ES2317694T3 - Metodo para inhibir la actividad osteoclastica. - Google Patents
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Abstract
RANK soluble para uso en el alivio de los efectos de la osteoclastogénesis y la actividad osteoclástica en carcinoma de células escamosas.
Description
Método para inhibir la actividad
osteoclástica.
La presente invención se refiere a RANK soluble
para uso en la mejora de los efectos de la osteoclastogénesis y la
actividad osteoclástica en carcinoma de células escamosas.
RANK (Activador del Receptor de
NK-\kappaB) y su ligando (RANKL) son un par
receptor/ligando recientemente descrito que juega un papel
importante en una respuesta inmune. La clonación de RANK y RANKL
está descrita en USSN 08/996.139 y en USSN 08/995.659,
respectivamente. Recientemente se ha encontrado que RANKL se une a
una proteína llamada osteoprotegerina (OPG), un miembro de la
familia de Receptores del Factor de Necrosis Tumoral (TNFR). Yasuda
et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 95:3597, 1998) clonaron en un
vector de expresión un ligando para OPG, que llamaron factor de
inhibición de osteoclastogénesis. Su trabajo fue repetido por Lacey
et al. (Cell 93:165, 1998). En ambos casos, el ligando que
clonaron resultó ser idéntico a RANKL.
En la osteoclastogénesis, la interacción de un
osteoblasto o célula estromal con un precursor de osteoclasto lleva
a la diferenciación del precursor a un osteoclasto. Se conocía que
OPG inhibe esta diferenciación. Se ha propuesto un modelo en el que
RANKL sobre la superficie del osteoblasto o célula estromal
interacciona con un receptor específico sobre la superficie de un
progenitor de osteoclasto, señalizando un acontecimiento de
diferenciación. In vitro, OPG bloquea eficazmente la
interacción de RANKL con un receptor sobre progenitores de
osteoclasto, y se ha demostrado que mejora los efectos de la
ooferectomía sobre la pérdida de hueso en ratones. Sin embargo, OPG
también es conocido por unir otros ligandos en la familia de TNF,
los cuales, in vivo, pueden tener un efecto dañino sobre las
actividades de dichos ligandos. Además, la presencia de otros
ligandos que unen OPG in vivo pueden necesitar altas dosis de
OPG a ser administrado, con el fin de tener suficiente OPG soluble
disponible para inhibir la osteoclastogénesis.
Por consiguiente, existe la necesidad, en el
estado de la técnica, de identificar factores solubles que unen
específicamente RANKL e inhiben la capacidad de RANKL para inducir
osteoclastogénesis sin reaccionar con otros ligandos.
La invención es como se expone en las
reivindicaciones.
La presente invención proporciona usos de un
receptor, llamado RANK (por las siglas en inglés de activador del
receptor de NK-\kappaB), que es un miembro de la
superfamilia de receptores de TNF. RANK es una proteína
transmembrana de tipo I que tiene 616 restos de aminoácidos, que
comprende un dominio extracelular, una región transmembrana y un
dominio citoplásmico. RANK interacciona con varios Factores
Asociados al Receptor de TNF (TRAFs); la estimulación de RANK da
como resultado la regulación al alza del factor de transcripción
NK-\kappaB, un factor de transcripción ubicuo que
es el más extensamente utilizado en células del sistema inmune.
Las formas solubles del receptor pueden ser
preparadas y utilizadas para interferir con la transducción de
señales a través de RANK unido a membrana. La inhibición de la
transducción de señales mediada por RANK será útil en la mejora de
los efectos de la osteoclastogénesis y la actividad osteoclástica
sobre carcinomas de células escamosas.
Las formas solubles de RANK comprenden el
dominio extracelular de RANK o un fragmento del mismo que une RANKL.
Las proteínas de fusión de RANK pueden estar hechas para permitir
la preparación de RANK soluble. Ejemplos de dichas proteínas de
fusión incluyen una proteína de fusión RANK/Fc, una proteína de
fusión de un resto de cremallera (es decir, una cremallera de
leucina), y varias etiquetas que son conocidas en el estado de la
técnica. Estos y otros aspectos de la presente invención serán
evidentes en referencia a la siguiente descripción detallada de la
invención.
Se identificó un novedoso inserto de ADNc
parcial con un marco de lectura abierto predicho que tiene alguna
similitud con CD40 y se usó para hibridarlo a manchas de colonias
generadas a partir de un banco de ADNc de células dendríticas (DC)
que contiene ADNcs de longitud completa. SEQ ID NO:1 muestra la
secuencia nucleotídica y aminoacídica de una proteína de longitud
completa predicha.
RANK es un miembro de la superfamilia de
receptores de TNF; se parece más estrechamente a CD40 en la región
extracelular. RANK se expresa sobre células epiteliales, algunas
líneas de célula B, y sobre células T activadas. Sin embargo, su
expresión sobre células T activadas es tardía, aproximadamente
cuatro días tras la activación. Esta secuencia temporal de
expresión coincide con la expresión de Fas, un conocido agente de
apoptosis. RANK puede actuar como una señal
anti-apoptótica, rescatando de la apoptosis células
que expresan RANK, como se conoce que hace CD40. De forma
alternativa, RANK puede confirmar una señal apoptótica en las
circunstancias apropiadas, de nuevo, similar a CD40. Probablemente,
RANK y su ligando parece que juegan un papel integral en la
regulación de la respuesta inmune e inflamatoria. El aislamiento de
un ADN que codifica RANK está descrito en USSN 08/996.139,
presentada el 22 de Diciembre de 1997. USSN 08/996.139 describe
varias formas de RANK que son útiles en la presente invención.
RANK soluble comprende el péptido señal y el
domino extracelular (restos 1 a 213 de SEQ ID NO:2) o un fragmento
del mismo. De forma alternativa, puede usarse un péptido señal
diferente en vez del líder natural, empezando con el resto 1 y
continuando hasta un resto seleccionado del grupo que consiste de
aminoácidos 24 hasta 33 (ambos incluidos) de SEQ ID NO:2. Además,
los fragmentos del dominio extracelular también proporcionarán
formas solubles de RANK.
Los fragmentos se pueden preparar utilizando
técnicas conocidas para aislar una porción deseada de la región
extracelular, y se puede preparar, por ejemplo, comparando la región
extracelular con las de otros miembros de la familia TNFR (de la
que RANK es un miembro) y seleccionar formas similares a las
preparadas para otros miembros de la familia. De forma alternativa,
se pueden usar lugares de restricción únicos o técnicas de PCR, que
son conocidas en el estado de la técnica, para preparar numerosas
formas truncadas, las cuales pueden ser expresadas y analizadas en
busca de actividad.
Otros derivados de las proteínas RANK dentro del
alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o
agregados de las proteínas o sus fragmentos con otras proteínas o
polipéptidos, tal como por síntesis en cultivo recombinante como
fusiones N-terminal o C-terminal.
Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia
polipeptídica señal (o líder) en la región
N-terminal de la proteína que dirige,
co-traduccionalmente o postraduccionalmente, la
transferencia de la proteína desde su lugar de síntesis a su lugar
de función dentro o fuera de la membrana o pared celular (por
ejemplo, el líder de factor-a de levaduras).
Las fusiones de proteínas pueden comprender
péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación
de proteínas RANK y homólogos (por ejemplo,
poli-His). La secuencia aminoacídica de las
proteínas inventivas también puede estar unida a un péptido de
identificación como el descrito por Hopp et al.,
Bio/Technology 6:1204 (1998; FLAG^{TM}). Dicho péptido altamente
antigénico proporciona un epítopo unido reversiblemente por un
anticuerpo monoclonal específico, permitiendo un ensayo rápido y
purificación fácil de la proteína recombinante expresada. La
secuencia de Hopp et al. también está específicamente
escindida por enteroquinasa mucosal bovina, permitiendo la
eliminación del péptido a partir de la proteína purificada.
Las proteínas de fusión, además comprenden la
secuencia aminoacídica de un RANK unido a una región Fc de
inmunoglobulina. Una región Fc ilustrativa es una IgG_{1} humana
que tiene una secuencia aminoacídica mostrada en SEQ ID NO:3.
También pueden ser utilizados fragmentos de una región Fc, como Fc
muteínas. Por ejemplo, ciertos restos dentro de la región bisagra
de una región Fc son críticos para la unión de alta afinidad a
FcyRI. Canfield y Morrison (J. Exp. Med. 173:1483, 1991)
describieron que Leu_{(234)} y Leu_{(235)} eran críticas para la
unión de alta afinidad de IgG_{3} a FcyRI presente sobre células
U937. Resultados similares fueron obtenidos por Lund et al.
(J. Immunol. 147:2657, 1991; Molecular Immunol. 29:53, 1991).
Dichas mutaciones, solas o en combinación, pueden hacerse en una
región Fc de IgG_{1} para reducir la afinidad de IgG_{1} por
FcR. Dependiendo de la porción de la región Fc utilizada, una
proteína de fusión puede ser expresada como un dímero, por formación
de enlaces disulfuro entre cadenas. Si las proteínas de fusión se
hacen con ambas cadenas, pesada y ligera, de un anticuerpo, es
posible formar un oligómero de proteína con hasta cuatro regiones
RANK.
En otra realización, las proteínas RANK además
comprenden un péptido oligomerizante tal como un dominio cremallera.
Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias
proteínas de unión a ADN (Landschulz et al., Science
204:1759, 1988). Dominio cremallera es un término usado para
referirse a un dominio peptídico conservado presente en estas (y
otras) proteínas, que es responsable de la multimerización de
proteínas. El dominio cremallera comprende una repetición en
heptada que se repite, con cuatro o cinco restos de leucina,
isoleucina o valina intercalados con otros aminoácidos. Ejemplos de
dominios cremallera son aquellos encontrados en el factor de
transcripción de levaduras GCN4 y en una proteína
térmico-estable de unión a ADN encontrada en hígado
de rata (C/EBP; Landschulz et al., Science 243:1681, 1989).
Dos proteínas nucleares transformantes, fas y jun,
también exhiben dominios cremallera, como el producto génico del
protooncogén de múridos, c-myc (Landschulz
et al., Science 240:1759, 1988). Los productos de los
oncogenes nucleares fas y jun comprenden dominios
cremallera que forman, preferencialmente, un heterodímero (O'Shea
et al., Science 245:646, 1989; Turner y Tjian, Science
243:1689, 1989). Un resto cremallera preferido es aquel de SEQ ID
NO:6 o un fragmento del mismo. Esta y otras cremalleras están
descritas en la Patente de EE.UU. 5.716.805.
Otras realizaciones de proteínas útiles incluyen
polipéptidos RANK codificados por ADNs capaces de hibridarse al ADN
de SEQ ID NO:1 bajo condiciones moderadamente estrictas (solución de
pre-lavado de SSC 5X, 0,5% SDS, EDTA 1,0 mM (pH
8,0) y condiciones de hibridación de 50ºC, SSC 5X, toda la noche) a
las secuencias de ADN que codifican RANK, o mas preferiblemente
bajo condiciones estrictas (por ejemplo, hibridación en SSC 6X a
63ºC toda la noche; lavando en SSC 3X a 55ºC), y otras secuencias
que degeneran a aquellas que codifican RANK. En una realización,
los polipéptidos RANK son, al menos, aproximadamente el 70%
idénticos en secuencia aminoacídica a la secuencia aminoacídica de
la proteína RANK natural como se muestra en SEQ ID NO:2 para RANK
humana y NO:5 para RANK de múrido. En una realización preferida, los
polipéptidos RANK son, al menos, aproximadamente el 80% idénticos
en secuencia aminoacídica a la forma natural de RANK; más
preferiblemente los polipéptidos que son, al menos, el 90%
idénticos a la RANK natural.
El porcentaje de identidad puede ser determinado
utilizando un programa informático, por ejemplo, el programa
informático GAP descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids
Res. 12:387, 1984) y disponible en la Universidad del Grupo de
Genética Informática de Wisconsin (UWGCG). Para fragmentos derivados
de la proteína RANK, la identidad se calcula basándose en la
porción de la proteína RANK que está presente en el fragmento.
La actividad biológica de análogos o muteínas de
RANK puede determinarse analizando la capacidad de los análogos o
muteínas para unir RANKL, por ejemplo, como se describe en los
Ejemplos de la presente memoria. Ensayos adecuados incluyen, por
ejemplo, un inmunoensayo enzimático o una hibridación puntual y
ensayos que emplean células que expresan RANKL. Ensayos apropiados
también incluyen, por ejemplo, ensayos de inhibición, donde RANK
soluble se utiliza para inhibir la interacción de RANKL con RANK
unido a membrana o RANK asociado a fase sólida (es decir, ensayos
de transducción de señales). Dichos métodos son bien conocidos en el
estado de la técnica.
RANKL y RANK son factores importantes en
osteoclastogénesis. RANK se expresa sobre osteoclastos e
interacciona con el ligando de RANK (RANKL) para mediar la
formación de células multinucleadas de tipo osteoclasto (OCL). Esto
se mostró tratando preparaciones de médula de ratón con
M-CSF (CSF-1) y RANKL soluble
durante 7 días en cultivo. No se necesitaron hormonas o factores
osteoclastogénicos adicionales para la generación de células
multinucleadas. Ni M-CSF ni RANKL a solas llevaron a
la generación de OCL. Las células multinucleadas expresaban
fosfatasa ácida resistente a tartrato y eran positivas para unión a
calcitonina-[I^{125}]. La tirosina quinasa c-src
estaba altamente expresada en OCL multinucleadas y un subconjunto de
células mononucleares como se demuestra por microscopía de
inmunofluorescencia. (Véase Ejemplo 2).
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RANK purificado, y homólogos o análogos del
mismo son preparados cultivando sistemas huésped/vector adecuados
para expresar los productos recombinantes de traducción de los ADNs
de la presente invención, que luego son purificados del medio de
cultivo o extractos celulares. Por ejemplo, los sobrenadantes de
sistemas que secretan proteína recombinante dentro del medio de
cultivo, primero pueden ser concentrados usando un filtro de
concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo,
una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.
Tras la etapa de concentración, el concentrado
puede ser aplicado a una matriz de purificación adecuada. Por
ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una
contra-estructura de molécula proteica o lectina de
anticuerpo unida a un soporte adecuado. De forma alternativa, se
puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una
matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetil colgantes (DEAE).
Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u
otros tipos comúnmente empleados en purificación proteica. De forma
alternativa, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico.
Intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices
insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo.
Grupos sulfopropilo son preferidos. La cromatografía de filtración
en gel también proporciona un medio para purificar las proteínas de
la invención.
La cromatografía de afinidad es un método
particularmente preferido para purificar RANK y análogos de la
misma. Por ejemplo, una RANK expresada como proteína de fusión que
comprende una región Fc de inmunoglobulina puede ser purificada
usando cromatografía de afinidad con Proteína A o Proteína G.
Además, una proteína RANK que comprende un dominio cremallera
oligomerizante, puede ser purificada sobre una resina que comprenda
un anticuerpo específico para el dominio cremallera oligomerizante.
Anticuerpos monoclonales frente a la proteína RANK pueden ser
útiles en purificación por cromatografía de afinidad, utilizando
métodos que son bien conocidos en el estado de la técnica. También
puede usarse un ligando para preparar una matriz de afinidad para
purificación de RANK por afinidad.
Finalmente, se pueden emplear una o más etapas
de cromatografía líquida en fase reversa de alta resolución
(RP-HPLC), que emplea medio RP-HPLC
hidrofóbico, por ejemplo gel de sílice que tiene grupos metilo
colgantes u otros grupos alifáticos, para purificar aún mas una
composición RANK. Métodos adecuados incluyen aquellos análogos al
método descrito por Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171,
1984). Alguna o todas las etapas de purificación precedentes, en
varias combinaciones, también pueden ser empleadas para proporcionar
una proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en cultivo
celular normalmente es aislada por extracción inicial a partir del
sedimento celular, tras una o mas etapas de concentración,
precipitación por sales, intercambio iónico acuoso o cromatografía
de exclusión por tamaño. Finalmente, puede ser empleada la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas
finales de purificación. Las células microbianas empleadas en la
expresión de la proteína recombinante pueden romperse por cualquier
método conveniente, incluyendo ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, rotura
mecánica, o uso de agentes lisantes de células. La fermentación de
levaduras que expresan la proteína de la invención como una
proteína secretada simplifica enormemente la purificación.
La proteína sintetizada en cultivo recombinante
está caracterizada por la presencia de componentes celulares,
incluyendo proteínas, en cantidades y de un carácter que dependen de
las etapas de purificación llevadas a cabo para recuperar la
proteína de la invención a partir del cultivo. Normalmente, estos
componentes serán de levaduras, de origen procariótico o de origen
eucariótico superior no humano y, preferiblemente, están presentes
en cantidades contaminantes inocuas, del orden de menos de
aproximadamente 1 por ciento en peso. Además, el cultivo celular
recombinante permite la producción de las proteínas de la invención
libres de otras proteínas que, normalmente pueden estar asociadas a
las proteínas, tal como se encuentran en la naturaleza en las
especies de origen.
La presente invención proporciona RANK soluble
para uso en la mejora de los efectos de la osteoclastogénesis y la
actividad osteoclástica en carcinoma de células escamosas. Estos
usos implican el uso de composiciones terapéuticas de RANK o
fragmentos solubles de RANK. También incluidos dentro de la presente
invención están los métodos para regular la actividad osteoclástica
asociada al carcinoma de células escamosas por administración de
composiciones terapéuticas de RANK o fragmentos solubles de RANK a
un individuo en cantidades suficientes para disminuir el exceso de
resorción ósea. Típicamente, el individuo que sufre un exceso de
resorción ósea y padece los efectos de la hipercalcemia, tiene
síntomas de hipercalcemia, o sufre una enfermedad que implica
excesiva resorción ósea. Además de regular la actividad
osteoclástica, los usos descritos en la presente memoria son
aplicables a la inhibición de la actividad osteoclástica, regulación
de la generación osteoclástica e inhibición la generación
osteoclástica en individuos que sufren un exceso de resorción ósea.
En conexión con los usos descritos en la presente memoria, la
presente invención contempla el uso de RANK junto con receptores
solubles de citoquinas o citoquinas, o moléculas reguladoras de
osteoclastos/osteoblastos.
En relación con los métodos descritos en la
presente memoria, se conoce que el ligando de RANK (RANKL) sobre
los osteoblastos o células estromales interacciona con RANK sobre
las superficies del progenitor de osteoclasto, señalizando un
acontecimiento que lleva a la diferenciación de precursores de
osteoclastos a osteoclastos. (Véase Ejemplo 2 mas abajo). Así,
RANK, y en particular las formas solubles de RANK, es útil para la
inhibición de la transducción de señales mediada por RANK, que
lleva a la diferenciación de precursores de osteoclastos a
osteoclastos. Las formas solubles de RANK también son útiles para la
regulación e inhibición de la actividad de osteoclastos, por
ejemplo resorción ósea. Al interferir con la diferenciación de
osteoclastos, las formas solubles de RANK son útiles en la mejora
de los efectos de la osteoclastogénesis en carcinomas de células
escamosas, en los que hay exceso de descomposición de hueso. Las
formas solubles de RANK pueden ser administradas a pacientes con
cáncer para interrumpir la ruta de diferenciación de osteoclastos y
dar como resultado menor número de osteoclastos, menor resorción
ósea, y alivio de los efectos negativos de la hipercalcemia.
Otros cánceres no se metastatizan al hueso, pero
se conoce que actúan sistémicamente sobre el hueso para interrumpir
la remodelación ósea dando como resultado hipercalcemia. (Véase
Guise et al. Endocrine Reviews, 19(1):
18-54, 1998). De acuerdo con esta invención, RANKL
se ha encontrado en la superficie de ciertas células escamosas que
no metastatizan a hueso, pero están asociadas a la hipercalcemia.
(Véase Ejemplo 3 mas abajo). Las células escamosas que están
asociadas con hipercalcemia también expresan M-CSF
(CSF-1), una citoquina que, junto con RANKL,
estimula la proliferación y diferenciación de precursores
osteoclásticos a osteoclastos. De acuerdo con la presente
invención, se ha descubierto que M-CSF directamente
regula al alza a RANK en las superficies de precursores de
osteoclastos. Cuando las células escamosas liberan cantidades
excesivas de CSF-1, se da aumento de expresión de
RANK en la superficie de precursores de osteoclastos. Así, hay una
mayor probabilidad de que RANK interaccione con RANKL sobre los
osteoblastos o células estromales para producir números aumentados
de osteoclastos, dando como resultado una cantidad elevada de
descomposición ósea e hipercalcemia.
Además de la mejora de los efectos de los
cánceres que metastatizan a hueso, la presente invención proporciona
métodos para mejorar los efectos sistémicos, por ejemplo,
hipercalcemia, carcinomas de células escamosas que están asociados
a exceso de actividad osteoclástica. Dichos métodos incluyen
administrar formas solubles de RANK en cantidades suficientes para
interferir con la trasducción de señal de RANK/RANKL que lleva a la
diferenciación de los precursores de osteoclastos a osteoclastos.
Menos osteoclastos llevan a resorción ósea reducida y alivian los
efectos negativos de la hipercalcemia.
Para uso terapéutico, la proteína purificada es
administrada a un individuo, preferiblemente un humano, para
tratamiento en una forma apropiada a la indicación. Así, por
ejemplo, las composiciones de proteína RANK administradas para
regular la función osteoclástica se pueden dar por inyección en
bolo, infusión continua, liberación sostenida a partir de
implantes, u otras técnicas apropiadas. Típicamente, se administrará
un agente terapéutico en forma de una composición que comprende
RANK purificado, junto con vehículos fisiológicamente aceptables,
excipientes o diluyentes. Dichos vehículos no serán tóxicos para
los receptores en las dosis y concentraciones empleadas.
Normalmente, la preparación de dichas
composiciones de proteína supone combinar la proteína de la
invención con soluciones tampón, antioxidantes como ácido
ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de
aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos
incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes como
EDTA, glutation y otros estabilizantes y excipientes. Tampón salino
neutro o solución salina mezclada con albúmina sérica coespecífica
son diluyentes ilustrativos apropiados. Preferiblemente, el producto
está formulado como un liofilozado utilizando soluciones
excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Las
dosis apropiadas se pueden determinar en ensayos clínicos. La
cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de
dichos factores como la naturaleza y severidad de la indicación a
ser tratada, la respuesta deseada, la condición del paciente, y así
sucesivamente.
Las formas solubles de RANK pueden ser
administradas con el propósito de inhibir la osteoclastogénesis
inducida por RANK. Es deseable inhibir la osteoclastogénesis en
carcinomas de células escamosas en las que se da un exceso de
pérdida ósea. Se conocen varios modelos animales de estas
enfermedades en el estado de la técnica; por consiguiente, es una
materia de experimentación rutinaria el determinar las dosis óptimas
y rutas de administración de RANK soluble, primero en un modelo
animal y luego en ensayos clínicos en humanos.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como
ilustrativos, y no como limitaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Este ejemplo describe un ensayo de placa de
unión útil para comparar la capacidad de varios ligandos para
unirse a receptores. El ensayo se lleva a cabo esencialmente como se
describe en Smith et al., Virology 236:216 (1997).
Brevemente, placas microtítulo de 96 pocillos se cubren con un
anticuerpo frente a Fc humano (es decir, anti(Fc humano)
policlonal de cabra). Luego se añaden proteínas de fusión
Receptor/Fc, y tras incubación, las placas se lavan. Luego se
añaden diluciones seriadas de los ligandos. Los ligandos pueden ser
marcados directamente (es decir, con ^{125}I), o se puede usar un
reactivo detector que está marcado radiactivamente. Tras la
incubación, las placas se lavan, se liberan los ligandos unidos
específicamente, y se cuantifica la cantidad de ligando unido.
Usando este método, RANK/Fc y OPG/Fc se unieron
a las placas de 96 pocillos. En un método indirecto, se determinó
una fusión RANKL/cremallera utilizando un anticuerpo marcado al
resto de la cremallera. Se encontró que OPG/Fc humano une mRANKL a
0,05 nM, y RANK/Fc humano une mRANKL a 0,1 nM. Estos valores indican
afinidades de unión similares de OPG y RANK por RANKL, confirmando
la utilidad de RANK como un inhibidor de la actividad osteoclástica
en una manera similar a OPG.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Lo siguiente describe la formación de células de
tipo osteoclasto a partir de cultivos celulares de médula ósea
utilizando un RANKL soluble en forma de proteína de fusión soluble
RANKL/cremallera de leucina (RANKL
ZL).
ZL).
Utilizando RANKL ZL a 1 \mug/ml, se generaron
osteoclastos a partir de médula ósea (MO) de múrido en presencia de
CSF-1. Estos osteoclastos están formados por la
fusión de células de tipo macrófago y se caracterizan por ser
TRAP-positivas (fosfatasa ácida resistente a
tartrato). No se vieron células TRAP^{+} en cultivos que contenían
solo CSF-1 o en cultivos que contenían
CSF-1 y TRAIL ZL (un control para RANKL LZ soluble).
Aunque la médula ósea de humanos y monos contiene mas fibroblastos
contaminantes que la médula ósea de múridos, los osteoclastos se
generaron a partir de médula ósea de múrido y mono con la
combinación de CSF-1 y RANKL LZ soluble. En un
estudio de dosis-respuesta usando médula ósea de
múridos y cantidades sub-óptimas de CSF-1 (40
ng/ml), los efectos de RANKL LZ soluble se estabilizaron a
aproximadamente 100 ng/ml.
El efecto de RANKL LZ soluble sobre la
proliferación de células se estudió en los mismos cultivos usando
Azul Alamar. Tras 5 días, la respuesta proliferativa fue menor en
cultivos que contenían CSF-1 y RANKL LZ que en
aquellos que contenían solo CSF-1. Esto avala la
observación de que RANKL LZ soluble está induciendo la
diferenciación de osteoclastos. Cuando CSF-1 y
RANKL LZ se lavan de los cultivos de MO de múridos en el día 7 u 8,
las células no sobreviven si son recultivadas en medio o en RANKL
LZ a solas. Por el contrario, las células sobreviven si se
recultivan en CSF-1. Cuando RANKL LZ se añadió a
estos cultivos, no aparecieron beneficios añadidos. Así, se
requiere la combinación de CSF-1 y RANKL para la
generación de osteoclastos. Además, una vez formados,
CSF-1 es suficiente para mantener su supervivencia
en cultivo.
Finalmente, usando médula ósea humana, los
anticuerpos monoclonales ("m Ab") RANK
anti-humanos solubles y los anticuerpos
monoclonales RANK anti-humanos inmovilizados se
compararon con RANKL LZ para la generación de osteoclastos en
presencia de CSF-1. Se encontró que M331
inmovilizados y RANKL LZ eran igualmente eficaces para la
generación de osteoclastos, mientras que M331 soluble era superior a
ambos, anticuerpo inmovilizado y RANKL LZ. Esto confirma que la
actividad de diferenciación de RANK de los osteoclastos está mediada
a través de RANK más que por vía de un receptor alternativo.
Ya que los osteoclastos no pueden ser fácilmente
recolectados y analizados por citometría de flujo, se utilizaron
ensayos de unión a calcitonina marcada con ^{125}I para
identificar los osteoclastos (el receptor de calcitonina se
considera que es un marcador específico de osteoclastos). Los
osteoclastos generados a partir de MO de múridos cultivados con
CSF-1 y RANKL LZ durante 9 días mostraron unión de
calcitonina marcada radiactivamente, confirmando su identidad de
osteoclastos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Con el fin de determinar la expresión de RANKL
por cualquiera de los dos carcinomas de células escamosas
diferentes, se realizaron estudios de Transferencia Western y
RT-PCR clásicos sobre células MH-85
y OKK. Una de estas células de carcinoma, las células
MH-85, está asociada con la hipercalcemia.
Los resultados confirmaron que las células
escamosas MH-85 y OKK expresan RANKL. Las células
MH-85, además de estar unidas a la hipercalcemia en
pacientes que sufren este carcinoma, también expresan
M-CSF (CSF-1). También se determinó
que CSF-1 regula al alza la expresión de RANK en los
precursores de osteoclastos. La elevada cantidad de
CSF-1 en células escamosas tipo
MH-85 de pacientes con cáncer puede llevar a una
regulación al alza de RANK e interacción aumentada de RANK con
RANKL. Las señales transducidas por RANK y la interacción con RANKL
dan como resultado un elevado número de osteoclastos maduros y
descomposición ósea. Ya que las formas solubles de RANK pueden
inhibir la interacción RANK/RANKL, la administración de una forma
soluble de RANK (por ejemplo, la región extracelular de RANK
fusionada a un Fc) a una células escamosas de un paciente con
cáncer proporciona alivio de los efectos adversos de este cáncer,
incluyendo la hipercalcemia.
(I) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Immunex Corporation
\hskip3.9cmAnderson, Dirk M.
\hskip3.9cmGaliberu, Laurent
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA INHIBIR LA ACTIVIDAD OSTEOCLÁSTICA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Immunex Corporation, Departamento Legal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 51 University Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: WA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 98101
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA DE ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD INTERNACIONAL: a asignar
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 13 Mayo 1999
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Henry, Janis C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34,347
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA /EXPEDIENTE: 2874-WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (206)587-0430
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (206)233-0644
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3136 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: HOMO SAPIENS
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BANCO: CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: RANGO DE LONGITUD COMPLETA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 39..1886
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 616 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 232 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: muteína Fc de IgGl
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1878 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENSTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: MÚRIDO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- BANCO: Epitelio de Hígado Fetal de Múrido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: muRANK
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1875
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 625 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
Claims (5)
1. RANK soluble para uso en el alivio de los
efectos de la osteoclastogénesis y la actividad osteoclástica en
carcinoma de células escamosas.
2. Uso de RANK soluble en la fabricación de una
composición para aliviar los efectos de la osteoclastogénesis y la
actividad osteoclástica en carcinoma de células escamosas.
3. RANK soluble para el uso según la
reivindicación 1, donde RANK soluble está codificado por un ADN
seleccionado del grupo que cosiste en:
(a) un ADN que codifica una proteína que tiene
una secuencia aminoacídica tal como se muestra en SEQ ID NO:2,
donde la proteína tiene un extremo amino-terminal
seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido entre el
aminoácido 1 y el aminoácido 33, incluidos, de la SEQ ID NO:2, y un
extremo carboxi-terminal seleccionado del grupo que
consiste en un aminoácido entre el aminoácido 196 y el aminoácido
616, inclusive;
(b) un ADN que codifica una proteína que tiene
una secuencia aminoacídica tal como se muestra en SEQ ID NO:5,
donde la proteína tiene un extremo amino-terminal
seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido entre el
aminoácido 1 y el aminoácido 33, inclusive, de la SEQ ID NO:5, y un
extremo carboxi-terminal seleccionado del grupo que
consiste en un aminoácido entre el aminoácido 197 y el aminoácido
625, inclusive;
(c) moléculas de ADN capaces de hibridarse al
ADN de (a) o (b) bajo condiciones estrictas, y que codifican
polipéptidos RANK que unen RANKL; y
(d) moléculas de ADN que codifican fragmentos de
proteínas codificadas por el ADN de (a), (b) o (c), donde los
fragmentos de los polipéptidos RANK unen RANKL.
4. RANK soluble para el uso según la
reivindicación 3, donde RANK es, al menos, 80% idéntico en secuencia
de aminoácidos a RANK natural, y donde RANK es capaz de unir
RANKL.
5. RANK soluble para el uso según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 y 3 a 4, donde RANK además comprende un
polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un dominio Fc de
inmunoglobulina, una muteína Fc de inmunoglobulina, una etiqueta
FLAG^{TM}, un péptido que comprende, al menos, aproximadamente 6
restos His, una cremallera de leucina, y combinaciones de los
mismos.
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