EA021425B1 - Мутанты fgf21 и их применение - Google Patents

Мутанты fgf21 и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA021425B1
EA021425B1 EA201171220A EA201171220A EA021425B1 EA 021425 B1 EA021425 B1 EA 021425B1 EA 201171220 A EA201171220 A EA 201171220A EA 201171220 A EA201171220 A EA 201171220A EA 021425 B1 EA021425 B1 EA 021425B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
pop21
polypeptide
mutants
mutant
amino acid
Prior art date
Application number
EA201171220A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201171220A1 (ru
Inventor
Эдвард Джон Белоуски
Мюриэль Мари Эллисон
Агнес Эва Хэмбёргер
Рэнди Айра Хект
Юэ-Шэн Ли
Марк Лео Майклс
Йонгхун Сун
Цзин Сюй
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42455356&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA021425(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA201171220A1 publication Critical patent/EA201171220A1/ru
Publication of EA021425B1 publication Critical patent/EA021425B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение предлагает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие мутантные полипептиды FGF21, мутантные полипептиды FGF21, как таковые, фармацевтические композиции, включающие мутантные полипептиды FGF21, и способы лечения метаболических заболеваний с применением таких нуклеиновых кислот, полипептидов или фармацевтических композиций.

Description

В заявке на данный патент заявлен приоритет предварительной заявки США № 61/175736, поданной 5 мая 2009 г., и предварительной заявки США № 61/285118, поданной 9 декабря 2009 г., все из которых включены в данное изобретение путем ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим мутантные полипептиды РОР21, к мутантным полипептидам РОР21, к фармацевтическим композициям, содержащим мутантные полипептиды Р0Р21, и к способам лечения метаболических заболеваний с применением таких нуклеиновых кислот, полипептидов или фармацевтических композиций.
Уровень техники
РОР21 представляет собой секретеруемый полипептид, принадлежащий к подсемейству факторов роста фибробластов (РОР), которые включают РОР19, РОР21 и РОР23 (ИоЬ е! а1., 2004, Тгепб Оепе!. 20: 563-69). Полипептид РОР21 является атипичным РОР в том отношении, что он независим от гепарина и функционирует как гормон в регуляции глюкозы, липидов и энергетического метаболизма.
РОР21 был выделен из библиотеки кДНК печени как секретируемый печеночный фактор. Он высоко экспрессируется в печени и поджелудочной железе, являясь единственным членом семейства РОР, экспрессируемым, главным образом, в печени. Трансгенные мыши с избыточной экспрессией РОР21 демонстрируют метаболические фенотипы замедленных темпов роста, низкого уровня глюкозы и триглицеридов в плазме, а также отсутствие связанного с возрастом сахарного диабета 2 типа, гиперплазии островковых клеток поджелудочной железы и ожирения. Фармакологическое введение рекомбинантного белка РОР21 в моделях грызунов и приматов приводит к нормализации уровня глюкозы в плазме, к снижению уровня триглицеридов и холестерина, а также к улучшению толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину. В дополнение к этому, РОР21 снижает вес тела и отложения телесного жира за счет увеличения потребления энергии, физической активности и скорости метаболизма. Экспериментальные исследования дают подтверждение фармакологическому введению РОР21 для лечения сахарного диабета 2 типа, ожирения, дислипидемии и других метаболических состояний или заболеваний у человека.
РОР21 человека имеет короткий период полувыведения ίη νίνο. У мышей период полувыведения РОР21 человека составляет от 1 до 2 ч, а у обезьян супошо1ди8 период полувыведения составляет от 2,5 до 3 ч. При разработке белкового препарата РОР21 для применения в качестве лекарства при лечении сахарного диабета 2 типа было бы желательно увеличить период полувыведения. Белки РОР21, имеющие удлиненный период полувыведения, позволили бы реже вводить дозы лекарства больным, получающим такие препараты. Описание таких белков приводится в настоящем документе.
Сущность изобретения
Описан выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 4 и дополнительно содержащий (а) по меньшей мере одно аминокислотное замещение в положении 180 и (Ь) по меньшей мере одно аминокислотное замещение, выбранное из группы, состоящей из (ί) замещения в положении 171; (ίί) замещения в положении 98; и (с) их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенный полипептид включает замещение в положении 98 и замещение в положении 180, где (а) замещение в положении 98 выбирают из группы, состоящей изаргинина, цистеина, глутамовой кислоты, глутамина, лизина и треонина; и (Ь) замещение в положении 180 выбирают из группы, состоящей из глицина, пролина, серина или глутамовой кислоты; и (с) их комбинаций. В одном из вариантов осуществления изобретения остаток в положении 98 является аргинином, а остаток в положении 180 является глутаминовой кислотой. Также представлен слитый полипептид, содержащий выделенный полипептид, слитый с гетерологической аминокислотной последовательностью. В одном варианте осуществления изобретения гетерологическая аминокислотная последовательность представляет собой Рс домен или его фрагмент, и может содержать аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 11. В другом варианте осуществления изобретения полипептид сливают с Рс доменом при помощи линкера и в еще одном варианте осуществления изобретения линкер содержит ОООО8ОООО8ОООО8 (8ЕЦ ГО N0: 31). В одном конкретном варианте осуществления изобретения полипептид содержит 8ЕЦ ГО N0: 47. Также описан мультимер, содержащий два или более слитых полипептида. Также описана фармацевтическая композиция, содержащая выделенный полипептид и фармацевтически приемлемый формообразующий агент, такой как гидрогель. В другом аспекте представлен способ лечения метаболического расстройства, и в одном варианте осуществления данный способ включает введение больному человеку, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, соответствующей настоящему изобретению. В одном варианте осуществления изобретения метаболическим заболеванием является сахарный диабет, а другим метаболическим заболеванием является ожирение. Также представлены нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный полипептид, и в одном варианте осуществления нуклеиновая кислота содержит 8ЕЦ ГО N0: 46. Нуклеиновая кислота может присутствовать в векторе, который сам по себе может присутствовать в клетке-хозяине. В еще одном варианте осуществления изобретения полипептид содержит (а) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (Ь) карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом
- 1 021425 полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего. В других вариантах осуществления изобретения полипептид ковалентно связан с одним или более полимерами, такими как ПЭГ.
В другом варианте осуществления выделенный полипептид содержит замещение в положении 171 и замещение в положении 180, где (а) замещение в положении 180 выбирают из группы, состоящей из глицина, пролина, серина и глутамовой кислоты; (Ь) замещение в положении 171 выбирают из группы, состоящей из аланина, аргинина, аспарагина, аспартамовой кислоты, цистеина, глутамовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана и тирозина; и (с) их комбинаций. В одном варианте осуществления изобретения остаток в положении 171 является глицином, а остаток в положении 180 является глутамовой кислотой. Также представлен полипептид слияния, содержащий выделенный полипептид, слитый с гетерологической аминокислотной последовательностью. В одном варианте осуществления изобретения гетерологическая аминокислотная последовательность является Ре доменом или его фрагментом, и может содержать аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 11. В другом варианте осуществления изобретения полипептид сливают с Рс доменом посредством линкера и в еще одном варианте осуществления изобретения линкер содержит 000080000800008 (8ЕЦ ΙΌ N0: 31). В одном конкретном варианте осуществления изобретения полипептид содержит 8ЕЦ ГО N0: 47. Также описан мультимер, содержащий два или более слитых полипептида. Также описана фармацевтическая композиция, содержащая выделенный полипептид и фармацевтически приемлемый формообразующий агент, такой как гидрогель. В другом аспекте представлен способ лечения метаболического заболевания, и один вариант осуществления изобретения включает введение больному человеку, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции, соответствующей настоящему изобретению. В одном варианте осуществления изобретения метаболическим заболеванием является диабет, а другим метаболическим заболеванием является ожирение.Также представлены нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный полипептид и в одном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота содержит 8Е0 ГО N0: 46. Нуклеиновая кислота может присутствовать в векторе, который сам по себе может присутствовать в клетке-хозяине. В еще одном варианте осуществления изобретения полипептид содержит (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (Ь) карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего. В других вариантах осуществления изобретения полипептид ковалентно связан с одним или более полимеров, например, ПЭГ.
В еще одном варианте осуществления изобретения полипептид содержит замещение в положении 98, замещение в положении 171 и замещение в положении 180, 8ЕЦ ГО N0: 4, где (а) замещение в положении 171 выбирают из группы, состоящей из аланина, аргинина, аспарагина, аспартамовой кислоты, цистеина, глутамовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина; (Ь) замещение в положении 98 выбирают из группы, состоящей из аргинина, цистеина, глутамовой кислоты, глутамина, лизина или треонина; и (с) замещение в положении 180 выбирают из группы, состоящей из глицина, пролина, серина или глутамовой кислоты, и их комбинаций. В дополнительном аспекте остатком в положении 98 является аргинин, остатком в положении 171 является глицин и остатком в положении 180 является глутамовая кислота. Также раскрыт слитой полипептид, содержащий выделенный полипептид, слитый с гетерологической аминокислотной последовательностью. В одном варианте осуществления изобретения гетерологическая аминокислотная последовательность является Рс доменом или его фрагментом и может содержать аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 11. В еще одном варианте осуществления изобретения полипептид слит с Рс доменом при помощи линкера и в еще одном варианте осуществления изобретения линкер содержит 000080000800008 (8ЕЦ ГО N0: 31). В одном конкретном варианте осуществления изобретении полипептид содержит 8ЕЦ ГО N0: 47. Также описан мультимер, содержащий два или более слитых полипептида. Также раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая выделенный полипептид и фармацевтически приемлемый формообразующий агент, например гидрогель. В другом аспекте представлен способ лечения метаболического заболевания, и один вариант осуществления изобретения включает введение больному человеку, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции, соответствующей настоящему изобретению. В одном варианте осуществления изобретения метаболическим заболеванием является диабет, а другим метаболическим заболеванием является ожирение. Также представлены нуклеиновые кислоты, кодирующие выделенный полипептид, и в одном варианте осуществления нуклеиновая кислота содержит 8Е0 ГО N0: 46. Нуклеиновая кислота может присутствовать в векторе, который сам по себе может присутствовать в клетке-хозяине. В еще одном варианте осуществления изобретения полипептид содержит (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (Ь) карбоксиконцевое усечение не более чем 12
- 2 021425 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего. В еще одних вариантах осуществления изобретения полипептид ковалентно связан с одним или более полимерами, например, ПЭГ.
Специфические варианты осуществления изобретения будут очевидны из последующего более подробного описания некоторых вариантов осуществления изобретения и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А-1В показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на усеченных мутантах РОР21 7-181 и 8-181 (фиг. 1А) и усеченных мутантах РОР21 1-172, 1-171, 1-169 и 1-164 (фиг. 1В); каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах РОР21 человека.
На фиг. 2 показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на контрольных образцах РОР21 человека и на усеченных мутантах РОР21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 и 1-149.
На фиг. 3 показаны значения уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили РВ§ (закрашенный столбец), контрольный РОР21 человека (пустой столбец) или усеченные мутанты РОР21 8-181 (серый столбец) и 9-181 (столбец с шахматными клетками).
На фиг. 4 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили РВ§ (закрашенные кружки), контрольный Ре-РОР21 дикого типа (νΤ) (пустые кружки) или усеченные гибридные белки РС-РОР21, включающие аминокислотные остатки 5-181 (закрашенные треугольники) или 7-181 (пустые треугольники).
На фиг. 5 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили РВ§ (закрашенные кружки), контрольный РОР21-Ре (νΤ) (пустые кружки), усеченный гибридный белок РОР21-Ре, включающий аминокислотные остатки 1-175 (закрашенные треугольники) или усеченный белок Ре-РОР21, включающий остатки 1-171 (пустые треугольники).
На фиг. 6Α-6Ό показаны результаты анализа контрольного образца Ре-(О5)-РОР21 (δΕΟ ГО N0: 107) человека (фиг. 6А) и образцов Ре-(О5)-РОР21, полученных от мышей через 6 ч (образец Ό6, фиг. 6В), 24 ч (образец Ό24, фиг. 6С) и 48 ч (образец Ό48, фиг. 6Ό) после инъекции с применением комбинированного способа жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЬС-Μδ).
На фиг. 7Α-7Ό показаны результаты анализа контрольного образца РОР21-(О3)-Ре (δΕΟ ΙΌ N0: 105) человека (фиг. 7А) и образцов РОР21-(О3)-Ре, полученных от мышей через 6 ч (образец Е6, фиг. 7В), 24 ч (образец Е24, фиг. 7С) и 48 ч (образец Е48, фиг. 7Ό) после инъекции, способом ЬС-Μδ.
На фиг. 8А-8Э показаны результаты анализа контрольного образца Рс-(Ь15)-РОР21 (δΕΟ ΙΌ N0: 49) (фиг. 8А) и образцов Рс-(Ь15)-РОР21, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 8В), 24 ч (фиг. 8С) и 48 ч (фиг. 8Ό) после инъекции, способом ЬС-Μδ.
На фиг. 9А-9Э показаны результаты анализа контрольного образца РОР21-(Ь15)-Рс (δΕΟ ΙΌ N0: 41) (фиг. 9А) и образцов РОР21-(Ь15)-Рс, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 9В), 24 ч (фиг. 9С) и 48 ч (фиг. 9Ό) после инъекции, способом ЬС-Μδ.
На фиг. 10А, 10В показаны сайты расщепления, идентифицированные анализом ЬС-Μδ гибридных белков Рс-(Ь15)-РОР21 (фиг. 10А, δΕΟ ΙΌ N0: 49) и Рс-(Ь15)-РОР21 (фиг. 10В, δΕΟ ΙΌ N0: 41), введенных мышам путем инъекции.
На фиг. 11 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили ΡΒδ (закрашенный столбец), Рс-(Ь15)-РОР21 (δΕΟ ΙΌ N0: 49) (пустой столбец) или такие мутанты Рс-(Ь15)-РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 Ο170Ε (δΕΟ ΙΌ N0: 51) (серый столбец), Рс-(Ь15)-РОР21 Р171А (δΕΟ ΙΌ N0: 53) (столбец с шахматными клетками), Рс-(Ь15)-РОР21 δ172Ρ (δΕΟ ΙΌ N0: 55) (пустой столбец с диагональными полосками), Рс-(Ь15)-РОР21 (Ο170Ε Р171 δ172Π) (δΕΟ ΙΌ N0: 59) (закрашенный столбец с горизонтальными полосками) или Рс-(Ь15)-РОР21 С151А (δΕΟ ΙΌ N0: 61) (пустой столбец с диагональными полосками).
На фиг. 12 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили ΡΒδ (закрашенные кружки), Рс-(Ь15)-РОР21 (δΕΟ ГО N0: 49) (пустые кружки) или такие мутанты Рс-(Ь15)-РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 Ο170Ε (δΕΟ ΙΌ N0: 51) (закрашенные треугольники), Рс-(Ь15)-РОР21 Р171А (δΕΟ ΙΌ N0: 53) (пустые треугольники), Рс-(Ь15)РСР21 δ172Ρ (δΕΟ ΙΌ N0: 55) (закрашенные ромбы), Рс-(Ь15)-РОР21 (С170Ε/Ρ171А/δ172^) (δΕΟ ΙΌ N0: 59) (пустые ромбы) или Рс-(Ь15)-РОР21 С151А (δΕΟ ΙΌ N0: 61) (закрашенные квадраты).
На фиг. 13 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили ΡΒδ (закрашенный столбец), Рс-(Ь15)-РОР21 (δΕΟ ΙΌ N0: 49) (пустой столбец) или такие мутанты Рс-(Ь15)-РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 (Р150А, С151А, П52У) (серый столбец), Рс-(Ь15)-РОР21 Ο170Ε (δΕΟ ΙΌ N0: 51) (пустой столбец с диагональными полосками), Рс-(Ь15)-РОР21 (С170Ε/Ρ171А) (δΕΟ ΙΌ N0: 63) (серый столбец с диагональными полосками) или Рс-(Ь15)-РОР21 (Ο170Ε/δ172Ρ) (δΕΟ ГО N0: 67) (пустой столбец с диагональными полосками).
На фиг. 14 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили ΡΒδ (закрашенные квадраты), Рс-(Ь15)-РОР21 (δΕΟ ГО N0:
- 3 021425
49) (пустые квадраты) или такие мутанты Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Рс-(Ь15)-РСР21 (Р150А, С151А, 1152У) (8ЕО ГО N0: 65) (закрашенные перевернутые треугольники), Рс-(Ь15)-РСР21 С170Е (8Е0 ГО N0: 51) (пустые перевернутые треугольники), Рс-(Ь15)-РСР21 (С170Е, Р171А) (8Е0 ГО N0: 63) (закрашенные кружки) или Рс-(Ь15)-РОР21 С170Е, 8172Ь (8Е0 ГО N0: 67) (пустые кружки).
На фиг. 15 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец) или такие мутанты Рс-(Ь15)-РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 0170Е (81 /С) ГО N0: 51) (пустой столбец), Рс-(Ь15)-Р0Р21 С170А (81 (С) ГО N0: 69) (серый столбец), Рс(Ь15)-РСР21 С170С (8Е0 ГО N0: 71) (пустой столбец с диагональными полосками), Рс-(Ь15)-РОР21 0170Ό (8ЕО ГО N0: 73) (серо-белый столбец), Рс-(Ь15)-Р0Р21 С170N (8ЕО ГО N0: 75) (закрашенный столбец с диагональными полосками) или Рс-(Ь15)-РОР21 01708 (8Е0 ГО N0: 77) (пустой столбец с диагональными полосками).
На фиг. 16 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки) или такие мутанты Рс-(Ь15)Р0Р21, как Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170Е (8ЕО ГО N0: 51) (пустые кружки), Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170А (8ЕО ГО N0: 69) (закрашенные треугольники), Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170С (8Е0 ГО N0: 71) (пустые треугольники), Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170Ό (8ЕО ГО N0: 73) (закрашенные ромбы), Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170N (8ЕО ГО N0: 75) (пустые ромбы) или Рс-(Ь15)-Р0Р21 01708 (8Е0 ГО N0: 77) (перевернутые пустые треугольники).
На фиг. 17 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец) или такие мутанты Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170Е (8ЕО ГО N0: 51) (пустой столбец), Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Е (8ЕО ГО N0: 79) (серый столбец), Рс(Ь15)-Р0Р21 Р171Н (8Е0 ГО N0: 81) (закрашенный столбец с диагональными полосками), Рс-(Ь15)Р0Р21 Р1710 (8Е0 ГО N0: 83) (пустой столбец с диагональными полосками), Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Т (8Е0 ГО N0: 85) (столбец с шахматными клетками) или Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171У (8Е0 ГО N0: 87) (серый столбец с диагональными полосками).
На фиг. 18 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки) или такие мутанты Рс-(Ь15)Р0Р21, как Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170Е (8ЕО ГО N0: 51) (пустые кружки), Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Е Р171Е (8ЕО ГО N0: 79) (8ЕО ГО N0: 79) (закрашенные треугольники), Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Н (8ЕО ГО N0: 81) (пустые треугольники), Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р1710 (8Е0 ГО N0: 83) (закрашенные ромбы), Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Т (8Е0 ГО N0: 85) (пустые ромбы) или Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171У (8Е0 ГО N0: 87) (закрашенные квадраты).
На фиг. 19А-19Э показаны результаты анализа контрольного образца Рс-(Ь15)-Р0Р21 (фиг. 19А, 8Е0 ГО N0: 49) и образцов, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 19В), 24 ч (фиг. 19С) и 48 ч (фиг. 19Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 20А-20Э показаны результаты анализа контрольного образца Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170Е (фиг. 20А, 8Е0 ГО N0: 51) и образцов Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170Е, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 20В), 24 ч (фиг. 20С) и 48 ч (фиг. 20Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 21А-21Э показаны результаты анализа контрольного образца Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171А (фиг. 21А, 8Е0 ГО N0: 53) и образцов Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171А, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 21В), 24 ч (фиг. 21С) и 48 ч (фиг. 21Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 22А-22Э показаны результаты анализа контрольного образца Рс-(Ь15)-Р0Р21 8172Ь (фиг. 22А, 8Е0 ГО N0: 55) и образцов Рс-(Ь15)-Р0Р21 8172Ь, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 22В), 24 ч (фиг. 22С) и 48 ч (фиг. 22Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 23А-23Э показаны сайты расщепления, идентифицированные анализом ЬС-М8 гибридных белков Рс-(Ь15)-Р0Р21 (фиг. 23 А, 8ЕО ГО N0: 49), Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170Е (фиг. 23В, 8ЕО ГО N0: 51), Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171А (фиг. 23С, 8ЕО ГО N0: 53) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 8172Ь (фиг. 23Ό, 8ЕО ГО N0: 55), введенных мышам путем инъекции.
На фиг. 24А-24С показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на таких мутантах Р0Р21, как Р0Р21 Ь99К (8ЕО ГО N0: 109), Р0Р21 Ь99Э (8ЕО ГО N0: 111) и Р0Р21 А111Т (8ЕО ГО N0: 113) (фиг. 24А), на таких мутантах Р0Р21, как Р0Р21 А129Э (8ЕО ГО N0: 115), Р0Р21 А129Р (8ЕО ГО N0: 117) и Р0Р21 А134К (8ЕО ГО N0: 119) (фиг. 24В), и на таких мутантах Р0Р21, как Р0Р21 А134У (8ЕО ГО N0: 121), Р0Р21 А134Е (8ЕО ГО N0: 123) и Р0Р21 А129К (8ЕО ГО N0: 125) (фиг. 24С), при этом каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах Р0Р21 человека.
На фиг. 25А-25Э показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на таких мутантах Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р1710 (8ЕО ГО N0: 89) Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р1718 (8ЕО ГО N0: 91) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Т (8ЕО ГО N0: 85) (фиг. 25А), на таких мутантах Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171У (8ЕО ГО N0: 87), Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171А (8ЕО ГО N0: 93) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171С (8ЕО ГО N0: 95) (фиг. 25В), на таких мутантах Рс-(Ь15)-Р0Р21 (8ЕО ГО N0: 49), как Рс-(Ь15)Р0Р21 А45К, 0170Е (8ЕО ГО N0: 97) и Р0Р21 А45К (8ЕО ГО N0: 99) (фиг. 25С), и на таких мутантах Рс-(Ь15)-Р0Р21, (8ЕО ГО N0: 49), как Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Е (8ЕО ГО N0: 79) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 А45К/0170Е (8Е0 ГО N0: 97) (фиг. 25Ό), при этом каждая панель показывает результаты, полученные
- 4 021425 на контрольных образцах Р0Р21 человека.
На фиг. 26А, 26В показана агрегация, как функцию времени, для зрелого РОР21 дикого типа и для разных мутантов РОР21, фиг. 26А показывает процентное изменение агрегации для контрольного РОР21 (^Т, закрашенные ромбы) и РОР21 А45К (закрашенные кружки) после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 2 и 4 дней, тогда как фиг. 26В показывает процентное изменение агрегации для контрольного Р0Р21 (№Т) (ЗЕО ГО N0: 4) и вариантов Р0Р21 Р78С (ЗЕО ГО N0: 127), Р0Р21, Р78К (ЗЕО ГО N0: 129), Р0Р21 Ь86Т (ЗЕО ГО N0: 131), Р0Р21 Ь86С (ЗЕО ГО N0: 133), Р0Р21 Ь98С (ЗЕО ГО N0: 135), Р0Р21 Ь98К (ЗЕО ГО N0: 137), Р0Р21 А111Т (ЗЕО ГО N0: 113), Р0Р21 Α129Ό (ЗЕО ГО N0: 115), Р0Р21 А129О (ЗЕО ГО N0: 117), Р0Р21 А129К (ЗЕО ГО N0: 125), Р0Р21 А134К (ЗЕО ГО N0: 119), Р0Р21 Α134Υ (ЗЕО ГО N0: 121) и Р0Р21 А134Е (ЗЕО ГО N0: 123) (все маркированы на графике) после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 6 и 10 дней.
На фиг. 27 показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на контрольном Р0Р21 человека и на таких мутантах Р0Р21, как Р0Р21 А45К (ЗЕО ГО N0: 99), Р0Р21 Ь52Т (ЗЕО ГО N0: 139) и Р0Р21 Ь58Е (ЗЕО ГО N0: 141).
На фиг. 28А представлен график, показывающий изменение уровня агрегации для таких мутантов Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Ре-(Е15)-РОР21 6-181, О170Е (ЗЕО ГО N0: 101) (закрашенные ромбы), Рс-(Ь15)Р0Р21 А45К, 0170Е (ЗЕО ГО N0: 97) (пустые квадраты), Рс-(Е15)-РОР21 Р171Е (ЗЕО ГО N0: 79) (закрашенные треугольники), Рс-(Е15)-РОР21 Р171А (ЗЕО ГО N0: 53) (крестики), Рс-(Е15)-РОР21 О170Е (ЗЕО ГО N0: 51) (пустые треугольники) и для контрольного Р0Р21 (закрашенные кружки) после инкубации при 4°С в течение 1, 4 и 8 дней, а фиг. 28В представляет собой гистограмму, также показывающую результаты инкубации.
На фиг. 29 показаны результаты измерения уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВЗ (носитель) (закрашенные кружки) или такие мутанты Рс-(Е15)-РОР21, как Рс-(Ь15)Р0Р21 А45К/0170Е (ЗЕО ГО N0: 97) (пустые кружки), Рс-(Е15)-РОР21 А45К, Р1710 (ЗЕО ГО N0: 103) (закрашенные треугольники) или Рс-(Е15)-РОР21 Ь98К, Р1710 (ЗЕО ГО N0: 43) (пустые треугольники).
На фиг. 30 представлен график, показывающий результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на Р0Р21 человека (закрашенные кружки, сплошная линия), на Рс-(Е15)-РОР21 (ЗЕО ГО N0: 49) (пустые кружки, сплошная линия) и на Рс-(Е15)-РОР21 Ь98К, Р1710 (ЗЕО ГО N0: 43) (закрашенные треугольники, пунктирная линия).
На фиг. 31 представлен график, показывающий процентную величину агрегатов с высоким молекулярным весом, наблюдаемых после девяти дней выдерживания при комнатной температуре (фиг. 31А) и 4°С (фиг. 31В) для Рс-(Е15)-РОР21 (ЗЕО ГО N0: 4) (закрашенные кружки, сплошная линия), Рс-(Ь15)Р0Р21 (ЗЕО ГО N0: 49) (пустые кружки, сплошная линия) и Рс-(Е15)-РОР21 (Ь98К/Р1710) (ЗЕО ГО N0: 43) (закрашенные треугольники, пунктирная линия).
На фиг. 32 представлена серия трасс МАЛДИ при масс-спектрометрии, показывающая наблюдаемые изменения Рс-(Е15)-РОР21 Ь98К, Р1710 (ЗЕО ГО N0: 43) в различных точках на протяжении 168часового промежутка времени.
На фиг. 33 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВЗ (пустые кружки), зрелого Р0Р21 дикого типа (закрашенные квадраты) и таких мутантов Р0Р21, как Рс-(Е15)-РОР21 (Ь98К, Р1710) (ЗЕО ГО N0: 43) (перевернутые закрашенные треугольники), Рс-(Е15)-РОР21 (Ь98К, Р1710, 182Р) (ЗЕО ГО N0: 143) (пустые ромбы) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, 1820) (ЗЕО ГО N0: 145) (закрашенные кружки).
На фиг. 34 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВЗ (закрашенные кружки) и мутантов Рс-(Е15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (ЗЕО ГО N0: 43) (закрашенные треугольники), Рс-(Е15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, 1820, 1830) (ЗЕО ГО N0: 147) (пустые треугольники), Рс-(Е15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, 1820) (ЗЕО ГО N0: 145) (закрашенные ромбы) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, 182Р) (ЗЕО ГО N0: 143) (пустые ромбы).
На фиг. 35 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВЗ (пустые кружки) и мутантов Рс-(Е15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (ЗЕО ГО N0: 43) (закрашенные квадраты), Рс-(Е15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, Υ179З) (ЗЕО ГО N0: 149) (пустые треугольники), Рс-(Е15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, Υ179Α) (ЗЕО ГО N0: 153) (перевернутые закрашенные треугольники), с-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180З) (ЗЕО ГО N0: 155) (пустые ромбы) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А1800) (ЗЕО ГО N0: 157) (закрашенные кружки).
На фиг. 36 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВЗ (закрашенные кружки) и таких мутантов Р0Р21, как Рс(Ы5)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (ЗЕО ГО N0: 43) (пустые квадраты), Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, Υ179Ρ) (ЗЕО ГО N0: 151) (закрашенные треугольники) и с-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (ЗЕО ГО N0: 57) (пустые ромбы).
На фиг. 37 представлена диаграмма, отображающая схему шестинедельного исследования с повышением дозы, проведенного на обезьянах резус. На указанной фигуре полутоновые символы обозначают взятия крови натощак, а фактурные символы обозначают взятия крови после кормления.
На фиг. 38Λ-38Ό представлена серия графиков, отображающих рандомизацию обезьян резус по
- 5 021425 профилям ООТТ, ЛИС (площади под кривой) ООТТ и весу тела. Фиг. 38А отображает базовый уровень глюкозы в ООТТ1, при этом закрашенные квадраты соответствуют группе А, закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют группе В, а пустые кружки на пунктирной линии соответствуют группе С перед распределением испытуемых соединений и носителя по группам. На фиг. 38В отображен базовый уровень глюкозы в ООТТ2, при этом закрашенные квадраты соответствуют группе А, закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют группе В, а пустые кружки на пунктирной линии соответствуют группе С распределением испытуемых соединений и носителя по группам. На фиг. 38С показан базовый уровень глюкозы в ООТТ1 и ООТТ2 в терминах АИС, при этом фактурный столбец соответствует группе А, полутоновой столбец соответствует группе В, а пустой столбец соответствует группе С. Фиг. 38Ό показывает базовый вес тела, при этом фактурный столбец соответствует группе А, полутоновой столбец соответствует группе В, а пустой столбец соответствует группе С.
На фиг. 39 представлен график, показывающий процент изменения массы тела относительно фонового носителя, РОР21 (ЗЕО ГО ЫО: 4) и Ре-(Ь15)-РСР21 Ь98К, Р171О (ЗЕО ГО ЫО: 43) у обезьян резус, при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1-й и 2-й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3-й и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5-й и 6й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7, 8 и 9 соответствуют периоду отмывания (с 7-й по 9ю неделю).
На фиг. 40 представлен график, показывающий процентное изменение уровня инсулина натощак по отношению к базовому уровню у обезьян резус для носителя, РСР21 (ЗЕО ГО ЫО: 4) и Ре-(Р15)-РСР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43), при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1-й и 2-й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3-й и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5-й и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7 и 8 соответствуют 7-й и 8-й неделе в период отмывания.
На фиг. 41 представлен график, показывающий влияние носителя, РСР21 (ЗЕО ГО ЫО: 4) и Рс(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43) при введении высокой дозы на уровень инсулина у обезьян резус после кормления на 5-й и 6-й неделе исследования, при этом закрашенные столбцы соответствуют 5-й неделе, а полутоновые столбцы соответствуют 6-й неделе.
На фиг. 42 представлен график, показывающий профили глюкозы в ходе теста ООТТ5 (пероральный тест на толерантность к глюкозе), проведенного в конце двухнедельного лечения высокими дозами Ре-(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43), при этом закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют носителю, пустые квадраты на пунктирной линии соответствуют РОР21, а закрашенные треугольники на сплошной линии соответствуют Ре-(Р15)-РСР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43).
На фиг. 43 представлен график, показывающий профили инсулина в ходе теста ООТТ5, проведенного в конце двухнедельного лечения высокими дозами Ре-(Р15)-РСР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43), при этом закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют носителю, пустые квадраты на пунктирной линии соответствуют РОР21, а закрашенные треугольники на сплошной линии соответствуют Рс(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43).
На фиг. 44 представлен график, показывающий процент изменения от фоновой линии АИС3-5 глюкозы в ходе теста ООТТ, проведенном в конце каждого периода введения доз (низкой, средней и высокой дозы) обезьянам резус, при этом пустые столбцы соответствуют АИС3, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в ООТТ3, закрашенные столбцы соответствуют АИС4, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в ООТТ4, а полутоновые столбцы соответствуют АИС5, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в ООТТ5.
На фиг. 45 представлен график, показывающий влияние носителя, РОР21 и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43) на процентное изменение уровня триглицеридов в плазме по сравнению с базовым уровнем в каждой группе обезьян резус, при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1-й и 2й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3-й и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5-й и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7, 8 и 9 соответствуют периоду отмывания (с 7-й по 9-ю неделю).
На фиг. 46 представлен график, показывающий уровень триглицеридов в плазме после кормления в каждой группе обезьян резус по результатам измерений на пятой и шестой неделях лечения носителем, РОР21 или Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43) в высокой дозе, при этом полутоновые столбцы соответствуют 5-й неделе, а закрашенные столбцы соответствуют 6-й неделе.
Фиг. 47 представляет собой график, показывающий уровень человеческого РОР21 у отдельных обезьян по результатам измерений перед началом введения доз, а также в 5-й, 12-й, 19-й и 26-й день при взятии образцов приблизительно через 21 ч после каждой инъекции.
На фиг. 48 представлен график, показывающий индивидуальный уровень Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43) у обезьяны по результатам измерений перед началом введения доз, а также в 5й, 12-й, 19-й и 26-й день при взятии образцов приблизительно через 5 дней после каждой инъекции.
На фиг. 49 представлен график, показывающий средние концентрации РОР21 и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43) по результатам измерений в ходе трех тестов ООТТ, проведенных после введения каждой дозы (низкой, средней и высокой), при этом полутоновые столбцы соответствуют
- 6 021425
ΘΟΤΤ3 с низкой дозой, закрашенные столбцы соответствуют ΘΟΤΤ4 со средней дозой, а пустые столбцы соответствуют ΘΟΤΤ5 с высокой дозой.
Фиг. 50 представляет собой аминокислотную последовательность Ес-(048)3-Е0Е21 (Ь98К, Р171О, А180Е) слитого белка (8ЕЦ ГО N0: 47); где 1§01 Ее остатки (8Е0 ГО N0: 11) указаны жирным шрифтом, (048)3 линкер (8ЕЦ ГО N0: 31) указан курсивом, точечные мутации в Е0Е21 последовательности (8ЕЦ ГО N0: 39) указаны жирным шрифтом и подчеркнуты.
Фиг. 51 представляет собой график, где показана кривая доза-ответ проанализированных соединений в анализах Егк-люциферазы, где были проанализированы Ес-(048)3-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (8ЕО ГО N0: 47), Ес-(Ь15)-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (8ЕО ГО N0: 57), дикого типа Е0Е21 и Ес слияние с Е0Е21 дикого типа.
Фиг. 52 представляет собой график, где показаны результаты, полученные в анализе связывания Биакор равновесия раствора Ес-(048)3-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (8ЕЦ ГО N0: 47) и Ес-(Ь15)-Е0Е21 (Ь98К, Р1710) (8ЕЦ ГО N0: 43) для человека (справа) и циано β-Клото (слева).
Фиг. 53 представляет собой пару графиков, где показана кривая доза-ответ Ес-(048)3-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (8ЕЦ ГО N0: 47) у мышей 6Ь/6Ь после одной инъекции; фиг. 53А показывает уровни глюкозы в крови у мышей 6Ь/6Ь в различные моменты времени после инъекции носителя или Ес-(048)3Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е), в то время как фиг. 53В показывает влияние Ес-(048)3-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) на массу тела после одной инъекции у мышей 6Ь/6Ь.
Фиг. 54 схематически графически представляет исследование влияние частоты доз Ес-(048)3Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81 /С) ГО N0: 47) и Ес-(Ь15)-Е0Е21 (Ь98К, Р1710) (81 (С) ГО N0: 43) у ΌΙ0 мышей.
Фиг. 55 представляет собой график, на котором показаны профили 0ΤΤ мышей, которых лечили носителем, Ес-(048)3-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81 (С) ГО N0: 47) или Ес-(Ь15)-Е0Е21 (Ь98К, Р1710) (8ЕЦ ГО N0: 43) при различных частотах введения доз.
Фиг. 56 представляет собой график, на котором показано изменение массы тела по сравнению с фоновой линией (день 0) у мышей, которых лечили носителем, Ес-(048)3-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (8ЕЦ ГО N0: 47) или Ес-(Ь15)-Е0Е21 (Ь98К, Р1710) (8ЕЦ ГО N0: 43) при различных частотах введения доз.
Фиг. 57 представляет собой график, на котором показаны результаты исследования ίη νίίτο гидрогелей, содержащих Е0Е21 (Ь98К, Р1710) (81 (С) ГО N0: 37) Е0Е21 мутант.
Фиг. 58 представляет собой график, на котором показано влияние на уровни глюкозы в крови 8недельных мышей 6Ь/6Ь, которым давали дозировки различных композиций гидрогеля.
Фиг. 59 представляет собой график, на котором показано влияние на уровни глюкозы в крови 8недельных мышей 6Ь/6Ь, которым давали дозировки различных композиций гидрогеля.
Фиг. 60 представляет собой график, на котором показано влияние на уровни глюкозы в крови 8недельных мышей 6Ь/В6, которым давали дозировки различных композиций гидрогеля; закрашенные кружки представляют мышей, которым давали дозы гидрогелевого контроля, закрашенные квадраты представляют мышей, которым давали дозы Е0Е21 (Ь98К, Р1710) (8ЕЦ ГО N0: 37) в гидрогеле при 10 мг/кг, закрашенные треугольники представляют мышей, которым давали дозы Е0Е21 (Ь98К, Р1710) в гидрогеле при 30 мг/кг, и перевернутые треугольники представляют мышей, которым давали дозы Ес(Ь15)-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81 (С) ГО N0: 57) отдельно.
Фиг. 61 представляет собой график, на котором показано влияние на уровни глюкозы в крови 8недельных мышей 6Ь/В6, которым давали доза различных гидрогелевых композиций; закрашенные кружки представляют мышей, которым давали дозы с гидрогелевым контролем, закрашенные квадраты представляют мышей, которым давали дозы Е0Е21 (Ь98К, Р1710) (8ЕЦ ГО N0: 37) в гидрогеле при 10 мг/кг, закрашенные треугольники представляют мышей, которым давали дозы Е0Е21 (Ь98К, Р1710) в гидрогеле при 30 мг/кг, и перевернутые треугольники представляют мышей, которым давали дозы Ес(Ь15)-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81 (С) ГО N0: 57) отдельно.
Фиг. 62 представляет собой график, на котором показано влияние на массу тела 8-недельных мышей 6Ь/В6, которым давали различные гидрогелевые композиции; закрашенные кружки представляют мышей, которым давали дозы гидрогелевого контроля, закрашенные квадраты представляют мышей, которым давали дозы Е0Е21 (Ь98К, Р1710) (8ЕЦ ГО N0: 37) в гидрогеле при 10 мг/кг, закрашенные треугольники представляют мышей, которым давали дозы Е0Е21 (Ь98К, Р1710) в гидрогеле при 30 мг/кг, и перевернутые треугольники представляют мышей, которым давали дозы Ес-(Ь15)-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81 (С) ГО N0: 57) отдельно.
Фиг. 63 представляет собой график, на котором показан процент изменения массы 8-недельных мышей 6Ь/В6, которым давали дозы различных гидрогелевых композиций; закрашенные кружки представляют мышей, которым давали дозы с гидрогелевым контролем, закрашенные квадраты представляют мышей, которым давали дозы Е0Е21 (Ь98К, Р1710) (8ЕЦ ГО N0: 37) в гидрогеле при 10 мг/кг, закрашенные треугольники представляют мышей, которым давали дозы Е0Е21 (Ь98К, Р1710) в гидрогеле при 30 мг/кг, и перевернутые треугольники представляют мышей, которым давали дозы Ес-(Ь15)-Е0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81 (С) ГО N0: 57) отдельно.
- 7 021425
Фиг. 64 представляет собой диаграмму, на которой графически отображен план клинического исследования для девятинедельного исследования с эскалацией дозы, которое выполняли для яванских макак с ухудшенной переносимостью глюкозы (ЮТ).
Фиг. 65 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на АМ поглощение пищи исследуемых яванских макак ЮТ.
Фиг. 66 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на поглощение фруктов исследуемых яванских макак ЮТ.
Фиг. 67 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на РМ поглощение пищи исследуемых яванских макак ЮТ.
Фиг. 68 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на массу тела исследуемых яванских макак 10Т.
Фиг. 69 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на индекс массы тела исследуемых яванских макак 10Т.
Фиг. 70 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на толщину кожной складки исследуемых яванских макак 10Т.
Фиг. 71 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на окружность живота исследуемых яванских макак 10Т.
Фиг. 72 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на уровни глюкозы в плазме исследуемых яванских макак 10Т.
Фиг. 73 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на толерантность к глюкозе исследуемых яванских макак 10Т.
Фиг. 74 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на уровни триглицеридов в плазме исследуемых яванских макак 10Т.
Фиг. 75 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) уровней общего холестерина в плазме исследуемых яванских макак 10Т.
Фиг. 76 представляет собой график, на котором отображено влияние носителя, Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 47) на уровни холестерина ЛПВП в плазме исследуемых яванских макак 10Т.
Фиг. 77 представляет собой серию следовых количеств в соответствии с масс-спектрометрией МАЛДИ, где показаны наблюдаемые изменения Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (левая панель, 8ЕЦ ГО N0: 43) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (правая панель, 8ЕЦ ГО N0: 57) в различные моменты времени в течение 168-часового периода.
Фиг. 78 представляет собой график, на котором показана относительная распространенность (%) полноразмерного С-концевого пептида по сравнению с общим количеством фрагментов С-концевого пептида, полученных как из Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710), так и из Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е), в соответствии с анализами мониторинга множественных реакций ЖХ/МС/МС после Акр-Л дигестии.
Фиг. 79 представляет собой график, на котором показаны результаты твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А) для концентрации в плазме интактного полноразмерного Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (81Т) ГО N0: 43) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (81Т) ГО N0: 57) в течение 240часового периода после внутривенной инъекции у мышей.
Фиг. 80 представляет собой график, на котором показаны результаты анализа ЕЬК-люциферазной активности, выполненного на негативном контроле, человеческих Р0Р21 (8ЕЦ ГО N0: 4) и Р0Р21 мутантов гликозилирования Р0Р21 (У179Ц, 8181Т) (81Т) ГО N0: 161), Р0Р21 Υ179N (81Т) ГО N0: 163) и Р0Р21 Р1248 (81Т) ГО N0: 165).
Белок человека Р0Р21, обладающий улучшенными свойствами, в частности, удлиненным периодом полувыведения и/или уменьшенной агрегацией, может быть изготовлен способами, раскрытыми в настоящем описании и стандартными способами молекулярной биологии. Факультативно можно дополнительно увеличить период полувыведения, гибридизируя антитело или его часть с Юконцевым или Сконцевым участком последовательности Р0Р21 дикого типа. Также можно дополнительно увеличить период полувыведения или уменьшить агрегацию белка Р0Р21 дикого типа, вводя в этот белок амино- 8 021425 кислотные замещения. Такие модифицированные белки упоминаются в данном документе как мутанты или мутанты Р0Р21 и формируют варианты осуществления настоящего изобретения.
Способы рекомбинантных нуклеиновых кислот, упоминаемые в данном описании, включая примеры, в целом представляют собой способы, сформулированные в опубликованных источниках 8атЬтоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬотаЮту Мапиа1 (Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬотаЮту Рте55, 1989) или Ситтеи! РгоЮео1§ ίη Мо1ееи1ат Вю1о§у (Аи5иЬе1 е! а1., еЙ5.. Отееи РиЬйккетк 1ис. аиб \УПеу аиб §ои8, 1994), причем оба указанных источника включены в настоящее описание в качестве ссылки с любой целью.
1. Общие термины и определения.
Термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты, представленной в данном изобретении, которая (1) была выделена как минимум приблизительно из 50% белков, липидов, углеводов или других материалов, вместе с которыми она встречается в природе, когда тотальную нуклеиновую кислоту выделяют из клеток-источников, (2) не сцеплена со всем полинуклеотидом или частью полинуклеотида, с которыми выделенная молекула нуклеиновой кислоты сцеплена в природе, (3) функционально связана с полинуклеотидом, с которым она не связана в природе, или (4) не встречается в природе как часть большей полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно, чтобы выделенная молекула нуклеиновой кислоты была, по существу, свободна от любых других загрязняющих молекул нуклеиновой кислоты или от других загрязнений, которые обнаруживаются в природном окружении и которые могли бы помешать ее применению в выработке полипептида или ее терапевтическому, диагностическому, профилактическому применению или применению в научноисследовательских целях.
Термин вектор употребляется для обозначения любой молекулы (например, нуклеиновой кислоты, плазмиды или вируса), используемой для переноса кодирующей информации в клетку-хозяина.
Термин вектор экспрессии относится к вектору, который пригоден для трансформации клеткихозяина и содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые направляют и/или контролируют экспрессию вставленных гетерологических последовательностей нуклеиновой кислоты. Экспрессия включает, но не ограничиваясь ими, такие процессы, как транскрипция, трансляция и сплайсинг РНК, если присутствуют интроны.
Термин функционально связанный(ая, ое) употребляется в данном документе для обозначения компоновки фланкирующих последовательностей, при этом фланкирующие последовательности, описанные таким образом, сконфигурированы или собраны так, что выполняют свою обычную функцию. Итак, фланкирующая последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, может быть способной вызывать репликацию, транскрипцию и/или трансляцию кодирующей последовательности. Например, кодирующая последовательность функционально связана с промотором, если промотор способен управлять транскрипцией этой кодирующей последовательности. Фланкирующая последовательность не обязательно должна примыкать к кодирующей последовательности до тех пор, пока она правильно функционирует. Так, например, между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью могут быть вставлены промежуточные не транслируемые, но еще транскрибируемые последовательности, при этом промоторная последовательность, по-прежнему, может считаться функционально связанной с кодирующей последовательностью.
Термин клетка-хозяин употребляется для обозначения клетки, которая была трансформирована или способна к трансформации последовательностью нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота, представленная в данном изобретении, после чего она экспрессирует представляющий интерес ген. Этот термин включает потомство родительской клетки независимо от того, идентично ли оно или не идентично первоначальному родителю по морфологии или генетической структуре до тех пор, пока клетка экспрессирует избранный ген.
Термин выделенный полипептид относится к полипептиду, представленному в данном изобретении, который (1) был выделен как минимум приблизительно из 50% полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, вместе с которыми он встречается в природе, когда его выделяют из клетокисточников, (2) не связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) со всем полипептидом или частью полипептида, с которыми выделенный полипептид связан в природе, (3) функционально связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (4) не встречается в природе. Предпочтительно, чтобы выделенный полипептид был, по существу, свободен от любых других загрязняющих полипептидов или от других загрязнений, которые обнаруживаются в природном окружении и которые могли бы помешать его применению в терапевтических, диагностических, профилактических или научно-исследовательских целях.
Термин встречающийся в природе применительно к таким биологическим материалам, как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к материалам, которые встречаются в природе и не подвергаются манипуляциям со стороны человека. Сходным образом, термин не встречающийся в природе при использовании в данном документе относится к материалу, который не встречается в природе либо был структурно модифицирован или синтезирован человеком. При использовании по отношению к нуклеотидам термин встречающийся в природе относится к таким основаниям, как аденин (А), цитозин (С), гуанин (О), тимин (Т) и урацил (И). При использовании по отношению к
- 9 021425 аминокислотам термин встречающаяся в природе относится к следующим 20 аминокислотам: аланин (А), цистеин (С), аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е), фенилаланин (Р), глицин (О), гистидин (Н), изолейцин (I), лизин (К), лейцин (Ь), метионин (М), аспарагин (Ν), пролин (Р), глутамин (О), аргинин (К), серин (§), треонин (Т), валин (V), триптофан (Щ) и тирозин (Υ).
Термин полипептид РОР21 относится к встречающемуся в природе полипептиду дикого типа, экспрессируемому у человека. В целях этого раскрытия изобретения термин полипептид РОР21 может использоваться взаимозаменяемо для любого полноразмерного полипептида РОР21, например, 8ЕО ГО N0: 2 и 6, которые состоят из 209 аминокислотных остатков и которые кодируются нуклеотидными последовательностями 8Е0 ГО N0: 1 и 5; соответственно, любая зрелая форма полипептида, 5>Е0 ГО N0: 4 и 8, которые состоят из 181 аминокислотных остатков, и которые кодируются нуклеотидными последовательностями 8Е0 ГО N0: 3 и 7, и в которых 28 аминокислотных остатков на аминоконце полноразмерного полипептида РОР21 (например, составляющих сигнальный пептид) были удалены. Полноразмерные и зрелые РОР21 полипептиды могут, но не обязательно, содержать аминоконцевой метионин, который вводят при помощи методов инженерии или в результате процесса бактериальной экспрессии.
Термины мутант полипептида РОР21 и мутант РОР21 могут быть использованы как взаимозаменяемые и относятся к полипептиду РОР21, в котором природная аминокислотная последовательность РОР21 (например, 8Е0 ГО N0: 2, 4, 6 или 8) была модифицирована. Такие модификации включают, но не ограничиваясь ими, одно или более аминокислотных замещений, включая замещения на аналоги аминокислот, не встречающиеся в природе, и аналоги аминокислот, встречающиеся в природе, и усечения. Таким образом, мутанты полипептида РОР21 включают, но не ограничиваясь ими, сайт-специфические мутанты РОР21, усеченные полипептиды РОР21, мутанты РОР21, устойчивые к протеолизу, мутанты РОР21 с пониженной агрегацией, комбинаторные мутанты РОР21 и гибридные белки РОР21, как описано в данном документе. В целях идентификации специфических усечений и аминокислотных замещений в мутантах РОР21 по настоящему изобретению нумерация усеченных или мутированных аминокислотных остатков соответствует нумерации в зрелом полипептиде РОР21, состоящем из 181 аминокислотного остатка. РОР21 мутанты могут, но необязательно, содержать аминоконцевой метионин, который может быть введен при помощи методов инженерии или в результате процесса бактериальной экспрессии. В других вариантах осуществления настоящего изобретения мутант полипептида РОР21 включает аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична мутантной РОР21'§ аминокислотной последовательности, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РОР21 желательные свойства, например, устойчивость к протеолизу, увеличенный период полувыведения, сниженную агрегацию или их комбинации, не были дополнительно модифицированы. Иными словами, за исключением тех остатков в мутантной последовательности РОР21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других аминокислотных остатков в мутантной последовательности РОР21. Например, в мутанте РОР21 О173Е, могут быть модифицированы до 15% всех других аминокислотных остатков в дополнение к остатку глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. В других вариантах осуществления изобретения мутантный полипептид РОР21 включает аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична мутантной РОР21'§ аминокислотной последовательности, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РОР21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие мутанты полипептида РОР21 обладают как минимум одним видом активности полипептида РОР21 дикого типа.
Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутант полипептида РОР21, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 85% идентична мутантной РОР21'§ аминокислотной последовательности, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РОР21 желательные свойства, например, устойчивость к протеолизу, увеличенный период полувыведения, сниженную агрегацию или их комбинации, не были дополнительно модифицированы.
Говоря другими словами, за исключением тех остатков в мутантной последовательности РОР21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других аминокислотных остатков в мутантной последовательности РОР21. Например, в мутанте РОР21 О173Е могут быть модифицированы до 15% всех других аминокислотных остатков в дополнение к остатку глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. Далее, настоящее изобретение охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, которая как минимум приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, кодирующей РОР21 мутант, но в которой нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки, которые придают кодируемому мутантному полипептиду РОР21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие молекулы нуклеиновых кислот кодируют мутанты РОР21, обладающие как ми- 10 021425 нимум одним видом активности полипептида Р0Р21 дикого типа.
Термин биологически активный мутант полипептида РСР21 относится к любому мутантному полипептиду РСР21, описанному в данном документе, который обладает активностью полипептида РСР21 дикого типа, в частности, способностью понижать уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, уменьшать вес тела и улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии или чувствительность к инсулину независимо от числа модификаций, введенных в мутант полипептида РСР21. Мутантные полипептиды РСР21, обладающие в некоторой степени пониженным уровнем активности РСР21 по сравнению с полипептидом РСР21 дикого типа, могут, тем не менее, считаться биологически активными мутантами полипептида РСР21.
Каждый из терминов эффективное количество и терапевтически эффективное количество относится к мутантному полипептиду РСР21, применяемому для поддержания наблюдаемого уровня одного или более видов биологической активности полипептида РСР21 дикого типа, в частности способности понижать уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, снижать вес тела или улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии или чувствительность к инсулину.
Термин фармацевтически приемлемый носитель или физиологически приемлемый носитель при использовании в данном документе относится к одному или более рецептурных агентов, пригодных для осуществления или улучшения доставки мутантного полипептида РСР21 в организм человеческого или нечеловеческого субъекта. Термин включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие поглощение агенты, и т.д., которые являются физиологически несовместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или более из воды, солевого раствора, фосфатного солевого буфера, декстрозы, глицерина, этанола и т.д., а также их комбинации. В некоторых случаях, предпочтительным будет включение изотонических агентов, например сахаров, полиспиртов, таких как маннитол, сорбитол, или хлорид натрия, в фармацевтическую композицию. Фармацевтически приемлемые вещества, например, смачивающие или незначительные количества вспомогательных веществ, например, смачивающих или эмульгирующих агентов, консерваторы или буферы, которые увеличивают срок годности полипептидного мутанта РСР21, могут также действовать в качестве носителя или образовывать компонент носителя.
Термин антиген относится к молекуле или части молекулы, которые способны связываться с антителом и, кроме того, их можно использовать на животных для выработки антител, которые способны связывать эпитоп антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов.
Термин нативный Ре относится к молекуле или последовательности, включающей последовательность неантигенсвязывающего фрагмента и полученной в результате расщепления целого антитела или выработанной другими средствами, как в мономерной, так и в мультимерной форме, которая может содержать шарнирный участок. Первоначальный иммуноглобулиновый источник нативного Рс предпочтительно, но не обязательно, имеет человеческое происхождение и представляет собой любой из иммуноглобулинов, хотя более предпочтительны 1§О1 и 1дС2. Также может быть использован 1дС4. Нативные молекулы Рс состоят из мономерных полипептидов, которые могут быть соединены в димерные или мультимерные формы посредством ковалентной (т.е. по типу дисульфидных связи) и нековалентной ассоциации. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Рс варьируется от 1 до 4 в зависимости от класса (например, 1§О, 1дА и 1дЕ) или подкласса (например, 1§О1, 1§О2, 1§О3, 1§О4, 1дА1 и 1§ОА2). Один из примеров нативного Рс представляет собой дисульфидно связанный димер, полученный в результате папаинового расщепления 1§О (см. ЕШкоп с1 а1., 1982, №.1с1сю Ас1Й5 Кек. 10: 4071-9). Термин нативный Рс при использовании в данном документе обобщает мономерные, димерные и мультимерные формы. Пример полипептидной последовательности Рс представлен в 8ЕО ГО N0: 11, который получен из человеческой молекулы 1дО1. Нативный Рс может, но не обязательно, содержать аминоконцевой метионин, который может быть введен при помощи методов инженерии или в результате процесса бактериальной экспрессии; такие Рс продолжают рассматривать как нативные Рс молекулы.
Термин вариант Рс относится к молекуле или последовательности, которые модифицированы из нативного Рс, но еще включают сайт связывания для рецептора утилизации, РсКп (рецептор Рс новорожденных). Международные патентные публикации № \У0 97/34631 и \У0 96/32478 описывают типичные варианты Рс, а также их взаимодействие с рецептором утилизации, в связи с чем указанные публикации включены в этот документ в качестве ссылки. Таким образом, термин вариант Рс может включать молекулу или последовательность, которые гуманизированы из нативного Рс нечеловеческого происхождения. Кроме того, нативный Рс включает участки, которые можно удалить, поскольку они обеспечивают структурные признаки биологической активности, не являющиеся необходимыми для гибридных молекул мутантов Р0Р21, соответствующих настоящему изобретению. Таким образом, термин вариант Рс включает молекулу или последовательность, в которых один или более сайтов или остатков нативного Рс утрачены или модифицированы, что влияет на (1) образование дисульфидных связей, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) Ν-концевую гетерогенность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с другим рецептором Рс, нежели рецептор утилизации, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС).
- 11 021425
Варианты Ре более подробно описаны в данном документе ниже. Вариант Ре может, но не обязательно, содержать аминоконцевой метионин, который может быть введен методами инженерии или в результате бактериальной экспрессии; такие Рс молекулы продолжают рассматривать как Рс варианты.
Термин домен Рс охватывает нативный Рс, варианты Рс и их последовательности в соответствии с данными выше определениями. Как в отношении вариантов Рс, так и в отношении нативных молекул Рс, термин домен Рс включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, полученные в результате расщепления целого антитела или выработанные другими средствами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Рс может быть соединен с РОР21 или мутантом РОР21 (включая усеченную форму РОР21 или мутанта РОР21) посредством, например, ковалентной связи между доменом Рс и последовательностью РОР21. Такие составные белки могут образовывать мультимеры через ассоциацию доменов Рс, при этом как составные белки, так и их мультимеры являются аспектом настоящего изобретения. Рс домен может, но необязательно, содержать аминоконцевой метионин, который может быть введен методами инженерии или в результате процесса бактериальной экспрессии.
2. Мутанты РОР21.
Термин мутант РОР21 относится к мутантному полипептиду РОР21, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности природного полипептида РОР21, например, 8Е0 ГО N0: 2, 4, 6 или 8, одной или более аминокислот. Мутанты РОР21 можно создавать, вводя одно или более аминокислотные замещения, консервативные или не консервативные, и используя как встречающиеся, так и не встречающиеся в природе аминокислоты в специфических положениях полипептида РОР21.
Консервативное аминокислотное замещение может включать замещение нативного аминокислотного остатка (т.е. остатка, обнаруживаемого в данном положении полипептидной последовательности РОР21 дикого типа) на ненативный остаток (т.н. остаток, который не обнаруживается в данном положении полипептидной последовательности РОР21 дикого типа), при этом не происходит никаких влияний, или происходят очень незначительные влияния на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Консервативные аминокислотные замещения также охватывают не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые обычно встраиваются посредством химического пептидного синтеза, а не синтеза в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие реверсированные или инвертированные формы аминокислотных компонентов.
Встречающиеся в природе аминокислотные остатки можно подразделить на классы, основываясь на общих свойствах боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин (пог1еисте), Мер А1а, Уа1, Ьеи, 11е;
(2) нейтральные гидрофильные: Суз, 8ег, ТНг;
(3) кислотные: Азр, О1и;
(4) основные: Азп, О1п, Из, Ьуз, Агд;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: О1у, Рго;
(6) ароматические: Тгр, Туг, Рйе.
Консервативные замещения могут включать замену члена одного из этих классов другим членом того же класса. Неконсервативные замещения могут включать замену члена одного из этих классов другим членом другого класса.
Желательные аминокислотные замещения (как консервативные, так и неконсервативные) могут определить компетентные специалисты в данной области в то время, когда такие замены понадобятся. Типичный (но не ограничивающий) список аминокислотных замещений представлен в табл. 1.
Таблица 1
Аминокислотные замещения
Первоначальный остаток Типичные замещения
А1а Уа1, Ьеи, Не
Агд Ьуз, О1п, Азп
Азп О1п
Азр О1и
Суз 8ег, А 1а
О1п Азп
О1и Азр
О1у Рго, А1а
ΗΪ5 Азп, О1п, Ьуз, Агд
- 12 021425
3. Усеченные полипептиды РОР21.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к усеченным формам зрелого полипептида РОР21 или мутанта РОР21. Этот вариант осуществления настоящего изобретения возник в связи с попыткой выявить усеченные полипептиды РОР21, которые способны обеспечивать активность, равную активности не усеченных форм зрелого полипептида РОР21, а в некоторых случаях превосходящую ее.
При использовании в настоящем описании термин усеченный полипептид РОР21 относится к полипептиду РОР21, в котором были удалены аминокислотные остатки из аминоконцевого (или Νконцевого участка) полипептида РОР21, были удалены аминокислотные остатки из карбоксиконцевого (или С-концевого) участка полипептида РОР21 или были удалены аминокислотные остатки как из аминоконцевого, так и из карбоксиконцевого участков полипептида РОР21. Различные усечения, раскрытые в настоящем документе, были подготовлены так, как это изложено в примерах 3 и 6.
Активность полипептидов РОР21, усеченных на Ν-конце, и полипептидов РОР21, усеченных на Сконце, можно оценивать, применяя анализ на ЕЬК-люциферазу ΐη νίΐΐΌ, как это описано в примере 4. Специфические подробности анализов ΐη νίΐτο, которые можно применять для исследования активности усеченных полипептидов РОР21, можно найти в примере 4.
Активность усеченных полипептидов РОР21 по настоящему изобретению также можно оценивать в анализе ΐη νίνο, таком как анализ на мышах ЙЬ/ЙЬ или на мышах оЬ/оЬ, описанный в примерах 5 и 7. В целом, для оценки активности усеченного полипептида РОР21 ΐη νίνο этот усеченный полипептид можно ввести животному, используемому для тестирования, внутрибрюшинно. После нужного периода инкубации (например, 1 ч или более) можно взять образец крови и измерить уровень глюкозы. Специфические подробности анализов ΐη νίνο, которые можно применять для исследования активности усеченных полипептидов РОР21, можно найти в примерах 5 и 7.
a. Ν-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Ν-концевые усечения включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков из Ν-концевого участка зрелого полипептида РОР21 или мутанта РОР21. Как продемонстрировано в примере 5 и на фиг. 3, усеченные полипептиды РОР21, имеющие концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков, сохраняют способность зрелого полипептида РОР21 понижать уровень глюкозы в крови субъекта. В соответствии с этим в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида РОР21 или мутантных полипептидов РОР21, имеющих Ν-концевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков.
b. С-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения С-концевые усечения включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков из С-концевого участка зрелого полипептида РОР21. Как продемонстрировано в примере 4 и на фиг. 1В, усеченные полипептиды РОР21, имеющие Сконцевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков, демонстрируют эффективность на уровне как минимум 50% эффективности РОР21 дикого типа в анализе на ЕЬК-люциферазу ΐη νΐΐΐΌ, указывающую на то, что эти мутанты РОР21 сохраняют способность зрелого полипептида РОР21 понижать уровень глюкозы в крови субъекта. В соответствии с этим в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида РОР21 или мутантных полипептидов РОР21, имеющих С-концевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков.
c. Ν-концевые и С-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения усеченные полипептиды РОР21
- 13 021425 могут иметь сочетанные Юконцевые и С-концевые усечения. Усеченные полипептиды РОР21, имеющие сочетание Юконцевых и С-концевых усечений, сохраняют активность соответствующих усеченных полипептидов РОР21, имеющих только Юконцевые или С-концевые усечения. Говоря иначе, усеченные полипептиды РОР21, имеющие как Юконцевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков, так и С-концевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков, обладают такой же или даже большей биологической активностью, например, по снижению уровня глюкозы в крови, чем усеченные полипептиды РОР21, имеющие только Юконцевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков или С-концевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков. В соответствии с этим в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида РОР21 или мутантных полипептидов РОР21, имеющих Юконцевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков и С-концевые усечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков.
Как и в отношении всех мутантов РОР21 по настоящему изобретению, усеченные полипептиды РОР21 и мутанты РОР21 могут в необязательном порядке включать аминоконцевой остаток метионина, который можно ввести посредством направленной мутации или в результате процесса бактериальной экспрессии.
Усеченные полипептиды РОР21 по настоящему изобретению можно изготовить так, как это описано в примерах 3 и 6. Средний специалист в данной области, знакомый со стандартными методиками молекулярной биологии, сможет употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять усеченные полипептиды РОР21 по настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию). См., например, публикацию 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Усеченные полипептиды РОР21 по настоящему изобретению также можно соединять с другим компонентом, который способен придать усеченному полипептиду РОР21 дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения усеченный полипептид РОР21 может быть соединен с последовательностью Рс. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов будут обсуждаться в данном документе более подробно.
4. Мутанты РОР21, устойчивые к протеолизу.
Как указано в примере 8, было обнаружено, что зрелый РОР21 подвергается разрушению ш νίνο, которое, в конечном итоге, является результатом протеолитической атаки. Было обнаружено, что разрушение зрелого РОР21 ш νίνο укорачивает эффективный период его полувыведения, а это, в свою очередь, отрицательно влияет на терапевтический потенциал молекулы. В соответствии с этим было проведено целенаправленное исследование по идентификации мутантов РОР21, которые проявляют устойчивость к протеолизу. В результате этого исследования было определено, что сайты в молекуле зрелого полипептида РОР21, которые особенно чувствительны к протеолизу, включают аминокислотные остатки в положениях 4-5, 20-21, 151-152, 171-172 и 178-181.
Было проведено широкое, но сфокусированное и целенаправленное исследование по идентификации специфических замещений, которые устраняют наблюдаемый протеолитический эффект, хотя при этом не влияют на активность белка в недопустимой степени. Табл. 8 и 11 представляют некоторые из полученных и протестированных мутантов. Как описано в примерах 13 и 14, не все мутанты РОР21 демонстрируют идеальный профиль: одни мутанты, приобретая устойчивость к протеолизу, утрачивали или снижали полезную активность РОР21, а другие мутанты сохраняли активность РОР21, но не приобретали устойчивости к протеолизу. Некоторые мутанты, включая, например, РОР21 Р171О, сохраняли уровень активности, сходный с РОР21 дикого типа, и в то же время демонстрировали устойчивость к протеолитическому разрушению.
Один из критериев отбора при идентификации желательных мутантов РОР21, устойчивых к протеолизу, заключался в том, чтобы активность мутанта РОР21 была, по существу, такой же или даже большей по сравнению с активностью РОР21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты РОР21, которые устойчивы к протеолизу, но при этом сохраняют активность, которая, по существу, не отличается от активности РОР21 дикого типа или превышает ее. Хотя в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настояще- 14 021425 го изобретения связан с мутантами РОР21, которые устойчивы к протеолизу, но проявляют в некоторой степени сниженную активность. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать протеолиз, вследствие чего мутанты РОР21, которые допускают некоторую степень протеолиза, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты РОР21, представленные в данном изобретении, мутанты РОР21, устойчивые к протеолизу, можно изготовить так, как описано в данном документе. Специалисты в данной области, например, знающие стандартные методики молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять мутанты РСР21, устойчивые к протеолизу, представленные в данном изобретении. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию). См., например, публикацию ЗатЪгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЪога1огу Мапиа1, выше, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Мутанты РСР21, устойчивые к протеолизу, можно соединять с другим компонентом, который способен придать мутанту РСР21, устойчивому к протеолизу, дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения устойчивый к протеолизу мутант РСР21 можно соединить с последовательностью Рс 1дС. например, ЗЕС ГО N0: 11. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов известны и будут обсуждаться в данном документе более подробно.
5. Мутанты РСР21 с пониженной агрегацией.
Как описано в примере 15, одним из свойств полипептида РСР21 дикого типа является его склонность к агрегации. При концентрации свыше приблизительно 5 мг/мл степень агрегации высока при комнатной температуре. Как показано и описано в данном документе, степень агрегации для полипептида РСР21 дикого типа зависит как от концентрации, так и от температуры.
Агрегация может создать проблемы при работе с РСР21 дикого типа в этих концентрациях, например, в контексте составления терапевтической композиции. В соответствии с этим было проведено целенаправленное исследование по идентификации мутантов РСР21, которые проявляют пониженную склонность к агрегации. Затем выявленные мутанты РСР21 были протестированы на склонность к агрегации в различных концентрациях.
Было проведено широкое, но сфокусированное и целенаправленное исследование по идентификации специфических замещений, которые устраняют наблюдаемый эффект агрегации для РСР21 дикого типа, но при этом не влияют на активность белка в недопустимой степени. Подход к идентификации подходящих мутантов с пониженной агрегацией описан в примере 15. В табл. 16 представлены некоторые полученные и протестированные мутанты. Как показано в примере 17, не все мутанты РСР21 проявляют идеальный профиль. Одни мутанты, такие как Р0Р21 Б58Е, имели сниженную активность Р0Р21 и не исследовались далее, а другие мутанты, такие как Р0Р21 А134Е, сохраняли активность Р0Р21, но не приобретали свойства пониженной склонности к агрегации. В то же время некоторые мутанты, такие как Р0Р21 Б98К, не только сохраняли активность Р0Р21, но и демонстрировали пониженную агрегацию. Один мутант, Р0Р21 А45К, неожиданно проявил повышенную активность Р0Р21 наряду с пониженной склонностью к агрегации.
Один из критериев отбора при идентификации желательных мутантов Р0Р21, не склонных к агрегации, заключался в том, чтобы активность мутанта Р0Р21 была, по существу, сходной или даже большей по сравнению с активностью Р0Р21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты Р0Р21, имеющие пониженную склонность к агрегации, но в то же время сохраняющие активность Р0Р21, которая сходна с активностью Р0Р21 дикого типа или превышает ее. Несмотря на то что в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами Р0Р21, которые имеют пониженную склонность к агрегации, но проявляют в некоторой степени сниженную активность Р0Р21. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать определенный уровень агрегации, вследствие чего мутанты Р0Р21, которые допускают некоторую степень агрегации, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты Р0Р21, представленные в данном изобретении, мутанты Р0Р21, обладающие пониженной склонностью к агрегации, можно изготовить так, как описано в данном документе. Средние специалисты в данной области, знакомые со стандартными методиками молекулярной биологии, смогут
- 15 021425 употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять мутанты Р0Р21 с пониженной склонностью к агрегации, представленные в данном изобретении. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию). См., например, 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Мутанты Р0Р21, не склонные к агрегации, можно соединять с другим компонентом, который способен придать мутанту Р0Р21, не склонному к агрегации, дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения не склонный к агрегации мутант Р0Р21 можно соединить с последовательностью Рс 1д0, например, 8ЕЦ ГО N0: 11. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов обсуждаются в данном документе более подробно.
6. Комбинированные мутанты Р0Р21.
Как описано в данном документе, последовательность Р0Р21 дикого типа обладает некоторыми свойствами, которые создают значительные проблемы при использовании Р0Р21 в качестве терапевтической молекулы. Среди этих проблем необходимо упомянуть чувствительность белка к разрушению и его склонность к агрегации в высоких концентрациях. После всесторонних попыток идентифицировать такие полипептиды Р0Р21, которые преодолевают каждую из этих проблем, было проведено целенаправленное исследование для определения того, можно ли скомбинировать аминокислотные замещения, придающие белку устойчивость к протеолизу, и замещения, понижающие склонность к агрегации, чтобы добиться аддитивного или синергического эффекта таких замещений в одной полипептидной последовательности, поддерживая при этом такой уровень активности, который соответствует активности Р0Р21 дикого типа или превосходит ее. Эта задача сложна для решения, поскольку в данной области знаний известно, что введение множественных мутаций в определенный полипептид иногда может отрицательно сказаться на экспрессии, активности и последующей выработке белка в производственных масштабах.
Неожиданно, как это продемонстрировано в примерах 19 и 20, было обнаружено, что желательные свойства нескольких мутантов Р0Р21, действительно, можно комбинировать аддитивным или синергическим образом, чтобы получить такой мутант Р0Р21, который обладает улучшенными фармацевтическими свойствами. В данном документе раскрыты мутанты Р0Р21, которые устойчивы к протеолизу, имеют пониженную степень агрегации, но при этом сохраняют такую активность, которая соответствует активности Р0Р21 дикого типа или превосходит ее.
Один из критериев отбора при идентификации желательных комбинированных мутантов Р0Р21 заключался в том, чтобы активность мутанта Р0Р21 была, по существу, сходной или даже большей по сравнению с активностью Р0Р21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты Р0Р21, устойчивые к протеолизу и имеющие пониженную склонность к агрегации, но в то же время сохраняющие активность Р0Р21, которая сходна с активностью Р0Р21 дикого типа или превышает ее. Хотя в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами Р0Р21, которые устойчивы к протеолизу и имеют пониженную склонность к агрегации, но проявляют в некоторой степени сниженную активность Р0Р21. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать определенный уровень протеолиза и/или агрегации, вследствие чего мутанты Р0Р21, которые допускают некоторую степень протеолиза и/или агрегации, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты Р0Р21 по настоящему изобретению, комбинированные мутанты Р0Р21, соответствующие этому изобретению, можно изготовить так, как описано в данном документе. Средние специалисты в данной области, знакомые со стандартными методиками молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять комбинированные мутанты Р0Р21, соответствующие настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию). См., например, 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, син- 16 021425 тетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Комбинированные мутанты РСР21, соответствующие настоящему изобретению, можно соединять с другим компонентом, который способен придать комбинированному мутанту РСР21 дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комбинированный мутант РСР21 можно соединить с последовательностью Рс 1дС. например, ЗЕС ГО N0: 11. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов обсуждаются в данном документе более подробно.
7. Составные белки РСР21.
При использовании в данном документе термин составной полипептид РСР21 или составной белок РСР21 относится к соединению одного или более аминокислотных остатков (например, с образованием гетерологического белка или пептида) на Ν-конце или С-конце любого мутантного полипептида РСР21, описанного в данном документе.
Гетерологические пептиды и полипептиды включают, но не ограничиваясь ими, эпитоп, позволяющий выявить и/или выделить мутантный полипептид РСР21, трансмембранный рецепторный белок или его часть, такую как внеклеточный домен или трансмембранный и внутриклеточный домен, лиганд или часть лиганда, которые связываются с трансмембранным рецепторным белком, фермент или часть фермента, которые каталитически активны, пептид или полипептид, которые стимулируют олигомеризацию, например, домен лейциновой застежки, пептид или полипептид, которые повышают стабильность, например, константный участок иммуноглобулина (например, Рс домен); повышающую срок полувыведения последовательность, содержащую комбинацию двух или более (например, 2, 5, 10, 15, 20, 25 и т.д.) встречающихся в природе или не встречающихся в природе заряженных и/или незаряженных аминокислот (например, серин, глицин, глутамовую или аспартамовую кислоту), разработанную для образования, главным образом, гидрофильного, или, главным образом, гидрофобного партнера гибридизации для мутанта РСР21, функциональное или не функциональное антитело либо его тяжелая или легкая цепь, а также полипептид, который обладает активностью, в частности терапевтической активностью, отличной от мутантных полипептидов РСР21 по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также охватывает мутантов РСР21, соединенных с сывороточным альбумином человека (ΗδΆ).
Составные белки РСР21 можно изготовить посредством соединения гетерологических последовательностей или на Ν-конце, или на С-конце мутантного полипептида РСР21. Как описано в данном документе, гетерологическая последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность или полимер, не содержащий аминокислот. Гетерологические последовательности можно соединять с мутантным полипептидом РСР21 или напрямую, или через линкер/адаптерную молекулу. Линкер или адаптерная молекула могут представлять собой один или более аминокислотных остатков (или -меров), например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 остатков (или -меров), предпочтительно от 10 до 50 аминокислотных остатков (или -меров), например 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 остатков (или -меров) и более предпочтительно от 15 до 35 аминокислотных остатков (или -меров). Линкер или адаптерную молекулу также можно сконструировать с сайтом расщепления для рестрикционной ДНК-эндонуклеазы или для протеазы, что позволяет разделять соединенные компоненты.
а. Соединения с Рс.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутантный полипептид РСР21 соединен с Рс доменом, например, одним или более доменов участка Рс иммуноглобулина 1дС человека. Антитела включают две функционально независимые части, вариабельный домен, известный как РаЪ, который связывает антиген, и константный домен, известный как Рс, который вовлечен в такие эффекторные функции как активация комплемента и атака фагоцитарными клетками. Домен Рс имеет длинный период полувыведения из сыворотки, тогда как домен РаЪ является короткоживущим (Сароп с1 а1., 1989, №-Цигс 337: 525-31). При соединении с терапевтическим белком домен Рс может обеспечить более длительный период полувыведения или встроить такие функции, как связывание рецептора Рс, связывание белка А, фиксация комплемента и, возможно, даже перенос через плаценту (Сароп с1 а1., 1989).
Фармакокинетический анализ ίη νίνο указывает на то, что РСР21 человека имеет короткий период полувыведения, который составляет у мышей приблизительно 1 ч, что связано с быстрым клиренсом и разрушением ίη νίνο. Следовательно, для удлинения периода полувыведения РСР21 нативную последовательность Рс присоединяли к Ν- или С-концевому участку полипептида РСР21. Слияние последовательности Рс с РСР21 дикого типа, в особенности, присоединение Рс к Ν-концу РСР21 дикого типа, вопреки ожиданиям, не удлиняло период полувыведения, однако это наблюдение привело к исследованию протеолитического распада РСР21 ίη νίνο и к идентификации мутантов РСР21, которые были устойчивы к такому распаду. Такие мутанты, описанные в примерах 9 и 11, проявляют больший период полувыведения по сравнению с РСР21 дикого типа. Эти и другие составные белки РСР21 формируют варианты осуществления настоящего изобретения.
- 17 021425
По всему тексту настоящего раскрытия изобретения обозначение Рс-РОР21 относится к составному белку, в котором последовательность Рс присоединена к Юконцу РСР21. Сходным образом, обозначение Рс-РОР21 относится к составному белку, в котором последовательность Рс присоединена к С-концу
РСР21.
Полученный в результате такого слияния составной белок РСР21 можно очистить, например, применяя колонку для аффинной хроматографии с белком А. Было обнаружено, что пептиды и белки, к которым присоединен участок Рс, проявляют ίη νίνο значительно более длительный период полувыведения по сравнению с не соединенными аналогами. К тому же составление с участком Рс создает возможность для димеризации/мультимеризации составного полипептида. Участок Рс может представлять собой участок Рс, встречающийся в природе, но также может подвергаться изменениям для улучшения определенных качеств, таких как терапевтические качества, время циркуляции или сниженная агрегация.
Полезные модификации белковых терапевтических средств за счет слияния с доменом Рс антитела подробно обсуждаются в Международной патентной публикации № ν0 00/024782, содержание которой включено в этот документ в качестве ссылки во всей полноте.
Ь. Линкеры составных белков.
При формировании составных белков по настоящему изобретению можно, но не обязательно, использовать линкер. Если линкер представлен, его химическая структура может быть принципиальной, поскольку он, в первую очередь, служит спейсером. Линкер может состоять из аминокислот, сцепленных друг с другом посредством пептидных связей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения линкер составлен из 1-20 аминокислот, сцепленных посредством пептидных связей, при этом аминокислоты выбраны из 20 аминокислот, встречающихся в природе. В различных вариантах осуществления изобретения от 1 до 20 аминокислот выбраны из глицина, серина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер составлен из большинства аминокислот, которые не испытывают стерических затруднений, таких как глицин и аланин. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкеры представляют собой полиглицины (такие как (С1у)4 (δΕΟ ΙΌ N0: 29) и (С1у)5 (δΕΟ ΙΌ N0: 30)), полиаланины, комбинации глицина и аланина (такие как поли(С1у-А1а)) или комбинации глицина и серина (такие как поли(О1у^ет)). Другие подходящие линкеры включают (О1у)5^ет-(О1у)3^ег-(О1у)4^ег (δΕΟ ΙΌ N0: 28), (О1у)4^ет-(О1у)4^ет-(О1у)4^ег (δΕΟ ΙΌ N0: 31), (С1у)3-Ьу5-(С1у)4 (δΕΟ ΙΌ N0: 32), (С1у)3-А5П-С1у-5ег-(С1у)2 (δΕΟ ΙΌ N0: 33), (С1у)3-Су8(С1у)4 (δΕΟ ΙΌ N0: 34) и С1у-Рто-А8п-С1у-С1у (δΕΟ ΙΌ N0: 35). Несмотря на то что было обнаружено, что для составных белков РСР21 особенно хорош линкер из 15 аминокислот, настоящее изобретение рассматривает линкеры любой длины или любого состава. При использовании линкера для соединения с гетерологической последовательностью, такой как Рс домен, и РСР21 полипептид или РСР21 мутант, линкер приведен в скобках.
Линкеры, описанные в данном документе, типичны, но настоящее изобретение также рассматривает линкеры, которые намного длиннее и могут включать другие аминокислотные остатки. Непептидные линкеры также рассматриваются в настоящем изобретении. Например, можно использовать алкильные линкеры, такие как -КН-(СН2)8-С(О)-, в котором 8 = от 2 до 20. Далее, такие алкильные линкеры могут быть замещены любой стерически незатрудненной группой, включая, но не ограничиваясь ими, низший алкил (например, С1-С6), низший ацил, галоген (например, С1, Вг), СК, КН2 или фенил. Типичным непептидным линкером является полиэтиленгликолевый линкер, который имеет молекулярный вес от 100 до 5000 кДа, например от 100 до 500 кДа.
8. Химически модифицированные мутанты РСР21.
Химически модифицированные формы мутантных полипептидов РСР21, описанные в данном документе, включая усеченные формы РСР21, описанные в данном документе, могут быть изготовлены квалифицированным специалистом с учетом информации, представленной в этом раскрытии изобретения. Такие химически модифицированные мутанты РСР21 изменены таким образом, что они отличаются от не модифицированных мутантов РСР21 или по типу, или по локализации молекул, естественным образом прикрепленных к мутанту РСР21. Химически модифицированные мутанты РСР21 могут включать молекулы, образующиеся посредством удаления одной или более химических групп, прикрепленных естественным образом.
В одном из вариантов осуществления изобретения мутантные полипептиды РСР21 по настоящему изобретению могут быть модифицированы посредством ковалентного присоединения одного или более полимеров. Например, в типичном случае отобранный полимер растворим в воде, поэтому белок, к которому он присоединяется, не выпадает в осадок в водной среде, такой как физиологическая среда. В сферу пригодных полимеров включены смеси полимеров. В целях терапевтического использования препарата, являющегося конечным продуктом, предпочтительно, чтобы полимер был фармацевтически приемлемым. Нерастворимые в воде полимеры, конъюгированные с мутантными полипептидами РСР21 по настоящему изобретению, также формируют один из аспектов изобретения.
Типичные полимеры могут иметь любой молекулярный вес и быть разветвленными или неразветвленными. Каждый типичный полимер имеет средний молекулярный вес приблизительно от 2 до 100 кДа (термин приблизительно указывает на то, что в препаратах водорастворимых полимеров вес некоторых
- 18 021425 молекул будет отличаться в большую или меньшую сторону от заявленного молекулярного веса). Предпочтительно, чтобы средний молекулярный вес каждого полимера составлял приблизительно от 5 до 50 кДа, более предпочтительно приблизительно от 12 до 40 кДа и наиболее предпочтительно приблизительно от 20 до 35 кДа.
Подходящие водорастворимые полимеры или их смеси включают, но не ограничиваясь ими, Νсцепленные или О-сцепленные углеводы, сахара, фосфаты, полиэтиленгликоль (ПЭГ) (включая такие формы ПЭГ, которые были использованы для получения производных белков, включая моно(С1-С10), алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль), монометоксиполиэтиленгликоль, декстран (такой как декстран низкого молекулярного веса, например приблизительно 6 кДа), целлюлозу или другие полимеры на углеводной основе, поли^-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловый спирт. Настоящее изобретение также охватывает бифункциональные поперечно сшитые молекулы, которые могут быть использованы для получения ковалентно связанных мультимеров мутантных полипептидов РОР21. Настоящее изобретение также охватывает мутанты РОР21, ковалентно присоединенные к полисиаловой кислоте.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант РОР21 ковалентно или химически модифицирован с присоединением одного или более водорастворимых полимеров, включая, но не ограничиваясь ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиоксиэтиленгликоль или пропиленгликоль. См., например, патенты США № 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант РОР21 содержит один или более полимеров, включая, но не ограничиваясь ими, монометокси-полиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, другой полимер на углеводной основе, поли^-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимера полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт или смеси таких полимеров.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант РОР21 ковалентно модифицирован субъединицами ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров связаны в одном или более специфических положений (например, на Νконце) мутанта РОР21. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров в случайном порядке прикреплены к одной или более боковых цепей мутанта РОР21. В некоторых вариантах осуществления изобретения ПЭГ используется для улучшения терапевтической производительности мутанта РОР21. Некоторые из таких способов обсуждаются, например, в патенте США № 6133426, который включен в этот документ в качестве ссылки с любой целью.
В тех вариантах осуществления настоящего изобретения, где полимером является ПЭГ, группа ПЭГ может иметь любой подходящий молекулярный вес и может быть линейной или разветвленной. Предпочтительно, чтобы средний молекулярный вес группы ПЭГ варьировался в приблизительном диапазоне от 2 до 100 кДа и более предпочтительно приблизительно от 5 до 50 кДа, например 10, 20, 30, 40 или 50 кДа. Группы ПЭГ обычно прикрепляются к мутанту РОР21 посредством ацилирования или восстановительного алкилирования через реактивную группу на компоненте ПЭГ (например, альдегидную, амино, тиоловую или эфирную группу), взаимодействующую с реактивной группой на мутанте РОР21 (например, альдегидной, амино или эфирной группой).
ПЭГилирование (или пегилирование) полипептидов, включая мутанты РОР21 по настоящему изобретению, может специфически осуществляться с применением любых реакций пегилирования, известных в данной области знаний. Такие реакции описаны, например, в следующих ссылках: Ргаис15 с1 а1., 1992, Γοαίδ οη Сго\\1Н РасГОю 3: 4-10, европейские патенты № 0154316 и 0401384, патент США № 4179337. Например, пегилирование можно осуществить посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реактивной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичного реактивного водорастворимого полимера), как описано в данном документе. Для реакций ацилирования выбранный полимер должен иметь одну реактивную эфирную группу. Для восстановительного алкилирования выбранный полимер должен иметь одну реактивную альдегидную группу. Реактивным альдегидом является, например, пропиональдегид полиэтиленгликоля, который стабилен в воде, либо его моно-С1-С10-алкокси или арилокси производные (см., например, патент США № 5252714).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полезная стратегия присоединения группы ПЭГ к полипептиду включает комбинирование через образование конъюгатной связи в растворе между пептидом и компонентом ПЭГ, при этом каждый из них несет особую функциональность со взаимной реактивностью по отношению друг к другу. Пептиды можно легко приготовить с помощью традиционного твердофазного синтеза. Пептиды предварительно активированы, т.е. имеют соответствующую функциональную группу в специфическом сайте. Перед реакцией с компонентом ПЭГ предшественники очищают и получают их полные характеристики. Сшивание пептида с ПЭГ обычно происходит в водной фазе, и его можно легко мониторировать посредством обращенно-фазовой аналитической ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Пегилированные пептиды можно легко очистить посредством препаративной ВЭЖХ и охарактеризовать посредством аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и лазерной десорбционной масс-спектрометрии.
- 19 021425
Полисахаридные полимеры представляют собой еще один тип водорастворимого полимера, который можно применять для модификации белка. Следовательно, мутанты РОР21 по настоящему изобретению, соединенные с полисахаридным полимером, формируют варианты осуществления настоящего изобретения. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры, состоящие из отдельных субъединиц глюкозы, преимущественно соединенных альфа 1-6 связями. Декстран, как таковой, доступен в широком диапазоне молекулярного веса и легко доступен в диапазоне молекулярного веса приблизительно от 1 до 70 кДа. Декстран является подходящим водорастворимым полимером для применения в качестве носителя самостоятельно или в комбинации с другим носителем (например, Рс). См., например, Международную патентную публикацию № \УО 96/11953. В ней было описано применение декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами. См., например, Европейскую патентную публикацию № 0315456, которая включена в этот документ в качестве ссылки. Настоящее изобретение также охватывает применение декстрана с молекулярным весом приблизительно от 1 до 20 кДа.
В целом, химическую модификацию можно проводить в любых подходящих условиях, которые способствуют реакции белка с активированной молекулой полимера. Способы приготовления химически модифицированных полипептидов обычно включают следующие этапы: (а) реакция полипептида с активированной молекулой полимера (такой как реактивное эфирное или альдегидное производное молекулы полимера) в таких условиях, при которых мутантный полипептид РОР21 прикрепляется к одной или более молекул полимера, и (Ь) получение продуктов реакции. Оптимальные условия реакции можно определить, основываясь на известных параметрах и желательном результате. Например, чем больше соотношение между молекулами полимера и белка, тем больше процентный показатель присоединения молекул полимера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения химически модифицированные мутанты РОР21 могут иметь единичный компонент, представленный молекулой полимера на аминоконце (см., например, патент США № 5234784).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения мутантные полипептиды РОР21 могут быть химически соединены с биотином. Затем комплексам биотина с мутантными полипептидами РОР21 дают возможность связываться с авидином, что приводит к образованию тетравалента авидин/биотин/мутантный полипептид РОР21.
Мутантные полипептиды РОР21 также можно ковалентно соединять с динитрофенолом (ΌΝΡ) или тринитрофенолом (ΤΝΡ), а полученные в результате конъюгаты, осаждаемые антителами 1дМ типа антиΌΝΡ или анти-ΤΝΡ, образуют декамерные конъюгаты с валентностью 10.
В целом, состояния, которые можно облегчить или модулировать введением описанных химически модифицированных мутантов РОР21, включают те же состояния, которые описаны в данном документе для мутантных полипептидов РОР21. Однако химически модифицированные мутанты РОР21, раскрытые в данном документе, могут обладать дополнительными видами активности, усиленной или ослабленной биологической активностью или другими свойствами, такими как удлиненный или укороченный период полувыведения по сравнению с немодифицированными мутантами РОР21.
9. Фармацевтические композиции мутантов РОР21 и их введение.
Фармацевтические композиции, включающие мутанты РОР21, относятся к сфере настоящего изобретения и специфически рассматриваются в свете идентификации различных мутантных последовательностей РОР21, проявляющих улучшенные свойства. Такие фармацевтические композиции с мутантами РОР21 могут включать терапевтически эффективное количество мутантного полипептида РОР21 в смеси с фармацевтически или физиологически приемлемым формообразующим агентом, подобранным в соответствии с предполагаемым способом введения.
Предпочтительно, чтобы приемлемые формообразующие агенты были нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях.
Фармацевтическая композиция может содержать формообразующий агент(ы) для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости разложения или высвобождения, адсорбции или пенетрации композиции. Соответствующие формообразующие агенты включают, но не ограничиваясь ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные средства, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия), буферы (такие как бораты, бикарбонаты, трис-НС1, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты), наполнители (такие как маннит или глицин), хелатообразующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ΕΌΤΑ)), комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бетациклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин), заполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), красящие, вкусоароматические или разбавляющие агенты, эмульгирующие агенты, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон), полипептиды низкого молекулярного веса, солеобразующие противоионы (такие как натрий), консерванты (такие как бензалконий хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода), растворители (такие как
- 20 021425 глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахарные спирты (такие как маннит или сорбит), суспендирующие агенты, сурфактанты или смачивающие агенты (такие как плюроники, ПЭГ, эфиры сорбита, полисорбаты, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин или тилоксапол), агенты, усиливающие стабильность (такие как сахароза или сорбит), агенты, усиливающие тоничность (такие как галиды щелочных металлов, предпочтительно хлорид натрия или калия, маннит, сорбит), транспортировщики для доставки, разбавители, наполнители и/или фармацевтические адъюванты (см., например, Кеш1п§1ои'5 РЬагтасеийса1 8с1спсс5 (181Н Еб., А.К. Оеппаго, еб., Маск РиЫМипд Сотрапу 1990) и последующие издания той же книги, которые включены в этот документ в качестве ссылки с любой целью).
Оптимальную фармацевтическую композицию вполне может определить квалифицированный специалист в зависимости, например, от намеченного способа введения, формата доставки и желательной дозы (см., например, КетшдХоп'к РЬагтасеибса1 Заепсек, выше). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ш νίνο и скорость клиренса ш νίνο мутантного полипептида РОР21.
Основной транспортировщик или носитель в фармацевтической композиции может быть водным или не водным по своей природе. Например, подходящим транспортировщиком или носителем для инъекций может быть вода, физиологический солевой раствор или искусственная спинно-мозговая жидкость, возможно с добавлением других материалов, общепринятых в композициях для парентерального введения. Другими типичными транспортировщиками являются забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином. Другими типичными фармацевтическими композициями являются буфер трис с приблизительным значением рН 7,0-8,5 или ацетатный буфер с приблизительным значением рН 4,0-5,5, которые дополнительно могут включать сорбит или его подходящий заменитель. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции с мутантным полипептидом РОР21 можно приготовить для хранения, смешивая выбранную композицию, имеющую желательную степень чистоты, с факультативными формообразующими агентами (КеттдЮп'5 РЬагтасеибса1 Зшепсек, выше) в виде лиофилизированной таблетки или водного раствора. Кроме того, фармацевтический продукт с мутантным полипептидом РОР21 может выпускаться в виде лиофилизата с применением соответствующих наполнителей, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции с мутантным полипептидом РОР21 могут быть подобраны для парентеральной доставки. В альтернативном варианте можно подобрать композиции для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например пероральной. Изготовление таких фармацевтически приемлемых композиций относится к квалификации специалистов, работающих в данной области.
Формообразующие компоненты представлены в таких концентрациях, которые приемлемы в месте введения композиции. Например, буферы применяют для поддержания рН композиции на физиологическом уровне или несколько ниже, обычно в приблизительном диапазоне рН от 5 до 8.
Когда речь идет о парентеральном введении, терапевтическая композиция для применения по настоящему изобретению может представлять собой апирогенный, парентерально приемлемый водный раствор, содержащий желательный мутантный полипептид РОР21 и фармацевтически приемлемый транспортировщик. Особенно подходящим транспортировщиком для парентеральных инъекций является стерильная дистиллированная вода, в которой растворяют мутантный полипептид РОР21, получая в результате стерильный изотонический раствор, законсервированный соответствующим образом. Еще один препарат может включать лекарственный состав из желательной молекулы с таким агентом, как инъекционные микросферы, биологически распадающиеся частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), капельки или липосомы, обеспечивающие управляемое и длительное высвобождение продукта, который можно доставлять посредством депонированных инъекций. Также можно использовать гиалуроновую кислоту, что может стимулировать длительное пребывание композиции в кровотоке. Другие подходящие средства для введения желательной молекулы включают имплантируемые приспособления для доставки лекарств.
В одном из вариантов осуществления изобретения может быть составлена фармацевтическая композиция для ингаляции. Например, мутантный полипептид РОР21 может быть оформлен в виде сухого порошка для ингаляции. Также можно приготовить ингаляционные растворы мутантного полипептида РОР21 с пропеллентом для аэрозольной доставки. Еще в одном варианте осуществления изобретения растворы можно распылять при помощи небулайзера. Пульмональное (легочное) введение более подробно описано в Международной патентной публикации № Щ0 94/20069, которая описывает пульмональное введение химически модифицированных белков.
Также рассматривается возможность перорального введения некоторых лекарственных составов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутантные полипептиды РОР21, которые вводят таким способом, можно вводить в лекарственные составы вместе с носителями или без носителей, которые обычно используют при изготовлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, можно сконструировать капсулу для высвобождения активной части лекарственного состава в том отделе желудочно-кишечного тракта, где биологическая доступность лекарства будет максимальной, а распад до попадания в системный кровоток будет минимальным. Для того чтобы облегчить
- 21 021425 всасывание мутантного полипептида РСР21, в лекарственный состав можно включить дополнительные агенты. Можно также использовать разбавители, вкусоароматические вещества, воски с низкой температурой плавления, растительные масла, смазки, суспендирующие агенты, агенты для распада таблеток и связующие вещества.
Фармацевтическая композиция другого типа может включать эффективное количество мутантного полипептида РСР21 в смеси с нетоксичными наполнителями, которые удобны для производства таблеток. Растворяя таблетки в стерильной воде или другом подходящем носителе, можно приготовить растворы в стандартной дозовой форме. Подходящие наполнители включают, но не ограничиваясь ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактозу или фосфат кальция, связующие агенты, такие как крахмал, желатин или гуммиарабик, а также смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк.
Квалифицированным специалистам будут очевидны дополнительные варианты фармацевтических композиций с мутантными полипептидами РСР21, включая лекарственные составы с замедленным или контролируемым высвобождением мутантных полипептидов РСР21. Компетентным специалистам также должны быть известны методики составления многих других средств с замедленным или контролируемым высвобождением, таких как липосомные носители, биологически разрушаемые микрочастицы, пористый бисер и депонированные инъекции (см., например, такие ссылки, как Международная патентная публикация № АО 93/15722, которая описывает контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций, А1зсНке & 8сН\уепйетап. 2008, Ιηΐ. 1. РНагт. 364: 298-327, а также РгеФегд & 2Ни, 2004, Ιηΐ. 1. РНагт. 282: 1-18, в которых обсуждается изготовление и применение микросфер/микрочастиц). Как описано в данном изобретении, гидрогель представляет собой пример композиции с замедленным или контролируемым высвобождением.
Дополнительные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде изделий с определенной формой, например пленок или микрокапсул. Матрицы с замедленным высвобождением могут включать сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США № 3773919 и европейский патент № 0058481), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (81йтап еΐ а1., 1983, Вюро1утегз 22: 547-56), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Ьапдег еΐ а1., 1981, I. Вютей. Ма1ег. Кез. 15: 167-277 и Ьапдег, 1982, СНет. ТесН. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Ьапдег еΐ а1., выше) или поли-Э(-)-3-гидроксибутировую кислоту (европейский патент № 0133988). Композиции с замедленным высвобождением также могут включать липосомы, которые можно изготовить любым из множества способов, известных в данной области техники. См., например, Ерз1ет еΐ а1., 1985, Ргос. №Й. Асай. 8ст И8А 82: 3688-92 и европейские патенты № 0036676, 0088046 и 0143949.
Типичная фармацевтическая композиция с мутантным полипептидом РСР21, применяемая для введения ш У1уо, должна быть стерильной. Этого можно достичь пропусканием через мембраны для стерильной фильтрации. При изготовлении лиофилизированной композиции стерилизацию с применением этого способа можно проводить или до лиофилизации, или после лиофилизации и восстановления. Композицию для парентерального введения можно хранить в лиофилизированном виде или в растворе. В дополнение к этому, парентеральную композицию обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, в мешок для внутривенного раствора или во флакон с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожной инъекции.
После составления фармацевтической композиции ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества, обезвоженного или лиофилизированного порошка. Такие лекарственные составы можно хранить или в готовой для применения форме, или в такой форме, которая требует восстановления перед введением (например, в лиофилизированной).
В специфическом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на наборы для изготовления модулей разовых доз, предназначенных для введения. Такие наборы могут включать как первый контейнер с сухим белком, так и второй контейнер с водным составом. В сферу этого изобретения также входят наборы, включающие однокамерные и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).
Эффективное количество фармацевтической композиции с мутантным полипептидом РСР21 для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтической ситуации и целевых объектов терапии. Квалифицированный специалист поймет, что подходящие уровни доз для лечения будут варьироваться, что частично зависит от вводимой молекулы, от показания для применения мутантного полипептида РСР21, от способа введения, а также от габаритов больного (веса тела, площади поверхности тела или размера органа) и от его/ее медицинского статуса (возраста и общего состояния здоровья). В соответствии с этим клиницист, стремясь добиться оптимального терапевтического эффекта, может титровать дозу и изменять способ введения лекарства. Типичная доза может варьироваться в приблизительном диапазоне от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. В других вариантах осуществления изобретения доза может варьироваться в приблизительном диапазоне от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг, от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или от 5 мкг/кг, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 мкг/кг до 100 мг/кг. В других вариантах осуществления изобретения доза может составлять 50,
- 22 021425
100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 мкг/кг или 10 мг/кг.
Частота введения доз будет зависеть от фармакокинетических параметров мутантного полипептида РОР21 в применяемом лекарственном составе. В типичном случае клиницист будет вводить композицию так, чтобы была достигнута доза, позволяющая добиться желательного лечебного эффекта. Следовательно, композицию можно вводить в виде разовой дозы, а также двух или более доз, разделенных по времени (которые могут содержать одно и то же или разное количество нужной молекулы), либо посредством непрерывного вливания через имплантируемое приспособление или катетер. Дальнейшую доводку правильной дозы обычно проводит средний специалист, что находится в пределах его компетенции и входит в сферу его повседневных задач. Правильную дозу устанавливают, исходя из соответствующих данных по дозовой зависимости реакции на лечение.
Способ введения фармацевтической композиции соответствует известным способам, например, перорально, через инъекцию: внутривенную, внутрибрюшинную, внутримозговую (интрапаренхиматозную или интравентрикулярную), внутримышечную, внутриглазную, внутриартериальную, интрапортальтную (в воротную вену), внутрь повреждения, а также через системы с длительным высвобождением (которые могут быть инъекционными или представлять собой имплантируемые приспособления). При желании композиции можно вводить болюсной инъекцией, непрерывным вливанием или через имплантируемое приспособление.
Альтернативно или в дополнение к этому, композицию можно вводить местно через имплантацию мембраны, губки или другого подходящего материала, который впитывает или инкапсулирует нужную молекулу. При использовании имплантируемого приспособления это приспособление можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, при этом доставка нужной молекулы может происходить через диффузию, рассчитанный по времени болюс или в виде непрерывного введения.
Для доставки лекарственного средства, например мутанта РОР21, описанного в данном изобретении, с предварительно определенной скоростью, таким образом, что концентрация лекарственного средства может быть поддержана на желаемом терапевтически эффективном уровне в течение продолжительного периода времени, могут быть применены различные подходы. В одном примере может быть использован гидрогель, содержащий полимер, например желатин (например, бычий желатин, человеческий желатин, или желатин, полученный из другого источника) или встречающийся в природе или синтетически полученный гидрогель. В гидрогеле может быть использовано любое процентное содержание полимера (например, желатина), например 5, 10, 15 или 20%. Выбор соответствующей концентрации может зависеть от множества факторов, например, желаемого терапевтического профиля и фармакокинетического профиля терапевтической молекулы.
Примеры полимеров, которые могут быть включены в гидрогель, включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиэтиленоксид, полиэтиленоксид-со-полипропиленоксид, блок-сополимеры сополиэтиленоксида или статистические сополимеры, поливиниловый спирт, поли(винилпирролидинон), поли(аминокислоты), декстран, гепарин, полисахариды, полиэфиры и т.д.
Другим фактором, который может быть принят во внимание при получении гидрогелевой композиции, является степень перекрестной сшивки в гидрогеле и агенте перекрестной сшивки. В одном варианте осуществления изобретения перекрестная сшивка может быть получена посредством реакции метакрилирования с использованием метакрилового ангидрида. В некоторых ситуациях может быть желательной высокая степень перекрестной сшивки, в то время как в других ситуациях предпочтительной является более низкая степень перекрестной сшивки. В некоторых случаях более высокая степень перекрестной сшивки обеспечивает более длительное замедленное высвобождение. Более высокая степень перекрестной сшивки может обеспечивать более плотный гидрогель и более длительный период доставки лекарственного средства.
Для получения гидрогеля с желательными свойствами может быть использовано любое соотношение полимера и агента перекрестной сшивки (например, метакриловый ангидрид). Например, соотношение полимера и агента перекрестной сшивки может быть, например, 8:1, 16:1, 24:1 или 32:1. Например, если гидрогелевым полимером является желатин, а агентом перекрестной сшивки является метакрилат, то могут быть использованы соотношения метакриловый ангидрид:желатин 8:1, 16:1, 24:1 или 32:1.
10. Возможности терапевтического применения мутантных полипептидов РОР21.
Мутантные полипептиды РОР21 можно применять для лечения, диагностики, облегчения или профилактики многих заболеваний или патологических состояний, включая нарушения обмена веществ, но не ограничиваясь ими. В одном из вариантов осуществления изобретения нарушение обмена веществ, подлежащее лечению, представляет собой сахарный диабет, например диабет 2 типа. В другом варианте осуществления изобретения нарушением обмена веществ является ожирение. Другие варианты осуществления изобретения направлены на такие метаболические состояния или нарушения, как дислипидемия, гипертония, гепатостеатоз, в частности неалкогольный гепатостеатоз (ΝΑδΗ), сердечно-сосудистое заболевание, в частности атеросклероз, и возрастные изменения обмена веществ.
В прикладном варианте осуществления изобретения такое заболевание/патологическое состояние, как сахарный диабет или ожирение, можно лечить посредством введения больному, нуждающемуся с
- 23 021425 таком лечении, мутантного полипептида РОР21 в терапевтически эффективной дозе, как описано в данном документе. Введение можно осуществить в соответствии со способами, описанными в данном документе, в частности, посредством внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутримышечной инъекции или перорально в виде таблеток или жидкого лекарственного состава. В большинстве ситуаций нужную дозу может определить клиницист, как описано в данном документе, при этом нужная доза представляет собой терапевтически эффективную дозу мутантного полипептида РОР21. Квалифицированному специалисту будет очевидно, что терапевтически эффективная доза мутантного полипептида РОР21 будет зависеть, кроме всего прочего, от графика введения, от стандартной дозы вводимого агента, от того, вводят ли молекулу нуклеиновой кислоты или полипептида в комбинации с другими терапевтическими средствами, от иммунного статуса и общего состояния здоровья реципиента. Термин терапевтически эффективная доза при использовании в данном документе означает, что количество мутантного полипептида РОР21, вызывающее биологическую или медицинскую реакцию в тканевой системе, в организме животного или человека, которое пытается определить исследователь, лечащий врач или другой клиницист, вызывает облегчение симптомов заболевания или расстройства, подлежащего лечению.
11. Антитела.
В объеме настоящего изобретения рассматриваются антитела и фрагменты антител, которые специфично связываются с мутантными полипептидами РОР21 по настоящему изобретению, но не дают специфического связывания с полипептидами РОР21 дикого типа. Антитела могут быть поликлональными, включая специфические поликлональные, моноклональными (МАЬ), рекомбинантными, химерными, гуманизированными, такими как антитела с пересаженным гипервариабельным участком (СОК), антителами человека, одноцепочечными и/или биспецифическими, а также могут представлять собой их фрагменты, варианты или химически модифицированные молекулы. Фрагменты антител включают те части антитела, которые специфически связываются с эпитопом на мутантном полипептиде РОР21. Примеры таких фрагментов включают фрагменты РаЬ и Р(аЬ'), полученные в результате ферментативного расщепления полноразмерных антител. Другие связывающие фрагменты включают фрагменты, полученные методиками рекомбинантных ДНК, такими как экспрессия рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные участки антитела.
Термин специфичное связывание при использовании в контексте антитела означает, что антитело связывает свою мишень в присутствии гетерогенной популяции белков или другого биологического материала. Более конкретно, если антитело специфично связывает свою мишень, это означает, что в предварительно определенных условиях иммуноанализа, данное антитело связывает свою мишень и не связывает в значительном количестве другие белки, присутствующие в данной пробе. Для идентификации антитела, которое специфично связывает свою мишень, может быть применен любой удобный формат иммуноанализа, например твердофазные иммуноанализы ЕЫЗА. См., например, Наг1оте аиб Ьапе (1988), АиДЬоЛек, А БаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б Зргшд НагЬог РиЬНсабоик, Ыете Уогк. Поликлональные антитела, направленные на РОР21 мутантный полипептид, в общем, продуцируются у животных (например, кролики или мыши) посредством множественных подкожных или внутрибрюшинных инъекций мутантного полипептида РОР21 и адъюванта. Может оказаться полезным конъюгировать мутантный полипептид РОР21 с белковым носителем, который является иммуногеном для иммунизированного биологического вида, таким как гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, тиреоглобулин крупного рогатого скота или соевый ингибитор трипсина. Для усиления иммунного ответа также используют агрегирующие агенты, такие как квасцы. После иммунизации у животных берут образцы крови и проводят анализ сыворотки на титр антитела против мутантного РОР21.
Моноклональные антитела, направленные на мутантные полипептиды РОР21, можно производить любым способом, который предусматривает выработку молекул антитела непрерывной клеточной линией в культуре. Примеры подходящих способов для выработки моноклональных антител включают способы гибридомы, описанные КоЫег е1 а1., 1975, ЫаШге 256: 495-97, и способ гибридомы из В-клеток человека (Ко/Ьог, 1984, I. 1ттиио1. 133: 3001; Вгобеиг е1 а1., Моиос1оиа1 АпДЬобу Ргобисбои ТесЬпкщек аиб АррИсаБопк 51-63 (Магсе1 Эеккег. 1ис., 1987)). Настоящее изобретение также предлагает клеточные линии, которые вырабатывают моноклональные антитела, реагирующие с мутантными полипептидами РОР21.
Моноклональные антитела по данному изобретению можно модифицировать для применения в качестве лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело представляет собой химерное антитело, в котором часть тяжелой (Н) и/или легкой (Ь) цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных от определенного биологического вида или принадлежащих к особому классу/подклассу антител, тогда как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных от другого биологического вида или принадлежащих к другому классу/подклассу антител. Сюда же можно включить фрагменты таких антител, которые способны проявлять нужную биологическую активность. См., например, патент США № 4816567, Моткои е1 а1., 1985, Ргос. ЫаИ. Асаб. Зск ИЗА 81: 6851-55.
- 24 021425
В другом варианте осуществления моноклональное антитело по данному изобретению представляет собой гуманизированное антитело. Способы гуманизации антител, происходящих не от человека, хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США № 5585089 и 5693762. Обычно гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, встроенных в него из источника нечеловеческого происхождения. Гуманизацию можно провести, например, применяя способы, описанные в данной области техники (см., например, Шпее е! а1., 1986, №1иге 321: 522-25; ШесЬтапп е! а1., 1998, №1иге 332: 323-27; УегЬоеуеп е! а1., 1988, 8с1епсе 239: 1534-36), посредством замещения как минимум части гипервариабельного участка антитела грызуна соответствующими участками из антитела человека.
Изобретение также охватывает антитела человека, которые связывают мутантные полипептиды РОР21 по настоящему изобретению. Используя трансгенных животных (например, мышей), которые способны вырабатывать набор антител человека при отсутствии эндогенной выработки иммуноглобулина, такие антитела получают, иммунизируя животных антигеном, полученным из мутанта РОР21 (т.е. антигеном, имеющим как минимум 6 смежных аминокислот), факультативно соединенных с носителем. См., например, ίηΐ^ονί^ е! а1., 1993, Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И8А 90: 2551-55; ^акοЬον^!е е! а1., 1993, №йиге 362: 255-58; Вгиддегтапп е! а1., 1993, Уеаг т 1ттипо, 7: 33. В одном из способов таких трансгенных животных получают, выводя из строя эндогенные локусы, кодирующие у них тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина, и вставляя в их геном локусы, кодирующие белки тяжелых и легких цепей человека. Затем частично модифицированных животных, т.е. животных, имеющих неполный комплект модификаций, скрещивают, чтобы получить животное, имеющее все нужные модификации иммунной системы. При введении иммуногена эти трансгенные животные вырабатывают антитела с аминокислотными последовательностями человека (скорее чем, например, с мышиными), включая вариабельные участки, которые иммуноспецифичны для этих антигенов. См., например, международные патентные публикации № \У0 96/33735 и \У0 94/02602. Дополнительные способы описаны в патенте США № 5545807, международных патентных публикациях № \У0 91/10741 и \У0 90/04036, а также в европейском патенте № 0546073. Антитела человека также можно вырабатывать посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клеткаххозяевах или экспрессии в клетках гибридомы, как описано в данном документе.
В альтернативном варианте осуществления изобретения антитела человека также можно получать из библиотек фагового дисплея (см., например, НоодепЬоот е! а1., 1991, I. Мо1. ΒίοΙ. 227: 381; Матке е! а1., 1991, ί. Мο1. ΒίοΙ. 222: 581). Эти процессы имитируют иммунный отбор через демонстрацию репертуара антител на поверхности нитевидного бактериофага и последующий отбор фага посредством его связывания с антигеном выбора.
Химерные антитела, антитела с пересаженным СИК и гуманизированные антитела обычно получают рекомбинантными способами. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, вводят в клетки-хозяева и экспрессируют, применяя материалы и процедуры, описанные в данном документе. В одном из вариантов осуществления изобретения антитела вырабатывают в клетках-хозяевах млекопитающего, таких как клетки СНО. Моноклональные (например, человеческие) антитела можно получать посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или в клетках гибридомы, как описано в данном документе.
Антитела против мутанта РОР21 по изобретению можно использовать в любом известном способе анализа для выявления и количественной оценки мутантных полипептидов РОР21, таком как анализы конкурентного связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации (см., например, публикацию 8ο1;·ι. Мοηοс1οηа1 Аη!^Ьοб^ее: А Мапиа1 οί ТесЬпкщее 147-158 (СКС Ргеее, 1пс., 1987), включенную в этот документ в качестве ссылки во всей полноте ее содержания). Антитела будут связывать мутантные полипептиды РОР21 с аффинностью, которая соответствует используемому методу анализа.
При диагностическом использовании в некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против мутантов РОР21 можно пометить выявляемым компонентом. Выявляемый компонент может представлять собой любой компонент, который способен создавать прямым или непрямым образом поддающийся выявлению сигнал. Например, выявляемым компонентом может быть радиоизотоп, такой как 3Н, 14С, 32Р, 35δ, 1251, 99Тс, 1Н1п или 67Оа, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцинизотиоцианат, родамин или люциферин, а также фермент, такой как щелочная фосфатаза, βгалактозидаза или пероксидаза хрена (Вауег е! а1., 1990, Ме!Ь. Еп/. 184: 138-63).
Анализы с конкурентным связыванием основаны на способности меченого стандарта (например, мутантного полипептида РОР21 или его иммунологически реактивной части) конкурировать с испытуемым анализируемым продуктом (например, мутантным полипептидом РОР21) за связывание с ограниченным количеством антитела против мутанта РОР21. Количество мутантного полипептида РОР21 в испытуемом образце обратно пропорционально количеству стандарта, который вступает в связь с антителами. Для того чтобы облегчить определение количества связанного стандарта, антитела обычно инсобилизируют (переводят в нерастворимую форму) до или после конкуренции, чтобы стандарт и анализируемый продукт, связанные с антителами, было удобно отделить от стандарта и анализируемого продукта, оставшихся несвязанными.
- 25 021425
Сэндвич-анализы обычно включают использование двух антител, каждое из которых способно связываться с самостоятельной иммуногенной частью или эпитопом белка, подлежащего выявлению или количественной оценке. В сэндвич-анализе тестируемый образец анализируемого продукта обычно связывается с первым антителом, которое иммобилизовано на твердой опоре, а затем второе антитело связывается с анализируемым продуктом, формируя таким образом комплекс из трех частей. См., например, патент США № 4376110. Второе антитело, само по себе, может быть мечено выявляемым компонентом (прямые сэндвич-анализы) или измеряться с применением антитела против иммуноглобулина, которое мечено выявляемым компонентом (непрямые сэндвич-анализы). Например, одним из типов сэндвичанализа является твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫЗА), в котором выявляемый компонент представляет собой фермент.
Антитела против мутанта Р0Р21 по настоящему изобретению также полезны для получения визуальных изображений ίη У1уо. Антитело, меченое выявляемым компонентом, можно ввести животному, предпочтительно в кровоток с последующей оценкой наличия и локализации меченого антитела в организме хозяина. Антитело можно пометить любым компонентом, который поддается выявлению у животного способами ядерного магнитного резонанса, радиологии или другими средствами выявления, известными в данной области техники.
Антитела к мутантам Р0Р21 по данному изобретению можно использовать как лекарственные средства. Терапевтические агенты обычно являются агонистами или антагонистами в том смысле, что они либо усиливают, либо ослабляют соответственно как минимум одну из биологических активностей мутантного полипептида Р0Р21. В одном из вариантов осуществления антагонистические антитела по изобретению представляют собой антитела или их связывающие фрагменты, которые способны к специфическому связыванию с мутантным полипептидом Р0Р21 и которые способны подавлять или устранять функциональную активность мутантного полипептида Р0Р21 ίη У1уо или ίη уйго. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело будет подавлять функциональную активность мутантного полипептида Р0Р21 как минимум приблизительно на 50% и предпочтительно как минимум приблизительно на 80%. Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против мутанта способно вмешиваться во взаимодействие между мутантным полипептидом Р0Р21 и рецептором Р0Р, таким образом, подавляя или устраняя активность мутантного полипептида РОР21 ίη уйго или ίη У1уо. Агонистические и антагонистические антитела против мутанта РОР21 идентифицируют скринирующими анализами, который хорошо известны в данной области техники.
Изобретение также относится к набору, включающему антитела против мутанта РОР21 и другие реактивы, полезные для выявления уровня мутантного полипептида Р0Р21 в биологических образцах. Такие реактивы могут включать выявляемую метку, блокирующую сыворотку, положительные и отрицательные контрольные образцы, а также реактивы для выявления.
Примеры
Приведенные ниже примеры иллюстрируют специфические варианты осуществления изобретения и различные варианты его применения. Они сформулированы только в целях пояснения, и их не следует воспринимать как ограничивающие сферу действия изобретения каким-либо образом.
Пример 1. Изготовление конструкций для экспрессии РОР21.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид Р0Р21, получали посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПИР) с использованием праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности, которые соответствуют 5' и 3' концам последовательности зрелого Р0Р21. Табл. 2 перечисляет праймеры, использованные амплификации последовательности зрелого Р0Р21.
Таблица 2
Праймеры ПИР для конструкции Р0Р21
Праймер Последовательность 8ЕО ГО ΝΟ:
Смысловой 5'-АООАООААТААСАТАТОСАТССААТТООАОАТТСТТСТСС-3' 12
Антисмысловой 5'-ТАОТОАОСТСОААТТСТТАООААОСОТАОСТОО-3’ 13
Праймеры, использованные для изготовления конструкции, экспрессирующей зрелый Р0Р21, включали сайты рестрикционной эндонуклеазы (сайт N001 также содержит ^концевой метионин для бактериальной экспрессии) для направленного клонирования последовательности в подходящий вектор экспрессии (например, рЕТ30 ^оуа^ей/ЕМО В^ше^ев; Сан-Диего, штат Калифорния) или рАМО33 (Атцещ Саузенд Оукс, штат Калифорния)). Вектор экспрессии рАМО33 содержит низкокопийную точку начала репликации К-100, модифицированный промотор 1ас и ген устойчивости к канамицину. Вектор экспрессии рЕТ30 содержит точку начала репликации, полученную из рВК322, индуцируемый промотор Т7 и ген устойчивости к канамицину. Было обнаружено, что экспрессия из рАМО33 выше, но рЕТ30 является более надежным вектором для клонирования. Таким образом, большинство конструкций, описанных в данном изобретении, сначала были созданы в рЕТ30, а затем скринированы на эффективность. После этого отобранные последовательности были перенесены в рАМО33 для дальнейшей амплифика- 26 021425 ции.
Последовательность РОР21 была амплифицирована в реакционной смеси, содержащей 40,65 мкл бН2О, 5 мкл реакционного буфера РгаИИга II Кеасбоп ВиРРег (10х), 1,25 мкл смеси 6ΝΤΡ (40 мМ - 4x10 мМ), 0,1 мкл матрицы (100 нг/мл), 1 мкл праймера 1 (10 мкм), 1 мкл праймера 2 (10 мкм) и 1 мкл соединяющей ДНК-полимеразы НЗ Р&ИИга II (З!га!адепе, Ла-Хойя, штат Калифорния). Реакции амплификации проводили с нагреванием в течение 2 мин при 95°С, сопровождающимся десятью циклами при 95°С в течение 20 с, 60°С в течение 20 с (с дополнительным вычитанием 1°С на цикл) и 72°С в течение 15 с на килобазу нужного продукта, после чего проводили 20 циклов при 94°С в течение 20 с, 55°С в течение 20 и 72°С в течение 15 с на килобазу нужного продукта, а затем 72°С в течение 3 мин. Продукты амплификации расщепляли рестрикционными эндонуклеазами ΝώΗ ЭрЛ и ЕсоК!, вшивали в подходящий вектор, а затем встраивали в компетентную клетку для ее трансформации.
Пример 2. Очистка белков РОР21, полученных из бактерий.
В последующих примерах различные белки РОР21, включая полипептид РОР21 дикого типа, усеченные полипептиды РОР21, мутанты РОР21 и гибридные белки РОР21, были экспрессированы в бактериальной системе экспрессии. После экспрессии, которая описана ниже, белки РОР21 были очищены, как описано в этом примере, если специально не указано иное.
Для очистки полипептида РОР21 дикого типа, усеченных полипептидов РОР21 и мутантов РОР21 от бактериальных телец включений дважды отмытые тельца включений (ЭХУШ) солюбилизировали в солюбилизационном буфере, содержащем гуанидина гидрохлорид и ΌΤΤ в буфере Τπ8 при рН 8,5. Их затем перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре, и солюбилизированную смесь добавляли к буферу для рефолдинга, содержащему мочевину, аргинин, цистеин и цистамина гидрохлорид при рН 9,5, а затем перемешивали 24 ч при 5°С (см., например, С1агке, 1998, Сигг. Ορίη. Вю!есбпо1. 9: 157-63; Маппа11 е! а1., 2007, Вю!есбпо1. Вюепд. 97: 1523-34; Кибо1рб е! а1., 1997, Ро1бб1д ргоЮпъ, Рго!еш Рипсбоп: А Ртасбса1 Арртоасб (СгбдЫоп, еб., Νον Уогк, [КБ Рге88), 57-99; и ИЫЪазЫ е! а1., 2005, Рто!еш Ехрг. РипР 42: 1-6).
После солюбилизации и рефолдинга смесь пропускали через фильтр с размером ячеек 0,45 мкм. Затем концентрацию пула рефолдинга увеличивали приблизительно в 10 раз, используя для этого отделяющую кассету Ра11 Отеда с молекулярным весом 10 кДа при трансмембранном давлении (ТМР) 20 ρδί, а также проводили диафильтрацию с 3 объемами колонки 20 мМ Τπ8, рН 8,0 при ТМР 20 ρδί.
После этого очищенный образец подвергали анионообменной хроматографии (АЕХ) с применением смолы С Зерйагоке НР. Линейный солевой градиент от 0 до 250 мМ ΝηΟ в 20 мМ Τπ8 прогоняли при рН 8,0 и температуре 5°С. Пиковые фракции анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и объединяли.
Затем пул элюата АЕХ подвергали хроматографии гидрофобного взаимодействия (ШС) с применением смолы РНепу1 Зерйагоке НР. Белок элюировали, применяя понижающийся линейный градиент от 0,7 до 0 М сульфата аммония при рН 8,0 и температуре окружающей среды. Пиковые фракции анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Ьаеттб, 1970, №йиге 227: 680-85) и объединяли.
Концентрацию пула ШС увеличивали до 7 мг/мл, применяя для этого отделяющую кассету Ра11 Отеда 0,2 м2 с молекулярным весом 10 кДа при ТМР 20 ρδί. Проводили диафильтрацию концентрата с 5 объемами колонки буфера композиции при ТМР 20 ρδί, а восстановленный концентрат разбавляли до 5 мг/мл. Наконец, раствор фильтровали через позидиновую мембрану Ра11 т1т-К1еепрас 0,2 мкМ.
Для очистки составных белков РОР21 и составных мутантных белков РОР21 от бактериальных телец включений дважды отмытые тельца включений (О^У(В) солюбилизировали в солюбилизационном буфере, содержащем гуанидина гидрохлорид и ΌΤΤ в буфере Ττίδ при рН 8,5, затем перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем солюбилизированную смесь добавляли к буферу для рефолдинга, содержащему мочевину, аргинин, цистеин и цистамина гидрохлорид при рН 9,5, а затем перемешивали 24 ч при 5°С (см., например, С1агке, 1998, Сигг. Орш. Вю!есЬпо1. 9: 157-63; Маппа11 е! а1., 2007, ВюРесЬпо1. Вюепд. 97: 1523-34; Кнбо1рй е! а1. 1997, Ро1бшд рто!еш8, Рто!еш Рипсбоп: А Ртасбса1 Арртоасб (Сте1дб!оп, еб., №ν Уогк, ШЬ Рте88) 57-99, и бНЮМй е! а1., 2005, Рто!еш Ехрг. РипР. 42: 1-6).
После солюбилизации и рефолдинга смесь подвергали диализу в 5 объемах 20 мМ Ττί8, рН 8,0, применяя диализную трубку 10 кВ. Уровень рН диализированного перевернутого материала доводили до 5,0 при помощи 50% уксусной кислоты, а затем осветляли материал центрифугированием в течение 30 мин при 4К.
После этого осветленный образец подвергали анионообменной хроматографии (АЕХ) с применением смолы С Зербато8е НР. Линейный солевой градиент от 0 до 250 мМ ΝπΟ в 20 мМ Ττί8 прогоняли при рН 8,0 и температуре 5°С. Пиковые фракции анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Ьаеттб, 1970, №йиге 227: 680-85) и объединяли.
Затем пул элюата АЕХ подвергали хроматографии гидрофобного взаимодействия (ШС) с применением смолы Рбепу1 Зербато8е НР. Белок элюировали, применяя понижающийся линейный градиент от 0,6 до 0 М сульфата аммония при рН 8,0 и температуре окружающей среды. Пиковые фракции анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и объеди- 27 021425 няли.
После этапа Н1С пул подвергали диализу в 60 объемах буфера композиции. Концентрацию диализированного пула увеличивали до 5 мг/мл, применяя устройство Ра11 1ишЬо§ер. Наконец, раствор фильтровали через позидиновую мембрану Ра11 т1П1-К1еепрас 0,2 мкМ.
Пример 3. Изготовление и экспрессия усеченных белков РОР21.
Конструкции, кодирующие усеченные белки РОР21 и перечисленные в табл. 3, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии РОР21 дикого типа, как описано ниже (конструкция вектора экспрессии РОР21 дикого типа описана в примере 1).
Таблица 3
Усечения РОР21
Аминокислотные остатки Число усеченных остатков*
С-концевые усечения
1-180 1
1-179 2
1-178 3
1-177 4
1-176 5
1-175 6
1-174 7
1-173 8
1 - 172 9
1 - 171 10
1-169 12
1-168 13
1-167 14
1-166 15
1-165 16
1-164 17
1-160 21
1-156 25
1-152 29
- 28 021425
1-149 32
1-113 68
Ν-концевые усечения
2-181 1
3-181 2
4-181 3
5-181 4
6-181 5
7-181 6
8-181 7
9-181 8
С- и Ν-концевые усечения
5-174 11
7-172 17
9-169 20
9-149 40
15-169 26
15-149 46
15-113 82
* По отношению к зрелому полипептиду Р0Р21.
Усеченные белковые конструкции Р0Р21 были изготовлены с применением праймеров, имеющих последовательности, которые гомологичны участкам, расположенным выше и ниже кодона (или кодонов), подлежащего делеции (что приводит к усечению). Праймеры, использованные в таких реакциях амплификации, также обеспечивали приблизительно 15 нуклеотидов перекрывающейся последовательности, что позволяло рециркуляризировать амплифицированный продукт, а именно весь вектор, теперь содержащий нужный мутант или усечение.
Типичная усеченная конструкция Р0Р21, кодирующая белок Р0Р21, в котором утрачен остаток гистидина в положении 1 зрелой последовательности Р0Р21 (т.е. усеченный мутант 2-181), была изготовлена с применением праймеров, показанных в табл. 4.
Таблица 4
Праймеры ПЦР для изготовления типичного усеченного мутанта Р0Р21
Праймер Последовательность 8ЕЦ Π) ΝΟ:
Смысловой 5’-ССАСАТАТАСАТАТСССААТТССАСАТТСТТСТССАТТАТТ-3' 14
Антисмысловой 5'-САТАТСТАТАТСТССТТСТТАААСТТАААСАААА-3’ 15
Праймеры, показанные в табл. 4, рассчитаны на делецию остатка гистидина, как показано ниже, при этом верхняя последовательность (8Е() ΙΌ N0: 9) является частью зрелого полипептида Р0Р21, включающей \-концевой метионин, вторая последовательность является смысловым праймером (8ЕР ΙΌ N0: 14), третья и четвертая последовательности (8ЕР ΙΌ N0: 17 и 8ЕР ΙΌ N0: 18) являются частями конструкции, экспрессирующей Р0Р21, а пятая последовательность является антисмысловым праймером (81 СО ΙΌ N0: 16):
МеСНтзРгоИеРгоАзрЗегЗегРгоЬеи 5'-ССАСАТАТАСАТАТ6---СААТТССАСАТТСТТСТССАТТАТТ
ТТТТСТТТААСТТТААСААССАСАТАТАСАТАТССАТССААТТССАСАТТСТТСТССАТТАТТ
ААААСАААТТСАААТТСТТССТСТАТАТСТАТАСбТАССТТААССТСТААСААСАССТААТАА
ААААСАААТТСАААТТСТТССТСТАТАТСТАТАС-5'
Усеченные конструкции белка Р0Р21 были изготовлены с применением, по существу, тех же условий ПЦР, что описаны в примере 1. Продукты амплификации были подвергнуты расщеплению рестрикционной эндонуклеазой 1)рп1, а затем введены в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой.
Усеченные белки Р0Р21 были экспрессированы посредством трансформации компетентных клеток ΒΙ.21 (1)123) или ΒΙ.21 81аг Цпуйгодеп, Карлсбад, штат Калифорния) конструкцией, кодирующей частич- 29 021425 но усеченный белок РОР21. Трансформанты выращивали в течение ночи с ограниченной аэрацией в среде ТВ с добавлением 40 мкг/мл канамицина, аэрировали на следующее утро и после короткого периода восстановления индуцировали в 0,4 мМ ΙΡΤΟ. Мутанты РОР21 собирали центрифугированием через 1820 ч после индукции.
Пример 4. Активность усеченных белков РОР21 ΐη νϊΐΓο.
Были проведены эксперименты по идентификации усеченных белков РОР21, которые сохраняют активность РОР21 дикого типа в анализе на ЕРК-люциферазу ιη νϊΐΓο. Табл. 5 показывает в сводном виде результаты, полученные для белков РОР21, имеющих усечения на Ν-конце, С-конце или как на Ν-конце, так и на С-конце. Анализы на ЕРК-люциферазу проводили с использованием рекомбинантной системы почечных клеток человека 293Т, в которой клетки 293Т избыточно экспрессируют генные конструкции β-Клото и репортера люциферазы. Эти конструкции также содержат последовательности, кодирующие ОЛЕ4-ЕЬК1 и 5хиА5-Ьис, репортер люциферазы, управляемый промотором, который содержит тандемные копии сайта связывания Оа14. β-Клото представляет собой сорецептор, который востребован РОР21 для активации его РОР-рецепторов и индуцирования трансдукции внутриклеточного сигнала, который, в свою очередь, приводит к фосфорилированию Егк и ЕРК. Активность люциферазы регулируется уровнем фосфорилированного Егк/ЕРК1 и используется для непрямого мониторирования и количественной оценки активности РОР21.
Анализы на ЕРК-люциферазу проводили, культивируя клетки 293Т в присутствии разных концентраций полипептида РОР21 дикого типа или мутантного полипептида РОР21 в течение 6 ч, после чего проводили оценку клеточных лизатов на активность люциферазы. На фиг. 1А, 1В показывают результаты анализа активности ЕРК-люциферазы, проведенного на усеченных мутантах РОР21 7-181 и 8-181 (фиг. 1А) и усеченных мутантах РОР21 1-172, 1-171, 1-169 и 1-164 (фиг. 1В). Люминесценция, полученная в анализах на активность ЕРК-люциферазы в каждом из усеченных мутантов РОР21: 3-181, 4-181, 5181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 и 1-149, показана на фиг. 2.
Мутантные полипептиды РОР21 сравнивали со стандартом РОР21 дикого типа, а мутанты, показывающие эффективность, составляющую как минимум 50% эффективности РОР21 дикого типа, считали не утратившими активность РОР21 (в табл. 5 они помечены символом +).
Таблица 5
Усеченные белки РОР21: анализ ίη νϊΐΓο
С-концевые усечения
Аминокислотные остатки Эффективность Активность (+/-)
1-180 93,2% +
1-178 95,0% +
1-177 112,0% +
1-176 104,8% +
1-174 104,6% +
1-173 96,1% +
1-172 97,5% +
1-171 113,0% +
1-169 84,9% +
1 - 167 20% -
1-166 20% -
1-165 10% -
Ν-концевые усечения
Аминокислотные остатки Эффективность Активность (+/-)
2-181 112,5% +
3-181 130,3% +
4-181 117,0% +
5-181 119,6% +
7-181 74,2% +
8-181 24,9% -
9-181 12,5% -
Собирательный взгляд на результаты, представленные в табл. 5, указывает на то, что С-концевые делеции 14 или более аминокислотных остатков (т.е. белка РОР21 с С-концевым усечением, состоящим
- 30 021425 из аминокислотных остатков 1-167 и более коротких белков) приводят к элиминации активности РОР21. В дополнение к этому табл. 5 указывает на то, что Ν-концевые делеции 7 или более аминокислотных остатков (т.е. белка РОР21 с Ν-концевым усечением, состоящим из аминокислотных остатков 8-181 и более коротких белков) приводят к элиминации активности РОР21. Не удивительно, что усеченные белки РОР21, имеющие как Ν-концевые усечения от 8 до 14 остатков, так и С-концевые усечения от 12 до 32 остатков, по результатам анализов на ЕЬК-люциферазу утрачивали активность.
В соответствии с данными, представленными в табл. 5, усеченные полипептиды РОР21, имеющие Ν-концевые усечения менее 7 аминокислотных остатков, составляют варианты осуществления настоящего изобретения. Сходным образом, усеченные полипептиды РОР21, имеющие С-концевые усечения менее 13 аминокислотных остатков, составляют варианты осуществления настоящего изобретения.
Пример 5. Активность усеченных белков РОР21 ш νί\Ό.
Белок РОР21 обладает множеством видов биологической активности, включая способность понижать в крови уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина, уменьшать вес тела, а также улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии и чувствительность к инсулину. Далее усеченные полипептиды РОР21 были проанализированы на активность РОР21 ш νί\Ό посредством введения усеченных полипептидов РОР21 инсулинорезистентным мышам оЬ/оЬ и измерения способности частично усеченных полипептидов РОР21 понижать уровень глюкозы в крови. Тестируемый усеченный полипептид РОР21 впрыскивали внутрибрюшинно 8-недельным мышам оЬ/оЬ Цасккои ЬаЬогаЮгу) и после разовой инъекции брали у животных образцы крови в разных точках времени, например, через 0, 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром ОиеТоисБ (Ы£е8саи, 1ис. Милпитас, штат Калифорния), и результаты измерений выражали в виде процентного изменения уровня глюкозы по сравнению с начальным уровнем глюкозы в крови (т.е. в точке времени 0).
Результаты одного из экспериментов представлены на фиг. 3, которая отображает количество глюкозы в крови, выявленное у мышей, которым впрыскивали усеченные мутанты РОР21 8-181 и 9-181. Этот эксперимент продемонстрировал, что усеченные составные белки РОР21, включающие аминокислотные остатки 8-181, проявляют активность по снижению уровня глюкозы в крови ш γί\Ό, однако эта активность несколько меньше по сравнению с активностью РОР21 дикого типа через 3 и 6 ч после инъекции, но усеченные составные белки РОР21, включающие аминокислотные остатки 9-181, не проявляют такой активности. Таким образом, анализ эффектов, производимых усеченными полипептидами РОР21 ш у|уо, показал, что делеция до 7 аминокислот с Ν-конца зрелого РОР21 не аннулирует биологическую активность молекулы (в отличие от анализа ш уйго, результаты которого позволяли предположить, что делеция 7 аминокислот с Ν-конца зрелого РОР21 аннулирует такую активность).
Различные результаты, полученные для отдельных полипептидов РОР21 с Ν-концевыми усечениями (например, РОР21 8-181) в анализах ш уйго и ш γί\Ό, можно объяснить взаимодействием РОР21 с βКлото и рецептором РОР при осуществлении сигнальной трансдукции. Более конкретно, РОР21 активирует двойной комплекс рецептора, включающий корецептор β-Клото и рецептор РОР (РОРК), который инициирует сигнальный каскад, включающий тирозинкиназу. Было показано, что Ν-конец РОР21 вовлечен в связывание и активацию РОРК, тогда как С-конец РОР21 необходим для взаимодействия с β-Клото (У1е е! а1., 2009, РЕВ§ ЬеК 583:19-24). Анализ на ЕЬК-люциферазу ш уйго был проведен с почечными клетками 293, в которых избыточно экспрессируется корецептор β-Клото, а РОРК экспрессируется на нормальном уровне. Количество РОРК по сравнению с количеством β-Клото относительно мало, следовательно, соотношение между β-Клото и РОРК в клетках 293 не является физиологическим, что может повлиять на формирование рецепторного комплекса, и, в конечном итоге, на связывание лиганда и активацию РОРК. Клеточная система 293 ш уйго, по-видимому, более уязвима к полипептидам РОР21 с Νконцевыми усечениями, следовательно, она могла давать потерю результатов при анализе активности нескольких протестированных мутантов с Ν-концевыми усечениями, в частности, РОР21 8-181. Таким образом, при определении того, сохраняет ли определенный мутант РОР21 с Ν-концевым усечением активность РОР21 дикого типа, активность этого мутанта РОР21 в анализе ш γί\Ό, рассматривалась как диспозитивная (допускающая выбор из нескольких вариантов). В соответствии с этим усеченные полипептиды РОР21, имеющие Ν-концевые усечения менее 8 аминокислотных остатков, охватываются изобретением.
Пример 6. Изготовление и экспрессия усеченных составных белков РОР21.
Поскольку период полувыведения белка можно увеличить, соединяя белок с последовательностью Рс, были изготовлены и проанализированы составные белки, включающие усеченные полипептиды РОР21. Усеченные составные белки РОР21, перечисленные в табл. 6, были изготовлены из амплифицированных последовательностей РОР21 посредством ПЦР типа 8ОЕ (сплайсинг генов с удлинением перекрывания). Составные белки РОР21 были изготовлены таким образом, что участок Рс гена иммуноглобулина человека 1дО1 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 11) был присоединен или к Ν-концу, или к С-концу белка РОР21.
- 31 021425
Таблица 6
Усеченные составные белки РОР21
Аминокислотные остатки Расположение Рс Линкер
С-концевые усечения
1 - 178 -νη2 15
1 - 175 -νη2 14
1 - 175 -СООН 15
1 - 171 -νη2 15
1 - 171 -СООН 15
1 - 170 -СООН 15
Ν-концевые усечения
5- 181 -νη2 15
5- 181 -СООН 15
7-181 -νη2 15
7- 181 -СООН 15
С- и Ν-концевые усечения
5 - 175 -νη2 15
5-175 -СООН 15
5-171 -νη2 15
5 - 171 -СООН 15
6- 170 -СООН 15
7-178 -СООН 35
7-175 -νη2 15
7- 175 -СООН 15
7- 174 -СООН 35
7- 172 -СООН 35
7- 171 -νη2 15
7-171 -СООН 35
7- 171 -СООН 15
В частности, конструкции составного белка РОР21 (включая конструкции, кодирующие усеченные составные белки РОР21) были изготовлены в серии из трех реакций амплификации с применением, по существу, тех же условий реакции, которые были описаны в примере 1. В первой реакции была сконструирована пара праймеров для выработки последовательности, содержащей сайт клонирования ΝάβΙ (включая Ν-концевой метионин для бактериальной экспрессии), участок Рс и линкерную последовательность. Во второй реакции была сконструирована пара праймеров для выработки последовательности, содержащей перекрывающуюся часть линкера, часть кодирующей последовательности РОР21 и сайт клонирования ЕсоК1. Наконец, в третьей реакции была сконструирована пара праймеров для сцепления продуктов двух первых реакций. Типичный набор праймеров для конструирования составного белка РсРОР21 1-181 приведен в табл. 7.
- 32 021425
Таблица 7
Праймеры ПЦР для изготовления типичной конструкции составного белка РОР21
Праймер П осл едовател ьность 8Е<2 Ιϋ ΝΟ:
Реакция 1
Смысловой 5’-АОСАОСААТААСАТАТССАСААААСТСАСАСАТС-3' 19
Антисмысловой 5'—ООАТССАССАССАССОСТАССАС-3’ 20
Реакция 2
Смысловой 5’-ООТООТООТООАТСССАТССААТТССАСАТТСТТСТССА-3 21
Антисмысловой 5’-ТАСТСАССТССААТТСТТАСОААОССТАОСТОО-3' 22
Реакция 3
Смысловой 5'-АССАССААТААСАТАТООАСААААСТСАСАСАТС-3' 19
Антисмысловой 5'-ТАСТСАССТССААТТСТТАССААСССТАССТОО-3' 22
Продукт последней реакции был расщеплен рестрикционными эндонуклеазами Ыйе1 и ЕсоК1, вшит в вектор рЕТ30, а затем введен в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой.
Пример 7. Активность усеченных составных белков РОР21 ίη νίνο.
Были созданы и проанализированы на активность ίη νίνο составные белки, включающие усеченную последовательность РОР21, соединенную с последовательностью Рс. Усеченные составные белки РОР21 были изготовлены посредством присоединения молекулы Рс 1дО1 или к П-концевому, или к Сконцевому участку усеченного белка РОР21 для образования целой непрерывной последовательности. Для различения между Ы-концевыми и С-концевыми слияниями составные белки РОР21, в которых молекула Рс была присоединена к П-концевому участку белка РОР21, будут обозначаться Рс-РОР21, а составные белки, в которых молекула Рс была присоединена к П-концевому участку белка РОР21, будут обозначаться РОР21-Рс.
Белок РОР21 обладает множеством видов биологической активности, включая способность понижать в крови уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина, уменьшать вес тела, а также улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии и чувствительность к инсулину. Для оценки активности РОР21 ίη νίνο полипептиды РОР21, мутантные полипептиды РОР21 и составные полипептиды РОР21 вводили инсулинорезистентным мышам οό/οό с последующим измерением способности определенного белка РОР21 понижать уровень глюкозы в крови. Тестируемый полипептид РОР21, мутантный полипептида РОР21 или составной полипептид РОР21 впрыскивали внутрибрюшинно 8-недельным мышам οό/οό (^аск8οη ^аЬο^аΐο^у) и после разовой инъекции брали у животных образцы крови в разных точках времени, например через 0, 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром Θ^ΤοπΛ (^^ίе8саη, 1пс. Милпитас, штат Калифорния), и результаты измерений выражали в виде процентного изменения уровня глюкозы по сравнению с начальным уровнем глюкозы в крови (т.е. в точке времени 0).
Результаты одного из экспериментов представлены на фиг. 4, которая отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у мышей, которым впрыскивали контрольный РВ8, контрольный Рс-РОР21 дикого типа с аминокислотными остатками 1-181 или усеченные составные белки РС-РОР21, включающие аминокислотные остатки 5-181 или 7-181. Этот эксперимент продемонстрировал, что усеченные составные белки Рс-РОР21, включающие аминокислотные остатки 5-181 или 7-181, проявляют такую активность по снижению глюкозы в крови, которая сходна с активностью Рс-РОР21 дикого типа через 6 ч после инъекции. Таким образом, анализ действия усеченных полипептидов РОР21 ίη νίνο показал, что делеция до 6 аминокислот с М-конца зрелого РОР21 не влияет на биологическую активность молекулы. Однако анализ ίη νίνο также показал, что способность усеченных полипептидов РОР21 понижать уровень глюкозы в крови снижалась, при этом содержание глюкозы в крови возвращалось к исходному уровню через 24 ч после инъекции (для РОР21 дикого типа были получены сходные результаты). Было обнаружено, что короткая активность ίη νίνο является результатом протеолитического разрушения РОР21, как это описано в примере 8.
Результаты другого эксперимента представлены на фиг. 5, которая отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у мышей, которым впрыскивали контрольный РВ8, контрольный РОР21-Рс дикого типа с аминокислотными остатками 1-181, усеченный составной белок РОР21-Рс, включающий аминокислотные остатки 1-175, или усеченный белок Рс-РОР21, включающий аминокислотные остатки 1-171. Этот эксперимент продемонстрировал, что РОР21-Рс дикого типа, включающий аминокислотные остатки 1-181, обладает длительной активностью по снижению глюкозы, приводящую к снижению уровня глюкозы в крови приблизительно на 30% в промежутке времени от 24 до 120 ч после инъекции. Усеченный белок Рс-РОР21, включающий аминокислотные остатки 1-171, проявляет замедленную активность по снижению глюкозы в крови, которая очевидно проявляется только через 72 ч после инъекции. Однако наблюдаемая активность почти не отличается от активности РОР21-Рс
- 33 021425 дикого типа. Усеченный составной белок РОР21-Рс, включающий аминокислотные остатки 1-175, неактивен ш νίνο в отношении снижения глюкозы в крови.
При совместном рассмотрении экспериментов с усечением, описанных в данном документе, было выявлено, что усеченные составные белки РОР21, имеющие ^концевое усечение, проявляют активность по снижению глюкозы в крови, которая сходна с составным белком РОР21 дикого типа, и далее, что усеченные составные белки РОР21, в которых молекула Рс была присоединена к ^концевому участку усеченного белка РОР21, более активны, чем составные белки, в которых молекула Рс была присоединена к С-концевому участку усеченного белка РОР21.
Пример 8. Наблюдаемое разрушение РОР21 ш νίνο.
Разрушение РОР21, прежде всего, наблюдалось при использовании конструкций для составного белка РОР21 Рс, как это описано в примере 7. Фармакокинетический анализ ш νίνο показал, что РОР21 человека имеет короткий период полувыведения у мышей, составляющий приблизительно 1 ч, что является следствием быстрого клиренса и разрушения ш νίνο. Следовательно, для удлинения периода полувыведения РОР21 к №или С-концевому участку полипептида РОР21 присоединяли последовательность Рс. Однако присоединение участка Рс не полностью разрешает проблему полувыведения, поскольку составные белки РОР21, к N или С-концам которых присоединена последовательность Рс, (и в особенности слияния Рс-РОР21, т.е. такие структуры, в которых последовательность Рс присоединена к №концу зрелого РОР21), не проявляют ожидаемой эффективности ш νίνο, а вместо этого, согласно имеющимся данным, сохраняют активность по снижению глюкозы в крови у мышей οό/οό не более 24 ч. Как показано на фиг. 4, составные белки Рс-РОР21 снижали уровень глюкозы в крови приблизительно на 30-40% через 6 ч после инъекции, но через 24 ч содержание глюкозы в крови возвращалось к исходному уровню.
Впоследствии изучали протеолитическое разрушение РОР21 дикого типа, при этом было обнаружено, что быстрая потеря активности составных белков Рс-РОР21 ш νίνο происходит в результате разрушения РОР21 ш νίνο. Протеолитическое разрушение приводит к снижению биологической активности молекулы ш νίνο, т.е. укорачивает эффективный период полувыведения, следовательно, такое разрушение отрицательно влияет на терапевтическое применение этой молекулы. В соответствии с этим наблюдаемое разрушение составных белков РОР21 Рс привело к изучению протеолитического разрушения РОР21 ш νίνο и к поиску таких мутантов РОР21, которые были бы устойчивы к подобному разрушению.
Для того чтобы определить сайты разрушения, были проведены анализ ЬС-М§ и секвенирование по Эдману на РОР21 дикого типа человека и составных белках РОР21, наблюдаемых в разных точках времени после инъекции самцам мышей С57В6. Секвенирование по Эдману помогало подтвердить, подвергался ли ^концевой участок или С-концевой участок белка разрушению. Было обнаружено, что при слиянии последовательности Рс с ^концом РОР21 человека разрушение в пептиде происходило между аминокислотными остатками 151 и 152 и между аминокислотными остатками 171 и 172 человеческой части составной молекулы РОР21 (приведенная выше нумерация остатков основана на зрелой последовательности РОР21 и не включает участок Рс составного белка). Было обнаружено, что в первую очередь происходит разрушение в сайте 171-172, вслед за которым происходит разрушение в сайте 151-152. Разрушение в сайте 171-172, по-видимому, является стадией, которая определяет скорость процесса, т.е. играет роль в темпах полувыведения молекулы. Кроме того, было обнаружено, что, если последовательность Рс была присоединена к С-концу РОР21, разрушение в пептиде происходило в связке между аминокислотными остатками 4 и 5 и между аминокислотными остатками 20 и 21. В результате этих экспериментов было определено, что последовательность Рс, по-видимому, защищает от разрушения ту часть последовательности РОР21, которая примыкает к Рс. Далее анализ разрушения РОР21 дикого типа и составных белков Рс-РОР21 ш νίνο был проведен на обезьянах суηοтο1ди5. Эти исследования подтвердили, что сайт расщепления РОР21 в аминокислотных остатках 171-172 является мажорным сайтом разрушения у обезьян, причем этот сайт разрушения законсервирован между мышиными и приматами.
Пример 9. Идентификация мутантов РОР21, устойчивых к протеолизу.
Подходящие мутанты РОР21 были идентифицированы посредством определения в экспериментах тех положений в последовательности РОР21 дикого типа, которые являются сайтами мажорной протеолитической активности, после чего в эти сайты были внесены специфические аминокислотные замещения. Аминокислотные замещения были основаны на консервации последовательности РОР21 с другими биологическими видами (как это описано в примере 8) и биохимической консервации с другими аминокислотными остатками. Перечень аминокислотных замещений, которые были введены или могут быть внесены в белок РОР21 дикого типа, представлен в табл. 8, хотя табл. 8 является только примером, т.е. вполне возможны и другие замещения. Номера положений, представленные в табл. 8, соответствуют положениям остатков в зрелом белке РОР21, который состоит из 181 аминокислотного остатка.
- 34 021425
Таблица 8
Мутированные аминокислотные остатки в Р0Р21
Пример 10. Анализ разрушения Рс-Р0Р21 и Р0Р21-Рс ΐη νίνο.
Стабильность составных белков Р0Р21 Рс ιη νίνο определяли посредством впрыскивания мышам составного белка, взятия у этих мышей проб крови в разных точках времени и анализа сыворотки методом жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (БС-М8). Более конкретно, мышам внутрибрюшинно впрыскивали 10 мг/кг Рс-(05)-Р0Р21 (8ЕР ГО N0: 107) (экспрессированного в Е.соН и очищенного, как описано в примере 2) или Р0Р21-(03)-Рс (8ЕР ГО N0: 105) (экспрессированного в клетках млекопитающего и очищенного в соответствии со стандартными процедурами). Образцы крови от мышей получали через 6, 24 и 48 ч после инъекции (табл. 9) и собирали в пробирки с ЕЭТА, предварительно обработанные коктейлями с ингибиторами протеаз (КосЬе 1)1ацпоЫ1сО. Плазму выделяли центрифугированием образцов на скорости 12()()()хц в течение 10 мин. Белки Р0Р21 аффинно очищали от крови с использованием агарозной смолы против Рс человека.
Таблица 9
Образцы Р0Р21
Образец Введенный белок Взятие крови
Э6 Рс-(О5)-РОР21 6 часов
ϋ24 Рс-(О5)-РОР21 24 часа
Э48 Рс-(О5)-РОР21 48 часов
Еб РОР21-(ОЗ)-Рс 6 часов
Е24 РОР21-(ОЗ)-Рс 24 часа
Е48 РОР21-(ОЗ)-Рс 48 часов
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом БС-М8 в качестве эталона анализировали стандарты белков Рс-(05)-Р0Р21 и Р0Р21-(03)-Рс. Белковые стандарты либо были редуцированы трис[2-карбоксиэтил]фосфином (ТСЕР), либо не были редуцированы. Редуцированные и не редуцированные стандарты анализировали методом БС-М8, используя колонку АСЕ циано 0,3 ммх30 см с распылением элюата в масс-спектрометрическую ионную ловушку ЬСР С1азз1с. Поскольку развернутые спектры редуцированных образцов были чище, перед анализом 1.С-М8 аффинно очищенные образцы были редуцированы.
Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Рс-(05)-Р0Р21 и образцов Ό6, Ό24 и Ό48 показаны на фиг. 6А-6Э. Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Р0Р21-(03)-Рс и образцов Е6, Е24 и Е48 показаны на фиг. 7Ά-7Ι). Некоторые элюаты стандартов и образцов были подвергнуты секвенированию по Эдману для подтверждения Х-конца белков и фрагментов в соответствии с определением в анализе 1.С-М8. Результаты анализа стандартов и образцов методом 1.С-М8 показаны в табл. 10.
- 35 021425
Таблица 10
Результаты анализа ЬС-Μδ и предсказанные фрагменты
Образец РСР21 Основные наблюдаемые массы Фрагмент Интактный Ν- конец?
Стандарт Рс-(05)- РОР21 45,339 Оа 1-414 Да
Ό6 45,338 Оа 44,317 Оа 1-414 1-404 Да
Ό24 44,321 Оа 1-404 Да
Ό48 44,327 Оа 42,356 Оа 1-404 ? Да
Стандарт РОР21-(ОЗ)-Рс 46,408 Оа (гликозилированный, СОР) 44,964 Оа (не гликозилированный) 1-410 1-410 Да
Еб 45,963 Оа (гликозилированный, СОР) 44,516 Оа (не гликозилированный) 5-410 5-410 Нет
Е24 45,963 Оа (гликозилированный, СОР) 44,526 Оа (не гликозилированный) 44,130 Оа (гликозилированный, СОР) 5-410 5-410 21-410 Нет
Е48 45,984 Оа 44,130 Оа 44,022 Оа 5-410? 21-410 ? Нет
Как показано в табл. 10, все аффинно очищенные образцы демонстрировали некоторую степень разрушения только через 6 ч циркуляции. После 24-часовой циркуляции основной продукт Рс-(О5)РОР21 представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 1-404, что наблюдалось как в образцах О, так и в образцах Е. Однако в образцах Е основной продукт РОР21-(О3)-Рс представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 5-410. В обоих протестированных составных белках РОР21-часть составного белка была более чувствительна к разрушению, чем Рс-часть белка.
Пример 11. Изготовление и экспрессия мутантов и составных белков РОР21, устойчивых к протеолизу.
Конструкции, кодирующие мутанты РОР21, перечисленные в табл. 11, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии РОР21 дикого типа, как описано ниже (конструкция вектора экспрессии РОР21 дикого типа описана в примере 1). При включении в конструкт линкера использовали линкер ΟΟΟΟΟδΟΟΟδΟΟΟΟδ (Ь15, δΕΟ !□ N0: 28). Цель этих экспериментов заключалась в создании мутантов РОР21, которые устойчивы к протеолизу и проявляют удлиненный период полувыведения.
- 36 021425
Таблица 11
Мутанты РОР21, устойчивые к протеолизу
- 37 021425
Ι152Η -νη2 Ы5
1152Ь
1152Ь -νη2 Ы5
1152У
О170А
О170А -νη2 Ы5
О170С
О ПОС -νη2 Ы5
О170Э
Ο170ϋ -νη2 Ы5
О170Е
О170Е -νη2 Ь15
Ο170Ν
Ο170Ν -νη2 Ь15
ОПОР
ОПОР -νη2 Ь15
01709
0170() -νη2 Ь15
01708
01708 -νη2 Ь15
ΟΠΟΕ,ΡΠΙΑ
ΟΠΟΕ,ΡΠΙΑ -νη2 Ь15
ОПОЕ, 3172Ь
О170Е,3172Ь -νη2 Ь15
О170Е, Р171А, 3172Ь
ΟΠΟΕ,ΡΠΙΑ, 3172Ь -νη2 Ь15
Ρ171Α
Ρ171Α -νη2 Ь15
Р171С -νη2 Ь15
Р17Ю -νη2 Ь15
Ρ171Ε -νη2 Ь15
Ρ171Ο -νη2 Ь15
Ρ171Η -νη2 П5
Ρ171Κ -νη2 Ь15
Ρ171Ν -νη2 Ь15
Р171С2 -νη2 Ь15
Р1718 -νη2 Ь15
Ρ171Τ -νη2 Ь15
Ρ171Ψ -νη2 Ь15
Ρ171Υ -νη2 Ь15
Ρ171Α, 3172Ь
Ρ171Α, 3172Ь -νη2 Ь15
3172Ь -νη2 Ь15
3172Т
5172Т -νη2 Ы5
()173Е
()173Е -νη2 Ь15
()173К
()173К. -νη2 Е15
Мутантные конструкции РОР21 были изготовлены с применением праймеров, имеющих последовательности, которые гомологичны участкам, расположенным выше и ниже кодона (или кодонов), подлежащего мутированию. Праймеры, использованные в таких реакциях амплификации, также обеспечивали приблизительно 15 нуклеотидов перекрывающейся последовательности, что позволяло рециркуляризи- 38 021425 ровать амплифицированный продукт, а именно весь вектор, теперь содержащий нужный мутант.
Типичная мутантная конструкция РОР21, кодирующая мутант РОР21, имеющий остаток глутаминовой кислоты в положении 170 вместо нативного остатка глицина (т.е. мутант О170Е), была изготовлена с применением праймеров, показанных в табл. 12.
Таблица 12
Праймеры ПЦР для изготовления типичного мутанта РОР21
Праймеры, показанные в табл. 12, рассчитаны на замещение остатка глицина остатком глутаминовой кислоты, как показано ниже, при этом первая последовательность представляет собой смысловой праймер (ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 23), вторая и третья последовательности (ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 25 и ЗЕО ГО ΝΟ: 27) являются частями конструкции, экспрессирующей РОР21, а четвертая последовательность является антисмысловым праймером (ЗЕР ГО ΝΟ: 26):
51-АтсстесААСсттсссАеоесссАлес
СТССТСОСАСССТСТСАССАТаСТеевАССТТСССАСОеССОААСССССА
САССАОССТСССАСЗАСТССТАССАСССТССААССОТССССССТТСССОСТ
АСССТСССАОАСТССТАССАССТТеСААСС-3'
Конструкции мутанта РОР21 были изготовлены с применением, по существу, тех же условий ПЦР, что описаны в примере 1. Продукты амплификации были подвергнуты расщеплению рестрикционной эндонуклеазой Όρη1, а затем введены в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой. Составные белки Рс-(Ь15)-РОР21 и РОР21-(Ь15)-Рс были созданы в соответствии с описанием, приведенным в данном документе, например, в примере 6.
Мутанты РОР21 были экспрессированы посредством трансформации компетентных клеток ВЕ21 (ИЕ3) или ВЬ21 З1аг (ΙηνίΙτοο,οη, Карлсбад, штат Калифорния) конструкцией, кодирующей специфический мутант. Трансформанты выращивали в течение ночи с ограниченной аэрацией в среде ТВ с добавлением 40 мкг/мл канамицина, аэрировали на следующее утро и после короткого периода восстановления индуцировали в 0,4 мМ ΙΡΤΘ. Мутантные полипептиды РОР21 собирали центрифугированием через 18-20 ч после индукции.
Мутанты РОР21 также анализировали на предсказанную иммуногенность. Иммунные реакции против белков усиливаются за счет процессинга антигена и его презентации в сайте связывания главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II. Это взаимодействие необходимо для помощи Т-клеток в созревании антител, распознающих белок. После того как были охарактеризованы сайты связывания молекул МНС класса ΙΙ, стало возможным предсказание того, имеют ли белки специфические последовательности, которые способны связываться с серией распространенных аллелей человека. На основе литературных ссылок и структур кристаллов МНС класса ΙΙ были созданы компьютерные алгоритмы, позволяющие определить, имеет ли линейная аминокислотная последовательность пептида потенциал для разрушения иммунотолерантности. Компьютерная программа ТЕР1ТОРЕ была использована для определения того, могут ли точковые мутации в конкретных мутантах РОР21 увеличить количество специфических Т-клеток у большинства людей. Основываясь на результатах анализа линейной белковой последовательности каждого мутанта РОР21, нельзя было предсказать усиление иммуногенности для какоголибо мутанта.
Пример 12. Влияние линкерной последовательности на разрушение РОР21.
Для того чтобы определить, влияет ли присутствие удлиненного аминокислотного линкера между последовательностью Рс и последовательностью РОР21 на разрушение РОР21, мышам впрыскивали составные белки РОР21, в которых участок Рс был выделен от последовательности РОР21 линкером из 15 аминокислот, имеющим последовательность ОООООЗОООЗООООЗ (обозначенную как Ь15, ЗЕО ГО ΝΟ: 28), после чего у мышей брали кровь в разных точках времени и проводили анализ сыворотки методом ЬС-МЗ. В частности, мышам впрыскивали Рс-(Ь15)-РОР21 или РОР21-(Ь15)-Рс (полученные из Ε^οΐϊ) в дозе 23 мг/кг, образцы крови брали через 6, 24 и 48 ч, а взятую кровь аффинно очищали, используя агарозную смолу против Рс человека.
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом ЬС-МЗ в качестве эталона анализировали стандарты белков Р, Рс-(Ь15)-РОР21 и РОР21-(Ь15)-Рс. Стандарты белков либо были редуцированы ТСЕР, либо не были редуцированы. Как редуцированные, так и не редуцированные стандарты анализировали методом ЬС-МЗ, используя колонку АСЕ циано 0,3 ммх30 см с распылением элюата в массспектрометрическую ионную ловушку ЬСР С1а551с. Поскольку развернутые спектры редуцированных образцов были чище, перед анализом ЕС-МЗ аффинно очищенные образцы были редуцированы.
Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Ес-(Е15)-ЕОЕ21 и соответствующих аффинно
- 39 021425 очищенных образцов, взятых в разных точках времени, показаны на фиг. 8Α-8Ό. Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Рс-(Ь15)-РСР21 и соответствующих аффинно очищенных образцов, взятых в разных точках времени, показаны на фиг. 9А-9И. Некоторые элюаты стандартов и образцов были подвергнуты секвенированию по Эдману для подтверждения Ν-конца белков и помощи в предсказании идентичности фрагментов, наблюдаемых посредством БС-М8. Результаты анализа стандартов и образцов методом БС-М8, а также индикация предсказанных фрагментов показаны в табл. 13.
Таблица 13
Результаты анализа ЕС-М8 и предсказанные фрагменты
Образец Р(1Р21 Основные наблюдаемые массы Процентная доля от общей величины Фрагмент Интактный Ν- конец?
Рс-(Ы5)-РОР21 Стандарт 46002 Оа 100% 1-424 Да
Рс-(Ы5)-РОР21 46000 Оа 65% 1-424 Да
6 часов 44978 Оа 35% 1-414
Рс-(Ы5)-РОР21 44978 Оа 85% 1-414 Да
24 часа 43022 Оа 15% 1-394
Рс-(Ь15)-РОР21 44976 Оа 60% 1-414 Да
48 часов 43019 0а 40% 1-394
РОР21-(Ь15)-Рс Стандарт 45999 Оа 100% 1-424 Да
45870 Оа 100% 1 -423 Да
Рс-(Ы5)-РОР21 6 часов
Рс-(Ы5)-РОР21 45869 Оа 40% 1 -423 Несколько
24 часов 45301Оа 35% 6-423
43460 Оа 25% 22-423
45870 Оа 15% 1 -423 Несколько
Рс-(Ы5)-РОР21 45297 Оа 20% 6-423
48 часов 43461Оа 65% 22-423
Как показано в табл. 13, все аффинно очищенные образцы демонстрировали некоторую степень разрушения только через 6 ч циркуляции. После 24 ч циркуляции основными продуктами Рс-(Ь15)РСР21 были фрагменты, состоящие из аминокислотных остатков 1-414 (85% образца) и 1-394 (15% образца), а основными продуктами РСР21(15)Рс были фрагменты, состоящие из аминокислотных остатков 1-423 (40% образца), 6-423 (35% образца) и 22-423 (25% образца). Идентифицированные точки расщепления для белков Рс-(Ь15)-РСР21 и Рс-(Ь15)-РСР21 показаны на фиг. 10А и 10В соответственно.
Пример 13. Активность устойчивых к протеолизу мутантов Рс-(Ь15)-РСР21 т νί\Ό через 1-7 дней после инъекции.
Как описано в данном документе, протеолитическое расщепление составных белков РСР21 Рс зависит от ориентации последовательности Рс, при этом окончание Рс составного белка более стабильно, чем окончание РСР21 составного белка (т.е. было обнаружено, что Ν-концевая часть составных белков Рс(Ь15)-РСР21 и С-концевая часть составных белков Рс-(Ь15)-РСР21 более стабильны). Например, расщепление было идентифицировано в положениях 5 и 21 белка Рс-(Ь15)-РСР21 и в положениях 151 и 171 белка Рс-(Ь15)-РСР21.
В результате этих наблюдений было проведено исследование по идентификации мутантов РСР21, устойчивых к протеолизу. Анализ белков Рс-(Ь15)-РСР21 методом БС-М8 показывает, что протеолитическое разрушение т νί\Ό в первую очередь происходит между аминокислотными остатками 171-172 с последующим разрушением между аминокислотными остатками 151-152. Блокируя протеолитическое разрушение в положении 171, можно предотвратить разрушение в положении 151, что эффективно увеличивает период полувыведения молекулы. Однако устойчивые к протеолизу мутанты, у которых расщепление в положении 151 предотвращено, по-прежнему, могут обладать в положении 171 остатками, чувствительными к атаке протеазы, что приводит к потере молекулой 10 последних аминокислот, которые, как известно, вовлечены в связывание корецептора β-Клото, являющегося детерминантом аффинности рецептора к лиганду и мощности т νΐΐΐΌ и т у1уо. Следовательно, мутационные изменения аминокислотных остатков, окружающих положение 171 в зрелом РСР21, по-видимому, более важны для улуч- 40 021425 шения стабильности ίη У1уо, мощности и эффективности молекулы.
Активность отдельных мутантов Рс-(Ь15)-РОР21, устойчивых к протеолизу ίη У1уо, оценивали, впрыскивая внутрибрюшинно мутант РОР21 мышам оЬ/оЬ, затем у мышей брали образцы крови через 0, 0,25, 1, 3, 5 и 7 дней после инъекции и измеряли в образцах уровень глюкозы. Результаты одного из экспериментов показаны на фиг. 11, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВЗ, контрольного Рс-(Ь15)-РОР21 (ЗЕО ГО ЫО: 49) или таких мутантов Рс-(Ь15)-РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 О170Е (ЗЕО ГО ЫО: 51), Рс(15)РОР21 Р171А (ЗЕО ГО ЫО: 53), Рс(Ь15)-РОР21 З172Ь (ЗЕО ГО ЫО: 55), Рс-(Ь15)-РОР21 (О170Е, Р171А, З172Ь) (ЗЕО ГО ЫО: 59) или Рс(Ь15)-РОР21 О151А (ЗЕО ГО ЫО: 61). Фиг. 12 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Этот эксперимент демонстрирует, что мутанты Рс-(Ь15)-РОР21 О170Е, Рс-(Ь15)-РОР21 Р171А, Рс-(Ь15)-РОР21 З172Ь и Рс-(Ь15)-РОР21 (О170Е, Р171А, З172Ь) проявляют длительную активность по снижению уровня глюкозы в крови (до 5 дней), которая превосходит активность Рс-РОР21 дикого типа. Мутант Рс-(Ь15)-РОР21 О151А лишь немного улучшал длительность активности по снижению уровня глюкозы в крови по сравнению с составным белком Рс-(Ь15)-РОР21 дикого типа. Неожиданно было обнаружено, что, хотя мутант Рс-(Ь15)-РОР21 З172Ь неустойчив к протеолизу и, следовательно, имеет сходный профиль разрушения с полипептидом Рс-(Ь15)-РОР21 дикого типа, этот мутант демонстрирует улучшенную эффективность ίη У1уо по сравнению с полипептидом Рс(Ь15)-РОР21 дикого типа.
Результаты другого эксперимента представлены на фиг. 13, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВЗ, контрольного Рс-(Ь15)-РОР21 или таких мутантов Рс-(Ь15)-РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 (Р150А, О151А, 1152У) (ЗЕО ГО ЫО: 65), Рс-(Ь15)-РОР21 О170Е (ЗЕО ГО ЫО: 51), Рс-(Ь15)-РОР21 (О170Е, Р171А) (ЗЕО ГО ЫО: 63) или Рс-(Ь15)-РОР21 (О170Е, З172Ь) (ЗЕО ГО ЫО: 67). Фиг. 14 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Как и в эксперименте, описанном выше, составной белок Рс-РОР21 дикого типа и мутант Рс-(Ь15)-РОР21 (Р150А, О151А, 1152У) не проявляли длительной активности по снижению уровня глюкозы в крови, возможно, вследствие того, что все еще могло происходить разрушение в сайте 171, а уровень глюкозы в крови животных, которым впрыскивали эти белки, возвращался к исходному не более чем через 24 ч после инъекции. Однако мутанты Рс-(Ь15)-РОР21 О170Е, Рс-(Ь15)-РОР21 (О170Е, Р171А) и Рс-(Ь15)-РОР21 (О170Е, З172Ь) проявляли максимальную активность по снижению уровня глюкозы в крови до 5 дней после инъекции, что превосходит эффекты составного белка Рс-РОР21 дикого типа и мутанта Рс-(Ь15)-РОР21 (Р150А, О151А, 1152У).
Результаты еще одного эксперимента показаны на фиг. 15, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВЗ, или таких мутантов Рс-(Ь15)-РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 О170Е (ЗЕО ГО ЫО: 51), Рс-(Ь15)-РОР21 О170А (ЗЕО ГО ЫО: 69), Рс-(Ь15)-РОР21 О170С (ЗЕО ГО ЫО: 71), Рс-(Ь15)-РОР21 Ο170Ό (ЗЕО ГО ЫО: 73), Рс-(Ь15)-РОР21 О170Ы (ЗЕО ГО ЫО: 75) или Рс-(Ь15)-РОР21 О170З (ЗЕО ГО ЫО: 77). Фиг. 16 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Все мутанты РОР21, протестированные в этом эксперименту, проявляли длительную активность по снижению уровня глюкозы в крови (до 5 дней после инъекции).
Результаты еще одного эксперимента показаны на фиг. 17, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВЗ или таких мутантов Рс-(Ь15)-РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 О170Е (ЗЕО ГО ЫО: 51), Рс-(Ь15)-РОР21 Р171Е (ЗЕО ГО ЫО: 79), Рс-(Ь15)-РОР21 Р171Н (ЗЕО ГО ЫО: 81), Рс-(Ь15)-РОР21 Р171р (ЗЕО ГО ЫО: 83), Рс-(Ь15)-РОР21 Р171Т (ЗЕО ГО ЫО: 85) или Рс-(Ь15)-РОР21 Р171У (ЗЕО ГО ЫО: 87). Фиг. 18 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Все мутанты РОР21, протестированные в этом эксперименте, демонстрировали улучшенную активность по снижению уровня глюкозы в крови при сопоставлении с Рс-РОР21 дикого типа.
Пример 14. Разрушение устойчивых к протеолизу мутантов Рс-(Ь15)-РОР21 ίη У1уо через 6-120 дней после инъекции.
Стабильность отобранных мутантов РОР21 ίη У1уо анализировали, впрыскивая мышам мутант РОР21, после чего у мышей брали образцы крови в разных точках времени и проводили анализ сыворотки методом ЬС-МЗ. Более конкретно, мышам впрыскивали либо мутанты Рс-(Ь15)-РОР21 О170Е, Рс(Ь15)-РОР21 Р171А, либо мутант Рс-(Ь15)-РОР21 З172Ь (полученные из Е.соП, как это описано в примере 2), причем каждый мутант перед инъекцией разбавляли приблизительно в 180 мкл 10 мМ НС1, а образцы крови брали через 6, 24, 48, 72 и 120 ч. Белки РОР21 аффинно очищали от крови, используя колонку с агарозной смолой против Рс человека. Образцы элюировали из колонки, используя 10 мМ НС1. Все конструкции РОР21 включали участок Рс и линкер из 15 аминокислот в аминоконцевой области белка РОР21. Мышам также впрыскивали контрольный РОР21 дикого типа.
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом ЬС-МЗ в качестве эталона анализировали необработанный РОР21 дикого типа и необработанные мутанты РОР21. Все стандарты и образцы по точкам времени были редуцированы ТСЕР, а затем проанализированы методом ЬС-МЗ с применением колонки АСЕ циано 0,3 ммх30 см и последующим распылением элюата в масс-спектрометрическую
- 41 021425 ионную ловушку ^С^ С1а§81с. Аффинно очищенные образцы были разбавлены ацетатом аммония, редуцированы ТСЕР, а затем проанализированы методом ЬС-М8, как описано выше.
Наблюдаемые массы Рс-(Е15)-РОР21 дикого типа через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 19Α-19Ώ соответственно. Наблюдаемые массы Рс-(Е15)-РОР21 О170Е через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 20Α-20Ώ соответственно. Наблюдаемые массы Рс-(Е15)-РОР21 Р171А через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 21А-2Ш соответственно. Наблюдаемые массы Рс-(Ь15)РОР21 8172Ь через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 22Α-22Ώ соответственно.
Было обнаружено, что все образцы, взятые через 72 и 120 ч, содержат компонент фибриногена высокого молекулярного веса (>200 кДа по результатам нередуцирующего анализа электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), который представлен намного обильнее, чем остальной составной белок Рс-(Е15)-РОР21. Результаты анализа ЬС-М8 для других стандартов и образцов представлены в табл. 14.
Таблица 14
Результаты анализа ЬС-М8 и предсказанные фрагменты
Образец РСГ21 Основные наблюдаемые массы Процентная доля от общей величины Фрагмент Эдман
Стандарт Рс- (Ь15)-РОР21 45994 Оа 100% 1-424
Рс-(Ы5)-РОР21 46001 Оа 80% 1-424 Нет
АУТ 6 часов 44987 Оа 20% 1-414
Рс-(Ы5)-РОР21 \УТ 24 часа 44979 Оа -100% 1-414 Нет
Рс-(Ь15)-РОР21 \УТ 48 часов 44980 Оа -100% 1-414
Стандарт Рс- (Ы5)-РОР21 О170Е 46068 Оа 100% 1-424
- 42 021425
Рс-(Ы5)-РОР21 О170Е 6 часов 46078 Эа 100% 1-424 Нет
Рс-(Ы5)-РОР21 46074 Оа 80% 1-424 Нет
О170Е 24 часа 45761 Ба 20% 1-421
Рс-(Ы5)-РСР21 46072 Оа -60% 1-424 Нет
О170Е 48 часов 45760 Оа -40% 1-421
Стандарт Рс- (Ь15)-РСР21 Р171А 45970 Эа 100% 1-424
Рс-(Ы5)-РОР21 Р171А 6 часов 45980 Оа 100% 1-424 Нет
Рс-(Ы5)-РОР21 45973 Оа -70% 1-424 Нет
Р171А 24 часа 45657 0а -30% 1-421
Рс-(Ь15)-РОР21 45992 Оа -50% 1-424 Нет
Р171А 48 часов 45673 Оа -50% 1-421
Стандарт Рс- (Ы5)-РСР21 5172Ь 46022 Оа 100% 1-424
Рс-(Ь15)-РОР21 5172Ь 6 часов 46027 Оа 100% 1-424 Нет
Рс-(Ь15)-РОР21 8172Ь 24 часа 44984 Оа 100% 1-414 Нет
Рс-(Ы5)-РОР21 5172Ь 48 часов 44985 Оа 100% 1-414 Нет
Как показано в табл. 14, разрушение Рс-(Ь15)-РОР21 дикого типа и мутанта 8172Ь выглядят сходно в том отношении, что после 24 ч циркуляции основной продукт составного белка представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 1-414. Продукты разрушения мутантов Рс-(Ь15)РОР21 О170Е и Рс-(Ь15)-РОР21 Р171А также выглядят сходно в том отношении, что образцы, взятые через 24 ч циркуляции, содержат 70-80% интактного белка (аминокислоты 1-424) и 20-30% фрагмента, состоящего из аминокислотных остатков 1-421. Даже спустя 48 ч мутанты Рс-(Ь15)-РОР21 О170Е и Рс(Ь15)-РОР21 Р171А все еще сохраняли интактный белок, но в то же время демонстрировали увеличение количества фрагментов, состоящих из аминокислотных остатков 1-421. Как наблюдалось в предыдущих анализах конструкций Рс-РОР21, выявлялось разрушение компонента РОР21 составного белка, а компонент Рс оставался стабильным. Сайты расщепления, идентифицированные для белка дикого типа, Рс(Ы5)-РОР21 О170Е, Рс-(Ь15)-РОР21 Р171А и Рс-(Ь15)-РОР21 8172Ь, показаны на фиг. 23А-23П соответственно.
Пример 15. Идентификация мутантов РОР21 с пониженной агрегацией.
Одним из свойств РОР21 дикого типа является склонность к агрегации. Ввиду данного свойства, было желательным получить понижающие агрегацию мутанты РОР21. Мутанты РОР21 с пониженной агрегацией были выявлены на основе двух гипотез. Первая гипотеза заключается в том, что применительно к РОР21 агрегацию (или димеризацию) запускают гидрофобные взаимодействия и вандерваальсовы взаимодействия между молекулами РОР21, вызванные гидрофобными остатками, которые подвергаются воздействию гидрофильной водоосновной среды растворителя. Вторая гипотеза заключается в том, что эти открытые гидрофобные остатки могут быть замещены для создания точечных мутаций в аминокислотной последовательности РОР21 без нарушения активности РОР21.
Для идентификации открытых гидрофобных остатков в РОР21 был использован системный рациональный подход белковой инженерии. Поскольку не были известны рентгеновские или ЯМР-структуры РОР21, которые можно было бы использовать для идентификации открытых гидрофобных остатков, для создания трехмерной модели гомологии РОР21 с применением компьютерной программы моделирова- 43 021425 ния МОЕ (молекулярная операционная среда, СЬетюа1 Сотрийид Огоир, Монреаль, Квебек, Канада) была использована рентгенокристаллическая структура РОР19 (ГР^А) высокого разрешения (1,3 А), полученная из банка данных по белкам (РОВ). В качестве матричного шаблона был выбран РОР 19, поскольку среди белков, депонированных в РОВ, именно РОР 19 является белком, наиболее родственным РОР21 по гомологии аминокислотной последовательности.
Доступность для растворителя была рассчитана следующим способом с применением программы МОЕ. Первое измерение площади поверхности (ЗА1) было определено как доступная площадь поверхности остатков в А2. Наряду с тем, что определенный аминокислотный остаток появляется в первичной последовательности белка много раз, каждое появление остатка может иметь разную площадь поверхности вследствие различий, среди всего прочего, в близости остатка к поверхности белка, в ориентации боковой цепи остатка и в пространственном расположении прилегающих аминокислотных остатков. Следовательно, проводят второе измерение площади поверхности (ЗА2), в котором представляющий интерес остаток извлечен из структуры белка наряду с его окружением, т.е. прилегающими остатками. Эти пространственно прилегающие остатки виртуально мутировали в глицины, чтобы удалить их боковые цепи, а затем вычисляли ЗА2 для представляющего интерес остатка, получая размер общей площади поверхности для этого остатка в его специфической конформации. Затем, вычисляя отношение ЗА1 к ЗА2 (ЗА1/ЗА2), можно получить процентный показатель возможной площади поверхности для того остатка, который фактически открыт.
Для дальнейшего анализа были отобраны несколько гидрофобных остатков, которые в значительной степени открыты для растворителя, и в этих остатках осуществлены виртуальные мутации с их замещением другими встречающимися в природе аминокислотными остатками. Изменения термостабильности белка, происходящие в результате различных замещений, были рассчитаны на модели Р0Р21 с применением интерактивной сетевой версии программы СИРЗАТ (Со1одие Итуегейу Рго1ет ЗйЬПйу Аиа1у818 Тоо15 [Инструменты кельнского университета для анализа стабильности белков]) в соответствии с инструкциями, представленными на веб-сайте СИРЗАТ. См. РаЧЫЬан е1 а1., 2006, ИисИю АсИ5 Ке5. 34: ХУ239-42; РаЧЫЬан е1 а1., 2007, ВМС З1гис1. Вю1. 7:54. При конструировании точечных мутаций РОР21 мутантов для снижения агрегации были исключены значительно дестабилизирующие или гидрофобные мутации. В качестве кандидатов на роль мутантов Р0Р21 с пониженной агрегацией рассматривались стабилизирующие (или, в редких случаях, немного дестабилизирующие) замещения, которые приводят к улучшению гидрофильных и/или ионных характеристик.
Сводка данных, полученных через этот рациональный подход белковой инженерии, представлена в табл. 15, где также перечислены типичные мутанты Р0Р21 с ожидаемой пониженной склонностью к белковой агрегации и улучшенной стабильностью.
- 44 021425
Таблица 15
Расчетное влияние мутантов РОР21 на стабильность
- 45 021425
К Е 2,88 1,48
98 Ь Т Ω к с Е К. 0,49 0,17 -0,19 3,08 0,84 3,4
99 ь С Е ϋ К 7,34 2,0 1,01 1,61
111 А Т К 0,47 -0,12
129 А Ω к N Е ϋ К Н 3,93 1,02 3,76 3,01 3,76 1,68 2,9
134 А К Υ Е К. Н 5,37 4,32 5,13 6,18 2,86
Пример 16. Изготовление и экспрессия мутантов и составных белков РОР21 с пониженной агрегацией.
Конструкции, кодирующие мутанты РОР21, которые перечислены в табл. 16, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии РОР21 дикого типа, как описано в примере 11 (конструкция вектора экспрессии РОР21 дикого типа описана в примере 1). Составные белки были изготовлены, как описано в данном документе, в частности, в примере 6. При применении линкера им был ООООО8ООО8ОООО8 (Е15, 8И) ΙΌ Ν0: 28).
- 46 021425
Таблица 16
Мутанты РОР21 с пониженной агрегацией
Мутация (мутации) Рс Линкер
А26Е
А26К
А26К.
А45Е
А45К
А45К -νη2 Ь15
А45К -νη2 Ы5
А45(} -νη2 Ь15
А45Т -νη2 Ь15
А45К, Ь98К -νη2 Ь15
52Т
Ь58С
Ь58Е
Ь58О
Ь588
Р60А
Р60Е
Р60К
Р60К
Р78А
Р78С
Р78Н
Р78К.
Ь86С
- 47 021425
Агрегацию разных белков РОР21, включая РОР21 дикого типа, усеченные полипептиды РОР21, мутанты РОР21 и составные белки РОР21, оценивали посредством эксклюзионной хроматографии (δΕ^. Анализируемые образцы инкубировали при 4°С, комнатной температуре или 37°С в течение различных периодов времени, а затем подвергали анализу методом δΕΟ Эксперименты проводили в системе ВЭЖХ Весктап, оснащенной колонкой δΕΟ Для РОР21 дикого типа использовали колонку Τ0δ0НААδ ΤδΚΟеI 02000 δΕС с 2xΡΒδ, содержащую 2% изопропиловый спирт в мобильной фазе. Для составных белков РОР21 Рс и мутантных полипептидов РОР21 использовали колонку Τ0δ0нААδ ΤδΚ-ΟеI 03000 δΕС с 2xΡΒδ в мобильной фазе.
Пример 17. Активность ίη νΐΐΓο мутантов РОР21 с пониженной агрегацией.
Были проведены эксперименты по идентификации мутантов с пониженной агрегацией, которые сохраняют активность РОР21 дикого типа в анализе на ΕΡΚ-люциферазу ίη νΐΐΓο. Анализы на РРКлюциферазу проводили таким образом, как описано в примере 4. На фиг. 24А-24С показаны результаты анализа на активность ΕΡΚ-люциферазы, проведенного на таких мутантах РОР21, как РОР21 Ь99К (δΕ^ ΙΌ N0: 109), РОР21 Ρ99Ό (δΕ^ ΙΌ N0: 111) и РОР21 А111Т (δΕ^ ΙΌ N0: 113) (фиг. 24А), на таких мутантах РОР21, как РОР21 А129В (δΕ^ ΙΌ N0: 115), РОР21 А129^ (δΕ^ ΙΌ N0: 117) и РОР21 А134К (δΕ^ ΙΌ N0: 119) (фиг. 24В), и на таких мутантах РОР21, как РОР21 А134У (δΕ^ ΙΌ N0: 121), РОР21 А134Е (δΕ^ ΙΌ N0: 123) и РОР21 А129К (δΕ^ ΙΌ N0: 125) (фиг. 24С). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что некоторые из мутантов с пониженной агрегацией не проявляют отрицательного влияния на активность РОР21 по результатам анализов на Ε^Κ-люциферазу.
Пример 18. Изготовление и экспрессия комбинированных мутантов Р-(Ь15)-РОР21, демонстрирующих удлиненное полувыведение и пониженную агрегацию.
Были изготовлены и конъюгированы с молекулами Рс Ι§01 (δΕΟ ΙΌ N0: 11) многие комбинированные мутанты Р0Р21, демонстрирующие пониженную агрегацию и удлиненный период полувыведения за счет подрыва протеолитического разрушения. Эти мутанты РОР21 были изготовлены, по существу, как это описано в примере 11.
- 48 021425
Пример 19. Исследования ΐη νίίΓο по изучению мутантов Рс-(Ь15)-Р0Р21, демонстрирующих удлиненное полувыведение и пониженную агрегацию.
Были проведены эксперименты по идентификации комбинированных мутантов Р0Р21, которые сохраняют активность Р0Р21 дикого типа в анализе на ЕЬК-люциферазу ΐη νίίΓο. Анализ на ЕЬКлюциферазу проводили таким образом, как описано в примере 4.
На фиг. 25А-25И показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на таких мутантах Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р1710, Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р1718 и Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Т (фиг. 25А), на таких мутантах Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171У, Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р17Ш и Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171С (фиг. 25В), на таких мутантах Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Рс-(Ь15)-Р0Р21 А45К/0170Е и Р0Р21 А45К (фиг. 25С), и на таких мутантах Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Е и Рс(15)Р0Р21 (А45К, 0170Е) (фиг. 25Ό). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что мутации, направленные на улучшение стабильности или как стабильности, так и растворимости, не теряют активность ΐη νίίΓο по сравнению с Рс-(Ь15)-Р0Р21 дикого типа. Интересно, что мутант Р0Р21 А45К продемонстрировал более высокую мощность по сравнению с Рс-(Ь15)-Р0Р21 дикого типа.
На фиг. 26А показано процентное изменение агрегации для контрольного Р0Р21 (^Т) и мутанта Р0Р21 А45К после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 2 и 4 дней. Данные показывают, что мутация А45К приводит к снижению агрегации мутантного белка по сравнению с белком дикого типа.
Фиг. 26В показывает процентное изменение агрегации для контрольного Р0Р21 (^Т), а также таких мутантов Р0Р21, как Р78С, Р0Р21 Р78К, Р0Р21 Ь86Т, Р0Р21 Ь86С, Р0Р21 Ь98С, Р0Р21 Ь98К, Р0Р21 А111Т, Р0Р21 А129И, Р0Р21 А129р, Р0Р21 А129К, Р0Р21 А134К, Р0Р21 А134У и Р0Р21 А134Е, после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 6 и 10 дней. Данные показывают, что мутации Р0Р21 Ь86С, Р0Р21 Ь98С, Р0Р21 Ь98К, Р0Р21 А111Т, Р0Р21 А129р и Р0Р21 приводят к снижению агрегации мутантного белка по сравнению с белком дикого типа.
Фиг. 27 показывает результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на контрольном Р0Р21 человека и на таких мутантах Р0Р21, как Р0Р21 А45К, Р0Р21 Ь52Т и Р0Р21 Ь58Е. Этот эксперимент демонстрирует, что мутант Р0Р21 А45К сохраняет полную эффективность Р0Р21 дикого типа и проявляет даже большую мощность по сравнению с Р0Р21 дикого типа. Однако мутанты Р0Р21 Ь52Т и Р0Р21 Ь58Е показывают меньшую мощность и эффективность по сравнению с Р0Р21 дикого типа.
На фиг. 28А-28В показано изменение уровня агрегации для таких мутантов Рс-(Ь15)-Р0Р21, как Рс(Ь15)-Р0Р21 (6-181, 0170Е), Рс-(Ь15)-Р0Р21 (А45К, 0170Е), Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171Е, Рс-(Ь15)-Р0Р21 Р171А, Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170Е, и контрольного Р0Р21 после их инкубации при 4°С в течение 1, 4 и 8 дней. Этот эксперимент демонстрирует, что после 8-дневного периода мутант Рс-(Ь15)-Р0Р21 (А45К, 0170Е) проявлял меньшую агрегацию по сравнению с мутантами Рс-(Ь15)-Р0Р21 0170Е или Рс-(Ь15)Р0Р21 Р171Е, но все три мутанта проявляли меньшую агрегацию по сравнению с контрольным Рс-(Ь15)Р0Р21. Табл. 17 показывает процентную величину агрегации, полученную для контрольного Рс-(Ь15)Р0Р21 и мутанта Рс-(Ь15)-Р0Р21 (А45К, 0170Е) после инкубации при 4°С или при комнатной температуре (КТ) в течение 0, 2, 3, 4 или 7 дней.
Таблица 17
Процентная величина агрегации для Рс-Р0Р21 и мутанта Рс-Р0Р21
Образец день 0 день 2 день 3 день 4 день 7
Рс-(Ы5)-РОР21 АТ 4°С 1,12 1,71 1,89 2,14 2,32
32 мг/мл К.Т 1,12 6,09 7,94 9,57 12,59
Рс-(Ь15)-РОР21 (А45К, О170Р) 4°С 0,45 0,77 0,88 1,03 1,24
33 мг/мл КТ 0,45 3,86 5,22 6,62 8,60
Пример 20. Изготовление и экспрессия комбинированных составных мутантов Рс-Р0Р21.
Как описано выше, стабильность и растворимость Р0Р21 можно модулировать при внесении специфических усечений и аминокислотных замещений. В дополнение к этому, стабильность Р0Р21 можно дополнительно увеличить за счет соединения таких модифицированных белков Р0Р21 с участком Рс гена иммуноглобулина человека 1дО1. Кроме того, комбинируя вышеуказанные модификации, можно создать молекулы Р0Р21, обладающие как улучшенной стабильностью, так и улучшенной растворимостью. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих комбинированные мутанты Р0Р21, перечисленные в табл. 18, были изготовлены по методикам, описанным выше. Использовали линкер Ь15, 000008000800008 (8Ер ΙΌ N0: 28).
- 49 021425
Таблица 18
Комбинированные мутанты РОР21
Аминокислотные остатки Мутация, направленная на устойчивость к протеолизу Мутация, направленная на уменьшение агрегации Рс Линкер
1-181 О170Е А45К -νη2 Ь15
1-181 С170Е Ь98К. -νη2 Ы5
1-181 О170Е А45К, Ь98К. -νη2 Ь15
1-181 Р171О А45К -νη2 Ы5
1-181 Р1718 А45К -νη2 Ь15
1-181 Р171О Ь98К -νη2 Ы5
1-181 Р1718 Ь98К -νη2 Ь15
1-181 Р171О А45К, Ь98К -νη2 Ь15
1-178 О170Е -νη2 Ь15
6-181 О170Е -νη2 Ь15
6-181 О170Е А45К -νη2 Ь15
6-181 О170Е Ь98К -νη2 Ь15
6-181 Р171О -νη2 Ь15
6-181 Р171О Ь98К -νη2 Ь15
7-181 О170Е -νη2 Ь15
На фиг. 29 показаны результаты измерения уровня глюкозы в крови у мышей, которым впрыскивали такие комбинированные мутанты Рс-(Ь15)-РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 (А45К, О170Е), Рс-(Ь15)РОР21 (А45К, Р171О) или Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О).
В другом эксперименте такой мутант РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О), исследовали параллельно со зрелым РОР21 и Рс-РОР21 дикого типа. В одном из экспериментов рекомбинантные клетки линии 293Т культивировали в присутствии разных концентраций РОР21, Рс-(И5)-РОР21 или Рс-(Ь15) РОР21 (Ь98К, Р171О) в течение 6 ч. Затем клеточные лизаты анализировали на активность люциферазы. Как показано на фиг. 30, Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) имел сходную активность с Рс-(Ь15)-РОР21, а это указывало на то, что внесение двух точковых мутаций не изменяет активность молекулы т уйго.
Еще в одном эксперименте стабильность Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) в концентрации 65 мг/мл оценивали в течение 9 дней при двух разных температурах, а именно при комнатной температуре и при 4°С, параллельно с РОР21 и Рс-(Ь15)-РОР21. По окончании периода инкубации клеточные лизаты анализировали методом ЗЕС-ВЭЖХ для определения профиля агрегации по времени при разных температурах. Данные, показанные на фиг. 31А и 31В, свидетельствуют о том, что скорость формирования агрегатов значительно снижалась для мутанта Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) при комнатной температуре (закрашенные треугольники, пунктирная линия на фиг. 31 А) и при 4°С (закрашенные треугольники, пунктирная линия на фиг. 31В).
Пример 21. Устойчивые к протеолизу мутанты РОР21, содержащие С-концевые мутации.
Также проводили исследования стабильности комбинированных мутантов т У1уо. В частности, стабильность 1и У1уо мутанта Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) сравнивали со стабильностью Рс-(Ь15)-РОР21 в мышиной модели и модели суиото1§и§. На обоих биологических видах были получены сходные результаты. В исследовании на обезьянах суиото1§и§ белки Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и Рс-(Ь15)РОР21 впрыскивали внутривенно в дозе 23,5 мг/кг, после чего собирали аликвотные пробы сыворотки и плазмы в разных точках времени до 840 ч после введения дозы. Анализировали точки времени до 168 ч. Образцы для разных точек времени аффинно очищали с применением реактивов против Рс, а затем анализировали методом масс-спектрометрии МАЛДИ. Сравнение результатов двух анализов выявило хорошую корреляцию между ними.
При анализе данных, полученных способом иммуноаффинность-МАЛДИ, было обнаружено, что в результате мутации Р171 в Р171О обрезание молекулы Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) в сайте Р171 элиминировалось. Однако для мутанта Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) наблюдалось минорное и медленное разрушение, приводящее к утрате до трех С-концевых остатков (фиг. 32). Минорные расщепления в трех С-концевых остатках также наблюдались для других мутантов РОР21 после того, как более чувствительный сайт расщепления между аминокислотными остатками 171 и 172 был заблокирован, как это показано на фиг. 20 и 21. Расщепление трех С-концевых остатков может представлять остановку отщепления от С-концевого участка молекулы карбоксипептидазой последовательным (от остатка к остатку) образом или специфическую атаку протеазы в аминокислотных остатках 178 и 179 с неспецифическим расщепле- 50 021425 нием в аминокислотных остатках 179-180 и 180-181. Утрата 2-3 аминокислот на С-конце может вызывать уменьшенное связывание β-Клото и, в конечном итоге, снижение мощности и уменьшение активности молекулы ш У1уо. См., например, У1е е1 а1., 2009, РЕВ8 Ьей. 583:19-24. Для адресного анализа очевидного разрушающего эффекта карбоксипептидазы на С-конце исследовали влияние добавления колпачка аминокислотного остатка к различным мутантным полипептидам Р0Р21. С применением методик, описанных в данном документе, были изготовлены и проанализированы многие конструкции, включая те, что представлены в табл. 19. Табл. 19 приводит сводку результатов анализа на ЕЬК-люциферазу ш νίΙΐΌ.
Подходящие аминокислотные колпачки могут иметь длину от 1 до 15 аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 10 или 15 аминокислот. В колпачке может быть использовано любое число аминокислот любого типа, например один остаток пролина, один остаток глицина, два остатка глицина, пять остатков глицина, а также другие комбинации. Дополнительные примеры колпачков представлены в непосредственном примере и в табл. 19.
В дополнение к этому, для адресного анализа очевидной атаки протеазы в аминокислотных остатках 178 и 179 исследовали мутации аминокислотных остатков в положениях 179, 180 и 181. И вновь с применением методик, описанных в данном документе, были изготовлены и проанализированы многие конструкции, включая те, что представлены в табл. 19. Также исследовали влияние комбинаций колпачка и мутаций в этих сайтах. Табл. 19 приводит в сводном виде типичные конструкции, которые были изготовлены и проанализированы ш уйго на активность ЕЬК-люциферазы способом, который описан в данном документе. В соответствии с терминологией, использованной в данном документе, ЬРс означает последовательность Рс человека (например, 8ЕЦ ГО N0: 11), Ь15 относится к линкеру Ь15 (например, 000008000800008, 81 Τ) ΙΌ N0: 28).
- 51 021425
Таблица 19
Эффективность и значения ЕС50 для полипептидов Р0Р21 с С-концевыми модификациями
Конструкции ЕС50(нМ) Эффективность
ЬиР0Р21 0,4 100,0%
ЬРс-(Ь 15)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710) 2,5 76,1 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Р171О, Υ179Ρ) 2,6 78,3 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К,Р171О, 1-180)
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К,Р171О, 1-179) 7,8 77,4 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) 1,9 79,6 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, 3181К) 130 87,9 %
ОЗОЗОЗОЗОЗ-ЬРс-Щ 15 )-ЬРСР21
МКЕОО-ЬРс-(Ь 15)-ЬРОР21 834 83,1 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, 3181Р, Р182) 272 69,9%
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Р171О, А180О) 3,25 76,9 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, 81810) 3,43 77,3 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К, Р171О, 1-182)
ЪРОР21(Ь98К, Р171О, 0182)
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, Υ179Ρ) 428 44,4 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, Υ179Ο) 61 82,6 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, Υ1793) 25,3 74,8 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Р171О, Υ179Α) 43,2 79,6 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К., Р171О, 8181Т) 3,07 77,6 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, 8181А) 2,66 73,5 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Ρ17Ι0, 8181Ь) 3,46 72,6 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К, ΡΙ710, 8181Р) 33,8 79,5 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, А180Р) 617 77,1 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, А1803) 2,18 84,7 %
НР0Р21 (Ь98К., Р171О, ООООО182-6)
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, Р182) 6,1 85,9 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, 0182) 6,5 71,1 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (1-178, Ь98К, Р1710) 167 63,9 %
ЬРс-(Ы5)-ЬРОР21 (Ь98К., Р1710, 00182-3) 1941 84,2 %
ЬРс-(Ь15)-ЬРОР21 (Ь98К, Р1710, ООООО182-6) 4307 99,7%
На фиг. 33 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических мышей бЪ/бЪ (фон С57В6), которым впрыскивали контрольный РВЗ, нативный Р0Р21 дикого типа, Рс(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р1710) и две закрытые колпачками молекулы, к С-концевому участку которых был добавлен или остаток пролина, или остаток глицина, т.е. Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, 182Р) и Рс-(Ь15)РОР21 (Ь98К, Р1710, 1820). Если остаток добавляли к С-концу полипептида РОР21 дикого типа или мутантного, остаток упоминается в том положении, которое он занимает в результирующем белке. Так, обозначение 1820 указывает на то, что остаток глицина присоединен к С-концевому остатку 181 зрелого полипептида дикого типа или мутанта. Фиг. 33 показывает, что нативный РОР21 снижал уровень глюкозы в крови в течение 6 ч, тогда как три изученных мутанта Рс-Р0Р21 демонстрировали длительную активность по снижению глюкозы в крови в течение как минимум 120 ч. Белок Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р1710, 182Р), молекула которого включала добавление остатка пролина на С-конце компонента Р0Р21 составного белка, оказался наиболее мощным и приводил к самому низкому уровню глюкозы в крови по сравнению с Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, 1820).
В последующем эксперименте изучали активность ш у1уо молекул Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, 1820) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, 182Р), сопоставляя ее с активностью ш у1уо закрытой колпачком молекулы, которая включала два остатка глицина, добавленных на С-конце, а именно Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, 1820, 1830). Фиг. 34 отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблю- 52 021425 даемое у мышей οό/οό, которым впрыскивали контрольный РВЗ, Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О), Рс(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, 182О, 183О), Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, 182О) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, 182Р).
Как показано на фиг. 34, все исследованные молекулы демонстрировали длительную активность по снижению глюкозы при сравнении с контрольным РВЗ. Этот эксперимент подтвердил предыдущие результаты (фиг. 33), свидетельствующие о том, что Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, 182Р) с добавлением пролина на С-конце демонстрирует немного большую активность по снижению уровня глюкозы при сравнении с молекулой без пролинового колпачка, например Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О). Однако оказалось, что добавление двух остатков глицина на С-конце, например Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, 182О, 183О), снижает мощность молекулы ш νίνο и уменьшает длительность эффекта ш νίνο по снижению уровня глюкозы.
На фиг. 35 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических мышей бЬ/бЬ (фон С57В6), которым впрыскивали контрольный РВЗ или такие мутантные полипептиды РОР21, как Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О), Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, Υ1793), Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, Υ179Α), Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180З) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180О). Все мутанты продемонстрировали сходную активность по снижению уровня глюкозы, а также сходную длительность эффекта.
Фиг. 36 отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических мышей бЬ/бЬ (фон С57В6), которым впрыскивали контрольный носитель, Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О), Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, Υ179Р) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е). По сравнению с белком Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) белок Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, Υ179Р) был менее эффективен в понижении уровня глюкозы в крови. Однако Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е), в котором было произведено мутационное замещение аланина на глутаминовую кислоту в положении 180, оказался более эффективным, чем Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и вызывал дополнительное снижение уровня глюкозы на 20% по сравнению с Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О). Эти данные позволяют предположить, что мутация А180Е может детерминировать уменьшенное С-концевое разрушение ш νίνο, т.е. улучшенную мощность и эффективность молекулы ш νίνο.
Пример 22. Исследование на обезьянах резус.
С применением методологии, описанной в данном документе, была создана конструкция Рслинкер-РОР21. Эта конструкция включала последовательность Рс 1дО1 (ЗЕО ГО N0: 11), соединенную на С-конце с линкерной последовательностью Ь15 (О1у)5-Зег-(О1у)3-Зег-(О1у)4-Зег (ЗЕО ГО N0: 28), которая далее была присоединена на С-конце к №концу зрелой последовательности РОР21 (ЗЕО ГО N0: 4) с двумя внесенными в последнюю мутациями, Ь98К и Р171О. Затем эта конструкция была экспрессирована и очищена, как описано в данном документе. Была выделена димерная форма белка, сцепленная через межмолекулярные дисульфидные связи между участками Рс каждого мономера. Эта молекула упоминается в непосредственном примере 22 как Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О), имеет аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 43 и кодируется последовательностью ЗЕО ГО N0: 42. В этом примере обозначение РОР21 относится к зрелой форме РОР21, а именно к ЗЕО ГО N0: 4.
22.1. Схема исследования.
Конструкцию Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) вводили хронически и подкожно (ЗС) самцам обезьян резус без диабета и с индексом массы тела (ИМТ) > 35. Две других группы обезьян (п=10 на группу) получали либо зрелый РОР21 (т.е. ЗЕО ГО N0: 4), либо контрольный носитель.
Перед началом введения любого испытуемого соединения животные проходили акклиматизацию в течение 42 дней, а затем их делили на группы численностью по 10 особей и вводили посредством множественных ЗС инъекций испытуемые соединения или контрольное вещество по принципу слепого исследования, как это отображено графически на фиг. 37. Вкратце, каждому животному делали в день одну инъекцию испытуемого соединения или носителя. РОР21 вводили ежедневно, тогда как Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) вводили еженедельно. Дозы Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и РОР21 повышали каждые 2 недели, как это показано на фиг. 37. По ходу всего исследования контролировали вес тела и потребление пищи. Научно-исследовательская организация, работающая по контракту (СК0), не была осведомлена о проводимом лечении.
Перед началом лечения проводили два пероральных теста на толерантность к глюкозе (0ОТТ). Результаты 0ОТТ1 использовали для разделения животных на три равноценные группы, основываясь на равномерном распределении по таким признакам, как площадь под кривой (АИС) и вес тела.
Результаты второго 0ОТТ (0ОТТ2) использовали для подтверждения сортировки по итогам первого 0ОТТ (0ОТТ1). Те обезьяны, для которых профиль 0ОТТ, полученный в первом тесте (0ОТТ1), отличался от профиля, полученного в следующем тесте (0ОТТ2), были исключены из исследования. Результаты 0ОТТ1 и 0ОТТ2 показаны на фиг. 38А и 38В, а результаты измерений АИС показаны на фиг. 38С. Исходный вес тела показан на фиг. 38Ό и в табл. 20.
0ОТТ 3, 4 и 5 проводили через каждые 2 недели по окончании лечения каждой из трех доз (низкой, средней и высокой). Образцы крови от животных собирали натощак еженедельно и использовали их для измерения уровней глюкозы, инсулина, триглицеридов, а также уровня испытуемого соединения. Образ- 53 021425 ца крови также собирали еженедельно в течение 3-недельного периода отмывания. Начальные результаты 0ОТТ1 и 0ОТТ2 показали ожидаемый профиль глюкозы у здоровых животных с максимальным уровнем глюкозы в плазме через 30 мин и продемонстрировали стабильность АиС в 3 разных группах.
Исходные биохимические показатели плазмы натощак показаны в табл. 20. Биохимические измерения в плазме проводили на образцах крови, полученных перед началом лечения.
Таблица 20
Исходные показатели веса тела, уровней глюкозы, инсулина и триглицеридов в плазме натощак в трех группах обезьян резус
Носитель Р0Р21 Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О))
N 10 10 10
Вес тела (кг) 8,5 ± 0,5 8,7 ± 0,4 8,5 ± 0,4
Глюкоза в плазме (мг/дл) 91,9 ± 4,8 94,8 ± 5,3 82,2 ± 3,7
Инсулин (пг/мл) 942,6 ± 121,4 976,1 ± 107,7 1023,4 ±205,1
Триглицериды (мг/дл) 44,4 ± 4,8 58,6 ±5,2 71,7 ±9,8
Были выбраны три разных уровня дозы: низкие дозы составляли 0,1 и 0,3 мг/кг, средние дозы - 0,3 и 1 мг/кг, а высокие дозы - 1 и 5 мг/кг для РОР21 и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) соответственно. Уровни доз были выбраны на основе наблюдаемой дозовой реакции у мышей, а схема введения доз основывалась на ожидаемой частоте инъекций для человека. Для средней и низкой доз были использованы эквимолярные дозы РОР21, а высокую дозу Рс-(Ы5)-РОР21 (Ь98К, Р171О) увеличили до 5 мг/кг (вместо 3 мг/кг, что соответствовало дозе, эквимолярной 1 мг/кг для РОР21).
22.2. Влияние испытуемых соединений на вес тела.
В этом эксперименте для оценки влияния испытуемых соединений на вес тела, измеряемый еженедельно, в трех разных группах обезьян резус еженедельно рассчитывали процентное изменение веса тела по сравнению с исходным. Вес тела также измеряли в течение трехнедельного периода отмывания. В табл. 20 указаны исходные значения веса тела для каждой группы.
Вес тела контролировали по ходу всего исследования, как до, так и после выведения испытуемых соединений. Процентное изменение веса тела по сравнению с начальным у животных, получавших носитель, нарастало, тогда как у животных, получавших Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и РОР21, на протяжении 6-недельного периода лечения вес тела снижался с эффектом дозовой зависимости, как это показано на фиг. 39. Как ранее наблюдалось у грызунов (Хи е! а1., О1аЬе1е5 58(1):250-9 (2009)), лечение РОР21 снижало вес тела на уровне статистической значимости. Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) имел большую экспозицию по сравнению с РОР21 (на фиг. 48 и 47 соответственно), и это позволяло дать полученным наблюдениям такое возможное объяснение, что Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) демонстрировал более выраженное снижение веса тела по сравнению с РОР21.
22.3. Влияние испытуемых соединений на уровень инсулина.
Уровень инсулина измеряли в образцах крови, полученных после ночного перерыва в приеме пищи (натощак) или после дневного кормления.
Уровень инсулина в плазме у обезьян резус, получавших носитель, РОР21 или Рс-(Ь15)-РОР21 (1.98К. Р171О), измеряли натощак еженедельно, включая 3-недельный период отмывания. Образцы крови натощак собирали приблизительно через 5 дней после последней инъекции Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции РОР21.
Уровень инсулина в плазме после приема пищи у обезьян резус измеряли на пятой и шестой неделе лечения либо носителем, либо РОР21 в высокой дозе. Образцы крови после приема пищи собирали приблизительно через 3 дня после последней инъекции Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и приблизительно через 2 ч после последней инъекции РОР21. Фиг. 40 показывает влияние носителя, РОР21 и Рс-(Ь15)РОР21 (1.98К, Р171О) на уровень инсулина в крови натощак на протяжении всего девятинедельного исследования, тогда как фиг. 41 отображает уровень инсулина после приема пищи, определенный в образцах, которые были получены на 5-й и 6-й неделе.
Вкратце, в двух самых высоких дозах как РОР21, так и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О), статистически значимо понижали уровень инсулина натощак и после приема пищи. То наблюдение, что уровень инсулина у животных, получавших РОР21 и Рс-(Ы5)-РОР21 (Ь98К, Р171О), снижался, а повышения уровня инсулина не происходило, свидетельствует о повышенной чувствительности к инсулину.
22.4. Влияние испытуемых соединений на 0ОТТ (глюкоза и инсулин).
Три теста 0ОТТ (0ОТТ 3, 4 и 5) были проведены после начала лечения. В тесте 0ОТТ5 профили уровней глюкозы и инсулина измеряли у животных, которые в течение 6 недель получали носитель, РОР21 или Рс-РОР21 (Ь98К, Р171О), в соответствии с последними двумя неделями режима повышения дозы (высокая доза). Тест 0ОТТ5 проводили приблизительно через 7 дней после последней инъекции Рс(Ы5)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции РОР21. Профили
- 54 021425 глюкозы и инсулина в тесте 0СТТ5 показаны на фиг. 42 и 43 соответственно. Животные, получавшие Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С), демонстрировали улучшенный клиренс глюкозы, сравнимый с 5 животными, получавшими носитель, только при самой высокой дозе и в последней точке времени при проведении измерений, как это показано на фиг. 42. В конце периода введения последней дозы Рс-(Ь15)РСР21 (Ь98К, Р171С) показал самое сильное улучшение клиренса глюкозы. РСР21 не показал улучшения клиренса глюкозы. Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) имел большую экспозицию по сравнению с РСР21 (на фиг. 48 и 47 соответственно), и это позволяло дать полученным наблюдениям такое возможное объяснение, что Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) демонстрировал более выраженный эффект в отношении клиренса глюкозы по сравнению с РСР21. Уровень инсулина по результатам теста 0СТТ5 был статистически значимо снижен в последней точке времени проведения изменений у животных, получавших Рс(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171С), по сравнению с животными, получавшими носитель.
Процентное изменение АИС глюкозы по сравнению с исходным рассчитывали для трех 0СТТ (0СТТ 3, 4 и 5), проведенных в конце периода введения каждой дозы (низкой, средней и высокой) в трех разных группах обезьян резус, как это показано на фиг. 44. Тест 0СТТ5 проводили приблизительно через 7 дней после последней инъекции Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) и через 21 ч после последней инъекции РСР21, и полученные результаты показали, что Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) статистически значимо улучшал АИС5. Исходные показатели теста 0СТТ для каждой группы показаны на фиг. 38С.
Уровень глюкозы в плазме натощак измеряли в те дни, когда не проводили тесты 0СТТ. Не было выявлено каких-либо значимых статистических различий между тремя группами животных по результатам измерений уровня глюкозы натощак.
22.5. Влияние испытуемых соединений на уровень триглицеридов.
Процентное изменение уровня триглицеридов натощак в плазме у обезьян резус, получавших носитель, РСР21 или Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С), рассчитывали еженедельно, включая 3-недельный период отмывания. Образцы крови натощак собирали приблизительно через 5 дней после последней инъекции Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции РСР21. Уровень триглицеридов измеряли каждую неделю после начала лечения, процентные изменения по сравнению с начальным уровнем показаны на фиг. 45, и исходные величины натощак показаны в табл. 20.
Как отображено на фиг. 45, животные, получавшие либо Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С), либо РСР21, демонстрировали снижение уровня триглицеридов с эффектом дозовой зависимости, причем Рс(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171С) имел более выраженный понижающий эффект по сравнению с РСР21.
На фиг. 46 показан уровень триглицеридов в плазме в образцах, полученных от обезьян резус после приема пищи на пятой и шестой неделе лечения носителем, Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) или РСР21. Образцы крови после приема пищи собирали приблизительно через 3 дня после последней инъекции Рс(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171С) и приблизительно через 2 ч после последней инъекции РСР21. Уровень триглицеридов в плазме после приема пищи у животных, получавших РСР21 и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С), был статистически значимо снижен по сравнению с животными, получавшими носитель (фиг. 46).
22.6. Концентрация испытуемых соединений.
Экспозицию испытуемых соединений, вводимых на приблизительно эквивалентном уровне молярной дозы, оценивали на протяжении всего исследования. Концентрацию Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) измеряли перед введением дозы и приблизительно через 5 дней после последней инъекции. Уровень РСР21 измеряли перед введением дозы, а также через 5, 12, 19 и 26 дней. Образцы крови получали приблизительно через 21 ч после последней инъекции.
Показатели индивидуальных концентраций испытуемых соединений у каждой обезьяны отображены на фиг. 47 и 48. Как показано на фиг. 47, большинство животных в группе, получавшей РСР21, имели концентрацию ниже порога количественного определения. Фиг. 48 показывает, что животные в группе, получавшей Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С), имели определяемый уровень Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) в каждой дозовой фазе (две еженедельных дозы одинаковой интенсивности). Средняя концентрация в каждой дозовой фазе для Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) увеличивалась примерно пропорционально дозе от 0,3 до 5 мг/кг. Имеется минимальное накопление, о чем свидетельствует устойчивая концентрация после первой и второй еженедельной дозы в каждой фазе повышения дозы для обоих соединений. В фазе после лечения (период отмывания) уровень Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) был определяемым приблизительно до 47-го дня (12 дней после последней дозы), а после этого падал ниже порога количественного определения (ЬЬ0О).
Экспозицию испытуемых соединений также мониторировали при каждом 0СТТ. РСР21 не поддавался определению в ходе тестов 0СТТ 3 и 4, после лечения РСР21 в низкой и средней дозе. Однако по результатам 0СТТ5, т.е. после лечения высокой дозой, наблюдался определяемый уровень. Пропорциональное дозе увеличение уровня Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С) наблюдалось от третьего до пятого 0СТТ при увеличении дозы, как это показано на фиг. 49.
Данные об уровнях соединений подтверждают, что животные подвергались воздействию ожидаемого количества каждого соединения, а именно РСР21 и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171С), в режиме повышения дозы. В отношении измеряемого количества РСР21 наблюдалась большая вариабельность, ко- 55 021425 торая представляла собой ожидаемый результат, учитывая то, что сбор образцов проводили приблизительно через 21 ч после последней дозы, а период полувыведения Р0Р21 составляет приблизительно 1 ч.
22.7. Выводы.
Р0Р21 понижал уровень триглицеридов натощак и после приема пищи, уровень инсулина, и уменьшал вес тела в самых высоких дозах. Рс-(Ы5)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) улучшал показатели тестов 00ΤΤ и понижал уровень инсулина в самой высокой дозе, а также с эффектом дозовой зависимости понижал уровень триглицеридов в плазме натощак и после приема пищи, как и вес тела. Как Р0Р21, так и Рс-(Ы5)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) снижали показатели по многим метаболическим параметрам у обезьян резус, не отягощенных сахарным диабетом. Уровень инсулина и триглицеридов снижался одинаково при лечении Р0Р21 и Рс-(Ы5)-РСР21 (Ь98К, Р1710), если уровень циркулирующих соединений находился в сходном диапазоне (в состоянии животных после приема пищи). Вследствие улучшенных характеристик Рс-(Ы5)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) превосходил Р0Р21 в отношении большинства измеряемых параметров, а для эффективного воздействия на метаболические параметры его можно было вводить один раз в неделю.
Пример 23. Составная молекула Ес-(048)3-Р0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е).
Была получена составная молекула Рс, содержащая мутант Р0Р21, который присоединяли к 1д01 Рс компоненту при помощи линкера. Компонент Р0Р21 составной молекулы Рс содержал три точечные мутации, сконструированные в полипептидной последовательности Р0Р21, а именно Ь98К, Р1710, А180Е (нумерация основана на зрелой форме Р0Р21, представленной как 8Е0 ГО N0: 4). Данная молекула была сконструирована путем конъюгации человеческой Рс (8Е0 ГО N0: 11) и Оконца Ь98К, Р1710, А180Е мутанта Р0Р21 (8Е0 ГО N0: 39) посредством 15 аминокислотного линкера, содержащего последовательность 000080000800008 (8Е0 ГО N0: 31). Данная молекула была обозначена как Ес-(048)3-Р0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) и ее полноразмерная аминокислотная последовательность показана на фиг. 50 и в 8Е0 ГО N0: 47; она кодирована нуклеиновой кислотой 8Е0 ГО N0: 46. Ιη νίίτο анализ Ес-(048)3-Р0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) показал, что она является эффективным стимулятором Егк фосфорилирования в рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей β-Клото. Ес-(048)3-Р0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) также проявила повышенную афинность связывания с β-Клото по сравнению с составной молекулой Рс Р0Р21 дикого типа или составной молекулой Рс Е0Е21-(048)3-Р0Е21 (Ь98К, Р1710) (8Е0 ГО N0: 45). При инъекции в диабетические животные модели, Рс-(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) уменьшала уровни глюкозы в крови, понижала массу тела и была приемлема для инъекций раз в две недели.
23.1. Активность ίη νίίτο Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е).
Были проведены эксперименты для исследования того, сохраняет ли Ес-(048)3-Р0Е21 (Ь98К, Р1710, А180Е) активность, аналогичную составной молекуле Рс дикого типа Р0Р21 или нативной Р0Р21 дикого типа в анализе ίη νίίτο ЕЬК-люциферазы.
Анализы ЕЬК-люциферазы были выполнены с использованием рекомбинантной человеческой системы почечных клеток 293Т, в которой 293Т клетки избыточно экспрессируют β-Клото и люциферазные репортерные конструкции. β-Клото является корецептором, который необходим для РСР21. чтобы активировать РСР рецепторы и вызывать внутриклеточную передачу сигналов, включая Егк фосфорилирование. Конструкции Егк-люциферазного репортера содержат последовательности, кодирующие 0АЬ4ЕЬК1 и 5хИА8-люциферазный репортер. 5хИА8-люциферазный репортер приводится в действие промотором, содержащим пять тандемных копий сайта связывания 0а14. Репортерная активность регулируется уровнем фосфорилированного Егк, и используется для непрямого контроля и количественного определения активности Р0Р21.
Анализы ЕЬК-люциферазы были проведены путем культивирования 293Т клеток в присутствии различных концентраций Р0Р21 дикого типа, составной молекулы Рс дикого типа Р0Р21, Рс-Е15-РСР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) и Рс-(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) в течение 6 ч, с последующим анализом клеточных лизатов на предмет люциферазной активности. Люминесценцию, полученную в анализах ЕЬК-люциферазы для каждой РСР21 конструкции, выражали по оси у, а концентрации соединений - по оси х.
На фиг. 51 показана кривая доза-ответ анализируемых соединений в анализах Егк-люциферазы. Рс(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) сохранял аналогичную активность по сравнению с составной молекулой Рс РСР21 дикого типа, предполагая, что комбинация мутаций с Ь98К, Р1710 и А180Е не изменяла биологическую активность Р0Р21. По сравнению с нативной молекулой Р0Р21 дикого типа, составные конструкции Рс демонстрировали слегка сниженную эффективность и максимальную активность в таких клеточных анализах с избыточно экспрессированным β-Клото.
23.2. Активность ίη νίίτο составных молекул Рс-РСР21 (Ь98К, Р1710, А180Е), содержащих различные линкерные последовательности.
Аналогичный составной аналог Рс был получен путем составления человеческого 1д01 Рс и РСР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) с другой линкерной последовательностью, 000008000800008 (8Е0 ГО N0: 28). Данный линкер был обозначен Ь15, и полученная в результате составная молекула была обозначена как Рс-Е15-РСР21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (8Е0 ГО N0: 57). В данном эксперименте было исследовано
- 56 021425 влияние различных линкерных последовательностей на активность составных молекул Рс-РОР21 (Ъ98К, Р171О, А180Е).
Анализы ЕЬК-люциферазы выполняли путем культивирования 293Т клеток в присутствии различных концентраций Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) и Рс-Ь15-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) в течение 6 ч, и затем анализа клеточных лизатов на предмет люциферазной активности. Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) демонстрировал активность, аналогичную Рс-Ь15-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е), что указывает на отсутствие значительного влияния различных линкерных последовательностей, например (О48)3 или Ь15 линкеров, на биологическую активность составных молекул Рс-РОР21.
23.3. Афинность связывания ίη νϊΐΓο Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) для β-Клото в анализах связывания.
Связывание Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) с человеческими β-Клото и β-Клото яванских макак было проанализировано в анализе связывания Биакор равновесия раствора. Афинность Рс-(О48)3РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) также сравнивали с Рс-составным РОР21 аналогом с только Ь98К и Р171О мутациями, а именно РС-Ы5-РОР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ΙΌ Ν0: 43).
Нейтравидин иммобилизовали на СМ5 чипе при помощи аминного сочетания. Биотин-РОР21 улавливали на второй проточной ячейке до —1500КИ. Первую проточную ячейку использовали в качестве фонового контроля. РОР21 мутанты при 5х разведениях (0,03-2000 нМ) инкубировали с 10 нМ человеческого β-Клото или 25 нМ β-Клото яванских макак в РВЗ плюс 0,1 мг/мл В8А, 0,005% Р20 при комнатной температуре в течение 1 ч. Связывание свободного β-Клото в смешанных растворах измеряли путем инъекции над биотин-РОР21 поверхностью. 100% сигнал связывания β-Клото был определен в отсутствие РОР21 мутантов в растворе. Сниженный ответ связывания β-Клото при повышенных концентрациях РОР21 мутантов указывал на то, что β-Клото связывался с РОР21 мутантами в растворе, что блокировало связывание β-Клото с иммобилизованной биотин-РОР21 поверхностью. Относительное связывание смеси относительно молярной концентрации РОР21 наносили на график при помощи ОгарЬРаб Рп/т 5. ЕС50 рассчитывали с использованием нелинейной подгонки конкуренции за один сайт на том же самом программном обеспечении.
На фиг. 52 показаны результаты, полученные в анализе Биакор равновесного связывания в растворе Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) и Рс-Ь15-РОР21 (Ь98К, Р171О) с человеческим (справа) β-Клото и β-Клото яванских макак (слева). Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) проявила по меньшей мере вдвое большую активность связывания как для человеческого β-Клото, так и для β-Клото яванских макак, по сравнению с Рс-Ь15-РОР21 (Ь98К, Р171О).
23.4. Эффективность ίη νίνο Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) у диабетических бЬ/бЬ мышей.
Был изучен вопрос, могут ли придавать Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) метаболические полезные эффекты, такие как понижение глюкозы в крови и уменьшение массы тела, у диабетических бЪ/бЪ мышей. Исследование было также предназначено для изучения продолжительности и ответа на дозу Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) после одной инъекции. Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) в дозах 0,1, 0,3, 1 и 3 мг/кг вводили путем интраперитонеальной инъекции бЪ/бЪ мышам. Также в данное исследование включали группу, обработанную основой (10 мМ ТЙ8, 2,2% сахарозы, 3,3% сорбита, рН 8,5). Пробы крови получали для каждого животного (η=10 на группу) при фоновом значении (перед инъекцией) и через 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровни глюкозы в крови измеряли на глюкометре ΟηοΤοιιΟι (ЕгГсЗсат 1пс. Милпитас, штат Калифорния). Массу тела измеряли на фоновом уровне (время 0) и через 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции.
На фиг. 53А показаны уровни глюкозы в крови у бЪ/бЪ мышей в различные моменты времени после инъекции основы или Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е). Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) привел к уменьшению зависимого от дозы уровня глюкозы в крови у бЪ/бЪ мышей. Максимальное уменьшение глюкозы составляло приблизительно 50% от фонового уровня или по сравнению с обработанной основой группой. Максимальный эффект достигался в течение 6 ч после инъекции и продолжался 120 ч после инъекции. Уровни глюкозы в крови начали возвращаться к фоновому уровню через приблизительно 168 ч. Оцененное значение ЕЭ50, дозы, необходимой для достижения половины максимального эффекта, для Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) составляло приблизительно 1 мг/кг у бЪ/бЪ мышей.
На фиг. 53В показано влияние Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) на массу тела после одной инъекции бЪ/бЪ мышам. Результаты выражены как измерение массы тела со времени 0 (перед инъекцией). Обработанные основой мыши показывали прогрессивный и стабильный набор массы в течение 7дневного периода исследования. Однако скорость возрастания массы тела была ингибирована у мышей, обработанных Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) в зависимости от дозы. Чем выше была доза, тем более длительным было ингибирование возрастания. В одном примере Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) угнетал прирост массы тела в течение 5 дней при 3 мг/кг, 3 дней при 1 мг/кг или 1 дня при 0,3 мг/кг. Скорости прироста регистрировали после этого. В данном эксперименте оцененное значение ЕЭ50 Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) на массу тела составляло приблизительно 1 мг/кг.
23.5. Сравнение эффективности Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) у мышей ΌΙΟ с различными частотами инъекций.
- 57 021425
Данное исследование было проведено для определения того, может ли Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) быть введено путем инъекции менее часто, чем Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710), но с достижением аналогичной эффективности. Исследование было проведено у мышей ΌΙ0 с Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е), которую давали раз в неделю (07Ό) или раз в две каждые недели (014Ό), или РсЫ5-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) вводили дважды в неделю (В^), 07Ό или 014Ό.
ΌΙ0 мышей готовили путем кормления 4-недельных С57ВЬ/6 мышей мужского рода высокожирной диетой, содержавшей 60% энергии от жиров, обогащенных насыщенными жирными кислотами (Ό12492, Ке8еагсЬ О1е18, Ιικ., Нью-Брунсвик, Нью-Джерси). Через 12 недель высокожирной диеты измеряли массу тела и уровни глюкозы в крови. Затем ΌΙ0 мышей рандомизировали в группы основы или лечения для достижения аналогичных фоновых средних уровней глюкозы в крови и массы тела. В данное исследование было включено всего 7 групп: основу вводили при Ο7Ό; Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) вводили при Ο7Ό или Ο14Ό; или Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) вводили при ВПУ, Ο7Ό или Ο14Ό. Инъекция была интраперитонеальной и исследование проводили в течение 31 дня. Массу тела измеряли еженедельно. 0ΤΤ выполняли на 28 день исследования и исследование прекращали на 31 день. Схема исследования графически показана на фиг. 54.
На фиг. 55 показаны профили 0ΤΤ мышей, которых лечили основой, Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) или Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) при различных частотах дозировок. Толерантность к глюкозе статистически значимо улучшалась у мышей, которых лечили Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) при Ο7Ό или Ο14Ό дозировках по сравнению с основой, предполагая, что Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) является эффективным и приемлемым для введения Ο14Ό мышам ΌΙ0. Рс-(Ь15)Р0Р21 (Ь98К, Р1710) улучшала толерантность к глюкозе при ведении при ВПУ или Ο7Ό, но не Ο14Ό, предполагая, что Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) может быть менее приемлемым для Ο14Ό инъекции у мышей. Эффективность Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) при Ο7Ό или Ο14Ό была сравнима с эффективностью Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) при ВПУ или Ο7Ό соответственно, предполагая, что Рс(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) может быть введен в 2 раза менее часто, чем Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710).
На фиг. 56 показано изменение массы тела относительно фона (день 0) у мышей, которых лечили основой, Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) или Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) при различных режимах дозировок. Мыши, которых лечили Ο7Ό с Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е), потеряли значительную массу тела, как и мыши, которых лечили ВПУ с Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710). Масса тела была умеренно снижена у мышей, которых лечили Ο14Ό с Рс-(04δ)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) или Ο7Ό с Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710). Отсутствие значительного влияния на массу тела наблюдали у мышей, которых лечили Ο14Ό с Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710). Влияние на массу тела соответствовало влиянию на 0ΤΤ, как описано выше, предполагая, что Рс-(04δ)4-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) был эффективным при Ο14Ό дозировке и требовал приблизительно в 2 раза менее частых инъекций, чем Рс(Ъ15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) для достижения того же самого влияния.
Пример 24. Композиции гидрогеля, содержащие Р0Р21 мутанты.
В качестве формообразующего агента для терапевтических средств на основе белков, гидрогели предлагают ряд желательных свойств. Например, гидрогели сохраняют нативную структуру и функцию белка, включенного в гидрогель. Дополнительно, они хорошо переносятся и в зависимости от полимера и типа перекрестной сшивки, они могут быть биоразлагаемыми. Дополнительно, гидрогели были ранее успешно использованы для непрерывного высвобождения белков. Соответственно, гидрогели были исследованы в качестве возможного способа доставки для мутантов Р0Р21, описанных в данном изобретении.
Для всех экспериментов, описанных в данном примере, гидрогели получали следующим образом. Получали раствор 1,25% бычьего желатина (δίβπκι) в ΡΒδ. Добавляли агент перекрестной сшивки - метакриловый альдегид - в молярном соотношении (МА к желатину) 16:1, 24:1 или 32:1. Полученный в результате раствор подвергали диализу с водой для удаления любых неполимеризованных метакриламидов и получения гидрогельной основы. Наконец, гидрогелевую основу подвергали лиофилизации и хранили при 4°С до готовности получения гидрогелей, содержащих Р0Р21 мутант. Данный препарат может быть использован для получения желатиновых гидрогелевых основ, которые могут быть затем приспособлены таким образом, чтобы содержать любые из Р0Р21 мутантов, которые описаны в данном изобретении.
Затем получали гидрогели с конкретными Р0Р21 мутантами. Начиная с 10% лиофилизации, получали растворы метакриловой желатиновой гидрогелевой основы. Гидрогелевые основы нагревали и затем центрифугировали с растворением и ожижением лиофилизованной МА желатиновой гидрогелевой основы. Выбранный Р0Р21 белок (Р0Р21 (Ь98К, Р1710) (δΕΟ ΙΌ N0: 37)) в настоящем примере затем добавляли к ожиженному желатиновому раствору в предварительно определенной концентрации. Затем добавляли маточный раствор ΤΕΜΕΌ. Затем добавляли маточный раствор ΕΒδ и раствор осторожно перемешивали. Шприцы на 1 мл наполняли до 200 мкл и оставляли для осаждения в течение 1,5-2 ч при комнатной температуре. Шприцы хранили при -20°С и оттаивали при 4°С в течение ночи перед использованием. В качестве контроля использовали гидрогелевую основу, содержавшую 10 мМ Ττΐ8, 9% саха- 58 021425 розы, рН 8,5 без добавления РОР21 мутанта.
Для экспериментов ίη νίνο шприцы помещали на электрогрелку при 37°С в течение приблизительно 10 мин перед инъекцией животным.
24.1. Активность ίη νίΐτο РОР21 (Ь98К, Р171О), высвобожденной из 10% гидрогелей с различными соотношениями перекрестной сшивки.
Целью данного эксперимента было проанализировать, является ли высвобождаемый из гидрогеля РОР21 (Ь98К, Р171О) биологически активным по сравнению с нативной формой РОР21 (Ь98К, Р171О) в анализе ЕЬК-люциферазы ίη νίΐτο.
Получали РОР21 (Ь98К, Р171О) и вводили в 10% метакриловые желатиновые растворы с соотношениями метакриловой желатиновой перекрестной сшивки при 16:1, 24:1 и 32:1, как было описано. Затем гидрогели диспергировали ίη νίΐτο в буферный раствор, позволяя высвобождение РОР21 (Ь98К, Р171О). Среду собирали через 100 или 150 ч и подвергали анализам ίη νίΐτο на предмет активности РОР21 (Ь98К, Р171О). Аналитические анализы (например, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, эксклюзионная хроматография ВЭЖХ, и обратнофазная ВЭЖХ), показали, что высвобожденный РОР21 (Ь98К, Р171О) был интактным во все моменты времени.
Анализы активности ЕЬК-люциферазы проводили при помощи рекомбинантной человеческой системы почечных клеток 293Т, в которой 293Т клетки избыточно экспрессируют β-Клото и люциферазные репортерные конструкции. β-Клото представляет собой корецептор, необходимый РОР21 для активации ее РОР рецепторов. Рецепторами РОР, которые использовали в данном анализе, являются эндогенные рецепторы РОР, экспрессированные в почечной клетке 293Т. Люциферазные репортерные конструкции содержат последовательности, кодирующие ОАЬ4-ЕЬК1 и люциферазный репортер, который управляется промотором, содержащим пять тандемных копий сайта связывания Оа14 (5хиАЗ-Ьис). Активность люциферазы регулируется уровнем фосфорилированной Етк/ЕЬК1, и ее используют для непосредственного контроля и количественного определения активности РОР21.
Анализы ЕЬК люциферазы проводили путем культивирования клеток 293Т в присутствии различных концентраций нативной формы РОР21 (Ь98К, Р171О) или гидрогель-высвобожденной РОР21 (Ь98К, Р171О) в течение 6 ч, и последующего анализа клеточных лизатов на предмет люциферазной активности. На фиг. 57 показаны результаты ίη νίΐτο анализа ЕЬК люциферазы. РОР21 (Ь98К, Р171О), высвобожденная из гидрогелей с соотношениями метакриловых желатиновых перекрестных сшивок 16:1, 24:1 и 32:1, была биологически активной, проявляя эквивалентную активность к нативной форме РОР21 (Ь98К, Р171О). Такие данные продемонстрировали, что гидрогель сохранял структуру и функцию введенного белка и что высвобожденный РОР21 (Ь98К, Р171О) является активным и стабильным даже через 10-15 ч в данной среде.
24.2. Эффективность ίη νίνο гидрогеля РОР21 (Ь98К, Р171О) при различных соотношениях перекрестных сшивок у мышей οΕοΚ
Целью данного эксперимента было определение того, обеспечивает ли РОР21 (Ь98К, Р171О) гидрогель, полученный с соотношениями метакриловой желатиновой перекрестной сшивки 24:1 и 32:1, непрерывное высвобождение биологически активного РОР21 (Ь98К, Р171О) ίη νίνο и в конечном счете приводит к более длительной эффективности ίη νίνο по сравнению с нативной формой РОР21 (Ь98К, Р171О). Дополнительно, исходя из оценки скоростей высвобождения ίη νίΐτο, было определено, что более высокие соотношения перекрестных сшивок метакрилового желатина предоставляют лучшее непрерывное высвобождение введенного РОР21 (Ь98К, Р171О). Поэтому другой целью данного эксперимента было сравнение двух РОР21 (Ь98К, Р171О) гидрогелей, полученных с соотношениями метакриловых желатиновых перекрестных сшивок 24:1 и 32:1.
РОР21 обладает рядом биологических активностей, включая способность понижать уровни глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, уменьшать массу тела; или повышать толерантность к глюкозе, потребление энергии, или чувствительность к инсулину. РОР21 (Ь98К, Р171О) гидрогели вводили резистентным к инсулину мышам οΕοΕ и измеряли способность РОР21 (Ь98К, Р171О) гидрогеля понижать уровни глюкозы в крови и уменьшать массу тела. Процедура получения ίη νίνο состояла в следующем.
Гидрогели получали при помощи описанной выше процедуры. 8-недельным мышам οЬ/οЬ (^аск5οη Ρ;ώοηιΙοτν) обривали волосы в месте инъекции и подвергали анестезии изофлураном и О2 непосредственно перед инъекцией. Гидрогели (0,2 мл) медленно вводили путем инъекции под кожу и наносили Ветбонд в месте инъекции после инъекции. Также в эксперимент включали основу (10 мМ Тгр. 9% сахарозу, рН 8,5) или нативный РОР21 (Ь98К, Р171О) и вводили путем инъекции аналогично гидрогелю. Животных возвращали в их клетки после того, как они просыпались после анестезии. Пробы крови получали перед инъекцией и в различные моменты времени после инъекции, например, через 0, 3, 6, 24, 72, 120, 192 и 264 ч после инъекции. Уровни глюкозы в крови измеряли при помощи глюкометра ΟηοΤοιιΟι (ЬтТеЗсац, 1пс. Милпитас, штат Калифорния). Также контролировали массу тела.
На фиг. 58 и 59 подытожены результаты данного эксперимента. По сравнению с основой или контрольным гидрогелем, нативная форма РОР21 (Ь98К, Р171О) быстро уменьшала уровни глюкозы в крови
- 59 021425 через 3 и 6 ч после инъекции. Однако активность ίπ У1уо нативной формы Р0Р21 (Ь98К, Р1710) убывала и уровни глюкозы в крови возвращались к фоновому значению через 24 ч после инъекции. Р0Р21 (Ь98К, Р1710) гидрогели приводили к уменьшению уровней глюкозы в крови через 3 ч после инъекции и активность сохранялась до 8 дней. Отсутствовала существенная разница между соотношениями перекрестной сшивки при 24:1 или 32:1. Р0Р21 (Ь98К, Р1710) гидрогелевые группы также проявляли более медленный прирост массы тела, чем у мышей, которых лечили основой или только гидрогелем. Данные результаты продемонстрировали, что Р0Р21 (Ь98К, Р1710) гидрогели, полученные с соотношениями метакриловых желатиновых перекрестных сшивок 24:1 и 32:1 способны обеспечивать непрерывное высвобождение биологически активного Р0Р21 (Ь98К, Р1710) т У1уо и в конечном счете приводят к более продолжительной эффективности т У1уо по сравнению с нативной формой Р0Р21 (Ь98К, Р1710).
24.3. Эффективность т У1уо гидрогеля Р0Р21 (Ь98К, Р1710) и Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) при различных соотношениях перекрестных сшивок у мышей 0Ь/В6.
Композиции гидрогеля получали, используя бычий желатин (81§та) и несколько Р0Р21 мутантов и конструкций, а именно Р0Р21 (Ь98К, Р1710) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е). Также получали гидрогелевый контроль. 0,2 мл гидрогеля помещали в шприц на 1 мл с иглой 210.
Гидрогелевые контроли и гидрогели, содержащие Р0Р21 мутант, получали, как описано выше. 8недельным мышам 0Ь/В6 Цаскзоп ЬаЬога1огу) обривали волосы в месте инъекции и подвергали анестезии изофлураном и О2 непосредственно перед инъекцией. Гидрогели (0,2 мл) медленно вводили путем инъекции под кожу и наносили Ветбонд в месте инъекции после инъекции. Также в эксперимент включали основу (10 мМ Тг13, 9% сахарозу, рН 8,5) или нативный Р0Р21 (Ь98К, Р1710) и вводили путем инъекции аналогично гидрогелю. Животных возвращали в их клетки после того, как они просыпались после анестезии. Пробы крови получали перед инъекцией и в различные моменты времени после инъекции, например через 0, 24, 96, 168, 240, 312 ч после инъекции. Уровни глюкозы в крови измеряли при помощи глюкометра 0пеТоисЬ (Ы£е8сап, Ыс. Милпитас, штат Калифорния). Также контролировали массу тела.
Экспериментальная схема была следующей:
Группа животных (п=9 на группу)
A. Контрольный гидрогель 32:1 (10%) МА:Ни4 200 мкл
B. Р0Р21 (Ь98К, Р171О) гидрогель 32:1 (10%) МА:Ни4 0,5 мг/мышь (200 мкл, ~ 10 мг/кг)
C. РОР21 (Ь98К, Ρ1710) гидрогель 32:1(10%) МА:Ни4 1,5 мг/мышь (200 мкл, ~ 30 мг/кг)
ϋ. Рс-(О48)3-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) (гидрогель отсутствует) мг/кг
Были измерены различные параметры и результаты экспериментов показаны на фиг. 60-63. На фиг. 60 показано изменение уровня глюкозы в крови в течение 14-дневного эксперимента, в то время как на фиг. 61 показан процент изменения уровня глюкозы в крови в течение того же самого периода времени. На фиг. 62 показано изменение массы тела в течение 14-дневного эксперимента, в то время как на фиг. 63 показан процент изменения массы тела в течение того же самого периода времени.
Результаты эксперимента графически представлены на фиг. 60-63 и могут быть подытожены следующим образом:
Р0Р21 (Ь98К, Р1710) 32:1(10%)МА:Ни4 при 10 мг/кг был эффективным при понижении уровня глюкозы в крови через 24 ч после инъекции, и уровень глюкозы в крови восстановился до фонового значения через 4-7 дней.
Р0Р21 (Ь98К, Р1710) 32:1(10%)МА:Ни4 при 30 мг/кг был более эффективным при уменьшении уровня глюкозы в крови, чем дозировка 10 мг/кг, и наблюдалось восстановление уровня глюкозы в крови до фонового значения через 7-10 дней.
Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) при 3 мг/кг сам по себе уменьшал уровень глюкозы в крови через 24 ч после инъекции в степени, аналогичной Р0Р21 (Ь98К, Р1710) при 30 мг/кг из гидрогеля.
Гидрогелевый контроль (не содержавший Р0Р21 мутант) не оказывал влияния на уменьшения уровня глюкозы в крови.
Р0Р21 (Ь98К, Р1710) гидрогелевые группы и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (не представленные в гидрогеле), проявляли уменьшенный прирост массы тела по сравнению с мышами, которых лечили гидрогелевым контролем.
Пример 25. Исследование обезьян Супото1диз.
Две Рс-линкер-Р0Р21 конструкции были получены при помощи методологии, описанной в данном изобретении. Одна конструкция содержала Ιβ01 Рс последовательность (8ЕР ΙΌ N0: 11), составленную на С-конце с (01у)5-8ег-(01у)3-8ег-(01у)4-8ег линкерной последовательностью (8ЕР ГО N0: 28), которая была затем составлена с ^концом зрелой Р0Р21 последовательности (8ЕР ГО N0: 4), в которую были введены две мутации, Ь98К и Р1710. Данную молекулу в настоящем примере называют Рс-(Ь15)-Р0Р21
- 60 021425 (Ь98К, Р171С) (8Е0 ΙΌ N0: 43). Вторая конструкция содержала 1дС1 Рс последовательность (8Е0 ГО N0: 11), составленную на С-конце с (С1у)4-8ег-(С1у)4-8ег-(С1у)4-8ег линкерной последовательностью (8Е0 ГО N0: 31), которая затем была составлена с Ν-концом зрелой РСР21 последовательности (8Е0 ГО N0: 4), в которую были введены три мутации, Ь98К, Р171С и А180Е. Данную молекулу в настоящем примере называют Рс-(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е) (8Е0 ГО N0: 47). Данные конструкции затем экспрессировали и очищали так, как описано в данном изобретении, и выделяли в виде димерной формы белка, каждый мономер которого был связан посредством межмолекулярных дисульфидных связей между Рс участками каждого мономера.
25.1. Схема исследования.
Исследование проводили для яванских макак, которые характеризуются ухудшенной толерантностью к глюкозе (1СТ). Возраст обезьян составлял 8-18 лет. Их масса тела находилась в диапазоне 5-15 кг и ИМТ в диапазоне 32-70 кг/м2. 44 обезьяны акклиматизировались в течение 6 недель перед началом введения соединения. В течение периода акклиматизации обезьян обучали 4 раза в неделю в течение 4 недель для ознакомления с процедурами, включая ограничение креслом, подкожную инъекцию (РВ8, 0,1 мл/кг), принудительный откорм (вода, 10 мл/кг), взятие крови из не-0СТТ и 0СТТ проб. Через 4 недели обучения измеряли фоновый 0СТТ и метаболические параметры плазмы. Отбирали 40 из 44 обезьян и рандомизовали на три лечебные группы для достижения аналогичных фоновых уровней массы тела, 0СТТ АИС ответа и уровней глюкозы и триглицеридов в плазме.
Исследование проводили вслепую. Основу (п=14), Рс-(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171С) (п=13) и Рс(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е) (п=13) помечали как соединения А, В и С и вводили раз в неделю посредством подкожной инъекции. Соединения давали, повышая дозы от низкого (0,3 мг/кг), среднего (1 мг/кг) до высокого (3 мг/кг) уровней и дозы повышали каждые три недели. Через 9 недель лечения соединениями животных контролировали еще 3 недели на предмет вымывания соединений и восстановления для лечения. В течение всего исследования контролировали поглощение пищи, массу тела, клиническую химию и 0СТТ. Поглощение пищи измеряли при каждом поглощении пищи. Массу тела измеряли каждую неделю. Пробы крови собирали еженедельно через 5 дней после каждой инъекции для измерения уровней глюкозы, триглицеридов, общего холестерина, липопротеидов высокой и низкой плотности. 0СТТ проводили каждые три недели после начала лечения (в конце каждого уровня дозировок). День начала лечения обозначали как 0 и подробный план исследования приведен на фиг. 64.
Результатами, показанными в данном примере, являются данные, собранные в конце 9 недель лечения.
25.2. Влияние тестовых соединений на поглощение пищи.
Животных кормили дважды в день, каждое животное получало 120 г состава еды, установленного в течение периода акклиматизации. Оставшуюся еду убирали и взвешивали после каждого приема пищи для расчета поглощения пищи. Время кормления находилось от 8:00 до 8:30 (±30 мин) и затем от 16:30 до 17:00 (±30 мин). Для получения блюд каждому животному давали яблоко (150 г) в 23:30-00:30 (±30 мин) каждый день.
По сравнению с основой, как Рс-(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171С), так и Рс-(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е) уменьшали поглощение пищи у обезьян (на фиг. 65, 66 и 67). Рс-(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е) ингибировал поглощение пищи при каждом приеме пищи, включая утренние приемы пищи, фруктовые и вечерние приемы пищи при 0,3 мг/кг доза. Однако эффект уменьшался и поглощение пищи восстанавливалось почти до фонового или контрольного уровней через приблизительно 30 дней лечения при повышении дозы до 1 мг/кг. Рс-(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171С) не оказывал значительного влияния на утреннее поглощение пищи и только умеренно уменьшал поглощение пищи при вечернем приеме пищи при повышении дозы до 1-3 мг/кг. Однако Рс-(Ь15)-РСР21 (Ь98К, Р171С) уменьшал поглощение фруктов аналогично Рс-(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е). В целом, Рс-(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е) демонстрировал более сильное влияние на ингибирование поглощения пищи, чем Рс-(Ь15)РСР21 (Ь98К, Р171С). Влияние на поглощение пищи было кратким и поглощение пищи восстановилось через приблизительно 30 дней лечения.
25.3. Влияние тестовых соединений на массу тела.
Массу тела контролировали еженедельно в течение всего исследования. В течение 9-недельного курса лечения масса тела животных, которых лечили основой, сохранялась постоянной, в то время как масса тела животных, которых лечили Рс-(Ь15)-РСР21 (Ъ98К, Р171С) и Рс-(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е), постепенно снижалась. Рс-(С48)3-РСР21 (Ь98К, Р171С, А180Е) приводил к более выраженному снижению массы тела, чем Рс-(Р15)-РСР21 (Ь98К, Р171С), как показано на фиг. 68.
25.4. Влияние тестовых соединений на индекс массы тела (ИМТ), толщину кожной складки (ТКС) и окружность живота (ОЖ).
ИМТ, ТКС и ОЖ контролировали еженедельно в течение всего исследования, как до, так и после введения тестовых соединений при рассмотрении массы тела. ИМТ определяют как массу тела особи, разделенную на квадрат его или ее роста. ТКС представляет собой толщину двойного слоя кожи и жира под ней, специального калибра, который придает постоянное натяжение этому месту. ИМТ, ТКС и ОЖ являются относительно точными, простыми и недорогими измерениями состава тела, которое является
- 61 021425 особо индикативным в отношении подкожного жира. Животные, которых лечили основой, проявляли относительно стабильные ИМТ, ТКС и ОЖ в течение всего исследования. Животные, которых лечили Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) и Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е), проявляли пониженные уровни ИМТ, ТКС и ОЖ в течение 9-недельного курса исследования, предполагая, что оба соединения привели к снижению массы. Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) были более эффективными и приводили к более выраженному снижению ИМТ, ТКС и ОЖ, чем Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710). Результаты показаны на фиг. 69, 70 и 71 соответственно.
25.5. Влияние тестовых соединений на уровни глюкозы в крови натощак.
Кровь собирали у животных, которых не кормили всю ночь. Сбор крови проводили еженедельно через 5 дней после каждой инъекции. Как Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е), так и Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ъ98К, Р1710) снижали уровни глюкозы в крови натощак. Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) снижал уровни глюкозы в крови натощак при дозе 0,3 мг/кг и максимального уменьшения уровней глюкозы достигали при повышении дозы до 1 мг/кг. Однако Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) приводил только к умеренному снижению уровней глюкозы в крови при наибольших проанализированных дозах (3 мг/кг). Поэтому Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) был более эффективным и приводил к более выраженному уменьшению уровней глюкозы в крови, чем Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710). Ни у кого из обезьян, которых лечили Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) или Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710), не наблюдалось гипогликемии. На фиг. 72 показаны уровни глюкозы в плазме натощак в течение курса исследования.
25.6. Влияние тестовых соединений на пероральный тест на толерантность к глюкозе (00ТТ).
00ТТ проводили перед и после начала лечения. 00ТТ после дозировок проводили каждые три недели для анализа влияния соединений при каждом уровне дозировок. Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) повышал толерантность к глюкозе при всех проанализированных дозах от 0,3 до 3 мг/кг. Уровни глюкозы были уменьшены и повышение уровней глюкозы после болюсной глюкозной стимуляции увеличилось в ответ на лечение Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е). Отсутствовал ответ на дозировку, что предполагает, что Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) достигал максимального влияния при дозе 0,3 мг/кг. Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) приводил только к улучшению переносимости глюкозы при дозе 1 мг/кг и было непонятно, почему влияние уменьшалось при повышении дозы до 3 мг/кг. На фиг. 73 показаны профили кривых до и после 00ТТ и площадь под кривой 00ТТ.
25.7. Влияние тестовых соединений на уровни триглицеридов.
Кровь собирали у животных, которых не кормили всю ночь. Сбор крови проводили еженедельно через 5 дней после каждой инъекции. Уровни триглицеридов были значительно снижены у животных, которых лечили Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) или Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710). Однако Рс(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) был более эффективным, чем Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710). Рс(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) приводил к максимальному уменьшению уровней триглицеридов в плазме при 0,3 мг/кг, в то время как Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) приводил только к промежуточному снижению уровней триглицеридов при наивысшей анализируемой дозе (3 мг/кг). На фиг. 74 показаны уровни триглицеридов в плазме натощак во время исследования.
25.8. Влияние тестовых соединений на уровни общего холестерина и липопротеидов высокой плотности.
Кровь собирали у животных, которых не кормили всю ночь. Сбор крови проводили еженедельно через 5 дней после каждой инъекции. Уровни общего холестерина и липопротеидов высокой плотности в плазме имеют тенденцию к повышению после лечения Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) или Рс(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710). На фиг. 75 и 76 показаны уровни общего холестерина и липопротеидов высокой плотности во время исследования.
25.9. Выводы.
В исследовании с увеличением дозы, которое проводили у обезьян 10Т суиото1ди8, животные, которых лечили Рс конъюгированными Р0Р21 мутантами, а именно Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) и Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710), проявляли улучшенные метаболические параметры. Масса тела была снижена, а состав тела был улучшен. Наблюдали кратковременное снижение поглощения пищи, и поглощение пищи восстанавливалось от фонового значения или контрольных уровней в середине исследования. Уровни глюкозы и триглицеридов в крови натощак были также снижены обоими соединениями, Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) или Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710). 00ТТ было улучшено и уровни липопротеидов высокой плотности были слегка повышены. По сравнению с Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710), Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) превосходил Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710) по всем параметрам, измеренным при любых анализируемых дозах. Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) достигал максимального влияния для большинства из параметров при введении при 0,3 мг/кг. Поэтому терапевтически эффективная доза Рс-(048)3-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) у высших видов может быть менее 0,3 мг/кг.
Пример 26. Исследование стабильности у обезьян Суиото1ди8.
Данное исследование было разработано для определения того, являлся ли Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710, А180Е) (8ЕЦ ГО N0: 57) более резистентным к протеазам, чем Рс-(Ь15)-Р0Р21 (Ь98К, Р1710)
- 62 021425 (ЗЕО ΙΌ ЫО: 43). Наблюдали карбоксиконцевой процессинг после Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) инъекций мышам или обезьянам, как показано в примере 21. Распад приводил к последующей потере 1-3 аминокислотных остатков в С-конце. Попытки кэппирования С-конца или введения дополнительных мутаций в С-конец Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) приводили к получению большей молекулы Рс-(Ь15)РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е). Данное исследование было разработано для оценки того, имел ли Рс(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) повышенную стабильность ίη У1уо по сравнению с Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О).
Были получены конструкции Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О). Данные конструкции содержали 1дО1 Рс последовательность (ЗЕО ГО ЫО: 11), соединенную на С-конце с (О1у)5-Зег-(О1у)3-Зег-(О1у)4-Зег линкерной последовательностью (ЗЕО ГО ЫО: 28), которую затем соединяли с Ы-концом зрелой РОР21 последовательности (ЗЕО ГО ЫО: 4), в которую вводили две мутации, Ь98К, Р171О, или три мутации, Ь98К, Р171О и А180Е. Данные конструкции затем экспрессировали и очищали, как описано в данном изобретении, и выделяли в виде димерной формы белка, каждый мономер которого был связан посредством межмолекулярных дисульфидных связей между Рс участком каждого мономера.
Стабильность ίη У1уо Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) сравнивали с обезьянами суиото1дик мужского рода. Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) вводили путем внутривенной инъекции обезьянам супотофик при 23,5 мг/кг. Пробы крови собирали в различные моменты времени после одной внутривенной инъекции. Масс-спектрометрию иммуноаффиности МАЛДИ-ТОР использовали для контроля метаболитов в каждый момент времени после инъекции. Результаты показаны на фиг. 77.
По сравнению с Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О), Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) продемонстрировала уменьшенный С-концевой распад с меньшими детектируемыми масс-пиками, прилегающими к родительскому пику интактной молекулы, предполагая, что А180Е мутация замедляла распад Сконцевой пептидазы. Также наблюдались большие усечения с потерями масс, оцененные при [1-376], [1394] и [1-401] и сайты, соответствующие 133-134, 153-154 и 158-159 в РОР21 полипептидной последовательности. Внутреннее эндопептидазное клипирование вносило вклад в общий метаболизм как Рс-(Ь15)РОР21 (Ь98К, Р171О), так и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е), и А180Е мутация не оказывала значительного влияния на скорость внутреннего эндопептидазного распада.
Для повышения разрешения и обеспечения подробностей распадной смеси, ЬС-МЗ масс спектрометрия ММР (мониторинга множественных реакций) также была проведена для мониторинга различных форм С-концевых фрагментов распада. Пробы обезьян афинно очищали и затем подвергали Акр-Ы дигестии. С-концевые дигестированные пептиды затем контролировали при помощи ММР. Результаты для различных форм С-концевых фрагментов распада выражены как количество относительно полноразмерных пептидных видов (%), показанных на фиг. 78. В соответствии со спектрами МАЛДИ, ММР полуколичественный анализ С-концевых фрагментов также продемонстрировал уменьшенную относительную встречаемость пептидных фрагментов, в которых отсутствует 1-3 аминокислоты в С-конце и повышенную относительную встречаемость интактной молекулы у обезьян, которым вводили Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) по сравнению с Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О).
Таким образом, Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) проявляет уменьшенный С-концевой распад и повышенную стабильность ίη У1уо по сравнению с Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) у обезьян суиото1дик.
Пример 27. Фармакокинетика Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) у мышей.
Данное исследование было разработано для оценки фармакокинетики Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) (ЗЕО ГО ЫО: 57) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) (ЗЕО ГО ЫО: 43) после одной внутривенной дозы мышам С57ВЬ/6.
Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) давали при 20 мг/кг посредством внутривенной инъекции. Пробы крови собирали через 0,083 (5 мин) и через 1, 4, 8, 16, 24, 48, 72, 96, 168 и 240 ч после дозировок. Для определения концентраций в плазме интактной полноразмерной молекулы был разработан анализ ЕЫЗА с иммунореактивностью, направленной на Ы-концевой и Сконцевой РОР21. Анализ отслеживает полноразмерную интактную молекулу с незначительными примесями других продуктов распада. Концентрации в плазме интактной Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) и Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) в течение 240-часового периода после внутривенной инъекции у мышей показаны на фиг. 79.
Концентрации в плазме Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) были значительно выше, чем концентрации Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О), введенные при том же самом уровне доз через 24-168 ч после инъекции. Значительное количество Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) было измеримым через 168 ч после инъекции у мышей. В результате Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) показала повышенное покрытие АИС и период полувыведения в плазме в 2 раза по сравнению с Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) у мышей. Период полувыведения Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О, А180Е) составлял 16,6 ч и период полувыведения Рс-(Ь15)-РОР21 (Ь98К, Р171О) составлял 9,4 ч. Оба соединения были ниже детектируемого
- 63 021425 уровня через 240 ч после дозировки.
Пример 28. Получение ^связанных мутантов гликозилирования для повышения растворимости или уменьшения С-концевого клипирования для повышения периода полувыведения.
РОР21 мутанты были разработаны и получены для создания возможных ^связанных сайтов гликозилирования для экспрессии млекопитающими с минимальным разрушением нативной аминокислотной последовательности. Сконструированные мутанты включают РОР21 (Υ179Κ, 8181Т) (8ЕЦ ГО N0: 161), РОР21 Υ179N (8ЕЦ ГО N0: 163) и РОР21 Р1248 (8ЕЦ ГО N0: 165).
Экспрессию мутантов выполняли кратковременно в 293-6Е клетках, и кондиционированные среды анализировали на активность в анализе ЕЬК-люциферазы ш νίΐτο. Анализы ЕЬК-люциферазы выполняли так, как описано в примере 4, за исключением того, что использовали последовательные разведения кондиционированных сред, а не различные концентрации очищенных белков.
Анализ кондиционированных сред выявил, что повышенное гликозилирование по сравнению с диким типом не было достигнуто в системах временной экспрессии. На фиг. 80 показаны результаты анализа ЕЬК-люциферазной активности. Результаты, показанные на фиг. 80, демонстрируют, что РОР21 Р1248 мутант не оказывал негативного влияния на активность РОР21, но на активность РОР21 Υ179N и РОР21 (У179Ю 8181Т) мутантов, в отсутствие гликозилирования, что приводило к пониженной активности, по оценкам анализа ЕЬК-люциферазы.
Хотя настоящее изобретение было описано на основе различных вариантов его осуществления, квалифицированные специалисты поймут, что вполне возможны его вариации и модификации. Таким образом, надо понимать, что прилагаемая формула изобретения охватывает все равноценные вариации, которые относятся к сфере действия настоящего изобретения, заявленного в данном документе. В дополнение к этому следует упомянуть, что заголовки разделов, использованные в данном документе, даны только в организационных целях и на должны восприниматься как ограничивающие описанный здесь предмет обсуждения.
Все источники, процитированные в этом патенте, явным образом включены в настоящий документ в качестве ссылок в любых целях.

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Полипептид, содержащий:
    (a) полипептид 8ЕЦ ГО N0: 4, при этом:
    (ί) лейцин в положении 98 замещен на аргинин;
    (ίί) пролин в положении 171 замещен на глицин;
    (ίίί) аланин в положении 180 замещен на глутаминовую кислоту;
    (b) линкерную последовательность, содержащую 8ЕЦ ГО N0: 31;
    (c) Рс домен, содержащий 8ЕЦ ГО N0: 11.
  2. 2. Полипептид, содержащий последовательность 8ЕЦ ГО N0: 47.
  3. 3. Фармацевтическая композиция, содержащая выделенный полипептид по п. 1 или 2 и фармацевтически приемлемый формообразующий агент.
  4. 4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемым формообразующим агентом является гидрогель.
  5. 5. Способ снижения содержания глюкозы в крови у пациента, страдающего метаболическим расстройством, включающий введение пациенту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.3.
  6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что метаболическим расстройством является диабет 2 типа.
  7. 7. Способ по п.5, отличающийся тем, что метаболическим расстройством является ожирение.
  8. 8. Способ лечения диабета 2 типа, включающий введение пациенту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.3.
  9. 9. Способ снижения уровня триглицеридов натощак у пациента, включающий введение пациенту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.3.
  10. 10. Способ повышения уровня липопротеинов высокой плотности (НОЬ)-холестерина у пациента, включающий введение пациенту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.3.
  11. 11. Способ улучшения толерантности к глюкозе у пациента, включающий введение пациенту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.3.
  12. 12. Полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что полипептид 8ЕЦ ГО N0: 4 содержит:
    (a) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови у млекопитающего;
    (b) карбоксиконцевое усечение не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови у млекопитающего; или (c) аминоконцевое усечение не более чем 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение
    - 64 021425 не более чем 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови у млекопитающего.
  13. 13. Полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что полипептид ковалентно связан с одним или более полимерами.
  14. 14. Полипептид по п.13, отличающийся тем, что полимер представляет собой ПЭГ.
  15. 15. Полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью 8Ер ΙΌ N0: 46.
  16. 16. Нуклеиновая кислота, кодирующая:
    (a) полипептид 8Ер ΙΌ N0: 4, при этом:
    (ΐ) лейцин в положении 98 замещен на аргинин;
    (ΐΐ) пролин в положении 171 замещен на глицин;
    (ш) аланин в положении 180 замещен на глутаминовую кислоту;
    (b) линкерную последовательность, содержащую 8Ер ΙΌ N0: 31;
    (c) Рс домен, содержащий 8Ер ΙΌ N0: 11.
  17. 17. Нуклеиновая кислота по п.16, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота содержит 8Ер ΙΌ N0: 46.
  18. 18. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.17.
  19. 19. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.18.
  20. 20. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид 8Ер ΙΌ N0: 47.
  21. 21. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотиды 1-1272 последовательности 8Ер ΙΌ N0: 46.
EA201171220A 2009-05-05 2010-05-04 Мутанты fgf21 и их применение EA021425B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17573609P 2009-05-05 2009-05-05
US28511809P 2009-12-09 2009-12-09
PCT/US2010/033478 WO2010129503A1 (en) 2009-05-05 2010-05-04 Fgf21 mutants and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201171220A1 EA201171220A1 (ru) 2012-05-30
EA021425B1 true EA021425B1 (ru) 2015-06-30

Family

ID=42455356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201171220A EA021425B1 (ru) 2009-05-05 2010-05-04 Мутанты fgf21 и их применение

Country Status (37)

Country Link
US (4) US8188040B2 (ru)
EP (3) EP2427208B1 (ru)
JP (1) JP5823954B2 (ru)
KR (2) KR101860572B1 (ru)
CN (2) CN107188950B (ru)
AR (1) AR076541A1 (ru)
AU (1) AU2010246108B2 (ru)
BR (1) BRPI1011404B1 (ru)
CA (1) CA2760196C (ru)
CL (1) CL2011002768A1 (ru)
CO (1) CO6470863A2 (ru)
CR (1) CR20110639A (ru)
DK (1) DK3248610T3 (ru)
EA (1) EA021425B1 (ru)
ES (2) ES2969528T3 (ru)
FI (1) FI3248610T3 (ru)
HK (1) HK1247134A1 (ru)
HR (1) HRP20240135T1 (ru)
HU (1) HUE065036T2 (ru)
IL (2) IL215937A (ru)
JO (1) JO3469B1 (ru)
LT (1) LT3248610T (ru)
MA (1) MA33716B1 (ru)
MX (1) MX2011011709A (ru)
MY (1) MY156542A (ru)
NZ (1) NZ596037A (ru)
PE (2) PE20120358A1 (ru)
PH (1) PH12015502433B1 (ru)
PL (1) PL3248610T3 (ru)
PT (1) PT3248610T (ru)
RS (1) RS65153B1 (ru)
SG (3) SG10201707763PA (ru)
SI (1) SI3248610T1 (ru)
TW (2) TWI560197B (ru)
UY (2) UY38740A (ru)
WO (1) WO2010129503A1 (ru)
ZA (1) ZA201108371B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2752530C2 (ru) * 2015-08-03 2021-07-29 Новартис Аг Способы лечения расстройств, связанных с fgf21

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20190083A1 (ar) * 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
UA105016C2 (ru) 2008-10-10 2014-04-10 Амген Інк. Fgf21 мутанты и их применение
EP2427207B1 (en) 2009-05-05 2017-08-16 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
KR101860572B1 (ko) * 2009-05-05 2018-05-24 암젠 인크 Ｆｇｆ２１ 돌연변이체 및 이의 용도
CA2764835A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 Amgen Inc. Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof
EP2506861A1 (en) 2009-12-02 2012-10-10 Amgen Inc. Binding proteins that bind to human fgfr1c, human b-klotho and both human fgfr1c and human b-klotho
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
JP2013523184A (ja) 2010-04-15 2013-06-17 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質
AU2011239386B2 (en) 2010-04-16 2015-03-19 Salk Institute For Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using FGF
US20140189893A1 (en) * 2011-05-10 2014-07-03 Amgen Inc. Method of identifying compounds that specifically modulate the interaction of fgfr1 and beta klotho
CN105601748B (zh) 2011-07-01 2021-08-27 恩格姆生物制药公司 用于代谢病症和疾病治疗的组合物、应用和方法
MX2014002260A (es) * 2011-08-31 2014-08-18 Amgen Inc Factor de crecimiento de fibroblasto 21 para usar en el tratamiento de diabetes tipo 1.
AU2015202304C1 (en) * 2011-09-26 2017-03-09 Novartis Ag Fusion proteins for treating metabolic disorders
US9458214B2 (en) 2011-09-26 2016-10-04 Novartis Ag Dual function fibroblast growth factor 21 proteins
JO3476B1 (ar) * 2011-09-26 2020-07-05 Novartis Ag بروتينات مندمجة لعلاج الاضطرابات الايضية
AR087973A1 (es) 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
WO2013131091A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 New York University Chimeric fgf21 proteins with enhanced binding affinity for beta-klotho for the treatment of type ii diabetes, obesity and related metabolic disorders
EP2830646B1 (en) 2012-03-27 2018-03-07 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
AU2013263349B2 (en) 2012-05-17 2016-09-08 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
TWI513705B (zh) 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
WO2013188182A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 variants
WO2014085365A2 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
CN105008548B (zh) 2012-12-27 2020-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态以及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
WO2014120619A2 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use in treating metabolic disorders
WO2014130659A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
WO2015057908A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Novartis Ag Methods of treating diabetes and related disorders
US9925241B2 (en) 2013-10-21 2018-03-27 Salk Institute For Biological Studies Mutated fibroblast growth factor (FGF) 1 and methods of use
NZ718962A (en) 2013-10-28 2019-12-20 Ngm Biopharmaceuticals Inc Cancer models and associated methods
ES2808340T3 (es) 2014-01-24 2021-02-26 Ngm Biopharmaceuticals Inc Anticuerpos que se unen al dominio de beta klotho 2 y procedimientos de uso de los mismos
US20170065678A1 (en) 2014-03-11 2017-03-09 Novartis Ag Methods of treating metabolic disorders associated with lipodystrophies and defects in insulin production or signaling
EP3122776B1 (en) 2014-03-25 2021-04-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fgf21 receptor agonists and uses thereof
CN103923207B (zh) * 2014-04-08 2016-03-09 东北农业大学 一种fgf-21突变体蛋白的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝中的应用
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
WO2015195509A2 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
CN106573966B (zh) 2014-07-30 2022-03-01 Ngm生物制药有限公司 用于治疗代谢异常的组合物和方法
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
CA2964463C (en) 2014-10-22 2024-02-13 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
IL251834B2 (en) 2014-10-23 2023-09-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Pharmaceutical compositions containing peptide variants and methods of using them
MD20170035A2 (ru) 2014-10-31 2017-09-30 Ngm Biopharmaceuticals Inc Композиции и методы применения для лечения метаболических расстройств
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
TWI681966B (zh) 2014-12-23 2020-01-11 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 Ｆｇｆ２１衍生物及其用途
KR20160088656A (ko) 2015-01-16 2016-07-26 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
US20180071981A1 (en) * 2015-03-31 2018-03-15 The Regents Of The University Of California System and method for tunable patterning and assembly of particles via acoustophoresis
US10800843B2 (en) 2015-07-29 2020-10-13 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Beta klotho-binding proteins
US20180280474A1 (en) * 2015-10-01 2018-10-04 Amgen Inc. Treatment of bile acid disorders
RU2741345C2 (ru) * 2015-10-28 2021-01-25 Юхан Корпорейшн Белки с двойной функцией и содержащая их фармацевтическая композиция
SI3368554T1 (sl) * 2015-10-28 2020-10-30 Yuhan Corporation Dolgo-delujoči FGF21 fuzijski proteini in farmacevtski sestavek, ki obsega le-te
CA3002400A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Salk Institute For Biological Studies Treatment of steroid-induced hyperglycemia with fibroblast growth factor (fgf) 1 analogs
CA3082794A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Ngm Biopharmaceuticals Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
TW201731867A (zh) 2015-12-02 2017-09-16 賽諾菲公司 Ｆｇｆ２１變異體
TWI815793B (zh) 2016-03-31 2023-09-21 美商恩格姆生物製藥公司 結合蛋白質及其使用方法
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
EP3502143A4 (en) 2016-08-19 2020-07-15 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN
CN107759696A (zh) 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
US20190201491A1 (en) * 2016-08-22 2019-07-04 Elanco Us Inc. Bovine fibroblast growth factor 21 and ketosis in dairy cattle
EP3503882A4 (en) 2016-08-26 2020-07-29 NGM Biopharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-19-MEDIATED CARCINOMAS AND TUMORS
AU2017358289A1 (en) 2016-11-10 2019-06-20 Yuhan Corporation Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins
JP7309606B2 (ja) 2016-12-22 2023-07-18 サノフイ 活性比が最適化されたｆｇｆ２１化合物／ｇｌｐ－１ｒアゴニスト組合せ物
JP7191850B2 (ja) 2017-04-21 2022-12-19 ユーハン・コーポレイション デュアル機能タンパク質およびその誘導体を生産するための方法
CN107056925B (zh) 2017-04-28 2022-01-14 中国科学院合肥物质科学研究院 人fgf21突变体、其制备方法及用途
US20220315919A1 (en) * 2017-10-27 2022-10-06 Svar Life Science Ab Secreted Reporter-Peptides for Optimizing Cell-Based Assays for Analysis on Immuno-Assay Platforms
US11679143B2 (en) * 2018-02-08 2023-06-20 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. FGF21 variant, fusion protein and application thereof
EP3817720A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Bristol-Myers Squibb Company Fgf21 formulations
CN109836486B (zh) * 2019-01-30 2020-09-08 北京双因生物科技有限公司 成纤维生长因子21变体、其融合蛋白及其用途
KR20210137093A (ko) * 2019-03-05 2021-11-17 선샤인 레이크 파르마 컴퍼니 리미티드 폴리펩티드 분자 및 이의 적용
CN111944055B (zh) 2019-05-16 2022-08-02 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
CN113583142A (zh) * 2021-08-20 2021-11-02 赣江中药创新中心 双靶点融合蛋白、编码基因、载体或宿主细胞及其应用与表达和纯化方法
KR20240053591A (ko) * 2021-09-08 2024-04-24 레토 래버러토리즈 컴퍼니 리미티드 Fgf21 돌연변이 단백질 및 이의 응용
CN117813323A (zh) 2021-09-23 2024-04-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗klb抗体及用途
CA3233918A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Mariana N. Dimitrova Pharmaceutical compositions of efruxifermin
WO2024059507A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 Akero Therapeutics, Inc. Fgf21 mutant polypeptides
CN116675780A (zh) * 2023-06-02 2023-09-01 东北农业大学 犬成纤维细胞生长因子21融合蛋白制备及其在治疗特应性皮炎中的用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028595A2 (en) * 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006065582A2 (en) * 2004-12-14 2006-06-22 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2009149171A2 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof

Family Cites Families (160)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
CA1310924C (en) 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990006952A1 (en) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5288855A (en) 1989-01-23 1994-02-22 Farmitalia Carlo Erba Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor
ES2133271T3 (es) 1989-07-06 1999-09-16 Univ California Receptores para factores de crecimiento de fibroblastos.
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
CA2071989C (en) 1989-12-22 1999-07-27 Scott C. Chappel Endogenous gene expression modification with regulatory element
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5672510A (en) 1990-01-19 1997-09-30 Genetic Therapy, Inc. Retroviral vectors
JP3615220B2 (ja) 1990-07-06 2005-02-02 アヴェンティス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 繊維芽細胞生育因子受容体
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5217889A (en) 1990-10-19 1993-06-08 Roninson Igor B Methods and applications for efficient genetic suppressor elements
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5229501A (en) 1991-01-11 1993-07-20 Chiron Corporation Expression and use of human fibroblast growth factor receptor
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
IL100219A0 (en) 1991-12-02 1992-09-06 Yeda Res & Dev Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
US5234784A (en) 1992-04-01 1993-08-10 Eastman Kodak Company Method of making a projection viewable transparency comprising an electrostatographic toner image
US5364791A (en) 1992-05-14 1994-11-15 Elisabetta Vegeto Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations
ES2091018T3 (es) 1992-06-18 1996-10-16 Whittier Inst Diabetes & Endoc Procedimiento para la deteccion de enfermedades neoplasicas.
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US5489743A (en) 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
GB9313210D0 (en) * 1993-06-25 1993-08-11 Sandoz Ltd Novel combinations
US6664107B1 (en) 1993-05-26 2003-12-16 Ontario Cancer Institute, University Health Network CD45 disrupted nucleic acid
CA2161015A1 (en) 1993-05-26 1994-12-08 Tak Wah Mak Transgenic mammals lacking expression of particular cd45 isoforms
US5589362A (en) 1993-06-14 1996-12-31 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities
EP0705334A1 (en) 1993-06-14 1996-04-10 Basf Aktiengesellschaft Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US5654168A (en) 1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units
US5469743A (en) * 1993-06-24 1995-11-28 Zorn; Roger H. Dynamic surface wave roll inspection device
DK0802800T3 (da) 1993-08-12 2002-10-07 Neurotech Sa Biokompatible immunoisolatoriske kapsler indeholdende genetisk ændrede celler for levering af biologisk aktive molekyler
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5654166A (en) * 1994-11-09 1997-08-05 Kurth; Gerhard P. Process of preparing hormone-free bovine cartilage for dosage form
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU711391B2 (en) 1995-05-26 1999-10-14 Syngenta Limited A gene switch comprising an ecdysone receptor
EP0832269A1 (en) 1995-06-07 1998-04-01 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
CA2219080A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamycin-based regulation of biological events
US5849303A (en) 1995-06-07 1998-12-15 American Home Products Corporation Recombinant feline Immunodeficiency virus subunit vaccines employing baculoviral-expressed envelope glycoproteins derived from isolate NCSU-1 and their use against feline immunodeficiency virus infection
AU2192797A (en) 1996-02-28 1997-09-16 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Synthetic derivatives of rapamycin as multimerising agents for chimeric proteins with immunophilin derived domains
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5679559A (en) 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
US6214795B1 (en) 1996-11-12 2001-04-10 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity
AU739057B2 (en) 1996-12-26 2001-10-04 Shirankai Kyoto University Faculty Of Medicine Alumni Association Inc. Novel polypeptide, novel DNA, and novel antibody
EP0861900A1 (en) * 1997-02-21 1998-09-02 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Immunological detection of prions
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
US6150096A (en) * 1997-09-26 2000-11-21 Universite De Sherbrooke Molecular markers for the diagnosis of human diseases including Crohn's disease
DK1032668T3 (da) 1997-11-25 2008-09-29 Genentech Inc Fibroblast vækstfaktor 19
US6150098A (en) 1998-02-20 2000-11-21 Amgen Inc. Methods for identifying novel secreted mammalian polypeptides
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2000027885A1 (fr) 1998-11-05 2000-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau popypeptide chimerique
WO2000046380A2 (en) 1999-02-08 2000-08-10 Chiron Corporation Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion
CA2367375A1 (en) 1999-03-15 2000-09-21 Chiron Corporation Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
WO2001018209A1 (en) 1999-09-10 2001-03-15 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
WO2001032678A1 (en) 1999-11-05 2001-05-10 Smithkline Beecham Corporation sbgFGF-19a
CA2392103A1 (en) 1999-11-18 2001-05-25 Chiron Corporation Human fgf-21 gene and gene expression products
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
AU1628101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor
US7108984B2 (en) 2000-01-12 2006-09-19 Mount Sinai School Of Medicine Methods of identifying modulators of the FGF receptor
US20020081663A1 (en) 2000-01-05 2002-06-27 Conklin Darrell C. Novel FGF homolog ZFGF11
AU2631001A (en) 2000-01-05 2001-07-16 Zymogenetics Inc. Novel fgf homolog zfgf11
WO2001072957A2 (en) 2000-03-31 2001-10-04 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
JP2002112772A (ja) 2000-07-10 2002-04-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20040018499A1 (en) 2001-06-06 2004-01-29 Lal Preeti G Extracellular messengers
AU2002314495A1 (en) 2001-06-20 2003-01-02 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
DE60236522D1 (de) 2001-07-11 2010-07-08 Maxygen Inc G-csf konjugate
US20040259780A1 (en) 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
US20050187150A1 (en) 2001-10-31 2005-08-25 New York University Structure-based design and synthesis of FGF inhibitors and FGF modulator compounds
US20050176631A1 (en) 2002-01-15 2005-08-11 Heuer Josef G. Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
JP2005530687A (ja) 2002-01-31 2005-10-13 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ Ｆｇｆｒアゴニスト
EP1332761A1 (en) 2002-01-31 2003-08-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonists of fibroblast growth factor receptors (FGFR)
IL149562A0 (en) 2002-05-09 2002-11-10 Prochon Ltd Fgf variants and methods for use thereof
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
WO2004022095A1 (en) 2002-09-04 2004-03-18 Abtech Anti-idiotypic antibodies as vegf or fgf agonists for bone therapy
US20060263774A1 (en) 2002-11-01 2006-11-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CA2510715A1 (en) 2002-12-20 2004-07-08 Enkam Pharmaceuticals A/S Method of modulation of interaction between receptor and ligand
TWI300430B (en) * 2003-01-10 2008-09-01 Ritek Corp Optical recording medium dye and optical recording medium using thereof
ATE490534T1 (de) * 2003-01-23 2010-12-15 Lg Electronics Inc Aufzeichnungsmedium mit in abstunden oder abwechselnd gewobbleten pits und vorrichtung und verfahren zur herstellung, aufzeichnung und wiedergabe des aufzeichnungsmediums
WO2004083381A2 (en) 2003-03-13 2004-09-30 Indiana University Advanced Research & Technology Institute Fibroblast growth factor receptor-1 polynucleotides, polypeptides, and mutants
JP2006240990A (ja) 2003-05-15 2006-09-14 Kirin Brewery Co Ltd ｋｌｏｔｈｏタンパク質および抗ｋｌｏｔｈｏタンパク質抗体ならびにそれらの用途
DK1641483T3 (da) 2003-06-12 2008-06-02 Lilly Co Eli Fusionsproteiner
AU2004251145C1 (en) 2003-06-12 2011-04-14 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion proteins
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
PL1680140T3 (pl) 2003-10-16 2011-11-30 Imclone Llc Inhibitory receptora-1 czynnika wzrostu fibroblastów i związane z nim sposoby leczenia
EA200601121A1 (ru) 2003-12-10 2006-10-27 Эли Лилли Энд Компани Мутеины фактора роста фибробластов 21
CA2550245A1 (en) 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
EP1727559A1 (en) 2004-01-26 2006-12-06 Eli Lilly And Company Use of fgf-21 and a thiazolidinedione for treating type 2 diabetes
US7887790B2 (en) * 2004-02-20 2011-02-15 Cornell Research Foundation, Inc. Polymers and polymer coatings
EP1735340A2 (en) 2004-03-17 2006-12-27 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
JP4505631B2 (ja) 2004-03-31 2010-07-21 独立行政法人産業技術総合研究所 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物
US7576190B2 (en) 2004-05-13 2009-08-18 Eli Lilly And Company FGF-21 fusion proteins
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
US20080176790A1 (en) 2004-10-29 2008-07-24 Defrees Shawn Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf)
WO2006078463A2 (en) 2005-01-21 2006-07-27 Eli Lilly And Company Method for treating cardiovascular disease
JP2006246823A (ja) 2005-03-11 2006-09-21 Kyoto Univ 造血因子としてのＦｇｆ２１の使用
WO2006130527A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Novartis Ag Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1
CA2614039C (en) 2005-07-22 2015-10-13 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating disease with fgfr fusion proteins
WO2007021423A2 (en) 2005-08-15 2007-02-22 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US7395962B2 (en) 2005-10-28 2008-07-08 United Parcel Service Of America, Inc. Pick up notice and method of using same
US8043833B2 (en) 2005-10-31 2011-10-25 Novo Nordisk A/S Expression of soluble therapeutic proteins
WO2007056789A1 (en) 2005-11-16 2007-05-24 Dier Corporation As Trustee For The Reid Family Superannuation Trust New frame assemblies for security screens
US20090142336A1 (en) 2006-02-28 2009-06-04 Trustees Of Boston University Metabolic regulators and uses thereof
WO2007144893A2 (en) 2006-06-15 2007-12-21 Fibron Ltd. Antibodies blocking fibroblast growth factor receptor activation and methods of use thereof
US20080242607A1 (en) 2006-07-21 2008-10-02 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
SG177225A1 (en) 2006-12-01 2012-01-30 Agency Science Tech & Res Cancer-related protein kinases
PL2068909T3 (pl) 2007-03-30 2012-09-28 Ambrx Inc Modyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowanie
SI2550972T1 (en) 2007-04-02 2018-05-31 Genentech, Inc. An antibody called Klotho-beta agonist for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance
WO2008123625A1 (ja) 2007-04-06 2008-10-16 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 補助因子による受容体の活性化方法並びにリガンド活性の利用方法
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
EP2152295B1 (en) 2007-05-08 2018-04-18 Tel HaShomer Medical Research Infrastructure and Services Ltd. Klotho protein and related compounds for the treatment of cancer
JP2010529954A (ja) 2007-05-22 2010-09-02 ノバルティス アーゲー Ｆｇｆ２１関連障害を処置、診断および検出する方法
CA2689242C (en) 2007-05-29 2015-07-07 Kohzoh Imai Agent and method for treatment of cancer
CN101778937A (zh) 2007-06-04 2010-07-14 诺和诺德公司 使用n-乙酰葡糖胺转移酶的o-联糖基化
JP2010535781A (ja) 2007-08-03 2010-11-25 イーライ リリー アンド カンパニー 肥満に対する処置
US20090038530A1 (en) 2007-08-08 2009-02-12 Thieu Truong Watercraft drogue system
US8426396B2 (en) 2008-01-08 2013-04-23 Shriners Hospitals For Children Treatment for achondroplasia
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
WO2009117622A2 (en) 2008-03-19 2009-09-24 Ambrx, Inc. Modified fgf-23 polypeptides and their uses
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
CN102171343B (zh) 2008-08-04 2017-07-14 戊瑞治疗有限公司 Fgfr细胞外结构域酸性区突变蛋白
EP2427207B1 (en) 2009-05-05 2017-08-16 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
KR101860572B1 (ko) 2009-05-05 2018-05-24 암젠 인크 Ｆｇｆ２１ 돌연변이체 및 이의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028595A2 (en) * 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006065582A2 (en) * 2004-12-14 2006-06-22 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2009149171A2 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Amgen Inc. Fgf21 mutants and uses thereof

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2752530C2 (ru) * 2015-08-03 2021-07-29 Новартис Аг Способы лечения расстройств, связанных с fgf21
US11236159B2 (en) 2015-08-03 2022-02-01 Novartis Ag Methods of treating FGF21-associated disorders
US11802152B2 (en) 2015-08-03 2023-10-31 Novartis Ag Methods of treating FGF21-associated disorders

Also Published As

Publication number Publication date
ES2969528T3 (es) 2024-05-21
BRPI1011404B1 (pt) 2022-05-03
PE20120358A1 (es) 2012-04-26
US20120178685A1 (en) 2012-07-12
IL215937A0 (en) 2011-12-29
TWI560197B (en) 2016-12-01
SG10201707763PA (en) 2017-11-29
US20120177646A1 (en) 2012-07-12
US20100285131A1 (en) 2010-11-11
ZA201108371B (en) 2012-07-25
TWI436776B (zh) 2014-05-11
CL2011002768A1 (es) 2012-08-24
EP2427208A1 (en) 2012-03-14
JP2012525844A (ja) 2012-10-25
EP3248610A1 (en) 2017-11-29
SG10201402038WA (en) 2014-07-30
IL242377A (en) 2016-12-29
PH12015502433A1 (en) 2017-01-16
MY156542A (en) 2016-02-26
CN107188950A (zh) 2017-09-22
EP4353247A2 (en) 2024-04-17
KR101860572B1 (ko) 2018-05-24
DK3248610T3 (da) 2024-01-15
AU2010246108A1 (en) 2011-11-24
BRPI1011404A2 (pt) 2016-03-15
FI3248610T3 (fi) 2024-01-18
WO2010129503A1 (en) 2010-11-11
UY38740A (es) 2020-12-31
MX2011011709A (es) 2012-02-29
ES2632742T3 (es) 2017-09-15
TW201446793A (zh) 2014-12-16
KR20120068764A (ko) 2012-06-27
UY32607A (es) 2010-12-31
PE20160718A1 (es) 2016-08-03
HK1247134A1 (zh) 2018-09-21
EP2427208B1 (en) 2017-04-26
NZ596037A (en) 2013-10-25
US8795985B2 (en) 2014-08-05
CN107188950B (zh) 2021-09-28
EP3248610B1 (en) 2023-12-20
HUE065036T2 (hu) 2024-04-28
CR20110639A (es) 2012-01-06
PL3248610T3 (pl) 2024-04-02
MA33716B1 (fr) 2012-11-01
JP5823954B2 (ja) 2015-11-25
AU2010246108B2 (en) 2014-10-23
IL215937A (en) 2015-11-30
PT3248610T (pt) 2024-02-01
SI3248610T1 (sl) 2024-03-29
CN102655877B (zh) 2017-04-05
CN102655877A (zh) 2012-09-05
SG175861A1 (en) 2011-12-29
CO6470863A2 (es) 2012-06-29
EA201171220A1 (ru) 2012-05-30
CA2760196A1 (en) 2010-11-11
HRP20240135T1 (hr) 2024-04-12
LT3248610T (lt) 2024-01-25
PH12015502433B1 (en) 2017-01-16
JO3469B1 (ar) 2020-07-05
CA2760196C (en) 2019-02-26
US8618053B2 (en) 2013-12-31
US8835385B2 (en) 2014-09-16
TW201105345A (en) 2011-02-16
US20120213779A1 (en) 2012-08-23
RS65153B1 (sr) 2024-02-29
KR20180014235A (ko) 2018-02-07
AR076541A1 (es) 2011-06-22
US8188040B2 (en) 2012-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021425B1 (ru) Мутанты fgf21 и их применение
JP7191076B2 (ja) Ｆｇｆ２１突然変異体及びその使用
US9493530B2 (en) FGF21 mutants comprising a mutation at position 98, 171 and/or 180
AU2014202582A1 (en) FGF21 mutants and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM