EA024751B1 - Мутанты fgf21 и их применение - Google Patents
Мутанты fgf21 и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA024751B1 EA024751B1 EA201270758A EA201270758A EA024751B1 EA 024751 B1 EA024751 B1 EA 024751B1 EA 201270758 A EA201270758 A EA 201270758A EA 201270758 A EA201270758 A EA 201270758A EA 024751 B1 EA024751 B1 EA 024751B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- pcp21
- residue
- amino acid
- pop21
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 102000003973 Fibroblast growth factor 21 Human genes 0.000 title abstract 4
- 108090000376 Fibroblast growth factor 21 Proteins 0.000 title abstract 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 309
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 300
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 295
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 79
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 27
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 119
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 119
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 116
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 106
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 106
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 80
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 63
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 60
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 claims description 51
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 51
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 47
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 45
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 44
- 239000004220 glutamic acid Chemical group 0.000 claims description 44
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 claims description 42
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 42
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 40
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 37
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 36
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 30
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 30
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 claims description 27
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 27
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 26
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 24
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical group OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 23
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Chemical group OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Chemical group SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 21
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 21
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 20
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 20
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Chemical group CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000004473 Threonine Chemical group 0.000 claims description 20
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 20
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 20
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 18
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 18
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 18
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 17
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 17
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Chemical group OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 17
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 16
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 15
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Chemical group CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 15
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 15
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 15
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 14
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 14
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical group OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 13
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 13
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 13
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 13
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 13
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 13
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 13
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 13
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 claims description 12
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 11
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 8
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 7
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 7
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical group C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Chemical group C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 claims description 5
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 2
- 101100534241 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SRP21 gene Proteins 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 207
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 202
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 201
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 124
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 113
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 65
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 63
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 63
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 61
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 60
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 60
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 58
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 58
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 42
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 41
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 38
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 38
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 38
- 230000008859 change Effects 0.000 description 37
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 36
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 30
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 29
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 29
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 29
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 28
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 27
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 25
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 24
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 24
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 102220527732 Coagulation factor VIII_E98K_mutation Human genes 0.000 description 20
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 20
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 17
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 17
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 17
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 17
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 14
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 11
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 11
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 11
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 9
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 8
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 8
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000010030 glucose lowering effect Effects 0.000 description 6
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 6
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102220479096 CD59 glycoprotein_L58E_mutation Human genes 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 4
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 4
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 4
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 3
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102220480988 Nicotinate phosphoribosyltransferase_L52T_mutation Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 3
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NULDEVQACXJZLL-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethyldisulfanyl)ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCSSCCN NULDEVQACXJZLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 2
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 102220561011 Forkhead box protein C1_L86K_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101000741271 Sorghum bicolor Phosphoenolpyruvate carboxylase 1 Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220621573 Vacuolar-sorting protein SNF8_L99K_mutation Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 2
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019577 caloric intake Nutrition 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004900 laundering Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007410 oral glucose tolerance test Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 231100000272 reduced body weight Toxicity 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 102200105133 rs28929768 Human genes 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-5-ethoxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound CCOC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000027 (C1-C10) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N (R)-3-hydroxybutyric acid Chemical compound C[C@@H](O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000486679 Antitype Species 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 101100004028 Avena sativa P60A gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100310222 Caenorhabditis briggsae she-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100041757 Caenorhabditis elegans sbds-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000402754 Erythranthe moschata Species 0.000 description 1
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHAUZYVSXAMYAZ-JYJNAYRXSA-N Gln-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N SHAUZYVSXAMYAZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000587820 Homo sapiens Selenide, water dikinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000701815 Homo sapiens Spermidine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000023486 Lissencephaly due to TUBA1A mutation Diseases 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000006416 Notata Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- PDUVELWDJZOUEI-IHRRRGAJSA-N Phe-Cys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PDUVELWDJZOUEI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108010063843 Phencyclidine Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101100271190 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) ATAT gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000219492 Quercus Species 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000220221 Rosales Species 0.000 description 1
- 241001318750 Sagda Species 0.000 description 1
- 102100031163 Selenide, water dikinase 1 Human genes 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102220536504 THAP domain-containing protein 1_P78A_mutation Human genes 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical group 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001508 alkali metal halide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008045 alkali metal halides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002072 anti-mutant effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004365 benzoic acid Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011325 biochemical measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 101150089467 dddP gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229960002163 hydrogen peroxide Drugs 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 208000033066 hyperinsulinemic hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000004989 laser desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000021190 leftovers Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000001225 nuclear magnetic resonance method Methods 0.000 description 1
- 238000001216 nucleic acid method Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940067107 phenylethyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000000291 postprandial effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 102200153928 rs148262378 Human genes 0.000 description 1
- 102200139430 rs28940315 Human genes 0.000 description 1
- 102200067724 rs369125667 Human genes 0.000 description 1
- 102200004925 rs56136737 Human genes 0.000 description 1
- 102220214864 rs779995504 Human genes 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L sodium dithionite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])=O JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- ALNUHUMOGUVHIO-XXJNWDAFSA-M sodium;7-[(1r,2s)-2-hexyl-5-hydroxycyclopentyl]heptanoate Chemical compound [Na+].CCCCCC[C@H]1CCC(O)[C@@H]1CCCCCCC([O-])=O ALNUHUMOGUVHIO-XXJNWDAFSA-M 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000036259 susceptibility to 4 autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 239000012443 tonicity enhancing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N trappsol cyclo Chemical compound CC(O)COC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)COCC(O)C)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 229950002929 trinitrophenol Drugs 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N tyloxapol Chemical compound O=C.C1CO1.CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004224 tyloxapol Drugs 0.000 description 1
- 229920001664 tyloxapol Polymers 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229920003176 water-insoluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
- C07K14/05—Epstein-Barr virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
Abstract
Изобретение предлагает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие мутантные полипептиды FGF21, мутантные полипептиды FGF21, как таковые, фармацевтические композиции, включающие мутантные полипептиды FGF21, и способы лечения метаболических заболеваний с применением таких нуклеиновых кислот, полипептидов или фармацевтических композиций.
Description
Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим мутантные полипептиды РСР21, к мутантным полипептидам РСР21, к фармацевтическим композициям, содержащим мутантные полипептиды РСР21, и к способам лечения метаболических заболеваний с применением таких нуклеиновых кислот, полипептидов или фармацевтических композиций.
Предпосылки создания изобретения
РСР21 представляет собой секретируемый полипептид, принадлежащий к подсемейству факторов роста фибробластов (РСР), которые включают РСР19, РСР21 и РСР23 (Кой с1 а1., 2004, Тгепб Сспс1. 20: 563-69). Полипептид РСР21 является атипичным РСР в том отношении, что он независим от гепарина и функционирует как гормон в регуляции глюкозы, липидов и энергетического метаболизма.
РСР21 был выделен из библиотеки кДНК печени как секретируемый печеночный фактор. Он высоко экспрессируется в печени и поджелудочной железе, являясь единственным членом семейства РСР, экспрессируемым, главным образом, в печени. Трансгенные мыши с избыточной экспрессией РСР21 демонстрируют метаболические фенотипы замедленных темпов роста, низкого уровня глюкозы и триглицеридов в плазме, а также отсутствие связанного с возрастом сахарного диабета 2 типа, гиперплазии островковых клеток поджелудочной железы и ожирения. Фармакологическое введение рекомбинантного белка РСР21 в моделях грызунов и приматов приводит к нормализации уровня глюкозы в плазме, к снижению уровня триглицеридов и холестерина, а также к улучшению толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину. В дополнение к этому, РСР21 снижает вес тела и отложения телесного жира за счет увеличения потребления энергии, физической активности и скорости метаболизма. Экспериментальные исследования дают подтверждение фармакологическому введению РСР21 для лечения сахарного диабета 2 типа, ожирения, дислипидемии и других метаболических состояний или заболеваний у человека.
РСР21 человека имеет короткий период полувыведения ίη νίνο. У мышей период полувыведения РСР21 человека составляет от 1 до 2 ч, а у обезьян супото1ди8 период полувыведения составляет от 2,5 до 3 ч. При разработке белкового препарата РСР21 для применения в качестве лекарства при лечении сахарного диабета 2 типа было бы желательно увеличить период полувыведения. Белки РСР21, имеющие удлиненный период полувыведения, позволили бы реже вводить дозы лекарства больным, получающим такие препараты. Описание таких белков приводится в настоящем документе.
Сущность изобретения
Настоящее раскрытие сущности изобретения относится к выделенному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0:4, кроме того, включающему аминокислотную замену, выбранную из остатка аланина в положении 45, остатка лейцина в положении 86, остатка лейцина в положении 98, остатка аланина в положении 111, остатка аланина в положении 129, остатка глицина в положении 170, остатка пролина в положении 171, остатка серина в положении 172 или их комбинаций. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенный полипептид включает аминокислотную замену остатка лейцина в положении 98, остатка пролина в положении 171 или как остатка лейцина в положении 98, так и остатка пролина в положении 171. В другом варианте осуществления изобретения выделенный полипептид включает аминокислотную замену как остатка лейцина в положении 98, так и остатка пролина в положении 171.
Настоящее раскрытие изобретения также представляет выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 4, имеющую: (а) как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (ί) остаток глутамина, изолейцина или лизина в положении 19, (ίί) остаток гистидина, лейцина или фениланина в положении 20, (ίίί) остаток изолейцина, фениланина, тирозина или валина в положении 21, (ίν) остаток изолейцина, фенилаланина или валина в положении 22, (ν) остаток аланина или аргинина в положении 150, (νί) остаток аланина или валина в положении 151, (νίί) остаток гистидина, лейцина, фениланина или валина в положении 152, (νίίί) остаток аланина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, пролина или серина в положении 170, (ίχ) остаток аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина в положении 171, (х) остаток лейцина или треонина в положении 172, (χί) остаток аргинина или глутаминовой кислоты в положении 173, или (Ь) как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (ί) остаток аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 26, (ίί) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 45, (ίίί) остаток треонина в положении 52, (ίν) остаток цистеина, глутаминовой кислоты, глицина или серина в положении 58, (ν) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 60, (νί) остаток аланина, аргинина, цистеина или гистидина в положении 78, (νίί) остаток цистеина или треонина в положении 86, (νίίί) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты, лизина или серина в положении 88, (ίχ) остаток аргинина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 98, (х) остаток аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина или глутаминовой кислоты в положении 99, (χί) остаток лизина или треонина в положении 111, (χίί) остаток аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина или лизина в положении 129 или (χίίί) остаток аргинина, глутаминовой
- 1 024751 кислоты, гистидина, лизина или тирозина в положении 134, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотный остаток в положении 98 представлен аргинином, а аминокислотный остаток в положении 171 представлен пролином, а в другом варианте осуществления изобретения полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности §ЕЦ ГО N0: 4, но в которой как минимум одна аминокислотная замена из (а)(1)-(х1) и φ)(ί)-(χίίί) далее не модифицируется.
Настоящее раскрытие изобретения далее представляет выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 4, имеющую как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (а) остаток глутамина, лизина или изолейцина в положении 19, (Ь) остаток гистидина, лейцина или фенилаланина в положении 20, (с) остаток изолейцина, фенилаланина, тирозина или валина в положении 21, (б) остаток изолейцина, фенилаланина или валина в положении 22, (е) остаток аланина или аргинина в положении 150, (ί) остаток аланина или валина в положении 151; (д) остаток гистидина, лейцина, фенилаланина или валина в положении 152, (Ь) остаток аланина, аспарагиновой кислоты или пролина в положении 170, (ί) остаток аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина в положении 171, (]) остаток лейцина в положении 172, или (к) остаток аргинина или глутаминовой кислоты в положении 173 или их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотный остаток в положении 171 представлен пролином, а в другом варианте осуществления изобретения полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности §ЕЦ ГО N0: 4, но в которой как минимум одна аминокислотная замена из (а)-(к) далее не модифицируется.
Настоящее раскрытие изобретения дополнительно представляет выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 4, имеющую как минимум одну аминокислотную замену, которое представляет собой: (а) остаток аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 26, (Ь) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 45, (с) остаток треонина в положении 52, (б) остаток глутаминовой кислоты, глицина или серина в положении 58, (е) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 60, (ί) остаток аланина, аргинина или гистидина в положении 78, (д) остаток аланина в положении 88, (Ь) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 98, (ί) остаток аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина или глутаминовой кислоты в положении 99, (]) остаток лизина или треонина в положении 111, (к) остаток аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина или лизина в положении 129 или (1) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, гистидина, лизина или тирозина в положении 134, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотный остаток в положении 98 представлен аргинином, а в другом варианте осуществления изобретения полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности §ЕЦ ГО N0: 4, но в которой как минимум одна аминокислотная замена из (а)-(1) далее не модифицируется.
В различных вариантах осуществления изобретения полипептиды, раскрытые в данном документе, могут дополнительно включать как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (а) фенилаланин, пролин, аланин, серин или глицин в положении 179, (Ь) глутаминовую кислоту, глицин, пролин или серин в положении 180 или (с) лизин, глицин, треонин, аланин, лейцин или пролин в положении 181, а также могут дополнительно включать от 1 до 10 аминокислотных остатков слитых с Сконцом полипептида, которые могут быть представлены любой аминокислотой, например одним или более остатков, выбранных из группы, состоящей из глицина, пролина и их комбинаций.
В различных вариантах осуществления изобретения полипептиды, раскрытые в данном документе, могут включать (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (Ь) карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды, раскрытые в данном документе, могут быть ковалентно связаны с одним или более полимеров, таких как РЕО. В других вариантах осуществления изобретения полипептиды по настоящему изобретению могут быть слиты с гетерологичной аминокислотной последовательностью, в необязательном порядке, через линкер, такой как ООООО8ООО8ОООО8 (8ЕЦ ГО N0: 23). Гетерологичная аминокислотная последовательность может представлять собой константный домен 1дО или его фрагмент, такой как аминокислотная последовательность §ЕЦ ГО N0: 13. Такие гибридные полипептиды, раскрытые в данном документе, также могут образовывать мультимеры.
Настоящее раскрытие изобретения также представляет фармацевтическую композицию, включающую полипептиды, раскрытые в данном документе, и фармацевтически приемлемый формообразующий агент. Такие фармацевтические композиции можно применять в способе лечения метаболического забо- 2 024751 левания, а указанный способ включает введение больному человеку, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, соответствующей настоящему изобретению. Метаболические заболевания, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают сахарный диабет и ожирение.
Также предлагаются выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды, раскрытые в данном документе, а также предлагаются векторы, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот.
Также раскрыты усеченные формы полипептида 8ЕЦ ГО N0: 4. В различных вариантах осуществления изобретения полипептид может включать: (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (Ь) карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего.
Настоящее раскрытие изобретения дополнительно предлагает выделенный гибридный белок, который может включать: (а) константный домен 1дС. (Ь) линкерную последовательность, слитую с константным доменом Ι§0, и (с) мутант Р0Р21, слитый с линкерной последовательностью и включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 4, в которой остаток аргинина был замещен остатком лейцина в положении 98, а остаток глицина был замещен остатком пролина в положении 171. В одном из вариантов осуществления изобретения линкерная последовательность может включать 000008000800008 (8ЕЦ ΙΌ N0: 23), а в другом варианте осуществления изобретения константный домен Ι§0 может включать 8ЕЦ ГО N0: 13. Еще в одном варианте осуществления изобретения линкерная последовательность включает 000008000800008 (8ЕЦ ГО N0: 23), а константный домен 1д0 включает аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 13. Еще в одном варианте осуществления изобретения Шконец линкера слит с С-концом константного домена 1д0, а Шконец мутанта Р0Р21 слит с Сконцом линкера. Раскрытый гибридный белок может образовывать мультимеры.
В различных вариантах осуществления гибридного белка мутантный компонент Р0Р21 может включать как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой: (а) фенилаланин, пролин, аланин, серин или глицин в положении 179, (Ь) глутаминовую кислоту, глицин, пролин или серин в положении 180 или (с) лизин, глицин, треонин, аланин, лейцин или пролин в положении 181, а также может дополнительно включать от 1 до 10 аминокислотных остатков, слитых с С-концом мутанта Р0Р21, и от 1 до 10 аминокислотных остатков, которые могут быть представлены любой аминокислотой, например одним или более остатков, выбранных из группы, состоящей из глицина, пролина и их комбинаций.
В других вариантах осуществления изобретения гибридного белка мутантный компонент Р0Р21 может включать: (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (Ь) карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего. Еще в одном варианте осуществления мутантный компонент Р0Р21 гибридного белка может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4, но в которой остатки аргинина и лизина далее не модифицируются.
Настоящее раскрытие изобретения также представляет фармацевтическую композицию, включающую гибридный белок, раскрытый в данном документе, и фармацевтически приемлемый формообразующий агент. Такие фармацевтические композиции можно применять в способе лечения метаболического заболевания, а указанный способ включает введение больному человеку, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, соответствующей настоящему изобретению. Метаболические заболевания, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают сахарный диабет и ожирение.
Также предлагаются выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гибридный белок, раскрытый в данном документе, а также предлагаются векторы, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот.
Специфические варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны из последующего более подробного описания некоторых вариантов осуществления изобретения и из формулы изобретения.
- 3 024751
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А, 1В показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на усеченных мутантах РОР21 7-181 и 8-181 (фиг. 1А) и усеченных мутантах РОР21 1-172, 1-171, 1-169 и 1-164 (фиг. 1В); каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах РОР21 человека.
На фиг. 2 показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на контрольных образцах РОР21 человека и на усеченных мутантах РОР21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8- 181, 1-180, 1178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 и 1-149.
На фиг. 3 показаны значения уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец), контрольный РОР21 человека (пустой столбец) или усеченные мутанты РОР21 8-181 (серый столбец) и 9-181 (столбец с шахматными клетками).
На фиг. 4 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки), контрольный Ре-РОР21 дикого типа (^Т) (пустые кружки) или усеченные гибридные белки Ре-РОР21, включающие аминокислотные остатки 5-181 (закрашенные треугольники) или 7-181 (пустые треугольники).
На фиг. 5 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки), контрольный РОР21-Ре (^Т) (пустые кружки), усеченный гибридный белок РОР21-РС, включающий аминокислотные остатки 1-175 (закрашенные треугольники) или усеченный белок Ре-РОР21, включающий остатки 1-171 (пустые треугольники).
На фиг. 6Α-6Ό показаны результаты анализа контрольного образца Ре(5)РОР21 человека (фиг. 6А) и образцов Ре(5)РОР21, полученных от мышей через 6 ч (образец Ό6, фиг. 6В), 24 ч (образец Ό24, фиг. 6С) и 48 ч (образец Ό48, фиг. 6Ό) после инъекции с применением комбинированного способа жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЬС-М8).
На фиг. 7Α-7Ό показаны результаты анализа контрольного образца РОР21(3)Раее человека (фиг. 7А) и образцов РОР21(3)Раее, полученных от мышей через 6 ч (образец Ό6, фиг. 7В), 24 ч (образец Ό24, фиг. 7С) и 48 ч (образец Ό48, фиг. 7Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 8А-8И показаны результаты анализа контрольного образца Раее(15)РОР21 (фиг. 8А) и образцов Раее(15)РОР21, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 8В), 24 ч (фиг. 8С) и 48 ч (фиг. 8Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 9А-9И показаны результаты анализа контрольного образца РОР21(15)Раее (фиг. 9А) и образцов РОР21(15)Раее, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 9В), 24 ч (фиг. 9С) и 48 ч (фиг. 9Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 10А, 10В показаны сайты расщепления, идентифицированные анализом ЬС-М8 гибридных белков Раее(15)РОР21 (фиг. 10А, 8ЕЦ ГО N0:24) и РОР21(15)Раее (фиг. 10В, 8ЕЦ ГО N0:25), введенных мышам путем инъекции.
На фиг. 11 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец), Раее(15)Р0Р21 (пустой столбец) или такие мутанты Раее(15)Р0Р21 как Раее(15)Р0Р21 О 170Е (серый столбец), Раее(15)Р0Р21 Р171А (столбец с шахматными клетками), Раее(15)РОР21 8172Ь (пустой столбец с диагональными полосками), Раее(15)РОР21 О170Е/Р171А/8172Ь (закрашенный столбец с горизонтальными полосками) или Раее(15)РОР21 О151А (пустой столбец с диагональными полосками).
На фиг. 12 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки), Раее(15)РОР21 (пустые кружки) или такие мутанты Раее(15)РОР21 как Раее(15)РОР21 О170Е (закрашенные треугольники), Раее(15)РОР21 Р171А (пустые треугольники), Раее(15)РОР21 8172Ь (закрашенные ромбы), Раее(15)РОР21 О170Е/Р171А/8172Ь (пустые ромбы) или Раее(15)РОР21 О151А (закрашенные квадраты).
На фиг. 13 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец), Ре(15)РОР21 (пустой столбец) или такие мутанты Ре(15)РОР21 как Ре(15)РОР21 Р150А/О151А/1152У (серый столбец), Ре(15)РОР21 О170Е (пустой столбец с диагональными полосками), Ре(15)РОР21 О170Е/Р171А (серый столбец с диагональными полосками) или Ре(15)РОР21 О170Е/8172Ь (пустой столбец с диагональными полосками).
На фиг. 14 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные квадраты), Ре(15)РОР21 (пустые квадраты) или такие мутанты Ре(15)РОР21 как Ре(15)РОР21 Р150А/О151А/1152У (закрашенные перевернутые треугольники), Ре(15)РОР21 О170Е (пустые перевернутые треугольники), Ре(15)РОР21 О170Е/Р171А (закрашенные кружки) или Ре(15)РОР21 О170Е/8172Ь (пустые кружки).
На фиг. 15 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец) или такие мутанты Ре(15)РОР21 как Ре(15)РОР21 О 170Е (пустой столбец), Ре(15)РОР21 О170А (серый столбец), Ре(15)РОР21 О170С (пустой столбец с диагональными полосками), Ре(15)РОР21 Ο170Ό (серо-белый столбец), Ре(15)РОР21 О 170Ν (закрашенный столбец с диагональными полосками) или Ре(15)РОР21 О 1708 (пустой столбец с диагональными полосками).
На фиг. 16 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у
- 4 024751 мышей, которым путем инъекции вводили ΡΒδ (закрашенные кружки) или такие мутанты Ре(15)РСР21 как Ре(15)РСР21 С170Е (пустые кружки), Ре(15)РСР21 С170Л (закрашенные треугольники),
Ре(15)РСР21 С170С (пустые треугольники), Ре(15)РСР21 Ο170Ό (закрашенные ромбы), Ре(15)РСР21 Ο170Ν (пустые ромбы) или Ре(15)РСР21 Ο170δ (перевернутые пустые треугольники).
На фиг. 17 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили ΡΒδ (закрашенный столбец) или такие мутанты Ре(15)РСР21 как Ре(15)РСР21 С 170Е (пустой столбец), Ре(15)РСР21 Р171Е (серый столбец), Ре(15)РСР21 Ρ171Η (закрашенный столбец с диагональными полосками), Ре(15)РСР21 Р171Ц (пустой столбец с диагональными полосками), Ре(15)РСР21 Р171Т (столбец с шахматными клетками) или Ре(15)РСР21 Ρ171Υ (серый столбец с диагональными полосками).
На фиг. 18 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили ΡΒδ (закрашенные кружки) или такие мутанты Ре(15)РСР21 как Ре(15)РСР21 С170Е (пустые кружки), Ре(15)РСР21 Ρ171Ε (закрашенные треугольники), Ре(15)РСР21 Р171Н (пустые треугольники), Ре(15)РСР21 Ρ171Ο (закрашенные ромбы), Ре(15)РСР21 Ρ171Τ (пустые ромбы) или Ре(15)РСР21 Ρ171Υ (закрашенные квадраты).
На фиг. 19Ά-19Ό показаны результаты анализа контрольного образца РСР21(15)Ре (фиг. 19А) и образцов, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 19В), 24 ч (фиг. 19С) и 48 ч (фиг. 19Ό) после инъекции, способом ЬС-Μδ.
На фиг. 20Ά-20Ό показаны результаты анализа контрольного образца Ре(15)РСР21 С170Е (фиг. 20А) и образцов Ре(15)РСР21 С 170Е, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 20В), 24 ч (фиг. 20С) и 48 ч (фиг. 20Ό) после инъекции, способом ЬС-Μδ.
На фиг. 21Ά-21Ό показаны результаты анализа контрольного образца Ре(15)РСР21 Ρ171Α (фиг. 21А) и образцов Ре(15)РСР21 Ρ171Α, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 21В), 24 ч (фиг. 21С) и 48 ч (фиг. 21Ό) после инъекции, способом ЬС-Μδ.
На фиг. 22Ά-22Ό показаны результаты анализа контрольного образца Ре(15)РСР21 δ172Ρ (фиг. 22А) и образцов Ре(15)РСР21 δ172Ρ, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 22В), 24 ч (фиг. 22С) и 48 ч (фиг. 22Ό) после инъекции, способом ЬС-Μδ.
На фиг. 23А-23Н показаны сайты расщепления, идентифицированные анализом ЬС-Μδ гибридных белков Рс(15)РСР21 (фиг. 23 А, δΙΥ) ГО N0: 24), Ре(15)РСР21 С 170Е (фиг. 23Β, δΙΥ) ГО N0: 26), Рс(15)РСР21 Ρ171Α (фиг. 23С, δΙΥ) ГО N0: 27) и Ре(15)РСР21 δ172Ρ (фиг. 23Ό, δΙΥ) ГО N0: 28), введенных мышам путем инъекции.
На фиг. 24А-24С показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на таких мутантах РСР21, как РСР21 Ь99К, РСР21 Ь99О и РСР21 А111Т (фиг. 24А), на таких мутантах РСР21, как РСР21 Α129Ό, РСР21 А129Ц и РСР21 А134К (фиг. 24В) и на таких мутантах РСР21, как РСР21 Α134Υ, РСР21 А134Е и РСР21 А129К (фиг. 24С), при этом каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах РСР21 человека.
На фиг. 25Λ-25Ω показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на таких мутантах Рс-РСР21, как Ре-РСР21 Ρ171Υ Рс-РСР21 Ρ171δ и Рс-РСР21 Р171Т (фиг. 25А), на таких мутантах Рс-РСР21, как Рс-РСР21 Ρ171Υ, Рс-РСР21 Ρ171№ и Рс- РСР21 Р171С (фиг. 25В), на таких мутантах Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 А45К/С170Е и РСР21 А45К (фиг. 25С) и на таких мутантах Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 Р171Е и Рс(15)РСР21 А45К/С170Е (фиг. 25Ό), при этом каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах РСР21 человека.
На фиг. 26А, 26В показана агрегация, как функцию времени, для зрелого РСР21 дикого типа и для разных мутантов РСР21, фиг. 26А показывает процентное изменение агрегации для контрольного РСР21 (^Т, закрашенные ромбы) и РСР21 А45К (закрашенные кружки) после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 2 и 4 дней, тогда как фиг. 26В показывает процентное изменение агрегации для контрольного РСР21 (№Т) и вариантов РСР21 Р78С, Ρ78Κ, Ь86Т, Ь86К, Ь98С, Ь98К, А111Т, Α129Ό, А129Ц, А129К, А134К, Α134Υ и А134Е (все маркированы на графике) после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 6 и 10 дней.
На фиг. 27 показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на контрольном РСР21 человека и на таких мутантах РСР21, как РСР21 А45К, РСР21 Ь52Т и РСР21 Ь58Е.
На фиг. 28А представлен график, показывающий изменение уровня агрегации для таких мутантов Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 6-181/С170Е (закрашенные ромбы), Рс(15)РСР21 А45К/С170Е (пустые квадраты), Рс(15)РСР21 Ρ17№ (закрашенные треугольники), Рс(15)РСР21 Ρ171Α (крестики),
Рс(15)РСР21 С 170Е (пустые треугольники) и для контрольного РСР21 (закрашенные кружки) после инкубации при 4°С в течение 1, 4 и 8 дней, а фиг. 28В представляет собой гистограмму, также показывающую результаты инкубации.
На фиг. 29 показаны результаты измерения уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили ΡΒδ (носитель) (закрашенные кружки) или такие мутанты Рс(15)РСР21 как Рс(15)РСР21 А45К/С170Е (пустые кружки), Рс(15)РСР21 А45К/Ρ171С (закрашенные треугольники) или Рс(15)РСР21 Ρ98Κ/Ρ17^ (пустые треугольники).
На фиг. 30 представлен график, показывающий результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы,
- 5 024751 проведенного на Р0Р21 человека (закрашенные кружки, сплошная линия), на Ре-РСР21 (пустые кружки, сплошная линия) и на Ре-РСР21 Ь98Р/Р1710 (закрашенные треугольники, пунктирная линия).
На фиг. 31 представлен график, показывающий процентную величину агрегатов с высоким молекулярным весом, наблюдаемых после девяти дней выдерживания при комнатной температуре (фиг. 31А) и 4°С (фиг. 31В) для РСР21 (закрашенные кружки, сплошная линия), Ре-РСР21 (пустые кружки, сплошная линия) и Ре-РСР21 Ь98К/Р1710 (закрашенные треугольники, пунктирная линия).
На фиг. 32 представлена серия трасс ΜΆΡΌΙ при масс-спектрометрии, показывающую наблюдаемые изменения Рс-Р СР21 Ь98Р/Р1710 в различных точках на протяжении 168-часового промежутка времени.
На фиг. 33 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВ§ (пустые кружки), зрелого РСР21 дикого типа (закрашенные квадраты) и таких мутантов РСР21, как Ь98К, Р171С (перевернутые закрашенные треугольники), Ь98К, Р171С, 182Р (пустые ромбы) и Ь98К, Р171С, 1820 (закрашенные кружки).
На фиг. 34 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВ§ (закрашенные кружки) и таких мутантов Р0Р21, как Ь98К, Р1710 (закрашенные треугольники), Ь98К, Р1710, 1820, 1830 (пустые треугольники), Ь98К, Р1710, 1820 (закрашенные ромбы) и Ь98К, Р1710, 182Р (пустые ромбы).
На фиг. 35 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВ§ (пустые кружки) и таких мутантов Р0Р21, как Ь98К, Р1710 (закрашенные квадраты), Ь98К, Р1710, Υ1798 (пустые треугольники), Ь98К, Р1710, Υ179Α (перевернутые закрашенные треугольники), Ь98К, Р1710, 1808 (пустые ромбы) и Ь98К, Р1710, Α1800 (закрашенные кружки).
На фиг. 36 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВ§ (закрашенные кружки) и таких мутантов Р0Р21, как Ь98К, Р1710 (пустые квадраты), Ь98К, Р1710, Υ179Ρ (закрашенные треугольники) и Ь98К, Р1710, А180Е (пустые ромбы).
На фиг. 37 представлена диаграмма, отображающую схему шестинедельного исследования с повышением дозы, проведенного на обезьянах резус. На указанной диаграмме полутоновые символы обозначают взятия крови натощак, а фактурные символы обозначают взятия крови после кормления.
На фиг. 38Α-38Ό представлена серия графиков, отображающих рандомизацию обезьян резус по профилям 00ТТ, АиС (площади под кривой) 00ТТ и весу тела. Фиг. 38А отображает базовый уровень глюкозы в 00ТТ1, при этом закрашенные квадраты соответствуют группе А, закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют группе В, а пустые кружки на пунктирной линии соответствуют группе С перед распределением испытуемых соединений и носителя по группам. На фиг. 38В отображен базовый уровень глюкозы в 00ТТ2, при этом закрашенные квадраты соответствуют группе А, закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют группе В, а пустые кружки на пунктирной линии соответствуют группе С распределением испытуемых соединений и носителя по группам. На фиг. 38С показан базовый уровень глюкозы в 00ТТ 1 и 00ТТ 2 в терминах АИС, при этом фактурный столбец соответствует группе А, полутоновой столбец соответствует группе В, а пустой столбец соответствует группе С. Фиг. 38Ό показывает базовый вес тела, при этом фактурный столбец соответствует группе А, полутоновой столбец соответствует группе В, а пустой столбец соответствует группе С.
На фиг. 39 представлен график, показывающий влияние носителя, Р0Р21 и Рс-Р0Р21(К0) на вес тела у обезьян резус, при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1-й и 2-й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3-й и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5-й и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7, 8 и 9 соответствуют периоду отмывания (с 7-й по 9-ю неделю).
На фиг. 40 представлен график, показывающий процентное изменение уровня инсулина натощак по отношению к базовому уровню у обезьян резус для носителя, Р0Р21 и Рс-Р0Р21(К0), при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1-й и 2-й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3-й и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5-й и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7 и 8 соответствуют 7-й и 8-й неделе в период отмывания.
На фиг. 41 представлен график, показывающий влияние носителя, Р0Р21 и Рс-Р0Р21(К0) при введении высокой дозы на уровень инсулина у обезьян резус после кормления на 5-й и 6-й неделе исследования, при этом закрашенные столбцы соответствуют 5-й неделе, а полутоновые столбцы соответствуют 6-й неделе.
На фиг. 42 представлен график, показывающий профили глюкозы в ходе теста 00ТТ5 (пероральный тест на толерантность к глюкозе), проведенного в конце двухнедельного лечения высокими дозами Рс-Р0Р21(К0), при этом закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют носителю, пустые квадраты на пунктирной линии соответствуют Р0Р21, а закрашенные треугольники на сплошной линии соответствуют Рс-Р0Р21(К0).
На фиг. 43 представлен график, показывающий профили инсулина в ходе теста 00ТТ5, проведенного в конце двухнедельного лечения высокими дозами Рс-Р0Р21(К0), при этом закрашенные кружки на
- 6 024751 сплошной линии соответствуют носителю, пустые квадраты на пунктирной линии соответствуют Р0Р21, а закрашенные треугольники на сплошной линии соответствуют Ре-РСР21(КС).
На фиг. 44 представлен график, показывающий ЛИС 1-3 глюкозы в ходе теста ΘΟΤΤ, проведенном в конце каждого периода введения доз (низкой, средней и высокой дозы) обезьянам резус, при этом пустые столбцы соответствуют ЛИС3, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в ΘΟΤΤ3, закрашенные столбцы соответствуют АИС4, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в ΘΟΤΤ4, а полутоновые столбцы соответствуют ЛИС5, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в ΘΟΤΤ5.
На фиг. 45 представлен график, показывающий влияние носителя, РСР21 и Рс-РОР21(КО) на процентное изменение уровня триглицеридов в плазме по сравнению с базовым уровнем в каждой группе обезьян резус, при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1 и 2 неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3-й и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5-й и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7-9 соответствуют периоду отмывания (с 7-й по 9-ю неделю).
На фиг. 46 представлен график, показывающий уровень триглицеридов в плазме после кормления в каждой группе обезьян резус по результатам измерений на пятой и шестой неделях лечения носителем, РСР21 или Рс-РОР21(КО) в высокой дозе, при этом полутоновые столбцы соответствуют 5-й неделе, а закрашенные столбцы соответствуют 6-й неделе.
Фиг. 47 представляет собой график, показывающий индивидуальный уровень РСР21 у обезьяны по результатам измерений перед началом введения доз, а также в 5-й, 12-й, 19-й и 26-й день при взятии образцов приблизительно через 21 ч после каждой инъекции.
На фиг. 48 представлен график, показывающий индивидуальный уровень Рс-РОР21(КО) у обезьяны по результатам измерений перед началом введения доз, а также в 5-й, 12-й, 19-й и 26-й день при взятии образцов приблизительно через 5 дней после каждой инъекции.
На фиг. 49 представлен график, показывающий средние концентрации РСР21 и Рс-РОР21(КО) по результатам измерений в ходе трех тестов ΘΟΤΤ, проведенных после введения каждой дозы (низкой, средней и высокой), при этом полутоновые столбцы соответствуют ΘΟΤΤ3 с низкой дозой, закрашенные столбцы соответствуют ΘΟΤΤ4 со средней дозой, а пустые столбцы соответствуют ΘΟΤΤ5 с высокой дозой.
Подробное описание изобретения
Белок человека РСР21, обладающий улучшенными свойствами, в частности удлиненным периодом полувыведения и/или уменьшенной агрегацией, может быть изготовлен способами, раскрытыми в настоящем описании и стандартными способами молекулярной биологии. Факультативно можно дополнительно увеличить период полувыведения, гибридизируя антитело или его часть с Ν-концевым или Сконцевым участком последовательности РСР21 дикого типа. Также можно дополнительно увеличить период полувыведения или уменьшить агрегацию белка РСР21 дикого типа, вводя в этот белок аминокислотные замещения. Такие модифицированные белки упоминаются в данном документе как мутанты или мутанты РСР21 и формируют варианты осуществления настоящего изобретения.
Способы рекомбинантных нуклеиновых кислот, упоминаемые в данном описании, включая примеры, в целом представляют собой способы, сформулированные в опубликованных источниках 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 (Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге55, 1989) или Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (АикиЬе1 е! а1., ейк., Сгееи РиЬБккегк 1ис. апй \УПеу апй 8опк 1994), причем оба указанных источника включены в настоящее описание в качестве ссылки с любой целью.
1. Общие термины и определения.
Термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, которая (1) была отделена как минимум приблизительно от 50% белков, липидов, углеводов или других материалов, вместе с которыми она встречается в природе, когда тотальную нуклеиновую кислоту выделяют из клеток-источников, (2) не сцеплена со всем полинуклеотидом или частью полинуклеотида, с которыми выделенная молекула нуклеиновой кислоты сцеплена в природе, (3) функционально связана с полинуклеотидом, с которым она не связана в природе, или (4) не встречается в природе как часть большей полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно, чтобы выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению была, по существу, свободна от любых других загрязняющих молекул нуклеиновой кислоты или от других загрязнений, которые обнаруживаются в природном окружении и которые могли бы помешать ее применению в выработке полипептида или ее терапевтическому, диагностическому, профилактическому применению или применению в научно-исследовательских целях.
Термин вектор употребляется для обозначения любой молекулы (например, нуклеиновой кислоты, плазмиды или вируса), используемой для переноса кодирующей информации в клетку-хозяина.
Термин вектор экспрессии относится к вектору, который пригоден для трансформации клеткихозяина и содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые направляют и/или контролируют экспрессию вставленных гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты. Экспрессия включает, но, не ограничиваясь ими, такие процессы как транскрипция, трансляция и сплайсинг РНК, если присутствуют интроны.
- 7 024751
Термин функционально связанный (ая, ое) употребляется в данном документе для обозначения компоновки фланкирующих последовательностей, при этом фланкирующие последовательности, описанные таким образом, сконфигурированы или собраны так, что выполняют свою обычную функцию. Итак, фланкирующая последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, может быть способной вызывать репликацию, транскрипцию и/или трансляцию кодирующей последовательности. Например, кодирующая последовательность функционально связана с промотором, если промотор способен управлять транскрипцией этой кодирующей последовательности. Фланкирующая последовательность не обязательно должна примыкать к кодирующей последовательности до тех пор, пока она правильно функционирует. Так, например, между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью могут быть вставлены промежуточные не транслируемые, но еще транскрибируемые последовательности, при этом промоторная последовательность, по-прежнему, может считаться функционально связанной с кодирующей последовательностью.
Термин клетка-хозяин употребляется для обозначения клетки, которая была трансформирована или способна к трансформации последовательностью нуклеиновой кислоты, после чего она экспрессирует представляющий интерес ген. Этот термин включает потомство родительской клетки независимо от того, идентично ли оно или не идентично первоначальному родителю по морфологии или генетической структуре до тех пор, пока клетка экспрессирует избранный ген.
Термин выделенный полипептид относится к полипептиду по настоящему изобретению, который (1) был отделен как минимум приблизительно от 50% полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, вместе с которыми он встречается в природе, когда его выделяют из клеток-источников, (2) не связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) со всем полипептидом или частью полипептида, с которыми выделенный полипептид связан в природе, (3) функционально связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (4) не встречается в природе. Предпочтительно, чтобы выделенный полипептид был, по существу, свободен от любых других загрязняющих полипептидов или от других загрязнений, которые обнаруживаются в природном окружении, и которые могли бы помешать его применению в терапевтических, диагностических, профилактических или научно-исследовательских целях.
Термин встречающийся в природе применительно к таким биологическим материалам как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т.п. относится к материалам, которые встречаются в природе и не подвергаются манипуляциям со стороны человека. Сходным образом, термин не встречающийся в природе при использовании в данном документе относится к материалу, который не встречается в природе либо был структурно модифицирован или синтезирован человеком. При использовании по отношению к нуклеотидам термин встречающийся в природе относится к таким основаниям, как аденин (А), цитозин (С), гуанин (С), тимин (Т) и урацил (И). При использовании по отношению к аминокислотам термин встречающаяся в природе относится к следующим 20 аминокислотам: аланин (А), цистеин (С), аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е), фенилаланин (Р), глицин (С), гистидин (Н), изолейцин (I), лизин (К), лейцин (Ь), метионин (М), аспарагин (Ν), пролин (Р), глутамин (О), аргинин (К), серин (8), треонин (Т), валин (V), триптофан (^) и тирозин (Υ).
Термин полипептид РСР21 относится к встречающемуся в природе полипептиду дикого типа, экспрессируемому у человека. В целях этого раскрытия изобретения термин полипептид РСР21 может использоваться взаимозаменяемо любого полноразмерного полипептида РСР21, например 5>ЕЭ ГО N0: 2, который состоит из 209 аминокислотных остатков, и который кодируется нуклеотидной последовательностью 5>ЕЭ ГО N0: 1; любая зрелая форма полипептида, 8ЕЦ ГО N0: 4, которая состоит из 181 аминокислотного остатка, которая кодируется нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3 и в которой 28 аминокислотных остатков на аминоконце полноразмерного полипептида РСР21 (например, составляющих сигнальный пептид) были удалены, а также их варианты. Термины 1етш5 мутант полипептида РСР21 и мутант РСР21 относятся к варианту полипептида РСР21, в котором природная аминокислотная последовательность РСР21 была модифицирована. Такие модификации включают, но, не ограничиваясь ими, одно или более аминокислотных замещений, включая замещения на аналоги аминокислот, не встречающиеся в природе, и усечения. Таким образом, мутанты полипептида РСР21 включают, но, не ограничиваясь ими, сайт-специфические мутанты РСР21, усеченные полипептиды РСР21, мутанты РСР21, устойчивые к протеолизу, мутанты РСР21 с пониженной агрегацией, комбинаторные мутанты РСР21 и гибридные белки РСР21, как описано в данном документе. В целях идентификации специфических усечений и аминокислотных замещений в мутантах РСР21 по настоящему изобретению нумерация усеченных или мутированных аминокислотных остатков соответствует нумерации в зрелом полипептиде РСР21, состоящем из 181 аминокислотного остатка.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения мутант полипептида РСР21 включает аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РСР21 желательные свойства, например устойчивость к протеолизу, увеличенный период полувыведения, сниженную агрегацию или их комбинации, не были дополнительно модифицированы. Иными словами, за исключением тех остатков в мутантной последовательности РСР21, которые были модифи- 8 024751 цированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других аминокислотных остатков в мутантной последовательности РСР21. Например, в мутанте РСР21 О173Е, могут быть модифицированы до 15% всех других аминокислотных остатков в дополнение к остатку глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. В других вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид РСР21 включает аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 5>ЕО ГО N0: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РСР21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие мутанты полипептида РСР21 обладают как минимум одним видом активности полипептида РСР21 дикого типа.
Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутант полипептида РСР21, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 85% идентична аминокислотной последовательности 5>Е0 ГО N0: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РСР21 желательные свойства, например устойчивость к протеолизу, увеличенный период полувыведения, сниженную агрегацию или их комбинации, не были дополнительно модифицированы. Иными словами, за исключением нуклеотидов, кодирующих те остатки в мутантной последовательности РСР21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других нуклеотидов в мутантной последовательности, кодирующей РСР21. Например, в молекуле, кодирующей мутант РСР21 О173Е, могут быть модифицированы до 15% всех других нуклеотидов в дополнение к нуклеотидам, кодирующим остаток глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид РСР21, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 5>Е0 ГО N0: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РСР21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие мутанты РСР21 обладают как минимум одним видом активности полипептида РСР21 дикого типа.
Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, которая как минимум приблизительно на 85% идентична нуклеотидной последовательности 5>Е0 ГО N0: 3, но в которой нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки, которые придают кодируемому мутантному полипептиду РСР21 устойчивость к протеолизу, пониженную способность к агрегации или другие желательные свойства, не были дополнительно модифицированы. Говоря другими словами, за исключением тех остатков в мутантной последовательности РСР21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других аминокислотных остатков в мутантной последовательности РСР21. Например, в мутанте РСР21 О173Е, могут быть модифицированы до 15% всех других аминокислотных остатков в дополнение к остатку глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. Далее, настоящее изобретение охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, которая как минимум приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 5>Е0 ГО N0: 3, но в которой нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки, которые придают кодируемому мутантному полипептиду РСР21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие молекулы нуклеиновых кислот кодируют мутанты РСР21, обладающие как минимум одним видом активности полипептида РСР21 дикого типа.
Термин биологически активный мутант полипептида РСР21 относится к любому мутантному полипептиду РСР21, описанному в данном документе, который обладает активностью полипептида РСР21 дикого типа, в частности способностью понижать уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, уменьшать вес тела и улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии или чувствительность к инсулину независимо от числа модификаций, введенных в мутант полипептида РСР21. Мутантные полипептиды РСР21, обладающие в некоторой степени пониженным уровнем активности РСР21 по сравнению с полипептидом РСР21 дикого типа, могут, тем не менее, считаться биологически активными мутантами полипептида РСР21.
Каждый из терминов эффективное количество и терапевтически эффективное количество относится к мутантному полипептиду РСР21, применяемому для поддержания наблюдаемого уровня одного или более видов биологической активности полипептида РСР21 дикого типа, в частности способности понижать уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, снижать вес тела или улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии или чувствительность к инсулину.
Термин фармацевтически приемлемый носитель или физиологически приемлемый носитель при использовании в данном документе относится к одному или более рецептурных материалов, пригодных
- 9 024751 для осуществления или улучшения доставки мутантного полипептида Р0Р21.
Термин антиген относится к молекуле или части молекулы, которые способны связываться с антителом и, кроме того, их можно использовать на животных для выработки антител, которые способны связывать эпитоп антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов.
Термин нативный Ре относится к молекуле или последовательности, включающей последовательность неантигенсвязывающего фрагмента и полученной в результате расщепления целого антитела или выработанной другими средствами, как в мономерной, так и в мультимерной форме, которая может содержать шарнирный участок. Предпочтительный первоначальный иммуноглобулиновый источник нативного Рс имеет человеческое происхождение и представляет собой любой из иммуноглобулинов, хотя более предпочтительны 1§О1 и 1дС2. Нативные молекулы Рс состоят из мономерных полипептидов, которые могут быть соединены в димерные или мультимерные формы посредством ковалентной (т.е. по типу дисульфидных связей) и нековалентной ассоциации. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Рс варьируется от 1 до 4 в зависимости от класса (например, 1дС, 1дА и 1дЕ) или подкласса (например, 1дО1, 1§О2, 1§О3, 1дА1 и 1дСА2). Один из примеров нативного Рс представляет собой дисульфидно связанный димер, полученный в результате папаинового расщепления 1§О (см. ЕШкоп с1 а1., 1982, Ыис1е1с АсМк Кек. 10: 4071-9). Термин нативный Рс при использовании в данном документе обобщает мономерные, димерные и мультимерные формы. Пример полипептидной последовательности Рс представлен в 8ЕЦ ГО N0: 13.
Термин вариант Рс относится к молекуле или последовательности, которые модифицированы из нативного Рс, но еще включают сайт связывания для рецептора утилизации, РсКп (рецептор Рс новорожденных). Международные патентные публикации №№ \У0 97/34631 и \У0 96/32478 описывают типичные варианты Рс, а также их взаимодействие с рецептором утилизации, в связи с чем указанные публикации включены в этот документ в качестве ссылки. Таким образом, термин вариант Рс может включать молекулу или последовательность, которые гуманизированы из нативного Рс нечеловеческого происхождения. Кроме того, нативный Рс включает участки, которые можно удалить, поскольку они обеспечивают структурные признаки биологической активности, не являющиеся необходимыми для гибридных молекул мутантов Р0Р21, соответствующих настоящему изобретению. Таким образом, термин вариант Рс включает молекулу или последовательность, в которых один или более сайтов или остатков нативного Рс утрачены или модифицированы, что влияет на: (1) образование дисульфидных связей, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) Ν-концевую гетерогенность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с другим рецептором Рс, нежели рецептор утилизации, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (АОСС). Варианты Рс более подробно описаны в данном документе ниже.
Термин домен Рс охватывает нативный Рс, варианты Рс и их последовательности в соответствии с данными выше определениями. Как в отношении вариантов Рс, так и в отношении нативных молекул Рс термин домен Рс включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, полученные в результате расщепления целого антитела или выработанные другими средствами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Рс может быть соединен с Р0Р21 или мутантом Р0Р21 (включая усеченную форму Р0Р21 или мутанта Р0Р21) посредством, например, ковалентной связи между доменом Рс и последовательностью Р0Р21. Такие составные белки могут образовывать мультимеры через ассоциацию доменов Рс, при этом как составные белки, так и их мультимеры являются аспектом настоящего изобретения.
2. Сайт-специфические мутанты Р0Р21.
Термин сайт-специфический мутант Р0Р21 или замещенный мутант Р0Р21 относится к мутантному полипептиду Р0Р21, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности природного полипептида Р0Р21, например 8ЕЦ ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4 и их вариантов. Сайт-специфические мутанты Р0Р21 можно создавать, вводя аминокислотные замещения, консервативные или не консервативные и используя как встречающиеся, так и не встречающиеся в природе аминокислоты в специфических положениях полипептида Р0Р21.
Консервативная аминокислотная замена может включать замену нативного аминокислотного остатка (т.о., остатка, обнаруживаемого в данном положении полипептидной последовательности Р0Р21 дикого типа) на ненативный остаток (т.н., остаток, который не обнаруживается в данном положении полипептидной последовательности Р0Р21 дикого типа), при этом не происходит никаких влияний или происходят очень незначительные влияния на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Консервативные аминокислотные замещения также охватывают не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые обычно встраиваются посредством химического пептидного синтеза, а не синтеза в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие реверсированные или инвертированные формы аминокислотных компонентов.
Встречающиеся в природе аминокислотные остатки можно подразделить на классы, основываясь на общих свойствах боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин (попеисше), Мер А1а, Уа1, Ьеи, 11е;
(2) нейтральные гидрофильные: Сук, 8ег, ТЬг;
- 10 024751 (3) кислотные: Акр, С1и;
(4) основные: Акп, ΟΙη, Ηίκ, Ьук, Агд;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: О1у, Рго; и (6) ароматические: Тгр, Туг, РЬе.
Консервативные замещения могут включать замену члена одного из этих классов другим членом того же класса. Неконсервативные замещения могут включать замену члена одного из этих классов другим членом другого класса.
Желательные аминокислотные замещения (как консервативные, так и неконсервативные) могут определить компетентные специалисты в данной области в то время, когда такие замены понадобятся. Типичный (но не ограничивающий) список аминокислотных замещений представлен в табл. 1.
Таблица 1
Аминокислотные замещения
Первоначальный остаток | Типичные замещения |
А1а | Уа1, Ьеи, Ие |
Аг§ | Ьуз, С1п, Азп |
Акп | О1п |
Азр | О1и |
Суз | Зет, А1а |
ΟΙη | Азп |
О1и | Азр |
О1у | Рго, А1а |
Шз | Азп, О1п, Ьуз, Аг§ |
Не | Ьеи, Уа|, Мец А1а, РЬе |
Ьеи | Не, Уа1. Ме£, А1а, РЬе |
Ьуз | Агд, О1п, Азп |
Ме1 | Ьеи, РЬе, 11е |
РЬе | Ьеи, Уа1, Не, А1а, Туг |
Рго | А1а |
Зег | ТЬг, А1а, Суз |
ТЬг | Зег |
Тгр | Туг, РЬе |
Туг | Тгр, РЬе, ТЬг, Зег |
Уа1 | 11е,Ме1, Ьеи, РЬе, А1а |
3. Усеченные полипептиды ΡΟΡ21.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к усеченным формам зрелого полипептида ΡΟΡ21. Этот вариант осуществления настоящего изобретения возник в связи с попыткой выявить усеченные полипептиды ΡΟΡ21, которые способны обеспечивать активность, равную активности не усеченных форм зрелого полипептида ΡΟΡ21, а в некоторых случаях превосходящую ее.
При использовании в настоящем описании термин усеченный полипептид ΡΟΡ21 относится к полипептиду ΡΟΡ21, в котором были удалены аминокислотные остатки из аминоконцевого (или Νконцевого участка) полипептида ΡΟΡ21, были удалены аминокислотные остатки из карбоксиконцевого (или С-концевого) участка полипептида ΡΟΡ21 или были удалены аминокислотные остатки как из аминоконцевого, так и из карбоксиконцевого участков полипептида ΡΟΡ21. Различные усечения, раскрытые в настоящем документе, были подготовлены так, как это изложено в примерах 3 и 6.
Активность полипептидов ΡΟΡ21, усеченных на Ν-конце, и полипептидов ΡΟΡ21, усеченных на Сконце, можно оценивать, применяя анализ на ЕЬК-люциферазу ίη νίΐτο, как это описано в примере 4. Специфические подробности анализов ίη νίΐτο, которые можно применять для исследования активности усеченных полипептидов ΡΟΡ21, можно найти в примере 4.
Активность усеченных полипептидов ΡΟΡ21 по настоящему изобретению также можно оценивать в анализе ίη νίνο, таком как анализ на мышах оЬ/оЬ, описанный в примерах 5 и 7. В целом, для оценки активности усеченного полипептида ΡΟΡ21 ίη νίνο этот усеченный полипептид можно ввести животному, используемому для тестирования, внутрибрюшинно. После нужного периода инкубации (например, 1 ч или более), можно взять образец крови и измерить уровень глюкозы. Специфические подробности ана- 11 024751 лизов ίη νίνο, которые можно применять для исследования активности усеченных полипептидов РСР21, можно найти в примерах 5 и 7.
a. Ν-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Ν-концевые усечения включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков из Ν-концевого участка зрелого полипептида РСР21. Как продемонстрировано в примере 5 и на фиг. 3, усеченные полипептиды РСР21, имеющие концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков, сохраняют способность зрелого полипептида РСР21 понижать уровень глюкозы в крови субъекта.
В соответствии с этим, в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида РСР21 или мутантных полипептидов РСР21, имеющих Νконцевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков.
b. С-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения С-концевые усечения включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков из С-концевого участка зрелого полипептида РСР21. Как продемонстрировано в примере 4 и на фиг. 1В, усеченные полипептиды РСР21, имеющие Сконцевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков, демонстрируют эффективность на уровне как минимум 50% эффективности РСР21 дикого типа в анализе на ЕЬК-люциферазу ίη νίίτο, указывающую на то, что эти мутанты РСР21 сохраняют способность зрелого полипептида РСР21 понижать уровень глюкозы в крови субъекта. В соответствии с этим, в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида РСР21 или мутантных полипептидов РСР21, имеющих С-концевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков.
c. Ν-концевые и С-концевые усечения.
С некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения усеченные полипептиды РСР21 могут иметь сочетанные Ν-концевые и С-концевые усечения. Усеченные полипептиды РСР21, имеющие сочетание Ν-концевых и С-концевых усечений, сохраняют активность соответствующих усеченных полипептидов РСР21, имеющих только Ν-концевые или С-концевые усечения. Говоря иначе, усеченные полипептиды РСР21, имеющие как Ν-концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков, так и С-концевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков, обладают такой же или даже большей активностью по снижению уровня глюкозы в крови, чем усеченные полипептиды РСР21, имеющие только Ν-концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков или С-концевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков. В соответствии с этим, в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида РСР21 или мутантных полипептидов РСР21, имеющих Ν-концевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков и С-концевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков.
Как и в отношении всех мутантов РСР21 по настоящему изобретению, усеченные полипептиды РСР21 могут в необязательном порядке включать аминоконцевой остаток метионина, который можно ввести посредством направленной мутации или в результате процесса бактериальной экспрессии.
Усеченные полипептиды РСР21 по настоящему изобретению можно изготовить так, как это описано в примерах 3 и 6. Средний специалист в данной области, знакомый со стандартными методиками молекулярной биологии, сможет употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять усеченные полипептиды РСР21 по настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию); см., например, публикацию 8ашЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Усеченные полипептиды РСР21 по настоящему изобретению также можно соединять с другим компонентом, который способен придать усеченному полипептиду РСР21 дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения усеченный полипептид РСР21 может быть соединен с последовательностью Рс. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов будут обсуждаться в данном документе более подробно.
- 12 024751
4. Мутанты Р0Р21, устойчивые к протеолизу.
Как указано в примере 8, было обнаружено, что зрелый Р0Р21 подвергается разрушению ίη νίνο, которое, в конечном итоге, является результатом протеолитической атаки. Было обнаружено, что разрушение зрелого Р0Р21 ίη νίνο укорачивает эффективный период его полувыведения, а это, в свою очередь, отрицательно влияет на терапевтический потенциал молекулы. В соответствии с этим, было проведено целенаправленное исследование по идентификации мутантов Р0Р21, которые проявляют устойчивость к протеолизу. В результате этого исследования было определено, что сайты в молекуле зрелого полипептида Р0Р21, которые особенно чувствительны к протеолизу, включают аминокислотные остатки в положениях 4-5, 20-21, 151-152 и 171-172.
Было проведено широкое, но сфокусированное и целенаправленное исследование по идентификации специфических замещений, которые устраняют наблюдаемый протеолитический эффект, хотя при этом не влияют на активность белка в недопустимой степени. Табл. 8 и 11 представляют некоторые из полученных и протестированных мутантов. Как описано в примерах 13 и 14, не все мутанты Р0Р21 демонстрируют идеальный профиль: одни мутанты, приобретая устойчивость к протеолизу, утрачивали или снижали полезную активность Р0Р21, а другие мутанты сохраняли активность Р0Р21, но не приобретали устойчивости к протеолизу. Некоторые мутанты, включая, например, Р0Р21 Р1710, сохраняли уровень активности, сходный с Р0Р21 дикого типа, и в то же время демонстрировали устойчивость к протеолэтическому разрушению.
Один из критериев отбора при идентификации желательных мутантов Р0Р21, устойчивых к протеолизу, заключался в том, чтобы активность мутанта Р0Р21 была, по существу, такой же или даже большей по сравнению с активностью Р0Р21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты Р0Р21, которые устойчивы к протеолизу, но при этом сохраняют активность, которая, по существу, не отличается от активности Р0Р21 дикого типа или превышает ее. Хотя в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами Р0Р21, которые устойчивы к протеолизу, но проявляют в некоторой степени сниженную активность. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать протеолиз, вследствие чего мутанты Р0Р21, которые допускают некоторую степень протеолиза, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты Р0Р21 по настоящему изобретению, мутанты Р0Р21, устойчивые к протеолизу, можно изготовить так, как описано в данном документе. Специалисты в данной области, например, знающие стандартные методики молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять мутанты Р0Р21, устойчивые к протеолизу, в соответствии с настоящим изобретением. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию); см., например, публикацию 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг Ο1οηίη§: А ЬаЬога1огу Мапиа1, выше, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Мутанты Р0Р21, устойчивые к протеолизу, можно соединять с другим компонентом, который способен придать мутанту Р0Р21, устойчивому к протеолизу, дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения устойчивый к протеолизу мутант Р0Р21 можно соединить с последовательностью Рс 1д0, например 8ЕО ГО N0: 13. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов известны и будут обсуждаться в данном документе более подробно.
5. Мутанты Р0Р21 с пониженной агрегацией.
Как описано в примере 15, одним из свойств полипептида Р0Р21 дикого типа является его склонность к агрегации. При концентрации свыше приблизительно 5 мг/мл степень агрегации высока при комнатной температуре. Как показано и описано в данном документе, степень агрегации для полипептида Р0Р21 дикого типа зависит как от концентрации, так и от температуры.
Агрегация может создать проблемы при работе с Р0Р21 дикого типа в этих концентрациях, например, в контексте составления терапевтической композиции. В соответствии с этим, было проведено целенаправленное исследование по идентификации мутантов Р0Р21, которые проявляют пониженную склонность к агрегации. Затем выявленные мутанты Р0Р21 были протестированы на склонность к агрегации в различных концентрациях.
Было проведено широкое, но сфокусированное и целенаправленное исследование по идентифика- 13 024751 ции специфических замещений, которые устраняют наблюдаемый эффект агрегации для РОР21 дикого типа, но при этом не влияют на активность белка в недопустимой степени. Подход к идентификации подходящих мутантов с пониженной агрегацией описан в примере 15. В табл. 16 представлены некоторые полученные и протестированные мутанты. Как показано в примере 17, не все мутанты РСР21 проявляют идеальный профиль. Одни мутанты, такие как Р0Р21 Ь58Е, имели сниженную активность Р0Р21 и не исследовались далее, а другие мутанты, такие как Р0Р21 А134Е, сохраняли активность Р0Р21, но не приобретали свойства пониженной склонности к агрегации. В то же время некоторые мутанты, такие как Р0Р21 Ь98К, не только сохраняли активность Р0Р21, но и демонстрировали пониженную агрегацию. Один мутант, Р0Р21 А45К, неожиданно проявил повышенную активность Р0Р21 наряду с пониженной склонностью к агрегации.
Один из критериев отбора при идентификации желательных мутантов Р0Р21, не склонных к агрегации, заключался в том, чтобы активность мутанта Р0Р21 была, по существу, сходной или даже большей по сравнению с активностью Р0Р21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты Р0Р21, имеющие пониженную склонность к агрегации, но в то же время сохраняющие активность Р0Р21, которая сходна с активностью Р0Р21 дикого типа или превышает ее. Несмотря на то, что в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами Р0Р21, которые имеют пониженную склонность к агрегации, но проявляют в некоторой степени сниженную активность Р0Р21. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать определенный уровень агрегации, вследствие чего мутанты Р0Р21, которые допускают некоторую степень агрегации, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты Р0Р21 по настоящему изобретению, мутанты Р0Р21, обладающие пониженной склонностью к агрегации, можно изготовить так, как описано в данном документе. Средние специалисты в данной области, знакомые со стандартными методиками молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять мутанты Р0Р21 с пониженной склонностью к агрегации, соответствующие настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию); см., например, 8ашЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЬога1огу Мапиа1, выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики. Мутанты Р0Р21, не склонные к агрегации, можно соединять с другим компонентом, который способен придать мутанту Р0Р21, не склонному к агрегации, дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения не склонный к агрегации мутант Р0Р21 можно соединить с последовательностью Рс 1§О, например 8ЕЦ ГО N0: 13. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов обсуждаются в данном документе более подробно.
6. Комбинированные мутанты Р0Р21.
Как описано в данном документе, последовательность Р0Р21 дикого типа обладает некоторыми свойствами, которые создают значительные проблемы при использовании Р0Р21 в качестве терапевтической молекулы. Среди этих проблем необходимо упомянуть чувствительность белка к разрушению и его склонность к агрегации в высоких концентрациях. После всесторонних попыток идентифицировать такие полипептиды Р0Р21, которые преодолевают каждую из этих проблем, было проведено целенаправленное исследование для определения того, можно ли скомбинировать аминокислотные замещения, придающие белку устойчивость к протеолизу, и замещения, понижающие склонность к агрегации, чтобы добиться аддитивного или синергического эффекта таких замещений в одной полипептидной последовательности, поддерживая при этом такой уровень активности, который соответствует активности Р0Р21 дикого типа или превосходит ее. Эта задача сложна для решения, поскольку в данной области знаний известно, что введение множественных мутаций в определенный полипептид иногда может отрицательно сказаться на экспрессии, активности и последующей выработке белка в производственных масштабах.
Неожиданно, как это продемонстрировано в примерах 19 и 20, было обнаружено, что желательные свойства нескольких мутантов Р0Р21, действительно, можно комбинировать аддитивным или синергическим образом, чтобы получить такой мутант Р0Р21, который обладает улучшенными фармацевтическими свойствами. В данном документе раскрыты мутанты Р0Р21, которые устойчивы к протеолизу, имеют пониженную степень агрегации, но при этом сохраняют такую активность, которая соответствует
- 14 024751 активности РОР21 дикого типа или превосходит ее.
Один из критериев отбора при идентификации желательных комбинированных мутантов РОР21 заключался в том, чтобы активность мутанта РОР21 была, по существу, сходной или даже большей по сравнению с активностью РОР21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты РОР21, устойчивые к протеолизу и имеющие пониженную склонность к агрегации, но в то же время сохраняющие активность РОР21, которая сходна с активностью РОР21 дикого типа или превышает ее. Хотя в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами РОР21, которые устойчивы к протеолизу и имеют пониженную склонность к агрегации, но проявляют в некоторой степени сниженную активность РОР21. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать определенный уровень протеолиза и/или агрегации, вследствие чего мутанты РОР21, которые допускают некоторую степень протеолиза и/или агрегации, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты РОР21 по настоящему изобретению, комбинированные мутанты РОР21, соответствующие этому изобретению, можно изготовить так, как описано в данном документе. Средние специалисты в данной области, знакомые со стандартными методиками молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять комбинированные мутанты РОР21, соответствующие настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию); см., например, 8ашЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЬогу Мапиа1, выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Комбинированные мутанты РОР21, соответствующие настоящему изобретению, можно соединять с другим компонентом, который способен придать комбинированному мутанту РОР21 дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комбинированный мутант РОР21 можно соединить с последовательностью Рс 1дО, например 8ЕЦ ГО N0: 13. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов обсуждаются в данном документе более подробно.
7. Составные белки РОР21.
При использовании в данном документе термин составной полипептид РОР21 или составной белок РОР21 относится к соединению одного или более аминокислотных остатков (например, с образованием гетерологичного белка или пептида) на Жконце или С-конце любого мутантного полипептида РОР21, описанного в данном документе.
Гетерологичные пептиды и полипептиды включают, но, не ограничиваясь ими, эпитоп, позволяющий выявить и/или выделить мутантный полипептид РОР21, трансмембранный рецепторный белок или его часть, такую как внеклеточный домен или трансмембранный и внутриклеточный домен, лиганд или часть лиганда, которые связываются с трансмембранным рецепторным белком, фермент или часть фермента, которые каталитически активны, пептид или полипептид, которые стимулируют олигомеризацию, например домен лейциновой застежки, пептид или полипептид, которые повышают стабильность, например константный участок иммуноглобулина, функциональное или не функциональное антитело либо его тяжелая или легкая цепь, а также полипептид, который обладает активностью, в частности терапевтической активностью, отличной от мутантных полипептидов РОР21 по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также охватывает мутантов РОР21, соединенных с сывороточным альбумином человека (Н8А).
Составные белки РОР21 можно изготовить посредством соединения гетерологичных последовательностей или на Жконце, или на С-конце мутантного полипептида РОР21. Как описано в данном документе, гетерологичная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность или полимер, не содержащий аминокислот. Гетерологичные последовательности можно соединять с мутантным полипептидом РОР21 или напрямую, или через линкер/адаптерную молекулу. Линкер или адаптерная молекула могут представлять собой один или более аминокислотных остатков (или -меров), например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или 9 остатков (или -меров), предпочтительно от 10 до 50 аминокислотных остатков (или -меров), например 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 остатков (или -меров), и более предпочтительно от 15 до 35 аминокислотных остатков (или -меров). Линкер или адаптерную молекулу также можно сконструировать с сайтом расщепления для рестрикционной ДНК-эндонуклеазы или для протеазы, что позволяет разделять соединенные компоненты.
- 15 024751
a. Соединения с Рс.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутантный полипептид РСР21 соединен с одним или более доменов участка Рс иммуноглобулина 1дС человека. Антитела включают две функционально независимые части, вариабельный домен, известный как РаЬ, который связывает антиген, и константный домен, известный как Рс, который вовлечен в такие эффекторные функции как активация комплемента и атака фагоцитарными клетками. Домен Рс имеет длинный период полувыведения из сыворотки, тогда как домен РаЬ является короткоживущим (Сароп е1 а1., 1989, №Лиге 337: 525-31). При соединении с терапевтическим белком домен Рс может обеспечить более длительный период полувыведения или встроить такие функции как связывание рецептора Рс, связывание белка А, фиксация комплемента и, возможно, даже перенос через плаценту (Сароп е1 а1., 1989).
Фармакокинетический анализ ίη νί\Ό указывает на то, что РСР21 человека имеет короткий период полувыведения, который составляет у мышей приблизительно 1 ч, что связано с быстрым клиренсом и разрушением ίη νί\Ό. Следовательно, для удлинения периода полувыведения о£ РСР21 последовательность Рс присоединяли к Ν- или С-концевому участку полипептида РСР21. Слияние участка Рс с РСР21 дикого типа, в особенности, присоединение Рс к Ν-концу РСР21 дикого типа, вопреки ожиданиям, не удлиняло период полувыведения, однако это привело к исследованию протеолитического распада РСР21 ίη νί\Ό и к идентификации мутантов РСР21, которые были устойчивы к такому распаду. Такие мутанты, описанные в примерах 8 и 11, проявляют больший период полувыведения по сравнению с РСР21 дикого типа. Эти и другие составные белки РСР21 формируют варианты осуществления настоящего изобретения.
По всему тексту настоящего раскрытия изобретения обозначение Рс-РСР21 относится к составному белку, в котором последовательность Рс присоединена к Ν-концу РСР21. Сходным образом, обозначение Рс-РСР21 относится к составному белку, в котором последовательность Рс присоединена к С-концу РСР21.
Полученный в результате такого слияния составной белок РСР21 можно очистить, например, применяя колонку для аффинной хроматографии с белком А. Было обнаружено, что пептиды и белки, к которым присоединен участок Рс, проявляют ίη νί\Ό значительно более длительный период полувыведения по сравнению с негибридизированными аналогами. К тому же слияние с участком Рс создает возможность для димеризации/мультимеризации составного полипептида. Участок Рс может представлять собой участок Рс, встречающийся в природе, но также может подвергаться изменениям для улучшения определенных качеств, таких как терапевтические качества, время циркуляции или сниженная агрегация.
Полезные модификации белковых терапевтических средств за счет слияния с доменом Рс антитела подробно обсуждаются в Международной патентной публикации № \У0 00/024782, содержание которой включено в этот документ в качестве ссылки во всей полноте. Этот документ обсуждает сцепление с транспортировщиком, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), декстран или участок Рс.
b. Линкеры составных белков.
При формировании составных белков по настоящему изобретению можно, но не обязательно, использовать линкер. Если линкер представлен, его химическая структура не принципиальна, поскольку он, в первую очередь, служит спейсером. Линкер может состоять из аминокислот, сцепленных друг с другом посредством пептидных связей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения линкер составлен из 1-20 аминокислот, сцепленных посредством пептидных связей, при этом аминокислоты выбраны из 20 аминокислот, встречающихся в природе. В различных вариантах осуществления изобретения от 1 до 20 аминокислот выбраны из глицина, серина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер составлен из большинства аминокислот, которые не испытывают стерических затруднений, таких как глицин и аланин. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкеры представляют собой полиглицины (такие как (С1у)4 (8ЕЦ ГО N0: 29) и (С1у)5 (8ЕЦ ГО N0: 30)), полиаланины, комбинации глицина и аланина (такие как поли(С1у- А1а)) или комбинации глицина и серина (такие как поли(С1у-8ег)). Другие подходящие линкеры включают (С1у)5-8ег-(С1у)з-8ег-(С1у)4-8ег (8ЕЦ ГО N0: 23), (С1у)4-8ег-(С1у)4-8ег-(С1у)4-8ег (8ЕЦ ГО N0: 31), (С1у)3-Ьу8-(С1у)4 (8ЕЦ ГО N0: 32), (С1\);-А8и-С1\-5ег-(С1\); (8ЕЦ ГО N0: 33), (С1у)3-Су8-(С1у)4 (8ЕЦ ГО N0: 34) и С1у-Рго-А5п-С1у-С1у (8ЕЦ ГО N0: 35). Несмотря на то что было обнаружено, что для составных белков РСР21 особенно хорош линкер из 15 аминокислот, настоящее изобретение рассматривает линкеры любой длины или любого состава.
Линкеры, описанные в данном документе, типичны, но настоящее изобретение также рассматривает линкеры, которые намного длиннее и могут включать другие аминокислотные остатки. Непептидные линкеры также рассматриваются в настоящем изобретении. Например, можно использовать алкильные линкеры, такие как -НН-(СН2),-С(0)-. в котором 8 = от 2 до 20. Далее, такие алкильные линкеры могут быть замещены любой стерически незатрудненной группой, включая, но, не ограничиваясь ими, низший алкил (например, С1-С6), низший ацил, галоген (например, С1, Вг), СИ, N4^ или фенил. Типичным непептидным линкером является полиэтиленгликолевый линкер, который имеет молекулярный вес от 100 до 5000 кДа, например от 100 до 500 кДа.
- 16 024751
8. Химически модифицированные мутанты РОР21.
Химически модифицированные формы мутантных полипептидов РОР21, описанные в данном документе, включая усеченные формы РОР21, описанные в данном документе, могут быть изготовлены квалифицированным специалистом с учетом информации, представленной в этом раскрытии изобретения. Такие химически модифицированные мутанты РОР21 изменены таким образом, что они отличаются от не модифицированных мутантов РОР21 или по типу, или по локализации молекул, естественным образом прикрепленных к мутанту РОР21. Химически модифицированные мутанты РОР21 могут включать молекулы, образующиеся посредством удаления одной или более химических групп, прикрепленных естественным образом.
В одном из вариантов осуществления изобретения мутантные полипептиды РОР21 по настоящему изобретению могут быть модифицированы посредством ковалентного присоединения одного или более полимеров. Например, в типичном случае отобранный полимер растворим в воде, поэтому белок, к которому он присоединяется, не выпадает в осадок в водной среде, такой как физиологическая среда. В сферу пригодных полимеров включены смеси полимеров. В целях терапевтического использования препарата, являющегося конечным продуктом, предпочтительно, чтобы полимер был фармацевтически приемлемым. Нерастворимые в воде полимеры, конъюгированные с мутантными полипептидами РОР21 по настоящему изобретению, также формируют один из аспектов изобретения.
Типичные полимеры могут иметь любой молекулярный вес и быть разветвленными или неразветвленными. Каждый типичные полимер имеет средний молекулярный вес приблизительно от 2 до 100 кДа (термин приблизительно указывает на то, что в препаратах водорастворимых полимеров вес некоторых молекул будет отличаться в большую или меньшую сторону от заявленного молекулярного веса). Предпочтительно, чтобы средний молекулярный вес каждого полимер составлял приблизительно от 5 до 50 кДа, более предпочтительно приблизительно от 12 до 40 кДа, наиболее предпочтительно приблизительно от 20 до 35 кДа.
Подходящие водорастворимые полимеры или их смеси включают, но, не ограничиваясь ими, Νсцепленные или О-сцепленные углеводы, сахара, фосфаты, полиэтиленгликоль (ПЭГ) (включая такие формы ПЭГ, которые были использованы для получения производных белков, включая моно-Щ-СпЭ, алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль), монометоксиполиэтиленгликоль, декстран (такой как декстран низкого молекулярного веса, например, приблизительно 6 кДа), целлюлозу или другие полимеры на углеводной основе, поли-Щ-винилпирролидон) полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиоли (например, глицерин) и поливиниловый спирт. Настоящее изобретение также охватывает бифункциональные поперечно сшитые молекулы, которые могут быть использованы для получения ковалентно связанных мультимеров мутантных полипептидов РОР21. Настоящее изобретение также охватывает мутанты РОР21, ковалентно присоединенные к полисиаловой кислоте.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант РОР21 ковалентно или химически модифицирован с присоединением одного или более водорастворимых полимеров, включая, но, не ограничиваясь ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиоксиэтиленгликоль или пропиленгликоль; см., например, патенты США №№ 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант РОР21 содержит один или более полимеров, включая, но, не ограничиваясь ими, монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, другой полимер на углеводной основе, поли-Щ-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимера полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиоли (например, глицерин), поливиниловый спирт или смеси таких полимеров.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант РОР21 ковалентно модифицирован субъединицами ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров связаны в одном или более специфических положений (например, на Νконце) мутанта РОР21. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров в случайном порядке прикреплены к одной или более боковых цепей мутанта РОР21. В некоторых вариантах осуществления изобретения ПЭГ используется для улучшения терапевтической производительности мутанта РОР21. Некоторые из таких способов обсуждаются, например, в патенте США № 6133426, который включен в этот документ в качестве ссылки с любой целью.
В тех вариантах осуществления настоящего изобретения, где полимером является ПЭГ, группа ПЭГ может иметь любой подходящий молекулярный вес и может быть линейной или разветвленной. Предпочтительно, чтобы средний молекулярный вес группы ПЭГ варьировался в приблизительном диапазоне от 2 до 100 кДа и более предпочтительно приблизительно от 5 до 50 кДа, например 10, 20, 30, 40 или 50 кДа. Группы ПЭГ обычно прикрепляются к мутанту РОР21 посредством ацилирования или восстановительного алкилирования через реактивную группу на компоненте ПЭГ (например, альдегидную, амино, тиоловую или эфирную группу), взаимодействующую с реактивной группой на мутанте РОР21 (например, альдегидной, амино или эфирной группой).
ПЭГилирование (или пегилирование) полипептидов, включая мутанты РОР21 по настоящему изобретению, может специфически осуществляться с применением любых реакций пегилирования, извест- 17 024751 ных в данной области знаний. Такие реакции описаны, например, в следующих ссылках: Ρταηακ е1 а1., 1992, Ροουκ οη Οιό\\11ι ΡαοΐΟΓκ 3: 4-10, европейские патенты №№ 0154316 и 0401384, патент США № 4179337. Например, пегилирование можно осуществить посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реактивной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичного реактивного водорастворимого полимера) как описано в данном документе. Для реакций ацилирования выбранный полимер должен иметь одну реактивную эфирную группу. Для восстановительного алкилирования выбранный полимер должен иметь одну реактивную альдегидную группу. Реактивным альдегидом является, например, пропиональдегид полиэтиленгликоля, который стабилен в воде, либо его моно С1-С10 алкокси или арилокси производные (см., например, патент США № 5252714).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полезная стратегия присоединения группы ПЭГ к полипептиду включает комбинирование через образование конъюгатной связи в растворе между пептидом и компонентом ПЭГ, при этом каждый из них несет особую функциональность со взаимной реактивностью по отношению друг к другу. Пептиды можно легко приготовить с помощью традиционного твердофазного синтеза. Пептиды предварительно активированы, т.е. имеют соответствующую функциональную группу в специфическом сайте. Перед реакцией с компонентом ПЭГ предшественники очищают и получают их полные характеристики. Сшивание пептида с ПЭГ обычно происходит в водной фазе, и его можно легко мониторировать посредством обращенно-фазовой аналитической ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Пегилированные пептиды можно легко очистить посредством препаративной ВЭЖХ и охарактеризовать посредством аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и лазерной десорбционной масс-спектрометрии.
Полисахаридные полимеры представляют собой еще один тип водорастворимого полимера, который можно применять для модификации белка. Следовательно, мутанты ΡΟΡ21 по настоящему изобретению, соединенные с полисахаридным полимером, формируют варианты осуществления настоящего изобретения. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры, состоящие из отдельных субъединиц глюкозы, преимущественно соединенных альфа 1-6 связями. Декстран, как таковой, доступен в широком диапазоне молекулярного веса и легко доступен в диапазоне молекулярного веса приблизительно от 1 до 70 кДа. Декстран является подходящим водорастворимым полимером для применения в качестве носителя самостоятельно или в комбинации с другим носителем (например, Ес); см., например, Международную патентную публикацию № νθ 96/11953. В ней было описано применение декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами; см., например, Европейскую патентную публикацию № 0315456, которая включена в этот документ в качестве ссылки. Настоящее изобретение также охватывает применение декстрана с молекулярным весом приблизительно от 1 до 20 кДа.
В целом, химическую модификацию можно проводить в любых подходящих условиях, которые способствуют реакции белка с активированной молекулой полимера. Способы приготовления химически модифицированных полипептидов обычно включают следующие этапы: (а) реакция полипептида с активированной молекулой полимера (такой как реактивное эфирное или альдегидное производное молекулы полимера) в таких условиях, при которых мутантный полипептид ΡΟΡ21 прикрепляется к одной или более молекул полимера, и (Ь) получение продуктов реакции. Оптимальные условия реакции можно определить, основываясь на известных параметрах и желательном результате. Например, чем больше соотношение между молекулами полимера и белка, тем больше процентный показатель присоединения молекул полимера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения химически модифицированные мутанты ΡΟΡ21 могут иметь единичный компонент, представленный молекулой полимера на аминоконце (см., например, патент США № 5234784).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения мутантные полипептиды ΡΟΡ21 могут быть химически соединены с биотином. Затем комплексам биотина с мутантными полипептидами ΡΟΡ21 дают возможность связываться с авидином, что приводит к образованию тетравалента авидин/биотин/мутантный полипептид ΡΟΡ21.
Мутантные полипептиды ΡΟΡ21 также можно ковалентно соединять с динитрофенолом (ΌΝΡ) или тринитрофенолом (ΤΝΡ), а полученные в результате конъюгаты, осаждаемые антителами 1дМ типа антиΌΝΡ или анти-ΤΝΡ образуют декамерные конъюгаты с валентностью 10.
В целом, состояния, которые можно облегчить или модулировать введением химически модифицированных мутантов ΡΟΡ21 по настоящему изобретению, включают те же состояния, которые описаны в данном документе для мутантных полипептидов ΡΟΡ21. Однако химически модифицированные мутанты ΡΟΡ21, раскрытые в данном документе, могут обладать дополнительными видами активности, усиленной или ослабленной биологической активностью или другими свойствами, такими как удлиненный или укороченный период полувыведения по сравнению с немодифицированными мутантами ΡΟΡ21.
9. Терапевтические композиции мутантов ΡΟΡ21 и их введение.
Терапевтические композиции, включающие мутанты ΡΟΡ21, относятся к сфере настоящего изобретения и специфически рассматриваются в свете идентификации различных мутантных последовательностей ΡΟΡ21, проявляющих улучшенные свойства. Такие фармацевтические композиции с мутантами ΡΟΡ21 могут включать терапевтически эффективное количество мутантного полипептида ΡΟΡ21 в смеси
- 18 024751 с фармацевтически или физиологически приемлемым формообразующим агентом, подобранным в соответствии с предполагаемым способом введения.
Предпочтительно, чтобы приемлемые формообразующие материалы были нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях.
Фармацевтическая композиция может содержать формообразующие материалы для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости разложения или высвобождения, адсорбции или пенетрации композиции. Соответствующие формообразующие материалы включают, но, не ограничиваясь ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные средства, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия), буферы (такие как бораты, бикарбонаты, трис-НС1, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты), наполнители (такие как маннит или глицин), хелатообразующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (БОТА)), комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин), заполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), красящие, вкусо-ароматические или разбавляющие агенты, эмульгирующие агенты, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон), полипептиды низкого молекулярного веса, солеобразующие противоионы (такие как натрий), консерванты (такие как бензалконий хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахарные спирты (такие как маннит или сорбит), суспендирующие агенты, сурфактанты или смачивающие агенты (такие как плюроники, ПЭГ, эфиры сорбита, полисорбаты, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин или тилоксапол), агенты, усиливающие стабильность (такие как сахароза или сорбит), агенты, усиливающие тоничность (такие как галиды щелочных металлов, предпочтительно хлорид натрия или калия, маннит, сорбит), транспортировщики для доставки, разбавители, наполнители и/или фармацевтические адъюванты (см., например, Кетшдоп'в РЬагтасеиДса1 8с1епсев (181Н ЕД., А.К. Оеппаго, еД., Маск РиЫЫйпд Сотрапу 1990) и последующие издания той же книги, которые включены в этот документ в качестве ссылки с любой целью).
Оптимальную фармацевтическую композицию вполне может определить квалифицированный специалист в зависимости, например, от намеченного способа введения, формата доставки и желательной дозы (см., например, Кетшдйп'в РЬагтасеиДса1 8аепсев, выше). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ш νί\Ό. и скорость клиренса ш νί\Ό мутантного полипептида Р0Р21.
Основной транспортировщик или носитель в фармацевтической композиции может быть водным или не водным по своей природе. Например, подходящим транспортировщиком или носителем для инъекций может быть вода, физиологический солевой раствор или искусственная спинномозговая жидкость, возможно с добавлением других материалов, общепринятых в композициях для парентерального введения. Другими типичными транспортировщиками являются забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином. Другими типичными фармацевтическими композициями являются буфер трис с приблизительным значением рН 7,0-8,5 или ацетатный буфер с приблизительным значением рН 4,0-5,5, которые дополнительно могут включать сорбит или его подходящий заменитель. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции с мутантным полипептидом Р0Р21 можно приготовить для хранения, смешивая выбранную композицию, имеющую желательную степень чистоты, с факультативными формообразующими агентами (Кепипд1оп'в РЬагтасеиДса1 8с1епсев, выше) в виде лиофилизированной таблетки или водного раствора. Кроме того, фармацевтический продукт с мутантным полипептидом Р0Р21 может выпускаться в виде лиофилизата с применением соответствующих наполнителей, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции с мутантным полипептидом Р0Р21 могут быть подобраны для парентеральной доставки. В альтернативном варианте можно подобрать композиции для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например пероральной. Изготовление таких фармацевтически приемлемых композиций относится к квалификации специалистов, работающих в данной области.
Формообразующие компоненты представлены в таких концентрациях, которые приемлемы в месте введения композиции. Например, буферы применяют для поддержания рН композиции на физиологическом уровне или несколько ниже, обычно в приблизительном диапазоне рН от 5 до 8.
Когда речь идет о парентеральном введении, терапевтическая композиция для применения по настоящему изобретению может представлять собой апирогенный, парентерально приемлемый водный раствор, содержащий желательный мутантный полипептид Р0Р21 и фармацевтически приемлемый транспортировщик. Особенно подходящим транспортировщиком для парентеральных инъекций является стерильная дистиллированная вода, в которой растворяют мутантный полипептид Р0Р21, получая в результате стерильный изотонический раствор, законсервированный соответствующим образом. Еще один препарат может включать лекарственный состав из желательной молекулы с таким агентом как инъекци- 19 024751 онный микросферы, биологически распадающиеся частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), капельки или липосомы, обеспечивающие управляемое и длительное высвобождение продукта, который модно доставлять посредством депонированных инъекций. Также можно использовать гиалуроновую кислоту, что может стимулировать длительное пребывание композиции в кровотоке. Другие подходящие средства для введения желательной молекулы включают имплантируемые приспособления для доставки лекарств.
В одном из вариантов осуществления изобретения может быть составлена фармацевтическая композиция для ингаляции. Например, мутантный полипептид РСР21 может быть оформлен в виде сухого порошка для ингаляции. Также можно приготовить ингаляционные растворы мутантного полипептида РСР21 с пропеллентом для аэрозольной доставки. Еще в одном варианте осуществления изобретения растворы можно распылять при помощи небулайзера. Пульмональное (легочное) введение более подробно описано в Международной патентной публикации № \У0 94/20069, которая описывает пульмональное введение химически модифицированных белков.
Также рассматривается возможность перорального введения некоторых лекарственных составов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутантные полипептиды РСР21, которые вводят таким способом, можно вводить в лекарственные составы вместе с носителями или без носителей, которые обычно используют при изготовлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, можно сконструировать капсулу для высвобождения активной части лекарственного состава в том отделе желудочно-кишечного тракта, где биологическая доступность лекарства будет максимальной, а распад до попадания в системный кровоток будет минимальным. Для того чтобы облегчить всасывание мутантного полипептида РСР21, в лекарственный состав можно включить дополнительные агенты. Можно также использовать разбавители, вкусо-ароматические вещества, воски с низкой температурой плавления, растительные масла, смазки, суспендирующие агенты, агенты для распада таблеток и связующие вещества.
Фармацевтическая композиция другого типа может включать эффективное количество мутантного полипептида РСР21 в смеси с нетоксичными наполнителями, которые удобны для производства таблеток. Растворяя таблетки в стерильной воде или другом подходящем носителе, можно приготовить растворы в стандартной дозовой форме. Подходящие наполнители включают, но, не ограничиваясь ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактозу или фосфат кальция, связующие агенты, такие как крахмал, желатин или гуммиарабик, а также смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. Квалифицированным специалистам будут очевидны дополнительные варианты фармацевтических композиций с мутантными полипептидами РСР21, включая лекарственные составы с замедленным или контролируемым высвобождением мутантных полипептидов РСР21. Компетентным специалистам также должны быть известны методики составления многих других средств с замедленным или контролируемым высвобождением, таких как липосомные носители, биологически разрушаемые микрочастицы, пористый бисер и депонированные инъекции (см., например, такие ссылки как Международная патентная публикация № \У0 93/15722, которая описывает контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций, ХУ^сНке & 8сЬетепйетап, 2008, Ιηί. ί. РЬагт. 364: 298-327, а также РгеЛегд & Ζΐιιι, 2004, Ιηί. ί. РЬагт. 282: 1-18, в которых обсуждается изготовление и применение микросфер/микрочастиц).
Дополнительные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде изделий с определенной формой, например пленок или микрокапсул. Матрицы с замедленным высвобождением могут включать сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США № 3773919 и европейский патент № 0058481), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (8Мтап е1 а1., 1983, Вюро1утегк 22: 547-56), поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) (Ьапдег е1 а1., 1981, 1. ВютеД Ма1ег. Ке8. 15: 167-277 и Ьапдег, 1982, СЬет. ТесЬ. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Ьапдег е1 а1., выше) или поли-Э(-)-3-гидроксибутировую кислоту (европейский патент № 0133988). Композиции с замедленным высвобождением также могут включать липосомы, которые можно изготовить любым из множества способов, известных в данной области техники; см., например, Ерк1еш е1 а1., 1985, Ргос. АсаД 8с1. И.8.А. 82: 3688-92 и европейские патенты №№ 0036676, 0088046 и 0143949.
Типичная фармацевтическая композиция с мутантным полипептидом РСР21, применяемая для введения ίη νίνο, должна быть стерильной. Этого можно достичь пропусканием через мембраны для стерильной фильтрации. При изготовлении лиофилизированной композиции стерилизацию с применением этого способа можно проводить или до лиофилизации, или после лиофилизации и восстановления. Композицию для парентерального введения можно хранить в лиофилизированном виде или в растворе. В дополнение к этому, парентеральную композицию обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, в мешок для внутривенного раствора или во флакон с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожной инъекции.
После составления фармацевтической композиции ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества, обезвоженного или лиофилизированного по- 20 024751 рошка. Такие лекарственные составы можно хранить или в готовой для применения форме, или в такой форме, которая требует восстановления перед введением (например, в лиофилизированной).
В специфическом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на наборы для изготовления модулей разовых доз, предназначенных для введения. Такие наборы могут включать как первый контейнер с сухим белком, так и второй контейнер с водным составом. В сферу этого изобретения также входят наборы, включающие однокамерные и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).
Эффективное количество фармацевтической композиции с мутантным полипептидом РСР21 для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтической ситуации и целевых объектов терапии. Квалифицированный специалист поймет, что подходящие уровни доз для лечения будут варьироваться, что частично зависит от вводимой молекулы, от показания для применения мутантного полипептида РСР21, от способа введения, а также от габаритов больного (веса тела, площади поверхности тела или размера органа) и от его/ее медицинского статуса (возраста и общего состояния здоровья). В соответствии с этим, клиницист, стремясь добиться оптимального терапевтического эффекта, может титровать дозу и изменять способ введения лекарства.
Типичная доза может варьироваться в приблизительном диапазоне от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. В других вариантах осуществления изобретения доза может варьироваться в приблизительном диапазоне от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг, от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или от 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 мкг/кг до 100 мг/кг. В других вариантах осуществления изобретения доза может составлять 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 мкг/кг или 10 мг/кг.
Частота введения доз будет зависеть от фармакокинетических параметров мутантного полипептида РСР21 в применяемом лекарственном составе. В типичном случае клиницист будет вводить композицию так, чтобы была достигнута доза, позволяющая добиться желательного лечебного эффекта. Следовательно, композицию можно вводить в виде разовой дозы, а также двух или более доз, разделенных по времени (которые могут содержать одно и то же или разное количество нужной молекулы), либо посредством непрерывного вливания через имплантируемое приспособление или катетер. Дальнейшую доводку правильной дозы обычно проводит средний специалист, что находится в пределах его компетенции и входит в сферу его повседневных задач. Правильную дозу устанавливают, исходя из соответствующих данных по дозовой зависимости реакции на лечение.
Способ введения фармацевтической композиции соответствует известным способам, например перорально, через инъекцию: внутривенную, внутрибрюшинную, внутримозговую (интрапаренхиматозную или интравентрикулярную), внутримышечную, внутриглазную, внутриартериальную, интрапортальтную (в воротную вену), внутрь повреждения, а также через системы с длительным высвобождением (которые могут быть инъекционными или представлять собой имплантируемые приспособления). При желании композиции можно вводить болюсной инъекцией, непрерывным вливанием или через имплантируемое приспособление.
Альтернативно или в дополнение к этому, композицию можно вводить местно через имплантацию мембраны, губки или другого подходящего материала, который впитывает или инкапсулирует нужную молекулу. При использовании имплантируемого приспособления это приспособление можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, при этом доставка нужной молекулы может происходить через диффузию, рассчитанный по времени болюс или в виде непрерывного введения.
10. Возможности терапевтического применения мутантных полипептидов РСР21.
Мутантные полипептиды РСР21 можно применять для лечения, диагностики, облегчения или профилактики многих заболеваний или патологических состояний, включая нарушения обмена веществ, но, не ограничиваясь ими. В одном из вариантов осуществления изобретения нарушение обмена веществ, подлежащее лечению, представляет собой сахарный диабет, например диабет 2 типа. В другом варианте осуществления изобретения нарушением обмена веществ является ожирение. Другие варианты осуществления изобретения направлены на такие метаболические состояния или нарушения как дислипидемия, гипертония, гепатостеатоз, в частности неалкогольный гепатостеатоз ^ΑδΗ), сердечно-сосудистое заболевание, в частности атеросклероз, и возрастные изменения обмена веществ.
В прикладном варианте осуществления изобретения такое заболевание/патологическое состояние, как сахарный диабет или ожирение можно лечить посредством введения больному, нуждающемуся с таком лечении, мутантного полипептида РСР21 в терапевтически эффективной дозе, как описано в данном документе. Введение можно осуществить в соответствии со способами, описанными в данном документе, в частности посредством внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутримышечной инъекции или перорально в виде таблеток или жидкого лекарственного состава. В большинстве ситуаций нужную дозу может определить клиницист, как описано в данном документе, при этом нужная доза представляет собой терапевтически эффективную дозу мутантного полипептида РСР21. Квалифицированному специалисту будет очевидно, что терапевтически эффективная доза мутантного полипептида РСР21 будет зависеть, кроме всего прочего, от графика введения, от стандартной дозы вводимого
- 21 024751 антигена, от того, вводят ли молекулу нуклеиновой кислоты или полипептида в комбинации с другими терапевтическими средствами, от иммунного статуса и общего состояния здоровья реципиента. Термин терапевтически эффективная доза при использовании в данном документе означает, что количество мутантного полипептида РОР21, вызывающее биологическую или медицинскую реакцию в тканевой системе, в организме животного или человека, которое пытается определить исследователь, лечащий врач или другой клиницист, вызывает облегчение симптомов заболевания или расстройства, подлежащего лечению.
11. Антитела.
В объеме настоящего изобретения рассматриваются антитела и фрагменты антител, которые специфично связываются с мутантными полипептидами РОР21 по настоящему изобретению, но не дают специфического связывания с полипептидами РОР21 дикого типа. Антитела могут быть поликлональными, включая специфические поликлональные, моноклональными (МАЬ), рекомбинантными, химерными, гуманизированными, такими как антитела с пересаженным гипервариабельным участком (СОК), антителами человека, одноцепочечными и/или биспецифическими, а также могут представлять собой их фрагменты, варианты или химически модифицированные молекулы. Фрагменты антител включают те части антитела, которые специфически связываются с эпитопом на мутантном полипептиде РОР21. Примеры таких фрагментов включают фрагменты РаЬ и Р(аЬ'), полученные в результате ферментативного расщепления полноразмерных антител. Другие связывающие фрагменты включают фрагменты, полученные методиками рекомбинантных ДНК, такими как экспрессия рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные участки антитела.
Поликлональные антитела, направленные против мутантного полипептида РОР21, обычно вырабатывают у животных (например, кроликов или мышей) посредством множественных подкожных или внутрибрюшинных инъекций мутантного полипептида РОР21 и адъюванта. Может оказаться полезным конъюгировать мутантный полипептид РОР21 с белковым носителем, который является иммуногеном для иммунизированного биологического вида, таким как гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, тиреоглобулин крупного рогатого скота или соевый ингибитор трипсина. Для усиления иммунного ответа также используют агрегирующие агенты, такие как квасцы. После иммунизации у животных берут образцы крови и проводят анализ сыворотки на титр антитела против мутантного РОР21.
Моноклональные антитела, направленные на мутантные полипептиды РОР21, можно производить любым способом, который предусматривает выработку молекул антитела непрерывной клеточной линией в культуре. Примеры подходящих способов для выработки моноклональных антител включают способы гибридомы, описанные КоЫег е! а1., 1975, №Лиге 256: 495-97 и способ гибридомы из В-клеток человека (Ко/Ьог, 1984, 1. 1тМипо1. 133: 3001; Вгойеиг е! а1., Мопос1опа1 АпРЬойу Ргойисйоп ΤесЬη^^иек апй Арр1юа!юпк 51-63 (Магсе1 Эеккег, 1пс., 1987). Настоящее изобретение также предлагает клеточные линии, которые вырабатывают моноклональные антитела, реагирующие с мутантными полипептидами Р0Р21.
Моноклональные антитела по изобретению можно модифицировать для применения в качестве лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело представляет собой химерное антитело, в котором часть тяжелой (Н) и/или легкой (Ь) цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных от определенного биологического вида или принадлежащих к особому классу/подклассу антител, тогда как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных от другого биологического вида или принадлежащих к другому классу/ подклассу антител. Сюда же можно включить фрагменты таких антител, которые способны проявлять нужную биологическую активность; см., например, патент США № 4816567, Моткоп е! а1., 1985, Ргос. №!1. Асай. 8сь И.8.А. 81: 6851-55.
В другом варианте осуществления моноклональное антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело. Способы гуманизации антител, происходящих не от человека, хорошо известны в данной области техники; см., например, патенты США №№ 5585089 и 5693762. Обычно гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, встроенных в него из источника нечеловеческого происхождения. Гуманизацию можно провести, например, применяя способы, описанные в данной области техники (см., например, 1опек е! а1., 1986, №Лиге 321: 522-25; КтесЬтапп е! а1., 1998, №-11иге 332: 323-27; Уегйоеуеп е! а1., 1988, §с1епсе 239: 1534-36), посредством замещения как минимум части гипервариабельного участка антитела грызуна соответствующими участками из антитела человека.
Изобретение также охватывает антитела человека, которые связывают мутантные полипептиды РОР21 по настоящему изобретению. Используя трансгенных животных (например, мышей), которые способны вырабатывать набор антител человека при отсутствии эндогенной выработки иммуноглобулина, такие антитела получают, иммунизируя животных антигеном мутанта Р0Р21 (т.е. антигеном, имеющим как минимум 6 смежных аминокислот), факультативно соединенных с носителем; см., например, .ТакоЬоукк е! а1., 1993, Ргос. Νηΐ1 Асай. 8сь И.8.А. 90: 2551-55; 1акоЬоуйк е! а1., 1993, №-Ииге 362: 255-58; Вгиддегтапп е! а1., 1993, Уеаг т 1тМипо1. 7: 33. В одном из способов таких трансгенных животных получают, выводя из строя эндогенные локусы, кодирующие у них тяжелые и легкие цепи иммуноглобули- 22 024751 на, и вставляя в их геном локусы, кодирующие белки тяжелых и легких цепей человека. Затем частично модифицированных животных, т.е. животных, имеющих неполный комплект модификаций, скрещивают, чтобы получить животное, имеющее все нужные модификации иммунной системы. При введении иммуногена эти трансгенные животные вырабатывают антитела с аминокислотными последовательностями человека (скорее чем, например, с мышиными), включая вариабельные участки, которые иммуноспецифичны для этих антигенов, см., например, международные патентные публикации №№ \У0 96/33735 и \У0 94/02602. Дополнительные способы описаны в патенте США № 5545807, международных патентных публикациях №№ \У0 91/10741 и \У0 90/04036, а также в европейском патенте № 0546073. Антитела человека также можно вырабатывать посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или экспрессии в клетках гибридомы, как описано в данном документе.
В альтернативном варианте осуществления изобретения антитела человека также можно получать из библиотек фагового дисплея (см., например, НоодепЬоот е! а1., 1991, I. Μοί. ΒίοΙ. 227: 381; Магкк е! а1., 1991, I. Мо1. Вю1. 222: 581). Эти процессы имитируют иммунный отбор через демонстрацию репертуара антител на поверхности нитевидного бактериофага и последующий отбор фага посредством его связывания с антигеном выбора. Одна из таких методик описана в международной патентной публикации № \У0 99/10494, которая описывает выделение высокоаффинных и функциональных агонистических антител для МРЬ- и ткк-рецепторов с применением такого подхода.
Химерные антитела, антитела с пересаженным СЭК и гуманизированные антитела обычно получают рекомбинантными способами. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела вводят в клетки-хозяева и экспрессируют, применяя материалы и процедуры, описанные в данном документе. В одном из вариантов осуществления изобретения антитела вырабатывают в клетках-хозяевах млекопитающего, таких как клетки СНО. Моноклональные (например, человеческие) антитела можно получать посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или в клетках гибридомы, как описано в данном документе.
Антитела против мутанта РСР21 по изобретению можно использовать в любом известном способе анализа для выявления и количественной оценки мутантных полипептидов РСР21, таком как анализы конкурентного связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации (см., например, публикацию 8о1а, Мопос1опа1 ЛибЬоФек: А Мапиа1 о£ ТесЬтциек 147-158 (СКС Рге§5, 1пс., 1987), включенную в этот документ в качестве ссылки во всей полноте ее содержания). Антитела будут связывать мутантные полипептиды РСР21 с аффинностью, которая соответствует используемому методу анализа.
При диагностическом использовании в некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против мутантов РСР21 можно пометить выявляемым компонентом. Выявляемый компонент может представлять собой любой компонент, который способен создавать прямым или непрямым образом поддающийся выявлению сигнал. Например, выявляемым компонентом может быть радиоизотоп, такой как 3Н, 14С, 32Р, 35§, 1251, 99Тс, 1 п1п или 67Са, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцинизотиоцианат, родамин или люциферин, а также фермент, такой как щелочная фосфатаза, ъъъ-галактозидаза или пероксидаза хрена (Вауег е! а1., 1990, Ме1к Еп/. 184: 138-63).
Анализы с конкурентным связыванием основаны на способности меченого стандарта (например, мутантного полипептида РСР21 или его иммунологически реактивной части) конкурировать с испытуемым анализируемым продуктом (например, мутантным полипептидом РСР21) за связывание с ограниченным количеством антитела против мутанта РСР21. Количество мутантного полипептида РСР21 в испытуемом образце обратно пропорционально количеству стандарта, который вступает в связь с антителами. Для того чтобы облегчить определение количества связанного стандарта, антитела обычно инсобилизируют (переводят в нерастворимую форму) до или после конкуренции, чтобы стандарт и анализируемый продукт, связанные с антителами, было удобно отделить от стандарта и анализируемого продукта, оставшихся несвязанными.
Сэндвич-анализы обычно включают использование двух антител, каждое из которых способно связываться с самостоятельной иммуногенной частью или эпитопом белка, подлежащего выявлению или количественной оценке. В сэндвич-анализе тестируемый образец анализируемого продукта обычно связывается с первым антителом, которое иммобилизовано на твердой опоре, а затем второе антитело связывается с анализируемым продуктом, формируя таким образом комплекс из трех частей; см., например, патент США № 4376110. Второе антитело, само по себе, может быть мечено выявляемым компонентом (прямые сэндвич-анализы) или измеряться с применением антитела против иммуноглобулина, которое мечено выявляемым компонентом (непрямые сэндвич-анализы). Например, одним из типов сэндвичанализа является твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ1§А), в котором выявляемый компонент представляет собой фермент.
Антитела против мутанта РСР21 по настоящему изобретению также полезны для получения визуальных изображений ш У1уо. Антитело, меченное выявляемым компонентом, можно ввести животному, предпочтительно в кровоток с последующей оценкой наличия и локализации меченого антитела в организме хозяина. Антитело можно пометить любым компонентом, который поддается выявлению у животного способами ядерного магнитного резонанса, радиологии или другими средствами выявления, из- 23 024751 вестными в данной области техники.
Антитела к мутантам РСР21 по изобретению можно использовать как лекарственные средства. Терапевтические агенты обычно являются агонистами или антагонистами в том смысле, что они либо усиливают, либо ослабляют соответственно как минимум одну из биологических активностей мутантного полипептида РСР21. В одном из вариантов осуществления антагонистические антитела по изобретению представляют собой антитела или их связывающие фрагменты, которые способны к специфическому связыванию с мутантным полипептидом РСР21 и которые способны подавлять или устранять функциональную активность мутантного полипептида РСР21 ίη νί\Ό или ίη νίΙΐΌ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело будет подавлять функциональную активность мутантного полипептида РСР21 как минимум приблизительно на 50% и предпочтительно как минимум приблизительно на 80%. Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против мутанта способно вмешиваться во взаимодействие между мутантным полипептидом РСР21 и рецептором РСР, таким образом, подавляя или устраняя активность мутантного полипептида РСР21 ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό. Агонистические и антагонистические антитела против мутанта РСР21 идентифицируют скринирующими анализами, который хорошо известны в данной области техники.
Изобретение также относится к набору, включающему антитела против мутанта РСР21 и другие реактивы, полезные для выявления уровня мутантного полипептида РСР21 в биологических образцах. Такие реактивы могут включать выявляемую метку, блокирующую сыворотку, положительные и отрицательные контрольные образцы, а также реактивы для выявления.
Примеры
Приведенные ниже примеры иллюстрируют специфические варианты осуществления изобретения и различные варианты его применения. Они сформулированы только в целях пояснения, и их не следует воспринимать как ограничивающие сферу действия изобретения каким-либо образом.
Пример 1. Изготовление конструкций для экспрессии РОР21.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид РОР21, получали посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности, которые соответствуют 5'- и 3'-концам последовательности зрелого РОР21. Табл. 2 перечисляет праймеры, использованные амплификации последовательности зрелого РОР21.
Таблица 2
Праймеры ПЦР для конструкции РОР21
Праймер | Последовательность | 8Е0 ГО ΝΟ: |
Смысловой | 5<-АОСАСОААТААСАТАТССАТССААТТООАОАТТСТТСТСС-3‘ | 5 |
Антисмысловой | 5-ТАОТОАОСТССААТТСТТАООААСССТАССТОС-З' | б |
Праймеры, использованные для изготовления конструкции, экспрессирующей РОР21, включали сайты рестрикционной эндонуклеазы для направленного клонирования последовательности в подходящий вектор экспрессии (например, рЕТ30 (№\аден/ЕМО Вюхаенсех; Сан-Диего, штат Калифорния) или рАМО33 (Лтден; Саузенд Оукс, штат Калифорния)). Вектор экспрессии рАМО33 содержит низкокопийную точку начала репликации К-100, модифицированный промотор 1ас и ген устойчивости к канамицину. Вектор экспрессии рЕТ30 содержит точку начала репликации, полученную из рВК322, индуцируемый промотор Т7 м ген устойчивости к канамицину. Было обнаружено, что экспрессия из рАМО33 выше, но рЕТ30 является более надежным вектором для клонирования. Таким образом, большинство конструкций, описанный в настоящей патентной заявке, сначала были созданы в рЕТ30, а затем скринированы на эффективность. После этого отобранные последовательности были перенесены в рАМО33 для дальнейшей амплификации.
Последовательность РОР21 была амплифицирована в реакционной смеси, содержащей 40,65 мкл 6Н2О, 5 мкл реакционного буфера РГиИНга II Реаскон ВиГГег (10х), 1,25 мкл смеси 6ΝΤΡ (40 мМ - 4x10 мМ), 0,1 мкл матрицы (100 нг/мл), 1 мкл праймера 1 (10 мкм), 1 мкл праймера 2 (10 мкм) и 1 мкл соединяющей ДНК-полимеразы Н§ РГиИНга II (81га1адене, Ла-Хойя, штат Калифорния). Реакции амплификации проводили с нагреванием в течение 2 мин при 95°С, сопровождающимся десятью циклами при 95°С в течение 20 с, 60°С в течение 20 с (с дополнительным вычитанием I °С на цикл) и 72°С в течение 15 с на килобазу нужного продукта, после чего проводили 20 циклов при 94°С в течение 20 с, 55°С в течение 20 с и 72°С в течение 15 с на килобазу нужного продукта, а затем 72°С в течение 3 мин. Продукты амплификации расщепляли рестрикционными эндонуклеазами Ибе1, Орн1 и ЕсоКЦ вшивали в подходящий вектор, а затем встраивали в компетентную клетку для ее трансформации.
Пример 2. Очистка белков РОР21, полученных из бактерий.
В последующих примерах различные белки РОР21, включая полипептид РОР21 дикого типа, усеченные полипептиды РОР21, мутанты РОР21 и гибридные белки РОР21, были экспрессированы в бактериальной системе экспрессии. После экспрессии, которая описана ниже, белки РОР21 были очищены, как описано в этом примере, если специально не указано иное.
Для очистки полипептида РОР21 дикого типа, усеченных полипептидов РОР21 и мутантов РОР21
- 24 024751 от бактериальных телец включений дважды отмытые тельца включений (Ό^ΙΒ) солюбилизировали в солюбилизационном буфере, содержащем гуанидина гидрохлорид и ΌΤΤ в буфере Тпк при рН 8,5, затем перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре, и солюбилизированную смесь добавляли к буферу для рефолдинга, содержащему мочевину, аргинин, цистеин и цистамина гидрохлорид при рН 9,5, а затем перемешивали 24 ч при 5°С (см., например, С1агке, 1998, Сигг. 0ρίη. В|о1есЬпо1. 9: 157-63; Маппа11 е! а1., 2007, Вю1есЬпо1. Вюепд. 97: 1523-34; Кибо1рЬ е! а1., 1997, Ро1бш§ ргоШпк, Рго!еш Рипсбоп: А Ргасбса1 АрргоасЬ (Сге1дЬ!оп, еб., Νον Уогк, 1КЬ Ргекк) 57-99; апб ЫнЬакЫ е! а1., 2005, Рго!еш Ехрг. РипГ. 42: 1-6).
После солюбилизации и рефолдинга смесь пропускали через фильтр с размером ячеек 0,45 мкм. Затем концентрацию пула рефолдинга увеличивали приблизительно в 10 раз, используя для этого отделяющую кассету Ра11 0теда с молекулярным весом 10 кДа при трансмембранном давлении (ТМР) 20 рк1, а также проводили диафильтрацию с 3 объемами колонки 20 мМ Тпк, рН 8,0 при ТМР 20 рк1.
После этого очищенный образец подвергали анионообменной хроматографии (АЕХ) с применением смолы О ЗерЬагоке НР. Линейный солевой градиент от 0 до 250 мМ №·ιθ в 20 мМ Тпк прогоняли при рН 8,0 и температуре 5°С. Пиковые фракции анализировали методом δΌδ-РАСЕ и объединяли.
Затем пул элюата АЕХ подвергали хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С) с применением смолы РЬепу1 ЗерЬагоке НР. Белок элюировали, применяя понижающийся линейный градиент от 0,7 до 0 М сульфата аммония при рН 8,0 и температуре окружающей среды. Пиковые фракции анализировали методом Бу δΌδ-РАСЕ (ЬаетМЬ, 1970, №биге 227: 680-85) и объединяли.
Концентрацию пула Н1С увеличивали до 7 мг/мл, применяя для этого отделяющую кассету Ра11 0теда 0,2 м2 с молекулярным весом 10 кДа при ТМР 20 рк1. Проводили диафильтрацию концентрата с 5 объемами колонки 10 мМ КР04, 5% сорбита, рН 8,0 при ТМР 20 рк1, а восстановленный концентрат разбавляли до 5 мг/мл. Наконец, раствор фильтровали через позидиновую мембрану Ра11 т1ш-К1еепрас 0,2 мкМ.
Для очистки составных белков РСР21 и составных мутантных белков РСР21 от бактериальных телец включений дважды отмытые тельца включений (Ό^ΙΒ) солюбилизировали в солюбилизационном буфере, содержащем гуанидина гидрохлорид и ОТТ в буфере Тпк при рН 8,5, затем перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре, и солюбилизированную смесь добавляли к буферу для рефолдинга, содержащему мочевину, аргинин, цистеин и цистамина гидрохлорид при рН 9,5, а затем перемешивали 24 ч при 5°С (см., например, С1агке, 1998, Сигг. 0рш. Вю!есЬпо1. 9: 157-63; Маппа11 е! а1., 2007, Вю1есЬпо1. Вюепд. 97: 1523-34; Кибо1рЬ е! а1. 1997, Ро1бш§ ргоЮпк, Рго!еш Рипсбоп: А Ргасбса1 АрргоасЬ (СтещЬЮи еб., №ν Уогк, 1КЬ Ргекк) 57-99, и [кЫЬакЫ е! а1., 2005, Рго!еш Ехрг. РипГ. 42: 1-6).
После солюбилизации и рефолдинга смесь подвергали диализу в 5 объемах 20 мМ Тпк, рН 8,0, применяя диализную трубку 10 кО. Уровень рН диализированного пересвернутого материала доводили до 5,0 при помощи 50% уксусной кислоты, а затем осветляли материал центрифугированием в течение 30 мин при 4К.
После этого осветленный образец подвергали анионообменной хроматографии (АЕХ) с применением смолы О 8ерЬагоке НР. Линейный солевой градиент от 0 до 250 мМ №·ιθ в 20 мМ Тпк прогоняли при 8,0 и температуре 5°С. Пиковые фракции анализировали методом δΌδ-РАСЕ (ЬаетМЬ, 1970, №биге 227: 680-85) и объединяли.
Затем пул элюата АЕХ подвергали хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С) с применением смолы РЬепу1 δеρЬа^оке НР. Белок элюировали, применяя понижающийся линейный градиент от 0,6 до 0 М сульфата аммония при рН 8,0 и температуре окружающей среды. Пиковые фракции анализировали методом δΌδ-РАСЕ и объединяли.
После этапа Н1С пул подвергали диализу в 60 объемах 10 мМ Тпк, 2,2% сахарозы, 3,3% сорбита при рН 8,5. Концентрацию диализированного пула увеличивали до 5 мг/мл, применяя устройство ЬинЬокер. Наконец, раствор фильтровали через позидиновую мембрану Ра11 т1ш-К1еепрас 0,2 мкМ.
Пример 3. Изготовление и экспрессия усеченных белков РСР21.
Конструкции, кодирующие усеченные белки РСР21 и перечисленные в табл. 3, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии РСР21 дикого типа, как описано ниже (конструкция вектора экспрессии РСР21 дикого типа описана в примере 1).
- 25 024751
Таблица 3
Усечения РСР21
Аминокислотные остатки | Число усеченных остатков* |
С-концевые усечения | |
1-180 | 1 |
1 - 179 | 2 |
1-178 | 3 |
1 - 177 | 4 |
1-176 | 5 |
1-175 | 6 |
1-174 | 7 |
1-173 | 8 |
1-172 | 9 |
1-171 | 10 |
1-169 | 12 |
1-168 | 13 |
1 - 167 | 14 |
1-166 | 15 |
1-165 | 16 |
1-164 | 17 |
1-160 | 21 |
1 - 156 | 25 |
1 - 152 | 29 |
1-149 | 32 |
1-113 | 68 |
Ν-концевые усечения | |
2-181 | 1 |
3-181 | 2 |
4-181 | 3 |
5-181 | 4 |
6-181 | 5 |
7-181 | 6 |
8-181 | 7 |
9-181 | 8 |
С- и Ν-концевые усечения | |
5-174 | 11 |
7-172 | 17 |
9-169 | 20 |
9-149 | 40 |
15 - 169 | 26 |
15 - 149 | 46 |
15-113 82
15- 113 | 82 |
* По отношению к зрелому полипептиду РОР21.
Усеченные белковые конструкции РСР21 были изготовлены с применением праймеров, имеющих последовательности, которые гомологичны участкам, расположенным выше и ниже кодона (или кодонов), подлежащего делеции (что приводит к усечению). Праймеры, использованные в таких реакциях
- 26 024751 амплификации, также обеспечивали приблизительно 15 нуклеотидов перекрывающейся последовательности, что позволяло рециркуляризировать амплифицированный продукт, а именно весь вектор, теперь содержащий нужный мутант.
Типичная усеченная конструкция Р0Р21, кодирующая белок Р0Р21, в котором утрачен остаток гистидина в положении 1 зрелой последовательности Р0Р21 (т.е. усеченный мутант 2-181), была изготовлена с применением праймеров, показанных в табл. 4.
Таблица 4
Праймеры ПЦР для изготовления типичного усеченного мутанта Р0Р21
Праймер | Последовательность | 8Е<3 Ю ΝΟ: |
Смысловой | 5-ССАСАТАТАСАТАТСССААТТССАСАТТСТТСТССАТТАТГ-3' | 7 |
Антисмысловой | 5'-С’АТАТ(1ТАТАКТС:{:ГГ(.'ТТААА<тТТАААСАААА-3' | 8 |
Праймеры, показанные в табл. 4, рассчитаны на делецию остатка гистидина, как показано ниже, при этом верхняя последовательность (8ЕЦ ГО N0: 10) является частью зрелого полипептида Р0Р21, включающей Шконцевой метионин, вторая последовательность является смысловым праймером (8ЕЦ ГО N0: 7), третья и четвертая последовательности (8ЕЦ ГО N0: 11 и 8ЕЦ ГО N0: 12) являются частями конструкции, экспрессирующей Р0Р21, а пятая последовательность является антисмысловым праймером (8ЕЦ ГО N0: 9)
МеННЬеРгоНеРгоАзрЗегЗегРгоЬеи 5 ' -ССАСАТАТАСАТАТС---СААТТССАСАТТСТТСТССАТТАТТ
ТТТТСТТТААСТТТААСААССАСАТАТАСАТАТССАТССААТТССАСАТТСТТСТССАТТАТТ
ААААСАААТТСАААТТСТТССТСТАТАТСТАТАСеТАееТТААССТСТААСААСАСеТААТАА
ААААСАААТТСАААТТСТТССТ СТАТАТСТАТАС 51
Усеченные конструкции белка Р0Р21 были изготовлены с применением, по существу, тех же условий ПЦР, что описаны в примере 1. Продукты амплификации были подвергнуты расщеплению рестрикционной эндонуклеазой Όρη1, а затем введены в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой.
Усеченные белки Р0Р21 были экспрессированы посредством трансформации компетентных клеток ВЬ21 (ЭЕ3) или ВЬ21 81аг (1пуПгодеп, Карлсбад, штат Калифорния) конструкцией, кодирующей частично усеченный белок Р0Р21. Трансформанты выращивали в течение ночи с ограниченной аэрацией в среде ТВ с добавлением 40 мкг/мл канамицина, аэрировали на следующее утро и после короткого периода восстановления индуцировали в 0,4 мМ ΙΡΤ0. Мутанты Р0Р21 собирали центрифугированием через 1820 ч после индукции.
Пример 4. Активность усеченных белков Р0Р21 ίη νίΙΐΌ.
Были проведены эксперименты по идентификации усеченных белков Р0Р21, которые сохраняют активность Р0Р21 дикого типа в анализе на ЕЬК-люциферазу ίη νίΙΐΌ. Табл. 5 показывает в сводном виде результаты, полученные для белков Р0Р21, имеющих усечения на Шконце, С-конце или как на Шконце, так и на С-конце. Анализы на ЕЬК-люциферазу проводили с использованием рекомбинантной системы почечных клеток человека 293Т, в которой клетки 293Т избыточно экспрессируют генные конструкции бета-клото и репортера люциферазы. Эти конструкции также содержат последовательности, кодирующие 0АЬ4-ЕЬК1 и 5хиА8-Ьис, репортер люциферазы, управляемый промотором, который содержит тандемные копии сайта связывания 0а14. Бета-клото представляет собой корецептор, который востребован Р0Р21 для активации его Р0Р-рецепторов и индуцирования трансдукции внутриклеточного сигнала, который, в свою очередь, приводит к фосфорилированию Егк и ЕЬК. Активность люциферазы регулируется уровнем фосфорилированного Егк/ЕЬК1 и используется для непрямого мониторирования и количественной оценки активности Р0Р21.
Анализы на ЕЬК-люциферазу проводили, культивируя клетки 293Т в присутствии разных концентраций полипептида Р0Р21 дикого типа или мутантного полипептида Р0Р21 в течение 6 ч, после чего проводили оценку клеточных лизатов на активность люциферазы. На фиг. 1А, 1В показывают результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на усеченных мутантах Р0Р21 7-181 и 8-181 (фиг. 1А) и усеченных мутантах Р0Р21 1-172, 1-171, 1-169 и 1-164 (фиг. 1В). Люминесценция, полученная в анализах на активность ЕЬК-люциферазы в каждом из усеченных мутантов Р0Р21: 3-181, 4-181, 5181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172,9-181 и 1-149, показана на фиг. 2.
Мутантные полипептиды Р0Р21 сравнивали со стандартом Р0Р21 дикого типа, а мутанты, показывающие эффективность, составляющую как минимум 50% эффективности Р0Р21 дикого типа, считали не утратившими активность Р0Р21 (в табл. 5 они помечены символом
- 27 024751
Таблица 5
Усеченные белки РОР21: анализ ίη νίΙΐΌ
С-концевые усечения | ||
Аминокислотные остатки | Эффективность | Активность (+/-[ |
1-180 | 93,2% | + |
1-178 | 95,0% | + |
1-177 | 112,0% | + |
1-176 | 104,8% | + |
1-174 | 104,6% | + |
1-173 | 96,1% | + |
1-172 | 97,5% | + |
1-171 | 113,0% | + |
1-169 | 84,9% | + |
1-167 | 20% | - |
1-166 | 20% | - |
1-165 | 10% | - |
Ν-концевые усечения | ||
Аминокислотные остатки | Эффективность | Активность (+/- |
2-181 | 112,5% | + |
3-181 | 130,3% | + |
4-181 | 117,0% | + |
5-181 | 119,6% | + |
7-181 | 74,2% | |
8-181 | 24,9% | - |
9-181 | 12,5% | - |
Собирательный взгляд на результаты, представленные в табл. 5 указывает на то, что С-концевые делеции 14 или более аминокислотных остатков (т.е. белка РОР21 с С-концевым усечением, состоящим из аминокислотных остатков 1-167 и более коротких белков) приводят к элиминации активности РОР21. В дополнение к этому, табл. 5 указывает на то, что Жконцевые делеции 7 или более аминокислотных остатков (т.е. белка РОР21 с Жконцевым усечением, состоящим из аминокислотных остатков 8-181 и более коротких белков) приводят к элиминации активности РОР21. Не удивительно, что усеченные белки РОР21, имеющие как Жконцевые усечения от 8 до 14 остатков, так и С-концевые усечения от 12 до 32 остатков по результатам анализов на ЕЬК-люциферазу утрачивали активность.
В соответствии с данными, представленными в табл. 5, усеченные полипептиды РОР21, имеющие Жконцевые усечения менее 7 аминокислотных остатков, составляют варианты осуществления настоящего изобретения. Сходным образом, усеченные полипептиды РОР21, имеющие С-концевые усечения менее 13 аминокислотных остатков, составляют варианты осуществления настоящего изобретения.
Пример 5. Активность усеченных белков РОР21 ίη У1уо.
Белок РОР21 обладает множеством видов биологической активности, включая способность понижать в крови уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина, уменьшать вес тела, а также улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии и чувствительность к инсулину. Далее усеченные полипептиды РОР21 были проанализированы на активность РОР21 ίη У1уо посредством введения усеченных полипептидов РОР21 инсулинорезистентным мышам оЬ/оЬ и измерения способности частично усеченных полипептидов РОР21 понижать уровень глюкозы в крови. Тестируемый усеченный полипептид РОР21 впрыскивали внутрибрюшинно 8-недельным мышам оЬ/оЬ (басккоп ЬаЬога1огу) и после разовой инъекции брали у животных образцы крови в разных точках времени, например через 0, 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром 0пеТоисЬ (Ы£е8сап, 1пс. Милпитас, штат Калифорния) и результаты измерений выражали в виде процентного изменения уровня глюкозы по сравнению с начальным уровнем глюкозы в крови (т.е. в точке времени 0).
Результаты одного из экспериментов представлены на фиг. 3, которая отображает количество глюкозы в крови, выявленное у мышей, которым впрыскивали усеченные мутанты РОР21 8-181 и 9-181. Этот эксперимент продемонстрировал, что усеченные составные белки РОР21, включающие аминокислотные остатки 8-181, проявляют активность по снижению уровня глюкозы в крови ш У1уо, однако эта активность несколько меньше по сравнению с активностью РОР21 дикого типа через 3 и 6 ч после инъекции, но усеченные составные белки РОР21, включающие аминокислотные остатки 9-181 не проявляют такой активности. Таким образом, анализ эффектов, производимых усеченными полипептидами РОР21
- 28 024751 ίη У1уо, показал, что делеция до 7 аминокислот с Ν-конца зрелого РОР21 не аннулирует биологическую активность молекулы (в отличие от анализа ίη νίΙΐΌ. результаты которого позволяли предположить, что делеция 7 аминокислот с Ν-конца зрелого РОР21 аннулирует такую активность).
Различные результаты, полученные для отдельных полипептидов РОР21 с Ν-концевыми усечениями (например, РОР21 8-181) в анализах ίη νίΙΐΌ и ίη У1уо, можно объяснить взаимодействием РОР21 с бета-клото и рецептором РОР при осуществлении сигнальной трансдукции. Более конкретно, РОР21 активирует двойной комплекс рецептора, включающий корецептор бета-клото и рецептор РОР (РОРК), который инициирует сигнальный каскад, включающий тирозинкиназу. Было показано, что Ν-конец РОР21 вовлечен в связывание и активацию РОРК, тогда как С-конец РОР21 необходим для взаимодействия с бета-клото (У1е е1 а1., 2009 РЕВ§ Бей. 583:19-24). Анализ на ЕЬК-люциферазу ίη νίΙΐΌ был проведен с почечными клетками 293, в которых избыточно экспрессируется корецептор бета-клото, а РОРК экспрессируется на нормальном уровне. Количество РОРК по сравнению с количеством бета-клото относительно мало, следовательно, соотношение между бета-клото и РОРК в клетках 293 не является физиологическим, что может повлиять на формирование рецепторного комплекса, и, в конечном итоге, на связывание лиганда и активацию РОРК. Клеточная система 293 ίη уПго, по-видимому, более уязвима к полипептидам РОР21 с Ν-концевыми усечениями, следовательно, она могла давать потерю результатов при анализе активности нескольких протестированных мутантов с Ν-концевыми усечениями, в частности РОР21 8-181. Таким образом, при определении того, сохраняет ли определенный мутант РОР21 с Νконцевым усечением активность РОР21 дикого типа, активность этого мутанта РОР21 в анализе ίη У1уо, рассматривалась как диспозитивная (допускающая выбор из нескольких вариантов). В соответствии с этим, усеченные полипептиды РОР21, имеющие Ν-концевые усечения менее 8 аминокислотных остатков, охватываются изобретением.
Пример 6. Изготовление и экспрессия усеченных составных белков РОР21.
Поскольку период полувыведения белка можно увеличить, соединяя белок с последовательностью Рс, были изготовлены и проанализированы составные белки, включающие усеченные полипептиды РОР21. Усеченные составные белки РОР21, перечисленные в табл. 6, были изготовлены из амплифицированных последовательностей РОР21 посредством ПЦР типа 80Е (сплайсинг генов с удлинением перекрывания).
Составные белки РОР21 были изготовлены таким образом, что участок Рс гена иммуноглобулина человека 1дО1 (8ЕЦ ГО Ν0: 13) был присоединен или к Ν-концу, или к С-концу белка РОР21.
- 29 024751
Таблица 6
Усеченные составные белки РОР21
Аминокислотные остатки | Расположение Рс | Линкер |
С-концевые усечения | ||
1 - 178 | -νη2 | 15 |
1-175 | -νη2 | 14 |
1 - 175 | -СООН | 15 |
1 - 171 | -νη2 | 15 |
1 - 171 | -СООН | 15 |
1-170 | -СООН | 15 |
Ν-концевые усечения | ||
5-181 | -νη2 | 15 |
5- 181 | -СООН | 15 |
7- 181 | -νη2 | 15 |
7- 181 | -СООН | 15 |
С- и Ν-концевые усечения | ||
5-175 | -νη2 | 15 |
5- 175 | -СООН | 15 |
5- 171 | -νη2 | 15 |
5- 171 | -СООН | 15 |
6- 170 | -СООН | 15 |
7- 178 | -СООН | 35 |
7- 175 | -νη2 | 15 |
7-175 | -СООН | 15 |
7- 174 | -СООН | 35 |
7-172 | -СООН | 35 |
7- 171 | -νη2 | 15 |
7- 171 | -СООН | 35 |
7- 171 | -СООН | 15 |
В частности, конструкции составного белка РОР21 (включая конструкции, кодирующие усеченные составные белки РОР21) были изготовлены в серин из трех реакций амплификации с применением, по существу, тех же условий реакции, которые были описаны в примере 1. В первой реакции была сконструирована пара праймеров для выработки последовательности, содержащей сайт клонирования Ше1, участок Рс и линкерную последовательность. Во второй реакции была сконструирована пара праймеров для выработки последовательности, содержащей перекрывающуюся часть линкера, часть кодирующей последовательности РОР21 и сайт клонирования ЕсоКР Наконец, в третьей реакции была сконструирована пара праймеров для сцепления продуктов двух первых реакций. Типичный набор праймеров для конструирования составного белка Рс-РОР21 1-181 приведен в табл. 7.
- 30 024751
Таблица 7
Праймеры ПЦР для изготовления типичной конструкции составного белка РСР21
Праймер | Последовательность | ί>ΕΜΠ>ΝΟ: |
Реакция 1 | ||
Смысловой | 5’-АССАССААТААСАТАТОаАСААААСТСАСАСАТС-3' | 14 |
Антисмысловой | 5’-СОАТССАССАССАССОСТАССАС-3' | 15 |
Реакция 2 | ||
Смысловой | 5'-ССТООТООТСОАТСССАТССААТТССАаАТГСТТСТССА-3 | 16 |
Антисмысло во! | 5’-ТАаТОАОСТССААТТСТТАООААОССТАОСТСС-3' | 17 |
Реакция 3 | ||
Смысловой | 5'-АСЮАСЮААТААСАТАТСОАСААААСТСАСАСАТО-3· | 14 |
АНТИСМЫСЛО ΒΟΙ | 5'-ТАСТОАОСТСОААТТСТТАООААОСОТАССТОО-3' | 17 |
Продукт последней реакции был расщеплен рестрикционными эндонуклеазами Νάβΐ и ЕсоК1, вшит в вектор рЕТ30, а затем введен в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой.
Пример 7. Активность усеченных составных белков РСР21 ίη νίνο.
Были созданы и проанализированы на активность ίη νίνο составные белки, включающие усеченную последовательность РСР21, соединенную с последовательностью Рс. Усеченные составные белки РСР21 были изготовлены посредством присоединения молекулы Рс 1§С1 или к Ν-концевому, или к Сконцевому участку усеченного белка РСР21 для образования целой непрерывной последовательности. Для различения между Ν-концевыми и С-концевыми слияниями составные белки РСР21, в которых молекула Рс была присоединена к Ν-концевому участку белка РСР21, будут обозначаться Рс-РСР21, а составные белки, в которых молекула Рс была присоединена к Ν-концевому участку белка РСР21, будут обозначаться РСР21-Рс.
Белок РСР21 обладает множеством видов биологической активности, включая способность понижать в крови уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина, уменьшать вес тела, а также улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии и чувствительность к инсулину. Для оценки активности РСР21 ίη νίνο полипептиды РСР21, мутантные полипептиды РСР21 и составные полипептиды РСР21 вводили инсулинорезистентным мышам оЬ/оЬ с последующим измерением способности определенного белка РСР21 понижать уровень глюкозы в крови. Тестируемый полипептид РСР21, мутантный полипептида РСР21 или составной полипептид РСР21 впрыскивали внутрибрюшинно 8-недельным мышам оЬ/оЬ Цаскюн ЬаЬогакгу) и после разовой инъекции брали у животных образцы крови в разных точках времени, например через 0, 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром ОпсТоиск (ЫГсБсап. 1пс. Милпитас, штат Калифорния) и результаты измерений выражали в виде процентного изменения уровня глюкозы по сравнению с начальным уровнем глюкозы в крови (т.е. в точке времени 0).
Результаты одного из экспериментов представлены на фиг. 4, которая отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у мышей, которым впрыскивали контрольный РВ§, контрольный Рс-РОР21 дикого типа с аминокислотными остатками 1-181 или усеченные составные белки Рс-РОР21, включающие аминокислотные остатки 5-181 или 7-181. Этот эксперимент продемонстрировал, что усеченные составные белки Рс-РОР21, включающие аминокислотные остатки 5-181 или 7-181 проявляют такую активность по снижению глюкозы в крови, которая сходна с активностью Рс-РОР21 дикого типа через 6 ч после инъекции. Таким образом, анализ действия усеченных полипептидов РСР21 ίη νί\Ό показал, что делеция до 6 аминокислот с Ν-конца зрелого РСР21 не влияет на биологическую активность молекулы. Однако анализ ίη νί\Ό также показал, что способность усеченных полипептидов РОР21 понижать уровень глюкозы в крови снижалась, при этом содержание глюкозы в крови возвращалось к исходному уровню через 24 ч после инъекции (для РОР21 дикого типа были получены сходные результаты). Было обнаружено, что короткая активность ίη νί\Ό является результатом протеолитического разрушения РОР21, как это описано в примере 8.
Результаты другого эксперимента представлены на фиг. 5, которая отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у мышей, которым впрыскивали контрольный РВ§, контрольный РОР21-Рс дикого типа с аминокислотными остатками 1-181, усеченный составной белок РОР21-Рс, включающий аминокислотные остатки 1-175, или усеченный белок Рс-РОР21, включающий аминокислотные остатки 1-171. Этот эксперимент продемонстрировал, что РОР21-Рс дикого типа, включающий аминокислотные остатки 1-181, обладает длительной активностью по снижению глюкозы, приводящую к снижению уровня глюкозы в крови приблизительно на 30% в промежутке времени от 24 до 120 ч после инъекции. Усеченный белок Рс-РОР21, включающий аминокислотные остатки 1-171, проявляет замедленную активность по снижению глюкозы в крови, которая очевидно проявляется только через 72 ч после инъекции. Однако наблюдаемая активность почти не отличается от активности РОР21-Рс дикого типа. Усеченный составной белок РОР21-Рс, включающий аминокислотные остатки 1-175, неак- 31 024751 тивен ίη νίνο в отношении снижения глюкозы в крови.
При совместном рассмотрении экспериментов с усечением, описанных в данном документе, было выявлено, что усеченные составные белки РСР21, имеющие ^концевое усечение, проявляют активность по снижению глюкозы в крови, которая сходна с составным белком РСР21 дикого типа, и далее, что усеченные составные белки РСР21, в которых молекула Рс была присоединена к ^концевому участку усеченного белка РСР21, более активны, чем составные белки, в которых молекула Рс была присоединена к С-концевому участку усеченного белка РСР21.
Пример 8. Наблюдаемое разрушение РСР21 ίη νίνο.
Разрушение РСР21, прежде всего, наблюдалось при использовании конструкций для составного белка РСР21 Рс, как это описано в примере 7. Фармакокинетический анализ ίη νίνο показал, что РСР21 человека имеет короткий период полувыведения у мышей, составляющий приблизительно 1 ч, что является следствием быстрого клиренса и разрушения ίη νίνο. Следовательно, для удлинения периода полувыведения РСР21 к N или С-концевому участку полипептида РСР21 присоединяли последовательность Рс. Однако присоединение участка Рс не полностью разрешает проблему полувыведения, поскольку составные белки РСР21, к N или С-концу которых присоединена последовательность Рс (и в особенности слияния Рс-РСР21, т.е. такие структуры, в которых последовательность Рс присоединена к Оконцу зрелого РСР21), не проявляют ожидаемой эффективности ίη νίνο, а вместо этого, согласно имеющимся данным, сохраняют активность по снижению глюкозы в крови у мышей οό/οό не более 24 ч. Как показано на фиг. 4, составные белки Рс-РСР21 снижали уровень глюкозы в крови приблизительно на 30-40% через 6 ч после инъекции, но через 24 ч содержание глюкозы в крови возвращалось к исходному уровню.
Впоследствии изучали протеолитическое разрушение РСР21 дикого типа, при этом было обнаружено, что быстрая потеря активности составных белков Рс-РСР21 ίη νίνο происходит в результате разрушения РСР21 ίη νίνο. Протеолитическое разрушение приводит к снижению биологической активности молекулы ίη νίνο, т.е. укорачивает эффективный период полувыведения, следовательно, такое разрушение отрицательно влияет на терапевтическое применение этой молекулы. В соответствии с этим, наблюдаемое разрушение составных белков РСР21 Рс привело к изучению протеолитического разрушения РСР21 ίη νίνο и к поиску таких мутантов РСР21, которые были бы устойчивы к подобному разрушению.
Для того чтобы определить сайты разрушения, были проведены анализ ЬС-Μδ и секвенирование по Эдману на РСР21 человека дикого типа и составных белках РСР21, наблюдаемых в разных точках времени после инъекции самцам мышей С57В6. Секвенирование по Эдману помогало подтвердить, подвергался ли ^концевой участок или С-концевой участок белка разрушению. Было обнаружено, что при слиянии последовательности Рс с ^концом РСР21 человека разрушение в пептиде происходило между аминокислотными остатками 151 и 152 и между аминокислотными остатками 171 и 172 человеческой части составной молекулы РСР21 (приведенная выше нумерация остатков основана на зрелой последовательности РСР21 и не включает участок Рс составного белка). Было обнаружено, что в первую очередь происходит разрушение в сайте 171-172, вслед за которым происходит разрушение в сайте 151-152. Разрушение в сайте 171-172, по-видимому, является стадией, которая определяет скорость процесса, т.е. играет роль в темпах полувыведения молекулы. Кроме того, было обнаружено, что, если последовательность Рс была присоединена к С-концу РСР21, разрушение в пептиде происходило в связке между аминокислотными остатками 4 и 5 и между аминокислотными остатками 20 и 21. В результате этих экспериментов было определено, что последовательность Рс, по-видимому, защищает от разрушения ту часть последовательности РСР21, которая примыкает к Рс. Далее анализ разрушения РСР21 дикого типа и составных белков Рс-РСР21 ίη νίνο был проведен на обезьянах суηοтο1§иδ. Эти исследования подтвердили, что сайт расщепления РСР21 в аминокислотных остатках 171-172 является мажорным сайтом разрушения у обезьян, причем этот сайт разрушения законсервирован между мышиными и приматами.
Пример 9. Идентификация мутантов РСР21, устойчивых к протеолизу.
Подходящие мутанты РСР21 были идентифицированы посредством определения в экспериментах тех положений в последовательности РСР21 дикого типа, которые являются сайтами мажорной протеолитической активности, после чего в эти сайты были внесены специфические аминокислотные замещения. Аминокислотные замещения были основаны на консервации последовательности РСР21 с другими биологическими видами (как это описано в примере 8) и биохимической консервации с другими аминокислотными остатками. Перечень аминокислотных замещений, которые были введены или могут быть внесены в белок РСР21 дикого типа, представлен в табл. 8, хотя табл. 8 является только примером, т.е. вполне возможны и другие замещения. Номера положений, представленные в табл. 8, соответствуют положениям остатков в зрелом белке РСР21, который состоит из 181 аминокислотного остатка.
- 32 024751
Таблица 8
Мутированные аминокислотные остатки в ΡΟΡ21
Пример 10. Анализ разрушения Ρο-ΡΟΡ21 и ΡΟΡ21-Ρο ίη νίνο.
Стабильность составных белков ΡΟΡ21 Ρс ίη νίνο определяли посредством впрыскивания мышам составного белка, взятия у этих мышей проб крови в разных точках времени и анализа сыворотки методом жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ЬС-М§). Более конкретно, мышам внутрибрюшинно впрыскивали 10 мг/кг Ρ^5)ΡΟΡ21 (экспрессированного в Е. тоП и очищенного, как описано в примере 2) или ΡΟΡ21(3)Ρс (экспрессированного в клетках млекопитающего и очищенного в соответствии со стандартными процедурами). Образцы крови от мышей получали через 6, 24 и 48 ч после инъекции (табл. 9) и собирали в пробирки с ΕΌΤΑ, предварительно обработанные коктейлями с ингибиторами протеаз (Κο^ Όί;·ι§ηοκΐΚκ). Плазму отделяли центрифугированием образцов на скорости 12000 д в течение 10 мин. Белки ΡΟΡ21 аффинно очищали от крови с использованием агарозной смолы против Ρс человека.
Таблица 9
Образцы ΡΟΡ21
Образец | Введенный белок | Взятие крови |
ϋό | РС-РОР21 | 6 часов |
ϋ24 | Рс-РОР21 | 24 часа |
048 | Рс-РОР21 | 48 часов |
Еб | РОР21-Рс | 6 часов |
Е24 | РОР21 -Рс | 24 часа |
Е48 | РОР2РРс | 48 часов |
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом ЬС-М§ в качестве эталона анализировали стандарты белков Ρο-ΡΟΡ21 и ΡΟΡ21-Ρ6. Белковые стандарты либо были редуцированы трис-[2карбоксиэтил] фосфином (ТСЕР), либо не были редуцированы. Редуцированные и не редуцированные стандарты анализировали методом ЬС-М§, используя колонку АСЕ циано 0,3 ммх30 см с распылением элюата в масс-спектрометрическую ионную ловушку БС'О Οακκχ. Поскольку развернутые спектры редуцированных образцов были чище, перед анализом ЬС-М§ аффинно очищенные образцы были редуцированы.
Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Ρ^5)ΡΟΡ21 и образцов Ό6, Ό24 и Ό48 показаны на фиг. 6Α-6Ό. Наблюдаемые массы редуцированного стандарта ЕОЕ21(3)Ес и образцов Е6, Е24 и Е48 показаны на фиг. 7Α-7Ό. Некоторые элюаты стандартов и образцов были подвергнуты секвенированию по Эдману для подтверждения Ν-конца белков и фрагментов в соответствии с определением в анализе ЬС-М§. Результаты анализа стандартов и образцов методом ЬС-М§ показаны в табл. 10.
- 33 024751
Таблица 10
Результаты анализа ЬС-Μδ и предсказанные фрагменты
Образец ГОГ21 | Основные наблюдаемые массы | Фрагмент | Интактный Ν- конец? |
Стандарт Рс(5)РОР21 | 45,339 Оа | 1-414 | Да |
Об | 45,338 Оа 44,317 0а | 1-414 1-404 | Да |
024 | 44,321 Оа | 1-404 | Да |
048 | 44,327 Оа 42,356 Оа | 1-404 | Да |
Стандарт РОР21(3)Р< | 46,408 Оа (гликозилированный, ООР | 1-410 | Да |
44,964 Оа (не гликозилированный) | 1-410 | ||
Е6 | 45,963 Оа (гликозилированный, ООР 44,516 Оа (не гликозилированный) | 5-410 5-410 | Нет |
Е24 | 45,963 Оа (гликозилированный, ООР 44,526 Оа (не гликозилированный) 44,130 Оа <Цусо.чу1а(еО, ООР) | 5-410 5-410 21-410 | Нет |
Е48 | 45,984 Оа 44,130 Оа 44,022 Оа | 5-410? 21-410 | Нет |
Как показано в табл. 10, все аффинно очищенные образцы демонстрировали некоторую степень разрушения только через 6 ч циркуляции. После 24-часовой циркуляции основной продукт Рс-РСР21 представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 1-404, что наблюдалось как в образцах Ό, так и в образцах Е. Однако в образцах Е основной продукт РСР21-Рс представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 5-410. В обоих протестированных составных белках РСР21 -часть составного белка была более чувствительна к разрушению, чем Рс-часть белка.
Пример 11. Изготовление и экспрессия мутантов и составных белков РСР21, устойчивых к протеолизу.
Конструкции, кодирующие мутанты РСР21, перечисленные в табл. 11, были получены посредством амплификации в ПНР вектора экспрессии РСР21 дикого типа, как описано ниже (конструкция вектора экспрессии РСР21 дикого типа описана в примере 1). Цель этих экспериментов заключалась в создании мутантов РСР21, которые устойчивы к протеолизу и проявляют удлиненный период полувыведения.
Таблица 11
Мутанты РСР21, устойчивые к протеолизу
Мутация (мутации) | Рс | Линкер |
К191 | ||
К.191 | СООН | 15 |
К19К | ||
К19К | СООН | 15 |
К19Ц | ||
К19Ц | СООН | 15 |
- 34 024751
К.19К, Υ20Η | ||
К19К, Υ20Η | СООН | 15 |
К19К, Ь211 | ||
К19К, 1.2] 1 | СООН | 15 |
К19К, Υ20Η, Е211 | ||
К19К, Υ20Η, Ь211 | СООН | 15 |
Υ20Ρ | ||
Υ20Ρ | СООН | 15 |
Υ20Η | ||
Υ20Η | СООН | 15 |
Υ20Ε | ||
Υ20ί | СООН | 15 |
Υ20Η, Ь211 | ||
Υ20Η, Ь211 | СООН | 15 |
Σ21Ι | ||
Ь2П | СООН | 15 |
Ь21Р | ||
Ь21Р | СООН | 15 |
Ь21У | ||
Ь21У | СООН | 15 |
1221Υ | ||
Ϊ.21Υ | СООН | 15 |
Υ22Ρ | ||
Υ22Ρ | СООН | 15 |
Υ22Ι | ||
Υ221 | СООН | 15 |
Υ22ν | ||
Υ22ν | СООН | 15 |
Р150А | ||
Р150А | ΝΗ2 | 15 |
Р150К | ΝΗ2 | 15 |
Р150А, 015ΙΑ | ||
Р150А, 0151А | ΝΗ2 | 15 |
- 35 024751
Р150А, 1152У | ||
Ρ150Α, 1152У | -ΝΗ2 | 15 |
Ρ150Α, 0151Α, 1152У | ||
Ρ150Α, 0151Α, 1152У | -ΝΗ2 | 15 |
0151Α | ||
0151Α | -ΝΗ2 | 15 |
0151У | ||
0151У | -ΝΗ2 | 15 |
0151Α, Ι152ν | ||
0151Α, 1152У | -ΝΗ2 | 15 |
Ι152Ρ | ||
Ι152Ρ | -ΝΗ2 | 15 |
Ι152Η | ||
Ι152Η | -ΝΗ2 | 15 |
11521. | ||
Ι152Ε | -ΝΗ2 | 15 |
1152У | ||
Ο170Α | ||
С170А | -ΝΗ2 | 15 |
О170С | ||
О170С | -ΝΗ2 | 15 |
Ο170Ώ | ||
0170ϋ | -ΝΗ2 | 15 |
С170Е | ||
Ο170Ε | -ΝΗ2 | 15 |
ΟΠΟΝ | ||
ΟΠΟΝ | -ΝΗ2 | 15 |
ОПОР | ||
ОПОР | -ΝΗ2 | 15 |
О170Ц | ||
С170Ц | -ΝΗ2 | 15 |
01705 | ||
01705 | -ΝΗ2 | 15 |
- 36 024751
О170Е, Р171А | ||
О170Е, Р171А | -ΝΗ2 | 15 |
О170Е, 51721. | ||
О170Е, 51721, | -ΝΗ2 | 15 |
С170Е, Р171А, 5172Ь | ||
С170Е, Р171А, 5172Б | -ΝΗ2 | 15 |
Р171А | ||
Р171А | -ΝΗ2 | 15 |
Р171С | -ΝΗ2 | 15 |
Р17ГО | -ΝΗ2 | 15 |
Р171Е | N112 | 15 |
Р171О | -ΝΗ2 | 15 |
Р171Н | -ΝΗ2 | 15 |
Р171К | -ΝΗ2 | 15 |
Ρ171Ν | -ΝΗ2 | 15 |
Р171Ц | -ΝΗ2 | 15 |
Р1715 | -ΝΗ2 | 15 |
Р171Т | -ΝΗ2 | 15 |
Р171\У | -ΝΗ2 | 15 |
Ρ171Υ | -ΝΗ2 | 15 |
Р171А, 5172Ь | ||
Р171А, 8172Е | -ΝΗ2 | 15 |
8172Б | -ΝΗ2 | 15 |
5172Т | ||
8172Т | -ΝΗ2 | 15 |
Ф173Е | ||
Ц173Е | -ΝΗ2 | 15 |
Ц173К | ||
Ц173К | -ΝΗ2 | 15 |
Мутантные конструкции РОР21 были изготовлены с применением праймеров, имеющих последовательности, которые гомологичны участкам, расположенным выше и ниже кодона (или кодонов), подлежащего мутированию. Праймеры, использованные в таких реакциях амплификации, также обеспечивали приблизительно 15 нуклеотидов перекрывающейся последовательности, что позволяло рециркуляризировать амплифицированный продукт, а именно весь вектор, теперь содержащий нужный мутант.
Типичная мутантная конструкция РОР21, кодирующая мутант РОР21, имеющий остаток глутаминовой кислоты в положении 170 вместо нативного остатка глицина (т.е. мутант О 170Е), была изготовлена с применением праймеров, показанных в табл. 12.
Таблица 12
Праймеры ПЦР для изготовления типичного мутанта РОР21
Праймер | Последовательность | 8ЕЦ ГО N0: |
Смысловой | 5-АТССТООААССТТСССАОООССОААОС-З' | 18 |
Антисмыслово! | 5’-ОСААООТТССАССАТОСТСАСАССОТСССА-3 | 19 |
Праймеры, показанные в табл. 12, рассчитаны на замену остатка глицина на остаток глутаминовой кислоты, как показано ниже, при этом первая последовательность представляет собой смысловой праймер (8ЕЦ ГО Ν0: 18), вторая и третья последовательности (8ЕЦ ГО Ν0: 20 и §ЕЦ ГО Ν0: 22) являются частями конструкции, экспрессирующей РОР21, а четвертая последовательность является антисмысловым праймером (8ЕЦ ГО Ν0: 21):
- 37 024751
51-АТССТССААССТТСССАССбССЕААСС
СТССТСССАСССТСТСАССАТССТСССАССТТСССАССССССААСССССА
САССАСССТССОАСАСТССТАССАСССТееААСеСТССССССТТСССССТ А6ССТСССАСАСТССТАССАССТТССААСС-3'
Конструкции мутанта РОР21 были изготовлены с применением, по существу, тех же условий ПЦР, что описаны в примере 1. Продукты амплификации были подвергнуты расщеплению рестрикционной эндонуклеазой Όρη1, а затем введены в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой. Составные белки Рс-РОР21 и РОР21-Рс были созданы в соответствии с описанием, приведенным в данном документе, например, в примере 6.
Мутанты РОР21 были экспрессированы посредством трансформации компетентных клеток ВЬ21 (ПЕ3) или ВЬ21 81аг Дпуйгодеп Карлсбад, штат Калифорния) конструкцией, кодирующей специфический мутант. Трансформанты выращивали в течение ночи с ограниченной аэрацией в среде ТВ с добавлением 40 мкг/мл канамицина, аэрировали на следующее утро и после короткого периода восстановления индуцировали в 0,4 мМ 1РТО. Мутантные полипептиды РОР21 собирали центрифугированием через 18-20 ч после индукции.
Мутанты РОР21 также анализировали на предсказанную иммуногенность. Иммунные реакции против белков усиливаются за счет процессинга антигена и его презентации в сайте связывания главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II. Это взаимодействие необходимо для помощи Т-клеток в созревании антител, распознающих белок. После того как были охарактеризованы сайты связывания молекул МНС класса II, стало возможным предсказание того, имеют ли белки специфические последовательности, которые способны связываться с серией распространенных аллелей человека. На основе литературных ссылок и структур кристаллов МНС класса II были созданы компьютерные алгоритмы, позволяющие определить, имеет ли линейная аминокислотная последовательность пептида потенциал для разрушения иммунотолерантности. Компьютерная программа ТЕРГГ0РЕ была использована для определения того, могут ли точковые мутации в конкретных мутантах РОР21 увеличить количество специфических Т-клеток у большинства людей. Основываясь на результатах анализа линейной белковой последовательности каждого мутанта РОР21, нельзя было предсказать усиление иммуногенности для какоголибо мутанта.
Пример 12. Влияние линкерной последовательности на разрушение РОР21.
Для того чтобы определить, влияет ли присутствие удлиненного аминокислотного линкера между последовательностью Рс и последовательностью РОР21 на разрушение РОР21, мышам впрыскивали составные белки РОР21, в которых участок Рс был отделен от последовательности РОР21 линкером из 15 аминокислот, имеющим последовательность ООООО8ООО8ОООО8 (8ЕЦ ГО N0: 23), после чего у мышей брали кровь в разных точках времени и проводили анализ сыворотки методом ЬС-М8. В частности, мышам впрыскивали Рс(15)РОР21 или РОР21(15)Рс (полученные из Е. сой) в дозе 23 мг/кг, образцы крови брали через 6, 24 и 48 ч, а взятую кровь аффинно очищали, используя агарозную смолу против Рс человека.
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом ЬС-М8 в качестве эталона анализировали стандарты белков Р, Рс(15)РОР21 и РОР21(15)Рс. Стандарты белков либо были редуцированы ТСЕР, либо не были редуцированы. Как редуцированные, так и не редуцированные стандарты анализировали методом ЬС-М8, используя колонку АСЕ циано 0,3 ммх30 см с распылением элюата в массспектрометрическую ионную ловушку ЬСЦ С1а881с. Поскольку развернутые спектры редуцированных образцов были чище, перед анализом ЬС-М8 аффинно очищенные образцы были редуцированы.
Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Рс(15)РОР21 и соответствующих аффинно очищенных образцов, взятых в разных точках времени, показаны на фиг. 8А-8И. Наблюдаемые массы редуцированного стандарта РОР21(15)Рс и соответствующих аффинно очищенных образцов, взятых в разных точках времени, показаны на фиг. 9А-9И. Некоторые элюаты стандартов и образцов были подвергнуты секвенированию по Эдману для подтверждения Ν-конца белков и помощи в предсказании идентичности фрагментов, наблюдаемых посредством ЬС-М8. Результаты анализа стандартов и образцов методом ЬСМ8, а также индикация предсказанных фрагментов показаны в табл. 13.
- 38 024751
Таблица 13
Результаты анализа ЬС-М§ и предсказанные фрагменты
Образец | Основные | Процентная доля | Фрагмент | Интактный Ν- |
ГСГ21 | наблюдаемые массы | от общей величины | конец? | |
Стандарт Рс(15)РОР21 | 46002 0а | 100% | 1-424 | Да |
Рс(15)РОР21 | 46000 0а | 65% | 1-424 | Да |
6 часов | 44978 Оа | 35% | 1-414 | |
Рс(15)РОР21 | 44978 Оа | 85% | 1-414 | Да |
24 часа | 43022 Оа | 15% | 1-394 | |
Рс(15)РОР21 | 44976 Оа | 60% | 1-414 | Да |
48 часов | 43019 Оа | 40% | 1-394 | |
Стандарт РСР21(15)Рс | 45999 Оа | 100% | 1-424 | Да |
РОР21(15)Рс 6 часов | 45870 Оа | 100% | 1 -423 | Да |
РОР21(15)Рс | 45869 Эа | 40% | 1 -423 | Несколько |
24 часа | 45301 Оа 43460 Оа | 35% 25% | 6-423 22-423 | |
РСР21(15)Рс | 45870 Оа | 15% | 1-423 | Несколько |
48 часов | 45297 Оа 43461Оа | 20% 65% | 6-423 22-423 |
Как показано в табл. 13, все аффинно очищенные образцы демонстрировали некоторую степень разрушения только через 6 ч циркуляции. После 24 ч циркуляции основными продуктами Рс(15)РОР21 были фрагменты, состоящие из аминокислотных остатков 1-414 (85% образца) и 1-394 (15% образца), а основными продуктами РОР21(15)Рс были фрагменты, состоящие из аминокислотных остатков 1-423 (40% образца), 6-423 (35% образца) и 22-423 (25% образца). Идентифицированные точки расщепления для белков Рс(15)РОР21 и РОР21(15)Рс показаны на фиг. 10А и 10В соответственно.
Пример 13. Активность устойчивых к протеолизу мутантов Рс(15)РОР21 ш У1уо через 1-7 дней после инъекции.
Как описано в данном документе, протеолитическое расщепление составных белков РОР21 Рс зависит от ориентации последовательности Рс, при этом окончание Рс составного белка более стабильно, чем окончание РОР21 составного белка (т.е. было обнаружено, что Ν-концевая часть составных белков РсРОР21 и С-концевая часть составных белков РОР21-Рс более стабильны). Например, расщепление было идентифицировано в положениях 5 и 21 белка РОР21-Рс и в положениях 151 и 171 белка Рс-РОР21.
В результате этих наблюдений было проведено исследование по идентификации мутантов РОР21, устойчивых к протеолизу. Анализ белков Рс-РОР21 методом ЬС-М§ показывает, что протеолитическое разрушение ш У1уо в первую очередь происходит между аминокислотными остатками 171-172 с последующим разрушением между аминокислотными остатками 151-152. Блокируя протеолитическое разрушение в положении 171, можно предотвратить разрушение в положении 151, что эффективно увеличивает период полувыведения молекулы. Однако устойчивые к протеолизу мутанты, у которых расщепление в положении 151 предотвращено, по-прежнему, могут обладать в положении 171 остатками, чувствительными к атаке протеазы, что приводит к потере молекулой 10 последних аминокислот, которые, как известно, вовлечены в связывание корецептора бета-клото, являющегося детерминантом аффинности рецептора к лиганду и мощности ш уйго и ш У1уо. Следовательно, мутационные изменения аминокислотных остатков, окружающих положение 171 в зрелом РОР21, по-видимому, более важны для улучшения стабильности ш У1уо, мощности и эффективности молекулы.
Активность отдельных мутантов Рс(15)РОР21, устойчивых к протеолизу ш У1уо, оценивали, впрыскивая внутрибрюшинно мутант РОР21 мышам оЬ/оЬ, затем у мышей брали образцы крови через 0, 0,25, 1, 3, 5 и 7 дней после инъекции и измеряли в образцах уровень глюкозы. Результаты одного из экспериментов показаны на фиг. 11, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВ§, контрольного Рс(15)РОР21 или таких мутантов Рс(15)РОР21, как Рс(15)РОР21 О170Е, Рс(15)РОР21 Р171А, Рс(15)РОР21 8172Ь, Рс(15)РОР21 О170Е/Р171А/§172Ь или Рс(15)РОР21 О151А. Фиг. 12 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Этот эксперимент демонстрирует, что мутанты Рс(15)РОР21 О170Е, Рс(15)РОР21 Р171А, Рс(15)РОР21 §172Ь и Рс(15)РОР21 О170Е/Р171А/§172Ь проявляют длительную активность по снижению уровня глюкозы в крови (до 5 дней), которая превосходит активность Рс-РОР21 дикого типа.
- 39 024751
Мутант Рс(15)Р0Р21 0151А лишь немного улучшал длительность активности по снижению уровня глюкозы в крови по сравнению с составным белком Рс-РОР21 дикого типа. Неожиданно было обнаружено, что, хотя мутант Рс(15)-РОР21 §172Ь неустойчив к протеолизу и, следовательно, имеет сходный профиль разрушения с полипептидом Рс(15)-РОР21 дикого типа, этот мутант демонстрирует улучшенную эффективность ш У1уо по сравнению с полипептидом Рс(15)-РОР21 дикого типа.
Результаты другого эксперимента представлены на фиг. 13, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВ8, контрольного ап Рс(15)РОР21 или таких мутантов Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)РОР21 Р150А/0151А/1152У, Рс(15)РОР21 О170Е, Рс(15)РОР21 О170Е/Р171А или Рс(15)РОР21 0170Е/8172Ь. Фиг. 14 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Как и в эксперименте, описанном выше, составной белок Рс-РОР21 дикого типа и мутант Рс(15)РОР21 Р150А/О151А/1152У не проявляли длительной активности по снижению уровня глюкозы в крови, возможно, вследствие того, что все еще могло происходить разрушение в сайте 171, а уровень глюкозы в крови животных, которым впрыскивали эти белки, возвращался к исходному не более чем через 24 ч после инъекции. Однако мутанты Рс(15)РОР21 О170Е, Рс(15)РОР21 О170Е/Р171А и Рс(15)РОР21 0170Е/8172Ь проявляли максимальную активность по снижению уровня глюкозы в крови до 5 дней после инъекции, что превосходит эффекты составного белка РсРОР21 дикого типа и мутанта Рс(15)РОР21 Р150А/О151А/1152У.
Результаты еще одного эксперимента показаны на фиг. 15, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВ8, или таких мутантов Рс(15)РОР21, как Рс(15)Р0Р21 0170Е, Рс(15)РОР21 О170А, Рс(15)РОР21 О170С, Рс(15)РОР21 Ο170Ό, Рс(15)РОР21 Ο170N или Рс(15)РОР21 01708. Фиг. 16 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Все мутанты Р0Р21, протестированные в этом эксперименту, проявляли длительную активность по снижению уровня глюкозы в крови (до 5 дней после инъекции).
Результаты еще одного эксперимента показаны на фиг. 17, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВ8 или таких мутантов Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 0170Е, Рс(15)Р0Р21 Р171Е, Рс(15)Р0Р21 Р171Н, Рс(15)Р0Р21 Р171р, Рс(15)Р0Р21 Р171Т, ог Рс(15)Р0Р21 Р171У. Фиг. 18 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Все мутанты Р0Р21, протестированные в этом эксперименте, демонстрировали улучшенную активность по снижению уровня глюкозы в крови при сопоставлении с Рс-Р0Р21 дикого типа.
Пример 14. Разрушение устойчивых к протеолизу мутантов Рс(15)Р0Р21 ш У1уо через 6-120 дней после инъекции.
Стабильность отобранных мутантов Р0Р21 ш У1уо анализировали, впрыскивая мышам мутант Р0Р21, после чего у мышей брали образцы крови в разных точках времени и проводили анализ сыворотки методом ЬС-М8. Более конкретно, мышам впрыскивали либо мутанты Рс(15)Р0Р21 0170Е, Рс(15)Р0Р21 Р171А, либо мутант Рс(15)Р0Р21 8172Б (полученные из Е. сой, как это описано в примере 2), причем каждый мутант перед инъекцией разбавляли приблизительно в 180 мкл 10 мМ НС1, а образцы крови брали через 6, 24, 48, 72 и 120 ч. Белки Р0Р21 аффинно очищали от крови, используя колонку с агарозной смолой против Рс человека. Образцы элюировали из колонки, используя 10 мМ НС1. Все конструкции Р0Р21 включали участок Рс и линкер из 15 аминокислот в аминоконцевой области белка Р0Р21. Мышам также впрыскивали контрольный Р0Р21 дикого типа.
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом ЬС-М8 в качестве эталона анализировали необработанный Р0Р21 дикого типа и необработанные мутанты Р0Р21. Все стандарты и образцы по точкам времени были редуцированы ТСЕР, а затем проанализированы методом ЬС-М8 с применением колонки АСЕ циано 0,3 ммх30 см и последующим распылением элюата в масс-спектрометрическую ионную ловушку БС’О С1а551с. Аффинно очищенные образцы были разбавлены ацетатом аммония, редуцированы ТСЕР, а затем проанализированы методом ЬС-М§, как описано выше.
Наблюдаемые массы Рс(15)Р0Р21 дикого типа через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 19Λ-19Ω соответственно. Наблюдаемые массы Рс(15)Р0Р21 0170Е через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 20А-20Э соответственно. Наблюдаемые массы Рс(15)Р0Р21 Р171А через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 21А-2ГО соответственно. Наблюдаемые массы Рс(15)Р0Р21 8172Ь через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 22А-22Э соответственно.
Было обнаружено, что все образцы, взятые через 72 и 120 ч, содержат компонент фибриногена высокого молекулярного веса (>200 кДа по результатам нередуцирующего анализа δΌδ-РАОЕ), который представлен намного обильнее, чем остальной составной белок Рс(15)Р0Р21. Результаты анализа ЬС-М8 для других стандартов и образцов представлены в табл. 14.
- 40 024751
Таблица 14
Результаты анализа ЬС-М§ и предсказанные фрагменты
Образец РСГ21 | Основные наблюдаемые массы | Процентная доля от общей величины | Фрагмент | Эдман |
Стандарт Рс(15)РОР21 | 45994 Оа | 100% | 1-424 | |
Рс(15)РОР21 λντ 6 часов | 46001 Па 44987 Оа | 80% 20% | 1-424 1-414 | Нет |
Рс(15)РОР21 АУТ 24 часа | 44979 Оа | -100% | 1-414 | Нет |
Рс(15)РОР21 ν/Τ 48 часов | 44980 Оа | -100% | 1-414 | |
Стандарт Рс(15)РОР21 О170Е | 46068 Оа | 100% | 1-424 | |
Рс(15)РСР21 01708 6 часов | 46078 Оа | 100% | 1-424 | Нет |
Рс(15)РОР21 О170Е 24 часа | 46074 Оа 45761 Оа | 80% 20% | 1-424 1421 | Нет |
Рс(15)РОР21 О170Е 48 часов | 46072 Оа 45760 Оа | -60% -40% | 1-424 1421 | Нет |
Стандарт Рс(15)РОР21 Р171А | 45970 Оа | 100% | 1-424 | |
Рс(15)РОР21 Р171А 6 часов | 45980 Оа | 100% | 1-424 | Нет |
Рс(15)РОР21 Р171А | 45973 Оа | -70% | 1-424 1- | Нет |
24 часа | 45657 Оа | -30% | 421 | |
Рс(15)РОР21 Р171А | 45992 Оа | -50% | 1-424 | Нет |
48 часов | 45673 Оа | -50% | 1-421 | |
Стандарт Рс(15)РОР21 8172Р | 46022 Оа | 100% | 1-424 | |
Рс(15)РОР21 3172Ь 6 часов | 46027 Оа | 100% | 1-424 | Нет |
Рс(15)РСР21 8172Ь 24 часа | 44984 Оа | 100% | 1-414 | Нет |
Рс(15)РСР21 5172Ь 48 часов | 44985 Оа | 100% | 1-414 | Нет |
Как показано в табл. 14, разрушение Рс(15)РОР21 дикого типа и мутанта §172Ь выглядят сходно в том отношении, что после 24 ч циркуляции основной продукт составного белка представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 1-414. Продукты разрушения мутантов Рс(15)РОР21 О170Е и Рс(15)РОР21 Р171А также выглядят сходно в том отношении, что образцы, взятые через 24 ч циркуляции, содержат 70-80% интактного белка (аминокислоты 1-424) и 20-30% фрагмента, состоящего из аминокислотных остатков 1-421.
Даже спустя 48 ч мутанты Рс(15)РОР21 О170Е и Рс(15)РОР21 Р171А все еще сохраняли интактный белок, но в то же время демонстрировали увеличение количества фрагментов, состоящих из аминокислотных остатков 1-421. Как наблюдалось в предыдущих анализах конструкций Рс-РОР21, выявлялось разрушение компонента РОР21 составного белка, а компонент Р оставался стабильным. Сайты расщепления, идентифицированные для белка дикого типа, Рс(15)РОР21 О170Е, Рс(15)РОР21 Р171А и
- 41 024751
Рс(15)РОР21 8172Ь, показаны на фиг. 23Ά-23Ό соответственно.
Пример 15. Идентификация мутантов РСР21 с пониженной агрегацией.
Одним из свойств Р0Р21 дикого типа является склонность к агрегации. Мутанты РОР21 с пониженной агрегацией были выявлены на основе двух гипотез. Первая гипотеза заключается в том, что применительно к Р0Р21 агрегацию (или димеризацию) запускают гидрофобные взаимодействия и ваандервальсовы взаимодействия между молекулами РОР21, вызванные гидрофобными остатками, которые подвергаются воздействию гидрофильной водоосновной среды растворителя. Вторая гипотеза заключается в том, что эти открытые гидрофобные остатки могут быть замещены для создания вариантов точковых мутаций с пониженной агрегацией без нарушения активности РОР21.
Для идентификации открытых гидрофобных остатков в РОР21 был использован системный рациональный подход белковой инженерии. Поскольку не были известны рентгеновские или ЯМР-структуры РОР21, которые можно было бы использовать для идентификации открытых гидрофобных остатков, для создания трехмерной модели гомологии РОР21 с применением компьютерной программы моделирования МОЕ (молекулярная операционная среда, Скешюа1 Сошрийид Огоир, Монреаль, Квебек, Канада) была использована рентгенокристаллическая структура РОР19 (ΙΡνΆ) высокого разрешения (1,3 Ά), полученная из банка данных по белкам (ΡΌΒ). В качестве матричного шаблона был выбран РОЕ 19, поскольку среди белков, депонированных в ΡΌΒ, именно РОЕ 19 является белком, наиболее родственным РОР21 по гомологии аминокислотной последовательности. Доступность для растворителя была рассчитана следующим способом с применением программы МОЕ. Первое измерение площади поверхности (8А1) было определено как доступная площадь поверхности остатков в Ά2. Наряду с тем что определенный аминокислотный остаток появляется в первичной последовательности белка много раз, каждое появление остатка может иметь разную площадь поверхности вследствие различий, среди всего прочего, в близости остатка к поверхности белка, в ориентации боковой цепи остатка и в пространственном расположении прилегающих аминокислотных остатков. Следовательно, проводят второе измерение площади поверхности (8А2), в котором представляющий интерес остаток извлечен из структуры белка наряду с его окружением, т.е. прилегающими остатками. Эти пространственно прилегающие остатки виртуально мутировали в глицины, чтобы удалить их боковые цепи, а затем вычисляли 8Л2 для представляющего интерес остатка, получая размер общей площади поверхности для этого остатка в его специфической конформации. Затем, вычисляя отношение 8А1 к 8А2 (8А1/8А2), можно получить процентный показатель возможной площади поверхности для того остатка, который фактически открыт.
Для дальнейшего анализа были отобраны несколько гидрофобных остатков, которые в значительной степени открыты для растворителя, и в этих остатках осуществлены виртуальные мутации с их заменой на другие встречающиеся в природе аминокислотные остатки. Изменения термостабильности белка, происходящие в результате различных замещений, были рассчитаны на модели РОР21 с применением интерактивной сетевой версии программы СИР8АТ (Со1одие Ишуегкйу Рго1еш 81аЫ1Пу Аиа1ук1к Тоо1к [Инструменты кельнского университета для анализа стабильности белков]) в соответствии с инструкциями, представленными на веб-сайте СИР8АТ; см. РайЫЬаи е1 а1., 2006, Иис1ею АсМк Кек. 34: \У239-42; РайЫЬаи е1 а1., 2007, ВМС 81гис1. Вю1. 7:54. При конструировании вариантов точковых мутаций для снижения агрегации были исключены значительно дестабилизирующие или гидрофобные мутации. В качестве кандидатов на роль мутантов РОР21 с пониженной агрегацией рассматривались стабилизирующие (или, в редких случаях, немного дестабилизирующие) замещения, которые приводят к улучшению гидрофильных и/или ионных характеристик.
Сводка данных, полученных через этот рациональный подход белковой инженерии, представлена в табл. 15, где также перечислены типичные мутанты РОР21 с ожидаемой пониженной склонностью к белковой агрегации и улучшенной стабильностью.
- 42 024751
Таблица 15
Расчетное влияние мутантов РОР21 на стабильность
№ остатка | остаток ХУТ | Мутация | Стабилизация (ккал/моль) |
26 | А | К Е К | 1,25 1,54 2,016 |
45 | А | т <2 к Е К | 0,66 0,71 1,8 2,34 1,59 |
52 | Ь | т | -0,33 |
58 | Ь | о 5 с Е | 0,16 -0,15 1,0 0,08 |
60 | Р | А К Е К | 1,3 1,51 0,66 1,31 |
78 | Р | А С К н | 0,14 2,48 0,08 0,13 |
- 43 024751
86 | Ь | Т С | ОД 8 4,1 |
88 | Р | А 5 К Е | 2,52 3,08 2,88 1,48 |
98 | ь | Т <3 к с Е К. | 0,49 0,17 -0,19 3,08 0,84 3,4 |
99 | ь | С Е ϋ К | 7,34 2,0 1,01 1,61 |
Ш | А | т к | 0,47 -0,12 |
129 | А | <3 к N Е ϋ К н | 3,93 1,02 3,76 3,01 3,76 1,68 2,9 |
134 | А | к Υ Е К н | 5,37 4,32 5,13 6,18 2,86 |
Пример 16. Изготовление и экспрессия мутантов и составных белков РСР21 с пониженной агрегацией.
Конструкции, кодирующие мутанты РСР21, которые перечислены в табл. 16, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии РСР21 дикого типа, как описано в примере 11 (конструкция вектора экспрессии РСР21 дикого типа описана в примере 1). Составные белки были изготовлены, как описано в данном документе, в частности, в примере 6.
- 44 024751
Таблица 16
Мутанты ΡΟΡ21 с пониженной агрегацией
Мутация (мутации) | Рс | Линкер |
А26Е | ||
А26К | ||
А26К. | ||
А45Е | ||
А45К | ||
А45К | -ΝΗ2 | 15 |
А45К | -ΝΗ2 | 15 |
А45<2 | -ΝΗ2 | 15 |
А45Т | -ΝΉ2 | 15 |
А45К, Ь98К | -ΝΗ2 | 15 |
52Т | ||
Ь58С | ||
Ь58Е | ||
Ь58О | ||
Ь585 | ||
Р60А | ||
Р60Е | ||
Р60К | ||
Р60К | ||
Р78А | ||
Р78С | ||
Р78Н | ||
Р78К | ||
Е86С | ||
Ь86Т |
- 45 024751
Агрегацию разных белков РСР21, включая РСР21 дикого типа, усеченные полипептиды РСР21, мутанты РСР21 и составные белки РСР21, оценивали посредством эксклюзионной хроматографии ^ЕС). Анализируемые образцы инкубировали при 4°С, комнатной температуре или 37°С в течение разного времени, а затем подвергали анализу методом δΕС. Эксперименты проводили в системе ОТЬС Βесктаη, оснащенной колонкой δΕС. Для РСР21 дикого типа использовали колонку Τ0δ0ΗΑΑδ ΤδК-СеI С2000 δΕС с 2χΡΒδ, содержащую 2% изопропиловый спирт в мобильной фазе. Для составных белков РСР21 Рс и мутантных полипептидов РСР21 использовали колонку Τ0δ0ΗΑΑδ ΤδК-СеI С3000 δΕС с 2χΡΒδ в мобильной фазе.
Пример 17. Активность ίη νίΐτο мутантов РСР21 с пониженной агрегацией.
Были проведены эксперименты по идентификации мутантов с пониженной агрегацией, которые сохраняют активность РСР21 дикого типа в анализе на ЕЬК-люциферазу ίη νίΐτο. Анализы на ЕЬКлюциферазу проводили, как это описано в примере 4. На фиг. 24А-24С показаны результаты анализа на активность ЕЬК-люциферазы, проведенного на таких мутантах РСР21, как РСР21 Ь99К, РСР21 Ь99И и РСР21 А111Т (фиг. 24А), на таких мутантах РСР21, как РСР21 А129И, РСР21 А129Ц и РСР21 А134К (фиг. 24В) и на таких мутантах РСР21, как РСР21 Α134Υ, РСР21 А134Е и РСР21 А129К (фиг. 24С). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что некоторые из мутантов с пониженной агрегацией не проявляют отрицательного влияния на активность РСР21 по результатам анализов на ЕЬК-люциферазу.
Пример 18. Изготовление и экспрессия комбинированных мутантов Рс(15)РСР21, демонстрирующих удлиненное полувыведение и пониженную агрегацию.
Были изготовлены и конъюгированы с молекулами Рс 1дС1 многие комбинированные мутанты
- 46 024751
РСР21, демонстрирующие пониженную агрегацию и удлиненный период полувыведения за счет подрыва протеолитического разрушения. Эти мутанты РСР21 были изготовлены, по существу, как это описано в примере 11.
Пример 19. Исследования ш уйго по изучению мутантов Рс(15)РСР21, демонстрирующих удлиненное полувыведение и пониженную агрегацию.
Были проведены эксперименты по идентификации комбинированных мутантов РСР21, которые сохраняют активность РСР21 дикого типа в анализе на ЕЬК-люциферазу ш уйго. Анализа на ЕЬКлюциферазу проводили, как это описано в примере 4.
На фиг. 25Λ-25Ό показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на таких мутантах Рс-РСР21, как Рс-РСР21 Р171С, Рс-РСР21 Р17ГО и Рс-РСР21 Р171Т (фиг. 25А), на таких мутантах Рс-РСР21, как Рс-РСР21 Р171У, Рс-РСР21 Р171№ и Рс- РСР21 Р171С (фиг. 25В), на таких мутантах Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 А45К/С170Е и РСР21 А45К (фиг. 25С) и на таких мутантах Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 Р171Е и Рс(15)РСР21 А45К/С170Е (фиг. 25Ό). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что мутации, направленные на улучшение стабильности или как стабильности, так и растворимости, не теряют активность ш уйго по сравнению с Рс-РСР21 дикого типа. Интересно, что мутант РСР21 А45К продемонстрировал более высокую мощность по сравнению с Рс-РСР21 дикого типа.
На фиг. 26А показано процентное изменение агрегации для контрольного РСР21 (\УТ) и мутанта РСР21 А45К после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 2 и 4 дней. Данные показывают, что мутация А45К приводит к снижению агрегации мутантного белка по сравнению с белком дикого типа.
Фиг. 26В показывает процентное изменение агрегации для контрольного РСР21 (^Т), а также таких мутантов РСР21, как Р78С, Р78К, Ь86Т, Ь86К, Ь98С, Ь98К, А111Т, А129Э, А129Ц, А129К, А134К, А134У и А134Е после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 6 и 10 дней. Данные показывают, что мутации Ь86К, Ь98С, Ь98К, А111Т, А129Ц и А129К приводят к снижению агрегации мутантного белка по сравнению с белком дикого типа.
Фиг. 27 показывает результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на контрольном РСР21 человека и на таких мутантах РСР21, как РСР21 А45К, РСР21 Ь52Т и РСР21 Ь58Е. Этот эксперимент демонстрирует, что мутант РСР21 А45К сохраняет полную эффективность РСР21 дикого типа и проявляет даже большую мощность по сравнению с РСР21 дикого типа. Однако мутанты РСР21 Ь52Т и РСР21 Ь58Е показывают меньшую мощность и эффективность по сравнению с РСР21 дикого типа.
На фиг. 28А, 28В показано изменение уровня агрегации для таких мутантов Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР216-181/С170Е, Рс(15)РСР21 А45К/С170Е, Рс(15)РСР21 Р171Е, Рс(15)РСР21 Р171А, Рс(15)РСР21 С170Е и контрольного РСР21 после их инкубации при 4°С в течение 1, 4 и 8 дней. Этот эксперимент демонстрирует, что после 8-дневного периода мутант Рс(15)РСР21 А45К/С170Е проявлял меньшую агрегацию по сравнению с мутантами Рс(15)РСР21 С 170Е или Рс(15)РСР21 Р171Е, но все три мутанта проявляли меньшую агрегацию по сравнению с контрольным Рс(15)РСР21. Табл. 17 показывает процентную величину агрегации, полученную для контрольного Рс-РСР21 и мутанта Рс-РСР21 А45К/С170Е после инкубации при 4°С или при комнатной температуре (КТ) в течение 0, 2, 3, 4 или 7 дней.
Таблица 17
Процентная величина агрегации для Рс-РСР21 и мутанта Рс-РСР21
Образец | день 0 | день 2 | день 3 | день 4 | день 7 | |
РС-РОР21 \УТ 32 мг/мл | 4°С | 1Д2 | 1,71 | 1,89 | 2,14 | 2,32 |
КТ | 1Д2 | 6,09 | 7,94 | 9,57 | 12,59 | |
Рс-РОР21 А45К/О170Е 33 мг/мл | 4°С | 0,45 | 0,77 | 0,88 | 1,03 | 1,24 |
КТ | 0,45 | 3,86 | 5,22 | 6,62 | 8,60 |
Пример 20. Изготовление и экспрессия комбинированных составных мутантов Рс-РСР21.
Как описано выше, стабильность и растворимость РСР21 можно модулировать при внесении специфических усечений и аминокислотных замещений. В дополнение к этому, стабильность РСР21 можно дополнительно увеличить за счет соединения таких модифицированных белков РСР21 с участком Рс гена иммуноглобулина человека 1дС1. Кроме того, комбинируя вышеуказанные модификации, можно создать молекулы РСР21, обладающие как улучшенной стабильностью, так и улучшенной растворимостью. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих комбинированные мутанты РСР21, перечисленные в табл. 18, были изготовлены по методикам, описанным выше.
- 47 024751
Таблица 18
Комбинированные мутанты Р0Р21
Аминокислотные остатки | Мутация, направленная на устойчивость к протеолизу | Мутация, направленная на уменьшение агрегации | Рс | Линкер |
1-181 | О170Е | А45К | -ΝΗ2 | 15 |
1-181 | О170Е | Ь98К | -ΝΗ2 | 15 |
1-181 | О170Е | А45К, Ь98К | -ΝΗ2 | 15 |
1-181 | Р171О | А45К | -ΝΗ2 | 15 |
1-181 | Р1718 | А45К | -ΝΗ2 | 15 |
1-181 | Р171О | щеп | -ΝΗ2 | 15 |
1-181 | Р1715 | Ь98Я | -ΝΗ2 | 15 |
1-181 | Р171С | А45К, Ь98К | -ΝΗ2 | 15 |
1-178 | С170Е | -ΝΗ2 | 15 | |
6-181 | С170Е | -ΝΗ2 | 15 | |
6-181 | О170Е | А45К | -ΝΗ2 | 15 |
6-181 | О170Е | Е98К | -ΝΗ2 | 15 |
6-181 | Р171О | -ΝΗ2 | 15 |
6-181 | Р171О | Е98К | -ΝΗ2 | 15 |
7-181 | С170Е | -ΝΗ2 | 15 |
На фиг. 29 показаны результаты измерения уровня глюкозы в крови у мышей, которым впрыскивали такие комбинированные мутанты Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 А45К/0170Е, Рс(15)Р0Р21 А45К/Р1710 или Рс(15)Р0Р21 Б98К/Р1710.
В другом эксперименте такой мутант Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 Б98К/Р1710 исследовали параллельно со зрелым Р0Р21 и Рс-Р0Р21 дикого типа. В одном из экспериментов рекомбинантные клетки линии 293Т культивировали в присутствии разных концентраций Р0Р21, Рс-Р0Р21 или Рс-Р0Р21Ь98К/Р1710 в течение 6 ч. Затем клеточные лизаты анализировали на активность люциферазы. Как показано на фиг. 30, Рс-Р0Р21 Б98К/Р1710 имел сходную активность с Рс-Р0Р21, а это указывало на то, что внесение двух точковых мутаций не изменяет активность молекулы ш νίΙΐΌ.
Еще в одном эксперименте стабильность Рс-Р0Р21 Б98К/Р1710 в концентрации 65 мг/мл оценивали в течение девяти дней при двух разных температурах, а именно при комнатной температуре и при 4°С, параллельно с Р0Р21 и Рс-Р0Р21. По окончании периода инкубации клеточные лизаты анализировали методом 8ЕС-НРЬС для определения профиля агрегации по времени при разных температурах. Данные, показанные на фиг. 31А и 31В, свидетельствуют о том, что скорость формирования агрегатов значительно снижалась для мутанта Рс-Р0Р21 Б98К/Р1710 при комнатной температуре (закрашенные треугольники, пунктирная линия на фиг. 31А) и при 4°С (закрашенные треугольники, пунктирная линия на фиг. 31В).
Пример 21. Устойчивые к протеолизу мутанты Р0Р21, содержащие С-концевые мутации.
Также проводили исследования стабильности комбинированных мутантов ш νί\Ό. В частности, стабильность ш νί\Ό мутанта Рс-Р0Р21 Б98К/Р1710 сравнивали со стабильностью Рс-Р0Р21 в мышиной модели и модели супото1див. На обоих биологических видах были получены сходные результаты. В исследовании на обезьянах супото1ди8 белки Рс-Р0Р21 Б98К/Р1710 и Рс-Р0Р21 впрыскивали внутривенно в дозе 23,5 мг/кг, после чего собирали аликвотные пробы сыворотки и плазмы в разных точках времени до 840 ч после введения дозы. Анализировали точки времени до 168 ч. Образцы для разных точек времени аффинно очищали с применением реактивов против Рс, а затем анализировали методом массспектометрии МАЬИ1. Сравнение результатов двух анализов выявило хорошую корреляцию между ними.
При анализе данных, полученных способом иммуноаффинность-МАЬИД было обнаружено, что в результате мутации Р171 в Р1710 обрезание молекулы Рс-Р0Р21 Б98К/Р1710 в сайте Р171 элиминировалось. Однако для мутанта Рс-Р0Р21 Б98К/Р1710 наблюдалось минорное и медленное разрушение, приводящее к утрате до трех С-концевых остатков (фиг. 32). Минорные расщепления в трех С-концевых остатках также наблюдались для других мутантов Р0Р21 после того, как более чувствительный сайт расщепления между аминокислотными остатками 171 и 172 был заблокирован, как это показано на фиг. 20 и 21. Расщепление трех С-концевых остатков может представлять остановку отщепления от Сконцевого участка молекулы карбоксипептидазой последовательным (от остатка к остатку) образом или специфическую атаку протеазы в аминокислотных остатках 178 и 179 с неспецифическим расщеплением
- 48 024751 в аминокислотных остатках 179-180 и 180-181. Утрата 2-3 аминокислот на С-конце может вызывать уменьшенное связывание бета-клото и, в конечном итоге, снижение мощности и уменьшение активности молекулы ίη νίνυ; см., например, У1е е1 а1., 2009, РЕВ§ Ьей. 583:19-24. Для адресного анализа очевидного разрушающего эффекта карбоксипептидазы на С-конце исследовали влияние добавления колпачка аминокислотного остатка к различным мутантным полипептидам РСР21. С применением методик, описанных в данном документе, были изготовлены и проанализированы многие конструкции, включая те, что представлены в табл. 19. Табл. 19 приводит сводку результатов анализа на ЕЬК-люциферазу ίη νίΐΐΌ.
Подходящие аминокислотные колпачки могут иметь длину от 1 до 15 аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 10 или 15 аминокислот. В колпачке может быть использовано любое число аминокислот любого типа, например один остаток пролина, один остаток глицина, два остатка глицина, пять остатков глицина, а также другие комбинации. Дополнительные примеры колпачков представлены в непосредственном примере и в табл. 19.
В дополнение к этому, для адресного анализа очевидной атаки протеазы в аминокислотных остатках 178 и 179 исследовали мутации аминокислотных остатков в положениях 179, 180 и 181. И вновь с применением методик, описанных в данном документе, были изготовлены и проанализированы многие конструкции, включая те, что представлены в табл. 19. Также исследовали влияние комбинаций колпачка и мутаций в этих сайтах. Табл. 19 приводит в сводном виде типичные конструкции, которые были изготовлены и проанализированы ίη νίΙΐΌ на активность ЕЬК-люциферазы способом, который описан в данном документе. В соответствии с терминологией, использованной в данном документе, НЕс означает последовательность Рс человека (например, 8ЕО ГО ΝΟ: 13), Ь15 относится к линкеру, имеющему 15 аминокислотных остатков (например, 8ЕО ГО ΝΟ: 23).
- 49 024751 икациями
Таблица 19
Эффективность и значения ЕС50 для полипептидов РСР21 с С-концевыми модис
Конструкции
Эффективность
ЕС50(нМ)
киР0Р21 | 0,4 | 100,0 % |
кРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710) | 2,5 | 76,1 % |
кРс.Е15.кРСР21(Е98К, Р1710, Υ179Ρ) кРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710,1-180) кРс.Е15.ЬРСР21(Е98К, Р1710,1-179) кРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710, А180Е) кРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710, 3181К) | 2,6 | 78,3 % |
7,8 | 77,4 % | |
Ε9 | 79,6% | |
130 | 87,9 % |
0808030505.1,РОР21.Е15.кРс
ΜΚΕΟϋ .НРОР21 .Ь15.ЬРс кРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710,3181Р, Р182) НРс.Ы5.ЬРСР21(Е98К, Р171О, А180С) ЬРс.Ы5.НРОР21(Ь98К, Р171О, 81810) ЬРе.Е15.кРОР21(Е98К, Р171О,1-182) кРОР21(Е98К, Р1710, 0182) кРс.Е15.кРОР21 (Е98К, Р1710, Υ179Ρ) кРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710, Υ179Ο) ЬРс.И5кРОР21(Е98К, Р171О, Υ1798) кРс.Е15.кРСР21(Е98К, Р1710, Υ179Α) ЬРс.И5.ЬРОР21(Е98К, Р171О,3181Т) кРс.Е15.кРСР21(Е98К, Р171О, 3181А) кЕсЫ 5.кРОР2)(Е98К, Ρ17ΙΟ, 5181Б) кРсЪ 15.НРОР21 (Е98К, ΡΙ710, 5181Р) кРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710, А180Р) кРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710, А1805)
НРОР21 (Б98К, Р1710,00000182-6) ЬРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710, Р182) кРс.Е15.кРОР21(Е98К, Р1710,0182) кРс.Е15.кРОР21(1-178, Б98К, Р171О) кРс.Е15.кРОР21(Е98К., Р1710, 00182-3) кРс.Е15.ЬРОР21(Е98К, Р1710, ООООО182-6)
834 | 83,1 % |
272 | 69,9% |
3,25 | 76,9 % |
3,43 | 77,3 % |
428 | 44,4% |
61 | 82,6 % |
25,3 | 74,8 % |
43,2 | 79,6% |
3,07 | 77,6% |
2,66 | 73,5% |
3,46 | 72,6 % |
33,8 | 79,5 % |
617 | 77,! % |
2,18 | 84,7 % |
6,1 | 85,9% |
6,5 | 71,1 % |
167 | 63,9 % |
1941 84,2%
4307 99,7%
На фиг. 33 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических мышей 6Ь/6Ь (фон С57В6), которым впрыскивали контрольный ΡΒδ, нативный РСР21 дикого типа, РсРСР21 (Ь98К, Ρ1710) и две закрытые колпачками молекулы, к С-концевому участку которых был добавлен или остаток пролина, или остаток глицина, т.е. Рс-РСР21 (Ь98К, И171С. 182Р) и Рс-РСР21 (Ь98К, И171С. 182С). В непосредственном примере, когда остаток добавляли к С-концу полипептида РСР21 дикого типа или мутантного, остаток упоминается в том положении, которое он занимает в результирующем белке. Так, обозначение 182С указывает на то, что остаток глицина присоединен к Сконцевому остатку 181 зрелого полипептида дикого типа или мутанта. Фиг. 33 показывает, что нативный РСР21 снижал уровень глюкозы в крови в течение 6 ч, тогда как три изученных мутанта Рс-РСР21 демонстрировали длительную активность по снижению глюкозы в крови в течение как минимум 120 ч. Белок Рс-Р СР21 (Ь98К, И171С. 182Р), молекула которого включала добавление остатка пролина на Сконце компонента РСР21 составного белка, оказался наиболее мощным и приводил к самому низкому уровню глюкозы в крови по сравнению с Рс-РСР21 (Ь98К, Ρ171Ο и Рс-РСР21 (Ь98К, И171С. 182С).
В последующем эксперименте изучали активность ίη νίνο молекул Рс-РСР21 (Ь98К, И171С. 182С) и Рс-РСР21 (Ь98К, И171С. 182Р), сопоставляя ее с активностью ίη νίνο закрытой колпачком молекулы, которая включала два остатка глицина, добавленных на С-конце, а именно Рс-РСР21 (Ь98К, И171С, 182С
- 50 024751
183С). Фиг. 34 показывает результаты этого эксперимента. Фиг. 34 отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у мышей оЬ/оЬ, которым впрыскивали контрольный РВ8, РсРСР21 (Ь98К, Р171С), Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, 182С 183С), Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, 182С) и Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, 182Р).
Как показано на фиг. 34, все исследованные молекулы демонстрировали длительную активность по снижению глюкозы при сравнении с контрольным РВ8. Этот эксперимент подтвердил предыдущие результаты (фиг. 33), свидетельствующие о том, что Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, 182Р) с добавлением пролина на С-конце демонстрирует немного большую активность по снижению уровня глюкозы при сравнении с молекулой без пролинового колпачка, например Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С). Однако оказалось, что добавление двух остатков глицина на С-конце, например Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, 182С 183С), снижает мощность молекулы ίη νί\Ό и уменьшает длительность эффекта ίη νί\Ό по снижению уровня глюкозы.
На фиг. 35 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических мышей 6Ь/6Ь (фон С57В6), которым впрыскивали контрольный РВ8 или такие мутантные полипептиды РСР21 как Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С), Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, Υ 1798), Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, Υ179Α), Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, А1808) и Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180С). Все мутанты продемонстрировали сходную активность по снижению уровня глюкозы, а также сходную длительность эффекта.
Фиг. 36 отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических мышей 6Ь/6Ь (фон С57В6), которым впрыскивали контрольный носитель, Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С), РсРСР21 (Ь98К, Р171С, Υ179Р) и Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е). По сравнению с белком Рс-РСР21 (Ъ98К, Р171С) белок Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, Υ 179Р) был менее эффективен в понижении уровня глюкозы в крови. Однако Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е), в котором было произведена мутационная замена аланина на глутаминовую кислоту в положении 180, оказался более эффективным, чем Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С) и вызывал дополнительное снижение уровня глюкозы на 20% по сравнению с Рс-РСР21 (Ь98К, Р171С). Эти данные позволяют предположить, что мутация А180Е может детерминировать уменьшенное С-концевое разрушение ίη νί\Ό, то есть улучшенную мощность и эффективность молекулы ίη νί\Ό.
Пример 22. Исследование на обезьянах резус.
С применение методологии, описанной в данном документе, была создана конструкция Рс-ликерРСР21. Эта конструкция включала последовательность Рс 1дС1 (8ЕЦ ГО N0: 13), соединенную на Сконце с линкерной последовательностью (С1у)5-§ег-(С1у)3-§ег-(С1у)4-§ег (8ЕЦ ГО N0: 23), которая далее была присоединена на С-конце к Оконцу зрелой последовательности РСР21 (8ЕЦ ГО N0: 4) с двумя внесенными в последнюю мутациями, Ь98К и Р171С. Затем эта конструкция была экспрессирована и очищена, как описано в данном документе, и была выделена в димерной форме белка, каждый мономер которого был сцеплен через межмолекулярные дисульфидные связи между участками Рс каждого мономера. Эта молекула упоминается в непосредственном примере как Рс-РСР21(КС), имеет аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО N0: 36 и кодируется последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 37. В этом примере обозначение РСР21 относится к зрелой форме РСР21, а именно к §ЕЦ ГО N0: 4.
22.1. Схема исследования.
Конструкцию Рс-РСР21(КС) вводили хронически и подкожно (8С) самцам обезьян резус без диабета и с индексом массы тела (ВМ1) > 35. Две других группы обезьян (η=10 на группу) получали либо зрелый РСР21 (т.е. 8ЕЦ ГО N0: 4), либо контрольный носитель.
Перед началом введения любого испытуемого соединения животные проходили акклиматизацию в течение 42 дней, а затем их делили на группы численностью по 10 особей и вводили посредством множественных 8С инъекций испытуемые соединения или контрольное вещество по принципу слепого исследования, как это отображено графически на фиг. 37. Вкратце, каждому животному делали в день одну инъекцию испытуемого соединения или носителя. РСР21 вводили ежедневно, тогда как Рс-РСР21(КС) вводили еженедельно. Дозы Рс-РСР21(КС) и РСР21 повышали каждые 2 недели, как это показано на фиг. 37. По ходу всего исследования контролировали вес тела и потребление пищи. Научноисследовательская организация, работающая по контракту (СК0) не была осведомлена о проводимом лечении.
Перед началом лечения проводили два пероральных теста на толерантность к глюкозе (0СТТ). Результаты 0СТТ1 использовали для разделения животных на три равноценные группы, основываясь на равномерном распределении по таким признакам как площадь под кривой (АИС) и вес тела.
Результаты второго 0СТТ (0СТТ2) использовали для подтверждения сортировки по итогам первого 0СТТ (0СТТ1). Те обезьяны, для которых профиль 0СТТ, полученный в первом тесте (0СТТ1), отличался от профиля, полученного в следующем тесте (0СТТ2), были исключены из исследования. Результаты 0СТТ1 и 0СТТ2 показаны на фиг. 38А и 38В, а результаты измерений АИС показаны на фиг. 38С. Исходный вес тела показан на фиг. 38Ό и в табл. 20.
0СТТ 3, 4 и 5 проводили через каждые 2 недели по окончании лечения каждой из трех доз (низкой, средней и высокой). Образцы крови от животных собирали натощак еженедельно и использовали их для измерения уровней глюкозы, инсулина, триглицеридов, а также уровня испытуемого соединения. Образца крови также собирали еженедельно в течение 3-недельного периода отмывания. Начальные результаты 0СТТ1 и 0СТТ2 показали ожидаемый профиль глюкозы у здоровых животных с максимальным
- 51 024751 уровнем глюкозы в плазме через 30 мин и продемонстрировали стабильность АИС в 3 разных группах. Исходные биохимические показатели плазмы натощак показаны в табл. 20. Биохимические измерения в плазме проводили на образцах крови, полученных перед началом лечения.
Таблица 20
Исходные показатели веса тела, уровней глюкозы, инсулина и триглицеридов в плазме натощак в трех группах обезьян резус
Носитель | Р0Р21 | Рс-РОР21(КО) | |
N | 10 | 10 | 10 |
Вес тела (кг) | 8,5 ± 0,5 | 8,7 ± 0,4 | 8,5 ± 0,4 |
Глюкоза в плазме (мг/дл) 91,9 ± 4,8 | 94,8 ±5,3 | 82,2 ± 3,7 | |
Инсулин (пг/мл) | 942,6 ± 121,4 976,1 ± 107,7 1023,4 ± 205,1 | ||
Триглицериды (мг/дл) | 44,4 ± 4,8 | 58,6 ±5,2 | 71,7 ±9,8 |
Были выбраны три разных уровня дозы: низкие дозы составляли 0,1 и 0,3 мг/кг, средние дозы - 0,3 и 1 мг/кг, а высокие дозы - 1 и 5 мг/кг для РСР21 и Рс-РСР21 (КС) соответственно. Уровни дозы были выбраны на основе наблюдаемой дозовой реакции у мышей, а схема введения доз основывалась на ожидаемой частоте инъекций для человека. Для средней и низкой доз были использованы эквимолярные дозы РСР21, а высокую дозу Рс-РСР21(КС) увеличили до 5 мг/кг (вместо 3 мг/кг, что соответствовало дозе, эквимолярной 1 мг/кг для РСР21).
22.2. Влияние испытуемых соединений на вес тела.
В этом эксперименте для оценки влияния испытуемых соединений на вес тела, измеряемый еженедельно, в трех разных группах обезьян резус еженедельно рассчитывали процентное изменение веса тела по сравнению с исходным. Вес тела также измеряли в течение трехнедельного периода отмывания. В табл. 20 указаны исходные значения веса тела для каждой группы.
Вес тела контролировали по ходу всего исследования, как до, так и после выведения испытуемых соединений. Процентное изменение веса тела по сравнению с начальным у животных, получавших носитель, нарастало, тогда как у животных, получавших Рс-РСР21(КС) и РСР21, на протяжении 6-недельного периода лечения вес тела снижался с эффектом дозовой зависимости, как это показано на фиг. 39. Как ранее наблюдалось у грызунов (Хи е! а1., Э|аЬе1е5 58(1):250-9 (2009)), лечение РСР21 снижало вес тела на уровне статистической значимости. Рс-РСР21(КС) имел большую экспозицию по сравнению с РСР21 (на фиг. 48 и 47 соответственно), и это позволяло дать полученным наблюдениям такое возможное объяснение, что Рс-РСР21(КС) демонстрировал более выраженное снижение веса тела по сравнению с РСР21.
22.3. Влияние испытуемых соединений на уровень инсулина.
Уровень инсулина измеряли в образцах крови, полученных после ночного перерыва в приеме пищи (натощак) или после дневного кормления.
Уровень инсулина в плазме у обезьян резус, получавших носитель, РСР21 или Рс-РСР21(КС), измеряли натощак еженедельно, включая 3-недельный период отмывания. Образцы крови натощак собирали приблизительно через пять дней после последней инъекции Рс-РСР21(КС) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции РСР21.
Уровень инсулина в плазме после приема пищи у обезьян резус измеряли на пятой и шестой неделе лечения либо носителем, либо РСР21 в высокой дозе. Образцы крови после приема пищи собирали приблизительно через три дня после последней инъекции Рс-РСР21(КС) и приблизительно через 2 ч после последней инъекции РСР21. Фиг. 40 показывает влияние носителя, РСР21 и Рс-РСР21(КС) на уровень инсулина в крови натощак на протяжении всего девятинедельного исследования, тогда как фиг. 41 отображает уровень инсулина после приема пищи, определенный в образцах, которые были получены на 5-й и 6-й неделе.
Вкратце, в двух самых высоких дозах как РСР21, так и Рс-РСР21(КС) статистически значимо понижали уровень инсулина натощак и после приема пищи. То наблюдение, что уровень инсулина у животных, получавших РСР21 и Рс-РСР21(КС), снижался, а повышения уровня инсулина не происходило, свидетельствует о повышенной чувствительности к инсулину.
22.4. Влияние испытуемых соединений на 0СТТ (глюкоза и инсулин).
Три теста 0СТТ (0СТТ 3, 4 и 5) были проведены после начала лечения. В тесте 0СТТ5 профили уровней глюкозы и инсулина измеряли у животных, которые в течение 6 недель получали носитель, РСР21 или Рс-РСР21(КС), в соответствии с последними двумя неделями режима повышения дозы (высокая доза). Тест 0СТТ5 проводили приблизительно через 7 дней после последней инъекции РсРСР21(КС) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции РСР21. Профили глюкозы и инсулина в тесте 0СТТ5 показаны на фиг. 42 и 43 соответственно. Животные, получавшие Рс-РСР21(КС), демонстрировали улучшенный клиренс глюкозы, сравнимый с 5 животными, получавшими носитель, только при самой высокой дозе и в последней точке времени при проведении измерений, как это показано на фиг. 42. В конце периода введения последней дозы Рс-РСР21(КС) показал самое сильное улучшение
- 52 024751 клиренса глюкозы. Р0Р21 не показал улучшения клиренса глюкозы. Рс-Р0Р21(К0) имел большую экспозицию по сравнению с Р0Р21 (на фиг. 48 и 47 соответственно), и это позволяло дать полученным наблюдениям такое возможное объяснение, что Рс-Р0Р21(К0) демонстрировал более выраженный эффект в отношении клиренса глюкозы по сравнению с Р0Р21. Уровень инсулина по результатам теста 00ΤΤ5 был статистически значимо снижен в последней точке времени проведения изменений у животных, получавших Рс-Р0Р21(К0), по сравнению с животными, получавшими носитель.
Процентное изменение АИС глюкозы по сравнению с исходным рассчитывали для трех 00ΤΤ (00ΤΤ 3, 4 и 5), проведенных в конце периода введения каждой дозы (низкой, средней и высокой) в трех разных группах обезьян резус, как это показано на фиг. 44. Тест 00ΤΤ5 проводили приблизительно через семь дней после последней инъекции Рс-Р0Р21(К0) и через 21 ч после последней инъекции Р0Р21, и полученные результаты показали, что Рс-Р0Р21(К0) статистически значимо улучшал АИС5. Исходные показатели теста 00ΤΤ для каждой группы показаны на фиг. 38С.
Уровень глюкозы в плазме натощак измеряли в те дни, когда не проводили тесты 00ΤΤ. Не было выявлено каких-либо значимых статистических различий между тремя группами животных по результатам измерений уровня глюкозы натощак.
22.5. Влияние испытуемых соединений на уровень триглицеридов.
Процентное изменение уровня триглицеридов натощак в плазме у обезьян резус, получавших носитель, Р0Р21 или Рс-Р0Р21(К0), рассчитывали еженедельно, включая 3-недельный период отмывания. Образцы крови натощак собирали приблизительно через пять дней после последней инъекции РсР0Р21(К0) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции Р0Р21. Уровень триглицеридов измеряли каждую неделю после начала лечения, процентные изменения по сравнению с начальным уровнем показаны на фиг. 45, и исходные величины натощак показаны в табл. 20.
Как отображено на фиг. 45, животные, получавшие либо Рс-Р0Р21(К0), либо Р0Р21, демонстрировали снижение уровня триглицеридов с эффектом дозовой зависимости, причем Рс-Р0Р21(К0) имел более выраженный понижающий эффект по сравнению с Р0Р21.
На фиг. 46 показан уровень триглицеридов в плазме в образцах, полученных от обезьян резус после приема пищи на пятой и шестой неделе лечения носителем, Рс-Р0Р21(К0) или Р0Р21. Образцы крови после приема пищи собирали приблизительно через 3 дня после последней инъекции Рс-Р0Р21(К0) и приблизительно через 2 ч после последней инъекции Р0Р21. Уровень триглицеридов в плазме после приема пищи у животных, получавших Р0Р21 и Рс-Р0Р21(К0) был статистически значимо снижен по сравнению с животными, получавшими носитель (фиг. 46).
22.6. Концентрация испытуемых соединений.
Экспозицию испытуемых соединений, вводимых на приблизительно эквивалентном уровне молярной дозы, оценивали на протяжении всего исследования. Концентрацию Рс-Р0Р21(К0) измеряли перед введением дозы и приблизительно через 5 дней после последней инъекции. Уровень Р0Р21 измеряли перед введением дозы, а также через 5, 12, 19 и 26 дней. Образцы крови получали приблизительно через 21 ч после последней инъекции.
Показатели индивидуальной концентрации испытуемых соединений у каждой обезьяны отображены на фиг. 47 и 48. Как показано на фиг. 47, большинство животных в группе, получавшей Р0Р21, имели концентрацию ниже порога количественного определения. Фиг. 48 показывает, что животные в группе, получавшей Рс-Р0Р21(К0), имели определяемый уровень Рс-Р0Р21(К0) в каждой дозовой фазе (две еженедельные дозы одинаковой интенсивности). Средняя концентрация в каждой дозовой фазе для РсР0Р21(К0) увеличивалась примерно пропорционально дозе от 0,3 до 5 мг/кг. Имеется минимальное накопление, о чем свидетельствует устойчивая концентрация после первой и второй еженедельной дозы в каждой фазе повышения дозы для обоих соединений. В фазе после лечения (период отмывания) уровень Рс-Р0Р21(К0) был определяемым приблизительно до 47-го дня (12 дней после последней дозы), а после этого падал ниже порога количественного определения (ЬЬ0Ц).
Экспозицию испытуемых соединений также мониторировали при каждом 00ΤΤ. Р0Р21 не поддавался определению в ходе тестов 00ΤΤ 3 и 4 после лечения Р0Р21 в низкой и средней дозе. Однако по результатам 0ΤΤ5, т.е. после лечения высокой дозой, наблюдался определяемый уровень. Пропорциональное дозе увеличение уровня Рс-Р0Р21(К0) наблюдалось от третьего до пятого 00ΤΤ при увеличении дозы, как это показано на фиг. 49.
Данные об уровнях соединений подтверждают, что животные подвергались воздействию ожидаемого количества каждого соединения, а именно Р0Р21 и Рс-Р0Р21(К0), в режиме повышения дозы. В отношении измеряемого количества Р0Р21 наблюдалась большая вариабельность, которая представляла собой ожидаемый результат, учитывая то, что сбор образцов проводили приблизительно через 21 ч после последней дозы, а период полувыведения Р0Р21 составляет приблизительно 1 ч.
22.7. Выводы.
Р0Р21 понижал уровень триглицеридов натощак и после приема пищи, уровень инсулина, и уменьшал вес тела в самых высоких дозах. Рс-Р0Р21(К0) улучшал показатели тестов 00ΤΤ и понижал уровень инсулина в самой высокой дозе, а также с эффектом дозовой зависимости понижал уровень триглицеридов в плазме натощак и после приема пищи, как и вес тела. Как Р0Р21, так и Рс-Р0Р21(К0)
- 53 024751 снижали показатели по многим метаболическим параметрам у обезьян резус, не отягощенных сахарным диабетом. Уровень инсулина и триглицеридов снижался одинаково при лечении ΡΟΡ21 и Ρο-ΡΟΡ21(ΚΟ). если уровень циркулирующих соединений находился в сходном диапазоне (в состоянии животных после приема пищи). Вследствие улучшенных характеристик Ρ^ΡΟΡ21(ΚΟ) превосходил ΡΟΡ21 в отношении большинства измеряемых параметров, а для эффективного воздействия на метаболические параметры его можно было вводить один раз в неделю.
Хотя настоящее изобретение было описано на основе различных вариантов его осуществления, квалифицированные специалисты поймут, что вполне возможны его вариации и модификации. Таким образом, надо понимать, что прилагаемая формула изобретения охватывает все равноценные вариации, которые относятся к сфере действия настоящего изобретения, заявленного в данном документе. В дополнение к этому следует упомянуть, что заголовки разделов, использованные в данном документе, даны только в организационных целях и на должны восприниматься как ограничивающие описанный здесь предмет обсуждения.
Все источники, процитированные в этом изобретении, явным образом включены в настоящий документ в качестве ссылок.
Перечень последовательностей <110> БЕЛУСКИ, Эдвард, Дж.
ЭЛЛИСОН, Мюриэль, М.
ГАМБУРГЕР, Агнес, Е.
ХЕХТ, Рэнди, АЙ.
ЛИ, ЕО-Шенг МИХАЕЛС, Марк, Л.
САН, Джеонгун КСУ, Джинг <120 МУТАНТЫ ГСЕ21 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130> А-1429-ГОО-РСТ <140> РСТ/и52009/04б113 <141> 2009-06-03 <160> 41 <170> РаЬепЫп νβΓ3ΐοη 3.5 <210> 1 <211> 630 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 1
аСддасЪсдд | асдадассдд | дггсдадсас | Ссаддас^дЪ | дддСί^сСдС | дс£ддс£дд£ | 60 |
с!ДсЪдс£дд | дадсс^дсса | ддсасасссс | а£ссс£дас£ | ссадЪссСсе | сс£дсааИс | 120 |
дддддссаад | Дссддсадсд | дСасс^сЪас | асадаЪда^д | сссадсадас | адаадсссас | 180 |
сЪддадаЪса | дддаддаЪдд | дасддГдддд | ддсдсЪдсЪд | ассададссс | сдааад£сЪс | 240 |
СЬдсадсЬда | аадссЬЬдаа | дссдддадН | аНсаааЬсЬ | ЬдддадЪсаа | дасаЪссадд | 300 |
РбссРдбдсс | адсддссада | £ддддссс6д | ЬаРддабсдс | ЪссасРббда | сссЪдаддсс | 360 |
Сдсадсббсс | дддадсбдсР | Ссббдаддас | ддабасаабд | бббассадбс | сдаадсссас | 420 |
ддссс.сссдс | £дсассс.дсс | адддаасаад | сссссасасс | дддасссьдс | ассссдадда | 480 |
ссадсЬсдс!: | ЪссЪдссасЪ | ассаддсс1:д | ссссссдсас | ссссддадсс | асссддааЪс | 540 |
с£ддсссссс | адссссссда | ЪдГдддсЪсс | ЬсддасссСс | ЪдадсаЪддЬ | дддассЪЪсс | 600 |
садддссдаа | дссссадсЬа | сдсПссЪда | 630 |
<210> 2 <211> 209 <212> БЕЛОК <213> Нолю гараепз <400> 2
Ме£ Азр 1 | Зег | Азр | С1и 5 | ТЬг С1у РЬе С1и | Н1з 10 | Зег О1у | Ьеи Тгр | Уа1 15 | Зег | ||||||
Уа1 | Ьеи | А1а | С1у | Ьеи | Ьеи | Ьеи | С1у | А1а | Суз | С1п | А1а | Нгз | Рго | Не | Рго |
20 | 25 | 30 |
- 54 024751
Азр | Зег Зег 35 | Рго Ьеи Ьеи СЬп | РЬе 40 | С1у 61у | СЬп | УаЬ | Агд 45 | СЬп | Агд | Туг | |||||
Ьеи | Туг | ТЬг | Азр | Азр | А1а | СЬп | СЬп | ТЬг | СЬи | АЬа | НЬз | Ьеи | СЬи | Не | Агд |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
СЬи | Азр | СЬу | ТЬг | Уа1 | СЬу | СЬу | АЬа | АЬа | Азр | СЬп | Зег | Рго | СЬи | Зег | Ьеи |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Ьеи | СЬп | Ьеи | Ьуз | АЬа | Ьеи | Ьуз | Рго | СЬу | Уа1 | 11е | С1п | Не | Ьеи | СЬу | Уа1 |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ьуз | ТЬг | Зег | Агд | РЬе | Ьеи | Суз | СЬп | Агд | Рго | Азр | СЬу | АЬа | Ьеи | Туг | СЬу |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Зег | Ьеи | ΗΪ3 | РЬе | Азр | Рго | СЬи | АЬа | Суз | Зег | РЬе | Агд | СЬи | Ьеи | Ьеи | Ьеи |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
СЬи | Азр | СЬу | Туг | Азп | УаЬ | Туг | СЬп | Зег | СЬи | АЬа | НЬз | СЬу | Ьеи | Рго | Ьеи |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
ΗΪ5 | Ьеи | Рго | СЬу | Азп | Ьуз | Зег | Рго | ΗΪ5 | Агд | Аэр | Рго | АЬа | Рго | Агд | СЬу |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Рго | АЬа | Агд | РЬе | Ьеи | Рго | Ьеи | Рго | СЬу | Ьеи | Рго | Рго | АЬа | Рго | Рго | СЬи |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Рго | Рго | СЬу | Не | Ьеи | АЬа | Рго | СЬп | Рго | Рго | Азр | УаЬ | СЬу | Зег | Зег | Азр |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Рго | Ьеи | Зег | МеЬ | УаЬ | СЬу | Рго | Зег | СЬп | СЬу | Агд | Зег | Рго | Зег | Туг | АЬа |
195 | 200 | 205 |
Зег <210> 3 <211> 546 <212> ДНК <213> Ното гарЬепз <400> 3
сасоссаЬсо | оЪдасЬссад ЬссЬсЬссЪд сааМзсдддд дссаадЪссд дсадсддЬас | 60 |
сСс^асасад | аЪда'Ьдссса дсадасадаа дсссассГдд адаГсаддда ддаЬдддасд | 120 |
дСддддддсд | сЬдс1:дасса дадссссдаа ад£сЬссЬдс адсЬдааадс сЬЬдаадссд | 180 |
ддадГГаЬЬс | аааЪсЪСддд адЬоаадаса ЬссаддЬЬсс ЬдГдссадсд дсоадаЬддд | 240 |
- 55 024751
дсссЪдЪа^д | даЬсдсЬсса сЬССдассс!: даддссЬдса дс£Ьссддда дсЬдсЪЬсЫ: | 300 |
даддасддаС | асааЪдЬЪЬа ссадЬссдаа дсссасддсс СсссдсЬдса ссЪдссаддд | 360 |
аасаадЬссс | сасассддда сссЬдсассс сдаддассад сЪсдсьЬссЪ дссасЬасса | 420 |
ддссЬдсссс | ссдсассссс ддадссассс ддааЬссСдд ссссссадсс ссссдаЬдГд | 480 |
ддсИссИсдд | асссЬсЬдад саЪддЬддда ссЬЬсссадд дссдаадссс садс1асссс | 540 |
ЬссЬда 546 <210> 4 <211> 181 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 4
ΗΪ5 1 | Рго | Не | Рго Азр 5 | Зег | Зег | Рго | Ьеи Ьеи С1п 10 | РЬе | С1у | СЬу | С1п 15 | УаЬ | |||
Агд | С1п | Агд | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Азр | Азр | А1а | СЬп | СЬп | ТЬг | СЬи | А1а | НЬе |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Ьеи | С1и | 11е | Агд | СЬи | Азр | С1у | ТЬг | Уа1 | С1у | СЬу | А1а | А1а | Азр | С1п | Зег |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Рго | С1и | Зег | Ьеи | Ьеи | С1п | Ьеи | Ьуз | А1а | Ьеи | Ьуз | Рго | СЬу | Уа1 | 11е | С1п |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
11е | Ьеи | С1у | Уа1 | Ьуз | ТЬг | Зег | Агд | РЬе | Ьеи | Суз | СЬп | Агд | Рго | Азр | С1у |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
А1а | Ьеи | Туг | С1у | Зег | Ьеи | Н±5 | РЬе | Азр | Рго | СЬи | А1а | Суз | Зег | РЬе | Агд |
35 | 90 | 95 | |||||||||||||
61и | Ьеи | Ьеи | Ьеи | С1и | Азр | СЬу | Туг | Азп | Уа1 | Туг | С1п | Зег | СЬи | А1а | ΗΪ5 |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
С1у | Ьеи | Рго | Ьеи | ΗΪ5 | Ьеи | Рго | С1у | Азп | Ьуз | Зег | Рго | Н1з | Агд | Азр | Рго |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
А1а | Рго | Агд | С1у | Рго | А1а | Агд | РЬе | Ьеи | Рго | Ьеи | Рго | С1у | Ьеи | Рго | Рго |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
А1а | Рго | Рго | С1и | Рго | Рго | СЬу | Не | Ьеи | А1а | Рго | СЬп | Рго | Рго | Азр | Уа1 |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
С1у | Зег | Зег | Азр | Рго | Ьеи | Зег | МеЬ | Уа1 | СЬу | Рго | Зег | СЬп | СЬу | Агд | Зег |
165 | 170 | 175 |
- 56 024751
Рго 5ег Туг А1а 5ег 180 <210> 5 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер ПЦР <400> 5 аддаддааРа асаРаРдсаР ссааРРссад аРРсРРсРсс 40 <210> 6 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер ПЦР <400> 6 радрдадсрс дааРРсРРад даадсдРадс Рдд 33 <210> 7 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер ПЦР <400> 7 ддадарарас арардссаар РссадаРРср рсРссаРРаР С 41 <210> 8 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер ПЦР <400> 8 саРаРдРаРа РсРссРРсРР ааадРРааас аааа 34 <210> 9 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер ПЦР <400> 9 аааасаааРР даааРРсРРс сРсРаРаРдР аРас 34
- 57 024751 <210> 10 <2Ы> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> часть зрелого полипептида ГСГ21 человека <400> 10
Ме£ НЬз Рго Не Рго Азр Зег 5ег Рго Ьеи 15 10 <2Ю> 11 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой тяж из части ГСЕ21 экспрессионной конструкции <400> 11
ЬЬЪЪдеъЪаа сЬАЬаадаад дадаЬа^аса £а£дса£сса а££ссада1;5 сЪЪс^сса^ь 60 аи 63 <210> 12 <2Ы> 63 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> антисмысловой тяж из части ГСЕ21 экспрессионной конструкции <400> 12 аааасаааСЬ дааа£1:сЪЪс сСсЬаСаСд!: аЪасдЪаддЪ еааддЪсЪаа даададдЪаа 60
Саа 63 <210> 13 <211> 227 <212> БЕЛОК
<213> Ното | варсепз | |||||||||||||
<400> : | 13 | |||||||||||||
Авр | Ьуз | ТЬг | Н18 ТЬг | Суз | Рго | Рго | Суз | Рго | А1а | Рго | СЬи | Ьеи | Ьеи | СЬу |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
С1 у | Рго | Бес | Уа1 РЬе | Ьеи | РНе | Рго | Рго | Ьуз | Рго | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | МеС |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
11е | Зег | Агд | ТЬг Рго | СЬи | УаЬ | ТЬг | Суз | УаЬ | УаЬ | Уа1 | Азр | УаЬ | 2ег | НЬз |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
О1и | Азр | Рго | С1и V»! | Ьуз | РЬе | Азп | Тгр | Туг | 7а1 | Азр | СЬу | УаЬ | СЬи | Уа1 |
50 | 55 | 60 |
ΗΪ3 65 | Азп | АЬа Ьуз | ТНг | Ьуз 70 | Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп 75 | Зег | ТНг | Туг 80 | |||||||
Агд | УаЬ | УаЬ | Зег | УаЬ | Ьеи | ТНг | Уа! | Ьеи | НЬз | С1п | Азр | Тгр | Ьеи | Азп | С1у |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ьуз | СЬи | Туг | Ьуз | Суз | Ьуз | УаЬ | Зег | Азп | Ьуз | АЬа | Ьеи | Рго | АЬа | Рго | Не |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
С1и | Ьуз | ТНг | Не | Зег | Ьуз | АЬа | Ьуз | СЬу | СЬп | Рго | Агд | СЬи | Рго | СЬп | УаЬ |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Туг | ТНг | Ьеи | Рго | Рго | Зег | Агд | Азр | СЬи | Ьеи | ТНг | Ьуз | Азп | СЬп | Уа1 | Зег |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Ьеи | ТНг | Суз | Ьеи | УаЬ | Ьуз | СЬу | РЬе | Туг | Рго | Зег | Азр | Не | А1а | УаЬ | СЬи |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Тгр | СЬи | Зег | Азп | СЬу | СЬп | Рго | С1и | Азп | Азп | Туг | Ьуз | ТНг | ТНг | Рго | Рго |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
УаЬ | Ьеи | Азр | Зег | Азр | СЬу | Зег | РЬе | РНе | Ьеи | Туг | Зег | Ьуз | Ьеи | ТНг | УаЬ |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Аэр | Ьуз | Зег | Агд | Тгр | СЬп | СЬп | <31у | Азп | УаЬ | РНе | Зег | Суг | Зег | УаЬ | МеГ |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
ΗΪ5 | СЬи | АЬа | Ьеи | НЬз | Азп | НЬз | Туг | ТНг | СЬп | Ьуз | Зег | Ьеи | Зег | Ьеи | Зег |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Рго | СЬу | Ьуз | |||||||||||||
225 | |||||||||||||||
<210> : | 14 | ||||||||||||||
<211> : | 34 | ||||||||||||||
<212> ДНК |
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер ПЦР <400> 14 аддаддааНа асаНаСддас аааасНсаса сатд 34 <210> 15 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер ПЦР
- 59 024751
<210>
<211>
<212>
<213>
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой тяж из части РСГ21 зкслрессионной конструкции <400> 20 стсс^сддас сс1с1:дадса ЬддЪдддасс ИЪсссадддс сдаадсссса
- 60 024751 <210> 21 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер ПЦР <400> 21 адссТдддад асТсдТасса ссТТддаадд <210> 22 <211> 50 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> антисмысловой тяж из части ЕСГ21 экспрессионной конструкции <400> 22 даддадссТд ддадасТсдТ ассасссТдд аадддТсссд дсТТсддддТ <210> 23 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> линкерная последовательность <400> 23
С1у С1у С1у <31у С1у Зег С1у С1у С1у Зег С1у 31у <31у <31у Зег 15 10 15 <210 24 <211> 424 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> Ес-(С45)3-ЕСГ21 <400> 24
Нет Авр Ьуз ТЬг ΗΪ5 ТЬг Сув Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 15 10 15
С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи 20 25 30
Нет Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 νβΐ \7а1 Азр Уа1 Зег 35 40 45
Н1з С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и 50 55 60
- 62 024751
Рго | Азр СЬу АЬа Ьеи 325 | Туг | СЬу Зег Ьеи | НЬз 330 | РЬе Азр | Рго | СЬи | АЬа 335 | Суз |
Зег | РЬе Агд СЬи Ьеи | Ьеи | Ьеи СЬи Азр | СЬу | Туг Азп | УаЬ | Туг | СЬп | Зег |
340 | 345 | 350 | |||||||
СЬи | А1а НЬз СЬу Ьеи | Рго | Ьеи НЬз Ьеи | Рго | СЬу Азп | Ьуз | Зег | Рго | НЬз |
355 | 360 | 365 | |||||||
Агд | Азр Рго АЬа Рго | Агд | СЬу Рго АЬа | Агд | РЬе Ьеи | Рго | Ьеи | Рго | СЬу |
370 | 375 | 380 | |||||||
Ьеи | Рго Рго А1а Рго | Рго | СЬи Рго Рго | СЬу | Не Ьеи | АЬа | Рго | СЬп | Рго |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||
Рго | Азр Уа! СЬу Зег | Зег | Азр Рго Ьеи | Зег | МеЬ Уа1 | СЬу | Рго | Зег | СЬп |
405 | 410 | 415 | |||||||
СЬу | Агд Зег Рго Зег | Туг | АЬа Зег | ||||||
420 | |||||||||
<2Ю> 25 | |||||||||
<211> 424 | |||||||||
<212> БЕЛОК | |||||||||
<213> Искусственная | |||||||||
<220> | |||||||||
<223> ГСГ21(15)-Гс | |||||||||
<400> 25 | |||||||||
МеГ | НЬз Рго Не Рго | Азр | Зег Зег Рго | Ьеи | Ьеи СЬп | РЬе | СЬу | СЬу | СЬп |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||
УаЬ | Агд СЬп Агд Туг | Ьеи | Туг ТЬг Азр | Азр | АЬа СЬп | СЬп | ТЬг | СЬи | АЬа |
20 | 25 | 30 | |||||||
НЬз | Ъеи СЬи Не Агд | СЬи | Азр СЬу ТЬг | УаЬ | СЬу СЬу | АЬа | АЬа | Азр | СЬп |
35 | 40 | 45 | |||||||
5ег | Рго СЬи Зег Ьеи | Ьеи | СЬп Ьеи Ьу5 | АЬа | Ьеи Ьуз | Рго | СЬу | УаЬ | Пе |
50 | 55 | 60 | |||||||
С1п | Не Ьеи СЬу Уа1 | Ьуз | ТЬг Зег Агд | РЬе | Ьеи Суз | СЬп | Агд | Рго | Азр |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||
СЬу | А1а Ьеи Туг СЬу | Зег | Ьеи НЬз РЬе | Азр | Рго СЬи | АЬа | Суз | Зег | РЬе |
85 | 90 | 95 | |||||||
Агд | СЬи Ьеи Ьеи Ьеи | СЬи | Азр СЬу Туг | Азп | УаЬ Туг | СЬп | Зег | СЬи | АЬа |
- 63 024751
- 64 024751
355
360
365
Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго 7а1 Ьеи Азр Зег Азр 61у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг 370 375 380
Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п СЬу Азп 1/а1 РЬе 385 390 395 400
Зег Суз Зег Уа1 Мер НЬз СЬи АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг С1п Ьуз 405 410 415
Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 420 <210> 26 <211> 424 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220 <223> Гс-(645)3-ГСЕ21 6170Е <400> 26
Мер Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго С1и Ьеи Ьеи 15 10 15
С1у 61у Рго Зег 1/а1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи 20 25 30
Мер 11е Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 7а1 Азр Уа1 Зег 35 40 45
НЬз 61и Азр Рго 61и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг \7а1 Азр СЬу Уа1 СЬи 50 55 60
1Ή НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Атд СЬи СЬи С1п Туг Азп Зег ТЬг 65 70 75 80
Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз 61п Азр Тгр Ьеи Азп 85 90 95
С1у Ьуз СЬи Туг Ьуз Суз Ьуз 7а1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 100 105 110
Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз СЬу С1п Рго Агд СЬи Рго С1п 115 120 125
7а1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр СЬи Ьеи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 130 135 140
- 65 024751
- 66 024751
Рго Азр Уа1 С1у Зег Зег Азр Рго Ьеи Зег Ме5 Уа1 С1и Рго Зег С1п 405 410 415
С1у Агд Зег Рго Зег Туг А1а Зег 420
<210> <211> £212> <213> | 27 424 БЕЛОК Искусственная | |
<220> | ||
<223> | Рс-(С45)3-Г6Р21 | Р171А |
<4 0 0> | 27 | |
Мее Азр | Ьуз ТЬг Ηίε ТНг | Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго С1и Ьеи Ьеи |
С1у С1у Рго Зег νάΐ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз А5р ТЬг Ьеи 20 25 30
Μβΐ Не Зег Агд ТЬг Рго С1и 7а1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег 35 40 45
ΗΪ5 С1и Азр Рго 51и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр СЬу Уа1 СЬи 50 55 60
Уа1 НЬз Азп АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Туг Азп Зег ТЬг 65 70 75 50
Туг Агд УаЬ Уа1 Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз С1п Азр Тгр Ьеи Азп 85 90 95
С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз АЬа Ьеи Рго А1а Рго 100 105 110
Пе СЬи Ьуз ТЬг Пе Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд С1и Рго СЬп 115 120 125
Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Аэр СЬи Ьеи ТЬг Ьуг Азп СЬп УаЬ 130 135 140
Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Аэр Пе А1а УаЬ 145 150 155 160
СЬи Тгр СЬи Зег Азп СЬу СЬп Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго 165 170 175
Рго УаЬ Ьеи Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг
- 68 024751 <211> 424 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> Бс-(С45)3-РСГ21 5172Ь <400> 28
Мее 1 | Азр Ьуз | ТНг | Ηί3 5 | ТНг | Суэ | Рго | Рго | Суз 10 | Рго | А1а | Рго | С1и | Ьеи 15 | Ьеи | |
С1у | С1у | Рго | Зег | Уа1 | РНе | Ьеи | РНе | Рго | Рго | Ьуз | Рго | Ьуз | Азр | ТНг | Ьеи |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Мее | Пе | Зег | Агд | ТЬг | Рго | С1и | Уа1 | ТЬг | Суз | νβΐ | Уа1 | Уа1 | Аэр | Уа1 | Зег |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
ΗΪ5 | С1и | Азр | Рго | СЬи | Уа1 | Ьуэ | РНе | Азп | Тгр | Туг | Уа1 | А5р | С1у | Уа1 | С1и |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Уа1 | ΗΪ3 | Азп | А1а | Ьуэ | ТНг | Ьуэ | Рго | Агд | С1и | С1и | С1п | Туг | Аэп | Зег | ТЬг |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Туг | Агд | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Ьеи | ТНг | Уа1 | Ьеи | Н±з | С1п | Азр | Тгр | Ьеи | А5П |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
С1у | Ьуз | 61и | Туг | Ьуз | Суэ | Ьуэ | Уа1 | 5ег | Азп | Ьуз | А1а | Ьеи | Рго | А1а | Рго |
100 | 105 | НО | |||||||||||||
Не | 61и | Ьуэ | ТНг | Не | Зег | Ьуз | А1а | Ьуз | С1у | С1п | Рго | Агд | С1и | Рго | С1п |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Уа1 | Туг | ТНг | Ьеи | Рго | Рго | Зег | Агд | Азр | С1и | Ьеи | ТНг | Ьуз | Азп | С1п | Уа1 |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Зег | Ьеи | ТНГ | Суз | Ьеи | Уа1 | Ьуз | С1у | РЬе | Туг | Рго | Зег | Азр | 11е | А1а | Уа1 |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
61и | Тгр | С1и | Зег | Азп | С1у | С1п | Рго | СЬи | Аэп | Азп | Туг | Ьуэ | ТЬг | ТНг | Рго |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Рго | Уа1 | Ьеи | Азр | Бег | Азр | СЬу | Зег | РЬе | РНе | Ьеи | Туг | Зег | Ьуз | Ьеи | ТНг |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Уа1 | Азр | Ьуз | Зег | Агд | Тгр | С1п | С1п | СЬу | Аэп | Уа1 | РНе | 5ег | Суз | Зег | Уа1 |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Мее | ΗΪ5 | С1и | А1а | Ьеи | ΗΪ5 | Азп | ΗΪ3 | Туг | ТНг | С1п | Ьуз | Зег | Ьеи | Зег | Ьеи |
210 | 215 | 220 |
- 69 024751
Зег 225 | Рго | С1у | Ьуз | С1у | С1у С1у 21у 230 | Зег С1у С1у С1у С1у Зег О1у С1у | |||||||||
235 | 240 | ||||||||||||||
С1у | С1у | Зег | Н1з | Рго | 11е | Рго | Азр | Зег | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | С1п | РНе | С1у |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
О1у | ΰΐη | Уа1 | Агд | С1п | Агд | Туг | Ьеи | Туг | ТНг | Азр | Азр | А1а | С1п | С1п | ТНг |
250 | 265 | 270 | |||||||||||||
С1и | А1а | ΗΪ3 | Ьеи | С1и | Не | Агд | С1и | Азр | С1у | ТНг | ν&1 | С1у | С1у | А1а | А1а |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Азр | С1п | Зег | Рго | С1и | Зег | Ьеи | Ьеи | 51п | Ьеи | Ьуз | А1а | Ьеи | Ьуз | Рго | С1у |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Уа1 | Не | Й1п | Пе | Ьеи | С1у | Уа1 | Ьуз | ТЬг | Зег | Агд | РНе | Ьеи | Суз | С1п | Агд |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Рго | Азр | С1у | А1а | Ьеи | Туг | С1у | Зег | Ьеи | ΗΪ3 | РЬе | Азр | Рго | С1и | А1а | Суз |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Зег | РНе | Агд | О1и | Ьеи | Ьеи | Ьеи | С1и | Азр | С1у | Туг | Азп | Уа1 | Туг | С1п | Зег |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
С1и | А1а | Н1з | С1у | Ьеи | Рго | Ьеи | ΗΪ3 | Ьеи | Рго | О1у | Азп | Ьуз | Зег | Рго | Нгд |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Агд | Азр | Рго | А1а | Рго | Агд | С1у | Рго | А1а | Агд | РНе | Ьеи | Рго | Ьеи | Рго | С1у |
370 | 375 | 330 | |||||||||||||
Ьеи | РГО | Рго | А1а | Рго | Рго | С1и | Рго | Рго | С1у | Не | Ьеи | А1а | РГО | С1п | Рго |
335 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Рго | Азр | Уа1 | С1у | Зег | Зег | Азр | Рго | Ьеи | Зег | ИеГ | Уа1 | 61у | Рго | Ьеи | С1п |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
С1у | Агд | Зег | Рго | Зег | Туг | А1а | Зег |
420 <210> 29 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> линкер <400> 29
С1у С1у <31 у С1у
- 70 024751 <210> 30 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220 <223> линкер <400 30
01у 01у 01у 01у С1у 1 5 <2Ю> 31 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> линкер <400> 31
С1у 01у 01у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 01у 01у Зег 15 10 15 <210> 32 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220 <223> линкер <400> 32
01у С1у С1у Ьуз С1у 01у <31у С1у 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> линкер <400> 33
С1у С1у 61у Азп 01у Зег С1у С1у 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная
- 71 024751 <220>
<223> линкер <400> 34
С1у С1у С1у Суз 01у С1у С1у 01у 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> линкер <400> 35
01у Рго Азп 01у 01у 1 5
<210> | 36 | ||
<211> | 424 | ||
<212> | БЕЛОК | ||
<213> | Искусственная | ||
<220> <223> | Рс-(043)3-ГОР21 | ЬЭ8Е, | Р171О |
<400> | 36 | ||
МеТ Азр Ьуз ТНг ΗΪ3 ТНг | Суз | Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи Ьеи |
10 15
С1у 01у Рго Зег Уа1 20
РНе Ьеи РНе Рго Рго 25
Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи 30
МеТ Не Зег Агд ТНг 35
Рго <31и Уа1 ТНг Суз 40 νβΐ Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег 45
ΗΪ5 01и Азр Рго С1и 50
7а1 Ьуз РНе Αδη Тгр 55
Туг Уа1 Агр <31 у Уа1 31и 60
Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуз 65
ТЬг Ьуз Рго Агд О1и 70
С1и <31п Туг Азп Зег ТНг 75 80
Туг Агд Уа1 Уа1 Зег 85
Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 90
ΗΪ3 01п Азр Тгр Ьеи Азп 95
01у Ьуз 31и Туг Ьуз 100
Суз Ьуз Уа1 Зег Азп 105
Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 110
Не С1и Ьуз ТЬг Не 115
Зег Ьуз А1а Ьуз С1у 120 □Ιη Рго Агд С1и Рго С1п 125
- 72 024751
Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи 130 135
ТЬг Ьуз Азп СТп УаТ 140
Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго 145 150 155
Зег Азр Не АТа Уа1 160
С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп 165 170
Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго 175
Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр СТу Зег РЬе РЬе ьеи 180 185
Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг 190
Уа1 А5р Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 195 200
РЬе Зег Суз Зег УаТ 205
Ме1 ΗΪ3 С1и А1а Ьеи ΗΪ3 Азп Нхз Туг ТЬг С1п 210 215
Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи 220
Зег Рго С1у Ьуз С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 225 230 235
С1у СТу Зег С1у СТу 240
С1у С1у Зег Н1з Рго Не Рго Азр Зег Зег Рго 245 250
Ьеи Ьеи СТп РЬе С1у 255
СТу С1п Уа1 Агд С1п Агд Туг Ьеи Туг ТЬг А5р 260 265
Азр А1а СТп С1п ТЬг 270
С1и А1а Н1з Ьеи С1и Не Агд С1и Азр С1у ТЬг 275 280
Уа1 СТу С1у АТа АТа 285
Азр С1п Зег Рго С1и Зег Ьеи Ьеи С1п Ьеи Ьуз 290 295
А1а Ьеи Ьуз Рго СТу 300 ν91 Не С1п Не Ьеи С1у Уа1 Ьуз ТЬг Зег Агд 305 310 315
РЬе Ьеи Суз С1п Агд 320
Рго Азр СТу А1а Ьеи Туг С1у Зег Ьеи ΗΪ5 РЬе 325 330
Азр Рго С1и А1а Суз 335
Зег РЬе Агд С1и Агд Ьеи Ьеи С1и Азр С1у Туг 340 345
Азп Уа1 Туг С1п Зег 350
С1и А1а Н1з С1у Ьеи Рго Ьеи Н1з Ьеи Рго С1у 355 360
Азп Ьуз Зег Рго ΗΪ3 365
Агд Азр Рго А1а Рго Агд С1у Рго А1а Агд РЬе 370 375
Ьеи Рго Ьеи Рго СТу 380
- 73 024751
Ьеи 385 | Рго | Рго А1а | Рго | Рго СЬи 390 | Рго | Рго | С1у | 11е Ьеи А1а 395 | Рго | С1п | Рго 400 | ||||
Рго | Азр | Уа1 | С1у | Зег | Зег | Азр | Рго | Ьеи | Зег | Уа1 | С1у | С1у | Зег | С1п | |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
01у | Агд | Зег | Рго | Зег | Туг | А1а | Зег |
420 <210> 37 <211> 1274 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Рс[15)ГСГ21 Ь98Р, Р171С <400> 37
аГддасаааа сСсасасаГд ГссассГЛд*; ссадсДссдд аас£сс£ддд дддассдЪса | 60 |
дГсДГссГсИ С-Ссссссааа асссааддас ассс^саГда ЦсЬсосдЬас сссЪдаддГс | 120 |
асаДдсдДдд СддДддасдС дадссасдаа дасссЬдадд Ъсаад^саа с^ддСасдГд | 180 |
дасддсдЪдд аддЬдсаГаа £дссаадаса аадссдсд^д аддадсад£а саасадсасд | 240 |
ЁассдГдГдд ЬсадсдГссГ сассдГссСд сассаддас£ ддсГдааСдд сааддадЪас | 300 |
аадДдсаадд ИсГссаасаа адсссДссса дсссссаЪсд адаааасса1; с^ссааадсс | 360 |
ааадддсадс сссдадаасс асаддГдЪас асссЪдсссс саДсссдИда £дадсСдасс | 420 |
аадаассадд Ьсадсс1:дас с^дссГддИс аааддсЪЪсЪ а1:сссадсда саГсдссдЪд | 480 |
дадГдддада дсааДдддса дссддадаас аасЪасаада ссасдссСсс сдГдсС.ддас | 540 |
ГссдасддсГ ссГГсЪГссС. сХасадсаад сГсассд^дд асаададосд ЪГддсадсад | 600 |
дддаасдЪсГ СсДса1:дсГс сдЬдаДдсаС даддсГсГдс асаассасЪа сасдсадаад | 660 |
адссДсСссс СдДсДссддд Сааадд^дда ддГдд^ддП: сДддСддГдд ГадсддГддЬ | 720 |
ддСддаИссс аСссааГГсс адаСИсДДс!; сса^аЬСас ааДГсддддд ссаадгссдд | 780 |
садсддГ.асс £сДасасада СдаИдсссад садасадаад сссасс1:дда даДсадддад | 840 |
даГдддасдд Гддддддсдс ГдсЬдассад адссссдааа дГсГссГдса дс1;дааадсс | 900 |
ЬЬдаадссдд дадДДаГГса ааИсСДддда дДсаадасаГ ссаддГСссЬ дЬдссадсдд | 960 |
ссадаГдддд сссДдГаДдд аГсдсГссас ^ДДдасссЬд аддсс^дсад с£1:ссдддад | 1020 |
сдСсДГсСГд аддасддаЪа сааДдДДДас садДссдаад сссасддссЪ сссдсГдсас | 1080 |
сГдссаддда асаад^сссс асассдддас ссЪдсасссс даддассадс ДсдсГГссДд | 1140 |
ссасСассад дссДдссссс сдсасссссд дадссасссд дааСссГддс сссссадссс | 1200 |
сссдаГдГдд дсДссДсдда ссс^сДдадс а£дд£дддад дСЛсссаддд ссдаадсссс | 1260 |
- 74 024751 адсСасдсСС ссЬа 1274 <210> 38 <211> 424 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> Гс(15)ЕСГ21 <400> 38
МеЬ 1 | Азр Ьуз ТЬг | НЬз 5 | ТЬг Суз | Рго Рго | Суз 10 | Рго А1а Рго 01и | Ьеи 15 | Ьеи | |||||||
СЬу | СЬу | Рго | Зег | УаЬ | РЬе | Ьеи | рье | Рго | Рго | Ьуз | Рго | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
МеЬ | 11е | Зег | Агд | ТЬг | Рго | СЬи | УаЬ | ты | Суз | УаЬ | УаЬ | Уа1 | Аэр | УаЬ | Зег |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
НЬз | СЬи | Азр | Рго | СЬи | Уа1 | Ьуз | РЬе | Азп | Тгр | Туг | 7а1 | Азр | СЬу | 7а1 | СЬи |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
УаЬ | НЬз | Азп | АЬа | Ьуз | ТЬг | Ьуз | Рго | Агд | СЬи | СЬи | СЬп | Туг | Азп | Зег | ТЬг |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Туг | Агд | УаЬ | УаЬ | 5ег | УаЬ | Ьеи | ТЬг | УаЬ | Ьеи | НЬз | СЬп | Азр | Тгр | Ьеи | Азп |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
еьу | Ьуз | СЬи | Туг | Ьуз | Суз | Ьуз | УаЬ | Зег | Азп | Ьуз | АЬа | Ьеи | Рго | АЬа | Рго |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Не | СЬи | Ьуз | ТЬг | 11е | Зег | Ьуз | АЬа | Ьуз | СЬу | СЬп | Рго | Агд | СЬи | Рго | СЬп |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Уа1 | Туг | ТЬг | Ьеи | Рго | Рго | Зег | Агд | Азр | СЬи | Ьеи | ТЬг | Ьуз | Азп | СЬп | Уа1 |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Зег | Ьеи | ТЬг | Суз | Ьеи | 7а1 | Ьуз | СЬу | РЬе | Туг | Рго | Зег | Азр | Ые | АЬа | ν31 |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
СЬи | Тер | СЬи | Зег | Азп | СЬу | СЬп | Рго | СЬи | Азп | Азп | Туг | Ьуз | ТЬг | ТЬг | Рго |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Рго | Уа1 | Ьеи | Азр | Зег | Азр | СЬу | Зег | РЬе | РЬе | Ьеи | Туг | Зег | Ьуз | Ьеи | ТЬг |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Уа1 | Азр | Ьуз | Зег | Агд | Тгр | СЬп | СЬп | СЬу | Азп | ν&ι | РЬе | Зег | Су5 | Зег | УаЬ |
195 | 200 | 205 |
Ме1: ΗΪ5 | С1и А1а | Ьеи | НЬз Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуя | Зег | Ьеи | Зег | Ьеи | ||||||||
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Зег | Рго | СЬу | Ьуз | СЬу | СЬу | СЬу | С1у | С1у | Зег | СЬу | СЬу | СЬу | Зег | СЬу | СЬу |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
СЬу | СЬу | Зег | НЬз | Рго | Не | Рго | Азр | Зег | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | СЬп | РЬе | СЬу |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
СЬу | СЬп | УаЬ | Агд | СЬп | Агд | Туг | ьеи | Туг | ТЬг | Азр | Азр | АЬа | СЬп | СЬп | ТЬг |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
СЬи | АЬа | Шб | Ьеи | СЬи | 11е | Агд | СЬи | Азр | СЬу | ТЬг | УаЬ | СЬу | СЬу | АЬа | АЬа |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Азр | СЬп | Зег | Рго | СЬи | Зег | Ьеи | Ьеи | СЬп | Ьеи | Ьуз | А1а | Ьеи | Ьуз | Рго | СЬу |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
УаЬ | Не | СЬп | Ые | Ьеи | СЬу | УаЬ | Ьуз | ТЬг | Зег | Агд | РЬе | Ьеи | Суз | СЬп | Агд |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
РГО | Азр | СЬу | АЬа | ьеи | Туг | С1у | Зег | Ьеи | ΗΪ3 | РЬе | Азр | Рго | СЬи | АЬа | Суз |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Зег | РЪе | Агд | СЬи | Ьеи | Ьеи | Ьеи | СЬи | Азр | СЬу | Туг | Азп | Уа1 | Туг | СЬп | Зег |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
СЬи | АЬа | ΗΪ5 | СЬу | Ьеи | Рго | Ьеи | ΗΪ3 | Ьеи | Рго | СЬу | Азп | Ьуз | Зег | Рго | НЬз |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Агд | Азр | Рго | АЬа | Рго | Агд | С1у | Рго | АЬа | Агд | РЬе | Ьеи | Рго | Ьеи | Рго | СЬу |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Ьеи | Рго | Рго | АЬа | Рго | Рго | СЬи | Рго | Рго | СЬу | 11е | Ьеи | А1а | Рго | СЬп | Рго |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Рго | Азр | УаЬ | СЬу | Зег | Зег | Азр | Рго | Ьеи | Зег | Ме(: | УаЬ | СЬу | Рго | Зег | СЬп |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
С1у | Агд | Зег | Рго | Зег | Туг | АЬа | Зег |
420 <210> 39 <2Π> 424 <212> БЕЛОК <213> Искусственная <220>
<223> Ес{15)БСЕ^! С170Е
- 76 024751
<400> 39 | |||||||||||||||
Мее | Азр | Ьуз | ТЬг | НЬз | ТЬг | Суз | Рго | Рго | Суз | Рго | АЬа | Рго | СЬи | Ьеи | Ьеи |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
С1у | СЬу | Рго | Зег | УаЬ | РЬе | Ьеи | РНе | Рго | Рго | Ьуз | Рго | Ьуз | Агр | ТНг | Ьеи |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Мее | Не | Зег | Агд | ТНг | Рго | СЬи | УаЬ | ТНг | Суз | Уа1 | УаЬ | УаЬ | Азр | УаЬ | Зег |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
НЬз | СЬи | Азр | Рго | СЬи | УаЬ | Ьуз | РНе | Азп | Тгр | Туг | УаЬ | Азр | СЬу | УаЬ | СЬи |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
УаЬ | НЬз | Азп | АЬа | Ьуз | ТНг | Ьуз | Рго | Агд | СЬи | СЬи | СЬп | Туг | Азп | Зег | ТНг |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Туг | Агд | УаЬ | УаЬ | Зег | УаЬ | Ьеи | ТНг | УаЬ | Ьеи | НЬз | СЬп | Азр | Тгр | Ьеи | Азп |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
СЬу | Ьуз | СЬи | Туг | Ьуз | Суз | Ьуз | УаЬ | Зег | Азп | Ьуз | АЬа | Ьеи | Рго | АЬа | Рго |
100 | 105 | но | |||||||||||||
Пе | СЬи | Ьуз | ТЬг | Пе | Зег | Ьуз | АЬа | Ьуз | СЬу | СЬп | Рго | Агд | СЬи | Рго | СЬп |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
УаЬ | Туг | ТЬг | Ьеи | Рго | Рго | Зег | Агд | Азр | СЬи | Ьеи | ТНг | Ьуз | Азп | СЬп | УаЬ |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Зег | Ьеи | ТНг | Суз | Ьеи | УаЬ | Ьуз | СЬу | РНе | Туг | Рго | Зег | Азр | Не | АЬа | УаЬ |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
СЬи | Тгр | СЬи | Зег | Азп | СЬу | СЬп | РГО | СЬи | Азп | Азп | Туг | Ьуз | ТНг | ТНг | Рго |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Рго | Уа1 | Ьеи | Азр | Зег | Азр | СЬу | Зег | РНе | РНе | Ьеи | Туг | Зег | Ьуз | Ьеи | ТНг |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
УаЬ | Азр | Ьуз | Зег | Агд | Тгр | СЬп | СЬп | СЬу | Азп | УаЬ | РНе | Зег | Су5 | Зег | УаЬ |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Мее | НЬз | СЬи, | АЬа | Ьеи | НЬз | Азп | НЬз | Туг | ТНг | СЬп | Ьуз | Зег | Ьеи | Зег | Ьеи |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Зег | Рго | СЬу | Ьуз | СЬу | СЬу | СЬу | СЬу | СЬу | Зег | СЬу | СЬу | СЬу | Зег | СЬу | СЬу |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
СЬу | СЬу | Зег | НЬз | Рго | Не | Рго | Азр | Зег | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | СЬп | РЬе | СЬу |
245 250 255
СЬу СЬп Уа1 Агд СЬп Агд Туг Ьеи Туг ТЬг Азр Азр АЬа СЬп СЬп ТЬг 260 265 270
СЬи АЬа НЬз Ьеи СЬи 11е Агд СЬи Азр СЬу ТЬг Уа1 СЬу СЬу АЬа АЬа 275 280 285
Азр СЬп Зег Рго СЬи Зег Ьеи Ьеи СЬп Ьеи Ьуз АЬа Ьеи Ьуз Рго СЬу 290 295 300
УаЬ 11е СЬп Пе Ьеи СЬу УаЬ Ьуз ТЬг Зег Агд РЬе Ьеи Суз СЬп Агд 305 310 315 320
Рго Азр С1у А1а Ьеи Туг СЬу Зег Ьеи НЬз РЬе Азр Рго С1и А1а Суз 325 330 335
Зег РЬе Агд С1и Ьеи Ьеи Ьеи С1и Азр С1у Туг Азп 7а1 Туг С1п Зег 340 345 350
СЬи АЬа НЬз СЬу Ьеи Рго Ьеи НЬз Ьеи Рго СЬу Азп Ьуз Зег Рго НЬз 355 360 365
Агд Азр Рго АЬа Рго Агд СЬу Рго А1а Агд РЬе Ьеи Рго Ьеи Рго С1у 370 375 380
Ьеи Рго Рго АЬа Рго Рго О1и Рго Рго СЬу 11е Ьеи АЬа Рго СЬп Рго 385 390 395 400
Рго Азр УаЬ СЬу Зег Зег Азр Рго Ьеи Зег МеС νβΐ С1и Рго Зег СЬп 405 410 415
СЬу Агд Зег Рго Зег Туг АЬа Зег 420
<210> | 40 |
<211> | 424 |
<212> | БЕЛОК |
<213> | Искусственная |
<220> | |
<223> | Рс (15)РСР21 Р171А |
<400> | 40 |
МеЬ Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи Ьеи Ьеи |
10 15
СЬу СЬу Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи 20 25 30
- 78 024751
УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег 45
Уа! Аар СЬу УаЬ СЬи 60
СЬп туг Азп Зег ТЬг 80
СЬп Азр Тгр Ьеи Азп 95
АЬа Ьеи Рго АЬа Рго 110
Рго Агд СЬи Рго СЬп 125
ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 140
Зег Азр Не А1а УаЬ 160
Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго 175
Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг 190
РЬе Зег Суз Зег УаЬ 205
Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи 220
СЬу СЬу Зег СЬу СЬу 240
Ьеи Ьеи СЬп РЬе СЬу 255
Агр АЬа СЬп СЬп ТЬг 270
УаЬ СЬу СЬу АЬа АЬа 285
- 79 024751
Азр 51п Зег Рго СЬи Зег Ьеи Ьеи С1п Ьеи Ьуз АЬа Ьеи Ьуз Рго С1у 290 295 300
Уа1 11е С1п 11е Ьеи 01у Уа1 Ьуз ТЬг Зег Агд РКе Ьеи Суз С1п Агд 305 310 315 320
Рго А5р СЬу А1а Ьеи Туг СЬу Зег Ьеи Ηίδ РЬе Азр Рго С1и АЬа Суз 325 330 335
Зег РЬе Агд С1и Ьеи Ьеи Ьеи 51и Азр С1у Туг Азп Уа1 Туг С1п Зег 340 345 350
С1и АЬа НЬз С1у Ьеи Рго Ьеи НЬз Ьеи Рго СЬу Азп Ьуз Зег Рго НЬз 355 360 365
Агд Аэр Рго А1а Рго Агд СЬу Рго А1а Агд РЬе Ьеи Рго Ьеи Рго С1у 370 375 380
Ьеи Рго Рго А1а Рго Рго С1и Рго Рго С1у Пе Ьеи А1а Рго СЬп Рго 385 390 395 400
Рго Азр Уэ1 С1у Зег Зег Азр Рго Ьеи Зег МеЪ Уэ1 СЬу АЬа Зег С1п 405 410 415
СЬу Агд Зег Рго Зег Туг АЬа Зег 420
<210> | 41 |
<211> | 424 |
<212> | БЕЛОК |
<213> | Искусственная |
<220> | |
<223> | Рс(15)ГСР21 51721· |
<400> | 41 |
МеЬ Азр Ьуз ТЬг НЬз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго СЬи Ьеи Ьеи |
10 15
СЬу СЬу Рго Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи 20 25 30
Мес 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и УаЬ ТЬг Суз УаЬ Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег 35 40 45
НЬз СЬи Азр Рго СЬи УаЬ Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр СЬу Уа1 СЬи 50 55 60
Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи С1и СЬп Туг Азп Зег ТЬг
Claims (31)
1. Выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность δΕ^ ГО N0: 4, кроме того, включающий аминокислотную замену, выбранную из остатка аланина в положении 45, остатка лейцина в положении 86, остатка лейцина в положении 98, остатка аланина в положении 111, остатка аланина в положении 129, остатка глицина в положении 170, остатка пролина в положении 171, остатка серина в положении 172 или их комбинаций.
2. Выделенный полипептид по п.1, при этом выделенный полипептид включает аминокислотную замену остатка лейцина в положении 98, остатка пролина в положении 171 или как остатка лейцина в положении 98, так и остатка пролина в положении 171.
3. Выделенный полипептид по п.2, при этом выделенный полипептид включает аминокислотную замену как остатка лейцина в положении 98, так и остатка пролина в положении 171.
4. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность δΕ^ ГО N0: 4, имеющую:
(a) как минимум одну аминокислотную замену, выбранную из группы:
(ί) остаток глутамина, изолейцина или лизина в положении 19;
(ίί) остаток гистидина, лейцина или фенилаланина в положении 20;
(ίίί) остаток изолейцина, фенилаланина, тирозина или валина в положении 21;
(ίν) остаток изолейцина, фенилаланина или валина в положении 22;
(ν) остаток аланина или аргинина в положении 150;
(νί) остаток аланина или валина в положении 151;
(νίί) остаток гистидина, лейцина, фенилаланина или валина в положении 152;
(νίίί) остаток аланина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, пролина или серина в положении 170;
(ίχ) остаток аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина в положении 171;
(х) остаток лейцина или треонина в положении 172 или (χί) остаток аргинина или глутаминовой кислоты в положении 173; и (b) как минимум одну аминокислотную замену, которая представляет собой:
(ί) остаток аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 26;
(ίί) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 45;
(ίίί) остаток треонина в положении 52;
(ίν) остаток цистеина, глутаминовой кислоты, глицина или серина в положении 58;
(ν) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 60;
(νί) остаток аланина, аргинина, цистеина или гистидина в положении 78;
(νίί) остаток цистеина или треонина в положении 86;
(νίίί) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты, лизина или серина в положении 88;
(ίχ) остаток аргинина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 98;
(х) остаток аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина или глутаминовой кислоты в положении 99;
(χί) остаток лизина или треонина в положении 111;
(χίί) остаток аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина или лизина в положении 129 или (χίίί) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, гистидина, лизина или тирозина в положении 134; и их комбинации.
5. Выделенный полипептид по п.4, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности δΕ^ ГО N0: 4, но в котором как минимум одна замена по п.4 (α)(ί)-(χί) и п.4 (ό)(ί)-(χίίί) далее не модифицируется.
6. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность δΕ^ ГО N0: 4, имеющую как минимум одну замену, выбранную из следующего:
(a) остаток глутамина, лизина или изолейцина в положении 19;
(b) остаток гистидина, лейцина или фенилаланина в положении 20;
(c) остаток изолейцина, фенилаланина, тирозина или валина в положении 21;
(б) остаток изолейцина, фенилаланина или валина в положении 22;
(е) остаток аланина или аргинина в положении 150;
(ί) остаток аланина или валина в положении 151;
(д) остаток гистидина, лейцина, фенилаланина или валина в положении 152;
(Н) остаток аланина, аспарагиновой кислоты, цистеина или пролина в положении 170;
(ί) остаток аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина в положении 171;
- 82 024751 (ί) остаток лейцина в положении 172 или (к) остаток аргинина или глутаминовой кислоты в положении 173; и их комбинации.
7. Выделенный полипептид по п.6, в котором остаток в положении 171 представлен пролином.
8. Выделенный полипептид по п.6, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 4, в котором как минимум одна замена по п.6(а)-(к) далее не модифицируется.
9. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 4, имеющую как минимум одну замену, выбранную из следующего:
(a) остаток аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 26;
(b) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 45;
(c) остаток треонина в положении 52;
(б) остаток глутаминовой кислоты, глицина или серина в положении 58;
(е) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 60;
(ί) остаток аланина, аргинина или гистидина в положении 78;
(д) остаток аланина в положении 88;
(к) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 98;
(ί) остаток аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина или глутаминовой кислоты в положении 99;
(ί) остаток лизина или треонина в положении 111;
(k) остаток аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина или лизина в положении 129 или (l) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, гистидина, лизина или тирозина в положении 134; и их комбинации.
10. Выделенный полипептид по п.9, в котором остаток в положении 98 представлен аргинином.
11. Выделенный полипептид по п.9, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 4, в котором как минимум одна замена по п.9 (а)-(1) далее не модифицируется.
12. Выделенный полипептид по любому из пп.1, 4, 6 или 9, дополнительно включающий как минимум одну замену, выбранную из следующего:
(a) фенилаланин, пролин, аланин, серин или глицин в положении 179;
(b) глутаминовая кислота, глицин, пролин или серин в положении 180 или (c) лизин, глицин, треонин, аланин, лейцин или пролин в положении 181.
13. Выделенный полипептид по любому из пп.1, 4, 6 или 9, дополнительно включающий от 1 до 10 аминокислотных остатков, присоединенных к С-концу полипептида.
14. Выделенный полипептид по п.9, в котором от 1 до 10 аминокислотных остатков выбраны из группы, состоящей из глицина, пролина и их комбинаций.
15. Выделенный полипептид по любому из пп.1, 4, 6 или 9, при этом полипептид включает:
(a) аминконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать глюкозу в крови у млекопитающего;
(b) карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать глюкозу в крови у млекопитающего; или (c) аминконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать глюкозу в крови у млекопитающего.
16. Выделенный полипептид по любому из пп.1, 4, 6 или 9, ковалентно связанный с одним или более полимерами.
17. Выделенный полипептид по п. 16, в котором полимером является ПЭГ.
18. Составной полипептид, включающий выделенный полипептид по любому из пп.1, 4, 6 или 9, присоединенный к гетерологичной аминокислотной последовательности.
19. Составной полипептид по п.18, при этом полипептид присоединен к гетерологичной аминокислотной последовательности через линкер.
20. Составной полипептид по п.19, в котором линкер включает 000008000800008 (8Е0 ГО N0: 23).
21. Составной полипептид по п.19, в котором гетерологичная аминокислотная последовательность представляет собой константный домен 1д0 или его фрагмент.
22. Составной полипептид по п.21, в котором константный домен 1д0 включает аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 13.
23. Мультимер, включающий два или более полипептида по п.22.
24. Фармацевтическая композиция, включающая выделенный полипептид по любому из пп.1, 4, 6 или 9 и фармацевтически приемлемый формообразующий агент.
25. Способ лечения метаболического заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции по п.24.
- 83 024751
26. Способ по п.25, в котором метаболическое заболевание представляет собой сахарный диабет.
27. Способ по п.25, в котором метаболическое заболевание представляет собой ожирение.
28. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп.1, 4, 6 или 9.
29. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.28.
30. Клетка-хозяин, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по п.28.
31. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 4, при этом полипептид включает:
(a) аминконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать глюкозу в крови у млекопитающего;
(b) карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать глюкозу в крови у млекопитающего; или (c) аминконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать глюкозу в крови у млекопитающего.
Моменты времени (часы) Время (часы)
Фиг. 3
- 84 024751
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6А
Фиг. 6В
Фиг. 6С
- 85 024751
Фиг. 7В
- 86 024751
- 87 024751
- 88 024751
Рс(15)РЗР21
ΜΟΚΤΗΤΟΡΡΟΡΑΡΕίίΟβΡδνΡΙΡΡΡΚΡΚΟΤίΜΙδΚΤΡΕνΤΟνννον
5ΗΕ0ΡΕνΚΡΝννΥν00νΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝ5ΤΥΚνν5νΐ-Τνΐ-Η(20 ννίΝ0ΚΕΥΚ0Κν5ΝΚΑΙΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚ6αΡΡΕΡανΥΤίΡΡδΚ0ΕίΤ
ΚΝΟνδΙΤΟίνΚΟΡΥΡδΟΙΑνΕννΕδΝΟαΡΕΝΝΥΚπΡΡνίΟδΟΟδΡΡΙ
Υδκιτνοκδκννοο6ΝνΡδθδνΜΗΕΑΐ-ΗΝΗΥΤοκδΐ.δΐ_δΡβΚΘθ<;(;
οδοοοδοοοαδΗΡίΡΟδδΡίίαροοονρακΥίΥΤΟΟΑΟΟΤΕΑΗίΕΐ
ΚΕ06Τνθ6ΑΑ0αδΡΕ51.Ι.αΐ.ΚΑΙ.ΚΡθνΐ<ΪΙ1.6νΚΤδΚΡΙΧΟΚΡ0ΟΑΙ.
Υ©3Ι.ΗΡΟΡΕΑ05ΡΚΕΙ.Ι.Ι.ΕΟΟΥΝνΥ(55ΕΑΗΟΙ.ΡΙ.ΗΙ.ΡΟΝΚ8ΡΗΚΟΡ
ΑΡΒΟΡΑΡΡΙ.ΡΙ.Ρ<3Ι.ΡΡΑΡΡΕΡΡΟΙΙ.ΑΡαΡΡ0νΘ38ΟΡ1.3Μν(3Ρδα6
ΡδΡδΥΑδ ί |
24 часа (15%) 48 часов (40%) [1-394]
6 часов (35%)
24 часа (85%) [1-414]
48 часов (60%)
Фиг. 10А
48 часов (20%)
ΜΗΡΙΡΟδδΡΙ-Ι-αΡΘθανΚΟΚΥΙ_ΥΤΟΟΑααΤΕΑΗΙ-ΕΙΚΕΟΟΤν©ΟΑΑ □αδΡΕ3ΐ_ι_αι_κΑΐ_κρ©νιαιι_ονκτδΚΡΐχαρροοΑΐ-Υ<33ΐ_ΗΡθΡΕΑ
05ΡΚΕΙ_1_Ι_Εϋ(3ΥΝνΥΟ5ΕΑΗΟΙ_ΡΙ_Η1_Ρ(3ΝΚ5ΡΗΚ0ΡΑΡΚ©ΡΑΚΡΙ_Ρ
Ι_Ρ©Ι_ΡΡΑΡΡΕΡΡ<3ΙΙ_ΑΡαΡΡθνθ330Ρ1.3Μν6Ρ3α©Κ3Ρ3ΥΑ3©Θσ
СС5ССС5ССеС50КТНТСРРСРАРЕи.©СР57Р1.РРРКРК0Т1.М13
ΡΤΡΕντσνννονδΗΕΒΡΕνΚΡΝννΥνΟβνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕαΥΝδΤΥ
Ρνν5νΐ_Τνΐ_Ηα0ννΐ_Ν0ΚΕΥΚ0Κν5ΝΚΑΙ_ΡΑΡΙΕΚΤΙ5ΚΑΚααΡΚΕΡ ανΥΤίΡΡδΡΟΕίΤΚΝανδίΤΟίνΚΟΡΥΡδΟΙΑνΕννΕδΝβαΡΕΝΝΥΚ πρρνΐ-θ3θ©3ρρι_Υ3κι_τνοκ3πνναα<3ΝνΡ3θ3νΜΗΕΑΐ.ΗΝΗΥτα
К51.51.5РСК
6 часов (100%) [1-423]
Фиг. 10В
Р6Р21(15)Рс
Фиг. 11
Фиг. 12
- 89 024751 Р65
СП Рс-И5-11РСР21 Ρο-Μ5-ΙιΡΟΕ21(Ρ150Α.Ο151Α,Ι152ν) КЗ Рс-И5-ЬРСР21(С170Е)
М Рс-1_15-1)РСР21(С170Е,Р171А) па Ρο-ί15-Ι)Ρ6Ρ21(6170Ε,δ172ί) * Р<0.05 # Р<0.01 л Р< 0.001
Время (О)
Фиг. 13
О 0.25 1 3 5 7 9
Время (ϋ)
Фиг. 15
Μ РВ5
СП Рс.1_15.РСР21(С170Е) Н РС.Ы5.РОР21 (С170А) ΙΖΖΙ Рс.1_15.РСР21(О170С) = Рс.1_15.РСР21(С170О)
ΡοΓ15.ΡΟΡ21(0170Ν) ΕΚΙ РС.1.15.РОР21 (01703) * Р<0.05 # Р<0.01
Л Р< 0.001
Активное лечение по сравнению с РВЗ
Фиг. 16
Фиг. 17
- 90 024751
- 91 024751
- 92 024751
- 93 024751
- 94 024751
Рс(15)РСР21
ΜΟΚΤΗΤΟΡΡΟΡΑΡΕίΙΟΟΡδνΡΙΡΡΡΚΡΚϋΤΙΜΙδΚΤΡΕνΤΟνννον 5ΗΕΟΡΕνΚΡΝ^νθανΕνΗΝΑΚΤΚΡΡΕΕ<2ΥΝ3ΤΥΚνν5νΐ-Τνΐ-Ηαθ ννΐΝΟΚΕΥΚαΚν5ΝΚΑΙ_ΡΑΡΙΕΚΤΙ5ΚΑΚθαΡΒΕΡανΥΤΙ-ΡΡδΡΟΕΙ-Τ ΚΝθν31Τ0Ι.νΐ«ΪΡΥΡ80ΙΑνΕννΕ8ΝββΡΕΝΝΥΚπΡΡνΐ.03Ο63ΡΡΙ. ΥδΚΙΤν0ΚδΡνν006ΝνΡ3εδνΜΗΕΑΙΗΝΗΥΤ0ΚδΙδΙδΡ6Κ0000 65ΟΟ63Ο0ΟΟ5ΗΡΙΡ083ΡΙ.Ι.ΟΡ(«0θνΒΟΡΥΙ.ΥΤ00ΑΟΟΤΕΑΗ1.ΕΙ ВЕ0СТУССАА0С)ЗРЕЗи.СИ.КА1.КРСУ1СШ.СУКТЗВР1-СС1ВР0СА1. ΥΟδΙ-ΗΡΟΡΕΑ03ΡΒΕΙ.Ι.Ι.ΕΟΟΥΝνΥα3ΕΑΗΟΙ.ΡΙ.ΗΙ.ΡσΝΚ3ΡΗΡΟΡ ΑΡΒΟΡΑΚΡΙ.ΡΙΡΟΙ.ΡΡΑΡΡΕΡΡΟΙίΑΡαΡΡθνθ330Ρ1.3Μν<3Ρ3α<3 Ρ5Ρ3ΥΑ5 |
6 часов (20%)
24 часа (100%) [1-414]
48 часов (=100%) ,
Фиг. 23А
Рс(15)РОР21 С170Е
ΜΟΚΤΗΤΟΡΡΟΡΑΡΕΙ-Ι-ΟΟΡ3νΡΙ.ΡΡΡΚΡΚΟΤΙ-ΜΙ3ΚΤΡΕνΤθνννθν
5ΗΕΟΡΕνΚΡΝννΥνθ6νΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝ3ΤΥΚνν3νΐ.Τνΐ.Ηαθ ννίΝΟΚΕΥΚΟΚνδΝΚΑΙΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΒΕΡΟνΥΠΡΡδΡΟΕίΤ
ΚΝ(5ν8Ι.Τ<:ΐ.νΐ«5ΡΥΡ30ΙΑνΕννΕ3ΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΐ.Ο80Ο3ΡΡΙ_
Υ8ΚΕΤνθΚ3Κννθ<50ΝνΡ303νΜΗΕΑΙ-ΗΝΗΥΤαΚ8Ι.3Ι_8Ρ<5Κ<;<300
63Ο£03ΟΟΟΟ3ΗΡΙΡ033ΡΙ.Ι_ΟΡ66θνΒΟΒΥίΥΤ00ΑΟΟΤΕΑΗίΕΙ
Г?ЕОСТУССААООЗРЕ31.1.01.КА1.КРСУ1(а11.СУКТЗВР1.С<2ВРОСА1.
ΥΟ5Ι_ΗΡ0ΡΕΑ05ΡΚΕΙ.Ι_Ι-Ε06ΥΝνΥ<33ΕΑΗ<;ΐ-ΡΙ-ΗΙ_ΡΟΝΚ5ΡΗΡ0Ρ
АРКСРАКР1_Р1.РС1-РРАРРЕРРС11-АР<аРРОУСЗЗОР1_ЗМУЕРЭаС
Ρ3Ρ3ΥΑ3 \6 часов (0%)
24 часа (20%) [1-421]
48 часов (=40%)
Фиг. 23В
Рс(15)РЭР21 Р171А
ΜΟΚΤΗΤΟΡΡΟΡΑΡΕίΕΟΟΡδνΡίΡΡΡΚΡΚϋΤίΜΙδΚΤΡΕνΤΟνννον δΗΕϋΡΕνΚΡΝννΥνΟΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΡΕΕΟΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΓΗαΟ ννίΝΟΚΕΥΚΟΚνδΝΚΑΙΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΚΕΡανΥΤΕΡΡδΚΟΕίΤ
ΚΝθν31-ΤΟΙ_νΚΘΡΥΡ50ΙΑνΕννΕ5ΝθαΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΐ-05005ΡΠΥ5ΚίΤνθΚ5Βνν(2αθΝνΡ502νΜΗΕΑΙ-ΗΝΗΥΤ(2Κ5Ι-5Ι-5Ρ(;ΚΟ<300
6δΰΟΟ36(3(;θδΗΡΙΡ033ΡΙ.Ι.ΟΡ060νΒΟΒΥΙ.ΥΤ00ΑΟΟΤΕΑΗΙ.ΕΙ
ΚΕΟΟΤνθΟΑΑθαδΡΕ3Ι-Ι-ΟΙ-ΚΑΙ-ΚΡ6νΐΟΙΙ.θνΚΤ3ΚΡΙ-θαΚΡϋΟΑΙ.
Υ05Ι_ΗΡΟΡΕΑε5ΡΒΕΙ_Ι-1-ΕΟΟΥΝνΥα3ΕΑΗΟΙ-ΡΙ_Η1-ΡΟΝΚ5ΡΗΒΟΡ
АРВСРАКР1.Р1.РС1.РРАРРЕРРе11-АР<аРР0У6350Р1-ЗМУеАЗа<3
ΡδΡδ^ΥΑδ
6 часов (0%)
24 часа (=30%) [1-421]
48 часов (=50%)
Фиг. 23С
Рс(15)РСР21 51721.
ΜοκτΗτορροΡΑΡΕΙίοορδνριρρρκρκοτίΜΙδκτΡΕντονννον
3ΗΕΟΡΕνΚΡΝννΥνθ<3νΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕαΥΝ5ΤΥΚνν3νΐ-Τνΐ-Ηαθ ννίΝΟΚΕΥΚΟΚνδΝΚΑίΡΑΡΙΕΚΤΙδΚΑΚΟΟΡΡΕΡΟνΥΤίΡΡδΡΟΕΙΤ
ΚΝθνδΙ.Τεΐ.νΚ6ΡΥΡ80ΙΑνΕννΕ3Ν60ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΐ.030<33ΡΡΙ
Υ3ΚίΤν0Κ5ΒννθααΝνΡ303νΜΗΕΑΙ_ΗΝΗΥΤ<2Κ3Ι-3Ι-5ΡΘΚ0<3Ο0
С5СС65СС0СЗНР1Р055Р1-1-<аР6СС)7ВаКУ1.УТ00АааТЕАН1.Е1
ΚΕΟΟΤνθΟΑΑθα3ΡΕ3Ι.Ι.<5Ι.ΚΑΙ.ΚΡθνΐαΐΙ.<3νΚΤ3ΒΡΙ.θαΚΡ06ΑΙ.
ΥΟ3Ι_ΗΡ0ΡΕΑ03ΡΒΕΙ_Ι.Ι_Ε0ΟΥΝνΥΟ3ΕΑΗ(3Ι_ΡΙ_ΗΙ_ΡΟΝΚ3ΡΗΒΟΡ
ΑΡΒΟΡΑΚΡΙ.ΡΙ.ΡΘΙ.ΡΡΑΡΡΕΡΡΟΙΙ.ΑΡαΡΡθνθ350ΡΙ.5ΜνθΡΙ.αβ
Ρ3Ρ3ΥΑ3 Γ
6 часов (0%) [1-414] 24 часа (100%)
48 часов (100%)
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US5891908P | 2008-06-04 | 2008-06-04 | |
US5886108P | 2008-06-04 | 2008-06-04 | |
US16436409P | 2009-03-27 | 2009-03-27 | |
US17573609P | 2009-05-05 | 2009-05-05 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201270758A1 EA201270758A1 (ru) | 2013-12-30 |
EA024751B1 true EA024751B1 (ru) | 2016-10-31 |
EA024751B8 EA024751B8 (ru) | 2020-01-31 |
Family
ID=40984291
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201270758A EA024751B8 (ru) | 2008-06-04 | 2009-06-03 | Мутанты fgf21 и их применение |
EA201690946A EA034847B1 (ru) | 2008-06-04 | 2009-06-03 | Мутанты fgf21 и их применение |
EA201001883A EA017690B1 (ru) | 2008-06-04 | 2009-06-03 | Мутанты fgf21 и их применение |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201690946A EA034847B1 (ru) | 2008-06-04 | 2009-06-03 | Мутанты fgf21 и их применение |
EA201001883A EA017690B1 (ru) | 2008-06-04 | 2009-06-03 | Мутанты fgf21 и их применение |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (9) | US8034770B2 (ru) |
EP (1) | EP2296690B1 (ru) |
JP (5) | JP2011523561A (ru) |
KR (2) | KR101651697B1 (ru) |
CN (1) | CN102143758B (ru) |
AR (1) | AR072009A1 (ru) |
AU (1) | AU2009256232B2 (ru) |
BR (2) | BR122020010972B1 (ru) |
CA (1) | CA2726589C (ru) |
CL (1) | CL2010001346A1 (ru) |
CO (1) | CO6341566A2 (ru) |
CR (1) | CR11851A (ru) |
EA (3) | EA024751B8 (ru) |
IL (1) | IL209395A (ru) |
JO (1) | JOP20190083A1 (ru) |
MA (1) | MA33142B1 (ru) |
MX (2) | MX346396B (ru) |
MY (1) | MY152721A (ru) |
NZ (1) | NZ590050A (ru) |
PE (1) | PE20100253A1 (ru) |
SG (1) | SG193860A1 (ru) |
TW (2) | TWI526220B (ru) |
WO (1) | WO2009149171A2 (ru) |
Families Citing this family (104)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104163864B (zh) | 2007-03-30 | 2017-08-01 | Ambrx公司 | 经修饰fgf‑21多肽和其用途 |
JOP20190083A1 (ar) | 2008-06-04 | 2017-06-16 | Amgen Inc | بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها |
EA201990619A1 (ru) | 2008-10-10 | 2019-07-31 | Амген Инк. | Fgf21 мутанты и их применение |
WO2010065439A1 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Eli Lilly And Company | Variants of fibroblast growth factor 21 |
UY32607A (es) * | 2009-05-05 | 2010-12-31 | Amgen Inc | Mutantes de fgf21 y usos del mismo |
EP2427207B1 (en) | 2009-05-05 | 2017-08-16 | Amgen, Inc | Fgf21 mutants and uses thereof |
JP2012530493A (ja) | 2009-06-17 | 2012-12-06 | アムジエン・インコーポレーテツド | キメラポリペプチドおよびその使用 |
WO2011006072A2 (en) * | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Northwestern University | Cardioprotective role of hepatic cells and hepatocyte secretory factors in myocardial ischemia |
CN101993485B (zh) * | 2009-08-20 | 2013-04-17 | 重庆富进生物医药有限公司 | 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途 |
MX2012006397A (es) | 2009-12-02 | 2012-11-30 | Amgen Inc | PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA. |
UA109888C2 (uk) | 2009-12-07 | 2015-10-26 | ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ | |
WO2011107494A1 (de) | 2010-03-03 | 2011-09-09 | Sanofi | Neue aromatische glykosidderivate, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und deren verwendung |
CA2796055A1 (en) | 2010-04-15 | 2011-10-20 | Amgen Inc. | Human fgf receptor and .beta.-klotho binding proteins |
DE102010015123A1 (de) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Benzylamidische Diphenylazetidinone, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung |
EP2558115B1 (en) | 2010-04-16 | 2019-07-31 | The Salk Institute for Biological Studies | Methods for treating metabolic disorders using fgf |
US8530413B2 (en) | 2010-06-21 | 2013-09-10 | Sanofi | Heterocyclically substituted methoxyphenyl derivatives with an oxo group, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments |
TW201215388A (en) | 2010-07-05 | 2012-04-16 | Sanofi Sa | (2-aryloxyacetylamino)phenylpropionic acid derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments |
TW201221505A (en) | 2010-07-05 | 2012-06-01 | Sanofi Sa | Aryloxyalkylene-substituted hydroxyphenylhexynoic acids, process for preparation thereof and use thereof as a medicament |
TW201215387A (en) | 2010-07-05 | 2012-04-16 | Sanofi Aventis | Spirocyclically substituted 1,3-propane dioxide derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as a medicament |
JP2013536233A (ja) | 2010-08-23 | 2013-09-19 | アムジエン・インコーポレーテツド | グルコキナーゼ調節タンパク質と相互作用する糖尿病治療用の化合物 |
RU2013118441A (ru) | 2010-11-05 | 2014-12-10 | КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед | Антидиабетические соединения |
CN102464712A (zh) * | 2010-11-11 | 2012-05-23 | 重庆富进生物医药有限公司 | 缺失型人成纤维细胞生长因子21变异体及其偶联物 |
US20140155415A1 (en) | 2011-04-05 | 2014-06-05 | Michael David BARTBERGER | Benzodioxepine and benzodioxine compounds that interact with glucokinase regulatory protein for the treatment of diabetes |
US8754044B2 (en) | 2011-05-03 | 2014-06-17 | Northwestern University | Neuroprotection by hepatic cells and hepatocyte secretory factors |
KR102077721B1 (ko) | 2011-07-01 | 2020-02-14 | 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. | 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법 |
MX2014002260A (es) * | 2011-08-31 | 2014-08-18 | Amgen Inc | Factor de crecimiento de fibroblasto 21 para usar en el tratamiento de diabetes tipo 1. |
EP2567959B1 (en) | 2011-09-12 | 2014-04-16 | Sanofi | 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors |
WO2013037390A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-21 | Sanofi | 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors |
TWI593708B (zh) * | 2011-09-26 | 2017-08-01 | 諾華公司 | 治療代謝病症之融合蛋白質 |
EP2760862B1 (en) | 2011-09-27 | 2015-10-21 | Sanofi | 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-alkyl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors |
AR087973A1 (es) * | 2011-10-04 | 2014-04-30 | Lilly Co Eli | Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos |
CN102558358A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-07-11 | 张海涛 | 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用 |
WO2013123444A1 (en) | 2012-02-17 | 2013-08-22 | Amgen Inc. | Sulfonyl compounds that interact with glucokinase regulatory protein |
US9475856B2 (en) | 2012-03-02 | 2016-10-25 | New York University | Chimeric FGF21 proteins with enhanced binding affinity for β-klotho for the treatment of type II diabetes, obesity, and related metabolic disorders |
WO2013173382A1 (en) | 2012-05-15 | 2013-11-21 | Amgen Inc. | Benzothiophene sulfonamides and other compounds that interact with glucokinase regulatory protein |
WO2013172967A1 (en) | 2012-05-17 | 2013-11-21 | Extend Biosciences, Inc | Carriers for improved drug delivery |
US9474785B2 (en) | 2012-06-07 | 2016-10-25 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use |
US9464126B2 (en) | 2012-06-07 | 2016-10-11 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use |
US9657075B2 (en) | 2012-06-07 | 2017-05-23 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use |
TWI513705B (zh) * | 2012-06-11 | 2015-12-21 | Lilly Co Eli | 纖維母細胞生長因子21蛋白質 |
AU2013274639A1 (en) | 2012-06-11 | 2014-11-06 | Eli Lilly And Company | Fibroblast growth factor 21 variants |
AR092076A1 (es) * | 2012-08-22 | 2015-03-18 | Lilly Co Eli | Proteinas homodimericas |
EP3798228A1 (en) | 2012-11-28 | 2021-03-31 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases |
US9290557B2 (en) | 2012-11-28 | 2016-03-22 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides |
US9273107B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-03-01 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
ES2915851T3 (es) | 2012-12-27 | 2022-06-27 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Péptidos quiméricos de FGF19 para usar en el tratamiento de trastornos de ácidos biliares |
WO2014130659A1 (en) | 2013-02-22 | 2014-08-28 | New York University | Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use |
WO2014149699A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Eli Lilly And Company | Bifunctional protein |
CN103191415A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-07-10 | 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 | 成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备治疗高血压的药物中的应用 |
EP3057605A1 (en) | 2013-10-18 | 2016-08-24 | Novartis AG | Methods of treating diabetes and related disorders |
WO2015061331A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-04-30 | Salk Institute For Biological Studies | Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use |
JP6621752B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-12-18 | ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ | 変異した線維芽細胞増殖因子(fgf)1および使用方法 |
CA2927592C (en) | 2013-10-28 | 2020-08-18 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Fgf-19 variants for treating a fgf-19 dependent cancer or tumor |
EP3097122B9 (en) | 2014-01-24 | 2020-11-11 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | Antibodies binding beta klotho domain 2 and methods of use thereof |
JP6712230B2 (ja) | 2014-03-11 | 2020-06-17 | ノバルティス アーゲー | リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法 |
US10519240B2 (en) | 2014-03-25 | 2019-12-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-FGFR1c antibody-FGF21 fusion proteins |
WO2015183890A2 (en) * | 2014-05-28 | 2015-12-03 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the treatment of metabolic disorders and diseases |
US10456449B2 (en) | 2014-06-16 | 2019-10-29 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases |
US9616109B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-04-11 | Extend Biosciences, Inc. | Insulin vitamin D conjugates |
US9789197B2 (en) | 2014-10-22 | 2017-10-17 | Extend Biosciences, Inc. | RNAi vitamin D conjugates |
CA2964463C (en) | 2014-10-22 | 2024-02-13 | Extend Biosciences, Inc. | Therapeutic vitamin d conjugates |
IL251834B2 (en) | 2014-10-23 | 2023-09-01 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Pharmaceutical compositions containing peptide variants and methods of using them |
PL3412302T3 (pl) | 2014-10-24 | 2021-11-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Zmodyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowania |
WO2016073855A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders |
KR102427527B1 (ko) | 2014-12-23 | 2022-08-01 | 노보 노르디스크 에이/에스 | Fgf21 유도체 및 그것의 용도 |
KR20160088656A (ko) | 2015-01-16 | 2016-07-26 | 주식회사유한양행 | 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
US11638745B2 (en) | 2015-05-20 | 2023-05-02 | University of Pittsburgh—Of the Commonwealth Cvctom of Hierher Education | Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients |
US10800843B2 (en) | 2015-07-29 | 2020-10-13 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Beta klotho-binding proteins |
KR102668200B1 (ko) * | 2015-10-28 | 2024-05-23 | 주식회사유한양행 | 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
KR102670157B1 (ko) * | 2015-10-28 | 2024-05-29 | 주식회사유한양행 | 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
AU2016344134A1 (en) | 2015-10-30 | 2018-05-31 | Salk Institute For Biological Studies | Treatment of steroid-induced hyperglycemia with fibroblast growth factor (FGF) 1 analogs |
CA3082794A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | Ngm Biopharmaceuticals Inc. | Methods for treatment of bile acid-related disorders |
TW201731867A (zh) * | 2015-12-02 | 2017-09-16 | 賽諾菲公司 | Fgf21變異體 |
WO2017116207A1 (ko) * | 2015-12-31 | 2017-07-06 | 한미약품 주식회사 | Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도 |
US20190142963A1 (en) * | 2016-04-15 | 2019-05-16 | Richard D. DiMarchi | Fgf21 c-terminal peptide optimization |
MA45797A (fr) | 2016-08-01 | 2021-04-21 | Hope Medicine Nanjing Co Ltd | Mutant de mg53, son procédé de préparation et ses utilisations |
CN106279437B (zh) | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
CN107759694B (zh) | 2016-08-19 | 2023-01-13 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 双特异性抗体及其制备方法与用途 |
US11123438B2 (en) | 2016-08-19 | 2021-09-21 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Linker peptide for constructing fusion protein |
EP3503882A4 (en) | 2016-08-26 | 2020-07-29 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | METHOD FOR TREATING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-19-MEDIATED CARCINOMAS AND TUMORS |
AU2017358289A1 (en) | 2016-11-10 | 2019-06-20 | Yuhan Corporation | Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins |
WO2018115401A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Sanofi | Fgf21 compound / glp-1r agonist combinations with optimized activity ratio |
CN108619490A (zh) * | 2017-03-22 | 2018-10-09 | 天士力医药集团股份有限公司 | 一种长效化突变的人源成纤维生长因子的新用途 |
MX2019012331A (es) * | 2017-04-21 | 2020-01-23 | Yuhan Corp | Metodo para producir proteinas de doble funcion y sus derivados. |
CN107056925B (zh) * | 2017-04-28 | 2022-01-14 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 人fgf21突变体、其制备方法及用途 |
AU2018297285A1 (en) | 2017-07-06 | 2020-01-30 | Yale University | Compositions and methods for treating or preventing endocrine FGF-linked diseases |
CN111050786A (zh) | 2017-09-08 | 2020-04-21 | 百时美施贵宝公司 | 用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法的修饰的成纤维细胞生长因子21(fgf-21) |
CN115109166A (zh) * | 2017-11-24 | 2022-09-27 | 浙江道尔生物科技有限公司 | 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白 |
CN111518770B (zh) | 2017-12-19 | 2023-01-06 | 北京吉源生物科技有限公司 | 一种表达glp1和fgf21的干细胞及其用途 |
CN110128525B (zh) * | 2018-02-08 | 2022-08-26 | 广东东阳光药业有限公司 | Fgf21变体、融合蛋白及其应用 |
JP7492463B2 (ja) | 2018-07-03 | 2024-05-29 | ブリストル-マイヤーズ スクイブ カンパニー | Fgf-21製剤 |
CA3123325A1 (en) * | 2019-03-05 | 2020-09-10 | Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. | A polypeptide molecule and application thereof |
US11427623B1 (en) | 2019-05-28 | 2022-08-30 | 89Bio Ltd. | Methods of treatment using mutant FGF-21 peptide conjugates |
US11542309B2 (en) | 2019-07-31 | 2023-01-03 | Salk Institute For Biological Studies | Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose |
US20220016211A1 (en) | 2020-01-08 | 2022-01-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Fgf-21 conjugate formulations |
JP7392491B2 (ja) * | 2020-01-21 | 2023-12-06 | トヨタ自動車株式会社 | 電源システム |
US11981718B2 (en) | 2020-05-27 | 2024-05-14 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation |
WO2022032187A1 (en) | 2020-08-07 | 2022-02-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Fgf21 combined with ccr2/5 antagonists for the treatment of fibrosis |
US20240123031A1 (en) | 2020-11-25 | 2024-04-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of treating liver diseases |
WO2023035817A1 (zh) | 2021-09-08 | 2023-03-16 | 北京志道生物科技有限公司 | 一种fgf21突变蛋白及其应用 |
CA3233918A1 (en) | 2021-10-13 | 2023-04-20 | Mariana N. Dimitrova | Pharmaceutical compositions of efruxifermin |
CN113980147B (zh) * | 2021-11-26 | 2023-07-28 | 中国药科大学 | 一种聚多肽与fgf21融合蛋白突变体及其应用 |
WO2023173021A2 (en) * | 2022-03-11 | 2023-09-14 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods and compositions for the treatment of alcohol toxicity |
WO2024059507A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | Akero Therapeutics, Inc. | Fgf21 mutant polypeptides |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001018172A2 (en) * | 1999-09-07 | 2001-03-15 | Amgen, Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
WO2005061712A1 (en) * | 2003-12-10 | 2005-07-07 | Eli Lilly And Company | Muteins of fibroblast growth factor 21 |
WO2005091944A2 (en) * | 2004-03-17 | 2005-10-06 | Eli Lilly And Company | Glycol linked fgf-21 compounds |
Family Cites Families (175)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4263428A (en) | 1978-03-24 | 1981-04-21 | The Regents Of The University Of California | Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same |
JPS6023084B2 (ja) | 1979-07-11 | 1985-06-05 | 味の素株式会社 | 代用血液 |
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
US4436366A (en) | 1981-02-17 | 1984-03-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | End capping an optical fiber |
AR230173A1 (es) | 1981-06-29 | 1984-03-01 | American Cyanamid Co | Instrumento para ligaciones quirurgicas |
US4640835A (en) | 1981-10-30 | 1987-02-03 | Nippon Chemiphar Company, Ltd. | Plasminogen activator derivatives |
EP0088046B1 (de) | 1982-02-17 | 1987-12-09 | Ciba-Geigy Ag | Lipide in wässriger Phase |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
EP0133968B1 (en) | 1983-07-29 | 1989-06-07 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Solid state overcurrent detector |
HUT35524A (en) | 1983-08-02 | 1985-07-29 | Hoechst Ag | Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance |
US4615885A (en) | 1983-11-01 | 1986-10-07 | Terumo Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition containing urokinase |
US4496689A (en) | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
DE3572982D1 (en) | 1984-03-06 | 1989-10-19 | Takeda Chemical Industries Ltd | Chemically modified lymphokine and production thereof |
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
EP0206448B1 (en) | 1985-06-19 | 1990-11-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide) |
CA1310924C (en) | 1986-04-24 | 1992-12-01 | Francis P. Mccormick | Infective drug delivery system |
US4791192A (en) | 1986-06-26 | 1988-12-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified protein with polyethyleneglycol |
US4970154A (en) | 1987-10-09 | 1990-11-13 | Baylor College Of Medicine | Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency |
ATE106249T1 (de) | 1987-11-05 | 1994-06-15 | Hybritech Inc | Polysaccharidmodifizierte immunglobuline mit reduziertem immunogenem potential oder verbesserter pharmakokinetik. |
US4892538A (en) | 1987-11-17 | 1990-01-09 | Brown University Research Foundation | In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells |
US5106627A (en) | 1987-11-17 | 1992-04-21 | Brown University Research Foundation | Neurological therapy devices |
US5158881A (en) | 1987-11-17 | 1992-10-27 | Brown University Research Foundation | Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments |
US5011472A (en) | 1988-09-06 | 1991-04-30 | Brown University Research Foundation | Implantable delivery system for biological factors |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
ATE135370T1 (de) | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5288855A (en) * | 1989-01-23 | 1994-02-22 | Farmitalia Carlo Erba | Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor |
DK0481000T3 (da) * | 1989-07-06 | 1999-11-15 | Univ California | Receptorer for fibroblastvækstfaktorer |
US5676954A (en) | 1989-11-03 | 1997-10-14 | Vanderbilt University | Method of in vivo delivery of functioning foreign genes |
US5272071A (en) | 1989-12-22 | 1993-12-21 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line |
ES2151463T5 (es) | 1989-12-22 | 2012-10-29 | Merck Serono Sa | Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos |
WO1991010470A1 (en) | 1990-01-08 | 1991-07-25 | Brown University Research Foundation | Devices and methods for enhanced delivery of active factors |
JP3068180B2 (ja) | 1990-01-12 | 2000-07-24 | アブジェニックス インコーポレイテッド | 異種抗体の生成 |
US5672510A (en) | 1990-01-19 | 1997-09-30 | Genetic Therapy, Inc. | Retroviral vectors |
ES2204886T3 (es) | 1990-07-06 | 2004-05-01 | Gencell S.A. | Receptores de factor de crecimiento fibroblastico. |
ATE158021T1 (de) | 1990-08-29 | 1997-09-15 | Genpharm Int | Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper |
US5217889A (en) | 1990-10-19 | 1993-06-08 | Roninson Igor B | Methods and applications for efficient genetic suppressor elements |
US5252714A (en) | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
US5229501A (en) * | 1991-01-11 | 1993-07-20 | Chiron Corporation | Expression and use of human fibroblast growth factor receptor |
US6565841B1 (en) | 1991-03-15 | 2003-05-20 | Amgen, Inc. | Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor |
IL100219A0 (en) | 1991-12-02 | 1992-09-06 | Yeda Res & Dev | Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity |
WO1993015722A1 (en) | 1992-02-07 | 1993-08-19 | Syntex (Usa) Inc. | Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles |
US5234784A (en) | 1992-04-01 | 1993-08-10 | Eastman Kodak Company | Method of making a projection viewable transparency comprising an electrostatographic toner image |
US5364791A (en) | 1992-05-14 | 1994-11-15 | Elisabetta Vegeto | Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations |
CA2136439A1 (en) * | 1992-06-18 | 1994-01-06 | Michael Philip Nova | Process for detection of neoplastic disease |
ES2301158T3 (es) | 1992-07-24 | 2008-06-16 | Amgen Fremont Inc. | Produccion de anticuerpos xenogenicos. |
US5474914A (en) | 1992-07-29 | 1995-12-12 | Chiron Corporation | Method of producing secreted CMV glycoprotein H |
US5489743A (en) | 1993-01-19 | 1996-02-06 | Amgen Inc. | Transgenic animal models for thrombocytopenia |
US5581476A (en) | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
AU6700594A (en) | 1993-05-07 | 1994-12-12 | Sterling Winthrop Inc. | Lactose-hydrolyzed milk and milk products with improved taste and suppressed sweetness |
US6664107B1 (en) | 1993-05-26 | 2003-12-16 | Ontario Cancer Institute, University Health Network | CD45 disrupted nucleic acid |
WO1994028122A1 (en) | 1993-05-26 | 1994-12-08 | Ontario Cancer Institute | Transgenic mammals lacking expression of particular cd45 isoforms |
US5654168A (en) | 1994-07-01 | 1997-08-05 | Basf Aktiengesellschaft | Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units |
AU684524B2 (en) | 1993-06-14 | 1997-12-18 | Tet Systems Holding Gmbh & Co. Kg | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
US5589362A (en) | 1993-06-14 | 1996-12-31 | Basf Aktiengesellschaft | Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities |
WO1995005452A2 (en) | 1993-08-12 | 1995-02-23 | Cytotherapeutics, Inc. | Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules |
US5658785A (en) | 1994-06-06 | 1997-08-19 | Children's Hospital, Inc. | Adeno-associated virus materials and methods |
US5484720A (en) | 1994-09-08 | 1996-01-16 | Genentech, Inc. | Methods for calcium phosphate transfection |
US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
US6096871A (en) | 1995-04-14 | 2000-08-01 | Genentech, Inc. | Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life |
DE69637481T2 (de) | 1995-04-27 | 2009-04-09 | Amgen Fremont Inc. | Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8 |
WO1996037609A1 (en) | 1995-05-26 | 1996-11-28 | Zeneca Limited | A gene switch comprising an ecdysone receptor |
JPH11506722A (ja) | 1995-06-07 | 1999-06-15 | ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン | 細胞に核酸を送達するための核酸運搬体 |
US5849303A (en) | 1995-06-07 | 1998-12-15 | American Home Products Corporation | Recombinant feline Immunodeficiency virus subunit vaccines employing baculoviral-expressed envelope glycoproteins derived from isolate NCSU-1 and their use against feline immunodeficiency virus infection |
WO1996041865A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-27 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Rapamcycin-based regulation of biological events |
ATE465149T1 (de) | 1996-02-28 | 2010-05-15 | Ariad Pharma Inc | Synthetische rapamycinderivate als multimerisierende wirkstoffe für chimere proteine mit von immunophilin abgeleiteten domänen |
EP0904107B1 (en) | 1996-03-18 | 2004-10-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobin-like domains with increased half lives |
US5679559A (en) | 1996-07-03 | 1997-10-21 | University Of Utah Research Foundation | Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery |
US6214795B1 (en) * | 1996-11-12 | 2001-04-10 | Praecis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity |
CA2276108C (en) * | 1996-12-26 | 2009-03-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel peptide, novel dna, and novel antibody |
US6133426A (en) | 1997-02-21 | 2000-10-17 | Genentech, Inc. | Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies |
US6342220B1 (en) | 1997-08-25 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Agonist antibodies |
KR100506786B1 (ko) | 1997-11-25 | 2005-08-08 | 제넨테크, 인크. | 섬유아세포 성장인자-19 |
US6150098A (en) | 1998-02-20 | 2000-11-21 | Amgen Inc. | Methods for identifying novel secreted mammalian polypeptides |
ZA200007412B (en) | 1998-05-15 | 2002-03-12 | Imclone Systems Inc | Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases. |
NL1010174C1 (nl) | 1998-09-24 | 2000-03-27 | Busschers Metaalbedrijf Bv | Inrichting en werkwijze voor het buigen van buisvormig en staafvormig materiaal. |
US6548634B1 (en) * | 1998-09-30 | 2003-04-15 | Chiron Corporation | Synthetic peptides having FGF receptor affinity |
US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
US6369109B1 (en) | 1998-10-28 | 2002-04-09 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts | Betulinic acid and derivatives thereof useful for the treatment of neuroectodermal tumor |
WO2000027885A1 (fr) | 1998-11-05 | 2000-05-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau popypeptide chimerique |
AU3224700A (en) | 1999-02-08 | 2000-08-25 | Chiron Corporation | Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion |
AU3755900A (en) | 1999-03-15 | 2000-10-04 | Chiron Corporation | Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye |
CA2311201A1 (en) | 1999-08-05 | 2001-02-05 | Genset S.A. | Ests and encoded human proteins |
US7408047B1 (en) * | 1999-09-07 | 2008-08-05 | Amgen Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
AU7368100A (en) | 1999-09-10 | 2001-04-10 | Curagen Corporation | Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same |
WO2001032678A1 (en) | 1999-11-05 | 2001-05-10 | Smithkline Beecham Corporation | sbgFGF-19a |
US6254671B1 (en) | 1999-11-15 | 2001-07-03 | Engelhard Corporation | Very green-shade yellow metallized disazo pigment |
US6716626B1 (en) | 1999-11-18 | 2004-04-06 | Chiron Corporation | Human FGF-21 nucleic acids |
ES2335386T3 (es) | 1999-11-18 | 2010-03-26 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Gen fgf-21 humano y productos de expresion genica. |
WO2001038357A2 (en) | 1999-11-22 | 2001-05-31 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor |
US7108984B2 (en) * | 2000-01-12 | 2006-09-19 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods of identifying modulators of the FGF receptor |
WO2001049849A1 (en) | 2000-01-05 | 2001-07-12 | Zymogenetics, Inc. | Novel fgf homolog zfgf11 |
US20020081663A1 (en) | 2000-01-05 | 2002-06-27 | Conklin Darrell C. | Novel FGF homolog ZFGF11 |
WO2001072957A2 (en) | 2000-03-31 | 2001-10-04 | Nobuyuki Itoh | Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof |
JP2002112772A (ja) | 2000-07-10 | 2002-04-16 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ポリペプチドおよびそのdna |
IL139380A0 (en) | 2000-10-31 | 2001-11-25 | Prochon Biotech Ltd | Active variants of fibroblast growth factor |
US20060223114A1 (en) * | 2001-04-26 | 2006-10-05 | Avidia Research Institute | Protein scaffolds and uses thereof |
US20030157561A1 (en) | 2001-11-19 | 2003-08-21 | Kolkman Joost A. | Combinatorial libraries of monomer domains |
US20040018499A1 (en) | 2001-06-06 | 2004-01-29 | Lal Preeti G | Extracellular messengers |
EP1423428B2 (en) | 2001-06-20 | 2012-11-14 | Fibron Ltd. | Antibodies that block fgfr3 activation, methods of screening for and uses thereof |
JP4444652B2 (ja) | 2001-07-11 | 2010-03-31 | マキシゲン・ホールディングズ・リミテッド | G−csf結合体 |
US20040259780A1 (en) * | 2001-07-30 | 2004-12-23 | Glasebrook Andrew Lawrence | Method for treating diabetes and obesity |
WO2003038054A2 (en) * | 2001-10-31 | 2003-05-08 | New York University | Structure-based design and synthesis of fgf inhibitors and fgf modulator compounds |
CA2468610A1 (en) | 2002-01-15 | 2003-07-24 | Eli Lilly And Company | Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients |
ES2363765T3 (es) * | 2002-01-31 | 2011-08-16 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Agonistas de fgfr. |
EP1332761A1 (en) * | 2002-01-31 | 2003-08-06 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Agonists of fibroblast growth factor receptors (FGFR) |
IL149562A0 (en) * | 2002-05-09 | 2002-11-10 | Prochon Ltd | Fgf variants and methods for use thereof |
JP2003334088A (ja) | 2002-05-22 | 2003-11-25 | Pharma Design Inc | ヒト由来の新規Klotho様タンパク質及びその遺伝子 |
WO2004022095A1 (en) | 2002-09-04 | 2004-03-18 | Abtech | Anti-idiotypic antibodies as vegf or fgf agonists for bone therapy |
JP2006515747A (ja) | 2002-11-01 | 2006-06-08 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法 |
AU2003287918A1 (en) | 2002-12-20 | 2004-07-14 | Enkam Pharmaceuticals A/S | Method of modulation of interaction between receptor and ligand |
TWI300430B (en) | 2003-01-10 | 2008-09-01 | Ritek Corp | Optical recording medium dye and optical recording medium using thereof |
WO2004083381A2 (en) | 2003-03-13 | 2004-09-30 | Indiana University Advanced Research & Technology Institute | Fibroblast growth factor receptor-1 polynucleotides, polypeptides, and mutants |
JP2006240990A (ja) | 2003-05-15 | 2006-09-14 | Kirin Brewery Co Ltd | klothoタンパク質および抗klothoタンパク質抗体ならびにそれらの用途 |
JP4629047B2 (ja) | 2003-06-12 | 2011-02-09 | イーライ リリー アンド カンパニー | Glp−1アナログ複合タンパク質 |
CN1802167A (zh) | 2003-06-12 | 2006-07-12 | 伊莱利利公司 | 融合蛋白质 |
WO2005019258A2 (en) | 2003-08-11 | 2005-03-03 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
JP4049723B2 (ja) | 2003-09-04 | 2008-02-20 | 沖電気工業株式会社 | 窒化物半導体素子の製造方法及び窒化物半導体素子の製造装置 |
JP4686465B2 (ja) | 2003-10-16 | 2011-05-25 | イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | 繊維芽細胞増殖因子レセプター−1阻害物質及びその治療方法 |
WO2005066211A2 (en) | 2003-12-19 | 2005-07-21 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention |
US20090111742A1 (en) | 2004-01-26 | 2009-04-30 | Alexei Kharitonenkov | Use of fgf-21 and thiazolidinedione for treating type 2 diabetes |
JP4505631B2 (ja) | 2004-03-31 | 2010-07-21 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物 |
EP2194064A1 (en) | 2004-05-13 | 2010-06-09 | Eli Lilly & Company | FGF-21 fusion proteins |
WO2006028714A1 (en) | 2004-09-02 | 2006-03-16 | Eli Lilly And Company | Muteins of fibroblast growth factor 21 |
JP4809352B2 (ja) | 2004-09-02 | 2011-11-09 | イーライ リリー アンド カンパニー | 線維芽細胞成長因子21の突然変異タンパク質 |
EP1796709A4 (en) | 2004-10-07 | 2009-10-28 | Univ California | ANALOGUE OF SHK-TOXIN AND ITS USE AS SELECTIVE INHIBITORS OF KV1.3-KALIUM CHANNELS |
DK2586456T3 (en) | 2004-10-29 | 2016-03-21 | Ratiopharm Gmbh | Conversion and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF) |
US7655627B2 (en) | 2004-12-14 | 2010-02-02 | Eli Lilly And Company | Muteins of fibroblast growth factor 21 |
US20080261875A1 (en) | 2005-01-21 | 2008-10-23 | Eli Lilly And Company | Method For Treating Cardiovascular Disease |
US20060193299A1 (en) * | 2005-02-25 | 2006-08-31 | Cicso Technology, Inc., A California Corporation | Location-based enhancements for wireless intrusion detection |
JP2006246823A (ja) | 2005-03-11 | 2006-09-21 | Kyoto Univ | 造血因子としてのFgf21の使用 |
WO2006130527A2 (en) | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Novartis Ag | Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1 |
NZ565511A (en) * | 2005-07-22 | 2011-03-31 | Five Prime Therapeutics Inc | Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins |
JP2009504183A (ja) | 2005-08-15 | 2009-02-05 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 遺伝子破壊、それに関連する組成物および方法 |
US7395962B2 (en) | 2005-10-28 | 2008-07-08 | United Parcel Service Of America, Inc. | Pick up notice and method of using same |
WO2007055789A2 (en) | 2005-10-31 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Expression of soluble therapeutic proteins |
WO2007056789A1 (en) | 2005-11-16 | 2007-05-24 | Dier Corporation As Trustee For The Reid Family Superannuation Trust | New frame assemblies for security screens |
US20110191871A1 (en) | 2006-02-28 | 2011-08-04 | Trustees Of Boston University | Methods to identify factors associated with muscle growth and uses thereof |
WO2007110079A2 (en) * | 2006-03-29 | 2007-10-04 | Enkam Pharmaceuticals A/S | Targeted delivery of fgfr ligands into the brain |
US8101721B2 (en) | 2006-06-15 | 2012-01-24 | Fibron Ltd. | Antibodies blocking fibroblast growth factor receptor activation and methods of use thereof |
EP2049144B8 (en) | 2006-07-21 | 2015-02-18 | ratiopharm GmbH | Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences |
US20100075375A1 (en) * | 2006-10-03 | 2010-03-25 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates |
US20110008347A1 (en) | 2006-12-01 | 2011-01-13 | Agency For Science ,Technology And Research | Cancer-related protein kinases |
CN104163864B (zh) | 2007-03-30 | 2017-08-01 | Ambrx公司 | 经修饰fgf‑21多肽和其用途 |
EP2550972B1 (en) * | 2007-04-02 | 2018-02-21 | Genentech, Inc. | A Klotho-beta agonist antibody for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance |
US8697369B2 (en) * | 2007-04-06 | 2014-04-15 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method for screening a test substance for activating a receptor associated with FGF 21 activity |
US7537903B2 (en) | 2007-04-23 | 2009-05-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner |
US20100330062A1 (en) | 2007-05-08 | 2010-12-30 | Koeffler H Phillip | Klotho protein and related compounds for the treatment and diagnosis of cancer |
JP2010529954A (ja) | 2007-05-22 | 2010-09-02 | ノバルティス アーゲー | Fgf21関連障害を処置、診断および検出する方法 |
US8481497B2 (en) | 2007-05-29 | 2013-07-09 | Sapporo Medical University | Therapeutic agent for cancer, and method for treatment of cancer |
EP2162535A4 (en) | 2007-06-04 | 2011-02-23 | Novo Nordisk As | O-linked glycosylation using N-acetylglucosamine transferases |
EP3260129A1 (en) | 2007-08-03 | 2017-12-27 | Eli Lilly and Company | An fgf-21 compound and a glp-1 compound for use in the treatment of obesity |
US20090038530A1 (en) | 2007-08-08 | 2009-02-12 | Thieu Truong | Watercraft drogue system |
US8426396B2 (en) | 2008-01-08 | 2013-04-23 | Shriners Hospitals For Children | Treatment for achondroplasia |
TW200936156A (en) * | 2008-01-28 | 2009-09-01 | Novartis Ag | Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides |
WO2009117622A2 (en) | 2008-03-19 | 2009-09-24 | Ambrx, Inc. | Modified fgf-23 polypeptides and their uses |
JOP20190083A1 (ar) * | 2008-06-04 | 2017-06-16 | Amgen Inc | بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها |
WO2010006214A1 (en) | 2008-07-09 | 2010-01-14 | Ambrx, Inc. | Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses |
WO2010017198A2 (en) | 2008-08-04 | 2010-02-11 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Fgfr extracellular domain acidic region muteins |
EA201990619A1 (ru) * | 2008-10-10 | 2019-07-31 | Амген Инк. | Fgf21 мутанты и их применение |
EP2427207B1 (en) | 2009-05-05 | 2017-08-16 | Amgen, Inc | Fgf21 mutants and uses thereof |
UY32607A (es) | 2009-05-05 | 2010-12-31 | Amgen Inc | Mutantes de fgf21 y usos del mismo |
JP2012530493A (ja) | 2009-06-17 | 2012-12-06 | アムジエン・インコーポレーテツド | キメラポリペプチドおよびその使用 |
JP6016636B2 (ja) | 2009-10-15 | 2016-10-26 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 改変したレセプター特異性を持つキメラ線維芽細胞増殖因子 |
MX2012006397A (es) | 2009-12-02 | 2012-11-30 | Amgen Inc | PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA. |
UA109888C2 (uk) | 2009-12-07 | 2015-10-26 | ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ | |
CA2796055A1 (en) | 2010-04-15 | 2011-10-20 | Amgen Inc. | Human fgf receptor and .beta.-klotho binding proteins |
US9023791B2 (en) | 2010-11-19 | 2015-05-05 | Novartis Ag | Fibroblast growth factor 21 mutations |
KR102077721B1 (ko) | 2011-07-01 | 2020-02-14 | 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. | 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법 |
EP2548570A1 (en) | 2011-07-19 | 2013-01-23 | Sanofi | Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome |
MX2014002260A (es) * | 2011-08-31 | 2014-08-18 | Amgen Inc | Factor de crecimiento de fibroblasto 21 para usar en el tratamiento de diabetes tipo 1. |
ES2915851T3 (es) | 2012-12-27 | 2022-06-27 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Péptidos quiméricos de FGF19 para usar en el tratamiento de trastornos de ácidos biliares |
-
2008
- 2008-06-04 JO JOP/2019/0083A patent/JOP20190083A1/ar unknown
-
2009
- 2009-06-03 EP EP09759330.5A patent/EP2296690B1/en active Active
- 2009-06-03 CN CN200980130476.4A patent/CN102143758B/zh active Active
- 2009-06-03 BR BR122020010972-6A patent/BR122020010972B1/pt active IP Right Grant
- 2009-06-03 US US12/455,610 patent/US8034770B2/en active Active
- 2009-06-03 MX MX2012002985A patent/MX346396B/es unknown
- 2009-06-03 EA EA201270758A patent/EA024751B8/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-06-03 JP JP2011512611A patent/JP2011523561A/ja active Pending
- 2009-06-03 WO PCT/US2009/046113 patent/WO2009149171A2/en active Application Filing
- 2009-06-03 KR KR1020117000029A patent/KR101651697B1/ko active IP Right Grant
- 2009-06-03 AU AU2009256232A patent/AU2009256232B2/en active Active
- 2009-06-03 EA EA201690946A patent/EA034847B1/ru unknown
- 2009-06-03 MY MYPI20105725 patent/MY152721A/en unknown
- 2009-06-03 CA CA2726589A patent/CA2726589C/en active Active
- 2009-06-03 MA MA34197A patent/MA33142B1/fr unknown
- 2009-06-03 NZ NZ590050A patent/NZ590050A/xx unknown
- 2009-06-03 EA EA201001883A patent/EA017690B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-06-03 SG SG2013067194A patent/SG193860A1/en unknown
- 2009-06-03 MX MX2010013333A patent/MX2010013333A/es active IP Right Grant
- 2009-06-03 BR BRPI0911385A patent/BRPI0911385B8/pt active IP Right Grant
- 2009-06-03 KR KR1020167010524A patent/KR101787300B1/ko active IP Right Grant
- 2009-06-04 TW TW100144484A patent/TWI526220B/zh active
- 2009-06-04 TW TW098118662A patent/TWI403519B/zh active
- 2009-06-04 PE PE2009000781A patent/PE20100253A1/es active IP Right Grant
- 2009-06-04 AR ARP090102008A patent/AR072009A1/es active IP Right Grant
-
2010
- 2010-11-17 IL IL209395A patent/IL209395A/en active IP Right Grant
- 2010-12-03 CL CL2010001346A patent/CL2010001346A1/es unknown
- 2010-12-16 CR CR11851A patent/CR11851A/es unknown
- 2010-12-30 CO CO10164989A patent/CO6341566A2/es active IP Right Grant
-
2011
- 2011-08-02 US US13/196,544 patent/US8410051B2/en active Active
- 2011-12-15 US US13/327,504 patent/US8642546B2/en active Active
- 2011-12-16 US US13/328,028 patent/US8361963B2/en active Active
-
2013
- 2013-12-19 US US14/134,482 patent/US9273106B2/en active Active
-
2016
- 2016-01-12 JP JP2016003404A patent/JP6250714B2/ja active Active
- 2016-01-22 US US15/004,281 patent/US10011642B2/en active Active
-
2017
- 2017-11-21 JP JP2017223339A patent/JP6960832B2/ja active Active
-
2018
- 2018-06-01 US US15/996,232 patent/US11072640B2/en active Active
-
2019
- 2019-04-26 JP JP2019085051A patent/JP6810190B2/ja active Active
-
2020
- 2020-12-09 JP JP2020204106A patent/JP7191076B2/ja active Active
-
2021
- 2021-06-24 US US17/357,444 patent/US11840558B2/en active Active
-
2023
- 2023-11-01 US US18/499,499 patent/US20240076333A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001018172A2 (en) * | 1999-09-07 | 2001-03-15 | Amgen, Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
WO2005061712A1 (en) * | 2003-12-10 | 2005-07-07 | Eli Lilly And Company | Muteins of fibroblast growth factor 21 |
WO2005091944A2 (en) * | 2004-03-17 | 2005-10-06 | Eli Lilly And Company | Glycol linked fgf-21 compounds |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA024751B1 (ru) | Мутанты fgf21 и их применение | |
EA021425B1 (ru) | Мутанты fgf21 и их применение | |
US9493530B2 (en) | FGF21 mutants comprising a mutation at position 98, 171 and/or 180 | |
DE60036945T2 (de) | Stimulierung oder hemmung von angiogenese und herzvaskularisierung mit tumor nekrose faktor ligand/rezeptor homologen | |
DK1729810T3 (en) | PROCEDURE FOR REDUCING AGGREGATION OF IL-1RA | |
AU2014202582A1 (en) | FGF21 mutants and uses thereof | |
UA116522C2 (uk) | Спосіб лікування метаболічного розладу мутантним fgf21 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM |