JP2001506982A

JP2001506982A - 一酸化窒素産生の制御法

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Publication number: JP2001506982A
Application number: JP52478898A
Authority: JP
Inventors: トラウト，アンソニー・ビー
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 2001-05-29
Also published as: WO1998023284A1; US6083906A; EP0959897B1; ES2326347T3; AU7408998A; DE69739375D1; EP0959897A1; ATE429241T1; EP0959897A4

Abstract

(57)【要約】一酸化窒素レベルを制御する方法が開示される。該方法はIL-17受容体を利用し、前記受容体はIL-1および／またはTNFの阻害剤と組み合わせて使用してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】一酸化窒素産生の制御法発明の技術分野本発明は一般的に、一酸化窒素（nitric oxide）レベルの調節、特に変形性関節症（osteoarthritis）における前記調節に関する。発明の背景サイトカインはホルモン様分子であり、免疫または炎症性反応のさまざまな側面を制御する；サイトカインは、細胞上に存在する受容体に特異的に結合し、そして細胞へ情報を伝達することによりその効果を発揮する。有益な効果（すなわち有効な免疫反応の発達および感染性疾患の調節）を有するのに加え、サイトカインはまた、さまざまな自己免疫および炎症性異常に関連付けられている。さまざまな軟骨関連細胞（すなわち、軟骨細胞、滑膜内層細胞(synovial lini ngcell)、内皮細胞、滑膜線維芽細胞および関節に存在する単核細胞）は、一酸化窒素（NO）を放出する可能性がある。この遊離基（free radical）は最前線の抗微生物剤として働き、そしてまた抗腫瘍作用も有する。しかし、NOはまた、自己免疫および炎症性疾患、および典型的には炎症性異常とは考えられない変形性関節症において起こる骨破壊を含む、いくつかの有害な状態にも関連付けられている。 Rouvierら（J.Immunol.150:5445;1993）は新規cDNAを報告し、CTLA-8と名付け、そしてこれは以来、インターロイキン−17（IL-17）として知られるようになった。IL-17はHVS13と称される、ヘルペスウイルス・サイミリ（Herpesvirus sa imiri）(HSV)に存在する読み枠（ORF）の予測されるアミノ酸配列と57％相同である(Nicholasら，Virol．179:189，1990;Albrechtら，J.Virol.66:5047;1992) 。 IL-17およびそのウイルス相同体(homolog)、HVS13に結合する新規受容体が、1 996年３月21日に出願されたUSSN 08/620,694に記載されるように単離されている。該受容体はＩ型膜貫通タンパク質であり；マウス受容体は864アミノ酸残基を有し、ヒト受容体は866アミノ酸残基を有する。該受容体の可溶性型は、IL-17が仲介するさまざまな作用を阻害することが見出された。発明の概要一酸化窒素（NO）は、慢性関節リウマチ（RA）および変形性関節症（OA）の病理生理学的異常を含む、多くの現象に関与する遊離基（free radical）である。 IL-17は、OAを患う個体由来の軟骨によるNO産生を刺激する。IL-17Rの可溶性型は、IL-17が仲介するさまざまな作用を阻害することが見出された。したがって、可溶性型IL-17Rは臨床的環境におけるNOレベルの制御に有用であろう。発明の詳細な説明一酸化窒素は、内皮依存弛緩、神経伝達および細胞仲介免疫反応を含む多くの生理学的現象に関与する、細胞内情報伝達分子である。NOは抗微生物剤として、細菌、ウイルス、蠕虫（helminth）および寄生虫に対し有効であり；また、腫瘍細胞を殺すのにも有用である。炎症性疾患（すなわち、関節炎、潰瘍性大腸炎、糖尿病、クローン病）において、NOレベルの上昇が起こり、そしてNOシンテターゼ（NOS）の阻害剤は、炎症性疾患の実験モデルに用いられ、多様な効果を示してきた(A.O.VladutiuによりClinical Immunology and Immunopathology 76:1-11 ;1995に論評されている)。変形性関節症（OA）は典型的には非炎症性疾患と見なされてきたが、Aminら（ J.Exp.Med.182:2097;1995）は最近、NOSレベルがOA患者由来の軟骨において上方制御されていることを報告した。OA罹患軟骨を無血清培地中でインキュベーションした結果、相当量のNOの自発的放出が生じた。インターロイキン−1β(IL-1β )、腫瘍壊死因子−α（TNF-α）およびリポ多糖（LPS）はOA罹患軟骨の亜硝酸塩放出を増大させた。同様の結果は、Sakuraiら（J.Clin.Invest.96:2357,1995）により慢性関節リウマチ患者でも観察された。 IL-17もまた、OA罹患軟骨からのNO放出を上方制御する。さらに、IL-1βおよびTNF-αの阻害剤は、IL-17が増大させるNO放出を阻害しない。したがって、IL-17阻害剤は、NOレベルの制御に有用であろう。こうした阻害剤はOAと共に、遊離基が役割を果たす他の疾患異常（すなわち、自己免疫および炎症性疾患）におけるNOの影響を改善するのに、治療的適用を見出すであろう。 IL-17阻害剤の特に好ましい型は、USSN 08/620,694に詳細に記載されている可溶性IL-17Rである。IL-17阻害剤はIL-1およびTNFの阻害剤と組み合わせて（すなわち、同時に、別々にまたは連続して）使用してもよい。典型的なIL-1阻害剤には、米国特許第5,319,071号、第5,180,812号および第5,350,683号に記載されるような可溶性IL-1受容体と共に、IL-1受容体アンタゴニストとして知られるタンパク質（IL-IRA；Eisenbergら，Nature 343:341,1990）および米国特許第5,416, 013号に記載されるような、IL-1を生物学的活性型に切断する酵素の阻害剤が含まれる。典型的なTNF阻害剤には、例えば、米国特許第5,395,760号に記載されるような TNF受容体の可溶性型、およびUSSN 08/406,824およびUSSN 08/651,286に開示されるようなTNF受容体融合タンパク質が含まれる。さらに、米国特許第5,359,039 号および第5,464,938号に記載されるように、ある種のウイルスがコードするタンパク質がTNFに結合し、そしてTNFアンタゴニストとして作用することが知られており；そしてTNFを生物学的活性型に切断する酵素の阻害剤もまた知られている(USSN 08/651,363およびUSSN 08/655,345を参照されたい)。前記特許および特許出願の関連する開示は、本明細書に援用される。IL-17 、HVS13および相同タンパク質 CTLA-8は、活性化Ｔ細胞ハイブリドーマクローンから単離されたcDNAを指す(R ouvierら，J.Immunol.150:5445;1993)。ノーザンブロット解析により、CTLA-8転写は非常に組織特異的であることが示された。CTLA-8遺伝子は、マウスでは染色体部位1aに、ヒトでは2q31にマップされることが見出された。CTLA-8遺伝子によりコードされるタンパク質はRouvierらによって同定されなかったが、CTLA-8の予測されるアミノ酸配列は、ヘルペスウイルス・サイミリに存在するORF、HVS13 の予測されるアミノ酸配列と57％相同であることが見出された。CTLA-8タンパク質は本明細書においてインターロイキン−17(IL-17) と称される。 HVSゲノムの完全なヌクレオチド配列が報告されている(Albrechtら,J.Virol.6 6:5047;1992)。HVS読み枠（ORF）の１つ、HVS13に関するさらなる研究が、Nicho lasら，Virol．179:189;1990に記載されている。HVS13はHVSのHindIII-G断片に存在する後期遺伝子である。HVS13由来のペプチドに対し作成された抗血清は後期タンパク質に反応すると考えられている(Nicholasら、上記)。 1995年３月23日に出願されたUSSN 08/410,536の一部継続出願であるUSSN 08/4 62,353に記載されるように、ネズミCTLA-8タンパク質の全長およびCTLA-81Fc融合タンパク質が発現され、試験され、そしてＴ細胞増殖に対し共刺激剤として作用することが見出された。ヒトIL-17（CTLA-8）は変性PCR由来のDNA断片を用いてヒトＴ細胞ライブラリーを探査することにより同定され；IL-17（CTLA-8）相同体は他の種にも存在することが期待される。全長HVS13タンパク質と共にHVS13 /Fc融合タンパク質もまた発現され、そしてIL-17（CTLA-8）タンパク質と同様の様式で作用することが見出された。さらに、ヘルペスウイルスの他種もまた、HV S13にコードされるものに相同なタンパク質をコードするらしい。タンパク質および類似体（analogue） 1996年３月21日に出願されたUSSN 08/620,694は、免疫制御作用を有する単離I L-17Rおよびその相同体を開示している。こうしたタンパク質は実質的に内因性成分の混入がなく、そして所望により、結合する天然型糖付加を伴わない。本発明の範囲内のIL-17R誘導体にはまた、生物学的活性を保持する一次タンパク質のさまざまな構造型が含まれる。イオン化可能なアミノおよびカルボキシル基が存在するため、例えばIL-17Rタンパク質は酸性または塩基性塩型であってもよく、また中性型であってもよい。個々のアミノ酸残基も、酸化または還元により修飾されてもよい。一次アミノ酸構造を、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびそれに匹敵するものなどの他の化学的部分と共有または凝集結合を形成することにより、またはアミノ酸配列突然変異体を生成することにより、修飾してもよい。共有結合誘導体は、特定の官能基をアミノ酸側鎖またはＮまたはＣ末端に連結することにより調製される。 IL-17Rの可溶性型もまた、本発明の範囲内にある。ネズミIL-17Rのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を配列番号１および２に示す。コンピューター解析により、該タンパク質は、切断部位がアミノ酸31および32の間であるＮ末端シグナルペプチドを有することが示された。当業者は、実際の切断部位がコンピューター解析により予測されるものと異なる可能性があることを認識するであろう。したがって、切断ペプチドのＮ末端アミノ酸は、予測される切断部位のどちらかの側のおよそ５アミノ酸の範囲にあることが期待される。シグナルペプチドに続いて、291アミノ酸の細胞外ドメイン、21アミノ酸の膜貫通ドメイン、および521アミノ酸の細胞質テールがある。可溶性IL-17Rはシグナルペプチドおよび細胞外ドメイン（配列番号１の残基１から322）またはその断片を含む。また別に、配列番号１の残基１から31の代わりに、異なるシグナルペプチドが置換していてもよい。ヒトIL-17Rのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を配列番号３および４に示す。これはネズミIL-17Rと多くの特徴を共有する。コンピューター解析により、該タンパク質は、切断部位がアミノ酸27および28の間であるＮ末端シグナルペプチドを有することが示された。当業者は、実際の切断部位がコンピューター解析により予測されるものと異なる可能性があることを認識するであろう。したがって、切断ペプチドのＮ末端アミノ酸は、予測される切断部位のどちらかの側のおよそ５アミノ酸の範囲にあることが期待される。シグナルペプチドに続いて、293アミノ酸の細胞外ドメイン、21アミノ酸の膜貫通ドメイン、および5 25アミノ酸の細胞質テールがある。可溶性IL-17Rはシグナルペプチドおよび細胞外ドメイン（配列番号３の残基１から320）またはその断片を含む。また別に、天然シグナルペプチドの代わりに、異なるシグナルペプチドが置換していてもよい。本発明の範囲内であるIL-17Rタンパク質の他の誘導体およびその相同体には、Ｎ末端またはＣ末端融合体として組換え培養において合成するものなど、該タンパク質およびその断片の、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集結合体が含まれる。例えば、結合するペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に、タンパク質を合成部位から細胞膜または細胞壁の内部または外部の機能部位へと向ける、タンパク質のＮ末端領域のシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列（例えば、酵母α−因子リーダー）であってもよい。タンパク質融合体は、IL-17Rタンパク質および相同体の精製または同定を容易にするため加えられたペプチド（例えばポリHis）を含んでもよい。本発明のタンパク質のアミノ酸配列はまた、Hoppら,Bio/Technology 6:1204(1988)に記載されるような同定ペプチドに連結していてもよい。こうした高い抗原性のペプチドは、特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速な検定および容易な精製を可能にする。Hoppらの配列はまた、ウシ粘膜エンテロキナーゼにより特異的に切断され、精製タンパク質から該ペプチドを除去することを可能にする。こうしたペプチドにキャップされた融合タンパク質はまた、大腸菌（E.coll）における細胞内分解にも抵抗性がある可能性がある。膜タンパク質の細胞外ドメイン（同族（cognate）結合領域）が免疫グロブリン重鎖定常（Fc）ドメインに結合する融合タンパク質として、いくつかの膜貫通タンパク質の可溶性型が発現されている。こうした融合タンパク質は、その同族タンパク質を検出する試薬として有用である。これらはまた、疾患の治療における治療剤としても有用である。しかし、Fcドメインの受容体は多くの細胞タイプに存在する。したがって、融合タンパク質がFcドメインおよび同族結合領域から形成される際、細胞への結合は同族タンパク質への同族結合領域の結合を通じて、またはFc受容体（FcR）へのFcドメインの結合を通じて起こる可能性がある。こうしたFc受容体へのFcドメインの結合は、相同体への同族結合領域のいかなる結合をも圧倒する可能性がある。さらに、Fc受容体へのFcドメインの結合は、免疫または炎症性反応のさまざまな側面を上方制御するのに関与する、さまざまなサイトカインの分泌を誘導する；こうした上方制御は、ある種の抗体の治療における投与のいくつかの副作用に関連付けられている(Krutmanら,J.Immunol.145:1 337,1990;Thistlewaiteら,Am.J.Kidney Dis.11:112,1988)。 Jefferisら（Mol.Immunol.27:1237;1990）はヒンジ領域と称される抗体の領域（および特にこの領域内の残基234−237）がヒトFc受容体であるFcγRI、Fcγ RII、およびFcγRIIIによる抗体認識を決定することを報告した。Leu₍₂₃₄₎およびLeu₍₂₃₅₎はIgG₃がU937細胞上に存在するFcγRIに高い親和性で結合するのに不可欠であった(CanfieldおよびMorrison,J.Exp.Med.173:1483;1991)。同様の結果がLundら(J.Immunol.147:2657,1991;Molecular Immunol.29:53,1991)により得られた。これらの著者は、不可欠な残基に単一アミノ酸置換を行った際、IgGのFcR への親和性が10から100倍減少するのを観察した。抗CD3モノクローナル抗体のFcドメイン内の単一アミノ酸置換（235位におけるロイシンからグルタミン酸への置換）の結果、突然変異を受けていない抗体に比べ、Ｔ細胞活性化が有意に減少する一方、免疫抑制特性は維持されることが見出された(Alegreら,J.Immunol.148:3461;1992)。Wawrzynczakらは、残基235に単一アミノ酸置換を含むネズミモノクローナル抗体が、天然抗体と同じ血清半減期を有することを見出した(Mol．Immunol.29:221;1992)。Fc受容体への親和性が減少したFcドメインは、Fc融合タンパク質の調製において有用である。ロイシンジッパーは元来、いくつかのDNA結合タンパク質で同定された(Landsc hulzら,Science 240:1759,1988)。ロイシンジッパードメインは、これら（および他の）タンパク質に存在する、タンパク質の二量体化能を有する保存ペプチドドメインを指すのに使用する用語である。ロイシンジッパードメイン(本明細書において、オリゴマー化、またはオリゴマー形成ドメインとも称される)は、他のアミノ酸内に間隔をおいて配置された４つまたは５つのロイシン残基を含む、繰り返される７残基反復（heptad repeat）を含む、。ロイシンジッパードメインの例には、酵母転写因子GCN4およびラット肝臓に見出される熱安定性DNA結合タンパク質（C/EBP；Landschulzら,Science 243:1681,1989）に見られるものがある。２つの核トランスフォーミングタンパク質、fosおよびjunもまた、ロイシンジッパードメインを示し、ネズミプロトオンコジーン、c-mycの遺伝子産物も同様である(Landschulzら,Science 240:1759,1988)。核オンコジーン、fosおよびjunの産物は優先的にヘテロ二量体を形成するロイシンジッパードメインを含む(O'Sheaら,Science 245:646,1989;TurnerおよびTjian,Science 243:1689,1989)。ロイシンジッパードメインは、これらタンパク質の生物学的活性（DNA結合）に必要である。パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスを含む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（fusogenic）タンパク質もまた、ロイシンジッパードメインを所有する(BucklandおよびWild,Nature 3 38:547,1989;Britton,Nature 353:394,1991;DelwartおよびMosialos,AIDS Resea rch and Human Retroviruses 6:703,1990)。こうした融合体形成性ウイルスタンパク質におけるロイシンジッパードメインは、該タンパク質の膜貫通領域の近傍にあり；ロイシンジッパードメインが融合体形成性タンパク質のオリゴマー構造に寄与している可能性が示唆されてきた。融合体形成性ウイルスタンパク質のオリゴマー化は融合孔（fusion pore）形成に関与している(Spruceら,Proc.Natl.A cad.Sci.U.S.A.88:3523,1991)。ロイシンジッパードメインはまた、最近、熱ショック転写因子のオリゴマー化において役割を果たしていることも報告されている(Rabindranら,Science 259:230,1993)。ロイシンジッパードメインは、短い、平行コイルドコイル(parallel coiled c oil)として折りたたまれている(O'Sheaら,Science 254:539,1991)。平行コイルドコイルの一般的構造は、Crickにより1953年に提唱された「ノブを穴へ(knobs- into-holes)」パッキング（Acta Crystallogr.6:689）により、よく特徴付けられている。ロイシンジッパードメインにより形成された二量体は、McLachlanおよびStewert（J．Mol．Biol．98:293;1975）の表記に従い、（abcdefg）_nと表される、７残基反復により安定化される。ここでａおよびｄは一般的に疎水性残基であり、ｄはロイシンであり、これらはらせんの同じ面に並ぶ。逆に荷電した残基は普通、ｇおよびｅ位にある。したがって、２つのらせん状ロイシンジッパードメインから形成される平行コイルドコイルにおいて、第一のらせんの疎水性側鎖により形成された「ノブ」は、第二のらせんの側鎖間に形成された「穴」にパッキングされる。ｄ位のロイシン残基は、巨大な疎水性安定化エネルギーに寄与し、そして二量体形成に重要である（Krystekら,Int.J.Peptide Res.38:229,1991）Lovejoyらは最近、らせんが上−上−下に走る、三重鎖αらせん束（triple-stranded α- helical bundle）合成を報告している(Science 259:1288,1993)。彼らの研究により、疎水性安定化エネルギーが、らせん単量体からのコイルドコイルの形成のための主要な原動力を提供していることが裏付けられた。これらの研究はまた、静電相互作用がコイルドコイルの化学量論および形状に寄与していることを示している。いくつかの研究により、保存性アミノ酸を個々のロイシン残基に置換しても二量体化能の減少が最小限である可能性があること；しかし、複数の変化により、通常この能力は損失することが示されてきた(Landshulzら,Science 243:1681,19 89;TurnerおよびTjian,Science 243:1689,1989;Huら,Science 250:1400,1990)。 van Heekerenらは、GCN4のロイシンジッパードメインにおいて、多くの異なるアミノ酸残基をロイシン残基に置換することが可能であることを報告し、そしてさらに２つのロイシン置換を含むいくつかのGCN4タンパク質が弱い活性を有することを見出した(Nucl.Acids Res.20:3721,1992)。麻疹ウイルス融合タンパク質（M VF）のロイシンジッパードメインの第一および第二の７残基のロイシンが突然変異しても、シンシチウム（syncytium）形成（ウイルス誘導細胞融合の基準）には影響を与えなかった；しかし、４つすべてのロイシン残基が突然変異すると、融合が完全に妨げられた(Bucklandら,J.Gen.Virol.73:1703,1992)。いずれの突然変異もMVFが四量体を形成する能力に影響を与えなかった。最近、GCN4ロイシンジッパードメインの代わりである合成ペプチドのａおよびｄ残基におけるアミノ酸置換が、該ロイシンジッパードメインのオリゴマー化特性を変化させることが見出されている(Alber,Sixth Symposium of the Protein Society,カリフォルニア州サンディエゴ)。ａ位のすべての残基がイソロイシンに変化しても、該ロイシンジッパーは依然として平行二量体を形成する。この変異に加え、ｄ位のすべてのロイシン残基もまたイソロイシンに変化すると、生じたペプチドは溶液中で自発的に三量体平行コイルドコイルを形成する。ｄ位のすべてのアミノ酸をイソロイシンに、ａ位のすべてのアミノ酸をロイシンに置換すると、四量体化するペプチドが生じる。これらの置換を含むペプチドは、そのオリゴマー形成機構が、上記のような伝統的なロイシンジッパードメインと同じであると考えられるため、依然としてロイシンジッパードメインと称される。 IL-17R誘導体はまた、免疫原、in vitro検定における試薬、またはアフィニティー精製法の結合剤として用いてもよい。こうした誘導体はまた、M-マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステルおよびN-ヒドロキシスクシンイミドなどの架橋（cross-link）剤によって、システインおよびリジン残基において得てもよい。本発明のタンパク質はまた、反応性側鎖を介した臭化シアン活性化、ビスオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化またはトシル活性化アガロース構造のような、さまざまな不溶性基質と共有結合していてもよく、またはポリオレフィン表面に吸着させることによってもよい(グルタルアルデヒド架橋を含みまたは含まず)。ひとたび基質に結合したタンパク質は、IL-17R若しくはIL-17R と同様の他のタンパク質に対して作成された抗体と共に、IL-17Rまたはその相同タンパク質と結合する他のタンパク質に選択的に結合する（検定または精製の目的で）のに用いてもよい。本発明はまた、結合する天然型糖付加を伴うまたは伴わないIL-17Rを含む。酵母または哺乳動物発現系、例えばCOS-7細胞において発現されたタンパク質は、発現系次第で、天然分子の分子量および糖付加パターンと同様である、またはわずかに異なる可能性がある。本発明のタンパク質をコードするDNAを大腸菌などの細菌において発現すると、非糖付加分子が提供される。不活性化Ｎ糖付加部位を有するIL-17Rタンパク質またはその相同体の機能的な突然変異類似体を、オリゴヌクレオチド合成および連結により、または部位特異的突然変異誘発技術により産生してもよい。これらの類似体タンパク質は、酵母発現系を用いて、高収率に、均質の炭水化物減少型として産生してもよい。真核タンパク質のＮ糖付加部位はアミノ酸トリプレットAsn-A₁-Z（A₁はPro以外のいかなるアミノ酸でもよく、そしてＺはSerまたはThrである）により特徴付けられる。この配列において、アスパラギンは炭水化物が共有結合する側鎖アミノ基を提供する。こうした部位は、Asnまたは残基Ｚを別のアミノ酸に置換する、AsnまたはＺを欠失させる、またはＺでないアミノ酸をA₁およびＺの間に、またはAsn以外のアミノ酸をAsnおよびA₁の間に挿入することにより、除去してもよい。 IL-17Rタンパク質誘導体はまた、天然IL-17Rまたはそのサブユニットを突然変異させることにより得てもよい。IL-17R突然変異タンパク質は、本明細書において、IL-17Rタンパク質と相同なポリペプチドであるが、１つまたは複数の欠失挿入または置換のため、天然IL-17Rと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。IL-17RペプチドをコードするDNAにおいて作成されたいかなる突然変異の影響も、突然変異IL-17Rペプチドが、IL-17（CTLA-8）または相同タンパク質によるＴまたはＢ細胞共刺激を阻害する、またはIL-17Rに特異的に結合するタンパク質（例えば、抗体またはCTLA-8cDNAまたはHVS13ORFにコードされるタンパク質）に結合する能力を解析することにより、容易に測定することが可能である。さらに、IL-17R類似体、突然変異体（mutein）または誘導体の活性は、本明細書に記載される検定法のいずれを用いて測定してもよい。同様の突然変異を、IL-1 7Rの相同体で作成し、そして同様の方法で試験してもよい。本発明のタンパク質に生物学的に等価な類似体は、例えばさまざまな残基または配列の置換を作成することにより、または生物学的活性に必要とされない末端または内部の残基または配列を欠失させることにより、構築してもよい。例えば、システイン残基を欠失させ、または他のアミノ酸と置き換え、再生時に誤った分子内ジスルフィド結合が形成されるのを妨げてもよい。突然変異誘発の他のアプローチには、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を高めるための、隣接二塩基性アミノ酸残基の修飾が含まれる。一般的に、置換は保存性であるべきである。すなわち、最も好ましい置換アミノ酸は、本発明のタンパク質が、天然mIL-17RまたはhIL-17Rと実質的に同等な様式でリガンドに結合する能力に影響しないものである。保存性置換の例には、結合ドメイン外のアミノ酸置換、およびIL-17Rおよびその相同体の二次および／または三次構造を改変しないアミノ酸置換が含まれる。さらなる例には、Ile、Val 、Leu、またはAlaを互いに置換するような、脂肪族残基の相互置換、あるいはLy sおよびArg間；GluおよびAsp間；またはGlnおよびAsn間のような、極性残基同士の置換が含まれる。他のこうした保存性置換、例えば同様の疎水性特性を有する全領域の置換などがよく知られている。同様に、欠失または挿入戦略が採用される際、欠失または挿入の生物学的活性に対する潜在的影響を考慮すべきである。本発明のタンパク質のサブユニットは、末端または内部の残基または配列を欠失することにより構築してもよい。IL-1 7 に結合するIL-17Rの断片は容易に調製し(例えば、制限酵素を用いて該DNAの一部を欠失させることにより)、そしてそれらのIL-17への結合能を試験することが可能である。作成してもよい突然変異のタイプのさらなる手引きは、IL-17R配列を同様の構造を有するタンパク質と比較することにより、また本発明のタンパク質の構造解析を行うことにより提供される。類似体IL-17Rの発現のため構築されるヌクレオチド配列における突然変異は、当然に、コード配列の読み枠相を保存し、そして好ましくは受容体mRNAの翻訳に不利に影響する可能性があるループやヘアピンなどの二次mRNA構造を産生するようにハイブリダイズする可能性がある相補的領域を生成しないであろう。突然変異部位はあらかじめ決定してもよいが、突然変異の性質自体が決定されている必要はない。例えば、既定の部位における突然変異体の最適な特性を選択するため、標的コドンにおいて無作為突然変異誘発を行い、そして発現した突然変異ウイルスタンパク質を望ましい活性に関し、スクリーニングしてもよい。 IL-17Rタンパク質またはその相同体にコードされるヌクレオチド配列において、すべての突然変異が最終産物中に発現されるわけではないであろう。例えば、ヌクレオチド置換を作成し、主に転写されたmRNAにおける二次構造ループを避け (本明細書に参考文献として援用されるEPA75,444Aを参照されたい)、または選択された宿主により、より容易に翻訳されるコドン、例えば、大腸菌発現のためよく知られる大腸菌が好むコドンを提供し、発現を高めてもよい。突然変異は、天然配列の断片への連結を可能にする制限酵素部位が隣接した、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の部位に導入してもよい。連結後、生じた再構築配列は望ましいアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。また別に、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発法を用い、必要とされる置換、欠失、または挿入にしたがい改変された特定のコドンを有する改変遺伝子を提供してもよい。上記に述べられた改変を作成する典型的な方法は、Wa lderら（Gene 42:133，1986）;Bauerら（Gene 37:73，1985）;Craik（Bio Techn iques.January 1985，12-19）;Smithら（Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981)により開示され；そして米国特許第4,518,584号および第4,737,462号は適切な技術を提供し、そして本明細書に援用される。コード縮重のため、同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列には、かなりの多様性がある可能性がある。他の態様には、中程度に厳密な（stringen t）条件（前洗浄溶液が５ＸSSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA（pH8.0）であり、そしてハイブリダイゼーション条件が50℃、５ＸSSC、一晩である）下で、IL-17RをコードするDNA配列、およびIL-17Rをコードするものに縮重する他の配列にハイブリダイズすることが可能な配列が含まれる。好ましい態様において、IL-17R類似体は、配列番号１または配列番号３に示されるIL-17Rタンパク質のアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも約70％同一である。同様に、IL-17R相同体の類似体は、天然の相同なタンパク質のアミノ酸配列に、アミノ酸配列において少なくとも約70％同一である。より好ましい態様において、IL-17Rまたはその相同体の類似体は、本発明のタンパク質の天然型にアミノ酸配列において少なくとも約80％同一であり；最も好ましい態様において、IL-17Rまたはその相同体の類似体は、本発明のタンパク質の天然型にアミノ酸配列において少なくとも約90 ％同一である。同一性パーセントは、例えば、Devereuxら（Nucl.Acids Res.12:387,1984）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGCG）より入手可能であるGAPコンピュータープログラムなどの、コンピュータープログラムを用いて決定してもよい。IL-17Rタンパク質由来の断片に関し、同一性は、断片に存在するIL-17Rタンパク質の部分に基づいて計算される。同様の方法を用いて、IL-17Rの相同体を解析してもよい。 IL-17R類似体がCTLA-8に結合する能力は、該類似体がIL-17（CTLA-8）誘導Ｔ細胞増殖を阻害する能力を試験することにより測定してもよい。また別に、例えば、CTLA-8またはHSV13（または天然IL-17Rに結合するその相同体）を使用した、酵素免疫検定またはドットブロットなどの適切な検定を使用して、IL-17R類似体がCTLA-8に結合する能力を評価してもよい。こうした方法は当業によく知られている。IL-17 組換え受容体の発現本発明のタンパク質は、好ましくは組換えDNA法により、IL-17Rタンパク質またはその相同体をコードするDNA配列を組換え発現ベクターに挿入し、そして発現を促進する条件下で組換え微生物発現系において該DNA配列を発現することにより、産生される。本発明により提供されるタンパク質をコードするDNA配列は、cDNA断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み合わせ、組換え発現ベクターに挿入し、そして組換え転写単位において発現することが可能である合成遺伝子を提供してもよい。組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適切な転写または翻訳制御要素に機能可能であるように連結した(operably link ed)、IL-17R、相同体、または生物学的等価類似体をコードする合成もしくはcDN A由来DNA断片を含む。こうした制御要素には、以下に詳細に記載するように、転写プロモーター、転写を調節するための所望によるオペレーター配列、適切なmR NAリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結を調節する配列が含まれる。通常、複製起点により与えられる宿主内で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子を付加的に取り入れてもよい。 DNA領域は、互いに機能的に関連している際、機能可能であるように連結している。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）に対するDNAは、ポリペプチドの分泌において関与する前駆体として発現されていれば、該ポリペプチドに対するDNAに機能可能であるように連結しており；プロモーターは、コード配列の転写を調節すれば、該コード配列に機能可能であるように連結しており；またはリボソーム結合部位は、翻訳を許可するように置かれていれば、コード配列に機能可能であるように連結している。一般的に、機能可能であるように連結されるとは、隣接する（contiguous）こと、そして分泌リーダーの場合は隣接し、そして読み枠内にあることを意味する。微生物において発現させようとするIL-17Rまたは相同体をコードするDNA配列は、好ましくはDNAのmRNAへの転写を時期尚早に終結させる可能性があるイントロンを含まないであろう。細菌での使用に有用な発現ベクターは、選択可能マーカーおよびよく知られるクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝的要素を含む商業的に入手可能なプラスミド由来の細菌複製起点を含んでもよい。こうした商業的なベクターには、例えばpKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals,スウエーデン・ウプサラ）およびpGEM1（Promega Biotec,米国ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。これらpBR322「骨格」断片は適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。大腸菌は典型的には、大腸菌種由来のプラスミドであるpBR322 の誘導体を用いて形質転換される(Bolivarら,Gene 2:95,1977)。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、そしてしたがって、形質転換細胞を同定する単純な手段を提供する。組換え微生物発現ベクターに通常使用されるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系(Changら,Nature 275: 615,1978;およびGoeddelら,Nature 281:544,1979)、トリプトファン(trp)プロモーター系（Goeddelら,Nucl.Acids Res.8:4057,1980;およびEPA36,776）およびta cプロモーター（Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Sprin g Harbor Laboratory,p.412,1982）が含まれる。特に有用な細菌発現系はファージλP_LプロモーターおよびcI857ts熱不安定性リプレッサーを使用する。λP_Lプロモーターの誘導体を取りこんだアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ameriacan Type Culture Collection）から入手可能なプラスミドベクターには、大腸菌株JMB9（ATCC37092）に常住するプラスミドpHUB2、および大腸菌RP I（ATCC53082)に常住するpPLc28が含まれる。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzemanら,J.Biol.Chem.255:2073,1980)あるいは、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６− リン酸イソメラーゼ、３−ホスグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Hessら,J.Adv.Enzyme Reg.7:149,1968;およびHolla ndら,Biochem.17:4900,1978）のプロモーターが含まれる。酵母発現系に使用するのに適したベクターおよびプロモーターはR.Hitzemanら,EPA73,657 にさらに記載されている。好ましい酵母ベクターは、大腸菌における選択および複製のためのpBR322由来 DNA配列（Amp^r遺伝子および複製起点）およびグルコース抑制可能ADH2プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む酵母DNA配列を用いて組み合わせてもよい。ADH2プロモーターはRussellら(J.Biol.Chem.258:2674,1982)およびBeierら（Nature 300:724,1982）により記載されている。異種タンパク質の分泌を指示する酵母α−因子リーダーは、プロモーターおよび発現されるべき構造遺伝子の間に挿入してもよい。例えば、Kurjanら,Cell 30:933,1982およびBitterら,Proc .Natl.Acad.Sci.USA.81:5330,1984を参照されたい。リーダー配列は、その3'端近傍に、リーダー配列が外来遺伝子に融合するのを容易にする、１つまたはそれ以上の有用な制限酵素部位を含むよう修飾してもよい。脊椎動物細胞を形質転換するのに使用する発現ベクターにおける転写および翻訳調節配列は、ウイルス供給源により提供されてもよい。例えば、よく用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス2、シミアンウイルス40(SV40)、およびヒトサイトメガロウイルス由来である。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えばSV40起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシングおよびポリアデニル化部位を使用し、異種DNA配列の発現に必要とされる他の遺伝的要素を提供してもよい。初期および後期プロモーターは、どちらもSV40ウイルス複製起点をも含む断片として容易に得られるため、特に有用である(Fiersら，Nature 273:113,1978)。ウイルス複製起点に位置するHind III部位からBglI部位までのおよそ250bp配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいSV40断片もまた使用してもよい。さらに、調節配列が選択された宿主細胞と適合可能であれば、ウイルスゲノムプロモーター、調節および／またはシグナル配列を利用してもよい。典型的なベクターは、OkayamaおよびB erg（Mol.Cell.Biol.3:280,1983）に開示されたように構築してもよい。 C127ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物受容体cDNAの安定した高レベル発現に有用な系を、実質的にCosmanら（Mol.Immunol.23:935,1986）に記載されたように構築してもよい。IL-17R DNAの発現に好ましい真核ベクターは、pD C406（McMahanら,EMBO J.10:2821,1991）と称され、そしてSV40、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびエプスタイン・バーウイルス（EBV）由来の制御配列を含む。他の好ましいベクターには、pDC406由来のpDC409およびpDC410が含まれる。 pDC410は、EBV複製起点をSV40ラージＴ抗原をコードする配列と置換することにより、pDC406より得られた。pDC409は、マルチクローニング部位の外側のBglII 制限酵素部位が欠失され、マルチクローニング部位内のBglII部位が唯一のものとなっている点で、pDC406と異なる。 EBV複製起点を含む、pDC406およびpDC409のような発現ベクターのエピソーム性発現を許す有用な細胞株は、CV-IIEBNA（ATCC CRL10478）である。CV-IIEBNA 細胞株は、CV-1細胞株をエプスタイン・バーウイルス核抗原−１（EBNA-1）をコードする遺伝子でトランスフェクションすることにより得られ、そして常にヒト CMV極初期エンハンサー／プロモーターに誘導され、EBNA-1を発現する。宿主細胞形質転換した宿主細胞は、組換えDNA技術を用いて構築した発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションし、そして本発明のタンパク質をコードする配列を含む細胞である。形質転換した宿主細胞は、望ましいタンパク質（IL -17Rまたはその相同体）を発現してもよいが、本発明のDNAをクローニングし、または増幅する目的で形質転換した宿主細胞は、該タンパク質を発現する必要はない。発現されたタンパク質は、選択されたDNA次第で、好ましくは培養上清中に分泌されるが、細胞膜中に置かれてもよい。ウイルスタンパク質の発現に適した宿主細胞には、適切なプロモーターの調節下にある原核生物、酵母またはより高次の真核細胞が含まれる。原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバシラスspp(Bacillus spp )が含まれる。より高次の真核細胞には、後述のような、哺乳動物起源の樹立細胞系が含まれる。また、無細胞翻訳系を使用し、本明細書に開示されるDNA構築物由来のRNAを用いてウイルスタンパク質を産生してもよい。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主に使用するのに適したクローニングおよび発現ベクターは、Pouwelら（Cloning Vectors:A Laboratory Manual,ニューヨーク州エルシーバー,1985）に記載され、その関連する開示は、参考文献として本明細書に援用される。原核発現宿主は、甚だしいタンパク質分解およびジスルフィドプロセシングを必要としない、IL-17Rまたは相同体発現に使用してもよい。原核発現ベクターは、一般的に１つまたはそれ以上の表現型選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性を与える、または独立栄養（autotrophic）必要条件を供給するタンパク質をコードする遺伝子、および宿主内での増幅を確実にするための、宿主により認識される複製起点を含む。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌、枯草菌(Bacillu s subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、およびシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびブドウ球菌属（Staphylococcus）のさまざまな種が含まれるが、他のものもまた、選択要素として使用してもよい。組換えIL-17Rはまた、酵母宿主、好ましくはS.セレビシエ（S.cerevisiae）のようなサッカロミセス（Saccharomyces）種において発現してもよい。ピキア属（Pichia）またはクロイベロミセス属（Kluyveromyces）のような、他の属の酵母もまた、使用してもよい。酵母ベクターは一般的に、2μ酵母プラスミドまたは自律複製配列（ARS）由来の複製起点、プロモーター、ウイルスタンパク質をコードするDNA、ポリアデニル化および転写終結のための配列、および選択遺伝子を含むであろう。好ましくは、酵母ベクターは、酵母および大腸菌両方での形質転換を許す複製起点および選択可能マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子および、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母突然変異株の選択マーカーを提供する、S．セレビシエのtrp1遺伝子、並びに、下流の構造配列の転写を誘導するための高発現酵母遺伝子由来のプロモーターを含むであろう。酵母宿主細胞ゲノムにおけるtrp1損傷の存在はその後、トリプトファンの非存在下における増殖により、形質転換を検出する効果的な環境を提供する。適切な酵母形質転換プロトコルは、当業者に知られており；典型的な技術はHi nnenら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:1929，1978に記載されるように、 0.67％酵母窒素基剤、0.5％カザミノ酸、2％グルコース、10μg/mlアデニン、および20μg/mlウラシルからなる選択培地において、Trp⁺形質転換体を選択する。 ADH2プロモーターを含むベクターにより形質転換された宿主株は、80μg/mlアデニンおよび80μg/mlウラシルを補った、1％酵母エキス、2％ペプトン、および1 ％グルコースからなるリッチ培地において発現のため増殖させてもよい。ADH2プロモーターの抑制解除（derepression）は、培地グルコースの枯渇に際して起こる。未精製酵母上清をろ過により回収し、そしてさらなる精製の前に4℃で維持する。さまざまな哺乳動物または昆虫細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現してもよい。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系がLuckowおよびSummers,Bio/Technology 6:47(1988)に論評されている。適切な哺乳動物宿主細胞株には、Gluzman（Cell 23:175,1981）に記載されるサル腎臓細胞のCOS-7株、および、例えば、CV-1/EBNA(ATCC CRL10478)、Ｌ細胞、C 127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、HeLaおよびBHK細胞株を含む、適切なベクターを発現することが可能な他の細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に連結した適切なプロモーターおよびエンハンサー、および他の5'または3'隣接非転写配列のような非転写要素、並びに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、および転写終結配列のような、5'または3'非翻訳配列を含んでもよい。IL-17R 受容体の精製精製IL-17R、相同体、または類似体は、適切な宿主／ベクター系を培養し、本発明のDNAの組換え翻訳産物を発現し、その後、培地または細胞抽出物から精製することにより、調製する。例えば培地中に組換えタンパク質を分泌する系の上清を、まず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過装置を用いて濃縮してもよい。濃縮段階に続き、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用してもよい。例えば、適切なアフィニティー・マトリックスは、適切な支持体に結合した対（counte r）構造タンパク質またはレクチンまたは抗体分子を含んでもよい。また別に、陰イオン交換レジン、例えばジエチルアミノエチル（DEAE）側鎖を有するマトリックスまたは支持体を使用してもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常使用される他のタイプのものであってもよい。あるいは、陽イオン交換段階を使用してもよい。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む、さまざまな不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲルろ過クロマトグラフィーもまた、本発明のタンパク質を精製する手段を提供する。アフィニティー・クロマトグラフィーは、IL-17Rおよびその相同体を精製するのに特に好ましい方法である。例えば免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質として発現されたIL-17Rは、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティー・クロマトグラフィーを用いて精製してもよい。さらに、オリゴマー化ジッパードメインを含むIL-17Rタンパク質は、オリゴマー化ジッパードメインに特異的な抗体を含むレジン上で精製してもよい。IL-17Rタンパク質に対するモノクローナル抗体もまた、当業によく知られる方法を利用することにより、アフィニティー・クロマトグラフィー精製に有用である可能性がある。リガンド（すなわち、IL -17またはHVS-13）もまた、IL-17Rのアフィニティー精製のためのアフィニティー・マトリックスを調製するのに用いてもよい。最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）媒体、例えばメチルまたは他の脂肪族基側鎖を有するシリカゲルを使用した、１つまたはそれ以上のRP-HPLC段階を行い、IL-17R組成物をさらに精製してもよい。また、前期精製段階のいくつかまたはすべてをさまざまな組み合わせにより用いて、均質の組換えタンパク質を提供してもよい。細菌培養において産生された組換えタンパク質は、通常、まず細胞沈澱から抽出し、続いて１つまたはそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー段階を行うことにより、単離される。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製段階として使用してもよい。組換えウイルスタンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、都合がよい方法のいずれにより破壊してもよい。本発明のタンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母発酵は、精製を非常に単純化する。大規模発酵により生じた分泌組換えタンパク質は、Urdalら（J.C hromatog.296:171,1984）に開示されたのと類似の方法により精製してもよい。本参考文献は、分離用HPLCカラム上での組換えヒトGM-CSF精製のための、２つの連続する、逆相HPLC段階を記載する。組換え体培養において合成されたタンパク質は、タンパク質を含む細胞成分が、培養からの本発明のタンパク質を回収するために取られた精製段階に依存した量および性質で存在することにより特徴付けられる。これらの成分は普通、酵母、原核または非ヒト高次真核生物起源であろうし、そして好ましくは重量にして約1％未満の桁である、無害な混入量で存在する。さらに組換え細胞培養により、元の種において天然に見出されるように、該タンパク質と通常結合する可能性がある他のタンパク質を含まない、本発明のタンパク質の産生が可能になる。IL-17R 組成物の投与本発明は、タンパク質の有効量および適切な希釈剤およびキャリアーを含む治療組成物を用いる方法を提供する。IL-17Rまたは相同体を可溶性サイトカイン受容体またはサイトカイン、または他の免疫制御分子と組み合わせた使用もまた企図される。こうした分子はIL-17R組成物と別々に、連続して、または同時に投与してもよい。特に好ましい免疫制御分子は、可溶性IL-1受容体、可溶性TNF受容体、およびそれらの融合タンパク質である。治療のための使用には、精製タンパク質が患者、好ましくはヒトに、徴候に適した方法で治療のために投与される。したがって、例えば、NOレベル制御のために投与されるIL-17Rタンパク質組成物は、大量（bolus）注射、連続注入、移入体（implant）からの維持放出、または他の適切な技術により、投与してもよい。典型的には、治療剤は、生理学的に許容されるキャリアー、賦形剤または希釈剤と組み合わせた精製IL-17Rを含む組成物の形で投与されるであろう。こうしたキャリアーは使用される投薬量および濃度で、受容者に無害であろう。通常、こうしたタンパク質組成物の調製は、本発明のタンパク質を緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（10残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、ショ糖またはデキストリンを含む炭水化物、EDTA のようなキレート剤、グルタチオンおよび他の安定化剤および賦形剤と組み合わせることを伴う。中性緩衝生理食塩水または、同種（conspecific）血清アルブミンと混合した生理食塩水は、典型的に適切な希釈剤である。好ましくは、産物は適切な賦形剤溶液（例えばショ糖）を希釈剤として用いた凍結乾燥品として処方される。適切な投薬量は試行により決定してもよい。投与量および頻度は、もちろん、治療される徴候の性質および重症度、望ましい反応、患者の状態などの要因に依存するであろう。 IL-17（CTLA-8）に対する受容体を、NOレベルを制御する目的で投与してもよい。可溶性IL-17Rはしたがって、変形性関節症の治療において有用である可能性がある。本発明の受容体タンパク質はまた、炎症の予防または治療に有用であるであろう。以下の例は、例示のために提供され、そして限定のためではない。当業者は、実施例に具体化された本発明の変型が作成されてもよいことを、特に本明細書に引用されるさまざまな参考文献の解説、本明細書に援用される開示に照らし、認識するであろう。実施例１本実施例は、IL-17RがＴ細胞の分裂促進剤（mitogen）に対する増殖反応を阻害する能力を例示する。リンパ系器官を無菌的に回収し、そして細胞懸濁物を生成した。脾臓およびリンパ節Ｔ細胞を細胞懸濁物から単離した。生じた脾臓Ｔ細胞調製の純度は常に>95％ CD3⁺および<1％ sIgM⁺であった。精製ネズミ脾臓Ｔ細胞（2x10⁵／ウェル）を、1％のPHAまたは1μg/mlのConＡのどちらかと共に培養し、そして可溶性IL-17R（ヒトIgG1のFc領域と融合したIL-17Rの細胞外領域を含むIL-17R可溶性型）を検定中で滴定（titer）した。増殖は３日後、１μCi[³H] チミジンを添加して測定した。ネズミＴ細胞に関し、サイトカイン（インターロイキン−2）の分泌を、10μg/mlのIL-17R.Fcの存在下または非存在下、またはコントロールFcタンパク質の存在下で、1μg/mlのConＡと共に培養し測定した。IL-2産生をELISAにより測定し、そして結果を産生されたIL-2のn g/mlで表した。可溶性IL-17R/Fcは、精製ネズミ脾臓Ｔ細胞の分裂促進剤誘導増殖を用量依存性に有意に阻害したが、コントロールFcはネズミＴ細胞増殖に何の影響も持たなかった。分裂促進剤誘導増殖の完全な阻害は、可溶性IL-17R.Fc濃度が10μg/ml であるとき見られた。ConＡで活性化された培養脾臓Ｔ細胞による、IL-17R.Fcの存在下または非存在下でのIL-2産生解析により、Ｔ細胞培養にIL-17.Fcを添加することにより、培地のみ、またはコントロールFcタンパク質を加えた培地を含む培養で観察されるより、IL-2産生が８から９倍低いレベルに阻害されることが明らかになった。精製ヒトＴ細胞が使用された際、同様の結果が観察された。実施例２本実施例は、IL-17Rが軟骨関連細胞からのNO産生を阻害する能力を例示する。 OA罹患患者または正常コントロールから、実質的にAminら、上記に記載されるように、関節軟骨を得る。軟骨を小さい（およそ３mm）の円盤に切り、IL-17R.Fc の存在下または非存在下、またはコントロールFcタンパク質の存在下で器官培養を行う。例えば、修飾Greiss反応（Anal.Biochem.12b:12299;1982）を用いることにより、異なる時間間隔で培地中の亜硝酸塩レベルを測定することにより、一酸化窒素産生を検定する。Dingら（J.Immunol.141:2407,1988）もまた、滑膜および軟骨関連細胞のex vivo器官培養におけるNO測定に有用な方法を記載している。IL-17R.Fcを滴定し、NO産生を阻害する効果的な濃度を決定する。他のIL-17 R可溶性型もまた、この方法でNOレベルを制御するのに用いてもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】 1．軟骨関連細胞により産生される一酸化窒素の量を減少させる方法であって、該細胞を可溶性インターロイキン−17受容体（IL-17R）と接触させることを含む、前記方法。 2．可溶性IL-17Rが：（a）配列番号２のアミノ酸１から322を含むタンパク質；（b）配列番号４のアミノ酸１から320を含むタンパク質；（c）（a）または（b）のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約70 ％同一なアミノ酸配列を有し、そしてIL-17に結合するタンパク質；および（d） IL-17と結合する(a)、（b）または（c）のタンパク質の断片からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 3．可溶性IL-17受容体および薬学的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含む、一酸化窒素レベルを制御するための組成物。 4．可溶性IL-17受容体が：（a）配列番号２のアミノ酸１から322を含むタンパク質；（b）配列番号４のアミノ酸１から320を含むタンパク質；（c）（a）または（b）のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約70 ％同一なアミノ酸配列を有し、そしてIL-17に結合するタンパク質；および（d） IL-17と結合する(a)、（b）または（c）のタンパク質の断片からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。 5．さらに、可溶性Ｉ型IL-1受容体、可溶性II型IL-1受容体、IL-1受容体アンタゴニスト、可溶性TNF受容体、IL-1受容体およびTNF受容体を含む融合タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫制御分子を含む、請求項３に記載の組成物。 6．さらに、可溶性Ｉ型IL-1受容体、可溶性II型IL-1受容体、IL-1受容体アンタゴニスト、可溶性TNF受容体、IL-1受容体およびTNF受容体を含む融合タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫制御分子を含む、請求項４に記載の組成物。 7．該細胞を、可溶性Ｉ型IL-1受容体、可溶性II型IL-1受容体、IL-1受容体アンタゴニスト、可溶性TNF受容体、IL-1受容体およびTNF受容体を含む融合タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫制御分子と、同時に、連続してまたは別々に接触させる、請求項１に記載の方法。 8．該細胞を、可溶性Ｉ型IL-1受容体、可溶性11型IL-1受容体、IL-1受容体アンタゴニスト、可溶性TNF受容体、IL-1受容体およびTNF受容体を含む融合タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫制御分子と、同時に、連続してまたは別々に接触させる、請求項２に記載の方法。 9．個体において変形性関節症を治療する方法であって、該個体に、薬学的に許容されるキャリアーまたは希釈剤中の、軟骨関連細胞により産生される一酸化窒素レベルを減少させるのに十分な量の可溶性IL-17受容体を投与することを含む、前記方法。 10．可溶性IL-17受容体が、可溶性Ｉ型IL-1受容体、可溶性II型IL-1受容体、IL-1受容体アンタゴニスト、可溶性TNF受容体、IL-1受容体およびTNF受容体を含む融合タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫制御分子と、同時に、連続してまたは別々に投与される、請求項９に記載の方法。 11．可溶性IL-17受容体が：（a）配列番号２のアミノ酸１から322を含むタンパク質；（b）配列番号４のアミノ酸１から320を含むタンパク質；（c） (a）または（b）のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を有し、そしてIL-17に結合するタンパク質；および（d） IL-17に結合する(a)、（b）または（c）のタンパク質の断片からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。 12．可溶性IL-17受容体が、可溶性Ｉ型IL-1受容体、可溶性II型IL-1受容体、IL-1受容体アンタゴニスト、可溶性TNF受容体、IL-1受容体およびTNF受容体を含む融合タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫制御分子と、同時に、連続してまたは別々に投与される、請求項11 に記載の方法。 13．変形性関節症に罹患した哺乳動物に投与するための医薬品を調製する方法であって、可溶性IL-17受容体を適切な賦形剤またはキャリアー中に処方することを含む、前記方法。 14．可溶性IL-17受容体が：（a）配列番号２のアミノ酸１から322を含むタンパク質；（b）配列番号４のアミノ酸１から320を含むタンパク質；（c） (a）または（b）のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を有し、そしてIL-17と結合するタンパク質；および（d） IL-17に結合する(a)、（b）または（c）のタンパク質の断片からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。 15．該医薬品がさらに、可溶性Ｉ型IL-1受容体、可溶性II型IL-1受容体、IL -1受容体アンタゴニスト、可溶性TNF受容体、IL-1受容体およびTNF受容体を含む融合タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫制御分子を含む、請求項13または14に記載の方法。