NO320073B1

NO320073B1 - Antistoffer som binder CD40-L

Info

Publication number: NO320073B1
Application number: NO19980030A
Authority: NO
Inventors: Richard J Armitage; William C Fanslow; Melanie K Spriggs; Subhashini Srinivasan
Original assignee: Immunex Corp
Priority date: 1991-10-25
Filing date: 1998-01-05
Publication date: 2005-10-17
Also published as: ES2227513T5; AU661360B2; DE69233402T2; DK0667901T4; EP0897983B1; NO980030L; CA2312667A1; ES2227513T3; NO317625B1; JPH07504083A; EP0667901B1; DK0822199T3; ES2198025T3; WO1993008207A1; DE69233402T3; EP0897983A2; DE69233402D1; DK0897983T3; FI941837A0; JPH10150994A

Description

Oppfinnelsens tekniske område

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert antistoff som er immunoreaktivt med CD40-L samt isolert antistoff som er immunoreaktivt med murin CD40-L.

Oppfinnelsens bakgrunn

Cytokiner som har en "Interleukin"-betegnelse, er de proteinfaktorene som påvirker immuneffektorceller. Cytokiner betegner interleukin-1 til interleukin-12, er blitt rapportert og navngitt som et interleukin. Andre kjente cytokiner omfatter tumornekrosefaktor (TNF), granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), mastcellevekstfaktor (MGF), epidermal vekstfaktor (EGF), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), nervevekstfaktor (NGF) , erytropoietin (EPO), y-interferon (y-IFN) og andre.

DNA-er for to forskjellige TNF-reseptorer (type I og type II) er blitt klonet (Smith et al., Science 248:1019,

1990; og Schall et al., Cell 61:361, 1990). Begge formene av TNF-reseptor er beslektet med hverandre og tilhører en familie av reseptorer med medlemmer som omfatter nervevekstfaktor-reseptor (Johnson et al., Cell 47:545, 1986), B-celleantigen CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 6:1403, 1989), T-celleantigen OX40 (Mallett et al., EMBO J. 3:1063, 1990), humant Fas-antigen (Itoh et al., Cell 66:233, 1991) og murin 4-1BB-reseptor (Kwon et al., Cell Immunol. 221:414, 1989 [Kwon et al. I] og Kwon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:1963, 1989 [Kwon et al. II]).

Humant CD40-protein (CD40) er et peptid med

277 aminosyrer som har en molekylvekt på 30.600, og et 19 aminosyrers sekresjonssignalpeptid som omfatter hovedsakelig hydrofobe aminosyrer (Stamenkovic et al.). Molekylvek-ten (uten glykosylering) til det ferdig utviklede, humane CD40-protein er 28.300. Det ble isolert en cDNA som koder for humant CD40, fra et cDNA-bibliotek fremstilt fra Burkitt lym-fomcellelinje Raji. Det antatte protein som kodes for av CD40-cDNA-en, inneholder en antatt ledersekvens, et transmembranområde og en rekke andre trekk som er felles for membranbundne

reseptorproteiner. CD40 er blitt funnet å bli uttrykt på B-lymfocytter, epitelceller og noen karsinomcellelinjer.

Et monoklonalt antistoff (mAb) rettet mot CD40, er blitt påvist å mediere forskjellige funksjonelle effekter av humane B-celler. Disse effektene omfatter: (a) homotypiske adhesjoner (Gordon et al., J. Immunol. 140:1425, 1988 [Gordon et al. I]; (b) forøkt cellestørrelse (Gordon et al. I og Valle et al., Eur. J. Immunol. 13:1463, 1989); (c) proliferasjon av B-celler aktivert med anti-IgM, anti-CD20-mAb, forbolester alene (Clark et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:4494, 1986; og Paulie et al., J. Immunol. 142:590, 1989), eller forbolester kombinert med interleukin-4 (Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17:1535, 1987 [Gordon et al. II]; og (d) produksjon av IgE (Jabara et al., J. Exp. Med. 172:1861, 1990; Zhang et al., J. Immunol. 146:1836, 1991) og IgM (Gascan et al., J. Immunol. 147:8, 1991) fra T-uttømte kulturer stimulert med interleukin-4 (IL-4).

Ett slikt antistoff, kalt mAb 89 av Banchereau et al., Clin. Immunol. Spectrum 3:8, 1991 [Banchereau et al. I], ble funnet å indusere proliferasjon av human B-celle ved for-holdsvis lav antistoff konsentrasjon (30 ng/ml eller ca. 10~<10>M). Proliferasjon varte i to til tre uker og resulterte i en ti gangers forøkelse av populasjonen av human B-celle. Optimal stimulering av B-cellene inntrådte når CD40-overflatemolekylet ble kryssbundet ved hjelp av IgM. Fab-fragmenter av et annet anti-CD40-mAb induserte bare en svak proliferativ respons. Videre rapporterte Banchereau et al., Science 251:70, 1991 [Banchereau et al. II] at hvilende, humane B-celler kom inn i en tilstand av langvarig proliferasjon når de ble inkubert med både en murin fibroblast-Ltk"-cellelinje som var transfektert med human Fc-reseptor, og med et monoklonalt antistoff som er spesifikt for humant CD40. Banchereau et al. II fant at kryssbundet CD40 er nødvendig for klonal forøkelse av B-celler.

CD23 er en lavaffinitets IgE-reseptor som er blitt funnet å uttrykkes på de fleste IgM"/IgD" fullt utviklede B-celler, men ikke T-celler. CD23 er blitt sekvensert, og dens sekvens ble beskrevet i Kikutani et. al., Cell 47:657, 1986. Oppløselig CD23 (sCD23) ble funnet å indusere en pyrogen reak sjon hos kaniner, og denne reaksjonen ble motvirket ved administrering av humant IgE (Ghaderi et al., Immunology 73:510, 1991). CD23 kan derfor være en passende markør for effekter av oppløselig CD40 eller CD40-L.

Før foreliggende oppfinnelse var en ligand for CD40 ukjent. Det er derfor et behov innen teknikken for å identi-fisere og karakterisere en CD40-ligand (CD40-L).

Oppsummering av oppfinnelsen

Et nytt cytokin, heretter henvist til som "CD40-L", er blitt isolert ogkarakterisert. Nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens til representativ, murin CD40-L-cDNA er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 1 og figur 1, og aminosyresekvensen er også angitt i sekvens med identifikasjonsnr. 2. Nukleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens til representativ, human CD40-L-cDNA er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 11 og figur 2, og aminosyresekvensen er også angitt i sekvens med identifikasjonsnr. 12. Foreliggende oppfinnelse omfatter således isolert antistoff som er immunoreaktivt med CD40-L, kjennetegnet ved at CD40-L er et polypeptid som angitt fra aminosyre 1 til og med 261 i sekvensen som angitt i SEQ.ID.NR.: 12. Også omfattet av oppfinnelsen er isolert antistoff som er immunoreaktivt med murin CD40-L, kjennetegnet ved at det murine CD40-L er et polypeptid som angitt fra og med aminosyrene 1 til og med 260 som angitt i SEQ.ID.NR.: 2.

CD40-L er et membranpolypeptid av type II med et ekstracellulært område i sin C-ende, et transmembranområde og et intracellulært område i sin N-ende. En oppløselig versjon av murin CD40-L er blitt funnet i supernatanter fra EL-4-celler og EL-4-celler sortert på grunnlag av et biotinylert CD40/Fc-fusjonsprotein beskrevet her. Oppløselig CD40-L omfatter et ekstracellulært område i CD40-L eller et fragment derav. Proteinsekvensen til murin CD40-L er beskrevet i figur 1 og sekvens med identifikasjonsnr. 2, og human CD40-L i figur 2 og sekvens med identifikasjonsnr. 12. Det ekstracellulære område i murin CD40-L strekker seg fra aminosyre 47 til aminosyre 260 i figur 1 og sekvens med identifikasjonsnr. 2, og i human CD40-L fra aminosyre 47 til aminosyre 261 i figur 2 og sekvens med identifikasjonsnr. 12. Biologisk aktivitet av CD40-L medieres ved binding av dette cytokinet til CD4 0 og omfatter B-celleproliferasjon og induksjon av antistoffsekresjon, inkludert IgE-sekresjon.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 illustrerer nukleotid- og aminosyresekvenser som tilsvarer murin CD40-L. Dette proteinet er et polypeptid av type II som har sin N-ende som sitt intracellulære domene, etterfulgt av et transmembranområde, og et ekstracellulært domene i C-enden til polypeptidet. Det ekstracellulære domene som er lenger enn enten det intracellulære domene eller trans-membranområdet, inneholder ett potensielt N-bundet glykosyler-ingssete og to potensielle disulfidbindinger på grunn av fire cysteinrester (Cys). Figur 2 illustrerer nukleotid- og aminosyresekvenser som tilsvarer human CD40-L. Dette proteinet er et polypeptid av type II som har sin N-ende som sitt intracellulære domene, etterfulgt av et transmembranområde, og et ekstracellulært domene i C-enden til polypeptidet. Det ekstracellulære domene, som er lenger enn enten det intracellulære domene eller transmembranområde t, inneholder 1 potensielt N-bundet glykosyler-ingssete og 2 potensielle disulfidbindinger på grunn av 5 cysteinrester (Cys). Figur 3 illustrerer en sammenligning mellom protein-sekvenser til humant og murin C.D40-L som oppviser 77,7% homo-logi på aminosyrenivå. Figur 4 illustrerer proliferasjon av T-celleuttømte, mononukleære celler fra humant, perifert blod (PBMC) forårsaket av inkubasjon med CVl-celler transfektert med fullengde murin CD40-L-cDNA (sekvens med identifikasjonsnr. 1) og som uttrykker bundne CD40-L (CD40-L<+>CVl-celler) sammenlignet med CVl-celler transfektert med tom vektor (HAVEO) og som ikke uttrykker bundet, murin CD40-L. Proliferasjonsresultatene på dag 7 viser at CD40-L<+>CVl-celler øker proliferasjon av T-celleuttømt PBMC vesentlig i nærvær eller fravær av interleukin-4 (IL-4). Figur 5 illustrerer en andre bestemmelse av T-celle-uttømt PBMC-proliferasjon ved tilsetning av bundet, murin CD40-L og 10 mg/ml IL-4. Disse data oppviser ingen komitogen effekt av IL-4, men fortsatt sterk mitogen effekt av bundet CD40-L. Figur 6 illustrerer at bundet CD40-L øker IgE-sekresjon. Figur 7 illustrerer at membranbundet CD40-L stimulerer CD23-utgytelse i nærvær av IL-4. Figur 8 illustrerer proliferasjon av murine milt-B-celler forårsaket av membranbundet, murin CD40-L eller 7A1-celler, som er en hjelper-T-celleklon. Figur 9 illustrerer en sammenligning av murine EL40.9-celler, en utsortert cellelinje som ble utsortert på grunnlag av ekspresjon av murin CD40-L, og T-celler 7A1 for induksjon av en antigenspesifikk respons angitt ved hjelp av plakkdannende celler (PFC) ved hjelp av røde anti-saue-blodlegemer (SCBC). Figur 10 illustrerer en sammenligning av B-celleproliferativ aktivitet av membranbundet CD40-L og andre celle-typer transfektert med forskjellige cDNA-er. Membranbundet CD40-L oppviste signifikant mer B-celleproliferativ aktivitet enn en hjelpercelleklon eller andre kontrollceller. Figur 11 illustrerer at 7C2-celler (en hjelper-T-celleklon) og CVl-celler transfektert med murin CD40-L-cDNA, in-duserer anti-SRBC-plakkdannende celler. Figur 12 illustrerer en sammenligning mellom to hjelper-T-cellekloner og celler som uttrykker membranbundet CD40-L for induksjon av murin B-celleproliferasjon. Figur 13 illustrerer induksjon av antigenspesifikke, plakkdannende celler ved hjelp av membranbundet CD4 0-L og en hjelper-T-celleklon i nærvær eller fravær av tilsatt interleukin-2 (IL-2). Figur 14 viser effekter av membranbundet CD40-L-sti-mulerende B-celleproliferasjon og IgE-sekresjon. Effektene av membranbundet CD40-L ble inhibert med CD40-reseptor, men ikke med TNF-reseptor.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Nye polypeptider som kan virke som en ligand for murint og humant CD40, er blitt isolert og sekvensert. Nærmere bestemt har cDNA-er som koder for disse ligandene, blitt klonet og sekvensert. Videre er det tilveiebrakt fremgangsmåter for ekspresjon av rekombinante CD40-L-polypeptider. CD40-L-polypeptid omfatter andre former av pattedyr-CD40-L, slik som derivater eller analoger av human eller murin CD40-L. Murin og human CD40-L omfatter henholdsvis et 214 og 215 aminosyrers ekstracellulært område i C-enden til fullengde, membranbundet polypeptid. Det ekstracellulære område inneholder domenet som bindes til CD40. Murin og human CD40-L omfatter videre et homologt, hydrofobt 24 aminosyrers transmembranområde som er delineært på hver side ved tilføyde amino-yrer og et 22 aminosyrers intracellulært område i sine N-ender. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fullengde CD40-L-polypeptider eller fragmenter derav som omfatter hele eller en del av det ekstracellulære område eller derivater av det ekstracellulære område og pattedyrceller transfektert med en cDNA som koder for murin eller human CD40-L og uttrykker human eller murin CD40-L som et membranbundet protein.

Det nye cytokinet som her er beskrevet, er en ligand for CD40, en reseptor som er et medlem i TNF-reseptorsuper-familien. CD40-L vil derfor sannsynligvis være ansvarlig for transduksjon av signal via CD40, som er kjent for å bli uttrykt f.eks. av B-lymfocytter. Fullengde CD40-L er et membranbundet polypeptid med et ekstracellulært område i sin C-ende, et transmembranområde og et intracellulært område i sin N-ende. En oppløselig versjon av CD40-L kan lages fra det ekstracellulære område eller et fragment derav, og en oppløselig CD40-L er blitt funnet i kultursupernatanter fra celler som uttrykker en membranbundet versjon av CD40-L. Proteinsekvensen i det ekstracellulære område av murin CD40-L strekker seg fra aminosyre 47 til aminosyre 260 i figur 1 og sekvens med iden-tif ikasjonsnr . 2. Proteinsekvensen i det ekstracellulære området av human CD40-L strekker seg fra aminosyre 47 til aminosyre 2 61 i figur 2, og sekvens med identifikasjonsnr. 12. Den biologiske aktivitet av CD40-L medieres ved binding til CD40 eller en artsspesifikk homolog derav og omfatter proliferasjon av B-celler og induksjon av immunglobulinsekresjon fra aktiverte B-celler. CD40-L (inkludert oppløselige monomer-og oligomerformer, samt membranbundne former) kan bevirke B-celleproliferasjon og immunglobulinsekresjon (bortsett fra IgE-sekresjon) uten tilstedeværelse av tilsatt IL-4, i motset-ning til anti-CD40-antistoffer som krever IL-4 og kryssbinding for å mediere aktivitet.

CD40-L henviser til en slekt polypeptider som er i stand til å binde CD40, eller pattedyrhomologer av CD40. Slik det her er brukt, omfatter uttrykket "CD40-L" oppløselige CD40-L-polypeptider som mangler transmembran- og intracellulære områder, pattedyrhomologer av human CD40-L, analoger av human eller murin CD40-L eller derivater av human eller murin CD40-L.

CD40-L kan også fås ved mutasjoner av nukleotidsek-venser som koder for et CD40-L-polypeptid. En CD40-L-analog slik den er henvist til her, er et polypeptid som i det vesentlige er homologt med en sekvens av human eller murin CD40-L, men som har en aminosyresekvens som er forskjellig fra naturlig forekommende sekvens CD40-L-polypeptid (human eller murin art) på grunn av én eller flere delesjoner, innføyelser eller utbyttinger. Analoger av CD40-L kan syntetiseres fra DNA-konstruksjoner fremstilt ved oligonukleotidsyntese og • ligering eller ved teknikker med setespesifikk mutagenese. Den primære aminosyrestruktur i human eller murin CD40-L kan modifiseres for å skape CD40-L-derivater ved å danne kovalente eller aggregasjonskonjugater med andre kjem-iske rester, slik som glykosylgrupper, lipider, fosfat, ace-tylgrupper og lignende, eller ved å skape aminosyresekvensmut-anter. Kovalente derivater av CD40-L fremstilles ved å binde bestemte, funksjonelle grupper til CD40-L-aminosyresidekjeder eller i N-enden eller C-enden til et CD40-L-polypeptid eller det ekstracellulære domene derav. Andre derivater av CD40-L innenfor omfanget av denne oppfinnelsen omfatter kovalente og aggregasjonskonjugater av CD40-L eller dens fragmenter med andre proteiner eller polypeptider, slik som en syntese i rekombinant kultur som N-ende- eller C-endefusjoner. Konjugatet kan således omfatte en signal- eller lederpolypeptidsekvens i N-endeområdet eller C-endeområdet i et CD40-L-polypeptid som kotranslasjonelt eller posttranslasjonelt styrer overføring av konjugatet fra dets syntesested til et sted innenfor eller utenfor cellemembranen eller celleveggen (f.eks. a-faktor-lederen til Saccharomyces). CD40-L-polypeptidfusjoner kan omfatte polypeptider tilsatt for å lette rensing og identifika-sjon av CD40-L (f.eks. poly-His), eller fusjoner med andre cytokiner for å tilveiebringe nye, flerfunksjonene enheter. Andre cytokiner omfatter f.eks. hvilke som helst av inter-leukinene 1-13, TNF (tumornekrosefaktor), GM-CSF (granulo-cyttmakrofag-kolonistimulerende faktor), G-CSF (granulocytt-kolonistimulerende faktor), MGF (mastcellevekstfaktor) , EGF (epidermvekst-faktor), PDGF (blodplateavledet vekstfaktor), NGF (nervevekstfaktor), EPO (erytropoietin), y- IFN (gamma-interferon), 4-1BB-L (4-lBB-ligand) og andre cytokiner som påvirker immuncellevekst, differensiering eller funksjon.

■ Nukleinsyresekvenser som beskrevet heri omfatter DNA-og/eller RNA-sekvenser som hybridiserer til nukleotidsekvensen ifølge sekvens med identifikasjonsnr. 1 eller sekvens med identifikasjonsnr. 11 eller de komplementære tråder, under middels eller svært strenge betingelser. Middels strenge hybridiseringsbetingelser henviser til betingelser beskrevet i f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., vol. 1, s. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) . Middels strenge betingelser omfatter, som definert av Sambrook et al., bruk av en forvaskoppløsning av 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) og hybridiseringsbetingelser på 50°C, 5 X SSC, over natten. Svært strenge betingelser omfatter høyere hybridiserings- og vasketemperaturer.

Biologisk aktivitet av CD40-L kan bestemmes f.eks. ved konkurranse med hensyn på binding til ligandbindingsdomenet i CD40 (dvs. kompetitive bindingsanalyser). Både murin CD40-L og human CD40-L bindes til humant CD40. Bindingsaffiniteten til murin CD40-L (uttrykt på utsorterte, murine EL-40.9-celler) for humant CD40 var omtrent 1,74 x IO<9>M"<1>. Likeledes var bindingsaffiniteten til murin CD40-L (uttrykt på usor-terte, murine EL-46.1-celler) for humant CD40 omtrent 2,3 xIO<9>M"<1>. Begge bindingsaffinitetsmålingene er innenfor et område som er typisk for binding mellom cytokin og cytokinresep-tor.

Ved én form for en kompetitiv bindingsanalyse for CD40-L-polypeptid anvendes en radioaktivt merket, oppløselig, murin CD40-L ifølge figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) eller human CD40-L ifølge figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11), og intakte celler som uttrykker CD40 (f.eks. humane B-celler). I stedet for intakte celler vil man kunne bytte ut oppløselig CD40 (slik som et CD40/Fc-fusjonsprotein) bundet til en fast fase gjennom en interaksjon mellom protein A eller protein G og Fc-området i fusjonsproteinet. Ved en annen form for en kompetitiv bindingsanalyse benyttes radioaktivt merket, oppløselig CD40, slik som et CD40/Fc-fusjonsprotein, og intakte celler som uttrykker CD40-L. Alternativt vil oppløselig CD4 0-L kunne bindes til en fast fase.

Kompetitive bindingsanalyser kan utføres ved å bruke standard metodikk. For eksempel kan radioaktivt merket murin CD40-L brukes til å konkurrere med en antatt CD40-L-homolog for å analysere med hensyn på bindingsaktivitet mot overflate-bundet CD40. Kvalitative resultater kan oppnås ved hjelp av kompetitive bindingsanalyser med autoradiografisk plate, eller Scatchard-plottinger kan benyttes til å frembringe kvantitative resultater.

Kompetitive bindingsanalyser med intakte celler som uttrykker CD40, kan utføres ved hjelp av to metoder. Ved en første metode dyrkes B-celler enten i suspensjon eller ved festing til vevskulturplater. Festede celler kan fjernes ved behandling med 5 mM EDTA-behandling i 10 minutter ved 37°C. Ved en andre fremgangsmåte kan.det brukes transfekterte COS-celler som uttrykker membranbundet CD40. COS-celler eller en annen pattedyrcelle kan transfekteres med human CD40-cDNA i en passende vektor for å uttrykke fullengde CD40 med et ekstracellulært område utenfor cellen.

Alternativt kan oppløselig CD40 bindes til en fast fase, slik som en kolonnekromatografimatriks, eller et rør eller et lignende substrat som er egnet for analyse med hensyn på tilstedeværelsen av en påvisbar rest, slik som<125>I. Binding til en fast fase kan for eksempel utføres ved å oppnå et CD40/Fc-fusjonsprotein og binde det til en protein A- eller protein G-overflate.

Et annet middel for å måle den biologiske aktivitet av CD40-L og homologer derav er å benytte konjugert, oppløse-lig CD40 (for eksempel<125>I-CD40/Fc) i lignende konkurranseana-lyser som de som er beskrevet ovenfor. I dette tilfellet anvendes imidlertid intakte celler som uttrykker CD40-L, eller oppløselig CD40-L bundet til en fast bærer, til å måle konkurranse med hensyn på binding av konjugert, oppløselig CD40 til CD40-L ved hjelp av en prøve som inneholder en antatt CD40-homolog.

CD40-L kan også analyseres ved å måle biologisk aktivitet i en B-celleproliferasjonsanalyse. Humane B-celler kan fås fra humane mandler ved rensing ved hjelp av negativ utvelgelse og Percoll-densitetssedimentasjon, som beskrevet av Defrance et al., J. Immunol. 139:1135, 1987. Burkitt lymfomcellelinjer kan brukes til å måle celleproliferasjon som respons på CD40-L. Eksempler på Burkitt lymfomcellelinjer omfatter for eksempel Raji (ATCC CCL 86), Daudi (ATCC CCL 213) og Namalwa (ATCC CRL 1432) . Membranbundet CD40-L-stimulert B-celleproliferasjon. Oligomer, fortrinnsvis dimer CD40-L, kan stimulere B-celleproliferasjon. CD40 (reseptor) antagoniserer CD40-L-proliferasjon av B-celler.

Nok en annen analyse for å bestemme CD40-L biologisk aktivitet er å måle immunglobulin produsert av B-celler som respons på aktivering ved hjelp av CD40-L eller et derivat eller en analog derav. Polyklonal immunglobulinsekresjon kan måles for eksempel ved å inkubere med 5 x IO<5>B-celler/ml i kultur i minst 7 dager. Immunglobulinproduksjon (Ig-produksjon) kan måles ved hjelp av en ELISA-analyse, slik som en som er beskrevet i Maliszewski et al., J. Immunol. 144:3028, 1990 [Maliszewski et al. I] eller Maliszewski et al., Eur. J. Immunol. 20:1735, 1990 [Maliszewski et al. II]. Murine B-celler kan for eksempel fås fra mus og dyrkes i henhold til fremgangsmåter beskrevet i Grabstein et al., J. Exp. Med.

163:1405, 1986 [Grabstein et al. I], Maliszewski et al. I, og Maliszewski et al. II.

CD40-L kan brukes i en bindingsanalyse for å påvise celler som uttrykker CD40. For eksempel kan murin CD40-L ifølge figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) eller human CD40-L ifølge figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11), eller et ekstracellulært domene eller et fragment derav, kon-jugeres til en påvisbar rest, slik som125I. Radioaktiv merking med<125>I kan utføres ved hjelp av hvilken som helst av de mange standardmetodene som gir et funksjonelt125I-CD40-L-molekyl merket til høy spesifikk aktivitet. Alternativt kan det anvendes en annen påvisbar rest, slik som et enzym som kan katalys-ere en kolorimetrisk eller fluorometrisk reaksjon, biotin eller avidin. Celler som uttrykker CD40, kan bringes i kontakt med konjugert CD40-L. Etter inkubasjon fjernes ubundet, konjugert CD40-L, og binding måles ved å bruke den påvisbare rest.

CD40-L-polypeptider kan foreligge som oligomerer, slik som dimerer eller trimerer. Oligomerer er bundet sammen ved hjelp av disulfidbindinger dannet mellom cysteinrester på forskjellige CD40-L-polypeptider. Alternativt kan man binde to oppløselige CD40-L-domener sammen med en Gly4SerGly5Ser-linkersekvens, eller en annen linkersekvens beskrevet i US patentskrift nr. 5 073 627. CD40-L-polypeptider kan også skapes ved fusjon av C-enden i oppløselig CD40-L (ekstracellulært domene) til Fc-området i IgGl (f.eks. sekvens med identifikasjonsnr. 3) som beskrevet for CD40/Fc-fusjonsproteinet. CD40-L/Fc-fusjonsproteiner får settes sammen omtrent som tunge kjeder i et antistoffmolekyl, hvorved det dannes toverdig CD40-L. Dersom fusjonsproteiner lages med både tunge og lette kjeder fra et antistoff, er det mulig å danne en CD40-L-oligomer med så mange som fire ekstracellulære CD40-L-områder.

Fusjonsproteiner kan fremstilles ved å bruke konven-sjonelle teknikker, med enzymkutting og ligering av fragmenter fra ønskede sekvenser. PCR-teknikker hvor det anvendes syntetiske oligonukleotider, kan anvendes for å fremstille og/eller amplifisere de ønskede fragmenter. Overlappende, syntetiske oligonukleotider som utgjør de ønskede sekvenser, kan også brukes til å fremstille DNA-konstruksjoner som koder for fusjonsproteiner. Fusjonsproteiner kan også omfatte CD40-L og to eller flere ytterligere sekvenser inkludert en ledersekvens (eller signalpeptidsekvens), Fc-område, linkersekvens og sekvenser som koder for svært antigene rester som gir et middel for å lette rensing eller hurtig påvisning av et fusjonsprotein.

Signalpeptider letter sekresjon av proteiner fra celler. Et eksempelvis signalpeptid er de 25 aminosyrene i aminoenden til ledersekvensen i humant interleukin-7 (IL-7; Goodwin et al., Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A. 86:302, 1989; figur 2B). Andre signalpeptider kan også anvendes. For eksempel kan visse nukleotider i IL-7-ledersekvensen endres uten å endre aminosyresekvensen. I tillegg kan det lages aminosyre-endringer som ikke påvirker evnen til IL-7-sekvensen når det gjelder å virke som en ledersekvens.

"Flag"-oktapeptidet (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) endrer ikke den biologiske aktivitet av fusjonsproteiner, er svært antigent og gir en epitop som er reversibelt bundet av et spesifikt, monoklonalt antistoff, noe som muliggjør hurtig påvisning og letter rensing av det uttrykte fusjonsprotein. "Flag"-sekvensen spaltes også spesifikt ved hjelp av bovin slimhinneenterokinase i resten som følger umiddelbart etter Asp-Lys-paringen, fusjonsproteiner tildekket med dette pep-tidet, kan også være resistente overfor intracellulær nedbrytning i E. coli. Et murint, monoklonalt antistoff som binder "Flag"-sekvensen, er blitt deponert ved ATCC under deponeringsnr. HB 9259; fremgangsmåter for anvendelse av antistoffet ved rensing av fusjonsproteiner som omfatter "Flag"-sekvensen, er beskrevet i US patentskrift nr. 5 011 912.

Egnede Fc-områder er definert som Fc-områder som kan binde seg til protein A eller protein G, eller alternativt gjenkjennes av et antistoff som kan brukes ved rensing eller påvisning av et fusjonsprotein som omfatter Fc-området. Fortrinnsvis omfatter Fc-områder Fc-området i humant IgGieller murint IgGx. Ett eksempel er det humane IgGi-Fc-område som er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 3; et annet eksempel er et Fc-område som kodes for av cDNA erholdt ved hjelp av PCR fra oligonukleotidprimere fra sekvens med identifikasjonsnr. 9 og sekvens med identifikasjonsnr. 10 med human cDNA som templat. Deler av et egnet Fc-område kan også anvendes, f.eks. et Fc-område i humant IgGihvorfra det er blitt delert en sekvens av aminosyrer som er ansvarlig for binding til protein A, slik at det resulterende Fc-område bindes til protein G, men ikke

protein A.

[Gly4Ser]3-gjentakelsessekvensen gir en linkersekvens som skiller det ekstracellulære område av CD40-L fra Fc-delen 1 fusjonsproteinet med en avstand som er tilstrekkelig til å sikre at CD4 0-L foldes korrekt i sine sekundær- og tertiær-strukturer. Egnede linkersekvenser (1) vil innta en fleksibel, forlenget konformasjon, (2) vil ikke utvise en tilbøyelighet til å utvikle en ordnet sekundærstruktur som kunne virke inn på de funksjonelle domenene i fusjonsproteiner, og (3) vil ha minimal hydrofob eller ladet karakter som kunne fremme interaksjon med de funksjonelle proteindomenene. Typiske overflate-aminosyrer i fleksible proteinområder omfatter Gly, Asn og Ser. Praktisk talt enhver permutasjon av aminosyresekvenser som inneholder Gly, Asn og Ser, ville forventes å tilfreds-stille de ovenfor nevnte kriterier for en linkersekvens. Andre tilnærmet nøytrale aminosyrer, slik som Thr og Ala, kan også brukes i linkersekvensen. Lengden av linkersekvensen kan vari-ere uten i betydelig grad å påvirke den biologiske aktivitet av fusjonsproteinet. Linkersekvenser er unødvendige når pro-teinene som smeltes sammen, har ikke-essensielle N- eller C-endeaminosyreområder som kan brukes til å atskille de funksjonelle domenene og forhindre sterisk hindring.

CD40-L-polypeptider kan foreligge som oppløselige

polypeptider som omfatter det ekstracellulære domene i CD40-L, som vist i figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) og figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11), eller som membranbundne polypeptider som omfatter det ekstracellulære domene, et

transmembranområde og et kort, intracellulært domene, som vist i figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) og figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11) for henholdsvis den murine og

den humane sekvens. For eksempel kan et dimert CD40-L-molekyl tilknyttes ved hjelp av en IgG-Fc-område-bindingsgruppe.

Uten å være bundet av teorien, kan membranbundet CD40-L og oligomer CD40-L oppnå aktivitet som stimulerer Ig-dannelse og proliferasjon av B-celler, noe som tidligere bare ble oppnådd ved hjelp av kryssbundet anti-CD40-antistoff i nærvær av IL-4. Det synes videre sannsynlig at monomer, opp-løselig CD40-L som omfatter bare det ekstracellulære domene i CD40-L, og som er i stand til å binde til CD40-reseptor, vil tjene til å antagonisere aktiviteten av membranbundet og oligomer CD40-L og/eller kryssbundne anti-CD40-antistoffer. Det synes videre sannsynlig at interaksjonen mellom membranbundet CD40-L og CD40 er den viktigste molekylære interaksjon som er ansvarlig for T-cellekontaktavhengig induksjon av B-cellevekst og differensiering både til antigen, spesifikk antistoffproduksjon og polyklonal Ig-sekresjon. I dette henseende kan en pattedyrcelle transfektert med en cDNA som koder for full-lengde-CD40-L (dvs. som er membranbundet og har et intracellulært domene, et transmembranområde og et ekstracellulært domene eller et fragment derav), etterligne T-celler i deres evne til å indusere B-cellevekst, differensiering og stimulering av antigenspesifikk antistoffproduksjon. Det synes som om aktivitetene av oligomer, oppløselig CD40-L, fortrinnsvis en dimer av ekstracellulære områder, kan etterligne de biologiske aktivitetene av membranbundet CD40-L. Dessuten kan oppløselig, monomer CD40-L (som omfatter det ekstracellulære domene eller et fragment derav) binde til CQ40-reseptor for å forhindre T-celleinteraksjon med B-celler og derfor ha lignende aktivitet som CD40 (reseptor) ekstracellulært domene som i seg selv kan være i monomer eller i oligomer form.- Alternativt kan CD40-L være oligomer (fortrinnsvis en dimer) for å virke som en opp-løselig faktor som er i stand til å indusere B-cellevekst, differensiering og stimulering av antigenspesifikk antistoffproduksjon. Det synes således som om membranbundet CD40-L og oligomer CD40-L virker som CD40-agonister, mens oppløselig (monomer) CD40-L og oppløselig CD40 virker som CD40-antagonister ved å blokkere CD40-reseptorseter uten signifikant å overføre signal, eller ved å forhindre CD40-L-binding til CD40-seter på B-celler og andre målceller.

Både CD40-agonister og CD40-antagonister vil ha nyttig terapeutisk aktivitet. For eksempel kan CD40-agonister (dvs. membranbundet CD40-L og oligomer CD40-L) anvendes som vaksineadjuvanser og for å stimulere mAb-produksjon fra hybridomceller. CD40-antagonister (dvs. CD40-reseptor, CD40/Fc og eventuelt oppløselig, monomer CD40-L) kan anvendes til å be-handle autoimmunsykdommer som er kjennetegnet ved tilstedeværelse av høye nivåer av antigen-antistoff-komplekser, slik som allergi, lupus, reumatoid artritt, insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM), "graft versus host"-sykdom (GVHD) og andre.

IgE-sekresjon fra humane B-celler kan induseres ved hjelp av IL-4 i nærvær av T-celler (Vercelli et al., J. Exp. Med. 169:1295, 1989). Videre kan IgE-produksjon induseres fra T-celleuttømt PBM (mononukleære celler fra perifert blod) ved tilsetning av et anti-CD40 mAb (Jabara et al., J. Exp. Med. 172:1861, 1990 og Zhang et al., J. Immunol. 146:1836, 1991).

DNA-konstruksjoner som koder for forskjellige addisjoner eller utbyttinger av aminosyrerester eller -sekvenser, eller delesjoner av ende- eller indre rester eller sekvenser som ikke trengs for biologisk aktivitet eller binding, kan fremstilles. For eksempel kan det ekstracellulære CD40-L-N-glykosyleringssete modifiseres for å utelukke glykosylering samtidig som ekspresjon av homogen, redusert karbohydratanalog under anvendelse av gjærekspresjonssystemer muliggjøres. N-glykosyleringsseter i eukaryote polypeptider er kjennetegnet ved en aminosyretriplett Asn-X-Y, hvor X er hvilken som helst aminosyre bortsett fra Pro, og Y er Ser eller Thr. Passende modifikasjoner i nukleotidsekvensen som koder for denne trip-letten, vil resultere i utbyttinger, addisjoner eller delesjoner som forhindrer festing av karbohydratrester i Asn-side-kjeden. I et annet eksempel kan sekvenser som koder for Cys-rester, endres slik at Cys-restene fjernes eller erstattes med andre aminosyrer, noe som forhindrer dannelse av ukorrekte, intramolekylære disulfidbroer eller renaturering. Human CD40-L omfatter fem Cys-rester i sitt ekstracellulære domene. Minst én av de fem Cys-restene kan således erstattes med en annen aminosyre eller fjernes uten å påvirke proteintertiærstruktur eller disulfidbindingsdannelse.

Andre fremgangsmåter for mutagenese omfatter modifi-kasjon av sekvenser som koder for tobasiske aminosyrerester, for å øke ekspresjon i gjærsystemer hvor KEX2-proteaseaktivi-tet er til stede. Underenheter av et CD40-L-polypeptid kan konstrueres ved å fjerne sekvenser som koder for ende- eller indre rester eller sekvenser.

CD40-L-polypeptider kodes for av flere eksongener.

Antisense- eller sense-oligonukleotider omfatter en entrådet nukleinsyresekvens (enten RNA eller DNA) som er i stand til å bindes til mål-CD40-L-mRNA- (sense) eller CD40-L-DNA- (antisense) sekvenser. Evnen til å skape et antisense-eller et sense-oligonukleotid basert på en cDNA-sekvens for CD40-L, er beskrevet f.eks. i Stein og Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 og van der Krol et al., BioTechniques 6:958, 1988.

Binding av antisense- eller sense-oligonukleotider til målnukleinsyresekvenser resulterer i dannelsen av duplek-ser som blokkerer translasjon (RNA) eller transkripsjon (DNA) på én av flere måter, inkludert forøkt nedbrytning av duplek-sene, for tidlig avslutning av transkripsjon eller translasjon, eller på andre måter. Egnede polymerasepromoterer omfatter promoterer for hvilken som helst RNA-polymerase, eller promoterer for hvilken som helst DNA-polymerase. Antisense-eller sense-oligonukleotider omfatter videre oligonukleotider med modifiserte sukker-fosfodiester-skjeletter (eller andre sukkerbindinger, slik som de som er beskrevet i WO91/06629) og hvor slike sukkerbindinger er motstandsdyktige overfor endo-gene nukleaser. Slike oligonukleotider med motstandsdyktige sukkerbindinger er stabile in vivo (dvs. i stand til å motstå enzymatisk nedbrytning), men bibeholde sekvensspesifisitet for å være i stand til å binde seg til målnukleotidsekvenser. Andre eksempler på sense- eller antisense-oligonukleotider omfatter de oligonukleotidene som er kovalent bundet til or-ganiske rester, slik som de som er beskrevet i WO 90/10448, og andre rester som øker affinitet av oligonukleotidet til en målnukleinsyresekvens, slik som poly(L-lysin). Enda ytter ligere kan slike innføyningsmidler som elliptisin, og alkyler-ingsmidler eller metallkomplekser, festes til sense- eller antisense-oligonukleotider for å modifisere bindingsspesifisi-teter til antisense- eller sense-oligonukleotidet for målnukleotidsekvensen. Antisense- eller sense-oligonukleotider kan innføres i en celle som inneholder målnukleinsyresekvensen, ved hjelp av hvilken som helst genoverføringsmetode, inkludert f.eks. CaPCU-mediert DNA-transfeksjon, elektroporasjon eller andre genoverføringsvektorer, slik som Epstein-Barr-virus. Antisense- eller sense-oligonukleotider innføres fortrinnsvis i en celle som inneholder målnukleinsyresekvenser, ved innføy-else av antisense- eller sense-oligonukleotidet i en egnet retrovirusvektor, og så bringe cellen i kontakt med retroirus-vektoren som inneholder den innføyde sekvens, enten in vivo eller ex vivo. Egnede retrovirusvektorer omfatter, men er ikke begrenset til, det murine retrovirus M-MuLV, N2 (et retrovirus avledet fra M-MuLV), eller dobbeltkopivektorene betegnet DCT5A, DCT5B og DCT5C (se PCT-søknad US 90/02656). Alternativt kan andre promotersekvenser brukes til å uttrykke oligonukleotidet.

Sense- eller antisense-oligonukleotider kan også inn-føres i en celle som inneholder målnukleotidsekvensen, ved dannelse av et konjugat med et ligandbindingsmolekyl, som beskrevet i WO 91/04753. Egnede ligandbindingsmolekyler omfatter, men er ikke begrenset til, celleoverflatereseptorer, vekstfaktorer, andre cytokiner eller andre ligander som binder seg til celleoverflatereseptorer. Fortrinnsvis virker konjuga-sjon av ligandbindingsmolekylet ikke vesentlig inn på evnen til ligandbindingsmolekylet når det gjelder å binde seg til sitt tilsvarende molekyl eller reseptor, eller blokkere inn-treden av sense- eller antisense-oligonukleotidet eller dets konjugerte versjon i cellen.

Alternativt kan et sense- eller et antisense-oligonukleotid innføres i en celle som inneholder målnukleinsyresekvensen, ved dannelse av et oligonukleotid-lipid-kompleks, som beskrevet i WO 90/10448. Sense- eller antisense-oligonukleotid-lipid-komplekset dissosieres fortrinnsvis i cellen ved hjelp av en endogen lipase.

Sekvensen til murin CD40-L-cDNA ble erholdt ved dir-ekte ekspresjonsteknikker. Sekvensen til human CD40-L ble erholdt ved kryssartshybridiseringsteknikker under anvendelse av den murine CD40-L-cDNA som en probe.

Vi klonet murin CD40-L ved først å oppnå en klon av det ekstracellulære området til humant CD40 (reseptoren) ved hjelp av teknikker med polymerasekjedereaksjon (PCR) under anvendelse av primere basert på en sekvens publisert i Stamenkovic et al. (sekvens med identifikasjonsnr. 4). En oppstrøms oligonukleotidprimer 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (sekvens med identifikasjonsnr. 5) innfører et Sal 1-sete oppstrøms fra et initiatormetionin i CD40, og en nedstrøms oligonukleotidprimer 5'-CCGTCGACGTCTAGAGCCGATCCTGGGG-3' (sekvens med iden-tif ikasj onsnr . 6) innføyer et avslutningskodon etter aminosyre 192 i CD40, etterfulgt av Xba 1- og Sal 1-seter. Den amplifiserte cDNA ble fordøyd med Sal 1 og klonet inn i pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 20:2821, 1991) for å konstruere pDC406/s CD40.

Et andre CD40-reseptorfragment (sekvens med iden-tif ikasjonsnr . 4) ble erholdt ved hjelp av PCR-teknikker for fusjon til Fc-domenet i humant IgGl (sekvens med identifika-sj onsnr. 3) . I korte trekk var den oppstrøms oligonukleotidprimer (sekvens med identifikasjonsnr. 5) og fusjonstemplatet (sekvens med identifikasjonsnr. 4) de samme som tidligere. Den nedstrøms oligonukleotidprimer var 5'-ACAAGATCTGGGCTCTACGTATC-TCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (sekvens med identifikasjonsnr. 7) som innføyer aminosyrer Tyr Val Glu Pro Arg (sekvens med identifikasjonsnr. 8) etter aminosyre 193 i CD40. Glu og Pro er de to første aminosyrene i et leddområde i humant IgGl og etter-følges av et Bgl II-restriksjonssete. Bgl II-restriksjonssetet ble brukt til å smelte sammen det ekstracellulære domene i CD40 med det gjenværende av humant IgGl-forbindelsesområde.

Andre fusjonsproteiner som omfatter ligandbindings-domener fra andre reseptorer, kan lages ved oppnå en DNA-sekvens for ligandbindingsdomenet i en reseptor og smelte denne sekvensen sammen med en DNA-sekvens som koder for et Fc-område i et antistoffmolekyl, og som binder seg til protein A eller protein G, eller et annet polypeptid med evne til affinitets rensing, f.eks. avidin eller streptavidin. Den resulterende genkonstruksjon kan innføres i pattedyrceller for forbigående å uttrykke et fusjonsprotein. Reseptor/Fc-fusjonsproteinet kan renses ved hjelp av protein A- eller protein G-affinitetsrensing. Reseptor/avidin-fusjonsprotein kan renses ved hjelp av biotinaffinitetskromatografi. Fusjonsproteinet kan senere fjernes fra kolonnen ved eluering med en oppløsning med høyt saltinnhold eller en annen passende buffer.

Vi fikk et cDNA-kodende, humant IgGl-Fc-område ved hjelp av PCR-amplifikasjon under anvendelse av cDNA fra human-celler som et templat, og en oppstrøms oligonukleotidprimer 5'-TATTAATCATTCAGTAGGGCCCAGATCTTGTGACAAAACTCAC-31 (sekvens med identifikasjonsnr. 9) og en nedstrøms oligonukleotidprimer 5'-GCCAGCTTAACTAGTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA-3" (sekvens med identifikasjonsnr. 10). Den PCR-amplifiserte cDNA innførte et Bgl II-sete nær begynnelsen av "hengsel"-området, som ble brukt til å ligere CD40 ekstracellulært domene for å konstruere en sCD40/Fc-fusjons-cDNA som ble ligert inn i pDC406 for å konstruere pDC406/CD40/Fc. Andre egnede Fc-områder er definert som hvilket som helst område som kan bindes med høy affinitet til protein A eller protein G, og omfatter Fc-området i humant IgGl eller murint IgGl. Ett eksempel er det humane IgGl-Fc-området som er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 3, eller den cDNA som ble oppnådd ved hjelp av PCR, fra oligonukleotidprimere fra sekvens med identifikasjonsnr. 9 og sekvens med identifikasjonsnr. 10 med human cDNA som et templat.

Reseptor/Fc-fusjonsmolekyler syntetiseres fortrinnsvis i rekombinant pattedyrcellekultur fordi dé generelt er for store og komplekse til å bli syntetisert ved hjelp av prokaryote ekspresjonsmetoder. Eksempler på egnede pattedyrceller for uttrykking av reseptor/Fc-fusjonsprotein omfatter CV-l-celler (ATCC CCL 70) og COS-7-celler (ATCC CRL 1651), begge avledet fra apenyre.

DNA-konstruksjonen pDC406/CD40/Fc ble transfektert inn i apenyrecellelinjen CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). pDC406-plasmidet omfatter regulatorsekvenser avledet fra SV40, humant immunsviktvirus (HIV) og Epstein-Barr-virus (EBV). CV-l/EBNA-cellelinjen ble utvunnet ved transfeksjon av CV-l-cellelinjen med et gen som koder for Epstein-Barr-virus-kjerneantigen-1 (EBNA-1) og som konstitutivt uttrykker EBNA-1 drevet fra human CMV "immediate-early enhancer"/promoter. Et EBNA-l-gen mulig-gjør episomal replikasjon av ekspresjonsvektorer, slik som pDC406, som inneholder EBV-replikasjonsopprinnelsen.

Transfektanter som uttrykker CD40/Fc-fusjonsprotein, identifiseres først ved å bruke "dot blots" eller Western blot. Supernatantene underkastes så "dot blot" eller gel-elektroforese etterfulgt av overføring av de elektroforesebe-handlede proteiner for binding til G28-5 mAb (et antistoff som binder seg til human CD40-reseptor). De blottede proteiner ble så inkubert med radioaktivt merket12<5>I-protein A, vasket for å fjerne ubundet markør og undersøkt med hensyn på ekspresjon av Fc. Monoklonalt antistoff G28-5 ble fremstilt ifølge Clark et

al., supra.

Når celler som uttrykker fusjonskonstruksjonen først var blitt identifisert, ble storskalakulturer av transfekterte celler dyrket for å akkumulere supernatant fra celler som uttrykker CD40/FC. CD40/Fc-fusjonsprotein i supernatantvæske ble renset ved affinitetsrensing. I korte trekk ble 1 liter kultursupernatant inneholdende CD40/Fc-fusjonsprotein, renset ved å filtrere pattedyrcellesupernatanter (f.eks. i et 0,45 um filter) og tilføre filtrat til en protein A/G-antistoffaffini-tetskolonne (Schleicher und Schuell, Keene, NH) ved 4°C ved en strømningshastighet på 80 ml/time for en 1,5 cm x 12,0 cm kolonne. Kolonnen ble vasket med 0,5 M NaCl i PBS inntil fritt protein Ikke kunne påvises i vaskebufferen. Til sist ble kolonnen vasket med PBS. Bundet fusjonsprotein ble eluert fra kolonnen med 25 mM sitratbuffer, pH 2,8, og brakt til pH 7 med 500 mM Hepes-buffer, pH 9,1. Sølvfargede SDS-geler av det eluerte CD40/Fc-fusjonsprotein viste at det var >98% rent.

Oppløselig CD40 (sCD40) og CD40/Fc-fusjonsproteiner ble laget som her beskrevet. Supernatantene ble renset gjennom en G28-5- (anti-CD40-mAb) affinitetskolonne for å affinitetsrense jsCD40 uttrykt ved hjelp av de transfekterte CV-l/EBNA-celler. Proteinholdige fraksjoner ble slått sammen og ali-quoter fjernet for G28-5-bindingsanalyser og analyse ved hjelp av SDS-PAGE (natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofor- ese) i nærvær 1 mM ditiotreitol som et reduksjonsmiddel. Det ble sett et enkeltbånd med molekylvekt 28.100 dalton. I fravær av et reduksjonsmiddel avslørte SDS-PAGE-analyse av sCD40 to bånd, et hovedbånd med molekylvekt 56.000 og et mindre bånd med molekylvekt 28.000. Bånddannelsesmønsteret indikerer at hovedparten av sCD40 foreligger som en disulfidbundet homo-dimer i oppløsning. Båndet ved 28.000 er fri monomer.

CD4 0-proteiner ble visualisert ved hjelp av sølvfar-ging. Prøveproteinkonsentrasjoner ble bestemt ved å bruke en mikro-BCA-analyse (Pierce) med ultrarent, bovint serumalbumin som standard. Renhet av oppløselig CD40 og proteinkonsentra-sjon ble bekreftet ved hjelp av aminosyreanalyse. Renset, opp-løselig CD40 ble absorbert til PVDF-papir og papiret underkas-tet automatisert Edman-nedbrytning på et Applied Biosystems modell 477A-proteinsekvenseringsapparat ifølge produsentens instruksjoner for N-terminal proteinsekvensering. Denne fremgangsmåten sjekket proteinsekvensen til sCD40.

Oppløselig CD40 og CD40/Fc-fusjonsprotein var i stand til å modulere responser hos human B-celle i fravær av anti-CD40-mAb (G28-5). Rensede tonsill-B-celler ble dyrket med anti-IgM og humant IL-4, og enten ble sCD40 eller CD40/Fc-fusjonsprotein tilsatt. Ingen av CD40-formene hadde en inhibitoreffekt på B-celleproliferasjon (som målt ved hjelp av tritiert tymidininkorporering). IL-4-reseptor inhiberte derimot IL-4-indusert B-celleprolifexasjon på en konsentrasjonsavhen-gig måte.

Oppløselig CD40 og CD40/Fc ble testet med hensyn på sin evne til å inhibere IL-4-indusert IgE-sekresjon i et system med 2-donor-MLC (blandet lymfocyttkultur). I tre forsøk ble nivået av IgE-produksjon redusert etter hvert som konsen-trasjonen av CD40 ble økt. Oppløselig CD40, tilsatt ved en konsentrasjon på 10 ug/ml, var i stand til fullstendig å inhibere IgE-sekresjon i denne allergimodellen. Videre hadde CD40/FClignende effekter som dets oppløselige motpart. Til-setningen av et IL-7-reseptor-Fc-fusjonsprotein (laget ved hjelp av lignende fremgangsmåter med en publisert IL-7-resep-torsekvens) påvirket ikke sekresjon av IgE i denne modellen.

Nivåer av CD23 ble også målt i den samme MLC som respons på sCD40 eller CD40/Fc-fusjonsproteiner. Oppløselig CD40 ga en liten, men reproduserbar reduksjon i sCD23-nivå på dag 6 sammenlignet med kulturer stimulert med IL-4 alene, en sterkere inhibitoreffekt var imidlertid klar på dag 12 i de samme kulturene. Oppløselig CD23-induksjon ved hjelp av IL-4-stimulerte, T-uttømte PBM (makrofager fra perifert blod) E-celler ble likeledes påvirket ved tilsetning av sCD40, noe som forårsaket en liten reduksjon i sCD23-nivåer på dag 6 og en klarere inhibering på dag 12. I hvert kultursystem var resultatene med CD40/Fc-fusjonsprotein i det vesentlige de samme som med sCD40.

I et forsøk på å isolere en cDNA for en CD40-L ble renset CD40/Fc-fusjonsprotein radioaktivt jodert med<125>I under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig fastfasemiddel ("Iodo-Gen", Pierce). Ved denne fremgangsmåten ble 5 ug "Iodo-Gen" platet ut på bunnen av et 10 x 75 mm glassrør og inkubert i 20 minutter ved 4°C med 75 ul 0,1 M natriumfosfat, pH 7,4, og 20 ul (2 mCi) Na<125>I. Oppløsningen ble så overført til et andre glassrør inneholdende 5 ug CD40/FCi 45 ul PBS (fosfatbufret saltoppløsning), og denne reaksjonsblandingen ble inkubert i 20 minutter ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved gelfiltrering på et 2 ml lagvolum av "Sephadex" G-25 (Sigma) og så ekvilibrert i RPMI 1640-medium inneholdende 2,5%

(volum/volum) bovint serumalbumin (BSA), 0,2% (volum/volum) natriumazid og 20 mM Hepes, pH 7,4, bindingsmedium. Sluttblandingen av125I CD40/Fc ble fortynnet til en arbeidsstandard-oppløsning på 1 x 10"<7>M i bindingsmedium og lagret i opp til én måned ved 4°C uten påvisbart tap av reseptorbindingsaktivitet.

Et cDNA-bibliotek ble fremstilt fra en EL4-cellelinje sortert ved hjelp av FACS (fluorescensaktivert cellesortering) på grunnlag av binding av et biotinylert CD40/Fc-fusjonsprotein. Celler ble sortert fem ganger inntil det var en betydelig endring i fluorescensstyrke basert på ekspresjon av en ligand for CD40 ved hjelp av de sorterte EL-4-celler. De fem ganger sorterte celler ble kalt EL-40.5-celler, og disse cellene ble dyrket for det formål å skape et cDNA-bibliotek fra EL-40.5-itiRNA. I korte trekk ble cDNA syntetisert, innføyd i tom pDC406-vektor og transformert i E. coli. Transformanter ble slått sammen, og DNA fra blandingene ble isolert og transfektert inn i CVl-EBNA-celler for å skape et ekspresjonsklon-ingsbibliotek. Transfekterte CVl-EBNA-celler ble dyrket på objektglass i tre dager for å muliggjøre forbigående ekspresjon av CD40-L. Objektglassene som inneholdt de transfekterte celler, ble så inkubert med radioaktivt jodert CD40/FC, vasket for å fjerne ubundet CD40/Fc og fiksert med glutaraldehyd. De fikserte objektglass ble dyppet i flytende, fotografisk emulsjon og eksponert i mørket. Etter fremkalling av objektglassene ble de individuelt undersøkt med et mikroskop, og celler som uttrykker CD40-L, ble identifisert ved tilstedeværelsen av autoradiografiske sølvkorn mot en lys bakgrunn.

Ekspresjonskloningsbiblioteket fra EL-40.5-celler ble screenet, og én mengde, inneholdende omtrent 2000 individuelle kloner, ble identifisert som positiv for binding av<125>I-merket CD40/Fc-fusjonsprotein. Denne mengden ble brutt ned i små mengder med omtrent 200 kolonier. De små mengdene ble screenet som beskrevet ovenfor. Én av de mindre mengdene var positiv med hensyn på CD40-L.

En enkelt klon ble isolert og sekvensert ved hjelp av standardteknikker, hvorved man fikk en cDNA-sekvens og utledet aminosyresekvens for murin CD40-L som vist i figur 1 og sekvens med identifikasjonsnr. 1.

Den humane homolog-CD40-L-cDNA ble funnet ved hjelp av artskrysningshybridiseringsteknikker. I korte trekk ble et cDNA-bibliotek av humanlymfocytter fra perifert blod (PBL) laget fra lymfocytter fra perifert blod behandlet med 0KT3-antistoff (ATCC, Rockville, MD) som bindes til CD3 (10 ng/ml) og interleukin-2 (IL-2, 10 ng/ml) i 6 dager. PBL-cellene ble vasket og så stimulert i 4 timer med 10 ng/ml PMA (forbolmyri-statacetat, Sigma, St. Louis) og 500 ng/ml ionomycin (Calbiochem). Messenger-RNA ble isolert fra stimulerte PBL-celler, cDNA dannet, og cDNA ble ligert i Eco Rl-linkere. Ligert cDNA ble innføyet i Eco Rl-setet til Xgtl0-fagkloningsbærer ("Gigapak", Stratagene, San Diego, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Fag ble amplifisert, platet ut ved tettheter på om trent 20.000 fag pr. 15 cm plate, og fagoverføringer ble ut-ført som beskrevet i Maniatis et al., Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, pp 316-328. En murin probe ble konstruert tilsvarende det kodende område i murin CD40-L fra nukleotid 13 til nukleotid 793 i sekvens med identifikasjonsnr. 1 og figur 1. Denne proben ble hybridisert til PBL-bibliotekfagoverføringene under betingelser med middels til høy strenghet. I korte trekk var hybridis-eringsbetingelsene 6 X SSC, 1 X Denhardts oppløsning, 2 mM EDTA, 0,5% Np40 ("Nonidet" P-40-detergent) ved 63°C over natten. Dette ble etterfulgt av vasking i 3 X SSC, 0,1% SDS i 3 timer ved 55°C, etterfulgt av eksponering over natten mot røntgenfilm. Positive plakker ble identifisert ved en hyppig-het på omtrent 1 pr. 1000 plakker. Positive plakker ble renset to ganger, og cDNA ble fremstilt fra amplifiserte kulturer.

Man kan benytte de murine eller humane CD40-L-cDNA-sekvenser som her er beskrevet, til å oppnå cDNA-er som koder for andre pattedyrhomologer av murin eller human CD40-L ved artskrysningshybridiseringsteknikker. I korte trekk skapes en oligonukleotidprobe fra nukleotidsekvensen i det ekstracellulære område i murin CD40-L som beskrevet i figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) eller human CD40-L som beskrevet i figur 2 (sekvens med identifikasjonsnr. 11). Denne proben kan lages ved hjelp av standardteknikker, slik som de som er beskrevet i Maniatis et al., supra. Den murine eller humane probe brukes til å screene et pattedyr-cDNA-bibliotek eller genombibliotek under middels strenge betingelser. Eksempler på pattedyr-cDNA- eller genombiblioteker omfatter, for cDNA, et bibliotek laget av pattedyrets lymfocytter fra perifert blod. Alternativt kan forskjellige cDNA-biblioteker eller mRNA-er isolert fra forskjellige cellelinjer, screenes ved hjelp av Northern-hybridisering for å bestemme en egnet kilde for pattedyr-CD40-L-DNA eller mRNA.

Rekombinante ekspresjonsvektorer for ekspresjon av CD40-L ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker omfatter en CD40-L-DNA-sekvens som omfatter et syntetisk eller cDNA-avledet DNA-fragment som koder for et CD4 0-L-polypeptid, operativt bundet til en egnet transkripsjons- eller translasjons- regulatornukleotidsekvens, slik som en som er avledet fra et pattedyr-, mikrobe-, virus- eller insektgen. Eksempler på regulatorsekvenser omfatter sekvenser med en regulatorrolle i genekspresjon (f.eks. en transkripsjonspromoter eller -enhancer), eventuelt en operatorsekvens for å kontrollere transkripsjon, en sekvens som koder for et mRNA-ribosomalt bindingssete, og passende sekvenser som kontrollerer transkripsjon og translasjonsinitiering og -terminering. Nuk-leotidsekvenser er operativt bundet når regulatorsekvensen står i funksjonelt forhold til CD40-L-DNA-sekvensen. En pro-moternukleotidsekvens er således operativt bundet til en CD40-L-DNA-sekvens dersom promoternukleotidsekvensen kontrollerer transkripsjonen av CD40-L-DNA-sekvensen. Ytterligere kan et ribosombindingssete være operativt bundet til en sekvens for et CD40-L-polypeptid dersom ribosombindingssetet er plassert innenfor vektoren for å befordre translasjon. I tillegg kan sekvenser som koder for signalpeptider, være inkorporert i ekspresjonsvektorer. En DNA-sekvens for et signalpeptid (sekresjonsleder) kan f.eks. være operativt bundet til en CD40-L-DNA-sekvens. Signalpeptidet uttrykkes som en forløper-aminosyresekvens som muliggjør forbedret ekstracellulær sekresjon av translatert fusjonspolypeptid ved hjelp av en gjær-vertscelle.

Egnede vertsceller for ekspresjon av CD40-L-polypeptider omfatter prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler. Prokaryoter omfatter gramnegative og grampositive organismer, f.eks. E. coli- eller Bacillus-arter. Egnede prokaryote vertsceller for transformasjon omfatter f.eks. E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, og forskjellige andre arter innenfor slektene Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus. Høyere eukaryote celler omfatter etablerte cellelinjer av pattedyropprinnelse. Cellefrie translasjonssys-temer vil også kunne anvendes for å fremstille CD40-L-polypeptider under anvendelse av RNA-er avledet fra DNA-konstruksjoner som er beskrevet. Passende klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterie-, sopp-, gjær- og pattedyr-celleverter er f.eks. beskrevet i Pouwels et al., Cloning Vec-tors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985).

I en prokaryot vertscelle, slik som E. coli, kan et CD40-L-polypeptid eller analog omfatte en N-endemetioninrest for å lette ekspresjon av det rekombinante polypeptid i den prokaryote vertscelle. N-ende-Met kan spaltes fra det uttrykte, rekombinante CD40-L-polypeptid. Prokaryote vertsceller kan anvendes for ekspresjon av CD40-L-polypeptider som ikke krever omfattende proteolytisk eller disulfidbearbeidelse.

Ekspresjonsvektorene som bærer den rekombinante CD40-L-DNA-sekvens, transfekteres eller transformeres i en i det vesentlige homogen kultur av en egnet vertsmikroorganisme eller pattedyrcellelinje. Transformerte vertsceller er celler som er blitt transformert eller transfektert med nukleotidsek-venser som koder for CD40-L-polypeptider og uttrykker CD40-L-polypeptider. Uttrykte CD4 0-L-polypeptider vil være lokalisert i vertscellen og/eller være utskilt i kultursupernatantvæske, avhengig av vertscellens egenskaper og genkonstruksjonen som er innføyet i vertscellen.

Ekspresjonsvektorer transfektert i prokaryote vertsceller, omfatter generelt én eller flere selekterbare feno-typemarkører. En selekterbar fenotypemarkør er f.eks. et gen som koder for et protein som gir antibiotisk resistens eller som tilfører et autotroft behov, og et replikasjonsopprinnelsessted gjenkjent av verten for å sikre amplifikasjon i verten. Andre anvendbare ekspresjonsvektorer for prokaryote vertsceller omfatter en selekterbar markør av bakterieopprin-nelse avledet fra kommersielt tilgjengelige plasmider. Denne selekterbare markør kan omfatte genetiske elementer i klon-ingsvektoren pBR322 (ATCC 37017).. pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetrasyklinresistens og gir således enkle mid-ler for identifisering av transformerte celler. pBR322-"ryggrad"-avsnittene kombineres med en passende promoter og en CD4 0-L-DNA-sekvens. Andre kommersielle vektorer omfatter f.eks. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA).

Promotersekvenser brukes vanligvis for rekombinante, prokaryote vertscelleekspresjonsvektorer. Vanlige promotersekvenser omfatter (3-laktamase (penicillinase) , laktosepro-motersystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978; og Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), tryptofan (trp) promotersystem

(Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; og EP-A-36776)

og tac-promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 412, 1982). Et særlig anvendbart prokaryot vertscelleekspresjonssystem anvender en fag-X PL-promoter og en cI857ts termolabil repressor-sekvens. Plasmidvektorer som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection, og som inneholder derivater av X PL-promoteren, omfatter plasmid pHUB2 (som finnes i E. coli stamme JMB9 (ATCC 37092)) og pPLc28 (som finnes i E. coli RR1 (ATCC 53082)).

CD40-L kan uttrykkes i gjærvertsceller, fortrinnsvis fra Saccharomyces-slekten (f.eks. S. cerevisiae). Andre slek-ter av gjær, slik som Pichia eller Kluyveromyces, kan også anvendes. Gjærvektorer kan ofte inneholde en replikasjonsopp-rinnelsesstedsekvens fra et 2 pm gjærplasmid, en autonomt rep-likerende sekvens (ARS), et promoterområde, sekvenser for polyadenylering og sekvenser for transkripsjonsterminering. Gjærvektorer omfatter fortrinnsvis en replikasjonsopprinnel-sesstedsekvens og selekterbar markør. Egnede promotersekvenser for gjærvektorer omfatter promoterer for metallotionein, 3-fosfoglyseratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; og Holland et al., Biochem. 27:4900, 1978), slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase. Andre egnede vektorer og promoterer for anvendelse i gjæreks-presjon er ytterligere beskrevet i Hitzeman, EPA-73.657.

Gjærvektorer kan f.eks. settes sammen ved å bruke DNA-sekvenser fra pBR322 for utvelgelse og replikasjon i E. coli (Amp<r->gen og replikasjonsopprinnelsessted). Andre gjær-DNA-sekvenser som kan inkluderes i gjærekspresjonskonstruk-sjonen, omfatter en glukoserepresserbar ADH2-promoter og en a-faktorsekresjonsleder. ADH2-promoteren er blitt beskrevet av Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) og Beier et al.

(Nature 300:724, 1982). Gjær-a-faktorledersekvensen styrer

sekresjon av heterologe polypeptider. a-faktorledersekvensen innføyes ofte mellom promotersekvensen og den strukturelle gensekvens. Se f.eks. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982 og Bit-ter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:5330, 1984. Andre ledersekvenser som er egnet for å lette sekresjon av rekombinante polypeptider fra gjærverter, er kjent for fagfolk innen teknikken. En ledersekvens kan være modifisert nær sin 3'-ende slik at den inneholder ett eller flere restriksjons-seter. Dette vil lette fusjon av ledersekvensen til det strukturelle gen.

Gjærtransformasjonsfremgangsmåter er kjent for fagfolk innen teknikken. Én slik fremgangsmåte er beskrevet av Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:1929, 1978. Ved fremgangsmåten til Hinnen et al. selekteres det med hensyn på Trp<+->transformanter i et selektivt medium, hvor det selektive medium består av 0,67% gjærnitrogenbase, 0,5% kasaminosyrer, 2% glukose, 10 ug/ml adenin og 20 ug/ml uracil.

Gjærvertsceller transformert ved hjelp av vektorer som inneholder ADH2-promotersekvens, kan dyrkes for å indusere ekspresjon i et "rikt" medium. Et eksempel på et rikt medium er ett som består av 1% gjærekstrakt, 2% pepton og 1% glukose supplert med 80 ug/ml adenin og 80 ug/ml uracil. Derepresjon av ADH2-promoteren inntrer når mediet er tømt for glukose.

Pattedyr- eller insektsvertscellekultursystemer vil også kunne anvendes for å uttrykke rekombinante CD40-^L-polypeptider. Eksempler på egnede pattedyrvertscellelinjer omfatter COS-7-linjen av apenyreceller (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L-celler, C127-celler, 3T3-celler (ATCC CCL 163), celler fra ovarie fra kinesisk hamster (CHO), HeLa-celler, og BHK-cellelinjer (ATCC CRL 10). Egnede pattedyrekspresjonsvektorer omfatter ikke-transkriberte elementer, slik som et replikasjonsopprinnelsessted, en promotersekvens, en enhancer bundet til det strukturelle gen, andre 5'- eller 3'-flankerende, ikke-transkriberte sekvenser, slik som ribo-sombindingsseter, et polyadenyleringssete, sammenspleisings-donor- og -akseptorseter, og transkripsjonstermineringssek-venser.

Transkripsjons- og translasjonskontrollsekvenser for pattedyrvertscelleekspresjonsvektorer kan tas ut fra virus-genomer. For eksempel utvinnes vanlig brukte cellepromotersek-venser og -enhancersekvenser fra polyomvirus, adenovirus 2, apevirus 40 (SV40) og humant cytomegalovirus. DNA-sekvenser utvunnet fra SV40-virusgenomet, f.eks. SV40-opprinnelse, "early" og "late" promoter-, enhancer-, sammenspleisings- og polyadenyleringsseter, kan anvendes for å tilveiebringe de øvrige genetiske elementer som er påkrevet for ekspresjon av en strukturell gensekvens i en pattedyrvertscelle. Virus-"early"- og -"late"-promoterer er særlig anvendbare ettersom begge lett lar seg erholde fra et virusgenom som et fragment som også kan inneholde et virusreplikasjonsopprinnelsessted (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forutsatt at sekvensen med omtrent 250 bp som strekker seg fra Hind III-setet mot Bgl le-setet lokalisert i SV40-virusreplikasjonsopprinnelsesstedet, er inkludert.

Eksempelvise pattedyrekspresjonsvektorer kan konstrueres som beskrevet av Okayama og Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). En anvendbar høyekspresjonsvektor, PMLSV N1/N4, beskrevet av Cosman et al., Nature 312:168, 1984, er blitt deponert som ATCC 39890. Ytterligere anvendbare pattedyrekspresjonsvektorer er beskrevet i EP-A-0367566 og i US patent-søknad nr. 07/701 415 innlevert 16. mai 1991. For ekspresjon av ekstracellulært område av type II-protein, slik som CD40-L, bør det tilsettes en heterolog signalsekvens slik som signalsekvensen for interleukin-7 (IL-7) beskrevet i US patentskrift nr. 4 965 195, eller signalsekvensen for interleukin-2-reseptor beskrevet i US patentsøknad nr. 06/626 667 innlevert 2. juli 1984.

Human eller murin CD40-L kan lages i membranbundet form når den er inkludert et intracellulært område og transmembranområde r, eller i oppløselig form med bare det ekstracellulære domene. Vi uttrykte fullengde murin CD40-L i pattedyrceller, hvorved vi fikk celler som uttrykker membranbundet, murin CD40-L. CVl-celler ble transfektert med en cDNA vist i figur 1 (sekvens med identifikasjonsnr. 1) i HAVEO-vektor, eller CVl-celler ble transfektert med HAVEO tom vektor under anvendelse av teknikker beskrevet i eksempel 6. Dette ga transfekterte CVl-celler som uttrykker membranbundet, murin CD40-L. Disse cellene ble brukt som en kilde for membranbundet, murin CD40-L for serien av forsøk rapportert i eksemplene 10-13 nedenunder.

Rensing av rekombinante CD40- L- polypeptider

CD40-L-polypeptider kan fremstilles ved å dyrke transformerte vertsceller under dyrkningsbetingelser som er nødvendige for å uttrykke CD40-L-polypeptider. De resulterende, uttrykte polypeptider kan så renses fra dyrkningsmedier eller celleekstrakter. Et CD40-L-polypeptid kan, om ønsket, konsentreres under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentrasjonsfilter, f.eks. en "Amicon" eller "Milli-pore Pellicon" ultrafiltreringsenhet. Etter konsentrasjons-trinnet kan konsentratet tilføres en rensematriks, slik som et gelfiltreringsmedium. En anionbytterharpiks kan alternativt anvendes, f.eks. en matriks eller et substrat med påhengte dietylaminoetylgrupper (DEAE). Matriksene kan være akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre typer som vanligvis anvendes i proteinrensing. Alternativt kan det anvendes et kationbyttertrinn. Egnede kationbyttere omfatter forskjellige, uoppløselige matrikser som omfatter sulfopropyl- eller karbok-symetylgrupper. Sulfopropylgrupper er foretrukket.

Endelig kan det anvendes ett eller flere trinn med reversfasevæskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC) under anvendelse av hydrofobe RP-HPLC-medier, f.eks. kan silikagel med påhengte metyl- eller andre alifatiske grupper anvendes for ytterligere å rense CD40-L. Noen av eller alle de ovenfor nevnte rensetrinn kan i forskjellige kombinasjoner også anvendes for å tilveiebringe et i det vesentlige homogent, rekombinant protein.

Det er også mulig å benytte en affinitetskolonne som omfatter CD4 0-ligandbindingsdomenet for å affinitetsrense uttrykte CD40-L-polypeptider. CD40-L-polypeptider kan fjernes fra en affinitetskolonne i en elueringsbuffer med høyt salt innhold og så dialyseres i en buffer med lavere saltinnhold for bruk.

Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur, isol-eres vanligvis ved innledende oppbrytning av vertscellene, sentrifugering, ekstraksjon fra cellepellets dersom det er. et uoppløselig polypeptid, eller fra supernatantvæsken dersom det er et oppløselig polypeptid, etterfulgt av én eller flere kon-sentrasjons-, utsaltings-, ionebytter-, affinitetsrensings-eller størrelsesutelukkelseskromatografitrinn. Til sist kan RP-HPLC anvendes for sluttrensingstrinn. Mikrobeceller kan brytes opp ved hvilken som helst passende metode, inkludert fryse-tine-sykluser, sonikering, mekanisk oppbrytning eller bruk av cellelyseringsmidler.

Transformerte gjærvertsceller anvendes fortrinnsvis for å uttrykke CD40-L som et utskilt polypeptid. Dette for-enkler rensing. Utskilt, rekombinant polypeptid fra en gjær-vertscellefermentasjon kan renses ved hjelp av fremgangsmåter som er analoge med de som er beskrevet av Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. beskriver to sekvens-vise, reversfase HPLC-trinn for rensing av rekombinant, humant IL-2 på en preparativ HPLC-kolonne.

Administrering av CD40- L- preparater

For terapeutisk anvendelse administreres renset CD40-L eller en biologisk aktiv analog derav til en pasient, fortrinnsvis et menneske, for behandling på en passende måte for indikasjonen. Således kan f.eks. farmasøytiske CD40-L-preparater (f.eks. i form av et oppløselig, ekstracellulært domene eller et fragment derav) som administreres for.å oppnå en ønsket terapeutisk effekt, gis ved bolusinjeksjon, kontinuerlig infusjon, vedvarende frigjørelse fra implantater eller annen egnet teknikk. Vanligvis vil et terapeutisk CD40-L-middel bli administrert i form av et farmasøytisk preparat som omfatter renset CD40-L-polypeptid sammen med fysiologisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynningsmidler. Slike bærere vil være ikke-toksiske for pasienter ved de doseringene og konsentrasjonene som anvendes. Vanligvis medfører fremstillingen av slike preparater kombinasjon av et CD40-L- polypeptid med buffere, slike antioksidanter som askorbinsyre, polypeptider med lav molekylvekt (mindre enn ca. 10 rester), proteiner, aminosyrer, karbohydrater inkludert glukose, sukrose eller dekstraner, chelateringsmidler, slik som EDTA, glutation og andre stabiliseringsmidler og eksipienser. Nøytral, bufret saltoppløsning eller saltoppløsning blandet med conspesifikt serumalbumin, er eksempler på passende fortynningsmidler. CD40-L-sense- eller -antisense-oligonukleotider kan administreres in vivo ved å administrere en effektiv mengde av en vektor som inneholder en nukleinsyresekvens som koder for et effektivt antisense- eller sense-oligonukleotid. I tillegg kan CD40-L-sense- eller antisense-oligonukleotider administreres ex vivo ved å fjerne celler som inneholder CD40-L-DNA eller mRNA fra et individ, inkorporere et antisense- eller sense-oligonukleotid i cellene under anvendelse av genoverføringsteknikker og på nytt sprøyte inn cellene i individet.

De følgende eksempler er ment å illustrere bestemte utførelsesformer av oppfinnelsen.

Eksempel 1

Dette eksemplet beskriver konstruksjon av en CD40/Fc-DNA-konstruksjon for å uttrykke et oppløselig CD40/Fc-fusjonsprotein for anvendelse ved påvisning av cDNA-kloner som koder for en CD40-ligand. cDNA-sekvensen i det ekstracellulære område eller ligandbindingsdomenet til komplett, human CD40-reseptorsekvens ble erholdt ved å bruke polymerasekjedereak-sjonsteknikker (PCR-teknikker) og er basert på sekvensen publisert i Stamenkovic et al., supra. Et CD40-plasmid (CDM8) ble brukt som et templat for PCR-amplifikasjon. CDM8 er beskrevet i Stamenkovic et al. og ble erholdt fra forfatterne. En PCR-teknikk (Sarki et al., Science 239:487, 1988) ble brukt under anvendelse av 5'- (oppstrøms) og 3'- (nedstrøms) oligonukleotidprimere for å amplifisere DNA-sekvensene som koder for CD40 ekstracellulært ligandbindingsdomene. Oppstrøms oligonukleotidprimer 5'-CCGTCGACCACCATGGTTCGTCTGCC-3' (sekvens med iden-tif ikasjonsnr . 5) innfører et Sal 1-sete oppstrøms fra et initiatormetionin i CD40 og en nedstrøms oligonukleotidprimer 5'- ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3' (sekvens med identifikasjonsnr. 7) som innføyer aminosyrene Tyr Val Glu Pro Arg (sekvens med identifikasjonsnr. 8) etter aminosyre 193 i CD40. Glu og Pro er de to første aminosyrene i et leddområde i humant IgGl og etterfølges av et Bgl II-restriksjonssete som ble brukt til å fusjonere det ekstracellulære domene i CD40 til det gjenværende av humant IgGl-Fc-område.

DNA-konstruksjonen pDC406/CD40/Fc ble transfektert i apenyrecellelinjen CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). pDC406-plas-midet omfatter regulatorsekvenser avledet fra SV40, humant immunsviktvirus (HIV) og Epstein-Barr-virus (EBV). CV-l/EBNA-cellelinjen ble utvunnet ved transfeksjon av CV-l-cellelinjen med et gen som koder for Epstein-Barr-viruskjerneantigen-1 (EBNA-1) som konstitutivt uttrykker EBNA-1 drevet fra den humane CMV-mellomliggende "early enhancer"/promoter. EBNA-1-genet muliggjør episomal replikasjon av ekspresjonsvektorer, slik som pDC406, som inneholder EBV-replikasjonsopprinnelses-stedet.

Når først celler som uttrykker fusjonskonstruksjonen var identifisert, ble storskalakulturer av transfekterte celler dyrket for å akkumulere supernatant fra celler som uttrykker CD40/FC. CD40/Fc-fusjonsproteinet i supernatantvæske ble renset ved affinitetsrensing. I korte trekk ble 1 liter kultursupernatant inneholdende CD40/Fc-fusjonsprotein, renset ved å filtrere pattedyrcellesupernatanter (f.eks. i et 0,45 um filter) og tilføre filtrat til en protein-A/G-antistoffaffini-tetskolonne (Schleicher und Schuell, Keene, NH) ved 4°C ved en strømningshastighet på 80 ml/time i en 1,5 cm x 12,0 cm kolonne. Kolonnen ble vasket med 0,5 M NaCl i PBS (fosfatbufret salt-oppløsning) inntil fritt protein ikke kunne påvises i vaskebuffer. Til sist ble kolonnen vasket med PBS. Bundet fusjonsprotein ble eluert fra kolonnen med 25 mM sitratbuffer, pH 2,8, og brakt til pH 7 med 500 mM Hepes-buffer, pH 9,1. Sølvfargede SDS-geler av det eluerte CD40/Fc-fusjonsprotein viste at det var >98% rent.

Renset CD40/Fc-f us jonsprotein ble jodert med125I under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig fastfasemiddel (Iodo-Gen", Pierce). Ved denne fremgangsmåten ble 5 ug "Iodo-

Gen" platet ut i bunnen av et 10 x 75 mm glassrør og inkubert

i 20 minutter ved 4°C med 75 ul 0,1 M natriumfosfat, pH 7,4,

og 20 ul (2 mCi) Na<125>I. Oppløsningen ble så overført til et andre glassrør inneholdende 5 ug CD40/Fc i 45 ul PBS, og denne reaksjonsblanding ble inkubert i 20 minutter ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved gelfiltrering på et 2 ml lagvolum av "Sephadex" G-25 (Sigma) og så ekvilibrert i RPMI 1640-medium inneholdende 2,5% (volum/volum) bovint serumalbumin (BSA), 0,2% (volum/volum) natriumazid og 20 mM Hepes, pH 7,4, bindingsmedium. Sluttblandingen av12<5>I CD40/Fc ble fortynnet til en arbeidsstandardoppløsning av 1 x IO"<7>M i bindingsmedium og lagret i opp til én måned ved 4°C uten påvisbart tap av reseptorbindingsaktivitet.

Det ble observert omtrent 50-60% markørinkorporering. Radioaktiv jodering ga spesifikke aktiviteter i området 1 x IO<15>til 5 x IO15 cpm/nmol (0,42-2,0 atomer radioaktivt jod pr. proteinmolekyl). SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) avslørte et enkelt, merket polypeptid i overensstemmelse med forventede verdier. Det merkede fusjonsprotein var mer enn 98% trikloreddiksyreutfellbart (TCA-utfellbart), noe som indikerer at<125>I var kovalent bundet til proteinet.

Eksempel 2

Dette eksemplet beskriver utvelgelse av en cellelinje som antas å uttrykke CD40-L. Flere cellelinjer ble screenet under anvendelse av det radioaktivt joderte CD40/Fc-fusjonsprotein beskrevet i eksempel 1. I korte trekk ble kvantitative bindingsundersøkelser utført i henhold til standardmetodikk,

og Scatchard-plottinger ble utvunnet for de forskjellige cel-lelinjene. En klonal cellelinje (EL4, ATCC katalog TIP 39), en murin tymomcellelinje, ble identifisert og sortert. Før sor-tering ble EL-4-celler funnet å uttrykke omtrent 450 molekyler CD40-L pr. celle. Cellene av syvende sort ble kalt EL-40.7 og ble dyrket og funnet å uttrykke omtrent 10.000 molekyler CD40-L pr. celle. Til sist ble cellene av niende sort kalt EL-40.9 og ble dyrket og funnet å uttrykke omtrent 15.000 molekyler CD40-L pr. celle.

Eksempel 3

Dette eksemplet beskriver fremstilling av et cDNA-bibliotek for ekspresjonskloning av murin CD40-L. Biblioteket ble fremstilt fra en femtesortert klon av en musetymomcelle-linje EL-4 (ATCC TIB 39), kalt EL-40.5. EL-40.5-celler var EL4-celler sortert fem ganger med biotinylert CD40/Fc-fusjonsprotein i en FACS (fluorescensaktivert cellesorterer). Et cDNA-bibliotek ble laget fra RNA erholdt fra EL-40.5-celler hovedsakelig som beskrevet i US patentskrift nr. 4 968.607. I korte trekk ble et cDNA-bibliotek konstruert ved revers-transkripsjon av poly (A)<+>mRNA isolert fra den totale RNA ekstrahert fra EL-40.5-cellelinjen. Bibliotekskonstruksjons-teknikken var i det vesentlige lik den som er beskrevet av Ausubel et al., red., Current Protocols In Molecular Biology, vol. 1, (1987). Poly (A)<+>mRNA ble isolert ved hjelp av oligo-dT-cellulosekromatografi, og dobbelttrådet cDNA ble laget hovedsakelig som beskrevet av Gubler et al., Gene 25:263, 1983. Poly (A)<+>mRNA-fragment ble omdannet til RNA-cDNA-hybrider ved hjelp av reverstranskriptase under anvendelse av vilkårlige heksanukleotider som primere. RNA-cDNA-hybridene ble så omdannet til dobbelttrådede cDNA-fragmenter under anvendelse av RNAse H i kombinasjon med DNA-polymerase I. Den resulterende, dobbelttrådede cDNA ble gjort buttendet med T4-DNA-polymerase.

ble ligert til 5'-ender i resulterende buttendet cDNA, som beskrevet i Haymerle et al., Nucleic Acids Res. 14:8615, 1986. Ikke-ligerte adaptorer ble fjernet ved hjelp av gelfiltrer-ingskromatografi ved 68°C. Dette etterlot 24-nukleotiders ikke-selvkomplementære overheng på cDNA. Den samme fremgangsmåte ble brukt til å omdanne 5'-Sal I-ender i pattedyrekspre-sjonsvektoren pDC406 til 24 nukleotiders overheng som er komplementære til de som er tilføyet til cDNA. Optimale forhold mellom adaptortilsatt vektor og cDNA ble ligert i nærvær av T4-polynukleotidkinase. Dialyserte ligeringsblandinger ble

elektroporert i E. coli-stamme DH5a og transformanter valgt ut på ampicillinplater.

Plasmid-DNA ble isolert fra blandinger bestående av omtrent 2.000 kloner av transformert E. coli pr. blanding. Den isolerte DNA ble transfektert i et sammenflytende lag av CVl-EBNA-celler under anvendelse av DEAE-dekstranet etterfulgt av klorokinbehandling, hovedsakelig ifølge fremgangsmåtene beskrevet i Luthman et al., Nucl. Acids Res. 22:1295, 1983 og McCutchan et al., J. Nati. Cancer Inst. 42:351, 1986.

CVl-EBNA-celler ble holdt i komplett medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 10% (volum/volum kalvefosterserum, 50 U/ml penicillin, 50 U/ml streptomycin og 2 mM L-glutamin) og ble platet ut til en tetthet på omtrent 2 x IO<5>celler/brønn i enkeltbrønnoppdelte objektglass (Lab-Tek). Objektglassene ble forbehandlet med 1 ml humant fibronektin (10 ug/ml PBS) i 30 minutter etterfulgt av en enkelt vasking med PBS. Medium ble fjernet fra adherente celler som vokste i et lag og erstattet med 1,5 ml komplett medium inneholdende 66,6 uM klorokinsulfat. Ca. 0,2 ml av en DNA-oppløsning (2 ug DNA, 0,5 mg/ml DEAE-dekstran i komplett medium inneholdende klorokin) ble tilsatt til cellene, og blandingen ble inkubert ved 37°C i ca. 5 timer. Etter inkubasjon ble medium fjernet, og cellene ble sjokkbehandlet ved tilsetning av komplett medium inneholdende 10% DMSO (dimetylsulfoksid) i 2,5-20 minutter. Sjokkbehandling ble etterfulgt av erstatning av oppløsningen med nytt, komplett medium. Cellene ble dyrket i kultur i 2 til 3 dager for å muliggjøre forbigående ekspresjon av de innføyde DNA-sekvenser. Disse betingelsene førte til en 30% til 80% transfeksjonshyppighet for overlevende CVl-EBNA-celler.

Eksempel 4

Dette eksemplet beskriver screening av ekspresjonskloningsbiblioteket laget i eksempel 3 med et merket CD40/FC-fusjonsprotein laget i eksempel 1. Etter 48-72 timer ble transfekterte monolag av CVl-EBNA-celler laget i eksempel 3, analysert ved hjelp av objektglassautoradiografi med hensyn på ekspresjon av CD40-L under anvendelse av radioaktivt jodert CD40/Fc-fusjonsprotein som fremstilt i eksempel 1. Transfekterte CVl-EBNA-celler ble vasket én gang med bindingsmedium (RPMI 1640 inneholdende 25 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 2 mg/ml natriumazid, 20 mM Hepes, pH 7,2, og 50 mg/ml tørrmelk uten fett) og inkubert i 2 timer ved 4°C i bindingsmedium inneholdende 1 x IO"<9>M<125>I-CD40/Fc-fusjonsprotein. Etter inkubasjon ble celler i de rominndelte objektglass vasket tre ganger med bindingsbuffer, etterfulgt av to vaskinger med PBS, (pH 7,3) for å fjerne ubundet, radioaktivt merket fusjonsprotein .

Cellene ble fiksert ved å inkubere i 10% glutaraldehyd i PBS (30 minutter ved romtemperatur), vasket to ganger i PBS og lufttørket. Objektglassene ble dyppet i "Kodak GTNB-2" fotografisk emulsjon (6 x fortynning i vann) og eksponert i mørket i 2 til 4 dager ved romtemperatur i en lystett boks. Objektglassene ble fremkalt i "Kodak D19" fremkaller, skyllet i vann og fiksert i "Agfa G433C" fikserbad. Objektglassene ble undersøkt hver for seg under et mikroskop ved 25-40x forstør-relse. Positive objektglass som oppviste celler som uttrykker CD40-L, ble identifisert ved tilstedeværelsen av autoradiografiske sølvkorn mot en lys bakgrunn.

Én blanding inneholdende omtrent 2.000 individuelle kloner, ble identifisert som potensielt positive for binding av CD40/Fc-fusjonsproteinet. Blandingen ble titrert og platet ut for å tilveiebringe plater som inneholdt omtrent 200 kolonier hver. Hver plate ble skrapet for å tilveiebringe blandet plasmid-DNA for transfeksjon i CVl-EBNA-celler i henhold til den samme fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor. De mindre blandingene ble screenet ved hjelp av objektglassautoradiografi som beskrevet tidligere. Én av de mindre blandingene inneholdt kloner som var positive med hensyn på CD40-L, slik som indikert ved tilstedeværelsen av et uttrykt genprodukt som er i stand til å binde seg til CD40/Fc-fusjonsproteinet.

Den positive, mindre blanding ble titrert og platet ut, hvorved man fikk individuelle kolonier. Omtrent 400 individuelle kolonier ble plukket ut og inokulert i dyrknings-medium i individuelle brønner på 96-brønners plater. Kulturer ble blandet ved å slå sammen rekker og spalter, og de blandede kulturer ble brukt til å fremstille DNA for en sluttrunde med transfeksjon og screening. Et kryssfelt i en positiv rekke og en positiv spalte indikerte en potensielt positiv koloni. Ti potensielt positive kolonier (dvs. kandidatkloner) ble identifisert. DNA ble isolert fra hver kandidatklon, på nytt transfektert og på nytt screenet. Fem kandidatkloner var positive ved binding til CD40/Fc. Alle fem positive kandidatkloner inneholdt en cDNA-innføyelse med 1.4 68 nukleotider, bestemt ved hjelp av dideoksynukleotidsekvensering. cDNA-kodings-området i CD40-L-klonen tilsvarer sekvensen i figur 1 og sekvens med identifikasjonsnr. 1.

En kloningsvektor inneholdende murin CD40-L-sekvens, betegnet pDC406-mCD40-L, ble deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC), 6. desember 1991, under deponeringsnr. 68872. Nukleotidsekvensen og den forutsagte aminosyresekvens til denne klonen er illustrert i sekvens med identifikasjonsnr. 1 og i figur 1.

Eksempel 5

Dette eksemplet illustrerer en artskrysningshybridis-eringsteknikk som ble brukt til å isolere en human CD40-L-homolog under anvendelse av en probe utformet fra sekvensen til murin CD40-L. En murin CD40-L-probe ble fremstilt ved å ta ut det kodende område fra murin CD40-L-klon p-DC406-CD40-L (nukleotid 13-7 93) og<32>P-merking av fragmentet under anvendelse av vilkårlige primere (Boehringer-Mannheim).

Et cDNA-bibliotek fra human lymfocytt fra perifert blod ble konstruert i en A-fagvektor under anvendelse av XgtlO-armer og emballert in vitro under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett ("Gigapak" Stratagene, San Diego, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. PBL-cellene ble erholdt fra normale, humane frivillige og behandlet med 10 ng/ml 0KT3 (et anti-CD3-antistoff) , og 10 ng/ml humant IL-2 (Immunex, Seattle, WA) i seks dager. PBL-cellene ble vasket og stimulert med 500 ng/ml ionomycin (Calbiochem) og 10 ng/ml PMA (Sigma) i fire timer. Messenger-RNA og cDNA ble erholdt fra de stimulerte PBL-celler og emballert i Xgtl0-fagvektorer ("Gigapak" Stratagene) i henhold til produsentens instruksjoner.

Den murine probe ble hybridisert til fag-cDNA i 6 X SSC (15 mM trinatriumsitrat og 165 mM natriumklorid), 1 X Denhardts oppløsning, 2 mM EDTA, 0,5% Np40 ved 63°C over natten. Hybridisering ble etterfulgt av omfattende vasking i 3 X SSC, 0,1% SDS ved omtrent 55°C i 3 timer. Spesifikke bånd ble visualisert ved autoradiografi.

En kloningsvektor inneholdende human CD40-L-sekvens, betegnet hCD4 0-L, ble deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC), 6. desember 1991, under deponeringsnr. 68873. Nukleotidsekvensen og den forutsagte aminosyresekvens til denne klon er illustrert i sekvens med identifikasjonsnr. 11 og i figur 2.

Eksempel 6

Dette eksemplet illustrerer ekspresjonen av membranbundet, murin CD40-L i CVl-EBNA-celler. Murin CD40-L-CDNA i HAVEO-vektor eller tom HAVEO-vektor ble transfektert i CVl-EBNA-celler under anvendelse av standardteknikker, slik som de som er beskrevet i McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991, og i eksempel 3 her. I korte trekk ble CVl-EBNA-celler platet ut ved en tetthet på 2 x IO<6>celler pr. 10 cm plate i 10 ml Dulbeccos minimalt, essensielt medium supplert med 10% kalvefosterserum (medium). Cellene fikk feste seg over natten ved 37°C. Mediet ble erstattet med 1,5 ml medium inneholdende 66,7 uM klorokin og en DNA-blanding inneholdende 5 ug cDNA som koder for mCD40-L. Medium inneholdende 175 ul og 25 ul DEAE-dekstran (4 mg/ml i PBS), ble også tilsatt til cellene. Cellene og cDNA ble inkubert ved 37°C i 5 timer. cDNA-blandingen ble fjernet, og cellene ble sjokkbehandlet med 1 ml nytt medium inneholdende 10% DMSO i 2,5 minutter. Mediet ble erstattet med nytt medium, og cellene ble dyrket i minst 3 dager.

Eksempel 7

Dette eksemplet illustrerer fremstillingen av monoklonale antistoffer mot CD40-L. Preparater av renset, murin CD40-L eller human CD40-L fremstilles ved hjelp av COS-celle-ekspresjon og CD40/Fc-affinitetsrensing som her beskrevet. Renset CD40-L kan frembringe monoklonale antistoffer mot CD40-L under anvendelse av vanlige teknikker, f.eks. de teknikkene som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 411 993. I korte trekk ble mus immunisert med CD40-L som et immunogen, emulgert i komplett Freunds adjuvans, og ble injisert i mengder i området fra 10-100 ug subkutant eller intraperitonealt. 10 til 12 dager senere tilføres de immuniserte dyrene ytterligere CD40-L emulgert i ukomplett Freunds adjuvans. Mus får deretter ny tilførsel etter en ukentlig til to-ukentlig immuniserings-plan. Serumprøver tas periodevis ved retroorbital blodprøve-taking eller haletypeeksisjon for testing ved hjelp av "dot blot"-analyse eller ELISA (enzymbundet immunsorbentanalyse) med hensyn på CD40-L-antistoffer.

Etter påvisning av en passende antistofftiter for-synes positive dyr med en siste intravenøs injeksjon av CD40-L i saltoppløsning. 3 til 4 dager senere avlives dyrene, miltcellene innhøstes, og miltcellene fusjoneres til en murin mye-lomcellelinje (f.eks. NS1 eller Ag 8.653). Fusjoner frem-bringer hybridomceller som plates ut i multiple mikrotiterplater i et HAT (hypoksantin, aminopterin og tymidin) selektivt medium for å inhibere proliferasjon av ikke-fusjonerte celler, myelomhybrider og miltcellehybrider.

Hybridomcellene screenes ved hjelp av ELISA med hensyn på reaktivitet mot renset CD40-L ved hjelp av tilpasninger av teknikkene som er beskrevet i Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971, og i US patentskrift nr. 4 703 004. Positive hybridomceller kan injiseres intraperitonealt i syngene . BALB/c-mus, hvorved det fremstilles ascites som inneholder høye konsentrasjoner av anti-CD40-L-monoklonale antistoffer. Alternativt kan hybridomceller dyrkes in vitro i kolber eller rulleflasker ved hjelp av forskjellige teknikker. Monoklonale antistoffer fremstilt i museascites, kan renses ved ammonium-sulfatutfelling, etterfulgt av gelutelukkelseskromatografi. Alternativt kan affinitetskromatografi basert på binding av antistoff til protein A eller protein G, også brukes, like så vel som affinitetskromatografi basert på binding på CD40-L.

Eksempel 8

Dette eksemplet illustrerer anti-allergiterapeutiske effekter avSCD40 og CD40/Fc-fusjonsprotein. Oppløselige CD40 og CD40/FCble testet med hensyn på deres evne til å inhibere IL-4- (5 ng/ml) indusert IgE-sekresjon i et to-donors MLC-system. Dataene fra tre forsøk er vist i tabell 1.

IgE-nivåer ble målt etter 12 dager i kultur ved hjelp av en ELISA-fremgangsmåte. I korte trekk ble flatbunnede, 96-brønners mikrotiterplater (Corning) belagt med muse-mAb-anti-humant IgE (Zymed) ved fortynning i forholdet 1:500 i PBS (fosfatbufret saltoppløsning). Etter tre gangers vasking ble det utført et blokkeringstrinn under anvendelse av 5% tørrmelk uten fett, etterfulgt av titrering av standarder av humant IgE eller testsupernatanter. Etter vasking tre ganger ble biotinylert geite-anti-humant IgE (Kirkegaard og Perry) tilsatt ved en fortynning i forholdet 1:500. Dette ble etterfulgt av ytterligere vasking og så tilsetning av streptavidin-HRP (Zymed) ved en fortynning i forholdet 1:500. Etter ytterligere vasking ble reaksjonen fremkalt under anvendelse av TMB-substrat (Kirkegaard og Perry), og absorbans ble målt ved 520 nm. Alle vasketrinn ble utført i PBS pluss 0,05% "Tween". Alle inkubasjonstrinn ble utført ved volumer på 100 ul/brønn i 1 time ved romtemperatur. Sensitiviteten til denne analysen er 100 pg/ml.

Eksempel 9

Dette eksemplet illustrerer effektene av sCD40 og CD40/Fc-fusjonsprotein når det gjelder å inhibere utskillelse av oppløselig CD23 fra IL-4-stimulerte (5 ng/ml) B-celler. Oppløselig CD40 og CD40/Fc ble testet med hensyn på deres evne til å inhibere IL-4-indusert utskillelse av sCD23 i et to-donors MLC-system. Dataene fra tre forsøk er vist i tabell 2.

Nivåer av oppløselig CD23 ble målt etter 6 og 12

dager i kultur ved hjelp av et kommersielt sCD23 ELISA-påvis-ningssett (Binding Site, San Diego, CA). Sensitivitetsgrensen var 500 pg/ml. Omtrent 1 x IO<5>pr. brønn ble dyrket in triplo i rundbunnete, 96-brønners mikrotiterplater (Intermountain Scientific, Bountiful, UT) i den angitte tid i nærvær eller

fravær av additiver som angitt i tabell 2. Resultatene viser anti-allergieffekter av sCD40. Lignende undersøkelser ble kjørt med CD40/Fc (data ikke vist) i stedet for sCD40, og det ble oppnådd lignende resultater. Disse dataene i eksemplene 8 og 9 illustrerer følgelig en anti-allergiegenskap hos CD40.

Eksempel 10

Dette eksemplet illustrerer B-celleproliferativ aktivitet av membranbundet, murin CD40-L for humane B-celler. Mononukleære celler fra humant, perifert blod (PBMC) ble isolert fra perifert blod fra normale frivillige ved densitetsgradientsentrifugering over "Histopaque" (Sigma, St. Louis, MO). T-celleuttømte preparater av celler (E~) ble erholdt ved å fjerne T-celler ved rosettbehandling med 2-aminoetylisotio-uroniumbromidbehandlede SRBC (røde blodlegemer fra sau) og ytterligere densitetsgradientsentrifugering over "Histopaque". B-celleproliferasjonsanalyser ble utført med E~-preparater i RPMI-medium med tilsatt 10% varmeinaktivert, bovint foster-serum (FBS) ved 37°C i en 10% C02-atmosfære. Omtrent 1 X IO<5>E"-celler pr. brønn ble dyrket in triplo i flatbunnede, 96-brønners mikrotiterplater (Corning) i 7 dager i nærvær av transfekterte CVl-EBNA-celler (beskrevet i eksempel 6). CV1-EBNA-cellene ble transfektert med murin CD40-L-cDNA eller tom vektor. Cellene ble pulset med 1 uCi/brønn tritiert tymidin (25 Ci/nmol Amersham, Arlington Heights, IL) i de siste åtte dyrkningstimene. Celler ble innhøstet på glassfiberplater med en automatisert celleinnhøster, og inkorporert cpm ble målt ved væskescintillasjonsspektrometri.

Figur 4a viser en sammenligning mellom human B-celleproliferasjon av CVl-EBNA-celler transfektert med tom vektor (HAVEO) eller med murin CD40-L-cDNA i HAVEO-vektor. Disse dataene viser at membranbundet CD4 0-L stimulerer human B-celleproliferasjon i fravær av et komitogen. Figur 4b viser et lignende forsøk, bortsett fra at 10 ng/ml humant IL-4 ble tilsatt til kulturene. I dette forsøket øker IL-4 svakt den B-cellemitogene aktivitet av membranbundet, murin CD40-L. Figur 5 er en gjentagelse av forsøket vist i figur 4b. Når forsøket ble gjentatt, var det imidlertid ikke noe bevis på IL-4-ko mitogen aktivitet. Det var gjentatt bevis på CD40-L-mitogen aktivitet. Membranbundet CD40-L stimulerer følgelig proliferasjon av humane B-celler.

Eksempel 11

Dette eksemplet illustrerer effekten av membranbundet, murin CD40-L når det gjelder å stimulere IgE-produksjon og CD23-utskillelse fra E"-celler isolert i eksempel 10. Omtrent 1 X IO<5>celler/brønn ble dyrket in triplo i rundbunnete, 96-brønners "Nunc" mikrotiterplater (Intermountain Scientific, Bountiful, UT) i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) pluss 10% FCS i en fuktig atmosfære ved 10% C02. Medium ble supplert med 50 ug/ml humantransferrin (Sigma), 0,5% bovint serumalbumin (Sigma) og 1 ug/ml hver av olje-, linolein- og palmitinsyre (Sigma) . E"-cellene ble dyrket i 10 dager i nærvær av 5 ng/ml humant IL-4. En titrering av CVl-EBNA-celler transfektert med murin CD40-L eller tom vektor, ble tilsatt. Etter 10 dager ble kultursupernatanter analysert med hensyn på IgE ved hjelp av ELISA-fremgangsmåten beskrevet i eksempel 8, eller med hensyn på CD23-utskillelse ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 9.

Figur 6 viser en sammenligning mellom IgE-produksjon i supernatantene (i ng/ml) for kulturer av E"-celler og CVl-EBNA-celler transfektert med tom vektor (HAVEO) eller med CD40-L. Det ble ikke lagt merke til noen forskjeller med opp til 3000 CVl-EBNA-celler, men man fikk imidlertid signifikant IgE-produksjon med tilsetning av 10.000 eller 30.000 CD40-L-transfekterte CVl-EBNA-celler. Som en sammenligning var, når E"-celler ble inkubert med medium alene, 5 ng/ml IL-4 eller

5 ng/ml IL-4 pluss 500 ng/ml G28-5-antistoff, IgE-produksjon henholdsvis 4,7, 2,9 og >600 ng/ml. Når CD23-utskillelse ble målt i figur 7, oppviste 10.000 og 30.000 CVl-EBNA-celler transfektert med CD40-L, økt CD23-utskillelse sammenlignet med tom vektorkontroll CVl-EBNA-celler. Som en sammenligning var, når E"-celler ble inkubert med medium alene, 5 ng/ml IL-4 eller 5 ng/ml IL-4 pluss 500 ng/ml G28-5-antistoff, CD23-utskillelse mindre enn henholdsvis 0,1, 2,4 og 11,2 ng/ml. Disse dataene viser at IgE-produksjon og CD23-utskillelse begge er biologiske aktiviteter forbundet med membranbundet CD40-L.

Eksempel 12

Dette eksemplet illustrerer B-celleproliferativ aktivitet, produksjon av polyklonalt immunglobulin (lg), dannelse av antigenspesifikt antistoff og forskjellige fremgangsmåter for anvendelse av membranbundet og oppløselig CD40-L i kliniske anvendelser. Vi oppnådde murine B-celler fra milt i henhold til fremgangsmåter beskrevet i Grabstein et al. I supra, Maliszewski et al. I supra og Maliszewski et al. II supra. I korte trekk ble den blandede kultur av celler renset ved hjelp av T-celleuttømming under anvendelse av T-celle-antiserum og komplement, og adherent celleuttømming ved pas-sering i "Sephadex" G10-kolonner og ved B-cellepositiv utvelgelse ved "panning" på petriskåler belagt med geite-anti-muse-IgM. Rensede B-celler ble dyrket i RPMI, kalvefosterserum (5% for B-celleproliferasjonsanalyser og 20% for plakkdannende celleanalyser eller for analyser med polyklonalt antistoff), 2-merkaptoetanol, antibiotika, aminosyrer og pyruvat. B-celle-prolif eras jon ble målt i henhold til analysen beskrevet i eksempel 10 og i Grabstein et al. I supra, Maliszewski et al. I supra og Maliszewski et al. II supra. Antigenspesifikk anti-stof f dannelse ble målt ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i Grabstein et al., J. Mol. Cell. Immunol. 2:199, 1986 [Grabstein et al. II]. I korte trekk ble det 'ved antigenspesifikk antistoffdannelse brukt røde blodlegemer fra sau (SRBC) som antigen (0,03% volum/volum) i 2,0 ml kulturer av 1 X 10<6>murine B-celler pr. kultur. B-cellekulturene ble inkubert i 5 dager, og plakkdannende celler ble bestemt ved hjelp av Jerne hemolytisk plakkanalyse som beskrevet i Grabstein et al. II supra. Celleantall ble bestemt i en coulter-teller. Polyklonal Ig-utskillelse ble bestemt ved hjelp av isotypespesifikke ELISA-analyser i 7-dagers kulturer med 1 X IO<6>B-celler pr. 2,0 ml kultur som beskrevet i Maliszewski et al. I supra og i Maliszewski et al. II supra.

Resultatene av B-celleproliferasjon ved hjelp av CVl-EBNA-celler transfektert med CD40-L eller tom vektor eller 7Al-celler (en T-cellehjelperklon), er vist i figurene 8, 10 og 12. Disse dataene viser at den største B-celleproliferasjon ble forårsaket av CD40-L. T-cellehjelperceller 7A1 og 7C2 hadde en minimal effekt på B-celleproliferasjon.

Effektene av forskjellige celler etter antigenspesifikk antistoffdannelse er vist i figurene 9 og 11. Figur 9 viser en sammenligning mellom plakkdannende celler hvor T-cellehjelperklon 7A1 og murine EL40.9-celler som utskiller en oppløselig CD40-L, sammenlignes. EL40.9-cellene synes å ha en inhibitoreffekt på antigenspesifikk antistoffdannelse. Figur 11 viser PFC (plakkdannende celler) for T-cellehjelperceller 7C2 og CVl-EBNA-celler transfektert med enten tom vektor eller CD40-L. Både 7C2-celler og membranbundet CD40-L stimulerte antigenspesifikk antistoffdannelse (PFC). I figur 13 sammenlignes antigenspesifikk antistoffdannelse av CD40-L og 7A1-celler i nærvær eller fravær av 10 ng/ml interleukin-2 (IL-2). IL-2 økte PFC for 7Al-celler, men økte ikke PFC forårsaket av membranbundet CD4 0-L.

Produksjon av polyklonalt lg ved hjelp av murine B-celler ble sammenlignet med hensyn på stimulering eller inhibering med membranbundet CD40-L, kontroll-CVl-EBNA-celler og hjelper-T-celler 7A1 i nærvær av cytokiner IL-4 (10 ng/ml) og IL-5 (1:40 fortynning av COS-cellesupernatanter) eller uten tilsatte cytokiner. Mengden av IgA, IgG3, IgE, IgG2b, IgM og IgGl er vist i henholdsvis tabellene 3-8.

Disse dataene indikerer at interaksjonen av CD40 med dens ligand er den viktigste molekylære interaksjon som er ansvarlig for T-cellekontaktavhengig induksjon av B-cellevekst og differensiering, både for antigenspesifikk antistoffproduksjon og polyklonal Ig-sekresjon. Som sådanne tyder disse dataene på at antagonister for denne interaksjonen vil, ved hjelp av oppløselig CD40, CD40/Fc-fusjonsprotein og muligens oppløselig CD40-L (monomer), signifikant virke inn på utvik-ling av antistoffresponser. Kliniske situasjoner hvor CD40, CD40/Fc-fusjonsproteiner og oppløselig CD40-L kan anvendes, omfatter derfor allergi, lupus, reumatoid artritt, insulinavhengig diabetes mellitus og enhver annen sykdom hvor autoim-munantistoff. eller antigen/antistoff-komplekser er ansvarlige for sykdommens kliniske patologi. Membranbundet CD40-L eller oligomer, oppløselig CD40-L vil dessuten være nyttig for å stimulere B-celleproliferasjon og antistoffproduksjon. Som sådanne er disse formene av CD40-L svært nyttige for vaksineadjuvanser og som et stimuleringsmiddel for mAb-sekresjon fra hybridomceller.

Eksempel 13

Dette eksemplet illustrerer effekten av membranbundet CD40-L etter proliferasjon av og IgE-sekresjon fra mononukleære celler fra perifert blod (E~) E-celler ble erholdt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 10 og inkubert i 7 eller 10 dager i nærvær av CVl-EBNA-celler transfektert med tom vektor eller mCD40-L-cDNA. I tillegg ble CD40/Fc-fusjonsprotein (beskrevet i eksempel 1) eller TNF-reseptor/Fc-fusjonsprotein (beskrevet i WO 91/03553) tilsatt til noen av preparatene som angitt i figur 14. IgE-sekresjon ble målt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 8, og B-celleproliferasjon ble målt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 10.

Resultatene for B-celleproliferasjon og IgE-sekresjon er vist i figur 14 for fem forskjellige konsentrasjoner av transfekterte CVl-EBNA-celler. Både B-celleproliferasjon og IgE-sekresjon ble økt i nærvær av membranbundet CD40-L. Tilsetning av CD40/Fc-fusjonsprotein fjernet både B-celleproliferasjon og IgE-sekresjon. TNF-reseptor/Fc-fusjonsproteinet hadde ingen effekt. Som en sammenligning for IgE-sekresjon ga tilsetning av IL-4 som kontrollmiddel (uten transfekterte CVl-EBNA-celler) ingen IgE i denne analysen, og tilsetning av IL-4 pluss G28-5-anti-CD40-mAb resulterte i 2-9,7 ng/ml IgE i denne analysen.

Eksempel 14

Dette eksemplet beskriver konstruksjon av en CD40-L/Fc-DNA-konstruksjon for å uttrykke et oppløselig CD40-L/Fc-fusjonsprotein henvist til som CD40-L/FC2-konstruksjon. DNA som koder for CD40-L/FC2, omfatter sekvenser som koder for et lederpeptid (eller signalpeptid), en 8 aminosyrers hydrofil sekvens beskrevet av Hopp et al. (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988; henvist til som "Flag"), et egnet Fc-område i et immunglobulin, en [Gly4Ser] 3-gjentakelsessekvens (beskrevet i US patentskrift nr. 5 073 627) eller annen egnet linkersekvens, og det ekstracellulære område i human CD4 0-L fra aminosyre 50 til aminosyre 261 (sekvens med identifikasjonsnr. 11). En pDC406-ekspresjonsvektor inneholdende en ledersekvens, "Flag" og humant IgGi-Fc, fremstilles ved å bruke vanlige teknikker for enzymkutting og ligering av fragmenter som koder

for en ledersekvens, "Flag" og humant IgGi-Fc, og ble

•begrenset med Nsi 1 og Not 1.

En PCR-teknikk (Sarki et al., Science 239:487, 1988) ble brukt under anvendelse av 51 - (oppstrøms) og 3'- (ned-strøms) oligonukleotidprimere for å amplifisere DNA-sekvensene som koder for CD40 ekstracellulært ligandbindingsdomene fra en kloningsvektor som inneholdt human CD40-L (ATCC 68873, sekvens med identifikasjonsnr. 11) for å danne et PCR-fragment. Den oppstrøms oligonukleotidprimer (sekvens med identifikasjonsnr. 13) innførte et Nsi I-sete oppstrøms fra en linkersekvens ( [Gly4Ser]3SerSer) , som ble etterfulgt av 21 nukleotider fra det ekstracellulære domene i CD40-L (aminosyrene 51-57 i sekvens med identifikasjonsnr. 11). En nedstrøms oligonukleotidprimer (sekvens med identifikasjonsnr. 14) innførte et Not 1-sete like nedstrøms fra termineringskodonet i CD40-L. PCR-fragmentet ble så ligert i pDC406-ekspresjonsvektoren som inneholdt en ledersekvens, "Flag" og humant IgGi-Fc. Nukleo-tidet og den forutsagte aminosyresekvens til CD40-L/FC2 er vist i sekvens med identifikasjonsnr. 15 og sekvens med iden-tif ikasjonsnr . 16. Den resulterende DNA-konstruksjon (CD40- L/FC2) ble transfektert i apenyrecellelinjen CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). Konstruksjonen kodet for en oppløselig CD40-L som var i stand til å binde CD40, slik det ble bevist ved binding observert i fluorescensaktivert cellesorteringsanalyse (FACS) under anvendelse av celler som uttrykker CD40.

Storskalakulturer av humane embryonyre-293-celler (ATCC CRL 1573) transfektert med konstruksjonen som koder for CD40-L/FC2, ble dyrket for å akkumulere supernatant som inneholder CD40-L/FC2. 293-cellelinjen, en permanent linje av pri-mær, human embryonyre transformert med humant adenovirus 5-DNA, muliggjør ekspresjon av rekombinante proteiner ligert i pCD406-vektoren. CD40-L/FC2-fusjonsproteinet i supernatantvæske ble renset ved affinitetsrensing. I korte trekk ble kultursupernatant inneholdende CD40-L/FC2-fusjonsproteinet, renset ved filtrering av pattedyrcellesupernatanter (f.eks. i et 0,45 um filter) og tilførsel av filtrat til en antistoffaffi-nitetskolonne som omfatter biotinylert geite-anti-humant IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., Westgrove, PA, USA) koblet til Streptavidin-agarose (Pierce Chemical, Rock-ford, IL, USA) ved 4°C, og ved en strømningshastighet på omtrent 60 til 80 ml/time for en 1,5 cm x 12,0 cm kolonne. Kolonnen ble vasket med omtrent 20 kolonnevolumer PBS (fosfatbufret saltoppløsning) inntil fritt protein ikke kunne påvises i vaskebuffer. Bundet fusjonsprotein ble eluert fra kolonnen med 12,5 mM sitratbuffer, 75 mM NaCl, pH 2,8, og brakt til pH 7 med 500 mM Hepes-buffer, pH 9,1. Det rensede, oligomere CD40-L/FC2-peptid induserte human B-celleproliferasjon i fravær av enhver kostimulus, og resulterte (sammen med det passende cytokin) i produksjonen av IgG, IgE, IgA og IgM, som beskrevet i eksempel 12 for membranbundet CD40-L.

Eksempel 15

Dette eksemplet beskriver konstruksjon av en CD40-L-DNA-konstruksjon for å uttrykke et oppløselig CD40-L-fusjonsprotein henvist til som trimer CD40-L. Trimer CD40-L inneholder en ledersekvens, en 33 aminosyrers sekvens henvist til som en "leucin-zipper" (sekvens med identifikasjonsnr. 17), og en 8 aminosyrers hydrofil sekvens beskrevet av Hopp et al.

(Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988; henvist til som "Flag"), etterfulgt av det ekstracellulære område i human CD40-L fra aminosyre 50 til aminosyre 261 (sekvens med iden-tif ikasjonsnr . 11). Utnyttbarheten av leder- og "Flag"-sekvensene er blitt beskrevet i den nærmere beskrivelse. Sekvensen med 33 aminosyrer presentert i sekvens med identifikasjonsnr. 17, trimeriserer spontant i oppløsning. Fusjonsproteiner som omfatter denne sekvensen med 33 aminosyrer, forventes således å danne trimerer eller multimerer spontant.

Konstruksjonen fremstilles ved å syntetisere oligonukleotider som representerer en ledersekvens, sekvensen med 33 aminosyrer beskrevet ovenfor og "Flag"-sekvensen, så ligere sluttproduktet til et DNA-fragment som koder for aminosyrene 51-261 i sekvens med identifikasjonsnr. 11, fremstilt som beskrevet i eksempel 14.

Det resulterende ligeringsprodukt i ekspresjonsvektor pDC4 06 ble transfektert i apenyrecellelinjen CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). pDC406-plasmidet omfatter regulatorsekvenser avledet fra SV40, humant immunsviktvirus (HIV) og Epstein-Barr-virus (EBV). CV-l/EBNA-cellelinjen ble utvunnet ved transfeksjon av CV-l-cellelinjen med et gen som koder for Epstein-Barr-virus-kjerneantigen-1 (EBNA-1) som konstitutivt uttrykker EBNA-1 drevet fra det humane CMV-mellomprodukt-"early enhancer" /promoter . EBNA-l-genet muliggjør episomal replikasjon av ekspresjonsvektorer, slik som pDC406, som inneholder EBV-replikasjonsopprinnelsesstedet.

Når først celler som uttrykker fusjonskonstruksjonen er identifisert, dyrkes storskalakulturer av transfekterte celler for å akkumulere supernatant fra celler som uttrykker trimer CD40-L. Det trimere CD40-L-fusjonsprotein i supernatantvæske renses ved affinitetsrensing hovedsakelig som beskrevet i US patentskrift nr. 5 011 912. Sølvfargede SDS-geler av det eluerte CD40-L-fusjonsprotein kan fremstilles for å bestemme renhet.

Claims

1. Isolert antistoff som er immunoreaktivt med CD40-L,karakterisert vedat CD40-L er et polypeptid som angitt fra aminosyre 1 til og med 261 i sekvensen som angitt i SEQ.ID.NR.: 12.

2. Isolert antistoff ifølge krav 1,karakterisert vedat det er et monoklonalt antistoff.

3. Isolert antistoff som er immunoreaktivt med murin CD40-L, karakterisert vedat det murine CD40-L er et polypeptid som angitt fra og med aminosyrene 1 til og med 260 som angitt i SEQ.ID.NR.: 2.

4. Isolert antistoff ifølge krav 3,karakterisert vedat det er et monoklonalt antistoff.