DE69128564T2

DE69128564T2 - Extrazelluläre form des menschlichen fibroblasten wachstumsfaktorrezeptors

Info

Publication number: DE69128564T2
Application number: DE69128564T
Authority: DE
Inventors: Laura Bergonzoni; Antonella Isacchi; Guy Mazue; Romeo Roncucci; Paolo Sarmientos
Original assignee: Pharmacia and Upjohn SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1990-01-23
Filing date: 1991-01-21
Publication date: 1998-05-07
Anticipated expiration: 2011-01-22
Also published as: WO1991011459A1; DE69128564D1; GB9001466D0; EP0464175B1; JPH04504428A; EP0464175A1

Description

Die Erfindung betrifft humane Wachstumsfaktorrezeptoren.
Die Bildung von Blutkapillargefäßen tritt bei einer Anzahl von wichtigen biologischen Prozessen auf, entweder physiologischen, wie der organentwicklung und Wundheilung, oder pathologischen, wie Tumorwachstum. Während die Sequenz der Vorkommnisse, die zur Neovaskularisierung führt, morphologisch charakterisiert worden ist, sind die molekularen Mechanismen, auf Grundlage derer dieser Prozeß auftritt, immer noch schlecht verstanden. Die Kontrolle des Wachstums im Kapillarendothel scheint sehr genau gesteuert zu sein, da diese Zellen normalerweise eine statische Monoschicht bilden, deren Vermehrung im angiogenischen Prozeß ausgelöst wird. Die normale nicht-aktive Natur der Endothelialzellen kann teilweise durch das offensichtliche Fehlen von Endotheilialzell-Wachstumsfaktoren im Plasma erklärt werden. Es werden in der Tat die Hauptendothelialzellmitogene im Plasma nicht gefunden, obwohl sie in Extrakten von beinahe alle untersuchen Geweben, als auch in vielen normalen und in Tumorzellinien vorliegen. Daher kann die lokalisierte Induktion der raschen Endothelialzellvermehrung die Freisetzung von Endothelialzellmitogenen aus den Zellen in Antwort auf Umwelteinflüsse zur Folge haben.
Das am besten charakterisierte Endothelialzellmitogen ist eine Familie von Polypeptidwachstumsfaktoren, einschließlich dem basischen Fibroblastwachstumsfaktor (bFGF), ebenfalls bekannt als Heparin-Bindungswachstumsfaktoren aufgrund ihrer hohen Affinität für Heparin. Basischer FGF wurde aus den meisten Mesoderm- oder Neuroektoderm-abgeleiteten Geweben oder Zellen gereinigt. Strukturuntersuchungen haben gezeigt, daß bFGF ein Einzelkettenpolypeptid aus 146 Aminosäuren ist, das auch in NHs&sub2;-terminal verkürzten Formen vorliegen kann, dem die ersten 10 bis 20 Aminosäuren fehlen. Die verkürzten Formen von bFGF sind so potent wie natives bFGF, wie durch Radiorezeptorbindung und biologischen Tests gezeigt wurde. Zusätzlich haben Änderungen in den Reinigungsvorschriften, nämlich Substitution der neutralen für saure Extraktion aus homogenisiertem Gewebe und Einschluß von Proteaseinhibitoren, zu einer längeren 154-Resteform geführt. Die beobachtete Mikroheterogenität von FGFs scheint wenigstens teilweise auf eine teilweise Proteolyse in der Nähe der Aminotermini zurückzuführen zu sein, die entweder in vivo oder während der Reinigung auftritt. Da jedoch verschiedene Formen gleichermaßen aktiv zu sein scheinen, ist die Mikroheterogenität wahrscheinlich physiologisch irrelevant.
Basischer FGF scheint sich über die Evolution äußerst gut konserviert zu haben. Z. B. unterscheiden sich Rinder- und humaner bFGF nur in zwei ihrer 146 Aminosäuren, was eine Gesamtaminosäuresequenzhomologie von 98,7 % ergibt. Verwandt mit bFGF ist saurer FGF (aFGF), welcher eine 55%ige Gesamtsequenzhomologie mit bFGF zeigt. Saurer FGF ist ein 140-Aminosäurepolypeptid, das auch in NH&sub2;-terminal verkürzter Form vorliegen kann, dem die ersten 6 Aminosäuren fehlen. Wie man aufgrund ihres hohen Homologiegrades erwartet, scheinen sowohl basischer als auch saurer FGF mit den gleichen Zelloberflächenrezeptoren in Wechselwirkung zu treten. Dies erklärt ihren gemeinsamen Bereich an Zielzellen und das Spektrum der biologischen Aktivität.
In jüngster Zeit haben Lee et al (Science, 245, 57-60, 1989) die Reinigung eines neuen Membranproteins aus Hühnerembryos beschrieben, das zur spezifischen Bindung an basischen FGF in der Lage ist. Auf Grundlage seiner biochemischen Eigenschaften und auf Grundlage der Homologie mit anderen bekannten Rezeptoren nimmt man an, daß dieses neue Protein ein basischer FGF-Rezeptor ist. Im gleichen Artikel beschreiben die Autoren die Isolierung eines Gesamtlängen- Hühnchen-cDNA-Klons, das das beschriebene Protein kodiert. Die Nukleotidsequenz dieses Klons wurde jedoch nicht offenbart.
Lee et al stellten fest, daß der Huhn-bFGF-Rezeptor eine bemerkenswerte Aminosäureähnlichkeit mit der zuvor identifizierten humanen Polypeptidsequenz aufweist, die das Produkt des flg-Gens ist (Ruta et al., Oncogene, 3, 9-15, 1988). Ähnlich wie der Huhn-bFGF-Rezeptor scheint das flg- Molekül eine Tyrosinkinase zu sein, zeigt eine typische hydrophobe Transmembranregion, und es ist daher wahrscheinlich, daß die beschriebene Humansequenz ein Teil des humanen bFGF-Rezeptors ist.
Die Aminosäuresequenz des flg-Moleküls wurde von Ruta et al durch Translation eines offenen Leserahmens eines partiellen CDNA-Klons abgeleitet. Die flg-CDNA-Sequenz nach Ruta et al. wurde erhalten durch niedrig-stringentes Screenen einer humanen Endothelialzell-CDNA-Bank unter Verwendung eines DNA- Fragments als Sonde, das für ein Tyrosinkinaseonkogen kodiert. Trotzdem ist der flg-CDNA-Klon, wie er bis heute beschrieben vorliegt, nur teilweise, und es fehlt ihm die Nukleotidsequenz, die für den extrazellulären Anteil des humanen bFGF-Rezeptors kodiert.
WO 91/00916, die vor Anmeldung der vorliegenden Anmeldung noch nicht publiziert war, welche jedoch eine frühere priorität beansprucht als die vorliegende Anmeldung, offenbart die CDNA und Aminosäuresequenzen eines humanen FGF- Rezeptors, welche von dem Rezeptor verschieden ist, welcher den Gegenstand der vorliegenden Anmeldung bindet.
Zusammenfassend ist festzustellen, daß die vor der vorliegenden Erfindung publizierten einzigen Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen solche waren, die dem vollständigen Huhn- bFGF-Rezeptor und einem Teil des humanen basischen FGF- Rezeptors entsprachen. Die komplette extrazelluläre Aminosäuresequenz des humanen bFGF-Rezeptors, welcher für die spezifische Verbindung von humanen basischen und sauren FGFs verantwortlich ist, war nicht publiziert.
Wir haben nun einen humanen bFGF-Rezeptor kloniert und haben seinen extrazellulären Anteil identifiziert. Der extrazelluläre Anteil kann als Antagonist für bFGF oder aFGF verwendet werden. Die Erfindung stellt demnach ein Polypeptid zur Verfügung, das zur spezifischen Bindung von humanem basischem Fibroblastwachstumsfaktor (bFGF) und humanem sauren Fibroblastwachstumsfaktor (aFGF) in der Lage ist, und das aufweist:
(a) die in Fig. 3 unterstrichene Sequenz, oder
(b) die Sequenz (a), welche mit einer Aminosäureverlängerungssequenz von einem oder beiden Enden modifiziert wurde.
Die Erfindung stellt auch ein DNA-Molekül zur Verfügung, das ein Polypeptid der Erfindung kodiert. Das DNA-Molekül kann die Sequenz von Nukleotid 64 bis Nukleotid 1128, wie in Fig. 2 gezeigt, haben.
Die Erfindung stellt ferner einen Vektor zur Verfügung, der ein DNA-Molekül gemäß der Erfindung umfaßt, und der bei Bereitstellung in einem transformierten Wirt, zur Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids, das durch das DNA-Molekül kodiert wird, in der Lage ist. Ein mit einem solchen Vektor transformierter Wirt bildet auch einen Teil der Erfindung.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird hergestellt durch ein Verfahren, welches die Kultur eines transformierten Wirts gemäß der Erfindung unter solchen Bedingungen umfaßt, daß das Polypeptid exprimiert wird. Das Polypeptid kann dann isoliert werden. Das Polypeptid kann in biologisch reiner Form gewonnen werden.
In den anliegenden Zeichnungen bedeutet:
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Klone PL5 und PL10;
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz des bFGF- Rezeptormoleküls; und
Fig. 3 zeigt die Aminosäuresequenz des bFGF-Rezeptors. Das vermutliche Leader-Peptid ist in Kursiv-Buchstaben angegeben. Der zuvor unbekannte extrazelluläre Anteil ist unterstrichen. Der Arginin-(R)-Rest, von dem man annimmt, daß er die erste Aminosäure des reifen Moleküls ist, ist in Fett-Buchstaben angegeben.
Fig. 4 zeigt die beiden Intermediatkonstrukte (Plasmide L23 und pFC42) als auch die beiden
Endexpressionsplasmide (pC138 und pFC164), die die Sequenz tragen, welche für die extrazelluläre Form des FGF-Rezeptors kodiert. Für Einzelheiten siehe folgendes Beispiel 2.
Polypeptide gemäß der Erfindung haben die in Fig. 3 unterstrichene Sequenz von Aminosäure 22 bis Aminosäure 376. Dies ist die Sequenz des extrazellulären Anteils des bFGF- Rezeptors ohne die vermutliche Leader-Sequenz.
Die in Fig. 3 unterstrichene Sequenz kann durch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen und/oder -insertionen modifiziert sein. Ein aus einer solchen modifizierten Sequenz aufgebautes Polypeptid muß natürlich noch zur Bindung von humanem bFGF und aFGF in der Lage sein. Für einen geeigneten Rezeptorbindungstest siehe Dower et al, J. Immunol. 42, 4314- 4320, 1989. Wenn die in Fig. 3 gezeigte unterstrichene Sequenz modifiziert ist, besteht ein Grad von Homologie von 55 % oder mehr zwischen der modifizierten Sequenz und der nicht-modifizierten Sequenz. Der Homologiegrad kann 95 % oder mehr sein.
Z. B. können eine oder mehrere Aminosäurereste aus der in Fig. 3 unterstrichenen Sequenz substituiert oder ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste können eingefügt sein, mit der Maßgabe, daß der physikochemische Charakter der Originalsequenz erhalten bleibt, d. h. hinsichtlich der Ladungsdichte, Hydrophobizität/Hydrohilizität, Größe und Konfiguration. Mögliche Substitutionen sind, beruhend auf dem Ein-Buchstaben-Code (Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984):
A für G und umgekehrt
V durch A, L oder G;
K durch R;
S durch T und umgekehrt;
E für D und umgekehrt; und
Q durch n und umgekehrt.
Soweit Verlängerungen betroffen sind, kann eine kurze Sequenz von bis zu 50 Aminosäureresten an einem oder beiden terminalen Enden vorgesehen sein. Die Sequenz kann bis zu 30, z. B. bis zu 20 oder bis zu 10 Aminosäurereste haben. Alternativ kann eine viel längere Verlängerung vorliegen. Längere Aminosäuresequenzen können an einem oder beiden Enden fusioniert sein. Ein chimäres Protein kann daher bereitgestellt werden, indem eine oder beide Verlängerungen eine heterologe Aminosäuresequenz ist, d. h. eine Sequenz die nicht natürlicherweise an die von Fig. 3 abgeleitete Sequenz geknüpft ist. Ein solches chimäres Protein kann daher die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an bFGF und aFGF mit einer weiteren Funktionalität kombinieren.
Die Polypeptide werden hergestellt durch rekombinante DNA- Technologie. Die Herstellung der Polypeptide hängt daher ab von der Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die für das Polypeptid kodiert. DNA mit der in Fig. 2 gezeigten Sequenz kann erhalten werden durch Sondenuntersuchung einer humanen Plazenta-CDNA-Bank, z. B. einer λgt11-Bank. Eine solche Bank ist erhältlich von Clontech. Geeignete Sonden sind:
ATAACGGACCTTGTAGCCTCCAATTCTGTG, GGGTCTCTGTGAGGGCACTGCATGCCAGCA und ACGGCCTAGCGGTGCAGAGTGTGGCTGTGA.
Eine kürze Sequenz als die in Fig. 2 gezeigt kann erhalten unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen und/oder Exonukleasen. Eine DNA-Sequenz von Nukleotid 64 bis Nukleotid 1128 kann zur Verfügung gestellt werden. Modifizierte Sequenzen können erhalten werden durch die Verwendung irgendeiner geeigneten Technik, einschließlich Restriktion mit einer Endonuklease, Insertion von Linker, Verwendung einer Exonuklease und/oder eine Polymerase und ortsgerichteter Mutagenese. Ob eine verkürzte und/oder modifizierte DNA-Sequenz ein Polypeptid der Erfindung kodiert, kann leicht sichergestellt werden. Das durch die Sequenz kodierte Polypeptid kann in einem geeigneten Wirt exprimiert werden und wird auf seine Fähigkeit zur spezifischen Bindung von bFGF und aFGF getestet werden.
- Für die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids wird ein Expressionsvektor konstruiert. Ein Expressionsvektor wird hergestellt, welcher eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid gemäß der Erfindung kodiert umfaßt, und der zur Expression des Polypeptids in der Lage ist, wenn er in einem geeigneten Wirt vorliegt. Es werden geeignete transkriptionale und translationale Kontrollelemente vorgesehen, einschließlich einem Promotor für die DNA-Sequenz, einer transkriptionalen Terminationsstelle und translationalen Start- und Stop- Kodons. Die DNA-Sequenz wird im richtigen Rahmen bereitgestellt, um so die Expression des Polypeptids in einem Wirt zu ermöglichen, der mit dem Vektor kompatibel ist.
Der Expressionsvektor wird dann in einem geeigneten Wirt zur Verfügung gestellt. Zellen, die den Vektor enthalten, läßt man wachsen, um das Auftreten der Expression zu ermglichen. Der Vektor kann ein Plasmid oder ein viraler Vektor sein. Jedes geeignete Wirt-Vektorsystem kann verwendet werden.
Der transformierte Wirt kann ein prokaryontischer oder eukaryontischer Wirt sen. Es kann ein Bakterien- oder Hefewirt verwendet werden, z. B. E. coli oder S. cerevisiae. Insektenzellen können alternativ verwendet werden, wobei in diesem Fall ein Baculovirus-Expressionssystem geeignet sein kann. Als weitere Alternative können Zellen von einer Säugerzellinie, wie chinesischen Hamster-Ei-Zellen (CHO), transformiert werden.
Das Polypeptid der Erfindung kann isoliert und gereinigt werden. Das Polypeptid kann als humaner bFGF- oder ein aFGF- Antagonist eingesetzt werden. Es kann bFGF in vivo sequestrieren, wodurch die biologische Aktivität von bFGF gehemmt wird, und so als ein Inhibitor von bFGF-Aktivitäten wirken. Antagonisten von bFGF- und aFGF-Aktivitäten könnten klinische Anwendungen in mehreren pathologischen Zuständen haben, die mit der abnormalen Angiogenese verbunden sind, wie Diabetes, Retinopathy, neovaskulärem Glaucom, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, Artheriosklerosie und Contraceptiva. Ferner legt die Beobachtung, daß bestimmte feste Tumore die Neovaskularisierung zum Wachstum brauchen, nahe, daß GF- Antagonisten therapeutisch zur Entwicklung dieser Krankheiten entwickelt werden könnten.
Zu diesem Zweck kann das erfindungsgemäße Polypeptid chemisch an ein weiteres Material unter Bereitstellung eines Konjugats gekoppelt werden. Das andere Material kann ein Trägermolekül sein oder ein Molekül mit einer weiteren biologischen Funktion. Das Polypeptid der Erfindung kann ebenfalls in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfaßt ebenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann aus Polypeptid gemäß der Erfindung in Form eines Konjugats enthalten.
Das Polypeptid der Erfindung kann den Patienten nach jeden bequemen Verabreichungsweg verabreicht werden. Die Wahl des oralen Verabreichungswegs oder des parenteralen Verabreichungswegs, wie subkutan, intravenös oder intramuskulär wird angepaßt; die Dosis und die Häufigkeit der Verabreichung hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab. Diese Faktoren umfassen die Indikation der Verabreichung, das Alter und Gewicht des zu behandelnden Patienten und den Zustand des Patienten. Typischerweise wird das Polypeptid in einer Menge von 1 bis 1000 µg pro Dosis verabreicht, besonders bevorzugt von 10 bis 100 µg pro Dosis für jeden Verabreichungsweg.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

BEISPIEL 1

Ein cDNA-Klon, der für den basischen FGF-Rezeptor kodiert, wurde durch Screenen einer humanen Plazenta-λgt11-cDNA-Bank isoliert. Diese Bank ist handelsüblich erhältlich von Clontech.
Ein Teil-cDNA-Klon, von dem man annahm, daß er einen Teil des humanen bFGF-Rezeptors kodierte, war bereits in der Literatur publiziert (Ruta et al., 1988). Nach diesem Artikel entwickelten wir zwei Nukleotidsonden mit den folgenden Sequenzen:
5' ATAACGGACCTTGTAGCCTCCAATTCTGTG 3' (bezeichnet OAB965) und 5' GGGTCTCTGTGAGGGCACTGCATGCCAGCA 3' (bezeichnet OAB984)
Das erste Screenen erfolgte unter Verwendung von nur der Sonde 0A8965. Das Oligonukleotid wurde unter Verwendung von (γ³²P)ATP mit Kinase behandelt und auf einer Nensorb-(Nen)- Säule gereinigt. Nach der Bestimmung des CDNA-Bank-Titers (2 x 10&sub9; pfu/ml) wurden geeignete Verdünnungen hergestellt und unter Verwendung des E. coli-Stamms Y1090 plattiert. 0,05 ml einer Übernachtkultur von Y1090 wurden mit 0,1 ml sterilem lambda-Verdünnungsmittel (10 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 0, mM EDTA) der 4 x 10&supmin;³-Verdunnung der Bank enthielt, vermischt, und bei 37ºC für 15 Minuten zur Durchführung der Phagenabsorption inkubiert. Das Plattieren erfolgte auf 20 Petri-Schalen mit LB, das Ampicillin 100 µg/ml enthielt.
Nach dem publizierten Verfahren (Maniatis et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1982) wurden 10&sup6; Plaques auf Nitrozellulosefilter überführt und unter niedrig-stringenten Bedingungen (5X SSC, 0,1 % SDS, 5X Denhardt-Lösung, 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA) über Nacht bei 65ºC hybridisiert. Die markierte Probe wurde zu 10&sup6; cmp/ml zugegeben. Es erfolgten Waschvorgänge bei 65ºC in 6X SSC, 0,1 % SDS und in 3X SSC 0,1 % SDS. Drei positive Klone, bezeichnet als PL3, PL10 und PL16, wurden nach übernacht-Exposition mit Emersham-Hyperfilm -MP nachgewiesen. Diese Positivsignale wurden in einem separaten Screening unter Verwendung der gleichen Probe bestätigt
Ein zweites Screenen erfolgte auf PL3, PL10 und PL16 auf Doppelfilter unter Verwendung der beiden Sonden OAB965 und OAB984. Interessanterweise wurden diese Klone von beiden Sonden erkannt.
Die drei Klone wurden Plaque-gereinigt und weiter analysiert. Phagen-DNA von PL3, PL10 und PL16 wurden unter Verwendung von Lambdasorb-Phagenadsorbens (Promega) gereinigt und mit EcoRI verdaut. Aus den verschiedenen Verdaus wählten wir zwei Inserts von 2,8 kb und 0,6 kb aus PL10 aus und subkionierten sie in M13mp19.
Nukleotidsequenzanalyse erfolgte durch geprimte DNA-Synthese auf einzelsträngigen DNA-Matrizen in Gegenwart von Dideoxynukleosidtriphosphaten (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977) unter Verwendung von Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Beide Stränge der Subklone wurden unter Verwendung entweder universaler oder spezifischer Primer-Oligonukleotide, auf1 Grundlage der erzeugten Sequenz, sequenziert.
Ein einzelner offener Leserahmen für 817 Aminosäuren mit einem Terminationskodon konnte nachgewiesen werden. Die ersten 196 Aminosäuren des reifen bFGF-Rezeptors werden durch das Insert von 0,6 kb kodifiziert. Die Endsequenz dieses Fragments enthält eine EcoRI-Schnittstelle, so daß die 626 Aminosäuren des COOH-Terminus durch das 2,8 kb-Insert modifiziert werden, worauf eine 3'-End-untranslatierte Region folgt, wie schematisch in Fig. 1 erläutert.
Der Huhn-Rezeptor für bFGF, wie er für Lee et al (1989) beschrieben wurde, ist ein Protein von 819 Aminosäuren einschließlich einer Leader-Peptid aus 21 Aminosäuren, gefolgt von einem reifen Protein von 798 Aminosäuren. Durch Homologie mit dieser Sequenz enthielt unser Klon das komplette bFGF-Rezeptormolekül, dem 16 Aminosäuren des Leader-Peptids vorangingen. Um die restlichen 5 Aminosäuren des Leader-Peptids herauszufinden, einschließlich dem Startmethionin, synthetisierten wir eine neue Oligonukleotidsonde mit der folgenden Sequenz, die vom 0,6 kb-Insert vom PL10 abgeleitet war:
5' ACGGCCTAGCGGTGCAGAGTGTGGCTGTGA 3' (bezeichnet OAB1088)
Das Screenen der Bank mit dieser Sonde selektierten wir einen neuen Klon mit der Bezeichnung PL5, der das 0,7 kb EcoRI Fragment enthielt. Dieses Fragment wurde sequenziert und man fand, daß es die 0,6 kb-Sequenz aus PL10 enthielt, wobei es weiter am 5'-Ende verlängert war. Das bedeutet genau, daß die 0,7 kb-Sequenz aus PL5 für die 196 Aminosäuren der NH&sub2;- terminalen Sequenz, die ebenfalls in PL10 gefunden werden, kodiert, der 21 Aminosäuren des Leader-Peptids, beginnend mit Methionin, vorausgehen. Eine schematische Darstellung der Klone PL5 und PL10 ist in Fig. 1 wiedergegeben.
Die gesamte Länge der DNA-Sequenz für einen bFGF-Rezeptor, wie aus den beiden überlappenden Klonen PLS und PL10 erhalten, ist in Fig. 2 wiedergegeben. Die entsprechende Aminosäuresequenz ist in Fig. 3 wiedergegeben. In dieser Sequenz ist das vermutliche Leader-Peptid aus 21 Aminosäuren in kursiv dargestellt. Der Arginin-(R)-Rest, von dem man annimmt, daß er die erste Aminosäure des reifen Moleküls ist, ist in fett wiedergegeben. Der zuvor unbekannte extrazelluläre Anteil ist unterstrichen.
Der Klon mit der gesamten Länge und der extrazellulären Domäne wurden sowohl in Säuger- als auch in Bakterienzellen exprimiert. Vernetzungsexperimente mit markierten basischen und sauren FGFs haben gezeigt, daß der komplette rekombinante Rezeptor und der extrazelluläre Anteil in der Tat in der Lage sind, spezifisch basischen und sauren FGF zu binden.

BEISPIEL 2

Für den Erhalt der Expression des extrazellulären Anteils des humanen FGF-Rezeptors in E. coli wurde in Vektor konstruiert unter Verwendung des Tryptophanpromotors aus E. coli als Regulationssignale und der Ribosom-Bindungsstellenregion des lambda-CII-Proteins (Hendrix R. W., Roberts J. W., Stahl F. W. und Weisberg R. A.: Lambda II Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y. 1983).
Das 5'-Ende der Rezeptorsequenz wurde synthetisch unter Klonierung in de Expressionsvektor rekonstruiert. Für diesen Zweck wurde ein Hindii-Psti-synthetisches DNA-Fragment, das für die CII-Ribosombindungsstelle gefolgt von dem ATG-Kodon und den ersten 95 Nukleotiden der reifen Rezeptorsequenz (Fig. 2: Nukleotide 61 bis 155) unter Verwendung komplementärer Oligonukleotide synthetisiert. Die gesamte Sequenz eines solchen synthetischen Fragmentes ist:
5' AGCTTGGGCATACATTCAATCAATTGTTATCTAAGGAAATACTTACATATGGCTAGGCCGT CCCCGACCTTGCCTGAACAAGCCCAGCCCTGGGGAGCCCCTGTGGAAGTGGAGTCCTTCCT GGTCCACCCCGGTGACCTGCTGCA 3'
-Dieses HindIII-PstI-Fragment wurde in M13mp18, der zuvor mit HindIII und EcoRI geschnitten worden war, zusammen mit einem PstI-EcoRI-Fragment aus PLS, welches die Rezeptorsequenz entsprechend den Nukleotiden 156 bis 586 aus Fig. 2 enthielt, subkloniert. Das erhaltene Plasmid L23 trägt die CII- Ribosombindungsstelle, gefolgt von den Nukleotiden 61 bis 586 der Rezeptorsequenz (siehe Fig. 4), entsprechend den ersten 175 Aminosäuren des reifen Proteins. Zum Erhalt des gesamten extrazellulären Anteils des FGF-Rezeptors wurde ein EcoRI- BamHI-Fragment durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf PL10 wiedergewonnen. Die Reaktion erfolgte in einem Perkin-Elmer- DNA-Thermocyclisator unter Verwendung von Perkin-Elmer- Amplitaq-DNA-Polymerase und den folgenden Zyklen: 2 Minuten 30 Sekunden bei 94ºC, 30 Zyklen aus einem ersten Schritt von 1 Minute 30 Sekunden bei 94 C und einem zweiten Schritt von 2 Minuten 30 Sekunden bei 72ºC und einem Endzyklus von 7 Minuten bei 72ºC. Die für die Reaktion verwendeten Primer, bezeichnet OAG1192 und OAG1195 waren die folgenden:
OAB1192: 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'
OAB119: 5' ATGAGGATCCTCACTCCAGGTACAGGGGCGAGGTCA 3'
Das amplifizierte Produkt wurde mit EcoRI und BamHI unter Erhalt eines Fragments von 546 bp, entsprechend in Fig. 2 den Nukleotiden 587 bis 1128 der reifen Rezeptorsequenz, verdaut.
Das Expressionsplasmid für das reife extrazelluläre Rezeptorprotein, bezeichnet als pFC138, wurde durch Verbinden der folgenden drei Fragmente konstruiert:
1) Das HindIII-EcoRI-Fragment aus L23.
2) Das EcoRI-BamHI-Fragment aus PL10.
3) Das Hind-III-BamHI große Fragment aus Plasmid pFC42, das zuvor in unserem Laboratorium erhalten wurde (Isacchi A., Samientos P., Lorenzetti R. und Soria M.: Mature apolipoprotein AI und ist precursor proApo AI: influence of the sequence at the 5' end of the gene on the efficiency of expression in Escherichia coli. Gene 81, S. 129-137, 1989), das den Tryptophanpromotor und das β- Laktamasegen für Ampicillinresistenz enthielt.
Ein E. coli B-Stamm (Delbruck M.: Bacterial viruses or bacteriophages. Biol. Rev. 21, S. 30-40, 1946) wurde zur Expression des reifen extrazellulären FGF-Rezeptorproteins verwendet.
Induktion und Analyse der Proteinexpression erfolgten wie beschrieben (Isacchi A. et al.).
Das Protein wurde in einem Western-Blot durch Kaninchen-anti- human-FGF-Rezeptor-polyklonale Antikörper (Promega) nachgewiesen.
Alternativ konnte die rekombinante extrazelluläre Domäne als Fusionsprotein synthetisiert werden, worin zusätzliche Aminosäuren entweder am NH&sub2;-Ende oder am COOH-Ende der reifen extrazellulären Region vorliegen.
Dieser Weg wird z. Z. zur Verbesserung der intrazellulären Proteinstabilität, Ausbeute, Nachweis und Isolierung verwendet.
Sowohl die Patent- als auch die wissenschaftliche Literatur berichten viele Beispiele verschiedener Expressionssysteme, die auf Fusionsproteinen beruhen [siehe z. B. internationale Patentanmeldung PCT/W084 /00380; europäische Patentanmeldung EP 243333; Harris T.J.R., 1983, Expression of eukariontic genes in E. coli, S. 127-185. In Williamson R. (Ed.), Genetic Engineering, Bd. 4, Academic Press, London; Hellebust M. et al., 1989, Biotechnology, Bd. 7, S. 167-168].
Wir haben ein neues Plasmid mit der Bezeichnung PFC 164, wie in Fig. 4 gezeigt, konstruiert, worin die Aminosäuren 9 bis 23 bei E. coli-β-Galaktosidase stromaufwärts dem reifen extrazellulären Domäne des FGF-Rezeptors eingebaut sind. Plasmid PFC 164 wurde in ähnlicher Weise wie PFC 138 konstruiert und liefert bei Einbau in den E. coli-Wirtsstamm B höhere Expressionsspiegel an extrazellulärer Domäne des FGF-Rezeptors. Die β-Galaktosidaseeinheit ist ebenfalls für eine erhöhte intrazelluläre Stabilität des Fusionsproteins verantwortlich.
Plasmide pFC 138 und pFC 164 sind daher Gegenstände der Erfindung.

Claims

1. Polypetid, das zur spezifischen Bindung von humanem basischen Fibroblastwachstumsfaktor (bFGF) und humanem sauren Fibroblastwachstumsfaktor (aFGF) in der Lage ist, und welches aufweist:

(a) die in Fig. 3 unterstrichene Sequenz, oder

(b) die Sequenz (a), welche durch eine Aminosäure- Verlängerungssequenz an einem oder beiden Enden modifiziert wurde.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Aminosäure- Verlängerungssequenz eine heterologe Aminosäuresequenz ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, worin die Aminosäure- Verlängerungssequenz bis zu 50 Aminosäurereste aufweist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3, das dahingehend modifiziert ist, daß die in Fig. 3 unterstrichene Sequenz eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen und/oder -insertionen aufweist und worin die modifizierte Sequenz einen Homologiegrad von 85 % oder mehr mit der in Fig. 3 unterstrichenen Sequenz hat.

5. Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3, das dahingehend modifiziert ist, daß die in Fig. 3 unterstrichene Sequenz eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen und/oder -insertionen aufweist und worin die modifizierte Sequenz einen Homologiegrad von 95 % oder mehr mit der in Fig. 3 unterstrichenen Sequenz aufweist.

6. DNA-Molekül, welches ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, kodiert.

7. DNA-Molekül, welches die Sequenz von Nukleotid 64 bis Nukleotid 1128, wie in Fig. 2 gezeigt, hat.

8. Vektor, welcher ein DNA-Molekül wie in Anspruch 6 oder 7 umfaßt, und welcher bei Bereitstellung in einem geeigneten Wirt zur Expression des Polypeptids in der Lage ist.

9. Vektor nach Anspruch 8, welcher ein Plasmid ist.

10. Plasmid pFC 138 wie in Fig. 4 gezeigt.

11. Plasmid pFC 164 wie in Fig. 4 gezeigt.

12. Wirt, transformiert mit einem Vektor oder einem Plasmid nach einem der Ansprüche 8 bis 11.

13. Wirt nach Anspruch 12, welcher eine Säugerzellinie ist.

14. Wirt nach Anspruch 12, welcher ein Bakterium ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren die Kultur eines transformierten Wirts nach einem der Ansprüche 12 bis 14 unter solchen Bedingungen umfaßt, daß das Polypeptid exprimiert wird.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner und, als Wirkprinzip ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

17. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung als Antagonist für humanen bFGF oder humanen aFGF.