HU215581B - Eljárás fibroblaszt növekedési faktor receptorok előállítására és terápiás alkalmazására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás fibrőblaszt növekedési faktőr (FGF)receptőr, ezen belül bázikűs fibrőblaszt növekedési faktőr receptőrelőállítására. Az eljárás számős váltőzat, köztük a trans membránszegmenst nem tartalmazó, őldható főrmák előállítására, valamint egyFGF–R ligandűmkötő részt tartalmazó, teljes hősszúságú fibrőblasztnövekedési faktőr receptőrőkat és pőlipeptideket kódőló DNS-szekvenciák izőlálására és szekvenálására alkalmas. A találmánytárgyát képezik tővábbá a receptőr elleni antitestek, valamint anövekedési faktőr receptőr fehérjék és fibrőblaszt növekedési faktőrreceptőr analógők előállítási eljárásai. Ide tartőzna a fibrőblasztnövekedési faktőrőkat aktiváló vagy gátló készítmények és afibrőblaszt növekedési faktőr receptőrőkkal agőnista vagy antagőnistakészítmények gyógyászati és diagnősztikai alkalmazásai is. ŕ

Description

A találmány tárgyát növekedési faktor receptorok, elsősorban fíbroblaszt növekedési faktor receptorok (FGF-R) képezik. Részletesebben, a találmány tárgyát különböző tisztított fíbroblaszt növekedési faktor fehérjék, a receptor fehérjéket kódoló nukleinsavak, eljárás a tisztított FGF-R-fehérjék előállítására, az eljárással előállítható fehérjék, a fehérjék elleni antitestek képezik, valamint ezeknek az anyagoknak a diagnosztikai és gyógyászati alkalmazása.

A polipeptid növekedési faktorok olyan mitogének, amelyek a plazmamembránnál lévő receptorokhoz specifikusan kötődve hatnak a sejtekre. Az ilyen receptorok általában három fő azonosítható régiót tartalmaznak. Az első egy sejten kívüli régió, amely a polipeptid növekedési faktort megkötő domént (azaz a ligandumkötő domént) tartalmazza. A második egy transzmembrán régió és a harmadik egy sejten belüli régió. A receptorok közül jó néhány a sejten belüli régióban egy tirozin kináz domént tartalmaz.

A fíbroblaszt növekedési faktor receptor (FGF-R) fehérjék a rokon növekedési faktor ligandumok családjához, a fíbroblaszt növekedési faktor (FGF) családhoz kötődnek. Ez a növekedési faktor család aminosavszekvencia homológiával, heparinmegkötő képességgel, valamint a hám-, embrionális kötőszöveti és idegsejtekre érképződést és mitogén aktivitást elősegítő hatással jellemezhető.

Az FGF-családhoz a következő hét, ismert FGF tartozik: (1,2) savas FGF (aFGF) és bázikus FGF (bFGF) [D. Gospodarowicz és munkatársai: Moll. Cell.

Endocrinol., 46, 107 (1986)];

(3) az int-2 géntermék [R. Moore és munkatársai: EMBO J., 5,919 (1986)];

(4) a hst géntermék vagy Kaposi szarkoma FGF [K. J. Anderson és munkatársai: Natúré, 332, 360 (1988); M. Taira és munkatársai: Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 84, 2980(1987)];

(5) az FGF-5 [X. Zhan és munkatársai: Mól. Cell. Bioi., 8,

3487 (1988)];

(6) keratinocita növekedési faktor [J. S. Rubin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.,

USA, 86, 802 (1989)];

(7) az FGF-6 [I. Marics és munkatársai: Oncogene, 3,

335 (1989)].

A savas és bázikus FGF-ek a 145 és 125 kD-os, nagy affinitású sejtfelszíni receptorokhoz kötődnek, és ezeken keresztül fejtik ki hatásukat [G. Neufeld és D. Gospodarowicz: J. Bioi. Chem. 261, 5631 (1986)].

Imamura és munkatársai a „Purification of Basic FGF Receptors ffom Rat Brain, Biochem. Biophys. Rés. Communications, 155, 583 (1988. szeptember 15.)” irodalmi helyen patkányagyból nyert, nanogram mennyiségű bázikus FGF-receptor (bFGF-R) tisztítási eljárást ismertetnek.

Számos növekedési faktor receptort kódoló gént molekulárisán klónoztak [például egér PDGF-receptor, Yardén és munkatársai: Natúré, 323, 226 (1986)], azonban eddig nem azonosítottak fíbroblaszt növekedési faktor receptort (FGF-R) kódoló gént. Egy egérmáj cDNS-könyvtárból a lambda-gtll cDNS-könyvtárak szkrinelésére alkalmazott antifoszfotirozin antitestekkel egy új, tirozin kináz gént (amelynek jelölése bek=baktérikusan expresszált kináz) kódoló, 2,5 kilobázisos cDNS-t izoláltak [S. Kombluth és munkatársai: Növel Tyrosine Kinase Identified by Phosphotyrosine Antibody Screening of cDNA Libraries, Mól. Cell. Bioi. 8. szám, 5541 (1988)]. A bek-szekvencia nem tartalmaz transzmembrán régiót, ezért növekedési faktor receptorként nem azonosítható. Egy humán hámsejt cDNSkönyvtárból v-fms onkogén próbával, mérsékelten sztringens körülmények között végzett hibridizálással egy másik, flg jelű fehérje tirozin kináz gént (fms-hez hasonló gént) izoláltak [M. Ruta és munkatársai: A Növel Protein Tyrosine Kinase Gene Whose Expression is Modulated During Endothelial Cell Differentiation, Oncogene, 3, 9 (1988)]. Az ismertetett szerzők nem azonosítottak transzmembrán régiót az általuk izolált szekvenciákban, ezért feltételezték, hogy az flg egy citoplazmikus tirozin kinázt kódol.

A találmány szerinti tisztított és klónozott csirke bFGF- és humán bFGF-receptorok az izolált régiókban a bek- és flg-klónokhoz hasonló aminosavszekvenciát tartalmaznak. Azonban a leírt bek- és flg-szekvenciák nem teljesek, és nem ismertetik FGF-kötő receptor funkciójukat sem. A korábbi munkák nem foglalkoznak számos olyan szerkezeti és funkcionális tulajdonsággal sem, amelyek a találmány részét képezik.

Az FGF-család tagjai valószínűleg a szövetek kialakulásában, szövetek helyreállításában, az idegek karbantartásában és a betegségek lefolyásában játszanak szerepet. Az FGF elfajult kifejezése autokrin mechanizmussal lejátszódó sejttranszformációt okozhat. Ezen túlmenően az FGF-ek elősegíthetik a tumomövekedést, és a tumorvéredények stimulálásával vagy fehérje, mint például plazminogén aktivátor indukálással a tumor kiterjedését. Azonban az ilyen komponensek azonosítása, valamint működésének és kölcsönhatásainak ismerete nem tökéletes.

A fíbroblaszt növekedési faktor funkciók megértését nagy mértékben elősegítik a tisztított FGF-receptorok és fragmentek, a meghatározott FGF-receptorokat kódoló, izolált DNS-szekvenciák és meghatározott fragmentek (például a ligandumkötő dómén). Az FGF-receptorok specifikus és határozott régiói elleni antitestek is előállíthatok. Ezek a reagensek a fentiekben ismertetett folyamatokban alkalmazható diagnosztikai és gyógyászati anyagok. A találmány a fentiekben ismertetett és egyéb igények kielégítésére szolgál.

A találmány tárgya tisztított fíbroblaszt növekedési faktor receptor (FGF-R) fehérje, FGF-R-fehérjét kódoló nukleinsav, eljárás a tisztított FGF-R-fehérje előállítására, az eljárással előállítható fehérje, a fehérjék és fragmentek elleni antitest, valamint a reagensek diagnosztikai és gyógyászati alkalmazása. Nevezetesen a találmány olyan oldható és diszkrét formájú receptorokra vonatkozik, amelyek szokatlan receptorszerkezettel jellemezhetők.

HU215 581 Β

A találmány tárgya olyan eljárás módosított hatású fibroblaszt növekedési faktor receptor in vivő módosítására, amelyben a betegnek annyi fibroblaszt növekedési faktor receptort blokkoló szert adunk, amennyi a fibroblaszt növekedési faktornak a fibroblaszt növekedési faktor receptorhoz való kötődését megakadályozza. Ez a blokkolószer tipikusan egy humán fibroblaszt növekedési faktor receptor fragment, például egy, legalább 15 bázisból álló szekvenciát tartalmazó nukleinsawal transzformált sejtben termelődő fragment, ahol a nukleinsav lehet

a) a 3. vagy 4. ábra szerinti DNS-szekvencia;

b) a 3., 4. vagy 7. ábra szerinti polipeptidet kódoló szekvencia; és

c) a 3. vagy 4. szekvenciával lényegében homológ szekvencia.

A fragment gyakran egy fibroblaszt növekedési faktor receptor tirozin kináz régió nélküli sejten kívüli tartománya.

A találmány további tárgya eljárás fibroblaszt növekedési faktor és fibroblaszt növekedési faktor receptor közötti kötés oldatban megvalósított gátlására. Az eljárás egy olyan lépést tartalmaz, amelyben egy FGF-Rpeptidet, például egy 3., 4. vagy 7. ábra szerinti szekvenciával homológ szekvenciájú peptidet egy olyan oldattal vagy tápközeggel kombinálunk, amely egy fibroblaszt növekedési faktort és egy fibroblaszt növekedési faktor receptort, általában egy természetes fibroblaszt növekedési faktor receptort tartalmaz. Az ilyen eljárások jelölt FGF-R-peptid alkalmazásával megvalósított kísérleti eljárásokban in vitro alkalmazhatók.

A találmány oltalmi köréhez tartozik a körülbelül 5-200, humán FGF-R sejten kívüli tartományból származó, összefüggő aminosavat tartalmazó, oldható FGF-R-polipeptidet tartalmazó készítmény is. A találmány szerinti egyik készítmény polipeptid komponense legalább 80 aminosavat tartalmaz a 7. ábra szerinti humán fibroblaszt növekedési faktor receptor 1 -287. aminosavából vagy egy IglI vagy IglII doménből vagy mindkettőből. Egy másik találmány szerinti készítményben az IglI dómén körülbelül hét egymást követő aminosavat tartalmaz a 7. ábra szerinti humán szekvencia 85-141. aminosavából. Emellett olyan karboxi-terminális szekvenciát tartalmazhat, amely lényegében homológ a 7. ábra szerinti oldható humán fehérje 222-300. aminosava közötti 79 aminosavnyi szekvenciával. Különösen előnyös polipeptidek lényegében a 7. ábra szerinti 44 vagy 45 aminosavat tartalmazó polipeptidek.

A találmány további tárgya olyan fibroblaszt növekedési faktor receptor készítmény, amely lényegében egy tiszta, legfeljebb körülbelül 85 kD molekulatömegű polipeptidet tartalmaz, amely egy fibroblaszt növekedési faktorkötő domént tartalmaz. A polipeptid lehet oldható vagy specifikusan tartalmazhat egy szignál szegmenst, egy Igl szegmenst, egy savas szegmenst, egy IglI szegmenst, egy IglII szegmenst, egy IglIIT szegmenst vagy egy transzmembrán szegmenst. Előnyösek az olyan polipeptidek, amelyek a 3., 4. vagy 7. ábra szerinti szekvenciával homológ szegmenst vagy az IglI és IglII doménokból legalább 30 aminosavat tartalmaznak. A polipeptid lehet egy többláncú komplex fehérje egyetlen lánca. Az egyik előnyös polipeptid a csirke fibroblaszt növekedési faktor receptor.

A találmány tárgyköréhez tartoznak az olyan humán fibroblaszt növekedési faktor receptor fehéijét kódoló nukleinsavak, amelyek sejten belüli domént nem tartalmaznak. Az ilyen nukleinsavak általában a 7. ábra szerinti IglI doménnel homológ szekvenciát vagy egy teljes hosszúságú IglI domént tartalmaznak. A nukleinsav a továbbiakban rendszerint egy szignál szegmenst, egy Igl szegmenst, egy savas szegmenst, egy IglII szegmenst, egy IglIIT szegmenst, egy transzmembrán szegmenst vagy egy tirozin kináz szegmenst tartalmaz, és lényegében a 3., 4. vagy 9. ábra szerinti szekvenciával azonos. Különösen előnyös a humán eredetű receptort kódoló nukleinsav. A nukleinsavak fúnkcionálisan egy transzkripciós promoter szekvenciához fúnkcionálisan kapcsolhatók, vagy olyan kifejező vektorba bevihetők, amelyek rekombináns FGF-R-peptid előállítására alkalmasak.

A találmány további tárgyát képezik az oldható humán fibroblaszt növekedési faktor receptor kódoló, előnyösen a h4-gyel vagy h5-tel (a jelölés magyarázata a 7. ábrán található), izolált nukleinsavak. Az ilyen izolált nukleinsavakkal megvalósított kifejezéssel fehéijetermékek állíthatók elő.

A találmány tárgyköréhez tartoznak az ilyen, új területeken alkalmazható fehéijék, például fibroblaszt növekedési faktor receptor hatású fehéijék izolált nukleinsav kifejezéssel megvalósított előállítási eljárása is, valamint az így előállított termékek.

A találmány tárgyköréhez tartoznak az olyan fibroblaszt növekedési faktor receptor peptid előállítási eljárások is, amelyekben egy sejtet legalább 21 bázisos nukleinsawal transzformálunk, ahol a nukleinsavszekvencia lehet

a) egy 3., 4. vagy 9. ábra szerinti DNS-szekvencia;

b) egy 3., 4. vagy 7. ábra szerinti polipeptid kódoló szekvencia; és

c) a 3., 4. vagy 9. ábra szerinti szekvenciával lényegében homológ szekvencia.

A leírásban egyéb, olyan fibroblaszt növekedési faktor receptor fragment elleni antitest előállítási eljárást is ismertetünk, amelyben a 3., 4. vagy 7. ábra szerinti legalább hat, összefüggő aminosavszekvenciával homológ polipeptid epitóp elleni antitestet állítunk elő. A legérdekesebbek a szignál szegmensből, Igl szegmensből, savas szegmensből, IglI szegmensből, IglII szegmensből vagy IglIIT szegmensből származó epitópok.

A reagensek diagnosztikai alkalmazásakor a vizsgálandó mintában lévő fibroblaszt növekedési faktort vagy fibroblaszt növekedési faktor receptort úgy mérjük, hogy

- a vizsgálandó mintát egy fibroblaszt növekedési faktor receptor receptor szegmenssel összekeverjük; és

- meghatározzuk az adott szegmens és a minta közötti kötődés mértékét.

HU 215 581 Β

A találmány további tárgyát képezik az olyan transzformált sejtek, amelyek egy humán fibroblaszt növekedési faktor receptor legalább egy részével homológ polipeptid kifejezésére képesek. Ezek közül előnyösek az olyan polipeptid kifejezésére képes sejtek, amelyek lényegében az egész membránhoz kötött vagy oldható formában lévő humán fibroblaszt növekedési faktor receptorral homológok.

Az 1. ábrán a különböző FGF-származékok FGF-Rhez való kötését hasonlítjuk össze. Az 1(A) ábrán a ¹²⁵I jelölésű bFGF-kötés százaléka gátlását, az 1(B) ábrán pedig bFGF-keresztkötésű Swiss 3T3 sejtek gélelektroforézissel felvett autoradiogramját mutatjuk be.

A 2(A) ábrán keresztkötésű csirke membrán frakciók és WGA (búzacsíra-agglutinin) eluátumok gélelektroforézissel felvett autoradiogramját ismertetjük, a 2(B) ábrán pedig ezüsttel megfestett gél állapotú tiszta FGF-receptort mutatunk be, amelyet a 2(A) ábra szerinti csirkeembrió eluátum WGA-Sepharose 4B kolonnán való affinitás tisztításával nyertünk.

A 3. ábrán egy csirke bFGF-receptor nukleotid- és aminosavszekvenciáját mutatjuk be.

A 4. ábrán egy humán FGF-receptor nukleotid- és aminosavszekvenciáját ismertetjük.

Az 5(A) ábrán egy teljes hosszúságú cDNS csirke bFGF-receptorral nagyon sztringens körülmények között vizsgált csirke RNS „northem” biot autoradiogramot mutatunk be. Az 5(B) ábrán egy akrilamid szekvenáló gélen elektroforézisnek alávetett csirke mRNS primermeghosszabbítási reakció autoradiogramját mutatjuk be.

A 6. ábrán egy csirke bFGF-receptor vázlatot ismertetünk; ezen látható a (tömör blokk) savas tartomány; (keresztvonalas blokk) transzmembrán régió; (pöttyös blokk) tirozin kináz tartomány; (S) az SH cisztein aminosav helyzete (az 1. táblázatban jelölt S-sel ellentétesen), (W) a triptofán aminosav helyzete az Ig-szerű doménben lévő első cisztein aminosav figyelembevételével.

A 7. ábrán a különböző FGF-receptor formák aminosavszekvenciáját hasonlítjuk össze. A négy humán receptor forma aminosavszekvenciáját egy csirke FGFreceptor szekvenciával hasonlítjuk össze. A csirke FGF-receptor szekvenciától különböző szekvenciákat bekereteztük, a transzmembrán szekvenciákat aláhúztuk. Ezek a DNS-szekvenciák a Gén Bank/EMBL adatbázisban a következő számon férhetők hozzá:

h2: M34185; h3: M34186; h4: M34184 és h5: M34188.

A 8. ábrán különböző FGF-receptor változatokat mutatunk be. A következő szerkezeti jellemzőket azonosítottuk: hidrofóbnak vélt szignál szekvencia (tömör négyszög jel); nagyon savas régió (nyitott négyszög); transzmembrán dómén (csíkos négyszög); kináz 1 és kináz 2 doménok (pontozott négyszög) és a h4/h5 divergens régió (cikk-cakk vonal). A csillagok azt a helyet jelölik, amelynél a h2 és h4 az ArgMet-szekvenciát tartalmaz, a csirkereceptor egy egyszerű Asn aminosavat tartalmaz, és a h3 és h4 nem tartalmaz megfelelő aminosavakat. A háromszögek azt a helyzetet jelölik, amelynél a h3 Glu-aminosavat és az összes többi receptorforma egy Lys-aminosavat tartalmaz. Az ábra tetején lévő számok azt az aminosavfokot jelölik, amelyek a h2 humán receptor és a csirkereceptor hasonló tartományai között azonosak.

A 9. ábrán különböző humán FGF-receptor genomiális szekvenciákat FGF-receptor cDNS-klón aminosavszekvenciákkal hasonlítunk össze. Egy PCR-rel kapott humán genomiális fragment szekvenciát humán és csirke cDNS-szekvenciákhoz hasonlítunk. Az Ig-szerű (lg) domént és nagyon savas tartományt kódoló genom szekvenciákat egy 1 kb intron választja el. A rés nélküli folytonos szekvenciát pontozott vonallal jelöljük. A csirke FGF-receptor aminosavszekvencia az iniciátor (1) metionin aminosawal kezdődik, és a savas tartománnyal (EDDDDEDD; a clFGF-R-ben a 125-132. aminosavak) végződik. A humán h2 FGF-receptor aminosavszekvenciája az iniciátor (1) metionin aminosavval kezdődik, és a savas tartománnyal (EDDDDDDD; a h2-ben a 37-44. aminosavak) végződik.

A 10. ábrán a savas vagy bázisos FGF-nek az FGFreceptor cDNS-sel transzfektált sejtekben lévő receptorokhoz való keresztkötődését mutatjuk be.

A cFGFR/psV7d kifejező szerkezettel (1,2, 7 és 8 sávok), a h2 FGFR/pSV7d kifejező szerkezettel (3,4, 9 és 10 sávok) vagy a vektorokkal önmagukban (5, 6, 11 és 12 sávok) transzfektált L6 sejteket (5 χ 10⁵) adott esetben kétszázszoros feleslegben jelenlévő nem jelzett a FGF (2, 4 és 6 sávok) vagy bFGF (8,10 és 12 sávok) jelenlétében 0,1 pmól ¹²⁵I-aFGF (1-6 sáv) vagy ¹²⁵I-bFGF termékkel inkubáltunk. A kötés lefolytatását 30 perc alatt, 37 °C-on végeztük. A sejteket ezután kétszer jéghideg 20 mmol/1 HEPES-t (pH=7,4) és 0,2 tömeg% zselatint tartalmazó DME H21 oldattal, majd kétszer jéghideg PBS-sel mostuk. Az elegyhez ezután annyi diszukcinimidil-szuberátot (DSS) adtunk, hogy végső koncentrációja 0,15 mmol/1 legyen, majd 4 °C-on 15 perc alatt lefolytattuk a térhálósítást. A mintákat mintapufferben újraszuszpendáltuk, majd SDS PGE, és ezt követően autoradiográfiás vizsgálatnak vetettük alá.

All. ábrán csirke FGF-receptort vagy a h2 humán FGF-receptort kódoló RNS-sel injektált Xenopus oocitákból kiáramló ⁴⁵Ca⁺ + termék savas vagy bázisos FGF-fel végzett indukcióját mutatjuk be. Az ábra olyan oocitákból kiáramló ⁴⁵Ca⁺⁺ terméket mutat, amelyet csirke FGF-receptor RNS-sel (A és C, nyitott négyzetek), h2 humán RNS-sel (B és D, nyitott négyzetek), h3 humán RNS-sel (B és D, tömör háromszögek) vagy vízzel (A-D, tömör négyzetek) injektáltunk. Az injektált oocitákat ⁴⁵CaCl₂-vel inkubáltuk 19 °C-on, 3 órán át, majd bőven mostuk. Egy 24 lyukú lemez egy-egy lyukába öt oocitacsoportot tettünk, és ezekhez 0,5 ml tápközeget adtunk. A tápközeget értékelési célból 10 percenként eltávolítottuk, és friss tápközeget adtunk a mintához. 40 perc múlva a mintához annyi aFGF-t (A és B lemez) vagy bFGF-t (C és D lemez) adtunk, hogy végső koncentrációja 0,5 mmol/1 legyen. A lyukakban lévő vizsgálati anyaghoz 100 perc múlva pozitív kontrollként karbacholt adtunk. Az eredményeket három lyuk átlagos mérési eredménye alapján adjuk meg.

HU215 581 Β

A találmány egyik tárgya homogén FGF-R-peptid. Ezekre a homogén FGF-R-ekre példaként említhető a csirke bázikus fibroblaszt növekedési faktor receptor és különböző humán fibroblaszt növekedési faktor receptorok. A homogén polipeptidek vagy FGF-R ligandumkötő hatásúak vagy egy, fentiekben ismertetett FGF-R ligandumkötő domént tartalmaznak. Ennek megfelelően a találmány tárgya olyan homogén polipeptid, amely azonos a természetben előforduló, különleges tulajdonságú FGF-kötő fehérjékkel. Az egyik csoportjukhoz a transzmembrán szegmenst nem tartalmazó oldható fehérjék, a másik csoportjukhoz a transzmembrán szegmenst, valamint tirozin kináz domént egyaránt tartalmazó fehérjék tartoznak. Mindkét csoportra a megfelelő csirke FGF-R-nél rövidebb, különleges sejten kívüli dómén jellemző. A kísérleti adatok azt mutatják, hogy egyetlen receptor különböző FGF-típusok megkötésére képes.

A találmány további tárgyát az izolált DNS-szekvenciák képezik. Ezek a szekvenciák FGF-R ligandumkötő hatású polipeptidek, köztük a természetben előforduló teljes hosszúságú fibroblaszt növekedési faktor receptoroknak megfelelő polipeptideket kódolnak. Izolálhatok csirke bFGF-R kódoló vagy különböző humán FGF-R (hFGF-R) kódoló DNS-szekvenciák is. A találmány tárgyköréhez tartoznak az FGF-R-t kódoló szekvenciákat tartalmazó klónozó és kifejező hordozóanyagok is. A teljes hosszúságú FGF-receptort vagy egy FGF-R polipeptid fragmentet kódoló DNSszekvencia funkcionálisan kontroll szekvenciákhoz kapcsolható, és egy kompatíbilis transzformált, transzfektált vagy fertőzött gazdaszervezet tenyészetében kifejezhető.

A találmány tárgyköréhez tartoznak a fibroblaszt növekedési faktor receptor fehérjék szintetikus előállítására szolgáló eljárások, valamint a fibroblaszt növekedési faktor analógok előállítási eljárása is.

A találmány tárgyát képezik a receptor meghatározott doménjaihoz rendelhető antitestek is. Ide tartoznak továbbá a ligandum és receptor kölcsönhatásokra agonista vagy antagonista készítmények, különösen a kötő kölcsönhatásukat elősegítő vagy gátló készítmények előállítási eljárásai is.

A leírásban a találmány szerinti reagensek diagnosztikai és gyógyászati célú alkalmazását is ismertetjük.

A fibroblaszt növekedési faktor receptorok (FGF-R) a fibroblaszt növekedési faktorok (FGF) családjához tartozó receptorok. Ismertetésüket megtaláljuk például a Lee és munkatársai: Science, 245, 57-60 (1989) irodalmi helyen.

Az FGF-családhoz tartoznak az olyan polipeptid növekedési faktorok, amelyek aminosavszekvencia homológjával, heparinmegkötő-képességgel, valamint a hám-, embrionális kötőszöveti és idegsejtekre érképződést és mitogén aktivitást elősegítő hatással jellemezhetők.

Az FGF-család a savas FGF-t, a bázikus FGF-t, az int-2 génterméket, a hst génterméket (Kaposi szarkóma-FGF), az FGF-5-öt, a keratinocita növekedési faktort és az FGF-6-ot foglalja magában.

Az FGF-család tagjai valószínűleg a szövetek kialakulásában, szövetek helyreállításában, az idegek karbantartásában és a betegségek lefolyásában játszanak szerepet. Az FGF elfajult kifejezése autokrin mechanizmussal lejátszódó sejttranszformációt okozhat. Ezen túlmenően az FGF-ek elősegíthetik a tumomövekedést, és a tumorvéredények stimulálásával vagy fehérje, mint például plazminogén aktivátor indukálással a tumor kiterjedését.

A leírásban alkalmazott „ligandum” kifejezés olyan, rendszerint a fibroblaszt növekedési faktor családhoz tartozó molekulákra vonatkozik, amelyek a növekedési faktor kötésben résztvevő doménokhoz kötődnek. A ligandum olyan molekula is lehet, amely vagy a receptorhoz kötődő természetes ligandumként vagy agonista vagy antagonista funkcionális analógként szolgál.

Amint azt a fentiekben ismertettük, egy csirke 6FGF-receptort különböző azonosítható szerkezeti tulajdonságokkal jellemezhetünk. A csirke és a humán FGF-R-szerkezetek egy, egyéb FGF-R-ekhez is alkalmazható szerkezeti nomenklatúra meghatározását teszi lehetővé. Általános fehérjeszerkezeteket és ezek nukleinsavszekvenciákkal való rokonságát ismertetik J. D. Watson és munkatársai a Molecular Biology of the Gene, 4. kiadás, 1. és 2. kötet, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Califomia, USA (1987) irodalmi helyen; és B. Alberts és munkatársai a Molecular Biology of the Cell, 2. kiadás, Garland, New York, USA (1989) irodalmi helyen. Az ismertetés az ismert FGF-R-ek, köztük a különböző, természetben előforduló, oldható humán FGF-kötő fehérjék általános tulajdonságait foglalja magában. A humán fibroblaszt növekedési faktor receptor vagy egy természetes humán FGF-R-génből származó fehéqe vagy a természetben előforduló humán FGF-receptorhoz nagyon hasonló szerkezeti tulajdonságokkal rendelkező fehérje.

Az izolált teljes hosszúságú csirke FGF-R mRNS egy membránon átnyúló szegmenshez (amelyet transzmembrán szegmensnek nevezünk) hasonló, egyszeres hidrofób szegmenst tartalmaz. A transzmembrán szegmenstől az aminoterminális felé eső FGF-R-szegmenseket sejten kívüli (extracelluláris) doménnek, a transzmembrán szegmenstől a karboxiterminális felé eső szegmenseket pedig sejten belüli (intracelluláris) doménnek nevezzük. A sejten kívüli dómén az aminovégnél egy NH₂-vég hidrofób feltételezett szignál szekvenciát, egy immunglobulinszerű domént (jele: Igl), egy savas szegmenst, egy második immunglobulinszerű domént (jele: IglI) és egy harmadik immunglobulinszerű domént (jele: IglII) tartalmaz. Az FGF-R külső doménben számos különböző tulajdonság azonosítható, azonban a domént meghatározó legfontosabb tulajdonság a receptor ligandumokhoz, például az FGF-család tagjaihoz való kötődés. Amint azt a továbbiakban ismertetjük, ez a tulajdonság az IglI és IglII doménok együttes jelenlététől függően változik.

A sejten belüli dómén egy osztott tirozin kináz szerkezeti dómén jelenlétével és a csirkereceptor-tartományban körülbelül 424 aminosav hosszúsággal jellemezhető. Ez a dómén funkcionálisan a sejten kívüli

HU 215 581 Β doménhez kötődő ligandummal modulált tirozin kináz aktivitásával határozható meg. Ha egy fehérje prototipikus sejten belüli doménja, elsősorban tirozin kináz doménja hiányzik, akkor lényegében a sejten belüli doménja hiányzik.

A csirkereceptoron kívül négy, egyedi humán cDNSt azonosítottunk. Ezek olyan, korábban nem ismert FGFreceptor változatokat kódolnak, amelyek csak két Ig-szerű domént tartalmaznak. A humán kiónok közül kettő transzmembrán receptorokat, és kettő feltételezett kiválasztott formákat kódol. Mindkét forma a savas és bázikus FGF-re biológiailag válaszoló, 3 Ig-szerű vagy 2 Igszerű dómén szerkezetet mutat. Ennek megfelelően a 3 lg doménforma első Ig-doménjének a savas és bázikus FGF-kötéstől eltérő funkciója lehet. A többszörös humánreceptor-formák számos régióban azonosak, de a sejten belüli dómén egyéb, kiválasztott régióiban nagy különbségeket mutatnak. A két humán receptor változat, a h4 és h5 valószínűleg az FGF-receptor kiválasztott formáját kódolják.

Egy tipikus FGF-R-nukleinsavszekvencia olyan ideiglenes NH₂-végi hidrofób szekvenciát kódol, amely a transzlokációs folyamatban általában lehasad. A szignál szekvencia klasszikus funkciója a keletkező polipeptidlánc membránhoz kötött riboszómákhoz való irányítása, ami membrán transzlokációhoz vezet. A szignál szekvencia azonban a transzlokációs eljárásban általában lehasad, ezért az érett polipeptidben hiányzik.

Az Ig-szerű doménok (lg doménok) a következő három fő tulajdonsággal jellemezhetők:

i) két karakterisztikus cisztein aminosav jelenléte mindegyik doménben;

ii) az első cisztein aminosavtól a COOH-vég felé a 11 — 12. aminosavnál egy konszenzus triptofán aminosav jelenléte mindegyik Ig-szerű doménben; és iii) a második cisztein aminosav NH₂-végi oldalán a DXGXYXC konszenzus szekvencia jelenléte. Ez utóbbi tulajdonság az oldható receptorfehéqék esetén ekvivalens méretű szekvenciával való helyettesítéssel módosul.

Az Ig-doménok további jellemzői is szembetűnők lesznek, amennyiben ezeket a doménokat egymással, vagy egyéb receptormolekulák homológ doménjaival összehasonlítjuk. A csirkeklónban talált amino-proximális Ig-domént Igl-gyel jelöltük. A csirkeklón három Ig-domént tartalmaz, a tartományok számozása az aminoterminálisok felől kiindulva történik. Amikor azt a 6. ábrán bemutatjuk, az Igl dómén 45 aminosavat tartalmaz, melyeket egy pár cisztein aminosav szegélyez. A csirke Igl dómén szekvenciája a humán FGF-R genomiális szekvenciában talált Igl doménnel nagyfokú homológiát mutat. A humán formából azonban hiányzik az Igl-nek megfelelő dómén.

A következő, Igü-vel jelölt dómén a csirkereceptorban két cisztein aminosav között 51 aminosavat tartalmaz (3. és 6. ábrák). Amint azt a fentiekben ismertettük, ez a dómén az IglII-mal kombinálva részt vesz a ligandumkötésben. Amint a 7. ábrán látható, a csirke- és humán receptoroknak ez a doménja egészen nagy polipeptidszekvencia-homológiát mutat. Megjegyezhető, hogy a humán receptorokból hiányzik az Igl dómén, de tartalmaznak IglI és IglII doménokat. A fenti dómén felvázolásához alkalmazott cisztein aminosavak a csirke-receptoroknál, illetőleg a h2, h3, h4 és h5 receptoroknál, az amino-proximális oldalon a 176, 89, 87, 89 és 87 pozíciókban, a karboxi-proximális oldalon a 228, 141, 139,141 és 139 pozíciókban találhatók.

Az IglII-mal jelölt, harmadik Ig-domén a csirkereceptorokban a két cisztein aminosav között 63 aminosavat tartalmaz (3. és 6. ábra). Itt is megjegyezzük, hogy a humán receptorok csak két, az IglI-nek és az IgHI-nak megfelelő domént tartalmaznak. Mind a csirke, mind a humán formában az IglII a transzmembrán szegmenshez legközelebb lévő dómén. A fenti dómén felvázolásához alkalmazott cisztein aminosavak a csirkéknél, illetőleg a h2, h3, h4 és h5 receptoroknál az amino-proximális oldalon a 274, 187, 185, 187 és 185, a karboxi-proximális oldalon a 339, 252, 250, 253 és 251 pozíciókban találhatók.

A h4 és h5 oldható receptorok egy IglIIT jelű helyettesített terminál szegmenst tartalmaznak. Ez a szegmens az IglII-hoz kötődő membránrészt helyettesítő, szubsztituált terminál szegmens, amelynek hossza 79 aminosav. Ez a szegmens azonos a h4, illetve h5224. és 225. aminosavaival, azonban a DSGSYSC kivételével az IglII dómén számos tulajdonságait megtartja. Megjegyzendő, hogy az IglIIT szekvenciák a humán FGF-R oldható formák között konzerválódnak.

Az FGF-receptorok az első és második immunglobulinszerű doménok között olyan tulajdonságokat mutatnak, amelyek az immunglobulin nagy család egyéb tagjainál nem fordulnak elő (a bázikus FGF-R-t mutatjuk be, de ugyanaz az FGF-R kötődik a savas és bázikus FGF-eknél). Nyolc, egymást követő savas aminosavból (EDDDDEDD a csirkénél, EDDDDDDD a humánnál) álló szériát három szerin aminosav, és két további savas aminosav követ (3. és 7. ábrák). A sejten belüli fehéijéknél, elsősorban a magfehéijéknél számos megszakítatlan, 7-35 savas aminosav hosszúságú rész ismert, azonban az ilyen savas doménok a transzmembrán receptorfehéqék sejten kívüli szakaszában szokatlanok.

Az 5 receptorfajta (azaz a csirke és a h2, h3, h4 és h5 receptorformák) a konzervált savas dómén és a konzervált második Ig-szerű dómén (IglI) közötti specifikus helyen szintén különbségeket mutatnak. A h2 és h4 receptorformák az 59. és 60. helyeken két aminosavat (ArgMet), míg a csirkereceptor ezen a helyen egyetlen aminosavat (Asn) tartalmaznak, és a h3 és h5 formák ezen a helyen nem tartalmaznak megfelelő aminosavat (8. ábra, *-gal jelölt rész).

Egy másik szokatlan tulajdonság az egymás melletti membránrégió hossza, amely a transzmembrán szegmens és a kináz dómén közötti régió. Ez a régió rendszerint a tirozin kináz receptorok között van. Az egymás melletti membránrégió például a PDGF, CSF-1, az epidermális növekedési faktor (EGF), a humán epidermális növekedési faktor-2 (HER-2) és az inzu6

HU 215 581 Β linreceptorokban állandóan 49-51 aminosavat tartalmaz. A sejten belüli dómén FGF-receptorok szokatlanul hosszú, körülbelül 87 aminosavból álló egymás melletti membránrégiót tartalmaznak.

A csirke, illetve humán formák aminosavszekvenciájának citoplazmikus régiói 424, illetve 425 aminosav hosszúságúak. Tartalmaznak egy tirozin kináz szekvenciát is (a csirke, illetőleg h2 és h3 formáknál a 482-759, 395-672, illetőleg a 393-670. aminosavakat). A bFGFreceptorok kinázrégiója a PDGF- és CSF-1 receptorokkal nagymértékű (51-53%) szekvenciaazonosságot mutat. A bFGF-receptorok GXGXXG motívumot és a tirozin kináz adenozin-5’-trifoszfát (ATP) kötőhely részét képező konzervált lizin aminosavat (körülbelül az 512. aminosav) tartalmazzák. A bFGF-receptorok a két jellegzetes tirozin motívumot, a HRDLAARNVL-t és a DGFLAR-t és a pp60vsrc fő foszforilezési helyével azonos pozícióban (körülbelül Tyr 416) egy tirozint (körülbelül a 651., 564. és 562. aminosavakat) is tartalmaznak.

Az egyéb tirozin kinázokkal való homológiával meghatározott bFGF-receptor kinázt kódoló szekvenciáját 14 aminosavas inszert szakítja meg. A kinázrégióban lévő inszert hossza kisebb, mint a PDFG- és CSF-1 (104, illetve 70 aminosav) receptorokban találhatók, és hasonló hosszú, mint az inzulin és inzulinszerű növekedési faktor-I receptorokban lévő inszert.

Az FGF-R-nek feltételezhetően három különböző biológiai funkciója van. Az első a ligandum, rendszerint az FGF-fehérjék és analógjaik megkötése. Ezek a ligandumok vagy analógok agonistaként vagy antagonistaként szolgálnak. A ligandumkötő hely nyilvánvalóan a sejten kívüli doménben van. A receptor a ligandumkötésre válaszul egy jelet transzdukál, és ennek eredményeként modulált aktivitású ligandum képződik. Mivel a ligandum valószínűleg FGF, a szignál általában FGF-modulált lesz.

A második biológiai hatás a tirozin kináz enzim hatáshoz kapcsolódik. Ez a hatás tipikusan a ligandumkötés válaszaként aktiválódik. Mivel a receptorok valószínűleg dimer állapotban működnek, a sejten belüli kötő kölcsönhatások egyéb, blokkolószerekkel közvetített biológiai hatások lehetnek. Ez a speciális hatású az FGF-közvetítés modulálás további eszközéül szolgálhat.

Az FGF-ek és receptoraik kölcsönhatása változásokat hozhat létre a speciális sejttípusokban, sejtmorfológiában és sejttranszformálásban, sejtszaporodásban, sejtosztódásban, sejtöregedésben, heparinérzékenységben és heparinhatásban. A speciális szervezetekben in vivő létrehozott FGF-hatásokhoz tartoznak a különböző hatások, például végtag-regeneráció, lencseregeneráció, angiogén hatások normál és tumorsejtekben, sebgyógyulás, adipocita osztódás és a különböző idegés mioblaszt sejtek növekedése. Az FGF-ek potenciális angiogén hatást is mutatnak. Feltételezzük, hogy az FGF-ek angiogén hatása ezeknek a faktoroknak az endotéliális sejtekre kifejtett kemotaktikus és mitogén hatásának köszönhető. Ezen túlmenően az FGF-ek konstitutív kifejezése a transzfektált sejtekben sejttranszformálódást indukál, ami azt jelzi, hogy a tumor kialakulásban az FGF autokrin vagy parakrin stimulálás is szerepet játszik. Ezek a különböző sejt és fiziológiai hatások is a receptor-ligandum kölcsönhatások fontosságát mutatják.

A készítmények és az ezeket tartalmazó sejtek diagnosztikai, valamint az FGF-receptorokkal kapcsolatos betegségek tanulmányozására és kezelésére alkalmazhatók. Határozott szekvenciákat tartalmazó klónozó hordozókat kifejező sejtek a speciális hatás kifejtéséhez szükséges specifikus FGF-receptor hely meghatározására alkalmazható. Ezek a sejtek a fentieken túlmenően egy kiválasztott receptor különböző ligandumokhoz (FGF-ek és analógjaik) tartozó kötőképességének meghatározására is alkalmasak, ezáltal olyan eszköz áll rendelkezésre, amely lehetővé teszi a gyógyszerek specifikus FGF-indukált sejtválaszokat gátló vagy elősegítő hatásának meghatározását.

A teljes hosszúságú természetes FGF-R-szekvenciát tartalmazó DNS vagy mRNS-sel transzfektált, injektált, fertőzött vagy elektroporált sejtek gyakran kifejezik a természetes vagy vadtípusú receptort, és ennek megfelelően válaszolnak. A tisztított receptor vagy receptor polipeptid ffagmentek speciális koncentrációban a ligandum FGF eredeti FGF-receptorokhoz való kötésének gátlására alkalmas. Emellett a receptor vagy fragment antitestek is ugyanilyen hatásúak.

A homogén és meghatározott polipeptidek és a DNS-szekvenciák antitestek előállítására alkalmazhatók. Diagnosztikai vizsgálatokban elsősorban a receptor specifikus régiói, például ligandumkötő doménja elleni antitestek alkalmazhatók. Az FGF-R-reagensek, FGF-R-polipeptidek és a receptorspecifikus régiók az FGF-közvetítésű hatásmechanizmus tanulmányozására alkalmazhatók. így például az FGF-agonisták a véredény fejlődést stimulálják, ezért különösen előnyösen alkalmazhatók sebgyógyításra, valamint a szíviszkémiás területek kollaterális véredényeinek növelésére. Az FGF-agonisták például a diabetikus retinopátia és reumatikus artitis esetén tapasztalható angiogenézisrendellenesség megelőzésére vagy a tumor vaszkularizációs szaporodás blokkolással tumorok kézbentartására alkalmazhatók.

A találmány tárgyköréhez tartoznak a fibroblaszt növekedési faktor receptor polipeptidek és FGF-R ligandumkötő hatású fehérjék is. A találmány szerinti receptorok felölelik az FGF-receptor aminosavszekvenciákat, mint például a 3., 4. és 7. ábrákon látható csirke bFGF-R- és humán FGF-R-formákat, valamint a homológ szekvenciákat, allelikus változatokat, természetes mutánsokat, indukált mutánsokat, a párhuzamosan kifejezett variánsokat, többé vagy kevésbé sztringens körülmények között hibridizáló DNS által kódolt fehéijéket, természetes anyagból származó nukleinsavak által kódolt FGF-receptort. A találmány oltalmi köre az FGF-receptor antiszérumból visszanyert, közeli rokonságú FGF-receptorokra is kiteljed.

Az aminosavakra alkalmazott jelöléseket a következő táblázatba foglaljuk össze:

HU 215 581 Β

1. táblázat

Aminosavak rövidítése

A, Alá; G, Gly; M, Met; S, Ser; C, Cys; H, His; N, Asn; T, Thr; D, Asp; I, Ile; P, Pro; V, Val; E, Glu; K, Lys; Q, Gin; W, Trp; F, Phe; L, Leu; R, Arg; Y, Tyr;

X jelentése tetszőleges aminosav és

Z jelentése záró aminosav.

Munkánk során különböző új humán FGF-receptorokat klónoztunk; ezek jellemzőit a következőkben részletesen ismertetjük. Különböző FGF-receptor rövid formákat (h2 és h3) és oldható változatokat (h4 és h5) találtunk. Az FGF-kötőkapacitású oldható fehérjékkel (például a transzmembrán szegmenst nem tartalmazó formák) szerzett tapasztalataink azt mutatják, hogy gyógyászati és/vagy diagnosztikai célra a rövidebb formák alkalmazhatók.

A találmány szerinti fibroblaszt növekedési faktor receptor peptidek a természetben előforduló receptorok IglI és IglII régióval körülbelül 85%, általában legalább 90%, és előnyösen legalább 95% homológiát mutatnak.

A ligandumkötő funkció a sejten kívüli doménben lokalizálódik, és az oldható formák megtartják ezt a speciális funkciót. Az FGF-receptor oldható fragmensei a természetes oldható változatok funkcióinak helyettesítésére vagy megváltoztatására alkalmazhatók. Az oldható formák az FGF-receptorok dimerizációját is befolyásolhatják, mivel a receptorok általában dimer formájúak.

A transzmembrán szegmenst tartalmazó humán receptorok a három Ig-doménből a szokásostól eltérően csak az IglI és IglII doménokat tartalmazzák. Az Igl dómén hiánya azt mutatja, hogy a humán receptorból bizonyos funkciók hiányoznak, vagy még valószínűbb, hogy az Igl dómén a humán receptorban nem szükséges.

A leírásban alkalmazott „lényegében tiszta és homogén” kifejezés olyan fehérjékre vonatkozik, amelyet az azt természetesen kísérő komponensektől elválasztunk. Egy monomer fehérje tipikusan akkor tiszta, ha a minta legalább 60-75 tömeg%-ban egyetlen polipeptidvázból felépülő termék. Ugyanabban a polipeptidszekvenciában kisebb változások vagy kémiai módosítások tipikusan előfordulhatnak. A lényegében tiszta fehérje általában legalább 85-90 tömeg%, még inkább legalább 95 tömeg%, és előnyösen legalább 99 tömeg% tiszta fehérjékből áll. A tisztaság mérését általában poliakrilamid géllel, a homogenitás meghatározását pedig megfestéssel végezzük. Bizonyos területeken való alkalmazásra nagytisztaságú reszolváló eljárást és HPLC (nagynyomású folyadékkromatográfiás) vagy hasonló tisztító eljárást alkalmazunk. A tisztaság meghatározását egyszerű kromatográfiás oszloppal vagy poliakrilamid géllel végezzük.

Valamely fehérje akkor tekinthető lényegében természetes kísérő komponensektől mentesnek, ha az azt eredeti állapotban kísérő, eredeti szennyező anyagoktól elválasztjuk. Ennek megfelelően a kémiailag szintetizált vagy a természetes eredetű sejtektől eltérő sejtrendszerben szintetizált fehérjék lényegében mentesek a fehérje természetes kísérő komponensektől. Ugyanezt a kifejezést alkalmazzuk heterogén emlős- vagy növénysejtben, E. coli és egyéb prokariótasejtben, szintetizált receptorok és nukleinsavak meghatározására. Ha egy polipeptid lényegében a teljes peptid hosszúságban azonos vagy nagyon homológ, valamint FGF-R természetben előforduló membrán-kötött formájával, akkor ez a polipeptid lényegében FGF-re teljes membrán-kötött formát képvisel.

A találmány oltalmi köréhez tartoznak az oldható és a membrán-kötött formájú, lényegében tiszta készítmények. Biológiai anyagból történő előállításukra különböző módszerek alkalmazhatók, amelyek részben az ismertetett szerkezeti és funkciós előírásokon alapulnak.

Az FGF-receptor peptidek, köztük a csirke és humán FGF-receptorok tisztítását a következőkben ismertetésre kerülő, klasszikus fehérjetisztító eljárásokkal végezhetjük. így például alkalmazhatunk egy lecitin-affinitás kromatográfiás lépést, ezt követően egy olyan nagyon specifikus ligandum-affmitás kromatográfiás eljárást, amelyben egy FGF-hez a risztéin aminosavon keresztül kapcsolódó biotint alkalmazunk. Tisztított FGF-R-receptorokat olyan FGF affinitás kromatográfiás eljárással is előállíthatunk, amelyben a fentiekben ismertetett Imamura eljárás szerinti, az FGF-hez elsődlegesen aminocsoportokon keresztül kapcsolódó aktivált CH-szefarózt alkalmazunk. Ezzel az eljárással ugyan tiszta fehérje állítható elő, de nem eredményez feldolgozható (azaz nanogrammnál nagyobb) mennyiségű terméket.

Specifikus FGF-recep torokat a specifikus antitestek beszerezhetőségétől függően immunaffinitás kromatográfiás eljárással is tisztíthatunk. Az előállított antitestek a következőkben ismertetésre kerülő eljárással inért anyaghoz köthetők, és így nagyon specifikus affinitás kolonna előállítására alkalmazhatók (a későbbiekben ismertetésre kerülő Herlow és Lane eljárás).

Az egyik tisztítási eljárásban például azt használjuk fel, hogy a jelzett biotin-bFGF kötés nagy affinitással kötődik azokhoz a sejtreceptorokhoz, amelyek a sejtben nagy mennyiségben fordulnak elő. A ¹²⁵I-jelzett biotin-bFGF Swiss 3T3 sejtekben bFGF-receptorokhoz kötődik, és térhálósán kapcsolódik a receptorfehérjéhez.

Kiindulási anyagként számos olyan sejt- vagy szövetforrást alkalmazhatunk, amelyek a kívánt receptort feleslegesen tartalmazzák. Előnyösek a csirkeembriók (6 nap, 29-30. állapot), mert ezek viszonylag nagymennyiségű receptort tartalmaznak, amint azt a nagy affinitású humán és borjú bFGF-fel meghatároztuk. Az embrióextraktumot először búzacsíra agglutinin (WGA=Wheat Germ Agglutinin) Sepharose 4B-n ffakcionáljuk, és a részlegesen tisztított bFGF-receptorokat biotin-bFGF-hez kötjük. A biotin és avidincsoportok közötti nagy affinitású kölcsönhatás miatt a receptor ligandum komplexet egy avidin-agarózon adszorbeálhatjuk. Az avidin-agaróz kolonnákat olyan vegyületekkel, például suraminnal vagy SDS-sel eluálhatjuk, amelyek az FGF-t disszociálja a receptorról. Az FGF-függő módon avidin-agarózhoz kötődő csirkefehéije a bFGF8

HU 215 581 Β receptor várható méretének (130 kD) megfelelően migrál (2B. ábra).

Az aminosavszekvencia meghatározásához vagy a receptor polipeptid ffagmentjének előállításához a receptort tripszinnel emészthetjük. A peptidfragmentet fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) elválasztjuk, és gázfázisú szekvenálással elemezzük. Egyéb, ismert szekvenáló eljárásokat is alkalmazhatunk.

Az FGF-affmitás tisztításához FGF-receptorok és a receptorok specifikus külső régiói alkalmazhatók. A csirke bFGF-R ligandumkötő doménjét tartalmazó külső régió körülbelül a 22. aminosavtól körülbelül a 374. aminosavig terjed. A humán FGF-R ligandumkötő doménja, amelyet a 4. ábrán láthatunk, körülbelül a 22. aminosavtól körülbelül a 285. aminosavig teljed. A különböző FGF-receptorok ligandumkötő doménja különböző, és a sejten kívüli dómén 5%-ától 100%-áig terjedően bárhol lehet. A ligandum megkötéséhez szükséges minimális mennyiségű fehéijeszekvenciát különböző fragmenteknek a sejten kívüli tartományból történő kihasításával határozzuk meg, és méljük a maradék szekvencia ligandumkötését. A ligandum-receptor kölcsönhatás vizsgálatai azt mutatják, hogy a receptor sejten kívüli tartományában legalább egy ligandumkötő régió helyezkedik el. A leírásban alkalmazott FGF-receptor vagy FGF-R ligandumkötő hatás valamely fibroblaszt növekedési faktorhoz vagy egyéb specifikus ligandumhoz való kötőképességet jelent. Ezek a ligandumok általában az FGF-család tagjai, ezért a külső régió FGF-agonisták vagy -antagonisták előállítására alkalmazhatók.

Az is valószínűsíthető, hogy az FGF-R egyéb növekedési faktor receptorokhoz hasonlóan a multimer fehérjekomplexben többnyire dimer alakban találhatók. Ennek megfelelően a receptorok egyéb fontos régiói, akár sejten belül, akár egyéb helyen, azok a régiók, amelyek a dimerizálásban részt vesznek.

A receptorok sejten belüli régiói (például a csirke bFGF-R esetén a körülbelül a 396. aminosavtól a COOH-végen át; a humán FGF-R esetén a körülbelül 307. aminosavtól a COOH-végen át elhelyezkedő régiók) tirozin kináz hatású enzimként alkalmazhatók. A bek-gén aminosavszekvenciája a csirke bFGF-R analóg régiójával (tirozin kináz régió) 84%-ban azonos. A flg a 4. ábrán ismertetett humán FGF-receptor különböző szekvenciájával 99% homológiát mutat.

A fehérjék sejtmembránon való áthaladását egy szignál vagy vezető szekvencia irányítja. A receptorok szignál szekvenciája a saját receptoijaikkal vagy egyéb fehérjékkel együtt alkalmazható (például a 3. ábrán ismertetett csirke bFGF-R és a 4. ábrán ismertetett humán FGF-R vezető vagy szignál szekvenciáit az N-terminál szekvencia 1-21. aminosavak tartalmazzák).

A találmány kiteljed a fibroblaszt növekedési faktor receptor polipeptidek analógjaira is. Ilyen analógok a polipeptidváz módosításával kapott termékek, valamint a polipeptidváltozatok és mutánsok. A módosításokhoz tartoznak például a polipeptidek kémiai átalakítással, mint például acetilezéssel, karboxilezéssel nyert származékai. Ide tartoznak a glikozilezett módosulatok és a tipikus polipeptidek feldolgozott változatai is. Ilyen feldolgozási lépés specifikusan az enzimatikus módosítás, mint például ubikinizálás [például Hershko és Ciechanover: Mechanisms of Intracellular Protein Breakdown, Ann, Rév. Bioch. 51, 335-364 (1982)].

Egyéb analógok például a természetes és az indukált genetikai változatok. Az indukált mutánsok különböző eljárásokkal, például a kódoló nukleinsavak besugárzás vagy EMS alkalmazásával megvalósított véletlenszerű mutagenézisével vagy génsebészeti eljárással helyspecifikus mutagenézissel vagy egyéb, modem molekulabiológiai eljárásokkal állíthatók elő [Sambrook, Fristch és Maniatis: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, CSH Press (1989)].

A lényegében teljes hosszúságú polipeptidek mellett a polipeptidek biológiailag aktív fragmentjei is a találmány tárgyát képezik. A szignifikáns biológiai hatáson a ligandumkötő, immunológiai és egyéb, a fibroblaszt növekedési faktor receptor peptidekre jellemző biológiai hatást értünk. A megcélzott immunrendszerben immugén funkciójú, valamint a kötésben részt vevő immunológiai epitópok tevékenységét megosztó immunológiai hatások a fibroblaszt növekedési faktor receptor epitóp antigén kompetitoraként vagy helyettesítésére szolgálnak. A leírásban a polipeptidnél alkalmazott „szegmens” kifejezés olyan részre vonatkozik, amely általában legalább öt egymás utáni, tipikusan legalább hét egymás utáni, még tipikusabban legalább kilenc egymás utáni, rendszerint legalább tizenegy egymás utáni, előnyösen legalább tizenhárom egymás utáni, még előnyösebben legalább tizenhat egymás utáni és még előnyösebben legalább húsz-harminc egymás utáni aminosavat tartalmaz.

Egy bizonyos dómén szegmense a megfelelő dómén adott méretű szegmensét jelenti.

A ligandumkötő és egyéb doménok például a különböző új fúziós polipeptidek vagy fragmensek között „cserélődnek”. Ennek megfelelően az új kiméra polipeptidek olyan új jellemző kombinációkat mutatnak, amelyek a ligandumkötő jellemzők és a sejten belüli doménok funkcionális kapcsolódásából származnak. Az Ig-doménok például egyéb, rokon polipeptid Ig-doménjaival helyettesíthetők.

Az immunológiai célú immunogének a polipeptid szegmensek megkettőzésével állíthatók elő, és az így kapott antigén fehérjék nagyon nagy hatásúak. Ezek a polipeptidek a specifikus kötések nagyon hatékony kompetitoraként is szolgálnak. A fibroblaszt növekedési faktor receptor polipeptidek antitestjeinek előállítását a következőkben részletesen ismertetjük.

A találmány tárgyköréhez tartoznak a fibroblaszt növekedési faktor receptor fragmenteket tartalmazó, egyéb polipeptidek is. Ennek megfelelően a receptorok és egyéb homológ vagy heterológ fehérjék közötti fúziós polipeptidek is a találmány tárgyát képezik. A homológ polipeptidek lehetnek különböző növekedési faktor receptorok közötti fúziók, amelyek eredményeként például az egyik receptor kötő jellegét és a másik sejten belüli doménjét mutató hibrid fehérje vagy egy szélesebb vagy szűkebb kötő jelleget mutató receptor

HU 215 581 Β képződik. A heterológ fúziók ehhez hasonlóan szerkeszthetők, és az eredeti fehérjék aktivitását jellemző tulajdonságokkal állíthatók elő. Ezek tipikus példái a riporter polipeptid, például a receptor domént, például ligandumkötő domént tartalmazó luciferáz fúziók, amelyek eredményeként a kívánt ligandum jelenléte vagy helye könnyen meghatározható (4 859 609 számú USAbeli szabadalmi leírás). Egyéb génfúziós partnerek még a bakteriális β-galaktozidáz, trpE fehérje A, β-laktamáz, α-amiláz, alkohol dehidrogenáz és élesztő a-párosodás faktor [Godowski és munkatársai: Science, 241, 812-186 (1988) és a következőkben ismertetésre kerülő kísérleti rész].

A fúziós fehérjék előállítása például rekombináns nukleinsaveljárással vagy szintetikus polipeptideljárással történhet. A nukleinsav manipulációs eljárásokat például Sambrook és munkatársai ismertetik a Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, 1-3. kötetek, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) irodalmi helyen. Polipeptidszintetizáló eljárásokat ismertet például Merrifield a J. Amer. Chem. Sco. 85, 2149-2156 (1963) irodalmi helyen. A találmány szerinti fúziós fehérjék előállításához alkalmazott rekombináns nukleinsavszekvenciákat természetes és szintetikus szekvenciákból származtathatjuk. Megfelelő próba alkalmazásával különböző cDNS-ekből vagy genomiális könyvtárakból számos természetes génszekvencia előállítható (GenBank, National Institutes of Health). Tipikus fibroblaszt növekedési faktor receptor próbák szabvány eljárásokkal a 3., 4. vagy 9. ábrákon ismertetett szekvenciákból szelektálhatok. Megfelelő szintetikus DNS-fragmentek állíthatók elő a Beaucaga és Carruthers által Tetra. Letts. 22, 1859-1862 (1981) irodalmi helyen ismertetett foszforamidáteljárással. A kétszálú fragment ezután a komplementer szál megfelelő körülmények között megvalósított szintetizálásával és a szál együttes temperálásával, vagy egy megfelelő primer szekvenciát tartalmazó DNS-polimeráz alkalmazással megvalósított komplementer szál hozzáadással állítható elő.

A találmány tárgyköréhez tartoznak a fentiekben ismertetett, különböző FGF-receptorokat kódoló nukleinsavszekvenciák is. A 3., 4. és 7. ábrákon a megfelelő, csirke és humán FGF-receptorokat kódoló cDNS-szekvenciákat mutatjuk be.

A 3. ábrán a csirke bFGF-R-t mutatjuk be (a tisztított fehérjéből szekvenált peptideket aláhúztuk); ezek a 35-53. (ala... arg) az 57-67. (leu-arg) és a 139-158. (glu-lys) aminosavakból származó, NH₂-szomszédos szekvenciákat tartalmazzák. A transzmembrán szekvenciát sötét sávval jelöltük, az egyedi aminosavrégiót kiemeltük, a cisztein aminosavat bekarikáztuk, a potenciális N-kapcsolt glikozilező helyeket ponttal jelöltük, és a gondolatjellel a vélt hidrofób szignál szekvenciát húztuk alá. Az aminosavszekvencia egy leolvasási fázisba illeszkedő kodont (körülbelül a -12. aminosav) és ezt követően egy metionin iniciátort tartalmaz. A szerkezeti szekvencia körülbelül a 22. aminosavnál kezdődik.

A humán FGF-R-t ábrázoló 4. ábrán láthatjuk, hogy az ATG-kodon metioninja, amely körülbelül az 529.

nukleotidnál kezdődik, az FGF-R-gén első aminosava. így például a 4. ábrán bemutatott receptor 22. aminosava egy olyan arginin aminosav (R), amely a 4. ábra 1. oldalán a balról lévő két aminosav között, alulról felfelé az „539” és „630” vonalnál helyezkedik el.

A találmány szerinti nukleinsavak egy olyan szekvenciát tartalmaznak, amely természetes humán, csirke vagy egyéb FGF-R-génből származik vagy valamely természetes FGF-R-génnel vagy egy részével lényeges homológiát mutat.

A nukleinsav lényeges homológiája azt jellemzi, hogy vagy az optimálisan sorbaállított és összehasonlított szegmensek vagy komplementer száljaik a nukleotid csoportok legalább 80%-ában, rendszerint legalább 90%-ában és méginkább legalább 95%-ában, előnyösen legalább 97%-ában és még előnyösebben legalább 98-99,5%-ában a megfelelő nukleotid inszerciókkal vagy deléciókkal azonosak. Ezen túlmenően akkor is lényeges homológiáról beszélünk, ha egy szegmens tipikusan egy 3., 4. vagy 9. ábrán látható szekvencia alkalmazásával, szelektív hibridizációs körülmények között egy szállal vagy ennek komplementerével hibridizálódik. Szelektív hibridizálásról akkor beszélünk, ha a hibridizáció szelektívebb, mint a szelektivitás teljes hiánya. Szelektív hibridizálás tipikusan akkor fordul elő, ha a homológia legalább 14/25 nukleotidon keresztül legalább 55%, előnyösen legalább 65%, és még előnyösebben legalább 90% [Kanehisa M.: Nukleic Acids Rés. 12, 203-213 (1984)]. A szorosabban vett hibridizációs körülmények tipikusan legfeljebb 1 mol/1, általában legfeljebb 500 mmol/1, és előnyösen legfeljebb 200 mmol/1 sókoncentrációt jelentenek. A hibridzáció hőmérséklete tipikusan 20 °C-nál, általában 30 °C-nál nagyobb, előnyösen valamivel 37 °C-nál nagyobb érték. A hibridizációt lényegesen befolyásoló tényezők közé tartozik még a bázisösszetétel, a komplementer szálak mérete, szerves oldószerek jelenléte, a bázisok rossz illeszkedése, ahol a paraméterek összetett hatása fontosabb, mint bármelyik abszolút értéke.

Az izolált nukleinsavakon az azt szokásosan kísérő szekvenciáktól, például egyéb sejt nukleinsavszekvenciáktól lényegében megtisztított termékeket értjük. Ezen a kifejezésen rendszerint szelektíven klórozott, izolált és lényegében homogénné tisztított genomiális ffagmentet értünk.

A próbák a 3., 4. és 9. ábrák szerinti FGF-receptor cDNS-ek szekvenciáiból kiindulva állíthatók elő. A próbák egy jelölő vagy riporter molekulához kapcsolódó izolált nukleinsavat tartalmaznak, és egyéb FGFreceptor nukleinsavszekvenciák szabvány eljárásokkal való izolálására alkalmazhatók [J. Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1-3. kötetek, CSH Press, New York, USA (1989)]. Homológ nukleinsavak alkalmazásával egyéb, hasonló nukleinsavak is kiválaszthatók. Az ilyen vagy hasonló receptor polipeptideket kódoló nukleinsavak előállíthatok és szelektálhatok a genetikai kódban lévő redundancia hasznosításával is. Különböző kodon helyettesítések is beültethetők. Ilyen helyettesítés például a csendes változás és ezáltal különböző restrikciós helyek létrehozá10

HU215 581 Β sa vagy valamely speciális rendszerhez a kifejezés optimalizálása. A receptor tulajdonságainak módosítására, például a ligandumkötő-affinitás, a láncon belüli aktivitás vagy a polipeptidbomlás vagy a ciklussebesség változtatásra mutáció alkalmazható.

A találmány szerinti DNS-készítmények genomiális DNS-ből vagy cDNS-ből szintézissel előállítható termékek vagy a különböző kombinálok hibrid termékei. Az egyébként a természetben nem előforduló szekvenciákat tartalmazó rekombináns nukleinsavak is a találmány tárgyát képezik. Egy izolált DNS-szekvencia minden olyan szekvenciát tartalmaz, amelyet primer vagy hibridizációs reakciókkal vagy restrikciós enzimmel vagy hasonló termékekkel való kezeléssel állítunk elő.

Szintetikus oligonukleotideket a Matteucci és munkatársai által a J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981) irodalmi helyen ismertetett triészter eljárással vagy egyéb eljárásokkal, mint például kereskedelmi automatikus oligonukleotid szintetizátorokkal állíthatunk elő. Az oligonukleotideket feleslegben lévő polinukleotidkinázzal jelölhetjük [például körülbelül 10 egységből 0,1 nmol mennyiségig teqedő szubsztrátot 50 mmol/1 7,6 pH-jú Trisszel, 5 mmol/1 ditioeritritollal, 10 mmol/1 magnézium-kloriddal, 1 -2 mmol/1 ATP-vel, 1,7 pmol/1 ³²P-ATP-vel (2,9 mCi/mmol), 0,1 mmol/1 spermidinnel és 0,1 mmol/1 EDTA-val együtt alkalmazzuk]. A próba előállítható „nick”-transzlációval, Klenow feltöltési reakcióval vagy egyéb, más ismert eljárással.

A különböző típusú cDNS- vagy genomiális könyvtárakat szkrinelésnek vethetjük alá. A DNS-könyvtárat általában a kívánt receptorokra feleslegben lévő mRNS-t tartalmazó szövetforrásnak megfelelően választjuk. így például egy keratinocita sejt genomiális vagy cDNSkönyvtár előnyösen alkalmazható keratinocita növekedési faktor receptor izolálására és klónozására. Az int-2, FGF-5 és hat-receptorokhoz embrió- vagy placentasejtek, és a savas FGF-receptorokhoz a hámsejtkönyvtár előnyös. A könyvtárklónokat lemezekre visszük, a szkrineléshez megfelelő szubsztrátumra transzferáljuk, denaturáljuk, és a kívánt szekvencia jelenlétére vizsgáljuk.

Például egy biot hibridizációs eljárás esetén a bakteriofág tartalmú lemezek mindegyikét kettős nitrocellulóz szűrőpapírokra (Millipore-HATF) másoljuk. A fág DNS-t körülbelül 1 percig valamilyen pufferral, például 500 mmol/1 nátrium-hidroxid és 1,5 mol/1 nátrium-klorid-oldattal denaturáljuk, majd háromszor tíz percig például 0,5 mol/1 Trisz-sósawal, pH=7,5, 1,5 mol/1 nátrium-klorid-oldattal semlegesítjük, majd a szűrőpapírokat lemossuk. A szűrőpapírokat szárítás után általában 2 órán át, 80 °C-os vákuumkemencében melegítjük. A másolt szűrőpapírokat 42 °C-on, 4-24 órán át, szűrőnként 10 ml DNS hibridizációs pufferrel (20-50 tömeg% formamid, 5xSSC, pH=7,0, 5 χ Denhardt-oldat, polivinil-pirrolidon, Ficol és borjú szérum albumin; 1x0,02 tömeg%, 50 mmol/1 nátrium-foszfát-puffer, pH=7,0, 0,2 tömeg% SDS és 50 μg/ml denaturált lazacsperma DNS) előhibridizáljuk.

A megfelelő próbával végzett hibridizálást 42 °Con, 16 órán át, szűrőnként 10 ml 1 χ 10⁶ cpm/ml jelölt próbát tartalmazó DNS hibridizációs puffer alkalmazásával folytatjuk le. A formamid végső koncentrációját a próba hosszától és a kívánt sztringencia mértékétől függően határozzuk meg [J. G. Wetmur és Davidson: J. Mól. Bioi. 31, 349-370 (1968); M. Kanehisa: Nuc. Acids Rés. 12, 203-213 (1984)].

A tisztított csirke bFGF-R két triptikus peptidjének aminosavszekvenciáján alapuló oligonukleotidpróbát 6 napos csirkeembrió cDNS-könyvtár sztringens körülmények között végrehajtott szkrinelésére alkalmazzuk. A kereskedelmi automatikus oligonukleotid szintetizátorral (Applied Biosystems) előállított TVALGSNVEFVCK és VYSDPQPHIQWLK szekvenciákat a 3. ábrán ismertetett csirke bFGF-receptor klónozásra alkalmazzuk. Ezt a kiónt vagy az ebből származó szekvenciát a bFGF-R-ek egyéb fajtákban, valamint egyéb FGF-R-ek célzott fajtákból való izolálására alkalmazunk.

A csirke bFGF-R izolálására alkalmazott és fent ismertetett próbák felhasználhatók egy humán bFGFreceptor cDNS-klón izolálására is.

A találmány szerinti eljárásban próbaként bármilyen, FGF-R teljes szerkezeti szekvenciát kódoló izolált DNS-t alkalmazhatunk.

Bármilyen FGF-R hidrofób szignál szekvenciát és ennek transzlációs start helyét tartalmazó DNS-szekvenciát is alkalmazhatunk. Az FGF-R-hatást (például ligandumkötő vagy FGF-R-kötő hatást) kódoló izolált részleges DNS-szekvenciák is a találmány tárgyköréhez tartoznak. Előnyösek az izolált FGF-receptor cDNSklón próbák.

A találmány szerinti DNS-szekvenciák általában legalább öt kodont (15 nukleotidet), még inkább legalább hét kodont, tipikusan legalább tíz kodont, előnyösen legalább tizenöt kodont, még előnyösebben legalább huszonöt kodont és a legelőnyösebben legalább harmincöt kodont tartalmaznak. Tartalmazhatnak egy vagy több intront is. Ez a nukleotidmennyiség alkotja általában azt a minimális hosszúságot, amennyit egy specifikusan egy FGF-receptorral való hibridizáláshoz szükséges sikeres próba igényel. így például az FGF-R karakterisztikus epitópok rövid peptidekben kódolhatók. Általában vadtípusú szekvenciát alkalmazunk, és néhány esetben egy vagy több olyan mutációt, mint például deléciót, helyettesítést, inszerciót vagy inverziót vihetünk be, amelyek az aminosavszekvenciában csendes mutációt hoznak létre a restrikciós hely módosítására vagy specifikus mutációk létrehozására. A genomiális szekvencia általában legfeljebb 200 kb, méginkább legfeljebb 100 kb, és előnyösen legfeljebb 0,5 kb.

Próbaként általában a legalább 15 nukleotidet, valamint legfeljebb 6 kD, általában legfeljebb 1,0 kD méretű FGF-receptort kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-szekvencia részek előnyösek. A próbákat a sejtben vagy különböző szövetekben lévő specifikus FGF-R-t kódoló mRNS jelenlétének meghatározására is alkalmazzuk.

A kívánt fibroblaszt növekedési faktor receptort kódoló természetes vagy szintetikus DNS-fragmentet egy

HU215 581 B sejttenyészetben in vitro bevezetésre és kifejezésre képes DNS-szerkezethez társítjuk. A DNS-szerkezetek általában egysejtű szervezetekben, mint például baktériumban vagy élesztőben való replikációra alkalmasak, de a genommal való integrálással vagy anélkül tenyésztett emlős vagy növény vagy egyéb eukarióta sejtvonalakba is beültethetjük. A baktériumba vagy élesztőbe való beültetésre szánt DNS-szerkezetek tipikusan egy, a gazdaszervezet által felismert replikációs rendszert, a kívánt receptor polipeptid kódolásra szánt DNS-fragmentet, a polipeptid kódoló szegmenshez kapcsolódó, transzkripciós és transzlációs indítást szabályozó szekvenciákat és a polipeptid kódoló szegmenshez kapcsolt transzkripciós és transzlációs lezárást szabályozó szekvenciákat tartalmaznak. A transzkripciós szabályozó szekvenciák tipikusan egy, a gazdaszervezet által felismert heterológ hatásjavítót vagy promótert tartalmaznak. A megfelelő promoter kiválasztása a gazdaszervezet függvénye, de ismertek a trp, lac és fág promoterek, tRNS-promóterek és glikolitikus enzim promoterek [Sambrook és munkatársai (1989)]. Alkalmazhatók olyan kényelmesen beszerezhető kifejező vektorok, amelyek tartalmazzák a replikációs rendszert, valamint a fibroblaszt növekedési faktor receptor DNS-szekvenciával együtt a transzkripciós és transzlációs szabályozó szekvenciákat. A sejtvonalak és expressziós vektorok jól alkalmazható kombinációit ismertetik Sambrook és munkatársai (1989); valamint Metzger és munkatársai: Natúré, 334, 31-36 (1988) irodalmi helyen.

Az ezekhez a sejtekhez alkalmazható kifejező vektorok tartalmazhatnak expressziós kontroll szekvenciákat, mint például replikációs origót, promótert, hatásjavítót és a szükséges feldolgozási információs helyeket, mint például riboszómakötő helyeket, RNS-hasítási helyeket, poliadenilező helyeket és transzkripciós terminátor szekvenciákat. A hatásjavítók vagy promoterek előnyösen a fibroblaszt növekedési faktor receptor kódoló génekkel természetesen kapcsolódó termékek, de sok esetben egyéb promoterek is hasonló jól vagy ezektől még jobban alkalmazhatók. Előnyös kifejezést ellenőrző szekvenciák továbbá a vírusokból, mint például az SV40-ből adenovírusból vagy borjú-papillomavírusból származó hatásjavítók vagy promoterek.

Hasonlóan előnyösek a természetes immunglobulintermelő sejtekben található promoterek (4663281 számú USA-beli szabadalmi leírás), valamint az SV40, polioma vírus, citomegalovírus (humán és egér) és a különböző retrovírusokból (mint például egér-leukémiavírusból, egér Rous szarkóma vírusból és a HIV-ből) származó LTR- és az FGF-R-génekre endogén promoterek [Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Ν. Y. USA (1983)].

A szóban forgó DNS-szegmenseket tartalmazó vektorok (például fibroblaszt növekedési faktor receptor gén vagy cDNS-szekvencia vagy ennek része) a gazdaszervezettől függő, ismert eljárásokkal a gazdaszervezetbe transzferálhatok. Például prokarióta sejtek esetén kalcium-kloridos transzfektálást, egyéb gazdaszervezetek esetén kalcium-foszfátos kezelést alkalmazhatunk [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, 2. kiadás, CSH Press, (1989)]. A „transzformált sejt” kifejezés a transzformált sejt utódjára is vonatkozik.

A tisztított polipeptidekhez hasonlóan a ligandumkötő szegmenssel társított nukleinsavak, és a sejten belüli és sejten kívüli doménok különösen jól alkalmazhatók. Ezek a génszegmensek próbaként alkalmazhatók hasonló biológiai hatású új gének szkrinelésére, de az ilyen gének szabályozó elemei is nagy fontosságúak.

A polipeptidek kifejezésére az FGF-receptor hatást mutató vagy gátló DNS-szekvenciák is alkalmazhatók. Például egy specifikus FGF-receptor hatású, tipikusan ligandumkötő hatású polipeptid kifejezésére körülbelül a 21. nukleotidtól (körülbelül 7 aminosav) a körülbelül a 2,1 kb-ig (körülbelül 700 aminosav) terjedő DNSszekvencia alkalmas.

A receptorfehérjék nagy mennyiségben való előállítását úgy végezhetjük, hogy a kifejezéshordozóban lévő egész receptort vagy részeit valamilyen kompatíbilis gazdaszervezetben, mint például E. coliban, élesztőben, emlőssejtben, rovarsejtben vagy béka oocitában kifejezzük. A kifejezéshordozó sejtbe való bevitelét jól ismert eljárásokkal, mint például kalcium-foszfátos kicsapással (a következőkben ismertetjük), lipofekcióval, elektroporációs vagy DEAE dextrán eljárással végezzük.

Az emlős gazdasejt általában valamilyen konzervált sejtvonal. Az FGF-R és a megfelelő növekedési faktorok tanulmányozására olyan emlőssejt transzfektálása vagy egyéb átalakítása célszerű, amelyben nincs FGFreceptor, vagy az FGF-receptor kis koncentrációban van jelen, mert ezen a helyen a szignál szekvencia a peptidet a sejtmembránra irányítja. A lényeges mennyiségű FGF-receptort nem tartalmazó sejtek közé tartoznak a limfociták, miociták, zöld majom cos-7 sejtek, valamint a kínai hörcsög petesejtek (CHO). A transzformáit vagy transzfektált vagy egyéb módon átalakított sejtek a vadtípusú receptorral funkcionálisan ekvivalens és a sejtnek FGF-érzékeny mitogén választ adó receptort kódolnak. Az ilyen sejtek lehetővé teszik a különböző eredetű FGF-ek kötő tulajdonságainak elemzését. A transzfektált sejtek készítmények vagy gyógyszerek FGF-agonista vagy -antagonista tulajdonságainak vizsgálatára is alkalmazhatók. A receptor tirozin kináz hatás mértéke vagy a nukleinsavszintézis sebessége úgy határozható meg, hogy a transzfektált sejteket gyógyszerekkel érintkeztetjük, és az FGF-ek vagy analógjaik gyógyszerrel kezelt sejtekre kifejtett hatását a kontrollal összehasonlítjuk. Gazdaszervezetként ugyan többnyire a legközönségesebb prokarióta sejteket, azaz E. coli törzseket használunk, azonban alkalmazhatunk egyéb prokariótákat, mint például Bacillus subtilist vagy Pseudomonast is. A találmány szerinti teljes receptort, a receptor egy részét vagy egy FGF-R-hatású polipeptidet kódoló szekvencia részeket vagy ffagmenteket tartalmazó DNS-szekvencia kifejezéshordozó előállítására vagy FGF- vagy FGF-R-hatású polipeptid szerkesztésre alkalmazhatók. Emlőssejtben való kifejezéshez kontroll szekvenciaként általában eukarióta promótert alkalmazunk. Néhány hordozó esetén a receptor saját kontroll

HU 215 581 Β szekvenciáit is alkalmazhatjuk. E. coli-transzformálásra a közönséges pBR322 prokarióta plazmid vektor vagy származékai [például a pkt279 (Contech) plazmid] [Bolavar és munkatársai: Gene, 2, 95 (1977)] alkalmazhatók. A prokarióta vektorok a transzkripció iniciálásra, adott esetben egy operátorral együtt prokarióta promótereket is tartalmazhatnak. A legáltalánosabban használt promoterek közé tartozik a β-laktamáz (penicillináz) és laktóz (lac) promoter [Cheng és munkatársai: Natúré, 198, 1056 (1977)], a triptofán (trp) promóter [Goeddell és munkatársai : Nucleic Acid Rés. 8, 457 (1980)], a PL-promóter, valamint az N-gén riboszómakötő hely [Shimatake és munkatársai: Natúré, 292, 128(1981)].

Az élesztővel alkalmazott promoterek lehetnek az enoláz génből származó promoterek [Holland és munkatársai: J. Bioi. Chem. 256, 1385 (1981)] vagy a glikolitikus enzim, például a 3-foszfoglicerát kináz szintézisének promótere [Hitzeman és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255 (1980)].

Nem természetes emlős promóterként alkalmazhatunk SV40-ből származó korai és késői promótereket [Fiers és munkatársai: Nautre, 273, 113 (1978)], valamint egér molony leukémiavírust, egér emlőstumor-vírust, madárszarkóma- vírust, adenovírus ΙΙ-t, boqúpapilloma-vírust vagy paliomát. Az FGF-receptor génmásolatok sokszorosításához a szerkezetet egy erősíthető génhez (például DHFR) kapcsolhatjuk.

A prokarióta transzformálást különböző eljárásokkal, köztük a kalcium-kloridos [Cohen S. N.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)] vagy a rubídium-kloridos [Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982)] eljárással végezhetjük. Az élesztő transzformálásra a Van Solingen és munkatársai: J. Bacter. 130946 (1977) és C. L. Hsiao és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979) irodalmi helyen ismertetett eljárást alkalmazhatjuk. Eukarióták esetén az emlőssejteket a Graham és van dér Eb: Virology, 52, 546 (1978) irodalmi helyen ismertetett kalcium-foszfátos kicsapatással vagy lipofektin (BRL) vagy retrovirális fertőzéssel [E. Gilboa: Experimental Manipulation of Gene Expression, 9. fejezet, Academic Press, P. 175 (1983)] transzfektálhatjuk. A megfelelő szekvenciákat tartalmazó aktuális kifejező vektorokat standard eljárásokkal, köztük ligálással és restrikciós enzimekkel (lásd példaként Maniatis) állíthatjuk elő. A DNS-t specifikus helyeken hasító kereskedelmi restrikciós enzimek, például a New England Biolabs, Waltham, Massachusetts, USA gyártótól szerezhetők be.

A kiónok kiválasztása a vektorszerkezettől függő markerekkel történik. A marker ugyanabban vagy eltérő DNS-molekulában, előnyösen azonos DNS-molekulában van. Emlőssejtek esetén maga a receptorgén a legjobb marker. Prokarióta gazdaszervezetekben a transzformáns kiválasztása az ampicillinnel, tetraciklinnel vagy egyéb antibiotikummal szemben mutatott rezisztencia alapján történhet. Valamely speciális termék hőmérséklet-érzékenysége is megfelelő markerként szolgálhat. Az FGF-R-receptorfehéije vagy peptidfragmens begyűjtése és tisztítása különböző eljárásokkal történhet. A peptid a gazdaszervezet egy lizátumából izolálható. A peptid kiválasztása esetén a felülúszóból nyerhető ki. Az FGF-R-peptid további tisztítását a fentiekben ismertetetteknek megfelelően HPLC, elektroforézis, affinitás kromatográfiás (előnyösen immunaffinitás vagy ligandumaffinitás) eljárással végezzük.

Az FGF-R rokon fajták cDNS-klónjai izolálására alkalmas további eljárás a polimeráz-láncreakció (PCR) [Saiki R. K. és munkatársai: Science 230,1350 (1985)]. Ebben az eljárásban az FGF-R-szekvencia különböző régióival azonos, két oligonukleotidet (27 mer) szintetizáljuk, majd a receptor-rokon mRNS-transzkriptek az RNS-forrásból való erősítésére alkalmazzuk. Az oligonukleotideket temperáljuk, és mérsékelten sztringens körülmények között a következőkben ismertetésre kerülő

2. példa szerinti PCR-körülményeket hozzuk létre. A kapott erősített fragmenteket szubklónozzuk, és az így kapott rekombináns kolóniákat nagyon sztringens és nem sztringens körülmények között (2. és 3. példa) ³²P-jelzett teljes hosszúságú FGF-R cDNS-sel próbáljuk. A nem sztringens körülmények között igen, de a nagyon sztringens körülmények között nem hibridizáló kiónok az FGF-R rokon mRNS transzkripteknek felelnek meg. Ezen túlmenően ez az eljárás az így megvalósuló illesztés eredményeként különböző változatú FGF-R cDNS-fajták izolálására alkalmazhatók [Frohman M. A. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998 (1988)].

A különböző FGF-receptorok és -fragmentek ellen poliklonális és/vagy monoklonális antitestek is előállíthatok. Az antitest kifejezést a homogén molekuláris antitestekre és a többségében különböző molekuláris antitesteket tartalmazó elegyekre egyaránt alkalmazzuk. A peptidfragmentek előállíthatok szintetikusan egy megfelelő szintetizátorban, ezután egy hordozó molekulához (például egy kulcslyuk limpet hemocianinhoz) kapcsolhatók, és néhány hónapon keresztül nyulakra olthatok. A nyúlszérum vizsgálatát az FGF-receptorfehérjére vagy -fragmentre kifejezett immunreaktivitás mérésével végezzük. Monoklonális antitesteket egerek FGF-R-fehéijével, FGF-R-polipeptidekkel vagy egérsejtekkel való beoltásával és így a klónozott FGF-receptor saját sejtfelületen való nagymértékű kifejezésével állítunk elő. A monoklonális antitesteket ELISAszkrinelésnek vetjük alá, és vizsgáljuk az FGF-receptorfehéqével vagy ennek polipeptidjeivel lejátszódó specifikus immunreaktivitását [E. Harlow és D. Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratories (1988)]. Az antitestek kísérleti és gyógyászati célokra alkalmazhatók.

A kívánt fibroblaszt növekedési faktor receptor polipeptid megfelelő mennyiségű előállítása esetén a fehérjét számos alkalmazási területen felhasználhatjuk. Ilyen tipikus alkalmazás az ezekhez a receptorokhoz specifikusan kötődő antitest előállítása. Az antitestek poliklonális vagy monoklonális jellegűek lehetnek, és előállításuk in vitro vagy in vivő eljárásokkal történhet.

Poliklonális antitestek előállításához egy megfelelő cél immunrendszert választunk. Ilyen immunrendszer

HU 215 581 Β tipikusan az egér vagy a nyúl immunrendszere. A lényegében tiszta antitestet az adott állatnak megfelelő, ismert eljárással adjuk az állatnak. Az injektálásra alkalmas tipikus helyek a talpak, valamint az intramuszkuláris, intraperitoneális vagy intradermális helyek. Az egér vagy nyúl helyett természetesen más állatot is alkalmazhatunk.

Az immunológiai választ immunológiai vizsgálati eljárással határozzuk meg. Az eljárásokban például az antigént előállító sejttel azonos sejtek által előállított antigénforrást valamilyen tisztítási eljárásnak vetjük alá. Az immunológiai vizsgálati eljárás lehet radioeljárás, enzimkapcsolt eljárás (ELISA), fluoreszcens eljárás vagy bármilyen, funkcionálisan ekvivalens, de a specifikus körülmények között előnyös eljárás.

10⁸ M-*, előnyösen 10⁹-10¹⁰ affínitású vagy erősebb monoklonális antitestek tipikus előállítása a Harlow és Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratory (1988); vagy Goding: Monoclonal Antibodies: Principles and Practics (2. kiadás), Academic Press, New York (1986) irodalmi helyeken ismertetett eljárásokkal történhet. Az előállítás röviden a megfelelő állatok kiválasztásával és az immunizálás lefolytatásával történik. Az állatok lépét megfelelő idő után kimetsszük, és az egyedi lépsejteket megfelelő szelekciós körülmények között tipikusan immortalizált mielomasejtekhez kapcsoljuk. A sejteket klonálisan elválasztjuk, és mindegyik klón felülúszóját az antigén kívánt régiójára specifikus antitest termelőképességére vizsgáljuk.

Egyéb, megfelelő eljárást is alkalmazhatunk. Ilyen például a limfociták antigén polipeptidek hatásának való in vitro alávetése vagy antitest könyvtárak fágokban való hasonló vektorokban való kiválasztása [Huse és munkatársai : Generation of a Large Cominatorial Library of the Immunglobulin Repertoire in Phage Lambda, Science, 246, 1275-1281 (1989)]. A találmány szerinti polipeptidek és antitestek módosítással vagy anélkül alkalmazhatók. A polipeptideket és antitesteket gyakran jelöljük; ezt egy érzékelhető jelet szolgáltató, kovalensen vagy nem kovalensen kötődő anyaghoz való kapcsolással végezzük. A jelölések és jelölési eljárások széles körben ismertek. Megfelelő jelölések például a radionuklidek, enzimek, szubsztrátok, kofaktorok, inhibitorok, fluoreszcens szerek, kemilumineszcens szerek vagy a mágneses részecskék. A jelzések ismertetését megtaláljuk a 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350,3 996 345, 4277437, 4275 149 és 4366241 számú USA-beli szabadalmi leírásokban. Rekombináns immunglobulinok előállítását ismerteti például a 4816567 számú USAbeli szabadalmi leírás.

A találmány tárgyköréhez tartozik a fíbroblaszt növekedési faktor receptor (FGF-R) tisztítási eljárása, valamint az FGF-receptorok sejten belüli szintetizálása is. Az eljárásokkal előállítható homogén receptorok, a receptorokat vagy ezek részeit kódoló nukleinsavszekvenciák, valamint az ilyen szekvenciákat tartalmazó kifejezéshordozók, az FGF-receptorokat tartalmazó sejtek és a receptorok elleni antitestek is a találmány tárgyköréhez tartoznak. Különösen fontosak a receptorok oldható formái, amelyek az FGF kötésében a receptorokkal versenyző kötőhelyeket tartalmaznak.

Azonban, amint azt a fentiekben ismertettük, az FGF-R valószínűleg dimer állapotban funkcionál. A receptor oldható formái a dimerizációt zavarhatják, és az FGF-ligandummal a kompetitív affinitástól eltérő mechanizmusú szignál transzdukció blokkolásban hatásosak. A különböző receptorformák oldható vagy intracelluláris vagy transzmembrán ffagmentjei várhatóan zavarják a dimerképződést, és így a szignál transzdukció valamennyi vagy legalább néhány típusának blokkolására alkalmazhatók.

Ez a megfigyelés vezetett a módosított hatású fibroblaszt növekedési faktor receptor in vivő módosító eljárásának kidolgozásához. Az eljárásban a betegnek annyi fíbroblaszt növekedési faktor receptor blokkoló szert adunk, amennyi a fíbroblaszt növekedési faktornak a fíbroblaszt növekedési faktor receptorokhoz való kapcsolódását hatásosan gátolja. A fehérjék FGF-családja a fentieknek megfelelően számos fontos fiziológiai eljárásban fontos szerepet játszik. Az oldható FGF-Rpolipeptidek hatásosan módosítják az FGF ezekben az eljárásokban létrejövő modulációjának mértékét. Emiatt a receptorok oldható formái az FGF-ek kompetetív kötőhelyeként alkalmazhatók. Ehhez hasonlóan a csonka FGF-kötőhelyek vagy módosított FGF-kötőhelyek különösen az ismertetett humán formák hasonló hatással, de mind a gazdaságosság, mind a mellékhatás tekintetében kisebb költséggel alkalmazhatók.

A találmány szerinti reagensek FGF- vagy FGF-Rtermelés diagnosztizálására is alkalmazhatók. A különböző betegségek, például Kaposi FGF-et termelő Kaposi-szarkóma, valamint a diabetikus retinopátia előfordulását ezeknek a fehérjéknek a természetellenes termelődés! szintje jelzi, és ezért az ilyen reagensektől függő diagnosztikai vizsgálatok ma már elvégezhetők.

A különböző FGF-ek a különböző ligandumokkal különböző affínitású, különböző receptortípusok létezését valószínűsítik. A találmány szerinti gének és fehérjék, a különböző receptorok között megfelelő különbségek találhatók. így ma már szövetmarkerek is hozzáférhetővé válnak.

Mivel a tumomövekedés nagymértékben a mikrovaszkularizáció függvénye, az FGF-R a tumomövekedés megelőzésére és elnyomására alkalmazható. Az FGF-tevékenység megelőzésével a találmány szerinti eljárás a tumor elleni harc fontos részét képezheti. A vírusos fertőzések is a speciális receptorokhoz való kötődés függvényei. Nyomatékos érvek támasztják alá, hogy a HSV (Herpes simplex vírus) az FGF-R-fehérjékhez való kötődéssel terjed. Az FGF-R oldható formák vagy fragmentek hatásos mennyiségű alkalmazása az ilyen vagy egyéb vírusok elleni, sejtben történő bejutás mechanizmusát felhasználó, megelőző eljárás lehet. A védelmi mechanizmus a kompetitív kötés, a dimer szerkezet felbomlása, a kombináció és egyéb tényezők függvénye.

A gyógyításhoz alkalmazott reagensek hatásos mennyisége különböző tényezők, köztük az alkalmazási eljárás, a megcélzott helye, a beteg pszichológiai álla14

HU215 581 Β pota, valamint az esetleg alkalmazott egyéb gyógyszerek függvénye. Emiatt az alkalmazott dózist egyedileg kell meghatározni. Az in situ alkalmazandó dózis tipikus meghatározásához a reagensek in vitro alkalmazott mennyisége a mértékadó. A humán dózis várható mértékének meghatározása történhet az adott betegségben szenvedő állatkísérleteknél beállított dózis segítségével is. A dózismeghatározáshoz szükséges megfontolások megtalálhatók a Gilman és munkatársai: Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. kiadás, MacMillan, New York, USA (1985) irodalmi helyen. Az FGF és receptorai között lévő nagy kötési affinitás következtében a reagensek feltételezhetően alacsony dózisban alkalmazhatók. A szokásos dózistartományok megfelelő hordozóval várhatóan legfeljebb 10 μηιοί/l, általában legfeljebb 100 nmol/1, rendszerint legfeljebb 1 nmol/1, előnyösen legfeljebb 10 pmol/1 (pikomol/1), még előnyösebben legfeljebb 100 fmol/1 (femtomol/1), és a legelőnyösebben legfeljebb 1 fmol/1 értéktartományig terjednek.

A következő példákat a találmány részletesebb ismertetésére mutatjuk be.

1. példa

A bFGF-receptor jellemzése

Először egy ¹²⁵I-jelzett bFGF-t kompetitív kötéssel Swiss 3T3 sejtekhez kötünk. Amint azt az 1(A) ábrán láthatjuk, az összefüggő 3T3 sejtekhez 2 Ci/pmól-os ¹²⁵Ijelzett bFGF-t adtunk 10⁵ sejtre t fmol ^l25I-jelzett bFGFkoncentrációban a következő anyagok jelzett koncentrációjú jelenlétében:

Nem módosított bFGF(-X-); biotin-bFGF (tömör négyszög); a biotin-FGF hozzáadása után a nem kötött frakciót avidin-agarózon inkubáljuk (nyitott négyszög); a bFGF hozzáadása után a nem kötött frakciót avidinagarózon inkubáltuk (nyitott háromszög). A kötési folyamatot 30 percig, 37 °C-on, 0,2 tömeg% zselatint és 15 U/ml heparint tartalmazó tenyészközegben (DMEH21) folytattuk le. A sejteket ezután 20 mmol/1 HEPES-t (pH=7,4), 02 tömeg% zselatint és 150 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmazó pufferral háromszor mostuk. A radioaktivitásukat Beckman gammaszámlálóval mértük. A maximális kötés (0% gátlás) 5700 cpm specifikus kötést (a nem specifikus kötés 600 cpm) jelent. A meghatározások mindegyikét három ismétléssel végeztük. A rekombináns humán bFGF [Barr és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 164671 (1988)] jódozását jódgyöngyökkel (Iodobeads, Pierce) végeztük. A bFGF-t 0,5-1 mCi 1251/1 pg FGF, 0,2 mol/1 NaPi, pH = 7,4, 2 jódgyöngy alkalmazásával jódoztuk, és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, és a reakciót ezt követően nátrium-metabiszulfit és feleslegben lévő kálium-jodidoldattal leállítottuk. A jódozott bFGF-t a reagálatlan szabad jódtól 0,2 mol/1 nátrium-foszfát-oldattal pH=7,5, 0,2 mol/1 nátrium-klorid-oldattal, és 0,2 tömeg%-os zselatinoldattal egyensúlyba hozott PD 10 oszlopon gélszűréssel elválasztottuk. A bFGF-t 10 mmol/1 Triszsósavban (pH=8,0) oldott 4:1 mólarányú cisztein aminosav :jódacetil-LC-biotin (Pierce) elegy alkalmazásával biotinileztük. A biotinilezést a Xamamoto és munkatársai: FEBS Lett., 176, 75 (1984) irodalmi helyen ismertetett eljárással, 5 órán át és 4 °C-on végeztük. A reagálatlan biotint, a fentiekben ismertetett PD10 kolonnákon (Pharmacia) gélszűréssel távolítottuk el. A tisztítási eljárásban a módosított és a nem módosított bFGF a ¹²⁵I-jelzett bFGF Swiss 3T3 sejtekben lévő nagy affmitású bFGF-receptorokhoz való kötésének gátlásában, valamint a bFGF-indukált tirozin kináz hatású anyagként ismert 90 kD fehéije foszforilezés stimulálásában nem különbözött (1 (A) ábra). Az avidin-konjugált agarózhoz való kötés mérésekor azt tapasztaltuk, hogy a biotinilező reakció a bFGF-molekulák 90-95%-át módosította.

Az 1 (B) ábrán a sejt bFGF-receptorok jelzett bFGFhez való in situ keresztkapcsolását mutatjuk be.

5xl0⁵ Swiss 3T3 sejthez adott esetben jelöletlen bFGF jelenlétében 0,1 pmol/1 ¹²⁵I-jelzett biotin-bFGF-t vagy ¹²⁵I-jelzett bFGF-t adtunk. A sejteket mostuk, és 0,15 mmol/1 diszukcin-imidil-szuberáttal (DSS, Pierce) keresztkapcsolásnak vetettük alá.

A sejteket ezután szolubilizáltuk, SDS poliakrilamid gél elektroforézisnek (PAGE) vetettük alá, és a ¹²⁵I-jelzett fehéqéket autoradiográfiás eljárással mértük. A ¹²⁵Ijelzett biotin-bFGF nagy affinitással a Swiss eT3 sejtben lévő bFGF-receptorokhoz kapcsolódott (disszociációs állandó 1 nmol/1), és egy, a ¹²⁵I-jelzett bFGF-hez térhálósán kapcsolódó bFGF-receptorral együtt vándorló 130 kD-s fehéijéhez térhálósodott.

Tisztított csirke bFGF-receptort állítottunk elő oly módon, hogy friss, 6 napos csirkeembriókat (29-30 állapot) a következő anyagokkal homogenizáltuk: Brinkmann politron; (1500 embrió/kísérlet); a végső koncentrációban 1:1 térfogatarányú 0,25 mol/1 szacharóz, 50 mmol/1 HEPES (pH=-7,5), 2 mmol/1 EDTA, 50 mmol/1 nátrium-fluorid, 150 pmol/l nátrium-ortovanadát, 30 mmol/1 nátrium-pirofoszfát, 1 mmol/1 fenilmetil-szulfonil-fluorid (PMSF), 20-30 kallikrein nemzetközi egység (KIU)/ml aprotinin, 10 pg/ml leupeptin és 1 pg/ml pepsztatin. A homogenátumot 45 percig 17 700 g-vel 4 °C-on centrifugáltuk. A pelletet 300 ml homogenizációs pufferben újraszuszpendáltuk, és így a membránfrakciónak (Mb) nevezett anyagot kaptuk. A membránfrakciót 30 percig, 4 °C-on, egyenlő térfogatú, következő összetételű anyaggal inkubáltuk: 2X lízis puffer (IX lízis puffer 10 mmol/1 Trisz-sósavat (pH = 7,5), 50 mmol/1 nátrium-kloridot, 5 mmol/1 EDTA-t, 1 tömeg% Triton Χ-100-at, 50 mmol/1 nátrium-fluoridot, 150 pmol/l nátrium-ortovanadátot, 30 mmol/1 nátrium-pirofoszfátot, 1 mmol/1 PMSF-t, 20-30 KlU/ml aprotinint, 10 pg/ml leupeptint és 1 pg/ml pepsztatint tartalmaz), majd 30 percen át 31000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszót szakaszosan egy 150 ml-es WGA-Sepharose 4B kolonnára vittük, majd először 300 ml lízis pufferral, és ezután 500 ml kolonnapufferral mostuk. A kolonnapuffer 20 mmol/1 HEPES-t (pH=7,5), 2 mmol/1 EDTA-t, 10 tömeg% glicerint, 0,1 tömeg% Triton Χ-100-at, 50 mmol/1 nátrium-fluoridot, 150 pmol/l nátrium-ortovanadátot, 30 mmol/1 nátrium-pirofoszfátot, 1 mmol/1 PMSF-t, 20-30 KlU/ml aprotinint, 10 pg/ml leupeptint és 1 pg/ml pepsztatint tartalmaz. A kolonnát 0,5 mol/1 N15

HU 215 581 Β acetil-glukozamint tartalmazó kolonnapufferral eluáltuk. A frakciókat tartalmazó eluátumokat összegyűjtöttük, és -70 °C-on tároltuk.

Az FGF-R-embriómembránban és WGA eluátumban való jelenlétének megállapítására a csirke bFGF-receptort 10 μΐ csirkeembrió membránfrakció (Mb) vagy 100 μΐ WGA-Sepharose 4B kolonnáról kapott eluátum 37 °C-on, 30 percig, adott esetben 200-szoros feleslegű nem jelzett bFGF jelenlétében (+) vagy távollétében (-) végzett inkubálásával térhálósításnak vetettük alá (2(A) ábra). A reakcióelegyhez 0,15 mmol/1 koncentráció eléréséhez szükséges DSS-t adtunk, és 10 percig jégen inkubáltuk. A mintákat ezután SDS PAGE, majd autoradiográfiás vizsgálatnak vetettük alá. A ¹²⁵I-bFGF nyers csirkeembrió membránfrakcióhoz való specifikus kötődését és keresztkapcsolódását csak egy 150 kd-s, egyszeres fehérjesávban tapasztaltuk (2(A) ábra). A csirke bFGF-receptor molekulatömege a bFGF molekulatömegének kivonása után 130-135 kD.

A 2(B) ábrán két nagyméretű ligandum affinitás tisztítási eljárás (mindkettőben 20000 embrióból álló kiindulási anyagot alkalmaztunk) eredményeit mutatjuk be. A WGA-Sepharose 4B kolonnáról kapott eluátumot a fentiekben ismertetetteknek megfelelően előállított biotin-bFGF készítménnyel (ligandum/receptor mólarány 10:1) és 15 U/ml heparinnal (az alacsony affinitású kötés redukálására), 4 °C-on inkubáltuk 30 percig. Az elegyet ezután egy 10 ml-es avidin-agaróz kolonnán (bFGF-agaróz) kétszer hajtottuk. A fehérje avidin-agarózhoz való nem specifikus kötésének meghatározásához (kontroll) a WGA-Sepharose 4B kolonnáról levett eluátumot a biotin-bFGF nélkül áthajtottuk az avidin-agaróz kolonnán (kontroll). A kolonnákat 200 ml, a Sepharose kolonnánál fentiekben ismertetett, 0,2 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó kolonnapufferral, majd 300 ml nátrium-kloridot nem tartalmazó kolonnapufferral mostuk, és ezt követően 10 mmol/1 szuramintartalmú kolonnapufferral eluáltuk. Leszedtünk 10-10 ml négy egymás utáni frakciót (1-4 frakciók), és a frakciókból vett mintákat SDS PAGE vizsgálatnak vetettük alá, és ezüst-nitráttal megfestettük. A 2(B) ábrán láthatjuk, hogy az avidin-agarózhoz FGF-függő módon csak egy egyszerű fehérje kapcsolódik, és ez a bFGF-receptor várt méreténél (130 kD) vándorol.

Az eluált fehérjéket akril-amid gél elektroforézissel választottuk el, és Coomassie Blue készítménnyel festettük meg. A bFGF-receptomak megfelelő sávot kivágtuk, és a fehérjét a M. W. Hunkapiller és munkatársai: Meth. In Enzymol. 91, 227 (1983) ismertetett eljárással elektroeluáltuk. Ezzel az eljárással csirkeembriónként 2-5 ng tiszta FGF-receptort kaptunk összesen 5%-os visszanyeréssel. A receptor további jellemzésére a fehérjét tripszinnel emésztettük. A peptidfragmenteket fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) elválasztottuk, és a fentiek szerinti, Yardén és munkatársai által ismertetett eljárással gázfázisú szekvenálásnak vetjük alá. Két, egymástól független készítményből a 3. ábrán ismertetett, tizennégy peptidből álló aminosavszekvenciát kaptuk. A két készítményben három peptid közös, ami a két független izolátum azonosságát jelzi. A triptikus peptidből négy, a LILGKPLGEGCFGQVVLA, IADFGLAR, MAPEALFDR és IYTHQSDVWSFGV (1. táblázat és 3. ábra) a tirozin kináz doménok egymás utáni szekvenciáival homológok (6. ábra). Ez egyezik azzal a tapasztalattal, hogy a tirozin kináz hatás a bFGF-receptorhoz kapcsolódik, amint azt a Huang és Huang: J. Bioi. Chem. 261, 9568 (1986) irodalmi helyen ismertetik. Ennek megfelelően a tisztított fehérje olyan tisztított bFGF-receptor, amely bFGF-hez kapcsolódik, molekulatömege a receptor várható molekulatömegével egyező, és tirozin kináz szekvenciákat tartalmaz.

Amint azt a fentiekben ismertettük, a tizennégy peptidből tizenegy aminosavszekvenciája az irodalomban korábban ismertetett részleges humán cDNS-klón szekvenciával (flg-vel lezárt fms-szerű gén) azonos [M. Ruta és munkatársai: Oncogene, 3, 9 (1988)]. Ezt a szekvenciát a proto-onkogén szekvenciához való homológiája alapján izoláltuk, és korábban nem ismerték fel, hogy transzmembrán receptorfehérjét kódol.

2. példa

Teljes hosszúságú csirke bFGF-receptor cDNSklón izolálása

Méretszelektált poli A+ mRNS-ból egy 6 napos csirkeembrió cDNS-könyvtárt szerkesztettünk. 10-30 tömeg%-os szacharóz gradiensen 200 pg poli A+ mRNS-t méret szerint frakcionáltunk, és a 3,5 Kb-os vagy ennél nagyobb RNS-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. 5 pg szelektált mRNS-ből a U. Gubler és B. Hoffinan: Gene, 25, 263 (1983) irodalmi helyen ismertetett eljárással cDNS-t állítottunk elő. Az eljárást a Pharmacia cégtől beszerzett cDNS-szintézis készlettel (kát. 27-9260-01) folytattuk le. A szintetizált cDNS-ek közül méret szerinti szelektálással elválasztottuk a 2,0 kb vagy ennél nagyobb méretű cDNS-eket, és a szelektált cDNS-eket ezután a ZapII bakteriofág vektor EcoRl helyére klónoztuk (Stratagene, kát. 23 6211). Az így kapott cDNS-könyvtár 2,0 χ 10⁶ független rekombinánst tartalmaz.

A könyvtárat a 3. ábra szerinti két egymás utáni peptidet kódoló ³²P-jelzett oligonukleotid próbával (TVALGSNVEFVCK és VYSDPQPHIQWLK) szkrineltük. Az oligonukleotideket kereskedelmi automatikus oligonukleotid szintetizátorral állítottuk elő. A két, 43-45 bázisú, 12 bázisos átfedő komplementer szekvenciát tartalmazó oligonukleotidet összeillesztettük, Klenow-féle dNTP (-dCTP), ³²P-dCTP és DNSpolimerázzal feltöltve jelöltük, így egy 70 bp-os jelölt próbát kaptunk. A szűrleteket nem sztringens körülmények között (20 tömeg% formamid, 5X standard kálium-citrát (SSC) és 5X Denhardt-oldat, 42 °C) hibridizáltuk, és 42 °C-on 0,2X SSC-vel mostuk. Három tenyészettisztítással huszonöt pozitív kiónt izoláltunk. A huszonöt pozitív klónból tizenegy nagyon sztringens körülmények között nick-transzlációval jelölt humán FGF-R cDNS-sel hibridizál, és mintaként alkalmazható (3. példa). A tizenegy klón mindegyike lényegében azonos volt, kivéve a ki ónok 5’ végénél bekövetkező hosszúságváltozást. A legnagyobb klón (3,2 kb)

HU 215 581 Β aminosavszekvenciája a fentiekben ismertetett fehérjetisztítási eljárással (3. ábra) előállított receptorpeptideknek mind a tizennégy szekvenciáját és az FGF-R teljes kódoló szekvenciáját tartalmazza. A transzmembrán régió és a hidrofób szignál szekvencia azonosítását a Kyte és Doolittle által a J. Mól. Bioi. 157, 105 (1982) irodalmi helyen ismertetett hidropátiás eljárással végeztük.

Egy körülbelül 3,5 Kb-os egyszerű hibridizáló sávot úgy azonosítottunk, hogy 5 γ csirkeembrió poli (A)+ RNS-t nagyon sztringens körülmények között (50% formamid), 42 °C-on, 5X Denhardt-oldattal és 5X SSCvel teljes hosszúságú csirke bFGF-receptor cDNS-sel próbáztunk. A szűrőket ezután 0,2X SSC-oldattal, 65 °C-on mostuk. A 3,5 Kb-os egyszerű hibridizáló sávot az RNS biot elemzéssel azonosítottuk (5(A) ábra). A klón 5’ végéhez közeli szekvenciára komplementer oligonukleotiddal primer-lánchosszabbítást folytattunk le. 5 μg csirkeembrió poli (A+) RNS-t 10 mmol/1 metilhigannyal denaturáltunk, ³²P-jelzett primerhez (5’ CTGCACGTCATCGCGCA-3’) illesztettük, és egér Moloney leukémiavírus reverz transzkriptázzal hosszabbítottuk. Az 5(B) ábrán látható:

- (S) sáv a ³²P-jelzett DNS-molekula méret-standardot (1 kb) mutatja;

- (E) sáv a meghosszabbított fragmentet (523 nukleotid) mutatja;

- (G, A, T és C) sávok az 5 tömeg%-os akril-amid szekvenáló gélt mutatják.

Az adatok azt mutatják, hogy a receptor mRNS 48 nukleotiddal hosszabb, mint az izolált klón.

A leghosszabb nyílt leolvasó keret (2,4 kb) aminosavszekvenciáját egy leolvasási fázisba illeszkedő kodon (-12. aminosav) tartalmaz, ezután egy iniciátor metionin (1. aminosav) és a teljes receptorkódoló szekvencia következik (3. ábra). A cDNS egy 91,7 kD csökkentett molekulatömegű fehéqét kódol; az ilyen molekulatömeg jó néhány ismert növekedési faktor receptor jellemző tulajdonsága. Tartalmaz egy egyszerű transzmembrán tartományt, egy NH₂-terminális hidrofób szignál szekvenciát, három sejten kívüli immunglobulinszerű domént és egy sejten belüli tirozin kináz domént (6. ábra). Tizenegy potenciális N-kapcsolt glikozilező helyet is találtunk. A csirke bFGF-receptor N- és O-kapcsolt glikozilezése lehet az oka a megfigyelt bFGF-receptor méret és a cDNS-szekvenciából várható méret különbségének.

A feltételezett sejten kívüli tartomány három immunglobulinszerű doménjét a következő három kritérium alapján azonosítottuk:

i) mindegyik doménben két karakterisztikus cisztein aminosav jelenléte;

ii) mindegyik immunglobulinszerű doménben az első cisztein aminosav COOH-vég oldalán 11-12 aminosavnyira egy konszenzus triptofán aminosav jelenléte; és iii) mindegyik immunglobulinszerű doménben a második cisztein aminosav NH₂-végi oldalán a DXGXYXC konszenzus szekvencia jelenléte.

Az interleukin-1 (IL— 1) receptor is három immunglobulinszerű domént tartalmaz, és a bFGF az IL-1gyel 25-30% szekvenciaazonosságot mutat. A receptorokban a vérlemezke eredetű növekedési faktor (Piatelet Derived Growth Factor=PDGF) és a kolóniastimuláló faktor-1 (CSF-1) esetén öt immunglobulinszerű dómén található.

A bFGF-receptort az jellemzi, hogy az első és a második immunglobulinszerű dómén közötti rész az immunglobulin nagycsalád egyéb tagjainál meg nem található szakaszból áll. A szakasz egy sorozat nyolc egymást követő savas aminosavat (EDDDDEDD), ezután három szerin aminosavat és két továbbá savas aminosavat tartalmaz (3. ábra). Néhány sejten belüli fehérjénél, elsősorban magfehérjénél ugyan ismertetnek olyan, megszakítatlan szakaszokat, amelyek 7—35 savas aminosavat tartalmaznak, azonban a transzmembrán receptorfehéqe sejten belüli tartományában az ilyen savas aminosavak teljesen szokatlanok.

További szokatlan tulajdonság a transzmembrán szegmens és a kináztartomány közötti egymás melletti membránrégió hosszúsága. Ez a régió általában a receptor tirozin kinázok között konzerválódik. így például az egymás melletti membránrégió a PDGF, CSF -1, epidermális növekedési faktor (EGF), humán epidermális növekedési faktor-2 (HER2) és inzulinreceptorokban a 49-51. aminosavak között foglal helyet. A bFGF-receptor a 87. aminosav környékén szokatlanul hosszú egymás melletti membránrégióval jellemezhető.

Az aminosavszekvencia citoplazmatikus régiója körülbelül 424 aminosav hosszú, és egy tirozin kináz szekvenciát tartalmaz (körülbelül a 452-759. aminosav). A bFGF-receptor kináz régiója a PDGF- és CSF-1 receptorokkal a legnagyobb szekvenciaazonosságot mutatja (51-53%). A bFGF-receptor a GXGXXG aminosavat és a tirozin kinázok adenozin 5’-trifoszfát (ATP) -kötő helyének részét képező konzervált lizin aminosavat (körülbelül az 512. aminosav) tartalmazza. A bFGFreceptor a két jellegzetes tirozin kináz szekvenciarészletet, a HRDLAARNVL és DFGLAR részleteket és egy, a pp60v-src fő foszforilező hellyel (körülbelül a 416. Tyr) analóg pozícióban lévő tirozint (körülbelül a 651. aminosav) is tartalmaz.

Az egyéb tirozin kinázokkal való homológiájukkal meghatározott bFGF-receptor kináz kódoló szekvenciája egy tizennégy aminosavas inszercióval megszakad. A kinázrégióban lévő inszert hossza rövidebb, mint a PDGF- és CSF-1 receptorokban található (körülbelül 104 és 70 aminosav), és körülbelül hasonló hosszúságú, mint az inzulin és inzulinszerű növekedési faktor I receptorokban inszertált szekvencia.

3. példa

Teljes hosszúságú humán FGF-receptor cDNSklón előállítása

Egy, az R. D. Ye T-C Wun és J. E. Sadler: J. Bioi. Chem. 262, 3718-3725 (1987) irodalmi helyen ismertetett eljárással előállított humán hámsejt DNS-könyvtárból egy humán FGF-receptor cDNS-klónt izoláltunk a 2. példában ismertetett oligonukleotid próba alkalmazásával.

HU 215 581 Β

A hámsejt könyvtárat 1 χ 10⁶ cpm/ml jelzett próbával, nagyon sztringens körülmények között (50 tömeg% formaldehid, 5X SSC, 5X Denhardts, 10 mmol/1 nátrium-foszfát, pH=6,5, 100 pg/ml lazacsperma DNS), 42 °C-on, 16-24 órán át hibridizáltuk, és 65 °C-on 0,2X SSC-vel és 0,1% SDS-sel mostuk.

A humán hámsejt cDNS-könyvtár első szkrinelésével négy kiónt azonosítottunk, és ezeket háromszoros tenyésztisztító eljárásnak vetettük alá. A kiónok közül háromból származó cDNS inszert azonos szekvenciákat képez, és a tisztított csirke bFGF-R-ből származó triptikus fragmentek szekvenciájával nagyon homológ szekvenciákat tartalmaz. A legnagyobb klón (körülbelül 3,6 kb) aminosav- és nukleinsavszekvenciáját a 4. ábrán mutatjuk be. A hidrofób szignál szekvenciákat körülbelül az 1-21. aminosavak, a ligandumkötő domént a sejten kívüli tartomány körülbelül 22-285. aminosava tartalmazza, transzmembrán régió körülbelül 286-306. aminosava és a citoplazmikus régió körülbelül 307-731. aminosava tartalmazza a tirozin kináz domént.

Ezzel az eljárással egyéb, nagyon rokon humán FGF-receptorok is izolálhatok.

4. példa

Humán aFGF—R cDNS-klón előállítása

Humán hámsejt vagy placentális könyvtárakat teljes hosszúságú FGF-R-próbákkal vagy FGF-R-szekvenciarészeket tartalmazó próbákkal szkrineltünk. A hibridizálást kevésbé sztringens körülmények között végeztük, és a mosást fokozatosan szigorodó körülmények között folytattuk le. A 2. és 3. példában ismertetett nagyon sztringens és kevésbé sztringens körülményeket alkalmaztuk. A két különböző fokozat között autoradiográfiás vizsgálatot végeztünk. A legsztringensebb körülmények után is pozitív kiónok mutatják a legnagyobb rokonságot a fentiekben ismertetett a 2. és 3. példák szerinti bFGF-receptorokkal. A mérsékelten sztringens körülmények között pozitív, de nagyon sztringens körülmények között már nem pozitív kiónok csak távoli rokonságot mutatnak. Az összes rokon, de nem azonos klón (4. ábra) meghatározását restrikciós térképezéssel és DNS-szekvenálással végeztük. Mindegyik rokon kiónt szelektáltuk, szubklónoztuk és kifejeztük. Ezután meghatároztuk a kifejezett FGF-rokon cDNS-ek különböző FGF-ekkel, azaz savas FGF-fel való kötőképességét.

Két próbát terveztünk; az egyik a sejten belüli, a másik a sejten kívüli FGF-R szekvenciát tartalmazza. Három szűrőt készítettünk. Az egyik szűrőt a sejten belüli FGF-R-próba alkalmazásával, nagyon szigorú körülmények között (2. és 3. példa) hibridizáltuk. A sejten kívüli próbával két szűrőt, az egyiket nagyon sztringens, a másikat kevésbé sztringens körülmények között hibridizáltuk.

Mivel a savas és bázisos FGF-ek szekvenciaazonossága csak 55%, receptoraik a ligandumkötő doménben szintén körülbelül 55% szekvenciaazonosságot mutatnak. A sejten belüli próbával nagyon sztringens körülmények között pozitív és a sejten kívüli próbával csak kevésbé sztringens körülmények között pozitív kiónok FGF-R rokon receptorok. Ezeket a kiónokat szelektáltuk, restrikciós térképezésnek vetettük alá, szekvenáltuk, és kifejeztük. A kifejezett receptorok különböző FGF, például savas FGF kötőképességét vizsgáltuk.

5. példa

Humán FGF-R cDNS-klónok jellemzése

Plazmidkonstrukciók

Transzfektáláshoz a PSV7d emlős kifejező vektort (P. Luciw, Chiron Corp.) BamHI/Sall helyeire egyedileg szubklónoztuk az 5’ nem transziáit szekvencia 46 nukleotidját tartalmazó, teljes hosszúságú csirke FGF-receptort, az 5’ nem transziáit szekvencia 13 nukleotidjét tartalmazó, teljes hosszúságú humán h2 cDNS-t és az egész 3’ nem transziáit szekvenciát. Ez a cDNS-fragmenteket egy SV40 promoter elemtől lefelé a megfelelő irányba igazította.

In vitro transzkriptáit RNS-ek előállítására alkalmas mintákat úgy szerkesztettük, hogy a Bluescript Sk (Stratagene) BamHI/Sall helyeire teljes hosszúságú csirke FGF-receptor cDNS-t és a Bluescript KS Pstl/Sall helyeire teljes hosszúságú humán FGF-receptor cDNS-eket (h2 és h3) szubklónoztuk. Ez a receptor szekvenciákat a T7 RNS-polimeráz promoter elemtől lefelé eső irányba helyezte. A hatékony transzlációs lehetőségek javításához az iniciátor metionintől felfelé eső ATG-szekvenciákat a szubklónozás előtt csirke, illetve humán szerkezeteknél az 5’ nem transziáit szekvencia 46, illetve 13 nukleotid érintetlenül hagyásával eltávolítottuk.

Sejtvonalak és transzfekció tömeg% magzati boíjúszérumot tartalmazó DME H21-ben patkány L6 vázizom mioblasztokat (ATCC CRL 1458) tenyésztettünk, és közvetlenül transzfektálás előtt Opti-MEM tápközegre (GIBCO) transzferáltuk. A kiszélesztést követően 24 órán belül 1 χ 10⁶ sejtet 20 pg megfelelő kifejező szerkezettel (cFGFR/pSV7d vagy h2 FGFR/psV7d) és 1 pg, neomicin rezisztencia gént (pSV2neo) tartalmazó vektorral ko-transzfektáltuk. A sejteket 50 pg lipofectinnel (Bethesda Research Laboratories) transzfektáltuk a gyártó által megadott eljárás szerint. 16 óra múlva 20 tömeg% magzati borjúszérumot tartalmazó, azonos térfogatú DME H21 tápközeget adtunk hozzá. A sejteket 48 óra múlva begyűjtöttük, és 1:10 arányban szelekciós tápközegbe [DME H21, 10 tömeg% magzati boíjúszérum, 500 pg/ml geneticin (GIBCO)] vittük. A transzfektált kolóniákat antireceptor peptid poliklonális antiszérum alkalmazásával megvalósított immun-blot vizsgálattal FGF-receptor kifejezésre vizsgáltuk.

Affinitásjelölés

A jelölést a Chiron Corporation rekombináns humán aFGF és humán bFGF alkalmazásával folytattuk le. Az affinitásjelölési kísérletekhez 5xl0⁶ sejtet 30 percig, 37 °C-on, adott esetben kétszázszoros feleslegben lévő, megfelelő nem jelzett ligandum jelenlétében 0,1 pmol ¹²⁵I-aFGF-fel vagy ¹²⁵I-bFGF-fel inkubáltunk. A sejteket ezután egyszer 20 mmol/1 HEPES-t,

HU 215 581 Β pH=7,4, és 0,2 tömeg% zselatint tartalmazó jéghideg DME H21-gyel és kétszer PBS-sel mostuk. 0,15 mmol/1 végső koncentrációig diszukcinimidil-szubenátot adtunk hozzá, és 4 °C-on, 15 percig hagytuk a folyamatot lejátszódni. A térhálósító szert ezután eltávolítottuk, és a sejteket 100 mmol/1 ditioeritritolt tartalmazó mintapufferben újraszuszpendáltuk, 5 percig forraltuk, majd SDS PAGE és ezt követően autoradiográfiás vizsgálatnak vetettük alá.

In vitro RNS-transzkripció

A transzkripció előtt a plazmid szerkezeteket Xholgyel linearizáltuk. A linearizált mintákból T7 RNSpolimeráz alkalmazásával, 500 μοί/ΐ rNTP (200 μιηοΐ/ΐ rGTP) és 500 μηιο1/1 5’GpppG3’ (Pharmacia) jelenlétében RNS-eket transzkriptáltunk. A transzkripciós reakcióelegyet 4 °C-on, 2 órán át inkubáltuk, majd RNS-áz mentes DNS-ázzal kezeltük, fenollal extraháltuk, etanollal kicsapattuk, szárítottuk, és vízben újraszuszpendáltuk.

Oociták injektálása

A vizsgált állatokat 0,06 tömeg%-os p-amino-etilbenzoát-oldattal elaltattuk, sebészeti úton oocitákat távolítottunk el, és ezeket manuálisan 10-20 oocitát tartalmazó nyalábokra metszettük. A nyalábokat 2 órán át, szobahőmérsékleten 1 mg/ml II. típusú kollagenát (Sigma) tartalmazó MBSH módosított Barth-sóoldatban [Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press (1982)] inkubáltuk, majd 2 mg/ml boíjúszérum albumint tartalmazó MBSH-sel bőségesen mostuk. Az egyes oocitákat 19 °C hőmérsékleten MBSH-ban (1 mg/ml BSA) tároltuk.

Az oociták vegetatív pólusát 50 ni vízzel vagy 1 pg/μΐ koncentrációjú RNS vizes oldattal növényszárba injektáltuk. Az injektálás után az oocitákat 19 °C-on, 48 órán át inkubáltuk, majd ⁴⁵Ca⁺⁺-kiáramlás vizsgálatnak vetettük alá.

Ehhez egy 24 lyukú lemez lyukaiba egyenként 50 injektált oocitacsoportot tettünk, és 4 χ 0,5 ml, BSA-t nem tartalmazó és Ca⁺⁺-mentes MBSH-oldattal mostuk. Az oocitákat ezután 3 órán át, 19 °C-on 100 pCi/ml ⁴⁵CaCl₂-t tartalmazó 0,5 ml mosóoldattal inkubáltuk, majd 6x0,5 ml MBSH-val (1 mg/ml BSA) mostuk, és áttettük egy másik 24 lyukú lemezre (lyukanként 5 oocitát). Az ezt követő mosásokat és inkubálásokat 0,5 ml, 1 mg/ml BSA-t tartalmazó MBSH alkalmazásával folytattuk le. 10 perc múlva a lyukak mindegyikéből eltávolítottuk a kondicionálódott felülúszót, és friss tápközeget tettünk helyébe. A kondicionált tápközegmintákat egyenként Bechman szcintillációs számlálóval végzett számlálásnak vetettük alá. A háttér kiáramlás stabilizálódása után a meghatározott koncentrációkhoz ligandumokat adtunk, és folytattuk a tápközeggyűjtést.

A tizenhat kísérletből kettőben az oocitákat vízzel injektáltuk, és az FGF-receptor DNS-ekkel injektált oocitákból kapott ⁴⁵Ca⁺⁺ kiáramlás mértékének megfelelő ⁴⁵Ca⁺⁺ kiáramlást mutató aFGF-fel vagy bFGF-fel stimuláltuk. Nem vizsgáltuk a jelenség okát, de elképzelhető, hogy az endogén FGF-receptorok szennyező follikuláris sejteken vagy magukon az oocita felületeken való kifejeződésének köszönhetők. A vízzel injektált oociták a többi kísérlet egyikében sem mutattak számottevő kiáramlás választ, miközben a receptor RNS FGF-re adott válasza az alapmérés 10-40-szerese.

Injektált oocitákban nem mértük a receptorszintet, mert a mi antireceptor poliklonális antiszérumunk nem specifikusan ugyanolyan molekulatömegű abundáns oocitafehéije felismerésére képes, mint az FGF-receptor a Westem-blot vizsgálatban. Emellett az oocitákban kifejezett exogén receptorok koncentrációja egészen kicsi.

Humán cDNS-klónok izolálása és jellemzése

J. Evan Sadler (Washingtoni Orvosi Egyetem, St. Louis, USA) által adományozott humán placentából és humán köldökvénasejtekből nyert komplementer DNSkönyvtárakat a fentiekben ismertetett, a csirke FGF-receptor cDNS-klónok azonosításánál alkalmazott ³²Pjelzett oligomerekkel azonos termékekkel vizsgáltuk. A szűrőket hibridizáltuk, és Standard eljárással, nagyon sztringens körülmények között mostuk. Mindkét könyvtárból 250 000 fágot szkrineltünk, és így összesen hét kiónt izoláltunk. Az általunk vizsgált négy kiónt (h2, h3, h4 és h5) a Sequenase rendszerrel (United States Biochemical Corporation), didezoxi lánclezárásos eljárással szekvenáltuk. A h2, h3 és h4 kiónokat az endotheliális sejtkönyvtárból és a h5 kiónt a placentakönyvtárból kaptuk. A nukleotidszekvencia-elemzések azt mutatják, hogy mind a négy klón azonos 5’ nem transziáit szekvenciát tartalmaz, és a 3 ’ -végükön poliA-részek vannak. Azonban csak a h23’ -vég poli-Arészt előzi meg konszenzus adenilező szekvencia (AATAAA; 37), ami azt mutatja, hogy a többi klón 3’ -vég poli-A-része belső priming következménye. A h2, h3, h4 és h5 cDNS-ek rendre a 3’ nem transziáit vég 0,93 kb, 0,78 kb, 0,95 kb és 0,2 kb részét tartalmazzák. A h2 és h3 3’ nem transziáit szekvenciája és a h4 és h5 3’ nem transziáit szekvenciája azonos. A h2/h33’ nem transziáit szekvenciák pedig teljes egészében különböznek a h4/h5 3 ’ nem transziáit szekvenciáktól.

Polimeráz-láncreakciók

A humán nagyon savas régiónak megfelelő primer (körülbelül) a h2-ben lévő 4-52. aminosavak;

_s-GTTTCTTTCTCCTCTGAAGAGGAGT-3’ és egy, a csirke FGF-receptor Igl doménnek megfelelő degenerált primer (körülbelül az 58-69. aminosavak; 5’-GA(TC)GACGTGCAG (A/T) (G/C) CATCAACTGGGTGCGTGATGG- 3 ’ alkalmazásával amplifikáló reakciókat (h2) folytattunk le. Egyéb, további reakciókban a humán nagyon savas régióból származó prímért és a humán FGF-receptor

5’-GAGGATCGAGCTCACTGTGGAGTA-3’ 5’ nem transziáit régióból származó, második prímért alkalmaztunk. A reakcióelegyek 750 ng humán genomális DNS-t, 10-10 pmol prímért, a négy dNTP-ből egyenként 200 μπιοΙ/1-t, 50 μΐ 10 mmol/1 Trisz-sósavban, pH=8,3, 1 egység Taq polimerázt (Perkin Elmer Cetus), 50 mmol/1 kálium-kloridot, 1,5 mmol/1 magnézium-kloridot és 100 ng/ml BSA-t tartalmaztak. A reakció kivitelezését egy Ericomp iker-blokk rendszerben végeztük. Harmincegy olyan ciklust folytattunk le, amely egy 94 °C-on végzett 50 mp-es denaturálást, egy

HU 215 581 Β °C-on végzett 1 perces és egy 72 °C-on végzett 3 perces láncnövesztést tartalmaz.

Négy egyedi humán FGF-receptor cDNS izolálása és jellemzése

A csirke bázisú FGF-receptor egy egyszeres transzmembrán domént, egy, 3 Ig-szerű domént és egy nagyon savas domént tartalmazó sejten kívüli tartományt és egy hasított tirozin kináz domént tartalmazó sejten belüli tartományt tartalmaz. A csirke FGF-receptor cDNS nagyon homológ az irodalomban korábban ismertetett, tirozin kinázt kódoló részleges cDNS-hez (hflg); ez a funkció az ismertetéskor még ismeretlen volt. A csirke bFGF-receptor és a humán flg közötti azonosság (95%) azt mutatja, hogy a hflg a bFGF-receptor humán megfelelője. Teljes hosszúságú humán FGF-receptor cDNS-eket úgy állítottuk elő, hogy hflg cDNS-szekvencia bázisú oligonukleotid próbával egy humán köldökvéna hámsejt cDNS-könyvtárat és egy humán placenta cDNS-könyvtárat szkrineltünk. Mindegyik könyvtárból 250 000 tenyészet kezdeti szkrineléséből származó pozitív kiónokat izoláltuk; négyet a hámsejt könyvtárból és hármat a placentakönyvtárból.

A cDNS-klónokat a 3’ -végüknél lévő restrikciós térkép mintái alapján két csoportba sorolhatjuk. Ezek egyik csoportja olyan cDNS-klónokból származik, amelyek sokkal rövidebbek. A csoportok képviselői a könyvtárukból származó kiónokban vannak jelen. A hosszabb cDNS-klóncsoportot képviselő két kiónt (h2 és h3), és a rövidebb cDNS-klóncsoportot képviselő két kiónt (h4 és h5) teljes egészében szekvenáltuk. A négy humán receptorformából kivett aminosavszekvenciákat a 7. ábrán a csirke FGF-receptor szekvenciához hasonlítjuk. A különböző receptorformák sematikus ábrázolását a 8. ábrán mutatjuk be.

A h2 és h3 kiónok előre várt aminosavszekvenciái gyakorlatilag azonosak, és csak három aminosavban (a 7. ábrán a h2-ben az 59., 60. és 103. aminosavak) különböznek. Nukleotid vonatkozásban a h2 és h3 csak az ezt a három aminosavat kódoló helyzetekben különbözik. A h2/h3 nyitott leolvasó keret egy hidrofób szignál szekvenciát és olyan szokatlan savas domént (nyolc egymás utáni savas aminosav a kísérő aminosavakkal) tartalmaz, amelyet először a csirke FGF-receptor cDNS-irodalomban ismertetett szekvenciájában mutattak be. A h2 és h3 sejten kívüli doménjai a csirke FGFreceptorral nagymértékű homológiát mutatnak azzal a különbséggel, hogy a h2 és h3 kiónokban egy Ig-szerű dómén szekvenciája hiányzik (a 8. ábrán jelölt I). A transzmembrán régió és a citoplazmiatikus doménok nagymértékű homológiát mutatnak a csirke FGF-receptor megfelelő doménjaival.

A rövid cDNS kódoló szekvenciái, a h4 és h5 csak két aminosavban különböznek (a h4-ben az 59. és 60. helyzetben; a h4 és h5 nukleotid szekvenciák csak az ezt a két aminosavat kódoló helyzetekben különböznek). A szignál szekvencia, a savas tartomány és az egyik Ig-szerű dómén (IglI) a h2 és h3 megfelelő régióival teljesen azonos. A h4 és h5 megkülönböztető tulajdonsága a transzmembrán dómén közelében lévő Igszerű domán (IglII). Ennek a doménnek közel a fele a h2 és h3 megfelelő szekvenciáival azonos, azonban a karboxil-végi fele a h2 és h3 szekvenciákkal nem rokon. A h2 és h3 szekvenciáktól és a csirke FGF-receptor cDNS-től eltérően a h4 és h5 nem kódol hidrofób transzmembrán régiót vagy citoplazmatikus domént.

Az izolált, összes humán cDNS-szekvencia csak két Ig-szerű tartományt tartalmaz. Annak eldöntésére, hogy a humán FGF-receptor tartalmaz-e első Ig-szerű domént (Igl) humán előbőr fibroblasztból (HFF) izolált genomiális DNS-en polimeráz-láncreakciót folytattunk le. Ezekben a kísérletekben egy, a csirkereceptor Igl dómén szekvencián alapuló prímért (58-69. aminosavnak megfelelő), valamint egy, a humán receptor savas tartományából származó szekvencián alapuló második prímért (a h2-ben a 44-52. aminosavak) amplifikáltunk. A primerek alkalmazásával egyetlen 1,3 kb-os genomiális ffagmentet amplifikáltunk. Amint azt a 9. ábrán ismertetjük, ez a fragment a csirke FGF-receptor Igl doménjével homológ (körülbelül 83% aminosavazonosság) szekvenciákat kódol. Ezen túlmenően ezeket a szekvenciákat a receptor nagyon savas tartományát kódoló szekvenciáktól egy körülbelül 1,0 kb-os intron szekvencia választja el. Ennek megfelelően a humán FGF-receptor gén egyértelműen a humán cDNS-klónokban nem található Igl domént kódoló szekvenciákat tartalmaz. Ezen túlmenően az Igl dómén szekvencia és a savas régió szekvencia közötti intron arra utal, hogy a két vagy három Ig-domént tartalmazó formák expressziója feltehetően alternatív „splicing” („Splicing”: az mRNS érési folyamata) útján szabályozódik.

Annak meghatározására, hogy a három lg domént tartalmazó receptorforma kifejeződik-e a HFF-sejtekben, a HFF mRNS-ből előállított cDNS-sel PCR-t végeztünk. HFF cDNS-ről a fentiekben ismertetett primerekkel egyetlen 0,24 kb-os ffagmentet sikerült amplifikálnunk. Ez a fragment tartalmazza az Igl domént és a savas tartományt kódoló szekvenciákat, de nem tartalmaz intron szekvenciákat. Ebből arra következtethetünk, hogy a HFF-sejtek a receptor három Ig-domént tartalmazó formáját írják át. Annak eldöntésére, hogy a HFF-sejtek a receptor két Ig-domént tartalmazó formáját is expresszálják-e, a savas régió prímért és egy, a humán FGF-receptor 5’-végi nem transziáit régiójának szekvenciáján alapuló prímért alkalmaztuk. Ezekben a reakciókban egy olyan, 0,23 kb-os fragmentet amplifikáltunk, amely a mi cDNS-klónjainkhoz hasonlóan nem tartalmazott az Igl doménnek megfelelő szekvenciákat. Megállapítható tehát, hogy a receptor két Igdomént tartalmazó formája szintén átíródik a HFF-sejtekben.

Mind a három Ig-szerű, mind pedig a két Ig-szerű domént tartalmazó receptorok megkötik mind a savas, mind pedig a bázikus FGF-et.

Mivel a három Ig-doménos receptorforma (amelyet először csirke cDNS-könyvtárból izoláltak) tisztítása a bázikus FGF-ekhez való affiniátásán alapul, érdekesnek látszott a receptor savas-FGF-kötő képességének meghatározása. A meghatározást úgy végeztük, hogy a csirkereceptor három Ig-doménos formáját patkány L6 mioblaszt sejtvonalban fejeztük ki, amely normáli20

HU 215 581 Β san nem expresszál FGF-receptort. Az L6 sejtekben emellett két Ig-doménos humán h2 receptorformát is kifejeztünk. A 10. ábrán a transzfektált sejtekkel lefolytatott affinitásjelzést mutatjuk be. A sejteket ^l25I-aFGF-fel vagy ¹²⁵I-bFGF-fel inkubáltuk, és a kötött ligandumokat 0,15 mmol/1 diszukcinimidilszuberáttal térhálósítottuk. Bármelyik ligandum alkalmazása azt eredményezte, hogy a receptor cDNS-ekkel transzfektált sejtekben egyszeres térhálós sávok jelentkeztek (1, 3, 9 és 9 sávok), de az önmagában vektorral transzfektált sávokban nem (5, 6, 11 és 12). Ha a keresztkötött komplex molekulatömegéből az FGF molekulatömegét (17 kD) kivonjuk, a receptor három Igdoménos formája becsült molekulatömegére 145 kD értéket, és a receptor két Ig-doménos formája becsült molekulatömegére 125 kD értéket kapunk. A feleslegben lévő nem jelzett ligandumok gátolják a keresztkötött komplexek képződését (2, 4, 8 és 10 sávok). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az FGF-receptor három Ig-doménos és két Ig-doménos formái egyaránt képesek a savas és bázikus FGF megkötésére. A Scatchard-féle kötési elemzés azt mutatja, hogy a ¹²⁵I-aFGF-nek a három Ig-doménos vagy a két Ig-doménos formához történő maximális kötődésének a fele 0,1 nmol/1 koncentrációnál érhető el. Hasonlóképpen, a ¹²⁵I-bFGFnek a három Ig-doménos vagy a két Ig-doménos formához történő maximális kötődésének a fele 0,1 nmol/1 koncentrációnál érhető el.

Mind a három Ig-doménos, mind pedig a két Igdoménos FGF-receptor forma biológiai választ közvetít mind savas, mind bázikus FGF hatására.

Annak meghatározására, hogy az FGF-receptorok transzmembrán alakjait aktiválja-e a savas vagy a bázikus FGF, a receptorokat Xenopus oocitákban fejeztük ki, és érzékeny Ca⁺⁺-kiáramlás méréssel mértük a receptor aktiválását. Ezt a kísérletet az egyéb Ca+ ⁺ mobilizáló ligandumok, közöttük kolecisztokinin, bombezin, vazopresszin és angiotrenzin II ligandum receptorok kifejezésére alkalmaztuk. A ligandumindukált kiáramlás a Ca++-sejten belüli tárolókból való mobilizálását mutatja, és a sejten belüli Ca⁺⁺-koncentráció növekedését és a kiáramlás felgyorsulását eredményezi.

A kísérletekben teljes hosszúságú cDNS-t transzkriptáltuk in vitro, és a sapkás mRNS-eket Xenopus oocitákba injektáltuk. Az injektált oocitákat 48 óra múlva feltöltöttük ⁴⁵CaCl₂-vel, és a ⁴⁵Ca-kiáramlás méréssel meghatároztuk a ligandumfüggő kalciummobilizálódást (11. ábra). Akár a savas aFGF (A és B), akár a lúgos bFGF (C és D) hozzáadása a csirke FGF-receptort (A és C) kódoló RNS-sel vagy a humán h2 receptort (B és D) kódoló RNS-sel injektált oocitákból gyors és nagy mennyiségű Ca⁺⁺ kiáramlást indukál. Ezzel szemben a humán h3 RNS-sel (B és D) vagy önmagában vízzel (A-D) injektált oociták sem az aFGF-re, sem a bFGF-re nem adnak választ. A 100 perces idő leteltével pozitív kontrollként karbacholt alkalmaztunk. A karbacholra endogén receptort kifejező oociták, valamint az FGF-receptor RNS-sel vagy vízzel injektált oociták a karbacholstimulálás után pozitív választ mutatnak. Arra a következtetésre jutottunk, hogy az FGFreceptomak mind a 3 Ig-doménos (cFGF-R), mind pedig a 2 Ig-doménos (h2) formája képes biológiai válaszadásra, mind savas, mind pedig bázikus FGF hatására. Tehát a savas és a bázikus FGF ligandumot kötő doménjai feltehetően az erősen savas domént, valamint az IglI és IglII doménokat magába foglaló receptorrégióban találhatók.

A humán h2 receptor egyértelműen mindkét ligandumra választ ad, azonban nem tapasztaltunk választ a h3 receptorformát kódoló RNS-sel injektált oocitákban. Feltételezhető, hogy a h2 és h3 közötti három aminosavkülönbség okozza a fehéijék különböző válaszát. Az is lehetséges azonban, hogy a h3 RNS-sel injektált oociták válaszadásának elmaradása a h3 fehérje szokatlanul alacsony expressziós szintjének következménye. Sajnos ez ideig nem sikerült a receptor fehéije expressziós szintjét meghatározni az oocitákban.

A kettő vagy három sejten kívüli Ig-szerű domént tartalmazó FGF-R-formák mind a savas, mind a lúgos FGF-t megkötik, és választ adnak rájuk. Az FGF-receptor néhány mRNS-e csak az FGF-receptor sejten kívüli doménjét, vagyis a sejtből könnyen távozó fehéijét kódolja.

Az a tény, hogy az FGF-receptor két Ig-szerű doménja (h2) mind az aFGF-t, mind a bFGF-t nagy affinitással megköti, lehetővé tette a ligandumok megkötésére szolgáló doménoknak a nagyon savas, valamint az IglI és IglII doménokat körülvevő régióban való lokalizálását.

A h4 és h5 receptorformák nem tartalmaznak transzmembrán szekvenciákat, és valószínűleg az FGFreceptor kiválasztott formáit képviselik. Az előzetes adatok azt mutatják, hogy a h4 cDNS-sel transzfektált sejtek egy, anti-FGF-R poliklonális antiszérum által felismert, 70 kD-s fehéijét választanak ki.

Az FGF-receptor kiválasztott formáinak szerepe nem ismert; szolgálhatnak a sejten kívüli FGF-ek koncentrációjának szabályozására, és ezáltal az FGF-ek sejtfelület FGF-receptorokhoz való hozzáférhetőségének szabályozására; vagy az FGF-ek speciális helyen való tárolására és elkülönítésére; vagy a kiválasztott formák az FGF-eket valamilyen sejten belüli részben megköthetik, és ezáltal a faktor kiválasztásának eszközéül szolgálhatnak. Ez nagyon fontos jellemző, ha figyelembe vesszük, hogy az aFGF és bFGF szignál szekvenciákat nem tartalmaz, és kiválasztó mechanizmusuk nem ismert.

Az eredményeinkből arra következtethetünk, hogy a receptordiverzitás feltehetően alternatív „splicing” eredménye. Öt különböző FGF-receptor cDNS-fajtát izoláltunk. Az aminosavszekvenciák összehasonlítása megerősíti, hogy mind az öt fajta ugyanabból a génből származik. A humán receptorformák másik fontos jellemzője, hogy a sejten kívüli dómén tartalmaz-e ArgMet-szekvenciát (a h2-ben és h4-ben az 59. és 60. aminosavak).

A ¹²⁵I-aFGF vagy ¹²⁵I-bFGF alkalmazásával végzett affinitásjelölési kísérletekben az FGF-receptor három Ig-doménos formáját expresszáló transzfektált sejteken egyetlen jelölődő, 145 kD-os receptor fehérjét,

HU 215 581 Β az FGF-receptor két Ig-doménos formáját expresszáló transzfektált sejteken pedig egyetlen jelölődő 125 kDos receptorfehéijét azonosítottunk (lásd all. ábrát). Az is lehetséges, hogy a két receptorfajta jelenléte a receptor három Ig-doménos és két Ig-doménos formái együttes expressziójának eredménye. Az adatok egyértelműen azt mutatják, hogy egy egyszeres FGF-receptorfajta az aFGF-t és a bFGF-t egyaránt nagy affinitással megköti, és e faktorok biológiai hatását közvetíti. Kísérleteinkben azért alkalmaztuk a savas és bázikus FGF-eket, mert ezek az FGF-család legjobban jellemzett tagjai, és rekombináns alakban könnyen hozzáférhetők.

6. példa

FGF-R-peptidek vagy -fragmentek kompetitív kötése

FGF-R rokon antigonisták és agonisták kialakítása

Egy gazdaszervezetben (például emlőssejtekben vagy baculovírussal fertőzött rovarsejtekben) egy, az FGF-R sejten kívüli, ligandumkötő doménjét vagy ennek egy részét tartalmazó fragmentet (azaz a 3. ábrán bemutatott 22-374. aminosavakat vagy a 4. ábrán bemutatott 22-285. aminosavakat tartalmazó fragmentet) vagy analógját fejeztük ki, és az 1. példa szerinti eljárással tisztítottuk. A ligandumkötő dómén fragmenteket emellett egy peptid szintetizátor (Applied Biosystems) alkalmazásával állítottuk elő, és a tisztítást HPLC-eljárással végeztük.

Az FGF-R-fragmenteket és analógjaikat (FGF-Rex) különböző koncentrációkban a ¹²⁵I FGF Swiss 3T3 sejtekhez való kötésére kifejtett blokkolóképességükre vizsgáltuk. A kompetitív kötés vizsgálatot az 1. példában ismertetett eljárással, az 1(A) ábra szerint végeztük úgy, hogy a jelöletlen ligandumok helyett FGF-Rex-eket alkalmaztunk.

Az FGF-Rex-eket az FGF-indukált mitogenézis gátlásra kifejtett hatásuk alapján is megvizsgáltuk úgy, hogy mértük a sejtek ³H-timidin-felvételét, és megszámoltuk a sejteket. Az FGF sejtfelszíni receptorhoz való kötését gátló FGF-Rex-ek antiagonistaként viselkednek, és blokkolják ³H-timidin felvételét blokkolóként és növelhetik az FGF-indukált sejtek számát. Az FGF-Rex-ek agonistaként is viselkedhetnek; azaz a ligandumközvetítésű receptor-receptor kölcsönhatást mimikáló sejtfelületi receptorokkal dimerizálhatók. Ilyen esetben az FGF-Rex-ek a ligandum hiányában mitogenézist stimulálhatnak vagy az FGF-közvetítésű mitogénválászt javíthatják.

Az FGF-Rex-ek esetén azt is megvizsgáltuk, hogy gátolják vagy aktiválják a Swiss 3T3 sejtek 90 szubsztrátfehéije FGF-indukált tirozin foszforilezését vagy a sejttel társult FGF autofoszforilezését. Az FGF-indukált tirozin foszforilezést gátló FGF-Rex-ek az antagonisták. A sejttel társult FGF-R autofoszforilezését FGF hiányában aktiváló FGF-Rex-ek az agonisták.

Az FGF-Rex-ek antiangiogén hatását is megvizsgáltuk. Az FGF-Rex-eket először in vitro vizsgáltuk, az FGF indukálta növekedésre és endotélsejtek véredényekbe történő mobilizálására kifejtett gátló hatása vonatkozásában. Angiogenézis vizsgálatot aortikus gyűrű vizsgálati eljárással, in vitro végeztünk. Az aortikus gyűrűket FGF-ek és FGF-Rex-ek jelenlétében vagy távollétében kialakított kollagén mátrixba tettük. A hámsejtek szaporodtak, és az aortikus gyűrűből, az FGF jelenlétében, néhány nap alatt edények képződtek. A korábbi vizsgálatokban antagonistaként viselkedő FGF-Rex-ek hozzáadása meggátolja a kapilláris szaporodás FGF-indukált növekedését. Az angiogén FGF-Rex-ek még FGF-ek jelenlétében is agonisták.

Megvizsgáltuk az FGF-analógok, angiogén faktorok, antiangiogén faktorok, valamint az FGF-R sejten kívüli részeivel szembeni antitestek tisztított vagy kifejezett FGF-R-rel való közvetlen vagy az eredeti FGFkötésre való versenyeztetésével megvalósított kötőképességét is. Emellett megvizsgáltuk ezek mitogenézis (agonista) stimuláló képességét vagy FGF-fuggő mitogenézis (antagonista) gátlóképességét, valamint az FGF-R kifejező sejtekben létrejövő tirozin foszforilező képességét is. Ezekkel a vizsgálatokkal meghatározhatjuk, hogy például az angiogén és antiangiogén faktorok hatása receptorközvetítésű-e vagy nem, és van-e angiogén és antiangiogén faktor receptor specifikus jelleg (azaz bázikus FGF-R-savas FGF-R kapcsolat).

A vizsgálatot úgy végeztük, hogy az FGF-analógokat rádió jelöléssel láttuk el, tisztítottuk, és a megfelelő fiziológiai pufferben [azaz tenyészközegben vagy foszfátpufferolt sóoldatban (PBS)], 37 °C-on, 0,5 órán át vagy 4 °C-on, 2-24 órán át kifejeztük.

A komplexet kicsapattuk (5-10 tömeg% polietilénglikol, 1 mg/ml IgG), és szűréssel elválasztottuk (például Whatman GFA szűrőn), és a kapcsolódó radioaktivitást meghatároztuk.

A leírásban ugyan csak a találmány bizonyos specifikus részleteit ismertettük, azonban nyilvánvalóan ezek különböző módosításai is a találmány tárgyköréhez tartoznak.

Claims (26)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás fibroblaszt növekedési faktor receptorokkal (FGFR-ekkel) kapcsolatos betegség kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy FGFR-t blokkoló szemek a fibroblaszt növekedési faktor FGFR-hez történő kötődését megakadályozó mennyiségét gyógyászatilag elfogadható hordozó- és/vagy segédanyagokkal elegyítjük, amely FGFR-t blokkoló szer a 7. ábrán bemutatott szekvenciájú humán FGFR vagy annak legalább hét egymást követő aminosavát tartalmazó fragmense, vagy a 7. ábrán bemutatott szekvenciájú humán FGFR-rel reagáló monoklonális ellenanyag.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy blokkolószerként humán FGFR-t vagy ennek fragmensét tartalmazó blokkolószert alkalmazunk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán FGFR-ként vagy fragmenseként egy, a következő szekvenciák bármelyikét tartalmazó nuklein22

   HU215 581 Β savval transzformált sejtben előállított FGFR-t vagy FGFR-fragmenst alkalmazunk:

   a) a 3. vagy 4. ábra szerinti DNS-szekvencia;

   b) a 7. ábra szerinti polipeptidek bármelyikét kódoló DNS-szekvencia; és

   c) a 3. vagy 4. szekvenciával sztringens körülmények között hibridizálódó DNS-szekvencia.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy blokkolószerként egy FGFR tirozin kináz régió nélküli, sejten kívüli doménjét tartalmazó blokkolószert alkalmazunk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy blokkolószerként a 7. ábra szerinti h3 jelű FGFR-t alkalmazzuk vagy annak legalább hét aminosavat tartalmazó fragmensét vagy ezek bármelyikével reagáló monoklonális ellenanyagot alkalmazunk.
6. 6. Eljárás FGFR-szegmenst tartalmazó fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 7. ábrán bemutatott szekvenciájú FGFR-t vagy annak legalább hét egymást követő aminosavát tartalmazó fragmensét kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy IglI vagy IglII domént tartalmazó polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk, melynek sejten kívüli doménja 80 aminosavat tartalmaz egy, a 7. ábrán bemutatott humán FGFR 1-287. aminosavai közül.
9. 9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk, melynek IglI doménja a 7. ábrán bemutatott humán szekvencia 85-141. aminosavai közül legalább hét aminosavat tartalmaz.
10. 10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy IglI és IglII domént egyaránt tartalmazó polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 7. ábrán bemutatott oldható humán fehéqe 222-300. aminosavai közül származó 79 aminosav hosszúságú szekvenciát magába foglaló karboxi-terminális szekvenciát is tartalmazó polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lényegében h4-nek vagy h5-nek megfelelő szekvenciájú polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
13. 13. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy legfeljebb 85 kD molekulatömegű, FGFR-ből származó fibroblaszt növekedési faktorkötő domént tartalmazó polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
14. 14. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 7. ábrán bemutatott h3 jelű FGFR-ből származó polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
15. 15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oldható polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
16. 16. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk, amely polipeptid a következő szegmensek bármelyikét is tartalmazza: szignál szegmens, Igl szegmens, savas szegmens, IglI szegmens, IglII szegmens, IglIIT szegmens vagy transzmembrán szegmens.
17. 17. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk, mely polipeptidben a fibroblaszt növekedési faktorkötő dómén az IglI és IglII domének mindegyikéből legalább mintegy 30 aminosavat tartalmaz.
18. 18. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy FGFR-ként csirke FGFR-t tartalmazó polipeptidet kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
19. 19. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy sejten belüli doméntől mentes humán FGFR-t kódoló izolált nukleinsavat expresszálunk.
20. 20. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzkripciós promoter szekvenciát is tartalmazó izolált nukleinsavat expresszálunk.
21. 21. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet az izolált nukleinsavval transzformáit sejtben állítjuk elő, és az izolált nukleinsav a következő szekvenciák bármelyikét tartalmazza:

    a) egy 3. vagy 4. ábra szerinti DNS-szekvencia;

    b) egy, a 7. ábra szerinti polipeptidek bármelyikét kódoló DNS-szekvencia; vagy

    c) egy, a 3. vagy 4. ábrán bemutatott szekvenciával sztringens körülmények között hibridizálódó DNSszekvencia.
22. 22. Eljárás FGFR-fragmens elleni antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 3., 4. vagy 7. ábrán bemutatott, legalább hat egymás utáni aminosavat tartalmazó polipeptid-epitóp ellen antitestet állítunk elő.
23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő epitópok bármelyike ellen állítunk elő antitestet: szignál szegmens, Igl szegmens, savas szegmens, IglI szegmens, IglII szegmens vagy IglIIT szegmens.
24. 24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan antitestet állítunk elő, amely gátolja a fibroblaszt növekedési faktor kötődését az FGFRfragmenshez.
25. 25. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 7. ábrán bemutatott h3 jelű FGFR-ből származó epitóp ellen állítunk elő antitestet.
26. 26. Eljárás fibroblaszt növekedési faktor vagy FGFR adott mintában történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy a mintát 7. ábra szerinti fibroblaszt növekedési faktor receptor szegmenssel kombináljuk; és meghatározzuk a szegmens és minta közötti kötés mértékét.