ES2368101T3 - Procedimiento para inhibición de la actividad de los osteoclastos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une a un polipéptido RANKL y antagoniza la interacción de RANK y RANKL para uso en la mejora de los efectos de la osteoclastogénesis y la actividad osteoclástica en un paciente con mieloma múltiple.

Description

Procedimiento para inhibición de la actividad de los osteoclastos

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere general al campo de los receptores de las citocinas, y de manera más específica, a las parejas receptor/ligando de citocinas que tienen actividad reguladora de los osteoclastos. La invención pertenece a la actividad de un anticuerpo que se une a un polipéptido rankl y antagoniza la reacción de rank y rankl.

Antecedentes de la invención

RANK (Activador del receptor de NF-κB) y su ligando (RANKL) son una pareja receptor/ligando recientemente descrita que juega un importante papel en una respuesta inmune. En los documentos US 6017729 y US 6242213 se describe la clonación de RANK y RANKL respectivamente. Se ha encontrado recientemente que RNAKL contiene una proteína denominada como osteoprotegerina (OPG), un miembro de la familia del Receptor del Factor de Necrosis Tumoral (TNFR). Yasuda y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. 95:3597; 1998) por ejemplo clonaron la expresión de un ligando de OPG, que se denominó como factor inhibidor de la osteoclastogénesis. Lacey y col. (Cell 93:165; 1998) repitieron su trabajo. En ambos casos, el ligando que clonaron resultó ser idéntico a RANKL.

El documento de Simonet y col., Cell, vol.89, pp.309-319 describe la clonación y la caracterización de la osteoprotegerina (OPG).

El documento de Anderson y col., Nature, vol.390, pp.175-179 describe el uso de una fusión entre una IgFc y el dominio extracelular de RANK para identificar el Ligando de RANK (RANKL).

El documento de Read R, J. Antimicrob. Chemother., vol. 41, Suppl. A, pp.65-69 descubre TNFR y anticuerpos contra TNF solubles como antagonistas de TNF.

En la osteoclastogénesis, la interacción de un osteoblasto o célula estromal con un precursor osteoclástico conduce a la diferenciación del precursor en un osteoclasto. Se sabe que la OPG inhibe esta diferenciación. Se ha propuesto un modelo en el que RANKL en el osteoblasto o en la superficie de la célula estromal interactúa con un receptor específico sobre una superficie del osteoclasto progenitor, señalizando un episodio de diferenciación. OPG bloquea eficazmente la interacción de RANKL con un receptor sobre los osteoclastos progenitores in vitro, y se ha demostrado que mejora los efectos de la ovariectomía sobre la pérdida ósea en ratones. Sin embargo. Se sabe también que la OPG se une a otros ligandos de la familia TNF, lo que puede tener un efecto perjudicial sobre las actividades de dichos ligandos in vivo. Además, la presencia de otros ligandos que se unen a la OPG in vivo puede requerir elevadas dosificaciones de la OPG que se va a administrar con el fin de tener suficiente OPG soluble disponible para inhibir la osteoclastogénesis.

De acuerdo con esto, existe una necesidad en la técnica de identificar factores solubles que se unan específicamente a RANKL e inhiban la capacidad de RANKL para inducir la osteoclastogénesis sin reaccionar con otros ligandos.

Resumen de la invención

La invención en su sentido más amplio es tal como se define en las reivindicaciones independientes.

Las formas de realización preferidas son como se enumeran en las reivindicaciones dependientes.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación proporciona procedimientos asociados con el uso de un receptor novedoso, denominado como RANK (por activador del receptor de NF-κB), que es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF. RANK es una proteína transmembrana de Tipo I que tiene 616 restos de aminoácidos, que comprende un dominio extracelular, una región transmembrana y un dominio citoplásmico. RANKS interactúa con diversos Factores Asociados al Receptor de TNF (TRAF); que estimulan los resultados de RANK en la regulación en exceso del factor de transcripción NF-κB, un factor de transcripción ubicuo que se utiliza lo más extensamente en células del sistema inmune.

Se pueden preparar formas solubles del receptor y usarse para interferir con la transducción de la señal a través de RANK unido a membrana. La inhibición de la transducción de la señal medida por RANKL será útil para mejorar los efectos de la osteoclastogénesis y la actividad osteoclástica en estados de enfermedad en los que existen demasiadas roturas de huesos. Entre los ejemplos de dichas dolencias se incluyen osteoporosis, enfermedad de Paget, cánceres que pueden metastatizar el hueso e inducir roturas de huesos (es decir, mieloma múltiple, cáncer de mama, algunos melanomas, véase también Mundy, C. Cancer Suppl. 80: 1546; 1997), y cánceres que no metastatizan necesariamente el hueso, pero dan como resultado una hipercalcemia y la pérdida de hueso (por ejemplo, carcinoma de células escamosas).

Las formas solubles de RANK comprenden el dominio extracelular de RANK o uno de sus fragmentos que se une a RANKL. Se pueden preparar proteínas de fusión de RANK para facilitar la preparación de RANK soluble. Entre los ejemplos de dichas proteínas de fusión se incluyen una proteína de fusión RANK/Fc, una proteína de fusión de un resto en cremallera (es decir, una cremallera de leucina), y diversas etiquetas que son conocidas en la materia. Se dan a conocer también en la invención otros antagonistas de la interacción de RANK y RANKL (es decir, anticuerpos dirigidos contra RANKL, moléculas pequeñas), tal como se define en las reivindicaciones. Estos y otros aspectos de la presente invención llegarán a ser evidentes tras referencia a la siguiente descripción detallada de la invención.

Se identificó una inserción de ADNc parcial novedosa con un marco de lectura abierto previsto que tiene alguna similitud con CD40 y se usó para hibridar las manchas de colonias generadas a partir de una biblioteca de ADNc de una célula dendrítica (CD) que contenía los ADNc de longitud completa. La SEQ ID NO: 1 muestra los nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de una proteína de longitud completa prevista.

RANK es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF; se asemeja mucho a CD40 en la región extracelular. RANK se expresa en las células epiteliales, algunas líneas de linfocitos B, y en linfocitos T activados. Sin embargo, su expresión en linfocitos T activados es tardía, aproximadamente cuatro días después de la activación Este curso temporal de la expresión coincide con la expresión de Fas, un conocido agente de la apoptosis. RANK puede actuar como una señal antiapoptótica, rescatando células que expresan RANK de la apoptosis tal como se sabe que hace CD40. Alternativamente, RANK puede confirmar una señal apoptótica en las circunstancias apropiadas, de nuevo, de manera similar a CD40. Es probable que RANK y su ligando jueguen un papel integral en la regulación de la respuesta inmune e inflamatoria. Se describe el aislamiento de un ADN que codifica RANK en el documento US 6017729. El documento US 6017729 describe algunas formas de RANK.

RANK soluble comprende el péptido señal y el dominio extracelular (restos 1 a 213 de la SEQ ID NO: 2) o uno de sus fragmentos Alternativamente se puede sustituir un péptido señal diferente por el líder nativo, comenzando con el resto 1 y continuando a través de un resto seleccionado entre el grupo constituido por los aminoácidos 24 a 33 (inclusive) de la SEQ ID NO: 2. Además, los fragmentos del dominio extracelular proporcionarán también formas solubles de RANK.

Se pueden preparar los fragmentos usando técnicas conocidas para aislar una porción deseada de la región extracelular, y se pueden preparar, por ejemplo, comparando la región extracelular con las de otros miembros de la familia de TNFR (de la cual RANK es un miembro) y seleccionando las formas similares a las preparadas para otros miembros de la familia. Alternativamente, se pueden usar sitios de restricción únicos o técnicas de la PCR que se conocen en la materia para preparar numerosas formas truncadas que se pueden expresar y analizar para la actividad.

Otros derivados de las proteínas RANK incluyen conjugados covalentes o agregativos de las proteínas o de sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante síntesis en cultivo recombinante como fusiones N terminales o C terminales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser una secuencia polipeptídica señal (o líder) en la región N terminal de la proteína que dirige de manera traduccionalmente simultánea o después de la traducción la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a su sitio de función en el interior o en el exterior de la membrana o de la pared celular (por ejemplo, el factor α líder de levadura).

La proteínas de fusión pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o la identificación de las proteínas RANK y los homólogos (por ejemplo, poli-His). Se puede unir también la secuencia de aminoácidos de la proteína a un péptido de identificación tal como el descrito por Hopp y col., BiolTechnology 6: 1204 (1988; FLAG™). Dicho péptido muy antigénico proporciona un epítopo unido de manera reversible mediante un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo una rápida prueba y una fácil purificación de la proteína recombinante expresada. La secuencia de Hopp y col. se escinde también específicamente mediante la enterocinasa mucosal bovina, facilitando la eliminación del péptido procedente de la proteína purificada.

Las proteínas de fusión comprenden además la secuencia de aminoácidos de RANK unida a una región Fc de la inmunoglobulina. Una región Fc a modo de ejemplo es una IgG humana, que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3. Se pueden usar también fragmentos de una región Fc, como pueden ser las muteínas de Fc. Por ejemplo, algunos restos en el interior de la región bisagra de una región Fc son críticos para disponer de una elevada afinidad de unión con FcγRI. Canfield y Morrison (J. Exp. Med. 173: 1483; 1991) informaron que Leu(234) y Leu(235) fueron críticos para la elevada afinidad de unión de IgG3 con FcyRI presente en células U937. Lund y col. (J. Immunol.

147: 2657, 1991; Molecular Immunol. 29: 53, 1991).obtuvieron similares resultados. Se pueden realizar dichas mutaciones, solas o en combinación en una región Fc de IgG, para disminuir la afinidad de IgG1 por FcR. Dependiendo de la porción de la región Fc usada, se puede expresar una proteína de fusión como un dímero, mediante la formación de enlaces disulfuro intercadena. Si se preparar las proteínas de fusión con las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de proteína con como mucho cuatro regiones RANK.

En otro aspecto, las proteínas RANK comprenden además un péptido de oligomerización tal como un dominio en cremallera. Se identificaron originalmente cremalleras de leucina en algunas proteínas de unión al ADN (Landschulz y col., Science 240: 1759, 1988). El dominio en cremallera es un término usado para referirse a un dominio peptídico conservado presente en estas proteínas (y en otras), que es responsable de la multimerización de las proteínas. El dominio en cremallera comprende una repetición en héptada repetitiva, con cuatro o cinco restos de leucina, isoleucina o valina intercalados con otros aminoácidos. Los ejemplos de dominios en cremallera son los que se encuentran en el factor GCN4 de transcripción de levadura y en una proteína de unión al ADN térmicamente estable que se encuentra en el hígado de rata (C/EBP; Landschulz y col., Science 243: 1681, 1989). Dos proteínas transformantes nucleares fos y jun, presentan también dominios en cremallera, como lo hace el producto génico del protooncogen de murino, c-myc (Landschulz y col., Science 240: 1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden dominios en cremallera que forman preferentemente un heterodímero (O’Shea y col., Science 245: 646, 1989; Turner y Tjian, Science 243: 1689, 1989). Un resto en cremallera preferido es el de SEQ ID NO: 6 o uno de sus fragmentos. Se dan a conocer este y otros restos en cremallera en la Patente de los Estados Unidos 5.716.805.

Otras proteínas útiles incluyen los polipéptidos RANK codificados por ADN capaces de hibridarse con el ADN de SEQ ID NO: 1 en condiciones moderadamente rigurosas (disolución de prelavado de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) y en condiciones de hibridación de 50ºC, 5 X SSC, durante la noche) con las secuencias de ADN que codifican RANK, o más preferiblemente en condiciones rigurosas (por ejemplo, hibridación en 6 X SSC a 63ºC durante la noche; lavado en 3 X SSC a 55ºC) y otras secuencias que están degeneradas con las que codifican RANK. En un aspecto los polipéptidos RANK son al menos aproximadamente un 70% idénticos en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos de la proteína RANK natural tal como se muestra en la SEQ ID NO: 2 para RANK humano y en la NO: 6 para RANK de murino. En otro aspecto, los polipéptidos RANK son al menos aproximadamente un 80% idénticos en la secuencia de aminoácidos a la forma natural de RANK; los polipéptidos más preferidos son los que son al menos aproximadamente un 90% idénticos a RANK natural.

Se puede determinar el porcentaje de identidad usando un programa informático, por ejemplo, el programa informático GAP descrito por Devereux y col. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) y disponible del University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Para los fragmentos derivados de la proteína RANK, se calculó la identidad basándose en la porción de la proteína RANK que está presente en el fragmento.

Se puede determinar la actividad biológica de los análogos o de las muteínas de RANK probando la capacidad de los análogos o de las muteínas de unirse a RANKL, por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos en el presente documento. Las pruebas adecuadas incluyen por ejemplo, una inmunoprueba enzimática o una inmunotransferencia, y pruebas que emplean células que expresan RANKL. Las pruebas adecuadas incluyen también, por ejemplo, pruebas de inhibición, en las que se usa RANK soluble para inhibir la interacción de RANKL con RANK asociado a fase sólida o unido a membrana (es decir, pruebas de transducción de la señal). Dichos procedimientos son bien conocidos en la materia.

RANKL y RANK son importantes factores en la osteoclastogénesis. RANK se expresa en osteoclastos e interactúa con el ligando de RANK (RANKL) para mediar en la formación de células multinucleadas de tipo osteoclasto (OCL). Se demostró esto tratando preparaciones de médula ósea de ratón con M-CSF (CSF-1) y RANKL soluble durante 7 días en cultivo. No fueron necesarias hormonas o factores osteoclastogénicos para la generación de células multinucleadas. Ni M-CSF ni RANK solos condujeron a la formación de OCL. Las células multinucleadas expresaron fosfatasa ácida resistente a tartrato y fueron positivas a la unión de la [125]-calcitonina. La tirosina cinasa c-src se expresó mucho en OCL multinucleadas y un subconjunto de células mononucleares tal como se demostró mediante microscopio de inmunofluorescencia (Véase el Ejemplo 2).

Purificación de RANK recombinante

Se prepararon RANK purificado, y sus homólogos o análogos cultivando sistemas hospedador/vector adecuados para expresar los productos de traducción recombinantes de los ADN, que se purificaron a continuación de los medios de cultivo o de los extractos celulares. Por ejemplo, se pueden concentrar en primer lugar los sobrenadantes de sistemas que segregan proteínas recombinantes en los medios de cultivo usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon.

Tras la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una proteína de contraestructura o lectina o molécula de anticuerpo unida a un soporte adecuado. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetil (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. La cromatografía de filtración en gel proporciona también un medio de purificación de las proteínas.

La cromatografía de afinidad es un procedimiento particularmente preferido para purificar RANK y sus homólogos. Por ejemplo, se puede purificar RANK expresada como una proteína de fusión que comprende una región Fc de inmunoglobulina usando la cromatografía de afinidad de la Proteína A o de la Proteína G. Además, se puede purificar una proteína RANK que comprende un dominio en cremallera oligomerizante sobre una resina que comprende un anticuerpo específico del dominio en cremallera oligomerizante. Pueden ser útiles también anticuerpos monoclonales contra la proteína RANK en la purificación mediante cromatografía de afinidad, utilizando procedimientos que son bien conocidos en la técnica. Se puede usar también un ligando para preparar una matriz de afinidad para la purificación por afinidad de RANK.

Finalmente, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) empleando medios RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene metilos colgantes u otros grupos alifáticos, para purificar adicionalmente una composición d RANK. Los procedimientos adecuados incluyen los análogos al procedimiento dado a conocer por Urdal y col. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Se pueden emplear alguna o todas las anteriores etapas de purificación, en diferentes combinaciones, para proporcionar una proteína recombinante homogénea.

La proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano se aísla normalmente mediante la extracción inicial de los aglomerados celulares, seguida de una o varias etapas de concentración y desalinización mediante cromatografía de intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión molecular. Finalmente se puede emplear la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas finales de la purificación. Se pueden perturbar las células microbianas empleadas en la expresión de la proteína recombinante mediante cualquier procedimiento conveniente, incluyendo un ciclo de congelación descongelación, sonicación, perturbación mecánica, o uso de agentes de lisado celular. La fermentación de levaduras que expresa n la proteína como una proteína secretada simplifica mucho la purificación.

La proteína sintetizada en el cultivo recombinante se caracteriza por la presencia de componentes celulares, que incluyen proteínas, en cantidades y de un carácter que depende de las etapas de purificación adoptadas para recuperar la proteína del cultivo. Estos componentes serán ordinariamente de levaduras, de origen procariota o eucariota superior no humano, y están presentes preferiblemente en cantidades contaminantes inocuas, del orden de menos de aproximadamente 1 por ciento en peso Además, el cultivo celular recombinantes permite la producción de las proteínas exentas de otras proteínas que se pueden asociar normalmente con las proteínas ya que se encuentran en la naturaleza en las especies de origen.

Usos y administración de composiciones de RANK o de una composición que comprende un anticuerpo que se une a un polipéptido rankl y antagoniza la interacción de rank y rankl.

[0031] La presente invención es tal como se detalla en las reivindicaciones. Las composiciones terapéuticas comprenden una proteína y un diluyente y vehículo adecuados.

Normalmente, el individuo está afectado de un exceso de resorción ósea y padece de los efectos de hipercalcemia, tiene los síntomas de la hipercalcemia, o está padeciendo una enfermedad que implica una excesiva resorción ósea. Además, para regular la actividad osteoclástica, el uso o el anticuerpo para el uso tal como se enumera en las reivindicaciones aplicables para inhibir la actividad osteoclástica, que regula la generación de osteoclastos e inhibe la generación de osteoclastos en individuos afligidos con exceso de resorción ósea, tal como se enumera en las reivindicaciones. Se describe el uso de RANK junto con receptores de citocinas o citocinas solubles u otras moléculas reguladoras de osteoclastos/osteoblastos.

Se sabe que el ligando de RANK (RANKL) en osteoblastos o células estromales interactúa con RANK en las superficies de los osteoclastos progenitores señalizando un episodio que conduce a la diferenciación de osteoclastos precursores en osteoclastos. (Véase el Ejemplo 2 a continuación) De esta manera, RANK, y en particular las formas solubles de RANK, es útil para la inhibición de la transducción de la señal medida por RANKL, que conduce a la diferenciación de los osteoclastos precursores en osteoclastos. Las formas solubles de RANK son también útiles para la regulación e inhibición de la actividad osteoclástica, por ejemplo, de la resorción ósea Interfiriendo con la diferenciación osteoclástica, las formas solubles de RANK son útiles en la mejora de los efectos de la osteoclastogénesis en los estados de enfermedad en los que existe un exceso de rotura del hueso. Dichos estados de enfermedad incluyen la enfermedad de Paget, osteoporosis y cáncer. Muchos cánceres metastatizan el hueso e induce la rotura del mismo perturbando localmente la remodelación normal del hueso Dichos cánceres pueden estar asociados con el aumento en el número de osteoclastos y con el aumento en la cantidad de resorción del hueso osteoclástico que da como resultado hipercalcemia. Estos cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, mieloma múltiple, melanomas cáncer de pulmón, de próstata, hematológico, de cabeza y de cuello, y renal (véase Guise y col. Endocrine Reviews, 19(1): 18-54, 1998.) Se pueden administrar formas solubles de RANK a dichos pacientes con cáncer para interrumpir la ruta de la diferenciación osteoclástica y dar como resultado un número pequeño de osteoclastos, menor resorción ósea, y el alivio de los efectos negativos de la hipercalcemia.

Otros cánceres no metastatizan el hueso, pero se sabe que actúan sistemáticamente en el hueso para interrumpir la remodelación ósea y dar como resultado hipercalcemia (Véase Guise y col. Endocrine Reviews, 19(1): 18-54, 1998.). Se ha encontrado que RANKL, en la superficie de algunas células escamosas, no metastatiza al hueso, pero está asociado con hipercalcemia. (Véase el Ejemplo 3 a continuación). Las células escamosas que se asocian con hipercalcemia expresan también M-CSF (CSF-1), una citocina que, junto con RANKL, estimula la proliferación y la diferenciación de osteoclastos precursores en osteoclastos. Se ha descubierto que M-CSF regula en exceso directamente RANK en las superficies de los osteoclastos precursores. Cuando las células escamosas liberan cantidades excesivas de CSF-1, se produce una creciente expresión de RANK en las superficies de los osteoclastos precursores. De esta manera, existe una probabilidad muy elevada de que RANK interactúe con RANKL en los osteoblastos o en las células estromales para producir un creciente número de osteoclastos, dando como resultado un aumento en la cantidad de roturas del hueso e hipercalcemia.

Además de mejorar los efectos de los cánceres que metastatizan el hueso, la presente divulgación describe procedimientos para mejorar los efectos sistémicos, por ejemplo, la hipercalcemia, de los cánceres que están asociados con un exceso en la actividad osteoclástica (por ejemplo, carcinomas de células escamosas). Dichos procedimientos incluyen administrar formas solubles de RANK en cantidades suficientes para interferir con la transducción de la señal RANK/RANKL que conduce a la diferenciación de los osteoclastos precursores en osteoclastos. Muy pocos osteoclastos conduces a reducir la resorción ósea y al alivio de los efectos negativos de la hipercalcemia.

Para uso terapéutico, se formula la proteína purificada para la administración a un individuo, preferiblemente a un ser humano, para el tratamiento de una manera apropiada a la indicación de esta manera, por ejemplo, se pueden formular composiciones de proteína RANK formuladas para la administración para regular la función de los osteoclastos para administración mediante inyección de bolo, infusión continua, liberación continua a partir de implantes, u otra técnica adecuada normalmente, se puede formular un agente terapéutico para la administración en la forma de una composición que comprende RANK purificada, junto con vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Dichos vehículos no serán tóxicos a los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas.

De manera ordinaria, la preparación de dichas composiciones de proteínas implica combinar la proteína con tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos) proteínas, aminoácidos, carbohidratos, incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero de la misma especie son diluyentes apropiados a modo de ejemplo. Preferiblemente el producto se formula como un liofilizado usando disoluciones de excipientes apropiados (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Se pueden determinar las dosificaciones apropiadas en los ensayos La cantidad y frecuencia de administración dependerán, por supuesto, de dichos factores como la naturaleza y la gravedad de la indicación que se está tratando, la respuesta deseada, la dolencia del paciente, y así sucesivamente.

Se pueden formular formas solubles de RANK y otros antagonistas de RANK tales como anticuerpos monoclonales antagonistas para la administración con el objetivo de inhibir la osteoclastogénesis inducida por RANK. Es deseable inhibir la osteoclastogénesis en diversos estados de enfermedad en los que se produce una pérdida ósea en exceso. Los ejemplos incluyen osteoporosis, enfermedad de Paget, y diversos cánceres. Se conocen en la técnica algunos modelos animales de estas enfermedades; de acuerdo con esto, es una materia de experimentación rutinaria determinar las dosificaciones y rutas de administración óptimas de RANK soluble, primero en un modelo animal y a continuación en ensayos clínicos en seres humanos.

Se ofrecen los siguientes ejemplos como medio de ilustración, y no como medio de limitación. Los expertos en la materia reconocerán que se pueden realizar variaciones de la invención incorporadas en los ejemplos, especialmente a la luz de las diversas referencias citadas en el presente documentos.

Ejemplo 1

Este ensayo describe un ensayo de unión a placa útil para comparar la capacidad de algunos ligandos de unirse a receptores. Se llevó a cabo este ensayo esencialmente tal como se describe en Smith y col., Virology 236: 316 (1997). De manera breve, se revistieron placas de microvaloración de 96 pocillos con un anticuerpo de una Fc humana (es decir, un anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra Fc humana). Se añadieron a continuación proteínas de fusión receptor/Fc, y tras incubación, se lavaron las placas. A continuación se añadieron diluciones en serie. Los ligandos se pueden marcar directamente (es decir, con 125I), o se puede usar un reactivo de detección que está marcado radioactivamente. Tras la incubación, se lavaron las placas, se liberaron específicamente los ligandos unidos, y se cuantificó la cantidad de ligando unido.

Usando este procedimiento, RANK/Fc y OPG/Fc se unieron a placas de 96 pocillos En un procedimiento indirecto, se detecto una fusión RANKL/resto en cremallera usando un anticuerpo marcado con el resto en cremallera. Se encontró que OPG/Fc se unía a mRANKL a 0,05 nM, y que RANK/Fc se unía a mRANKL a 0,1 nm. Estos valores indican similares afinidades de unión de OPG y RANK para RANKL, confirmando la utilidad de RANK como un inhibidor de la actividad osteoclástica de una manera similar a OPG

Ejemplo 2 (Ejemplo comparativo)

Lo siguiente describe la formación de células similares a osteoclastos procedentes de médula ósea (MO) de murino en presencia de CSF-1. Estos osteoclastos se formaron mediante la fusión de células de tipo macrófagos y se caracterizaron por su positividad a TRAP (fosfatasa ácida resistente a tartrato). No se observaron células TRAP+ en cultivos que contenían CSF-1 solo o en cultivos que contenían CSF-1 y TRAIL LZ (un control para el RANKL LZ soluble).

Incluso aunque la médula ósea de seres humanos y monos contiene más fibroblastos contaminantes que la médula ósea de murino, se generaron osteoclastos a partir de la médula ósea de murino y de mono con la combinación de CSF-1 y RANKL LZ soluble. En un estudio de respuesta a la dosis usando médula ósea de murino y cantidades subóptimas de CSF-1 (40 ng/ml), los efectos de RANKL LZ soluble se interrumpieron a aproximadamente 100 ng/ml.

Se estudió el efecto de RANKL LZ soluble sobre la proliferación de las células en los mismos cultivos usando Azul Alamar. Después de 5 días, la respuesta proliferativa fue inferior en los cultivos que contenían CSF-1 y RANKL LZ que en los que contenían solo CSF-1. Esto apoya la observación de RANKL LZ soluble está induciendo la diferenciación de los osteoclastos. Cuando CSF-1 y RANKL LZ se eliminaron mediante lavado de los cultivos de MO de murino en los días 7 u 8, las células no sobreviven si se vuelven a cultivar n medio o solo en RANKL LZ. E contraste, las células sobreviven si se vuelven a cultivar en CSF-1. Cuando se añadió RANKL LZ a estos cultivos, no se añadieron beneficios. De esta manera, se requiere la combinación de CSF-1 y RANKL para la generación de osteoclastos. Adicionalmente, una vez formado, CSF-1 es suficiente para mantener su supervivencia en el cultivo.

Finalmente, usando médula ósea humana, se compararon mAb soluble dirigido contra RANK humano y mAb inmovilizado dirigido contra RANK humano con RANKL LZ, para la generación de osteoclastos en presencia de CSF-1. Se encontró que M331 inmovilizado y RANKL LZ eran igualmente eficaces para la generación de osteoclastos mientras que M331 soluble fue superior al anticuerpo inmovilizado y a RANKL LZ, esto confirma que la actividad en la diferenciación de los osteoclastos de RANKL está medida a través de RANK más bien que mediante un receptor alternativo.

Debido a que no se pueden cosechar fácilmente los osteoclastos y analizarse mediante citometría de flujo, se utilizaron ensayos de unión a calcitonina marcada con 125I para identificar los osteoclastos (se considero que el receptor de la calcitonina era un marcador específico de osteoclastos). Los osteoclastos generados de la MO de murino cultivada con CSF-1 y RANKL LZ durante 9 días mostraron la unión de la calcitonina radiomarcada confirmando su identidad osteoclástica

Ejemplo 3 (Ejemplo comparativo)

Con el fin de determinar la expresión de RANKL en dos carcinomas de células escamosas diferentes, se llevaron a cabo la transferencia Western y los estudios de RT-PCR en células MH-85 y OKK. Unas de estas células de carcinoma, las células MH-85 se asocian con hipercalcemia.

Los resultados confirmaron que las células escamosas MH-85 y OKK expresan RANKL. Las células MH-85, además de estar relacionadas con la hipercalcemia en pacientes que padecen este carcinoma, también expresan M-CSF (CSF-1). Se determinó también que CSF-1 regula en exceso la expresión de RANK en osteoclastos precursores. El aumento en la cantidad de CSF-1 en pacientes con cáncer de células escamosas de tipo MH-85 puede conducir a la regulación en exceso de RANK y a un aumento en la interacción de RANK con RANKL. Las señales transducidas por la interacción de RANK y RANKL dan como resultado números crecientes de osteoclastos maduros y rotura de huesos. Debido a que las formas solubles de RANK pueden inhibir la interacción RANK/RANKL, la administración de una forma soluble de RANK (por ejemplo, la región extracelular de RANK fusionada a una FC) a un paciente con cáncer de células escamosas proporciona el alivio de los efectos adversos de este cáncer, incluyendo la hipercalcemia.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Immunex Corporation

Anderson, Dirk M.

Galibert, Laurent

<120> TÍTULO DE LA INVENCION: PROCEDIMIENTO PARA INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LOS OSTEOCLASTOS

<130> 2874-WO

<140> PCT/US99/10588 <141> 13-05-1999

<160> 6

<170> PatentIn Ver.2.0

<210> 1

<211> 3136

<212> ADN

<213> Ser humano

<220>

<221> CDS

<222> 39..1886

<400> 1

<210> 2

<211> 616

<212> PRT

<213> Ser humano

<400> 2:

<210> 3

<211> 232

<212> PRT

<213> Ser humano

<400> 3 <210> 4

<211> 1878

<212> ADN

<213> Murino

<220>

<221> CDS

<222> 1.1875

<400> 4

<210> 5

<211> 625

<212> PRT

<213> Murino

<400> 5

<210> 6

<211> 33

<212> PRT

<213> Murino

<400> 6

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo que se une a un polipéptido RANKL y antagoniza la interacción de RANK y RANKL para uso en la mejora de los efectos de la osteoclastogénesis y la actividad osteoclástica en un paciente con mieloma múltiple.

2. 2.

   El anticuerpo para el uso tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

   5 3. El anticuerpo para el uso tal como se reivindica en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en el que la mejora en los efectos de la osteoclastogénesis y la actividad osteoclástica disminuye la resorción ósea en exceso.

3. 4. Uso de un anticuerpo que se une a un polipéptido RANKL y antagoniza la interacción de RANK y RANKL en la fabricación de un medicamente para mejorar los efectos de la osteoclastogénesis y la actividad osteoclástica en un paciente con mieloma múltiple.

   10 5. Uso, tal como se reivindica en la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. 6. Uso, tal como se reivindica en la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que la mejora en los efectos de la osteoclastogénesis y la actividad osteoclástica disminuye la resorción ósea en exceso.