ES2281896T3 - Ligando de cd27. - Google Patents
Ligando de cd27. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2281896T3 ES2281896T3 ES93920446T ES93920446T ES2281896T3 ES 2281896 T3 ES2281896 T3 ES 2281896T3 ES 93920446 T ES93920446 T ES 93920446T ES 93920446 T ES93920446 T ES 93920446T ES 2281896 T3 ES2281896 T3 ES 2281896T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cd27l
- cells
- polypeptide
- sequence
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Registering, Tensioning, Guiding Webs, And Rollers Therefor (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
SE PRESENTAN UN POLIPEPTIDO LIGADOR CD27 (CD27L) Y SECUENCIAS DNA, VECTORES Y CELULAS ANFITRIONAS TRANSFORMADAS UTILES PARA PREPARAR POLIPEPTIDOS CD27L. EL POLIPEPTIDO CD27L LIGA AL RECEPTOR CD27.
Description
Ligando de CD27.
El antígeno de lifoncitos CD27 es un receptor de
citoquina encontrado en la superficie de la mayoría de los
linfocitos T y algunos linfocitos B humanos. Se ha aislado un cDNA
que codifica el receptor CD27 (Camerini y otros, J. Immunol.
147:3165, (1991). Basándose en la secuencia polipeptídica
predicha, CD27 pertenece a una familia de receptores ricos en
cisteína cuyos ligandos conocidos incluyen factor de crecimiento
nervioso y TNF-\alpha y -\beta. Las similitudes
estructurales sugieren que CD27 pertenece a un subgrupo específico
de linfocitos de la familia comprendida por el Ag CD40 de células B,
el subgrupo Ag OX40 de células T de rata y el Ag
4-1BB de activación de células T de ratón. Se cree
que el receptor CD27 media en las funciones que permiten la
supervivencia de células activadas.
El factor de crecimiento responsable de la unión
a y la iniciación de actividades de CD27 todavía no se ha
identificado. La existencia y la naturaleza de tales factores de
crecimiento serán importantes para elucidar los mecanismos para la
supervivencia de células activadas. Ha existido así una necesidad de
identificar y caracterizar un ligando que se una a CD27. Camerini y
otros (J. Immunology, 147, 3165-3169 (1991))
describen una caracterización de CD27. Armitage y otros (Nature
1992, 357, 80-82) describen la clonación y la
caracterización del ligando para el receptor CD40 en ratones. WO
94/10308 trata de una proteína de fusión que comprende una
cremallera de leucina y un dominio extracelular de una proteína de
transmembrana de mamífero tal como CD40L, CD27L, OX40L o TNF. Val
Lier y otros (European Journal of Immunology, 1988, 18,
811-816) describen anticuerpos que se unen a
CD27.
Stein y otros (Leucocyte IV, 1989,
446-455) describe un informe agrupado relativo a
CDw70. Hintzen y otros (International Immunology, 1994, 6,
477-480) se refieren al descubrimiento de que CD70
representa el ligando humano para CD27. Paloczi y otros
(Haematologia, 1991, 24, 83-90) describen el patrón
de la expresión de antígeno de activación sobre la subpoblación de
linfocitos T en la mononucleoisis infecciosa. Paloczi (Leukaemia and
Lymphoma, 1990, 3, 31-36) describe la detección de
antígenos de activación sobre células de leucemia linfocítica
crónica. Pileri (Histopathology, 1990, 16, 383-391)
describe el linfoma de células T linfotiohistiocítico.
La presente invención proporciona un nuevo
ligando de CD27 (CD27L) que se une al receptor CD27. La presente
invención también proporciona DNA aislado que codifica la proteína
de CD27L, vectores de expresión que comprenden el DNA aislado y un
método para producir CD27L cultivando células huésped que contienen
los vectores de expresión bajo condiciones apropiadas para la
expresión de la proteína de CD27L. También se describen anticuerpos
dirigidos contra la proteína de CD27L o uno de sus fragmentos
inmunogénicos.
CD27L estimula la proliferación de células T de
sangre periférica humana purificadas, como se describe con detalle
en el Ejemplo 8A. Células T purificadas (1 x 10^{5}/pocillo) se
cultivaron con una concentración de células
CV-1/EBNA fijadas que se transfectaron bien con
vector vacío o bien con vector que expresa CD27L durante 3 días en
presencia de una concentración subóptima de PHA (0,1%). Durante las
8 horas finales de cultivo las células se sometieron a impulsos con
^{3}H-timidina y se determinó la incorporación. Se
determinaron los cpm medios \pm DE de cultivos por triplicado.
Las células que expresan CD27L proliferan hasta una extensión mayor
que las células que expresan vector vacío.
Células T CD4^{+} o CD8^{+} purificadas (1 x
10^{5}/pocillo) se cultivaron en IL-2 (10 ng/ml) o
células CV-1/EBNA que expresan CD27L (1 x
10^{4}/pocillo) durante 3 días con PHA subóptima. Las células se
cultivaron bien con o bien sin un antisuero de IL-2
neutralizador. Para células T tanto CD4^{+} como CD8^{+} CD27L
estimulaba la proliferación de una manera independiente de
IL-2.
CD27L induce células T citolíticas (según se
describe con detalle en el Ejemplo 8B). Células T purificadas se
cultivaron en medio solo, en medio más IL-2 o con
células CV-1/EBNA transfectadas con vector vacío o
con vector que expresa CD27L bien en ausencia o bien en presencia
de una concentración subóptima de PHA (0,1%). Después de 4 días,
las células se recuperaron y se ensayaron por duplicado con respecto
a la actividad citolítica frente a dianas P815 marcadas con
^{51}Cr en presencia de PHA (0,6%). Las células que expresaban
CD27L no tenían efecto estimulante sobre la actividad citolítica en
ausencia de coestimulación. En contraste, las células que expresan
CD27L que se coestimulaban con PHA potenciaban la generación de
células citolíticas.
La electroforesis en gel de poliacrilamida en
presencia de SDS de CD27L se describe con detalle en el Ejemplo 7.
Células MP-1 y CV-1/EBNA
transfectadas con vector vacío o vector que expresa CD27L se
marcaron superficialmente con ^{125}I-sodio. Los
lisados se precipitaron a continuación con CD27/Fc seguido por
proteína G-Sepharose y se analizaron sobre
SDS-gel de poliacrilamida (al 4%-20%) bajo
condiciones reductoras. La especie proteínica predominante sobre
células CV-1/EBNA que expresan tanto
MP-1 como CD27L tenía un M_{r} aparente de
aproximadamente 50.000.
Un cDNA que codifica un nuevo ligando proteínico
para el antígeno de activación de células T CD27 se ha aislado de
acuerdo con la presente invención. También se proporcionan vectores
de expresión que comprenden el cDNA de ligando de CD27 (CD27L) y
métodos para producir polipéptidos de CD27L recombinantes cultivando
células huésped que contienen los vectores de expresión bajo
condiciones apropiadas para la expresión de CD27L, y recuperar el
CD27L expresado. La proteína de CD27L purificada también es abarcada
por la presente invención.
La presente invención también proporciona CD27L
o sus fragmentos antigénicos que pueden actuar como inmunógenos
para generar anticuerpos específicos para los inmunógenos de CD27L.
Pueden así prepararse anticuerpos monoclonales específicos para
CD27L o sus fragmentos antigénicos.
La nueva citoquina descrita aquí es un ligando
para CD27, un receptor que es un miembro de la superfamilia de
receptores de TNF/NGF. Por lo tanto, se cree que CD27L es el ligando
que inicia la señal biológica mediada por CD27, que se sabe que se
expresa sobre la superficie de la mayoría de las células T y algunas
células B. Un uso del ligando de CD27 de la presente invención es
como una herramienta de investigación para estudiar el papel de
CD27L en la supervivencia de células activadas. Los polipéptidos de
CD27L de la presente invención también pueden emplearse en ensayos
in vitro para la detección de CD27 o CD27L o sus
interacciones. Se ha mostrado que CD27L induce la proliferación de
células T coestimuladas y mejora la generación de células T
citolíticas, sugiriendo que CD27L representa un papel en la
maduración de células T. Estudios biológicos del CD27L de la
presente invención (según se describe en los Ejemplos 6, 8 y 10)
muestran que CD27L coestimula la proliferación de células T y
también potencia la generación de precursores de células T
citolíticas.
El término "CD27L", según se usa aquí, se
refiere a un género de polipéptidos que son capaces de unirse a
CD27. CD27L humano está dentro del alcance de la presente invención,
como también proteínas de CD27L derivadas de otras especies de
mamíferos. Según se usa aquí, el término "CD27L" incluye
proteínas unidas a la membrana (que comprenden un dominio
citoplásmico, una región de transmembrana y un dominio extracelular)
así como proteínas truncadas que retienen la propiedad de unión a
CD27. Tales proteínas truncadas incluyen, por ejemplo, CD27L
soluble que comprende solo el dominio extracelular (unión al
receptor). La secuencia de cDNA y la secuencia de aminoácidos
predicha de CD27L se indican en el Nº ID SEC: 1 y el Nº ID SEC:
2.
El aislamiento de un cDNA que codifica CD27L
humano se describe en los Ejemplos 1-4 posteriores.
Una proteína de fusión CD27/Fc humana se preparó como se describe
en el Ejemplo 1 para el uso en clones de rastreo en un
procedimiento de clonación por expresión directa, para identificar
los que expresan una proteína que se une a CD27.
Cualquiera de las líneas celulares que
demuestran unión de CD27 a CD27L puede usarse como una fuente de
ácido nucleico en un intento de aislar una secuencia de DNA que
codifica CD27L. Una biblioteca de cDNA puede prepararse, por
ejemplo, a partir de la línea celular U937, la línea celular
monocítica THP-1, la línea celular de leucemia
linfoblástica pre-B temprana EU-1,
células T tonsilares purificadas o células MP-1, y
rastrearse para identificar cDNA de CD27L usando la estrategia de
clonación por expresión directa descrita posteriormente. Las células
pueden derivarse de fuentes humanas, múridas u otras fuentes
mamíferas, incluyendo, pero no limitadas a, células de rata,
bovinas, porcinas o de diversos primates.
Brevemente, RNA total se extrajo de células
MP-1 y se enriqueció con respecto a RNA de
poli(A)+ mediante cromatografía con
oligo(dT)-celulosa, esencialmente como se
describe por Ausubel y otros, eds., Current Protocols in
Molecular Biology, Vol. 1 (1987). Se preparó cDNA de la primera
hebra usando el RNA total como plantilla. DNA que codifica el
dominio extracelular de CD27 humano se amplificó mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores basados
en la secuencia de CD27 humano publicada por Camerini y otros,
anteriormente, y el fragmento de DNA amplificado se aisló. Un
vector de expresión que comprende el DNA del dominio extracelular
de CD27 fusionado en el marco al extremo N de una secuencia de DNA
de la región Fc de IgG1 humana se construyó y se transfectó a
células de mamífero. La proteína expresada se purificó mediante un
procedimiento que implicaba el uso de una columna de proteína G (a
la que se une la porción Fc de la proteína de fusión).
La línea de células B humanas
MP-1 que expresa CD27L se identificó usando un
ensayo de rastreo en dos etapas en el que la proteína de fusión
CD27/Fc se unía a células que tenían CD27L, seguido por
^{125}I-anticuerpo anti-(Fc humana) de ratón
unido a la porción Fc de la proteína de fusión CD27/Fc. Se preparó
una biblioteca de cDNA a partir de la línea de células B humanas
transformadas con EBV MP-1. cDNA de esta biblioteca
(en un vector de expresión de mamífero que también se replica en
E. coli) se transfectó en células
CV-1/EBNA-1 (mamíferas), para el
aislamiento de clones que expresan una proteína que se une a CD27
usando una técnica de clonación por expresión directa. Los clones
se rastrearon usando el método de rastreo en dos etapas que implica
la proteína de fusión CD27/Fc unida a células, seguido por
^{125}I-anticuerpo anti-(Fc humana) de ratón
unido a la porción Fc de la proteína de fusión CD27/Fc. El vector
recombinante aislado del clon positivo (cDNA de CD27L múrido en el
plásmido pDC303) se transformó en células de E. coli, se
depositó en the American Type Culture Collection el 18 de agosto de
1992, y se le asignó en Nº de registro ATCC 69052. El depósito se
realizó bajo los términos del Tratado de Budapest.
El análisis de la secuencia del clon resultante
revelaba un inserto de 813 pb en un marco de lectura abierto largo
simple capaz de codificar una proteína de 193 aminoácidos. Los 20
aminoácidos aminoterminales estaban seguidos por 18 aminoácidos
hidrófobos (aminoácidos 21-38) que presumiblemente
funcionan como un anclaje de transmembrana. Esta falta de una
secuencia de señal, la presencia de un dominio hidrófobo interno y
la presencia de dos sitios de glicosilación potenciales conectados
por N (aminoácidos Asn^{63} y Asn^{170}) en el dominio
C-terminal sugería que CD27L es una proteína de
transmembrana tipo II que tiene un dominio carboxiterminal
extracelular.
El clon de cDNA originalmente aislado contenía
solo 37 nucleótidos aguas arriba del codón de iniciación supuesto
(empezando en el nucleótido 114 del Nº ID SEC: 1) sin codones de
terminación en el marco. Además, la secuencia alrededor de este
sitio de iniciación no está de acuerdo con el consenso para tales
sitios descrito por Kozak, Nucl. Acids. Res. 12:857 (1984).
Así, se realizó una reacción de "PCR anclada" (según se
describe por Carrier y otros, Gene 116:173 (1992)) para
clonar el extremo 5’ del transcrito de CD27L para asegurar que no
existía un sitio de iniciación aguas arriba. Esto daba como
resultado la identificación de 113 nucleótidos adicionales
(nucleótidos 1-113 del Nº ID SEC: 1) que precedían
al extremo del clon originalmente aislado. No se encontraron sitios
de iniciación aguas arriba del que se identificaba previamente.
El cDNA de CD27L humano puede radiomarcarse y
usarse como una sonda para aislar otros cDNAs de CD27L de mamífero
mediante hibridación de especies cruzadas. Por ejemplo, una
biblioteca de cDNA preparada a partir de linfocitos de sangre
periférica múridos activados puede rastrearse con cDNA humano
radiomarcado para aislar un clon positivo.
Aunque se empleó una proteína de fusión CD27/Fc
en el procedimiento de rastreo descrito en el Ejemplo 4
posteriormente, puede usarse CD27 marcado para rastrear clones y
posibles líneas celulares para la expresión de proteínas de CD27L.
Sin embargo, la proteína de fusión CD27/Fc ofrece la ventaja de
purificarse fácilmente. Además, se forman enlaces disulfuro entre
las regiones Fc de dos cadenas de la proteína de fusión separadas,
creando dímeros. El receptor de CD27/Fc dímero se eligió por la
ventaja potencial de una unión de afinidad superior del ligando de
CD27, en vista de la posibilidad de que el ligando que se buscaba
fuera multímero.
Además, otras proteínas de fusión adecuadas que
comprenden CD27 pueden substituir a CD27/Fc en los procedimientos
de rastreo. Otras proteínas de fusión pueden elaborarse fusionando
una secuencia de DNA para el dominio de unión al ligando de CD27 a
una secuencia de DNA que codifica otro polipéptido que es capaz de
purificación por afinidad, por ejemplo avidina o estreptavidina. La
construcción génica resultante puede introducirse en células de
mamífero para expresar una proteína de fusión. Las proteínas de
fusión receptor/avidina pueden purificarse mediante cromatografía
de afinidad a biotina. La proteína de fusión puede recuperarse más
tarde de la columna eluyendo con una solución altamente salina u
otro tampón apropiado. Otras regiones Fc de anticuerpo pueden
substituir a la región Fc de IgG1 humana descrita en el Ejemplo 1.
Otras regiones Fc adecuadas son aquellas que pueden unirse con alta
afinidad a la proteína A o la proteína G e incluyen la región Fc de
IgG1 múrida o fragmentos de la región Fc de IgG1 humana, por
ejemplo, fragmentos que comprenden al menos la región bisagra de
modo que se formarán enlaces disulfuro intercatenarios.
cDNA que codifica un polipéptido de CD27L puede
aislarse de otras especies de mamífero usando los métodos descritos
en los Ejemplos. Por ejemplo, una biblioteca de cDNA múrido puede
substituir a la biblioteca de cDNA humano que se rastreó con
respecto a la unión de la proteína de fusión CD27/Fc humana
radioyodada en el procedimiento de clonación por expresión directa
descrito en el Ejemplo 4. Pueden así identificarse clones que
expresan otras proteínas de CD27 de mamífero. Tipos celulares a
partir de los cuales pueden prepararse bibliotecas de cDNA pueden
elegirse mediante el procedimiento de unión en dos etapas descrito
en el Ejemplo 2, o cualquier otra técnica adecuada.
Alternativamente, mRNAs aislados de diversas líneas celulares pueden
rastrearse mediante hibridación Northern para determinar una fuente
adecuada de mRNA de CD27L de mamífero para el uso en la clonación
de un gen de
CD27L.
CD27L.
Alternativamente, pueden utilizarse los cDNAs de
CD27L humanos descritos aquí para rastrear cDNA derivado de otras
fuentes de mamífero con respecto a cDNA de CD27L usando técnicas de
hibridación de especies cruzadas bien conocidas. Brevemente, una
sonda oligonucleotídica basada en la secuencia de nucleótidos de la
región de codificación (preferiblemente la región extracelular) del
clon múrido o humano se prepara mediante técnicas estándar. La
sonda múrida o humana se usa para rastrear una biblioteca de cDNA de
mamífero o una biblioteca genómica, generalmente bajo condiciones
moderadamente restrictivas.
Una modalidad de la presente invención
proporciona polipéptidos de CD27L solubles. Los polipéptidos de
CD27L solubles comprenden la totalidad o parte del dominio
extracelular de un CD27L natural pero carecen de la región de
transmembrana que provocaría la retención del polipéptido sobre una
membrana celular. CD27L soluble se secreta así durante la
expresión. Los polipéptidos de CD27L soluble que pueden emplearse
retienen la capacidad para unirse al receptor CD27. El CD27L
soluble también puede incluir parte de la región de transmembrana o
parte del dominio citoplásmico u otras secuencias, con tal de que la
proteína de CD27L soluble sea capaz de secretarse.
CD27L soluble puede identificarse (y
distinguirse de sus homólogos unidos a la membrana no solubles)
separando células intactas que expresan la proteína deseada del
medio de cultivo, por ejemplo mediante centrifugación, y ensayando
el medio (sobrenadante) con respecto a la presencia de la proteína
deseada. El medio de cultivo puede ensayarse usando procedimientos
que son similares o idénticos a los descritos en los ejemplos
posteriores. La presencia de CD27L en el medio indica que la
proteína se secretaba de las células y es así una forma soluble de
la proteína deseada. CD27L soluble también puede ser una forma
presente en la naturaleza de esta proteína.
El uso de formas solubles de CD27L es ventajoso
para ciertas aplicaciones. La purificación de las proteínas
procedentes de células huésped recombinantes se facilita, ya que las
proteínas solubles se secretan de las células. Además, las
proteínas solubles son generalmente más adecuadas para la
administración intravenosa.
Formas solubles de proteínas de CD27L también
pueden prepararse sometiendo a deleción los dominios de
transmembrana y citoplásmico y añadiendo un péptido de señal
apropiado para permitir la secreción de la forma soluble de la
proteína (Smith y otros, Science 238:1704, 1987; Treiger y
otros, J. Immunol. 136:4099, 1986). Polipéptidos de CD27L
solubles incluyen los que comprenden el dominio extracelular total o
parcial de una proteína de CD27L natural. CD27L truncado,
incluyendo los polipéptidos solubles, puede prepararse mediante
cualquiera de un número de técnicas convencionales. En el caso de
las proteínas recombinantes, un fragmento de DNA que codifica un
fragmento deseado puede subclonarse en un vector de expresión.
Alternativamente, una secuencia de DNA deseada puede sintetizarse
químicamente usando técnicas conocidas. También pueden producirse
fragmentos de DNA mediante digestión con endonucleasas de
restricción de una secuencia de DNA clonada de longitud completa, y
aislarse mediante electroforesis sobre geles de agarosa. Pueden
emplearse conectores que contienen un sitio o sitios de
segmentación con endonucleasas de restricción para insertar el
fragmento de DNA deseado en un vector de expresión, o el fragmento
puede digerirse en sitios de fragmentación presentes naturalmente en
el mismo. También puede emplearse el bien conocido procedimiento de
reacción en cadena de la polimerasa para aislar una secuencia de
DNA que codifica un fragmento proteínico deseado.
En otro sistema, puede emplearse un tratamiento
enzimático (por ejemplo, usando exonucleasas Bal 31) para someter a
deleción nucleótidos terminales de un fragmento de DNA para obtener
un fragmento que tiene un extremo deseado particular. Entre los
conectores disponibles comercialmente están aquellos que pueden
ligarse a los extremos romos producidos por la digestión con Bal
31, y que contienen un sitio o sitios de segmentación con
endonucleasas de restricción. Alternativamente, pueden sintetizarse
oligonucleótidos que reconstruyen el extremo N o C de un fragmento
de DNA hasta un punto deseado. El oligonucleótido puede contener un
sitio de segmentación con endonucleasas de restricción aguas arriba
de la secuencia de codificación deseada y situar un codón de
iniciación (ATG) en el extremo N de la secuencia de
codificación.
Las proteínas de CD27L solubles también pueden
expresarse como proteínas de fusión en las que el dominio
extracelular de la proteína de membrana está ligado a una región
constante de la cadena pesada de inmunoglobulina (Fanslow y otros,
J. Immunol. 149:65, 1992; Noelle y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 89:6550, 1992) para crear una molécula de
CD27L soluble dímera, o pueden fusionarse con el dominio
extracelular del antígeno CD8 de linfocitos T múridos (Hollenbaugh
y otros, EMBO J. 11:4313, 1992).
Múltiples moléculas de CD27L solubles también
pueden oligomerizarse. Un método preferido para crear formas
multímeras de CD27L es usar una cremallera de leucina, que es un
motivo de héptada de aminoácidos repetitivo presente como un
dominio conservado en ciertas proteínas naturales. La cremallera de
leucina contiene de 4 a 5 residuos de leucina intercalados con
otros aminoácidos que se pliegan como espirales superenrolladas
paralelas cortas y provocan la oligomerización de las proteínas a
las que se fusionan (O’Shea y otros, Science 254:539; 1991).
La arquitectura general de la espiral superenrollada paralela se ha
caracterizado bien, con un empaquetamiento de "nudos en
agujeros" como el propuesto por Crick en 1953 (Acra
Crystallogr. 6:689). Los dímeros formados por un dominio de
cremallera de leucina se estabilizan mediante la repetición
heptádica, denominada (abcdefg)_{n}, de acuerdo con la
notación de McLachlan y Stewart (J. Mol. Biol. 98:293; 1975),
en la que los residuos a y d son generalmente residuos hidrófobos,
siendo d una leucina, que se alinean en la misma cara de una hélice.
Residuos cargados opuestamente se presentan comúnmente en las
posiciones g y e. Así, en una espiral superenrollada paralela
formada a partir de dos dominios de cremallera de leucina
helicoidales, los "nudos" formados por las cadenas laterales
hidrófobas de la primera hélice se empaquetan en los "agujeros"
formados entre las cadenas laterales de la segunda hélice.
Los residuos de leucina en la posición d
contribuyen a energías de estabilización hidrófoba grandes, y son
importantes para la formación de dímeros (Krystek y otros, Int.
J. Peptide Res. 38:229, 1991). Lovejoy y otros presentaron
recientemente la síntesis de un haz helicoidal a de triple hebra en
el que las hélices se sitúan
arriba-arriba-abajo (Science
259:1288, 1993). Sus estudios confirmaron que la energía de
estabilización hidrófoba proporciona la principal fuerza conductora
para la formación de espirales superenrolladas a partir de
monómeros helicoidales y que las interacciones electrostáticas
contribuyen a la estequiometría y la geometría de espirales
superenrolladas.
Secuencias de cremallera de leucina derivadas de
las proteínas fos y jun pueden usarse en la formación
de proteínas de fusión biespecíficas, según se describe por Kostelny
y otros, J. Immunol. 148:1547, 1992; O’Shea y otros,
Science 245: 646, 1989 y Turner y Tjian, Science
243:1689, 1989. También se encuentran dominios de cremallera de
leucina en el factor de transcripción de levadura GCN4 y una
proteína de unión a DNA termoestable encontrada en hígado de rata
(C/EBP; Landschulz y otros, Science 243:1681, 1989). Las
proteínas fusogénica de varios virus diferentes, incluyendo
paramixovirus, coronavirus, virus del sarampión y muchos
retrovirus, también poseen motivos de cremallera de leucina
(Buckland y Wild, Nature 338:547, 1989; Britton, Nature
353:394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research and Human
Retroviruses 6:703, 1990). Los dominios de cremallera de
leucina en estas proteínas virales fusogénicas están cerca de la
región de transmembrana de las proteínas, donde los motivos de
cremallera de leucina pueden contribuir a la estructura oligómera de
las proteínas fusogénicas.
Varios estudios han indicado que los residuos de
leucina individuales pueden substituirse por aminoácidos
conservativos con disminución mínima en la capacidad para
dimerizarse. van Heekeren y otros presentaron que un número de
diferentes residuos de aminoácidos puede substituir a los residuos
de leucina en el dominio de cremallera de leucina de GCN4, y que
algunas proteínas de GCN4 que contienen dos substituciones de
leucina eran débilmente activas (Nucl. Acids Res. 20:3721,
1992). Las substituciones de aminoácidos en los residuos a y d de
un péptido sintético que representa el dominio de cremallera de
leucina de GCN4 también pueden cambiar la oligomerización de
dominios de cremallera de leucina (Alber, Sixth Symposium of the
Protein Society, San Diego, CA). Cuando todos los residuos en la
posición a se cambian por isoleucina, la cremallera de leucina
todavía forma un dímero paralelo. Cuando, además de este cambio,
todos los residuos de leucina en la posición d también se cambian
por isoleucina, el péptido resultante forma espontáneamente una
espiral superenrollada paralela trímera en solución. Substituir
todos los aminoácidos en la posición d por isoleucina y en la
posición a por leucina da como resultado un péptido que se
tetrameriza.
La presente invención proporciona polipéptidos
de CD27L purificados, tanto recombinantes como no recombinantes.
Variantes y derivados de proteínas de CD27L naturales que retienen
la actividad biológica deseada también están dentro del alcance de
la presente invención. Las variantes de CD27L pueden obtenerse
mediante mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican para
polipéptidos de CD27L naturales. Una variante de CD27L, según se
menciona aquí, es un polipéptido substancialmente homólogo a CD27
natural, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de
la del CD27L natural (ser humano, múrido u otras especies mamíferas)
debido a una o más deleciones, inserciones o substituciones.
La secuencia de aminoácidos variante es
preferiblemente al menos 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos
de CD27L natural, lo más preferiblemente al menos 90% idéntica. El
porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, comparando
la información de secuencias usando el programa informático GAP,
versión 6.0, descrito por Devereux y otros (Nucl. Acids Res.
12:387, 1984) y disponible de the University of Wisconsin
Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método
de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443,
1970), según se revisó por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math
2:482, 1981). Brevemente, el programa GAP define la similitud
como el número de símbolos (es decir, nucleótidos o aminoácidos)
alineados que son similares, dividido por el número total de
símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por
defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de
comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y
0 para no identidades) para nucleótidos y la matriz de comparación
ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745,
1986, según se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of
Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research
Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) una penalización
de 3,0 para cada hueco y una penalización de 0,10 adicional para
cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para huecos
extremos.
Pueden efectuarse alteraciones de la secuencia
de aminoácidos natural mediante cualquiera de un número de técnicas
conocidas. Pueden introducirse mutaciones en loci particulares
sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante,
flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a
fragmentos de la secuencia natural. Después de la ligación, la
secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la
inserción, substitución o deleción de aminoácidos deseada.
Alternativamente, pueden emplearse
procedimientos de mutagénesis específica para el sitio dirigida a
oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado que tiene
codones particulares alterados de acuerdo con la substitución,
deleción o inserción requerida. Métodos ejemplares para realizar las
alteraciones indicadas anteriormente son descritos por Walder y
otros (Gene 42:133, 1986); Bauer y otros (Gene 37:73,
1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985,
12-19); Smith y otros (Genetic Engineering:
Principles and Methods, Plenum Press, 1981) y las Patentes de
EE.UU. Nº 4.518.584 y 4.737.462, que se incorporan en la presente
mediante referencia.
Las variantes pueden comprender secuencias
conservativamente substituidas, lo que significa que un residuo de
aminoácido dado se reemplaza por un residuo que tiene
características fisicoquímicas similares. Ejemplos de
substituciones conservativas incluyen la substitución de un residuo
alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o
substituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y
Arg; Glu y Asp o Gln y Asn. Otras de tales substituciones
conservativas, por ejemplo substituciones de regiones enteras que
tienen características de hidrofobia similares, son bien
conocidas.
CD27L también puede modificarse para crear
derivados de CD27L formando conjugados covalentes o agregativos con
otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos,
fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes de
CD27L pueden prepararse conectando los restos químicos a grupos
funcionales en cadenas laterales de aminoácidos de CD27L o en el
extremo N o el extremo C de un polipéptido de CD27L o su dominio
extracelular. Otros derivados de CD27L dentro del alcance de esta
invención incluyen conjugados covalentes o agregativos de CD27L o
sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como
mediante síntesis en cultivo recombinante como fusiones
N-terminales o C-terminales. Por
ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia de polipéptido
de señal o líder (por ejemplo, el líder de factor \alpha de
Saccharomyces) en el extremo N de un polipéptido de CD27L.
El péptido de señal o líder dirige cotraducccionalmente o
postraduccionalmente la transferencia del conjugado desde su zona
de síntesis a un lugar dentro o fuera de la membrana celular o la
pared celular. Las fusiones de polipéptidos CD27L pueden comprender
péptidos añadidos para facilitar la purificación y la
identificación de CD27L. Tales péptidos incluyen, por ejemplo,
poli-His o los péptidos de identificación
antigénicos descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.011.912 y en Hopp
y otros, Bio/Technology 6:1204, 1988. Uno de tales péptidos
es el péptido FLAG®,
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(DYKDDDDK), que es altamente antigénico y proporciona un epítopo
unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico que
permite el ensayo rápido y la purificación fácil de proteína
recombinante expresada. Esta secuencia también es segmentada
específicamente por enteroquinasa mucosal bovina en el residuo
inmediatamente siguiente al apareamiento Asp-Lys.
Las proteínas de fusión protegidas con este péptido también pueden
ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli. Un
hibridoma múrido denominado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal
que se une al péptido DYKDDDDK en presencia de ciertos cationes
metálicos divalentes (según se describe en la Patente de EE.UU.
5.011.912) y se ha depositado en the American Type Culture
Collection bajo el Nº de registro HB 9259.
La presente invención incluye además
polipéptidos de CD27L con o sin glicosilación de patrón natural
asociada. CD27L expresado en sistemas de expresión de levadura o
mamífero (por ejemplo, células COS-7) puede ser
similar a o significativamente diferente de un polipéptido de CD27L
natural en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de
la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos
de CD27L en sistemas de expresión bacterianos, tales como E.
coli, proporciona moléculas no glicosiladas.
Pueden prepararse constructos de DNA que
codifican diversas adiciones o substituciones de residuos o
secuencias de aminoácidos, o deleciones de residuos o secuencias
terminales o internos no necesarios para la actividad biológica o
la unión. Por ejemplo, sitios de N-glicosilación en
el dominio extracelular de CD27L pueden modificarse para impedir la
glicosilación mientras que se permite la expresión de un análogo de
carbohidrato reducido homogéneo usando sistemas de expresión de
levadura. Sitios de N-glicosilación en polipéptidos
eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos
Asn-X-Y, en el que X es cualquier
aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Modificaciones apropiadas
para la secuencia de nucleótidos que codifica este triplete darán
como resultado substituciones, adiciones o deleciones que evitan el
empalme de residuos de carbohidrato en la cadena lateral de Asn.
Procedimientos conocidos para desactivar sitios de
N-glicosilación en proteínas incluyen los descritos
en la Patente de EE.UU. Nº 5.071.972 y EP 276.846. En otro ejemplo,
secuencias que codifican residuos de Cys que no son esenciales para
la actividad biológica pueden alterarse para hacer que los residuos
de Cys se sometan a deleción o se reemplacen por otros aminoácidos,
previniendo la formación de puentes de disulfuro intramoleculares
incorrectos durante la renaturalización. Otras variantes se preparan
mediante la modificación de residuos de aminoácido dibásicos
adyacentes para mejorar la expresión en sistemas de levadura en los
que está presente actividad de proteasa KEX2. EP 212.914 describe el
uso de mutagénesis específica para el sitio para inactivar sitios
de procesamiento de proteasa KEX2 en una proteína.
Variantes de CD27L presentes en la naturaleza
también son abarcadas por la presente invención. Ejemplos de tales
variantes son proteínas que resultan de episodios de reparación de
mRNA alternativos (ya que CD27L está codificado por un gen
multiexónico) o de la segmentación proteolítica de la proteína de
CD27L, en donde se retiene la propiedad de unión a CD27. La
reparación alternativa de mRNA puede dar una proteína de CD27L
truncada pero biológicamente activa, tal como la forma soluble
presente en la naturaleza de la proteína, por ejemplo. Variaciones
atribuibles a proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los
extremos N o C durante la expresión en diferentes tipos de células
huésped, debido a la retirada proteolítica de uno o más aminoácidos
terminales de la proteína de CD27L.
Secuencias de ácido nucleico dentro del alcance
de la invención incluyen secuencias de DNA y RNA aisladas que se
hibridan a las secuencias de nucleótidos de CD27L descritas aquí
bajo condiciones de restricción moderada o severa, y que codifican
CD27L biológicamente activo. Condiciones de hibridación de
restricción moderada se refieren a condiciones descritas en, por
ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª ed. Vol. 1, pp. 101-104, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, (1989). Condiciones de restricción
moderada, según se define por Sambrook y otros, incluyen el uso de
una solución de prelavado de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH
8,0) y condiciones de hibridación de aproximadamente 55ºC, 5 X SSC,
durante la noche. Condiciones de restricción severa incluyen
temperaturas superiores de hibridación y lavado. El experto
reconocerá que la temperatura y la concentración salina de la
solución de lavado pueden ajustarse según sea necesario de acuerdo
con factores tales como la longitud de la sonda.
La presente invención proporciona así secuencias
de DNA aisladas que codifican CD27L biológicamente activo,
seleccionadas de: (a) DNA derivado de la región codificante de un
gen de CD27L mamífero natural (por ejemplo, cDNA derivado de la
región codificante del cDNA de CD27L múrido o humano aislado según
se describe en el Ejemplo 4); (b) DNA capaz de hibridación a un DNA
de (a) bajo condiciones moderadamente restrictivas y que codifica
CD27L biológicamente activo; y (c) DNA que está degenerado como
resultado del código genético con respecto a un DNA definido en (a)
o (b) y que codifica CD27L biológicamente activo. Variantes que
poseen la capacidad requerida para unirse a CD27 pueden
identificarse mediante cualquier ensayo adecuado. La actividad
biológica de CD27L puede determinarse, por ejemplo, mediante
competición con respecto a la unión al dominio de unión al ligando
de CD27 (es decir, ensayos de unión competitiva).
Un tipo de un ensayo de unión competitiva para
polipéptido de CD27L usa un CD27L humano o múrido soluble
radiomarcado y células intactas que expresan CD27 de la superficie
celular (por ejemplo, líneas celulares tales como
MP-1 descrita en el Ejemplo 2). En lugar de células
intactas, podría substituirse CD27 soluble (tal como una proteína
de fusión CD27/Fc) unido a una fase sólida a través de una
interacción con Proteína A o Proteína G por la región Fc de la
proteína de fusión. Otro tipo de ensayo de unión competitiva utiliza
CD27 soluble radiomarcado, tal como la proteína de fusión CD27/Fc,
y células intactas que expresan CD27L. Alternativamente, CD27L
soluble podría unirse a una fase sólida.
Los ensayos de unión competitiva pueden
realizarse usando metodología estándar. Por ejemplo, CD27L múrido
radiomarcado puede usarse para competir con un homólogo de CD27L
putativo para ensayar con respecto a la actividad de unión frente a
CD27 unido a la superficie. Pueden obtenerse resultados cualitativos
mediante ensayos competitivos de unión a placas autorradiográficas,
o pueden utilizarse gráficas de Scatchard para generar resultados
cuantitativos.
Los ensayos de unión competitivos con células
intactas que expresan CD27 pueden realizarse mediante dos métodos.
En un primer método, células que expresan CD27 de la superficie
celular se hacen crecer bien en suspensión o bien mediante
adherencia a placas de cultivo tisular. Las células adherentes
pueden retirarse mediante tratamiento con EDTA 5 mM durante 10
minutos a 37ºC. En un segundo método, pueden usase células COS
transfectadas que expresan CD27 unido a la membrana. Células COS u
otras células de mamífero, tales como la línea celular
CV-1/EBNA-1, pueden transfectarse
con cDNA de CD27 humano en un vector apropiado para expresar CD27 de
longitud completa con una región extracelular.
Alternativamente, CD27 soluble puede unirse a
una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o
un substrato similar adecuado para el análisis con respecto a la
presencia de un resto detectable tal como ^{125}I. La unión a una
fase sólida puede efectuarse, por ejemplo, obteniendo una proteína
de fusión CD27/Fc y uniéndola a una matriz que contiene proteína A
o proteína G.
Las características de unión de CD27L
(incluyendo las variantes) también pueden determinarse usando el
CD27 soluble conjugado (por ejemplo,
^{125}I-CD27/Fc) en ensayos competitivos similares
a los descritos anteriormente. Sin embargo, en este caso, se usan
células intactas que expresan CD27L o CD27L soluble unido a un
substrato sólido para medir la extensión hasta la que una muestra
que contiene una variante de CD27 putativa compite con respecto a
la unión de un CD27 soluble conjugado a CD27L.
El CD27L de la presente invención puede usarse
en un ensayo de unión para detectar células que expresan CD27. Por
ejemplo, CD27L o un dominio extracelular o uno de sus fragmentos
puede conjugarse a un resto detectable tal como ^{125}I. El
radiomarcaje con ^{125}I puede realizarse mediante cualquiera de
varias metodologías estándar que dan una molécula de
^{125}I-CD27L funcional marcada hasta una
actividad específica alta. Alternativamente, puede usarse otro
resto detectable tal como una enzima que puede catalizar una
reacción colorimétrica o fluorimétrica, biotina o avidina. Las
células que han de probarse con respecto a la expresión de CD27
pueden ponerse en contacto con CD27L conjugado. Después de la
incubación, el CD27L conjugado no unido se retira y la unión se mide
usando el resto detectable.
Los polipéptidos de CD27L pueden existir como
oligómeros, tales como dímeros o trímeros. Los oligómeros están
conectados mediante enlaces disulfuro formados entre residuos de
cisteína en diferentes polipéptidos de CD27L. En una modalidad de
la invención, se crea un dímero de CD27L fusionando CD27L a la
región Fc de un anticuerpo (IgG1) de una manera que no interfiere
con la unión de CD27L al dominio de unión al ligando de CD27. El
polipéptido de Fc preferiblemente se fusiona al extremo N de un
CD27L soluble (que comprende solo el dominio extracelular). Un
procedimiento para aislar DNA que codifica una región Fc de IgG para
el uso en la preparación de proteínas de fusión se presenta en el
Ejemplo 1 posteriormente. Una fusión génica que codifica la proteína
de fusión CD27L/Fc se inserta en un vector de expresión apropiado.
Las proteínas de fusión CD27L/Fc se dejan ensamblar de forma muy
similar a moléculas de anticuerpo, con lo que se forman enlaces
disulfuro intercatenarios entre polipéptidos de Fc, dando CD27L
divalente. Si se elaboran proteínas de fusión con cadenas tanto
pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un
oligómero de CD27L con tanto como cuatro regiones extracelulares de
CD27. Alternativamente, pueden conectarse dos dominios de CD27L
soluble con un conector peptídico tal como la secuencia conectora
Gly_{4}SerGly_{5}Ser descrita en la Patente de Estados Unidos
5.073.627.
La presente invención proporciona oligómeros de
dominios extracelulares de CD27L o sus fragmentos, conectados
mediante interacciones disulfuro o expresados como polímeros de
fusión con o sin grupos conectores de aminoácidos espaciadores. Por
ejemplo, una molécula de CD27L dímera puede conectarse mediante un
grupo de conexión de la región Fc de IgG.
La presente invención proporciona vectores de
expresión recombinantes para la expresión de CD27L y células
huésped transformadas con los vectores de expresión. Puede emplearse
cualquier sistema de expresión adecuado. Los vectores incluyen una
secuencia de DNA de CD27L (una secuencia de DNA sintética o derivada
de cDNA que codifica un polipéptido de CD27L) conectada
operablemente a secuencias de nucleótidos reguladoras de la
transcripción o la traducción adecuadas, tales como las derivadas
de un gen de mamífero, microbio, virus o insecto. Ejemplos de
secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores o
potenciadores transcripcionales, un sitio de unión ribosómico de
mRNA y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y la
terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de
nucleótidos están conectadas operablemente cuando la secuencia
reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de DNA de
CD27L. Así, una secuencia de nucleótidos promotora está conectada
operablemente a una secuencia de DNA de CD27L si la secuencia de
nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de
DNA de CD27L. La capacidad para replicarse en las células huésped
deseadas, habitualmente conferida por un origen de replicación, y
un gen de selección mediante el cual se identifican transformantes,
pueden incorporarse adicionalmente en el vector de expresión.
Además, secuencias que codifican péptidos de
señal apropiados que no son naturales para el gen de CD27L pueden
incorporarse en vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de
DNA para un péptido de señal (líder secretor) puede fusionarse en
el marco a la secuencia de CD27L de modo que el CD27L se traduzca
inicialmente como una proteína de fusión que comprende péptido de
señal. Un péptido de señal que es funcional en las células huésped
pretendidas potencia la secreción extracelular del polipéptido de
CD27L. El péptido de señal se segmenta del polipéptido de CD27L
durante la secreción de CD27L desde la célula.
Células huésped adecuadas para la expresión de
polipéptidos de CD27L incluyen procariotas, células de levadura o
células eucarióticas superiores. Vectores de clonación y expresión
apropiados para el uso con huéspedes celulares bacterianos,
fúngicos, de levadura y mamíferos se describen, por ejemplo, en
Pouwels y otros, Cloning Vectors: A Laboratory Manual,
Elsevier, Nueva York, (1985). También podrían emplearse sistemas de
traducción libres de células para producir polipéptidos de CD27L
usando RNAs derivados de constructos de DNA descritos aquí.
Los procariotas incluyen organismos Gram
negativos o Gram positivos, por ejemplo, E. coli o
Bacilli. Células huésped procarióticas adecuadas para la
transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis,
Salmonella typhimurium, y otras especies diversas dentro de los
géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.
En una célula huésped procariótica, tal como E. coli, un
polipéptido de CD27L puede incluir un residuo de metionina
N-terminal para facilitar la expresión del
polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. La Met
N-terminal puede segmentarse del polipéptido de
CD27L recombinante expresado.
Vectores de expresión para el uso en células
huésped procarióticas comprenden generalmente uno o más genes
marcadores seleccionables fenotípicos. Un gen marcador seleccionable
fenotípico es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que
confiere resistencia a antibióticos o que suministra un
requerimiento autotrófico. Ejemplos de vectores de expresión útiles
de células huésped procarióticas incluyen los derivados de plásmidos
disponibles comercialmente tales como el vector de clonación pBR322
(ATCC 37017). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y
tetraciclina y proporciona así medios simples para identificar
células transformadas. Un promotor apropiado de una secuencia de
DNA de CD27L se inserta en el vector pBR322. Otros vectores
disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo,
pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia)
y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU. de A.).
Secuencias promotoras comúnmente usadas para
vectores de expresión de células huésped procarióticas recombinantes
incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema
promotor de lactosa (Chang y otros, Nature 275:615, 1978; y
Goeddel y otros, Nature 281:544, 1979), sistema promotor de
triptófano (trp) (Goeddel y otros, Nucl. Acids Res. 8:4057,
1980 y EP-A-36776) y promotor tac
(Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión de
células huésped procarióticas particularmente útil emplea un
promotor P_{L} del fago \lambda y una secuencia represora
termolábil de cl857ts. Vectores plasmídicos disponibles de the
American Type Culture Collection que incorporan derivados del
promotor P_{L} de \lambda incluyen el plásmido pHUB2 (residente
en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092)) y pPLc28 (residente
en E. coli PR1 (ATCC 53082)).
CD27L puede expresarse alternativamente en
células huésped de levadura, preferiblemente del género
Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También
pueden emplearse otros géneros de levadura, tales como Pichia
o Kluyveromyces. Los vectores de levadura contendrán a
menudo una secuencia de origen de replicación procedente de un
plásmido de levadura 2 \mu, una secuencia que se replica
autónomamente (ARS), una región promotora, secuencias para
poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción
y un gen marcador seleccionado. Secuencias promotoras adecuadas
para vectores de levadura incluyen, entre otras, promotores para
metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman
y otros, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas
glicolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968
y Holland y otros, Biochem. 17:4900, 1978), tales como
enolasa, gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfasto isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión en
levadura se describen adicionalmente en Hitzeman,
EPA-73.657. Otra alternativa es el promotor ADH2
reprimible con glucosa descrito por Russell y otros (J. Biol.
Chem. 258:2674, 1982) y Beier y otros (Nature
300:724, 1982). Vectores lanzadera replicables tanto en
levadura como en E. coli pueden construirse insertando
secuencias de DNA procedentes de pBR322 para la selección y
replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de
replicación) en los vectores de levadura descritos
anteriormente.
La secuencia líder de factor \alpha de
levadura puede emplearse para dirigir la secreción del polipéptido
de CD27L. La secuencia líder de factor \alpha a menudo se inserta
entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural.
Véanse, por ejemplo, Kurjan y otros, Cell 30:933, 1982 y
Bitter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330;
1984. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción
de polipéptidos recombinantes procedentes de huéspedes de levadura
son conocidas por los expertos en la técnica. Una secuencia líder
puede modificarse cerca de su extremo 3’ para contener uno o más
sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia
líder al gen estructural.
Protocolos de transformación de levadura son
conocidos por los expertos en la técnica. Uno de tales protocolos
es descrito por Hinnen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen y otros selecciona
transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en donde el medio
selectivo consiste en base nitrogenada de levadura al 0,67%,
casaminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, 10 \mug/ml de adenina y 20
\mug/ml de uracilo.
Células huésped de levadura transformadas por
vectores que contienen secuencia promotora ADH2 pueden hacerse
crecer para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo
de un medio rico es uno que consiste en extracto de levadura al 1%,
peptona al 2% y glucosa al 1% complementado con 80 \mug/ml de
adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desrepresión del promotor
ADH2 se produce cuando la glucosa se agota del medio.
También podrían emplearse sistemas de cultivo de
células huésped de mamífero o insecto para expresar polipéptidos de
CD27L recombinantes. Sistemas de baculoviros para la producción de
proteínas heterólogas en células de insecto son revisados por
Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). También pueden
emplearse líneas celulares establecidas de origen mamífero.
Ejemplos de líneas de células huésped mamíferas incluyen la línea
COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651)
(Gluzman y otros, Cell 23:175, 1981), células L,
células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de
hámster chino (CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL
10) y la línea celular CV-1/EBNA-1
derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CVI
(ATCC CCL 70) que es descrita por McMahan y otros (EMBO J.
10: 2821, 1991).
Secuencias de control de la transcripción y la
traducción para vectores de expresión de células huésped de
mamífero pueden cortarse de genomas virales. Secuencias promotoras y
secuencias potenciadoras comúnmente usadas se derivan de
poliomavirus, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) y
citomegalovirus humano. Pueden usarse secuencias de DNA derivadas
del genoma viral de SV40, por ejemplo, sitios de origen, promotor
temprano y tardío, potenciador, de reparación y de poliadenilación
de SV40, para proporcionar otros elementos genéticos para la
expresión de una secuencia génica estructural en una célula huésped
mamífera. Los promotores tempranos y tardíos virales son
particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente de
un genoma viral como un fragmento que también puede contener un
origen de replicación viral (Fiers y otros, Nature
273:113, 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40
menores o mayores, con tal de que se incluya la secuencia de
aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind
III hasta el sitio Bgl I situado en el sitio de origen de
replicación viral de SV40.
Vectores de expresión ejemplares para el uso en
células huésped mamíferas pueden construirse según se describe por
Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un
sistema útil para la expresión estable de alto nivel de cDNAs
mamíferos en células epiteliales mamarias múridas C127 puede
construirse substancialmente como se describe por Cosman y otros
(Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de alta
expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y otros,
Nature 312:768, 1984, se ha depositado como ATCC
39890. Vectores de expresión mamíferos útiles adicionales se
describen en EP-A-0367566 y en la
Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/701.415, presentada
el 16 de mayo de 1991, incorporada mediante referencia en la
presente. Los vectores pueden derivarse de retrovirus. Para la
expresión de una proteína tipo II que carece de una secuencia de
señal natural, puede añadirse una secuencia de señal heteróloga, tal
como la secuencia de señal para interleuquina-7
(IL-7) descrita en la Patente de Estados Unidos
4.965.195 o la secuencia de señal para el receptor de
interleuquina-2 descrita en la Solicitud de Patente
de Estados Unidos 06/626.667, presentada el 2 de julio de 1984.
La presente invención proporciona proteína de
CD27L substancialmente homogénea, que puede producirse mediante
sistemas de expresión recombinantes como los descritos anteriormente
o purificarse de células presentes en la naturaleza. El CD27L se
purifica hasta homogeneidad substancial, según se indica por una
sola banda de proteína durante el análisis mediante electroforesis
en gel de poliacarilamida en presencia de SDS
(SDS-PAGE).
En una modalidad de la presente invención, CD27L
se purifica de una fuente celular usando cualquier técnica de
purificación de proteínas adecuada. Las células pueden, por ejemplo,
ser linfocitos T activados de una especie mamífera de interés, tal
como la línea celular múrida 7B9 descrita en los ejemplos 2 y 3 o
células T de sangre periférica humana inducidas.
Un procedimiento alternativo para producir la
proteína de CD27L comprende cultivar una célula huésped transformada
por un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA que
codifica CD27L bajo condiciones tales que se expresa CD27L. La
proteína de CD27L se recupera a continuación del medio de cultivo o
los extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión
empleado. Como reconocerá un experto, los procedimientos para
purificar el CD27L recombinante variarán de acuerdo con factores
tales como el tipo de células huésped empleado y si el
CD-30-L se secreta o no al medio de
cultivo.
Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de
expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo
puede concentrarse en primer lugar usando un filtro de
concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo
una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después
de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una
matriz de purificación tal como un medio de filtración.
Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio
aniónico, por ejemplo, una matriz o un substrato que tiene grupos
dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser
acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados
comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede
emplearse una etapa de intercambio catiónico. Intercambiadores
catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que
comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los
grupos sulfopropilo. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas
de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa
(RP-HPLC) empleando medios de
RP-HPLC hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice que
tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes) para
purificar adicionalmente CD27L. Algunas o la totalidad de las
etapas de purificación precedentes, en diversas combinaciones,
pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante
substancialmente homogénea.
También es posible utilizar una columna de
afinidad que comprende el dominio de unión a ligando de CD27 para
purificar por afinidad polipéptidos de CD27L expresados. Los
polipéptidos de CD27L pueden retirarse de una columna de afinidad
en un tampón de elución de alto contenido de sal y a continuación
dializarse en un tampón de contenido de sal inferior para el uso.
Alternativamente, la columna de afinidad puede comprender un
anticuerpo que se une a CD27L. El Ejemplo 5 describe un
procedimiento para emplear la proteína de CD27L de la presente
invención para generar anticuerpos monoclonales dirigidos contra
CD27L.
La proteína recombinante producida en cultivo
bacteriano se aísla habitualmente mediante rotura inicial de las
células huésped, centrifugación, extracción de las pellas celulares
si hay polipéptido insoluble o del fluido sobrenadante si hay
polipéptido soluble, seguido por una o más etapas de concentración,
precipitación por sales, intercambio iónico, purificación por
afinidad o cromatografía de exclusión por tamaños. Finalmente,
puede emplearse RP-HPLC para etapas de purificación
finales. Las células microbianas pueden romperse mediante cualquier
método conveniente, incluyendo ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, ruptura
mecánica o uso de agentes de lisis celular.
Las células huésped de levadura transformadas se
emplean preferiblemente para expresar CD27L como un polipéptido
secretado. Esto simplifica la purificación. Polipéptido recombinante
secretado procedente de una fermentación de células huésped de
levadura puede purificarse mediante métodos análogos a los descritos
por Urdal y otros (J. Chromatog. 296:171,
1984). Urdal y otros describen dos etapas de HPLC en fase inversa
secuenciales para la purificación de IL-2 humana
recombinante en una columna de HPLC preparativa.
La presente invención proporciona además
oligonucleótidos antisentido o de sentido que comprenden una
secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (bien RNA o bien DNA)
capaz de unirse a secuencias diana de mRNA (sentido) de CD27L o DNA
(antisentido) de CD27L. Los oligonucleótidos de antisentido o
sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un
fragmento de la región codificante de cDNA de CD27L. Tal fragmento
comprende generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos,
preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30
nucleótidos. La capacidad para crear un oligonucleótido de
antisentido o sentido, basándose en una secuencia de cDNA para una
proteína dada, se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer
Res. 48:2659, 1988 y van der Krol y otros BioTechniques
6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos de antisentido o
sentido a secuencias de ácido nucleico diana da como resultado la
formación de dúplex que bloquean la transcripción (RNA) o la
traducción (DNA) mediante uno de varios medios, incluyendo la
degradación potenciada de los dúplex, la terminación prematura de la
transcripción o la traducción, o mediante otros medios. Los
oligonucleótidos antisentido pueden usarse así para bloquear la
expresión de proteínas de CD27L. Los oligonucleótidos de
antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen
cadenas principales de azúcar-fosfodiéster
modificadas (u otros enlaces de azúcar, tales como las descritas en
WO91/06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a
nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar
resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la
degradación enzimática) pero retienen especificidad de secuencia
para poder unirse a secuencias de nucleótidos diana. Otros ejemplos
de oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen los
oligonucleótidos que están conectados covalentemente a restos
orgánicos, tales como los descritos en WO 90/10448, y otros restos
que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia
de ácido nucleico diana, tales como
poli(L-lisina). Más aún, agentes
intercaladores, tales como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos pueden empalmarse a oligonucleótidos de sentido
o antisentido para modificar las especificidades de unión del
oligonucleótido de antisentido o sentido para la secuencia de
nucleótidos diana. Los oligonucleótidos de antisentido o sentido
pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de
ácido nucleico diana mediante cualquier método de transferencia
génica, incluyendo, por ejemplo, transfección de DNA mediada por
CaPO_{4}, electroporación u otros vectores de transferencia
génica tales como el virus de Epstein-Barr. Los
oligonucleótidos de antisentido o sentido se introducen
preferiblemente en una célula que contiene la secuencia de ácido
nucleico diana mediante inserción del oligonucleótido de
antisentido o sentido en un vector retroviral adecuado, a
continuación poniendo en contacto la célula con el vector de
retrovirus que contiene la secuencia insertada, bien in vivo o bien
ex vivo. Vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se
limitan a, el retrovirus múrido M-MuLV, N2 (un
retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de
doble copia denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la Solicitud
PCT US 90/02656). Alternativamente, pueden usarse otras secuencias
promotoras para expresar el oligonucleótido.
Los oligonucleótidos de sentido o antisentido
también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia
de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una
molécula que se une a ligando, según se describe en WO 91/04753.
Moléculas que se unen a ligandos adecuadas incluyen, pero no se
limitan a, receptores de la superficie celular, factores de
crecimiento, otras citoquinas u otros ligandos que se unen a
receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la
conjugación de la molécula que se une a ligando no interfiere
substancialmente con la capacidad de la molécula que se une a
ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o
bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o
su versión conjugada en la célula.
Alternativamente, un oligonucleótido de sentido
o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la
secuencia de ácido nucleico mediante la formación de un complejo
oligonucleótido-lípido, según se describe en WO
90/10448. El complejo oligonucleótido de sentido o
antisentido-lípido se disocia preferiblemente dentro
de la célula mediante una lipasa endógena.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar modalidades particulares y no para limitar el alcance de
la invención.
Este ejemplo describe la construcción de un
vector que codifica CD27/Fc que expresa una proteína de fusión CD27
soluble/Fc para el uso en la detección de clones de cDNA que
codifican un ligando de CD27 (CD27L). Un fragmento de cDNA que
codifica la región extracelular (dominios de unión a ligandos) del
receptor humano CD27 se obtuvo usando técnicas de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), y se basa en la secuencia publicada
por Camerini y otros, J. Immunol. 147:3165, 1991.
El cDNA de CD27 usado como una plantilla en la
reacción de PCR se obtuvo de D. Camerini y se usó como una
plantilla en la reacción de PCR. El cebador 5’ empleado en la
reacción de PCR era un oligonucleótido de una sola hebra
(27-mero) que tenía la siguiente secuencia:
Nº ID SEC:3:
5’-ATAGCGGCCGCCTGGGCAGGGACCATG-3’
Este cebador comprende un sitio de
reconocimiento para la endonucleasa de restricción NotI
(subrayado) aguas arriba de una secuencia que contiene los
nucleótidos 83-103 de la secuencia de CD27 publicada
por Camerini y otros, hasta la metionina N-terminal
(codificada por el codón de iniciación de la traducción ATG).
El cebador 3’ empleado en la reacción de PCR era
un oligonucleótido de una sola hebra (39-mero) de la
secuencia:
Nº ID SEC:4:
3’-GTGACCGGTGGGGTTTCTAGGGACCTCGGGTCTAGAGCG-5’
Este cebador comprende una secuencia (negrita)
que es complementaria a los nucleótidos 629-652 (que
codifican los aminoácidos 157-164) de la secuencia
de CD27 publicada por Camerini y otros. Este cebador se diseñó para
eliminar los últimos 7 aminoácidos del dominio extracelular de CD27.
La secuencia CTCGGG que sigue a la secuencia de CD27 es
complementaria a los codones para Glu y Pro. Glu y Pro son los dos
primeros aminoácidos de un fragmento Fc de anticuerpo que se
fusiona al extremo C del fragmento de CD27 que se describe
posteriormente. El cebador también sitúa un sitio de reconocimiento
para el endonucleasa de restricción BglII (subrayado) aguas
abajo, para el uso en el empalme de una secuencia de DNA que
codifica el resto del gen que codifica Fc.
La reacción de PCR puede efectuarse usando
cualquier procedimiento adecuado, tal como los descritos en Sarki y
otros, Science 239:487 (1988); en Recombinant DNA
Methodology, Wu y otros, eds., Academic Press Inc., San Diego
(1989), pp. 189-196; y en PCR Protocols: A Guide
to Methods and Applications, Innis y otros, eds., Academic
Press, Inc. (1990). Un ejemplo de un procedimiento de PCR adecuado
es como sigue. Todas las temperaturas son en grados centígrados.
Los siguientes reactivos de PCR se añaden a un tubo de
microcentrífuga de Eppendorf de 0,5 ml: 10 \mul de 10 x tampón de
PCR (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,3 a 25ºC,
MgCl_{2} 25 mM y 1 mg/ml de gelatina)
(Perkins-Elmer Cetus, Norwalk, CN), 8 \mul de una
solución 2,5 mM que contiene cada dNTP (dATP 2 mM, dCTP 2 mM, dGTP
2 mM y dTTP 2 mM), 2,5 unidades (0,5 \mul de 5000 unidades
estándar/ml de solución) de DNA polimerasa de Taq
(Perkins-Elmer Cetus), 1 ng de DNA de plantilla, 100
picomoles de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos y agua
hasta un volumen final de 100 \mul. La mezcla final se cubre a
continuación con 100 \mul de aceite de parafina. La PCR se lleva a
cabo usando un ciclador térmico de DNA (Ericomp, San Diego,
CA).
En un procedimiento preferido, la plantilla se
desnaturalizó a 94ºC durante 5 minutos, seguido por 5 ciclos de
94ºC durante 1 minuto (desnaturalización), 50ºC durante 1 minuto
(reasociación) y 72ºC durante 1 minuto (extensión); seguido por 30
ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC
durante 1 minuto, siendo seguido el último ciclo por una extensión
final a 72ºC durante 7 minutos. Una parte alícuota de los productos
de esta reacción de PCR se reamplificó en una segunda reacción de
PCR, usando las mismas condiciones.
El fragmento de DNA deseado amplificado mediante
esta reacción de PCR comprendía un sitio NotI aguas arriba
de una secuencia que codifica el dominio extracelular de CD27 (pero
sometiendo a deleción los últimos siete aminoácidos para retirar el
aminoácido Cys), seguido por un sitio BglII. Los productos de
reacción de PCR se digirieron con NotI y BglII y el
fragmento deseado se purificó mediante electroforesis en gel. La
retirada del aminoácido Cys era necesaria para facilitar la
expresión de la proteína de fusión CD27/Fc descrita
posteriormente.
Una secuencia de DNA que codifica un fragmento
de Fc de anticuerpo, que ha de condensarse al fragmento de DNA que
codifica CD27, se preparó como sigue. DNA que codifica un
polipéptido monocatenario derivado de la región Fc de un anticuerpo
IgG1 humano se ha clonado en el sitio SpeI del vector
pBLUESCRIPT SK®, que está disponible comercialmente de Stratagene
Cloning Systems, La Jolla, California. Este vector plasmídico es
replicable en E. coli y contiene un segmento policonector que
incluye 21 sitios de restricción únicos. Un sitio BglII
único se introdujo cerca del extremo 5’ de la secuencia que codifica
Fc insertada.
El polipéptido de Fc codificado por el DNA se
extiende desde la región de bisagra N-terminal hasta
el extremo C natural, es decir, es una región de Fc de anticuerpo
esencialmente de longitud completa. También pueden emplearse
fragmentos de las regiones Fc, por ejemplo, aquellos que están
truncados en el extremo C-terminal. Los fragmentos
contienen preferiblemente múltiples residuos de cisteína (al menos
los residuos de cisteína en la reacción de la bisagra) para
permitir que se formen enlaces disulfuro intercatenarios entre las
porciones polipeptídicas de Fc de dos proteínas de fusión CD27/Fc
separadas, formando dímeros según se analiza anteriormente.
El vector recombinante que contiene la secuencia
de Fc se digiere con BglII (que segmenta solo en el extremo
5’) y NotI (que segmenta el vector en el sitio de clonación
múltiple aguas abajo de inserto de cDNA de Fc). El fragmento que
codifica Fc (aproximadamente 720 pb de longitud) se aisló mediante
procedimientos convencionales usando electroforesis en gel de
agarosa LMT.
El fragmento NotI/BglII de DNA que
codifica CD27 y el fragmento de DNA BglII/NotI que
codifica Fc preparados anteriormente se ligaron en un vector de
expresión denominado pDC406 como sigue. El plásmido pDC406, que ha
sido descrito por McMahan y otros (EMBO J. 10:2821, 1991), es
un vector de expresión para el uso en células de mamífero, pero
también es replicable en células de E. coli.
pDC406 contiene orígenes de replicación
derivados de SV40, virus de Epstein-Barr y pBR322 es
un derivado de HAV-EO descrito por Dower y otros,
J. Immunol. 142:4314, 1989). pDC406 difiere de
HAV-EO por la deleción del intrón presente en la
secuencia líder tripartita de adenovirus 2 en
HAV-EO. pDC406 se digirió con NotI, que
segmenta el plásmido en un sitio de clonación múltiple justo 3’ del
sitio SalI y a continuación se trató con fosfatasa alcalina
intestinal de ternero (CIAP) para prevenir la autoligación.
La ligación tridireccional para enlazar los
fragmentos de DNA del vector, Fc y CD27 se efectuó bajo condiciones
convencionales y las células de E. coli se transformaron con
la mezcla de ligación. Se encontró que un plásmido del tamaño
deseado que se recuperaba de las células de E. coli
comprendía el inserto de fusión génico CD27/Fc, pero en la
orientación errónea para la expresión. La fusión génica CD27/Fc se
cortó de este plásmido recombinante mediante digestión con
NotI y se ligó a pDC406 digerido con NotI y tratado
con CIAP. Las células de E. coli se transformaron con la
mezcla de ligación. Un plásmido recombinante que contenía el
inserto en la orientación deseada se aisló. La secuencia de CD27 se
fusionó (en el mismo marco de lectura) a la secuencia de Fc aguas
abajo.
Las moléculas de fusión CD27/Fc preferiblemente
se sintetizan en cultivo celular de mamífero recombinante debido a
que generalmente son demasiado grandes y complejas para sintetizarse
mediante métodos de expresión procariótica. Ejemplos de células de
mamífero adecuadas para expresar una proteína de fusión receptor/Fc
incluyen células CV-1 (ATCC CCL 70) y células
COS-8 (ATCC CRL 1651), ambas derivadas de riñón de
mono.
El constructo de DNA pDC406/CD27/Fc se
transfectó en la línea celular de riñón de mono
CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478). En
células huésped de mamífero tales como
CV-1/EBNA-1, la proteína de fusión
CD27/Fc se expresa fuera del promotor de la región de
transactivación (TAR) de HIV. La línea celular
CV-1/EBNA-1 se derivó mediante
transfección de la línea celular CV-1 (ATCC CCL 70)
con un gen que codifica antígeno nuclear de virus de
Epstein-Barr 1 (EBNA-1) que expresa
constitutivamente EBNA-1 conducido desde el
potenciador/promotor intermedio-temprano de CMV
humano según se describe por McMahan y otros, anteriormente. El gen
de EBNA-1 permite la replicación episomática de
vectores de expresión, tales como pDC406, que contienen el origen de
replicación de
EBV.
EBV.
Células CV-1/EBNA transfectadas
con el vector pDC406/CD27/Fc se cultivaron en botellas giratorias
para permitir la expresión transitoria de la proteína de fusión,
que se secreta en el medio de cultivo a través del péptido de señal
de CD27. La proteína de fusión CD27/Fc se purificó mediante
cromatografía de afinidad. Brevemente, un litro de sobrenadante de
cultivo que contiene la proteína de fusión CD27/Fc se purificó
filtrando los sobrenadantes (por ejemplo, en un filtro de 0,45
\mu) y aplicando el filtrado a una columna de afinidad de proteína
G (Schleicher y Schuell, Keene, NH) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. La porción de Fc de la proteína de
fusión se une mediante la Proteína G a la columna. La proteína de
fusión unida se eluyó de la columna y la pureza se confirmó en un
gel de SDS teñido con plata.
Este ejemplo describe el rastreo de ciertas
líneas celulares con respecto a la capacidad para unirse a una
proteína de fusión CD27/Fc. El ensayo de rastreo usado era un método
en dos etapas que implicaba proteína de fusión CD27/Fc unida a
células, seguido por ^{125}I-anticuerpo anti-(Fc
humana) de ratón unido a la porción Fc de la proteína de fusión
CD27/Fc. Se consideraba que las líneas celulares que se encontraba
que eran capaces de unirse a CD27/Fc eran candidatos para el uso
como fuentes de ácido nucleico en el intento de clonar CD27L.
El anticuerpo anti-(Fc humana) de ratón se
obtuvo de Jackson Laboratories. Este anticuerpo mostraba unión
mínima a proteínas de Fc unidas al receptor Fc\gamma. El
anticuerpo se marcó usando el método de cloramina T. Brevemente, se
preparó una columna P6 de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. En un tubo de microcentrífuga, 10 \mug de anticuerpo
se disolvieron en 10 \mul de PBS. Se añadieron 2000 \muCi de Na
^{125}I libre de portador y la solución se mezcló bien. Se
añadieron a continuación 15 \mul de una solución recientemente
preparada de cloramina T (32 \mug/ml en tampón de fosfato sódico
0,05 M (pH 7,2)) y la mezcla se incubó durante 30 minutos a
temperatura ambiente. La mezcla se aplicó inmediatamente a la
columna P6. El anticuerpo radiomarcado se eluyó a continuación de
la columna recogiendo fracciones de 100-150 \mul
de eluato. Se añadieron medios de unión a las fracciones de los
picos para llevar el volumen total de cada fracción hasta 2 ml. La
radioyodación daba actividades específicas en el intervalo de
5-10 x 10^{15} cpm/mmol de proteína.
La línea celular MP-1 se generó
para el uso en el rastreo con respecto a la unión de CD27/Fc.
MP-1 es una línea celular linfoblastoide B
transformada con virus de Epstein-Barr (EBV)
espontánea desarrollada de células mononucleares de sangre
periférica derivadas de un donante normal. Después de dos semanas,
las células B proliferativas se sometieron a dos rondas de
clonación a 0,3 células por pocillo en medio RPMI complementado con
suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10%, 100 U/ml de
penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Las células
MP-1 se derivan de uno de tales clones.
La línea celular MP-1 se rastreó
con respecto a la unión de CD27/Fc mediante el siguiente
procedimiento. Aproximadamente 2 x 10^{6} células se cultivaron
en placas de 96 pocillos. Se añadieron a las células 5 ml de medio
de unión (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero
bovino (BSA), 2 mg/ml de azida sódica, Hepes 20 mM, pH 7,2) y las
células se incubaron a continuación en presencia o ausencia de
CD27/Fc durante 1 hora a 37ºC con agitación suave. Las células se
sedimentaron de la mezcla mediante la centrifugación de las placas
de 96 pocillos, se lavaron con PBS, se centrifugaron de nuevo y se
resuspendieron en medio de unión. Las células se inocularon a
continuación con el ^{125}I-anticuerpo anti-(Fc
humana) de ratón, preparado como se describe anteriormente, durante
1 hora a 37ºC. Las células también se incubaron con
^{125}I-anticuerpo anti-(Fc humana) de ratón en
presencia de anticuerpo anti-(Fc humana) sin marcar como un control
negativo. Después de 1 hora de incubación con el
^{125}I-anticuerpo, las células y el
^{125}I-anticuerpo no unido se separaron mediante
el método de separación con aceite de ftalato, esencialmente como se
describe por Dower y otros, J. Immunol. 132:751, 1984. El
^{125}I-anticuerpo unido a células y libre se
cuantificó en un contador Packard Autogamma. Las células
MP-1 poseían números significativos de CD27L unido a
la superficie celular, sugiriendo que las células
MP-1 pueden ser una fuente adecuada de mRNA para
clonar cDNA de
CD27L.
CD27L.
Este ejemplo describe la preparación de una
biblioteca de cDNA a partir de células B MP-1
humanas para la clonación por expresión de CD27L humano. La técnica
de construcción de la biblioteca era substancialmente similar a la
descrita por Ausubel y otros, eds., Current Protocols In
Molecular Biology, Vol. 1, (1987). En general, RNA total se
extrajo de cultivos de células MP-1 sometidas a
lisis con HCl de guanidina 8M usando precipitación diferencial con
etanol y el mRNA de poli(A)^{+} se aisló y se
enriqueció mediante cromatografía con
oligo-dT-celulosa.
Se elaboró cDNA de doble hebra a partir de una
plantilla de RNA substancialmente como se describe por Gubler y
otros, Gene 25:263, 1983. Los fragmentos de mRNA de
poli(A)^{+} se convirtieron en híbridos de
RNA-cDNA usando transcriptasa inversa cebada con
hexanucleótidos aleatorios. Los híbridos de RNA-cDNA
se convirtieron a continuación en fragmentos de cDNA de doble hebra
usando RNAasa H en combinación con DNA polimerasa I. El cDNA de
doble hebra resultante se cortó en extremos romos con DNA polimerasa
de T4.
Los siguientes adaptadores BglII sin
quinasa (es decir, desfosforilados)
Nº ID SEC:5:
5’-GATCTTGGAACGAGACGACCTGCT-3’
(24-mero)
Nº ID SEC:6:
3’-AACCTTGCTCTGCTGGACGA-5’
(20-mero)
se ligaron a extremos 5’ de los
dúplex de cDNA de extremos romos anteriores, usando el método de
clonación con adaptador descrito en Haymerle y otros, Nucleic
Acids Res. 14:8615, 1986. Bajo las condiciones descritas, solo
el oligonucleótido 24-mero (hebra superior) se unirá
covalentemente al cDNA durante la reacción de ligación. Los
adaptadores no unidos covalentemente (incluyendo el oligonucleótido
20-mero complementario descrito anteriormente y
cualesquiera adaptadores no ligados) se retiraron mediante
cromatografía de filtración en gel a 65ºC, dejando salientes no
autocomplementarios de 24 nucleótidos en los extremos de
cDNA.
El cDNA tratado con adaptador se insertó en
pDC303, un vector de expresión mamífero que también se replica en
E. coli. pDC303 se ensambló a partir de DNA de pDC201 (un
derivado de pMLSV, previamente descrito por Cosman y otros,
Nature 312: 768, 1984), SV40 y citomegaloviurs y comprende,
en secuencia con la dirección de transcripción desde el origen de
replicación, los siguientes componentes: (1) secuencias de SV40 de
las coordenadas 5171-270 que contienen el origen de
replicación, secuencias potenciadoras y promotores temprano y
tardío; (2) regiones promotora y potenciadora de citomegalovirus
(nucleótidos 671-63 de la secuencia publicada por
Boechart y otros (Cell 41:521, 1985); (3)
adenovirus-2 de las coordenadas
5779-6079 que contiene el primer exón de líder
tripartito (TPL), el segmento 7101-7172 y
9634-9693 que contiene el segundo exón y parte del
tercer exón del TPL y un sitio de clonación múltiple (MCS) que
contiene sitios para XhoI, KpnI, SmaI y BglI; (4) segmentos
de SV40 de las coordenadas 4127-4100 y
2770-2533 que contienen las señales de
poliadenilación y terminación para la transcripción temprana; (5)
secuencias de adenovirus-2 de las coordenadas
10532-11156 de los genes de RNA asociados a virus
VAI y VAII de pDC201; y (6) secuencias de pBR322 de las coordenadas
4363-2486 y 1094-375 que contienen
el gen de resistencia a ampicilina y el origen de replicación.
La biblioteca de cDNA de MP-1 en
pDC303 se introdujo en la cepa de E. coli DH10B mediante
electroporación. Los recombinantes se cultivaron en placa para
proporcionar aproximadamente 5.000 colonias por placa. Estos
recombinantes se reunieron para dar una gran reserva de
aproximadamente 500.000 recombinantes para el rastreo.
Partes alícuotas de esta gran reserva se
cultivaron en placa para dar fracciones reunidas de 1000 colonias.
DNA plasmídico se aisló de estas fracciones reunidas y se transfectó
en una capa subconfluente de células
CV-1/EBNA-1 usando
DEAE-dextrano seguido por tratamiento con
cloroquina, de forma similar a lo descrito por Luthman y otros,
Nucl. Acids Res. 11:1295 (1983) y McCutchan y otros, J. Natl.
Cancer Inst. 41:351 (1986). Las células
CV-1/EBNA-1 se derivaron como sigue.
La línea celular CV-1/EBNA-1 expresa
constitutivamente antígeno-1 nuclear de EBV
conducido desde el potenciador/promotor
intermedio-temprano de CMV. La línea celular de
riñón de mono verde africano, CCV-1 (ATCC CCL 70),
se cotransfectó con 5 \mug de pSV2gpt (Mulligan y Berg, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981) y 25 \mug de
pDC303/EBNA-1 usando una técnica de coprecipitación
con fosfato cálcico (Ausubel y otros, eds., Current Protocols in
Molecular Biology, Wiley, Nueva York, 1987).
pDC303/EBNA-1 se construyó a partir de pDC302
(Mosley y otros, Cell 59:335, 1989) en dos etapas. En primer
lugar, el intrón presente en la secuencia líder tripartita de
adenovirus se sometió a deleción reemplazando un fragmento PvuII a
ScaI que abarca el intrón por el siguiente par de oligonucleótidos
sintéticos para crear el plásmido pDC303:
Nº ID SEC:7
5’CTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGT-3’
Nº ID SEC:8
3’GACAACCCGAGCGCCAACTCCTGTTTGAGAAGCGCCAGAAAGGTCA-5’
En segundo lugar, un fragmento de restricción
HindIII-AhaII que codifica antígeno nuclear de virus
de Epsteni-Barr 1 (EBNA-1) y que
consiste esencialmente en las coordenadas de EBV 107.932 a 109.894
(Baer y otros, Nature 310:207, 1984) se insertó a
continuación en el sitio de clonación múltiple de pDC303 para crear
el plásmido pDC303/EBNA-1. Las células
transfectadas se hicieron crecer en presencia de hipoxantina,
aminopterina, timidina, xantina y ácido micofenólico de acuerdo con
métodos estándar (Ausubel y otros, anteriormente; Mulligan y Berg,
anteriormente) para seleccionar las células que habían incorporado
establemente los plásmidos transfectados. Las colonias resistentes
a fármacos resultantes se aislaron y se expandieron individualmente
en líneas celulares para el análisis. Las líneas celulares se
rastrearon con respecto a la expresión de EBNA-1
funcional. Se encontró usando este ensayo que una línea celular, el
clon 68, expresaba EBNA-1, y se denominó
CV-1/EBNA-1.
Para transfectar las células
CV-1/EBNA-1 con la biblioteca de
cDNA, las células se mantuvieron en medio completo (medio de Eagle
modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero de ternero fetal
(FCS) al 10% (v/v), 50 U/ml de penicilina, 50 U/ml de
estreptomicina, L-glutamina 2 mM) y se cultivaron en
placa a una densidad de 2 x 10^{5} células/pocillo en
portaobjetos de cámara de un solo pocillo (Lab-Tek).
Los portaobjetos se pretrataron con 1 ml de fibronectina humana (10
\mug/ml en PBS) durante 30 minutos seguido por un lavado con PBS.
El medio se retiró de la capa de células adherentes y se reemplazó
por 1,5 ml de medio completo que contiene sulfato de cloroquina
66,6 \muM. Se añadieron a continuación a las células 0,2 ml de
solución de DNA (2 \mug de DNA, 0,5 mg/ml de
DEAE-dextrano en medio completo que contiene
cloroquina) y se incubaron durante 5 horas. Después de la
incubación, el medio se retiró y las células se sometieron a choque
mediante la adición de medio completo que contenía DMSO al 10%
durante de 2,5 a 20 minutos, seguido por la substitución de la
solución por medio completo reciente. Las células se hicieron crecer
en cultivo para permitir la expresión transitoria de las secuencias
insertadas. Estas condiciones conducían a una frecuencia de
transfección de 80% en células
CV-1/EBNA-1 supervivientes.
Las células transfectadas se cultivaron durante
de dos a tres días en portaobjetos de vidrio con cámara
(Lab-Tek) para permitir la expresión transitoria de
las secuencias de DNA insertadas. Monocapas transfectadas de células
CV-1/EBNA-1 se ensayaron con
respecto a la expresión de CD27L uniéndose a
^{125}I-anticuerpo anti-(Fc humana) mediante
autorradiografía del portaobjetos según se describe
posteriormente.
Las células
CV-1/EBNA-1 transfectadas (adheridas
a los portaobjetos con cámara) se lavaron una vez con medio de
unión con leche desnatada en polvo (BM-NFDM) (medio
RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA),
2 mg/ml de azida sódica, HEPES 20 mM, pH 7,2, y 50 mg/ml de leche
desnatada en polvo). Las células se incubaron a continuación con
CD27/Fc en BM-NFDM (1 \mug/ml) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Después de la incubación, las monocapas
celulares en los portaobjetos con cámara se lavaron tres veces con
BM-NFDM para retirar proteína de fusión CD27/Fc no
unida y a continuación se incubaron con 40 ng/ml de
^{125}I-anticuerpo anti-(Fc humana) de ratón (una
dilución 1:50) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se
lavaron tres veces con BM-NFDM, seguido por 2
lavados con solución tamponada con fosfato (PBS) para retirar
^{125}I-anticuerpo anti-(Fc humana) de ratón no
unido. Las células se fijaron incubando durante 30 minutos a
temperatura ambiente en glutaraldehído al 2,5% en PBS, pH 7,3, se
lavaron dos veces en PBS y se secaron al aire. Los portaobjetos con
cámara que contenían las células se expusieron en un Phophorimager
durante la noche, a continuación se sumergieron en emulsión
fotográfica Kodak GTNB-2 (6 x dilución en agua) y se
expusieron en la oscuridad durante 3-5 días a 4ºC
en una caja a prueba de luz. Los portaobjetos se revelaron a
continuación durante aproximadamente 4 minutos en revelador Kodak
D19 (40 g/500 ml de agua), se enjuagaron en agua y se fijaron en
fijador Agfa G433C. Los portaobjetos se examinaron individualmente
con un microscopio con 25-40 aumentos y las células
positivas que expresaban CD27L se identificaron mediante la
presencia de granos de plata autorradiográficos frente a un fondo
claro.
Usando el sistema de autorradiografía del
portaobjetos, aproximadamente 50.000 cDNAs se rastrearon en
fracciones reunidas de aproximadamente 1.000 cDNAs hasta que el
ensayo de una fracción reunida de transfectantes mostraba múltiples
células claramente positivas con respecto a la unión a CD27/Fc. Esta
fracción reunida se sometió a reparto a continuación en fracciones
de 300 y de nuevo se rastreó mediante autorradiografía del
portaobjetos y se identificó una fracción reunida positiva.
Colonias individuales de esta fracción reunida de 300 se rastrearon
hasta que se identificaba un solo clon (clon Nº 60) que dirigía la
síntesis de una proteína superficial con actividad de unión a
CD27/Fc detectable. Este clon se aisló y su inserto se sometió a
secuenciación para determinar la secuencia del clon 60 de cDNA de
CD27L humano.
El vector de expresión de mamífero pDC304 que
contenía CD27L humano (denominado pDC304/HuCD27L) se depositó en
the American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) el
18 de agosto de 1992 y se le asignó el número de registro ATCC
69052. El depósito se realizó bajo los términos del Tratado de
Budapest. El Listado de Secuencias adjunto indica las secuencias de
nucleótidos (Nº ID SEC: 1) y de aminoácidos predicha del clon 60
(Nº ID SEC: 1 y Nº ID SEC: 2) y aparece información asociada al
final de la memoria descriptiva inmediatamente antes de las
reivindicaciones.
El análisis de la secuencia del clon resultante
revelaba un inserto de 813 pb con un solo marco de lectura abierto
largo capaz de codificar una proteína de 193 aminoácidos (Nº ID SEC:
1). Los 20 aminoácidos aminoterminales estaban seguidos por 18
aminoácidos hidrófobos que presumiblemente funcionan como un anclaje
de transmembrana. Esta falta de una secuencia de señal, la
presencia de un dominio hidrófobo interno y la presencia de dos
sitios de glicosilación conectados con N potenciales en el dominio
C-terminal (en los aminoácidos Asn^{63} y
Asn^{170}) sugerían que CD27L es una proteína de transmembrana
tipo II, que tiene un dominio carboxiterminal extracelular.
El clon de cDNA aislado contenía solo 37
nucleótidos aguas arriba del codón de iniciación supuesto (Nº ID
SEC: 1) sin codones de terminación en el marco. Además, la secuencia
alrededor de este sitio de iniciación no está de acuerdo con el
consenso para tales sitios descrito según se predice por Kozak,
Nucl. Acids. Res. 12:857 (1984). Así, se llevó a cabo
una reacción de "PCR anclada" de acuerdo con Carrier y otros,
Gene 116:173 (1992) para clonar el extremo 5’ del transcrito
de CD27L para asegurar que no había un sitio de iniciación aguas
arriba. Esto daba como resultado la identificación de 113
nucleótidos adicionales que precedían al extremo del clon aislado
(Nº ID SEC: 1). No se encontraron sitios de iniciación aguas arriba
del que se identificaba previamente.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales para CD27L. CD27L se expresa en células
huésped de mamífero tales como células COS-7 o
CV-1/EBNA-1 y se purifica usando
cromatografía de afinidad a CD27/Fc. Puede usarse CD27L purificado
para generar anticuerpos monoclonales contra CD27L usando técnicas
convencionales, por ejemplo, las técnicas descritas en la Patente
de EE.UU. 4.411.993. Brevemente, se inmunizan ratones con CD27L
como un inmunógeno emulsificado en adyuvante completo de Freund y se
inyectan en cantidades que varían de 10-100 \mug
subcutáneamente o intraperitonealmente. De diez a doce días más
tarde, los animales inmunizados son reforzados con CD27L adicional
emulsificado en adyuvante incompleto de Freund. Los ratones son
reforzados periódicamente posteriormente con un esquema de
inmunización de semanal a bisemanal. Se toman periódicamente
muestras de suero mediante sangrado retroorbital o escisión de la
punta de la cola para probar mediante ensayo de transferencia por
gotas o ELISA (Ensayo de Inmunoabsorción con Enzimas Ligadas), con
respecto a anticuerpos para CD27L.
Después de la detección de una concentración de
anticuerpo apropiada, a los animales positivos se les proporciona
una última inyección intravenosa de CD27L en solución salina. De
tres a cuatro días más tarde, los animales son sacrificados, las
células del bazo se recogen y las células del bazo se fusionan a una
línea celular de mieloma múrido (por ejemplo, NS 1 o Ag 8.653). Las
fusiones generan células de hibridoma, que se cultivan en placa en
placas de microvaloración múltiples en un medio selectivo para HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la
proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e
híbridos de células del bazo.
Las células de hibridoma se rastrean mediante
ELISA con respecto a la reactividad frente a CD27L purificado
mediante adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall y otros,
Immunochem. 8:871, 1971 y en la Patente de EE.UU. 4.703.004.
Células de hibridoma positivas pueden inyectarse
intraperitonealmente en ratones BALB/c singeneicos para producir
ascitis que contiene altas concentraciones de anticuerpos
monoclonales anti-CD27L. Alternativamente, las
células de hibridoma pueden hacerse crecer in vitro en matraces o
botellas giratorias mediante diversas técnicas. Los anticuerpos
monoclonales producidos en ascitis de ratón pueden purificarse
mediante precipitación con sulfato amónico, seguido por
cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, también puede
usarse cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a
proteína A o proteína G, como también cromatografía de afinidad
basada en la unión a CD27L.
Para comparar la unión de CD27 al CD27L natural
expresado en células MP-1 con la del CD27L clonado
expresado en células CV-1/EBNA transfectadas, se
previó un ensayo de unión indirecta modificado usando la CD27/Fc y
los ^{125}I-anticuerpos anti-(IgG humana) de ratón
descritos en el Ejemplo 2. Esto era necesario debido a que el
radiomarcaje directo de CD27/Fc daba como resultado su inactivación.
Las células MP-1 se expusieron a concentraciones
variables de CD27/Fc, seguido por una concentración saturante
constante de ^{125}I-anticuerpo contra la porción
Fc de la molécula, como sigue.
Los ensayos de unión para células
MP-1 se efectuaron haciendo crecer células en
cultivo en suspensión en placas de cultivo de 96 pocillos.
Brevemente, células MP-1 (2 x 10^{6}
células/pocillo) se incubaron en presencia o ausencia de diversas
concentraciones de CD27/Fc en medio de unión (medo RMPI 1640,
albúmina de suero bovino al 1%, azida sódica al 0,2% y Hepes 20 mM,
pH 7,2) durante 1 hora a 37ºC. Las células se lavaron a continuación
una vez con PBS y se incubaron con
^{125}I-anti-(IgG humana) de ratón (40 mg/ml) en
medio de unión con agitación suave durante 1 hora a 37ºC. Las
células y el ^{125}I-anticuerpo no unido se
separaron mediante el método de separación con aceite de ftalato,
esencialmente como se describe por Dower y otros, J. Immunol.
132:751 (1984).
Monocapas de células CV-1/EBNA
(2,5 x 10^{5} células por pocillo) transfectadas con las
fracciones reunidas de cDNA de MP-1 se ensayaron
con respecto a la expresión de CD27L después de dos días usando la
unión a anti-(IgG humana) de ratón y autorradiografía de
portaobjetos. Las monocapas de células transfectadas se lavaron con
medio de unión que contenía leche desnatada en polvo (50 mg/ml;
BM-NFDM), y a continuación se incubaron con CD27/Fc
en BM-NFDM (1 \mug/ml) durante una hora a
temperatura ambiente. Las células se lavaron a continuación tres
veces con BM-NFDM y se incubaron con 40 mg/ml de
^{125}I-anti-(IgG humana) de ratón en
BM-NFDM durante una hora. Las células se lavaron
dos veces con BM-NFDM, tres veces con PBS y se
fijaron en PBS que contenía glutaraldehído al 2,5% durante 30
minutos, se lavaron dos veces más con PBS y se secaron al aire. Los
portaobjetos de cámara se sumergieron a continuación en emulsión
fotográfica Kodak GTNB-2 y se expusieron durante 3
días a temperatura ambiente antes de revelar.
Para ensayos de unión sobre el CD27L clonado,
células CV-1/EBNA adherentes se transfectaron con el
plásmido de expresión de CD27L en placas de 12 pocillos (2,5 x
10^{5} células/pocillo) como anteriormente. Dos días más tarde
las células se lavaron con BM-NFDM y se incubaron
con diversas concentraciones de CD27/Fc. Subsiguientemente, las
células se lavaron, se incubaron con
^{125}I-anticuerpo anti-(IgG humana) de ratón
según se describe previamente y se recogieron mediante
tripsinización. En todos los ensayos, la unión no específica de
^{125}I-anticuerpo se ensayó en ausencia de
CD27/Fc así como en presencia de CD27/Fc y un exceso molar de 200
veces de anticuerpo no marcado.
^{125}I-anticuerpo libre y unido a células se
cuantificó en un Packard Autogamma Counter. Los cálculos de
afinidad se generaron en RS/1 (BBN Software, Boston, MA) ejecutado
en un ordenador Microvax.
Cuando los datos de unión a MP-1
se representaban de nuevo en el sistema de coordenadas de Scatchard,
se generaba una curva bifásica que indicaba componentes de unión
tanto de alta como de baja afinidad. El CD27L expresado en células
MP-1 tenía valores de Ka de 1,58 x 10^{9} M^{-1}
y 1,83 x 10^{8} M^{-1}, con 250 y 560 sitios por célula,
respectivamente. De forma similar, el CD27L clonado expresado en
células CV-1/EBNA demostraba componentes de unión
de afinidad tanto alta como baja. Las constantes de afinidad
generadas a partir de análisis de Scatchard, 2,7 x 10^{9}
M^{-1} y 1,2 x 10^{8} M^{-1}, se adaptan bien a las observadas
para la unión de CD27/Fc al ligando natural expresado en células
MP-1. Globalmente, la expresión del ligando se
potenciaba en células CV-1/EBNA con 12.017 sitios
de unión de alta afinidad y 68.560 de baja afinidad por célula
detectada.
Se analizó proteína de CD27L natural y
recombinante mediante SDS-PAGE bajo condiciones
reductoras como sigue. Las células se marcaron superficialmente con
^{125}I según se describe previamente por Urdal y otros, (J.
Biol. Chem. 263:2870 (1988). Las proteínas de la membrana se
solubilizaron con detergente en presencia de inhibidores de
proteasa incluyendo yodoacetamida 100 mM. Se aisló CD27L mediante
unión a CD27/Fc y proteína G-Sepharose (Armitage y
otros, Nature 357:80, (1992). Para eliminar la unión de
CD27/Fc a receptores de Fc, los lisados de detergente se
preclarificaron con 50 \mug/ml de IgG humana y sueros de conejo y
cabra al 5%. Las muestras se resuspendieron en tampón que contenía
urea 4 M y 2-mercaptoetanol al 5% y se sometieron a
electroforesis a través de geles de poliacrilamida en presencia de
SDS (NOVEX) con un gradiente de 4-20%.
Las especies proteínicas predominantes
observadas en células CV-1/EBNA que expresan tanto
MP-1 como CD27L tenían un M_{r} aparente de
\sim50.000. La comparación con el M_{r} calculado (21.146) del
CD27L no modificado sugiere que se usan los sitios de glicosilación
conectados con N en el dominio extracelular. Los precipitados de
ambas células también demostraban una especie proteínica secundaria
de aproximadamente 20.000 que no se encontraba en células
CV-1/EBNA de control. Esta podía ser bien CD27L no
modificado o bien el producto de la degradación proteínica. También
se observó una especie proteínica de \sim200 kDa que se precipita
específicamente usando CD27/Fc.
La capacidad de CD27L para estimular la
proliferación de células T de sangre periférica humana se mostró
usando el siguiente ensayo de proliferación. Células T de sangre
periférica humana se purificaron de PBMC reajustando con SRBC
tratadas con hidrobromuro de bromuro de
2-aminoetilisotiouronio. Después de la lisis
hipotónica de SRBC, los monocitos se ajustaron mediante adherencia
a plástico durante 1 h a 37ºC. Células T CD4^{+} y CD8^{+} se
purificaron mediante agotamiento negativo de células CD8^{+} o
CD4^{+}, respectivamente, usando clasificación magnética de
células de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec,
Sunnyvale, CA). Las células clasificadas eran habitualmente >95%
puras, según se determinaba mediante citometría de flujo. Las
células T se cultivaron en placas de 96 pocillos a 10^{5} células
por pocillo por triplicado durante 3 días en presencia de una
concentración subóptima de fitohemaglutinina (0,1% v/v). También
estaban presentes en los cultivos células CV-1/EBNA
que se fijaban a los 2 días después de la transfección con
paraformaldehído al 1% durante 5 minutos a 25ºC. Los pocillos se
sometieron a impulsos con 1 \muCi de timidina tritiada durante
las 8 horas finales de cultivo y se determinó la incorporación de
c.p.m. Un antisuero de IL-2 neutralizador,
preparado en un conejo, se usó para bloquear la bioactividad de
IL-2 con una dilución de 1:500, según se describió
previamente por Alderson y otros, J. Exp. Med. 172:577
(1990).
La adición de células CV-1/EBNA
que expresan CD27L a células T en presencia de una concentración
subóptima de fitohemaglutinina (PHA) daba como resultado una
incorporación de timidina mejorada, mientras que la adición de
células CV-1/EBNA de control transfectadas con
vector vacío no tenía efecto. Tan pocas como 100 células
CV-1/EBNA que expresan CD27L eran suficientes para
mejorar significativamente la proliferación en cultivos
establecidos con 1 x 10^{5} células T. En contraste, en ausencia
de coestimulación, CD27L no tenía efectos sobre la proliferación de
células T.
Usando cuentas magnéticas para aislar
subplobaciones de células T, se determinó que CD27L coestimulaba la
proliferación de células T tanto CD4^{+} como CD8^{+}. Además,
la inducción de la proliferación de células T CD4^{+} y CD8^{+}
por CD27L estaba inalterada por la presencia de un antisuero
neutralizador para IL-2, implicando que bajo estas
condiciones de cultivo la proliferación de células T mediada por
CD27L es independiente de IL-2. Así, CD27L bien
aporta una señal proliferativa directa a al menos algunas células T
o bien, alternativamente, esas citoquinas distintas a
IL-2 pueden contribuir a la respuesta.
Para caracterizar adicionalmente el efecto de
CD27L sobre células T, se determinó su capacidad para afectar a la
generación in vitro de células citolíticas en presencia o
ausencia de lectina. Las condiciones de cultivo para medir la
actividad citolítica eran como las descritas posteriormente para
ensayos de proliferación, excepto que las células T se cultivaban
durante 4 días en placas de 24 pocillos a 10^{6} células por
pocillo usando una concentración fija (10^{5}) de células
CV-1/EBNA. Se usó un ensayo de liberación de
^{51}Cr de 4 h para determinar la actividad citolítica de células
cultivadas según se describe previamente (Alderson y otros, J.
Exp. Med. 172:577 (1990). Brevemente, células cultivadas se
lavaron en medio de cultivo y fracciones de cultivo duplicadas se
diluyeron en serie en placas de fondo en V de 96 pocillos. Como una
célula diana, se usó la línea celular de tumor múrido P815 en
presencia de PHA (0,6% v/v) para revelar células líticas
independientemente de su especificidad. Una unidad lítica (LU) se
definió como la fracción del cultivo inicial que da lugar a 50% de
lisis de las células diana.
CD27L no tenía efecto estimulante sobre la
actividad citolítica en ausencia de coestimulación, según se
detectaba en un ensayo de citotoxicidad mediado por lectina. Sin
embargo, la incubación de células T purificadas con CD27L en
presencia de PHA subóptima daba como resultado la generación
mejorada de células citolíticas en comparación con células
cultivadas con PHA sola o PHA más células CV-1/EBNA
de control. La actividad lítica inducida por CD27L sobre células T
coestimuladas con PHA en este ensayo era comparable a la inducida
por IL-2 (1100 y 800 unidades líticas (LU) por
cultivo, respectivamente) y era más de diez veces mayor que la
observada con células incubadas en presencia de PHA sola (61 LU) o
PHA más células CV-1/EBNA de control (50 LU). El
efecto de CD27L sobre la generación de células citolíticas también
era evidente sobre una base por células efectoras (780 LU para
10^{6} células para CD27L + PHA en comparación con 71 LU para
10^{6} células para células CV-1/EBNA de control
+ PHA), implicando que además de apoyar la proliferación de células
T, CD27L mejora la diferenciación de precursores de células T
citolíticas.
Se construyó un DNA de CD27-L
para expresar una proteína de fusión de CD27-L
oligómera soluble denominada sCD27L-3. El
constructo que codifica sCD27L-3 (mostrado en el Nº
ID SEC: 9 y el Nº ID SEC: 10) contiene una secuencia líder (que
comprende los aminoácidos -24 a -1), una secuencia de 37 aminoácidos
que comprende un dominio de cremallera de leucina (que comprende
los aminoácidos 3-35) y la región extracelular de
CD27-L humano (que comprende los aminoácidos
39-193). Los nucleótidos que codifican los
aminoácidos 1-2 y 36-38 eran
residuos no funcionales de sitios de restricción. El constructo se
preparó usando métodos que son bien conocidos en la técnica para
obtener un DNA que codifica la región extracelular de
CD27-L. Brevemente, la región extracelular de
CD27-L se amplificó a partir de un cDNA de
CD27-L de longitud completa usando PCR. Los
cebadores usados se derivaron de la región extracelular de
CD27-L (Nº ID SEC: 1, nucleótidos
222-245, para el cebador 5’, y el complemento de
nucleótidos 663-689 para el cebador 3’) con adición
de secuencias que codifican sitios de enzimas de restricción
deseados (ACTAGT, que contiene un sitio Spe I, para el
cebador 5’, y GCGGCCGC, que contiene un sitio Not I, para el
cebador 3’). El producto de PCR amplificado, que representa el
dominio extracelular de CD27-L, se clonó en un
vector SMAG (pDC206) cortado con Spe I/Not I. El
vector SMAG es un derivado de pDC201 (Sims y otros, Science
241:585, 1988) que contiene la secuencia líder de
IL-7 múrida. El vector se amplificó, a continuación
se cortó con Spe I y se trató con fosfatasa alcalina
intestinal de ternero. La secuencia de nucleótidos que comprende la
región de cremallera de leucina se sintetizó ligando múltiples
oligonucleótidos derivados de la secuencia de aminoácidos conocida
de la cremallera de leucina usando metodología estándar, y a
continuación ligando con el vector SMAG cortado con Spe I,
para formar un vector de expresión que comprende una secuencia
líder de IL-7 múrida (Namen y otros, Nature
333:571; 1988), un dominio de cremallera de leucina y el
dominio extracelular de CD27-L. El vector de
expresión se denominó pDC206/sCD27L-3.
pDC206/sCD27L-3 se cotransfectó
en la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA (ATCC
CRL 10478) junto con un plásmido pSV4Neo. pSV3Neo (Mulligan y Berg,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2072; 1981) es un plásmido
que expresa el antígeno T de SV40, y así permite la replicación
episomáica del plásmido pDC206.
Una vez que se identifican las células que
expresan el constructo de fusión, cultivos a gran escala de células
transfectadas se hacen crecer para acumular sobrenadante a partir de
células que expresan la proteína de fusión de
CD27-L oligómera soluble (denominada
sCD27L-3). sCD27L-3 en fluido
sobrenadante se purifica mediante purificación por afinidad
substancialmente como se describe en la Patente de EE.UU. 5.011.912.
sCD27L-3 también puede purificarse usando otros
métodos de purificación de proteínas, según se describe aquí. Geles
de SDS teñidos con plata de la proteína de fusión de
CD27-L oligómera soluble pueden prepararse para
determinar la pureza. sCD27L-3 se une a CD27
soluble e inhibe la unión de CD27 soluble a células que expresan
CD27-L, según se describe en el Ejemplo 10.
Este ejemplo ilustra una actividad biológica de
sCD27L-3. Una forma soluble del antígeno CD27 de la
superficie de linfocitos humanos se preparó substancialmente como
se describe por Fanslow y otros, J. Immunol. 149:65 (1992),
para formar un constructo de fusión de Fc dímero denominado CD27/Fc.
CD27/Fc comprende la región extracelular de CD27 y una región Fc de
una IgG_{1} humana. sCD27L-3 inhibe la unión de
CD27/Fc a células MP-1, una línea de células B
transformada con virus de Epstein-Barr humana que
expresa CD27-L endógeno.
Fluido sobrenadante acondicionado procedente de
células CV-1/EBNA transfectadas con
pDC206/sCD27L-3 se valoró en una placa de 96
pocillos. Una cantidad constante de CD27/Fc (1 \mug/pocillo) se
añadió a cada pocillo, seguido por 1-2 x 10^{6}
células MP-1 por pocillo, en medio de unión
(RPMI-1640 que contiene albúmina de suero bovino al
1%, azida sódica al 0,2% y Hepes 20 mM, pH 7,2). La placa se incubó
a 37ºC durante 1 horas. Las células se lavaron dos veces con PBS, a
continuación se formaron como pellas mediante centrifugación. Se
añadió ^{125}I-(anti-Fc de IgG humana) de ratón a
cada pocillo a una concentración constante y la placa se incubó
durante 1 hora adicional a 37ºC. El
^{125}I-anti-(Fc de IgG humana) de ratón se unía a
la CD27/Fc que se unía a las células MP-1. Después
de la incubación final, las células se recogieron sobre tubos que
contienen aceite de ftalato para separar el
^{125}I-anti-(Fc de IgG humana) de ratón y la
cantidad de radiactividad se cuantificó usando un contador
gamma.
sCD27L-3 exhibía una inhibición
dependiente de la dosis de la unión de CD27/Fc a células
MP-1. Comparando la concentración a la que la
inhibición de la unión de CD27/Fc está a 50% con respecto a la
valoración de la inhibición por sCD27L-3, se
estimaba que la concentración de sCD27L-3 en el
medio acondicionado estaba entre 18 y 40 \mug/ml. Realizando esta
comparación, se estimó que el PM de sCD27L-3 era 135
Kd (el PM estimado de la región extracelular de
CD27-L era 45 Kd, multiplicado por tres para la
formación de trímero), y se supuso que la unión de
sCD27L-3 a CD27/Fc se producía con una relación
molar. Se estimó que la K_{i} era 10 veces la K_{a}, que era 3
x 10^{-7} M^{-1}, y se supuso que la concentración final era 1 x
10^{-8} M. Los resultados demostraban que la suposición inicial
de una concentración de 1 x 10^{-8} M era aproximadamente 10
veces demasiado baja, y una dilución 1:3 del fluido sobrenadante
daba realmente una concentración estimada de 1 x 10^{-7} M.
<110> Immunex Corporation
\vskip0.400000\baselineskip
<120> LIGANDO DE CD27
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P18581EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP93920446.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1993-09-01
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US07/941,648
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1992-09-08
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US08/106,507
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1993-08-13
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 926
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (151)..(729)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (151)..(732)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagcggccg cctgggcagg gaccatg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgaccggtg gggtttctag ggacctcggg tctagagcg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcttggaa cgagacgacc tgct
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccttgctc tgctggacga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgttgggct cgcggttgag gacaaactct tcgcggtctt tccagt
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacaacccga gcgccaactc ctgtttgaga agcgccagaa aggtca
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 689
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: trímero del ligando de CD27
(CD27L-3)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(689)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido de señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(110)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (111)..(686)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: trímero del ligando de CD27
(CD27L-3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (16)
1. Una secuencia de DNA aislada que codifica un
polipéptido de CD27L biológicamente activo que comprende la
secuencia de aminoácidos 1-193 del Nº ID SEC: 1 o
una de sus formas truncadas que retiene la propiedad de unión a
CD27.
2. Una secuencia de DNA aislada que codifica un
polipéptido de CD27L soluble biológicamente activo que comprende la
secuencia de aminoácidos 39-193 del Nº ID SEC: 1 o
una de sus formas truncadas que retiene la propiedad de unión a
CD27.
3. Una secuencia de DNA aislada, en donde la
secuencia de DNA se selecciona del grupo que consiste en:
- (a)
- cDNA que comprende la secuencia de nucleótidos 268-729 del Nº ID SEC: 1;
- (b)
- una secuencia de DNA que es un complemento de un DNA que se hibrida al cDNA de (a) bajo condiciones de restricción severa, en donde el DNA complementario codifica un CD27L biológicamente activo capaz de unirse a CD27 y bien estimular la proliferación de células T o bien potenciar la diferenciación de precursores de células T citolíticas; y
- (c)
- una secuencia de DNA que está degenerada como resultado del código genético con respecto a una secuencia de DNA de (a) o (b), y que codifica un CD27L biológicamente activo capaz de unirse a CD27 y bien estimular la proliferación de células T o bien potenciar la diferenciación de precursores de células T citolíticas.
4. Un vector de expresión que comprende una
secuencia de DNA de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
5. Una célula huésped transformada o
transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 4.
6. Un procedimiento para preparar un polipéptido
de CD27L, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con
la reivindicación 5 bajo condiciones que promueven la expresión de
CD27L, y recuperar el polipéptido de CD27L del cultivo.
7. Un polipéptido de CD27L codificado por una
secuencia como la indicada en una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3.
8. Un polipéptido de CD27L que es al menos 80%
idéntico a un polipéptido como el indicado en la reivindicación
7.
9. Un polipéptido de CD27L que es al menos 90%
idéntico a un polipéptido como el indicado en la reivindicación
7.
10. Un polipéptido de CD27L de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dicho polipéptido
es un polipéptido soluble.
11. Un polipéptido de CD27L de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que es homogéneo.
12. Un polipéptido de CD27L de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que dicho CD27L es
CD27L humano.
13. Un polipéptido de CD27L de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, que está purificado.
14. Un polipéptido de CD27L de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el que el polipéptido
de CD27L es un polipéptido de CD27L oligómero que comprende dos o
más polipéptidos de CD27L fusionados entre sí.
15. Un anticuerpo inmunorreactivo con CD27L de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
7-13 o uno de sus fragmentos antigénicos.
16. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 15, que es un anticuerpo monoclonal.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US94164892A | 1992-09-08 | 1992-09-08 | |
| US941648 | 1992-09-08 | ||
| US08/106,507 US5573924A (en) | 1992-09-08 | 1993-08-13 | CD27 ligand |
| US106507 | 1993-08-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2281896T3 true ES2281896T3 (es) | 2007-10-01 |
Family
ID=26803747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES93920446T Expired - Lifetime ES2281896T3 (es) | 1992-09-08 | 1993-09-01 | Ligando de cd27. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5573924A (es) |
| EP (1) | EP0662077B1 (es) |
| JP (1) | JP3559281B2 (es) |
| AT (1) | ATE353906T1 (es) |
| AU (1) | AU5099293A (es) |
| CA (1) | CA2144056C (es) |
| DE (1) | DE69334111T2 (es) |
| ES (1) | ES2281896T3 (es) |
| WO (1) | WO1994005691A1 (es) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7405270B2 (en) * | 1991-10-25 | 2008-07-29 | Immunex Corporation | CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation |
| US5573924A (en) | 1992-09-08 | 1996-11-12 | Immunex Corporation | CD27 ligand |
| US6599719B2 (en) | 1994-11-07 | 2003-07-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acid molecules encoding tumor necrosis factor-gamma-alpha |
| US6824767B2 (en) | 1994-11-07 | 2004-11-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Tumor necrosis factor-gamma |
| US5994503A (en) * | 1995-03-27 | 1999-11-30 | Yale University | Nucleotide and protein sequences of lats genes and methods based thereon |
| US7070771B1 (en) | 1996-12-09 | 2006-07-04 | Regents Of The University Of California | Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells |
| US6010853A (en) * | 1997-05-29 | 2000-01-04 | Dana-Farber Cancer Institute | Siva genes, novel genes involved in CD27-mediated apoptosis |
| US6307024B1 (en) * | 1999-03-09 | 2001-10-23 | Zymogenetics, Inc. | Cytokine zalpha11 Ligand |
| US7034132B2 (en) | 2001-06-04 | 2006-04-25 | Anderson David W | Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use |
| WO2003009862A1 (en) * | 2001-07-20 | 2003-02-06 | Genset S.A. | Agonists and antagonists of modumet for use in the treatment of metabolic disorders |
| US7261892B2 (en) * | 2001-11-27 | 2007-08-28 | Celltech R&D Limited | Methods for diagnosis and treatment of epithelial-derived cancers |
| AU2002343109B2 (en) * | 2001-11-27 | 2008-06-12 | Ucb Pharma S.A. | Methods for diagnosis and treatment of epithelial-derived cancers, such as colorectal cancers and kidney cancers |
| US7786282B2 (en) * | 2001-12-06 | 2010-08-31 | The Regents Of The University Of California | Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain |
| CA2472049A1 (en) * | 2002-01-04 | 2003-07-17 | Xencor | Dominant negative proteins and methods thereof |
| US20040170602A1 (en) * | 2002-01-04 | 2004-09-02 | Desjarlais John R. | Dominant negative proteins and methods thereof |
| SG108837A1 (en) * | 2002-03-11 | 2005-02-28 | Pi Eta Consulting Co Pte Ltd | An enterprise knowledge and information acquisition, management and communications system with intelligent user interfaces |
| US20040223966A1 (en) * | 2002-10-25 | 2004-11-11 | Wolfman Neil M. | ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor |
| US20080025989A1 (en) * | 2003-02-20 | 2008-01-31 | Seattle Genetics, Inc. | Anti-cd70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of cancer and immune disorders |
| DE602004027888D1 (de) | 2003-02-20 | 2010-08-12 | Seattle Genetics Inc | Anti-cd70 antikörper-arzneimittelkonjugate und ihr |
| US20050282168A1 (en) * | 2003-09-29 | 2005-12-22 | Wyeth | Cell surface molecules as markers and therapeutic agents against kidney cancers |
| US7641903B2 (en) * | 2004-10-15 | 2010-01-05 | Seattle Genetics, Inc. | Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders |
| US8337838B2 (en) * | 2004-10-15 | 2012-12-25 | Seattle Genetics, Inc. | Anti-CD70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders |
| WO2006044643A2 (en) * | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Seattle Genetics, Inc. | Anti-cd70 antibody and its use for the treatment and prevention of cancer and immune disorders |
| CA2605507C (en) | 2005-04-19 | 2016-06-28 | Seattle Genetics, Inc. | Humanized anti-cd70 binding agents and uses thereof |
| CA2623236A1 (en) * | 2005-09-26 | 2007-04-05 | Medarex, Inc. | Human monoclonal antibodies to cd70 |
| NZ578354A (en) * | 2006-12-14 | 2012-01-12 | Medarex Inc | Antibody-partner molecule conjugates that bind cd70 and uses thereof |
| EP2090320A1 (en) | 2008-02-15 | 2009-08-19 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Ligands of the Natural Killer (NK) cell surface marker CD27 and therapeutic uses thereof |
| CA2975228C (en) | 2008-05-02 | 2020-07-21 | Seattle Genetics, Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
| PT2310509E (pt) * | 2008-07-21 | 2015-05-19 | Apogenix Gmbh | Moléculas de tnfsf em cadeia simples |
| EP4190149A1 (en) | 2009-12-25 | 2023-06-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for searching and screening for target of anti-cancer agent using non-human animal model having nog established cancer cell line transplanted therein |
| WO2012046797A1 (ja) | 2010-10-06 | 2012-04-12 | ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド | 癌幹細胞集団及びその作製方法 |
| US9765148B2 (en) | 2011-03-16 | 2017-09-19 | Argen-X N.V. | Antibodies to CD70 |
| WO2013035824A1 (ja) | 2011-09-07 | 2013-03-14 | ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド | 癌幹細胞の分離 |
| KR102007055B1 (ko) | 2011-09-22 | 2019-08-02 | 암젠 인크 | Cd27l 항원 결합 단백질 |
| EP2772268B8 (en) | 2011-10-28 | 2020-01-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cancer stem cell-specific molecule |
| BR112014022812A2 (pt) | 2012-03-15 | 2017-07-18 | Janssen Biotech Inc | anticorpos anti-cd27 humanos, métodos e usos |
| US10391168B1 (en) | 2014-08-22 | 2019-08-27 | University Of Bern | Anti-CD70 combination therapy |
| WO2017058850A1 (en) | 2015-09-28 | 2017-04-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Chimeric antigen receptor (car) t cells as therapeutic interventions for auto- and allo-immunity |
| EP3364995B1 (en) * | 2015-10-23 | 2021-08-04 | Apogenix AG | Single-chain cd27-receptor agonist proteins |
| GB201800649D0 (en) | 2018-01-16 | 2018-02-28 | Argenx Bvba | CD70 Combination Therapy |
| TW202038958A (zh) | 2018-12-18 | 2020-11-01 | 比利時商阿根思公司 | Ｃｄ７０組合治療 |
| TW202138388A (zh) | 2019-12-30 | 2021-10-16 | 美商西根公司 | 以非海藻糖苷化抗－ｃｄ７０抗體治療癌症之方法 |
| JPWO2022196719A1 (es) | 2021-03-17 | 2022-09-22 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US5573924A (en) | 1992-09-08 | 1996-11-12 | Immunex Corporation | CD27 ligand |
| PT672141E (pt) * | 1992-10-23 | 2003-09-30 | Immunex Corp | Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis |
-
1993
- 1993-08-13 US US08/106,507 patent/US5573924A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-01 AU AU50992/93A patent/AU5099293A/en not_active Abandoned
- 1993-09-01 JP JP50741194A patent/JP3559281B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-01 DE DE69334111T patent/DE69334111T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-01 ES ES93920446T patent/ES2281896T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-01 AT AT93920446T patent/ATE353906T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-09-01 CA CA2144056A patent/CA2144056C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-01 WO PCT/US1993/008223 patent/WO1994005691A1/en active IP Right Grant
- 1993-09-01 EP EP93920446A patent/EP0662077B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2144056C (en) | 2010-04-13 |
| AU5099293A (en) | 1994-03-29 |
| JP3559281B2 (ja) | 2004-08-25 |
| EP0662077B1 (en) | 2007-02-14 |
| ATE353906T1 (de) | 2007-03-15 |
| EP0662077A1 (en) | 1995-07-12 |
| DE69334111D1 (en) | 2007-03-29 |
| EP0662077A4 (en) | 1997-01-08 |
| JPH08500976A (ja) | 1996-02-06 |
| CA2144056A1 (en) | 1994-03-17 |
| WO1994005691A1 (en) | 1994-03-17 |
| DE69334111T2 (de) | 2007-11-22 |
| US5573924A (en) | 1996-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2281896T3 (es) | Ligando de cd27. | |
| EP0615451B1 (en) | Novel cytokine that binds cd30 | |
| US5674704A (en) | Cytokine designated 4-IBB ligand | |
| EP0760857B1 (en) | Receptor for oncostatin m | |
| US7211259B1 (en) | 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides | |
| EP0669929B1 (en) | Elk ligand, a cytokine | |
| US8034343B2 (en) | Methods of treating inflammatory disorders of the lungs | |
| US6949366B2 (en) | Cytokines that bind the cell surface receptor hek | |
| ES2236710T3 (es) | Nueva citoquina denominada lerk-5. | |
| US7138500B1 (en) | Antibodies to human 4-1BB | |
| EP0739350B1 (en) | Ligand that binds fas antigen | |
| US7834157B2 (en) | Family of immunoregulators designated leukocyte immunoglobulin-like receptors (LIR) | |
| US5576191A (en) | Cytokine that binds ST2 | |
| IL138410A (en) | Polypeptides and DNA fragments that activate NK cells and methods for their preparation |