BR122020010972B1 - polipeptídeo isolado e de fusão, sua composição farmacêutica e multímero - Google Patents

polipeptídeo isolado e de fusão, sua composição farmacêutica e multímero Download PDF

Info

Publication number
BR122020010972B1
BR122020010972B1 BR122020010972-6A BR122020010972A BR122020010972B1 BR 122020010972 B1 BR122020010972 B1 BR 122020010972B1 BR 122020010972 A BR122020010972 A BR 122020010972A BR 122020010972 B1 BR122020010972 B1 BR 122020010972B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
fgf21
amino acid
mutants
polypeptide
mutant
Prior art date
Application number
BR122020010972-6A
Other languages
English (en)
Inventor
Edward John Belouski
Murielle Marie Ellison
Agnes Eva Hamburger
Randy Ira Hecht
Yue-Sheng Li
Mark Leo Michaels
Jeonghoon Sun
Jing Xu
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40984291&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BR122020010972(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of BR122020010972B1 publication Critical patent/BR122020010972B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/05—Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

A invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos mutante de FGF21, composições farmacêuticas que compreendem polipeptídeos mutantes de FGF21, e métodos para o tratamento distúrbios metabólicos com a utilização desses ácidos nucleicos, polipeptídeos ou composições farmacêuticas.

Description

Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisória U.S. No. 61/058.861, depositado em 4 de junho de 2008, Pedido de Patente Provisória U.S. No. 61/058.919, depositado em 4 de junho de 2008, Pedido de Patente Provisória U.S. No. 61/164.364, depositado em 27 de março de 2009, e Pedido de Patente Provisória U.S. No. 61/175.736, depositado em 5 de maio de 2009, sendo cada um deles aqui incorporado em sua totalidade.
Fundamento da invenção 1. Campo da invenção
A invenção relaciona-se a moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos mutantes de FGF21, polipeptídeos mutantes de FGF21, composições farmacêuticas que compreendem polipeptídeos mutantes de FGF21, e métodos para o tratamento de distúrbios metabólicos que usam tais ácidos nucleicos, polipeptídeos ou composições farmacêuticas. 2. Fundamento da invenção FGF21 é um polipeptídeo secretado que pertence a uma subfamília de fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs) que inclui FGF19, FGF21 e FGF23 (Itoh e cols., 2004, Trend Genet. 20: 563-69). FGF21 é um FGF atípico em que ele é independente de heparina e age como um hormônio na regulação da glicose, lipídeo e metabolismo de energia. FGF21 foi isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de fígado como um fator secretado hepático. Ele é altamente expresso no fígado e pâncreas e é o único membro da família de FGF a ser primariamente expresso no fígado. Camundongos transgênicos que superexpressam FGF21 exibem fenótipos metabólicos de taxa de crescimento lenta, baixos níveis de glicose e triglicerídeos no plasma, e um diabetes tipo 2 associado à idade, hiperplasia da ilhota e obesidade. A administração farmacológica de proteína de FGF21 recombinante em modelos de roedores e primatas resulta em níveis normalizados de glicose plasmática, níveis reduzidos de triglicerídeos e colesterol, e tolerância à glicose e sensibilidade à insulina aumentadas. Alem disso, FGF21 reduz o peso corporal e gordura corporal por aumento do gasto de energia, atividade física e taxa metabólica.
Pesquisa experimental fornece suporte para a administração farmacológica de FGF21 para o tratamento de diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia, e outras condições metabólicas ou distúrbios em humanos. FGF21 humano tem uma meia-vida curta in vivo. Em camundongos, a meia-vida de FGF21 humano é 1 a 2 horas, e, em macacos cynomolgus, a meia-vida é 2,5 a 3 horas. No desenvolvimento de uma proteína de FGF21 para uso como um terápico no tratamento de diabetes tipo 2, um aumento na meia-vida seria desejável. As proteínas de FGF21 que têm uma meia-vida aumentada devem permitir uma dosagem menos freqüente de pacientes sendo administrados com a proteína. Tais proteínas são aqui descritas.
Sumário da invenção
A presente revelação fornece um polipeptídeo isolado que compreende uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4, que também compreende a substituição de qualquer aminoácido pelo resíduo de alanina na posição 45, o resíduo de leucina na posição 86, o resíduo de leucina na posição 98, o resíduo de alanina na posição 111, o resíduo de alanina na posição 129, o resíduo de glicina na posição 170, o resíduo de prolina na posição 171 ou o resíduo de serina na posição 172, e combinações destes. Em uma modalidade, o polipeptídeo isolado compreende a substituição de qualquer aminoácido pelo resíduo de leucina na posição 98, o resíduo de prolina em 171 ou o resíduo de leucina na posição 98, e o resíduo de prolina na posição 171. Em outra modalidade, o polipeptídeo isolado compreende a substituição de qualquer aminoácido pelo resíduo de leucina na posição 98 e o resíduo de prolina na posição 171.
A presente revelação também fornece um polipeptídeo isolado que compreende uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4 que tem: (a) pelo menos uma substituição de aminoácido que é: (i) um resíduo de glutamina, isoleucina ou lisina na posição 19; (ii) um resíduo de histidina, leucina ou fenilalanina na posição 20; (iii) um resíduo de isoleucina, fenilalanina, tirosina ou valina na posição 21; (iv) um resíduo de isoleucina, fenilalanina ou valina na posição 22; (v) um resíduo de alanina ou arginina na posição 150; (vi) um resíduo de alanina ou valina na posição 151; (vii) um resíduo de histidina, leucina, fenilalanina ou valina na posição 152; (viii) um resíduo de alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, prolina ou serina na posição 170; (ix) um resíduo de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, serina, treonina, triptofano ou tirosina na posição 171; (x) um resíduo de leucina ou treonina na posição 172; ou (xi) um resíduo de arginina ou ácido glutâmico na posição 173; e (b) pelo menos uma substituição de aminoácido que é: (i) um resíduo de arginina, ácido glutâmico ou lisina na posição 26; (ii) um resíduo de arginina, ácido glutâmico, glutamina, lisina ou treonina na posição 45; (iii) um resíduo de treonina na posição 52; (iv) um resíduo de cisteína, ácido glutâmico, glicina ou serina na posição 58; (v) um resíduo de alanina, arginina, ácido glutâmico ou lisina na posição 60; (vi) um resíduo de alanina, arginina, cisteína ou histidina na posição 78; (vii) um resíduo de cisteína ou treonina na posição 86; (viii) um resíduo de alanina, arginina, ácido glutâmico, lisina ou serina na posição 88; (ix) um resíduo de arginina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, lisina ou treonina na posição 98; (x) um resíduo de arginina, ácido aspártico, cisteína ou ácido glutâmico na posição 99; (xi) um resíduo de lisina ou treonina na posição 111; (xii) um resíduo de arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina ou lisina na posição 129; ou (xiii) um resíduo de arginina, ácido glutâmico, histidina, lisina ou tirosina na posição 134; e combinações destes. Em uma modalidade, o resíduo na posição 98 é arginina e o resíduo na posição 171 é prolina, e em outra modalidade, o polipeptídeo pode compreender uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 85 por cento idêntica à seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4, mas em que pelo menos uma substituição de aminoácido de (a)(i)-(xi) e (b)(i)-(xiii) não é adicionalmente modificada.
A presente revelação adicionalmente fornece um polipeptídeo isolado que compreende uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4 que tem pelo menos uma substituição de aminoácido que é: (a) um resíduo de glutamina, lisina ou isoleucina na posição 19; (b) um resíduo de histidina, leucina ou fenilalanina na posição 20; (c) um resíduo de isoleucina, fenilalanina, tirosina ou valina na posição 21; (d) um resíduo de isoleucina, fenilalanina ou valina na posição 22; (e) um resíduo de alanina ou arginina na posição 150; (f) um resíduo de alanina ou valina na posição 151; (g) um resíduo de histidina, leucina, fenilalanina ou valina na posição 152; (h) um resíduo de alanina, ácido aspártico, cisteína ou prolina na posição 170; (i) um resíduo de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, serina, treonina, triptofano, ou tirosina na posição 171; (j) um resíduo de leucina na posição 172; ou (k) um resíduo de arginina ou ácido glutâmico na posição 173; e combinações destes. Em uma modalidade, o resíduo na posição 171 é prolina, e em outra modalidade o polipeptídeo pode compreender uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 85 por cento idêntica a uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4, mas em que pelo menos uma substituição de aminoácido de (a)-(k) não é adicionalmente modificada.
A presente revelação também fornece um polipeptídeo isolado que compreende uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4 que tem pelo menos uma substituição de aminoácido que é: (a) um resíduo de arginina, ácido glutâmico ou lisina na posição 26; (b) um resíduo de arginina, ácido glutâmico, glutamina, lisina ou treonina na posição 45; (c) um resíduo de treonina na posição 52; (d) um resíduo de ácido glutâmico, glicina ou serina na posição 58; (e) um resíduo de alanina, arginina, ácido glutâmico ou lisina na posição 60; (f) um resíduo de alanina, arginina, ou histidina na posição 78; (g) um resíduo de alanina na posição 88; (h) um resíduo de arginina, ácido glutâmico, glutamina, lisina ou treonina na posição 98; (i) um resíduo de arginina, ácido aspártico, cisteína ou ácido glutâmico na posição 99; (j) um resíduo de lisina ou treonina na posição 111; (k) um resíduo de arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina, histidina ou lisina na posição 129; ou (l) um resíduo de arginina, ácido glutâmico, histidina, lisina ou tirosina na posição 134; e combinações destes. Em uma modalidade, o resíduo na posição 98 é arginina e em outra modalidade o polipeptídeo pode compreender uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 85 por cento idêntica a uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4, mas em que pelo menos uma substituição de aminoácido de (a)-(l) não é adicionalmente modificada.
Em várias modalidades, os polipeptídeos aqui revelados também podem compreender pelo menos uma substituição de aminoácido que é: (a) uma fenilalanina, prolina, alanina, serina ou glicina na posição 179; (b) um ácido glutâmico, glicina, prolina, ou serina na posição 180; ou (c) uma lisina, glicina, treonina, alanina, leucina, ou prolina na posição 181, e também pode compreender 1 a 10 resíduos de aminoácidos fundidos ao terminal C do polipeptídeo, e pode ser qualquer aminoácido, por exemplo, um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste em glicina, prolina e combinações destes.
Em várias modalidades, os polipeptídeos aqui revelados podem compreender (a) um truncamento de terminal amino de não mais que 8 resíduos de aminoácidos, em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicemia em um mamífero; (b) um truncamento de terminal carboxil de não mais que 12 resíduos de aminoácidos, em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicemia em um mamífero; ou (c) um truncamento de terminal amino de não mais que 8 resíduos de aminoácidos e um truncamento de terminal carboxil de não mais que 12 resíduos de aminoácidos, em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicemia em um mamífero.
Em algumas modalidades, os polipeptídeos aqui revelados podem ser ligados de modo covalente a um ou mais polímeros, como PEG. Em outras modalidades, os polipeptídeos da presente invenção podem ser fundidos a uma seqüência de aminoácidos heteróloga, opcionalmente por meio de um ligante, como GGGGGSGGGSGGGGS (Id. de Seq. N°: 23). A seqüência de aminoácidos heteróloga pode ser um domínio constante de IgG ou fragmento deste, como uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 13. Tais polipeptídeos de fusão aqui revelados também podem formar multímeros.
A presente revelação também fornece composições farmacêuticas que compreendem os polipeptídeos aqui revelados e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas podem ser usadas em um método para o tratamento de um distúrbio metabólico, e o método compreende a administração a um paciente humano em necessidade de uma composição farmacêutica da presente invenção. Os distúrbios metabólicos que podem ser tratados incluem diabetes e obesidade.
São também fornecidas moléculas de ácido nucleico isolado que codificam os polipeptídeos aqui revelados, bem como vetores que compreendem tais moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreendem tais moléculas de ácido nucleico.
Formas truncadas do polipeptídeo de Id. de Seq. N°:4 são também reveladas. Em várias modalidades, o polipeptídeo pode compreender: (a) um truncamento de terminal amino de não mais que 8 resíduos de aminoácidos, em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicemia em um mamífero; (b) um truncamento de terminal carboxil de não mais que 12 resíduos de aminoácidos, em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicemia em um mamífero; ou (c) um truncamento de terminal amino de não mais que 8 resíduos de aminoácidos e um truncamento de terminal carboxil de não mais que 12 resíduos de aminoácidos, em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicemia em um mamífero.
A presente revelação fornece adicionalmente uma proteína de fusão isolada que pode compreender: (a) um domínio constante de IgG; (b) uma seqüência de ligante fundida ao domínio constante de IgG; e (c) um mutante de FGF21 fundido à seqüência de ligante e que compreende uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4 em que um resíduo de arginina foi substituído pelo resíduo de leucina na posição 98 e um resíduo de glicina foi substituído pelo resíduo de prolina na posição 171. Em uma modalidade, a seqüência de ligante pode compreender GGGGGSGGGSGGGGS (Id. de Seq. N°:23), e em outra modalidade o domínio constante de IgG pode compreender Id. de Seq. N°: 13. Em outra modalidade, a seqüência de ligante compreende GGGGGSGGGSGGGGS (Id. de Seq. N°:23) e o domínio constante de IgG compreende uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 13. Ainda em outra modalidade, o terminal N do ligante é fundido ao terminal C do domínio constante de IgG e o terminal N do mutante de FGF21 é fundido ao terminal C do ligante. As proteínas de fusão reveladas podem formar multímeros.
Em várias modalidades da proteína de fusão, o componente do mutante de FGF21 pode compreender pelo menos uma substituição de aminoácido que é: (a) uma fenilalanina, prolina, alanina, serina ou glicina na posição 179; (b) um ácido glutâmico, glicina, prolina, ou serina na posição 180; ou (c) uma lisina, glicina, treonina, alanina, leucina ou prolina na posição 181, e também pode compreender 1 a 10 resíduos de aminoácidos fundidos ao terminal C do mutante de FGF21, e 1 a 10 resíduos de aminoácidos, e pode ser qualquer aminoácido, por exemplo, um ou mais resíduos selecionados do grupo que consiste em glicina, prolina e combinações destes.
Ainda em outras modalidades da proteína de fusão, o componente do mutante de FGF21 pode compreender: (a) um truncamento de terminal amino de não mais que 8 resíduos de aminoácidos, em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicemia em um mamífero; (b) um truncamento de terminal carboxil de não mais que 12 resíduos de aminoácidos, em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicemia em um mamífero; ou (c) um truncamento de terminal amino de não mais que 8 resíduos de aminoácidos e um truncamento de terminal carboxil de não mais que 12 resíduos de aminoácidos, em que o polipeptídeo é capaz de diminuir a glicemia em um mamífero. Em outra modalidade, o componente do mutante de FGF21 da proteína de fusão pode compreender uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 85 por cento idêntica a uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4, mas em que os resíduos de arginina e glicina não são também modificados.
A presente revelação também fornece composições farmacêuticas que compreendem a proteína de fusão aqui revelada e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas podem ser usadas em um método para o tratamento de um distúrbio metabólico, e o método compreende a administração a um paciente humano em necessidade de uma composição farmacêutica da presente invenção. Os distúrbios metabólicos que podem ser tratados incluem diabetes e obesidade.
São também fornecidas moléculas de ácido nucleico isolado que codificam a proteína de fusão aqui revelada, bem como vetores que compreendem tais moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreendem tais moléculas de ácido nucleico.
Modalidades específicas da presente invenção serão evidentes a partir da descrição mais detalhada a seguir de certas modalidades e das reivindicações.
Breve descrição dos desenhos As Figuras 1A-1B mostram os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado nos mutantes de truncamento de FGF21 7-181 e 8-181 (Figura 1A) e nos mutantes de truncamento de FGF21 1-172, 1-171, 1-169 e 1164 (Figura 1B); cada painel mostra os resultados obtidos para um controle humano de FGF21. A Figura 2 mostra os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado em um controle humano de FGF21 e nos mutantes de truncamento de FGF21 3-181, 4181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 e 1-149. A Figura 3 mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida), controle humano de FGF21 (barra aberta), ou os mutantes de truncamento de FGF21 8-181 (barra cinza) e 9-181 (barra pontilhada). A Figura 4 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (círculos sólidos), um controle de Fc-FGF21 (WT) (círculos abertos), ou proteínas de fusão de Fc-FGF21 truncado que compreendem resíduos de aminoácidos 5-181 (triângulos sólidos) ou 7181 (triângulos abertos). A Figura 5 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (círculos sólidos), um controle de FGF21-Fc (WT) (círculos abertos), uma proteína de fusão de FGF21-Fc truncado que compreende resíduos 1-175 (triângulos sólidos), ou uma proteína de Fc- FGF21 truncado que compreende resíduos de aminoácidos 1-171 (triângulos abertos). As Figuras 6A-6D mostram os resultados de análise de espectrometria de massa-cromatografia líquida (LC-MS) de uma amostra de controle de Fc(5)FGF21 humano (Figura 6A) e amostras de Fc(5)FGF21 retiradas de camundongos em 6 horas (Amostra D6; Figura 6B), 24 horas (Amostra D24; Figura 6C) e 48 horas (Amostra D48; Figura 6D) depois de injeção. As Figuras 7A-7D mostram os resultados da análise de LC-MS de uma amostra de controle de FGF21(3)Fc humano derivada de mamífero (Figura 7A) e de amostras de FGF21(3)Fc retiradas de camundongos em 6 horas (Amostra E6; Figura 7B), 24 horas (Amostra E24; Figura 7C) e 48 horas (Amostra E48; Figura 7D) após injeção. As Figuras 8A-8D mostram os resultados da análise de LC-MS de uma amostra de controle de Fc(15)FGF21 (Figura 8A) e de amostras de Fc(15)FGF21 retiradas de camundongos em 6 horas (Figura 8B), 24 horas (Figura 8C) e 48 horas (Figura 8D) após injeção. As Figuras 9A-9D mostram os resultados de análise de LC-MS de uma amostra de controle de FGF21(15)Fc (Figura 9A) e de amostras de FGF21(15)Fc retiradas de camundongos em 6 horas (Figura 10 9B), 24 horas (Figura 9C) e 48 horas (Figura 9D) após injeção. As Figuras 10A-10B mostram os sítios de clivagem identificados por análise de LC-MS de proteínas de fusão de Fc(15)FGF21 (Figura 10A, Id. de Seq. N°:38) e FGF21(15)Fc (Figura 10B, Id. de Seq. N°:25) injetadas em camundongo. A Figura 11 mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida), Fc(15)FGF21 (barra aberta) ou com os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E (barra cinza), Fc(15)FGF21 P171A (barra pontilhada), Fc(15)FGF21 S172L (barra tracejada na diagonal aberta), Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L (barra tracejada na horizontal sólida), ou Fc(15)FGF21 G151A (barra tracejada na diagonal aberta). A Figura 12 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (círculos sólidos), Fc(15)FGF21 (círculos abertos), ou com os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E (triângulos sólidos), Fc(15)FGF21 P171A (triângulos abertos), Fc(15)FGF21 S172L (diamantes sólidos), Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L (diamantes abertos) ou Fc(15)FGF21 G151A (quadrados sólidos). A Figura 13 mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida), Fc(15)FGF21 (barra aberta), ou com os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V (barra cinza), Fc(15)FGF21 G170E (barra tracejada na diagonal aberta), Fc(15)FGF21 G170E/P171A (barra tracejada na diagonal cinza), ou Fc(15)FGF21 G170E/S172L (barra tracejada na diagonal aberta). A Figura 14 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (quadrados sólidos), Fc(15)FGF21 (quadrados abertos), ou com os mutantes de Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V (triângulos invertidos sólidos), Fc(15)FGF21 G170E (triângulos invertidos abertos), Fc(15)FGF21 G170E/P171A (círculos sólidos) ou Fc(15)FGF21 G170E/5172L (círculos abertos). A Figura 15 mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida) ou os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E (barra aberta), Fc(15)FGF21 G170A (barra cinza), Fc(15)FGF21 G170C (barra tracejada na diagonal aberta), Fc(15)FGF21 G170D (barra cinza e branca), Fc(15)FGF21 G170N (barra tracejada na diagonal sólida) ou Fc(15)FGF21 G1705 (barra tracejada na diagonal aberta). A Figura 16 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (círculos sólidos) ou os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E (círculos abertos), Fc(15)FGF21 G170A (triângulos sólidos), Fc(15)FGF21 G170C (triângulos abertos), Fc(15)FGF21 G170D (diamantes sólidos), Fc(15)FGF21 G170N (diamantes abertos) ou Fc(15)FGF21 G1705 (triângulos invertidos sólidos). A Figura 17 mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida) ou os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E (barra aberta), Fc(15)FGF21 P171E (barra cinza), Fc(15)FGF21 P171H (barra tracejada na diagonal sólida), Fc(15)FGF21 P171Q (barra tracejada na diagonal aberta), Fc(15)FGF21 P171T (barra pontilhada) ou Fc(15)FGF21 P171Y (barra tracejada na diagonal cinza). A Figura 18 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (círculos sólidos) ou os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E (círculos abertos), Fc(15)FGF21 P171E (triângulos sólidos), Fc(15)FGF21 P171H (triângulos abertos), Fc(15)FGF21 P171Q (diamantes sólidos), Fc(15)FGF21 P171T (diamantes abertos) ou Fc(15)FGF21 P171Y (quadrados sólidos). As Figuras 19A-19D mostram os resultados de análise de LC-MS de uma amostra de controle de Fc(15)FGF21 (Figura 19A) e amostras retiradas de camundongos em 6 horas (Figura 19B), 24 horas (Figura 19C) e 48 horas (Figura 19D) após a injeção. As Figuras 20A-20D mostram os resultados de análise de LC-MS de uma amostra de controle de Fc(15)FGF21 G170E (Figura 20A) e amostras de Fc(15)FGF21 G170E retiradas de camundongos em 6 horas (Figura 20B), 24 horas (Figura 20C) e 48 horas (Figura 20D) após injeção. As Figuras 21A-21D mostram os resultados de análise de LC-MS de uma amostra de controle de Fc(15)FGF21 P171A (Figura 21A) e amostras de Fc(15)FGF21 P171A retiradas de camundongos em 6 horas (Figura 21B), 24 (Figura 21C) e 48 horas (Figura 21D) após injeção. As Figuras 22A-22D mostram os resultados de análise de LC-MS de uma amostra de controle de Fc(15)FGF21 S172L (Figura 22A) e de amostras de Fc(15)FGF21 S172L retiradas de camundongos em 6 horas (Figura 22B), 24 horas (Figura 22C), e 48 horas (Figura 22D) após injeção. As Figuras 23A-23D mostram os sítios de clivagem identificados por análise de LC-MS de proteínas de fusão de Fc(15)FGF21 (Figura 23A, Id. de Seq. N°:38), Fc(15)FGF21 G170E (Figura 23B, Id. de Seq. N°: 39), Fc(15)FGF21 P171A (Figura 23C, Id. de Seq. N°: 40), e Fc(15)FGF21 S172L (Figura 23D, Id. de Seq. N°: 41) injetadas em camundongos. As Figuras 24A-24C mostram os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado nos mutantes de FGF21 FGF21 L99R, FGF21 L99D e FGF21 A111T (Figura 24A); nos mutantes de FGF21 FGF21 A129D, FGF21 A129Q e FGF21 A134K (Figura 24B); e nos mutantes de FGF21 FGF21 A134Y, FGF21 A134E e FGF21 A129K (Figura 24C); cada painel mostra os resultados obtidos para um controle humano de FGF21. As Figuras 25A-25D mostram os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado nos mutantes de Fc-FGF21 Fc-FGF21 P171G, Fc-FGF21 P171S, e Fc-FGF21 P171T (Figura 25A); nos mutantes de Fc-FGF21 Fc-FGF21 P171Y, Fc- FGF21 P171W e Fc- FGF21 P171C (Figura 25B); Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 A45KJG170E, e FGF21 A45K (Figura 25C); e Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 P171E, e Fc(15)FGF21 A45K/G170E (Figura 25D); cada painel mostra os resultados obtidos para um controle humano de FGF21. As Figuras 26A-B mostram a agregação em função do tempo para FGF21 maduro de tipo selvagem e vários mutantes de FGF21; a Figura 26A mostra a alteração na agregação percentual para um controle de FGF21 (WT, diamantes sólidos) e FGF21 A45K (círculos sólidos) após incubação de 65 mg/ml proteína a 4°C por 1, 2 e 4 dias, enquanto a Figura 26B mostra a alteração na agregação percentual para um controle de FGF21 (WT) e FGF21 P78C, P78R, L86T, L86R, L98C, L98R, Al 11T, A129D, A129Q, A129K, A134K, A134Y, e A134E (todos rotulados no gráfico) após incubação de 65 mg/ml de proteína a 4°C por 1, 6 e 10 dias. A Figura 27 mostra os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado em um controle humano de FGF21 e nos mutantes de FGF21 FGF21 A45K, FGF21 L52T, e FGF21 L58E. A Figura 28A é um gráfico que mostra a alteração nos níveis de agregação para os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 6-181/G170E (diamantes sólidos), Fc(15)FGF21 A45K/G170E (quadrados abertos), Fc(15)FGF21 P171E (triângulos sólidos), Fc(15)FGF21 P171A (cruzes), Fc(15)FGF21 G170E (triângulos abertos) , e um controle de FGF21 (círculos sólidos) depois de incubação a 4°C por 1, 4 e 8 dias, e Figura 28B é um gráfico em barra que também mostra os resultados da incubação. A Figura 29 mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS (veículo) (círculos sólidos) ou com os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 A45K/G170E (círculos abertos), Fc(15)FGF21 A45K/P171G (triângulos sólidos), ou Fc(15)FGF21 L98R/P171G (triângulos abertos). A Figura 30 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado em FGF21 humano (círculos sólidos, linha sólida), Fc(15)FGF21 (círculos abertos, linha sólida) e Fc(15)FGF21 L98R/P171G (triângulos sólidos, linha pontilhada). A Figura 31 é um gráfico que mostra o percentual de agregados de alto peso molecular observados depois de nove dias em temperatura ambiente (Figura 31A) e a 4°C (Figura 31B) para FGF21 (círculos sólidos, linha sólida), Fc(15)FGF21 (círculo aberto, linha sólida) e Fc(15)FGF21 L98R/P171G (triângulos sólidos, linha pontilhada). A Figura 32 é uma série de traçados de espectrometria de massa MALDI que mostram alterações observadas em Fc(15)FGF21 L98R/P171G em vários pontos por um período de tempo de 168 horas. A Figura 33 é um gráfico que mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia em camundongos db/db para cada um de, um controle de veículo PBS (círculos abertos), FGF21 maduro de tipo selvagem (quadrados sólidos) e os mutantes de FGF21, L98R, P171G (triângulos invertidos sólidos); L98R, P171G, 182P (diamantes abertos), e L98R, P171G, 182G (círculos sólidos). A Figura 34 é um gráfico que mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia em camundongos ob/ob para cada um de, um controle de veículo PBS (círculos sólidos), e os mutantes de FGF21, L98R, P171G (triângulos sólidos); L98R, P171G, 182G, 183G (triângulos abertos), L98R, P171G, 182G (diamantes sólidos) e L98R, P171G, 182P (diamantes abertos). A Figura 35 é um gráfico que mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia em camundongos db/db para cada um de, um controle de veículo PBS (círculos abertos), e os mutantes de FGF21, L98R, P171G (quadrados sólidos); L98R, P171G, Y179S (triângulos abertos), L98R, P171G, Y179A triângulos invertidos sólidos), L98R, P171G, 180S (diamantes abertos) e L98R, P1710, A180G (círculos sólidos). A Figura 36 é um gráfico que mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia camundongos db/db para cada um de, um controle de veículo PBS (círculos sólidos), e os mutantes de FGF21, L98R, P171G (quadrados abertos); L98R, P171G, Y179F (triângulos sólidos) e L98R, P171G, A180E (diamantes abertos). A Figura 37 é um diagrama que apresenta graficamente o design do estudo para um estudo de escalonamento de dose de seis semanas realizado em macacos Rhesus; na Figura, símbolos sombreados indicam retiradas de sangue em jejum e símbolos pontilhados indicam retiradas de sangue no estado prandial. As Figuras 38A-D representam uma série de gráficos que apresentam como os macacos Rhesus foram randomizados em perfis de OGTT, AUCs de OGTT e peso corporal; a Figura 38A apresenta os níveis de glicemia de base em OGTT1, quadrado sólido corresponde ao grupo A, círculo sólido, linha sólida corresponde ao grupo B e círculo aberto, linha tracejada corresponde ao grupo C antes dos compostos ou veículo terem sido determinados a cada grupo; a Figura 38B apresenta os níveis de glicemia de base em OGTT2, quadrado sólido corresponde ao grupo A, círculo sólido, linha sólida corresponde ao grupo B e círculo aberto, linha sólida corresponde ao grupo C antes de os compostos ou veículo terem sido determinados a cada grupo; a Figura 38C mostra os níveis de glicemia de base para OGTTs 1 e 2 mostrados em termos de AUC, a barra pontilhada corresponde ao grupo A, a barra sombreada corresponde ao grupo B e a barra aberta corresponde ao grupo C; e a Figura 38D mostra peso corporal de base, a barra pontilhada corresponde ao grupo A, a barra sombreada corresponde ao grupo B e a barra aberta corresponde ao grupo C. A Figura 39 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, FGF21 e Fc-FGF21(RG) sobre o peso corporal em macacos Rhesus; as barras sombreadas 1 e 2 correspondem às semanas 1 e 2 na dose baixa, as barras abertas 3 e 4 correspondem às semanas 3 e 4 na dose média, as barras sólidas 5 e 6 correspondem às semanas 5 e 6 na dose alta e as barras pontilhadas 7, 8 e 9 correspondem às semanas 7-9 durante o período de eliminação. A Figura 40 é um gráfico que mostra a alteração percentual nos níveis de insulina em jejum em relação ao valor de base de veículo, FGF21 e Fc-FGF21(RG) nos níveis de jejum de insulina em macacos Rhesus; as barras sombreadas 1 e 2 correspondem às semanas 1 e 2 na dose baixa, as barras abertas 3 e 4 correspondem às semanas 3 e 4 na dose média, as barras sólidas 5 e 6 correspondem às semanas 5 e 6 na dose alta e as barras pontilhadas 7 e 8 correspondem às semanas 7 e 8 durante o período de eliminação. A Figura 41 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, FGF21 e Fc-FGF21(RG), dados na dose alta, sobre os níveis de insulina com alimentação de macacos Rhesus adquiridos durante as semanas 5 e 6 do estudo; as barras sólidas correspondem a semana 5 e as barras sombreadas correspondem a semana 6. A Figura 42 é um gráfico que mostra os perfis de glicose de OGTT5 realizados ao final do tratamento de alta dose de duas semanas com Fc-FGF21(RG); círculo sólido, linha sólida corresponde ao veículo, quadrado aberto, linha pontilhada corresponde a FGF21, e triângulo sólido, linha sólida corresponde a Fc-FGF21(RG). A Figura 43 é um gráfico que mostra os perfis de insulina de OGTT5 realizados ao final do tratamento de alta dose de duas semanas com Fc-FGF21(RG); círculo sólido, linha sólida corresponde ao veículo, quadrado aberto, linha pontilhada corresponde a FGF21, e triângulo sólido, linha sólida corresponde a Fc-FGF21(RG). A Figura 44 é um gráfico que mostra a glicose OGTT AUC 1-3 determinada ao final de cada período de dose (dose baixa, média e alta) dos macacos Rhesus; barras abertas correspondem a AUC3 calculada a partir de medições de glicose durante OGTT3, barras sólidas correspondem ao AUC4 calculado a partir de medições de glicose durante OGTT4, e barras sombreadas correspondem a AUC5 calculada a partir de medições de glicose durante OGTT5. A Figura 45 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, FGF21 e Fc-FGF21(RG) sobre a alteração percentual do valor de base dos níveis de triglicerídeo plasmático em jejum de cada grupo de macacos Rhesus; barras sombreadas 1 e 2 correspondem às semanas 1 e 2 na dose baixa, barras abertas 3 e 4 correspondem a semanas 3 e 4 na dose média, barras sólidas 5 e 6 correspondem a semanas 5 e 6 na dose alta, e as barras pontilhadas 7, 8 e 9 correspondem a semanas 7-9 durante o período de eliminação. A Figura 46 é um gráfico que mostra níveis de triglicerídeo plasmático sem jejum de cada grupo dos macacos Rhesus; como medido durante a quinta e sexta semanas de tratamento com veículo, FGF21 ou Fc-FGF21(RG) na dose alta; barras sombreadas correspondem a semana 5 e as barras sólidas correspondem a semana 6. A Figura 47 é um gráfico que mostra níveis individuais de FGF21 de macaco medidos em pré-dose, e 5, 12, 19 e 26 dias, com amostras adquiridas aproximadamente 21 horas depois de cada injeção. A Figura 48 é um gráfico que mostra níveis individuais de Fc-FGF21(RG) de macaco medidos em pré-dose, e 5, 12, 19 e 26 dias, com amostras adquiridas aproximadamente 5 dias depois de cada injeção. A Figura 49 é um gráfico que mostra as concentrações de níveis de FGF21 e Fc-FGF21(RG) medidos a partir de três OGTTs realizados depois de cada uma das doses baixa, média e alta; barras sombreadas correspondem a OGTT3 na dose baixa, barras sólidas correspondem a OGTT4 na dose média, e as barras abertas correspondem a OGTT5 na dose alta. Descrição detalhada da invenção
Uma proteína de FGF21 humana tendo propriedades aumentadas como uma meia-vida aumentada e/ou agregação diminuída pode ser preparada com o uso dos métodos aqui revelados e métodos padrão de biologia molecular. Opcionalmente, a meia-vida também pode ser estendida por fusão de um anticorpo, ou porção deste, à extremidade de terminal N ou terminal C da seqüência de FGF21 de tipo selvagem. É também possível estender adicionalmente a meia- vida ou diminuir a agregação da proteína de FGF21 de tipo selvagem por introdução de substituições de aminoácido na proteína. Tais proteínas modificadas são aqui referidas como mutantes, ou mutantes de FGF21, e formam modalidades da presente invenção.
Os métodos de ácido nucleico recombinante aqui usados, incluindo os Exemplos, são geralmente aqueles apresentados em Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ou Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel e cols., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994), ambos são aqui incorporados por referencia para qualquer objetivo. 1. Definições gerais
O termo “molécula de ácido nucleico isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico da invenção que (1) foi separada de pelo menos cerca de 50 por cento de proteínas, lipídeos, carboidratos, ou outros materiais com os quais ela é naturalmente encontrada quando ácido nucleico total é isolado das células fonte, (2) não é ligada a toda ou a uma porção de um polinucleotídeo ao qual a “molécula de ácido nucleico isolado” é ligada em natureza, (3) é operacionalmente ligada a um polinucleotídeo ao qual ela não é ligada em natureza, ou (4) não ocorre na natureza como parte de uma seqüência de polinucleotídeos maior.
Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico isolado da presente invenção é substancialmente livre de quaisquer outras moléculas de ácido nucleico ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que poderiam interferir com seu uso na produção de polipeptídeo ou seu uso terapêutico, diagnóstico, em profilaxia ou uso em pesquisa.
O termo “vetor” é usado para se referir a qualquer molécula (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo ou vírus) usada para transferir informação de codificação a uma célula hospedeira.
O termo “vetor de expressão” refere-se a um vetor que é adequado para transformação de uma célula hospedeira e contém seqüências de ácidos nucleicos que direcionam e/ou controlam a expressão de seqüências de ácidos nucléicos inseridas heterólogas. A expressão inclui, sem limitação, processos como transcrição, tradução e splicing de RNA, se íntrons estiverem presentes.
O termo “operacionalmente ligado” é aqui usado para referir-se a um arranjo de seqüências de flanqueamento em que as seqüências de flanqueamento assim descritas são configuradas ou montadas de modo a realizar sua função usual. Portanto, uma seqüência de flanqueamento operacionalmente ligada a uma seqüência codificadora pode ser capaz de efetuar a replicação, transcrição e/ou tradução da seqüência codificadora. Por exemplo, a seqüência codificadora é operacionalmente ligada a um promotor quando o promotor é capaz de direcionar a transcrição daquela seqüência codificadora. A seqüência de flanqueamento não precisa ser contígua com a seqüência codificadora, desde que ela funcione corretamente. Portanto, por exemplo, seqüências interveniente não traduzidas porém já transcritas podem estar presentes entre uma seqüência de promotor e a seqüência codificadora e a seqüência de promotor pode ainda ser consideradas “operacionalmente ligadas” à seqüência codificadora.
O termo “célula hospedeira” é usado para se referir a uma célula que foi transformada, ou é capaz de ser transformada com uma seqüência de ácidos nucleicos e então capaz de expressar um gene selecionado de interesse. O termo inclui a progênie da célula parente, seja a progênie idêntica ou não em morfologia ou em constituição genética ao parente original, desde que o gene selecionado esteja presente.
O termo “polipeptídeo isolado” refere-se a um polipeptídeo da presente invenção que (1) foi separado de pelo menos cerca de 50 por cento dos polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos ou outros materiais com os quais ele é naturalmente encontrado quando isolado a partir da célula fonte, (2) não é ligado (por interação covalente ou não covalente) a todo ou a uma porção de um polipeptídeo ao qual o “polipeptídeo isolado” é ligado em natureza, (3) é operacionalmente ligado (por interação covalente ou não covalente) a um polipeptídeo com o qual ele não é ligado em natureza, ou (4) não ocorre na natureza. Preferivelmente, o polipeptídeo isolado é substancialmente livre de quaisquer outros polipeptídeos contaminantes ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que poderiam interferir com seu uso terapêutico, diagnóstico, profilático ou em pesquisa.
O termo “de ocorrência natural” quando usado junto com materiais biológicos como moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos, células hospedeiras e outros refere-se a materiais que são encontrado em natureza e não são manipulados pelo homem. De forma similar, “de ocorrência não natural” como aqui usado refere-se a um material que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem. Quando usado junto com nucleotídeos, o termo “de ocorrência natural” refere-se às bases adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) e uracil (U). Quando usado junto a aminoácidos, o termo “de ocorrência natural” refere-se aos 20 aminoácidos alanina (A), cisteína (C), ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), fenilalanina (F), glicina (G), histidina (H), isoleucina (I), lisina (K), leucina (L), metionina (M), asparagina (N), prolina (P), glutamina (Q), arginina (R), serina (S), treonina (T), valina (V), triptofano (W) e tirosina (Y).
O termo “polipeptídeo de FGF21” refere-se a um polipeptídeo de tipo selvagem de ocorrência natural expresso em humanos. Para os objetivos desta revelação, o termo “polipeptídeo de FGF21” pode ser usado de modo intercambiável para se referir a qualquer polipeptídeo de FGF21 de comprimento total, por exemplo, Id. de Seq. N°: 2, que consiste em 209 resíduos de aminoácidos e que é codificado pela seqüência de nucleotídeos de Id. de Seq. N°: 1; qualquer forma madura do polipeptídeo, por exemplo, Id. de Seq. N°: 4, que consiste em 181 resíduos de aminoácidos e que é codificado pela seqüência de nucleotídeos de Id. de Seq. N°: 3, e em que os 28 resíduos de aminoácidos na extremidade de terminal amino do polipeptídeo de FGF21 de comprimento total (ou seja, que constitui o peptídeo de sinal) foram removidos, e variantes destes.
Os termos “mutante de polipeptídeo de FGF21” e “mutante de FGF21” referem-se a uma variante de polipeptídeo de FGF21 em que uma seqüência de aminoácidos de FGF21 de ocorrência natural foi modificada. Tais modificações incluem, sem limitação, uma ou mais substituições de aminoácido, que incluem substituições com análogos de aminoácido de ocorrência não natural, e truncamentos. Portanto, mutantes de polipeptídeo de FGF21 incluem, sem limitação, mutantes de FGF21 direcionados a sítio, polipeptídeos de FGF21 truncado, mutantes de FGF21 resistentes à proteólise, mutantes de FGF21 de redução de agregação, mutantes em combinação de FGF21, e proteínas de fusão de FGF21, como aqui descrito. Para fim de identificação dos truncamentos específicos e substituições de aminoácido dos mutantes de FGF21 da presente invenção, a numeração dos resíduos de aminoácidos truncados ou mutados corresponde àquela do polipeptídeo de FGF21 maduro de 181- resíduos.
Em outras modalidades da presente invenção, um mutante de polipeptídeo de FGF21 compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 85 por cento idêntica a uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4, mas em que os resíduos específicos que conferem uma propriedade desejável ao mutante de polipeptídeo de FGF21, por exemplo, resistência a proteólise, meia-vida aumentada ou propriedades de redução da agregação e combinações destes, não foram modificados. Em outras palavras, com a exceção dos resíduos na seqüência do mutante de FGF21 que foram modificados para conferir resistência a proteólise, redução da agregação, ou outras propriedades, cerca de 15 por cento de todos os outros resíduos de aminoácidos na seqüência do mutante de FGF21 podem ser modificados. Por exemplo, no mutante de FGF21 Q173E, até 15 por cento de todos os resíduos de aminoácidos diferentes do resíduo de ácido glutâmico, que foi substituído por glutamina na posição 173, podem ser modificados. Ainda em outras modalidades, um mutante de polipeptídeo de FGF21 compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90 por cento, ou cerca de 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica a uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4, mas em que os resíduos específicos que conferem propriedades de resistência a proteólise ou redução da agregação ao mutante de polipeptídeo de FGF21 não foram modificados. Tais mutantes de polipeptídeo de FGF21 possuem pelo menos uma atividade do polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem.
A presente invenção também engloba uma molécula de ácido nucleico que codifica um mutante de polipeptídeo de FGF21 que compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 85 por cento idêntica a uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4, em que resíduos específicos que conferem uma propriedade desejável ao mutante de polipeptídeo de FGF21, por exemplo, propriedades de resistência a proteólise, meia-vida aumentada ou redução da agregação e combinações destes, não foram modificados. Em outras palavras, com a exceção de nucleotídeos que codificam resíduos na seqüência do mutante de FGF21 que foram modificados para conferir resistência a proteólise, redução da agregação, ou outras propriedades, cerca de 15 por cento de todos os outros nucleotídeos na seqüência do mutante de FGF21 podem ser modificados. Por exemplo, no mutante de FGF21 Q173E, até 15 por cento de todos os nucleotídeos outros que não os nucleotídeos que codificam o resíduo de ácido glutâmico, que foi substituído por glutamina na posição 173, podem ser modificados. A presente invenção também engloba uma molécula de ácido nucleico que codifica um mutante de polipeptídeo de FGF21 que compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90 percento, ou cerca de 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento, idêntica a uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 4, mas em que os resíduos específicos que conferem as propriedades de resistência a proteólise ou de redução da agregação aos mutantes de polipeptídeo de FGF21 não foram modificados. Tais mutantes de FGF21 possuem pelo menos uma atividade do polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem.
A presente invenção também engloba uma molécula de ácido nucleico que compreende uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 85 por cento idêntica à seqüência de nucleotídeos de Id. de Seq. N°: 3, mas em que os nucleotídeos que codificam resíduos de aminoácidos que conferem resistência à proteólise, redução da agregação ou outras propriedades aos mutantes de polipeptídeo de FGF21 não foram adicionalmente modificados. Em outras palavras, com a exceção dos resíduos na seqüência do mutante de FGF21 que foram modificados para conferir resistência à proteólise, redução da agregação, ou outras propriedades, cerca de 15 por cento de todos os outros resíduos de aminoácidos na seqüência do mutante de FGF21 podem ser modificados. Por exemplo, no mutante de FGF21 Q173E, até 15 por cento de todos os resíduos de aminoácidos diferentes do resíduo de ácido glutâmico, que foi substituído por glutamina na posição 173, podem ser modificados. A presente invenção engloba também uma molécula de ácido nucleico que compreende uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 90 por cento, ou cerca de 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento, idêntica à seqüência de nucleotídeos de Id. de Seq. N°: 3, mas em que os nucleotídeos que codificam resíduos de aminoácidos que conferem propriedades de resistência a proteólise ou redução da agregação aos mutantes de polipeptídeo de FGF21 codificados não foram modificados. Tais moléculas de ácido nucleico codificam polipeptídeos mutantes de FGF21 que possuem pelo menos uma atividade do polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem.
O termo “mutante de polipeptídeo de FGF21 biologicamente ativo” refere-se a qualquer mutante de polipeptídeo de FGF21 aqui descrito que possui uma atividade do polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem, como a capacidade de diminuir a glicemia, insulina, triglicerídeo, ou colesterol; reduzir o peso corporal; e melhorar a tolerância à glicose, gasto de energia, ou sensibilidade à insulina, a despeito do tipo ou número de modificações que foram introduzidas no mutante de polipeptídeo de FGF21. Os mutantes de polipeptídeo de FGF21 que possuem um nível um tanto diminuído de atividade de FGF21 em relação ao polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem podem ser considerados como sendo mutantes de polipeptídeo de FGF21 biologicamente ativos.
Os termos “quantidade eficaz” e “quantidade terapeuticamente eficaz” referem-se à quantidade de um mutante de polipeptídeo de FGF21 usada para sustentar um nível observável de uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem, como a capacidade de diminuir os níveis de glicemia, insulina, triglicerídeo,ou colesterol; reduzir o peso corporal; ou melhorar a tolerância à glicose, gasto de energia ou sensibilidade à insulina.
O termo “veículo farmaceuticamente aceitável” ou “veículo fisiologicamente aceitável” como aqui usado refere-se a um ou mais materiais da formulação adequados para realizar ou melhorar a liberação de um mutante de polipeptídeo de FGF21.
O termo “antígeno” refere-se a uma molécula ou uma porção de uma molécula que é capaz de ser ligada por um anticorpo, e adicionalmente que é capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos que são capazes de se ligar a um epitopo daquele antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais epitopos.
O termo “Fc nativo” refere-se a molécula ou seqüência que compreende a seqüência de um fragmento de não ligação ao antígeno que resulta da digestão de anticorpo inteiro ou produzido por outro meio, em forma monomérica ou multimérica, e pode conter a região de dobradiça. A fonte de imunoglobulina original do Fc nativo é preferivelmente de origem humana e pode ser qualquer uma das imunoglobulinas, embora IgG1 e IgG2 sejam preferidas.
As moléculas de Fc nativo são feitas de polipeptídeos monoméricos que podem ser ligados em formas diméricas ou multiméricas por associação covalente (ou seja, ligações de dissulfeto) e associação não covalente. O número de ligações de dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativo varia de 1 a 4 dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA e IgE) ou subclasse (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl e IgGA2). Um exemplo de um Fc nativo é um dímero ligado por dissulfeto que resulta da digestão com papaína de um IgG (veja, Ellison e cols., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). O termo “Fc nativo” como aqui usado é genérico às formas monoméricas, diméricas e multiméricas. Um exemplo de uma seqüência de polipeptídeo Fc é apresentado em Id. de Seq. N°: 13.
O termo “variante de Fc” refere-se a uma molécula ou seqüência que é modificada de um Fc nativo mas ainda compreende um sítio de ligação para o receptor salvage, FcRn (receptor de Fc neonatal). As Publicações
Internacionais Nos. WO 97/34631 e WO 96/32478 descrevem exemplos de variantes de Fc, bem como interação com o receptor salvage, e são aqui incorporadas por referência. Portanto, o termo “variante de Fc” pode compreender uma molécula ou seqüência que é humanizada a partir de um Fc nativo não humano. Além disso, um Fc nativo compreende regiões que podem ser removidas porque elas fornecem características estruturais ou atividade biológica que não são necessárias para as moléculas de fusão do mutante de FGF21s da presente invenção. Portanto, o termo “variante de Fc” compreende uma molécula ou seqüência que é desprovida de um ou mais sítios ou resíduos de Fc nativo, ou em que um ou mais sítios ou resíduos de Fc foram modificados, que afetam ou estão envolvidos em: (1) formação de ligação de dissulfeto, (2) incompatibilidade com uma célula hospedeira selecionada, (3) heterogeneidade do terminal N após expressão em uma célula hospedeira selecionada, (4) glicosilação, (5) interação com complemento, (6) ligação a um receptor de Fc diferente de um receptor salvage, ou (7) citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). As variantes de Fc são descritas em maiores detalhes a seguir.
O termo “domínio de Fc” engloba um Fc nativo e variantes de Fc e seqüências como acima definido. Assim como com variantes de Fc e moléculas de Fc nativo, o termo “domínio de Fc” inclui moléculas em forma monomérica ou multimérica, digeridas de anticorpo total ou produzidas por outro meio. Em algumas modalidades da presente invenção, um domínio de Fc pode ser fundido a FGF21 ou a um mutante de FGF21 (incluindo uma forma truncada de FGF21 ou um mutante de FGF21) por meio, por exemplo, de uma ligação covalente entre o domínio de Fc e a seqüência de FGF21. Tais proteínas de fusão podem formar multímeros por meio da associação dos domínios de Fc e essas proteínas de fusão e seus multímeros são um aspecto da presente invenção. 2. Mutante de FGF21 sítio-específicos
O termo “mutante de FGF21 sítio-específico” ou “mutante de FGF21 substituído” refere-se a um polipeptídeo mutante de FGF21 que tem uma seqüência de aminoácidos que difere da seqüência de aminoácidos de uma seqüência de polipeptídeos de FGF21 de ocorrência natural, por exemplo, Id. de Seq. Nos: 2 e 4 e variantes destas. Mutantes de FGF21 sítio-específicos podem ser gerados por introdução de substituições de aminoácido, conservadoras ou não conservadoras, e pelo uso de aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, em posições particulares do polipeptídeo de FGF21.
“Substituição conservadora de aminoácido” pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo (ou seja, um resíduo encontrado em uma dada posição da seqüência de polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem) com um resíduo não nativo (ou seja, resíduo que não é encontrado em uma dada posição da seqüência de polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem) de modo que há pouco ou nenhum efeito sobre a polaridade ou carga do resíduo aminoácido naquela posição. Substituições conservadoras de aminoácido também englobam resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural que são tipicamente incorporados por síntese de peptídeo química em vez de síntese em sistemas biológicos. Esses incluem peptidomiméticos, e outras formas reversas ou invertidas de porções de aminoácido.
Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades comuns de cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly, Pro; e (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
As substituições conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por outro membro da mesma classe. As substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por um membro de outra classe.
Substituições de aminoácido desejadas (conservadoras 5 ou não conservadoras) podem ser determinadas por aqueles habilitados na técnica no momento em que tais substituições são desejadas. Uma lista de exemplo (não limitante) de substituições de aminoácido é apresentada adiante na Tabela 1. Tabela 1
Figure img0001
Figure img0002
3. Polipeptídeos de FGF21 truncados
Uma modalidade da presente invenção é direcionada a formas truncadas do polipeptídeo de FGF21 maduro. Essa modalidade da presente invenção surge de um esforço para identificar polipeptídeos de FGF21 truncados que são capazes de fornecer uma atividade que é similar, e em alguns casos superior, às formas não truncadas do polipeptídeo de FGF21 maduro.
Como aqui usado, o termo “polipeptídeo de FGF21 truncado” refere-se a um polipeptídeo de FGF21 em que os resíduos de aminoácidos foram removidos da extremidade de terminal amino (ou terminal N) do polipeptídeo de FGF21, resíduos de aminoácidos foram removidos da extremidade do terminal carboxil (ou terminal C) do polipeptídeo de FGF21, ou resíduos de aminoácidos foram removidos de ambas as extremidades de terminais amino e carboxil do polipeptídeo de FGF21. Os vários truncamentos aqui revelados foram preparados como aqui descrito nos Exemplos 3 e 6.
A atividade de polipeptídeos de FGF21 truncado N- terminalmente e polipeptídeos de FGF21 truncado C- terminalmente pode ser avaliada com o uso de um ensaio in vitro de ELK-luciferase como descrito no Exemplo 4. Detalhes específicos dos ensaios in vitro que podem ser usados para examinar a atividade de polipeptídeos de FGF21 truncados podem ser encontrados no Exemplo 4.
A atividade dos polipeptídeos de FGF21 truncados da presente invenção também pode ser avaliada em um ensaio in vivo, como camundongos ob/ob como mostrado nos Exemplos 5 e 7. Geralmente, para avaliar a atividade in vivo de um polipeptídeo de FGF21 truncado, o polipeptídeo de FGF21 truncado pode ser administrado a um animal de teste por via intraperitoneal. Depois de um período de incubação desejado (por exemplo, uma hora ou mais), uma amostra de sangue pode ser retirada, e os níveis de glicemia podem ser medidos. Detalhes específicos dos ensaios in vivo que podem ser usados para examinar a atividade de polipeptídeos de FGF21 truncados podem ser encontrados nos Exemplos 5 e 7. a. Truncamentos de terminal N
Em algumas modalidades da presente invenção, os truncamentos do terminal N compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácidos da extremidade de terminal N do polipeptídeo de FGF21 maduro. Como demonstrado, por exemplo, no Exemplo 5 e Figura 3, polipeptídeos de FGF21 truncados que têm truncamentos de terminal N de menos que 9 resíduos de aminoácidos retêm a capacidade do polipeptídeo de FGF21 maduro de diminuir a glicemia em um indivíduo. Portanto, em modalidades particulares, a presente invenção engloba formas truncadas do polipeptídeo de FGF21 maduro ou mutantes de polipeptídeo de FGF21 que têm truncamentos de terminal N de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácidos. b. Truncamentos de terminal C
Em algumas modalidades da presente invenção, truncamentos do terminal C compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de aminoácidos da extremidade de terminal C do polipeptídeo de FGF21 maduro. Como demonstrado, por exemplo, no Exemplo 4 e Figura 1B, polipeptídeos de FGF21 truncados que têm truncamentos de terminal C de menos que 13 resíduos de aminoácidos exibiram uma eficácia de pelo menos 50% da eficácia de FGF21 de tipo selvagem em um ensaio in vitro de ELK-luciferase, indicando que esses mutantes de FGF21 retêm a capacidade do polipeptídeo de FGF21 maduro de diminuir a glicemia em um indivíduo. Portanto, em modalidades particulares, a presente invenção engloba formas truncadas do polipeptídeo de FGF21 maduro ou mutantes de polipeptídeo de FGF21 que têm truncamentos de terminal C de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de aminoácidos. c. Truncamentos de terminal N e terminal C
Em algumas modalidades da presente invenção, polipeptídeos de FGF21 truncados podem ter uma combinação de truncamentos de terminal N e terminal C. Polipeptídeos de FGF21 truncados que têm uma combinação de truncamentos de terminal N terminal C partilham a atividade de polipeptídeos de FGF21 truncados correspondentes que têm ou o truncamento de terminal N ou de terminal C isoladamente. Em outras palavras, os polipeptídeos de FGF21 truncados que têm ambos os truncamentos de terminal N de menos que 9 resíduos de aminoácidos e truncamentos de terminal C de menos que 13 resíduos de aminoácidos possuem atividade de diminuição da glicemia similar ou maior que os polipeptídeos de FGF21 truncados que têm truncamentos de terminal N de menos que 9 resíduos de aminoácidos ou polipeptídeos de FGF21 truncados que têm truncamentos de terminal C de menos que 13 resíduos de aminoácidos. Portanto, em modalidades particulares, a presente invenção engloba formas truncadas do polipeptídeo de FGF21 maduro ou mutantes de polipeptídeo de FGF21 que têm truncamentos de terminal N de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácidos e truncamentos de terminal C de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de aminoácidos.
Como com todos os mutantes de FGF21 da presente invenção, os polipeptídeos de FGF21 truncados podem compreender opcionalmente um resíduo de metionina amino-terminal, que pode ser introduzido por mutação direcionada ou como um resultado de um processo de expressão bacteriana.
Os polipeptídeos de FGF21 truncados da presente invenção podem ser preparados como descrito nos Exemplos 3 e 6. Aqueles habilitados na técnica, familiares com técnicas padrão de biologia molecular, podem empregar conhecimento, junto com a atual revelação, para a confecção e uso dos polipeptídeos de FGF21 truncados da presente invenção. As técnicas padrão podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, cultura de tecido e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Veja, por exemplo, Sambrook e cols., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, supra, que é aqui incorporado por referência para qualquer objetivo. Técnicas de reação enzimática e de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica, ou como aqui descrito. A menos que sejam fornecidas definições específicas, as nomenclaturas utilizadas, e os procedimentos laboratoriais e técnicas, de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para síntese química; análise química; preparação farmacêutica, formulação e liberação; e tratamento de pacientes.
Os polipeptídeos de FGF21 truncados da presente invenção também podem ser fundidos a outra entidade, que pode transmitir propriedades adicionais ao polipeptídeo de FGF21 truncado. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídeo de FGF21 truncado pode ser fundido a uma seqüência de Fc. Tal fusão pode ser realizada com o uso de métodos conhecidos de biologia molecular e/ou o guia aqui fornecido. Os benefícios de tais polipeptídeos de fusão, bem como de métodos para confeccionar tais polipeptídeos de fusão, são discutidos em maiores detalhes nesta especificação. 4. Mutantes de FGF21 resistentes à proteólise
Como descrito no Exemplo 8, foi constatado que FGF21 maduro sofre degradação in vivo, o que foi determinado como surgindo de ataque proteolítico. Foi constado que a degradação in vivo de FGF21 maduro leva a meia-vida de eficácia mais curta, o que pode afetar de forma adversa o potencial terapêutico da molécula. Portanto, um estudo direcionado foi realizado para identificar mutantes de FGF21 que exibem uma resistência à proteólise.
Como um resultado dessa investigação, os sítios no polipeptídeo de FGF21 maduro que foram determinados para serem particularmente suscetíveis à proteólise incluem a ligação de peptídeo entre os resíduos de aminoácidos nas posições 4-5, 20-21, 151-152 e 171-172.
Um estudo amplo e direcionado foi realizado para identificar substituições particulares que eliminam o efeito proteolítico observados embora não afete a atividade da proteína a um grau inaceitável. As Tabelas 8 e 11 evidenciam alguns dos mutantes que foram preparados e testados. Como descrito, por exemplo, nos Exemplos 13 e 14, nem todos os mutantes de FGF21 exibiram um perfil ideal; alguns mutantes conferiram resistência à proteólise, mas ao custo de atividade comprometida de FGF21. Outras mutações retiveram a atividade de FGF21 mas não conferiram resistência à proteólise. Vários mutantes, incluindo, por exemplo, FGF21 P171G, retiveram um nível similar de atividade como FGF21 de tipo selvagem embora também exibam resistência à degradação proteolítica.
Um critério de seleção para a identificação de mutantes de FGF21 resistentes à proteólise desejáveis era que a atividade do mutante de FGF21 fosse essencialmente a mesma, ou maior que, a atividade de FGF21 de tipo selvagem. Portanto, outra modalidade da presente invenção é direcionada a mutantes de FGF21 que são resistentes à proteólise e ainda retêm a atividade que é essencialmente a mesma, ou maior que, a de FGF21 de tipo selvagem. Embora menos desejável em alguns casos, mutantes de FGF21 que são resistentes à proteólise mas exibem alguma atividade diminuída formam outra modalidade da presente invenção. Em alguns casos pode ser desejável manter um grau de proteólise, e, conseqüentemente, mutantes de FGF21 que permitem que ocorra algum grau de proteólise também formam outra modalidade da presente invenção.
Como com todos os mutantes de FGF21 da presente invenção, os mutantes de FGF21 resistentes à proteólise da presente invenção podem ser preparados como aqui descrito. Aqueles habilitados na técnica, por exemplo, aqueles familiares com técnicas padrão de biologia molecular, podem empregar aquele conhecimento, junto à atual revelação, para confeccionar e usar os mutantes de FGF21 resistentes à proteólise da presente invenção. As técnicas padrão podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, cultura de tecido e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Veja, por exemplo, Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, que é aqui incorporado por referência para qualquer objetivo. Técnicas de reação enzimática e de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comente realizado na técnica, ou como aqui descrito. A menos que sejam fornecidas definições específicas, as nomenclaturas utilizadas, e os procedimentos laboratoriais e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritas, são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para síntese química; análise química; preparação farmacêutica, formulação e liberação; e tratamento de pacientes.
Os mutantes de FGF21 resistentes à proteólise da presente invenção podem ser fundidos a outra entidade, que pode transmitir propriedades adicionais ao mutante de FGF21 resistente à proteólise. Em uma modalidade da presente invenção, um mutante de FGF21 resistente à proteólise pode ser fundido a uma seqüência de Fc de IgG, por exemplo, Id. de Seq. N°: 13. Tal fusão pode ser realizada com o uso de métodos conhecidos de biologia molecular e/ou o guia aqui fornecido. Os benefícios de tais polipeptídeos de fusão, bem como de métodos para confeccionar tais polipeptídeos de fusão, são conhecidos e são discutidos em maiores detalhes nesta especificação. 5. Mutantes de FGF21 de redução da agregação
Como descrito no Exemplo 15, uma propriedade do polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem é sua propensão a agregar. Em concentrações acima de cerca de 5 mg/ml, a taxa de agregação é alta em temperatura ambiente. Como mostrado e descrito nesta especificação, a taxa de agregação para o polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem é dependente tanto da concentração quanto da temperatura.
A agregação pode se mostrar como um desafio quando trabalhamos com FGF21 de tipo selvagem nessas concentrações, como no contexto de uma formulação terapêutica. Portanto, um estudo direcionado foi realizado para identificar mutantes de FGF21 que exibem agregação de FGF21 reduzida. Os mutantes de FGF21 resultantes foram então testados para a propensão a agregar em várias concentrações.
Um estudo amplo e direcionado foi realizado para identificar substituições particulares que eliminam ou reduzem o efeito de agregação observado de FGF21 de tipos selvagem embora não afete a atividade da proteína a um grau inaceitável. A abordagem para identificar mutantes de redução da agregação adequados é descrita no Exemplo 15. A Tabela 16 evidencia alguns dos mutantes que foram preparados e testados. Como descrito, por exemplo, no Exemplo 17, nem todos os mutantes de FGF21 exibiram um perfil ideal. Alguns mutantes, como FGF21 L58E, tiveram a atividade de FGF21 comprometida e não foram estudados.
Outras mutações, como FGF21 A134E, retiveram a atividade de FGF21 mas não conferiram propriedades de agregação reduzida. Vários mutantes, como FGF21 L98R, retiveram a atividade como FGF21 e também exibiram agregação reduzida. Um mutante, FGF21 A45K, exibiu, de modo surpreendente, atividade aumentada de FGF21 embora também exibindo propriedades de agregação reduzida.
Um critério de seleção para a identificação de mutantes de FGF21 de redução de agregação desejáveis era que a atividade do mutante de FGF21 fosse essencialmente a mesma, ou maior que, a atividade de FGF21 de tipo selvagem. Portanto, outra modalidade da presente invenção é direcionada a mutantes de FGF21 que têm propriedades de agregação reduzida e ainda retêm a atividade de FGF21 que é similar, ou maior que, a de FGF21 de tipo selvagem. Embora menos desejável em alguns casos, mutantes de FGF21 que têm propriedades de agregação reduzida mas exibem alguma atividade diminuída formam outra modalidade da presente invenção. Em alguns casos, pode ser desejável manter um grau de agregação, e, conseqüentemente, mutantes de FGF21 que permitem que ocorra algum grau de agregação também formam outra modalidade da presente invenção.
Como com todos os mutantes de FGF21 da presente invenção, os mutantes de FGF21 de redução de agregação da presente invenção podem ser preparados como aqui descrito. Aqueles habilitados na técnica familiares com técnicas padrão de biologia molecular podem empregar aquele conhecimento, junto à atual revelação, para confeccionar e usar os mutantes de FGF21 de redução de agregação da presente invenção. As técnicas padrão podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, cultura de tecido e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Veja, por exemplo, Sambrook e cols., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, supra, que é aqui incorporado por referência para qualquer objetivo. Técnicas de reação enzimática e de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comente realizado na técnica, ou como aqui descrito. A menos que sejam fornecidas definições específicas, as nomenclaturas utilizadas, e os procedimentos laboratoriais e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritas, são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para síntese química; análise química; preparação farmacêutica, formulação e liberação; e tratamento de pacientes.
Os mutantes de FGF21 de redução de agregação da presente invenção podem ser fundidos a outra entidade, que pode transmitir propriedades adicionais ao mutante de FGF21 de redução de agregação. Em uma modalidade da presente invenção, um mutante de FGF21 de redução de agregação pode ser fundido a uma seqüência de Fc de IgG humana, por exemplo, Id. de Seq. N°: 13. Tal fusão pode ser realizada com o uso de métodos conhecidos de biologia molecular e/ou o guia aqui fornecido. Os benefícios de tais polipeptídeos de fusão, bem como de métodos para confeccionar tais polipeptídeos de fusão, são conhecidos e são discutidos em maiores detalhes nesta especificação. 6. Mutantes de Combinação de FGF21
Como aqui descrito, a seqüência de FGF21 de tipo selvagem possui várias propriedades que podem apresentar desafios significativos quando FGF21 é usado como uma molécula terapêutica. Entre esses desafios estão a suscetibilidade da proteína à degradação e sua propensão por agregação em alta concentração. Depois de um grande esforço para identificar polipeptídeos de FGF21 que superam cada um desses desafios, foi realizado um estudo direcionado para determinar se as substituições de aminoácido que conferem resistência à proteólise e aquelas que conferem propriedades de redução da agregação podem ser combinadas de modo aditivo ou sinérgico em uma seqüência de polipeptídeo único embora mantenha os níveis de atividade que são iguais ou maiores que a atividade de FGF21 de tipo selvagem. Isso representou um desafio significativo, como é conhecido na técnica que a introdução de mutações múltiplas em um dado polipeptídeo pode, algumas vezes, afetar de modo adverso a expressão, atividade e subseqüente fabricação da proteína.
De modo surpreendente, como demonstrado, por exemplo, nos Exemplos 19 e 20, foi constatado que as propriedades desejáveis de vários mutantes de FGF21 podem, de fato, ser combinadas em uma maneira aditiva ou sinérgica para gerar um mutante de FGF21 que tem propriedades farmacêuticas aumentadas. Os mutantes de FGF21 que são resistentes à proteólise têm uma taxa reduzida de agregação, e ainda retêm a atividade que é a mesma, ou maior que, a de FGF21 de tipo selvagem são aqui revelados.
Um critério de seleção para a identificação de mutantes em combinação de FGF21 desejáveis era que a atividade do mutante de FGF21 fosse essencialmente a mesma, ou maior que, a atividade de FGF21 de tipo selvagem. Portanto, outra modalidade da presente invenção é direcionada a mutantes de FGF21 que são resistentes à proteólise e têm propriedades de agregação reduzida e ainda retêm uma atividade de FGF21 que é similar, ou maior que, a de FGF21 de tipo selvagem. Embora menos desejável em alguns casos, mutantes de FGF21 que são resistentes à proteólise e têm propriedades de agregação reduzida mas exibem alguma atividade de FGF21 diminuída formam outra modalidade da presente invenção. Em alguns casos, pode ser desejável manter um grau de proteólise e/ou agregação, e, conseqüentemente, mutantes de FGF21 que permitem que ocorra algum grau de proteólise e/ou agregação também formam outra modalidade da presente invenção.
Como com todos os mutantes de FGF21 da presente invenção, mutantes em combinação de FGF21 da presente invenção podem ser preparados como aqui descrito. Aqueles habilitados na técnica familiares com técnicas padrão de biologia molecular podem empregar aquele conhecimento, junto à atual revelação, para confeccionar e usar os mutantes em combinação de FGF21 da presente invenção. As técnicas padrão podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, cultura de tecido e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Veja, por exemplo, Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, que é aqui incorporado por referência para qualquer objetivo. Técnicas de reação enzimática e de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comente realizado na técnica, ou como aqui descrito. A menos que sejam fornecidas definições específicas, as nomenclaturas utilizadas, e os procedimentos laboratoriais e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritas, são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para síntese química; análise química; preparação farmacêutica, formulação e liberação; e tratamento de pacientes.
Os mutantes em combinação de FGF21 da presente invenção podem ser fundidos a outra entidade, que pode transmitir propriedades adicionais aos mutantes em combinação de FGF21. Em uma modalidade da presente invenção, um mutante em combinação de FGF21 pode ser fundido a uma seqüência de Fc de IgG humana, por exemplo, Id. de Seq. N°: 13. Tal fusão pode ser realizada com o uso de métodos conhecidos de biologia molecular e/ou o guia aqui fornecido. Os benefícios de tais polipeptídeos de fusão, bem como de métodos para confeccionar tais polipeptídeos de fusão, são conhecidos e são discutidos em maiores detalhes nesta especificação. 7. Proteínas de fusão de FGF21
Como aqui usado, o termo “polipeptídeo de fusão de FGF21” ou “proteína de fusão de FGF21” refere-se à fusão de um ou mais resíduos de aminoácidos (como uma proteína ou peptídeo heterólogo) no terminal N ou terminal C de qualquer mutante de polipeptídeo de FGF21 aqui descrito.
Peptídeos e polipeptídeos heterólogos incluem, sem limitação, um epitopo para permitir a detecção e/ou isolação de um mutante de polipeptídeo de FGF21; uma proteína de receptor de transmembrana ou uma porção desta, como um domínio extracelular ou um domínio de transmembrana e intracelular; um ligante ou uma porção deste que se liga a uma proteína de receptor de transmembrana; uma enzima ou porção desta que é cataliticamente ativa; um polipeptídeo ou peptídeo que promove oligomerização, como um domínio zipper de leucina; um polipeptídeo ou peptídeo que aumenta a estabilidade, como uma região constante de imunoglobulina; um anticorpo funcional ou não funcional, ou uma cadeia pesada ou leve deste; e um polipeptídeo que tem uma atividade, como uma atividade terapêutica, diferente dos mutantes de polipeptídeo de FGF21 da presente invenção. Também são englobados pela presente invenção mutantes de FGF21 fundidos a albumina sérica humana (HSA).
As proteínas de fusão de FGF21 podem ser feitas por fusão de seqüências heterólogas no terminal N ou no terminal C de um mutante de polipeptídeo de FGF21. Como aqui descrito, uma seqüência heteróloga pode ser uma seqüência de aminoácidos ou um polímero que não contém aminoácido. As seqüências heterólogas podem ser fundidas diretamente ao mutante de polipeptídeo de FGF21 ou por meio de um ligante ou molécula adaptadora. Um ligante ou molécula adaptadora pode ser um ou mais resíduos de aminoácidos (ou -mers), por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos (ou -mers), preferivelmente de 10 a 50 resíduos de aminoácidos (ou -mers), por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 resíduos (ou -mers), e mais preferivelmente de 15 a 35 resíduos de aminoácidos (ou -mers). Um ligante ou uma molécula adaptadora também pode ser desenhada com um sítio de clivagem para uma endonuclease de restrição de DNA ou para que uma protease permita a separação das porções fundidas. a. Fusões de Fc
Em uma modalidade da presente invenção, um mutante de polipeptídeo de FGF21 é fundido a um ou mais domínios de uma região Fc de IgG humana. Anticorpos compreendem duas partes funcionalmente independentes, um domínio variável conhecido como “Fab,” que se liga a um antígeno, e um domínio constante conhecido como “Fc,” que está envolvido em funções efetoras como ativação de complemento e ataque por células fagocíticas. Um Fc tem uma meia-vida sérica longa, enquanto um Fab é de vida curta (Capon e cols., 1989, Nature 337: 525-31). Quando unidos com uma proteína terapêutica, um domínio de Fc pode fornecer meia-vida mais longa ou incorporar tais funções como ligação de receptor Fc, ligação de proteína A, fixação de complemento, e talvez até mesmo transferência placentária (Capon e cols., 1989).
Análise farmacocinética in vivo indicou que FGF21 humano tem uma meia-vida curta de cerca de 1 hora em camundongos devido ao rápido clearance e degradação in vivo. Portanto, para estender a meia-vida de FGF21, uma seqüência de Fc foi fundida à extremidade de terminal C ou N do polipeptídeo de FGF21. A fusão de uma região Fc ao FGF21 de tipo selvagem, particularmente em Fc fundido ao terminal N de FGF21 de tipo selvagem, não estendeu a meia- vida como esperado, no entanto, o que levou a uma investigação da degradação proteolítica de FGF21 in vivo e a identificação de mutantes de FGF21 que eram resistentes a tal degradação. Tais mutantes são descritos, por exemplo, nos Exemplos 8 e 11, e exibem meias-vidas mais longas que FGF21 de tipo selvagem. Essas e outras proteínas de fusão de FGF21 formam modalidades da presente invenção.
Por toda a revelação, Fc-FGF21 refere-se a uma proteína de fusão em que a seqüência de Fc é fundida ao terminal N de FGF21. De modo similar, por toda a revelação, FGF21-Fc refere-se a uma proteína de fusão em que a seqüência de Fc é fundida ao terminal C de FGF21.
A proteína de fusão de FGF21 resultante pode ser purificada, por exemplo, pelo uso de uma coluna de afinidade de proteína A. Peptídeos e proteínas fundidos a uma região Fc exibem uma meia-vida in vivo substancialmente maior que a contraparte não fundida. Também, uma fusão a uma região Fc permite a dimerização/multimerização do polipeptídeo de fusão. A região Fc pode ser uma região Fc de ocorrência natural, ou pode ser alterada para melhorar certas qualidades, como qualidades terapêuticas, tempo de circulação ou agregação reduzida.
Modificações úteis dos agentes terapêuticos da proteína por fusão com o domínio “Fc” de um anticorpo são discutidas em detalhes da Publicação Internacional No. WO 00/024782, que é aqui incorporada em sua totalidade por referência. Esse documento discute a ligação a um “veículo” como polietileno glicol (PEG), dextrana ou uma região Fc. b. Ligantes de proteína de fusão
Quando da formação de uma proteína de fusão da presente invenção, um ligante pode, mas não precisa, ser empregado. Quando presente, a estrutura química do ligante pode não ser crítica, uma vez que ele age primariamente como um espaçador. O ligante pode ser feito de aminoácidos ligados por ligações de peptídeo. Em algumas modalidades da presente invenção, o ligante é feito de 1 a 20 aminoácidos ligados por ligações de peptídeo, em que os aminoácidos são selecionados dos 20 aminoácidos de ocorrência natural. Em várias modalidades, 1 a 20 aminoácidos são selecionados de aminoácidos glicina, serina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Em algumas modalidades, um ligante é feito de uma maioria de aminoácidos que são impedidos estericamente, como glicina e alanina. Em algumas modalidades, os ligantes são poliglicinas (como (Gly)4 (Id. de Seq. N°:29) e (Gly)5 (Id. de Seq. N°:30)), polialaninas, combinações de glicina e alanina (como poli(Gly-Ala)), ou combinações de glicina e serina (como poli(Gly-Ser)). Outros ligantes adequados incluem: (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser- (Gly)4-Ser (Id. de Seq. N°:23), (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser- (Gly)4-Ser (Id. de Seq. N°:31), (Gly)3-Lys-(Gly)4 (Id. de Seq. N°:32), (Gly)3-Asn-Gly- Ser-(Gly)2 (Id. de Seq. N°:33), (Gly)3-Cys-(Gly)4 (Id. de Seq. N°:34) e Gly-Pro- Asn-Gly-Gly (Id. de Seq. N°:35). Embora tenha sido constatado que um ligante de 15 resíduos de aminoácidos funcione particularmente bem para as proteínas de fusão de FGF21, a presente invenção contempla ligantes de qualquer comprimento ou composição.
Os ligantes aqui descritos são exemplares, e os ligantes que são muito mais longos e que incluem outros resíduos são contemplados pela presente invenção. Ligantes não peptídicos são também contemplados pela presente invenção. Por exemplo, ligantes de alquila como —NH—(CH2)s— C(O)—, em que s = 2 a 20, podem ser usados. Esses ligantes de alquila também podem ser substituídos por qualquer grupo impedidos não estericamente, incluindo, sem limitação, uma alquila inferior (por exemplo, C1—C6), acila inferior, halogênio (por exemplo, Cl, Br), CN, NH2 ou fenila. Um exemplo de ligante não peptídico é um ligante de polietileno glicol, em que o ligante tem um peso molecular de 100 a 5.000 kD, por exemplo, 100 a 500 kD. 8. Mutantes de FGF21 quimicamente modificados
Formas quimicamente modificadas dos mutantes de polipeptídeo de FGF21 aqui descritos, que incluem as formas truncadas de FGF21 aqui descritas, podem ser preparadas por pessoa habilitada na técnica, dadas as revelações aqui descritas. Tais mutantes de FGF21 quimicamente modificados são alterados de tal modo que o mutante de FGF21 quimicamente modificado é diferente de mutante de FGF21 não modificado, no tipo ou localização das moléculas naturalmente anexadas ao mutante de FGF21. Os mutantes de FGF21 quimicamente modificados podem incluir moléculas formadas pela deleção de um ou mais grupos químicos naturalmente anexados.
Em uma modalidade, os mutantes de polipeptídeo de FGF21 da presente invenção podem ser modificados pela anexação covalente de um ou mais polímeros. Por exemplo, o polímero selecionado é tipicamente hidrossolúvel de modo que a proteína à qual ele é anexado não precipite em um ambiente aquoso, como um ambiente fisiológico. Incluída no escopo de polímeros adequados está uma mistura de polímeros. Preferivelmente, para uso terapêutico da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável. Polímeros não hidrossolúveis conjugados a mutantes de polipeptídeo de FGF21 da presente invenção também formam um aspecto da invenção.
Exemplos de polímeros podem ser de qualquer peso molecular e podem ser ramificados ou não ramificados. Os polímeros tipicamente têm um peso molecular médio entre cerca de 2 kDa e cerca de 100 kDa (o termo “cerca de” indicando que, nas preparações de um polímero hidrossolúvel, algumas moléculas pesarão mais e algumas menos que o peso molecular determinado). O peso molecular médio de cada polímero é preferivelmente entre cerca de 5 kDa e cerca de 50 kDa, mais preferivelmente entre cerca de 12 kDa e cerca de 40 kDa, e ainda mais preferivelmente entre cerca de 20 kDa e cerca de 35 kDa.
Polímeros hidrossolúveis adequados ou misturas destes incluem, sem limitação, carboidratos ligados em N ou ligados em O, açúcares, fosfatos, polietileno glicol (PEG) (incluindo as formas de PEG que foram usadas para derivatizar proteínas, incluindo mono-(C1-C10), alcoxi-, ou ariloxi-polietileno glicol), monometoxi-polietileno glicol, dextrana (como dextrana de baixo peso molecular, por exemplo, de cerca de 6 kD), celulose, ou outros polímeros à base de carboidrato, poli-(N-vinil pirrolidona) polietileno glicol, propileno glicol homopolímeros, co-polímeros de óxido de polipropileno/ óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), e polivinil álcool. Também são englobadas pela presente invenção moléculas de entrecruzamento bifuncionais que podem ser usadas para preparar multímeros de mutante de polipeptídeo de FGF21 covalentemente anexados. Também são englobados pela presente invenção mutantes de FGF21 covalentemente anexados a ácido polissiálico.
Em algumas modalidades da presente invenção, um mutante de FGF21 é covalentemente, ou quimicamente, modificado para incluir um ou mais polímeros hidrossolúveis, incluindo, sem limitação, polietileno glicol (PEG), polioxiethileno glicol ou polipropileno glicol. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; e 4.179.337. Em algumas modalidades da presente invenção, um mutante de FGF21 compreende um ou mais polímeros, incluindo, sem limitação, monometoxi-polietileno glicol, dextrana, celulose, outro polímero à base de carboidrato, poli-(N- vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno / óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), polivinil álcool ou misturas de tais polímeros.
Em algumas modalidades da presente invenção, um mutante de FGF21 é covalentemente modificado com subunidades de PEG. Em algumas modalidades, um ou mais polímeros hidrossolúveis são ligados a uma ou mais posições específicas (por exemplo, no terminal N) do mutante de FGF21. Em algumas modalidades, um ou mais polímeros hidrossolúveis são aleatoriamente anexados a uma ou mais cadeias laterais de um mutante de FGF21. Em algumas modalidades, PEG é usado para melhorar a capacidade terapêutica de um mutante de FGF21. Certos métodos são discutidos, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.133.426, que é aqui incorporada por referência para qualquer objetivo.
Em modalidades da presente invenção em que o polímero é PEG, o grupo de PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente, e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio do grupo de PEG será preferivelmente de cerca de 2 kD a cerca de 100 kDa, e mais preferivelmente de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, por exemplo,10, 20, 30, 40 ou 50 kDa. Os grupos de PEG serão geralmente anexados ao mutante de FGF21 por meio de acilação ou alquilação redutora através de um grupo reativo na porção de PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reativo no mutante de FGF21 (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster).
A PEGuilação de um polipeptídeo, incluindo os mutantes de FGF21 da presente invenção, pode ser realizada especificamente com o uso de quaisquer reações de PEGuilação conhecidas na técnica. Tais reações são descritas, por exemplo, nas seguintes referências: Francis e cols., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; Patente Européia Nos. 0 154 316 e 0 401 384; e Patente U.S. No. 4.179.337. Por exemplo, a PEGuilação pode ser realizada por meio de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula reativa de polietileno glicol (ou um polímero hidrossolúvel análogo reativo) como aqui descrito. Para as reações de acilação, um polímero selecionado deve ter um único grupo éster reativo. Para alquilação redutora, um polímero selecionado deve ter um único aldeído reativo. Um aldeído reativo é, por exemplo, polietileno glicol propionaldeído, que é estável em água, ou derivados de mono C1-C10 alcoxi ou ariloxi destes (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.252.714).
Em algumas modalidades da presente invenção, uma estratégia útil para a anexação do grupo PEG a um polipeptídeo envolve a combinação, através da formação de uma ligação conjugada em solução, um peptídeo e uma porção de PEG, cada um portando uma funcionalidade especial que é mutuamente reativa uma com a outra. Os peptídeos pode ser facilmente preparados com síntese convencional de fase sólida. Os peptídeos são “pré-ativados” com um grupo funcional adequado em um sítio específico. Os precursores são purificados e totalmente caracterizados antes da reação com a porção de PEG. A ligação do peptídeo com PEG comumente ocorre em fase aquosa e pode ser facilmente monitorada por HPLC analítica de fase reversa. Os peptídeos PEGuilados podem ser facilmente purificados por HPLC preparatória e caracterizados por HPLC analítica, análise de aminoácido e espectrometria de massa de laser desorption.
Os polímeros de polissacarídeo são outro tipo de polímero hidrossolúvel que pode ser usado para modificação da proteína. Portanto, os mutantes de FGF21 da presente invenção fundidos a um polímero de polissacarídeo formam modalidades da presente invenção. Dextranas são polímeros de polissacarídeo que compreendem subunidades individuais de glicose predominantemente ligadas por ligações alfa 1-6. A dextrana em si é disponível em várias faixas de peso molecular, e é facilmente disponível em pesos moleculares de cerca de 1 kD a cerca de 70 kD. Dextrana é um polímero hidrossolúvel adequado para uso como um veículo por si ou em combinação com outro veículo (por exemplo, Fc). Veja, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 96/11953. O uso de dextrana conjugada a imunoglobulinas terapêuticas ou diagnósticas foi relatado. Veja, por exemplo, Publicação de Patente Européia No. 0 315 456, que é aqui incorporada por referência. A presente invenção também engloba o uso de dextrana de cerca de 1 kD a cerca de 20 kD.
Em geral, a modificação química pode ser realizada sob qualquer condição adequada usada para reagir uma proteína com uma molécula de polímero ativado. Métodos para a preparação de polipeptídeos quimicamente modificados compreenderão geralmente as etapas de: (a) reação do polipeptídeo com a molécula de polímero ativado (como um éster reativo ou derivado de aldeído da molécula do polímero) sob condições pelas quais um mutante de polipeptídeo de FGF21 torna-se anexado a uma ou mais moléculas de polímero, e (b) obtenção dos produtos da reação. As condições de reação ótimas serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e nos resultados desejados. Por exemplo, quanto maior a proporção de moléculas de polímero para proteína, maior a percentagem de molécula de polímero anexada. Em uma modalidade da presente invenção, mutantes de FGF21 quimicamente modificados podem ter uma porção de molécula de polímero única no terminal amino (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.234.784).
Em outra modalidade da presente invenção, os mutantes de polipeptídeo de FGF21 podem ser quimicamente ligados à biotina. Os mutantes de polipeptídeo de FGF21/biotina então são ligados a avidina, resultando em mutantes de polipeptídeo de avidina/biotina/FGF21 tetravalentes. Os mutantes de polipeptídeo de FGF21 tambem podem ser covalentemente ligados a dinitrofenol (DNP) ou trinitrofenol (TNP) e os conjugados resultantes tes precipitaram com anti-DNP ou anti-TNP-IgM para formar conjugados decaméricos com uma valência de 10.
Geralmente, condições que podem ser aliviadas ou 58/145 moduladas pela administração dos presentes mutantes de FGF21 quimicamente modificados incluem aquelas aqui descritas para mutantes de polipeptídeo de FGF21. No entanto, os mutantes de FGF21 quimicamente modificados aqui revelados podem ter atividades adicionais, atividade biológica aumentada ou reduzida, ou outras características, como meia-vida aumentada ou diminuída, quando comparados a mutantes de FGF21 não modificados. 9. Composições terapêuticas de mutantes de FGF21 e administração desses
As composições terapêuticas que compreendem mutantes de FGF21 estao dentro do escopo da presente invenção, e são especificamente contempladas em vista da identificação de várias seqüências de FGF21 mutante que exibem propriedades melhoradas. Tais composições farmacêuticas de mutante de FGF21 podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mutante de polipeptídeo de FGF21 em mistura com um agente de formulação farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável selecionado para adequação com o modo de administração. Materiais aceitáveis de formulação preferivelmente são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas.
A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificação, manutenção, ou conservação, por exemplo, do pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção, ou penetração da composição. Materiais de formulação adequados incluem, sem limitação, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina, ou lisina), antimicrobianos, antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sódio, ou sulfito de sódio hidrogênio), tampões (como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, ou outros ácidos orgânicos), agentes de volume (como manitol ou glicina), agentes de quelação (como ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA)), agentes de complexação (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina, ou hidroxipropil- beta-ciclodextrina), preenchedores, monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos (como glicose, manose, ou dextrinas), proteínas (como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas), agentes colorantes, flavorizantes e de diluição, agentes emulsificantes, polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona), polipeptídeos de baixo peso molecular, contra-íons de formação de sal (como sódio), conservantes (como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, fenetil álcool, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, ou peróxido de hidrogênio), solventes (como glicerina, propileno glicol, ou polietileno glicol), álcoois de açúcar (como manitol ou sorbitol), agentes de suspensão, tensoativos ou agentes umectantes (como pluronics; PEG; ésteres de sorbitano; polissorbatos como polissorbato 20 ou polissorbato 80; triton; trometamina; lecitina; colesterol ou tiloxapal), agentes de aumento de estabilidade (como sacarose ou sorbitol), agentes de aumento de tonicidade (como haletos de metal alcalino — preferivelmente cloreto de sódio ou potássio— ou manitol sorbitol), veículos de liberação, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), e edições subseqüentes dos mesmos, aqui incorporados por referência para qualquer objetivo).
A composição farmacêutica ótima será determinada por um profissional jhabilitado dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato de liberação, e da dosagem desejada (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra). Tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa de clearance in vivo do mutante de polipeptídeo de FGF21.
O veículo ou carreador primário em uma composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso em natureza. Por exemplo, um veículo ou carreador para injeção pode ser água, solução salina fisiológica, ou fluido cefalorraquidiano artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são exemplos adicionais de veículos. Outros exemplos de composições farmacêuticas compreendem tampão Tris de pH cerca de 7,0-8,5, ou tampão de acetato de pH de cerca de 4,0-5,5, que também pode incluir sorbitol ou um substituto adequado. Em uma modalidade da presente invenção, as composições de mutante de polipeptídeo de FGF21 podem ser preparadas para estocagem por mistura da composição selecionada que tem o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcionais(Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Além disso, o produto do mutante de polipeptídeo de FGF21 pode ser formulado como um liofilizado com o uso de excipientes adequados como sacarose.
As composições farmacêuticas do mutante de polipeptídeo de FGF21 pode ser selecionadas para liberação parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para liberação através do trato digestivo, como por via oral. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da habilidade do profissional.
Os componentes da formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis para o local da administração. Por exemplo, tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou em um pH levemente menor, tipicamente em uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.
Quando é contemplada a administração parenteral, as composições terapêuticas para uso nessa invenção podem estar na forma de uma solução aquosa livre de pirógeno, parenteralmente aceitável que compreende o mutante de polipeptídeo de FGF21 desejado em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril em que um mutante de polipeptídeo de FGF21 é formulado como uma solução estéril, solução isotônica, adequadamente conservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas bio-erosíveis, compostos poliméricos (como ácido polilático ou ácido poliglicólico), glóbulos, ou lipossomos, que fornecem uma liberação controlada ou sustentada do produto que pode ser então liberação por meio de uma injeção de depósito. Ácido hialurônico também pode ser usado, e esse pode ter o efeito de promoção de duração sustentada na circulação. Outros meios adequados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos de liberação de fármaco implantável.
Em uma modalidade, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, um mutante de polipeptídeo de FGF21 pode ser formulado como um pó seco para inalação. As soluções de inalação do mutante de polipeptídeo de FGF21 também podem ser formuladas com um propelente para liberação em aerossol. Ainda em outra modalidade, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é também descrita na Publicação Internacional No. WO 94/20069, que descreve a liberação pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.
É também contemplado que certas formulações podem ser administradas por via oral. Em uma modalidade da presente invenção, os mutantes de polipeptídeo de FGF21 que são administrados desse modo podem ser formulados com ou sem aqueles carreadores comumente usados na composição de formas de dosagem sólidas como comprimidos e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser desenhada para liberar a porção ativa da formulação no ponto no trato gastrintestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção do mutante de polipeptídeo de FGF21. Diluentes, flavorizantes, ceras de baixo ponto de fusão, [óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimido, e aglutinantes também podem ser empregados.
Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de mutantes de polipeptídeo de FGF21 em uma mistura com excipientes atóxicos que são adequados para a confecção de comprimidos. Por dissolução dos comprimidos em água estéril, ou outro veículo adequado, as soluções podem ser preparadas em forma de dose unitária. Excipientes adequados incluem, sem limitação, diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose, ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, como amido, gelatina, ou acácia; ou agentes lubrificantes como estearato de magnésio, ácido esteárico, ou talco.
Composições farmacêuticas de mutante de polipeptídeo de FGF21 adicionais serão evidentes para aqueles habilitados na técnica, incluindo formulações que envolvem mutantes de polipeptídeo de FGF21 em formulações de liberação sustentada ou controlada. Técnicas para a formulação de vários outros meios de liberação sustentada ou controlada, como carreadores de lipossomo, micropartículas bio-erosíveis ou glóbulos porosos e injeções de depósito, são também conhecidas para aqueles habilitados na técnica (veja, por exemplo, Publicação Internacional No. WO 93/15722, que descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a liberação de composições farmacêuticas, e Wischke & Schwendeman, 2008, Mt. J. Pharm. 364: 298-327, e Freiberg & Zhu, 2004, Mt. J. Pharm. 282: 1-18, que discutem a preparação e uso de microesfera/micropartícula).
Exemplos adicionais de preparações de liberação sustentada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos com forma, por exemplo filmes, ou microcápsulas. As matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidas (Patente U.S. No. 3.773.919 e Patente Européia No. 0 058 481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman e cols., 1983, Biopolymers 22: 547-56), poli(2- hidroxietil-metacrilato) (Langer e cols., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98 105), etileno vinil acetato (Langer e cols., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Patente Européia No. 0 133 988). As composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomos, que podem ser preparados por qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Epstein e cols., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92; e Patentes Européias Nos. 0 036 676, 0 088 046, e 0 143 949.
A composição farmacêutica do mutante de polipeptídeo de FGF21 a serem usadas para administração in vivo devem ser tipicamente estéreis. Isso pode ser realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização com o uso desse método pode ser conduzida antes, ou depois, da liofilização e reconstituição. A composição para administração parenteral pode ser estocada em forma liofilizada ou em uma solução. Além disso, as composições parenterais geralmente são colocadas em um recipiente que tem uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa que tem uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
Uma vez que a composição farmacêutica tenha sido formulada, ela pode ser estocada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser estocadas em uma forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que requer reconstituição antes da administração.
Em uma modalidade específica, a presente invenção é direcionada a kits para a produção de uma unidade de administração de dose única. Os kits podem conter um primeiro recipiente que tem uma proteína seca e um segundo recipiente que tem uma formulação aquosa. Também são incluídos dentro do escopo dessa invenção kits que contêm seringas preenchidas únicas e preenchidas de múltiplas câmaras (por exemplo, seringas líquidas e lio-seringas).
A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de mutante de polipeptídeo de FGF21 a ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto e objetivo terapêutico. Uma pessoa habilitada na técnica perceberá que os níveis adequados de dosagem para tratamento irão variar dependendo, em parte, da molécula liberada, da indicação para a qual o mutante de polipeptídeo de FGF21 está sendo usado, da via de administração, e do tamanho (peso corporal, superfície corporal, ou tamanho do órgão) e condição (a idade e saúde geral do paciente). Portanto, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ótimo. Uma dosagem típica pode variar de cerca de 0,1 μg/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Em outras modalidades, a dosagem pode variar de 0,1 μg/kg até cerca de 100 mg/kg; ou μg/kg até cerca de 100 mg/kg; ou 5 μg/kg, 10 μg/kg, 15 μg/kg, 20 μg/kg, 25 μg/kg, 30 μg/kg, 35 μg/kg, 40 μg /kg, 45 μg/kg, 50 μg/kg, 55 μg/kg, 60 μg/kg, 65 μg/kg, 70 μg/kg, 75 μg/kg, até cerca de 100 mg/kg. Ainda em outra modalidades, a dosagem pode ser 50 μg/kg, 100 μg/kg, 150 μg/kg, 200 μg/kg, 250 μg/kg, 300 μg/kg, 350 μg/kg, 400 μg/kg, 450 μg/kg, 500 μg/kg, 550 μg/kg, 600 μg/kg, 650 μg/kg, 700 μg/kg, 750 μg/kg, 800 μg/kg, 850 μg/kg, 900 μg/kg, 950 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg, 300 μg/kg, 400 μg/kg, 500 μg/kg, 600 μg/kg, 700 μg/kg, 800 μg/kg, 900 μg/kg, 1.000 μg/kg, 2.000 μg/kg, 3.000 μg/kg, 4.000 μg/kg, 5.000 μg/kg, 6.000 μg/kg, 7.000 μg/kg, 8.000 μg/kg, 9.000 μg/kg ou 10 mg/kg.
A freqüência da dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos do mutante de polipeptídeo de FGF21 na formulação sendo usada. Tipicamente, um clínico administrará a composição até que seja atingida uma dosagem que atinja o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única, como duas ou mais doses (que podem ou mão conter a mesma quantidade da molécula desejada) pelo tempo, ou como uma infusão contínua por meio de um dispositivo de implantação ou cateter. Um refinamento adicional da dosagem adequada é rotineiramente feito por aqueles habilitados na técnica e está dentro do âmbito de tarefas rotineiramente realizadas por eles. As dosagens adequadas podem ser confirmadas pelo uso de um dado dose-resposta adequado.
A via de administração da composição farmacêutica está de acrodo com métodos conhecidos, por exemplo, oral; através de injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparênquima), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal, ou intralesional; por sistemas de liberação sustentada (que podem ser injetados); ou por dispositivos de implante. Quando desejado, as composições podem ser administradas por injeção em bolo ou continuamente por infusão, ou por dispositivo de implantação.
Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode ser administrada localmente por meio de implante de uma membrana, esponja ou outro material adequado no qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Quando um dispositivo de implante é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e a liberação da molécula desejada pode ser por meio de difusão, bolo de liberação por tempo, ou administração contínua. 10. Usos terapêuticos de mutantes de polipeptídeo de FGF21
Os mutantes de polipeptídeo de FGF21 podem ser usados para tratar, diagnosticar, melhorar, ou prevenir inúmeras doenças, distúrbios, ou condições, que incluem, sem limitação distúrbios metabólicos. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico a ser tratado é diabetes, por exemplo, diabetes tipo 2. Em outra modalidade, o distúrbio metabólico é obesidade. Outra modalidades inclui condições ou distúrbios metabólicos como dislipidemia; hipertensão; hepatoesteaotose, como esteatohepatite não alcoólica (NASH); doença cardiovascular, como aterosclerose; e envelhecimento.
Em aplicação, um distúrbio ou condição como diabetes ou obesidade pode ser tratado por administração de um mutante de polipeptídeo de FGF21 como aqui descrito a um paciente que dele necessita na quantidade de uma dose terapeuticamente eficaz. A administração pode ser realizada como aqui descrito, como por injeção IV, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, ou via oral na forma de um comprimido ou formulação líquida. Na maior parte das situações, uma dosagem desejada pode ser determinada por um clínico, como aqui descrito, e pode representar uma dose terapeuticamente eficaz do mutante de polipeptídeo de FGF21. Estará aparente para aqueles habilitados na técnica que uma dose terapeuticamente eficaz de mutante de polipeptídeo de FGF21 dependerá, entre outros, do esquema de administração, da dose unitária de antígeno administrado, se a molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo é administrado em combinação com outros agentes terapêuticos, do estado imune e da saúde do receptor. O termo “dose terapeuticamente eficaz”, como aqui usado, significa que a quantidade de mutante de polipeptídeo de FGF21 que desperta a resposta biológica ou medicinal em um sistema de tecido, animal, ou ser humano acompanhado por um pesquisador, médico, ou outro clínico, que inclui o alívio dos sintomas da doença ou distúrbio sendo tratado. 11. Anticorpos
Anticorpos e fragmentos de anticorpo que se ligam especificamente aos polipeptídeos mutantes de FGF21 da presente invenção mas não se ligam especificamente aos polipeptídeos de FGF21 de tipo selvagem são contemplados e estão dentro do escopo da presente invenção. Os anticorpos podem ser policlonais, incluindo policlonal mono- específico; monoclonal (MAbs); recombinante; quimérico; humanizado, como região de determinação de complementaridade (CDR)-enxertado; humano; de cadeia única; e/ou bi-específico; bem como fragmentos; variantes; ou moléculas quimicamente modificadas desses. Os fragmentos de anticorpo incluem aquelas porções do anticorpo que se ligam especificamente a um epitopo em um mutante de polipeptídeo de FGF21.
Exemplos de tais fragmentos incluem fragmentos Fab e F(ab') gerados por clivagem enzimática de anticorpos de comprimento total. Outros fragmentos de ligação incluem aqueles gerados por técnicas de DNA recombinante, como a expressão de plasmídeos recombinantes que contêm seqüências de ácidos nucleicos que codificam regiões variáveis de anticorpo.
Os anticorpos policlonal direcionados para um mutante de polipeptídeo de FGF21 geralmente são produzidos em animais (por exemplo, coelhos ou camundongos) por meio de múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais do mutante de polipeptídeo de FGF21 e um adjuvante. Pode ser útil conjugr um mutante de polipeptídeo de FGF21 a uma proteína carreadora que é imunogênica na espécie a ser imunizada, como hemocianina keyhole limpet, albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja. Além disso, agentes de agregação como alume são usados para aumentar a resposta imune. Depois da imunização, retira-se sangue dos animais e o soro é analisado para título de anticorpo anti-FGF21 mutante.
Os anticorpos monoclonais direcionados para mutantes de polipeptídeo de FGF21 podem ser produzidos com o uso de qualquer método que forneça a produção de moléculas de anticorpo por linhagens de células contínuas em cultura. Exemplos de métodos adequados para a preparação de anticorpos monoclonais incluem os métodos de hibridoma de Kohler e cols., 1975, Nature 256: 495-97 e o método de hibridoma de célula B humana (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur e cols., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). Também são fornecidas pela invenção linhagens de células de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais reativos com os polipeptídeos mutantes de FGF21.
Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser modificados para uso como terápicos. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal é um anticorpo “quimérico” em que uma porção da cadeia pesada (H) e/ou leve (L) é idêntica ou homóloga a uma seqüência correspondente em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou q eu pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, embora o restante da cadeia seja idêntica ou homóloga a uma seqüência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo. Também são incluídos fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 4.816.567; Morrison e cols., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-55.
Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal da invenção é um anticorpo “humanizado”. Métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.585.089 e 5.693.762. Geralmente, um anticorpo humanizados tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos a ele a partir de uma fonte que é não humana.
A humanização pode ser realizada, por exemplo, com a utilização de métodos descritos na técnica (veja, por exemplo, Jones e cols., 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann e cols., 1998, Nature 332: 323-27; Verhoeyen e cols., 1988, Science 239: 1534-36), por substituição de pelo menos uma porção de uma região de determinação de complementaridade de roedor pelas regiões correspondentes de um anticorpo humano.
Também são englobados pela invenção anticorpos humanos que se ligam aos polipeptídeos mutantes de FGF21 da presente invenção. Com o uso de animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena, tais anticorpos são produzidos por imunização com um antígeno de mutante de FGF21 (ou seja, que tem pelo menos 6 aminoácidos contíguos), opcionalmente conjugados a um carreador. Veja, por exemplo, Jakobovits e cols., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 2551-55; Jakobovits e cols., 1993, Nature 362: 255-58; Bruggermann e cols., 1993, Year in Immuno. 7: 33. Em um método, tais animais transgênicos são produzidos por incapacitação dos loci endógenos que codificam as cadeia de imunoglobulina pesada e leve neles, e inserção dos loci que codificam proteínas de cadeia pesada e leve no genoma desses. Os animais parcialmemnte modificados, ou seja, animais que têm menos que o complemento total de modificações, são então reproduzidos de foram cruzada para obter um animal que tenha todas as modificações do sistema imune desejadas.
Quando administrado com um imunógeno, esses animais transgênicos produzem anticorpos com seqüências de aminoácidos humanas (em vez de, por exemplo, murídea), incluindo regiões variáveis que são imuno-específicas para esses antígenos. Veja, por exemplo, a Publicação Internacional Nos. WO 96/33735 e WO 94/02602. Métodos adicionais são descritos na Patente U.S. No. 5.545.807, Publicação Internacional Nos. WO 91/10741 e WO 90/04036, e na Patente Européia No. 0 546 073. OS anticorpos humanos também podem ser produzidos pela expressão de DNA recombinante em células hospedeiras ou por expressão em células de hibridoma como aqui descrito.
Em uma modalidade alternativa, os anticorpos humanos também podem ser produzidos a partir de bibliotecas de apresentação de fago (veja, por exemplo, Hoogenboom e cols., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks e cols., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581). Esses processos imitam a seleção imune através da apresentação de repertórios de anticorpo na superfície de bacteriófago filamentoso, e subseqüente seleção de fago por sua ligação a um antígeno de escolha. Tal técnica é descrita na Publicação Internacional No. WO 99/10494, que descreve a isolação de anticorpos de alta afinidade e agonistas funcionais para receptores de MPL- e msk- com o uso de tal abordagem.
Os anticorpos quiméricos, enxertados por CDR, e humanizados são tipicamente produzidos por métodos recombinantes. Ácidos nucleicos que codificam os anticorpos são introduzidos em células hospedeiras e expressos com o uso de materiais e procedimentos aqui descritos. Em uma modalidade, os anticorpos são produzidos em células hospedeiras de mamífero, como células CHO. Os anticorpos monoclonais (por exemplo, humanos) podem ser produzidos pela expressão de DNA recombinante em células hospedeiras ou por expressão em células de hibridoma como aqui descrito.
Os anticorpos de mutante de anti-FGF21 da invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, como ensaios de ligação competitivos, ensaios sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação (veja, por exemplo, Sola, Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987), aqui incorporado em sua totalidade por referência) para a detecção e quantificação de polipeptídeos mutantes de FGF21. Os anticorpos se ligarão aos polipeptídeos mutantes de FGF21 com uma afinidade que é adequada para o método de ensaio sendo empregado.
Para aplicações diagnósticas, em certas modalidades, anticorpos anti-FGF21 mutante podem ser rotulados com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir diretamente ou indiretamente um sinal detectável. Por exemplo, porção detectável pode ser um radioisótopo, como 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In, ou 67Ga; um composto fluorescente ou quimioluminescente, como fluoresceína isotiocianato, rodamina, ou luciferina; ou uma enzima, como fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou peroxidase de raiz forte (Bayer e cols., 1990, Meth. Enz. 184: 138-63).
Ensaios de ligação competitiva se baseiam na capacidade de um padrão rotulado (por exemplo, um polipeptídeo mutante de FGF21, ou uma porção imunologicamente reativa desse) de competir com o analito da amostra de teste (por exemplo, um polipeptídeo mutante de FGF21) para ligação com uma quantidade limitada de anticorpo anti-FGF21 mutante. A quantidade de um polipeptídeo mutante de FGF21 na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que se torna ligado aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que se torna ligado, os anticorpos tipicamente são insolubilizados antes ou depois da competição, de modo que o padrão e analito que são ligados aos anticorpos podem ser convenientemente separados do padrão e analito que permanecem não ligados.
Ensaios sanduíche tipicamente envolvem o uso de dois anticorpos, cada um capaz de se ligar a uma diferente porção imunogênica, ou epitopo, da proteína a ser detectada e/ou quantificada. Em um ensaio sanduíche, o analito da amostra de teste é tipicamente ligada por um primeiro anticorpo que é imobilizado em um suporte sólido, e depois um segundo anticorpo se liga ao analito, assim formando um complexo insolúvel de três partes. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 4.376.110. O segundo anticorpo pode em si ser rotulado com uma porção detectável (ensaios sanduíche diretos) ou pode ser medido com o uso de um anticorpo anti- imunoglobulina que é rotulado com uma porção detectável (ensaios sanduíche indiretos). Por exemplo, u tipo de ensaio sanduíche é um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), em que a porção detectável é uma enzima.
Os anticorpos anti-FGF21 mutante da presente invenção são também úteis para imagem in vivo. Um anticorpo rotulado com uma porção detectável pode ser administrado a um animal, preferivelmente na corrente sangüínea, e a presença e localização do anticorpo rotulado no hospedeiro analisado. O anticorpo pode ser rotulado com qualquer porção que seja detectável em um animal, por ressonância nuclear magnética, radiologia, ou outro meio de detecção conhecido na técnica.
Os anticorpos de FGF21 mutante da invenção podem ser usados como terápicos. Esses agentes terapêuticos são geralmente agonistas ou antagonistas, porque eles aumentam ou reduzem, respectivamente, pelo menos uma das atividades biológicas de um polipeptídeo de FGF21 mutante. Em uma modalidade, os anticorpos antagonistas da invenção são anticorpos ou fragmentos de ligação desses que são capazes de ligação específica a um polipeptídeo de FGF21 mutante e que são capazes de inibir ou eliminar a atividade funcional de um polipeptídeo de FGF21 mutante in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista inibirá a atividade funcional de um polipeptídeo de FGF21 mutante em pelo menos cerca de 50%, e preferivelmente em pelo menos cerca de 80%. Em outra modalidade, o anticorpo anti-FGF21 mutante é capaz de interferir com a interação entre um polipeptídeo de FGF21 mutante e um receptor de FGF assim inibindo ou eliminando a atividade do polipeptídeo de FGF21 mutante in vitro ou in vivo. Anticorpos anti-FGF21 mutantes agonistas e antagonistas são identificados por ensaios de rastreamento que são bem conhecidos na técnica.
A invenção também relaciona-se a um kit que compreende anticorpos de FGF21 mutante e outros reagentes úteis para a detecção de níveis de polipeptídeo de FGF21 mutante em amostras biológicas.
Tais reagentse podem incluir um rótulo detectável, soro de bloqueio, amostras de controle positivas e negativas, e reagentes de detecção. EXEMPLOS
Os Exemplos que se segue são ilustrativos de modalidades específicas da invenção, e vários usos dessas. Eles são apresentados para objetivos de explicação apenas, e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção de qualquer modo. EXEMPLO 1 Preparação de construções de expressão de FGF21
Uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica p polipeptídeo de FGF21 maduro foi obtida por amplificação da reação de cadeia de polimerase (PCR) com o uso de iniciadores que têm seqüências de nucleotídeos que correspondem às extremidades 5' e 3' da seqüência de FGF21 maduro. A Tabela 2 lista os iniciadores que foram usados para amplificar a seqüência de FGF21 maduro. Tabela 2 Iniciadores de PCR para a Preparação de construção de FGF21
Figure img0003
Os iniciadores usados para preparar a construção de expressão de FGF21 incorporaram sítios de endonuclease de restrição para clonagem direcional da seqüência em um vetor de expressão adequado (por exemplo, pET30 (Novagen/EMD Biosciences; San Diego, CA) ou pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, CA)). O vetor de expressão pAMG33 contém uma origem de replicacao R-100 de número de cópia baixo, um promotor lac modificado, e um gene de resistência à kanamicina. O vetor de expressão pET30 contém uma origem de replicação derivada de pBR322, um promotor T7 indutível, e um gene de resistência à kanamicina. Enquanto a expressão a partir de pAMG33 é maior, foi constatado que pET30 é um vetor de clonagem mais confiável. Portanto, a maioria das construções descritas nesse pedido foram primeiramente geradas em pET30 e então rastreadas para eficácia. As seqüências selecionadas foram então transferidas para pAMG33 para amplificação adicional.
A seqüência de FGF21 foi amplificada em uma mistura de reação que contém 40,65 μl dH2O, 5 μl PfuUltra II Tampão de reação (10x), 1,25 μl dNTP Mix (40 mM — 4 x 10mM), 0,1 μl modelo (100 ng/ml), 1 μl iniciador 1 (10 μM), 1 μl iniciador 2 (10 μM), e 1 μl PfuUltra II fusão HS DNA Polimerase (Stratagene; La Jolla, CA). As reações de amplificação foram realizadas por aquecimento por 2 minutos a 95°C; seguida por dez ciclos a 95°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos (com mais 1°C subtraído por ciclo), e 72°C por 15 segundos/kilobase do produto desejado; seguido por 20 ciclos a 94°C por 20 segundos, 55°C por 20 segundos, e 72°C por 15 segundos/kilobase de produto desejado; seguido por 72°C por 3 minutos. OS produtos da amplificação foram digeridos com as endonucleases de restrição NdeI, DpnI, e EcoRI; ligadas em um vetor adequado; e então transformadas em células competentes. EXEMPLO 2 Purificação de Proteínas de FGF21 a partir de Bactérias
Nos Exemplos que se seguem, várias proteínas de FGF21, que incluem o polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem, polipeptídeos de FGF21 truncados, mutantes de FGF21, e proteínas de fusão de FGF21, foram expressos em um sistema de expressão bacteriano. Depois da expressão, que é descrita abaixo, as proteínas de FGF21 foram purificadas como descrito nesse Exemplo, a menos que indicado de outra forma.
Para purificar o polipeptídeo de FGF21 de tipo selvagem, polipeptídeos de FGF21 truncados, e mutantes de FGF21 a partir de corpos de inclusão bacterianos, corpos de inclusão duplamente lavados (DWIBs) foram solubilizados em um tampão de solubilização que contém cloridrato de guanidina e DTT em tampão Tris em pH 8,5 e então misturado por uma hora em temperatura ambiente, e a mistura de solubilização foi adicionada a um tampão que contém uréia, arginina, cisteína, e cloridrato de cistamina em pH 9,5 e então misturada por 24 horas a 5°C (veja, por exemplo, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall e cols., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph e cols., 1997, “Folding proteins,” Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press) 57-99; e Ishibashi e cols., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6).
Após a solubilização e redobra, a mistura foi filtrada através de um filtro de 0,45 mícron. O conjunto redobrado foi então concentrado aproximadamente 10 vezes com um valor de corte de peso molecular de 10 kD Pall Omega cassete em uma pressão de transmembrana (TMP) de 20 psi (137,89 kPa), e dialfiltrada com 3 volumes de coluna de 20 mM Tris, pH 8,0 a uma TMP de 137,89 kPa.
A amostra clarificada foi então submetida a cromatografia de troca aniônica (AEX) com o uso de uma resina de Q Sefarose HP. Um gradiente linear de sal de 0 a 250 mM NaCl em 20 mM Tris foi processado em pH 8,0 a 5°C. As frações de pico foram analisadas por SDS-PAGE e reunidas.
O conjunto eluído de AEX foi então submetido a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) com o uso de uma resina de fenil Sefarose HP. A proteína foi eluída com o uso de um gradiente linear decrescente de 0,7 M a 0 M sulfato de amônio em pH 8,0 e temperatura ambiente. As frações de pico foram analisadas por SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) e reunidas.
O conjunto de HIC foi concentrado com um cassete de valor de corte de 10 kD de peso molecular Pall Omega 0,2 m2 a 7 mg/ml em um TMP de 137,89 kPa. O concentrado foi dialfiltrado com 5 volumes de coluna de 10 mM KPO4, 5% sorbitol, pH 8,0 em um TMP 137,89 kPa, e o concentrado recuperado foi diluído a 5 mg/ml. Finalmente, a solução foi filtrada através de uma membrana Pall mini-Kleenpac 0,2 μM Posidyne.
Para purificar proteínas de fusão de FGF21 e proteínas de mutante de fusao de FGF21 a partir de corpos de inclusao bacterianos, corpos de inclusão duplamente lavados (DWIBs) foram solubilizados em um tampão de solubilização que contém cloridrato de guanidina e DTT em tampão Tris em pH 8,5 e então misturado por uma hora em temperatura ambiente, e a mistura de solubilização foi adicionada a um tampão que contém uréia, arginina, cisteína, e cloridrato de cistamina em pH 9,5 e então misturada por 24 horas a 5°C (veja, por exemplo, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall e cols., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph e cols., 1997, “Folding proteins,” Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press) 57-99; e Ishibashi e cols., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6).
Após a solubilização e redobra, a mistura foi dialisada contra 5 volumes e 20 mM Tris, pH 8,0 com o uso de tubos de diálise de 10 kD. O pH da redobra dialisada foi ajustado a 5,0 com 50% ácido acético, e então clarificado por centrifugação por 30 minutos a 4K.
A amostra clarificada foi então submetida a cromatografia de troca aniônica (AEX) com o uso de uma resina de Q Sefarose HP. Um gradiente linear de sal de 0 a 250 mM NaCl em 20 mM Tris foi processado em pH 8,0 a 5°C. As frações de pico foram analisadas por SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) e reunidas.
O conjunto eluído de AEX foi então submetido a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) com o uso de uma resina de fenil Sefarose HP. A proteína foi eluída com o uso de um gradiente linear decrescente de 0,6 M a 0 M sulfato de amônio em pH 8,0 e temperatura ambiente. As frações de pico foram analisadas por SDS-PAGE e reunidas.
Depois da etapa de HIC, o conjunto foi então dialisadao 60 volumes de 10 mM Tris, 2,2% sacarose, 3,3% sorbitol, pH 8,5. O conjunto dialisado foi concentrado a 5 mg/ml com o uso de um jumbosep. Finalmente, a solução foi filtrada através de uma membrana Pall mini-Kleenpac 0,2 μM Posidyne. EXEMPLO 3 Preparação e expressão de proteínas de FGF21 truncado
As construções que codificam as proteínas de FGF21 truncado listadas na Tabela 3 foram preparadas por amplificação com PCR do vetor de expressão de FGF21 de tipo selvagem como descrito abaixo (a construção do vetor de 10 expressão FGF21 de tipo selvagem é descrita no Exemplo 1). Tabela 3 Truncamentos de FGF21
Figure img0004
Figure img0005
* relativo ao polipeptídeo de FGF21 maduro
As construções de proteína de FGF21 truncado foram preparadas com o uso de iniciadores que têm seqüências que são homólogas a regiões acima e abaixo de um códon (ou códons) a serem deletadas (resultando no truncamento). Os iniciadores usados em tais reações de amplificação também forneceram aproximadamente 15 nucleotídeos de seqüência sobreposta para permitir a recircularização do produto amplificado, ou seja o vetor inteiro agora tendo o mutante desejado.
Um exemplo de construção de FGF21 truncado, que codifica uma proteína de FGF21 desprovida do resíduo de histidina na posição 1 da seqüência de FGF21 maduro (ou seja, o mutante de truncamento 2-181), foi preparada com ouso dos iniciadores mostrado na Tabela 4. Tabela 4 Iniciadores de PCR para a preparação de mutante de truncamento de FGF21 de exemplo
Figure img0006
Os iniciadores mostrados na Tabela 4 permitem a deleção do resíduo de histidina como mostrado abaixo, em que a seqüência superior (Id. de Seq. N°: 10) é uma porção de um polipeptídeo de FGF21 maduro que compreende uma metionina N-terminal, a segunda seqüência é o iniciador senso (Id. de Seq. N°: 7), a terceira e quarta seqüências (Id. de Seq. NOs: 11 e 12) são porções de uma construção de expressão de FGF21, e a quinta seqüência é o iniciador anti-senso (Id. de Seq. N°: 9): MetHisProIleProAspSerSerProLeu 5'-GGAGATATACATATG CCAATTCCAGATTCTTCTCCATTATT TTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGÇATCCAATTCCAGATTCTTCTCCATTATT AAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTATACGTAGGTTAAGGTCTAAGAAGAGGTAATAA AAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTATAC-5'
As construções de proteína de FGF21 truncado foram preparadas com o uso essencialmente das condições de PCR descritas no Exemplo 1. Os produtos da amplificação foram digeridos com a endonuclease de restrição DpnI, e então transformados em células competentes. Os clones resultantes foram seqüenciados para confirmar a ausência de erros gerados por polimerase.
As proteínas de FGF21 truncado foram expressas por células BL21 competente de transformação (DE3) ou células BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) com a construção que codifica uma proteína de FGF21 truncado em particular. Transformantes cresceram de um dia para o outro com aeração limitada em meio TB suplementado com 40 μg/ml kanamicina, foram aerados na manhã seguinte, e depois de um cruto período de recuperação, foram induzidos em 0,4 mM IPTG. Os mutantes de FGF21 foram coletados por centrifugação 18-20 horas depois da indução. EXEMPLO 4
Atividade in vitro de proteínas de FGF21 truncado Experimentos foram realizados para identificar proteínas de FGF21 truncado que retêm atividade de FGF21 de tipo selvagem em um ensaio de ELK-luciferase in vitro. A tabela 5 sumariza os resultados obtidos para proteínas de FGF21 que têm truncamentos no terminal N, terminal C, ou em bos terminais N e C. Ensaios de ELK-luciferase foram realizados com o uso de um sistema de célula renal recombinante humana 293T, em que as células 293T superexpressam beta-klotho e construções de repórter de luciferase. Essas construções também contêm seqüências que codificam GAL4-ELK1 e 5xUAS-Luc, um repórter de luciferase dirigido por um promotor que contém cinco cópias tandem do sítio de ligação de Gal4. Beta-klotho é um co-receptor que é requerido por FGF21 para ativação de seus receptores de FGF e indução de transdução de sinal intracelular, que por sua vez leva a fosforilação de Erk e ELK. A atividade de luciferase é regulada pelo nível de Erk/ELK1 fosforilado, e é usado para monitorar indiretamente e quantificar a atividade de FGF21.
Os ensaios de ELK-luciferase foram realizados por cultura das células 293T na presença de diferentes concentrações de FGF21 de tipo selvagem ou polipeptídeo de FGF21 mutante por 6 horas, e então análise dos lisdos de células para atividade de luciferase. As Figuras 1A-1B mostram os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado nos mutantes de truncamento de FGF21 7-181 e 8-181 (Figura 1A) e os mutantes de truncamento de FGF21 1-172, 1-171, 1-169, e 1-164 (Figura 1B). A luminescência obtida em ensaios de ELK-luciferase para cada um dos mutantes de truncamento de FGF21 3-181, 4181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181, e 1-149 é mostrada na Figura 2.
Os polipeptídeos mutantes de FGF21 foram comparados com um padrão de FGF21 de tipo selvagem e mutantes que mostram uma eficácia de pelo menos 50% da eficácia de FGF21 de tipo selvagem foram considerados como tendo atividade de FGF21 não perdida e foram designados com um “+” na Tabela 5. Tabela 5 Proteínas de FGF21 truncado: ensaio in vitro
Figure img0007
Coletivamente, os resultados apresentados na Tabela 5 indicam que as deleções de terminal C de 14 ou mais resíduos de aminoácidos (ou seja, uma proteína de FGF21 C- terminalmente truncada que consiste em resíduos de aminoácidos 1-167 e proteínas mais curtas) eliminam a atividade de FGF21. Além disso, a Tabela 5 indica que as deleções de terminal N de 7 ou mais resíduos de aminoácidos (ou seja, uma proteína de FGF21 N-terminalmente truncada que consiste em resíduos de aminoácidos 8-181 e proteínas amis curtas) eliminam a atividade de FGF21. Não surpreendentemente, as proteínas de FGF21 truncado que possuem um truncamento de terminal N de 8 a 14 resíduos e um truncamento de terminal C de 12 ou 32 resíduos são desprovidos de atividade em ensaios de ELK-luciferase.
Consistente com os dados apresentados na Tabela 5, os polipeptídeos de FGF21 truncados que têm truncamentos de terminal N de menos que 7 resíduos de aminoácidos constituem modalidades da presente invenção. De modo similar, os polipeptídeos de FGF21 truncados que têm truncamentos de terminal C de menos que 13 resíduos de aminoácidos constituem modalidades da presente invenção. EXEMPLO 5
Atividade in vivo de Proteínas de FGF21 truncado FGF21 possui inúmeras atividades biológicas, que incluem a capacidade de diminuir os níveis de glicemia, insulina, triglicerídeo, ou colesterol; reduzir o peso corporal; ou melhorar a tolerância à glicose, gasto de energia, ou sensibilidade à insulina. Os polipeptídeos de FGF21 truncados foram também analisados para atividade de FGF21 in vivo, por introdução dos polipeptídeos de FGF21 truncados em camundongos ob/ob resistentes à insulina, e medição ca capacidade de um polipeptídeo de FGF21 truncado particular de reduzir a glicemia. O polipeptídeo de FGF21 truncado a ser testado foi injetado intraperitonealmente em um camundongos ob/ob de 8 semanas de idade (Jackson Laboratory), e amostras de sangue foram obtidas em vários pontos de tempo após uma injeção única, por exemplo, 0, 6, 24, 72, 120, e 168 horas após injeção. Os níveis de glicemia foram medidos com um glicosímetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA), e os resultados expressos como uma alteração percentual da glicemia em relação ao nível basal de glicemia (ou seja, no tempo 0).
Os resultados de um experimento são fornecidos na Figura 3, que mostra a quantidade de glicemia detectada em camundongos injetados com os mutantes de truncamento de FGF21 8-181 e 9-181. Esse experimento demonstra que as proteínas de fusão de FGF21 truncado que compreendem resíduos de aminoácidos 8-181 exibem atividade de redução da glicemia in vivo embora a atividade seja levemente menor que a atividade de FGF21 de tipo selvagem em 3 e 6 horas após injeção, mas que as proteínas de fusão de FGF21 truncado que compreendem os resíduos de aminoácidos 9-181 não exibem tal atividade. Assim, a análise in vivo dos polipeptídeos de FGF21 truncados indicou que a deleção de até 7 aminoácidos do terminal N de FGF21 maduro não abole a atividade biológica da molécula (em contraste com a análise in vitro, que sugere que a deleção de 7 aminoácidos do terminal N de FGF21 maduro abole a atividade).
Os diferentes resultados obtidos com polipeptídeos de FGF21 truncados particulares de terminal N (por exemplo, FGF21 8-181) em ensaios in vitro e in vivo podem ser explicados pela interação de FGF21 com beta-klotho e receptor de FGF na efetuação de transdução de sinal. Em particular, FGF21 ativa um complexo de receptor duplo que compreende o co-receptor beta-klotho e receptor de FGF (FGFR), que inicia uma cascata de sinalização que envolve tirosina quinase. O terminal N de FGF21 está envolvido na ligação e ativação de FGFR embora o terminal C de FGF21 seja necessário para intercao de beta-klotho (Yie e cols., 2009 FEBS Lett. 583:19-24). O ensaio de ELK-luciferase in vitro é realizado em células renais 293 em que o coreceptor beta-klotho é superexpresso e FGFR é expresso em níveis normais. A quantidade de FGFR é baixa em relação àquela de beta-klotho e a proporção de beta-klotho para FGFR em células 293 é portanto não fisiológica, o que pode afetar a formação do complexo do receptor e finalmente a ligação do ligante e ativação de FGFR. O sistema 293 in vitro parece ser mais vulnerável aos polipeptídeos de FGF21 truncados de terminal N e podem ter produzido resultados de perda de atividade para alguns dos mutantes truncados de terminal N testados, como FGF21 8-181. Portanto, na determinação de se um mutante de FGF21 truncado de terminal N particular reteve a atividade de FGF21 de tipo selvagem, a atividade daqueles mutante de FGF21 no ensaio in vivo foi considerada como sendo dispositiva. Portanto, os polipeptídeos de FGF21 truncados que têm truncamentos de terminal N de menos que 8 resíduos de aminoácidos são englobados pela invenção. EXEMPLO 6 Preparação e expressão de proteínas de fusão de FGF21 truncado Pelo fato de a meia-vida da proteína poder ser aumentada por fusão de uma proteína a uma seqüência de Fc, as proteínas de fusão que compreendem polipeptídeos de FGF21 truncados foram preparadas e analisadas. As proteínas de fusão de FGF21 truncado listadas na Tabela 6 foram preparadas de seqüências amplificadas de FGF21 por PCR 5 SOEing (splicing de gene por extensão de sobreposição). As proteínas de fusão de FGF21 foram preparadas de modo que a porção Fc do gene de imunoglobulina IgG1 humana (Id. de Seq. N°: 13) foi fundida ao terminal N ou terminal C da proteína de FGF21. Tabela 6 Proteínas de fusão de FGF21 truncado
Figure img0008
Figure img0009
Em particular, as construções de proteína de fusão de FGF21 (incluindo aquelas que codificam proteínas de fusão de FGF21 truncado) foram preparadas em uma série de três reações de amplificação que usam essencialmente as 5 condições de reação descritas no Exemplo 1. Na primeira reação, um par de iniciadores foi desenhado para produzir uma seqüência que contém um sítio de clonagem NdeI, região Fc, e seqüência ligante. Na segunda reação, um par de iniciadores foi desenhado para produzir uma seqüência que 10 contém uma porção de sobreposição do ligante, uma porção da seqüência codificadora de FGF21, e um sítio de clonagem de EcoRI. Finalmente, na terceira reação, um par de iniciadores foi desenhado para o objetivo de ligação dos produtos das primeiras duas reações. Um conjunto de exemplo 15 de iniciadores para a construção de Fc-FGF21 1-181 é listado na Tabela 7. Tabela 7 Iniciadores de PCR para a preparação de exemplos de construção de proteína de fusão de FGF21
Figure img0010
Figure img0011
O produto da reação final foi digerido com as endonucleases de restrição NdeI e EcoRI, ligado no vetor pET30, e então transformado em células competentes. Os clones resultantes foram seqüenciados para confirmar a 5 ausência de erros gerados por polimerase. EXEMPLO 7
Atividade in vivo de proteínas de fusão de FGF21 truncado As proteínas de fusão que compreendem uma seqüência de FGF21 truncado fundida a uma seqüência de Fc foram geradas 10 e analisadas para atividade in vivo. As proteínas de fusão de FGF21 truncado foram preparadas por fusão de uma molécula de Fc de IgG1 à extremidade de terminal N ou terminal C de uma proteína de FGF21 truncado para formar uma seqüência contígua única. Para distinguir entre fusões de terminal N e terminal C, as proteínas de fusão de FGF21 em que a molécula Fc foi fundida à extremidade de terminal
N da proteína de FGF21 são designadas como Fc-FGF21, e proteínas de fusão em que a molécula Fc foi fundida à extremidade de terminal C da proteína de FGF21 são designadas como FGF21-Fc. FGF21 possui inúmeras atividades biológicas, que incluem a capacidade de diminuir os níveis de glicemia, insulina, triglicerídeo, ou colesterol; reduzir o peso corporal; ou melhorar a tolerância à glicose, gasto de energia, ou sensibilidade à insulina. Para avaliar a atividade in vivo de FGF21, os polipeptídeos de FGF21, polipeptídeos mutantes de FGF21, e polipeptídeos de FGF21 de fusão foram introduzidos em camundongos ob/ob resistentes à insulina, e a capacidade de uma proteína de FGF21 particular de diminuir os níveis de glicemia foi medida. O polipeptídeo de FGF21, polipeptídeo de FGF21 mutante, ou polipeptídeo de FGF21 de fusão a serem testados foram injetados por via intraperitoneal em camundongos ob/ob de 8 semanas de idade (Jackson Laboratory), e amostras de sangue foram obtidas em vários pontos de tempo após uma injeção única, por exemplo, 0, 6, 24, 72, 120, e 168 horas após a injeção. Os níveis de glicemia foram medidos com um glicosímetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA), e os resultados expressos como uma alteração percentual da glicemia em relação ao nível basal de glicemia (ou seja, no tempo 0).
Os resultados de um experimento são fornecidos na Figura 4, que mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia observada em camundongos injetados com um controle de PBS, um controle de Fc-FGF21 de tipo selvagem que compreende resíduos de aminoácidos 1-181, ou proteínas de fusão de Fc-FGF21 truncado que compreendem resíduos de aminoácidos 5-181 ou 7-181. Esse experimento demonstrou que as proteínas de fusão de Fc-FGF21 truncado que compreendem resíduos de aminoácidos 5-181 ou 7-181 exibem atividade de diminuição da glicemia que é similar à atividade de Fc- FGF21 de tipo selvagem em 6 horas após injeção. Portanto, a análise in vivo de polipeptídeos de FGF21 truncados indicou que a deleção de até 6 aminoácidos do terminal N de FGF21 maduro não afeta a atividade biológica da molécula. A análise in vivo também indicou, no entanto, que a capacidade dos polipeptídeos de FGF21 truncados de diminuir a glicemia foi reduzida e que os níveis de glicemia retornaram aos basais em 24 horas após a injeção (resultados similares foram obtidos com FGF21 de tipo selvagem). A curta atividade in vivo é um resultado da degradação proteolítica de FGF21, como descrito no Exemplo 8.
Os resultados de outro experimento são fornecidos na Figura 5, que mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia observada em camundongos injetados com um controle de PBS, um controle de Fc-FGF21 de tipo selvagem que compreende resíduos de aminoácidos 1-181, ou proteínas de fusão de Fc-FGF21 truncado que compreendem resíduos de aminoácidos 1-175 ou uma proteína de Fc -FGF21 truncado que compreendem resíduos de aminoácido 1-171. Esse experimento demonstra que FGF21 de tipo selvagem-Fc que compreende resíduos de aminoácidos 1-181 têm uma atividade de diminuição da glicemia sustentada que que resulta em uma redução dos níveis de glicemia de aproximadamente 30% pelo período de tempo de 24 horas a 120 horas após a injeção. A proteína de Fc-FGF21 trucado que compreende resíduos de aminoácidos 1-171 exibe atividade retardada de diminuição da glicemia evidente apenas 72 horas após a injeção. No entanto, a atividade observada é a mesma que a atividade de FGF21-Fc de tipo selvagem. A proteína de fusão de FGF21-Fc truncado que compreende resíduos 1-175 não é ativa in vivo na diminuição da glicemia.
Coletivamente, os experimentos de truncamento aqui descritos demonstram que as proteínas de fusão de FGF21 truncado que têm um truncamento de terminal N exibem atividade de diminuição da glicemia que é similar àquela de proteína de fusão de FGF21 de tipo selvagem, e também, que as proteínas de fusão de FGF21 truncado em que a molécula de Fc foi fundida à extremidade de terminal N da proteína de FGF21 truncado exibe mais atividade que as proteínas de fusão em que a molécula de Fc foi fundida à extremidade de terminal C da proteína de FGF21 truncado. EXEMPLO 8 Degradação of FGF21 pbservada in vivo
A degradação de FGF21 foi primeiramente observada com construções de proteína de fusão de FGF21 Fc como descrito no Exemplo 7. Análise de farmacocinética in vivo indicou que FGF21 humano tem uma meia-vida curta de cerca de 1 hora em camundongos devido ao clearance rápido e degradação in vivo. Portanto, para estender a meia-vida de FGF21 uma seqüência de Fc foi fundida à extremidade de terminal C ou N do polipeptídeo de FGF21. No entanto, a fusão de uma região Fc não resolve completamente o problema de meia-vida uma vez que as proteínas de fusão em que uma seqüência de Fc foi fundida à extremidade de terminal C ou N do polipeptídeo de FGF21 (e em particular fusões de Fc-FGF21, ou seja, em que a seqüência de Fc é fundida ao terminal N de FGF21 maduro), não exibe a eficácia esperada in vivo, e ao contrário, mantém a atividade de diminuição da glicemia por não mais que 24 horas em camundongos ob/ob. Como descrito na Figura 4, proteínas de fusão de Fc-FGF21 reduziram os níveis de glicemia em cerca de 30-40% em 6 horas após injeção, enquanto os níveis de glicemia retornaram aos níveis basais em 24 horas.
A degradação proteolítica de FGF21 de tipo selvagem foi subseqüentemente investigada, e a perda rápida da atividade in vivo com proteínas de fusão de Fc-FGF21 é o resultado da degradação de FGF21 in vivo. A degradação proteolítica leva a atividade biológica diminuída da molécula in vivo e assim uma meia-vida eficaz mais curta, e tal degradação afeta de modo adverso o uso terapêutico daquela molécula. Portanto, a degradação observada de proteínas de fusão FGF21-Fc leva à investigação da degradação proteolítica de FGF21 in vivo e a identificação de mutantes de FGF21 que foram resistentes a tal degradação.
Para determinar os sítios de degradação, análise de LC-MS e seqüenciamento de Edman foi realizado em FGF21 de tipo selvagem humano e proteínas de fusão de FGF21 Fc obtidas em vários pontos de tempo após injeção em machos de camundongos C57B6. O seqüenciamento de Edman ajudou a confirmar se a extremidade de terminal C ou terminal N da proteína sofreu degradação. Quando uma seqüência de Fc foi fundida ao terminal N de FGF21 humano, a degradação ocorre no peptídeo ligado entre os resíduos de aminoácidos 151 e 152 e entre os resíduos de aminoácidos 171 e 172 da porção de FGF21 humano da molécula de fusão (a numeração do resíduo acima é baseada na seqüência de FGF21 maduro e não inclui a porção Fc da proteína de fusão). A degradação em 171-172 ocorre primeiramente, e foi seguida por degradação em 151-152. Degradação em 171-172 parece ser a etapa de limitação da taxa e tem um papel na meia-vida da molécula. Quando uma seqüência de Fc foi fundida ao terminal C de FGF21, a degradação ocorre no peptídeo ligado entre os resíduos de aminoácidos 4 e 5 e entre os resíduos de aminoácidos 20 e 21. Como um resultado desses experimentos, foi determinado que a seqüência de Fc parece proteger a porção da seqüência de FGF21 que é adjacente à seqüência de Fc de degradação. Uma análise da degradação in vivo de FGF21 de tipo selvagem e proteínas de fusão de Fc-FGF21 foi também conduzida em macacos cynomolgus. Esses estudos confirmaram que o sítio de clivagem de FGF21 nos resíduos de aminoácidos 171-172 é o sítio principal de degradação em macacos e que esse sítio de degradação é conservado entre murídeo e primata. EXEMPLO 9
Identificação de mutantes de FGF21 resistentes à proteólise Mutantes de FGF21 adequados foram identificados por determinação experimental das posições da seqüência de FGF21 de tipo selvagem que são sítios de atividade proteolítica principal, e substituições específicas de aminoácido foram introduzidas nesses ced sítios. As substituições de aminoácido foram baseadas em conservação de seqüência de FGF21 com outras espécies (como descrito no Exemplo 8) e conservação bioquímica com outros resíduos de aminoácidos. Uma lista de substituições de aminoácido que foram ou podem ser introduzidos na proteína de FGF21 de tipo selvagem é fornecida na Tabela 8, embora a tabela 8 seja apenas um exemplo e outras substituições possam ser feitas. Os números das posições dadas na Tabela 8 5 correspondem à posição do resíduo na proteína de FGF21 maduro, que consiste em 181 resíduos de aminoácidos. Tabela 8 Resíduos de FGF21 mutados
Figure img0012
EXEMPLO 10
Análise in vivo da degradação de Fc-FGF21 e FGF21-Fc A estabilidade de proteínas de fusão FGF21 Fc in vivo foi determinada por injeção de camundongos com uma proteína de fusão, retirada de sangue dos camundongos em vários pontos do tempo, e análise do soro por espectrometria de massa-cromatografia líquida (LC-MS). Em particular, os camundongos foram injetados por via intraperitoneal com 10 mg/kg de Fc(5)FGF21 (expresso em E. coli e purificado como descrito no Exemplo 2) ou FGF21(3)Fc (expresso em células de mamíferos e purificado de acordo com procedimentos padronizados). O sangue foi retirado dos camundongos em 6, 24 e 48 horas após injeção (Tabela 9) e coletado em tubos com EDTA pré-tratados com coquetéis de inibidor de protease (Roche Diagnostics). O plasma foi separado por centrifugação das amostras a 12.000 g por 10 minutos. As proteínas de FGF21 foram purificadas por afinidade do sangue usando resina de agarose anti-Fc humano. Tabela 9 Amostras de FGF21
Figure img0013
Antes da análise das amostras purificadas por afinidade por LC-MS, padrões de proteína de Fc-FGF21 e FGF21-Fc foram analisados como uma referência. Os padrões de proteína foram reduzidos com tris[2-carboxietil]fosfina (TCEP) ou não reduzidos. Os padrões reduzidos e não reduzidos foram analisados por LC-MS usando uma coluna ACE ciano de 0,3 mm x 30 cm com o efluente da coluna pulverizando em um espectrômetro de massa de captura de íon LCQ Classic. Como os espectros deconvoluídos das amostras reduzidas eram mais claros, as amostras purificadas por afinidade foram reduzidas antes da análise por LC-MS. As massas observadas para o padrão reduzido de 5 Fc(5)FGF21 e as amostras D6, D24 e D48 são mostradas nas Figuras 6A-6D. As massas observadas para o padrão reduzido de FGF21(3)Fc e as amostras E6, E24 e E48 são mostradas nas Figuras 7A-7D. Alguns dos eluatos do padrão e das amostras foram submetidos ao seqüenciamento de Edman a fim de 10 confirmar o terminal N das proteínas e os fragmentos como determinado por LC-MS. Os resultados da análise por LC-MS dos padrões e das amostras são fornecidos na Tabela 10. Tabela 10 Resultados da análise por LC-MS e fragmentos previstos
Figure img0014
Figure img0015
Como indicado na Tabela 10, todas as amostras purificadas por afinidade mostraram algum grau de degradação após apenas 6 horas de circulação. Após 24 horas de circulação, o produto principal de Fc-FGF21 foi um fragmento que consiste nos resíduos de aminoácidos 1-404, que foi observado nas amostras D e E. Nas amostras E, no entanto, o produto principal de FGF21-Fc foi um fragmento que consiste nos resíduos de aminoácidos 5-410. Para ambas as proteínas de fusão testadas, a porção de FGF21 da proteína de fusão era mais suscetível à degradação do que a porção de Fc da proteína. EXEMPLO 11 Preparação e expressão de mutantes de FGF21 resistentes à proteólise e proteínas de fusão
Construções que codificam os mutantes de FGF21 listados na Tabela 11 foram preparadas por amplificação por PCR do vetor de expressão de FGF21 do tipo selvagem, como descrito abaixo (a construção do vetor de expressão de FGF21 do tipo selvagem é descrita no Exemplo 1). O objetivo desses experimentos foi gerar mutantes de FGF21 que são resistentes à proteólise e exibem meias-vidas mais longas. Tabela 11 Mutantes de FGF21 resistentes a proteólise
Figure img0016
Figure img0017
Figure img0018
Figure img0019
Construções de mutante de FGF21 foram preparadas usando iniciadores que possuem seqüências que são homólogas às regiões acima e abaixo de um códon (ou códons) a ser mutado. Os iniciadores usados nessas reações de 5 amplificação também forneceram aproximadamente 15 nucleotídeos de seqüências superpostas para permitir a recircularização do produto amplificado, especificamente todo o vetor que agora possui o mutante desejado.
Uma construção de mutante de FGF21 exemplar, que codifica um mutante de FGF21 que possui um resíduo de ácido glutâmico na posição 170 em vez do resíduo de glicina nativo (ou seja, o mutante G170E), foi preparada usando os iniciadores mostrados na Tabela 12. Tabela 12 Iniciadores de PCR para a preparação de mutante de FGF21 exemplar
Figure img0020
Os iniciadores mostrados na Tabela 12 permitem a substituição do resíduo de glicina com um resíduo de ácido glutâmico, como mostrado abaixo, em que a seqüência superior é o iniciador senso (Id. de Seq. N°: 18), a segunda e a terceira seqüências (Id. de Seq. Nos: 20 e 22) são porções de uma construção de expressão de FGF21, e a quarta seqüência é o iniciador anti-senso (Id. de Seq. N°: 21): 5'-ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC CTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCA GAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCACCCTGGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGT AGCCTGGGAGACTCGTACCACCTTGGAAGG—5'
As construções de mutante de FGF21 foram preparadas usando basicamente as condições de PCR descritas no Exemplo 1. Os produtos de amplificação foram digeridos com a endonuclease de restrição DpnI, e depois transformados em células competentes. Os clones resultantes foram seqüenciados para confirmar a ausência de erros gerados por polimerase. Proteínas de fusão de Fc-FGF21 e FGF21-Fc foram geradas, como aqui descrito, por exemplo, no Exemplo 6. Os mutantes de FGF21 foram expressos por transformação de células competentes BL21 (DE3) ou BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) com a construção que codifica um mutante em particular. Os transformantes foram desenvolvidos de um dia para o outro com aeração limitada em meio TB suplementado com 40 μg/ml de canamicina, foram aerados na manhã seguinte e, depois de um período de recuperação curto, foram induzidos em 0,4 mM de IPTG. Os polipeptídeos mutantes de FGF21 foram coletados por centrifugação 18-20 horas após indução.
Os mutantes de FGF21 também foram analisados quanto à imunogenicidade prevista. As respostas imunes contra proteínas são aumentadas por processamento e apresentação de antígeno no sítio de ligação do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe II. Essa interação é necessária para que a célula T ajude na maturação de anticorpos que reconhecem a proteína. Como os sítios de ligação de moléculas de MHC classe II foram caracterizados, é possível prever se as proteínas possuem seqüências específicas que podem se ligar a uma série de alelos humanos comuns. Foram criados algoritmos computacionais com base nas referências da literatura e estruturas cristais de MHC da classe II para determinar se seqüências de peptídeos de aminoácidos lineares possuem o potencial de quebrar a tolerância imune. O programa de computador TEPITOPO foi usado para determinar se mutações pontuais em mutantes de FGF21 específicos aumentariam células T antígeno-específicas na maioria dos humanos. Com base em uma análise da seqüência de proteína linear de cada mutante de FGF21, nenhum dos mutantes foi previsto como aumentando a imunogenicidade. EXEMPLO 12 Impacto da seqüência ligante sobre a degradação de FGF21
Para determinar se a presença de um ligante de aminoácido mais longo entre a seqüência de Fc e a seqüência de FGF21 afeta a degradação de FGF21, os camundongos foram injetados com proteínas de fusão de FGF21 nas quais a região Fc foi separada da seqüência de FGF21 por um ligante de 15 aminoácidos que possui a seqüência GGGGGSGGGSGGGGS (Id. de Seq. N°: 23), o sangue foi retirado dos camundongos em vários pontos do tempo, e o soro foi analisado por LC- MS. Em particular, os camundongos foram injetados com Fc(15)FGF21 ou FGF21(15)Fc (obtidos de E. coli) a 23 mg/kg, o sangue foi retirado em 6, 24 e 48 horas, e o sangue retirado foi purificado por afinidade usando uma resina de agarose anti-Fc humano.
Antes da análise das amostras purificadas por LC-MS, padrões de proteína de Fc(15)FGF21 e FGF21(15)Fc foram analisados como uma referência. Os padrões de proteína foram reduzidos com TCEP ou não reduzidos. Tanto os padrões reduzidos quanto os não reduzidos foram analisados por LC- MS usando uma coluna ACE ciano de 0,3 mm x 30 cm com o efluente da coluna pulverizando em um espectrômetro de massa de captura de íon LCQ Classic. Como os espectros deconvoluídos das amostras reduzidas eram mais claros, as amostras purificadas por afinidade foram reduzidas antes da análise por LC-MS.
As massas observadas para o padrão reduzido de Fc(15)FGF21 e amostras purificadas por afinidade correspondentes retirados em vários pontos do tempo são mostradas nas Figuras 8A-8D. As massas observadas para o padrão reduzido de FGF21(15)Fc e amostras purificadas por afinidade correspondentes retiradas em vários pontos do tempo são mostradas nas Figuras 9A-9D. Alguns dos eluatos do padrão e das amostras foram submetidos ao seqüenciamento de Edman a fim de confirmar o terminal N das proteínas e 5 ajudar na previsão da identidade dos fragmentos observados por LC-MS. Os resultados da análise por LC-MS dos padrões e das amostras e uma indicação de fragmentos previstos são fornecidos na Tabela 13. Tabela 13 Resultados de análise por LC-MS e fragmentos previstos
Figure img0021
Figure img0022
Como indicado na Tabela 13, todas as amostras purificadas por afinidade mostraram algum grau de degradação após apenas 6 horas de circulação. Após 24 horas de circulação, os produtos principais de Fc(15)FGF21 eram fragmentos que consistiam nos resíduos de aminoácidos 1-414 (85% da amostra) e 1-394 (15% da amostra), e os produtos principais de FGF21(15)Fc eram fragmentos que consistiam nos resíduos de aminoácidos 1-423 (40% da amostra), 6-423 (35% da amostra) e 22-423 (25% da amostra). Os pontos de clivagem identificados para as proteínas de Fc(15)FGF21 e FGF21(15)Fc são mostrados nas Figuras 10A e 10B, respectivamente. EXEMPLO 13 Atividade in vivo de mutantes de Fc(15)FGF21 resistentes à proteólise em 1-7 dias após injeção
Como aqui descrito, a clivagem proteolítica das proteínas de fusão FGF21 Fc depende da orientação da seqüência de Fc, com a extremidade Fc da proteína de fusão sendo mais estável do que a extremidade FGF21 da proteína de fusão (ou seja, verificou-se que a porção do terminal N das proteínas de fusão de Fc-FGF21 e a porção do terminal C de proteínas de fusão de FGF21-Fc eram mais estáveis). Por exemplo, a clivagem foi identificada nas posições 5 e 21 de FGF21-Fc e nas posições 151 e 171 de Fc-FGF21.
Como resultado dessas observações, foi realizada uma investigação para identificar mutantes de FGF21 resistentes a proteólise. A análise por LC-MS de Fc-FGF21 demonstra que a degradação proteolítica in vivo ocorre primeiro entre os resíduos de aminoácidos 171-172, seguida por degradação entre os resíduos de aminoácidos 151-152. Por bloqueio da degradação proteolítica na posição 171, a clivagem na posição 151 pode ser evitada, estendendo eficazmente a meia-vida da molécula. No entanto, mutantes resistentes à proteólise nos quais a clivagem é evitada na posição 151 ainda podem possuir resíduos na posição 171 que são suscetíveis ao ataque da protease, resultando, dessa forma, em uma molécula que não possui os últimos 10 aminoácidos, que sabidamente estão envolvidos na ligação do co-receptor beta-klotho, que é um determinante de afinidade de receptor de ligante e da potência in vitro e in vivo. Portanto, a mutagênese de resíduos de aminoácidos que circundam a posição 171 no FGF21 maduro parece ser mais crucial para aumento da estabilidade in vivo, potência e eficácia da molécula.
A atividade in vivo de mutantes de Fc(15)FGF21 resistentes particular à proteólise específicos foi testada injetando-se por via intraperitoneal camundongos ob/ob com um mutante de FGF21, retirando-se amostras de sangue de camundongos injetados em 0, 0,25, 1, 3, 5 e 7 dias após injeção, e depois medindo-se os níveis de glicemia nas amostras. Os resultados de um experimento são fornecidos na Figura 11, que mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com um controle de PBS, um controle de Fc(15)FGF21 ou os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A, Fc(15)FGF21 S172L, Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L ou Fc(15)FGF21 G151A. A Figura 12 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia como determinado nesse experimento. Esse experimento demonstra que os mutantes de Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A, Fc(15)FGF21 S172L e Fc(15)FGF21 G170E/P171A/S172L exibem atividade sustentada de redução da glicemia por até 5 dias, que é superior à atividade de Fc-FGF21 do tipo selvagem. O mutante de Fc(15)FGF21 G151A aumentou apenas parcialmente a duração da atividade de redução da glicemia, quando comparado com a proteína de fusão de Fc-FGF21 do tipo selvagem. Surpreendentemente, embora o mutante de Fc(15)- FGF21 S172L não seja um mutante resistente à proteólise e, portanto, possua perfil de degradação similar ao polipeptídeo de Fc(15)-FGF21 do tipo selvagem, verificou-se que esse mutante exibe eficácia in vivo aumentada, quando comparado com o polipeptídeo de Fc(15)-FGF21 do tipo selvagem.
Os resultados de outro experimento são fornecidos na Figura 13, que mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com um controle de PBS, um controle de Fc(15)FGF21 ou os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V, Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 G170E/P171A ou Fc(15)FGF21 G170E/S172L. A Figura 14 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia como determinado nesse experimento. Como no experimento descrito acima, a proteína de fusão de Fc-FGF21 do tipo selvagem e o mutante de Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V não exibem atividade sustentada de redução da glicemia, possivelmente pois a degradação no sítio 171 ainda poderia ocorrer, e os níveis de glicemia em animais injetados com essas proteínas retornaram aos níveis de base em 24 horas após injeção. No entanto, os mutantes de Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 G170E/P171A ou Fc(15)FGF21 G170E/S172L exibem atividade de redução da glicemia máxima até 5 dias após injeção, o que é superior à proteína de fusão de Fc-FGF21 do tipo selvagem e ao mutante de Fc(15)FGF21 P150A/G151A/I152V.
Os resultados de outro experimento são fornecidos na Figura 15, que mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com um controle de PBS ou os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 G170A, Fc(15)FGF21 G170C, Fc(15)FGF21 G170D, Fc(15)FGF21 G170N ou Fc(15)FGF21 G170S. A Figura 16 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia como determinado nesse experimento. Todos os mutantes de FGF21 testados nesse experimento exibiram atividade sustentada de redução da glicemia por até 5 dias após injeção.
Os resultados de outro experimento são fornecidos na Figura 17, que mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com PBS ou com os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171E, Fc(15)FGF21 P171H, Fc(15)FGF21 P171Q, Fc(15)FGF21 P171T ou Fc(15)FGF21 P171Y. A Figura 18 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia como determinado nesse experimento. Todos os mutantes de FGF21 testados nesse experimento exibiram atividade de redução da glicemia aumentada, quando comparados com Fc-FGF21 do tipo selvagem. EXEMPLO 14 Degradação in vivo de mutantes de Fc(15)FGF21 resistentes à proteólise em 6 a 120 horas após injeção
A estabilidade in vivo de mutantes de FGF21 selecionados foi analisada por injeção de camundongos com um mutante de FGF21, retirada de sangue dos camundongos em vários pontos do tempo e análise do soro por LC-MS. Em particular, os camundongos foram injetados com os mutantes de Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A ou Fc(15)FGF21 S172L (obtidos de E. coli, como descrito no Exemplo 2), cada um dos quais foi diluído em aproximadamente 180 μl de 10 mM de HCl antes da injeção, e o sangue foi retirado em 6, 24, 48, 72 e 120 horas. As proteínas de FGF21 foram purificadas por afinidade do sangue retirado usando uma coluna de resina de agarose anti-Fc humano. As amostras foram eluídas da coluna usando 10 mM de HCl. Todas as construções de FGF21 compreendem uma região Fc e um ligante de 15 aminoácidos na extremidade do terminal amino da proteína de FGF21. Os camundongos também foram injetados com um controle de FGF21 do tipo selvagem.
Antes da análise das amostras purificadas por afinidade por LC-MS, FGF21 do tipo selvagem não processado e mutantes de FGF21 não processados foram analisados como uma referência. Todos os padrões e amostras de pontos do tempo foram reduzidos com TCEP, e depois analisados por LC- MS usando uma coluna ACE ciano de 0,3 mm x 30 cm com o efluente da coluna pulverizando em um espectrômetro de massa de captura de íon LCQ Classic. Amostras purificadas por afinidade foram diluídas com acetato de amônio, reduzidas com TCEP, e depois analisadas por LC-MS, como descrito acima.
As massas observadas para Fc(15)FGF21 do tipo selvagem em 0, 6, 24 e 48 horas após injeção são mostradas nas Figuras 19A-19D, respectivamente. As massas observadas para Fc(15)FGF21 G170E em 0, 6, 24 e 48 horas após injeção são mostradas nas Figuras 20A- 20D, respectivamente. As massas observadas para Fc(15)FGF21 P171A em 0, 6, 24 e 48 horas após injeção são mostradas nas Figuras 21A-21D, respectivamente. As massas observadas para Fc(15)FGF21 S172L em 0, 6, 24 e 48 horas após injeção são mostradas nas 5 Figuras 22A-22D, respectivamente. Verificou-se que todas as amostras retiradas em 72 e 120 horas contêm um componente de fibrinogênio de alto peso molecular (>200 kDa por SDS-PAGE não redutora) que é bem mais abundante do que a proteína de fusão de Fc(15)FGF21 10 restante. Os resultados da análise por LC-MS dos outros padrões e amostras são fornecidos na Tabela 14. Tabela 14 Resultados de análise por LC-MS e fragmentos previstos
Figure img0023
Figure img0024
Como indicado na Tabela 14, a degradação de Fc(15)FGF21 do tipo selvagem e do mutante S172L parece similar, pelo fato de que, após 24 horas de circulação, o produto principal da proteína de fusão foi um fragmento que consiste nos resíduos de aminoácidos 1-4 14. Os produtos de degradação dos mutantes de Fc(15)FGF21 G170E e Fc(15)FGF21 P171A também parecem similares, pelo fato de que as amostras retiradas após 24 horas de circulação contêm 7080% de proteína intacta (aminoácidos 1-424) e 20-30% de um fragmento que consiste nos resíduos de aminoácidos 1-421. Até mesmo após 48 horas, os mutantes de Fc(15)FGF21 G170E e Fc(15)FGF21 P171A ainda retêm proteína intacta, embora mostrem um aumento na quantidade do fragmento que consiste nos resíduos de aminoácidos 1-421. Como observado em análises anteriores de construções de Fc-FGF21, a degradação da porção de FGF21 da proteína de fusão foi detectada, e verificou-se que a porção de Fc permanece estável. Os sítios de clivagem identificados para o tipo selvagem, Fc(15)FGF21 G170E, Fc(15)FGF21 P171A e Fc(15)FGF21 S172L, são mostrados nas Figuras 23A-23D, respectivamente. EXEMPLO 15 Identificação de mutantes de FGF21 da redução de agregação
Uma propriedade de FGF21 do tipo selvagem é sua propensão a agregar. Mutantes de FGF21 de redução da agregação foram identificados com base em duas hipóteses. A primeira hipótese é que, com relação ao FGF21, a agregação (ou dimerização) é desencadeada por interações hidrofóbicas e interações de van der Waals entre moléculas de FGF21 causadas por resíduos hidrofóbicos que são expostos ao ambiente de solvente hidrofílico à base de água. A segunda hipótese é que esses resíduos hidrofóbicos expostos podem ser substituídos para criar variantes com mutação pontual de redução da agregação sem comprometer a atividade de FGF21.
Foi usada uma abordagem lógica sistemática de criação genética de proteína para identificar resíduos hidrofóbicos expostos em FGF21. Como não havia estruturas conhecidas por raios-X ou RNM de FGF21 que pudessem ser usadas para identificar resíduos hidrofóbicos expostos, foi usada uma estrutura cristal de alta resolução de raios-X (1,3 Â) de FGF19 (1PWA) obtida de uma base de dados de proteínas (PDB) para criar um modelo 3D de homologia de FGF21 usando o software de modelagem MOE (“Molecular Operating Environment”; Chemical Computing Group; Montreal, Quebec, Canadá). FGF19 foi escolhido como modelo, já que, entre as proteínas depositadas na PDB, FGF19 é a proteína mais intimamente relacionada ao FGF21 em termos de homologia da seqüência de aminoácidos.
A acessibilidade ao solvente foi calculada pelo método seguinte usando MOE. Uma primeira medida da área de superfície (SA1) é definida como a área da superfície acessível do resíduo em Â2. Embora um resíduo de aminoácido em particular apareça em uma seqüência primária da proteína várias vezes, cada ocorrência do resíduo pode ter uma área de superfície diferente em função de diferenças, inter alia, na proximidade do resíduo com a superfície da proteína, a orientação da cadeia lateral do resíduo e a posição espacial de resíduos de aminoácidos adjacentes. Portanto, é feita uma segunda medida da área de superfície (SA2), em que o resíduo de interesse é extraído de uma estrutura de proteína junto com aquele vizinho do resíduo, ou resíduos adjacentes. Esses resíduos espacialmente adjacentes são mutados in silico em glicinas para remover suas cadeias laterais, e depois a SA2 para o resíduo de interesse é calculada, gerando uma medida da área de superfície possível total para aquele resíduo em sua conformação particular. Uma proporção de SA1 para SA2 (SA1/SA2) pode então gerar uma medida da percentagem da área de superfície possível para aquele resíduo que está realmente exposta.
Vários resíduos hidrofóbicos que estão altamente expostos ao solvente foram selecionados para análise adicional, e mutações pontuais in silico foram feitas a esses resíduos para substituir o resíduo selecionado com os outros resíduos de aminoácidos de ocorrência natural. As alterações na estabilidade térmica da proteína resultantes de diferentes substituições foram calculadas usando o modelo de FGF21 e o programa interativo baseado na web CUPSAT (“Cologne University Protein Stability Analysis Tools”) de acordo com instruções fornecidas na página na Web de CUPSAT. Veja Parthiban e cols., 2006, Nucleic Acids Res. 34: W239-42; Parthiban e cols., 2007, BMC Struct. Biol. 7: 54. Mutações significativamente desestabilizantes ou hidrofóbicas foram excluídas no design de variantes de mutação pontual de redução da agregação. Substituições estabilizantes (ou, em casos raros, ligeiramente desestabilizantes) que introduzem características hidrofílicas e/ou iônicas aprimoradas foram consideradas como candidatas para os mutantes de FGF21 de redução da agregação.
Um resumo dos dados gerados por meio dessa abordagem lógica de criação genética de proteína é fornecido na Tabela 15, que também lista mutantes de FGF21 exemplares 5 que supostamente possuem agregação de proteína reduzida e estabilidade aumentada. Tabela 15 Efeito calculado de mutantes de FGF21 sobre a estabilidade
Figure img0025
Figure img0026
Figure img0027
EXEMPLO 16
Preparação e expressão de mutantes de FGF21 e proteínas de fusão de redução da agregação Construções que codificam os mutantes de FGF21 5 listados na Tabela 16 foram preparadas por amplificação por PCR do vetor de expressão de FGF21 do tipo selvagem, como descrito no Exemplo 11 (a construção do vetor de expressão de FGF21 do tipo selvagem é descrita no Exemplo 1). Foram geradas proteínas de fusão, como aqui descrito, por 10 exemplo, no Exemplo 6. Tabela 16 Mutantes de FGF21 de redução da agregação
Figure img0028
Figure img0029
Figure img0030
A agregação de várias proteínas de FGF21, incluindo FGF21 do tipo selvagem, polipeptídeos de FGF21 truncados, mutantes de FGF21 e proteínas de fusão de FGF21, foi testada por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). As amostras a serem analisadas foram incubadas a 4°C, temperatura ambiente ou 37°C, por vários pontos do tempo, e depois submetida à análise por SEC. Foram feitos experimentos em um sistema de HPLC Beckman equipado com uma coluna de SEC. Para FGF21 do tipo selvagem, uma coluna de SEC TOSOHAAS TSK-Gel G2000 foi usada com 2x PBS contendo álcool isopropílico 2% como a fase móvel. Para proteínas de fusão FGF21 Fc e polipeptídeos mutantes de FGF21, uma coluna de SEC TOSOHAAS TSK-Gel G3000 foi usada com 2x PBS como a fase móvel. EXEMPLO 17
Atividade in vitro de mutantes de FGF21 de redução da agregação Foram feitos experimentos para identificar mutantes de redução da agregação que retêm atividade de FGF21 do tipo selvagem em um ensaio in vitro de ELK-luciferase. Os ensaios de ELK-luciferase foram realizados como descrito no Exemplo 4. As Figuras 24A-24C mostram os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado nos mutantes de FGF21 FGF21 L99R, FGF21 L99D e FGF21 A111T (Figura 24A); nos mutantes de FGF21 FGF21 A129D, FGF21 A129Q, e FGF21 A134K (Figura 24B); e nos mutantes de FGF21 FGF21 A134Y, FGF21 A134E e FGF21 A129K (Figura 24C). Os resultados desses experimentos demonstram que algumas das mutações de redução da agregação não afetaram adversamente a atividade de FGF21, como testada nos ensaios de ELKluciferase. EXEMPLO 18
Preparação e expressão de mutantes de combinação de Fc(15)FGF21 que exibem meia-vida mais longa e níveis menores de agregação Diversos mutantes de combinação de FGF21, contendo mutações que comprovadamente reduzem a agregação, bem como aumentam a meia-vida por ruptura da degradação proteolítica, foram preparados e conjugados às moléculas de Fc de IgG1. Esses mutantes de FGF21 foram preparados basicamente como descrito no Exemplo 11. EXEMPLO 19
Estudos in vitro de mutantes de Fc(15)FGF21 que exibem meia-vida mais longa e níveis menores de agregação Foram feitos experimentos para identificar mutantes de combinação de FGF21 que retêm atividade de FGF21 do tipo selvagem em um ensaio in vitro de ELK-luciferase. Os ensaios de ELK-luciferase foram realizados como descrito no Exemplo 4. As Figuras 25A-25D mostram os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado nos mutantes de em Fc-FGF21, Fc-FGF21 P171G, Fc-FGF21 P171S e Fc-FGF21 P171T (Figura 25A); os mutantes de Fc-FGF21 Fc-FGF21 P171Y, Fc- FGF21 P171W e Fc-FGF21 P171C (Figura 25B); Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 A45K/G170E e FGF21 A45K (Figura 25C); e Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 P171E e Fc(15)FGF21 A45K/G170E (Figura 25D). Os resultados desses experimentos demonstram que mutações destinadas a aumentar a estabilidade, ou tanto a estabilidade quanto a solubilidade, não comprometeram a atividade in vitro, quando comparados com Fc-FGF21 do tipo selvagem. Curiosamente, o mutante de FGF21 A45K exibiu potência aumentada em relação ao Fc-FGF21 do tipo selvagem. A Figura 26A mostra a alteração na agregação percentual para um controle de FGF21 (WT) e FGF21 A45K após incubação de 65 mg/ml de proteína a 4°C por 1, 2 e 4 dias. Os dados indicam que a mutação A45K leva a uma diminuição da agregação da proteína, comparada com a proteína do tipo selvagem. A Figura 26B mostra a alteração na agregação percentual para um controle de FGF21 (WT) e FGF21 P78C, P78R, L86T, L86R, L98C, L98R, A111T, A129D, A129Q, A129K, A134K, A134Y e A134E após incubação de 65 mg/ml de proteína a 4°C por 1, 6 e 10 dias. Os dados indicam que os mutantes L86R, L98C, L98R, A111T, A129Q e A129K levam a uma diminuição na agregação da proteína, comparados com a proteína do tipo selvagem. A Figura 27 mostra os resultados de um ensaio de atividade de luciferase ELK realizado em um controle humano de FGF21 e nos mutantes de FGF21 FGF21 A45K, FGF21 L52T e FGF21 L58E. Esse experimento demonstra que o mutante FGF21 A45K retém a eficácia plena de FGF21 do tipo selvagem e exibe uma potência que é até maior do que FGF21 do tipo selvagem. No entanto, os mutantes de FGF21 L52T e FGF21 L58E exibem potência e eficácia reduzidas, comparados com FGF21 do tipo selvagem. As Figuras 28A-28B mostram a alteração nos níveis de agregação para os mutantes de Fc(15)FGF21, Fc(15)FGF21 6- 181/G170E, Fc(15)FGF21 A45K/G170E, Fc(15)FGF21 P171E, Fc(15)FGF21 P171A, Fc(15)FGF21 G170E e um controle de FGF21 depois de incubação a 4°C por 1, 4 e 8 dias. Esse experimento demonstra que, ao longo do período de 8 dias, o mutante de Fc(15)FGF21 A45K/G170E exibiu menos agregação do que os mutantes Fc(15)FGF21 G170E ou Fc(15)FGF21 P171E, mas todos os três mutantes mostraram menos agregação do que o controle de Fc(15)FGF21. A Tabela 17 mostra o percentual de agregação obtido para um controle de Fc-FGF21 e para o mutante de Fc-FGF21 A45K/G170E depois de incubação a 4°C ou temperatura ambiente por 0, 2, 3, 4 ou 7 dias. Tabela 17 Agregação percentual para Fc-FGF21 e mutante Fc-FGF21
Figure img0031
Figure img0032
EXEMPLO 20 Preparação e expressão de mutantes de combinação de fusão de Fc-FGF21 Como descrito acima, a estabilidade e a solubilidade de FGF21 podem ser moduladas por meio da introdução de truncamentos e substituições de aminoácidos específicos. Além disso, a estabilidade de FGF21 pode ser ainda aumentada por fusão dessas proteínas de FGF21 modificadas com a porção de Fc do gene da imunoglobulina humana IgG1.
Além disso, por introdução de combinações das modificações acima, podem ser geradas moléculas de FGF21 que possuem tanto estabilidade quanto solubilidade aumentadas. As seqüências de ácidos nucleicos que codificam os mutantes de combinação de FGF21 listados na Tabela 18 foram preparadas usando as técnicas descritas acima. Tabela 18 Mutantes de combinação de FGF21
Figure img0033
Figure img0034
A Figura 29 mostra os níveis de glicemia medidos em camundongos injetados com os mutantes de combinação de Fc(15)FGF21 Fc(15)FGF21 A45K/G170E, Fc(15)FGF21 A45K/P171G ou Fc(15)FGF21 L98R/P171G.
Em outro experimento, o mutante de FGF21 Fc(15)FGF21 L98R/P171G foi estudado lado a lado com FGF21 e Fc-FGF21 do tipo selvagem maduros. Em um experimento, uma linhagem de célula 293T recombinante foi cultivada na presença de diferentes concentrações de FGF21, Fc-FGF21 ou Fc(15)FGF21 L98R/P171G por 6 horas. Os lisados de células foram então testados quanto à atividade de luciferase. Como mostrado na Figura 30, Fc(15)FGF21 L98R/P171G teve atividade similar ao Fc-FGF21, indicando que a introdução das duas mutações pontuais não alterou a atividade in vitro da molécula.
Ainda em outro experimento, a estabilidade de Fc(15)FGF21 L98R/P171G a 65 mg/ml foi avaliada por nove dias em duas temperaturas diferentes, especificamente em temperatura ambiente e 4°C, lado a lado com FGF21 e Fc- FGF21. Após o período de incubação, os lisados de células foram então analisados com SEC-HPLC para determinar o perfil de agregação versus tempo em várias temperaturas. Os dados mostrados nas Figuras 31A e 31B indicam que a taxa de formação agregação foi reduzida significativamente no Fc(15)FGF21 L98R/P171G em temperatura ambiente (triângulos sólidos, linha pontilhada na Figura 31A) e a 4°C (triângulos sólidos, linha pontilhada na Figura 31B). EXEMPLO 21 Mutantes de FGF21 resistentes à proteólise que compreendem mutações no terminal C
A estabilidade in vivo de mutantes de combinação também foi estudada. Especificamente, a estabilidade in vivo de Fc(15)FGF21 L98R/P171G foi comparada com a estabilidade de Fc-FGF21 em modelos murídeos e em cynomolgus. Verificou-se que os resultados eram similares em ambas as espécies. No estudo em cynomolgus, Fc(15)FGF21 L98R/P171G e Fc(15)FGF21 foram injetados IV a 23,5 mg/kg e alíquotas do soro e plasma foram coletadas em pontos do tempo em até 840 horas pós-dose. Pontos do tempo até 168 horas foram analisados. As amostras dos pontos do tempo foram purificadas por afinidade usando reagentes anti-Fc, e depois analisadas usando espectrometria de massa MALDI. Os resultados estavam bem correlacionados entre as duas análises.
Pela análise dos dados gerados usando imunoafinidade- MALDI, foi observado que o corte no sítio de P171 estava eliminado na molécula de Fc(15)FGF21 L98R/P171G em conseqüência da mutação de P171 em P171G. No entanto, uma degradação pequena e lenta que resulta em uma perda de até 3 resíduos do terminal C foi observada para Fc(15)FGF21 L98R/P171G (Figura 32). As pequenas clivagens nos três resíduos do terminal C também foram observadas com outros mutantes de FGF21 após o sítio de clivagem mais suscetível entre resíduos de aminoácidos 171 e 172 ter sido bloqueado, como mostrado nas Figuras 20 e 21. A clivagem de 3 resíduos do terminal C pode representar o término da clivagem da extremidade do terminal C da molécula por uma carboxipeptidase de uma forma seqüencial, resíduo por resíduo, ou um ataque de protease específico nos resíduos de aminoácidos 178 e 179 com corte não específico nos resíduos de aminoácidos 179-180 e 180-181. A perda de 2-3 aminoácidos no terminal C poderia causar ligação reduzida de beta-klotho e, por fim, potência e atividade in vivo diminuídas da molécula. Veja, por exemplo, Yie e cols., 2009, FEBS Lett. 583: 19-24. Para solucionar a degradação aparente de carboxipeptidase do terminal C, foi estudado o impacto da adição de um resíduo de aminoácido “cap” a vários polipeptídeos mutantes de FGF21. Diversas construções, incluindo aquelas apresentadas na Tabela 19, foram feitas e testadas usando as técnicas aqui descritas. A Tabela 19 resume os resultados do ensaio de luciferase ELK in vitro.
Caps de aminoácidos adequados podem ter comprimento entre 1 e 15 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 aminoácidos de comprimento. Qualquer número e tipo de aminoácido(s) pode ser empregado como um cap, por exemplo, um único resíduo de prolina e um único resíduo de glicina, dois resíduo de glicinas, cinco resíduo de glicinas, além de outras combinações. Exemplos adicionais de caps são fornecidos no presente Exemplo e na Tabela 19.
Adicionalmente, para solucionar o aparente ataque de protease nos resíduos de aminoácidos 178 e 179, foi estudada a mutação dos resíduos de aminoácidos nas posições 179, 180 e 181. Novamente, diversas construções, incluindo aquelas apresentadas na Tabela 19, foram feitas e testadas usando as técnicas aqui descritas. O impacto de combinações de cap e mutações nesses sítios também foi explorado. A Tabela 19 resume construções exemplares que foram feitas e estudadas no ensaio de ELK-luciferase in vitro, que foi realizado como aqui descrito. Consistente com a terminologia aqui utilizada, hFc significa uma seqüência de Fc humano (ou seja, Id. de Seq. N°:13), L15 refere-se a um ligante que possui 15 resíduos (ou seja, Id. de Seq. N°:23) Tabela 19 Eficácia e valores de EC50 para polipeptídeos de FGF21 que compreendem modificações no terminal C
Figure img0035
Figure img0036
A Figura 33 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia observada em camundongos db/db diabéticos (base de C57B6) injetados com um controle de PBS, FGF21 nativo do tipo selvagem, Fc-FGF21 (L98R, P171G) e duas moléculas com 5 cap às quais um resíduo de prolina ou glicina foi adicionado na extremidade do terminal C, ou seja, Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182P) e Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182G). No presente Exemplo, quando um resíduo foi adicionado ao terminal C de um polipeptídeo de FGF21 do 10 tipo selvagem ou mutante, o resíduo é citado por sua posição na proteína resultante. Dessa forma, “182G” indica que um resíduo de glicina foi adicionado ao terminal C do resíduo 181 da proteína madura do tipo selvagem ou mutante.
A Figura 33 mostra que FGF21 nativo reduziu os níveis de 15 glicemia por 6 horas, enquanto todos os três mutantes de Fc(15)FGF21 estudados exibiram atividade sustentada de redução da glicemia por pelo menos 120 horas. Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182P), uma molécula que compreende a adição de um resíduo de prolina no terminal C do componente FGF21 da molécula de fusão, pareceu o mais potente e resultou nos menores níveis de glicemia, comparado com Fc(15)FGF21 (L98R, P171G) e Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182G).
Em um experimento subseqüente, a atividade in vivo de (L98R, P171G, 182G) e Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182P) foi estudada e comparada com a atividade in vivo de uma molécula com cap que compreende uma adição de duas glicinas no terminal C, especificamente Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G). A Figura 34 mostra os resultados daquele experimento. A Figura 34 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia observada em camundongos ob/ob injetados com controle de PBS, Fc(15)FGF21 (L98R, P171G), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182G) e Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182P).
Como mostrado na Figura 34, todas as moléculas estudadas exibiram atividade de redução de glicose sustentada, comparadas com o controle de PBS. Esse experimento confirmou os resultados prévios (Figura 33) de que Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182P) com uma adição de prolina no terminal C exibiu eficácia de redução de glicose ligeiramente aumentada, comparado com a molécula sem um cap de prolina, por exemplo, Fc(15)FGF21 (L98R, P171G). No entanto, a adição de dois resíduos de glicina no terminal C, por exemplo, Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G), pareceu reduzir a potência in vivo da molécula, e encurtou a duração do efeito de redução de glicose in vivo. A Figura 35 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia observada em camundongos db/db diabéticos (base de C57B6) injetados com controle de PBS ou com os polipeptídeos mutantes de FGF21 Fc(15)FGF21 (L98R, P171G), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, Y179S), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, Y179A), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, A180S) e Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, A180G). Todos os mutantes exibiram atividade de redução de glicose similar com duração de ação similar. A Figura 36 mostra a alteração percentual nos níveis de glicemia observada em camundongos db/db diabéticos (base de C57B6) injetados com controle de veículo, Fc(15)FGF21 (L98R, P171G), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, Y179F) e Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, A180E). Comparado com Fc(15)FGF21 (L98R, P171G), Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, Y179F) foi menos eficaz na redução da glicemia. No entanto, Fc(15)FGF21 (L98R, P171G, A180E), em que alanina na posição de aminoácido de 180 foi mutada para ácido glutâmico, foi mais eficaz do que Fc(15)FGF21 (L98R, P171G) e causou uma redução adicional de 20% dos níveis de glicemia, comparado com Fc(15)FGF21 (L98R, P171G). Esses dados sugerem que a mutação A180E pode ter reduzido a degradação do terminal C in vivo e, dessa forma, aumentou a potência e eficácia in vivo da molécula. EXEMPLO 22 Estudo em macaco Rhesus Uma construção de Fc-Ligante-FGF21 foi gerada usando a metodologia aqui descrita. A construção era composta por uma seqüência de Fc de IgG1 (Id. de Seq. N°:13) fundida no terminal C a uma seqüência ligantea (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser- (Gly)4-Ser (Id. de Seq. N°:23), que foi então fundida no terminal C ao terminal N a uma seqüência de FGF21 maduro (Id. de Seq. N°:4), na qual duas mutações, L98R e P171G, haviam sido introduzidas. Essa construção foi então expressa e purificada, como aqui descrito, e foi isolada como uma forma dimérica da proteína, da qual cada monômero estava ligado por meio de ligações intermoleculares de dissulfeto entre a região Fc de cada monômero. Essa molécula é denominada no presente Exemplo “Fc-FGF21(RG)” e possui a seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°:36 e é codificada pelo Id. de Seq. N°:37. Nesse Exemplo, FGF21 refere-se à forma madura de FGF21, especificamente o Id. de Seq. N°:4. 22.1. Design do estudo
A construção Fc-FGF21(RG) foi administrada cronicamente e por via subcutânea (“SC”) em machos de macacos Rhesus não diabéticos com um BMI > 35. Dois outros grupos de macacos (n = 10 por grupo) foram tratados com FGF21 maduro (ou seja, Id. de Seq. N°:4) ou um controle de veículo.
Os animais foram aclimatados por 42 dias antes da administração de qualquer composto de teste e foram então divididos em grupos de 10 e receberam a administração de múltiplas injeções SC de compostos de teste ou artigo de controle de forma cega, como revelado graficamente na Figura 37. Resumidamente, cada animal foi injetado uma vez ao dia com composto ou veículo. FGF21 foi administrado diariamente, enquanto Fc-FGF21(RG) foi administrado semanalmente. As doses de Fc-FGF21(RG) e FGF21 foram aumentadas a cada 2 semanas, como mostrado na Figura 37. O peso corporal e a ingesta de alimentos foram monitorados ao longo do estudo. O CRO foi omitido do tratamento.
Dois testes de tolerância à glicose oral (OGTTs) foram realizados antes do início do tratamento. OGTT1 foi usado para separar os animais em três grupos equivalentes que possuem uma distribuição similar de animais com base na área sob a curva (AUC) e peso corporal. Os resultados do segundo OGTT (OGTT2) foram usados para confirmar a separação do primeiro OGTT (OGTT1). Macacos com perfis de OGTT que eram inconsistentes de um teste (OGTT1) para o teste seguinte (OGTT2) foram excluídos. Os resultados dos OGTTs 1 e 2 são mostrados nas Figuras 38A e 38B, com as medidas da AUC mostradas na Figura 38C. O peso corporal de base é mostrado na Figura 38D e na Tabela 20.
Os OGTTs 3, 4 e 5 foram realizados a cada 2 semanas ao final de cada tratamento de dose de doses baixa, média e alta. Foram coletadas amostras de sangue de animais em jejum semanalmente, e foram usadas para a medida de glicose, insulina, níveis de triglicerídeos, bem como dos níveis de composto de teste. Também foram coletadas amostras de sangue semanalmente durante o período de eliminação de 3 semanas.
Os OGTT1 e OGTT2 de base mostraram um perfil de glicose esperado, com observado em animais normais, com uma glicemia máxima obtida em 30 minutos, e demonstraram AUCs estáveis para os 3 grupos diferentes.
Os valores basais de jejum para bioquímica do plasma são mostrados na Tabela 20. As medidas da bioquímica do plasma foram realizadas em amostras de sangue coletadas antes do início do tratamento. Tabela 20 Valores basais para peso corporal, glicemia de jejum, insulina e triglicerídeo. Níveis dos três grupos de macacos Rhesus
Figure img0037
Foram selecionados três níveis de dose diferentes; a dose baixa foi de 0,1 e 0,3 mg/kg, a dose média foi de 0,3 e 1 mg/kg e a dose alta foi de 1 e 5 mg/kg para FGF21 e Fc- FGF21(RG), respectivamente. Os níveis de dose foram escolhidos com base na dose-respota observada em camundongos, com um regime de dosagem baseado na freqüência antecipada de injeção em seres humanos.
Doses eqüimolares de FGF21 foram usadas para as doses baixas e médias, e a dose alta de Fc-FGF21(RG) foi elevada até 5 mg/kg (ou seja, ao invés de 3 mg/kg, que seria eqüimolar à dose de FGF21 de 1 mg/kg). 22.2. Efeito de compostos de teste sobre o peso corporal
Nesse experimento, a fim de medir o efeito dos compostos de teste sobre o peso corporal medido semanalmente, a alteração percentual do peso corporal a partir do nível de base foi calculada semanalmente nos três grupos diferentes de macacos Rhesus. O peso corporal também foi medido durante o período de eliminação de três semanas. Os valores do peso corporal de base para cada grupo estão incluídos na Tabela 20.
O peso corporal foi acompanhado ao longo do estudo, tanto pré- quanto pós-administração de compostos de teste. A alteração percentual do peso corporal a partir do nível basal dos animais com veículo aumentou com o tempo, enquanto o peso corporal de animais tratados com Fc- FGF21(RG) e FGF21 diminuiu de forma dose-dependente ao longo do período de tratamento de 6 semanas, como mostrado na Figura 39. Como observado previamente em roedores (Xu e cols., Diabetes 58(1): 250-9 (2009)), o tratamento com FGF21 estatisticamente diminuiu significativamente o peso corporal. Fc-FGF21(RG) teve uma exposição maior do que FGF21 (Figura 48 e Figura 47, respectivamente), oferecendo uma possível explicação para a observação de que Fc- FGF21(RG) mostrou uma diminuição mais pronunciada do peso corporal do que FGF21. 22.3. Efeito de compostos de teste sobre os níveis de insulina
Os níveis de insulina foram medidos em amostras de sangue que foram coletadas após jejum de um dia para o outro ou após uma refeição à tarde.
Os níveis plasmáticos de insulina de jejum foram medidos em macacos Rhesus a cada semana em animais tratados com veículo, FGF21 ou Fc-FGF21(RG), e durante o período de eliminação de 3 semanas. Amostras de sangue em jejum foram retiradas aproximadamente cinco dias após a última injeção de Fc-FGF21(RG) e aproximadamente 21 horas após a última injeção de FGF21.
Os níveis plasmáticos prandiais de insulina foram medidos em macacos Rhesus durante a quinta e a sexta semanas de tratamento com veículo ou FGF21 durante o tratamento com dose alta. Amostras prandiais de sangue foram retiradas aproximadamente três dias após injeção de Fc-FGF21(RG) e aproximadamente 2 horas após a última injeção de FGF21. A Figura 40 mostra o efeito do veículo, FGF21 e Fc-FGF21(RG) sobre os níveis de insulina de jejum ao longo de todo o estudo de 9 semanas, enquanto a Figura 41 revela os níveis prandiais de insulina determinados de amostras retiradas durante a 5a e 6a semanas.
Resumidamente, nas duas maiores doses, tanto FGF21 quanto Fc-FGF21(RG) estatisticamente diminuíram significativamente os níveis plasmáticos de jejum e prandiais de insulina. A observação de que os níveis de insulina de animais tratados com FGF21 e Fc-FGF21(RG) eram diminuídos sem observação de níveis aumentados da glicemia é indicativa de sensibilidade aumentada à insulina. 22.4. Efeito de compostos de teste sobre OGTT (glicose e insulina)
Três OGTTs (OGTTs 3, 4 e 5) foram realizados após o tratamento ter sido iniciado. Perfis do nível de glicose e insulina do OGTT5 foram medidos em animais tratados por 6 semanas com veículo, FGF21 ou Fc-FGF21(RG), correspondendo às últimas duas semanas do regime de escalonamento da dose alta. O OGTT5 foi realizado aproximadamente 7 dias após a última injeção de Fc-FGF21(RG), e aproximadamente 21 horas após a última injeção de FGF21. Os perfis de glicose e insulina do OGTT5 são mostrados na Figura 42 e na Figura 43, respectivamente. Animais tratados com Fc-FGF21(RG) mostraram uma depuração de glicose aumentada, comparados com animais tratados apenas com veículo na maior dose e no último ponto do tempo medido, como mostrado na Figura 42. Ao final da última dose, Fc-FGF21(RG) mostrou o maior aumento da depuração de glicose. FGF21 não exibiu aumento da depuração de glicose. Fc-FGF21(RG) teve uma exposição maior do que FGF21 (Figura 48 e Figura 47, respectivamente), oferecendo uma possível explicação para a observação de que Fc-FGF21(RG) mostrou um efeito mais pronunciado na depuração de glicose do que FGF21. Os níveis de insulina durante OGTT5 foram estatisticamente significativamente reduzidos no último ponto do tempo medido em animais tratados com Fc-FGF21(RG), comparados com animais tratados com veículo.
A alteração percentual da AUC de glicose a partir do nível de base foi calculada para os três OGTT (OGTTs 3, 4 e 5) realizados ao final de cada uma das doses baixas, médias e altas nos três grupos diferentes de macacos Rhesus, como mostrado na Figura 44. O OGTT5 foi realizado aproximadamente sete dias após a última injeção de Fc- FGF21(RG) e 21 horas após a última injeção de FGF21, e mostrou que Fc-FGF21(RG) estatisticamente reduziu significativamente a AUC5. Os valores de base do OGTT para cada grupo são mostrados na Figura 38C.
Os níveis de glicemia de jejum foram medidos nos dias em que não foi realizado nenhum OGTT. Não houve diferenças estatísticas importantes observadas nos níveis de glicemia de jejum medidos entre os três grupos de animais. 22.5. Efeito de compostos de teste sobre os níveis de triglicerídeos
A alteração percentual dos níveis plasmáticos de jejum de triglicerídeos foi calculada em macacos Rhesus a cada semana em animais tratados com veículo, FGF21 ou Fc- FGF21(RG), e durante o período de eliminação de 3 semanas. Amostras de sangue de jejum foram retiradas aproximadamente cinco dias após a última injeção de Fc-FGF21(RG) e aproximadamente 21 horas após a última injeção de FGF21. Os níveis de triglicerídeo foram medidos a cada semana após o tratamento ser iniciado e as alterações percentuais a partir do nível de base são mostradas na Figura 45, e os valores de base de jejum são mostrados na Tabela 20.
Como revelado na Figura 45, animais tratados com Fc- FGF21(RG) ou FGF21 mostraram uma diminuição dose-dependente nos níveis de triglicerídeos, com Fc-FGF21(RG) tendo o maior efeito redutor comparado com FGF21. A Figura 46 mostra os níveis plasmáticos de triglicerídeos em amostras adquiridas de macacos Rhesus em jejum, durante a quinta e a sexta semanas de tratamento com veículo ou Fc-FGF21(RG) ou FGF21. As amostras prandiais de sangue foram retiradas aproximadamente 3 dias após injeção de Fc-FGF21(RG) e aproximadamente 2 horas após a última injeção de FGF21. Os níveis plasmáticos prandiais de triglicerídeos de animais tratados com FGF21 e Fc-FGF21(RG) estavam estatisticamente significativamente reduzidos, comparados com os níveis de triglicerídeos de animais tratados com veículo (Figura 46). 22.6. Concentração de compostos de teste
A exposição dos compostos testados administrados em níveis aproximadamente equivalentes de dose molar foi avaliada ao longo do período de estudo. A concentração de Fc-FGF21(RG) foi medida na pré-dose, e aproximadamente 5 dias após a última injeção.
Os níveis de FGF21 foram medidos na pré-dose, e em 5, 12, 19 e 26 dias. Foram retiradas amostras de sangue aproximadamente 21 horas após a última injeção.
A concentração individual dos compostos testados em cada macaco é mostrada nas Figuras 47 e 48. Como mostrado na Figura 47, a maioria dos animais no grupo tratado com FGF21 teve concentrações abaixo do limite de quantificação. A Figura 48 mostra que animais no grupo tratado com Fc- FGF21(RG) tiveram níveis detectáveis de Fc-FGF21(RG) durante cada fase de dosagem (duas doses semanais na mesma potência de dose). A concentração média de cada fase de dosagem aumentou aproximadamente de forma proporcional à dose de 0,3 a 5 mg/kg para Fc-FGF21(RG). Há um acúmulo mínimo, como demonstrado pelas concentrações estáveis após a primeira e a segunda dose semanal dentro de cada fase de escalonamento da dose para ambos os compostos. Durante a fase sem tratamento (período de eliminação), os níveis de Fc-FGF21(RG) eram detectáveis até aproximadamente o 47° dia (12 dias após a última dose) e estavam abaixo do limite inferior de quantificação (LLOQ) posteriormente.
A exposição dos compostos de teste também foi monitorada durante cada OGTT. FGF21 não era detectável durante OGTTs 3 e 4, após o tratamento com dose baixa e média de FGF21. No entanto, foram observados níveis mensuráveis durante OGTT5, após o tratamento com dose alta. Foi observado um aumento proporcional à dose nos níveis de Fc-FGF21(RG) através do terceiro ao quinto OGTT, com níveis crescentes de dose, como mostrado na Figura 49.
Os dados dos níveis de composto confirmam que os animais foram expostos à quantidade esperada de cada composto, especificamente FGF21 e Fc-FGF21(RG), de uma forma proporcional ao aumento da dose. Foi observada uma grande variabilidade na quantidade de FGF21 medida, o que era um resultado esperado considerando que a coleta das amostras foi feita aproximadamente 21 horas após a última dose e a meia-vida de FGF21 é de aproximadamente 1 hora. 22.7. Conclusões FGF21 diminuiu os níveis plasmáticos de jejum e prandiais de triglicerídeo e de insulina e diminuiu o peso corporal nas maiores doses. Fc-FGF21(RG) melhorou o OGTT e diminuiu os níveis de insulina na maior dose, e diminuiu de forma dose-dependente os níveis plasmáticos de jejum e prandiais de triglicerídeos, bem como o peso corporal. Tanto FGF21 quanto Fc-FGF21(RG) diminuíram diversos parâmetros metabólicos nos macacos Rhesus não diabéticos. As diminuições do nível de insulina e triglicerídeos foram idênticas entre FGF21 e Fc-FGF21(RG) quando os níveis circulantes de composto estavam em uma faixa similar, na condição prandial. Em função de suas propriedades aprimoradas, Fc-FGF21(RG) foi superior ao FGF21 na maioria dos parâmetros medidos, e poderia ser administrado uma vez por semana para observar a eficácia sobre parâmetros metabólicos.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em termos de várias modalidades, deve-se subentender que variações e modificações ocorrerão àqueles habilitados na técnica.
Portanto, há a intenção de que as reivindicações em anexo englobem todas essas variações equivalentes que estão incluídas no escopo da invenção, como reivindicada. Além disso, os capítulos das seções aqui usados têm finalidade apenas organizacional, e não devem ser considerados como 5 limitantes da matéria em questão descrita. Todas as referências citadas neste pedido são expressamente aqui incorporadas por referência.

Claims (12)

1. Polipeptídeo isolado caracterizado por compreender uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°:4, que também compreende a substituição de um resíduo lisina pelo resíduo de alanina na posição 45, o resíduo de arginina pelo resíduo de leucina na posição 98, um resíduo de ácido glutâmico pelo resíduo de glicina na posição 170, ou um resíduo de glicina ou serina pelo resíduo de prolina na posição 171, e combinações desses.
2. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado também por compreender pelo menos uma substituição de aminoácido que é: (a) uma fenilalanina, prolina, alanina, serina ou glicina na posição 179; (b) um ácido glutâmico, glicina, prolina ou serina na posição 180; ou (c) uma lisina, glicina, treonina, alanina, leucina, ou prolina na posição 181.
3. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado também por compreender 1 a 10 resíduos de aminoácidos fundidos ao terminal C do polipeptídeo.
4. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é ligado covalentemente a um ou mais polímeros.
5. Polipeptídeo isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polímero é PEG.
6. Polipeptídeo de fusão caracterizado por compreender o polipeptídeo isolado, conforme definido na reivindicação 1, fundido a uma seqüência de aminoácidos heteróloga.
7. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é fundido à seqüência de aminoácidos heteróloga por meio de um ligante.
8. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende GGGGGSGGGSGGGGS (Id. de Seq. N°: 23).
9. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos heteróloga é um domínio constante de IgG ou fragmento desse.
10. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o domínio constante de IgG compreende a seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 13.
11. Multímero, caracterizado por compreender duas ou mais cópias do polipeptídeo de fusão, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10.
12. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o polipeptídeo isolado, conforme definido na reivindicação 1, e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável.
BR122020010972-6A 2008-06-04 2009-06-03 polipeptídeo isolado e de fusão, sua composição farmacêutica e multímero BR122020010972B1 (pt)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5886108P 2008-06-04 2008-06-04
US5891908P 2008-06-04 2008-06-04
US61/058,861 2008-06-04
US61/058,919 2008-06-04
US16436409P 2009-03-27 2009-03-27
US61/164,364 2009-03-27
US17573609P 2009-05-05 2009-05-05
US61/175,736 2009-05-05
PCT/US2009/046113 WO2009149171A2 (en) 2008-06-04 2009-06-03 Fgf21 mutants and uses thereof
BRPI0911385A BRPI0911385B8 (pt) 2008-06-04 2009-06-03 polipeptídeo isolado, polipeptídeo de fusão, multímero e composição farmacêutica

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR122020010972B1 true BR122020010972B1 (pt) 2021-05-18

Family

ID=40984291

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR122020010972-6A BR122020010972B1 (pt) 2008-06-04 2009-06-03 polipeptídeo isolado e de fusão, sua composição farmacêutica e multímero
BRPI0911385A BRPI0911385B8 (pt) 2008-06-04 2009-06-03 polipeptídeo isolado, polipeptídeo de fusão, multímero e composição farmacêutica

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0911385A BRPI0911385B8 (pt) 2008-06-04 2009-06-03 polipeptídeo isolado, polipeptídeo de fusão, multímero e composição farmacêutica

Country Status (23)

Country Link
US (9) US8034770B2 (pt)
EP (1) EP2296690B1 (pt)
JP (5) JP2011523561A (pt)
KR (2) KR101787300B1 (pt)
CN (1) CN102143758B (pt)
AR (1) AR072009A1 (pt)
AU (1) AU2009256232B2 (pt)
BR (2) BR122020010972B1 (pt)
CA (1) CA2726589C (pt)
CL (1) CL2010001346A1 (pt)
CO (1) CO6341566A2 (pt)
CR (1) CR11851A (pt)
EA (3) EA034847B1 (pt)
IL (1) IL209395A (pt)
JO (1) JOP20190083A1 (pt)
MA (1) MA33142B1 (pt)
MX (2) MX2010013333A (pt)
MY (1) MY152721A (pt)
NZ (1) NZ590050A (pt)
PE (1) PE20100253A1 (pt)
SG (1) SG193860A1 (pt)
TW (2) TWI526220B (pt)
WO (1) WO2009149171A2 (pt)

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140012199A (ko) 2007-03-30 2014-01-29 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
JOP20190083A1 (ar) * 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
EP2358749B1 (en) * 2008-10-10 2018-07-18 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
WO2010065439A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
AU2010246038A1 (en) 2009-05-05 2011-12-01 Amgen Inc. FGF21 mutants and uses thereof
DK3248610T3 (da) 2009-05-05 2024-01-15 Amgen Inc Fgf21-mutanter og anvendelser deraf
EP2443145A1 (en) 2009-06-17 2012-04-25 Amgen, Inc Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof
EP2493495A4 (en) * 2009-07-10 2013-08-21 Univ Northwestern HERZSCHÜTZENDE ROLE OF LIVER CELLS AND SEKRETORIC FACTORS FROM LIVER CELLS IN MYOCARDIAN EMERGENCE
CN101993485B (zh) * 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
AU2010326024A1 (en) 2009-12-02 2012-07-05 Amgen Inc. Binding proteins that bind to human FGFR1c, human beta-Klotho and both human FGFR1c and human beta-Klotho
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
WO2011107494A1 (de) 2010-03-03 2011-09-09 Sanofi Neue aromatische glykosidderivate, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und deren verwendung
EP2558497A2 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
CA2796459C (en) 2010-04-16 2016-05-24 Salk Institute For Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using fgf-1
DE102010015123A1 (de) 2010-04-16 2011-10-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Benzylamidische Diphenylazetidinone, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung
US8530413B2 (en) 2010-06-21 2013-09-10 Sanofi Heterocyclically substituted methoxyphenyl derivatives with an oxo group, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
TW201215387A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Aventis Spirocyclically substituted 1,3-propane dioxide derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as a medicament
TW201221505A (en) 2010-07-05 2012-06-01 Sanofi Sa Aryloxyalkylene-substituted hydroxyphenylhexynoic acids, process for preparation thereof and use thereof as a medicament
TW201215388A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Sa (2-aryloxyacetylamino)phenylpropionic acid derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
MX2013002208A (es) 2010-08-23 2013-05-30 Amgen Inc Derivados de sulfonilpiperazina que interactuan con la proteina reguladora de glucocinasa para el tratamiento de diabetes.
SG190082A1 (en) * 2010-11-05 2013-06-28 Covx Technologies Ireland Ltd Anti-diabetic compounds
CN102464712A (zh) * 2010-11-11 2012-05-23 重庆富进生物医药有限公司 缺失型人成纤维细胞生长因子21变异体及其偶联物
EP2694491A1 (en) 2011-04-05 2014-02-12 Amgen Inc. Benzodioxepine and benzodioxine compounds that interact with glucokinase regulatory protein for the treatment of diabetes
WO2012151349A1 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Liu Shu Q Neuroprotection by hepatic cells and hepatocyte secretory factors
KR102077721B1 (ko) 2011-07-01 2020-02-14 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법
AU2012301769B2 (en) * 2011-08-31 2016-05-19 Amgen Inc. FGF21 for use in treating type 1 diabetes
EP2567959B1 (en) 2011-09-12 2014-04-16 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
WO2013037390A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
JO3476B1 (ar) * 2011-09-26 2020-07-05 Novartis Ag بروتينات مندمجة لعلاج الاضطرابات الايضية
EP2760862B1 (en) 2011-09-27 2015-10-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-alkyl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
AR087973A1 (es) 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
CN102558358A (zh) * 2011-12-30 2012-07-11 张海涛 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用
WO2013123444A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 Amgen Inc. Sulfonyl compounds that interact with glucokinase regulatory protein
WO2013131091A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 New York University Chimeric fgf21 proteins with enhanced binding affinity for beta-klotho for the treatment of type ii diabetes, obesity and related metabolic disorders
WO2013173382A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Amgen Inc. Benzothiophene sulfonamides and other compounds that interact with glucokinase regulatory protein
CA3062003C (en) 2012-05-17 2022-01-11 Extend Biosciences, Inc. Vitamin d as a targeting group for therapeutic peptides
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
TWI513705B (zh) * 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
AU2013274639A1 (en) * 2012-06-11 2014-11-06 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 variants
AR092076A1 (es) * 2012-08-22 2015-03-18 Lilly Co Eli Proteinas homodimericas
WO2014085365A2 (en) * 2012-11-28 2014-06-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
CN108888757A (zh) 2012-12-27 2018-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法
US9550820B2 (en) 2013-02-22 2017-01-24 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23/fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
CN103191415A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备治疗高血压的药物中的应用
US20160235810A1 (en) 2013-10-18 2016-08-18 Novartis Ag Methods of treating diabetes and related disorders
WO2015061331A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use
CN105828833A (zh) 2013-10-21 2016-08-03 萨克生物研究学院 突变的成纤维细胞生长因子（fgf）1及使用方法
WO2015065897A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Cancer models and associated methods
RU2701434C2 (ru) 2014-01-24 2019-09-26 Нгм Биофармасьютикалс, Инк. Связывающие белки и способы их применения
JP6712230B2 (ja) 2014-03-11 2020-06-17 ノバルティス アーゲー リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法
WO2015148708A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fgf21 receptor agonists and uses thereof
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
WO2015195509A2 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
EP3220961B1 (en) 2014-10-22 2023-07-05 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
EP3209681A4 (en) 2014-10-23 2018-10-31 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising peptide variants and methods of use thereof
KR20240024362A (ko) 2014-10-24 2024-02-23 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
PT3236991T (pt) * 2014-12-23 2019-09-06 Novo Nordisk As Derivados de fgf21 e usos dos mesmos
KR20160088656A (ko) 2015-01-16 2016-07-26 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2016187558A2 (en) 2015-05-20 2016-11-24 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients
WO2017019957A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
KR102668200B1 (ko) * 2015-10-28 2024-05-23 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR102670157B1 (ko) 2015-10-28 2024-05-29 주식회사유한양행 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
JP2018535964A (ja) 2015-10-30 2018-12-06 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ）１アナログによるステロイド誘導性高血糖の処置
US10744185B2 (en) 2015-11-09 2020-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of using variants of FGF19 polypeptides for the treatment of pruritus
TW201731867A (zh) * 2015-12-02 2017-09-16 賽諾菲公司 Ｆｇｆ２１變異體
WO2017116207A1 (ko) * 2015-12-31 2017-07-06 한미약품 주식회사 Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도
EP3442997A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Indiana University Research & Technology Corporation Fgf21 c-terminal peptide optimization
TWI781948B (zh) 2016-08-01 2022-11-01 大陸商和其瑞醫藥（南京）有限公司 Ｍｇ５３突變體及其製備方法和用途
CN106317226B (zh) 2016-08-19 2017-09-05 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
EP3502143A4 (en) 2016-08-19 2020-07-15 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
WO2018039557A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors
CA3042512A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Yuhan Corporation Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins
RU2019122785A (ru) 2016-12-22 2021-01-22 Санофи Комбинации соединения на основе fgf21/агониста glp-1r с оптимизированным соотношением активности
CN108619490A (zh) * 2017-03-22 2018-10-09 天士力医药集团股份有限公司 一种长效化突变的人源成纤维生长因子的新用途
MX2019012331A (es) * 2017-04-21 2020-01-23 Yuhan Corp Metodo para producir proteinas de doble funcion y sus derivados.
CN107056925B (zh) * 2017-04-28 2022-01-14 中国科学院合肥物质科学研究院 人fgf21突变体、其制备方法及用途
US11365228B2 (en) 2017-07-06 2022-06-21 Yale University Mutant FGF21 polypeptide compositions
SG11202001379WA (en) 2017-09-08 2020-03-30 Bristol Myers Squibb Co Modified fibroblast growth factor 21 (fgf-21) for use in methods for treating nonalcoholic steatohepatitis (nash)
CN109836504B (zh) * 2017-11-24 2022-08-02 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白
CN111518770B (zh) 2017-12-19 2023-01-06 北京吉源生物科技有限公司 一种表达glp1和fgf21的干细胞及其用途
CN116098989A (zh) 2018-02-08 2023-05-12 广东东阳光药业有限公司 Fgf21变体、融合蛋白及其应用
CN114903978A (zh) 2018-07-03 2022-08-16 百时美施贵宝公司 Fgf-21配制品
CN111662373B (zh) * 2019-03-05 2024-05-14 广东东阳光药业股份有限公司 一种多肽分子及其应用
US11427623B1 (en) 2019-05-28 2022-08-30 89Bio Ltd. Methods of treatment using mutant FGF-21 peptide conjugates
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
TW202140074A (zh) 2020-01-08 2021-11-01 美商必治妥美雅史谷比公司 Fgf-21結合物調配物
JP7392491B2 (ja) * 2020-01-21 2023-12-06 トヨタ自動車株式会社 電源システム
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
WO2022032187A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Fgf21 combined with ccr2/5 antagonists for the treatment of fibrosis
WO2022115597A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating liver diseases
GB2625224A (en) 2021-09-08 2024-06-12 Leto Laboratories Co Ltd FGF21 mutant protein and use thereof
WO2023064808A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Akero Therapeutics, Inc. Pharmaceutical compositions of efruxifermin
CN113980147B (zh) * 2021-11-26 2023-07-28 中国药科大学 一种聚多肽与fgf21融合蛋白突变体及其应用
WO2023173021A2 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for the treatment of alcohol toxicity
WO2024059507A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 Akero Therapeutics, Inc. Fgf21 mutant polypeptides

Family Cites Families (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4436366A (en) 1981-02-17 1984-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company End capping an optical fiber
AR230173A1 (es) 1981-06-29 1984-03-01 American Cyanamid Co Instrumento para ligaciones quirurgicas
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0133968B1 (en) 1983-07-29 1989-06-07 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Solid state overcurrent detector
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
CA1310924C (en) 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5288855A (en) * 1989-01-23 1994-02-22 Farmitalia Carlo Erba Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor
JP3039802B2 (ja) * 1989-07-06 2000-05-08 ザ リージェンツ オブザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 繊維芽細胞成長因子のための受容体
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
EP0779362B2 (en) 1989-12-22 2012-06-13 Laboratoires Serono SA DNA constructs for endogenous gene activation and expression modification
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5672510A (en) 1990-01-19 1997-09-30 Genetic Therapy, Inc. Retroviral vectors
EP1403285A1 (en) 1990-07-06 2004-03-31 Gencell S.A. Fibroblast growth factor receptors
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5217889A (en) 1990-10-19 1993-06-08 Roninson Igor B Methods and applications for efficient genetic suppressor elements
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5229501A (en) * 1991-01-11 1993-07-20 Chiron Corporation Expression and use of human fibroblast growth factor receptor
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
IL100219A0 (en) 1991-12-02 1992-09-06 Yeda Res & Dev Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
US5234784A (en) 1992-04-01 1993-08-10 Eastman Kodak Company Method of making a projection viewable transparency comprising an electrostatographic toner image
US5364791A (en) 1992-05-14 1994-11-15 Elisabetta Vegeto Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations
CA2136439A1 (en) * 1992-06-18 1994-01-06 Michael Philip Nova Process for detection of neoplastic disease
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US5489743A (en) 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
WO1994026122A1 (en) 1993-05-07 1994-11-24 Sterling Winthrop Inc. Lactose-hydrolyzed milk and milk products with improved taste and suppressed sweetness
JPH08509870A (ja) 1993-05-26 1996-10-22 オンタリオ キャンサー インスティテュート 特定のｃｄ４５イソ型タンパク質の発現を遮断するトランスジェニック哺乳動物
US6664107B1 (en) 1993-05-26 2003-12-16 Ontario Cancer Institute, University Health Network CD45 disrupted nucleic acid
DE705334T1 (de) 1993-06-14 1999-12-30 Basf Ag Strenge kontrolle der genexpression in eukaryotischen zellen durch auf tetrazyklin ansprechende promotoren
US5589362A (en) 1993-06-14 1996-12-31 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities
US5654168A (en) 1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units
EP1179350A3 (en) 1993-08-12 2003-01-02 Cytotherapeutics, Inc. Encapsulated cell system for implantation into the human CNS
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JPH11506319A (ja) 1995-05-26 1999-06-08 ゼネカ・リミテッド エクジソンレセプターを含む遺伝子スイッチ
EP0832269A1 (en) 1995-06-07 1998-04-01 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
WO1996041865A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamcycin-based regulation of biological events
US5849303A (en) 1995-06-07 1998-12-15 American Home Products Corporation Recombinant feline Immunodeficiency virus subunit vaccines employing baculoviral-expressed envelope glycoproteins derived from isolate NCSU-1 and their use against feline immunodeficiency virus infection
ATE465149T1 (de) 1996-02-28 2010-05-15 Ariad Pharma Inc Synthetische rapamycinderivate als multimerisierende wirkstoffe für chimere proteine mit von immunophilin abgeleiteten domänen
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5679559A (en) 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
US6214795B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-10 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity
CN1167795C (zh) 1996-12-26 2004-09-22 协和发酵工业株式会社 肽、dna及抗体
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
DE69839571D1 (de) 1997-11-25 2008-07-10 Genentech Inc Fibroblasten-wachstumsfaktor-19
US6150098A (en) 1998-02-20 2000-11-21 Amgen Inc. Methods for identifying novel secreted mammalian polypeptides
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
NL1010174C1 (nl) 1998-09-24 2000-03-27 Busschers Metaalbedrijf Bv Inrichting en werkwijze voor het buigen van buisvormig en staafvormig materiaal.
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6369109B1 (en) 1998-10-28 2002-04-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Betulinic acid and derivatives thereof useful for the treatment of neuroectodermal tumor
WO2000027885A1 (fr) 1998-11-05 2000-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau popypeptide chimerique
US6656728B1 (en) 1999-02-08 2003-12-02 Chiron Corporation Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion
JP2002539176A (ja) 1999-03-15 2002-11-19 カイロン コーポレイション 眼の疾患を処置または予防するための組換え遺伝子送達ベクターの使用
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US7459540B1 (en) * 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
AU7368100A (en) 1999-09-10 2001-04-10 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
WO2001032678A1 (en) 1999-11-05 2001-05-10 Smithkline Beecham Corporation sbgFGF-19a
US6254671B1 (en) 1999-11-15 2001-07-03 Engelhard Corporation Very green-shade yellow metallized disazo pigment
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
AU1922101A (en) 1999-11-18 2001-05-30 Chiron Corporation Human fgf-21 gene and gene expression products
AU1628101A (en) * 1999-11-22 2001-06-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor
US7108984B2 (en) 2000-01-12 2006-09-19 Mount Sinai School Of Medicine Methods of identifying modulators of the FGF receptor
US20020081663A1 (en) 2000-01-05 2002-06-27 Conklin Darrell C. Novel FGF homolog ZFGF11
WO2001049849A1 (en) 2000-01-05 2001-07-12 Zymogenetics, Inc. Novel fgf homolog zfgf11
US20020001825A1 (en) 2000-03-31 2002-01-03 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
JP2002112772A (ja) 2000-07-10 2002-04-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20040018499A1 (en) 2001-06-06 2004-01-29 Lal Preeti G Extracellular messengers
JP2005500034A (ja) 2001-06-20 2005-01-06 プロション バイオテク リミテッド 受容体型タンパク質チロシンキナーゼ活性化を遮断する抗体、そのスクリーニング方法、及びその使用
MXPA04000231A (es) 2001-07-11 2004-05-04 Maxygen Holdings Ltd Conjugados del factor de estimulacion de colonias de granulocitos.
US20040259780A1 (en) 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
US20050187150A1 (en) 2001-10-31 2005-08-25 New York University Structure-based design and synthesis of FGF inhibitors and FGF modulator compounds
AU2003201810A1 (en) 2002-01-15 2003-07-30 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
CN100531796C (zh) 2002-01-31 2009-08-26 马普科技促进协会 Fgfr激动剂
EP1332761A1 (en) 2002-01-31 2003-08-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonists of fibroblast growth factor receptors (FGFR)
IL149562A0 (en) 2002-05-09 2002-11-10 Prochon Ltd Fgf variants and methods for use thereof
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
AU2003265057A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Abtech Anti-idiotypic antibodies as vegf or fgf agonists for bone therapy
JP2006515747A (ja) 2002-11-01 2006-06-08 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
JP2007524566A (ja) 2002-12-20 2007-08-30 エンカム ファーマシューティカルズ アクティーゼルスカブ レセプターとリガンドの間の相互作用の調節の方法
TWI300430B (en) 2003-01-10 2008-09-01 Ritek Corp Optical recording medium dye and optical recording medium using thereof
WO2004083381A2 (en) 2003-03-13 2004-09-30 Indiana University Advanced Research & Technology Institute Fibroblast growth factor receptor-1 polynucleotides, polypeptides, and mutants
JP2006240990A (ja) 2003-05-15 2006-09-14 Kirin Brewery Co Ltd ｋｌｏｔｈｏタンパク質および抗ｋｌｏｔｈｏタンパク質抗体ならびにそれらの用途
AU2004251145C1 (en) 2003-06-12 2011-04-14 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion proteins
SI1641483T1 (sl) 2003-06-12 2008-08-31 Lilly Co Eli Fuzijski proteini
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP4049723B2 (ja) 2003-09-04 2008-02-20 沖電気工業株式会社 窒化物半導体素子の製造方法及び窒化物半導体素子の製造装置
PT1680140E (pt) 2003-10-16 2011-05-31 Imclone Llc Inibidores do receptor-1 do factor de crescimento de fibroblastos e m?todos de tratamento destes
JP4477013B2 (ja) 2003-12-10 2010-06-09 イーライ リリー アンド カンパニー 線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質
US20070248605A1 (en) 2003-12-19 2007-10-25 Five Prime Therapetutics, Inc. Fibroblast Growth Factor Receptors 1,2,3, and 4 as Targets for Therapeutic Intervention
WO2005072769A1 (en) 2004-01-26 2005-08-11 Eli Lilly And Company Use of fgf-21 and thiazolidinedione for treating type 2 diabetes
WO2005091944A2 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
JP4505631B2 (ja) 2004-03-31 2010-07-21 独立行政法人産業技術総合研究所 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物
DE602005016917D1 (de) 2004-05-13 2009-11-12 Lilly Co Eli Fgf-21-fusionsproteine
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
PT1789442E (pt) 2004-09-02 2009-11-11 Lilly Co Eli Muteínas do factor de crescimento de fibroblasto 21
US8080523B2 (en) 2004-10-07 2011-12-20 The Regents Of The University Of California Analogs of ShK toxin and their uses in selective inhibition of Kv1.3 potassium channels
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US7655627B2 (en) 2004-12-14 2010-02-02 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006078463A2 (en) 2005-01-21 2006-07-27 Eli Lilly And Company Method for treating cardiovascular disease
US20060193299A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Cicso Technology, Inc., A California Corporation Location-based enhancements for wireless intrusion detection
JP2006246823A (ja) 2005-03-11 2006-09-21 Kyoto Univ 造血因子としてのＦｇｆ２１の使用
WO2006130527A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Novartis Ag Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1
NZ565511A (en) 2005-07-22 2011-03-31 Five Prime Therapeutics Inc Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
ZA200800970B (en) 2005-08-15 2009-10-28 Genentech Inc Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US7395962B2 (en) 2005-10-28 2008-07-08 United Parcel Service Of America, Inc. Pick up notice and method of using same
US8043833B2 (en) 2005-10-31 2011-10-25 Novo Nordisk A/S Expression of soluble therapeutic proteins
WO2007056789A1 (en) 2005-11-16 2007-05-24 Dier Corporation As Trustee For The Reid Family Superannuation Trust New frame assemblies for security screens
EP1996216A2 (en) 2006-02-28 2008-12-03 Trustees Of Boston University Methods to identify factors associated with muscle growth and uses thereof
WO2007110079A2 (en) * 2006-03-29 2007-10-04 Enkam Pharmaceuticals A/S Targeted delivery of fgfr ligands into the brain
EP2046384A4 (en) 2006-06-15 2009-12-02 Fibron Ltd ANTIBODIES BLOCKING FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR ACTIVATION AND METHODS OF USING THE SAME
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
WO2008066498A1 (en) 2006-12-01 2008-06-05 Agency For Science, Technology And Research Cancer-related protein kinases
KR20140012199A (ko) 2007-03-30 2014-01-29 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
CA2682096A1 (en) 2007-04-02 2009-01-15 Genentech, Inc. Klotho beta
JP5187837B2 (ja) 2007-04-06 2013-04-24 独立行政法人産業技術総合研究所 補助因子による受容体の活性化方法並びにリガンド活性の利用方法
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
WO2008135993A1 (en) 2007-05-08 2008-11-13 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Klotho protein and related compounds for the treatment and diagnosis of cancer
KR20100017169A (ko) 2007-05-22 2010-02-16 노파르티스 아게 Ｆｇｆ２１-관련 장애의 치료, 진단 및 검출 방법
WO2008149521A1 (ja) 2007-05-29 2008-12-11 Immuno-Biological Labolatories Co., Ltd 癌治療剤及び癌の治療方法
JP2010531135A (ja) 2007-06-04 2010-09-24 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを使用したｏ結合型グリコシル化
EP2185178B1 (en) 2007-08-03 2017-08-23 Eli Lilly And Company Use of an fgf-21 compound and a glp-1 compound for the treatment of obesity
GB2464062A (en) 2007-08-08 2010-04-07 Foster Miller Inc Watercraft drogue system
US8426396B2 (en) 2008-01-08 2013-04-23 Shriners Hospitals For Children Treatment for achondroplasia
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
US20110015345A1 (en) 2008-03-19 2011-01-20 Ambrx, Inc. Modified FGF-23 Polypeptides and Their Uses
JOP20190083A1 (ar) * 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
CA2732449A1 (en) 2008-08-04 2010-02-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Fgfr extracellular domain acidic region muteins
EP2358749B1 (en) * 2008-10-10 2018-07-18 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
AU2010246038A1 (en) * 2009-05-05 2011-12-01 Amgen Inc. FGF21 mutants and uses thereof
DK3248610T3 (da) 2009-05-05 2024-01-15 Amgen Inc Fgf21-mutanter og anvendelser deraf
EP2443145A1 (en) 2009-06-17 2012-04-25 Amgen, Inc Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof
CN102656266B (zh) 2009-10-15 2016-08-03 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改变的受体特异性的嵌合成纤维细胞生长因子
AU2010326024A1 (en) 2009-12-02 2012-07-05 Amgen Inc. Binding proteins that bind to human FGFR1c, human beta-Klotho and both human FGFR1c and human beta-Klotho
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
EP2558497A2 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins
US9023791B2 (en) 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
KR102077721B1 (ko) 2011-07-01 2020-02-14 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
AU2012301769B2 (en) * 2011-08-31 2016-05-19 Amgen Inc. FGF21 for use in treating type 1 diabetes
CN108888757A (zh) 2012-12-27 2018-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20120003216A1 (en) 2012-01-05
CA2726589A1 (en) 2009-12-10
BRPI0911385B1 (pt) 2021-04-13
EA201270758A1 (ru) 2013-12-30
EA034847B1 (ru) 2020-03-27
JP7191076B2 (ja) 2022-12-16
KR101651697B1 (ko) 2016-08-29
EA201690946A1 (ru) 2017-05-31
US9273106B2 (en) 2016-03-01
JP2018082699A (ja) 2018-05-31
US20120087920A1 (en) 2012-04-12
KR20110025810A (ko) 2011-03-11
US20160168223A1 (en) 2016-06-16
PE20100253A1 (es) 2010-04-10
EA017690B1 (ru) 2013-02-28
AR072009A1 (es) 2010-07-28
JP2016128449A (ja) 2016-07-14
JP2019187417A (ja) 2019-10-31
EA024751B1 (ru) 2016-10-31
CL2010001346A1 (es) 2011-06-03
TW201219052A (en) 2012-05-16
US20240076333A1 (en) 2024-03-07
WO2009149171A2 (en) 2009-12-10
US8410051B2 (en) 2013-04-02
EA201001883A1 (ru) 2011-06-30
EP2296690A2 (en) 2011-03-23
EP2296690B1 (en) 2016-11-30
WO2009149171A4 (en) 2010-05-06
US11072640B2 (en) 2021-07-27
BRPI0911385B8 (pt) 2021-09-14
US8034770B2 (en) 2011-10-11
JP2021052780A (ja) 2021-04-08
JOP20190083A1 (ar) 2017-06-16
US20210317176A1 (en) 2021-10-14
CN102143758A (zh) 2011-08-03
KR20160046929A (ko) 2016-04-29
US11840558B2 (en) 2023-12-12
JP2011523561A (ja) 2011-08-18
CN102143758B (zh) 2015-11-25
US20120093815A1 (en) 2012-04-19
SG193860A1 (en) 2013-10-30
US8642546B2 (en) 2014-02-04
TWI403519B (zh) 2013-08-01
IL209395A0 (en) 2011-01-31
JP6960832B2 (ja) 2021-11-05
WO2009149171A3 (en) 2010-03-11
MX346396B (es) 2017-03-16
KR101787300B1 (ko) 2017-10-18
US8361963B2 (en) 2013-01-29
CO6341566A2 (es) 2011-11-21
US20140243503A1 (en) 2014-08-28
EA024751B8 (ru) 2020-01-31
AU2009256232B2 (en) 2011-12-22
US20090305986A1 (en) 2009-12-10
AU2009256232A1 (en) 2009-12-10
MX2010013333A (es) 2011-04-05
US20190023757A1 (en) 2019-01-24
CA2726589C (en) 2017-06-13
CR11851A (es) 2011-05-13
NZ590050A (en) 2012-08-31
IL209395A (en) 2014-08-31
TWI526220B (zh) 2016-03-21
JP6810190B2 (ja) 2021-01-06
MY152721A (en) 2014-11-28
JP6250714B2 (ja) 2017-12-20
TW201010715A (en) 2010-03-16
US10011642B2 (en) 2018-07-03
BRPI0911385A2 (pt) 2019-03-26
MA33142B1 (fr) 2012-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7191076B2 (ja) Ｆｇｆ２１突然変異体及びその使用
US8835385B2 (en) FGF21 polypeptides comprising two or more mutations and uses thereof
AU2014202582A1 (en) FGF21 mutants and uses thereof
AU2014201837B2 (en) FGF21 mutants and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B11A Dismissal acc. art.33 of ipl - examination not requested within 36 months of filing
B04C Request for examination: application reinstated [chapter 4.3 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 03/06/2009, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF