JP2002514418A - 破骨細胞活性の阻害方法 - Google Patents

破骨細胞活性の阻害方法

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Abstract

(57)【要約】 単離した可溶性ＲＡＮＫ受容体、それらの受容体をコードするＤＮＡ、およびそれらから調製した医薬組成物を開示する。単離した受容体を用いて破骨細胞形成を調節し、したがって過剰の骨損失が起きる疾病を処置することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の技術分野 本発明は一般にサイトカイン受容体の分野、より詳細には破骨細胞調節活性を
もつサイトカイン受容体／リガンド対に関する。
【０００２】 発明の背景 ＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ、ＮＦ
−κＢの受容体アクチベーター）およびそのリガンド（ＲＡＮＫＬ）は、最近報
告された、免疫応答において重要な役割を果たす受容体／リガンド対である。Ｒ
ＡＮＫおよびＲＡＮＫＬのクローニングは、それぞれＵＳＳＮ ０８／９９６，
１３９およびＵＳＳＮ ０８／９９５，６５９に記載されている。ＲＡＮＫＬが
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーであるオステオプロテゲ
リン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ，ＯＰＧ）と呼ばれるタンパク質に結合
することが最近見出された。Ｙａｓｕｄａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．９５：３５９７；１９９８）はＯＰＧに対するリガンドを発現クローニ
ングし、破骨細胞形成（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｇｅｎｅｓｉｓ）阻害因子と呼ん
だ。彼らの研究をＬａｃｅｙら（Ｃｅｌｌ ９３：１６５；１９９８）が繰り返
した。両方の場合とも、彼らがクローニングしたリガンドはＲＡＮＫＬと一致す
ることが分かった。
【０００３】 破骨細胞形成においては、骨芽細胞または間質細胞と破骨細胞前駆体との相互
作用により、この前駆体が破骨細胞に分化する。ＯＰＧはこの分化を阻害するこ
とが知られている。骨芽細胞または間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）の表
面にあるＲＡＮＫＬが破骨細胞前駆体表面にある特異的受容体と相互作用して分
化事象をシグナリングするモデルが提唱された。ＯＰＧはｉｎ ｖｉｔｒｏでＲ
ＡＮＫＬと破骨細胞前駆体上の受容体との相互作用を遮断し、マウスにおいて骨
損失に対する卵巣切除の影響を改善することが示された。しかしＯＰＧはＴＮＦ
ファミリーの他のリガンドに結合することも知られており、これはｉｎ ｖｉｖ
ｏでのそのようなリガンド活性に有害な影響を与える可能性がある。さらに、ｉ
ｎ ｖｉｖｏでＯＰＧに結合する他のリガンドが存在すると、破骨細胞形成を阻
害するのに利用できる十分な可溶性ＯＰＧを得るために、高い投与量のＯＰＧが
必要になるであろう。
【０００４】 したがって、ＲＡＮＫＬを特異的に結合して、ＲＡＮＫＬが他のリガンドと反
応することなくＲＡＮＫＬの破骨細胞形成誘発能を阻害する可溶性因子を同定す
ることが、当技術分野で要望されている。
【０００５】 発明の概要 本発明は、ＲＡＮＫと呼ばれる新規な受容体（ＮＦ−κＢの受容体アクチベー
ターに対するもの）の使用に関連する方法を提供する。これはＴＮＦ受容体スー
パーファミリーのメンバーである。ＲＡＮＫは、６１６個のアミノ酸残基をもち
、細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む、Ｉ型膜貫通タンパ
ク質である。ＲＡＮＫは種々のＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）と相互作用す
る；ＲＡＮＫの引金を引くと、転写因子ＮＦ−κＢ、すなわち免疫系の細胞にお
いて最も広く利用される汎在性（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）転写因子がアップレギ
ュレーションされる。
【０００６】 この受容体の可溶性形を調製し、膜結合ＲＡＮＫを介したシグナル伝達を妨害
するのに使用することができる。ＲＡＮＫ仲介シグナル伝達を阻害することは、
過剰の骨破壊が起きる疾病状態において破骨細胞形成および破骨細胞活性の影響
を改善するのに有用であろう。そのような状態の例には、骨粗鬆症、ページェッ
ト病、ならびに骨に転移して骨破骨を誘発する可能性のある癌（すなわち多発骨
髄腫、乳癌、ある種の黒色腫；Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．
８０：１５４６；１９９７も参照されたい）、ならびに必ずしも骨に転移しない
が高カルシウム血症および骨損失を生じる癌（たとえば扁平上皮細胞癌）が含ま
れる。
【０００７】 可溶性形ＲＡＮＫは、ＲＡＮＫＬを結合する細胞外ＲＡＮＫドメインまたはそ
のフラグメントを含む。可溶性ＲＡＮＫを調製できるＲＡＮＫ融合タンパク質を
作成することができる。そのような融合タンパク質の例には、ＲＡＮＫ／Ｆｃ融
合タンパク質、ジッパー部分（すなわちロイシンジッパー）および当技術分野で
既知の種々のタグの融合タンパク質が含まれる。ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬの相互作
用の他のアンタゴニスト（すなわちＲＡＮＫＬに対する抗体、小分子）も、本発
明方法に有用であろう。これらおよび他の本発明の態様は、以下の本発明の詳細
な記述を参照することによって明らかになるであろう。
【０００８】 発明の詳細な記述 ＣＤ４０と若干類似する推定オープンリーディングフレームをもつ新規な部分
ｃＤＮＡ挿入配列を同定し、全長ｃＤＮＡを含む樹状細胞（ＤＣ）ｃＤＮＡライ
ブラリーから形成されるコロニーブロットにハイブリダイズさせるのに用いた。
配列番号：１は、この推定全長タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配
列を示す。
【０００９】 ＲＡＮＫはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである；それはＣＤ４
０の細胞外ドメインに最も近似する。ＲＡＮＫは上皮細胞、ある種のＢ細胞系、
および活性化Ｔ細胞上に発現する。しかし活性化Ｔ細胞上におけるその発現は遅
く、活性化の約４日後である。この発現のタイムコースは、既知のアポトーシス
物質であるＦａｓの発現と一致する。ＲＡＮＫは抗アポトーシスシグナルとして
作用し、ＲＡＮＫを発現する細胞を救出することができる。ＣＤ４０がこの作用
を行うことが知られている。あるいは、ＲＡＮＫは適切な状況下ではアポトーシ
スシグナルを確認することができる。これもＣＤ４０に類似する。ＲＡＮＫとそ
のリガンドは、免疫応答および炎症応答の調節に不可欠な役割をもつと思われる
。ＲＡＮＫをコードするＤＮＡの単離は、ＵＳＳＮ ０８／９９６，１３９（１
９９７年１２月２２日出願）に記載されている。その開示内容を本明細書に参考
として援用する。ＵＳＳＮ ０８／９９６，１３９には、本発明に有用な幾つか
の形のＲＡＮＫが記載されている。
【００１０】 可溶性ＲＡＮＫはシグナルペプチドおよび細胞外ドメイン（配列番号：２の残
基１〜２１３）またはそのフラグメントを含む。あるいは、配列番号：２の残基
１に始まり、アミノ酸２４〜３３（含む）よりなる群から選択される残基まで続
く天然リーダー配列の代わりに、異なるシグナルペプチドを含むことができる。
さらに、細胞外ドメインのフラグメントも可溶性形ＲＡＮＫを与える。
【００１１】 フラグメントは細胞外領域の目的部分を単離する既知の技術を用いて調製でき
る。たとえば細胞外領域をＴＮＦＲファミリー（ＲＡＮＫはこのメンバーである
）の他のメンバーの領域と比較し、他のファミリーメンバーについて調製された
ものに類似する形を選択することにより調製できる。あるいは、ユニーク制限部
位または当技術分野で既知のＰＣＲ技術を用いて、多数の短縮型（ｔｒｕｎｃａ
ｔｅｄ ｆｏｒｍ）を調製し、これらを発現させて活性を分析することができる
。
【００１２】 本発明の範囲に含まれる他のＲＡＮＫタンパク質誘導体には、このタンパク質
またはそのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドの共有結合体また
は凝集結合体、たとえば組換え培養においてＮ−末端またはＣ−末端融合体とし
て合成されるものが含まれる。たとえば結合したペプチドが、その合成部位から
細胞膜または細胞壁の内側または外側にある機能部位へのタンパク質の移動を翻
訳時または翻訳後に指令するタンパク質のＮ−末端領域にあるシグナル（または
リーダー）ポリペプチド配列（たとえば酵母α因子リーダー配列）であってもよ
い。
【００１３】 タンパク質融合体は、ＲＡＮＫタンパク質および相同体の精製または同定を容
易にするために付加されたペプチド（たとえばポリ−Ｈｉｓ）を含むことができ
る。本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、Ｈｏｐｐらにより記載された識別用
ペプチドに結合していてもよい：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４
（１９８８；ＦＬＡＧ（商標））。そのような高抗原性ペプチドは、特異的モノ
クローナル抗体が可逆的に結合したエピトープを提供し、発現した組換えタンパ
ク質の迅速アッセイおよび容易な精製を可能にする。Ｈｏｐｐらの配列はウシ粘
膜エンテロキナーゼによって同様に特異的に開裂し、このペプチドを精製タンパ
ク質から除去できる。
【００１４】 融合タンパク質は、さらに免疫グロブリンＦｃ領域に結合したＲＡＮＫアミノ
酸配列を含む。Ｆｃ領域の一例は、配列番号：３に示すアミノ酸配列をもつヒト
ＩｇＧ1である。Ｆｃ領域のフラグメントも使用でき、Ｆｃムテインも使用でき
る。たとえばＦｃ領域のヒンジ部内にある特定の残基は、ＦｃγＲＩへの高親和
性結合に重要である。ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１７３：１４８３；１９９１）は、Ｕ９３７細胞上に存在するＦｃγＲ
ＩへのＩｇＧ3の高親和性結合にＬｅｕ(234)およびＬｅｕ(235)が重要であると
報告した。同様な結果がＬｕｎｄら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７，
１９９１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：５３，１９９１）によ
り得られた。Ｆｃに対するＩｇＧ1の親和性を低下させるために、ＩｇＧ1 Ｆｃ
領域にそのような変異を単独で、または組み合わせて行うことができる。用いる
Ｆｃ領域部分に応じて、鎖間ジスルフィド結合の形成により融合タンパク質を二
量体として発現させることができる。抗体のＨ鎖およびＬ鎖両方を含む融合タン
パク質を形成すると、４つものＲＡＮＫ領域を含むタンパク質オリゴマーを形成
することができる。
【００１５】 他の態様において、ＲＡＮＫタンパク質はさらに、ジッパードメインなどのオ
リゴマー形成性ペプチドを含む。ロイシンジッパーは当初幾つかのＤＮＡ結合性
タンパク質中に同定された（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０：１７５９，１９８８）。ジッパードメインとは、これらの（およ
び他の）タンパク質中に存在し、それらのタンパク質の多量体化に関与する保存
ペプチドドメインを表すために用いられる用語である。ジッパードメインは、４
または５個のロイシン、イソロイシンまたはバリン残基が他のアミノ酸で中断さ
れた７塩基反復配列を含む。ジッパードメインの例は、酵母転写因子ＧＣＮ４中
にみられるもの、およびラット肝中にみられる熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質（
Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：
１６８１，１９８９）である。２つの核トランスフォーミングタンパク質、ｆｏ
ｓおよびｊｕｎもジッパードメインを示し、ネズミ癌原遺伝子ｃ−ｍｙｃの産物
も同様である（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０
：１７５９，１９８８）。核癌遺伝子産物ｆｏｓおよびｊｕｎは、優先的にヘテ
ロ二量体を形成するジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４５：６４６，１９８９；Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｔｊｉａｎ
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６８９，１９８９）。好ましいジッパー部分は、
配列番号：６のものおよびそのフラグメントである。これおよび他のジッパーが
米国特許５，７１６，８０５に開示されている。
【００１６】 有用なタンパク質の他の態様には下記のものが含まれる：中程度のストリンジ
ェントな条件下（５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡの予備洗
浄溶液、および５０℃、５×ＳＳＣ、一夜のハイブリダイゼーション条件）で、
またはより好ましくはストリンジェントな条件下（たとえば６×ＳＳＣ、６３℃
で一夜のハイブリダイゼーション；３×ＳＳＣにより５５℃で洗浄）で配列番号
：１のＤＮＡ［ＲＡＮＫをコードするＤＮＡ配列］にハイブリダイズしうるＤＮ
ＡによりコードされるＲＡＮＫポリペプチド、ならびにＲＡＮＫがコードするも
のに対し縮重である他の配列。１態様においては、ＲＡＮＫポリペプチドのアミ
ノ酸配列がヒトＲＡＮＫについて配列番号：２、ネズミＲＡＮＫについて配列番
号：６に示した天然ＲＡＮＫタンパク質のアミノ酸配列に、少なくとも約７０％
同一である。好ましい態様においては、ＲＡＮＫポリペプチドのアミノ酸配列が
天然形ＲＡＮＫに対し少なくとも約８０％同一である；最も好ましいポリペプチ
ドは、天然ＲＡＮＫに少なくとも約９０％同一であるものである。
【００１７】 一致率は、コンピュータープログラム、たとえばＤｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）により記載されたＧＡＰコ
ンピュータープログラムであって、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグ
ループ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるものを用いて決定できる。ＲＡＮＫタンパ
ク質由来のフラグメントについては、一致率はフラグメント中に存在する部分の
ＲＡＮＫタンパク質に基づいて計算される。
【００１８】 ＲＡＮＫ類似体またはムテインの生物学的活性は、たとえば本明細書中の実施
例に記載するように、その類似体またはムテインがＲＡＮＫＬを結合する能力を
調べることにより決定できる。適切なアッセイ法には、たとえば酵素イムノアッ
セイ法、またはドットブロット法、およびＲＡＮＫＬ発現細胞を用いるアッセイ
法が含まれる。適切なアッセイ法にはたとえば阻害アッセイ法も含まれる。この
場合、可溶性ＲＡＮＫを用いてＲＡＮＫＬと膜結合または固相付随ＲＡＮＫとの
相互作用を阻害する（すなわちシグナル伝達アッセイ）。そのような方法は当技
術分野で周知である。
【００１９】 ＲＡＮＫＬおよびＲＡＮＫは破骨細胞形成において重要な因子である。ＲＡＮ
Ｋは破骨細胞上に発現し、ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）と相互作用して、破
骨細胞様（ＯＣＬ）多核細胞の形成を仲介する。これは、マウス骨髄調製物を培
養中にＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１）および可溶性ＲＡＮＫＬで７日間処理すること
により示された。多核細胞の形成に他の破骨細胞形成ホルモンまたは因子は不必
要であった。Ｍ−ＣＳＦもＲＡＮＫＬも、単独ではＯＣＬを形成しなかった。多
核細胞は酒石酸耐性酸性ホスファターゼを発現し、［125Ｉ］−カルシトニン結
合について陽性であった。免疫蛍光顕微鏡検査により証明されるように、チロシ
ンキナーゼｃ−ｓｒｃが多核ＯＣＬおよび一組の単球において著しく発現した（
実施例２）。
【００２０】 組換えＲＡＮＫＬの精製 精製ＲＡＮＫおよびその相同体または類似体は、適切な宿主／ベクター系を培
養して本発明のＤＮＡの組換え翻訳産物を発現させ、次いでこれを培地または細
胞抽出液から精製することにより調製される。たとえば組換えタンパク質を培地
中へ分泌する系からの上清を、まず市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえば
ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットに
より濃縮することができる。
【００２１】 濃縮工程後、濃縮物を適切な精製用マトリックスに付与することができる。た
とえば適切なアフィニティーマトリックスは、適切な支持体に結合した対構造タ
ンパク質またはレシチンまたは抗体分子を含むことができる。あるいは、アニオ
ン交換樹脂、たとえばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をもつマ
トリックスまたは基質を使用できる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロ
ース、デキストラン、セルロース、その他、タンパク質精製に慣用されるタイプ
のものでよい。あるいは、カチオン交換工程を採用できる。適切なカチオン交換
体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリ
ックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィー
も本発明のタンパク質の精製手段となる。
【００２２】 アフィニティークロマトグラフィーは、ＲＡＮＫおよびその相同体を精製する
ための特に好ましい方法である。たとえば免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タ
ンパク質として発現するＲＡＮＫは、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニ
ティークロマトグラフィーを用いて精製できる。さらに、オリゴマー形成性ジッ
パードメインを含むＲＡＮＫタンパク質は、このオリゴマー形成性ジッパードメ
インに特異的な抗体を含む樹脂上で精製できる。ＲＡＮＫに対するモノクローナ
ル抗体も、当技術分野で周知の方法を用いるアフィニティークロマトグラフィー
精製に有用である。リガンドもＲＡＮＫのアフィニティー精製用アフィニティー
マトリックスの調製に使用できる。
【００２３】 最後に、疎水性逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体、た
とえばペンダントメチル基その他の脂肪族基をもつシリカゲルを用いる１回以上
のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を採用して、ＲＡＮＫ組成物をさらに精製することができ
る。適切な方法には、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１
，１９８４）により示される方法に類似の方法が含まれる。以上の精製工程の幾
つかまたはすべてをさまざまに組み合わせて用い、均質な組換えタンパク質を得
ることもできる。
【００２４】 細菌培養において産生された組換えタンパク質は、通常はまず細胞ペレットか
らの抽出、次いで１回またはそれより多くの濃縮、塩析、水性イオン交換または
サイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。最後に、最終精製工程と
して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を採用できる。組換えタンパク質
の発現に用いた微生物細胞は、いずれか好都合な方法で破壊することができる。
これには凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用
が含まれる。本発明のタンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は
、精製を著しく簡単にする。
【００２５】 組換え培養において合成されたタンパク質は、細胞成分の存在を特色とする。
これには、培養物から本発明のタンパク質を回収するために採用した精製工程に
応じた量および性質のタンパク質が含まれる。これらの成分は通常は酵母、原核
細胞またはヒト以外の高等真核細胞に由来するであろうが、約１重量％未満程度
の無害な汚染物質量で存在することが好ましい。さらに、組換え細胞培養によれ
ば、普通は自然界で供給源種中にみられるタンパク質に付随する可能性のある他
のタンパク質を含まない本発明タンパク質を調製できる。
【００２６】 ＲＡＮＫ組成物の使用および投与 本発明は、タンパク質ならびに適切な希釈剤およびキャリヤーを含む療法用組
成物の使用方法を提供する。これらの方法は、ＲＡＮＫまたは適切な可溶性ＲＡ
ＮＫフラグメントの療法用組成物を、免疫応答または炎症応答の調節に使用する
ことを伴う。本発明にはさらに、ＲＡＮＫまたは可溶性ＲＡＮＫフラグメントの
療法用組成物を骨再吸収過剰の低下に十分な量で個体に投与することにより、破
骨細胞活性を調節する方法が含まれる。典型的にはこの個体は、骨再吸収過剰を
伴い、高カルシウム血症の影響を受け、高カルシウム血症の症状を呈し、または
骨再吸収過剰を伴う疾患に罹患している。本明細書に記載する方法は、骨再吸収
過剰を伴う個体において、破骨細胞活性の調節のほか、破骨細胞活性の阻害、破
骨細胞形成の調節および破骨細胞形成の阻害のために適用できる。本明細書に記
載する方法に関連して本発明は、ＲＡＮＫと可溶性サイトカイン受容体もしくは
サイトカインまたは他の破骨細胞／骨芽細胞調節分子との併用を含む。
【００２７】 本明細書に記載する方法に関連して、骨芽細胞または間質細胞上にあるＲＡＮ
Ｋリガンド（ＲＡＮＫＬ）が破骨細胞前駆体表面にあるＲＡＮＫと相互作用して
、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化を生じる事象をシグナリングすることが
知られている（後記の実施例２参照）。したがってＲＡＮＫ、特に可溶性形ＲＡ
ＮＫは、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分化を生じるＲＡＮＫ仲介シグナル伝
達の阻害に有用である。可溶性形ＲＡＮＫは、破骨細胞活性、たとえば骨再吸収
の調節および阻害にも有用である。可溶性形ＲＡＮＫは、破骨細胞分化を妨害す
ることにより、過剰の骨破壊が起きる疾病状態において破骨細胞形成の影響を改
善するのにも有用である。そのような疾病状態には、ページェット病、骨粗鬆症
および癌が含まれる。多くの癌が骨に転移し、正常な骨リモデリングを局部的に
撹乱することにより骨破壊を誘発する。そのような癌は破骨細胞数の増加、およ
び破骨細胞による骨再吸収量の増加を伴い、高カルシウム血症を生じる可能性が
ある。これらの癌には、乳癌、多発骨髄腫、黒色腫、肺癌、前立腺癌、血液学的
癌、頭頸部癌および腎癌が含まれるが、これらに限定されない（Ｇｕｉｓｅ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９（１）：１８−５４，
１９９８参照）。可溶性形ＲＡＮＫをそのような癌患者に投与して破骨細胞分化
経路を撹乱し、その結果、破骨細胞数を減少させ、骨再吸収を低下させ、高カル
シウム血症の負の影響を緩和することができる。
【００２８】 他の癌は骨に転移しないが全身的に骨に作用し、骨リモデリングを撹乱して高
カルシウム血症を生じることが知られている（Ｇｕｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９（１）：１８−５４，１９９８参照）。
本発明によれば、ＲＡＮＫＬは骨に転移しないが高カルシウム血症に関連する特
定の扁平上皮細胞の表面にみられた（後記の実施例３参照）。高カルシウム血症
に関連する扁平上皮細胞もＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１）を発現する。これはＲＡＮ
ＫＬと一緒になって、破骨細胞の増殖および破骨細胞前駆体から破骨細胞への分
化を刺激するサイトカインである。本発明によれば、Ｍ−ＣＳＦは破骨細胞前駆
体の表面にあるＲＡＮＫを直接にアップレギュレーションすることが見出された
。扁平上皮細胞が過剰量のＣＳＦ−１を放出すると、破骨細胞前駆体の表面でＲ
ＡＮＫの過剰発現が起きる。したがって、ＲＡＮＫが骨芽細胞または間質細胞上
にあるＲＡＮＫＬと相互作用して破骨細胞数を増加させ、その結果、骨破壊量お
よび高カルシウム血症を高める可能性が高くなる。
【００２９】 本発明は、骨に転移する癌の影響を改善するほか、破骨細胞活性過剰に関連す
る癌（たとえば扁平上皮細胞癌）の全身作用、たとえば高カルシウム血症を改善
する方法を提供する。そのような方法には、破骨細胞前駆体から破骨細胞への分
化をもたらすＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬシグナル伝達を妨害するのに十分な量の可溶
性形ＲＡＮＫの投与が含まれる。破骨細胞数が減少すると、骨再吸収が低下し、
高カルシウム血症の負の影響を緩和することができる。
【００３０】 療法に使用するには、精製タンパク質を、個体、好ましくはヒトに、その適応
症に適した様式での療法のために投与する。たとえば破骨細胞機能の調節のため
に投与するＲＡＮＫタンパク質組成物は、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射、連続注
入、埋込体からの持続放出、その他の適切な手法で投与できる。一般に、精製Ｒ
ＡＮＫを生理学的に許容できるキャリヤー、賦形剤または希釈剤と共に含む組成
物の形で療法薬を投与する。そのようなキャリヤーは、使用する投与量および濃
度でレシピエントに対し無毒性である。
【００３１】 普通はそのような組成物の調製は、本発明のタンパク質を緩衝剤、酸化防止剤
、たとえばアスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タン
パク質、アミノ酸、炭水化物、たとえばグルコース、ショ糖またはデキストリン
、キレート化剤、たとえばＥＤＴＡ、グルタチオン、ならびに他の安定剤および
賦形剤と混和することを伴う。中性緩衝食塩水、または同種血清アルブミンと混
合した食塩水は、きわめて適切な希釈剤である。好ましくは、希釈剤として適し
た賦形剤溶液（たとえばショ糖）を用いて、調製物を凍結乾燥品として製剤化す
る。適切な投与量は試験により決定できる。もちろん投与の量および回数は、処
置される適応症の性質および程度、目的とする応答、患者の状態などの要因に応
じて異なるであろう。
【００３２】 可溶性形ＲＡＮＫおよび他のＲＡＮＫアンタゴニスト、たとえばアンタゴニス
ト性モノクローナル抗体を、ＲＡＮＫ誘発性破骨細胞形成の阻害のために投与で
きる。過剰の骨損失が起きる種々の疾病状態において、破骨細胞形成を阻害する
ことが望ましい。その例には、骨粗鬆症、ページェット病および種々の癌が含ま
れる。これらの疾病の種々の動物モデルが当技術分野で知られている；したがっ
て可溶性ＲＡＮＫの最適な投与量および投与経路をまず動物モデルにおいて判定
し、次いでヒトの臨床試験において判定するのはルーティン実験である。
【００３３】 以下の実施例は説明のために提供するものであり、限定のためのものではない
。特に本明細書に引用した種々の参考文献（それらの教示内容を参考として援用
する）の教示を考慮して実施例中の本発明の態様を変更しうることは、当業者に
認識されるであろう。
【００３４】 実施例１ この例は、種々のリガンドが受容体に結合する能力を比較するのに有用なプレ
ート結合アッセイ法を記載する。このアッセイ法は、本質的にＳｍｉｔｈ ｅｔ
ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３６：３１６（１９９７）の記載に従って行わ
れる。要約すると、９６ウェルのマイクロタイタープレートをヒトＦｃに対する
抗体（すなわちポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ）でコーティングする。次いで受
容体／Ｆｃ融合タンパク質を添加し、インキュベーション後、プレートを洗浄す
る。次いでリガンドの系列希釈液を添加する。リガンドを直接標識してもよく（
たとえば125Ｉで）、または放射性標識した検出試薬を用いてもよい。インキュ
ベーション後、プレートを洗浄し、特異的に結合したリガンドを放出させ、結合
リガンドの量を定量する。
【００３５】 この方法を用いて、ＲＡＮＫ／ＦｃおよびＯＰＧ／Ｆｃを９６ウェルプレート
に結合させた。間接法では、ＲＡＮＫＬ／ジッパー融合体をジッパー部分に対す
る標識抗体で検出する。ヒトＯＰＧ／ＦｃはｍＲＡＮＫＬを０．０５ｎＭで結合
し、ヒトＲＡＮＫ／ＦｃはｍＲＡＮＫＬを０．１ｎＭで結合することが認められ
た。これらの数値はＲＡＮＫＬに対するＯＰＧとＲＡＮＫの結合親和性が類似す
ることを示し、ＲＡＮＫがＯＰＧと同様に破骨細胞活性の阻害薬として有用であ
ることを示す。
【００３６】 実施例２ 以下に、ＲＡＮＫＬ／ロイシンジッパー融合タンパク質（ＲＡＮＫＬ ＬＺ）
の形の可溶性ＲＡＮＫＬを用いて骨髄細胞培養物から破骨細胞様細胞を形成する
ことについて記載する。
【００３７】 ＲＡＮＫＬ ＬＺを１μｇ／ｍｌで用いて、ネズミ骨髄（ＢＭ）からＣＳＦ−
１の存在下で破骨細胞を形成した。これらの破骨細胞はマクロファージ様細胞の
融合により形成され、それらはＴＲＡＰ（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ）陽性
であることを特色とする。ＣＳＦ−１を単独で含有する培養物、またはＣＳＦ−
１とＴＲＡＩＬ ＬＺを含有する培養物（可溶性ＲＡＮＫＬ ＬＺに対する対照
）中には、ＴＲＡＰ+細胞はみられなかった。ヒトおよびサルの骨髄はネズミの
骨髄より多くの汚染線維芽細胞を含有するが、ネズミおよびサルの骨髄からＣＳ
Ｆ−１と可溶性ＲＡＮＫＬ ＬＺの組合わせにより破骨細胞が形成された。ネズ
ミ骨髄と最適量未満（ｓｕｂｏｐｔｉｃａｌ）のＣＳＦ−１（４０ｎｇ／ｍｌ）
を用いた用量応答試験において、可溶性ＲＡＮＫＬ ＬＺの効果は約１００ｎｇ
／ｍｌでプラトーに達した。
【００３８】 細胞増殖に対する可溶性ＲＡＮＫＬ ＬＺの効果を、同じ培養においてＡｌａ
ｍａｒ Ｂｌｕｅを用いて調べた。５日後、ＣＳＦ−１およびＲＡＮＫＬ ＬＺ
を含有する培養物の増殖応答はＣＳＦ−１を単独で含有するものより低かった。
これは可溶性ＲＡＮＫＬ ＬＺが破骨細胞分化誘発性であるという所見を支持す
る。７または８日目にＣＳＦ−１およびＲＡＮＫＬ ＬＺをネズミ培養物から洗
い去ると、細胞は培地中またはＲＡＮＫＬ ＬＺ単独中で再培養しても生存しな
い。これに対しＣＳＦ−１中で再培養した場合、細胞は生存する。ＲＡＮＫＬ
ＬＺをこれらの培養に添加しても、効果はなかった。したがって、破骨細胞形成
にはＣＳＦ−１とＲＡＮＫＬの組合わせが必要である。さらに、いったん形成さ
れると、培養においてそれらの細胞の生存を維持するのにＣＳＦ−１は十分であ
る。
【００３９】 最後にヒト骨髄を用いて、可溶性抗ヒトＲＡＮＫ ｍＡｂおよび固定化抗ヒト
ＲＡＮＫ ｍＡｂを、ＣＳＦ−１の存在下での破骨細胞形成について、ＲＡＮＫ
Ｌ ＬＺと比較した。固定化したＭ３３１とＲＡＮＫＬ ＬＺは破骨細胞形成に
ついて同等に有効であることが認められたが、可溶性Ｍ３３１は固定化した抗体
およびＲＡＮＫＬ ＬＺの両方より優れていた。このことから、ＲＡＮＫＬの破
骨細胞分化活性は他の受容体ではなくＲＡＮＫにより仲介されることが確認され
る。
【００４０】 破骨細胞はフローサイトメトリーにより採集および分析するのが容易ではない
ので、破骨細胞を同定するために125Ｉ−標識カルシトニン結合アッセイ法を採
用した（カルシトニン受容体は破骨細胞特異的マーカーであると考えられる）。
ＣＳＦ−１およびＲＡＮＫＬ ＬＺと共に９日間培養したネズミＢＭから形成さ
れた破骨細胞は放射性標識カルシトニンの結合を示し、それらの破骨細胞同一性
が確認された。
【００４１】 実施例３ ２つの異なる扁平上皮細胞癌によるＲＡＮＫＬ発現を測定するために、ＭＨ−
８５細胞およびＯＫＫ細胞について標準ウェスタンブロット法およびＲＴ−ＰＣ
Ｒ試験を実施した。これらの癌細胞のうちの１つ、ＭＨ−８５細胞は、高カルシ
ウム血症に関連する。
【００４２】 その結果から、ＭＨ−８５細胞およびＯＫＫ細胞がＲＡＮＫＬを発現すること
を確認された。ＭＨ−８５は、この癌に罹患している患者の高カルシウム血症に
関連するほか、Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１）をも発現する。ＣＳＦ−１は破骨細胞
前駆体上でのＲＡＮＫ発現をアップレギュレーションすることも認められた。Ｍ
Ｈ−８５タイプ扁平上皮細胞癌患者においてＣＳＦ−１量が増加すると、ＲＡＮ
ＫのアップレギュレーションおよびＲＡＮＫとＲＡＮＫＬの相互作用の増加を生
じる可能性がある。ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬの相互作用により伝達されるシグナル
は、成熟破骨細胞数および骨破壊を増加させる。可溶性形ＲＡＮＫはＲＡＮＫ／
ＲＡＮＫＬ相互作用を阻害しうるので、可溶性形ＲＡＮＫ（たとえばＲＡＮＫの
細胞外領域がＦｃに融合したもの）を扁平上皮細胞癌患者に投与すると、高カル
シウム血症を含めてこの癌の不都合な影響が緩和される。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/705 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA01 HA01 4C084 AA02 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 DB60 MA02 NA14 ZA892 ZA962 ZA972 ZB262 4H045 AA30 BA10 DA50 EA28

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 破骨細胞活性の調節方法であって、可溶性ＲＡＮＫにＲＡＮＫ
    Ｌを結合させることを含む方法。
  2. 【請求項２】 可溶性ＲＡＮＫが下記よりなる群から選択されるＤＮＡにより
    コードされる、請求項１に記載の方法： （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ
    ＮＡ；このタンパク質は、配列番号：６２のアミノ酸１〜３３（１および３３を
    含む）よりなる群から選択されるアミノ末端、およびアミノ酸１９６〜６１６（
    １９６および６１６を含む）よりなる群から選択されるカルボキシ末端を有する
    ； （ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ
    ＮＡ；このタンパク質は、配列番号：６のアミノ酸１〜３０（１および３０を含
    む）よりなる群から選択されるアミノ末端、およびアミノ酸１９７〜６２５（１
    ９７および６２５を含む）よりなる群から選択されるカルボキシ末端を有する； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダ
    イゼーションすることができ、かつＲＡＮＫＬを結合するＲＡＮＫポリペプチド
    をコードする、ＤＮＡ分子；ならびに （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡによりコードされるタンパク質の
    フラグメントをコードするＤＮＡ分子；これらのＲＡＮＫポリペプチドフラグメ
    ントはＲＡＮＫＬを結合する。
  3. 【請求項３】 ＲＡＮＫのアミノ酸配列が天然ＲＡＮＫに少なくとも８０％同
    一である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 ＲＡＮＫがさらに、免疫グロブリンＦｃドメイン、免疫グロブ
    リンＦｃムテイン、ＦＬＡＧ（商標）タグ、少なくとも約６個のＨｉｓ残基を含
    むペプチド、ロイシンジッパー、およびこれらの組合わせよりなる群から選択さ
    れるポリペプチドを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 骨損失過剰の影響を改善する方法であって、可溶性ＲＡＮＫポ
    リペプチド組成物を骨損失過剰のリスクがある個体に投与し、可溶性ＲＡＮＫに
    ＲＡＮＫＬを結合させ、ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫ発現細胞に結合するのを阻害する
    ことを含む方法。
  6. 【請求項６】 個体が、骨粗鬆症、ページェット病および骨癌、ならびに高カ
    ルシウム血症に関連する癌のリスクをもつか、またはそれらに罹患している、請
    求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 可溶性ＲＡＮＫが下記よりなる群から選択されるＤＮＡにより
    コードされる、請求項５に記載の方法： （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ
    ＮＡ；このタンパク質は、配列番号：６２のアミノ酸１〜３３（１および３３を
    含む）よりなる群から選択されるアミノ末端、およびアミノ酸１９６〜６１６（
    １９６および６１６を含む）よりなる群から選択されるカルボキシ末端を有する
    ； （ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ
    ＮＡ；このタンパク質は、配列番号：６のアミノ酸１〜３０（１および３０を含
    む）よりなる群から選択されるアミノ末端、およびアミノ酸１９７〜６２５（１
    ９７および６２５を含む）よりなる群から選択されるカルボキシ末端を有する； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダ
    イゼーションすることができ、かつＲＡＮＫＬを結合するＲＡＮＫポリペプチド
    をコードする、ＤＮＡ分子；ならびに （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡによりコードされるタンパク質の
    フラグメントをコードするＤＮＡ分子；これらのＲＡＮＫポリペプチドフラグメ
    ントはＲＡＮＫＬを結合する。
  8. 【請求項８】 ＲＡＮＫのアミノ酸配列が天然ＲＡＮＫに少なくとも８０％同
    一である、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ＲＡＮＫがさらに、免疫グロブリンＦｃドメイン、免疫グロブ
    リンＦｃムテイン、ＦＬＡＧ（商標）タグ、少なくとも約６個のＨｉｓ残基を含
    むペプチド、ロイシンジッパー、およびこれらの組合わせよりなる群から選択さ
    れるポリペプチドを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 可溶性ＲＡＮＫが下記よりなる群から選択されるＤＮＡによ
    りコードされる、請求項６に記載の方法： （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ
    ＮＡ；このタンパク質は、配列番号：６２のアミノ酸１〜３３（１および３３を
    含む）よりなる群から選択されるアミノ末端、およびアミノ酸１９６〜６１６（
    １９６および６１６を含む）よりなる群から選択されるカルボキシ末端を有する
    ； （ｂ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤ
    ＮＡ；このタンパク質は、配列番号：６のアミノ酸１〜３０（１および３０を含
    む）よりなる群から選択されるアミノ末端、およびアミノ酸１９７〜６２５（１
    ９７および６２５を含む）よりなる群から選択されるカルボキシ末端を有する； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダ
    イゼーションすることができ、かつＲＡＮＫＬを結合するＲＡＮＫポリペプチド
    をコードする、ＤＮＡ分子；ならびに （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡによりコードされるタンパク質の
    フラグメントをコードするＤＮＡ分子；これらのＲＡＮＫポリペプチドフラグメ
    ントはＲＡＮＫＬを結合する。
  11. 【請求項１１】 ＲＡＮＫのアミノ酸配列が天然ＲＡＮＫに少なくとも８０％
    同一である、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ＲＡＮＫがさらに、免疫グロブリンＦｃドメイン、免疫グロ
    ブリンＦｃムテイン、ＦＬＡＧ（商標）タグ、少なくとも約６個のＨｉｓ残基を
    含むペプチド、ロイシンジッパー、およびこれらの組合わせよりなる群から選択
    されるポリペプチドを含む、請求項１１に記載の方法。
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