DE69033109T2

DE69033109T2 - Rezeptoren für fibroblasten-wachstumsfaktoren

Info

Publication number: DE69033109T2
Application number: DE69033109T
Authority: DE
Inventors: Daniel Johnson; Pauline Lee; Lewis Williams
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1989-07-06
Filing date: 1990-07-06
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2010-07-07
Also published as: SG72657A1; DK0481000T3; EP0481000B1; US6384191B1; CA2063431C; US6350593B1; CA2063431A1; EP0481000A4; NO310032B1; AU6077990A; EP0481000A1; AU638734B2; HUT61052A; US6355440B1; HU215581B; FI920027A0; US5707632A; NO920060L; KR100235266B1; JPH04506604A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, im speziellen Fibroblasten-Wachstumfaktor-Rezeptor (FGF-R). Im speziellen stellt sie verschiedene gereinigte Fibroblasten-Wachstumsiaktor-Rezeptorproteine, für die Rezeptorproteine kodierende Nukleinsäuren, Verfahren zur Produktion von gereinigten FGF-R-Proteinen, nach diesen Verfahren erzeugte Proteine, Antikörper gegen diese Proteine sowie diagnostische und therapeutische Anwendungen dieser verschiedenen Reagenzien bereit.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Polypeptid-Wachstumsfaktoren sind Mitogene, die auf Zellen wirken, indem sie sich spezifisch an Rezeptoren binden, die sich an der Plasmamembran befinden. Diese Rezeptoren weisen üblicherweise drei identifizierbare Hauptbereiche auf. Beim ersten handelt sich um einen extrazellulären Bereich, der die Domäne enthält, die sich an den Polypeptid-Wachstumsfaktor bindet (d. h. die Liganden-Bindedomäne). Der zweite Bereich ist ein Transmembranbereich, und der dritte ist ein intrazellulärer Bereich.
Die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-(FGF-R-)Proteine binden sich an eine Familie verwandter Wachstumsfaktor-Liganden, die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-(FGF-)Familie. Diese Familie von Wachstumsfaktoren ist durch Aminosäuresequenzhomologie, betonte Affinität zu Heparin-Bindung sowie die Fähigkeit gekennzeichnet, Angiogenese und mitogene Aktivität gegenüber Zellen mit epithelialem, mesenchymalem und neuralem Ursprung zu fördern.
Die FGF-Familie umfaßt die folgenden sieben bekannten FGFs:
(1, 2) sauren FGF (aFGF) und basischen FGF (bFGF) (D. Gospadarowicz et al., Mol. Cell. Endocrinol. 46, 107 (1986);
(3) das int-2-Genprodukt (R. Moore et al., EMBO. J. 5, 919 (1986);
(4) das hst-Genprodukt oder den Kaposi-Sarkom-FGF (K.). Anderson et al., Nature 332, 360 (1988); M. Taira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2980 (1987));
(5) FGF-5 (X. Zhan et al., Mol. Cell. Biol. 8, 3487 (1988));
(6) Keratinozyten-Wachstumsfaktor (J. S. Rubin et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86, 802 (1989)); und
(7) FGF-6 (I. Marics et al., Oncogene 3, 335 (1989)).
Die Wirkung von saurem und basischem FGF wird durch die Bindung an Hochaffinitäts- Zelloberflächen-Rezeptoren mit etwa 145 und 125 kDa vermittelt (G. Neufeld und D. Gospodarowicz,). Biol. Chem. 261, 5631 (1986)).
Das Zitat von Imamura et al., "Purification of Basic FGF Receptors from Rat Brain", Biochem. Biophys. Res. Communication 155, 583 (15. September 1988), offenbart die Reinigung von Nanogramm-Mengen eines basischen FGF-Rezeptors (bFGF-R) aus Rattenhirn.
Es sind zwar Genmoleküle kloniert worden, die für eine Anzahl an Wachstumsfaktor- Rezeptoren kodieren (z. B. Mäuse-PDGF-Rezeptor, Yarden et a., Nature 323, 226 (1986), aber zuvor ist noch kein Klon als für einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (FGF-R) kodierend identifiziert worden. Unter Verwendung von Antiphosphotyrosin-Antikörpern zum Screenen von λgt11-cDNA-Expressionssammlungen wurde cDNA mit 2,5 kb, die für ein neues Tyrosin-Kinase-Gen mit der Bezeichnung bek (bakteriell exprimierte Kinase) kodiert, aus einer Mäuseleber-cDNA-Sammlung isoliert (S. Kornbluth et al., "Novel Tyrosin Kinase Identified by Phosphotyrosine Antibody Screening of cDNA Libraries", Mol. Cell. Biol. 8, 5541 (1988)). Die bek-Sequenz enthielt keinen Transmembranbereich und konnte daher nicht als Wachstumsfaktor-Rezeptor identifiziert werden. Ein weiteres Protein-Tyrosin-Kinase-Gen mit der Bezeichnung fig (fms-arti ges Gen) wurde durch Hybridisierung unter schonenden Bedingungen mit einer v-fms- Onkogensonde aus einer menschlichen Endothelzell-cDNA-Sammlung isoliert. (M. Ruta et al., "A Novel Protein Tyrosine Kinase Gene Whose Expression is Modulated During Endothel Cell Differentiation", Oncogene 3, 9 (1988)). Diese Autoren konnten keinen Transmembranbereich in ihrer isolierten Sequenz identifizieren und stellten daher die Hypothese auf, daß flg für eine zytoplasmatische Tyrosin-Kinase kodiert.
Es ist behauptet worden, daß FGF-Rezeptor aus von menschlichen Nabelvenen abgeleiteten Endothelzellen isoliert worden ist und ein MG von 130.000 aufweist (Neufield et al.,. of Cell. Physiol. 136, 537-542). Es wurde keine Sequenzinformation bereitgestellt. Lee et al. (Reinigung des Rezeptors für FGF und Klonieren seiner cDNA) berichten über das Klonieren, ohne Details dafür anzugeben.
Die gereinigten und klonierten Hühner-bFGF- und Menschen-bFGF-Rezeptoren gemäß vorliegender Erfindung weisen in jenen Bereichen auf, die isoliert wurden, Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit mit den bek- und fig-Klonen auf. Allerdings waren sowohl die berichteten bek- als auch flg-Sequenzen unvollständig, und es gab keine Erkennung ihrer Funktion als FGF-Binderezeptoren. Darüber hinaus konnten nach den früheren Berichten viele der gemäß vorliegender Erfindung beschriebenen Struktur- und Funktionsmerkmale nicht erkannt werden.
Mitglieder der FGF-Familie scheinen bei der Gewebsentwicklung, Wiederherstellung von Gewebe, Erhaltung von Neuronen sowie bei der Pathogenese eine Rolle zu spielen. Die abweichende Expression von FGF kann Zeiltransformation durch einen autokrinen Mechanismus verursachen. Darüber hinaus können FGFs das Tumorwachstum und die Durchdringungsfähigkeit erhöhen, indem sie das Blutgefäßwachstum im Tumor stimulieren oder indem sie die Produktion von Proteinen, wie Plasminogenaktivator, herbeiführen. Es fehlt jedoch unglücklicherweise eine vollständige Identifizierung der beteiligten Komponenten und der zum Einsatz kommenden Mechanismen und Wechselwirkungen.
Gereinigte FGF-Rezeptoren und Fragmente sowie isolierte DNA-Sequenzen, die für definierte FGF-Rezeptoren und definierte Fragmente kodieren (z. B. die Liganden-Bindedomänen) werden das Begreifen der Fibroblasten-Wachstumfaktor-Funktionen wesentlich beschleunigen. Ebenso werden Antikörper gegen spezifische und definierte Bereiche des FGF-Rezeptors verfügbar. Diese Reagenzien kommen sowohl bei der Diagnose als auch der Therapie der obengenannten Verfahren zum Einsatz. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Anforderungen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt gereinigte Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorproteine (FGF-R), für FGF-R-Proteine kodierende Nukleinsäuren, Verfahren zur Herstellung gereinigter FGF-R-Proteine, durch diese Verfahren hergestellte gereinigte Proteine, Antikörper gegen diese Proteine und Fragmente sowie diagnostische und therapeutische Anwendungen dieser Reagenzien bereit. Vor allem stellt die vorliegende Erfindung lösliche und sekretierte Formen der Rezeptoren bereit, die eine ungewöhnliche Rezeptorstruktur aufweisen.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein gereinigtes lösliches Polypeptid bereit, das IgII- und IgIII-Domänen einer der in Fig. 7 gezeigten Aminosäuresequenzen oder eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zumindest zu 85 % homolog zur IgII- oder IgIII- Domäne einer dieser Sequenzen sind; wobei dem Polypeptid die Transmembran-Domäne fehlt und das Polypeptid fähig ist, die Bindung zwischen einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor zu hemmen.
Zu solchen Polypeptiden gemäß vorliegender Erfindung zählt ein Polypeptid, das umfaßt: eine erste Ig-Domäne, die (i) zwei Cysteinreste, (ii) einen Tryptophanrest, 11 oder 12 Aminosäuren an der carboxylterminalen Seite jenes der obengenannten Cysteinreste, der dem n-terminalen Ende am nächsten ist, von diesem entfernt, und (iii) eine Sequenz DXGXYXC an der aminoterminalen Seite des anderen der Cysteinreste umfaßt; eine zweite Ig-Domäne, C-terminal zur ersten Domäne, die ebenfalls die Merkmale (i), (ii) und (iii), wie für die erste Ig-Domäne definiert, aufweist, mit der Ausnahme, daß die zweite dieser Ig-Domänen anstelle des anderen Cysteinrests und der Sequenz (iii) eine carboxyfterminafe Sequenz aufweisen kann, die zumindest zu 85% homolog zur 79- Aminosäuren-Sequenz der Reste 224 bis 302 oder 222 bis 300 des menschlichen Proteins h4 bzw. h5 aus Fig. 7 ist.
Die Erfindung stellt auch ein gereinigtes Polypeptid bereit, das die in Fig. 7 als h4 oder h5 bezeichnete menschliche Sequenz umfaßt, sowie eingereinigtes Polypeptid mit weniger als 85 kD, das eine Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Bindedomäne eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors umfaßt; wobei der Rezeptor eine Aminosäuresequenz, wie in Fig. 7 gezeigt, oder eine Allel-Variante oder Mutante davon umfaßt, oder eine homologe Sequenz, für die eine Nukleinsäure kodiert, die unter rauhen Bedingungen, zu denen eine Temperatur von über 37ºC und eine Salzkonzentration von weniger als 1 M zählen, an DNA hybridisiert, die für die Sequenzvariante oder Mutante kodiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen monoklonalen Antikörper bereit, der sich an ein Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung bindet.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Nukleinsäuren bereit, insbesondere isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid gemäß vorliegender. Erfindung kodieren, wie z. B. eine isolierte Nukleinsäure, welche die gesamte oder einen Teil einer Sequenz in der IgII- oder der IgIII-Domäne, die in einer der Fig. 3, 4 oder 9 dargestellt werden, umfaßt oder unter rauhen Bedingungen, zu denen eine Temperatur von über 37ºC und eine Salzkonzentration von weniger als1 M zählen, selektiv damit hybridisiert und die für ein Polypeptid kodiert, das fähig ist, die Bindung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors mit einem Fibroblasten-Wachstumsfakto-Rezeptor zu hemmen.
Nukleinsäuren können zur Bereitstellung von Polypeptiden gemäß vorliegender Erfindung beispielsweise nach einem Verfahren exprimiert werden, bei dem das Peptid in einer Zelle erzeugt wird, die mit einer Nukleinsäure transformiert ist, die eine Sequenz umfaßt, die für das Peptid kodiert, das mit Transkriptions- und Translations-Initiationssequenzen operabel verbunden ist, wobei das Verfahren das Exprimieren der Nukleinsäure und das Gewinnen des FGF-R-Peptids umfaßt.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gegen ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorfragment, wobei das Verfahren einen Schritt der Herstellung eines Antikörpers gegen ein Polypeptidepitop umfaßt, das zumindest sechs zusammenhängende Aminosäuren eines Polypeptids gemäß vorliegender Erfindung umfaßt.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Messen eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors in einer Zielprobe bereit, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
das Kombinieren der Zielprobe mit einem Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung; und
das Bestimmen des Ausmaßes an Bindung zwischen dem Segment und der Probe.
Die vorliegende Erfindung wird beispielsweise in einem Verfahren zum Modifizieren einer durch Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor modulierten Aktivität in vivo angewandt, umfassend das Verabreichen einer Menge eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor- Rezeptor-Blockers, der bewirkt, daß die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Bindung an den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor verhindert wird, an einen Patienten.
Alternativ dazu kann die Erfindung eingesetzt werden, um ein Verfahren zum Hemmen der Bindung zwischen einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und einem Fibroblasten- Wachstumsfaktor-Rezeptor in einer Lösung bereitzustellen. Dieses Verfahren umfaßt einen Schritt des Kombinierens eines FGF-R-Peptid, z. B. eines Peptids, das Sequenzhomologie mit einer in den Fig. 3, 4 oder 7 beschriebenen Sequenz aufweist, mit der Lösung oder dem Medium, die/das Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor, üblicherweise nativen Fibroblasten-Wachstumfaktor-Rezeptor, enthält. Solche Verfahren sind in vitro nützlich, nachdem markierter FGF-R-Peptid in Assayverfahren eingesetzt worden ist.
Gemäß vorliegender Erfindung werden auch Zusammensetzungen beschrieben, die ein lösliches FGF-R-Polypeptid mit zwischen etwa 5 und 200 zusammenhängenden Aminosäuren einer menschlichen extrazellulären FGF-R-Domäne aufweisen. Ein Polypeptid enthält zumindest etwa 80 Aminosäuren von den Resten 1 bis 287 eines menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors aus Fig. 7 oder eine IgII- oder IgIII-Domäne, oder von beiden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 vergleicht die Bindung verschiedener Derivate von FGF an FGF-R. Fig. 1(A) ist eine grafische Darstellung der prozentuellen Bindungshemmnung von ¹²&sup5;I-markiertem bFGF. Fig. 1(B) ist ein Autoradiogramm von vernetzten bFGF-Swiss 3T3-Zellen, die Gelelektrophorese unterzogen wurden.
Fig. 2(A) ist ein Autoradiogramm von vernetzten Hühner-Membranfraktionen und WGA- Eluaten, die Gelelektrophorese unterzogen wurden. Fig. 2(B) ist ein silbergefärbtes Gel, das reinen FGF-Rezeptor zeigt, der aus Affinitätsreinigung resultiert, die am WGA-Sepharose 4B-Säulen-Hühnerembryo-Eluat vorgenommen wurde, wie in Fig. 2(A) gezeigt.
Fig. 4 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz eines Hühner-bFGF-Rezeptors.
Fig. 5(A) stellt ein Autoradiogramm eines Northernblots von Hühner-RNA, sondiert mit cDNA-Hühner-bFGF-Rezeptor unter sehr rauhen Bedingungen, dar. Fig. 5(B) stellt ein Autoradiogramm einer Primer-Verlängerung von Hühner-mRNA dar, die Elektrophorese auf einem Acrylamidsequenziergel unterzogen wurde.
Fig. 6 ist ein Schema eines Hühner-bFGF-Rezeptors, das die saure Domäne (schwarzes Kästchen); den Transmembranbereich (schraffiertes Kästchen), Tyrosin-Kinase-Domäne (gepunktetes Kästchen); die Position der SH-Cysteinreste (S) (im Gegensatz zur S-Bezeichnung ion Tabelle I); und die Position von Tryptophanrest in bezug auf den ersten Cysteinrest in der Ig-artigen Domäne (W) zeigt.
Fig. 7 liefert einen Aminosäuresequenzvergleich verschiedener unterschiedlicher FGF- Rezeptorformen. Die Aminosäuresequenzen von 4 menschlichen Rezeptorformen werden im Vergleich mit einer Hühner-FGF-Rezeptorsequenz gezeigt. Sequenzen, die sich von der Hühner-FGF-Rezeptorsequenz unterscheiden, sind in leeren Kästchen angezeigt. Transmembransequenzen sind unterstrichen. Diese DNA-Sequenzen liegen in GenBank/EMBL-Datenbanken unter den folgenden Eingangsnummern vor: h2 ist M34185, h3 ist M34186, h4 ist M34187 und h5 ist M34188.
Fig. 8 liefert eine schematische Darstellung verschiedener unterschiedlicher FGF-Rezeptoren. Die folgenden Strukturmerkmale werden identifiziert: mutmaßliche hyrophobe Signalsequenz (schwarze Kästchen), der stark saure Bereich (leere Kästchen), Transmembrandomäne (schraffierte Kästchen), Kinase 1- und Kinase 2-Domänen (gepunktete Kästchen) und der divergierende Bereich von h4/h5 (Zickzacklinie). Sternchen geben die Position an, an der h2 und h4 die Sequenz ArgMet enthalten, der Hühner-Rezeptor einen einzigen Asn-Rest enthält und h3 und h5 keine entsprechenden Reste enthalten. Dreiecke zeigen die Position an, an der h3 einen Glu-Rest enthält und alle anderen Rezeptorformen einen Lys-Rest enthalten. Die Zahlen im oberen Teil der Figur geben das Ausmaß an Aminosäure-Identität zwischen ähnlichen Domänen des menschlichen h2- Rezeptors und des Hühner-Rezeptors an.
Fig. 9 bietet einen Vergleich verschiedener menschlicher genomischer FGF-Rezeptorsequenzen mit abgeleiteten Aminosäuresequenzen von FGF-Rezeptor-cDNA-Klonen. Die durch PCR erhaltene Sequenz eines menschlichen Genom-Fragments wird im Vergleich zu Menschen- und Hühner-cDNA-Sequenzen gezeigt. Ein Intron mit 1 kb trennt Genom-Sequenzen, die für die Ig-artige (Ig) Domäne kodieren, und den stark sauren Bereich. Strichlierte Linien stellen eine kontinuierliche Sequenz ohne Zwischenräume dar. Die für den Hühner-FGF-Rezeptor gezeigte abgeleitete Aminosäuresequenz beginnt mit dem Initiator-Methioninrest (1) und endet mit dem sauren Bereich (EDDDDEDD; Aminosäuren 125-132 in cl FGF-R). Die für den menschlichen h2-FGF-Rezeptor gezeigte Aminosäuresequenz beginnt mit dem Initiator-Methioninrest (1) und endet mit dem sauren Bereich (EDDDDDDD; Aminosäuren 37-44 in h2).
Fig. 10 zeigt die Vernetzung von saurem oder basischem FGF mit Rezeptoren in Zellen, die mit FGF-Rezeptor-cDNAs transfiziert wurden. L6-Zellen (5 · 10&sup5;), die mit dem cFGFR/pSV7d-Expressionskonstrukt (Spuren 1, 2, 7 und 8), dem h2FGFR/pSV7d-Expressionskonstrukt (Spuren 3, 4, 9 und 10) oder mit Vektoren alleine (Spuren 5, 6, 11 und 12) transfiziert wurden, wurden mit 0,1 pMol ¹²&sup5;I-aFGF (Spuren 1-6) oder ¹²&sup5;I-bFGF (Spuren 7-12) in Gegenwart oder Abwesenheit eines 200fachen Überschusses an unmarkiertem aFGF (Spuren 2, 4 und 6) oder bFGF (Spuren 8, 10 und 12) inkubiert. Bindung erfolgte 30 min lang bei 37ºC. Die Zellen wurden dann zweimal mit eiskaltem DME H21 gewaschen, das 20 mM HEPES, pH 7,4, 0,2% Gelatine, enthielt, und zweimal mit eiskaltem PBS gewachen. Disuccinimidylsuberat (DSS) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,15 mM zugegeben, und Vernetzung für 15 min bei 4ºC herbeigeführt. Die Proben wurden in Probenpuffer resuspendiert und dann SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von Autoradiographie.
Fig. 11 veranschaulicht saure und basische FGF-Induktion eines &sup4;&sup5;Ca&supmin;&supmin;-Ausflusses von Xenopus-Oocyten, denen RNA injiziert wurde, die für einen Hühner-FGF-Rezeptor oder den menschlichen h2-FGF-Rezeptor kodiert. Die Grafiken zeigen &sup4;&sup5;Ca&spplus;&spplus;-Ausfluß von Oocyten, denen Hühner-FGF-Rezeptor RNA (A und C, leere Quadrate), menschlicher h2-RNA (B und D, leere Quadrate), menschlicher h3-RA (B und D, schwarze Dreiecke) oder Wasser (A-D, schwarze Quadrate) injiziert wurde. Injizierte Oocyten wurden 3 Stunden lang bei 19ºC mit &sup4;&sup5;CaCl&sub2;, inkubiert und dann ausgiebig gewaschen. Gruppen von 5 Oocyten wurden in einzelne Näpfe einer 24 Napf-Platte gefüllt, und 0,5 ml Me dium wurde zugegeben. In 10 min-Intervallen wurde das Medium zum Zählen entfernt und frisches Medium zugegeben. Nach 40 min wurden aFGF (Panel A und B) oder bFGF (Panel C und D) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 nM zugegeben. Als positiver Vergleich wurde Carbachol nach 100 min zugegeben. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert dreier Näpfe dar.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

INHALTSANGABE

I. Allgemeine Beschreibung

A. FGF-R
1. Strukturmerkmale
a. Extrazelluläre Domäne
i. Signalsequenz
ii. Ig-Domänen
iii. saurer Aminosäurebereich
b. Transmembransegment
c. Intrazelluäre Domäne
i. Tyrosin-Kinase
ii. Insert
2. Funktion
a. Bindung von FGF
b. Bindung an FGF-R-Peptid
c. Tyrosin-Kinase-Aktivität
B. Physiologische Funktionen
1. zellulär
2. Gewebedifferenzieung
3. auf den Organismus bezogen

II. Polypeptide

A. lösliche Formen
B. verkürzte Formen
C. Fusionsproteine
D. Genetische Varianten (stellengerichtete Mutagenese)
E. Proteine umfassende Zusammensetzungen

III. Nukleinsäuren

A. Isolierte Nukleinsäuren
8. Rekombinante Nukleinsäuren
C. Nukleinsäuren umfassende Zusammensetzungen

IV. Verfahren zur Herstellung von FGF-R

A. Proteinreinigung
1. Affinität für derivatisierten FGF
2. verschiedene Liganden, gleicher Rezeptor
B. Expression von Nukleinsäuren
V. Antikörper
VI. Anwendungsverfahren
A. Diagnose
B. Therapie

I. Allgemeine Beschreibung

Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung homogene FGF-R-Peptide bereit. Diese homogenen FGF-Rs umfassen einen basischen Hühner-Fibroblasten- Wachstumsfaktor-Rezeptor und verschiedene menschliche Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren. Es werden homogene Polypeptide beschrieben, die entweder FGF-R-Liganden-Bindungsaktivität aufweisen oder einen Abschnitt der Liganden-Bindedomäne eines FGF-R umfassen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung homogene Polypeptide bereit, die natürlich vorkommenden FGF-Bindeproteinen mit unerwarteten Strukturmerkmalen entsprechen. Eine Klasse stellt lösliche Proteine bereit, die sowohl ein Transmembransegment als auch eine Tyrosin-Kinase-Domäne aufweisen. Beide dieser Klassen haben eine unerwartete extrazelluläre Domänenstruktur, die kürzer als der entsprechende Hühner-FGF-R ist. Es werden auch Versuchsdaten beschrieben, die darauf hinweisen, daß sich ein einzelner Rezeptor an verschiedene FGF-Typen bindet.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung werden isolierte DNA-Sequenzen bereitgestellt. Diese Sequenzen kodieren für Polypeptide, die FGF-R-Liganden-Bindungsaktivität aufweisen, einschließlich Polypeptiden, die natürlich auftretenden Fibroblasten- Wachstumsfaktor-Rezeptoren voller Länge entsprechen. Es sind DNA-Sequenzen isoliert worden, die für einen Hühner-bFGF-R kodieren und für verschiedene menschliche FGF- Rs (hFGF-Rs) kodieren. Ebenfalls bereitgestellt werden Klonier- und Expressionsvehikel, weiche die FGF-R-Kodiersequenzen enthalten. Eine DNA-Sequenz, die für den FGF- Rezeptor voller Länge oder ein FGF-R-Polypeptidfragment kodiert, kann operabel an Kontrollsequenzen gebunden und in einer Kultur kompatibler, transformierter, transfizierter oder infizierter Wirtszellen exprimiert werden.
Es werden Verfahren zum Synthetisieren von Wachstumsfaktor-Rezeptor-Proteinen und Verfahren zum Bereitstellen von Analogen der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren bereitgestellt.
Die Erfindung stellt auch Antikörper gegen definierte Domänen des Rezeptors bereit. Wiederum andere Aspekte der Erfindung umfassen Verfahren zum Bewerten von Zusammensetzungen, die für Liganden- und Rezeptor-Wechselwirkungen agonistisch oder antagonistisch sind, insbesondere jene, die Bindungswechselwirkungen fördern oder hemmen.
Es werden auch diagnostische und therapeutische Verwendungen für die gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellten Reagenzien beschrieben.

A. FGF-Rezeptoren

Die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren (FGF-R) sind Rezeptoren für die Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs), wie oben beschrieben. Siehe auch P. L. Lee et al., Science 245, 57-60 (1989), das durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Die FGF-Familie besteht aus Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die durch Aminosäuresequenzhomologie, betonte Affinität zu Heparin-Bindung sowie die Fähigkeit gekennzeichnet sind, Angiogenese und mitogene Aktivität gegenüber Zellen mit epithelialem, mesenchymalem und neuralem Ursprung zu fördern. Die FGF-Familie umfaßt sauren FGF, basischen FGF, das int-2-Genprodukt, das hst-Genprodukt (Kaposi-Sarkom-FGF), FGF-5, den Keratinozyten-Wachstumsfaktor und FGF-6. Mitglieder der FGF-Familie scheinen bei der Entwicklung, Gewebe-Wiederherstellung, Erhaltung von Neuronen und der Pathogenese eine Rolle zu spielen. Abweichende Expression von FGFs kann Zelltransformation nach einem autokrinen Mechanismus verursachen. Darüber hinaus können FGFs Tumorwachstum und die Durchdringungsfähigkeit erhöhen, indem sie das Blutgefäßwachstum in den Tumor stimulieren oder indem sie die Produktion von Proteasen, wie z. B. Plasminogenaktivator, herbeiführen.
Der Begriff "Ligand" bezeichnet Moleküle, üblicherweise Mitglieder der Fibroblasten- Wachstumsfaktor-Familie, die sich an die Domänen binden, die an der Wachstumsfaktorbindung beteiligt sind. Außerdem ist ein Ligand ein Molekül, das entweder als natürlicher Ligand, an den sich der Rezeptor bindet, oder als funktionelles Analog dient, das als Agonist oder Antagonist dienen kann.
Wie hierin beschrieben, ist ein Hühner-bFGF-Rezeptor durch verschiedene identifizierbare Strukturmerkmale gekennzeichent. Die Hühner- und Menschen-FGF-R-Strukturen werden verallgemeinert, um eine Strukturnomenklatur zu definieren, die auf andere FGF-Rs anwendbar ist. Allgemeine Beschreibungen der Proteinstruktur und ihrer Beziehung zu Nukleinsäuresequenzen werden in J. D. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4. Aufl. Bd. 1 und 2, Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA (USA) (1987); und B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2. Aufl., Garland, NY (USA) (1989), erörtert, die beide durch Verweis hierin aufgenommen sind. Es werden gemeinsame Strukturmerkmale bekannter FGF-Rs beschrieben, einschließlich verschiedener natürlich auftretender löslicher menschlicher FGF-Bindeproteine. Ein menschlicher Fibroblasten- Wachstumsfaktor-Rezeptor ist ein Protein, das entweder von einem natürlichen menschlichen FGF-R-Gen abgeleitet ist oder wesentliche Struktureigenschaften teilt, die einem natürlich auftretenden menschlichen Rezeptor für FGF zu eigen sind.
Die isolierte Hühner-FGF-R-mRNA voller Länge enthält ein einzelnes hydrophobes Segment, das einem membranüberspannenden Semgent (als Transmembransegment bezeichnet) ähnlich ist. Diese zum Transmembransegment amino-proximalen FGF-R-Segmente werden als extrazelluläre Domäne bezeichnet, während die zum Transmembransegment carboxy-proximalen Segmente als intrazelluläre Domäne bezeichnet werden. Vom Aminoterminus ausgehend weist die extrazelluläre Domäne eine NH&sub2;-terminale hydrophobe mutmaßliche Signalsequenz, eine immunglobulinartige Domäne (als IgI bezeichnet) und saures Segment, eine zweite immunglobulinartige Domäne (als IgII bezeichnet) und eine dritte immunglobulinartige Domäne (als IgIII bezeichnet) auf. In der externen Domäne des FGF-R können zwar verschiedene strukturierte Merkmale identifiziert werden, die wichtigste funktionelle Eigenschaft, welche die Domäne definiert, ist jedoch die Bindung an die Rezeptorliganden, z. B. Elemente der FGF-Familie. Wie nachstehend erörtert, korreliert diese Funktion mit dem kombinierten Vorhandensein von IgII- und IgIII-Domänen.
Die intrazelluläre Domäne ist durch das Vorhandensein einer aufgespaltenen Tyrosin-Kinase-Strukturdomäne gekennzeichnet, und ist im Hühnerrezeptor etwa 424 Reste lang. Funktionell ist diese Domäne durch ihre Tyrosin-Kinase-Aktivität definiert, typischerweise moduliert durch Liganden, der sich an die extrazelluläre Domäne bindet. Einem Protein fehlt eine intrazelluläre Domäne im wesentlichen, wenn ihm eine protypische intrazelluläre Domäne, insbesondere eine Tyrosin-Kinase-Domäne, fehlt.
Neben dem Hühner-Rezeptor sind vier einzigartige menschliche cDNA-Klone identifiziert worden. Diese kodieren für zuvor unbekannte FGF-Rezeptor-Varianten, die nur zwei Ig-artige Domänen enthalten. Zwei der menschlichen Klone kodieren für membranumspannende Rezeptoren, und zwei kodieren für mutmaßliche sekretierte Formen. Sowohl die Form, welche die 3 Ig-artigen als auch jene, welche die 2 Ig-artigen Domänenstrukturen aufweist, vermitteln biologisches Ansprechen auf sauren und basischen FGF. So kann die erste Ig-Domäne der 3 Ig-Domänenform eine andere Funktion als die Bindung von saurem und basischem FGF haben. Die mehrfachen menschlichen Rezeptorformen sind in einigen Bereichen identisch, divergieren aber in anderen ausgewählten Bereichen der extrazellulären Domäne in hohem Maße. Bei zwei der menschlichen Varianten-Rezeptoren, h4 und h5, ist es wahrscheinlich, daß sie für eine sekretierte Form des FGF-Rezeptors kodieren.
Eine typische FGF-R-Nukleinsäuresequenz kodiert für eine vorübergehende NH&sub2;-terminale hyrophobe Sequenz, die normalerweise während des Translokationsvorgangs abgespalten wird. Die klassische Funktion einer Signalsequenz besteht darin, die entstehende Polypeptidkette zu membrangebundenen Ribosomen zu lenken, was zu Membran- Translokation führt. Da die Signalsequenz jedoch typischerweise im Translokationsvorgang entfernt wird, fehlt die Signalsequenz im reifen Polypeptid.
Die Ig-artigen Domänen (Ig-Domänen) sind durch drei Hauptmerkmale gekennzeichnet: (i) das Vorhandensein zweier charakteristischer Cysteinreste in jeder Domäne; (ii) das Vorhandensein eines Konsens-Tryptophanrests 11 bis 12 Aminosäuren an der COOHterminalen Seite des ersten Cysteinrests in jeder Ig-artigen Domäne; und (iii) das Vorhandensein der Konsensequenz DXGXYXC an der NH&sub2;-terminalen Seite des zweiten Cysteinrests. Das letzte Merkmal ist in Fällen der löslichen Rezeptorprotein modifiziert und durch eine Sequenz äquivalenter Größe substituiert.
Zusätzliche Merkmale, die für die Ig-Domänen charakteristisch sind, sind sowohl beim Vergleichen der Domänen miteinander als auch beim Vergleichen homologer Domänen unterschiedlicher Rezeptormoleküle ersichtlich. Die im Hühner-Klon zu findende amino-proximale Ig-Domäne wurde mit IgI bezeichnet. Da der Hühner-Klon drei Ig-Domänen aufweist, sind die Domänen vom Aminoterminus ausgehend numeriert worden. Wie in Fig. 6 angegeben, umfaßt die IgI-Domäne die 45 Aminosäuren, flankiert von einem Paar Cysteinreste. Die Hühner-IgI-Domäne weist hohe Sequenz-Homologie mit der IgI-Domäne auf, die in der genomischen Sequenz des menschlichen FGF-R zu finden ist. Der menschlichen Form scheint jedoch eine Domäne zu fehlen, die IgI entspricht.
Die nächste Ig-Domäne wird als IgII bezeichnet, und umfaßt beim Hühner-Rezeptor 51 Aminosäuren zwischen den beiden Cysteinresten (siehe Fig. 3 und 6). Wie nachstehend beschrieben, ist diese Domäne in Kombination mit der IgIII-Domäne an der Ligandenbindung beteiligt. Die Polypeptid-Sequenzhomolgie dieser Domäne zwischen dem Hühner- und dem Menschen-Rezeptor ist ziemlich hoch, wie durch die Sequenzausrichtungen in Fig. 7 gezeigt. Es ist festzustellen, daß den menschlichen Rezeptoren die IgI- Domäne fehlt, sie aber die IgII- und die IgIII-Domänen aufweisen. Die zur Angabe dieser Domäne verwendeten Reste sind die Reste 176, 89, 87, 89 und 87 auf der aminoproximalen Seite und 228, 141, 139, 141 und 139 an der carboxy-proximalen Seite für die Hühner-, h2-, h3-, h4- bzw. h5-Rezeptoren.
Die dritte Ig-Domäne wird als IgIII bezeichnet und umfaßt beim Hühner-Rezeptor 63 Aminosäuren zwischen den beiden Cysteinresten. Siehe Fig. 3 und 6. Wieder stimmen die Domänen überein, obwohl die menschlichen Rezeptoren nur zwei Domänen aufweisen, nämlich IgII und IgIII. Sowohl bei der Hühner- als auch bei der Menschen-Form ist die IgIII-Domäne jene, die dem Transmembransegment am nächsten ist. Die Cysteinreste für die Hühner-, h2-, h3-, h4- bzw. h5-Rezeptoren, die zur Angabe dieser Domäne verwendet werden, sind die Reste 274, 187, 185, 187 und 185 an der amino-proximalen Seite und die Reste 339, 252, 250, 253 und 251 an der carboxy-proximalen Seite.
Die löslichen h4- und h5-Rezeptoren weisen ein als IgIIIT bezeichnetes, substituiertes, terminales Segment auf. Dieses Segment ist ein substituiertes terminales Segment, das einen Teil der an IgIII gebundenen Membran ersetzt, und ist 79 Aminosäuren lang. Diese Sequenz entspricht den Aminosäuren 224 und 222 von h4 bzw. h5, während sie mit Ausnahme von DSGSYSC viele der Merkmale beibehält, die in der IgIII-Domäne zu finden sind. Es sollte jedoch angemerkt werden, daß die IgIIIT-Sequenzen zwischen den löslichen Formen des menschlichen FGF-R konserviert werden.
Zwischen der ersten und der. zweiten immunglobulin-artigen Domäne weisen die FGF- Rezeptoren (für den basischen FGF-R gezeigt, aber der gleiche FGF-R bindet sowohl den sauren als auch den basischen FG F) ein Merkmal auf, das in anderen Mitgliedern der Immunglobulin-Überfamilie nicht zu finden ist. Es gibt eine Abfolge von 8 aufeinanderfolgenden sauren Resten (EDDDDEDD im Fall von Hühnern und EDDDDDDD im Fall von Menschen), gefolgt von drei Serinresten und zwei zusätzlichen sauren Resten (Fig. 3 und 7). Obwohl für mehrere intrazelluläre Proteine, insbesondere Kernproteine, ununterbrochene Abschnitte mit 7 bis 35 sauren Resten beschrieben worden sind, sind im extrazellulären Bereich von Transmembran-Rezeptor-Proteinen solche sauren Bereiche ungewöhnlich.
Die 5 Rezeptorspezies (z. B. die Hühner-, h2-, h3-, h4- und h5-Formen) weisen auch an einer spezifischen Stelle zwischen dem konservierten sauren Bereich und der konservierten zweiten Ig-artigen Domäne (IgII) Variabilität auf. Die h2- und h4-Rezeptorformen enthalten zwei Aminosäuren (ArgMet) an den Positionen 59 und 60, während der Hühner-Rezeptor eine einzelne Aminosäure (Asn) an dieser Position enthält und die h3- und h5-Rezeptor-Formen keine entsprechenden Aminosäuren an dieser Position enthalten (siehe Sternchen in Fig. 8).
Ein weiteres ungewöhnliches Merkmal ist die Länge des Juxtamembranbereichs, des Bereichs zwischen dem membranüberspannenden Segment und der Kinase-Domäne. Dieser Bereich ist bei Rezeptor-Tyrosin-Kinasen normalerweise konserviert. Beispielsweise hat der Juxtamembranbereich bei den Rezeptoren für PDGF, CSF-1, Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF), menschlicher epidermaler Wachstumfaktor-2 (HER2) und Insulin beständig eine Länge von 49 bis 51 Resten. Die FGF-Rezeptoren mit einer interzellulären Domäne weisen einen ungewöhnlich langen Juxtamembranbereich von etwa 87 Resten auf.
Die Cytoplasma-Bereiche der Aminosäuresequenzen haben für die Hühner- bzw. die Menschen-Formen jeweils eine Länge von etwa 424 bis 425 Resten. Diese enthalten auch eine Tyrosin-Kinase-Sequenz (etwa Reste 482 bis 759, 395 bis 672 bzw. 393 bis 670 für die Hühner-, h2- und h3-Formen). Insgesamt weist der Kinasebereich der bFGF- Rezeptoren die höchste Sequenzidentität (etwa 51 bis 53ºh) mit den PDGF und CSF-1- Rezeptoren auf. Die bFGF-Rezeptoren enthalten das GXGXXG-Motiv und den konservierten Lysinrest (etwa Rest 512), die einen Teil der Adenosin-5'-triphosphat-(ATP-)Bindungsstelle von Tyrosin-Kinasen bilden. Die bFGF-Rezeptoren enthalten auch die beiden charakteristischen Tyrosin-Kinase-Motive HRDLAARNVL und DFGLAR, sowie ein Tyrosin (etwa Reste 651, 564 und 562) an der Position analog zur Haupt-Phosphorylierungsstelle von pp60v-src (etwa Tyr 416).
Die Kinase-Kodiersequenz der bFGF-Rezeptoren, definiert durch Homologie zu anderen Tyrosin-Kinasen, ist durch ein Insert aus 14 Aminosäuren geteilt. Die Länge des Inserts im Kinasebereich ist kürzer als jene in den Rezeptoren für PDGF und CSF-1 (104 bzw. 70 Aminosäuren) und ist ähnlich der Länge der insertierten Sequenz in den Rezeptoren für Insulin und insulinartigen Wachstumsfaktor-I.
Der FGF-R scheint drei verschiedene biologische Funktionen zu erfüllen. Die erste ist die Bindung von Liganden, üblicherweise die FGF-Proteine oder ihre Analoge. Diese Liganden oder Anaoge können auch entweder als Agonisten oder als Antagonisten dienen. Die Ligandenbindungsstelle befindet sich offenbar in der extrazellulären Domäne. Der Rezeptor wandelt ein Signal als Reaktion auf Ligandenbindung um, und das Ergeb nis ist eine ligandenmodulierte Aktivität. Da der wahrscheinliche Ligand ein FGF ist, ist das Signal üblicherweise FGF-moduliert.
Eine zweite biologische Aktivität betrifft die enzymatische Tyrosin-Kinase-Aktivität. Diese Aktivität wird typischerweise als Reaktion auf Ligandenbindung aktiviert. Da die Rezeptoren jedoch wahrscheinlich in einem Dimerzustand funktionieren, können die Intraketten-Bindungswechselwirkungen als weitere biologische Aktivität angesehen werden, die durch Blocker vermittelt werden kann. Das kann als weiteres Mittel zum Modulieren der FGF-Vermittlung bestimmter Aktivitäten dienen.

B. Physiologische Implikationen

Die Wechselwirkungen von FGFs mit ihren Rezeptoren verursachen bei bestimmten Zelltypen Veränderungen der Zellmorphologie und Zelltransformation, Zellvermehrung, Zelldifferenzierung, Zel alterung, Heparinempfindlichkeit und Heparinwirkungen. Zu den in vivo-Wirkungen von FGF gehören bei bestimmten Organismen die Modulation verschiedener Aktivitäten, z. B. Gliedmaßen-Regeneration, Linsen-Regeneration, gefäßbildende Wirkungen sowohl bei normalen als auch bei Tumorzellen, Wundheilung, Adipocytendifferenzierung und Wachstum veschiedener Neural- und Myoblastenzellen. FGFs weisen auch starke gefäßbildende Aktivitäten auf. Es wird angenommen, daß die gefäßbildende Aktivität von FGFs weitgehend auf die chemotaktischen und mitogenischen Wirkungen dieser Faktoren auf Endothelzellen zurückzuführen ist. Außerdem ist gezeigt worden, daß die konstitutive Expression von FGEs Zelltransformation von transfizierten Zellen herbeiführt, was darauf hinweist, daß an der Tumorbildung autokrine oder parakrine Stimulation durch FGFs beteiligt sein kann. Diese diversen zellulären und physiologischen Wirkungen sind ein erstes Anzeichen für die zentrale Bedeutung dieser Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen.
Die Zusammensetzungen und sie umfassenden Zellen können für diagnostische Zwecke verwendet werden, sowie um Erkrankungen zu untersuchen und zu behandeln, die mit FGF-Rezeptoren verbunden sind. Zellen, die Kloniervehikel exprimieren, die definierte Sequenzen enthalten, können verwendet werden, um spezifische Stellen eines FGF-Rezeptors zu definieren, die notwendig sind, um eine spezielle Aktivität zu bewirken. Alternativ dazu können diese Zellen dazu dienen, die Fähigkeit eines ausgewählten Rezeptors zu bewerten, verschiedene Liganden (FGFs und Analoge) zu binden, was ein wirksames Werkzeug für die Bewertung der Fähigkeit von Arzneimitteln darstellt, spezifische, durch FGF herbeigeführte Zellreaktionen zu fördern oder zu hemmen.
Zellen, die mit DNA oder mRNA transfiziert, injiziert, infiziert oder elektroporiert wurden, die eine natürliche FGF-R-Sequenz voller Länge enthält, exprimieren oft den nativen oder Wildform-Rezeptor und reagieren entsprechend. Spezifische Konzentrationen eines gereinigten Rezeptors oder eines Rezeptor-Polypeptid-Fragments können verwendet werden, um die Bindung des Liganden (FGF) an native FGF-Rezeptoren zu blockieren. Alternativ dazu können Antikörper gegen den Rezeptor oder das Fragment die gleiche Wirkung haben.
Homogene und definierte Polypeptide und DNA-Sequenzen finden beim Züchten von Antikörpern Verwendung. Insbesondere finden bei Diagnosetests Antikörper gegen spezifische Bereiche des Rezeptors, z. B. die Liganden-Bindedomäne, Anwendung. Die Reagenzien FGF-R, FGF-R-Polypeptide und Antikörper gegen spezifische Bereiche des Rezeptors können verwendet werden, um die Regulierung FGF-vermittelter Aktivitäten zu untersuchen. Beispielsweise sollten FGF-Agonisten die Blutgefäßentwicklung stimulieren, eine Wirkung, die bei Wundheilung und beim Wachstum kollateraler Blutgefäße in ischämischen Bereichen des Herzens besonders vorteilhaft ist. FGF-Antagonisten sollten bei der Vorbeugung gegen anormale Angiogenese Anwendung finden, wie sie bei diabetischer Retinopathie und rheumatoider Arthritis oder bei der Eindämmung von Tumoren durch die Blockierung der Verbreitung von Gefäßbildung zu einem Tumor festzustellen ist.

II. Polypeptide

Die vorliegende Erfindung umfaßt Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Polypeptide und Proteine, die FGF-R-Ligandenbindungsaktivität aufweisen, wie in den beiliegenden Ansprüchen definiert.
Die Symbole für die Aminosäurereste sind in Tabelle I angeführt. Tabelle I Abkürzungen für die Aminosäurereste
X, eine beliebige Aminosäure; Z, Termination.
Verschiedene neue menschliche FGF-Rezeptoren sind kloniert und charakterisiert worden, wie nachstehend näher beschrieben. Speziell anzumerken ist, daß verschiedene kürzere Formen (h2 und h3) und lösliche Versionen (h4 und h5) von FGF-Rezeptoren entdeckt worden sind. Die löslichen Proteine (z. B. Formen, denen ein Transmembransegment fehlt), die FGF-Bindungskapazität aufweisen, weisen darauf hin, daß kürzere Formen therapeutische und/oder diagnostische Verwendung finden können.
Typischerweise weisen die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Peptide gemäß vorliegender Erfindung zumindest etwa 85%-ige Homologie mit den natürlich vorkommenden Rezeptoren in den IgII- und IgIII-Bereichen auf, üblicherweise zumindest etwa 90%- ige Homologie, vorzugsweise zumindest etwa 95%-ige Homologie.
Die Ligandenbindungsfunktion ist insbesondere in der extrazellulären Domäne lokalisiert, und die löslichen Formen behalten diese spezielle Funktion bei. Lösliche Fragmente von FGF-Rezeptoren sollten dazu dienen, die Funktionen der natürlichen löslichen Varianten zu ersetzen oder diese zu stören. Alternativ dazu können die löslichen Formen die Dimerisierung von FGF-Rezeptoren stören, da die Rezeptoren normalerweise in dimerer Form vorliegen können. Rezeptordimerisierung kann für eine geeignete physiologische Signalumwandlung wesentlich sein.
Die menschlichen Rezeptoren, die ein Transmembransegment aufweisen, sind insofern ungewöhnlich, als sie nur die IgII- oder IgIII- der drei Ig-Domänen aufweisen. Das Fehlen der IgI-Domäne weist darauf hin, daß bestimmte Funktionen im menschlichen Rezeptor fehlen können, oder, was wahrscheinlicher ist, daß die IgI-Domäne im menschlichen Rezeptor nicht notwendig ist. Die nachstehend angeführten Daten zeigen, daß die IgI-Domäne für die Ligandenbindung nicht wesentlich ist.
Wie hierin verwendet, beschreiben die Begriffe rein und homogen ein Protein, das von Komponenten abgetrennt wurde, die es in der Natur begleiten. Typischerweise ist ein monomeres Protein im wesentlichen rein, wenn zumindest etwa 60 bis 70% einer Probe ein einziges Polypeptid-Grundgerüst aufweisen. Geringfügige Varianten oder chemische Modifikationen weisen typischerweise die gleiche Polypeptidsequenz auf. Ein im wesentlichen reines Portein umfaßt typischerweise über etwa 85 bis 90% einer Proteinprobe, häufiger zumindest etwa 95%, und ist vorzugsweise zu über etwa 99% rein. Normalerweise wird die Reinheit auf einem Polyacrylamidgel gemessen, wobei die Homogenität durch Färbung bestimmt wird. Für bestimmte Zwecke wird hohe Auflösung verwendet, und HPLC oder ein ähnliches Mittel zur Reinigung eingesetzt. Für die meisten Zwecke wird eine einfache Chromatographiesäule oder ein Polyacrylamidgel verwendet, um die Reinheit zu bestimmen.
Ein Protein ist im wesentlichen frei von natürlich damit verbundenen Komponenten, wenn es von den nativen Verunreinigungen abgetrennt wurde, die es in seinem natürlichen Zustand begleiten. Daher ist ein Protein, das chemisch synthetisiert oder in einem Zellsystem synthetisiert wird, das von der Zelle verschieden ist, aus der es natürlich stammt, im wesentlichen frei von seinen natürlich damit verbundenen Komponenten.
Der Begriff wird verwendet, um Rezeptoren und Nukleinsäuren zu beschreiben, die in heterologen Säugetierzellen oder Pflanzenzellen, E.coli und anderen Prokaryoten synthetisiert worden sind.
Ein Polypeptid ist im wesentlichen eine vollständige membrangebundene Form eines FGF-R, wenn es im wesentlichen ein Peptid voller Länge ist, das einer natürlich vorkommenden membrangebundenen Form eines FGF-R entspricht oder in hohem Maße homolog dazu ist.
Gleichgültig ob löslich oder membrangebunden, die vorliegende Erfindung stellt im wesentlichen reine Präparate bereit. Es können verschiedene Verfahren für deren Isolierung aus biologischem Material entwickelt werden, teilweise basierend auf den strukturellen und funktionellen Beschreibungen, die in der vorliegenden Beschreibung enthalten sind.
FGF-Rezeptorpeptide, einschließlich von Hühner- und Menschen-FGF-Rezeptoren, können unter Einsatz von Techniken klassischer Proteinchemie gereinigt werden, wie nachstehend angeführt. Beispielsweise kann ein Lectin-Affinitätschromatographie-Schritt eingesetzt werden, gefolgt von einem hochspezifischen Liganden-Affinitätschromatographieverfahren, bei dem ein FGF eingesetzt wird, der über die Cysteinreste des FGF an Biotin konjugiert ist. Gereinigte FGF-R-Rezeptoren können auch durch ein Verfahren wie FGF-Affinitätschromatographie unter Einsatz aktivierter, über primäre Aminogruppen an FGF gebundener CH-Sepharose erhalten werden, wie von Imamura, s. o., beschrieben. Dieses Verfahren ergibt jedoch zwar ein gereinigtes Protein, liefert aber möglicherweise keine praktikable Menge an gereinigtem Protein (d. h. mehr als ng-Mengen).
Je nach Verfügbarkeit spezifischer Antikörper, wie hierin vorgesehen, können unter Einsatz von Immunaffinitätschromatographie auch spezifische FGF-Rezeptoren gereinigt werden. Hergestellte Antikörper können, wie nachstehend beschrieben, an einer inerten Substanz immobilisiert werden, um eine hochspezifische Affinitätssäule zu erzeugen. Siehe Harlow und Lane, unten.
Beispielsweise, nicht als Einschränkung, kann ein Reinigungsverfahren eingesetzt werden, bei dem die Tatsache genutzt wird, daß sich markierter Biotin-bFGF mit hoher Affinität an Rezeptoren in Zellen bindet, die große Mengen dieser Rezeptoren enthalten. ¹²&sup5;I-markierter Biotin-bFGF bndet sich an bFGF-Rezeptoren in Swiss 3T3-Zellen und kann mit dem Rezeptorprotein vernetzt werden.
Verschiedene Zell- oder Gewebequellen können aus Ausgangsmaterialien gewählt werden, die üblicherweise aufgrund eines reichen Vorhandenseins des gewünschten Rezeptors ausgewählt werden. Hühner-Embryos (Tag 6, Schritt 29-30) werden bevorzugt, weil sie relativ große Mengen des Rezeptorproteins enthalten, wie durch Hochaffinitätsbindung von Menschen- und Rinder-bFGF bestimmt. Embryoextrakte können zuerst auf Weizenkeimagglutinin-(WGA-)Sepharose 4B fraktioniert und die teilweise gereinigten bFGF-Rezeptoren dann an Biotin-bFGF gebunden werden. Der Rezeptor-Ligand-Komplex kann aufgrund der hohen Affinitätswechselwirkung zwischen den Biotin- und Avidin-Gruppen an eine Avidin-Agarose adsorbiert werden. Die Avidin-Agarose-Säulen können mit Verbindungen eluiert werden, die den FGF von seinem Rezeptor dissoziieren, wie z. B. Suramin oder SDS. Das Hühnerprotein, das die Avidin-Agarose in Abhängigkeit von FGF band, wanderte in der erwarteten Größe (130 kDa) des bFGF-Rezeptors. Siehe Fig. 2B.
Um die Aminosäuresequenz zu bestimmen oder Polypeptidfragmente des Rezeptors zu erhalten, kann der Rezeptor mit Trypsin gespalten werden. Peptidfragmente können durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) abgetrennt und durch Gasphasen-Sequenzierung analysiert werden. Es können auch andere nach dem Stand der Technik bekannte Sequenzierverfahren eingesetzt werden.
Die FGF-Rezeptoren oder die spezifischen externen Bereiche der Rezeptoren können verwendet werden, um jeweilige FGFs Affinitätsreinigung zu unterziehen. Der externe Bereich, der die Liganden-Bindedomäne des Hühner-bFGF-R umfaßt, wie in Fig. 3 gezeigt, erstreckt sich etwa von Aminosäure 22 bis etwa Aminosäure 374. Die Liganden- Bindedomäne des menschlichen FGF-R, wie in Fig. 4 gezeigt, erstreckt sich etwa von Aminosäure 22 bis etwa Aminosäure 285. Die Liganden-Bindedomäne variiert mit unterschiedlichen FGF-Rezeptoren und kann irgendwo zwischen 5% bis 100% des extrazellulären Bereichs liegen. Die zur Ligandenbindung erforderliche Mindestmenge an Proteinsequenz kann durch Ausschneiden verschiedener Segmente der extrazellulären Domäne und Untersuchung der Ligandenbindung an die verbleibende Sequenz bestimmt werden. Untersuchungen der Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung weisen darauf hin, daß es erforderlich ist, daß sich zumindest der Liganden-Bindungsbereich im extrazellulären Bereich des Rezeptors befindet. Wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, ist mit FGF-Rezeptor oder FGF-R-Liganden-Bindungsaktivität die Fähigkeit zur Bindung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder anderen spezifischen Liganden gemeint. Üblicherweise sind diese Liganden Mitglieder der FGF-Familie. Daher dient der externe Bereich zur Ermittlung von FGF-Agonisten oder Antagonisten.
Es ist auch wahrscheinlich, daß der FGF-R, wie viele andere Wachstumsfaktorezeptoren, in einem multimeren Proteinkomplex natülich vorkommt, wahrscheinlich in Dimerform. Daher sind andere wichtige Bereiche eines Rezeptors jene, entweder extrazelluläre oder andere, die an der Dimerisierung beteiligt sind.
Die intrazellulären Bereiche der Rezeptoren (z. B. beginnend etwa bei Aminosäure 396 bis zum COOH-Terminus für den Hühner-bFGF-R oder etwa Aminosäure 307 bis zum COOH-Terminus für den menschlichen FGF-R, wie in den Fig. 3 bzw. 4 gezeigt), können auch als Enzyme mit Tyrosin-Kinase-Aktivität verwendet werden. Das bek-Gen weist 85% Aminosäuresequenzidentität mit dem analogen Bereich (Tyrosin-Kinase-Bereich) des Hühner-bFGF-R auf. Das flg weist 99%-ige Homologie mit verschiedenen Sequenzen des menschlichen FGF-Rezeptors auf, wie in Fig. 4 beschrieben.
Eine Signal- oder Leadersequenz führt ein Protein durch die Membran einer Zelle. Die Signalsequenzen der Rezeptoren können in Verbindung mit ihren jeweiligen Rezeptoren verwendet werden, können aber auch mit anderen Proteinen verwendet werden (z. B. umfassend etwa die Aminosäuren 1 bis 21 der N-terminalen Sequenz die Leader- oder Signalsequenz des Hühner-bFGF-R, wie in Fig. 3 gezeigt, und des menschlichen FGF-R, wie in Fig. 4 gezeigt).
Chemische Derivatisierungen und Modifikationen von Polypeptiden, wie Acetylierungen, Carboxylierungen und dergleichen, können durchgeführt werden, einschließlich von Glykosylierungsmodifikationen und Verarbeitungsvarianten eines typischen Polypeptids. Diese Verfahrensschritte umfassen im speziellen enzymatische Modifikationen, wie Ubichinisierung. Siehe z. B. Hershko und Ciechanover, "Mechanisms of Intracellular Protein Breakdown", Ann. Rev. Bioch. 51, 335-364 (1982).
Analoge umfassen sowohl natürliche als auch induzierte genetische Varianten. Induzierte Mutanten können von verschiedenen Techniken abgeleitet werden, einschließlich sowohl statistischer Mutagenese der kodierenden Nukleinsäuren unter Einsatz von Bestrahlung oder Einwirkung von EMS, oder können die Form durch genetisches Engineering bewirkter Änderungen durch stellenspezifische Mutagenese oder andere Techniken moderner Molekularbiologie haben. Siehe Sambrook, Fritsch und Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl.), CSH Press.
Neben Polypeptid mit im wesentlichen voller Länge stellt die vorliegende Erfindung auch biologisch aktive Fragmente der Polypeptide bereit, wie in den beiliegenden Ansprüchen definiert.
Immunogene können durch im Tandem wiederholte Polypeptidsegmente erzeugt werden, wodurch stark antigenische Proteine erzeugt werden. Alternativ dazu dienen solche Polypeptide als hocheffiziente Konkurrenten um spezifische Bindung. Die Erzeu gung von Antikörpern gegen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Polypeptide wird nachstehend beschrieben.
Fusionspolypeptide zwischen den Rezeptoren und anderen homologen oder heterologen Proteinen können hergestellt werden. Homologe Polypeptide können Fusionen zwischen verschiedenen Wachstumsfaktor-Rezeptoren sein, die beispielsweise in Hybridprotein resultieren, das Ligandenspezifität eines Rezeptors und der intrazellulären Domäne eines anderen aufweist, oder einem Rezeptor, der erweiterte oder geschwächte Bindungsspezifität aufweist. Ebenso können heterologe Fusionen konstruiert werden, die eine Kombination aus Eigenschaften oder Aktivitäten der Derivatproteine aufweisen. Typische Beispiele sind Fusionen eines Reporter-Polypeptids, z. B. Luciferase, mit einer Domäne eines Rezeptors, beispielsweise einer Liganden-Bindugnsdomäne, so daß das Vorhandensein oder die Position eines gewünschten Liganden leicht bestimmt werden kann. Siehe z. B. Dull et al., US-Patent Nr. 4.859.606. Andere Genfusionspartner sind bakterielle β-GalaCtosidase, trpE-Protein A, β-Lactamase, α-Amylase, Alkohol-Dehydrogenase und Hefe-α-Paarungsfaktor. Siehe z. B. Godowski et al., Science 241, 812-816 (1988), und den nachstehenden experimentellen Teil.
Fusionsproteine werden typischerweise entweder durch Nukleinsäure-Rekombinations- Verfahren oder durch Polypeptid-Syntheseverfahren hergestellt. Techniken zur Nukleinsäure-Manipulation werden allgemein beispielsweise von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl.), Band 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), beschrieben. Techniken zur Synthese von Polypeptiden werden beispielsweise von Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2156 (1963), beschrieben. Die rekombinanten Nukleinsäuresequenzen, die zur Erzeugung von Fusionsproteinen gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, können von natürlichen oder synthetischen Sequenzen abgeleitet werden. Viele natürliche Gensequenzen sind von verschiedenartiger cDNA oder von Genom-Sammlungen unter Einsatz geeigneter Sonden erhältlich. Siehe GenBankTM, National Institute of Health. Typische Sonden für Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren können nach Standardverfahren aus den Sequenzen der Fig. 3, 4 oder 9 ausgewählt werden. Geeignete synthetische DNA-Fragmente können nach dem von Beaucage und Carruthers, Tetra. Letts. 22, 1859-1862 (1981), beschriebenen Phosphoramidit-Verfahren hergestellt werden. Ein doppelstrangiges Fragment kann dann entweder durch Synthetisieren des komplementären Stranges und Zusammenannelieren des Stranges unter geeigneten Bedingungen oder durch Addition des komplementären Stranges unter Einsatz von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz erhalten werden.

III. Nukleinsäuren

Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuresequenzen bereit, die für verschiedene oben beschriebene FGF-Rezeptorsequenzen kodieren. Die Fig. 3, 4 und 7 legen jeweils die entsprechenden cDNA-Sequenzen dar, die für Hühner- und Menschen-FGF-Rezeptoren kodieren.
In Fig. 3, die den Hühner-bFGF-R zeigt, sind aus gereinigtem Protein sequenzierte Peptide unterstrichen, einschließlich der NH&sub2;-proximalen Sequenzen von den Aminosäuren 35-53 (ala---arg), 56-67 (leu---arg) und 139-158 (glu---lys). Die Transmembransequenz ist durch einen dunklen Balken angezeigt, ein einzigartiger saurer Aminosäurebereich ist umrahmt, Cysteinreste sind eingekreist, potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen sind durch einen Punkt angegeben, und die strichlierte Unterstreichung zeigt die mutmaßliche hydrophobe Signalsequenz an. Die Aminosäuresequenz umfaßt ein In-frame- Stopcodon (etwa Rest -12), gefolgt von einem Initiator-Methionin. Die strukturelle Sequenz beginnt etwa bei Aminosäure 22.
In Fig. 4, die den menschlichen FGF-R zeigt, ist das Methionin von Codon ATG, das etwa bei Nukleotid 529 beginnt, die erste Aminosure des FGF-R-Gens. Beispielsweise ist Aminosäure 22 des in Fig. 4 gezeigten Rezeptors ein Argininrest (R), der sich zwei Aminosäuren von links nach innen, zwei Zeilen oberhalb des unteren Endes zwischen "589" und "630" auf Seite 1 von Fig. 4 befindet.
Nukleinsäuren gemäß vorliegender Erfindung weisen eine Sequenz auf, die entweder von einem natürlichen Menschen-, Hühner- oder anderem FGF-R-Gen oder einem solchen abgeleitet ist, das beträchtliche Homologie mit einem natürlichen FGF-Gen oder einem Abschnitt davon aufweist.
Rauhe Hybridisierungsbedingungen umfassen üblicherweise eine Salzkonzentration von weniger als etwa 1 M, häufiger weniger als etwa 500 M, und vorzugsweise weniger als etwa 200 mM. Die Temperaturbedingungen liegen üblicherweise über 20ºC, häufiger über etwa 30ºC, vorzugsweise über etwa 37ºC. Da andere Faktoren die Rauheit der Hybridisierung beträchtlich beeinflussen können, unter anderem einschließlich der Basenzusammensetzung und Größe der komplementären Stränge, Vorhandensein organischer Lösungsmittel und Ausmaß von Basen-Fehlpaarung, ist die Kombination aus Parametern wichtiger als das absolute Ausmaß eines davon.
Eine isolierte Nukleinsäure ist eine, die von anderen Sequenzen, die sie normalerweise begleiten, z. B. anderen zellulären Nukleinsäuresequenzen, im wesentlichen durch Reinigen abgetrennt worden ist. Üblicherweise bezieht sich der Begriff auf ein Fragment eines Genoms, das selektiv kloniert, isoliert und im wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt worden ist.
Sonden können auf Basis der in den Fig. 3, 4 und 9 dargelegten Sequenz der FGF-Rezeptor-cDNAs hergestellt werden. Die Sonden umfassen eine isolierte Nukleinsäure, die an eine Markierung oder ein Reporter-Molekül gebunden ist, und können verwendet werden, um andere FGF-Rezeptor-Nukleinsäuresequenzen nach herkömmlichen Verfahren zu isolieren. Siehe z. B. J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Band 1-3, CSH Press, N. Y. (1989). Die Selektion bezüglich anderer ähnlicher Nukleinsäuren kann unter Einsatz homologer Nukleinsäuren erfolgen. Alternativ dazu können Nukleinsäuren, die für die gleichen oder ähnliche Rezeptorpolypeptide kodieren, synthetisiert oder ausgewählt werden, indem die Redundanz im genetischen Code genutzt wird. Es können verschiedene Codon-Substitutionen eingeführt werden, z. B. stille Ände rungen, wodurch verschiedene Restriktionsstellen erzeugt werden, oder um die Expression für ein bestimmtes System zu optimieren. Mutationen können eingeführt werden, um die Eigenschaften der Rezeptoren zu ändern, vielleicht, um die Ligandenbindungsaffinitäten, die Affinitäten zwischen den Ketten oder die Polypeptidabbau- oder -umsatzrate zu ändern.
Die DNA-Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung können von genomischer DNA oder cDNA abgeleitet, durch Synthese hergestellt oder ein Hybrid der verschiedenen Kombinationen sein. Die vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante Nukleinsäuren bereit, die Sequenzen umfassen, die ansonsten nicht natürlich vorkommen. Zu den isolierten DNA-Sequenzen gehört jede Sequenz, die durch Primer- oder Hybridisierungsreaktionen erhalten oder Behandlung mit Restriktionsenzymen oder dergleichen unterzogen worden ist.
Synthetische Oligonukleotide können nach dem Triester-Verfahren nach Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981), oder nach anderen Verfahren, wie z. B. mit kommerziellen automatisierten Oligonukleotid-Synthesizern, formuliert werden. Oligonukleotide können mit überschüssiger Polynukleotidkinase markiert werden (z. B. werden etwa 10 Einheiten auf 0,1 nMol Substrat in Verbindung mit 50 mM Tris, pH 7,6, 5 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl&sub2;, 1-2 mM ATP, 1,7 pMol 32P-ATP (2,9 mCi/mMol) 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA eingesetzt). Sonden können auch durch Nick-Translation, Klenow-Füllreaktion oder andere nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden.
cDNA oder Genom-Sammlungen verschiedener Typen können gescreent werden. Die Wahl von cDNA-Sammlungen entspricht normalerweise einer Gewebequelle, wo ausreichend mRNA für die gewünschten Rezeptoren vorhanden ist. Phagen-Sammlungen werden normalerweise bevorzugt, es können aber auch Plasmidsammlungen verwendet werden. Beispielsweise wird eine genomische Keratinozyten- oder cDNA- Sammlung bevorzugt, um einen Keratinocyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor zu isolieren und zu klonieren. Embryo- oder Plazenta-Sammlungen können für int-2, FGF-5 und hst- Rezeptoren verwendet werden, und eine Endothelzellensammlung wird für saure FGF- Rezeptoren bevorzugt. Klone einer Sammlung werden auf Platten verteilt, zum Screenen auf ein Substrat übertragen, denaturiert und auf das Vorhandensein gewünschter Sequenzen sondiert.
Beispielsweise wird bei einem Plaque-Hybridisierungsverfahren jede Platte, die Bakteriophagenplaques enthält, auf Duplikat-Nitrocellulose-Filterpapiere repliziert (Millipore- HATF). Die Phagen-DNA wird mit einem Puffer, wie 500 mM NOH, 1,5 M NaCl, etwa 1 min lang denaturiert und beispielsweise mit 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, 1,5 M NaCl, neutralisiert (dreimal jeweils für 10 min). Die Filter werden dann gewaschen. Nach dem Trocknen werden die Filter typischerweise gebacken, beispielsweise 2 h lang bei 80ºC in einem Vakuumofen. Die Duplikatfilter werden bei 42ºC 4-24 h lang mit 10 ml pro Filter an DNA-Hybridisierungspuffer (20-50% Formamid, 5 XSSC, pH 7,0, 5X Denhardt-Lösung (Polyvinlpyrrolidon plus Ficoll und Rinderserumalbumin; 1X = 0,02% jeweils) 50 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 7,0, 0,2% SDS und 50 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA), 50 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 7,0, 0,2% SDS, und 50 ug/ml denaturierte Lachssperma-DNA) vorhybridisiert. Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde kann bei 42ºC 16 h lang mit 10 ml/Filter 1 · 10&sup6; cpm/ml DNA-Hybridisierungspuffer durchgeführt werden, der markierte Sonde enthält. Die Endkonzentration an Formamid wird je nach der Länge der Sonde und dem gewünschten Rauhigkeitsgrad variiert. Siehe z. B. J. G. Wetmur und Davidson, J. Mol. Biol. 31, 349-370 (1968); und M. Kanehisa, Nuc. Acids. Res. 12, 203-213 (1984), bezüglich einer Erörterung der Hybridisierungsbedingungen und Sequenzhomologie.
Eine Oligonukleotidsonde auf Basis der Aminosäuresequenzen der beiden tryptischen Peptide des gereinigten Hühner-bFGF-R wurde verwendet, um eine Hühnerembryo (Tag 6)-cDNA-Sammlung unter wenig rauhen Bedingungen zu screenen. Sequenzen, die TVALGSNVEFVCK und VYSDPQPHIQWLK entsprachen, hergestellt unter Einsatz eines kommerziellen automatisierten Oligonukleotid-Synthesizers (Applied Biosystems), wur den verwendet, um den in Fig. 3 beschriebenen Hühner-bFGF-Rezeptorklon zu erhalten. Dieser Klon oder davon abgeleitete Sequenzen können verwendet werden, um bFGF-Rs in anderen Spezies sowie andere FGF-Rs in einer Zielspezies zu isolieren.
Die oben beschriebenen Sonden, die verwendet wurden, um den Hühner-bFGF-R zu isolieren, wurden auch verwendet, um einen menschlichen bFGF-Rezeptor-cDNA-Klon zu isolieren.
Gemäß vorliegender Erfindung kann als Sonde jede isolierte DNA-Sequenz verwendet werden, die für eine vollständige strukturelle FGF-R-Sequenz kodiert. Alternativ dazu kann jede DNA-Sequenz verwendet werden, die für eine hydrophobe FGF-R-Signalsequenz und deren Translationsstartstelle kodiert. Bevorzugte Sonden sind cDNA-Klone jedes isolierten FGF-Rezeptors.
Die gemäß vorliegender Erfindung verwendeten DNA-Sequenzen umfassen üblicherweise zumindest etwa 5 Codons (15 Nukleotide), häufiger zumindest etwa 7 Codons, typischerweise zumindest etwa 10 Codons, vorzugsweise zumindest etwa 15 Codons, mehr bevorzugt zumindest etwa 25 Codons und am meisten bevorzugt zumindest etwa 35 Codons. Es können auch ein oder mehrere Introns vorhanden sein. Bei dieser Anzahl an Nukleotiden handelt es sich üblicherweise um die Mindestlänge, die für eine erfolgreiche Sonde erforderlich ist, die spezifisch mit einem FGF-Rezeptor hybridisiert. Beispielsweise können Epitope, die für einen FGF-R charakteristisch sind, in kurzen Peptiden kodiert werden. Üblicherweise kann die Wildform-Sequenz eingesetzt werden, in manchen Fällen können eine oder mehrere Mutationen eingebracht werden, wie Deletionen, Substitutionen, Insertionen oder Inversionen, was zu Änderungen in der Aminosäuresequenz führt, die stille Mutationen ergeben, um eine Restriktionsstelle zu modifizieren oder um für spezifische Mutationen zu sorgen. Die Genom-Sequenz ist üblicherweise nicht größer als etwa 200 kb, häufiger nicht größer als 100 kb und vorzugsweise nicht größer als 0,5 kb.
Als Sonden werden Abschnitte der DNA-Sequenz mit zumindest etwa 15 Nukleotiden, üblicherweise zumindest etwa 15 Nukleotiden, und weniger als etwa 6 kd, üblicherweise weniger als etwa 1,0 kb, von einer DNA-Sequenz bevorzugt, die für einen FGF-Rezeptor kodiert. Die Sonden können auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob mRNA, die für einen spezifischen FGF-R kodiert, in einer Zelle oder anderen Geweben vorhanden ist.
Die natürlichen oder synthetischen DNA-Fragmente, die für ein gewünschtes Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorfragment kodieren, werden in DNA-Konstrukte eingebaut, die zum Einbringen in eine und Exprimieren in einer Zellkultur in vitro fähig sind. Üblicherweise eignen sich die DNA-Konstrukte zur Replikation in einem einzelligen Wirt, wie z. B. Hefe oder Bakterien, können aber auch mit oder ohne Integration innerhalb des Genoms zum Einbringen in kultivierte Säugetier- oder Pflanzen- oder andere eukaryotische Zell-Linien bestimmt sein. DNA-Konstrukte, die zum Einbringen in Bakterien oder Hefe konstruiert sind, umfassen typischerweise ein Replikationssystem, das vom Wirt erkannt wird, wobei das beabsichtigte DNA-Fragment für das gewünschte Rezeptorpolypeptid kodiert, die Transkriptions- und Translationsinitiations-Regulierungssequenzen mit dem für Polypeptid kodierenden Segment operabel verbunden sind und die Transkriptions- und Translationsterminations-Regulierungssequenzen mit dem für Polypeptid kodierenden Segment operabel verbunden sind. Die Transkriptions-Regulierungssequenzen umfassen typischerweise einen heterologen Enhancer oder Promotor, der vom Wirt erkannt wird. Die Wahl eines geeigneten Promotors hängt vom Wirt ab, aber es sind Promotoren wie trp-, lac- und Phagen-Promotoren, tRNA-Promotoren und glykolytische Enzym-Promotoren bekannt. Siehe Sambrook et al. (1989). Zweckmäßigerweise können verfügbare Expressionsvektoren eingesetzt werden, die das Replikations- System sowie Transkriptions- und Translations-Regulierungssequenzen zusammen mit der Insertionsstelle für die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-DNA-Sequenz umfassen. Beispiele für taugliche Kombinationen aus Zell-Linien und Expressionsvektoren werden von Sambrook et al. (1989) beschrieben; siehe auch Metzger et al. (1988), Nature 334, 31-36.
Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen umfassen, wie z. B. einen Replikationsursprung, einen Promotor, einen Enhancer und notwendige Verarbeitungsinformationsstellen, wie z. B. Ribosomen-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminatorsequenzen. Vorzugsweise sind die Enhancer oder Promotoren jene, die natürlich mit Genen assoziiert sind, die für die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren kodieren, es versteht sich jedoch, daß in vielen Fällen andere gleichermaßen oder besser geeignet sind. Andere bevorzugte Expressionskontrollsequenzen sind Enhancer oder Promotoren, die von Viren abgeleitet sind, wie z. B. SV40, Adenovirus, Rinder-Papilloma-Virus und dergleichen.
Auf ähnliche Weise sind bevorzugte Promotoren jene, die natürlich in Immunglobulin erzeugenden Zellen zu finden sind (siehe US-Patent Nr. 4.663.281), aber es können auch SV40, Polyomavirus, Cytomegalovirus (von Menschen oder Mäusen) und der LTR von verschiedenen Retroviren (wie z. B. Mäuse-Leukämievirus, Mäuse- oder Rous-Sarkom-Virus und HIV) eingesetzt werden, sowie für GFG-R-Gene endogene Promotoren. Siehe Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, N. Y., 1983.
Die Vektoren, welche die DNA-Segmente von Interesse enthalten (z. B. ein Fibroblasten- Wachstumsfaktor-Rezeptorgen oder cDNA-Sequenz oder Abschnitte davon) kann nach bekannten Verfahren in die Wirtszelle übertragen werden, die je nach Art des zellulären Wirts variiert. Beispielsweise wird Kalziumchlorid-Transfektion üblicherweise für prokaryotische Zellen eingesetzt, während Kalziumphosphat-Behandlung für andere zelluläre Wirte eingesetzt werden kann. Siehe allgemein Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl.) CSH Press (1989). Der Begriff "transformierte Zelle" umfaßt auch die Nachkommenschaft einer transformierten Zelle.
Wie bei den gereinigten Polypeptiden, sind die mit dem Liganden-Bindungssegment assoziierten Nukleinsäuresegmente, die extrazelluläre Domäne und die intrazelluläre Do mäne besonders nützlich. Diese Gensegmente werden als Sonden zum Screenen auf neue Gene verwendet, die ähnliche biologische Aktivitäten aufweisen, obwohl die Kontrollelemente für diese Gene ebenfalls von Bedeutung sein können.

IV. Verfahren zur Herstellung von FGF-Rezeptoren

DNA-Sequenzen können auch verwendet werden, um Polypeptide zu exprimieren, die FGF-Rezeptoraktivität aufweisen oder hemmen. Beispielsweise kann eine DNA-Sequenz mit etwa 21 Nukleotiden (etwa 7 Aminosäuren) bis etwa 2,1 kb (etwa 700 Aminosäuren) verwendet werden, um ein Polypeptid zu exprimieren, das eine für FGF-Rezeptor spezifische Aktivität aufweist, typischerweise Liganden-Bindung.
Große Mengen der Rezeptorproteine können hergestellt werden, indem der gesamte Rezeptor oder Teile des Rezeptors, der in den Expressionsvehikeln enthalten ist, in kompatiblen Wirten, wie z. B. E.coli, Hefe, Säugetierzellen, Insektenzellen oder Frosch-Oozyten, exprimiert wird. Die Expressionsvehikel können in die Zellen unter Einsatz von nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren eingebracht werden, wie Kalziumphosphatfällung (nachstehend erörtert), Lipofektion, Elektroporation oder DEAE-Dextran.
Üblicherweise handelt es sich bei den Säugetierzellwirten um immortalisierte Zell-Linien. Um die Eigenschatten eines FGF-R und seines entsprechenden Wachstumsfaktors zu untersuchen, ist es nützlich, Säugetierzellen zu transfizieren usw., denen ein FGF-Rezeptor fehlt oder die große Mengen davon aufweisen, wobei die Signalsequenz das Peptid in die Zellmembran lenkt. Zellen ohne nennenswerte FGF-Rezeptoren umfassen Lymphozyten, Myozyten, Grüne Meerkatzen-cos-7-Zellen und China-Hamster-Eierstockzellen (CHO). Transformierte oder transfizierte usw. Zellen kodieren für einen Rezeptor, der funktionell mit einem Wildform-Rezeptor äquivalent ist und der Zelle eine FGF-empfindliche mitogenische Reaktion verleiht. Derartige Zellen ermöglichen es, die Bindungseigenschaften verschiedener nativer FGFs zu analysieren. Transfizierte Zellen können auch eingesetzt werden, um die Wirksamkeit einer Zusammensetzung oder eines Arzneimittels als FGF-Antagonist oder Agonist zu bewerten. Das Ausmaß an Rezeptor- Tyrosin-Kinase-Aktivität oder die Rate an Nukleinsäuresynthese kann bestimmt werden, indem transfizierte Zellen mit Arzneimitteln in Kontakt gebracht und die Wirkungen von FGFs oder ihrer Analoge auf den mit Arzneimittel behandelten Zellen mit den Vergleichen verglichen werden. Obwohl die häufigsten prokaryotischen Zellen, die als Wirte verwendet werden, Stämme von E.coli sind, können auch andere Prokaryoten, wie Bacillus subtilis oder Pseudomonas, verwendet werden. Die DNA-Sequenz gemäß vorliegender Erfindung, einschließlich von Fragmenten oder Abschnitten der Sequenz, die für einen gesamten Rezeptor, einen Abschnitt des Rezeptors oder ein Polypeptid mit FGF-R-Aktivität kodieren, kann verwendet werden, um ein Expressionvehikel oder Konstrukt für einen FGF-R oder ein Polypeptid mit FGF-R-Aktivität herzustellen. Üblicherweise ist die Kontrollsequenz ein eukaryotischer Promotor zur Expression in einer Säugetierzelle. Bei manchen Vehikeln können auch die eigenen Kontrollsequenzen des Rezeptors verwendet werden. Ein üblicher prokaryotischer Plasmidvektor zum Transformieren von E.coli is pBR322 oder dessen Derivate (z. B. das Plasmid pkt279 (Ciontech)) (Bolavar et al., Gene 2, 95 (1977)). Die prokaryotischen Vektoren können auch prokaryotische Promotoren zur Transkriptionsinitiation enthalten, gegebenenfalls mit einem Operator. Beispiele für die am häufigsten verwendeten prokaryotischen Promotoren sind der β-Lactamase- (Penicillinase-) und Lactose- (Iac-) Promotor (trp) (Goeddell et al., Nucleic Acid Res. 8, 457 (1980)), der PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomen-Bindungsstelle (Shimatake et al., Nature 292, 128(1981)).
Promotoren, die in Verbindung mit Hefe verwendet werden, können Promotoren sein, die vom Enolase-Gen abgeleitet sind (Holland et al., J. Biol. Chem. 256, 1385 (1981)) oder der Promotor für die Synthese von glykolytischen Enzymen, wie 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980)).
Geeignete nicht-native Säugetier-Promotoren könne die frühen und späten Promotoren von SV40 (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)) oder Promotoren umfassen, die von Mäuse-Kolonie-Leukämievirus, Mäuse-Milchdrüsentumor-Virus, Vogel-Sarkomaviren, Adenovirus 11, Rinder-Papillomavirus oder Polyoma abgeleitet sind. Außerdem kann das Konstrukt an ein amplifizierbares Gen (z. B. DHFR) angefügt werden, so daß mehrere Kopien des FGF-Rezeptorgens gemacht werden können.
Prokaryoten können unter Einsatz verschiedener Verfahren transformiert werden, einschließlich der Verwendung von CaCl&sub2; (S. N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972) oder des RbCI-Verfahrens (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 1982)). Hefe kann unter Einsatz eines Verfahrens transformiert werden, das von Van Solingen et al., J. Bacter. 130, 946 (1977), und C. L. Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), beschrieben wurde. Was Eukaryoten betrifft, können Säugetierzellen unter Einsatz eines Kalziumphosphat-Fällungsverfahrens transfiziert werden, das von Graham und Van der Eb, Virology 52, 546 (1978), beschrieben wurde, oder durch Lipofektin (BRL) oder retrovirale Infektion (E. Gilboa, Experimental Manipulation of Gene Expression, Kapitel 9, Academic Press, S. 175 (1983)). Die tatsächlichen Expressionsvektoren, die geeignete Sequenzen enthalten, können nach Standardtechniken hergestellt werden, an denen Ligations- und Restriktionsenzyme beteiligt sind (siehe z. B. Maniatis, s. o.). Im Handel erhältliche Restriktionsenzyme zum Spalten spezifischer DNA-Stellen können von New England Biolabs, Waltham, MA (USA), erhalten werden.
Klone werden unter Verwendung von Markierungen in Abhängigkeit von der Art der Vektorkonstruktion selektiert. Die Markierung kann auf dem gleichen oder einem anderen DNA-Molekül vorliegen, vorzugsweise dem gleichen DNA-Molekül. Bei Säugetierzellen kann das Rezeptor-Gen selbst die beste Markierung sein. Bei prokaryotischen Wirten kann der Transformant durch Resistenz gegen Ampicillin, Tetrazyklin oder andere Antibiotika selektiert werden. Die Produktion eines bestimmten Produktes auf Basis der Temperaturempfindlichkeit kann ebenfalls als geeignete Markierung dienen. Verschiedene Verfahren können eingesetzt werden, um das FGF-R-Rezeptorprotein oder Peptidfragment zu ernten und zu reinigen. Das Peptid kann aus einem Lysat des Wirts isoliert werden. Das Peptid kann aus dem Zellüberstand isoliert werden, wenn das Peptid sekretiert wird. Das FGF-R-Peptid wird dann weiter gereinigt, wie oben erörtert, wobei HPLC, Elektrophroese, Affinitätschromatographie (vorzugsweise Immunaffinität oder Ligandenaffinität) eingesetzt werden.
Ein weiteres Verfahren, das eingesetzt werden kann, um cDNA-Klone von mit FGF-R verwandeten Spezies zu isolieren, umfaßt den Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). (R. K. Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)). Bei diesem Ansatz werden zwei Oligonukleotide (27mere), die bestimmten Regionen der FGF-R-Sequenz entsprechen, synthetisiert und dann bei der PCR-Reaktion verwendet, um Repeztor-verwandte mRNA- Transkripte von einer mRNA-Quelle zu amplifizieren. Annelieren der Oligonukleotide und PCR-Reaktion erfolgen unter Bedingungen reduzierter Rauheit, wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben. Die resultierenden amplifizierten Fragmente werden subkloniert, und die resultierenden rekombinanten Kolonien werden mit ³²P-markierter FGF-RcDNA voller Länge sondiert, wobei sowohl sehr als auch wenig rauhe Bedingungen eingesetzt werden (siehe Beispiele 2 und 3). Klone, die unter Bedingungen geringer, nicht jedoch hoher Rauheit hybridisieren, stellen mit FGF-R verwandte mRNA-Transkripte dar. Außerdem kann dieser Ansatz eingesetzt werden, um Varianten-FGF-R-cDNA-Spezies zu isolieren, die als Ergebnis von alternativem Spleißen entstehen, siehe M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 85, 8998 (1988).

V. Antikörper

Polyklonale und/oder monoklonale Antikörper gegen verschiedene FGF-Rezeptoren können ebenfalls hergestellt werden. Der Begriff Antikörper wird verwendet, um sowohl eine homogene molekulare Einheit, als auch ein Gemisch, wie z. B. ein Serumprodukt, aus einer Vielzahl verschiedener molekularer Einheiten zu bezeichnen. Peptidfragmente können synthetisch in einem Peptid-Synthesizer hergestellt und an ein Trägermolekül (d. h. Schlüsselloch-Schnecken-Hämocyanin) gekoppelt und über mehrere Monate in Kaninchen injiziert werden. Die Kaninchenseren werden auf Immunreaktivität gegen das FGF-Rezeptorprotein oder -fragment getestet. Monoklonale Antikörper können durch Injizieren von FGF-R-Protein, FGF-R-Polypeptiden oder Mäusezellen, die große Mengen des klonierten FGF-Rezeptors an ihrer Zelloberfläche exprimieren, in Mäuse erzeugt werden. Monoklonale Antikörper werden mittels ELISA gescreent und mit dem FGF-Rezeptorprotein oder Polypeptiden davon auf spezifische Immunreaktivität getestet. Siehe E. Harlow und D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratosies (1988). Diese Antikörper dienen für Assays ebenso wie für Pharmazeutika.
Sobald eines ausreichende Menge des gewünschten Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorpolypeptids erhalten worden ist, kann das Protein für verschiedene Zwecke verwendet werden. Eine typische Verwendung ist die Herstellung von Antikörpern, die für die Bindung an diese Rezeptoren spezifisch sind. Diese Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein und können durch in vitro- oder in vivo-Techniken hergestellt werden.
Zur Produktion polyklonaler Antikörper wird ein geeignetes Ziel-Immunsystem gewählt, typischerweise eine Maus oder ein Kaninchen. Das im wesentlichen gereinigte Antigen wird dem Immunsystem auf eine Weise präsentiert, die durch für das Tier geeignete Verfahren und andere den Immunologen wohlbekannte Parameter bestimmt ist. Typische Stellen für die Injektion sind die Fußballen, sowie intramuskuläre, intraperitoneale oder interdermale Injektion. Selbstverständlich kann die Maus oder das Kaninchen auch durch eine andere Spezies ersetzt werden.
Ein Assay bezüglich einer immunologischen Reaktion erfolgt üblicherweise mit einem Immungssay. Normalerweise umfassen solche Immungssays eine gewisse Reinigung einer Antigenquelle, beispielsweise erzeugt durch die gleichen Zellen und auf die gleiche Weise, wie das Antigen erzeugt wurde. Das Immungssay kann ein Radioimmungssay, ein Enzymbindungs-Assay (ELISA), ein Fluoreszenzassay oder eine vieler anderer Wahlmöglichkeiten sein, von denen die meisten funktionell äquivalent sind, aber unter spezifischen Bedingungen Vorteile aufweisen können.
Monoklonale Antikörper mit Affinitäten von 10&sup8; M&supmin;¹, vorzugsweise 10&sup9; bis 10¹&sup0; oder darüber, erfolgen typischerweise durch Standardverfahren, wie beispielsweise von Har low und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratory (1988); oder Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Aufl.) Academic Press, NY (USA) (1986), beschrieben. Kurz zusammengefaßt werden geeignete Tiere ausgewählt und das gewünschte Immunisierungsprotokoll befolgt. Nach angemessener Zeit wird die Milz solcher Tiere herausgeschnitten, und einzelne Milzzellen werden unter geeigneten Selektionsbedingungen typischerweise mit immortalisierten Myleomzellen fusioniert. Daraufhin werden die Zellen durch Klonieren getrennt, und die Überstände jedes Klons werden auf ihre Produktion eines geeigneten Antikörpers getestet, der für den gewünschten Bereich des Antigens spezifisch ist.
Andere geeignete Techniken umfassen die in vitro-Einwirkung von antigenischen Polypeptiden auf Lymphozyten oder alternativ dazu die Selektion von Sammlungen von Antikörpern in Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse et al., "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246, 1275-1281 (1989). Die Polypeptide und Antikörper gemäß vorliegender Erfindung werden mit oder ohne Modifikation verwendet. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper durch kovalentes oder nicht-kovalente Anbindung einer Substanz markiert, die ein detektierbares Signal liefert. Es ist eine große Vielzahl von Markierungen und Konjugationstechniken bekannt, und sie werden sowohl in der wissenschaftlichen als auch der Patent-Literatur ausgiebig behandelt. Geeignete Markierungen sind Radionuklide, Enzyme, Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, Fluoreszenzmittel, Chemolumineszenzmittel, magnetische Teilchen und dergleichen. Zu den Patenten, welche die Verwendung solcher Markierungen lehren, zählen die US-Patente Nr. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 und 4.366.241. Es können auch rekombinante Immunglobuline hergestellt werden, siehe Cabilly, US-Patent Nr. 4.816.567.

VIII. Verfahren zur Verwendung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-(FGF-R-) Reinigungsverfahren sowie ein Verfahren zum Synthetisieren von FGF-Rezeptoren in nerhalb von Zellen bereit. Ebenfalls bereitgestellt werden die durch diese Verfahren hergestellten homogenen Rezeptoren, die Nukleinsäuresequenzen, die für die Rezeptoren oder Abschnitte der Rezeptoren kodieren, sowie die Expressionsvehikel, die diese Sequenzen enthalten, Zellen, welche die FGF-Rezeptoren umfassen, und Antikörper gegen die Rezeptoren. Von besonderem Interesse sind die löslichen Formen der Rezeptoren, die Bindungsstellen aufweisen, die mit Rezeptoren um die Bindung von FGF konkurrieren können.
Der FGF-R funktioniert jedoch wahrscheinlich in einem Dimerzustand, wie oben angeführt. Die löslichen Formen des Rezeptors können die Dimerisierung stören und können die Signalumwandlung wirksam durch einen anderen Mechanismus als die kompetitive Affinität für die FGF-Liganden blockieren. Es wird erwartet, daß die löslichen oder intrazellulären oder Transmembranfragmente der verschiedenen Rezeptorformen die Dimerbildung stören und daher dazu dienen können, zumindest einige Arten von oder einen Teil der Signalumwandlung blockieren.
Durch diese Beobachtung wird ein Verfahren zur in vivo-Modifikation einer durch Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor modulierten Aktivität bereitgestellt, umfassend das Verabreichen einer Menge eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Blockers, der wirksam ist, um die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Bindung an Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren zu hemmen. Wie oben erörtert, spielt die FGF-Proteinfamilie eine wichtige Rolle beim Regulieren vieler wichtiger physiologischer Vorgänge. Die löslichen FGF-R-Polypeptide können das Ausmaß der FGF-Modulation dieser Verfahren wirksam modifizieren. Aus diesem Grund können die löslichen Formen der Rezeptoren als kompetitive Bindungsstellen für FGF Verwendung finden. Ebenso können verkürzte FGF-Bindungsstellen oder Bindungsstellen, die mutiert worden sind, insbesondere jene der beschriebenen menschlichen Formen, in dieser Hinsicht zu geringeren Kosten, sowohl was die wirtschaftlichen Belange, als auch was medizinische Nebenwirkungen bei der Verabreichung betrifft, gleichermaßen wirksam sein.
Die gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellten Reagenzien können auch bei der Diagnose, sowohl der FGF-Produktion als auch der FGF-R-Produktion, Anwendung finden. Durch ein abnormales Ausmaß an Produktion eines dieser Proteine, einschließlich von z. B. Kaposi-Sarkom, das Kaposi-FGF erzeugt, und diabetischer Retinopathie, werden verschiedene medizinische Zustände indiziert. So werden nun Diagnosetests verfügbar, die von diesen Reagenzien abhängen.
Mit den verschiedenen FGF-Typen ist es wahrscheilich, daß verschiedene Rezeptor-Typen vorliegen, die Variationen in den Affinitäten für verschiedene Liganden aufweisen. Bei den Genen und Proteinen gemäß vorliegender Erfindung sind Unterscheidungen zwischen verschiedenen Rezeptortypen zu finden. So sollten Gewebemarkierungen verfügbar werden.
Da Tumorwachstum von Mikrogefäßbildung abhängig ist, kann die Verabreichung des FGF-R dazu dienen, diese zu verhindern und zu einer Unterdrückung von Tumorwachstum führen. Durch die Verhinderung der FGF-Aktivierung kann die vorliegende Erfindung eine wichtige Ergänzung des Arsenals von Mitteln zur Bekämpfung von Tumorwachstum sein.
Virale Infektionen können auch von der Bindung an spezielle Rezeptoren für den Invasionsvorgang abhängen. Es gibt Anzeichen, die darauf hinweisen, daß HSV (Herpes Simplex Virus) durch die Bindung an FGF-R-Proteine inifiziert. So kann die Verabreichung therapeutisch wirksamer Mengen von löslichen FGF-R-Formen oder Fragmenten als prophylaktische Maßnahme zur Minimierung des Risikos der Infektion mit diesem oder anderen Viren dienen, die diesen Mechanismus zum Eindringen in die Zell nützen. Wieder kann der Schutzmechanismus von kompetitiver Bindung, Zerstörung der Dimerstruktur, einer Kombination davon oder etwas anderem abhängen.
Die für die wirksame Therapie notwendigen Reagenzienmengen hängen von vielen verschiedenen Faktoren ab, einschließlich von Verabreichungsmitteln, Zielstelle, physiolo gischem Zustand des Patienten und anderen verabreichten Medikamenten. So sollte die Dosis zur Behandlung bestimmter Zustände titriert werden. Typischerweise können die in vitro verwendeten Dosen eine nützliche Anleitung für die Mengen sein, die zur in situ-Verabreichung dieser Reagenzien nützlich sind. Tierversuche bezüglich der Dosen für die Behandlung bestimmter Störungen liefern weitere Vorab-Indikatoren für die Dosis beim Menschen. Verschiedene Überlegungen werden von Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. Auf., MacMillan, NY, USA (1985), beschrieben. Wegen der Hochaffinitätsbindung zwischen FGF und seinen Rezeptoren wird zunächst erwartet, daß geringe Dosen dieser Reagenzien wirksam sind. Daher wird üblicherweise erwartet, daß die Dosisbereiche üblicherweise in Mengen unter den mM-Konzentrationen liegen, typischerweise weniger als etwa 10 uM-Konzentrationen, üblicherweise weniger als etwa 100 nM-Konzentrationen, häufiger weniger als etwa 1 nM, vorzugsweise weniger als etwa 10 pM (pikomolar), mehr bevorzugt weniger als etwa 100 fM (femtomolar) und am meisten bevorzugt weniger als etwa 1 fM, mit einem geeigneten Träger.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden veranschaulichenden Beispiele besser verstanden werden.

Beispiel 1

Charakterisierung eines bFGF-Rezeptors

¹²&sup5;I-markierter bFGF wurde zunächst kompetitiv an Swiss 3T3-Zellen gebunden. Wie in Fig. 1(A) gezeigt, wurde ¹²&sup5;I-markierter bFGF (2 Ci/uMol) zu den konfluenten 3T3-Zellen zugegeben (6 fMol ¹²&sup5;I-markierter bFGF pro 10&sup5; Zellen), und zwar in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen an: unmodifiziertem bFGF (-X-); Biotin-bFGF (schwarzes Quadrat); der ungebundenen Fraktion, nachdem Biotin-bFGF mit Avidin-Agarose inkubiert worden war (leeres Quadrat); der ungebundenen Fraktion, nachdem bFGF mit Avidin-Agarose inkubiert worden war (leeres Dreieck). Die Bindung wurde 30 min lang bei 37ºC in Kulturmedium (DME H21) durchgeführt, das 0,2% Gelatine und Heparin (15 U/ml) enthielt. Die Zellen wurden dreimal mit einem Puffer gewaschen, der 20 mM HEPES (pH 7,4), 0,2% Gelatine und 150 mM NaCl enthielt. Die vorhandene Radioaktivität wurde in einem Beckman-y-Zähler bestimmt. Die maximale Bindung (0% Hemmung) stellt 5.700 cpm spezifischer Bindung dar (nicht-spezifische Bindung betrug 600 cpm). Alle Bestimmungen wurden in dreifacher Ausführung gemacht. Rekombinanter menschlicher bFGF (Barr et al., J. Biol. Chem. 263, 16471 (1988)) wurde unter Verwendung von IODOBEADS (Pierce) iodiert. Der bFGF wurde unter Verwendung von 0,2M NaPi, pH 7,4, 2 IODOBEADS mit 0,5-1 mCi ¹²&sup5;I pro 1 ug FGF iodiert und 15 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, mit Na-Metasulfit und einem KI-Überschuß gequencht. Iodierter bFGF wurde durch Gelfiltration auf einer PD 10-Säule, äquilibiert mit 0,2 M Na-Phosphat, pH 7,5, 0,2M NaCl, 0,2% Gelatine, von nicht-umgesetztem freiem 10d abgetrennt. Der bFGF wurde unter Einsatz von Iodacetyl-LC-Biotin (Pierce) in einem molaren Überschuß von 4 : 1 an Cysteinresten in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) 5 h lang bei 4ºC nach dem Verfahren von Yamamoto et al., FEBS Lett. 176, 75 (1984), biotinyliert. Nicht-umgesetztes Biotin wurde durch Gelfiltration mit PD 10-Säulen entfernt, wie oben beschrieben (Pharmacia). Während des Reinigungsverfahrens war modifizierter bFGF von unmodifiziertem bFGF nicht unterscheidbar, was seine Fähigkeit betrifft, die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem bFGF an Hochaffnitäts-bFGF-Rezeptoren in Swiss 3T3-Zellen zu hemmen, und was seine Fähigkeit betrifft, die Phosphorylierung eines 90 kD-Proteins zu stimulieren, von dem bekannt ist, daß es ein Substrat für bFGF-induzierte Tyrosin-Kinase-Aktivität ist. Seihe Fig. 1(A). Die Biotinylierungsreaktion modifizierte 90 bis 95% der bFGF-Moleküle, wie durch Bindung an Avidin-konjugierte Agarose gemessen.
Wie in Fig. 1 (B) gezeigt, wurden zelluläre in situ-bFGF-Rezeptoren mit markiertem bFGF vernetzt. ¹²&sup5;I-markierter Biotin-bFGF oder ¹²&sup5;I-markierter bFGF (0,1 pMol) wurden zu Swiss 3T3-Zellen (5 · 10&sup5; Zellen) in Gegenwart oder Abwesenheit von unmarkiertem bFGF zugegeben, wie angeführt. Die Zellen wurden gewaschen und mit 0,15 mM Disuccinimidylsuberat (DSS) (Pierce) vernetzt. Die Zellen wurden dann solubilisiert, SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) unterzogen, und ¹²&sup5;I-markierte Proteine wurden durch Autoradiographie detektiert. ¹²&sup5;I-markierter Biotin-bFGF band sich an bFGF-Rezeptoren in Swiss 3T3-Zellen mit hoher Affinität (Dissoziationskonstante ent sprach 1 nM) und wurde an ein 130 kD-protein vernetzt, das gemeinsam mit dem mit ¹²&sup5;I-markiertem bFGF vernetzten bFGF-Rezeptor wanderte.
Gereinigter Hühner-bFGF-Rezeptor wurde durch Homogenisieren frischer Tag 6-Hühner-Embryos (Stufe 29-30) mit einem Brinkmann-Polytron hergestellt (1.500 Embryos/Charge); (Volumsverhältnis 1 : 1) in einer Endkonzentration von 0,25 M Saccharose, 50 mM HEPES (pH 7,5), 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 150 uM Natriumorthovanadat, 30 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Aprotinin (20 bis 30 internationale Einheiten an Kallikrein (KIU)/ml, Leupeptin (10 ug/ml) und Pestatin (1 ug/ml)), und dann mit 31.000 g 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde chargenweise auf eine 150 ml WGA-Sepahrose 4B-Säule aufgebracht, mit 300 ml Lysepuffer gewaschen, gefolgt von 500 ml Säulenpuffer, der 20 mM HEPES (pH 7,5), 2 mM EDTA, 10% Glycerin, 0,1 % Triton X-100, 50 mM NaF, 150uM Natriumorthovanadat, 30 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM PMSF, Aprotinin (20 bis 30 KIU/ml), Leupeptin (10 ug/ml) und Pepstatin (1 ug/ml) enthielt. Die Säule wurde mit Säulenpuffer eluiert, der 0,5 M N- Acetylglucosamin enthielt. Peak-Protein enthaltende Fraktionen wurden kombiniert und bei -70ºC gelagert.
Um die Gegenwart von FGF-R in den Embryomembranen und WGA-Eluat zu bestimmen, wurde Hühner-bFGF-Rezeptor durch Inkbuieren von 10 ul der Hühner-Embryomembranfraktion (Mb) oder 100 ul des Eluats der WGA-Sepharose 4B-Säule mit ¹²&sup5;I- markiertem bFGF (0,1 pMol) in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) eines 200fachen Überschusses an unmarkiertem bFGF 30 min lang bei 37ºC vernetzt (siehe Fig. 2(A)). DSS wurde bis zu einer Konzentration von 0,15 mM zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 10 min lang auf Eis inkubiert. Die Proben wurden SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie unterzogen. Spezifische Bindung und Vernetzung von ¹²&sup5;I-bFGF an rohe Hühnerembryomembranfraktion zeigt nur eine einzige Proteinbande mit 150 kDa (Fig. 2(A)). Nachdem die Molekülmasse von bFGF substrahiert worden war, betrug die abgeleitete Größe des Hühner-bFGF-Rezeptors 130-135 kDa.
Wie in Fig. 2(B) gezeigt, wurden zwei großangelegte Ligandenaffinitätsreinigungen durchgeführt (wobei jeweils das Material von 20.000 Embryos verwendet wurde). Das Eluat der WGA-Sepharose 4B-Säule wurde mit Biotin-bFGF, der wie oben beschrieben hergestellt worden war (10 : 1 molarer Überschuß an Ligand gegenüber Rezeptor) und Heparin in einer Konzentration von 15 U/ml (um Bindung mit niedriger Affinität zu reduzieren) 30 min lang bei 4ºC unkubiert. Das Gemisch wurde dann zweimal über eine 10 ml Avidin-Agarose-Säule (bFGF-Agarose) zyklisiert. Um die nicht-spezifische Bindung von Protein an Avidin-Agarose zu bestimmen (Vergleich), wurde das Eluat der WGA-Sepharose 4b-Säule durch Avidin-Agarose in Abwesenheit von Biotin-bFGF zyklisiert (Vergleich). Die Säulen wurden mit 200 ml Säulenpuffer gewaschen, der in der oben beschriebenen Sepharosesäule verwendet wurde und 0,2 M NaCl enthielt, gefolgt von Säulenpuffer ohne NaCl (300 ml), und dann mit 10 mM Suramin in Säulenpuffer eluiert. Vier aufeinanderfolgende 10 ml-Fraktionen wurden abgenommen (Frakt. 1-4), und Proben jeder Fraktion wurden SDS PAGE unterzogen und mit Silbernitrat gefärbt. Wie in Fig. 2(B) gezeigt, band sich nur ein einziges Protein auf FGF-abhängige Weise an Avidin-Agarose, und es wanderte mit der erwarteten Größe (130 kDa) des bFGF-Rezeptors.
Die eluierten Proteine wurden durch Acrylamidgelelektrophorese abgetrennt und mit Coomassie Blue gefärbt. Die Bande, die dem bFGF-Rezeptor entsprach, wurde herausgeschnitten und das Protein nach dem Verfahren von M. W. Hunkapiller et al., Meth. in Enyzmol. 91, 227 (1983), elektroeluiert. Dieses Verfahren führte zur Reinigung von 2 bis 5 ng reinem FGF-Rezeptor pro Hühnerembryo mit einer Gesamtausbeute von 5%.
Um den Rezeptor näher zu charakterisieren, wurde Protein mit Trypsin gespalten. Peptidfragmente wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP- HPLC) isoliert und durch Gasphasensequenzierung analysiert, wie von Yarden et al., s. o., beschrieben. Von den beiden unabhängigen Präparaten wurden die Aminosäuresequenzen von 14 Peptiden, wie in Fig. 3 gezeigt, erhalten. Drei der Peptide waren beiden Präparaten gemeinsam, was auf Identität zwischen den beiden unabhängigen Isola ten hinweist. Vier der tryptischen Peptide (LILGKPLGEGCFGQVVLA, IADFGLAR, MAPEALFDR und IYTHQSDVWSFGV, siehe Tabelle I und Fig. 3) waren homolog zu Konsenssequenzen für Tyrosin-Kinase-Domänen (Fig. 6). Das stand in Übereinstimmung mit dem Ergebnis, daß Tyrosin-Kinase-Aktivität mit dem bFGF-Rezeptor verbunden ist, wie von Huang und Huang, J. Biol. Chem. 261, 9568 (1986), beschrieben. So wurde das gereinigte Protein als gereinigter bFGF-Rezeptor ermittelt, weil es sich an bFGF band, das erwartete Molekulargewicht des Rezeptors hatte und Tyrosin-Kinase-Sequenzen aufwies.
Wie oben erörtert, wurden die Aminosäuresequenzen von 11 der 14 Peptide in einer zuvor veröffentlichten Sequenz eines partiellen menschlichen cDNA-Klons mit der Bezeichnung flg (fms-artiges Gen) identifiziert. Sie M. Ruta et al. Oncogene 3, 9 (1988). Diese Sequenz wurde auf Basis ihrer Homologie mit der Proto-Oncogen-Sequenz isoliert, und es war zuvor nicht erkannt worden, daß sie für ein Transmembran-Rezeptorprotein kodiert.

Beispiel 2

Isolierung eines Hühner-bFGF-Rezeptor-cDNA-Klons voller Länge

Eine Hühnerembryo (Tag 6)-cDNA-Sammlung wurde aus Größenselektion unterzogener Poly A&spplus;-mRNA konstruiert. 200 pg Poly A&spplus;-mRNA wurde auf einem 10%-30% -Saccharosegradienten größenfraktioniert, und Fraktionen, die mRNA über oder gleich 3,54 kb enthielten, wurden gepoolt. 5 ug der größenbestimmten mRNA wurden verwendet, um die cDNA nach dem Verfahren von U. Gubler und B. Hoffman, Gene 25, 263 (1983), zu erzeugen, wobei ein cDNA-Syntheseset von Pharmacia (Katalognr. 27-9260-01) verwendet wurde. Die synthetisierten cDNAs wurden bezüglich cDNAs über oder gleich 2,0 kb größenselektioniert, und die größenbestimmten cDNAs wurden dann in die Eco RI-Stelle des Bakteriophagenvektors Zapll (Stratagene, Katalognr. 236211) kloniert. Die resultierende cDNA-Sammlung enthielt 2,0 · 10&sup6; unabhängige Rekombinationen.
Die Sammlung wurde mit einer ³²P-markierten Oligonukleotidsonde gescreent, die für die beiden zusammenhängenden Peptide kodierte, wie in Fig. 3 dargestellt (TVALGSNVEFVCK und VYSDPQPHIQWLK). Die Oligonukleotide wurden unter Einsatz eines im Handel erhältlichen automatisierten Oligonukleotid-Synthesizers hergestellt. Zwei Oligonukleotide mit 43-45 Basen, die eine überlappende komplementäre Sequenz aus 12 Basen enthielten, wurden anneliert und durch Klenow-Füllung mit dNTP'S (-dCTP), ³²P-dCTP und DNA-Polymerase-Klenow-Fragment markiert, was eine markierte 70 bp-Sonde ergab. Filter wurden unter geringfügig rauhen Bedingungen (20 % Formamid, 5x Standard-Salzlösung-Citrat (SSC) und 5X Denhardt-Lösung bei 42ºC) hybridisiert und mit 0,2X SSC bei 42ºC gewaschen. Nach 3 Runden Plaquereinigung wurden 25 positive Klone isoliert. Von den 25 positiven Klonen hybridisierten 11 bei starker Rauheit an die menschliche FGF-R-cDNA, die durch Nick-Translation markiert war und als Sonde verwendet wurde (siehe Beispiel 3). Alle der 11 Klone waren mit Ausnahme einer Variation in der Länge am 5-Ende der Klone im wesentlichen identisch. Die Aminosäuresequenz des größten Klons (3,2 kb) enthielt die Sequenz aller 14 Rezeptorpeptide, die bei der oben beschriebenen Proteinreinigung erhalten wurden (siehe Fig. 3), und die vollständige Kodiersequenz des FGF-R. Der Transmembranbereich und die hydrophobe Signalsequenz wurden durch Kyte&Doolittle-Hydropathie-Analyse identifiziert, wie von Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105(1982), beschrieben.
Eine einzelne Hybridisierungsbande mit etwa 3,5 kb wurde durch Sondieren von Hühnerembryo-Poly(A)&spplus;-RNA (5 ug) mit Hühner-bFGF-Rezeptor-cDNA voller Länge unter Bedingungen hoher Rauheit (50% Formamid), 5X Denhardt-Lösung und 5X SSC bei 42ºC identifiziert. Die durch die RNA-Blotanalyse identifizierte einzelne Hybridsierungsbande mit 3,5 kb wird in Fig. 5(A) gezeigt. Es wurden Primerverlängerungsversuche mit einem Oligonukleotid durchgeführt, das zu einer Sequenz nahe dem 5'-Ende des Klons komplementär war. Hühnerembryo-Poly(A)&spplus;-RNA (5 ug) wurde mit 10 mM Methylquecksilber denaturiert, an ³²P-markierten Primer (5' CTGCACGTCATCGCGCA- 3') anneliert und mit reverser Transkriptase von Mäuse-Moloney-Leukämievirus verlängert (siehe Fig. 5(B): Spur (S) stellt ³²P-markierte DNA-Molekulargrößenstandards (1 kb) dar; Spur (E) stellt ein verlängertes Fragment (523 Nukleotide) dar; die Spuren (G, A, T und C) stellen ein 5%-iges Acrylamid-Sequenziergel dar. Die Daten sagten vorher, daß die mRNA des Rezeptors um 48 Nukleotide länger ist als der isolierte Klon.
Die Aminosäuresequenz des längsten offenen Leserahmens (2,4 kb) umfaßt ein Stopcodon innerhalb des Rahmens (Aminosäurerest -12), gefolgt von einem Initiator-Methionin (Rest 1) und der gesamten Rezeptor-Kodiersequenz (Fig. 3). Die cDNA kodierte für ein Protein mit einer abgeleiteten Molekülmasse von 91,7 kD, die Merkmale aufwies, die in mehreren bekannten Wachstumsfaktorrezeptoren zu finden waren. Sie enthielt einen eine einzelne Membran überspannenden Bereich, eine NH&sub2;-terminale hydrophobe Signalsequenz, drei extrazelluläre immunglobulin-artige Domänen und eine intrazelluläre Tyrosin-Kinase-Domäne (Fig. 6). Es wurden auch 11 potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen gefunden. N- und O-gebundene Glykosylierung des HühnerbFGF-Rezeptors können für die Differenz zwischen der beobachteten Größe des bFGF- Rezeptors und der von der cDNA-Sequenz vorhergesagten Größe verantwortlich sein.
Drei immunglobulin-artige Domänen im mutmaßlichen extrazellulären Bereich wurden auf Basis von drei Kriterien identifiziert: (i) das Vorhandensein zweier charakteristischer Cysteinreste in jeder Domäne; (ii) das Vorhandensein eines Konsens-Tryptophanrests 11 bis 12 Aminosäuren an der COOH-terminalen Seite des ersten Cysteinrests in jeder immunglobulin-artigen Domäne; und (iii) das Vorhandensein der Konsenssequenz, DXGXYXC, an der NH&sub2;-terminalen Seite des zweiten Cysteinrests in jeder immunglobulin-artigen Domäne. Der Interleukin-1-(IL-1-)Rezeptor weist ebenfalls drei immunglobulin-artige Domänen auf, und bFGF weist 25-30%-ige Sequenzidentität mit IL-1 auf. Fünf immunglobulin-artige Domänen sind in den Rezeptoren für von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF) und Kolonie-Stimulierungsfaktor-1 (CSF-1) vorhanden.
Zwischen der ersten und der zweiten immunglobulin-artigen Domäne weist der bFGF- Rezeptor ein Merkmal auf, das bei anderen Mitgliedern der Immunglobulin-Überfamilie nicht zu finden ist. Es gibt eine Serie von acht aufeinanderfolgenden Resten (EDDDDEDD), gefolgt von drei Serinresten und zwei zusätzlichen sauren Resten (Fig. 3). Es sind zwar ununterbrochene Strecken von 7 bis 35 sauren Resten für mehrere intrazelluläre Proteine, insbesondere Kernproteine, beschrieben worden, aber solche sauren Bereiche sind im extrazellulären Bereich von Transmembran-Rezeptorproteinen ungewöhnlich.
Ein weiteres ungewöhnliches Merkmal ist die Länge des Juxtamembranbereichs, des Bereichs zwischen dem membranüberspannenden Segment und der Kinase-Domäne. Dieser Bereich wird bei Rezeptor-Tyrosin-Kinasen normalerweise konserviert. Beispielsweise kann der Juxtamembranbereich bei den Rezeptoren für PDGF, CSF-1, Epidermis- Wachstumsfaktor (EG F), menschlichen Epidermis-Wachstumsfaktor-2 (HER2) und Insulin beständig eine Länge von 49 bis 51 Resten. Der bFGF-Rezeptor hat einen ungewöhnlich langen Juxtamembranbereich von etwa 87 Resten.
Der Cytoplasma-Bereich der Aminosäuresequenz ist etwa 424 Reste lang und enthält eine Tyrosin-Kinase-Sequenz (etwa Reste 482 bis 759). Insgesamt weist der Kinasebereich des bFGF-Rezeptors die größte Sequenzidentifität (etwa 51 bis 53%) mit den PDGF- und CSF-1-Rezeptoren auf. Der bFGF-Rezeptor enthält das GXGXXG-Motiv und den konservierten Lysinrest (etwa Rest 512), die einen Teil der Adenosin-5'-triphosphat- (ATP-)Bindungsstelle von Tyrosin-Kinasen bilden. Der bFGF-Rezeptor enthält auch die beiden charakteristischen Tyrosin-Kinase-Motive HRDLAARNVL und DFGLAR, sowie ein Tyrosin (etwa Rest 651) an der Position analog zur Haupt-Phosphorylierungsstelle von pp60v-src (etwa Tyr 416).
Die Kinase-Kodiersequenz des bFGF-Rezeptors, die durch Homologie zu anderen Tyrosin-Kinasen definiert ist, ist durch ein Insert von 14 Aminosäuren geteilt. Die Länge des Inserts im Kinasebereich ist kürzer als jenes, das in Rezeptoren für PDGF und CSF-1 zu finden ist (104 bzw. 70 Aminosäuren), und ist ähnlich der Länge der eingefügten Sequenz in den Rezeptoren für Insulin und insulinartigen Wachstumsfaktor-I.

Beispiel 3

Herstellung von menschlichen FGF-Rezeptor-cDNA-Klonen voller Länge

Ein menschlicher FGF-Rezeptor-cDNA-Klon wurde aus einer menschlichen Endothelzellen-cDNA-Sammlung isoliert, die von E. Sadler erhalten wurde (R. D. Ye T-C Wun und J. E. Sadler, J. Biol. Chem. 262, 3718-3725 (1987)), wobei die gleiche Oligonukleotidsonde verwendet wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die Endothelsammlung wurde mit hoher Rauheit mit markierter Sonde 1 · 10&sup6; cpm/ml (50% Formamid, 5X SSC, 5X Denhardts, 10 mM NaPO&sub4;, pH 6,5, 100 ug/ml Lachssperma-DNA bei 42ºC (16-24 h) hybridisiert und bei 65ºC mit 0,2X SSC, 0,1% SDS gewaschen.
Durch das anfängliche Screenen der menschlichen Endothelzellen-cDNA-Sammlung wurden vier Klone identifiziert und mittels dreier Durchgänge Plaquereinigung gereinigt. Die cDNA-Inserts dreier dieser Klone erzeugten identische Sequenzen und enthielten Sequenzen, die zu den Sequenzen tryptischer Fragmente vom gereinigten HühnerbFGF-R in hohem Maße homolog waren. Die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenz des größten Klons (etwa 3,6 kb) ist in Fig. 3 dargestellt. Die Aminosäuren von etwa 1-21 stellen die hydrophobe Signalsequenz dar, etwa 22 bis 285 den extrazellulären Bereich, der die Liganden-Bindedomäne enthält, etwa 286 bis 306 den Transmembranbereich und etwa 307 bis 731 den Cytoplasma-Bereich, der Tyrosin-Kinase-Domäne enthält. Dieses Verfahren isolierte auch andere nahe verwandte menschliche FGF-Rezeptoren.

Beispiel 4

Herstellung von menschlichen aFGF-R-cDNA-Klonen

Menschliche Endothelzellen- und Plazentasammlungen werden mit FGF-R-Sonden voller Länge oder Sonden, die einen Abschnitt der Sequenz für FGF-R enthalten, gescreent. Die Hybridisierung wird unter geringfügig rauhen Bedingungen durchgeführt und unter Steigerungen bei zunehmend höherer Rauheit gewaschen. Es werden die in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen wenig und sehr rauhen Bedingungen eingesetzt. Zwi schen jeder Steigerung wird Autoradiographie durchgeführt. Klone, die bis zu den rauhesten Bedingungen psoitiv sind, sind am stärksten mit dem bFGF-Rezeptoren verwandt, die zuvor in den Beispielen 2 und 3 beschrieben wurden. Klone, die bei gesenkter Rauheit positiv sind, aber unter sehr rauhen Bedingungen nicht mehr positiv sind, sind entfernter verwandt. Alle verwandten, aber nicht identen (bezogen auf Fig. 4) Klone werden durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung bestimmt. Alle verwandten Klone werden selektiert, subkloniert und exprimiert. Die exprimierten FGF-verwandten cDNAs werden dann auf ihre Fähigkeit getestet, sich an die verschiedenen FGFs, d. h. sauren FGF, zu binden.
Alternativ dazu werden zwei Sonden kostruiert, wobei eine Sonde intrazelluläre FGF-R- Sequenz und die andere extrazelluläre FGF-R-Sequenz enthält. Dreifachfilter werden angefertigt. Ein Filter wird mit hoher Rauheit (siehe Beispiele 2 und 3) mit der intrazellulären FGF-R-Sonde hybridisiert. Zwei Filter werden mit der extrazellulären Sonde hybridisiert, ein Filter mit hoher Rauheit und einer mit niedriger Rauheit. Da saure und basische FGFs nur zu 55% Sequenzidentität aufweisen, können ihre Rezeptoren ebenfalls etwa 55%-ige Sequenzidentität in der Liganden-Bindedomäne aufweisen. Klone, die bei hoher Rauheit gegenüber der intrazellulären Sonde positiv sind und nur bei geringer Rauhkeit gegenüber der extrazellulären Sonde positiv sind, sind FGF-R-verwandte Rezeptoren. So werden Klone selektiert, Restriktionskartierung durchgeführt, sequenziert und exprimiert. Die exprimierten Rezeptoren werden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Bindung an verschiedene FGFs, z. B. sauren FGF, getestet.

Beispiel 5

Charakterisierung von menschlichen FGF-R-cDNA-Klonen

Plasmidkonstruktionen

Für Transfektionsversuche wurde Hühner-FGF-Rezeptor-cDNa, die 46 Nukleotide mit untranslatierter 5'-Sequenz und die gesamte untranslatierte 3'-Sequenz enthielt, sowie menschliche h2-cDNA voller Länge, die 13 Nukleotide untranslatierter 5-Sequenz und die gesamte untranslatierte 3'-Sequenz enthielt, individuell in die BamHl/Sall-Stellen des Säugetier-Expressionsvektors pSV7d subkloniert (P. Luciw, Chiron Corporation). Das brachte die Rezeptor-cDNA-Fragmente in die richtige Ausrichtung direkt stromab von einem SV40-Promotorelement.
Zur Herstellung von Konstrukten zur Verwendung als Template zur Erzeugung von in vitro transkribierten RNAs wurde Hühner-FGF-Rezeptor-cDNA voller Länge in die Bam- HI/Sall-Stellen von Bluescript Sinterkörper (Stratagene) subkloniert, und menschliche FGF-Rezeptor-cDNAs (h2 und h3) wurden in die Pstl/Sall-Stellen von Bluescript KS subkloniert. Dadurch wurden die Rezeptorsequenzen direkt stromab vom T7-RNA-Polymerase-Promotorelement angeordnet. Um die Möglichkeit für effiziente Translation zu erhöhen, wurden ATG-Sequenzen stromauf vom Initiator-Methioninrest vor dem Subklonieren entfernt, was 46 und 13 Nukleotide mit intakter untranslatierter 5'-Sequenz für die Hühner- bzw. Menschenkonstrukte zurückließ.

Zell-Linien und Transfektionen

Ratten-L6-Skelettmuskel-Myoblasten (ATCC CRL 1458) wurden in DME H21 gezüchtet, das 10% Kalbsfötenserum enthielt, und unmittelbar vor der Transfektion in Opti-MEM (GIBCO) übertragen. Innerhalb von 24 h nach dem Plattieren wurden 1 · 10&sup6; Zellen mit 20 pg des geeigneten Expressionskonstrukts (entweder cFGFR/pSV7d oder h2FGFR/pSV7d) und 1 pg eines Vektors, der das Neomycin-Resistenzgen (pSV2neo) enthielt, cotransfiziert. Zeilen wurden unter Verwendung von 50 pg Lipofectin (Bethesda Research Laboratories) nach Vorschrift des Herstellers transfiziert. 16 h später wurde das gleiche Volumen an DHE H21-Medium zugegeben, das 20% Kalbsfötenserum enthielt. Nach 48 h wurden Zellen geerntet und in Selektionsmedium (DME H21, 10% Kalbsfötenserum, 500 ug/ml Geneticin (GIBCO)) eingebracht (1 : 10). Transfizierte Kolonien wurden durch Immunblotting mit polyklonalen Anti-Rezeptor-Peptid einem Assay bezüglich der Expression des FGF-Rezeptors unterzogen.

Affinitätsmarkierung

Rekombinanter menschlicher aFGF und menschlicher bFGF wurden von der Chiron Corporation großzügig zur Verfügung gestellt und indiziert. Für Affinitätsmarkierungsversuche wurden 5 · 10&sup6; Zellen 30 min lang bei 37ºC in Gegenwart oder Abwesenheit eines 200fachen Überschusses des entsprechenden nicht-markierten Liganden mit 0,1 pMol ¹²&sup5;I-aFGF oder ¹²&sup5;I-bFGF inkubiert. Die Zellen wurden dann einmal mit eiskaltem DME H21, das 20 mM HEPES pH 7,4, 0,2% Gelatine, enthielt, und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Disuccinimidylsuberat wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,15 mM zugegeben, und Inkubationen wurden für 15 min bei 4ºC ablaufen gelassen. Der Vernetzer wurde dann entfernt, und die Zellen wurden in Probenpuffer resuspendiert, der 100 mM Dithiothreitol enthielt, 5 min lang aufgekocht, und SDS PAGE gefolgt von Autoradiographie unterzogen.

In vitro-Transkription von RNA

Vor der Transkription wurden Plasmidkonstrukte mit Xhol linearisiert. RNAs wurden aus den linearisierten Templaten unter Verwendung von T7 RNA-Polymerase in Gegenwart von 500 pM rNTPs (200 uM rGTP) und 500 pM 5'GpppG3' (Pharmacia) transkribiert. Nach 2-stündiger Inkubation bei 4ºC wurden Transkriptionsreaktionen mit RNAse-freier DNAse behandelt, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt, getrocknet und in Wasser resuspendiert.

Injektion von Oozyten

Tiere wurden in einer Lösung aus 0,06% Ethyl-p-aminobenzoat narkotisiert. Oozyten wurden chirurgisch entfernt und manuell in Cluster zerschnitten, die 10-20 Oozyten enthielten. Die Cluster wurden in modifizierter Barth Saline (siehe Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press (1982), das durch Verweis hierin aufgenommen ist) MBSH, das 1 mg/ml Typ II-Kollagenase (Sigma) 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann ausgiebig mit MBSH gewaschen, das 2 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) enthielt. Einzelne Oozyten wurden bei 19ºC in MBSH (1 mg/ml BSA) gehalten.
Oozyten wurden in den Pflanzenpol mit 50 nl Wasser oder RNA-Lösung (1 ug/pl in Wasser) injiziert. Nach der Injektion wurden Oozyten bei 19ºC 48 h lang inkubiert, bevor &sup4;&sup5;Ca&supmin;&supmin;-Ausflußassays durchgeführt wurden.

&sup4;&sup5;Ca&supmin;&supmin;-Ausflußassays

Gruppen von 50 injizierten Oozyten wurden in einzelne Näpfe einer 24 Napf-Platte gefüllt und viermal mit 0,5 ml einer Ca&spplus;&spplus;-freien MBSH-Lösung gewaschen, die kein BSA enthielt. Oozyten wurden dann 3 h lang bei 19ºC in 0,5 ml der Waschlösung inkubiert, die &sup4;&sup5;CaCl&sub2; (100 uCi/ml) enthielt. Nach der Inkubation wurden Oozyten sechsmal mit 0,5 ml MBSH (1 mg/ml BSA) gewaschen und dann auf eine andere 24-Napf-Platte übertragen (5 Oozyten pro Napf). Alle nachfolgenden Waschungen und Inkubationen wurden unter Verwendung von 0,5 ml MBSH durchgeführt, das 1 mg/ml BSA enthielt. In 10 min-Zeitintervallen wurden konditionierte Überstände aus jedem Napf entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Die konditionierten Medienproben wurden einzeln in einem Beckman-Szintillationszähler gezählt. Als der Hintergrundausfluß stabilisiert war, wurden Liganden in den angegeben Konzentrationen zugegeben, und die Mediensammlungen wurden fortgesetzt.
Bei 2 von 16 Versuchen wiesen Oozyten, denen Wasser injiziert und die entweder mit aFGF oder bFGF stimuliert waren, &sup4;&sup5;Ca&spplus;&spplus;-Ausflußmengen auf, die ähnlich waren wie jene von Oozyten, denen FGF-Rezeptor-RNA injiziert wurde. Der Grund für diese unerwarteten Reaktionen ist nicht festgestellt worden, es ist aber möglich, daß sie auf die Expression endogener FGF-Rezeptoren auf verunreinigenden Follikelzellen oder auf die Oberfläche der Oozyten selbst zurückzuführen waren. In allen anderen Versuchen wiesen die mit Wasser injizierten Oozyten keine nennenswerte Ausflußreaktion auf, während die Rezeptor-RNA-Reaktion auf FGF 10- bis 40fach über der Ausgangsmessung lag.
Die Rezeptormengen bei injizierten Oozyten sind noch nicht gemessen worden, weil das polyklonale Anti-Rezeptor-Antiserum gemäß vorliegender Erfindung ein reichlich vorhandenes Oozytenprotein mit etwa dem gleichen Molekulargewicht wie der FGF-Rezeptor bei Westernblots nicht-spezifisch erkennt. Weiters scheint die Menge an exogenen Rezeptoren, die in Oozyten exprimiert werden, ziemlich gering zu sein.

Isolierung und Charakterisierung menschlicher cDNA-Klone

Komplementäre DNA-Sammlungen von menschlichen Plazenta- und menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen wurden großzügig von J. Evans Sadler (Washington University School of Medicine, St. Louis) gespendet. Die Sammlungen wurden mit ³²P-markierten Oligomeren gescreent, die mit den zuvor verwendeten identisch waren, um Hühner- FGF-Rezeptor-cDNA-Klone zu identifizieren. Filter wurden unter sehr rauhen Bedingungen hybridisiert und gewaschen, wobei Standardverfahren eingesetzt wurden. Insgesamt 7 positive Klone wurden nach dem Screenen von 250.000 Phagen aus beiden Sammlungen isoliert. Die in diesem Bericht beschriebenen 4 Klone (h2, h3, h4 und h5) wurden nach dem Didesoxy-Kettenterminationsverfahren sequenziert, wobei das Sequenase-System (United States Biochemical Corporation) verwendet wurde. Klone h2, h3 und h4 wurden aus der Endothelzellensammlung erhalten, und Klon h5 wurde aus der Plazentasammlung erhalten. Nukleotidsequenzanalysen zeigten, daß alle vier Klone identische untranslatierte 5'-Sequenzen enthielten und Poly-A-Schwänze an ihren 3-Enden aufwiesen. Aber nur dem Poly-A-Strang am 3'-Ende von h2 ging stromauf eine Konsens-Polyadenylierungs-Signalsequenz (AATAAA, 37) voraus, was darauf hinweist, daß inneres Primen für die Poly-A-Schwänze an den 3'-Enden der anderen Klone verantwortlich war. Die h2-, h3-, h4- und h5-cDNAs enthielten 0,93 kb, 0,78 kb, 0,95 kb bzw. 0,2 kb untranslatierte 3'-Sequenz. Die untranslatierten 3-Sequenzen von h2 und h3 waren identisch, und die untranslatierten 3'-Sequenzen von h4 und h5 waren ebenfalls identisch. Im Gegensatz dazu waren die untranslatierten 3'-Sequenzen von h2/h3 vollständig von den untranslatierten 3'-Sequenzen von h4/h5 verschieden.

Polymerase-Kettenreaktionen

Amplifizierungsreaktionen (42) wurden unter Verwendung eines Primers, der dem menschlichen stark sauren Bereich entsprach (etwa Aminosäuren 44-52 bei h2; S'GTTTCTTTCTCCTCTGAAGAGGAGT-3') und eines degenerierten Primers durchgeführt, der der IgI-Domäne des Hühner-FGF-Rezepotrs entsprach (etwa Aminosäuren 58- 69; 5'-GA(TC)GACGTGCAG (A/T)(G/C)CATCAACTGGGTGCGTGATGG-3'). Bei weiteren Reaktionen wurde der Primer vom menschlichen stark sauren Bereich und ein zweiter Primer verwendet, der vom untranslatierten 5'-Bereich des menschlichen FGF-Rezeptors (5'-GAGGATCGAGCTCACTGTGGAGTA-3') abgeleitet wurde. Die Reaktionsgemische enthielten 750 ng menschliche Genom-DNA, 10 pMol jedes Primers, 200 mM jedes der vier dNTPs und 1 Einheit Taq-Polymerase (Perkin Eimer Cetus) in 50ul 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 100 ng/ml BSA. Reaktionen wurden in einem Ericomp-Doppelblocksystem durchgeführt. Es wurden 31 Zyklen durchgeführt, die aus Denaturierung bei 94ºC für 50 s, Annelieren bei 65ºC für 1 min und Verlängerung bei 72ºC für 3 min bestanden.
Isolierung und Charakterisierung von vier einzigartigen menschlichen FGF-RezeptorcDNAs
Der basische Hühner-FGF-Rezeptor enthält eine einzelne Transmembrandomäne, einen extrazellulären Bereich, der 3 Ig-artige Domänen und eine stark saure Domäne enthält, sowie einen intrazellulären Bereich, der eine gespaltene Tyrosin-Kinase-Domäne enthält. Die Hühner-FGF-Rezeptor-cDNA ist in hohem Maße homolog zu einer früher veröffentlichten partiellen cDNA (hflg), die für eine Tyrosin-Kinase kodiert, deren Funktion zum Zeitpunkt ihrer Beschreibung nicht bekannt war. Der hohe Grad an Identität (95%) zwischen dem Hühner-bFGF-Rezeptor und menschlichem fig wies darauf hin, daß hflg das menschliche Gegenstück des bFGF-Rezeptors war. Um menschliche FGF-RezeptorcDNAs voller Länge zu erhalten, wurden Oligonukleotidsonden auf Basis der hflgcDNA-Sequenz verwendet, um eine menschliche Nabelvenen-Endothelzellen-cDNA- Sammlung und eine menschliche Plazenta-cDNA-Sammlung zu screenen. Durch anfängliches Screenen von 250.000 Plaques aus jeder Sammlung wurden vier positive Klone aus der Endothelzellensammlung und drei aus der Plazentasammlung isoliert.
Die cDNA-Klone konnten auf Basis verschiedener Muster von Restriktionskarten an ihren 3'-Enden in zwei Klassen unterteilt werden. Eine dieser Klassen stammte von cDNA- Klonen, die eine viel geringere Länge aufwiesen. Vertreter für jede Klasse waren in den aus jeder Sammlung isolierten Klonen vorhanden. Zwei Klone (h2 und h3), welche die Klasse größerer cDNA-Klone repräsentierten, und zwei Klone (h4 und h5), welche die Klasse kürzerer cDNA-Klone repräsentierten, wurden zur Gänze sequenziert. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der vier menschlichen Rezeptorformen werden im Vergleich zur Hühner-FGF-Rezeptorsequenz in Fig. 7 gezeigt. Eine schematische Darstellung der verschiedenen Rezeptorformen wird in Fig. 8 gezeigt.
Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der h2- und h3-Klone sind so gut wie identisch und unterscheiden sich nur um drei Aminosäuren (Aminosäuren 59, 60 und 103 in h2, Fig. 7). Auf Nukleotidebene unterscheiden sich h2 und h3 nur an den Positionen, die für diese drei Aminosäurereste kodieren. Die offenen Leserahmen von h2/h3 umfassen eine hydrophobe Signalsequenz und die ungewöhnliche saure Domäne (8 aufeinanderfolgende saure Reste mit begleitetenden Resten), die zunächst in der veröffentlichten Sequenz der Hühner-FGF-Rezeptor-cDNA festgestellt wurde. Die extrazellulären Domänen von h2 und h3 sind in hohem Maße homolog zum Hühner-FGF-Rezeptor, mit der Ausnahme, daß h2 und h3 die Sequenzen einer Ig-artigen Domäne fehlen (in Fig. 8 mit I markiert). Der Transmembranbereich und die Cytoplasma-Domänen sind in hohem Maße homolog zu den entsprechenden Domänen des Hühner-FGF-Rezeptors.
Die Kodiersequenzen der kürzeren cDNA-Klone h4 und h5 unterscheiden sich nur um zwei Aminosäuren (Positionen 59 und 60 in h4; die Nukleotidsequenzen von h4 und h5 unterscheiden sich nur an den Positionen, die für diese beiden Reste kodieren). Die Signalsequenz, der saure Bereich und eine der Ig-artigen Domänen (IgII) sind im wesentlichen identisch mit den entsprechenden Bereichen von h2 und h3. Das unterscheidende Merkmal von h4 und h5 ist die Ig-artige Domäne (IgIII), die der Transmembrandomäne am nächsten ist. Etwa die Hälfte dieser Domäne ist identisch mit der entsprechenden Sequenz von h2 und h3. Die carboxylterminale Hälfte dieser Ig-artigen Domäne ist je doch nicht mit den h2- und h3-Sequenzen verwandt. Anders als h2, h3 und die Hühner- FGF-Rezeptor-cDNA kodieren h4 und h5 nicht für einen hydrophoben membranüberspannenden Bereich oder eine Cytoplasma-Domäne.
Die Sequenzen aller menschlichen cDNAs, die isoliert worden sind, enthalten nur 2 Igartige Domänen. Um zu bestimmen, ob das menschliche FGF-Rezeptorgen Sequenzen enthält, die für die erste Ig-artige Domäne (IgI) kodieren, wurden Polyermase-Kettenreaktionen an Genom-DNA durchgeführt, die von menschlichen Vorhautfibroblasten (HFFs) isoliert worden war. Für diese Versuche wurde ein Amplifizierungsprimer auf Basis der Sequenz der Igf-Domäne des Hühner-Rezeptors (die den Aminosäuren 58-69 entspricht) und ein zweiter Primer auf Basis einer Sequenz vom sauren Bereich des menschlichen Rezeptors (Aminosäuren 44-52 in h2) verwendet. Unter Verwendung dieser Primer wurde ein einzelnes Genom-Fragment mit 1,3 kb amplifiziert. Wie in Fig. 9 gezeigt, enthielt dieses Fragment Kodiersequenzen, die homolog (etwa 83% Aminosäureidentität) zur IgI-Domäne des Hühner-FGF-Rezeptors waren. Außerdem trennt eine Intronsequenz mit eta 1,0 kb diese Kodiersequenzen von Sequenzen, die für den stark sauren Bereich des Rezeptors kodieren. Somit enthält das menschliche FGF-Rezeptorgen klar für die IgI-Domäne kodierende Sequenzen, die in menschlichen cDNA-Klonen nicht zu finden sind. Weiters weist das Vorhandensein eines Introns zwischen der IgI- Domänensequenz und der Sequenz des sauren Bereichs darauf hin, daß die Expression von 2 oder 3 Ig-Domänenformen durch alternatives Spleißen reguliert werden kann.
Um zu bestimmen, ob eine 3 Ig-Domänenform des Rezeptors in HFF-Zellen exprimiert wird, wurde PCR an cDNA durchgeführt, die von HFF-mRNA erzeugt wurde. Unter Verwendung der oben beschriebenen Primer wurde ein einzelnes 0,24 kb-Fragment von HFF-cDNA amplifiziert. Dieses Fragment enthielt Sequenzen, die für die IgI-Domäne und den sauren Bereich kodieren, aber keine Intronsequenzen. So kamen die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes zu dem Schluß, HFF-Zellen eine 3 Ig-Domänenform des Rezeptors transkribieren. Um zu bestimmen, ob HFF-Zellen auch eine 2 Ig-Domänenform des Rezeptors exprimieren, wurde der Primer des sauren Bereichs und ein zweiter Primer auf Basis einer Sequenz vom untranslatierten 5'-Bereich des menschlichen FGF-Rezeptors verwendet. Bei diesen Reaktionen wurde ein 0,23 kb-Fragment amplifiziert, dem auf die gleiche Weise wie den erfindungsgemäßen cDNA-Klone Sequenzen fehlten, die der IgI-Domäne entsprechen. Somit wird eine 2-Ig-Domänenform des Rezeptors ebenfalls in HFF-Zellen transkribiert.
Rezeptoren, die 3 Ig-artige und 2 Ig-artige Domänen enthalten, binden sauren FGF und basischen FGF
Da der 3 Ig-Domänenrezeptor (anfänglich aus einer Hühner-cDNA-Sammlung isoliert) auf Basis seiner Affinität für basischen FGF gereinigt wurde, war es von Interesse zu bestimmen, ob dieser Rezeptor auch sauren FGF bindet. Um diese Frage zu beantworten, wurde der 3 Ig-Domänen-Hühnerrezeptor in Ratten-L6-Myoblasten exprimiert, einer Zell-Linie, die normalerweise keine FGF-Rezeptoren exprimiert. Außerdem wurde der 2 Ig-Domänen-Menschen-h2-Rezeptor ebenfalls in L6-Zellen exprimiert. Fig. 10 zeigt einen Affinitätsmarkierungsversuch, der mit transfizierten Zellen durchgeführt wurde. Zellen wurden entweder mit ¹²&sup5;I-aFGF oder ¹²&sup5;I-bFGF inkubiert, und gebundener Ligand wurde in Gegenwart von Disuccinimidylsuberat (0,15 mM) vernetzt. Unter Verwendung eines Liganden waren einzelne vernetzte Banden bei Zellen zu sehen, die mit RezeptorcDNAs transfiziert wurden (Spuren 1, 3, 7 und 9), nicht aber bei Zellen, die mit Vektor allein transfiziert wurden (Spuren 5, 6, 11 und 12). Subtraktion des Molekulargewichts von FGF (17 kd) von der Größe der vernetzten Komplexe ergibt geschätzte Molekulargewichtswerte von 145 kd für die 3 Ig-Domänenform des Rezeptors und 125 kd für die 2 Ig-Domänenform des Rezeptors. Überschüssige unmarkierte Liganden blockieren die Bildung der vernetzten Komplexe (Spuren 2, 4, 8 und 10). Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl die 3 Ig-Domänenform als auch die 2 Ig-Domänenform des FGF-Rezeptors fähig sind, entweder sauren oder basischen FGF zu binden. Scatchard-Bindungsanalysen weisen darauf hin, daß halb-maximale Bindung von ¹²&sup5;I-aFGF entweder an die 3 Ig-Domänenform oder die 2 Ig-Domänenform bei einer Konzentration von 0,05 nM auftritt. Auf ähnliche Weise tritt halb-maximale Bindung von ¹²&sup5;I-bFGF entweder an die 3 Ig-Domänenform oder die 2 Ig-Domänenform bei 0,1 nM auf.
Ein 3 Ig-Domänen-FGF-Rezeptor und ein 2 Ig-Domänen-FGF-Rezeptor vermitteln biologische Reaktionen, sowohl auf sauren als auch basischen FGF
Um zu bestimmen, ob eine der membranüberspannenden Formen des FGF-Rezeptors durch aFGF oder bFGF aktiviert wird, wurden diese Rezeptoren in Xenopus-Oozyten exprimiert und die Rezeptoraktivierung unter Verwendung eines empfindlichen Ca&supmin;&supmin;- Ausflußassays gemesen. Dieses Assay ist eingesetzt worden, um die Expression von Rezeptoren für andere Ca&spplus;&spplus;-Mobilisierungsliganden, einschließlich Cholecystokinin, Bombesin, Vasopressin und Angiotensin II zu untersuchen. Liganden-induzierter Ausfluß ist ein Zeichen für eine Mobilisierung von Ca&spplus;&spplus; aus intrazellulären Lagern, was zu erhöhten Mengen an intrazellulärem Ca&spplus;&spplus; und beschleunigtem Ausfluß führt. Für die erfindungsgemäßen Versuche wurde cDNA voller Länge in vitro transkribiert, und die verkappten mRNAs wurden in Xenopus-Oocyten injiziert. Nach 48 h wurden die injizierten Oocyten mit &sup4;&sup5;CaCl&sub2; beladen, und ein Assay bezüglich Liganden-abhängiger Kalziummobilisierung wurde durch Messen des &sup4;&sup5;Ca&spplus;&supmin;-Ausflusses durchgeführt (Fig. 11). Die Zugabe entweder von aFGF (A und B) oder bFGF (C und D) führt zu einem raschen und starken Ausfluß von &sup4;&sup5;Ca&spplus;&spplus; aus Oozyten, denen RNA injiziert wurde, die für den Hühner-FGF-Rezeptor kodiert (A und C), oder RNA, die für den menschlichen h2-Rezeptor kodiert (B und D). Im Gegensatz dazu zeigten Oozyten, denen entweder menschliche h3-RNA (Bund D) oder Wasser allein (A-D) injiziert wurde, keine Reaktion auf aFGF oder bFGF. Als positiver Vergleich wurde nach dem 100-Minuten-Zeitpunkt Carbachol zugegeben. Oozyten exprimieren endogene Rezeptoren für Carbachol, und Oozyten, denen entweder FGF-Rezeptor-RNA oder Wasser injiziert wurde, zeigen nach Carbachol-Stimulierung positive Reaktion. Es wird der Schluß gezogen, daß sowohl die 3 Ig-Domänenform (cFGF-R) als auch die 2 Ig-Domänenform (h2) des FGF-Rezeptors biologisch auf sowohl sauren als auch basischen FGF ansprechen. Somit scheinen die Liganden-Bindedomänen für sauren und basischen FGF im Rezeptorbereich zu liegen, der die stark saure Domäne und die IgII- und IgIII-Domänen umfaßt.
Während der menschliche h2-Rezeptor deutlich auf beide Liganden anspricht, wurde bei Oozyten, denen RNA injiziert wurde, die für die h3-Rezeptorform kodiert, keine Reaktion festgestellt. Es ist möglich, daß die drei Aminosäureunterschiede zwischen h2 und h3 bewirken, daß diese Proteine unterschiedlich reagieren. Alternativ dazu kann das Fehlen einer Reaktion bei Oozyten, denen die h3-RNA injiziert wurde, auf ungewöhnlich geringe Expressionsmengen des h3-Proteins zurückzuführen sein. Unglücklicherweise konnten die Rezeptorprotein-Expressionsmengen bei Oozyten noch nicht bestimmt werden.
FGF-R-Formen, die entweder 2 oder 3 extrazelluläre Ig-artige Domänen aufweisen, binden sich an und reagieren sowohl auf sauren als auch basischen FGF. Einige Formen von FGF-Rezeptor-mRNA kodieren nur für die extrazelluläre Domäne des FGF-Rezeptors, ein Protein, dessen Ausscheidung aus der Zelle wahrscheinlich ist.
Die Tatsache, daß eine 2-Ig-artige Domänenform des FGF-Rezeptors (h2) sowohl aFGF als auch bFGF mit hoher Affinität bindet, hat es den Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes ermöglicht, die Bindedomänen für diese Liganden auf einen Bereich zu lokalisieren, der den stark sauren Bereich und die IgII- und IgIII-Domänen umfaßt.
Dem h4- und h5-Rezeptorformen fehlen Transmembranseugenzen, und sie stellen vermutlich sekretierte Formen des FGF-Rezeptors dar. Frühere Daten weisen darauf hin, daß mit der h4-cDNA transfizierte Zellen ein 70 kd-Protein sekretieren, das von polyklonalen Anti-FGF-R-Antiseren erkannt wird.
Die Rolle sekretierter Formen des FGF-Rezeptors ist unklar. Die sekretierten Formen können bewirken, daß die Mengen an extrazellulären FGFs reguliert werden, wodurch die Verfügbarkeit von FGFs für Zelloberflächen-FGF-Rezeptoren reguliert wird. Alternativ dazu können die sekretierten FGF-Rezeptoren dazu dienen, FGFs an einer bestimmten Stelle zu speichern und zu sequestrieren. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß die sekretierten Formen sich an FGFs in einem intrazellulären Abteil binden und da raufhin als Mittel zum Ausscheiden des Faktors dienen können. Das ist im Hinblick auf die Tatsache, daß aFGF und bFGF keine Signalsequenzen enthalten und ihr Ausscheidungsmechanismus unbekannt ist, eine wichtige Überlegung.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß Rezeptor-Vielfalt durch alternatives Spleißen erzeugt werden kann. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben insgesamt 5 verschiedene FGF-Rezeptor-DNA-Sequenzen isoliert. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen weist stark darauf hin, daß alle 5 Spezies vom gleichen Gen abgeleitet sind. Ein weiteres interessantes Merkmal der menschlichen Rezeptor-Formen ist das Vorhandensein oder Fehlen der ArgMet-Sequenz (Aminosäuren 59 und 60 in h2 und h4) in der extrazellulären Domäne.
Affinitätsmarkierungsverusche, bei denen entweder ¹²&sup5;I-aFGF oder ¹²&sup5;I-bFGF verwendet wurde, identifizierten ein einzelnes 145 kd-Rezeptorprotein an transfizierten Zellen, welche die 3 Ig-Domänenform des FGF-Rezeptors exprimieren, und ein einzelnes 125 kd-Rezeptorprotein auf transfizierten Zellen, welche die 2 Domänenform des FGF-Rezeptors exprimieren (siehe Fig. 11). Es ist möglich, daß das Vorhandensein zweier Rezeptorspezies die Coexpression der 3 Ig-Domänen- und der 2 Ig-Domänen-Formen des Rezeptors widerspiegeln kann. Die erfindungsgemäßen Daten legen klar fest, daß eine einzelne FGF-Rezeptorspezies sowohl aFGF als auch bFGF mit hoher Affinität binden und die biologischen Wirkungen dieser Faktoren vermitteln kann. Bei diesen Versuchen ist saurer und basischer FGF verwendet worden, weil sie die am besten charakterisierten Mitglieder der FGF-Familie und in rekombinanter Form leicht verfügbar sind.

Beispiel 6

Kompetitive Bindung von FGF-R-Peptiden oder Fragmenten, Entwicklung von FGF-R-verwandten Antagonisten oder Agonisten

Ein Fragment, das die gesamte oder einen Teil der extrazellulären Liganden-Bindedomäne des FGF-R enthält (d. h. die Aminosäuren 22-374 in Fig. 3 oder 22-285 in Fig. 4) oder Analoge davon werden in einem Wirt (z. B. Säugetierzellen oder mit Baculovirus infi zierte Insektenzellen) exprimiert und gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Alternativ dazu werden Fragmente der Liganden-Bindedomäne unter Einsatz eines Peptid-Synthesizers (Applied Biosystems) hergestellt und mittels HPLC gereinigt. Verschiedene Konzentrationen des FGF-R-Fragments oder Analoge davon (FGF-Rexs) werden auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung von ¹²&sup5;I-FGF an Swiss 3T3-Zellen zu blockieren. Kompetitive Bindung wird durchgeführt, wie in Fig. 1A in Beispiel 1 beschrieben, wobei FGF-Rexs anstelle von unmarkiertem Liganden verwendet werden, und es wird kompetitive Bindung ermittelt.
FGF-Rexs werden auch auf ihre Fähigkeit getestet, die FGF-induzierte Mitogenese zu hemmen, wie durch ³H-Thymidinaufnahme in Zellen und durch Zählen der Zellenanzahl gemessen. FGF-Rexs, welche die Bindung von FGF an den Zelloberflächenrezeptor blockieren, können als Antagonist wirken und die ³H-Thymidinaufnahme und die durch FGF herbeigeführte Steigerung der Zellenanzahl blockieren. FGF-Rexs können auch als Agonisten wirken, d. h. durch Dimerisierung mit dem Zelloberflächenrezeptor, der eine Liganden-vermittelte Rezeptor-Rekaptor-Wechselwirkung imitieren kann. In einem solchen Fall können FGF-Rexs die Mitogenese in Abwesenheit von Ligand stimulieren oder die FGF-vermittelte mitogenische Reaktion verstärken.
FGF-Rexs werden auch auf ihre Fähigkeit getestet, die FGF-induzierte Tyrosinphosphorylierung des 90 Substrat-Proteins in Swiss 3T3-Zellen oder die Autophosphorylierung des zellen-assoziierten FGF-R zu hemmen oder zu aktivieren. FGF-Rexs, welche die FGF-induzierte Tyrosinphosphorylierung blockieren, sind Antagonisten. FGF-Rexs, welche die Autophosphorylierung des zellen-assoziierten FGF-R in Abwesenheit von FGF aktivieren, sind Agonisten.
FGF-Rexs werden auch auf ihre anti-angiogene Aktivität getestet. FGF-Rexs werden zunächst auf ihre Fähigkeit getestet, das FGF-induzierte Wachstum und die Mobilisierung von Endothelzellen in Gefäßen in vitro zu hemmen. Angiogenese wird in vitro unter Einsatz eines Aortaring-Assays untersucht. Aortaringe werden in eine Kollgenmatrix ein gelegt, die in Gegenwart oder Abwesenheit von FGF und FGF-Rexs gebildet wird. Endothelzellen sprießen und bilden innerhalb weniger Tage in Gegenwart von FGF Gefäße vom Aortaring weg. Die Zugabe der FGF-Rexs, die in vorherigen Assays Antagonisten waren, hemmen das FGF-induzierte Wachstum von Kapillarsprossen. FGF-Rexs, die auch in Abwesenheit von FGF angiogen sind, sind Agonisten.
FGF-Analoge, angiogene Faktoren, anti-angiogene Faktoren sowie Antikörper gegen den extrazellulären Abschnitt des FGF-R weden auf ihre Fähigkeit getestet, sich direkt zu binden oder um die Bindung von nativem FGF für die Bindung an gereinigten oder exprimierten FGF-R zu konkurrieren. Außerdem werden sie auf ihre Fähigkeit getestet, Mitogenese zu stimulieren (Agonisten) oder FGF-abhängige Mitogenese zu hemmen (Antagonisten), sowie Tyrosinphosphorylierung in Zellen, die den FGF-R exprimieren. Diese Untersuchungen sind wichtig, um zu bestimmen, ob die Wirkungsweise jedes angiogenen und anti-angiogenen Faktors usw. rezeptor-vermittelt ist, und um zu bestimmen, ob Rezeptorspezifität (d. h. von saurem gegenüber basischem FGF-R) für angiogene und anti-angiogene Faktoren vorliegt.
FGF-Analoge werden radiomarkiert, und die Bindung wird mit markiertem Liganden, gereinigtem oder exprimiertem Rezeptor im geeigenten physiologischen Puffer (d. h. Kulturmedium oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)) für 0,5 h bei 37ºC oder 2-24 h bei 4ºC durchgeführt. Der Komplex wird gefällt (5-10% Polyethylenglykol, 1 mg/ml IgG) und durch Filtration mittels Filtern (d. h. Whitman GFA) abgetrennt und die zugehörige Radioaktivität ermittelt.
Die Erfindung ist zwar in Verbindung mit bestimmten spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden, es ist jedoch festzustellen, daß verschiedene Modifikationen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar sein werden, ebenfalls in den Schutzumfang der Erfindung fallen, wie durch die beiliegenden Ansprüche definiert.

Claims

1. Gereinigtes lösliches Polypeptid, das IgII- und IgIII-Domänen einer der in Fig. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen oder eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zwei Domänen umfaßt, die zu zumindest 85% homolog zur IgII- bzw. IgIII-Domäne einer dieser Sequenzen sind; wobei dem Polypeptid die Transmembran-Domäne fehlt und das Polypeptid fähig ist, die Bindung zwischen einem Fibroblasten-Wachstumfaktor und einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor zu hemmen.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, das die IgII- und IgIII-Domänen von Fibroblasten- Wachstumsfaktor-Rezeptor h3, wie in Fig. 7 dargestellt, oder ein in diesen Domänen dazu zu 85% homologes Polypeptid umfaßt.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das eine erste Ig-Domäne umfaßt, die (i) zwei Cysteinreste, (ii) einen Tryptophanrest, 11 oder 12 Aminosäuren an der carboxylterminalen Seite jenes der obengenannten Cysteinreste, der dem N-terminalen Ende am nächsten ist, von diesem entfernt, und (iii) eine Sequenz DXGXYXC an der aminoterminalen Seite des anderen der Cysteinreste umfaßt; eine zweite Ig-Domäne, C-terminal zur ersten Domäne, die ebenfalls die Merkmale (i), (ii) und (iii), wie für die erste Ig-Domäne definiert, aufweist, mit der Ausnahme, daß die zweite dieser Ig-Domänen anstelle des anderen Cysteinrests und der Sequenz (iii) eine carboxylterminale Sequenz aufweisen kann, die zu zumindest 85% zur 79-Aminosäuren-Sequenz der Reste 224 bis 302 oder 222 bis 300 des menschlichen Proteins h4 bzw. h5 aus Fig. 7 homolog ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 3, worin die erste Ig-Domäne die Reste 85 bis 141 einer menschlichen Sequenz, wie in Fig. 7 dargestellt, umfaßt.

5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das weiters eine carboxylterminale Sequenz umfaßt, welche die 79-Aminosäuren-Sequenz der Reste 224 bis 302 oder 222 bis 300 der Sequenz einer menschlichen Sequenz h4 bzw. h5, wie in Fig. 7 dargestellt, ist.

6. Gereinigtes Polypeptid, das die in Fig. 7 als h4 oder h5 bezeichnete menschliche Sequenz umfaßt.

7. Gereinigtes Polypeptid, das kleiner als 85 kD ist und eine Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Bindungsdomäne eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors umfaßt, wobei der Rezeptor eine Aminosäuresequenz, wie in Fig. 7 dargestellt, oder eine Allel- Variante oder Mutante davon, oder eine homologe Sequenz umfaßt, für die eine Nukleinsäure kodiert, die unter rauhen Bedingungen, zu denen eine Temperatur von über 37ºC und eine Salzkonzentration von weniger als 1 M zählen, an DNA hybridisiert, die für die Sequenzvariante oder -mutante kodiert.

8. Polypeptid nach Anspruch 7, das löslich ist.

9. Polypeptid nach Anspruch 7, das weiters ein Segment aus zumindest 5 zusammenhängenden Aminosäuren umfaßt oder einschließt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

(a) einem Signalsegment;

(b) einem sauren Segment, das eine Abfolge von 8 aufeinanderfolgenden sauren Resten aufweist;

(c) bis zu drei Ig-Segmenten von Ig-Domänen, von denen jedes dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgendes aufweist: (i) zwei Cysteinreste, (ii) einen Tryptophanrest, 11 oder 12 Aminosäuren an der carboxylterminalen Seite jenes der obengenannten Cysteinreste, der dem N-terminalen Ende am nächsten ist, von diesem entfernt, und (iii) eine Sequenz DXGXYXC an der aminoterminalen Seite des anderen der Cysteinreste; mit der Ausnahme, daß eine der Ig-Domänen anstelle des anderen Cysteinrests und der Sequenz (iii) eine carboxylterminale Sequenz aufweisen kann, die zu zumindest 85% zur 79-Aminosäuren-Sequenz der Reste 224 bis 302 oder 222 bis 300 des menschlichen Proteins h4 bzw. h5 aus Fig. 7 homolog ist; oder

(d) ein Transmembran-Segment.

10. Polypeptid nach einem der Ansprüche 7 bis 9, worin die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Bindungsdomäne zumindest 30 Aminosäuren jeder der beiden Ig-Domänen, wie in Anspruch 9 definiert, umfaßt, die dem Carboxylterminus am nächsten liegen, wie in Fig. 7 dargestellt.

11. Polypeptid nach Anspruch 7, worin der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor ein Hühner-Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor ist.

12. Polypeptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das in einem mehrkettigen Proteinkomplex vorliegt.

13. Monoklonaler Antikörper, der sich an ein Polypeptid nach einem der vorangegangenen Ansprüche bindet.

14. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 13, der sich an den in Fig. 7 dargestellten Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor h3 bindet.

15. Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zusammen mit einem Träger umfaßt.

16. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder monoklonaler Antikörper nach Anspruch 13 oder Anspruch 14 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 15 zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, die mit Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptoren in Zusammenhang stehen.

17. Isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert.

18. Isolierte Nukleinsäure, welche die gesamte oder einen Teil einer Sequenz in der IgI- und der IgIII-Domäne, die in einer der Fig. 3, 4 oder 9 dargestellt werden, umfaßt oder unter rauhen Bedingungen, zu denen eine Temperatur von über 37ºC und eine Salzkonzentration von weniger als 1 M zählen, selektiv damit hybridisiert, und die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert.

19. Nukleinsäure nach Anspruch 18, die mit der in Fig. 4 dargestellten Sequenz hybridisiert.

20. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 18, die zu zumindest 80% zu einer in den Fig. 3, 4 oder 9 dargestellten Sequenz oder zu dem Teil davon homolog ist.

21. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 18 oder 20, die für einen Fibroblasten- Wachstumsfaktor-Rezeptor kodiert, dem eine intrazelluläre Domäne im wesentlichen fehlt.

22. Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 18 bis 21, die eine Sequenz umfaßt, die eine Nukleinsäuresequenz umfaßt oder unter rauhen Bedingungen, zu denen eine Temperatur von über 37ºC und eine Salzkonzentration von weniger als 1 M zählen, damit hybridisiert, die für eine Ig-Domäne kodiert, die von zwei Cysteinresten begrenzt wird, die in jenem Bereich der Sequenz vorhanden sind, der von den Aminosäuren 87 bis 141 der in Fig. 7 dargestellten menschlichen Sequenzen oder von den Aminosäuren 176 bis 228 der in Fig. 7 dargestellten Hühner-Sequenz begrenzt wird.

23. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 21, die für eine IgII-Domäne mit im wesentlichen voller Länge eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors kodiert, worin die IgII-Domäne dadurch gekennzeichnet ist, daß sie folgendes aufweist: (i) zwei Cysteinreste, (ii) einen Tryptophanrest, 11 oder 12 Aminosäuren an der carboxylterminalen Seite jenes der obengenannten Cysteinreste, der dem N-terminalen Ende am nächsten ist, von diesem entfernt, und (iii) eine Sequenz DXGXYXC an der aminoterminalen Seite des anderen der Cysteinreste.

24. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 23, worin die Sequenz, die für die IgII- Domäne kodiert, für einen Menschen nativ ist.

25. Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 18 bis 23, die weiters eine Transkriptionspromotorsequenz umfaßt.

26. Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 18 bis 25, die für einen löslichen menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor kodiert, dem ein Transmembranbereich fehlt.

27. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 26, worin der lösliche menschliche Wachstumsfaktor-Rezeptor zwei Domänen umfaßt, die zu zumindest 85% zur IgII- bzw. -IgIII- Domäne von h4 und h5, wie in Fig. 7 dargestellt, homolog sind.

28. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das die Expression einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 18 bis 27 umfaßt.

29. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 18 bis 27, die weiters eine Nukleinsäure umfaßt, die für ein Reportermolekül kodiert.

30. Verfahren zur Herstellung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorpeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Peptid in einer Zelle produziert wird, die mit einer Nukleinsäure transformiert ist, die eine für das Peptid kodierende Sequenz umfaßt, die mit Transkriptions- und Translationsinitiationsbereichen operabel verbunden ist, wobei das Verfahren das Exprimieren der Nukleinsäure und das Gewinnen des FGF- R-Peptids umfaßt.

31. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gegen ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorfragment, wobei das Verfahren einen Schritt der Herstellung eines Antikörpers gegen ein Polypeptid-Epitop umfaßt, das zumindest 6 zusammenhängende Aminosäuren eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfaßt.

32. Verfahren nach Anspruch 31, worin das Epitop aus der Gruppe von Proteinsegmenten ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: einer Signalsequenz, einem Ig-Segment einer Ig-Domäne, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie folgendes aufweist: (i) zwei Cysteinreste, (ii) einen Tryptophanrest, 11 oder 12 Aminosäuren an der carboxylterminalen Seite jenes der obengenannten Cysteinreste, der dem N-terminalen Ende am nächsten ist, von diesem entfernt, und (iii) eine Sequenz DXGXYXC an der aminoterminalen Seite des anderen der Cysteinreste; einem sauren Segment, das eine Abfolge von 8 aufeinanderfolgenden sauren Resten aufweist, oder einem Segment einer modifizierten Ig-Domäne, die anstelle der Sequenz DXGXYXC eine carboxylterminale Sequenz aufweist, die zu zumindest 85% zur 79-Aminosäuren-Sequenz der Reste 224 bis 302 oder 222 bis 300 des h4- bzw. h5-Proteins aus Fig. 7 homolog ist.

33. Verfahren zum Messen eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors in einer Zielprobe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

das Kombinieren der Zielprobe mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12; und

das Bestimmen des Ausmaßes der Bindung zwischen dem Segment und der Probe.

34. Transformierte Zelle, die zum Exprimieren eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 12 fähig ist.

35. Transformierte Zelle nach Anspruch 34, die eine Nukleinsäure enthält, die eine Nukleinsäure umfaßt, die für die gesamte membrangebundene Form eines menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors, wie in Fig. 7 dargestellt, kodiert, oder mit dieser unter rauhen Bedingungen, zu denen eine Temperatur von über 37ºC und eine Salzkonzentration von weniger als 1 M zählen, hybridisiert.

36. Transformierte Zelle nach Anspruch 35, die eine Nukleinsäure enthält, die eine Nukleinsäure umfaßt, die für die gesamte extrazellulare Domäne eines menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors kodiert, wie in Fig. 7 dargestellt, oder mit dieser hybridisiert.

37. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 34 bis 36, worin die Zelle zur Sekretion des menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorpeptids fähig ist.

38. Verfahren zum Messen eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors, umfassend:

das Kombinieren einer Zielprobe, die einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor enthält, mit einem löslichen Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 12; und

das Bestimmen des Ausmaßes der Bindung zwischen dem Segment und dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor in der Probe.

39. Verfahren nach Anspruch 38, das weiters die Bewertung eines potentiellen Agonisten oder Antagonisten auf seine Fähigkeit zur Förderung oder Hemmung der Bindungswechselwirkung des Segments und des Wachstumsfaktors umfaßt.

PATENTANSPRÜCHE FÜR DEN VERTRAGSSTAAT ES

1. Verfahren zur Herstellung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorpeptids, umfassend IgII- und IgIII-Domänen einer der in Fig. 7 dargestellten Aminosäuresequenzen oder eine Aminosäuresequenz, die zwei Domänen umfaßt, die zu zumindest 85% homolog zur IgII- bzw. IgIII-Domäne einer der Sequenzen sind; wobei dem Polypeptid eine Transmembrandomäne fehlt und wobei das Polypeptid fähig ist, die Bindung zwischen einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor zu hemmen, worin das Peptid in einer Zelle produziert wird, die mit einer Nukleinsäure transformiert ist, die eine für das Peptid kodierende Sequenz umfaßt, die mit Transkriptions- und Translationsinitiationsbereichen operabel verbunden ist, wobei das Verfahren das Exprimieren der Nukleinsäure und das Gewinnen des FGF-R-Peptids umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peptid die IgII- und IgII-Domänen von Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor h3, wie in Fig. 7 dargestellt, oder ein in diesen Domänen zu 85% dazu homologes Polypeptid umfaßt. ·

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Peptid eine erste Ig-Domäne umfaßt, die (i) zwei Cysteinreste, (ii) einen Tryptophanrest, 11 oder 12 Aminosäuren an der carboxylterminalen Seite jenes der obengenannten Cysteinreste, der dem N-terminalen Ende am nächsten ist, von diesem entfernt, und (iii) eine Sequenz DXGXYXC an der aminoterminalen Seite des anderen der Cysteinreste umfaßt; eine zweite Ig-Domäne, Cterminal zur ersten Domäne, die ebenfalls die Merkmale (i), (ii) und (iii), wie für die erste Ig-Domäne definiert, aufweist, mit der Ausnahme, daß die zweite dieser Ig-Domänen anstelle des anderen Cysteinrests und der Sequenz (iii) eine carboxylterminale Sequenz aufweisen kann, die zu zumindest 85% zur 79-Aminosäuren-Sequenz der Reste 224 bis 302 oder 222 bis 300 des menschlichen Proteins h4 bzw. h5 aus Fig. 7 homolog ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die erste Ig-Domäne die Reste 85 bis 141 einer menschlichen Sequenz, wie in Fig. 7 dargestellt, umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Polypeptid weiters eine carboxylterminale Sequenz umfaßt, welche die 79-Aminosäuren-Sequenz der Reste 224 bis 302 oder 222 bis 300 der Sequenz einer menschlichen Sequenz h4 bzw. h5 ist, wie in Fig. 7 dargestellt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines gereinigten Polypeptids, das die als h4 oder h5 bezeichnete menschliche Sequenz aus Fig. 7 umfaßt.

7. Verfahren zur Herstellung eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorpeptids, das kleiner als 85 kD ist und eine Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Bindungsdomäne eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors umfaßt, wobei der Rezeptor eine Aminosäuresequenz, wie in Fig. 7 dargestellt, oder eine Allel-Variante oder Mutante davon umfaßt, oder eine homologe Sequenz, für die eine Nukleinsäure kodiert, die sich unter rauhen Bedingungen, zu denen eine Temperatur von über 37ºC und eine Salzkonzentration von weniger als 1 M zählen, an DNA hybridisiert, die für die Sequenzvariante oder -mutante kodiert, worin das Peptid in einer Zelle produziert wird, die mit einer Nukleinsäure transformiert ist, die eine für das Peptid kodierende Sequenz umfaßt, die mit Transkriptions- und Translationsinitiationsbereichen operabel verbunden ist, wobei das Verfahren das Exprimieren der Nukleinsäure und das Gewinnen des FGF-R-Peptids umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Polypeptid löslich ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Polypeptid weiters ein Segment aus zumindest 5 zusammenhängenden Aminosäuren umfaßt oder einschließt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

(a) einem Signalsegment;

(d) ein Transmembran-Segment.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, worin die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Bindungsdomäne zumindest 30 Aminosäuren jeder der beiden Ig-Domänen, wie in Anspruch 9 definiert, umfaßt, die dem Carboxylterminus am nächsten liegen, wie in Fig. 7 dargestellt.

11. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor ein Hühner-Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor ist.

12. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Polypeptid in einem mehrkettigen Proteinkomplex vorliegt.

13. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gegen ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptorfragment, wobei das Verfahren einen Schritt der Herstellung eines Antikörpers gegen ein Polypeptid-Epitop umfaßt, das zumindest 6 zusammenhängende Aminosäuren eines Polypeptids umfaßt, wie nach einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Epitop aus der Gruppe von Proteinsegmenten ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: einer Signalsequenz, einem Ig-Segment einer Ig-Domäne, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie folgendes aufweist: (i) zwei Cysteinreste, (ii) einen Tryptophanrest, 11 oder 12 Aminosäuren an der carboxylterminalen Seite jenes der obengenannten Cysteinreste, der dem N-terminalen Ende am nächsten ist, von diesem entfernt, und (iii) eine Sequenz DXGXYXC an der aminoterminalen Seite des anderen der Cysteinreste; einem sauren Segment, das eine Abfolge von 8 aufeinanderfolgenden sauren Resten aufweist, oder einem Segment einer modifizierten Ig-Domäne, die anstelle der Sequenz DXGXYXC eine carboxylterminale Sequenz aufweist, die zu zumindest 85% zur 79-Aminosäuren-Sequenz der Reste 224 bis 302 oder 222 bis 300 des h4- bzw. h5-Proteins aus Fig. 7 homolog ist.

15. Verfahren zum Messen eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors in einer Zielprobe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

das Bestimmen des Ausmaßes der Bindung zwischen dem Segment und der Probe.

16. Verfahren zum Messen eines Fibroblasten-Wachstumsfaktors oder eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptors, umfassend:

17. Verfahren nach Anspruch 16, das weiters die Bewertung eines potentiellen Agonisten oder Antagonisten auf seine Fähigkeit zur Förderung oder Hemmung der Bindungswechselwirkung des Segments und des Wachstumsfaktors umfaßt.