fusjonsproteinet kan renses ved hjelp av protein A- eller protein G-affinitetsrensing. Reseptor/avidin-fusjonsprotein kan renses ved hjelp av biotinaffinitetskromatografi. Fusjonsproteinet kan senere fjernes fra kolonnen ved eluering med en oppløsning med høyt saltinnhold eller en annen passende buffer.
Vi fikk et cDNA-kodende, humant IgGi-Fc-område ved hjelp av PCR-amplifikasjon under anvendelse av cDNA fra human-celler som et templat, og en oppstrøms oligonukleotidprimer 5'-TATTAATCATTCAGTAGGGCCCAGATCTTGTGACAAAACTCAC-3<1> (sekvens med identifikasjonsnr. 9) og en nedstrøms oligonukleotidprimer 51-GCCAGCTTAACTAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA-3" {sekvens med identifikasjonsnr. 10). Den PCR-amplifiserte cDNA innførte et Bgl II-sete nær begynnelsen av "hengsel"-området, som ble brukt til å ligere CD40 ekstracellulært domene for å konstruere en sCD40/Fc-fusjons-cDNA som ble ligert inn i pDC406 for å konstruere pDC406/CD40/Fc. Andre egnede Fc-områder er definert som hvilket som helst område som kan bindes med høy affinitet til protein A eller protein G, og omfatter Fc-området i humant IgGi eller murint IgGi. Ett eksempel er det humane IgGl-Fc-området som er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 3, eller den cDNA som ble oppnådd ved hjelp av PCR, fra oligonukleotidprimere fra sekvens med identifikasjonsnr. 9 og sekvens med identifikasjonsnr. 10 med human cDNA som et templat.
Reseptor/Fc-fusjonsmolekyler syntetiseres fortrinnsvis i rekombinant pattedyrcellekultur fordi de generelt er for store og komplekse til å bli syntetisert ved hjelp av prokaryote ekspresjonsmetoder, Eksempler på egnede pattedyrceller for uttrykking av reseptor/Fc-fusjonsprotein omfatter CV-1-celler (ATCC CCL 70) og COS-7-celler (ATCC CRL 1651), begge avledet fra apenyre.
DNA-konstruksjonen pDC406/CD40/Fc ble transfektert
inn i apenyrecellelinjen CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). pDC406-plasmidet omfatter regulatorsekvenser avledet fra SV40, humant immunsviktvirus (HIV) og Epstein-Barr-virus (EBV). CV-l/EBNA-cellelinjen ble utvunnet ved transfeksjon av CV-l-cellelinjen med et gen som koder for Epstein-Barr-virus-kjerneantigen-1 (EBNA-1) og som konstitutivt uttrykker EBNA-1 drevet fra human CMV "immediate-early enhancer"/promoter. Et EBNA-1-gen mulig-gjør episomal replikasjon av ekspresjonsvektorer, slik som pDC406, som inneholder EBV-replikasjonsopprinneIsen.
Transfektanter som uttrykker CD40/Fc-fusjonsprotein, identifiseres først ved å bruke "dot blots" eller Western blot. Supernatantene underkastes så "dot blot" eller gel-elektroforese etterfulgt av overføring av de elektroforesebe-handlede proteiner for binding til G28-5 mAb (et antistoff som binder seg til human CD40-reseptor). De blottede proteiner ble så inkubert med radioaktivt merket 125I-protein A, vasket for å fjerne ubundet markør og undersøkt med hensyn på ekspresjon av Fc. Monoklonalt antistoff G28-5 ble fremstilt ifølge Clark et al., supra.
Når celler som uttrykker fusjonskonstruksjonen først var blitt identifisert, ble storskalakulturer av transfekterte celler dyrket for å akkumulere supernatant fra celler som uttrykker CD40/FC. CD40/FC-fusjonsprotein i supernatantvæske ble renset ved affinitetsrensing. I korte trekk ble 1 liter kul-tursupematant inneholdende CD40/Fc-fusjonsprotein, renset ved å filtrere pattedyrcellesupernatanter (f.eks. i et 0,45 um filter) og tilføre filtrat til en protein A/G-antistoffaffini-tetskolonne (Schleicher und Schuell, Keene, NH) ved 4°C ved en strømningshastighet på 80 ml/time for en 1,5 cm x 12,0 cm kolonne. Kolonnen ble vasket med 0,5 M NaCl i PBS inntil fritt protein ikke kunne påvises i vaskebufferen. Til sist ble kolonnen vasket med PBS. Bundet fusjonsprotein ble eluert fra kolonnen med 25 mM sitratbuffer, pH 2,8, og brakt til pH 7 med 500 mM Hepes-buffer, pH 9,1. Sølvfargede SDS-geler av det eluerte CD40/FC-fusjonsprotein viste at det var >98% rent.
Oppløselig CD40 (sCD40) og CD40/Fc-fusjonsproteiner ble laget som her beskrevet. Supernatantene ble renset gjennom en G28-5- (anti-CD40-mAb) affinitetskolonne for å affinitetsrense sCD40 uttrykt ved hjelp av de transfekterte CV-l/EBNA-celler. Proteinholdige fraksjoner ble slått sammen og ali-quoter fjernet for G28-5-bindingsanalyser og analyse ved hjelp av SDS-PAGE (natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofor-ese) i nærvær 1 mM ditiotreitol som et reduksjonsmiddel. Det ble sett et enkeltbånd med molekylvekt 28.100 dalton. I fravær av et reduksjonsmiddel avslørte SDS-PAGE-analyse av sCD40 to bånd, et hovedbånd med molekylvekt 56.000 og et mindre bånd med molekylvekt 28.000. Bånddannelsesmønsteret indikerer at hovedparten av sCD40 foreligger som en disulfidbundet homo-dimer i oppløsning. Båndet ved 28.000 er fri monomer.
CD40-proteiner ble visualisert ved hjelp av sølvfar-ging. Prøveproteinkonsentrasjoner ble bestemt ved å bruke en mikro-BCA-analyse (Pierce) med ultrarent, bovint serumalbumin som standard. Renhet av oppløselig CD40 og proteinkonsentra-sjon ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse. Renset, opp-løselig CD40 ble absorbert til PVDF-papir og papiret underkas-tet automatisert Edman-nedbrytning på et Applied Biosystems modell 477A-proteinsekvenseringsapparat ifølge produsentens instruksjoner for N-terminal proteinsekvensering. Denne fremgangsmåten sjekket proteinsekvensen til sCD40.
Oppløselig CD40 og CD40/Fc-fusjonsprotein var i stand til å modulere responser hos human B-celle i fravær av anti-CD40-mAb (G28-5). Rensede tonsill-B-celler ble dyrket med anti-IgM og humant IL-4, og enten ble sCD40 eller CD40/Fc-fusjonsprotein tilsatt. Ingen av CD40-formene hadde en inhibitoreffekt på B-celleproliferasjon (som målt ved hjelp av tritiert tymidininkorporering). IL-4-reseptor inhiberte derimot IL-4-indusert B-celleproliferasjon på en konsentrasjonsavhen-gig måte.
Oppløselig CD40 og CD40/Fc ble testet med hensyn på sin evne til å inhibere IL-4-indusert IgE-sekresjon i et system med 2-donor-MLC (blandet lymfocyttkultur). I tre forsøk ble nivået av IgE-produksjon redusert etter hvert som konsen-trasjonen av CD40 ble økt. Oppløselig CD40, tilsatt ved en konsentrasjon på 10 ug/ral, var i stand til fullstendig å inhibere IgE-sekresjon i denne allergimodellen. Videre hadde CD40/Fc lignende effekter som dets oppløselige motpart. Til-setningen av et IL-7-reseptor-Fc-fusjonsprotein {laget ved hjelp av lignende fremgangsmåter med en publisert IL-7-resep-torsekvens) påvirket ikke sekresjon av IgE i denne modellen.
Nivåer av CD23 ble også målt i den samme MLC som respons på sCD40 eller CD40/Fc-fusjonsproteiner. Oppløselig CD40 ga en liten, men reproduserbar reduksjon i sCD23-nivå på dag 6 sammenlignet med kulturer stimulert med IL-4 alene, en sterkere inhibitoreffekt var imidlertid klar på dag 12 i de samme kulturene. Oppløselig CD23-induksjon ved hjelp av IL-4-stimulerte, T-uttømte PBM (makrofager fra perifert blod) E-celler ble likeledes påvirket ved tilsetning av sCD40, noe som forårsaket en liten reduksjon i sCD23-nivåer på dag 6 og en klarere inhibering på dag 12. I hvert kultursystem var resultatene med CD40/Fc-fusjonsprotein i det vesentlige de samme som med sCD40.
I et forsøk på å isolere en cDNA for en CD40-L ble renset CD40/Fc-fusjonsprotein radioaktivt jodert med <125>I under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig fastfasemiddel ("lodo-Gen", Pierce). Ved denne fremgangsmåten ble 5 ug "Iodo-Gen" platet ut på bunnen av et 10 x 75 mm glassrør og inkubert i 20 minutter ved 4°C med 75 ul 0,1 M natriumfosfat, pH 7,4, og 20 ul (2 mCi) Na 12<5>1. Oppløsningen ble så overført til et andre glassrør inneholdende 5 ug CD40/Fc i 45 ul PBS (fosfatbufret saltoppløsning), og denne reaksjonsblandingen ble inkubert i 20 minutter ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved gelfiltrering på et 2 ml lagvolum av "Sephadex" G-25 (Sigma) og så ekvilibrert i RPMI 1640-medium inneholdende 2,5%
(volum/volum) bovint serumalbumin (BSA), 0,2% (volum/volum) natriumazid og 20 mM Hepes, pH 7,4, bindingsmedium. Sluttblandingen av 125I CD40/Fc ble fortynnet til en arbeidsstandard-oppløsning på 1 x IO"<7> M i bindingsmedium og lagret i opp til én måned ved 4°C uten påvisbart tap av reseptorbindingsaktivitet.
Et cDNA-bibliotek ble fremstilt fra en EL4-cellelinje sortert ved hjelp- av FACS {fluorescensaktivert cellesortering) på grunnlag av binding av et biotinylert CD40/FC-fusjonsprotein. Celler ble sortert fem ganger inntil det var en betydelig endring i fluorescensstyrke basert på ekspresjon av en ligand for CD40 ved hjelp av de sorterte EL-4-celler. De fem ganger sorterte celler ble kalt EL-40.5-celler, og disse cellene ble dyrket for det formål å skape et cDNA-bibliotek fra EL-40.5-mRNA. I korte trekk ble cDNA syntetisert, innføyd i tom pDC406-vektor og transformert i E. coli. Transformanter ble slått sammen, og DNA fra blandingene ble isolert og transfektert inn i CVl-EBNA-celler for å skape et ekspresjonsklon-ingsbibliotek. Transfekterte CVl-EBNA-celler ble dyrket på objektglass i tre dager for å muliggjøre forbigående ekspresjon av CD40-L. Objektglassene som inneholdt de transfekterte celler, ble så inkubert med radioaktivt jodert CD40/FC, vasket for å fjerne ubundet CD40/FC og fiksert med glutaraldehyd. De fikserte objektglass ble dyppet i flytende, fotografisk emulsjon og eksponert i mørket. Etter fremkalling av objektglassene ble de individuelt undersøkt med et mikroskop, og celler som uttrykker CD40-L, ble identifisert ved tilstedeværelsen av autoradiografiske sølvkorn mot en lys bakgrunn.
Ekspresjonskloningsbiblioteket fra EL-40.5-celler ble screenet, og én mengde, inneholdende omtrent 2000 individuelle kloner, ble identifisert som positiv for binding av <125>I-merket CD40/Fc-fusjonsprotein. Denne mengden ble brutt ned i små mengder med omtrent 200 kolonier. De små mengdene ble screenet som beskrevet ovenfor. Én av de mindre mengdene var positiv med hensyn på CD40-L.
En enkelt klon ble isolert og sekvensert ved hjelp av standardteknikker, hvorved man fikk en cDNA-sekvens og utledet aminosyresekvens for murin CD40-L som vist i figur 1 og sekvens med identifikasjonsnr. 1.
Den humane homolog-CD40-L-cDNA ble funnet ved hjelp av artskrysningshybridiseringsteknikker. I korte trekk ble et cDNA-bibliotek av humanlymfocytter fra perifert blod (PBL) laget fra lymfocytter fra perifert blod behandlet med OKT3-antistoff (ATCC, Rockville, MD) som bindes til CD3 (10 ng/ml) og interleukin-2 (IL-2, 10 ng/ml) i 6 dager. PBL-cellene ble vasket og så stimulert i 4 timer med 10 ng/ml PMA (forbolmyri-statacetat, Sigma, St. Louis) og 500 ng/ml ionomycin (Calbiochem). Messenger-RNA ble isolert fra stimulerte PBL-celler, cDNA dannet, og cDNA ble ligert i Eco Rl-linkere. Ligert cDNA ble innføyet i Eco Rl-setet til AgtlO-fagkloningsbærer ("Gigapak", Stratagene, San Diego, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Fag ble amplifisert, platet ut ved tettheter på omtrent 20.000 fag pr. 15 cm plate, og fagoverføringer ble ut-ført som beskrevet i Maniatis et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, pp 316-328. En murin probe ble konstruert tilsvarende det kodende område i murin CD40-L fra nukleotid 13 til nukleotid 793 i sekvens med identifikasjonsnr. 1 og figur 1. Denne proben ble hybridisert til PBL-bibliotekfagoverføringene under betingelser med middels til høy strenghet. I korte trekk var hybridiseringsbetingelsene 6 X SSC, 1 X Denhardts oppløsning, 2 mM EDTA, 0,5% Np40 ("Nonidet" P-40-detergent) ved 63°C over natten. Dette ble etterfulgt av vasking i 3 X SSC, 0,1% SDS i 3 timer ved 55°C, etterfulgt av eksponering over natten mot røntgenfilm. Positive plakker ble identifisert ved en hyppig-het på omtrent 1 pr. 1000 plakker. Positive plakker ble renset to ganger, og cDNA ble fremstilt fra amplifiserte kulturer.
Man kan benytte de murine eller humane CD40-L-cDNA-sekvenser som her er beskrevet, til å oppnå cDNA-er som koder for andre pattedyrhomologer av murin eller human CD40-L ved artskrysningshybridiseringsteknikker. I korte trekk skapes en oligonukleotidprobe fra nukleotidsekvensen i det ekstracellulære område i murin CD40-L som beskrevet i figur 1 {sekvens med identifikasjonsnr. 1) eller human CD40-L som beskrevet i figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11). Denne proben kan lages ved hjelp av standardteknikker, slik som de som er beskrevet i Maniatis et al., supra. Den murine eller humane probe brukes til å screene et pattedyr-cDNA-bibliotek eller genombibliotek under middels strenge betingelser. Eksempler på pattedyr-cDNA- eller genombiblioteker omfatter, for cDNA, et bibliotek laget av pattedyrets lymfocytter fra perifert blod. Alternativt kan forskjellige cDNA-biblioteker eller mRNA-er isolert fra forskjellige cellelinjer, screenes ved hjelp av Northem-hybridisering for å bestemme en egnet kilde for pattedyr-CD4 0-L-DNA eller mRNA.
Rekombinante ekspresjonsvektorer for ekspresjon av
CD40-L ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker omfatter en CD40-L-DNA-sekvens som omfatter et syntetisk eller cDNA-avledet DNA-fragment som koder for et CD4O-L-polypeptid, operativt bundet til en egnet transkripsjons- eller translasjons-regulatomukleotidsekvens, slik som en som er avledet fra et pattedyr-, mikrobe-, virus- eller insektgen. Eksempler på regulatorsekvenser omfatter sekvenser med en regulatorroile i genekspresjon (f.eks. en transkripsjonspromoter eller -enhancer), eventuelt en operatorsekvens for å kontrollere transkripsjon, en sekvens som koder for et mRNA-ribosomalt bindingssete, og passende sekvenser som kontrollerer transkripsjon og translasjonsinitiering og -terminering. Nukleotidsekvenser er operativt bundet når regulatorsekvensen står i funksjonelt forhold til CD40-L-DNA-sekvensen. En pro-moternukleotidsekvens er således operativt bundet til en CD40-L-DNA-sekvens dersom promoternukleotidsekvensen kontrollerer transkripsjonen av CD40-L-DNA-sekvensen. Ytterligere kan et ribosombindingssete være operativt bundet til en sekvens for et CD40-L-polypeptid dersom ribosombindingssetet er plassert innenfor vektoren for å befordre translasjon. I tillegg kan sekvenser som koder for signalpeptider, være inkorporert i ekspresjonsvektorer. En DNA-sekvens for et signalpeptid (sekresjonsleder) kan f.eks. være operativt bundet til en CD40-L-DNA-sekvens. Signalpeptidet uttrykkes som en forløper-aminosyresekvens som muliggjør forbedret ekstracellulær sekresjon av translatert fusjonspolypeptid ved hjelp av en gjær-vertscelle.
Egnede vertsceller for ekspresjon av CD40-L-polypeptider omfatter prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler. Prokaryoter omfatter gramnegative og grampositive organismer, f.eks. E. coli- eller Bacillus-arter. Egnede prokaryote vertsceller for transformasjon omfatter f.eks. E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, og forskjellige andre arter innenfor slektene Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus. Høyere eukaryote celler omfatter etablerte cellelinjer av pattedyropprinnelse. Cellefrie translasjonssys-temer vil også kunne anvendes for å fremstille CD40-L-polypeptider under anvendelse av RNA-er avledet fra DNA-konstruksjoner som er beskrevet. Passende klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterie-, sopp-, gjær- og pattedyr-celleverter er f.eks. beskrevet i Pouwels et al., Cloning Vec-tors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985),
I en prokaryot vertscelle, slik som E. coli, kan et CD40-L-polypeptid eller analog omfatte en N-endemetioninrest for å lette ekspresjon av det rekombinante polypeptid i den prokaryote vertscelle. N-ende-Met kan spaltes fra det uttrykte, rekombinante CD40-L-polypeptid. Prokaryote vertsceller kan anvendes for ekspresjon av CD40-L-polypeptider som ikke krever omfattende proteolytisk eller disulfidbearbeidelse.
Ekspresjonsvektorene som bærer den rekombinante CD40-L-DNA-sekvens, transfekteres eller transformeres i en i det vesentlige homogen kultur av en egnet vertsmikroorganisme eller pattedyrcellelinje. Transformerte vertsceller er celler som er blitt transformert eller transfektert med nukleotidsekvenser som koder for CD40-L-polypeptider og uttrykker CD40-L-polypeptider. Uttrykte CD40-L-polypeptider vil være lokalisert i vertscellen og/eller være utskilt i kultursupernatantvæske, avhengig av vertscellens egenskaper og genkonstruksjonen som er innføyet i vertscellen.
Ekspresjonsvektorer transfektert i prokaryote vertsceller, omfatter generelt én eller flere selekterbare feno-typemarkører. En selekterbar fenotypemarkør er f.eks. et gen som koder for et protein som gir antibiotisk resistens eller som tilfører et autotroft behov, og et replikasjonsopprinnelsessted gjenkjent av verten for å sikre amplifikasjon i verten. Andre anvendbare ekspresjonsvektorer for prokaryote vertsceller omfatter en selekterbar markør av bakterieopprin-nelse avledet fra kommersielt tilgjengelige plasmider. Denne selekterbare markør kan omfatte genetiske elementer i klon-ingsvektoren pBR322 (ATCC 37017). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetrasyklinresistens og gir således enkle mid-ler for identifisering av transformerte celler. pBR322-"ryggrad"-avsnittene kombineres med en passende promoter og en CD4O-L-DNA-sekvens. Andre kommersielle vektorer omfatter f.eks. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Promotersekvenser brukes vanligvis for rekombinante, prokaryote vertscelleekspresjonsvektorer. Vanlige promotersekvenser omfatter p-laktamase (penicillinase), laktosepro-motersystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978; og Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), tryptofan (trp) promotersystem
(Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; og EP-A-36776)
og tac-promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 412, 1982). Et særlig anvendbart prokaryot vertscelleekspresjonssystem anvender en fag-A PL-promoter og en cI857ts termolabil
repressorsekvens. Plasmidvektorer som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection, og som inneholder derivater av A PL-promoteren, omfatter plasmid pHUB2 (som finnes i E. coli stamme JMB9 (ATCC 37092)) og pPLc28 (som finnes i E. coli RR1 (ATCC 53082)).
CD40-L kan uttrykkes i gjærvertsceller, fortrinnsvis fra Saccharomyces-slekten (f.eks. S. cerevisiae). Andre slek-ter av gjær, slik som Pichia eller Kluyveromyces, kan også anvendes. Gjærvektorer kan ofte inneholde en replikasjonsopp-rinnelsesstedsekvens fra et 2 um gjærplasmid, en autonomt rep-likerende sekvens (ARS), et promoterområde, sekvenser for polyadenylering og sekvenser for transkripsjonsterminering. Gjærvektorer omfatter fortrinnsvis en replikasjonsopprinnel-sesstedsekvens og selekterbar markør. Egnéde promotersekvenser for gjærvektorer omfatter promoterer for metallotionein, 3-fosfoglyseratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; og Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase. Andre egnede vektorer og promoterer for anvendelse i gjæreks-presjon er ytterligere beskrevet i Hitzeman, EPA-73.657.
Gjærvektorer kan f.eks. settes sammen ved å bruke DNA-sekvenser fra pBR322 for utvelgelse og replikasjon i E. coli (Amp<r->gen og replikasjonsopprinnelsessted). Andre gjær-DNA-sekvenser som kan inkluderes i gjærekspresjonskonstruk-sjonen, omfatter en glukoserepresserbar ADH2-promoter og en a-faktorsekresjonsleder. ADH2-promoteren er blitt beskrevet av Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) og Beier et al.
(Nature 300:724, 1982). Gjær-a-faktorledersekvensen styrer sekresjon av heterologe polypeptider. a-faktorledersekvensen innføyes ofte mellom promotersekvensen og den strukturelle gensekvens. Se f.eks. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982 og Bit-ter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:5330, 1984. Andre ledersekvenser som er egnet for å lette sekresjon av rekombinante polypeptider fra gjærverter, er kjent for fagfolk innen teknikken. En ledersekvens kan være modifisert nær sin 3'-ende slik at den inneholder ett eller flere restriksjons-seter. Dette vil lette fusjon av ledersekvensen til det strukturelle gen.
Gjærtransformasjonsfremgangsmåter er kjent for fagfolk innen teknikken. Én slik fremgangsmåte er beskrevet av Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:1929, 1978. Ved fremgangsmåten til Hinnen et al. selekteres det med hensyn på Trp<+->transformanter i et selektivt medium, hvor det selektive medium består av 0,67% gjærnitrogenbase, 0,5% kasaminosyrer, 2% glukose, 10 ug/ml adenin og 20 ug/ml uracil.
Gjærvertsceller transformert ved hjelp av vektorer som inneholder ADH2-promotersekvens, kan dyrkes for å indusere ekspresjon i et "rikt" medium. Et eksempel på et rikt medium er ett som består av 1% gjærekstrakt, 2% pepton og 1% glukose supplert med 80 ug/ml adenin og 80 ug/ml uracil. Derepresjon av ADH2-promoteren inntrer når mediet er tømt for glukose.
Pattedyr- eller insektsvertscellekultursystemer vil også kunne anvendes for å uttrykke rekombinante CD40-L-polypeptider. Eksempler på egnede pattedyrvertscellelinjer omfatter COS-7-linjen av apenyreceller (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L-celler, C127-celler, 3T3-celler (ATCC CCL 163), celler fra ovarie fra kinesisk hamster (CHO), HeLa-celler, og BHK-cellelinjer (ATCC CRL 10). Egnede pattedyrekspresjonsvektorer omfatter ikke-transkriberte elementer, slik som et replikasjonsopprinnelsessted, en promotersekvens, en enhancer bundet til det strukturelle gen, andre 51 - eller 3'-flankerende, ikke-transkriberte sekvenser, slik som ribo-sombindingsseter, et polyadenyleringssete, sammenspleisings-donor- og -akseptorseter, og transkripsjonstermineringssek-venser.
Transkripsjons- og translasjonskontrollsekvenser for pattedyrvertscelleekspresjonsvektorer kan tas ut fra virus-genomer. For eksempel utvinnes vanlig brukte cellepromotersek-venser og -enhancersekvenser fra polyomvirus, adenovirus 2, apevirus 40 (SV40) og humant cytomegalovirus. DNA-sekvenser utvunnet fra SV40-virusgenomet, f.eks. SV40-opprinnelse, "early" og "late" promoter-, enhancer-, sammenspleisings- og polyadenyleringsseter, kan anvendes for å tilveiebringe de øvrige genetiske elementer som er påkrevet for ekspresjon av en strukturell gensekvens i en pattedyrvertscelle. Virus-11 early"- og -"late"-promoterer er særlig anvendbare ettersom begge lett lar seg erholde fra et virusgenom som et fragment som også kan inneholde et virusreplikasjonsopprinnelsessted (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forutsatt at sekvensen med omtrent 250 bp som strekker seg fra Hind III-setet mot Bgl I-setet lokalisert i SV40-virusreplikasjonsopprinnelsesstedet, er inkludert.
Eksempelvise pattedyrekspresjonsvektorer kan konstrueres som beskrevet av Okayama og Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). En anvendbar høyekspresjonsvektor, PMLSV N1/N4, beskrevet av Cosman et al., Nature 312:768, 1984, er blitt deponert som ATCC 39890. Ytterligere anvendbare pattedyrekspresjonsvektorer er beskrevet i EP-A-0367566 og i US patent-søknad nr. 07/701 415 innlevert 16. mai 1991. For ekspresjon av ekstracellulært område av type II-protein, slik som CD40-L, bør det tilsettes en heterolog signalsekvens slik som signalsekvensen for interleukin-7 (IL-7) beskrevet i US patentskrift nr. 4 965 195, eller signalsekvensen for interleukin-2-reseptor beskrevet i US patentsøknad nr. 06/626 667 innlevert 2. juli 1984.
Human eller murin CD40-L kan lages i membranbundet form når den er inkludert et intracellulært område og transmembranområde r, eller i oppløselig form med bare det ekstracellulære domene. Vi uttrykte fullengde murin CD40-L i pattedyrceller, hvorved vi fikk celler som uttrykker membranbundet, murin CD40-L. CV1-celler ble transfektert med en cDNA vist i figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) i HAVEO-vektor, eller CV1-celler ble transfektert med HAVEO tom vektor under anvendelse av teknikker beskrevet i eksempel 6. Dette ga transfekterte CVl-celler som uttrykker membranbundet, murin CD40-L. Disse cellene ble brukt som en kilde for membranbundet, murin CD4 0-L for serien av forsøk rapportert i eksemplene 10-13 nedenunder.
Rensing av rekombinante CD40- L- polypeptider
CD40-L-polypeptider kan fremstilles ved å dyrke transformerte vertsceller under dyrkningsbetingeIser som er nødvendige for å uttrykke CD4O-L-polypeptider. De resulterende, uttrykte polypeptider kan så renses fra dyrkningsmedier eller celleekstrakter. Et CD40-L-polypeptid kan, om ønsket, konsentreres under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentrasjonsfilter, f.eks. en "Amicon" eller "Milli-pore Pellicon" ultrafiltreringsenhet. Etter konsentrasjons-trinnet kan konsentratet tilføres en rensematriks, slik som et gelfiltreringsmedium. En anionbytterharpiks kan alternativt anvendes, f.eks. en matriks eller et substrat med påhengte dietylaminoetylgrupper (DEAE). Matriksene kan være akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre typer som vanligvis anvendes i proteinrensing. Alternativt kan det anvendes et kationbyttertrinn. Egnede kationbyttere omfatter forskjellige, uoppløselige matrikser som omfatter sulfopropyl- eller karbok-symetylgrupper. Sulfopropylgrupper er foretrukket.
Endelig kan det anvendes ett eller flere trinn med reversfasevæskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC) under anvendelse av hydrofobe RP-HPLC-medier, f.eks. kan silikagel med påhengte metyl- eller andre alifatiske grupper anvendes for ytterligere å rense CD40-L. Noen av eller alle de ovenfor nevnte rensetrinn kan i forskjellige kombinasjoner også anvendes for å tilveiebringe et i det vesentlige homogent, rekombinant protein.
Det er også mulig å benytte en affinitetskolonne som omfatter CD40-ligandbindingsdomenet for å affinitetsrense uttrykte CD4 0-L-polypeptider. CD40-L-polypeptider kan fjernes fra en affinitetskolonne i en elueringsbuffer med høyt saltinnhold og så dialyseres i en buffer med lavere saltinnhold for bruk.
Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur, isol-eres vanligvis ved innledende oppbrytning av vertscellene, sentrifugering, ekstraksjon fra cellepellets dersom det er et uoppløselig polypeptid, eller fra supernatantvæsken dersom det er et oppløselig polypeptid, etterfulgt av én eller flere kon-sentrasjons-, utsaltings-, ionebytter-, affinitetsrensings-eller størrelsesutelukkelseskromatografitrinn. Til sist kan RP-HPLC anvendes for sluttrensingstrinn. Mikrobeceller kan brytes opp ved hvilken som helst passende metode, inkludert fryse-tine-sykluser, sonikering, mekanisk oppbrytning eller bruk av cellelyseringsmidler.
Transformerte gjaervertsceller anvendes fortrinnsvis for å uttrykke CD40-L som et utskilt polypeptid. Dette for enklere rensing. Utskilt, rekombinant polypeptid fra en gjær-vertscellefermentasjon kan renses ved hjelp av fremgangsmåter som er analoge med de som er beskrevet av Urdal et al. {J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. beskriver to sekvens-vise, reversfase HPLC-trinn for rensing av rekombinant, humant IL-2 på en preparativ HPLC-kolonne.
Administrering av CD40- L- preparater
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer terapeutiske preparater som omfatter en effektiv mengde av CD40-L i en egnet fortynner eller bærer, og anvendelse av CD40-L for fremstilling av et medikament for behandling av pattedyr under anvendelse av preparatene. For terapeutisk anvendelse administreres renset CD40-L eller en biologisk aktiv analog derav til en pasient, fortrinnsvis et menneske, for behandling på en passende måte for indikasjonen. Således kan f.eks. farmasøyt-iske CD40-L-preparater (f.eks. i form av et oppløselig, ekstracellulært domene eller et fragment derav) som administreres for å oppnå en ønsket terapeutisk effekt, gis ved bolusinjek-sjon, kontinuerlig infusjon, vedvarende frigjørelse fra im-plantater eller annen egnet teknikk. Vanligvis vil et terapeutisk CD40-L-middel bli administrert i form av et farmasøyt-isk preparat som omfatter renset CD40-L-polypeptid sammen med fysiologisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynnings-midler. Slike bærere vil være ikke-toksiske for pasienter ved de doseringene og konsentrasjonene som anvendes. Vanligvis medfører fremstillingen av slike preparater kombinasjon av et CD40-L-polypeptid med buffere, slike antioksidanter som askor-binsyre, polypeptider med lav molekyl vekt (mindre enn ca.. 10 rester), proteiner, aminosyrer, karbohydrater inkludert glukose, sukrose eller dekstraner, chelateringsmidler, slik som EDTA, glutation og andre stabiliseringsmidler og eksipienser. Nøytral, bufret saltoppløsning eller saltoppløsning blandet med conspesifikt serumalbumin, er eksempler på passende for-tynningsmidler. CD4O-L-sense- eller -antisense-oligonukleotider kan administreres in vivo ved å administrere en effektiv mengde av en vektor som inneholder en nukleinsyresekvens som koder for et effektivt antisense- eller sense-oligonukleotid. I tillegg kan CD40-L-sense- eller antisense-
oligonukleotider administreres ex vivo ved å fjerne celler som inneholder CD40-L-DNA eller mRNA fra et individ, inkorporere et antisense- eller sense-oligonukleotid i cellene under anvendelse av genoverføringsteknikker og på nytt sprøyte inn cellene i individet.
De følgende eksempler er ment å illustrere bestemte utførelsesformer av oppfinnelsen.
Eksempel 1
Dette eksemplet beskriver konstruksjon av en CD40/Fc-DNA-konstruksjon for å uttrykke et oppløselig CD40/Fc-fusjonsprotein for anvendelse ved påvisning av cDNA-kloner som koder for en CD40-ligand. cDNA-sekvensen i det ekstracellulære område eller ligandbindingsdomenet til komplett, human CD40-reseptorsekvens ble erholdt ved å bruke polymerasekjedereak-sjonsteknikker (PCR-teknikker) og er basert på sekvensen publisert i Stamenkovic et al., supra. Et CD40-plasmid (CDM8) ble brukt som et templat for PCR-amplifikasjon. CDM8 er beskrevet i Stamenkovic et al. og ble erholdt fra forfatterne. En PCR-teknikk (Sarki et al., Science 239:487, 1988) ble brukt under anvendelse av 51 - (oppstrøms) og 3'- (nedstrøms) oligonukleotidprimere for å amplifisere DNA-sekvensene som koder for CD4 0 ekstracellulært ligandbindingsdomene. Oppstrøms oligonukleotidprimer 5<1->CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (sekvens med iden-tif ikasjonsnr. 5) innfører et Sal 1-sete oppstrøms fra et initiatormetionin i CD40 og en nedstrøms oligonukleotidprimer 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3<1> (sekvens med identifikasjonsnr. 7) som innføyer aminosyrene Tyr Val Glu Pro Arg (sekvens med identifikasjonsnr. 8) etter aminosyre 193 i CD40. Glu og Pro er de to første aminosyrene i et leddområde i humant IgGi og etterfølges av et Bgl II-restriksjonssete som ble brukt til å fusjonere det ekstracellulære domene i CD40 til det gjenværende av humant IgGi-Fc-område.
DNA-konstruksjonen pDC406/CD40/Fc ble transfektert i apenyrecellelinjen CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). pDC406-plas-midet omfatter regulatorsekvenser avledet fra SV40, humant immunsviktvirus (HIV) og Epstein-Barr-virus (EBV). CV-l/EBNA-cellelinjen ble utvunnet ved transfeksjon av CV-l-cellelinjen med et gen som koder for Epstein-Barr-viruskjerneantigen-1 (EBNA-1) som konstitutivt uttrykker EBNA-1 drevet fra den humane CMV-mellomliggende "early enhancer"/promoter. EBNA-1-genet muliggjør episomal replikasjon av ekspresjonsvektorer, slik som pDC406, som inneholder EBV-replikasjonsopprinnelses-stedet.
Når først celler som uttrykker fusjonskonstruksjonen var identifisert, ble storskalakulturer av transfekterte celler dyrket for å akkumulere supernatant fra celler som uttrykker CD40/Fc. CD40/Fc-fusjonsproteinet i supernatantvæske ble renset ved affinitetsrensing. I korte trekk ble 1 liter kultursupernatant inneholdende CD40/Fc-fusjonsprotein, renset ved å filtrere pattedyrcellesupernatanter (f.eks. i et 0,45 um filter) og tilføre filtrat til en protein-A/G-antistoffaffini-tetskolonne (Schleicher und Schuell, Keene, NH) ved 4°C ved en strømningshastighet på 80 ml/time i en 1,5 cm x 12,0 cm kolonne. Kolonnen ble vasket med 0,5 M NaCl i PBS (fosfatbufret saltoppløsning) inntil fritt protein ikke kunne påvises i vaskebuffer. Til sist ble kolonnen vasket med PBS. Bundet fusjonsprotein ble eluert fra kolonnen med 25 mM sitratbuffer, pH 2,8, og brakt til pH 7 med 500 mM Hepes-buffer, pH 9,1. Sølvfargede SDS-geler av det eluerte CD40/Fc-fusjonsprotein viste at det var >98% rent.
Renset CD40/Fc-fusjonsprotein ble jodert med 125I under anvendelse av et kommersielt, tilgjengelig fastfasemiddel (Iodo-Gen", Pierce). Ved denne fremgangsmåten ble 5 ug "Iodo-Gen" platet ut i bunnen av et 10 x 75 mm glassrør og inkubert i 20 minutter ved 4°C med 75 ul 0,1 M natriumfosfat, pH 7,4, og 20 ul (2 mCi) Na<125>I. Oppløsningen ble så overført til et andre glassrør inneholdende 5 ug CD40/FC i 45 ul PBS, og denne reaksjonsblanding ble inkubert i 20 minutter ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved gelfiltrering på et 2 ml lagvolum av "Sephadex" G-25 (Sigma) og så ekvilibrert i RPMI 1640-medium inneholdende 2,5% (volum/volum) bovint serumalbumin (BSA), 0,2% (volum/volum) natriumazid og 20 mM Hepes, pH 7,4, bindingsmedium. Sluttblandingen av 125I CD40/FC ble fortynnet til en arbeidsstandardoppløsning av 1 x 10"<7> M i bindingsmedium og lagret i opp til én måned ved 4°C uten påvisbart tap av reseptorbindingsaktivitet.
Det ble observert omtrent 50-60% markørinkorporering. Radioaktiv jodering ga spesifikke aktiviteter i området 1 x IO<15> til 5 x IO<15> cpm/nmol (0,42-2,0 atomer radioaktivt jod pr. proteinmolekyl). SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) avslørte et enkelt, merket polypeptid i overensstemmelse med forventede verdier. Det merkede fusjonsprotein var mer enn 98% trikloreddiksyreutfellbart (TCA-utfellbart), noe som indikerer at <125>I var kovalent bundet til proteinet.
Eksempel 2
Dette eksemplet beskriver utvelgelse av en cellelinje som antas å uttrykke CD40-L. Flere cellelinjer ble screenet under anvendelse av det radioaktivt joderte CD40/Fc-fusjonsprotein beskrevet i eksempel 1. I korte trekk ble kvantitative bindingsundersøkelser utført i henhold til standardmetodikk, og Scatchard-plottinger ble utvunnet for de forskjellige cel-lelinjene. En klonal cellelinje (EL4, ATCC katalog TIP 39), en murin tymomcellelinje, ble identifisert og sortert. Før sor-tering ble EL-4-celler funnet å uttrykke omtrent 450 molekyler CD40-L pr. celle. Cellene av syvende sort ble kalt EL-40.7 og ble dyrket og funnet å uttrykke omtrent 10.000 molekyler CD40-L pr. celle. Til sist ble cellene av niende sort kalt EL-40.9 og ble dyrket og funnet å uttrykke omtrent 15.000 molekyler CD40-L pr. celle.
Eksempel 3
Dette eksemplet beskriver fremstilling av et cDNA-bibliotek for ekspresjonskloning av murin CD40-L. Biblioteket ble fremstilt fra en femtesortert klon av en musetymomcelle-linje EL-4 (ATCC TIB 39), kalt EL-40.5. EL-40.5-celler var EL4-celler sortert fem ganger med biotinylert CD40/Fc-fusjonsprotein i en FACS (fluorescensaktivert cellesorterer). Et cDNA-bibliotek ble laget fra RNA erholdt fra EL-40.5-celler hovedsakelig som beskrevet i US patentskrift nr. 4 968.607. I korte trekk ble et cDNA-bibliotek konstruert ved revers-transkripsjon av poly (A)<+> mRNA isolert fra den totale RNA ekstrahert fra EL-40.5-cellelinjen. Bibliotekskonstruksjons-teknikken var i det vesentlige lik den som er beskrevet av Ausubel et al., red., Current Protocols In Molecular Biology, vol. 1, (1987) . Poly (A)<+> mRNA ble isolert ved hjelp av oligo-dT-cellulosekromatografi, og dobbelttrådet cDNA ble laget hovedsakelig som beskrevet av Gubler et al., Gene 25:263, 1983. Poly (A)<+> mRNA-fragment ble omdannet til RNA-cDNA-hybrider ved hjelp av reverstranskriptase under anvendelse av vilkårlige heksanukleotider som primere. RNA-cDNA-hybridene ble så omdannet til dobbelttrådede cDNA-fragmenter under anvendelse av RNAse H i kombinasjon med DNA-polymerase I. Den resulterende, dobbelttrådede cDNA ble gjort buttendet med T4-DNA-polymerase.
Sal I-adaptorer
5'- TCG ACT GGA ACG AGA CGA CCT GCT -3'
GA CCT TGC TCT GCT GGA CGA -5'
ble ligert til 5'-ender i resulterende buttendet cDNA, som beskrevet i Haymerle et al., Nucleic Acids Res. 14:8615, 1986. Ikke-ligerte adaptorer ble fjernet ved hjelp av gelfiltrer-ingskromatografi ved 68°C. Dette etterlot 24-nukleotiders ikke-selvkomplementære overheng på cDNA. Den samme fremgangsmåte ble brukt til å omdanne 5'-Sal I-ender i pattedyrekspre-sjonsvektoren pDC406 til 24 nukleotiders overheng som er komplementære til de som er tilføyet til cDNA. Optimale forhold mellom adaptortilsatt vektor og cDNA ble ligert i nærvær av T4-polynukleotidkinase. Dialyserte ligeringsblandinger ble elektroporert i E. coli-stamme DH5a og transformanter valgt ut på ampicillinplater.
Plasmid-DNA ble isolert fra blandinger bestående av omtrent 2.000 kloner av transformert E. coli pr. blanding. Den isolerte DNA ble transfektert i et sammenflytende lag av CVl-EBNA-celler under anvendelse av DEAE-dekstranet etterfulgt av klorokinbehandling, hovedsakelig ifølge fremgangsmåtene beskrevet i Luthman et al., Nucl. Acids Res. 11:1295, 1983 og McCutchan et al., J. Nati. Cancer Inst. 41:351, 1986.
CVl-EBNA-celler ble holdt i komplett medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 10% (volum/volum kalvefosterserum, 50 U/ml penicillin, 50 U/ml streptomycin og 2 mM L-glutamin) og ble platet ut til en tetthet på omtrent 2 x 10s celler/brønn i enkeltbrønnoppdelte objektglass (Lab-Tek). Objektglassene ble forbehandlet med 1 ml humant fibro-nektin (10 ug/ml PBS) i 3 0 minutter etterfulgt av en enkelt vasking med PBS. Medium ble fjernet fra adherente celler som vokste i et lag og erstattet med 1,5 ml komplett medium inneholdende 66,6 uM klorokinsulfat. Ca. 0,2 ml av en DNA-oppløsning (2 ug DNA, 0,5 mg/ml DEAE-dekstran i komplett medium inneholdende klorokin) ble tilsatt til cellene, og blandingen ble inkubert ved 37°C i ca. 5 timer. Etter inkubasjon ble medium fjernet, og cellene ble sjokkbehandlet ved tilsetning av komplett medium inneholdende 10% DMSO (dimetylsulfoksid) i 2,5-20 minutter. Sjokkbehandling ble etterfulgt av erstatning av oppløsningen med nytt, komplett medium. Cellene ble dyrket i kultur i 2 til 3 dager for å muliggjøre forbigående ekspresjon av de innføyde DNA-sekvenser. Disse betingelsene førte til en 30% til 80% transfeksjonshyppighet for overlevende CVl-EBNA-celler.
Eksempel 4
Dette eksemplet beskriver screening av ekspresjonskloningsbiblioteket laget i eksempel 3 med et merket CD40/Fc-fusjonsprotein laget i eksempel 1. Etter 48-72 timer ble transfekterte monolag av CVl-EBNA-celler laget i eksempel 3, analysert ved hjelp av objektglassautoradiografi med hensyn på ekspresjon av CD40-L under anvendelse av radioaktivt jodert CD40/Fc-fusjonsprotein som fremstilt i eksempel 1. Transfekterte CVl-EBNA-celler ble vasket én gang med bindingsmedium (RPMI 1640 inneholdende 25 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) ,
2 mg/ml natriumazid, 20 mM Hepes, pH 7,2, og 50 mg/ml tørrmelk uten fett) og inkubert i 2 timer ved 4°C i bindingsmedium inneholdende 1 x IO"<9> M 12SI-CD4 0/Fc-fusjonsprotein. Etter inkubasjon ble celler i de rominndelte objektglass vasket tre ganger med bindingsbuffer, etterfulgt av to vaskinger med PBS, (pH 7,3) for å fjerne ubundet, radioaktivt merket fusjonsprotein.
Cellene ble fiksert ved å inkubere i 10% glutaraldehyd i PBS (30 minutter ved romtemperatur), vasket to ganger i PBS og lufttørket. Objektglassene ble dyppet i "Kodak GTNB-2" fotografisk emulsjon (6 x fortynning i vann) og eksponert i mørket i 2 til 4 dager ved romtemperatur i en lystett boks. Objektglassene ble fremkalt i "Kodak D19" fremkaller, skyllet i vann og fiksert i "Agfa G433C" fikserbad. Objektglassene ble undersøkt hver for seg under et mikroskop ved 25-40x forstør-relse. Positive objektglass som oppviste celler som uttrykker CD40-L, ble identifisert ved tilstedeværelsen av autoradiografiske sølvkorn mot en lys bakgrunn.
Én blanding inneholdende omtrent 2.000 individuelle kloner, ble identifisert som potensielt positive for binding av CD40/Fc-fusjonsproteinet. Blandingen ble titrert og platet ut for å tilveiebringe plater som inneholdt omtrent 200 kolonier hver. Hver plate ble skrapet for å tilveiebringe blandet plasmid-DNA for transfeksjon i CVl-EBNA-celler i henhold til den samme fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor. De mindre blandingene ble screenet ved hjelp av objektglassautoradiografi som beskrevet tidligere. Én av de mindre blandingene inneholdt kloner som var positive med hensyn på CD40-L, slik som indikert ved tilstedeværelsen av et uttrykt genprodukt som er i stand til å binde seg til CD40/Fc-fusjonsproteinet.
Den positive, mindre blanding ble titrert og platet ut, hvorved man fikk individuelle kolonier. Omtrent 400 individuelle kolonier ble plukket ut og inokulert i dyrknings-medium i individuelle brønner på 96-brønners plater. Kulturer ble blandet ved å slå sammen rekker og spalter, og de blandede kulturer ble brukt til å fremstille DNA for en sluttrunde med transfeksjon og screening. Et kryssfelt i en positiv rekke og en positiv spalte indikerte en potensielt positiv koloni. Ti potensielt positive kolonier (dvs. kandidatkloner) ble identifisert. DNA ble isolert fra hver kandidatklon, på nytt transfektert og på nytt screenet. Fem kandidatkloner var positive ved binding til CD40/Fc. Alle fem positive kandidatkloner inneholdt en cDNA-innføyelse med 1.468 nukleotider, bestemt ved hjelp av dideoksynukleotidsekvensering. cDNA-kodings-området i CD40-L-klonen tilsvarer sekvensen i figur 1 og sekvens med identifikasjonsnr. 1.
En kloningsvektor inneholdende murin CD4O-L-sekvens, betegnet pDC406-mCD40-L, ble deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC), 6. desember 1991, under deponeringsnr. 68872. Nukleotidsekvensen og den forutsagte aminosyresekvens til denne klonen er illustrert i sekvens med identifikasjonsnr. 1 og i figur 1.
Eksempel 5
Dette eksemplet illustrerer en artskrysningshybridis-eringsteknikk som ble brukt til å isolere en human CD40-L-homolog under anvendelse av en probe utformet fra sekvensen til murin CD40-L. En murin CD40-L-probe ble fremstilt ved å ta ut det kodende område fra murin CD40-L-klon p-DC406-CD40-L (nukleotid 13-793) og <32>P-merking av fragmentet under anvendelse av vilkårlige primere (Boehringer-Mannheim).
Et cDNA-bibliotek fra human lymfocytt fra perifert blod ble konstruert i en A-fagvektor under anvendelse av Agt10-armer og emballert in vitro under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett ("Gigapak" Stratagene, San Diego, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. PBL-cellene ble erholdt fra normale, humane frivillige og behandlet med 10 ng/ml 0KT3 (et anti-CD3-antistoff), og 10 ng/ml humant IL-2 (Immunex, Seattle, WA) i seks dager. PBL-cellene ble vasket og stimulert med 500 ng/ml ionomycin (Calbiochem) og 10 ng/ml PMA (Sigma) i fire timer. Messenger-RNA og cDNA ble erholdt fra de stimulerte PBL-celler og emballert i Agtl0-fagvektorer ("Gigapak" Stratagene) i henhold til produsentens instruksjoner.
Den murine probe ble hybridisert til fag-cDNA i 6 X SSC (15 mM trinatriumsitrat og 165 mM natriumklorid), 1 X Denhardts oppløsning, 2 mM EDTA, 0,5% Np40 ved 63°C over natten. Hybridisering ble etterfulgt av omfattende vasking i 3 X SSC, 0,1% SDS ved omtrent 55°C i 3 timer. Spesifikke bånd ble visualisert ved autoradiografi.
En kloningsvektor inneholdende human CD40-L-sekvens, betegnet hCD40-L, ble deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC), 6. desember 1991, under deponeringsnr. 68873. Nukleotidsekvensen og den forutsagte aminosyresekvens til denne klon er illustrert i sekvens med iden-tif ikasjonsnr . 11 og i figur 2.
Eksempel 6
Dette eksemplet illustrerer ekspresjonen av membranbundet, murin CD40-L i CVl-EBNA-celler. Murin CD40-L-CDNA i HAVEO-vektor eller tom HAVEO-vektor ble transfektert i CVl-EBNA-celler under anvendelse av standardteknikker, slik som de som er beskrevet i McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991, og i eksempel 3 her. I korte trekk ble CVl-EBNA-celler platet ut ved en tetthet på 2 x IO<6> celler pr. 10 cm plate i 10 ml Dulbeccos minimalt, essensielt medium supplert med 10% kalvefosterserum (medium). Cellene fikk feste seg over natten ved 37°C. Mediet ble erstattet med 1,5 ml medium inneholdende 66,7 uM klorokin og en DNA-blanding inneholdende 5 ug cDNA som koder for mCD40-L. Medium inneholdende 175 ul og 25 ul DEAE-dekstran (4 mg/ml i PBS), ble også tilsatt til cellene. Cellene og cDNA ble inkubert ved 37°C i 5 timer. cDNA-blandingen ble fjernet, og cellene ble sjokkbehandlet med 1 ml nytt medium inneholdende 10% DMSO i 2,5 minutter. Mediet ble erstattet med nytt medium, og cellene ble dyrket i minst 3 dager.
Eksempel 7
Dette eksemplet illustrerer fremstillingen av monoklonale antistoffer mot CD40-L. Preparater av renset, murin CD40-L eller human CD40-L fremstilles ved hjelp av COS-celle-ekspresjon og CD40/Fc-affinitetsrensing som her beskrevet. Renset CD40-L kan frembringe monoklonale antistoffer mot CD40-L under anvendelse av vanlige teknikker, f.eks. de teknikkene som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 411 993. I korte trekk ble mus immunisert med CD40-L som et immunogen, emulgert i komplett Freunds adjuvans, og ble injisert i mengder i området fra 10-100 ug subkutant eller intraperitonealt. 10 til 12 dager senere tilføres de immuniserte dyrene ytterligere CD40-L emulgert i ukomplett Freunds adjuvans. Mus får deretter ny tilførsel etter en ukentlig til to-ukentlig immuniserings-plan. Serumprøver tas periodevis ved retroorbital blodprøve-taking eller haletypeeksisjon for testing ved hjelp av "dot blot"-analyse eller ELISA (enzymbundet iramunsorbentanalyse) med hensyn på CD40-L-antistoffer.
Etter påvisning av en passende antistofftiter for-synes positive dyr med en siste intravenøs injeksjon av CD40-L i saltoppløsning. 3 til 4 dager senere avlives dyrene, miltcellene innhøstes, og miltcellene fusjoneres til en murin mye-lomcellelinje (f.eks. NS1 eller Ag 8.653). Fusjoner frem-bringer hybridomceller som plates ut i multiple mikrotiterplater i et HAT (hypoksantin, aminopterin og tymidin) selektivt medium for å inhibere proliferasjon av ikke-fusjonerte celler, myelomhybrider og miltcellehybrider.
Hybridomcellene screenes ved hjelp av ELISA med hensyn på reaktivitet mot renset CD40-L ved hjelp av tilpasninger av teknikkene som er beskrevet i Engvall et al., Immunochem. 5:871, 1971, og i US patentskrift nr. 4 703 004. Positive hybridomceller kan injiseres intraperitonealt i syngene BALB/c-mus, hvorved det fremstilles ascites som inneholder høye konsentrasjoner av anti-CD40-L-monoklonale antistoffer. Alternativt kan hybridomceller dyrkes in vitro i kolber eller rulleflasker ved hjelp av forskjellige teknikker. Monoklonale antistoffer fremstilt i museascites, kan renses ved ammonium-sulfatutfelling, etterfulgt av gelutelukkelseskromatografi. Alternativt kan affinitetskromatografi basert på binding av antistoff til protein A eller protein G, også brukes, like så vel som affinitetskromatografi basert på binding på CD40-L.
Eksempel 8
Dette eksemplet illustrerer anti-allergiterapeutiske effekter av sCD40 og CD40/Fc-fusjonsprotein. Oppløselige CD40 og CD40/FC ble testet med hensyn på deres evne til å inhibere IL-4- (5 ng/ml) indusert IgE-sekresjon i et to-donors MLC-system. Dataene fra tre forsøk er vist i tabell 1.
IgE-nivåer ble målt etter 12 dager i kultur ved hjelp av en ELISA-fremgangsmåte. I korte trekk ble flatbunnede, 96-brønners mikrotiterplater (Corning) belagt med muse-mAb-anti-humant IgE (Zymed) ved fortynning i forholdet 1:500 i PBS (fosfatbufret saltoppløsning). Etter tre gangers vasking ble det utført et blokkeringstrinn under anvendelse av 5% tørrmelk uten fett, etterfulgt av titrering av standarder av humant IgE eller testsupernatanter. Etter vasking tre ganger ble biotinylert geite-anti-humant IgE (Kirkegaard og Perry) tilsatt ved en fortynning i forholdet 1:500. Dette ble etterfulgt av ytterligere vasking og så tilsetning av streptavidin-HRP (Zymed) ved en fortynning i forholdet 1:500. Etter ytterligere vasking ble reaksjonen fremkalt under anvendelse av TMB-substrat (Kirkegaard og Perry), og absorbans ble målt ved 520 nm. Alle vasketrinn ble utført i PBS pluss 0,05% "Tween". Alle inkubasjonstrinn ble utført ved volumer på 100 ul/brønn i 1 time ved romtemperatur. Sensitiviteten til denne analysen er 100 pg/ml.
Eksempel 9
Dette eksemplet illustrerer effektene av sCD40 og CD40/Fc-fusjonsprotein når det gjelder å inhibere utskillelse av oppløselig CD23 fra IL-4-stimulerte (5 ng/ml) B-celler. Oppløselig CD40 og CD40/FC ble testet med hensyn på deres evne til å inhibere IL-4-indusert utskillelse av sCD23 i et to-donors MLC-system. Dataene fra tre forsøk er vist i tabell 2.
Nivåer av oppløselig CD23 ble målt etter 6 og 12 dager i kultur ved hjelp av et kommersielt sCD23 ELISA-påvis-ningssett (Binding Site, San Diego, CA). Sensitivitetsgrensen var 500 pg/ml. Omtrent 1 x 10s pr. brønn ble dyrket in triplo i rundbunnete, 96-brønners mikrotiterplater (Intermountain Scientific, Bountiful, UT) i den angitte tid i nærvær eller fravær av additiver som angitt i tabell 2. Resultatene viser anti-allergieffekter av sCD40. Lignende undersøkelser ble kjørt med CD40/Fc (data ikke vist) i stedet for sCD40, og det ble oppnådd lignende resultater. Disse dataene i eksemplene 8 og 9 illustrerer følgelig en anti-allergiegenskap hos CD40.
Eksempel 10
Dette eksemplet illustrerer B-celleproliferativ aktivitet av membranbundet, murin CD40-L for humane B-celler. Mononukleære celler fra humant, perifert blod (PBMC) ble isolert fra perifert blod fra normale frivillige ved densitetsgradientsentrifugering over "Histopaque" (Sigma, St. Louis, MO). T-celleuttømte preparater av celler (E") ble erholdt ved å fjerne T-celler ved rosettbehandling med 2-aminoetylisotio-uroniumbromidbehandlede SRBC (røde blodlegemer fra sau) og ytterligere densitetsgradientsentrifugering over "Histopaque". B-celleproliferasjonsanalyser ble utført med E~-preparater i RPMI-medium med tilsatt 10% varmeinaktivert, bovint foster-serum (FBS) ved 37°C i en 10% C02-atmosfære. Omtrent 1 X 10<5 >E"-celler pr. brønn ble dyrket in triplo i flatbunnede, 96-brønners mikrotiterplater (Corning) i 7 dager i nærvær av transfekterte CVl-EBNA-celler (beskrevet i eksempel 6). CV1-EBNA-cellene ble transfektert med murin CD40-L-CDNA eller tom vektor. Cellene ble pulset med 1 uCi/brønn tritiert tymidin (25 Ci/nmol Amersham, Arlington Heights, IL) i de siste åtte dyrkningstimene. Celler ble innhøstet på glassfiberplater med en automatisert celleinnhøster, og inkorporert cpm ble målt ved væskescintillasj onsspektrometri.
Figur 4a viser en sammenligning mellom human B-celleproliferasjon av CVl-EBNA-celler transfektert med tom vektor (HAVEO) eller med murin CD40-L-CDNA i HAVEO-vektor. Disse dataene viser at membranbundet CD40-L stimulerer human B-celleproliferasjon i fravær av et komitogen. Figur 4b viser et lignende forsøk, bortsett fra at 10 ng/ml humant IL-4 ble
tilsatt til kulturene. I dette forsøket øker IL-4 svakt den B-cellemitogene aktivitet av membranbundet, murin CD40-L. Figur 5 er en gjentagelse av forsøket vist i figur 4b. Når forsøket ble gjentatt, var det imidlertid ikke noe bevis på IL-4-komitogen aktivitet. Det var gjentatt bevis på CD40-L-mitogen aktivitet. Membranbundet CD40-L stimulerer følgelig proliferasjon av humane B-celler.
Eksempel 11
Dette eksemplet illustrerer effekten av membranbundet, murin CD40-L når det gjelder å stimulere IgE-produksjon og CD23-utskillelse fra E"-celler isolert i eksempel 10. Omtrent 1 X 10<5> celler/brønn ble dyrket in triplo i rundbunnete, 96-brønners "Nunc" mikrotiterplater (Intermountain Scientific, Bountiful, UT) i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) pluss 10% FCS i en fuktig atmosfære ved 10% C02. Medium ble supplert med 50 ug/ml humantransferrin (Sigma), 0,5% bovint serumalbumin (Sigma) og 1 ug/ml hver av olje-, linolein- og palmitinsyre (Sigma). E"-cellene ble dyrket i 10 dager i nærvær av 5 ng/ml humant IL-4. En titrering av CVl-EBNA-celler transfektert med murin CD40-L eller tom vektor, ble tilsatt. Etter 10 dager ble kultursupernatanter analysert med hensyn på IgE ved hjelp av ELlSA-fremgangsmåten beskrevet i eksempel 8, eller med hensyn på CD23-utskillelse ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 9.
Figur 6 viser en sammenligning mellom IgE-produksjon i supernatantene (i ng/ml) for kulturer av E"-celler og CVl-EBNA-celler transfektert med tom vektor (HAVEO) eller med CD40-L. Det ble ikke lagt merke til noen forskjeller med opp til 3000 CVl-EBNA-celler, men man fikk imidlertid signifikant IgE-produksjon med tilsetning av 10.000 eller 30.000 CD40-L-transfekterte CVl-EBNA-celler. Som en sammenligning var, når E"-celler ble inkubert med medium alene, 5 ng/ml IL-4 eller 5 ng/ml IL-4 pluss 500 ng/ml G28-5-antistoff, IgE-produksjon henholdsvis 4,7, 2,9 og >600 ng/ml. Når CD23-utskillelse ble målt i figur 7, oppviste 10.000 og 30.000 CVl-EBNA-celler transfektert med CD40-L, økt CD23-utskillelse sammenlignet med tom vektorkontroll CVl-EBNA-celler. Som en sammenligning var, når E"-celler ble inkubert med medium alene, 5 ng/ml IL-4 eller 5 ng/ml IL-4 pluss 500 ng/ml G28-5-antistoff, CD23-utskillelse mindre enn henholdsvis 0,1, 2,4 og 11,2 ng/ml. Disse dataene viser at IgE-produksjon og CD23-utskillelse begge er biologiske aktiviteter forbundet med membranbundet CD40-L.
Eksempel 12
Dette eksemplet illustrerer B-celleproliferativ aktivitet, produksjon av polyklonalt immunglobulin (lg), dannelse av antigenspesifikt antistoff og forskjellige fremgangsmåter for anvendelse av membranbundet og oppløselig CD40-L i kliniske anvendelser. Vi oppnådde murine B-celler fra milt i henhold til fremgangsmåter beskrevet i Grabstein et al. I supra, Maliszewski et al. I supra og Maliszewski et al. II supra. I korte trekk ble den blandede kultur av celler renset ved hjelp av T-celleuttømming under anvendelse av T-celle-antiserum og komplement, og adherent celleuttømming ved pas-sering i "Sephadex" Gl0-kolonner og ved B-cellepositiv utvelgelse ved "panning" på petriskåler belagt med geite-anti-muse-IgM. Rensede B-celler ble dyrket i RPMI, kalvefosterserum (5% for B-celleproliferasjonsanalyser og 20% for plakkdannende celleanalyser eller for analyser med polyklonalt antistoff), 2-merkaptoetanol, antibiotika, aminosyrer og pyruvat. B-celle-prolif erasjon ble målt i henhold til analysen beskrevet i eksempel 10 og i Grabstein et al. I supra, Maliszewski et al. I supra og Maliszewski et al. II supra. Antigenspesifikk anti-stof f dannelse ble målt ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i Grabstein et al., J. Mol. Cell. Immunol. 2:199, 1986 [Grabstein et al. II]. I korte trekk ble det ved antigenspesifikk antistoffdannelse brukt røde blodlegemer fra sau (SRBC) som antigen (0,03% volum/volum) i 2,0 ml kulturer av 1 X IO<6 >murine B-celler pr. kultur. B-cellekulturene ble inkubert i 5 dager, og plakkdannende celler ble bestemt ved hjelp av Jerne hemolytisk plakkanalyse som beskrevet i Grabstein et al. II supra. Celleantall ble bestemt i en coulter-teller. Polyklonal Ig-utskillelse ble bestemt ved hjelp av isotypespesifikke ELISA-analyser i 7-dagers kulturer med 1 X IO<6> B-celler pr. 2,0 ml kultur som beskrevet i Maliszewski et al. I supra og i Maliszewski et al. II supra.
Resultatene av B-celleproliferasjon ved hjelp av CVl-EBNA-celler transfektert med CD40-L eller tom vektor eller 7Al-celler (en T-cellehjelperklon), er vist i figurene 8, 10 og 12. Disse dataene viser at den største B-celleproliferasjon ble forårsaket av CD40-L. T-cellehjelperceller 7A1 og 7C2 hadde en minimal effekt på B-celleproliferasjon.
Effektene av forskjellige celler etter antigenspesifikk antistoffdannelse er vist i figurene 9 og 11. Figur 9 viser en sammenligning mellom plakkdannende celler hvor T-cellehjelperklon 7A1 og murine EL40.9-celler som utskiller en oppløselig CD40-L, sammenlignes. EL40.9-cellene synes å ha en inhibitoreffekt på antigenspesifikk antistoffdannelse. Figur 11 viser PFC (plakkdannende celler) for T-cellehjelperceller 7C2 og CVl-EBNA-celler transfektert med enten tom vektor eller CD40-L. Både 7C2-celler og membranbundet CD40-L stimulerte antigenspesifikk antistoffdannelse (PFC). I figur 13 sammenlignes antigenspesifikk antistoffdannelse av CD40-L og 7A1-celler i nærvær eller fravær av 10 ng/ml interleukin-2 (IL-2). IL-2 økte PFC for 7Al-celler, men økte ikke PFC forårsaket av membranbundet CD40-L.
Produksjon av polyklonalt lg ved hjelp av murine B-celler ble sammenlignet med hensyn på stimulering eller inhibering med membranbundet CD40-L, kontroll-CVl-EBNA-celler og hjelper-T-celler 7A1 i nærvær av cytokiner IL-4 (10 ng/ml) og IL-5 (1:40 fortynning av COS-cellesupernatanter) eller uten tilsatte cytokiner. Mengden av IgA, IgG3, IgE, IgG2b, IgM og IgGi er vist i henholdsvis tabellene 3-8.
Disse dataene indikerer at interaksjonen av CD40 med dens ligand er den viktigste molekylære interaksjon som er ansvarlig for T-cellekontaktavhengig induksjon av B-cellevekst og differensiering, både for antigenspesifikk antistoffproduksjon og polyklonal lg-sekresjon. Som sådanne tyder disse dataene på at antagonister for denne interaksjonen vil, ved hjelp av oppløselig CD40, CD40/Fc-fusjonsprotein og muligens oppløselig CD40-L (monomer), signifikant virke inn på utvik-ling av antistoffresponser. Kliniske situasjoner hvor CD40, CD40/Fc-fusjonsproteiner og oppløselig CD40-L kan anvendes, omfatter derfor allergi, lupus, reumatoid artritt, insulinavhengig diabetes mellitus og enhver annen sykdom hvor autoim-munantistoff eller antigen/antistoff-komplekser er ansvarlige for sykdommens kliniske patologi. Membranbundet CD40-L eller oligomer, oppløselig CD40-L vil dessuten være nyttig for å stimulere B-celleproliferasjon og antistoffproduksjon. Som sådanne er disse formene av CD40-L svært nyttige for vaksineadjuvanser og som et stimuleringsmiddel for mAb-sekresjon fra hybridomceller.
Eksempel 13
Dette eksemplet illustrerer effekten av membranbundet CD40-L etter proliferasjon av og IgE-sekresjon fra mononukleære celler fra perifert blod (E"). E-celler ble erholdt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 10 og inkubert i 7 eller 10 dager i nærvær av CVl-EBNA-celler transfektert med tom vektor eller mCD40-L-cDNA. I tillegg ble CD40/Fc-fusjonsprotein (beskrevet i eksempel 1) eller TNF-reseptor/Fc-fusjonsprotein (beskrevet i WO 91/03553) tilsatt til noen av preparatene som angitt i figur 14. IgE-sekresjon ble målt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 8, og B-celleproliferasjon ble målt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 10.
Resultatene for B-celleproliferasjon og IgE-sekresjon er vist i figur 14 for fem forskjellige konsentrasjoner av transfekterte CVl-EBNA-celler. Både B-celleproliferasjon og IgE-sekresjon ble økt i nærvær av membranbundet CD40-L. Tilsetning av CD40/Fc-fusjonsprotein fjernet både B-celleproliferasjon og IgE-sekresjon. TNF-reseptor/Fc-fusjonsproteinet hadde ingen effekt. Som en sammenligning for IgE-sekresjon ga tilsetning av IL-4 som kontroilmiddel (uten transfekterte CVl-EBNA-celler) ingen IgE i denne analysen, og tilsetning av IL-4 pluss G28-5-anti-CD40-mAb resulterte i 29,7 ng/ml IgE i denne analysen.
Eksempel 14
Dette eksemplet beskriver konstruksjon av en CD40-L/Fc-DNA-konstruksjon for å uttrykke et oppløselig CD40-L/FC-fusjonsprotein henvist til som CD40-L/FC2-konstruksjon. DNA som koder for CD40-L/FC2, omfatter sekvenser som koder for et lederpeptid (eller signalpeptid), en 8 aminosyrers hydrofil sekvens beskrevet av Hopp et al. (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988; henvist til som "Flag"), et egnet Fc-område i et immunglobulin, en [Gly4Ser] 3-gjentakelsessekvens (beskrevet i US patentskrift nr. 5 073 627) eller annen egnet linkersekvens, og det ekstracellulære område i human CD40-L fra aminosyre 50 til aminosyre 261 (sekvens med identifikasjonsnr. 11). En pDC406-ekspresjonsvektor inneholdende en ledersekvens, "Flag" og humant IgGi-Fc, fremstilles ved å bruke vanlige teknikker for enzymkutting og ligering av fragmenter som koder for en leder sekvens, "Flag" og humant IgGi-Fc, og ble begrenset med Nsi 1 og Not 1.
En PCR-teknikk (Sarki et al., Science 239:487, 1988) ble brukt under anvendelse av 5'- (oppstrøms) og 3'- (ned-strøms) oligonukleotidprimere for å amplifisere DNA-sekvensene som koder for CD40 ekstracellulært ligandbindingsdomene fra en kloningsvektor som inneholdt human CD40-L (ATCC 68873, sekvens med identifikasjonsnr. 11) for å danne et PCR-fragment. Den oppstrøms oligonukleotidprimer (sekvens med identifikasjonsnr. 13) innførte et Nsi I-sete oppstrøms fra en linkersekvens ( [Gly4Ser] 3SerSer) , som ble etterfulgt av 21 nukleotider fra det ekstracellulære domene i CD40-L (aminosyrene 51-57 i sekvens med identifikasjonsnr. 11). En nedstrøms oligonukleotidprimer (sekvens med identifikasjonsnr. 14) innførte et Not 1-sete like nedstrøms fra termineringskodonet i CD40-L. PCR-fragmentet ble så ligert i pDC406-ekspresjonsvektoren som inneholdt en ledersekvens, "Flag" og humant IgGi-Fc. Nukleo-tidet og den forutsagte aminosyresekvens til CD40-L/FC2 er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 15 og sekvens med iden-tif ikasjonsnr . 16. Den resulterende DNA-konstruksjon (CD40-L/FC2) ble transfektert i apenyrecellelinjen CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) . Konstruksjonen kodet for en oppløselig CD40-L som var i stand til å binde CD40, slik det ble bevist ved binding observert i fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse (FACS)
under anvendelse av celler som uttrykker CD40.
Storskalakulturer av humane embryonyre-293-celler (ATCC CRL 1573) transfektert med konstruksjonen som koder for CD40-L/FC2, ble dyrket for å akkumulere supernatant som inneholder CD40-L/FC2. 2 93-cellelinjen, en permanent linje av pri-mær, human embryonyre transformert med humant adenovirus 5-DNA, muliggjør ekspresjon av rekombinante proteiner ligert i pCD406-vektoren. CD40-L/FC2-fusjonsproteinet i supernatantvæske ble renset ved affinitetsrensing. I korte trekk ble kultur supe r na tant inneholdende CD40-L/FC2-fusjonsproteinet, renset ved filtrering av pattedyrcellesupernatanter (f.eks. i et 0,45 um filter) og tilførsel av filtrat til en antistoffaffi-nitetskolonne som omfatter biotinylert geite-anti-humant IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Westgrove, PA, USA) koblet til Streptavidin-agarose (Pierce Chemical, Rock-ford, IL, USA) ved 4°C, og ved en strømningshastighet på omtrent 60 til 80 ml/time for en 1,5 cm x 12,0 cm kolonne. Kolonnen ble vasket med omtrent 20 kolonnevolumer PBS {fosfatbufret saltoppløsning) inntil fritt protein ikke kunne påvises i vaskebuffer. Bundet fusjonsprotein ble eluert fra kolonnen med 12,5 mM sitratbuffer, 75 mM NaCl, pH 2,8, og brakt til pH 7 med 500 mM Hepes-buffer, pH 9,1. Det rensede, oligomere CD40-L/FC2-peptid induserte human B-celleproliferasjon i fravær av enhver kostimulus, og resulterte (sammen med det passende cytokin) i produksjonen av IgG, IgE, IgA og IgM, som beskrevet i eksempel 12 for membranbundet CD40-L.
Eksempel 15
Dette eksemplet beskriver konstruksjon av en CD40-L-DNA-konstruksjon for å uttrykke et oppløselig CD40-L-fusjonsprotein henvist til som trimer CD40-L. Trimer CD40-L inneholder en ledersekvens, en 33 aminosyrers sekvens henvist til som en "leucin-zipper" (sekvens med identifikasjonsnr. 17), og en 8 aminosyrers hydrofil sekvens beskrevet av Hopp et al.
(Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988; henvist til som "Flag"), etterfulgt av det ekstracellulære område i human CD40-L fra aminosyre 50 til aminosyre 261 (sekvens med iden-tif ikasjonsnr . 11). Utnyttbarheten av leder- og "Flag"-sekvensene er blitt beskrevet i den nærmere beskrivelse. Sekvensen
med 33 aminosyrer presentert i sekvens med identifikasjonsnr. 17, trimeriserer spontant i oppløsning. Fusjonsproteiner som omfatter denne sekvensen med 33 aminosyrer, forventes således å danne trimerer eller multimerer spontant.
Konstruksjonen fremstilles ved å syntetisere oligonukleotider som representerer en ledersekvens, sekvensen med 33 aminosyrer beskrevet ovenfor og "Flag"-sekvensen, så ligere sluttproduktet til et DNA-fragment som koder for aminosyrene 51-261 i sekvens med identifikasjonsnr. 11, fremstilt som beskrevet i eksempel 14.
Det resulterende ligeringsprodukt i ekspresjonsvektor pDC406 ble transfektert i apenyrecellelinjen CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). pDC406-plasmidet omfatter regulatorsekvenser avledet fra SV40, humant immunsviktvirus (HIV) og Epstein-Barr-virus (EBV). CV-l/EBNA-cellelinjen ble utvunnet ved transfeksjon av CV-1-cellelinjen med et gen som koder for Epstein-Barr-virus-kjerneantigen-1 (EBNA-1) som konstitutivt uttrykker EBNA-1 drevet fra det humane CMV-mellomprodukt-"early enhancer"/promoter. EBNA-l-genet muliggjør episomal replikasjon av ekspresjonsvektorer, slik som pDC406, som inneholder EBV-replikasjonsopprinnelsesstedet.
Når først celler som uttrykker fusjonskonstruksjonen er identifisert, dyrkes storskalakulturer av transfekterte celler for å akkumulere supematant fra celler som uttrykker trimer CD40-L. Det trimere CD4O-L-fusjonsprotein i supernatantvæske renses ved affinitetsrensing hovedsakelig som beskrevet i US patentskrift nr. 5 011 912. Sølvfargede SDS-geler av det eluerte CD4O-L-fusjonsprotein kan fremstilles for å bestemme renhet.
Claims (17)
1. Isolert DNA-sekvens som koder for et CD40-L-polypeptid som bindes til CD40,
karakterisert ved "at DNA-sekvensen er valgt fra gruppen bestående av: (a) nukleotidene 46-828, 184-828, 196-828 eller 193-762 i SEQ ID NO: 11, (b) DNA-sekvenser som påviselig hybridiserer til én av sekvensene ifølge (a) eller deres komplementære tråder under moderate stringensbetingelser, som koder for et protein med tilsvarende biologisk aktivitet sammenlignet med proteinet som er kodet for av DNA-sekvensen ifølge (a), hvori hybridiseringsbetingelsene omfatter forvasking med 5 x SSC,
0,5 % SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) og hybridiseringsinnkubering over natt i 5 x SSC ved 50'C, og (c) DNA-sekvenser som koder for aminosyrene 1-261 i SEQ ID NO: 12, aminosyrene 47-261 i SEQ ID NO: 12, aminosyrene 51-261 i SEQ ID NO: 12 og aminosyrene 50-239 i SEQ ID NO: 12.
2. Isolert DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den koder for et opp-løselig CD40-L-polypeptid.
3. Isolert DNA ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et DNA som koder for et leucin-zipperpeptid.
4. Isolert DNA ifølge krav 3, karakterisert ved at leucin-zipperpeptidet er et peptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 17.
5. Isolert DNA ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det ytterligere omfatter et DNA som koder for et immunoglobulin-Fc-område.
6. Rekombinant ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens som koder for et CD40-L-polypeptid ifølge krav 1 eller 2 .
7. Vertscelle,
karakterisert ved at den er transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 6.
8. Fremgangsmåte for fremstilling av et CD40-L-polypeptid,
karakterisert ved at en vertscelle ifølge krav 7 dyrkes under betingelser som fremmer ekspresjon, og CD40-L-polypeptidet utvinnes fra kulturen.
9. Renset, biologisk aktivt CD40-L-polypeptid, karakterisert ved at det består av en sekvens av aminosyrer som kodes for av en nukleotidsekvens ifølge krav 1 eller 2.
10. Renset, biologisk aktivt CD40-L-polypeptid, ifølge krav 9,
karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av: (a) polypeptidet definert ved aminosyrene fra og med 1 til og med 261 i sekvensen som er angitt i SEQ ID NO: 12, (b) polypeptidet definert ved aminosyrene fra og med 47 til og med 261 i sekvensen angitt i SEQ ID NO: 12, (c) et polypeptid definert ved aminosyrene fra og med 51 til og med 261 i sekvensen angitt i SEQ ID NO: 12, og (d) et fragment av (b) eller (c) som opprettholder biologisk aktivitet, som koder for et protein med tilsvarende biologisk aktivitet sammenlignet med proteinet som er kodet for av DNA-sekvensen ifølge krav 1(a).
11. Renset, biologisk aktivt CD40-L-polypeptid ifølge krav 10(b), 10(c) og 10(d),
karakterisert ved at CD40-L er en oppløselig CD4O-L-monomer.
12. Oppløselig CD4O-L-oligomer, karakterisert ved at oligomeren omfatter to eller flere polypeptider ifølge krav 10.
13. Anvendelse av oppløselig CD4 0-L-polypeptid ifølge krav 10 for fremstilling av et medikament for behandling av allergi, en allergisk reaksjon, lupus, reumatoid artritt eller transplantat-mot-vertsykdom.
14. Anvendelse av oppløselig CD40-L-polypeptid ifølge krav 11 for fremstilling av et medikament for stimulering av polyklonal lg sekresjon fra B-celler, stimulering av antigenspesifikk antistoffproduksjon fra B-celler, stimulering av proliferasjon av B-celler, og som en vaksineadjuvans.
15. CD40-L-fusjonsprotein,
karakterisert ved at det omfatter et CD40-L-polypeptid ifølge ethvert av kravene 9 - 12 og et immunoglobu-1in-Fc-område.
16. CD40-L-fusjonsprotein,
karakterisert ved at det omfatter et CD40-L-polypeptid ifølge ethvert av kravene 9 - 12 og en leucin-zipper.
17. Farmasøytisk preparat,
karakterisert ved at det omfatter et CD40-L-polypeptid, CD40-L-fusjonsprotein eller CD4 0-L-oligomer ifølge ethvert av kravene 9 - 12, 15 og 16 og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærer eller eksipiens.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US78370791A | 1991-10-25 | 1991-10-25 | |
US80572391A | 1991-12-05 | 1991-12-05 | |
PCT/US1992/008990 WO1993008207A1 (en) | 1991-10-25 | 1992-10-23 | Novel cytokine |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO941422D0 NO941422D0 (no) | 1994-04-19 |
NO941422L NO941422L (no) | 1994-06-27 |
NO317625B1 true NO317625B1 (no) | 2004-11-29 |
Family
ID=27120174
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19941422A NO317625B1 (no) | 1991-10-25 | 1994-04-19 | Ligand til CD40 reseptoren, DNA, Vektor, Vertcelle, Fremgangsmate for fremstilling, Protein og Farmasoytisk preparat. |
NO19980030A NO320073B1 (no) | 1991-10-25 | 1998-01-05 | Antistoffer som binder CD40-L |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19980030A NO320073B1 (no) | 1991-10-25 | 1998-01-05 | Antistoffer som binder CD40-L |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0897983B1 (no) |
JP (2) | JP3308534B2 (no) |
KR (1) | KR100283541B1 (no) |
AT (2) | ATE239790T1 (no) |
AU (1) | AU661360B2 (no) |
CA (2) | CA2121798C (no) |
DE (2) | DE69233051T2 (no) |
DK (3) | DK0667901T4 (no) |
ES (2) | ES2198025T3 (no) |
FI (2) | FI116850B (no) |
HK (1) | HK1019343A1 (no) |
NO (2) | NO317625B1 (no) |
WO (1) | WO1993008207A1 (no) |
Families Citing this family (75)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5716805A (en) * | 1991-10-25 | 1998-02-10 | Immunex Corporation | Methods of preparing soluble, oligomeric proteins |
US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
US7405270B2 (en) | 1991-10-25 | 2008-07-29 | Immunex Corporation | CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation |
US5981724A (en) * | 1991-10-25 | 1999-11-09 | Immunex Corporation | DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40 |
US7070777B1 (en) * | 1991-11-15 | 2006-07-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein |
US5474771A (en) | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
US6472510B1 (en) | 1992-02-14 | 2002-10-29 | Bristol-Myers Squibb Company | CD40 receptor ligands |
US5874082A (en) * | 1992-07-09 | 1999-02-23 | Chiron Corporation | Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation |
US5397703A (en) | 1992-07-09 | 1995-03-14 | Cetus Oncology Corporation | Method for generation of antibodies to cell surface molecules |
AU5098493A (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-15 | Schering Corporation | Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40 |
US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
DE69423806T2 (de) * | 1993-01-22 | 2000-08-17 | Kanegafuchi Chemical Ind | Therapeutisches Agens für NIDDM |
ES2211876T3 (es) * | 1993-01-22 | 2004-07-16 | Immunex Corporation | Deteccion y tratamiento de mutaciones en un gel del ligando de cd40. |
NZ273208A (en) * | 1993-09-02 | 2000-12-22 | Dartmouth College | Suppressing a humoral immune response against a thymus dependant (TD) antigen |
ZA946765B (en) | 1993-09-02 | 1996-02-15 | Dartmouth College | Methods of prolonged suppression of humoral immunity |
WO1995006481A1 (en) | 1993-09-02 | 1995-03-09 | Trustees Of Dartmouth College | Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance |
US5869049A (en) * | 1993-09-02 | 1999-02-09 | Trustees Of Dartmouth College | Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists |
WO1995014487A1 (en) * | 1993-11-24 | 1995-06-01 | The Australian National University | Treatment of viral disease with cd40l peptide |
ATE267607T1 (de) * | 1993-12-23 | 2004-06-15 | Immunex Corp | Verwendung von löslichen oligomerischen cd40 liganden oder monoklonalen antikörpern zur herstellung eines arzneimitells zur vorbeugung oder behandlung von neoplastischen krankheiten |
US5683693A (en) * | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
CA2188165C (en) | 1994-04-28 | 2007-08-28 | Marilyn Kehry | Methods for proliferating and differentiating b cells, and uses thereof |
PT812206E (pt) * | 1995-03-01 | 2002-11-29 | Immunex Corp | Proteina de ligacao a cd40 para estimulacao de uma resposta imunitaria |
AU2556195A (en) | 1995-03-13 | 1996-10-02 | Regents Of The University Of Michigan, The | CD40 binding compositions and methods of using same |
DE69631331T2 (de) * | 1995-06-07 | 2004-11-18 | Immunex Corp., Seattle | Cd40l mutein |
JPH11508262A (ja) * | 1995-06-22 | 1999-07-21 | バイオジェン,インコーポレイテッド | Cd40リガンドのフラグメントの結晶およびその使用 |
US6440418B1 (en) | 1995-11-07 | 2002-08-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies |
US6001358A (en) | 1995-11-07 | 1999-12-14 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof |
US6340459B1 (en) | 1995-12-01 | 2002-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients |
AU3570797A (en) * | 1996-06-14 | 1998-01-07 | University Of Washington | Absorption-enhanced differential extraction device |
NZ333607A (en) * | 1996-07-10 | 2000-08-25 | Immunex Corp | Method of stimulating the immune system by transfecting dendritic cells |
US6017527A (en) * | 1996-07-10 | 2000-01-25 | Immunex Corporation | Activated dendritic cells and methods for their activation |
US7070771B1 (en) | 1996-12-09 | 2006-07-04 | Regents Of The University Of California | Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells |
US6271349B1 (en) | 1996-12-23 | 2001-08-07 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-κB |
DE69738841D1 (de) | 1996-12-23 | 2008-08-28 | Immunex Corp | Ligand für rezeptor aktivator of nf-kappa b, ligand ist mitglied der tnf superfamilie |
EP2009025B1 (en) | 1998-05-14 | 2011-07-27 | Immunex Corporation | Method of inhibiting osteoclast activity |
MEP42108A (en) | 1998-10-23 | 2011-02-10 | Kiren Amgen Inc | Dimeric thrombopoietin peptide mimetics binding to mp1 receptor and having thrombopoietic activity |
US7300774B1 (en) | 1999-12-09 | 2007-11-27 | The Regents Of The University Of California | Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands |
EP1067194A1 (en) * | 1999-04-16 | 2001-01-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Vectors containing a gene coding for CD40 and/or CD40L under the control of a cytokine-inducible promoter which is a human acute phase amyloid A gene promoter. Methods for their production and uses thereof |
EP1173589A1 (en) * | 1999-04-16 | 2002-01-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof |
AU6934600A (en) * | 1999-08-27 | 2001-03-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cd40 ligand and cd40 agonist compositions and methods of use |
GB9927757D0 (en) * | 1999-11-25 | 2000-01-26 | Kennedy Rheumatology Inst | Treatment of autoimmune diseases |
WO2001079555A2 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Roles of jak/stat family members in tolerance induction |
BR0110779A (pt) | 2000-05-12 | 2005-01-11 | Beth Israel Hospital | Composições e métodos para adquirir supressão imunológica |
DE60143535D1 (de) | 2000-10-02 | 2011-01-05 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Humane antikörper gegen cd40 |
WO2002036769A2 (en) * | 2000-10-31 | 2002-05-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acids encoding cd40/cd40l chimeric polypeptides, methods for their production and uses thereof |
US6586245B2 (en) | 2001-07-18 | 2003-07-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of CD40 ligand expression |
US20050054565A1 (en) * | 2001-07-31 | 2005-03-10 | John Lucas | Agonists and antagonists of moxifin for the treatment of metabolic disorders |
PL232477B1 (pl) | 2001-09-20 | 2019-06-28 | Immunex Corp | System ekspresji gospodarza i sposób wytwarzania heteromerycznego kompleksu |
US7786282B2 (en) | 2001-12-06 | 2010-08-31 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain |
US7495090B2 (en) | 2002-05-23 | 2009-02-24 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acids encoding chimeric CD154 polypeptides |
WO2004074439A2 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | Biogen Idec Ma Inc. | An expression cassette and vector for transient or stable expression of exogenous molecules |
WO2006033702A2 (en) | 2004-07-26 | 2006-03-30 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-cd154 antibodies |
US8513008B2 (en) * | 2004-10-07 | 2013-08-20 | Argos Therapeutics, Inc. | Mature dendritic cell compositions and methods for culturing same |
KR101243577B1 (ko) | 2004-10-07 | 2013-03-20 | 아고스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 | 성숙 수지상 세포 조성물 및 그의 배양 방법 |
JP5553963B2 (ja) | 2004-10-22 | 2014-07-23 | アムジエン・インコーポレーテツド | 組換え抗体をリフォールディングする方法 |
AU2007294731B2 (en) | 2006-09-13 | 2014-04-17 | Abbvie Inc. | Cell culture improvements |
EP2500415A1 (en) | 2006-09-13 | 2012-09-19 | Abbott Laboratories | Cell culture improvements |
EP2517723B1 (en) | 2006-09-18 | 2019-11-06 | The Board of Trustees of The University of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses |
MX2010002683A (es) | 2007-09-14 | 2010-03-26 | Amgen Inc | Poblaciones de anticuerpos homogeneos. |
BRPI0818736A2 (pt) | 2007-10-30 | 2017-06-13 | Univ Arkansas | composições e métodos para intensificar imunorrepostas à bactéria flagelada |
HUE047164T2 (hu) | 2007-11-01 | 2020-04-28 | Univ Arkansas | Kompozíciók és eljárások eimeria elleni immunválasz fokozására |
KR20100113112A (ko) | 2008-01-15 | 2010-10-20 | 아보트 러보러터리즈 | 개선된 포유동물 발현 벡터 및 이의 용도 |
EP3255153A1 (en) | 2009-11-17 | 2017-12-13 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Methods for enhanced protein production |
EP2525817B8 (en) | 2010-01-21 | 2017-09-20 | The Board of Trustees of The University of Arkansas | Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses |
HUE046858T2 (hu) | 2010-06-09 | 2020-03-30 | Univ Arkansas | Vakcina és eljárások campylobacter fertõzés csökkentésére |
MY173328A (en) | 2013-02-14 | 2020-01-16 | Texas A & M Univ Sys | Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria or limiting eimeria infection |
US10023608B1 (en) | 2013-03-13 | 2018-07-17 | Amgen Inc. | Protein purification methods to remove impurities |
EA033538B1 (ru) | 2013-03-15 | 2019-10-31 | Univ Arkansas | Композиции и способы усиления иммунного ответа на кишечные патогены |
JP2018521983A (ja) | 2015-07-16 | 2018-08-09 | バイオカイン セラピューティックス リミテッド | がんを治療するための組成物および方法 |
MY188405A (en) | 2015-08-05 | 2021-12-08 | Janssen Biotech Inc | Anti-cd154 antibodies and methods of using them |
WO2017083604A1 (en) | 2015-11-12 | 2017-05-18 | Amgen Inc. | Triazine mediated pharmacokinetic enhancement of therapeutics |
TWI758288B (zh) | 2016-05-03 | 2022-03-21 | 阿肯色州大學董事會 | 包含免疫刺激性及抗原性多肽的酵母菌疫苗載體以及其使用方法 |
KR102439719B1 (ko) | 2016-05-11 | 2022-09-02 | 암젠 인크 | 글루타민 합성효소 유전자내 상보성 벡터를 사용한 높은 수준의 헤테로머 단백질을 발현하는 세포의 직접적인 선택 |
JP7121029B2 (ja) * | 2017-02-27 | 2022-08-17 | シャタック ラボ,インコーポレイテッド | Csf1rベースのキメラタンパク質 |
JP7260477B2 (ja) | 2017-02-27 | 2023-04-18 | シャタック ラボ,インコーポレイテッド | Tigit及びlightベースのキメラタンパク質 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2089229C (en) * | 1992-02-14 | 2010-04-13 | Alejandro A. Aruffo | Cd40cr receptor and ligands therefor |
US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
-
1992
- 1992-10-23 JP JP50789793A patent/JP3308534B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-23 AU AU31226/93A patent/AU661360B2/en not_active Expired
- 1992-10-23 DK DK92925017T patent/DK0667901T4/da active
- 1992-10-23 ES ES98113461T patent/ES2198025T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 EP EP98113461A patent/EP0897983B1/en not_active Revoked
- 1992-10-23 DK DK98113461T patent/DK0897983T3/da active
- 1992-10-23 DE DE69233051T patent/DE69233051T2/de not_active Revoked
- 1992-10-23 ES ES92925017T patent/ES2227513T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 AT AT98113461T patent/ATE239790T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-23 WO PCT/US1992/008990 patent/WO1993008207A1/en active IP Right Grant
- 1992-10-23 EP EP92925017A patent/EP0667901B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 CA CA002121798A patent/CA2121798C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-23 DE DE69233402T patent/DE69233402T3/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-23 AT AT92925017T patent/ATE274055T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-23 DK DK97117514T patent/DK0822199T3/da active
- 1992-10-23 CA CA002312667A patent/CA2312667C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-23 KR KR1019940701285A patent/KR100283541B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-04-19 NO NO19941422A patent/NO317625B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-04-20 FI FI941837A patent/FI116850B/fi active IP Right Grant
-
1997
- 1997-11-19 JP JP9318110A patent/JP2877788B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-05 NO NO19980030A patent/NO320073B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 FI FI981765A patent/FI116828B/fi not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-08-24 HK HK99103655A patent/HK1019343A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0667901B1 (en) | Novel cytokine | |
US6410711B1 (en) | DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40 | |
US7309489B1 (en) | Mouse CD40 ligand-specific antibodies and hybridomas | |
US5962406A (en) | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same | |
US5783665A (en) | Cytokine which is a ligand for OX40 | |
EP0662077B1 (en) | Cd27 ligand | |
EP0615451B1 (en) | Novel cytokine that binds cd30 | |
US5674704A (en) | Cytokine designated 4-IBB ligand | |
US6355779B1 (en) | Cytokine designated 4-1BB ligand antibodies and human receptor that binds thereto | |
US7138500B1 (en) | Antibodies to human 4-1BB | |
US7405270B2 (en) | CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation | |
EP0804482A1 (en) | Cytokines that bind the cell surface receptor hek | |
ES et al. | NEUE CYTOKINE NOUVELLE CYTOKINE |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |