ES2632742T3

ES2632742T3 - Mutantes de FGF21 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2632742T3
Application number: ES10718381.6T
Authority: ES
Inventors: Edward John Belouski; Murielle Marie Ellison; Agnes Eva Hamburger; Randy Ira Hecht; Yue-Sheng Li; Mark Leo Michaels; Jeonghoon Sun; Jing Xu
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2009-05-05
Filing date: 2010-05-04
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2030-05-04
Also published as: HK1247134A1; SI3248610T1; ES2969528T3; PE20160718A1; US20120177646A1; US8795985B2; CN107188950B; KR20180014235A; DK3248610T5; AR076541A1; RS65153B1; BRPI1011404B1; AU2010246108A1; MX2011011709A; SG10201707763PA; CN102655877B; PE20120358A1; IL215937A0; EP2427208A1; EA021425B1

Abstract

Polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, en el que: (a) el residuo en la posición 180 es ácido glutámico; (b) el residuo en la posición 171 es glicina; y (c) el residuo en la posición 98 es arginina, y en el que el polipéptido puede disminuir los niveles de glucemia en un mamífero.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los mutantes de FGF21 resistentes a proteólisis de la presente invención puede fusionarse con otra entidad, que puede transmitir propiedades adicionales al mutante de FGF21 resistente a la proteólisis. En una realización de la presente invención, un mutante de FGF21 resistente a la proteólisis puede fusionarse con una secuencia de Fc de IgG, por ejemplo, SEQ ID NO: 11. Tal fusión puede llevarse a cabo usando métodos de biología molecular conocidos y/o la orientación proporcionada en el presente documento. Los beneficios de tales polipéptidos de fusión, así como métodos para producir tales polipéptidos de fusión, se conocen y se tratan en más detalle en el presente documento.

5. Mutantes de FGF21 de reducción de la agregación

Tal como se describe en el ejemplo 15, una propiedad del polipéptido de FGF21 silvestre es su propensión a agregarse. A concentraciones por encima de aproximadamente 5 mg/ml, la tasa de agregación es alta a temperatura ambiente. Tal como se muestra y describe en el presente documento, la tasa de agregación para el polipéptido de FGF21 silvestre depende tanto de la concentración como de la temperatura.

La agregación puede demostrar ser un reto cuando se trabaja con FGF21 silvestre a estas concentraciones, tal como en el contexto de una formulación terapéutica. Por consiguiente, se realizó un estudio dirigido para identificar mutantes de FGF21 que muestran agregación de FGF21 reducida. Luego se sometieron a prueba los mutantes de FGF21 resultantes para determinar la propensión a agregarse a diversas concentraciones.

Se realizó un estudio amplio pero centrado y dirigido para identificar sustituciones particulares que eliminan o reducen el efecto de agregación observado de FGF21 silvestre mientras que no afectan a la actividad de la proteína en un grado inaceptable. El enfoque para identificar mutantes de reducción de la agregación adecuados se describe en el ejemplo 15. La tabla 16 destaca alguno de los mutantes que se prepararon y se sometieron a prueba. Tal como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 17, no todos los mutantes de FGF21 muestran un perfil ideal. Algunos mutantes, tales como FGF21 L58E tenían actividad de FGF21 comprometida y no se estudiaron adicionalmente. Otras mutaciones, tales como FGF21 A134E, conservaban la actividad de FGF21 pero no conferían propiedades de agregación reducida. Varios mutantes, tales como FGF21 L98R, conservaban la actividad de FGF21 y también mostraban agregación reducida. Un mutante, FGF21 A45K, presentó sorprendentemente un aumento de la actividad de FGF21 mientras que también presentó propiedades de agregación reducida.

Un criterio de selección para identificar mutantes de FGF21 de reducción de la agregación deseables fue que la actividad del mutante de FGF21 fuese esencialmente similar a, o mayor que, la actividad de FGF21 silvestre. Por tanto, otra realización de la presente invención se refiere a mutantes de FGF21 que tienen propiedades de agregación reducida mientras que todavía conservan una actividad de FGF21 que es similar a, o mayor que, la de FGF21 silvestre. Aunque menos deseable en algunos casos, los mutantes de FGF21 que tienen propiedades de agregación reducida pero que muestran una actividad de FGF21 disminuida en cierta medida forman otra realización de la presente invención. En algunos casos puede ser deseable mantener un grado de agregación, y por consiguiente, los mutantes de FGF21 que permiten que se produzca cierto grado de agregación también forman otra realización de la presente invención.

Como con todos los mutantes de FGF21 proporcionados en el presente documento, los mutantes de FGF21 de reducción de la agregación proporcionados en el presente documento pueden prepararse tal como se describe en el presente documento. Los expertos habituales en la técnica, familiarizados con técnicas de biología molecular convencionales, pueden emplear ese conocimiento, junto con la presente descripción, para producir y usar los mutantes de FGF21 de reducción de la agregación de la presente invención. Pueden usarse técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, cultivo tisular y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección). Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, citado anteriormente. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden realizarse según las especificaciones del fabricante, tal como se lleva a cabo comúnmente en la técnica, o tal como se describe en el presente documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica de síntesis y química medicinal y farmacéutica descritos en el presente documento son los que se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Pueden usarse técnicas convencionales para síntesis químicas; análisis químicos; administración, formulación y preparación farmacéutica; y tratamiento de pacientes.

Los mutantes de FGF21 de reducción de la agregación de la presente invención pueden fusionarse con otra entidad, que puede transmitir propiedades adicionales al mutante de FGF21 de reducción de la agregación. En una realización de la presente invención, un mutante de FGF21 de reducción de la agregación puede fusionarse con una secuencia de Fc de IgG, por ejemplo, SEQ ID NO: 11. Tal fusión puede llevarse a cabo usando métodos de biología molecular conocidos y/o la orientación proporcionada en el presente documento. Los beneficios de tales polipéptidos de fusión, así como métodos para producir tales polipéptidos de fusión, se tratan en más detalle en el presente documento.

6. Mutantes de combinación de FGF21

Tal como se describe en el presente documento, la secuencia de FGF21 silvestre presenta varias propiedades que

15

imagen14

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

sérica humana (HSA).

Las proteínas de fusión de FGF21 pueden producirse fusionando secuencias heterólogas o bien en el extremo Nterminal o bien en el extremo C-terminal de un mutante de polipéptido de FGF21. Tal como se describe en el presente documento, una secuencia heteróloga puede ser una secuencia de aminoácidos o un polímero que no contiene aminoácidos. Las secuencias heterólogas pueden fusionarse o bien directamente con el mutante de polipéptido de FGF21 o bien a través de una molécula de ligador o adaptador. Una molécula de ligador o adaptador puede ser uno o más residuos de aminoácido (o meros), por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 residuos (o meros), preferiblemente desde 10 hasta 50 residuos de aminoácido (o meros), por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 residuos (o meros), y más preferiblemente desde 15 hasta 35 residuos de aminoácido (o meros). Una molécula de ligador o adaptador también puede diseñarse con un sitio de escisión para una endonucleasa de restricción de ADN o para una proteasa para permitir la separación de los restos fusionados.

a. Fusiones de Fc

En una realización de la presente invención, un mutante de polipéptido de FGF21 se fusiona con un dominio de Fc, por ejemplo, uno o más dominios de una región Fc de una IgG humana. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como “Fab”, que se une a un antígeno, y un dominio constante conocido como “Fc“ que participa en funciones efectoras tales como activación del complemento y ataque por células fagocíticas. Un Fc tiene una larga semivida sérica, mientras que un Fab es de vida corta (Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31). Cuando se unen entre sí con una proteína terapéutica, un dominio de Fc puede proporcionar una semivida más larga o incorporar funciones tales como unión a receptor de Fc, unión a proteína A, fijación del complemento, y quizás incluso transferencia placentaria (Capon et al., 1989).

El análisis farmacocinético in vivo indicó que FGF21 humano tiene una semivida corta de aproximadamente 1 hora en ratones debido a aclaramiento y degradación rápidos in vivo. Por tanto, para ampliar la semivida de FGF21, se fusionó una secuencia de Fc nativo con el extremo N-o C-terminal del polipéptido de FGF21. La fusión de la secuencia de Fc con FGF21 silvestre, en particularmente Fc fusionado con el extremo N-terminal de FGF21 silvestre, no amplió la semivida tal como se esperaba, sin embargo esta observación condujo a una investigación de la degradación proteolítica de FGF21 in vivo y a la identificación de los mutantes de FGF21 que eran resistentes a tal degradación. Tales mutantes se describen, por ejemplo, en los ejemplos 9 y 11, y muestran semividas más largas que FGF21 silvestre. Estas y otras proteínas de fusión de FGF21 forman realizaciones de la presente invención.

En la totalidad de la presente divulgación, Fc-FGF21 se refiere a una proteína de fusión en la que la secuencia de Fc se fusiona con el extremo N-terminal de FGF21. De manera similar, en la totalidad de la descripción, FGF21-Fc se refiere a una proteína de fusión en la que la secuencia de Fc se fusiona con el extremo C-terminal de FGF21.

La proteína de fusión de FGF21 resultante puede purificarse, por ejemplo, mediante el uso de una columna de afinidad de proteína A. se ha encontrado que las proteínas y los péptidos fusionados con una región Fc muestran una semivida sustancialmente mayor in vivo que el homólogo sin fusionar. También, una fusión con una región Fc permite la dimerización/multimerización del polipéptido de fusión. La región Fc puede ser una región Fc que se produce de manera natural, o puede alterarse para mejorar determinadas cualidades, tales como cualidades terapéuticas, tiempo de circulación o agregación reducida.

Se tratan modificaciones útiles de agentes terapéuticos proteicos mediante fusión con el dominio de “Fc“ de un anticuerpo en detalle en la publicación internacional n.º WO 00/024782.

b. Ligadores de proteínas de fusión

Al formar las proteínas de fusión de la presente invención, puede emplearse, pero no es necesario, un ligador. Cuando está presente, la estructura química del ligador puede no ser crítica, puesto que sirve principalmente como espaciador. El ligador puede componerse de aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. En algunas realizaciones de la presente invención, el ligador se compone de desde 1 hasta 20 aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, en el que los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural. En diversas realizaciones, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de los aminoácidos glicina, serina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. En algunas realizaciones, un ligador se compone de una mayoría de aminoácidos que no están impedidos estéricamente, tales como glicina y alanina. En algunas realizaciones, los ligadores son poliglicinas (tales como (GIy)4 (SEQ ID NO:29) y (GIy)5 (SEQ ID NO:30)), polialaninas, combinaciones de glicina y alanina (tales como poli(Gly-Ala)), o combinaciones de glicina y serina (tales como poli(Gly-Ser)). Otros ligadores adecuados incluyen: (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO:28), (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO:31), (GIy)3-Lys-(GIy)4 (SEQ ID NO:32), (Gly)3-Asn-Gly-Ser-(Gly)2 (SEQ ID NO:33), (GIy)3-Cys-(GIy)4 (SEQ ID NO:34) y Gly-Pro-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO:35). Aunque se ha encontrado que un ligador de 15 residuos de aminoácido funciona particularmente bien para proteínas de fusión de FGF21, la presente invención contempla ligadores de cualquier longitud o composición. Cuando se empleó un ligador para unir una secuencia heteróloga, tal como un dominio de Fc, y un polipéptido de FGF21 o mutante de FGF21, el ligador se expresa entre paréntesis.

Los ligadores descritos en el presente documento son a modo de ejemplo, y se contemplan por la presente invención ligadores que son mucho más largos y que incluyen otros residuos. También se contemplan por la

17

imagen15

imagen16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

concentraciones empleadas.

La composición farmacéutica puede contener agente(s) de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, viscosidad, transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los agentes de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio), tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes de carga (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)), agentes de complejación (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas), proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas), agentes colorantes, saborizantes y de dilución, agentes emulsionantes, polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones de formación de sal (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol), alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, surfactantes o agentes humectantes (tales como Pluronic; PEG; ésteres de sorbitano; polisorbatos tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; Triton; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapol), agentes de potenciación de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes de potenciación de la tonicidad (tales como haluros de metal alcalino, preferiblemente cloruro de sodio o de potasio, o manitol, sorbitol), vehículos de administración, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18ª ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), y posteriores ediciones del mismo).

La composición farmacéutica óptima la determinará un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración propuesta, el formato de administración y la dosificación deseada (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente). Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, tasa de liberación in vivo y tasa de aclaramiento in vivo del mutante de polipéptido de FGF21.

El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza o bien acuosa o bien no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado para inyección puede ser agua, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, complementados posiblemente con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos a modo de ejemplo. Otras composiciones farmacéuticas a modo de ejemplo comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5 o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pueden incluir además sorbitol o un sustituto adecuado. En una realización de la presente invención, pueden prepararse composiciones de mutante de polipéptido de FGF21 para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, el producto de mutante de polipéptido de FGF21 puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las composiciones farmacéuticas de mutante de polipéptido de FGF21 pueden seleccionarse para administración parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para administración a través del tracto digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de los conocimientos de la técnica.

Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, los tampones se usan para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente menor, normalmente dentro de un intervalo de pH de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.

Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para su uso en esta invención pueden ser en forma de una disolución acuosa, aceptable por vía parenteral, libre de pirógenos que comprende el mutante de polipéptido de FGF21 deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que se formula un mutante de polipéptido de FGF21 como una disolución estéril, isotónica, conservada apropiadamente. Aún otra preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como poli(ácido láctico) o poli(ácido glicólico)), perlas o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o sostenida del producto que luego puede administrarse a través de una inyección de medicamento de liberación lenta. También puede usarse ácido hialurónico, y este puede tener el efecto de promover una duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos de administración de fármacos implantables.

En una realización, puede formularse una composición farmacéutica para inhalación. Por ejemplo, puede formularse un mutante de polipéptido de FGF21 como polvo seco para inhalación. Las disoluciones de inhalación de mutante de polipéptido de FGF21 también pueden formularse con un propelente para la administración en aerosol. En aún otra realización, las disoluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar se describe adicionalmente en la

20

imagen17

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

anteriormente. En otras realizaciones, la dosificación puede oscilar entre 0,1 µg/kg y aproximadamente 100 mg/kg; o entre 1 µg/kg y aproximadamente 100 mg/kg; o entre 5 µg/kg, 10 µg/kg, 15 µg/kg, 20 µg/kg, 25 µg/kg, 30 µg/kg, 35 µg/kg, 40 µg/kg, 45 µg/kg, 50 µg/kg, 55 µg/kg, 60 µg/kg, 65 µg/kg, 70 µg/kg, 75 µg/kg y aproximadamente 100 mg/kg. En aún otras realizaciones, la dosificación puede ser de 50 µg/kg, 100 µg/kg, 150 µg/kg, 200 µg/kg, 250 µg/kg, 300 µg/kg, 350 µg/kg, 400 µg/kg, 450 µg/kg, 500 µg/kg, 550 µg/kg, 600 µg/kg, 650 µg/kg, 700 µg/kg, 750 µg/kg, 800 µg/kg, 850 µg/kg, 900 µg/kg, 950 µg/kg, 100 µg/kg, 200 µg/kg, 300 µg/kg, 400 µg/kg, 500 µg/kg, 600 µg/kg, 700 µg/kg, 800 µg/kg, 900 µg/kg, 1000 µg/kg, 2000 µg/kg, 3000 µg/kg, 4000 µg/kg, 5000 µg/kg, 6000 µg/kg, 7000 µg/kg, 8000 µg/kg, 9000 µg/kg o 10 mg/kg.

La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del mutante de polipéptido de FGF21 en la formulación que esté usándose. Normalmente, un médico clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. Por tanto, la composición puede administrarse como una dosis única, como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) a lo largo del tiempo o como infusión continua a través de un catéter o dispositivo de implantación . El ajuste con precisión adicional de la dosificación apropiada se realiza de manera rutinaria por los expertos habituales en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas realizadas de manera rutinaria por ellos. Pueden determinarse dosificaciones apropiadas a través del uso de datos de dosis-respuesta apropiados.

La vía de administración de la composición farmacéutica es según métodos conocidos , por ejemplo, por vía oral; a través de inyección por las vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; mediante sistemas de liberación sostenida (que también pueden inyectarse); o mediante dispositivos de implantación. Cuando se desee, las composiciones pueden administrarse mediante inyección en bolo o de manera continua mediante infusión, o mediante un dispositivo de implantación.

Alternativa o adicionalmente, la composición puede administrarse localmente a través de la implantación de una membrana, esponja, u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de molécula deseada puede ser a través de difusión, bolo de liberación prolongada o administración continua.

Para administrar un fármaco, por ejemplo, un mutante de FGF21 dado a conocer en el presente documento, a una tasa predeterminada de tal manera que la concentración del fármaco pueda mantenerse a un nivel terapéuticamente eficaz deseado a lo largo de un periodo prolongado, puede emplearse una variedad de diferentes enfoques. En un ejemplo, puede emplearse un hidrogel que comprende un polímero tal como una gelatina (por ejemplo, gelatina bovina, gelatina humana o gelatina de otra fuente) o un polímero que se produce de manera natural o que se genera mediante síntesis. Cualquier porcentaje de polímero (por ejemplo, gelatina) puede emplearse en un hidrogel, tal como el 5, el 10, el 15 o el 20%. La selección de una concentración apropiada puede depender de una variedad de factores, tales como el perfil terapéutico deseado y el perfil farmacocinético deseado de la molécula terapéutica.

Los ejemplos de polímeros que pueden incorporarse a un hidrogel incluyen polietilenglicol (“PEG”), poli(óxido de etileno), poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno), copolímeros al azar o de bloque de co-poli(óxido de etileno) ,poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidinona, poli(aminoácidos), dextrano, heparina, polisacáridos, poliéteres y similares.

Otro factor que puede considerarse cuando se genera una formulación de hidrogel es el grado de reticulación en el hidrogel y el agente de reticulación. En una realización, la reticulación puede lograrse a través de una reacción de metacrilación que implica anhídrido metacrílico. En algunas situaciones, puede desearse un alto grado de reticulación mientras que en otras situaciones se prefiere un bajo grado de reticulación. En algunos casos, un alto grado de reticulación proporciona una liberación sostenida más larga. Un alto grado de reticulación puede proporcionar un hidrogel más firme y un periodo más largo a lo largo del cual se administra el fármaco.

Puede emplearse cualquier razón de polímero con respecto a agente de reticulación (por ejemplo, anhídrido metacrílico) para generar un hidrogel con propiedades deseadas. Por ejemplo, la razón de polímero con respecto a agente de reticulación puede ser, por ejemplo, de 8:1, 16:1, 24:1 ó 32:1. Por ejemplo, cuando el polímero de hidrogel es gelatina y el agente de reticulación es metacrilato, pueden emplearse razones de anhídrido metacrílico:gelatina de 8:1, 16:1, 24:1 ó 32:1.

10. Usos terapéuticos de mutantes de polipéptido de FGF21

Los mutantes de polipéptido de FGF21 pueden usarse para tratar, diagnosticar, mejorar o prevenir varias enfermedades, trastornos o estados, incluyendo, pero sin limitarse a trastornos metabólicos. En una realización, el trastorno metabólico que va a tratarse es diabetes, por ejemplo, diabetes tipo 2. En otra realización, el trastorno metabólico es obesidad. Otras realizaciones incluyen estados o trastornos metabólicos tales como dislipidimia; hipertensión; hepatoesteatosis, tal como esteatohepatitis no alcohólica (EHNA); enfermedad cardiovascular, tal como aterosclerosis; y envejecimiento.

22

imagen18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Para purificar el polipéptido de FGF21 silvestre, polipéptidos de FGF21 truncados y mutantes de FGF21 de cuerpos de inclusión bacterianos, se solubilizaron cuerpos de inclusión sometidos a doble lavado (DWIB, double-washed inclusion bodies) en un tampón de solubilización que contenía clorhidrato de guanidina y DTT en tampón Tris a pH 8,5. Luego se mezclaron durante una hora a temperatura ambiente, y se añadió la mezcla de solubilización a un tampón de replegamiento que contenía urea, arginina, cisteína y clorhidrato de cistamina a pH 9,5 y luego se mezclaron durante 24 horas a 5ºC (véanse, por ejemplo, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph et al., 1997, “Folding Proteins”, Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., Nueva York, IRL Press) 57-99; e Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6).

Tras la solubilización y el replegamiento, se filtró la mezcla a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Luego se concentró la combinación de replegamiento aproximadamente 10 veces con un casete Pall Omega de punto de corte de peso molecular de 10 kD a una presión transmembrana (PTM) de 20 psi, y se sometió a diafiltración con 3 volúmenes de columna de Tris 20 mM, pH 8,0 a una PTM de 20 psi.

Luego se sometió la muestra aclarada a cromatografía de intercambio aniónico (AEX) usando una resina Q Sepharose HP. Se ejecutó un gradiente salino lineal de NaCl de 0 a 250 mM en Tris 20 mM a pH 8,0 a 5ºC. Se analizaron las fracciones de picos mediante SDS-PAGE y se combinaron.

Luego se sometió la combinación de eluato de AEX a cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) usando una resina Phenyl-Sepharose HP. Se eluyó la proteína usando un gradiente lineal decreciente de sulfato de amonio de 0,7 M a 0 M a pH 8,0 y temperatura ambiental. Se analizaron las fracciones de picos mediante SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) y se combinaron.

Se concentró la combinación de HIC con un casete de 0,2 m2 Pall Omega de punto de corte de peso molecular de 10 kD hasta 7 mg/ml a una PTM de 20 psi. Se sometió el concentrado a diafiltración con 5 volúmenes de columna de tampón de formulación a una PTM de 20 psi, y se diluyó el concentrado recuperado hasta 5 mg/ml. Finalmente, se filtró la disolución a través de una membrana Pall mini-Kleenpac de 0,2 µM de Posidyne.

Para purificar proteínas de fusión de FGF21 y proteínas mutantes de fusión de FGF21 de cuerpos de inclusión bacterianos, se solubilizaron cuerpos de inclusión sometidos a doble lavado (DWIB) en un tampón de solubilización que contenía clorhidrato de guanidina y DTT en tampón Tris a pH 8,5 y luego se mezclaron durante una hora a temperatura ambiente. Luego se añadió la mezcla de solubilización a un tampón de replegamiento que contenía urea, arginina, cisteína y clorhidrato de cistamina a pH 9,5 y luego se mezclaron durante 24 horas a 5ºC (véanse, por ejemplo, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall et al., 2007, Biotechnoh Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph et al., 1997, “Folding Proteins”, Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., Nueva York, IRL Press) 57-99; e Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42 : 1 -6).

Tras la solubilización y el replegamiento, se dializó la mezcla frente a 5 volúmenes de Tris 20 mM, pH 8,0 usando tubos para diálisis de 10 kD. Se ajustó el pH del material de replegamiento dializado a 5,0 con ácido acético al 50%, y luego se aclaró mediante centrifugación durante 30 minutos a 4K.

Luego se sometió la muestra aclarada a cromatografía de intercambio aniónico (AEX) usando una resina Q Sepharose HP. Se ejecutó un gradiente salino lineal de NaCl de 0 a 250 mM en Tris 20 mM a pH 8,0 a 5ºC. Se analizaron las fracciones de picos mediante SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) y se combinaron.

Luego se sometió la combinación de eluato de AEX a cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) usando una resina Phenyl-Sepharose HP. Se eluyó la proteína usando un gradiente lineal decreciente de sulfato de amonio de 0,6 M a 0 M a pH 8,0 a temperatura ambiental. Se analizaron las fracciones de picos mediante SDS-PAGE y se combinaron.

Tras la etapa de HIC, luego se dializó la combinación con 60 volúmenes de tampón de formulación. Se concentró la combinación dializada hasta 5 mg/ml usando un aparato Pall Jumbosep. Finalmente, se filtró la disolución a través de una membrana Pall mini-Kleenpac de 0,2 µM de Posidyne.

Ejemplo 3

Preparación y expresión de proteínas FGF21 truncadas

Se prepararon constructos que codifican para las proteínas FGF21 truncadas enumeradas en la tabla 3 mediante amplificación por PCR del vector de expresión de FGF21 silvestre tal como se describe a continuación (la construcción del vector de expresión de FGF21 silvestre se describe en el ejemplo 1).

Tabla 3

Truncamientos de FGF21

24

imagen19

Truncamientos en el extremo C-terminal

1-180: 1

1-179: 2

1-178: 3

1-177: 4

1-176: 5

1-175: 6

1-174: 7

1-173: 8

1-172: 9

1-171: 10

1-169: 12

1-168: 13

1-167: 14

1-166: 15

1-165: 16

1-164: 17

1-160: 21

1-156: 25

1-152: 29

1-149: 32

1-113: 68

Truncamientos en el extremo N-terminal

2-181: 1

3-181: 2

4-181: 3

5-181: 4

6-181: 5

7-181: 6

8-181: 7

9-181: 8

Truncamientos en el extremo C-y N-terminal

5-174: 11

7-172: 17

9-169: 20

9-149: 40

15-169: 26

15-149: 46

15-113: 82

* con relación al polipéptido de FGF21 maduro

Se prepararon constructos de proteína FGF21 truncada usando cebadores que tienen secuencias que son homólogas a regiones en el sentido de 3’ y en el sentido de 5’ de un codón (o codones) que va a delecionarse (dando como resultado el truncamiento). Los cebadores usados en tales reacciones de amplificación también 5 proporcionaron aproximadamente 15 nucleótidos de secuencia solapante para permitir la recircularización del producto amplificado, concretamente todo el vector que tiene ahora el mutante o truncamiento deseado.

Se preparó un constructo de FGF21 truncado a modo de ejemplo, que codifica para una proteína FGF21 que carece del residuo de histidina en la posición 1 de la secuencia de FGF21 maduro (es decir, el mutante de truncamiento 2181), usando los cebadores mostrados en la tabla 4.

10 Tabla 4

Cebadores de PCR para preparar el mutante de FGF21 de truncamiento de modo de ejemplo

Cebador: Secuencia SEQ ID NO:

Sentido: 14

Antisentido: 15

Los cebadores mostrados en la tabla 4 permiten la deleción del residuo de histidina tal como se muestra a continuación, en los que la secuencia superior (SEQ ID NO:9) es una parte de un polipéptido de FGF21 maduro que comprende una metionina N-terminal, la segunda secuencia es el cebador sentido (SEQ ID NO: 14), las secuencias 15 tercera y cuarta (SEQ ID NO: 17 y 18) son partes de un constructo de expresión de FGF21, y la quinta secuencia es

25 5

10

15

20

25

30

35

el cebador antisentido (SEQ ID NO: 16):

imagen20

Se prepararon constructos de proteína FGF21 truncada usando esencialmente las condiciones de PCR descritas en el ejemplo 1. Se digirieron los productos de amplificación con la endonucleasa de restricción Dpnl, y luego se transformaron en células competentes. Se secuenciaron los clones resultantes para confirmar la ausencia de errores generados por la polimerasa.

Se expresaron proteínas FGF21 truncadas transformando células competentes BL21 (DE3) o BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) con el constructo que codifica para una proteína FGF21 truncada particular. Se hicieron crecer los transformantes durante la noche con aireación limitada en medios TB complementados con kanamicina 40 µg/ml, se airearon a la mañana siguiente, y después de un corto periodo de recuperación, se indujeron en IPTG 0,4 mM. Se recogieron los mutantes de FGF21 mediante centrifugación 18-20 horas después de la inducción.

Ejemplo 4

Actividad in vitro de proteínas FGF21 truncadas

Se realizaron experimentos para identificar proteínas FGF21 truncadas que conservan actividad de FGF21 silvestre en un ensayo in vitro de ELK-luciferasa. La tabla 5 resume los resultados obtenidos para proteínas FGF21 que tienen truncamientos en el extremo N-terminal, el extremo C-terminal, o tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal. Se realizaron ensayos de ELK-luciferasa usando un sistema de células de riñón 293T humanas recombinantes, en el que las células 293T sobreexpresan constructos de indicador de luciferasa y β-Klotho. Estos constructos también contienen secuencias que codifican para GAL4-ELK1 y 5xUAS-Luc, un indicador de luciferasa dirigido por un promotor que contiene cinco copias en tándem del sitio de unión a Gal4. β-Klotho es un correceptor que se requiere por FGF21 para la activación de sus receptores de FGF y la inducción de transducción de señales intracelulares, que conduce a su vez a fosforilación de Erk y ELK. La actividad luciferasa está regulada por el nivel de Erk/ELK1 fosforilado, y se usa para indirectamente monitorizar y cuantificar la actividad de FGF21.

Se realizaron ensayos de ELK-luciferasa cultivando las células 293T en presencia de diferentes concentraciones de FGF21 silvestre o polipéptido mutante de FGF21 durante 6 horas, y luego sometiendo a ensayo los lisados celulares para determinar la actividad luciferasa. Las figuras 1A-1B muestran los resultados de un ensayo de actividad ELKluciferasa realizado con los mutantes de truncamiento de FGF21 7-181 y 8-181 (figura 1A) y los mutantes de truncamiento de FGF21 1-172, 1-171, 1-169 y 1-164 (figura 1B). La luminiscencia obtenida en los ensayos de ELKluciferasa para cada uno de los mutantes de truncamiento de FGF21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 y 1-149 se muestra en la figura 2.

Se compararon polipéptidos mutantes de FGF21 con un patrón de FGF21 silvestre y se consideró que los mutantes que mostraron una eficacia de al menos el 50% de la eficacia de FGF21 silvestre no habían perdido la actividad de FGF21 y se les asignó un “+” en la tabla 5.

Tabla 5

Proteínas FGF21 truncadas: Ensayo in vitro

Truncamientos en el extremo C-terminal

Residuos de aminoácido: Eficacia Actividad (+/-)

1-180: 93,2% +

1-178: 95,0% +

1-177: 112,0% +

1-176: 104,8% +

26 5

10

15

20

25

30

35

40

1-174: 104,6% +

1-173: 96,1% +

1-172: 97,5% +

1-171: 113,0% +

1-169: 84,9% +

1-167: 20% -

1-166: 20% -

1-165: 10% -

Truncamientos en el extremo N-terminal

2-181: 112,5% +

3-181: 130,3% +

4-181: 117,0% +

5-181: 119,6% +

7-181: 74,2% +

8-181: 24,9% -

9-181: 12,5% -

Colectivamente, los resultados presentados en la tabla 5 indican que deleciones C-terminales de 14 residuos de aminoácido o más (es decir, una proteína FGF21 truncada de manera C-terminal que consiste en los residuos de aminoácido 1-167 y proteínas más cortas) eliminan la actividad de FGF21. Además, la tabla 5 indica que deleciones N-terminales de 7 o más residuos de aminoácido (es decir, una proteína FGF21 truncada de manera N-terminal que consiste en los residuos de aminoácido 8-181 y proteínas más cortas) eliminan la actividad de FGF21. De manera no sorprendente, se encontró que las proteínas FGF21 truncadas que presentan tanto un truncamiento N-terminal de 8 a 14 residuos como un truncamiento C-terminal de 12 ó 32 residuos carecían de actividad en los ensayos de ELK-luciferasa.

De manera acorde con los datos presentados en la tabla 5, los polipéptidos de FGF21 truncados que tienen truncamientos N-terminales de menos de 7 residuos de aminoácido constituyen realizaciones de la presente invención. De manera similar, los polipéptidos de FGF21 truncados que tienen truncamientos C-terminales de menos de 13 residuos de aminoácido constituyen realizaciones de la presente invención.

Ejemplo 5

Actividad in vivo de proteínas FGF21 truncadas

FGF21 presenta varias actividades biológicas, incluyendo la capacidad para disminuir los niveles de glucemia, insulina, triglicéridos o colesterol; reducir el peso corporal; o mejorar la tolerancia a la glucosa, el gasto de energía o la sensibilidad a la insulina. Se analizaron adicionalmente polipéptidos de FGF21 truncados para determinar la actividad in vivo de FGF21, introduciendo los polipéptidos de FGF21 truncados en ratones ob/ob con resistencia a insulina, y midiendo la capacidad de un polipéptido de FGF21 truncado particular para disminuir la glucemia. Se inyectó el polipéptido de FGF21 truncado que iba a someterse a prueba por vía intraperitoneal a un ratón ob/ob de 8 semanas de edad (Jackson Laboratory), y se extrajeron muestras de sangre en diversos puntos de tiempo tras una única inyección, por ejemplo, 0, 6, 24, 72, 120 y 168 horas después de la inyección. Se midieron los niveles de glucemia con un glucómetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA), y se expresaron los resultados como un porcentaje de cambio de la glucemia en relación con el nivel inicial de glucemia (es decir, a tiempo 0).

Se proporcionan los resultados de un experimento en la figura 3, que muestra la cantidad de glucemia detectada en ratones a los que se les inyectaron los mutantes de truncamiento de FGF21 8-181 y 9-181. Este experimento demostró que proteínas de fusión de FGF21 truncado que comprenden los residuos de aminoácido 8-181 muestran actividad hipoglucemiante in vivo, sin embargo la actividad es ligeramente menor que la actividad de FGF21 silvestre a 3 y 6 horas después de la inyección, pero que proteínas de fusión de FGF21 truncado que comprenden los residuos de aminoácido 9-181 no muestran tal actividad. Por tanto, el análisis in vivo de polipéptidos de FGF21 truncados indicó que la deleción de hasta 7 aminoácidos del extremo N-terminal de FGF21 maduro no suprime la actividad biológica de la molécula (en contraposición con el análisis in vivo, lo que sugirió que la deleción de 7 aminoácidos del extremo N-terminal de FGF21 maduro suprimiría la actividad).

Los resultados diferentes obtenidos con polipéptidos de FGF21 truncados de manera N-terminal particulares (por ejemplo, FGF21 8-181) en ensayos in vitro e in vivo pueden explicarse mediante la interacción de FGF21 con β-Klotho y el receptor de FGF en la realización de la transducción de señales. En particular, FGF21 activa un complejo de receptor dual que comprende el correceptor β-Klotho y el receptor de FGF (FGFR), lo que inicia una cascada de señalización en la que participa tirosina cinasa. Se ha mostrado que el extremo N-terminal de FGF21 participa en la unión y activación de FGFR mientras que se requiere el extremo C-terminal de FGF21 para la interacción con β-Klotho (Yie et al., 2009 FEBS Lett. 583: 19-24). Se realiza el ensayo in vitro de ELK-luciferasa en células de riñón 293 en las que se sobreexpresa el correceptor β-Klotho y se expresa FGFR a niveles normales. La cantidad de FGFR es baja en relación con la de β-Klotho y, por tanto, la razón de β-Klotho con respecto a FGFR en células 293 es no fisiológica, lo que puede afectar a la formación del complejo de receptor y en última instancia, a la unión a

27

ligandos y la activación de FGFR. El sistema in vitro de células 293 parece ser más vulnerable a polipéptidos de FGF21 truncados de manera N-terminal y, por tanto, puede haber producido resultados de pérdida de actividad para unos cuantos de los mutantes truncados de manera N-terminal sometidos a prueba, tales como FGF21 8-181. Por tanto, en la determinación de si un mutante de FGF21 truncado de manera N-terminal particular conservó la

5 actividad de FGF21 silvestre, se consideró que la actividad de ese mutante de FGF21 en el ensayo in vivo era decisiva. Por consiguiente, polipéptidos de FGF21 truncados que tienen truncamientos N-terminales de menos de 8 residuos de aminoácido están englobados por la invención.

Ejemplo 6

Preparación y expresión de proteínas de fusión de FGF21 truncado

10 Dado que puede aumentarse la semivida de una proteína fusionando la proteína a una secuencia de Fc, se prepararon y analizaron proteínas de fusión que comprendían polipéptidos de FGF21 truncados. Se prepararon las proteínas de fusión de FGF21 truncado enumeradas en la tabla 6 a partir de secuencias de FGF21 amplificadas mediante PCR de SOE (corte y empalme de genes mediante extensión por solapamiento). Se prepararon proteínas de fusión de FGF21 de tal manera que se fusionó la parte de Fc del gen de la inmunoglobulina humana IgG1 (SEQ

15 ID NO: 11) o bien con el extremo N-terminal o bien con el extremo C-terminal de la proteína FGF21.

Tabla 6

Proteínas de fusión de FGF21 truncado

Residuos de aminoácido: Posición de Fc Ligador

Truncamientos en el extremo C-terminal

1-178: -NH2 15

1-175: -NH2 14

1-175: -COOH 15

1-171: -NH2 15

1-171: -COOH 15

1-170: -COOH 15

Truncamientos en el extremo N-terminal

5-181: -NH2 15

5-181: -COOH 15

7-181: -NH2 15

7-181: -COOH 15

Truncamientos en el extremo C-y N-terminal

5-175: -NH2 15

5-175: -COOH 15

5-171: -NH2 15

5-171: -COOH 15

6-170: -COOH 15

7-178: -COOH 35

7-175: -NH2 15

7-175: -COOH 15

7-174: -COOH 35

7-172: -COOH 35

7-171: -NH2 15

7-171: -COOH 35

7-171: -COOH 15

En particular, se prepararon constructos de proteína de fusión de FGF21 (incluyendo los que codifican para

proteínas de fusión de FGF21 truncado) en una serie de tres reacciones de amplificación usando esencialmente las 20 condiciones de reacción descritas en el ejemplo 1. En la primera reacción, se diseñó un par de cebadores para

producir una secuencia que contenía un sitio de clonación NdeI (que incluye una metionina N-terminal para la

expresión bacteriana), una región Fc y una secuencia de ligador. En la segunda reacción, se diseñó un par de

cebadores para producir una secuencia que contenía una parte solapante del ligador, una parte de la secuencia

codificante de FGF21 y un sitio de clonación EcoRI. Finalmente, en la tercera reacción, se diseñó un par de 25 cebadores con el fin de ligar los productos de las primeras dos reacciones. Se enumera un conjunto de cebadores a

modo de ejemplo para la construcción de Fc-FGF21 1-181 en la tabla 7.

Tabla 7

Cebadores de PCR para preparar constructo de proteína de fusión de FGF21 a modo de ejemplo

imagen21

28

imagen22

imagen23

imagen24

44.526 Da (no glicosilado): 5-410

44.130 Da (glicosilado, G0F): 21-410

E48: 45.984 Da ¿5-410? No

44.130 Da: 21-410

44.022 Da: ¿?

Tal como se indica en la tabla 10, todas las muestras purificadas por afinidad mostraron cierto grado de degradación después de solo 6 horas de circulación. Después de 24 horas de circulación, el producto principal de Fc-(G5)-FGF21 fue un fragmento que consiste en los residuos de aminoácido 1-404, que se observó en tanto en las muestras D como en las E. En las muestras E, sin embargo, el producto principal de FGF21-(G3)-Fc fue un fragmento que

5 consiste en los residuos de aminoácido 5-410. Para ambas proteínas de fusión sometidas a prueba, la parte de FGF21 de la proteína de fusión era más susceptible a degradación que la parte de Fc de la proteína.

Ejemplo 11

Preparación y expresión de proteínas de fusión y mutantes de FGF21 resistentes a la proteólisis

Se prepararon constructos que codifican para los mutantes de FGF21 enumerados en la tabla 11 mediante

10 amplificación por PCR del vector de expresión de FGF21 silvestre tal como se describe a continuación (la construcción del vector de expresión de FGF21 silvestre se describe en el ejemplo 1). Cuando se incluyó un ligador en el constructo, el ligador usado fue GGGGGSGGGSGGGGS (“L15”, SEQ ID NO: 28). El objetivo de estos experimentos era generar mutantes de FGF21 que son resistentes a la proteólisis y muestran semividas más largas.

Tabla 11

15 Mutantes de FGF21 resistentes a la proteólisis

Mutación/mutaciones: Fc Ligador

R19I

R19I: -COOH L15

R19K

R19K: -COOH L15

R19Q

R19Q: -COOH L15

R19K, Y20H

R19K, Y20H: -COOH L15

R19K, L21I

R19K, L21I: -COOH L15

R19K, Y20H, L21I

R19K, Y20H, L21I: -COOH L15

Y20F

Y20F: -COOH L15

Y20H

Y20H: -COOH L15

Y20L

Y20L: -COOH L15

Y20H, L21I

Y20H, L21I: -COOH L15

L21I

L21I: -COOH L15

L21F

L21F: -COOH L15

L21V

L21V: -COOH L15

L21Y

L21Y: -COOH L15

Y22F

Y22F: -COOH L15

Y22I

Y22I: -COOH L15

Y22V

Y22V: -COOH L15

P150A

P150A: -NH2 L15

P150R: -NH2 L15

32

P150A, G151A

P150A, G151A: -NH2 L15

P150A, I152V

P150A, I152V: -NH2 L15

P150A, G151A, I152V

P150A, G151A, I152V: -NH2 L15

G151A

G151A: -NH2 L15

G151V

G151V: -NH2 L15

G151A, I152V

G151A, I152V: -NH2 L15

I152F

I152F: -NH2 L15

I152H

I152H: -NH2 L15

I152L

I152L: -NH2 L15

I152V

G170A

G170A: -NH2 L15

G170C

G170C: -NH2 L15

G170D

G170D: -NH2 L15

G170E

G170E: -NH2 L15

G170N

G170N: -NH2 L15

G170P

G170P: -NH2 L15

G170Q

G170Q: -NH2 L15

G170S

G170S: -NH2 L15

G170E, P171A

G170E, P171A: -NH2 L15

G170E, S172L

G170E, S172L: -NH2 L15

G170E, P171A, S172L

G170E, P171A, S172L: -NH2 L15

P171A

P171A: -NH2 L15

P171C: -NH2 L15

P171D: -NH2 L15

P171E: -NH2 L15

P171G: -NH2 L15

P171H: -NH2 L15

P171K: -NH2 L15

P171N: -NH2 L15

P171Q: -NH2 L15

P171S: -NH2 L15

P171T: -NH2 L15

P171W: -NH2 L15

P171Y: -NH2 L15

P171A, S172L

P171A, S172L: -NH2 L15

S172L: -NH2 L15

S172T

S172T: -NH2 L15

Q173E

Q173E: -NH2 L15

Q173R

33 5

10

15

20

25

30

35

40

imagen25

Se prepararon constructos mutantes de FGF21 usando cebadores que tienen secuencias que son homólogas a regiones en el sentido de 3’ y en el sentido de 5’ de un codón (o codones) que va a mutarse. Los cebadores usados en tales reacciones de amplificación también proporcionaron aproximadamente 15 nucleótidos de secuencia solapante para permitir la recircularización del producto amplificado, concretamente todo el vector que tiene ahora el mutante deseado.

Se preparó un constructo mutante de FGF21 a modo de ejemplo, que codifica para un mutante de FGF21 que tiene un residuo de ácido glutámico en la posición 170 en vez del residuo de glicina nativo (es decir, el mutante G170E), usando los cebadores mostrados en la tabla 12.

Tabla 12

Cebadores de PCR para preparar mutante de FGF21 a modo de ejemplo

Cebador: Secuencia SEQ ID NO:

Sentido: 23

Antisentido: imagen26 24

Los cebadores mostrados en la tabla 12 permiten la sustitución del residuo de glicina por un residuo de ácido glutámico tal como se muestra a continuación, en la que la secuencia superior es el cebador sentido (SEQ ID NO:23), las secuencias segunda y tercera (SEQ ID NO: 25 y 27) son partes de un constructo de expresión de FGF21, y la cuarta secuencia es el cebador antisentido (SEQ ID NO:26):

imagen27

Se prepararon constructos mutantes de FGF21 usando esencialmente las condiciones de PCR descritas en el ejemplo 1. Se digirieron los productos de amplificación con la endonucleasa de restricción Dpnl, y luego se transformaron en células competentes. Se secuenciaron los clones resultantes para confirmar la ausencia de errores generados por la polimerasa. Se generaron las proteínas de fusión Fc-(L15)-FGF21 y FGF21-(L15)-Fc tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el ejemplo 6.

Se expresaron mutantes de FGF21 transformando células competentes BL21 (DE3) o BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) con el constructo que codifica para un mutante particular. Se hicieron crecer los transformantes durante la noche con aireación limitada en medios TB complementados con kanamicina 40 µg/ml, se airearon a la mañana siguiente, y después de un corto periodo de recuperación, se indujeron en IPTG 0,4 mM. Se recogieron los polipéptidos mutantes de FGF21 mediante centrifugación 18-20 horas después de la inducción.

También se analizaron los mutantes de FGF21 para determinar la inmunogenicidad predicha. Se potencian las respuestas inmunitarias frente a proteínas mediante procesamiento antigénico y presentación en el sitio de unión del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase II. Se requiere esta interacción para que las células T ayuden en la maduración de anticuerpos que reconocen la proteína. Puesto que se han caracterizado los sitios de unión de las moléculas de CMH de clase II, es posible predecir si las proteínas tienen secuencias específicas que pueden unirse a una serie de alelos humanos comunes. Se han creado algoritmos informáticos basándose en referencias bibliográficas y las estructuras cristalinas de CMH de clase II para determinar si secuencias peptídicas de aminoácidos lineales tienen el potencial de suprimir la tolerancia inmunitaria. Se usó el programa informático TEPITOPE para determinar si mutaciones puntuales, en particular mutantes de FGF21, aumentarían las células T específicas de antígeno en la mayoría de seres humanos. Basándose en un análisis de la secuencia de proteína lineal de cada mutante de FGF21, no se predijo que ninguno de los mutantes potenciase la inmunogenicidad.

Ejemplo 12

Impacto de la secuencia de ligador sobre la degradación de FGF21

Para determinar si la presencia de un ligador de aminoácidos más largo entre la secuencia de Fc y la secuencia de FGF21 afecta a la degradación de FGF21, se les inyectaron a ratones proteínas de fusión de FGF21 en las que la región Fc estaba separada de la secuencia de FGF21 por un ligador de 15 aminoácidos que tiene la secuencia GGGGGSGGGSGGGGS (designado como “L15”, SEQ ID NO:28), se extrajo sangre de los ratones en diversos puntos de tiempo, y se analizó el suero mediante CL-EM. En particular, se les inyectó a los ratones Fc-(L15)-FGF21

34

imagen28

imagen29

Antes de analizar mediante CL-EM las muestras purificadas por afinidad, se analizaron FGF21 silvestre sin procesar y mutantes de FGF21 sin procesar como referencia. Se redujeron todos los patrones y muestras de punto de tiempo con TCEP, y luego se analizaron mediante CL-EM usando una columna de ciano de 0,3 mm x 30 cm de ACE pulverizándose el efluente de columna en un espectrómetro de masas de trampa iónica LCQ Classic. Se diluyeron

5 las muestras purificadas por afinidad con acetato de amonio, se redujeron con TCEP, y luego se analizaron mediante CL-EM tal como se describió anteriormente.

Se muestran las masas observadas para Fc-(L15)-FGF21 silvestre 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección en las figuras 19A-19D, respectivamente. Se muestran las masas observadas para Fc-(L15)-FGF21 G170E 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección en las figuras 20A-20D, respectivamente. Se muestran las masas observadas para

10 Fc-(L15)-FGF21 P171A 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección en las figuras 21A-21D, respectivamente. Se muestran las masas observadas para Fc-(L15)-FGF21 S172L 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección en las figuras 22A-22D, respectivamente.

Se encontró que todas las muestras extraídas a las 72 y 120 horas contenían un componente de alto peso molecular (>200 kDa mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras) de fibrinógeno que es mucho más abundante que la

15 proteína de fusión de Fc-(L15)-FGF21 restante. Se proporcionan los resultados del análisis de CL-EM de los otros patrones y muestras en la tabla 14.

Tabla 14

Resultados del análisis de CL-EM y fragmentos predichos

Muestra de FGF21: Masas observadas principales Porcentaje del total Fragmento Edman

Patrón de Fc-(L15)-FGF21 WT: 45.994 Da 100% 1-424 -

Fc-(L15)-FGF21 WT 6 horas: 46.001 Da 44.987 Da 80% 20% 1-424 1-414 No

Fc-(L15)-FGF21 WT 24 horas: 44.979 Da ∼100% 1-414 No

Fc-(L15)-FGF21 WT 48 horas: 44.980 Da ∼100% 1-414 -

Patrón de Fc-FGF21(L15) G170E: 46.068 Da 100% 1-424 -

Fc-FGF21-(L15) G170E 6 horas: 46.078 Da 100% 1-424 No

Fc-FGF21-(L15) G170E 24 horas: 46.074 Da 45.761 Da 80% 20% 1-424 1-421 No

Fc-FGF21-(L15) G170E 48 horas: 46.072 Da 45.760 Da ∼60% ∼40% 1-424 1-421 No

Patrón de Fc-FGF21(L15) P171A: 45.970 Da 100% 1-424 -

Fc-FGF21-(L15) P171A 6 horas: 45.980 Da 100% 1-424 No

Fc-FGF21-(L15) P171A 24 horas: 45.973 Da 45.657 Da ∼70% ∼30% 1-424 1-421 No

Fc-FGF21-(L15) P171A 48 horas: 45.992 Da 45.673 Da ∼50% ∼50% 1-424 1-421 No

Patrón de Fc-(L15)-FGF21 S172L: 46.022 Da 100% 1-424 -

FGF21-(L15)-Fc S172L 6 horas: 46.027 Da 100% 1-424 No

Fc-(L15)-FGF21 S172L 24 horas: 44.984 Da 100% 1-414 No

Fc-(L15)-FGF21 S172L 48 horas: 44.985 Da 100% 1-414 No

Tal como se indica en la tabla 14, la degradación de Fc-(L15)-FGF21 silvestre y el mutante S172L parecen similares,

20 porque después de 24 horas de circulación, el producto principal de la proteína de fusión era un fragmento que consistía en los residuos de aminoácido 1-414. Los productos de degradación de los mutantes de Fc-(L15)-FGF21 G170E y Fc-(L15)-FGF21 P171A también parecen similares porque las muestras extraídas después de 24 horas de circulación contienen el 70-80% de proteína intacta (aminoácidos 1-424) y el 20-30% de un fragmento que consiste en los residuos de aminoácido 1-421. Incluso después de 48 horas, los mutantes de Fc-(L15)-FGF21 G170E y Fc

25 (L15)-FGF21 P171A conservan todavía proteína intacta mientras que muestran un aumento de la cantidad del

37

imagen30

45: A T Q K E R 0,66 0,71 1,8 2,34 1,59

52: L T -0,33

58: L G S C E 0,16 -0,15 1,0 0,08

60: P A K E R 1,3 1,51 0,66 1,31

78: P A C R H 0,14 2,48 0,08 0,13

86: L T C 0,18 4,1

88: F A S K E 2,52 3,08 2,88 1,48

98: L T Q K C E R 0,49 0,17 -0,19 3,08 0,84 3,4

99: L C E D R 7,34 2,0 1,01 1,61

111: A T K 0,47 -0,12

129: A Q K N E D R H 3,93 1,02 3,76 3,01 3,76 1,68 2,9

134: A K Y E R H 5,37 4,32 5,13 6,18 2,86

Ejemplo 16

Preparación y expresión de proteínas de fusión y mutantes de FGF21 de reducción de la agregación

Se prepararon constructos que codifican para los mutantes de FGF21 enumerados en la tabla 16 mediante amplificación por PCR del vector de expresión de FGF21 silvestre tal como se describe en el ejemplo 11 (la construcción del vector de expresión de FGF21 silvestre se describe en el ejemplo 1). Se generaron proteínas de fusión tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el ejemplo 6. Cuando se empleó un ligador, fue GGGGGSGGGSGGGGS (“L15”, SEQ ID NO:28)

Tabla 16

Mutantes de FGF21 de reducción de la agregación

Mutación/mutaciones: Fc Ligador

A26E

A26K

39

A26R

A45E

A45K

A45K: -NH2 L15

A45R: -NH2 L15

A45Q: -NH2 L15

A45T: -NH2 L15

A45K, L98R: -NH2 L15

L52T

L58C

L58E

L58G

L58S

P60A

P60E

P60K

P60R

P78A

P78C

P78H

P78R

L86C

L86T

F88A

F88E

F88K

F88R

F88S

L98C

L98E: -NH2 L15

L98K: -NH2 L15

L98Q: -NH2 L15

L98R

L98R: -NH2 L15

L99C

L99D

L99E

L99R

A111K: -NH2 L15

A111T

A129D

A129E: -NH2 L15

A129H: -NH2 L15

A129K

A129N: -NH2 L15

A129R: -NH2 L15

A129Q

A134E

A134H: -NH2 L15

A134K

A134Y

Se sometió a ensayo la agregación de diversas proteínas FGF21, incluyendo FGF21 silvestre, polipéptidos de FGF21 truncados, mutantes de FGF21 y proteínas de fusión de FGF21 mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC). Se incubaron las muestras que iban a analizarse a 4ºC, temperatura ambiente o 37ºC para diversos puntos de tiempo, y luego se sometieron a análisis de SEC. Se realizaron los experimentos con un sistema

5 de HPLC de Beckman equipado con una columna de SEC. Para FGF21 silvestre, se usó una columna de SEC TSK-Gel G2000 de TOSOHAAS con PBS 2x que contenía alcohol isopropílico al 2% como fase móvil. Para proteínas de fusión de FGF21-Fc y polipéptidos mutantes de FGF21, se usó una columna de SEC TSK-Gel G3000 de TOSOHAAS con PBS 2x como fase móvil.

Ejemplo 17

10 Actividad in vitro de mutantes de FGF21 de reducción de la agregación

40

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

Claims

imagen1

imagen2