JPH07507926A - サポリン含有タンパク質の組換え産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

サポリン含有タンパク質の組換え産生 本出願は、Ｄｏｕｇｌａｓ　Ａ　Ｌａｐｐｉ、ｌ５ａｂｅｌ　Ｂａｒｔｈｅｌｅ ｍｙ及びＡｎｄｒｅｗ　Ｊ、Ｂａ１ｒｄにより１９９２年６月１６日に出願され た米国特許出願第０７／９０１，７１８号、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｒｏ ｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　５ａｐｏｒｉｎ−Ｃ。 ｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ″の一部継続出願である。米国特許出願第 ０７／９０１．７１８号の開示は総て本明細書に参考として包含される。 発明の分野 本発明は、タンパク質の組換え産生、より具体的にはサボリン及びサポリン含有 融合タンパク質の組換え産生に関リポソーム不活性化タンパク質（ｒ　ｉ　ｂｏ 　ｓ　ｏｍｅ　−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ＝ＲＩＰ）は、真 核生物リポソームを触媒的に不活性化する植物タンパク質である。ＲＩＰは、タ ンパク質合成のタンパク質伸長ステップを妨害することによってリポソームを不 活性化することが判明した。例えば、ＲＩＰサポリン（ＳＡＰ）は、ラット２８ ＳリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）中の位置４３２４のアデニンのｎ−グリコシ ド結合の開裂によって、６０Ｓリポソームを不活性化することが判明した。Ａ４ ３１４がｒＲＮＡ中に配置されているこの特定領域は、原核生物及び真核生物の 間で高度に保存されている。２ａＳ　ｒＲＮＡ中のＡ４３２４は、大腸菌（Ｅ、 ｃｏ　１１）２３Ｓ　ｒＲＮＡ中のＡ２ａａＯに対応する。幾つかのＲＩＰは、 大腸菌のような原核生物のタンパク質合成も妨害すると思われる。ＲＩＰは真核 細胞に対して毒性であり且つ一部のＲＩＰは原核生物に対して毒性あるため（例 えば、Ｈａｂｕｋａら（１９９０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：１０９ ８８−１０９９２参照）、ＲＩＰを組換えＤＮＡ技術で発現することは難しい。 幾つかの構造的に関連したＲＩＰが、植物５ａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎ ａｌｉｓ（シャボンソウ）の種子及び葉から単離された。これらのうち、サボリ ン−６は最も活性で最も豊富に存在し、種子タンパク質全体の７％を占める。サ ポリンは極めて安定であり、等電点が高く、炭水化物を含まず、ＳＤＳのような 変性剤及び種々のプロテアーゼに対して耐性を示す。種子に由来する幾つかのサ ポリン−６アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）のアミノ酸配列は既知であり、数 個のアミノ酸残基が異なる複数のサボリンＲＩＰ類が存在すると思われる。 サボリンはＩ型ＲＩＰであるため、毒素リジン及びアブリンのように細胞結合鎖 をもたない。従って、全細胞に対する毒性はこれらの毒素よりはるかに低い。し かしながら、細胞にターゲツティングされて該細胞によりインターナリゼーショ ンされると、その細胞毒性はりシンＡ鎖の１００〜１０００倍強（なる。サボリ ンは、その細胞毒性のために、細胞表面結合リガンドに共有結合して細胞毒性化 学結合体を製造するのに使用され、又は抗体に結合して、特定細胞にターゲツテ ィングされ且つインターナリゼーションされるイムノトキシンを製造するのに使 用された（例えば、。例えば塩基性線維芽細胞（ｂＦＧＦ）が、マイトキシンＦ ＧＦ−ＳＡＰを製造するためにサポリン−６に化学的に結合された（例えば、Ｌ ａｐｐｉらの米国特許第５．１９１．０６７号、及びＬａｐｐｉら（１９８９） Ｂｉｏｃｈ再発狭窄症（ｒｅｓ　ｔ　１ｎｏｓ　ｉ　ｓ）の治療に使用された（ 例えば、米国特許出願第０７／６３７，０７４号に基づく国際特許出願節Ｗ０　 ９２／１１８７２号参照）。治療は、例えばバルーンカテーテルを用いる血管形 成に次いで、治療有効量のＦＧＦ結合体を局部投与又は静脈内投与することによ って実施する。ＦＧＦ−サポリン結合体は、特定の腫瘍の治療剤として有望であ ることも判明した。黒色腫の増殖、及びＦＧＦと結合する受容体を発現する他の 腫瘍の増殖は、ＦＧＦ−８ＡＰによって阻止することができる（例えば、米国特 許出願第０７１５８５．３１９号に基づく国際特許出願節Ｗ０　９２１０４９１ ８号、及びＢｅ１ｔｚら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５２　 ：　２２７−２３０参照）。 抗ヒト免疫グロブリンＨ鎖モノクローナル抗体がサボリン−６に結合された。得 られたイムノトキシンは、再移植に先立つｅｘ　ｖｉｖｏ処理の間に、ヒト骨髄 からリンパ腫及び白血病細胞を除去するために潜在的に有用である。 サボリンと、あるパネルの抗Ｔリンパ球モノクローナル抗体との化学的結合体は 、移植の前にヒト骨髄を浄化するためのｅｘ　ｖｉｖｏ物質として、また移植片 対宿主病並びにＴ細胞及びＢ細胞白血病の患者の全身性治療剤として有望視され た。 細胞結合リガンド及び抗体へのサボリンの結合はこれまで化学的に行われてきた 。しかしながら、化学的結合は分子の不均質集団を発生させる。例えば、ｂＦＧ Ｆをシスティン残基を介してサポリンに結合する。該サポリンは、まずＮ−スク シンイミジル−３（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）で誘導体 化する。塩基性ＦＧＦは、５ＰＤＰ誘導体化サポリンとの反応に使用できるシス ティンを少なくとも二つ有する。従って、ｂＦＧＦと５ＰＤＰ誘導体ＳＡＰとの 反応では、生物学的に関連した特性がおそらく異なり、ｉｎ　ｖｉｖｏ適用には 理想的であり得ない一連の分子が形成される。 サボリン含有融合タンパク質は多（の潜在的用途を有するため、サポリン含有タ ンパク質の均質調製物を直接製造できる効率的な組換え方法があれば、極めて有 用であろう。 サボリンは大腸菌及び真核生物に対して毒性を示すため、生物学的に活性なサボ リンの組換え体産生はこれまで解明されなかった。サポリン６をコードするＤＮ Ａがクローニングされ、切頭体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆｏｒｍ）をコードする ＤＮＡが大腸菌内で発現された（ＦＡＲＭＩＴＡＬＩＡの英国特許出願ＧＢ２２ １６８９１Ａ）。しかしながら、得られたタンパク質は細胞毒性ではない。サボ リン及びＦＧＦが切頭された組換えｂＦＧＦ−サボリン融合タンパク質をコード するＤＮＡが製造された（Ｐｒｉｅｔ。 ら（１９９１）Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、５３８　：　４３４−４３ ７参照）。しかしながら、得られた融合タンパク質はその後細胞毒性ではないこ とが判明した。 そこで本発明は、融合タンパク質を含む細胞毒性サポリン含有タンパク質を真核 細胞内で産生ずるための効果的な組換えＤＮＡ方法を提供することを目的とする 。本発明は、組換えＤＮＡ方法によって産生したｂＦＧＦ−８ＡＰ結合体の提供 も目的とする。 発明の概要 サボリン含有タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を提供する。該ＤＮＡはサボ リン含有タンパク質をコードする。 サポリン含有タンパク質は、サボリンタンパク質のアミノ末端に結合したＮ末端 延長領域からなる。サポリンポリペプチドは、少なくとも、選択したアッセイで サポリンが細胞毒性又はタンパク質合成阻止機能を示すようにするために必要な 量のサボリンタンパク質を含む。サポリンをコードするＤＮＡ及びＮ末端延長領 域をコードするＤＮＡは、サボリン含有タンパク質が、選択した細胞によるイン ターナリゼーションの際に細胞毒性を示すように選択する。 Ｎ末端延長領域は、形成されるサボリン含有タンパク質を、宿主に対して、選択 した宿主内でのサボリン含有ペプチドの翻訳を含む組換え発現を可能にするのに 十分なほど非細胞毒性にすると思われる。ある具体例では、Ｎ末端延長領域は約 ２〜１５、好ましくは５〜１２アミノ酸である。 Ｎ末端延長領域の配列は、天然サボリンボリペプチドシグナル配列の配列と同じ であり得る。 別の具体例では、Ｎ末端延長領域は、標的細胞の表面のタンパク質と特異的に作 用し合う、細胞表面結合タンパク質又は抗体のようなリガンドである。該リガン ドをコードするＤＮＡは、サポリンボリペプチドのＮ末端をコードするＤＮＡに 結合するか、又は、結合ペプチドもしくはアミノ酸をコードする一つ、好ましく は二つ、もしくはそれ以上のコドンを介して結合する。結合コドンの数は、得ら れるＤＮＡが、選択した細胞に対して細胞毒性である融合タンパク質をコードす るように選択する。 リガンドとサボリンとの結合体は、組換えＤＮＡ技術を用いてキメラとして製造 する。融合タンパク質分子は、該複合体のリガンド部分の受容体結合ドメインが 、それぞれの細胞表面受容体の認識に使用され、融合タンパク質をそれぞれの細 胞表面受容体を含む細胞にターゲツティングできるように設計し製造する。好ま しい具体例では、リガンドが塩基性ＦＧＦ、又は高親和性ＦＧＦ受容体と反応す る別のＦＧＦポリペプチド、例えば酸性ＦＧＦである。 ペプチドスペーサー領域を介してサボリンポリペプチドに結合したリガンドを含 む融合タンパク質も提供する。前記スペーサー領域は、得られる融合タンパク質 が所望の細胞毒活性を有するように、一つ以上のアミノ酸を含む。好ましい具体 例では、リガンドはＦＧＦである。該融合タンパク質は強力な細胞毒性物質であ り、従って、化学的に結合したＦＧＦ−３ＡＰが効果を示すことが判明している 状態を含めて、種々のＦＧＦ仲介病理生理学的状態の治療に有用なはずである。 サボリン含有タンパク質をコードするＤＮＡの発現のためのベクター又はプラス ミドも提供する。細菌、酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような選択した宿主 内で機能する選択可能マーカー遺伝子及び複製起点を含むか、又は融合タンパク 質の発現を可能にするベクター又はプラスミドを提供する。好ましい具体例では 、プラスミドは、大腸菌のような原核生物宿主内での異種タンパク質の発現に適 したものである。サポリン含有タンパク質をコードするＤＮＡは、該ＤＮＡが選 択した宿主内で誘導的に発現されるように、プロモーター領域に機能的に結合す る。別の好ましい具体例では、ＤＮＡ構築物を、選択した宿主内でサポリン含有 タンパク質をコードするＤＮＡの転写を終結する機能を果たす転写ターミネータ −に機能的に結合する。好ましい宿主は、ＤＮＡ構築物の誘導性発現を行うもの である。 サポリン含有タンパク質をコードするＤＮＡ構築物の発現方法も提供する。特に 、ＤＮＡの発現を得るためにサボリンポリペプチドの細胞毒部分のアミノ末端に 結合したＮ末端延長領域をコードするＤＮＡ構築物を含むプラスミドで大腸菌宿 主細胞を形質転換し、サポリン含有タンパク質を単離することによって、大腸菌 内でサボリン含有タンパク質を産生ずる方法を提供する。 好ましい具体例では、天然シグナル配列の全体又は一部分に結合したサボリンを コードするＤＮＡ構築物を、該ＤＮＡ構築物が、結合したペプチドの分泌を制御 すべく大腸菌内で機能するシグナル配列に機能的に結合し、且つ選択した宿主内 で機能する誘導性プロモーター及びターミネータ−に機能的に結合するように、 プラスミド内に挿入する。 該プラスミドは、プロモーターが誘導的に調節される宿主内に導入する。別の好 ましい具体例では、サポリンボリベブチドをコードするＤＮＡ構築物を、ＦＧＦ をコードするＤＮＡに結合する。 最も好ましい具体例では、サボリンに結合したｂＦＧＦを含む融合タンパク質を 産生ずるためのＤＮＡ構築物及び方法を提供する。該融合タンパク質は、該融合 タンパク質中のｂＦＧＦと結合する細胞表面受容体を含む細胞にターゲツティン グされ、該細胞によってインターナライズされると細胞毒性を示す。 特に指示のない限り、本明細書で使用する総ての技術用語及び科学用語は、本発 明の分野の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本明細書で引 用する総ての米国特許及び総ての出版物は、その全体が参考として本明細書に包 含される。 本明細書中の種々のアミノ酸配列中に存在するアミノ酸は、良く知られている三 文字又は−文字の略号で示す。種々のＤＮＡフラグメント中に存在するヌクレオ チドは、当業界でルーチン的に使用されている標準的単一文字記号で示す。 本明細書中のサポリン（ｓａｐｏｒｉｎ、ここではＳＡＰと略す）という用語は 、天然植物宿主５ａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ中に存在するアミ ノ酸配列、及びアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含み依然として実質的な リポソーム不活性化活性を示す改変配列を有するポリペプチドを意味する。サボ リンの精製調製物はしばしば、該タンパク質の幾つかの分子アイソフオームを含 んでいることが観察される。アミノ酸配列の相違は、異なる種に由来するサボリ ンで生起し得るとともに、同一種の個々の生物に由来するサボリン分子の間でも 生起し得ると理解される。 従って、本明細書中のサボリンポリペプチドは、Σａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉ ｃｉｎａｌｉｓ又は関連種もしくは細胞毒活性を保持する改変種から単離し得る あらゆるサボリンアイソフォームを包含する。特に、前述のような改変サボリン は、一つ以上のアミノ酸を置換するか、又はＦＧＦ又は他の細胞表面結合タンパ ク質への結合を容易にし得るシスティンのような一つ以上のアミノ酸を欠失もし くは挿入することにより、本明細書で開示するＤＮＡを改変することによって製 造し得る。前述のようにＦＧＦに結合すると、標準的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ 　ｖｉｖｏアッセイで、本明細書に記載のサボリン結合体の少なくとも約−桁以 内で細胞毒性を示すような任意のタンパク質又はその一部分が本発明で使用する のに適しているとみなされる。 本明細書中のサポリン含有タンパク質は、（１）サポリンタンパク質と、サボリ ンに別の生物学的活性を付与しないＮ末端延長領域とを含むタンパク質、又は（ ２）サボリンボリペプチドと、特定の細胞表面受容体に対して反応するリガンド 、好ましくは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）とを含む融合タンパク質の いずれかである。 得られるサポリンタンパク質（１）は、細胞表面受容体の種々のリガンド、例え ば増殖因子（例えば線維芽細胞増殖因子）、ホルモン、抗体等への化学的結合に 対する毒素として有用である。得られるサボリン含有融合タンパク質（２）は、 例えば非限定的具体例として、ある種の再発狭窄症（ｒｅｓｔｉｎｏｓｉｓ）及 び癌、例えばヒト黒色腫及びヒト卵巣癌といった病気を治療するための細胞毒素 として有用である。 本明細書中のＤＮＡフラグメントという用語は、人ニブラスミドもしくはベクタ ー以外の、細胞器官のＤＮＡ又は染色体の一部分ではないＤＮＡ分子を意味する 。ＤＮＡフラグメントは、ＤＮＡ複製起点と、種々の源に由来する原核生物及び 真核生物遺伝子、例えば選択可能マーカー遺伝子、リプレッサー遺伝子、及び他 の任意のヌクレオチド配列を含み得る。ＤＮＡフラグメントは、プラスミドベク ターの環状形態で存在し得る。 本明細書中のマイトキシン（ｍｉｔｏｘｉｎ）とは、マイトジェンによって特定 の細胞にターゲツティングされた細胞毒性分子である。 本明細書中の、サボリン含有タンパク質をターゲツティングするという表現は、 該タンパク質を、選択した受容体を発現する細胞に向かわせる（送る）ことを意 味する。受容体に結合すると、サポリン含有タンパク質は当該細胞によってイン ターナライズされ、該細胞に対して細胞毒性を示す。 本明細書中の「生物学的に活性な（生物学的活性）」という用語、又はサポリン 含有ポリペプチドの生物学的活性、もしくはサボリン含有ポリペプチドの細胞毒 性への言及は、この種のポリペプチドが、ｉｎ　ｖｉｖｏもしくは１ｎｖｉｔｒ ｏのリポソームの不活性化によりタンパク質合成を阻止する能力、又は細胞によ るサポリン含有ポリペプチドのインターナリゼーション時に細胞の増殖を阻止す るかもしくは細胞を殺す能力を意味する。好ましい生物学的活性サボリンポリペ プチドは、真核細胞内に入った時に該細胞に対して毒性を示すものである。この ような生物学的活性又は細胞毒活性は、当業者に公知の任意の方法、例えば非限 定具体例として、タンパク質合成を測定するｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ、及び細 胞増殖もしくはタンパク質合成に対する検査化合物の作用を測定することにより 細胞毒性を評価するｉｎ　ｖｉｖｏアッセイによって分析し得る。 但し、特に好ましいのは、標的細胞内での細胞毒性を評価するアッセイである。 本明細書中の分泌シグナルという用語は、宿主の細胞質から細胞周辺校又は細胞 外増殖培地への前駆体タンパク質の分泌を制御する、前駆体タンパク質中のペプ チド領域を意味する。この種のシグナルは、前駆体タンパク質のアミノ末端又は カルボキシル末端のいずれかに存在し得る。好ましい分泌シグナルは、Ｎ末端延 長領域のアミノ末端に結合されている。 本明細書中のＮ末端延長領域（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）とい う用語は、サポリンボリペプチドの生物学的に活性な部分のアミノ末端に結合し ているペプチド領域を意味する。本明細書が明らかにするように、Ｎ末端延長領 域は、サボリン含有タンパク質のサポリンボリペプチド部分を、宿主内でのタン パク質の発現時に宿主に対して無毒にするか、又はＮ末端延長領域をもたないサ ボリンポリペプチドの発現より実質的に低い毒性を宿主に対して示すようにする 。アミノ酸を５個しか有していないＮ末端延長領域、及びアミノ酸を５００個も （又は使用するリガンドの大きさに応じてそれ以上）有するＮ末端延長領域を使 用し得る。現時点で好ましいＮ末端延長領域は、アミノ酸数が約８〜３００であ る。最も好ましいＮ末端延長領域は、約５〜約１５０個のアミノ酸を有する。特 に好ましいＮ末端延長領域はリガンドをコードする。 本明細書中のリガンドという用語は、細胞表面タンパク質に結合することができ 、細胞内へのりガント含有融合タンパク質のインターナリゼーションを容易にす ることができる任意のポリペプチドを意味する。この種のりガントとしては、増 殖因子、抗体もしくはそのフラグメント、ホルモン及び他の種類のタンパク質が 挙げられる。 本明細書中のＦＧＦという用語は、天然ＦＧＦタンパク質のアミノ酸配列、並び に天然タンパク質のアミノ酸置換、欠失、挿入又は付加を有するがＦＧＦ受容体 に結合しインターナライズされる能力を保持している改変配列を有するポリペプ チドを意味する。この種のポリペプチドの非限定的具体例としては、ＦＧＦ−１ ，ＦＧＦ−９が挙げられる。 例えば、ｂＦＧＦは通常、ウシｂＦＧＦ又はヒトｂＦＧＦと同じアミノ酸配列及 び受容体ターゲツティング活性を有するポリペプチドを意味すると理解されたい 。 アミノ酸配列の相違は、異なる種のＦＧＦの間で生起し得るとともに、個々の生 物又は種に由来するＦＧＦの間で生起し得ると理解される。ＦＧＦという用語に は、天然の源から単離したタンパク質、並びに、例えば組換え手段又は場合によ っては化学的合成により合成的に製造したタンパク質も含まれる。ＦＧＦには、 サボリンをＦＧＦ−受容体発現細胞にターゲツティングする能力を有する、ＦＧ Ｆのムティンも包含される。このようなムティンの非限定的具体例としては、例 えば増殖因子の活性もしくは安定性を保持もしくは増加させるために、ジスルフ ィドスクランプリングを低下もしくは除去するために、又はグリコジル化を変え るために、一つ以上のシスティンをセリンもしくは他のアミノ酸で置換するか、 又は任意のアミノ酸を置換することにより製造したものが挙げられる（例えば、 ＫａｔＯらの米国特許第５，１２０，７１５号ＨＦｏｌｋｍａｎらの米国特許第 ５，１７５，１４７号；Ｔａｋｅｄａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ ｓ　Ｌｔｄ、の欧州特許出願５１０６６２　Ａ；Ｔａｋｅｄａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、のＪＰ　４１６４０９６　Ａ参照）。 本明細書中のｒＦＧＦ受容体」という用語は、ＦＧＦと特異的に作用し合って該 ＦＧＦを細胞内に輸送する受容体を意味する。この種の受容体としては、米国特 許出願箱０７／３７７．０３３号に基づく国際出願筒ＷＯ９１１００９１６号； 米国特許出願箱０７１５４９，５８７号に基づく国際出願筒Ｗ０　９２１００９ ９９号；国際出願筒Ｗ０　９０１０５５２２号：及び国際出願筒ＷＯ９２／１２ ９４８号に記載のものが挙げられる。Ｉ　ｍａｍｕ　ｒ　ａ本明細書中のｒＦＧ Ｆ受容体と反応する（ＦＧＦ受容体に対して反応性を示す）ポリペプチド」とい う用語は、ＦＧＦ受容体、好ましくは高親和性ＦＧＦ受容体と特異的に作用し合 い、ＦＧＦ受容体との相互作用によって細胞内に輸送される任意のポリペプチド を意味する。 本明細書で使用する、ヌクレオチドの調節配列及びエフェクター配列、例えばプ ロモーター、エンハンサ−１転写及び翻訳停止部位並びに他のシグナル配列への 異種ＤＮＡの作動可能な結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ　ｌｉｎｋａｇｅ又はｏｐｅ ｒａｔｉｖｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）という表現は、前記ＤＮＡと前記ヌク レオチド配列との間の機能的関係を意味する。例えば、プロモーターへの異種Ｄ ＮＡの作動可能な結合とは、前記ＤＮＡの転写が、読取り枠内のＤＮＡを特異的 に認識し、これに結合し且つこれを転写するＲＮＡポリメラーゼによって前記プ ロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的及び機 能的関係を意味する。 本明細書中のプロモーター領域とは、ＤＮＡと作動可能なように結合して該ＤＮ Ａの転写を制御する遺伝子のＤＮＡ部分を意味する。プロモーター領域の一部分 は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合及び転写開始に十分な特定ＤＮＡ配列を含 む。プロモーター領域のこの部分はプロモーターと称される。プロモーター領域 は更に、ＲＮＡポリメラーゼの前記認識、結合及び転写開始活性を調節する配列 もｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）に応答し得る。プロモーターは、調節の種類に応じて、 構成的であるか又は調節され得る。本発明では、誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ） プロモーターを使用するのが好ましい。プロモーターは、宿主によって発現され るＲＮＡポリメラーゼによって認識される。ＲＮＡポリメラーゼは宿主に対して 内因性であり得、又は遺伝子工学により、宿主染色体の一部分として、もしくは サボリン含有ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドのようなエピソ ームエレメント上で、宿主内に導入し得る。 本発明で使用するための最も好ましいプロモーターは、誘導がない場合にはサポ リン含有タンパク質をコードするＤＮＡが発現されないように、厳密に制御され る。 本明細書中の転写ターミネータ−領域は、（ａ）転写体中のポリアデニル化シグ ナル及びポリアデニル化部位をコードするサブセグメント、及び／又は（ｂ）選 択したプロモーターを認識するポリメラーゼによって転写を終結する転写終結シ グナルを与えるサブセグメントを有する。完全転写クーミネーターは、プロモー ターの供給源である遺伝子と同じか又は異なっていてよいタンパク質コーディン グ遺伝子から得ることができる。好ましい転写ターミネータ−領域は、大腸菌内 で機能するものである。転写ターミネータ−は本発明における発現システムの任 意的成分であるが、好ましい具体例では使用される。 本明細書中のＦＧＦ仲介病理生理学的状態とは、ｂＦＧＦマイトジェン刺激に敏 感な細胞の増殖を特徴とするか又は該細胞によって引き起こされる有害な状態を 意味する。 塩基性ＦＧＦ仲介病理生理学的状態の非限定的具体例としては、ある種の腫瘍、 リュウマチ性関節炎、再発狭窄症、デュプイトラン撃縮及びある種の糖尿病合併 症、例えば増殖性網膜症が挙げられる。 本明細書中のベクター又はプラスミドは、異種ＤＮＡの発現か又はクローン化異 種ＤＮＡの複製のために異種ＤＮＡを細胞内に導入するために使用される別個の （ｄ　ｉ　ｓ　ｃｒｅｔｅ）エレメントを意味する。このようなベクター及びプ ラスミドの選択及び使用は、当業者の能力範囲内にある。 本明細書中の発現ベクターは、調節配列と機能的に結合しているＤＮＡフラグメ ントの発現を実施することができる調節配列、例えばプロモーター領域に、作動 可能なように結合しているＤＮＡフラグメントを発現することができるベクター を包含する。従って発現ベクターは、組換えＤＮＡ又はＲＮＡ構築物、例えばプ ラスミド、ファージ、組換えウィルス、又は、適当な宿主細胞内に導入されると クローン化ＤＮＡを発現させる他のベクターを意味する。適当な発現ベクターは 当業者に良く知られており、真核細胞及び／又は原核細胞内で複製可能なもの、 並びにエピソーム状態を維持するか又は宿主細胞ゲノムに組込み得るものが挙げ られる。 本明細書中の、単離された実質的に純粋なりＮＡとは、当業者によって使用され ている標準的方法で精製したＤＮＡフラグメントを意味する（例えば、Ｍａｎｉ ａｔｉｓらｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｔａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） 、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ参照）。 本明細書中の発現という用語は、核酸がｍＲＮＡに転写され、且つペプチド、ポ リペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。核酸がゲノムＤＮ Ａに由来する場合には、適当な真核細胞又は生物が選択されれば、発現はｍＲＮ Ａのスプライシングを含み得る。 本明細書中の「培養」とは、細胞を増殖させる培地中での細胞の増殖及びその総 ての継代培養を意味する。「継代培養」という用語は、別の培養（源培養（ｓｏ ｕｒｃｅｃｕｌｔｕｒｅ））の細胞から増殖した細胞の培養を意味するか、又は 当該継代培養と源培養との間で実施された継代培養の数に関係なく、源培養の任 意の継代培養を意味する。 本明細書中のＩＤ！。は、ＦＧＦ−５ＡＰのような毒素とともに７２時間インキ ュベートした後で細胞の５０％が死滅する濃度を意味する。 本明細書中のＥＤｓｏは、処理細胞内でのタンノくり質合成を、サボリン含有タ ンパク質が存在しない場合のタンノ々り質合成の５０％に抑−制するのに必要な サポリン含有タンノ々り質の濃度を意味する。 ＤＮＡ構築物 本発明が提供するＤＮＡ構築物は、サポリンポリペプチドをコードするヌクレオ チド配列と、サポリンボリペプチドのアミノ末端に結合したＮ末端延長配列とを 含むサボリン含有タンパク質をコードする。 好ましいサポリンポリペプチドとしては、アミノ酸位置４８及び９１に不均質性 （ｈｅ　ｔ　ｅ　ｒｏｇｅｎｅ　ｉ　ｔｙ）を有する４個のアイソフオームを含 むサボリン−６（Ｓ〇−６）と実質的に同じアミノ酸配列及びリポソーム不活性 化活性を有するポリペプチドをか挙げられる（例えば、Ｍａｒａｓら（１９９０ ）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｎｔｅｒｎａ：４８−５３参照）。他の適当なサポリンボ リペプチドとしては、８０−１及び５ｏ−３（Ｆｏｒｄｈａｍ−３ｋｅＩｔｏｎ ら（１９９０）Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２ｋｅ　Ｉ　ｔｏｎら（１９９１ ）Ｍｏ　１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅ　ｔ。 ｏｎｔｅｃｕｃｃｈｉら（１９８９）Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　Ｒｅｓ、３３、　二　２６３−２６７）を含むサポリン型ＲＩＰのアイソ フオームをコードする多重遺伝子族のメンバーが挙げられる。 現時点で好ましいサボリンポリペプチドとしては、配列番号３〜７に示されてい るものと実質的に同じアミノ酸配列を有するものが挙げられる。これらのタンパ ク質をコードするＤＮＡの単離及び発現は実施例１で説明する。最も好ましいサ ボリンポリペプチドは配列番号３に示されているものである。 適当なＮ末端延長領域は実質的に中性であり得、サポリンボリペプチドをその発 現宿主に対して無毒又低毒性にする機能以外の生物学的機能をもたない。Ｎ末端 延長領域の特定アミノ酸構造は、サポリン含有タンパク質を、該タンパク質の発 現時に宿主に対して無毒又は低毒性にする上で決定的に重要なものとは思われな い。 好ましい具体例では、Ｎ末端延長領域は、インターナリゼーションの際に、サポ リン含有融合タンパク質のＮ末端延長領域が、単一フラグメントサポリンタンパ ク質を生物学的に活性にする細胞真核プロテアーゼにより開裂又は分解され、そ の結果細胞が死滅するように、一般的細胞内分解又はタンパク質分解シグナル配 列の部位特異的タンパク質分解プロセッシングによって、真核細胞内プロテアー ゼによる開裂を受ける（適当な部位特異的タンパク質分解シグナル配列の説明に ついては、例えば欧州特許出願ＥＰ０４６６　２２２を参照されたい）。 適当なＮ末端延長領域は、サボリンポリペプチドを宿主細胞に対して無毒又は低 毒性にする以外に、単離の後でサポリン含有タンパク質に別の生物学的機能を付 与する役割も果たし得る。ある具体例では、Ｎ末端延長領域は、サポリンポリペ プチドをｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒ。 で特定細胞にターゲツティングすることができるリガンド、好ましくはｂＦＧＦ を含み、それによってサポリン含有タンパク質がインターナライズされ、標的細 胞に対して細胞毒性になる。 代表的なりガントの非限定的具体例としては、既にサポリンとの化学的結合に成 功しているリガンド、例えば塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）　、精製ヒ トシフェリツク（ｄｉｆｅｒｒｉｃ）　トランスフェリン及び抗体の抗原結合ド メイン、Ｆａｂフラグメント（例えばＢｅｔｔｅｒら（１９８９）Ｍｅｔｈ、Ｅ ｎｚ、１７８：４７６−４９６参照）、例えば抗ヒト免疫グロブリンＨ鎖モノク ローナル抗体及び抗Ｔｈｙｌモノクローナル抗体が挙げられる。 別のリガンドとしては、抗Ｔリンパ球モノクローナル抗体の細胞表面結合ドメイ ン、例えば非限定的具体例として、抗ＣＤ５Ｔ細胞表面抗原、抗ＣＤ１９及び抗 ＣＤ２２、抗ＣＤ３並びに抗ＣＤ２が挙げられる。特に好ましいリガンドは、線 維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）　、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）　、血管性内 皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ −Ｃ８Ｆ）である。最も好ましいリガンドはｂＦＧＦである。 別のリガンドの非限定的具体例としては、別の毒素との結合が既に成功している もの、例えば抗ヒトトランスフェリン受容体モノクローナル抗体、α−メラニン 細胞刺激ホルモン、ＩＬ−２、Ｉ　Ｌ−６、形質転換増殖因子α型（ＴＧＦ−α ）及びヒトＣＤ４分子のＨＩＶ結合ドメイン等が挙げられる。 好ましい具体例では、サポリンポリペプチドをコードするＤＮＡを、ＦＧＦポリ ペプチドをコードするＤＮＡに結合する。ＦＧＦポリペプチドをコードするＤＮ Ａは、翻訳停止コドンと、存在し得る他の転写もしくは翻訳停止シグナルとを除 去するために改変される。次いで該Ｄ　Ｎ　Ａを、サボリンポリペプチドをコー ドするＤＮＡに連結する。ＤＮＡは、サボリンの第一のコドンとＦＧＦの最後の コドンとの間の一つ以上のコドンのスペーサー領域を含み得る。 該スペーサー領域の大きさは、形成される結合体が標的細胞によるインターナリ ゼーションの際に細胞毒活性を示す限り、どんな長さでもよい。現時点では、約 ２個〜約１２個のコドンからなるスペーサー領域が好ましい。 ＦＧＦ及び／又はＦＧＦのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは当業者には公知で ある。ヒト酸性ＦＧＦ　（Ｊａｙｅ下垂体組織から単離した代表的哺乳動物ｂＦ ＧＦのアミノｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　８２：６５０７− ６５１１；及び米国特許第４．９５６，４５５号参照）。単離された哺乳動物塩 基性ＦＧＦタンパク質は、典型的には、分子量約１５ｋＤ、ｐｌ約９．６の１４ ６残基ポリペプチドである。該タンパク質は、得られるタンパク質が約１８ｋＤ の分子量を有するように、約９残基のアミノ末端延長部を含むように発現され得 る。 サボリン含有ポリペプチドの発現のためのプラスミドＤＮＡ構築物を、所望の宿 主内で発現するためのプラスミドに導入する。好ましい具体例では、宿主は細菌 宿主である。調節領域である該プラスミドのヌクレオチド配列、例えばプロモー ター及びオペレーターは、サボリン含有タンパク質をコードするヌクレオチド配 列の転写のために互いに作動可能なように結合される。サポリン含有タンパク質 をコードするヌクレオチド配列は、分泌シグナルをコードするＤＮＡも含み得、 その場合は得られるペプチドがサポリン前駆体である。その結果得られるプロセ シングされたサボリンタンパク質は、得られるタンパク質が天然サポリンと同じ であって天然サポリンタンパク質の細胞毒活性を保持するようにプロセシングさ れない場合には、細胞周辺買控又は発酵培地から回収され得る。 好ましい具体例では、ＤＮＡプラスミドは転写終結配列も含む。プロモーター領 域及び転写ターミネータ−は、各々独立して、同じ又は異なる遺伝子から選択さ れる。 本発明で使用するプラスミドは、好ましくは、サボリン含有タンパク質をコード するＤＮＡに作動可能なように結合していプロモーターを含み、細菌宿主内でタ ンパク質を発現するように設計される。サボリンの発現には、厳密に調節できる プロモーターが好ましいことが判明した。サボリン含有タンパク質の発現に適し たプロモーターは広く入手でき、当業者によく知られている。調節領域に結合し た誘導性プロモーター又は構成プロモーターが好ましい。この種のプロモーター の非限定的具体例としては、Ｔ７フアージプロモーター及び他のＴ７様ファージ プロモーター、例えばＴ３、Ｔ５及びＳＰ６プロモーター、ｔｒｐ、ｌｐｐ及び 大腸菌由来１ａｃプロモーター、例えば１ａｃＵＶ５；バキュロウィルス／昆虫 細胞発現システムのＰＩＯもしくはポリへドロン遺伝子プロモーター、及び他の 真核生物発現システム由来の誘導性プロモーターが挙げられる。 このようなプロモーターは、サポリン含有タンパク質を発現させるために、ｌａ ｃオペロンのような制御領域と作動可能なように結合しているプラスミドに挿入 する。 好ましいプロモーター領域は、大腸菌内で誘導され機能し得るものである。適当 な誘導性プロモーター及びプロモーター領域の非限定的具体例としては、イソプ ロピルβ−ローチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、例えばＮａｋａｍｕｒａら （１９７９）Ｃｅ　Ｉ　Ｉ　上８：１１０９−１１１７参照）に応答する大腸菌 １ａｃオペレーター；重金属（例えば亜鉛）誘導に応答するメタロチオネインプ ロモーター金属調節エレメント（例えばＥｖａｎｓらの米国特許第４．８７０． ００９号参照）；及びＩ　ＰＴＧに応答するファージＴ７１ａｃプロモーター（ Ｓｔｕｄｉｅｒら肚ｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ１．，１８５：６０−８９．１９９０： 及び米国特許第４．９５２，４９６号参照）が挙げられる。 プラスミドは、好ましくは、選択可能マーカー遺伝子、又は宿主内で機能する遺 伝子も含む。選択可能マーカー遺伝子は、形質転換された細菌細胞が同定され、 非形質転換細胞の大部分の中から選択的に増殖されるようにする表現型を細菌に 付与する任意の遺伝子を含む。例えば細菌宿主に適した選択可能マーカー遺伝子 としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ’）、テトラサイクリン耐性遺伝子 （Ｔｃ’）及びカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎつが挙げられる。現時点で好ま しいのはカナマイシン耐性遺伝子である。 好ましいプラスミドは、作動可能にサポリン含有タンノ（り質の分泌のシグナル をコードするＤ　Ｎ　Ａも含む。使用するのに適している分泌シグナルは広く入 手でき、当業者によく知られている。大腸菌内で機能する原核生物及び真核生物 分泌シグナルを使用し得る。現時点で好ましい分泌シグナルの非限定的具体例と しては、次の大腸菌遺伝子でコードされるものが挙げられる：ｏｍｐＡ、ｏｍｐ Ｔ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＣ，β−ラクタマーゼ及びアルカリホスファターゼ等（ｖ ｏｎ　Ｈｅ　ｉ　ｊｎｅ　（１９８５）Ｊ、Ｍｏ　Ｉ。 Ｂｉｏｌ、１８４：９９−１０５）、また、細菌ｐｅｌＢ遺伝子分泌シグナル（ Ｌｅｉら（１９８７）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：４３７９，１９８７） 、Ｉ）ｈｏＡ分泌シグナル、及び昆虫細胞内で機能するｃｅｋ２も使用し得る。 最も好ましい分泌シグナルは大腸菌ｏｍｐＡ分泌シグナルである。当業者に公知 の別の原核生物及び真核生物分泌シグナルも使用し得る（例えばｖｏｎ　Ｈｅ１ ｊｎｅ（１９８５）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８４：９９−１０５参照）。当業 者は、本明細書に記載の方法を用いて、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞内で機能す る分泌シグナルを置換して、これらの細胞からサポリン含有タンパク質を分泌さ せることができる。 大腸菌細胞を形質転換するための特に好ましいプラスミドとしてはｐＥＴ発現ベ クターが挙げられる（米国特許第４．９５２，４９６号参照；　Ｎ０ＶＡＧＥＮ 、Ｍａｄ　ｉ　ｓｏｎ、Ｗｌから入手可能）。この種のプラスミドには、Ｔ７１ ａｃプロモーターとＴ７ターミネーターと誘導性大腸菌１ａｃオペレーターとＩ ａｃリプレッサー遺伝子とを含むｐＥＴ　ｌｌａ、並びにＴ７プロモーターとＴ ７ターミネーターと大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルとを含むｐＥＴ１２ａ−ｃがあ る。 別の好ましいプラスミドとしては、ｐＩＮ−１１１ｏｍｐＡプラスミド（Ｉ　ｎ ｏｕｙｅの米国特許第４．５７５゜０１３号、及びＤｕｆｆａｕｄら（１９８７ ）Ｍｅｔｈ。 Ｅｎｚ、１５３：４９２−５０７参照）、例えばｐｌＮ−Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｏｍｐＡ ２が挙げられる。ｐｌＮ−１１１ｏｍｐＡプラスミドは、読取り段階における転 写発現のために大腸菌のりボタンバク質遺伝子に由来する４個の機能フラグメン トに結合した異種ＤＮＡ　（サボリン含有タンパク質をコードするＤＮＡ）の挿 入部位を含む。該プラスミドは、所望のポリペプチドがｏｍｐＡシグナルペプチ ドをアミノ末端に含んだ状態で発現され、その結果細胞質膜を通して効率的な分 泌が行われるように配置されている大腸菌のｏｍｐＡタンパク質のシグナルペプ チドをコードするＤＮＡフラグメントも含む。該プラスミドは更に、所望のポリ ペプチドの転写発現に適した方向で配置されている大腸菌１ａＣプロモーター− オペレーターの特定セグメントをコードするＤＮＡと、ｌａｃオペロン誘導物質 が存在しない場合にｌａｃプロモーター−オペレーターと作用し合ってそこから の転写を阻止する関連リプレッサー分子をコードする別の機能性大腸菌１ａｃ遺 伝子とを含む。所望のポリペプチドの発現はりボタンバク質プロモーター（ｌｐ ｐ）及びＩａｃプロモーター−オペレーターの制御下にあるが、どちらのプロモ ーターからの転写も通常はリプレッサー分子によって阻止される。リプレッサー は誘導物質分子によって選択的に不活性化され、その結果両方のプロモーターか ら所望のポリペプチドの転写発現が誘発される。 前述のように、好ましい具体例は、融合タンパク質のＮ末端延長領域内へのｂＦ ＧＦリガンドの導入をり要とする。 最も好ましいｂＦＧＦコーディング領域は、配列番号１２のヌクレオチド１〜４ ６５で示されるものである。別の好ましいコーディング領域は、配列番号１３の ヌクレオチド１〜４６５で示されるものである。塩基性ＦＧＦ　（ｂＦＧＦ）及 び酸性ＦＧＦ　（ａＦＧＦ）以外に、ＦＧＦ受容体への結合を介して塩基性ＦＧ Ｆマイトジェン活性を示す多くのタンパク質が存在することが知られている。ａ ＦＧＦ以外のＦＧＦタンパク質としては、Ｈ３Ｔ、上■工／２、ＦＧＦ−５、Ｆ ＧＦ−６、ＫＧＦ　（ＦＧＦ−７）　、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−９が挙げられる （例えばＢａ　ｉ　ｒｄら（１照）。総てのＦＧＦタンパク質は、広範囲にわた る正常二倍体中肝葉由来及び神経堤由来細胞内で、マイトジェン活性を誘発する 。このようなｒＦＧＦマイトジェン活性」の検査の一つは、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏ ｗｉｃｚら（１９８２）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７．１２２６６−１２２ ７８、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら（１９７６）Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７３：４１２０−４１２４に記載のような、培養ウ シ大動脈内皮細胞の増殖を刺激する能力の検査である。 好ましい具体例では、ＤＮＡフラグメントを細菌細胞、好ましくは大腸菌内で複 製する。好ましいＤＮＡフラグメントは、細菌の世代から世代へとＤＮＡフラグ メントを維持するために、細菌複製起点も含む。このようにすれば、細菌内での 複製によって大量のＤＮＡフラグメントを製造することができる。好ましい細菌 複製起点の非限定的具体例としては、ｆｌ−ｏｒｉ及びｃｏｌＥ１複製起点が挙 げられる。好ましい宿主は、１ａｃＵＶプロモーターのような誘導性プロモータ ーに作動可能なように結合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの染 色体コピーを含む（米国特許第４，９５２．４９６号参照）。このような宿主の 非限定的具体例としては、溶原大腸菌株ＨＭＳ　１７４　（ＤＥ３）ｐＬｙｓｓ 、ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＨＭＳ１７４　（ＤＥ３）及びＢＬ２１　 （ＤＥ３）が挙げられる。好ましいのは株ＢＬ２１　（ＤＥ３）である。ｐＬｙ ｓ株は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼの天然の阻害物質であるＴ７リゾチームを低 レベルで与える。 任意的に与えられるＤＮＡフラグメントは更に、リプレッサータンパク質をコー ドする遺伝子を含む。リプレッサータンパク質は、該リプレッサータンパク質が 結合するヌクレオチド配列を含むプロモーターの転写を抑制することができる。 該プロモーターは、細胞の生理学的状態を変化させることによって抑制解除でき る。前記変化は、例えばオペレーターもしくは調節タンパク質又はＤＮＡの別の 領域と作用し合う能力を抑制する分子を増殖培地に加えるか、又は増殖培地の温 度を変えることによって達成し得る。好ましいリプレッサータンパク質の非限定 的具体例としては、ＩＰＴＧ誘導に応答する大腸菌１ａｃｌリプレツサー、温度 に敏感なｃ１８５７リブレツサー等が挙げられる。好ましいのは大腸菌１ａｃＩ リプレツサーである。 結果として得られるｂＦＧＦ融合タンパク質は、標的細胞によってインターナラ イズされるときに大きな細胞毒性宿主生物としては、異種タンパク質の組換え産 生が行われた生物、例えば非限定的具体例として、細菌（例えば大哺乳動物細胞 、昆虫細胞が挙げられる。現時点で好ましい宿主生物は細菌株である。最も好ま しい宿主生物は大腸菌株である。 組換えＳＡＰ産生方法： 選択した宿主生物内でポリペプチドを発現させるために、適当なプロモーターに 機能的に結合しているプラスミドに、サポリン含有タンパク質をコードするＤＮ Ａを導入する。 生物学的に活性なサボリンボリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントは、選 択した宿主内で、細胞周辺又は培養培地中に成熟ポリペプチドを送る機能を果た すタンパク質分泌シグナルも含み得る。得られたサポリン含有タンパク質は、当 業者がルーチン的に使用する方法、例えば後述の実施例に記載の方法で精製し得 る。 適当な宿主細胞、好ましくは細菌細胞、より好ましくは大腸菌細胞を形質転換す る方法、及び異種タンパク質をコードする遺伝子を含む前記細胞を培養するため の方法は、通常、当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９ ）Ｍｏｌｅｃｕ！ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ参照。 サボリン含有タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、任意の適当な手段、例え ば非限定的具体例として、プラスミド、ウィルス又は細菌ファージベクターを用 いる形質転換、トランスフェクション、電気穿孔法、リボフェクション等により 宿主細胞内に導入する。異種ＤＮＡは任意に、サボリン含有プラスミドの染色体 外維持を可能にする複製起点のような配列を含み得、又は（宿主内での安定な維 持のための別の手段として）宿主のゲノム内に組込むように設計し得る。 陽性形質転換体は、ＤＮＡ組込み部位を調べるためのサザンプロット分析（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍ。 Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ。 ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）；誘導性 プロモータ一応答すボリン遺伝子発現を調べるためのノーザンプロット；並びに 細胞質、細胞周縁質又は増殖培地中のサボリン含有タンパク質の存在を調べるた めの産物分析によって特徴を解析し得る。 サボリン含有ＤＮＡフラグメントを宿主細胞内に導入したら、該宿主細胞を、プ ロモーターが誘導され、それによって作動的に結合したＤＮＡが転写されるよう な条件にかけることにより、所望のサポリン含有タンパク質が産生される。好ま しい具体例では、前記条件は、大腸菌１ａｃオペロンから発現を誘導するような 条件である。サボリン含有タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、 プロモーター内のオペレーター（０）領域も含み、またＩａｃリプレッサータン パク質をコードする１ａｃｌ遺伝子も含み得る（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌ ｌら（１９６８）１２５９−１２６４９参照）ｏ　Ｉａｃリプレッサーは、サボ リン含有タンパク質をコードするＤＮＡの転写を誘発するのに十分な量でＩ　Ｐ ＴＧを添加することによって誘発されるまで、ｌａｃプロモーターからの発現を 抑制する。 従うて、大腸菌内でのサボリンの発現は、２段階プロセスで実施する。第一の段 階では、形質転換大腸菌細胞の培獲物を、形質転換用プラスミド、好ましくはｐ ＯＭＰＡＧ４内でのサボリン含有タンパク質の発現が、ｌａｃリプレッサーの作 用によって抑制されるような条件下で増殖させる。 この段階で細胞密度が増加する。最適密度に到達したら、リプレッサーがオペレ ーターに結合するのを阻止し、それによってｌａｃプロモーター及びサボリンコ ーディングＤＮＡの転写を誘発するＩ　ＰＴＧの添加により、第二の段階を開始 する。 好ましい具体例では、プロモーターが、ｌａｃオペレーターに結合していてよい Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであり、大腸菌宿主株が、ｌａｃオペレ ーターに作動可能なように結合したＴ７　ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮ Ａと、プロモーター、好ましくはＩａｃＵＶ５プロモーターとを含む。Ｉ　ＰＴ Ｇの添加は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ、及びＴ７ボリメラーゼによって認識さ れるＴ７プロモーターの発現を誘発する。より好ましい具体例では、ＤＮＡ構築 物が、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによって認識される転写ターミネータ−を含む 。 所望の表現型及び遺伝子型を有する形質転換株を当業者に公知の方法で発酵槽中 で増殖させる。第一の段階、又は増殖段階では、誘導条件、好ましくはＩ　ＰＴ Ｇを欠く所定の最少培地で発現宿主を培養する。このような条件で増殖させると 、異種遺伝子発現は完全に抑制され、そのため異種タンパク質発現の不在下で細 胞が大量に製造される。異種遺伝子発現の抑制下での増殖期間に次いで、誘導物 質、好ましくはＩ　ＰＴＧを発酵ブイヨンに加え、それによってＩ　ＰＴＧ応答 プロモーター（ｌａｃオペレーターを含むプロモーター領域）に機能的に結合し た任意のＤＮＡの発現を誘発する。この最後の段階は誘発段階である。 好ましい具体例では、発現されたサボリン含有タンパク質を、細胞質、細胞周縁 質又は細胞培養培地から単離する。 より好ましくは、発現されたサポリン含有タンパク質を、細胞周縁質又は培養培 地からの分泌物として単離する。最も好ましいのは、細胞周縁質からのサボリン 含有産物の単離である。 得られたサポリン含有タンパク質は、当業者がルーチン的に使用している方法、 例えば実施例１．Ｅ〜Ｆ及び２゜Ｄに記載のような適当なアフィニティカラムの 使用；硫酸アンモニウムでの沈殿；ゲル濾過；クロマトグラフィー、分取用フラ ットベッド等電点電気泳動；ゲル電気泳動；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ 　Ｌ　Ｃ）等により、他の発酵産物から適当に単離し得る。サボリンの単離方法 は、しる。 本明細書に記載の方法の実施では、成熟ＳＡＰポリペプチド全体とサポリンシグ ナル配列の１５個のアミノ酸とをコードするＥｃｏＲＩフラグメントを、サポリ ンシグナル配列及びサボリンタンパク質をコードするＤＮＡが、ＯｍｐＡリーダ ーをコードするＤＮＡに作動的に結合して、大腸菌宿主細胞に導入されるプラス ミドｐＯＭＰＡＧ４を産生ずるように、細胞周縁質分泌ベクターｐＩＮＩＩＩｏ ｍｐＡ２に挿入した。サポリン含有タンパク質をコードするＤＮＡの発現が誘発 されたら、サポリン含有ポリペプチドを細胞周縁質及び細胞質から単離した。サ ボリン含有ポリペプチドをイムノアフィニティクロマトグラフィーで精製然シグ ナル配列の３〜１０個のアミノ酸も除去されていることが判明した。細胞質タン パク質の類似の分析では、天然シグナルペプチド全体と、更に２個のアミノ酸と が除去されていることが判明した。 ＦＧＦ−３ＡＰ融合タンパク質の細胞内及び細胞周辺発現をそれぞれ生起させる ために、全長ｂＦＧＦをコードするＤＮＡを、成熟サポリンタンパク質をコード するＤＮＡに結合し、ｐＥＴベクター、ｐＥＴ−１１８及びｐＥＴ−１２ａ発現 ベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄ　ｉ　ｓ　ｏｎ。 ＷＩ）に導入した。得られた融合タンパク質は細胞毒活性を示し、少なくとも、 化学的に結合したＦ　Ｇ　Ｆ　−Ｓ　Ａ　Ｐ　ｍ。 型物と同じくらい強力であると思われる。。 以下の実施例は本発明を説明するためのものでありで、その範囲を限定するもの ではない。 大腸菌株ＪＡ２２１　（Ｉｐｐ−ｈｄｓＭ＋ｔｒｐＥ５ＩｅｕＢ６１ａｃＹｒｅ ｃＡＩＦ’　［１ａｃＩ＠ｌａｃ”ｐｒｏ”］）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ＭＤ　２０８５２から受託番号ＡＴＣＣ３３８７５で入手できる。（ＪＡ２２１ は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ（ ＮＲＲＬ）、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅ、Ｕ 、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　’Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｅｏｒｉａ 、ＩＬ、６１６０４からも、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５２１１で入手し得る。 Ｉ　ｎｏｕｙｅの米国特許第４．７５７．０１３号、及びＮａｋａｍｕｒａら（ １９７９）Ｃｅ　Ｉ　１　１８　：　１１０９〜１１１７も参照されたい）。株 ＩＮＶＩ（ＺはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販され 本発明で使用する制限酵素及び修飾酵素は米国内で市販されており、天然サボリ ン及び、サポリンに対するウサギポリクローナル抗血清は、Ｌａｐｐ　ｉらＢｉ ｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、１２９：９３４−９４２に記載のように 得た。リシンＡ鎖はＳＩＧＭＡ、Ｍｉ　１ｗａｕｋｅｅ、Ｗｌから市販されてい る。抗血清は製造業者の指示に従ってＡｆｆｉ−ｇｅｌ　１０（ＢＩＯ−ＲＡＤ 、Ｅｍｅ　ｒｙｖ　ｉ　１１　ｅ、ＣＡ）に結合した。種々の構築物の配列決定 は、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎの５ｅｑｕｅｎａｓｅキツト（バージョン２．０）を製造業者の指示通り に使用して行った。プラスミドの微量調製（ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ） 及び大量調製（ｍａｘｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）、コンピテント細胞の調製、 形質転換、Ｍ１３操作、細菌培地、ウェスタンブロッティング及びＥＬ　Ｉ　Ｓ Ａアッセイは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔ ｓｃｈ及びＴ、Ｍａｎｉｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙＰｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｈａｒｂｏｒ。 ＮＹ）に従って行った。ＤＮＡフラグメントの精製は、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　Ｉ Ｉキット（Ｂｉｏ　１０１）を製造業者の指示通りに使用して行った。ＳＤＳゲ ル電気泳動はＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で実施した。 ウェスタンブロッティングは、Ｐｈａｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｒシステムを製造業 者の指示通りに使用して電気泳動タンパク質をニトロセルロースにトランスファ ーすることにより実施した。ＳＡＰに対する抗血清は１　：　１０００の希釈度 で使用した。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗１ｇＧを第二抗体として 使用した（Ｄａｖｉｓら（１ｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ 　Ｃｏ。 、ｐｐ１〜３３８参照）。 Ｂ、　サボリンをコードするＤＮＡの単離１、ゲノムＤＮＡの単離及びポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＤＮＡを、Ｂｉａｎｃｈｉら（１９８８）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ １．Ｂｉｏｌ、１１：２０３−２１４に記載のように製造した。ゲノムＤＮＡ増 幅のためのプライマーを３８０Ｂ自動ＤＮＡ合成機で合成した。サポリンの「セ ンス」鎖（配列番号１）に対応するプライマーは、天然サポリンＮ末端リーダー 配列（配列番号１）： ５°−ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＡＡＴ−３゜ のアミノ酸−１５のＤＮＡコドンのすぐ上流に、ＥｃｏＲＩ制限部位アダプター を含む。サボリンの「アンチセンス」鎖（配列番号２）に対応するプライマーは 、成熟ペプチドのカルボキシル末端をコードするＤＮＡの最後の５個のヌクレオ チドから出発するサポリンコーディング配列を相補し、成熟サポリンをコードす る配列の後に翻訳停止コドンを導入し、サボリンコーディングＤＮＡ及び導入し た停止コドンの下流にＥｃｏ’ＲＩ制限部位を導入する：（配列番号２）　二　 ５’　−ＣＴＧＣＡＧ　＾＾ＴＴＣＧＣＣＴＣＧＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧ− ３。 ２、サボリンをコードするＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ非分画（ｕｎｆａｃｔ 　１ｏｎａｔｔｅｄ）Ｓａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ葉ゲノムＤ ＮＡ　（１μｌ）を、１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）と５０ｍＭＫＣ ｌと０．０１％ゼラチンと２ｍＭ　ＭｇＣｌ２と０゜２ｍＭ　ｄＮＴＰと０．８ ｔｔｇの各プライマーとを含む１００μｌの最終量で混合した。次いで、２．５ ＵのＴａｑＩ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ） を加え、該混合物を３０ａ　ｌの鉱油（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）で覆った。ＤＮＡ　Ｔ ｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）でイン キュベーションを行った。１サイクルは、変性ステップ（９４℃で１分間）、ア ニーリングステップ（６０℃で２分間）及び伸長ステップ（７２℃で３分間）か らなる。３０サイクル後、各反応混合物の１０μｍアリコートを１．５％アガロ ースゲル上での電気泳動にかけて、増幅産物の正確な構造を確認した。 増幅ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ制限Ｍ１３ｍｐ　１８　（ＮＥＷ 　ＥＮＧＬＡＮＤ　Ｂ　Ｉ　０ＬＡＢＳ。 Ｂｅｖｅ　ｒ　Ｉ　ｙ、ＭＡｌ及びＹａｎ　ｉ　ｓ　ｃｈ−Ｐｅ　ｒ　ｒ。 ｎら（１９８５）、“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｍ１３　ｐｈａｇｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ 　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍ１３ｍｐ１８　ａｎｄ　ｐＵＣ１９ｖ ｅｃｔｏｒｓ、Ｇｅｎｅ　３３：１０３参照）。 組換えファージ由来の一本鎖ＤＮＡを、サポリンコーディング配列の内部点（ｉ ｎｔｅｒｎａｌ　ｐｏｉｎｔ）に基づ（オリゴヌクレオチドを用いて配列決定し た（Ｂｅｎｎの９個が配列決定され、これらを比較した。９個の配列決定クロー ンのうち５個が、それぞれ配列番号３〜７に示されているような非反復配列を有 していた。これらのクローンを、Ｍ１３ｍｐ　１８−Ｇ４、−Ｇｌ、−Ｇ２、− Ｇ７及び−６９と命名した。これらのクローンはいずれも、サポリンコーディン グ配列全部と、天然サポリンＮ末端リーダーペプチドをコードするＤＮＡの４５ 個のヌクレオチドとを含んでいる。 Ｃ，ｐＯＭＰＡＧ４プラスミドの構築：実施例１．８．２の配列番号３クローン を含むＭ１３ｍｐ１８−Ｇ４をＥｃｏＲＩで消化し、得られたフラグメントを、 実施例１．Ａ、２に記載の方法で、ベクターｐｒＮ　−１１１ｏｍｐＡ２　（例 えば、Ｉｎｏｕｙｅの米国特許第４，５７５．０１３号、及びＤｕｆｆａｕｄら （１９８含むサポリンコーディングＤＮＡが細菌ｏｍｐＡ遺伝子のリーダーペプ チドセグメントに融合されるように実施した。 得られたプラスミドｐＯＭＰＡＧ４は、Ｉｐｐプロモータ腸菌１ａｃプロモータ ーオペレーター配列（ｌａｃ　Ｏ）と、互いに且つサボリン及び配列番号３に示 されている天然Ｎ末端リーダーコーディングＤＮＡに作動可能なように結合され ている大腸菌ｏｍｐＡ遺伝子分泌シグナルとを含む。該プラスミドは、大腸菌１ ａｃリプレツサー遺伝子（１ａｃＩ）も含む。 それぞれ配列番号４〜７を含む実施例ｉ、８．２で得たＭ１３ｍｐ１８−Ｇｌ、 −Ｇ２、−Ｇ７及び−Ｇ９クローＩ　ｏｍｐＡ２に連結する。その結果得られた プラスミド、標識ｐ　ＯＭ　Ｐ　Ａ　Ｇ　１、ｐＯＭＰＡＧ２、ｐＯＭＰＡＧ７ 、ｐＯＭＰＡＧ９を、プラスミドｐＯＭＰＡＧ４について説明したようにスクリ ーニングし、発現させ、精製し、特徴解析する。 ＩＮＶｌαコンピテント細胞をｐＯＭＰＡＧ４で形質転換し、実施例１．Ａ、２ に記載の方法を用いて単離ｐＯＭＰＡＧ４プラスミドを大量に製造するために、 所望のプラスミド構築物を含む培養物を更に増殖させた。 ｐＯＭＰＡＧ４形質転換大腸菌細胞を、サボリン含有タンパク質の発現がｌａｃ リプレッサーによって対数増殖期の間又は最後にＯ，Ｄ、　まで抑制されるよう な条件下で増殖させ、その後Ｉ　ＰＴＧを加えてサポリンコーディングＤＮ　Ａ の発現を誘発した。 ｐＯＭＰＡＧ４形質転換大腸菌細胞の大バッチ培養物を形成するために、プラス ミドｐＯＭＰＡＧ４で形質転換したＪＡ２２１大腸菌細胞を、１２５ｍｇ／ｍｌ アンピシリン含有ＬＢブイヨン（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃ。 ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ参照）中で一晩（約１６時間）培養し たものを、７５０ｍ１の１２５ｍｇ／’ｍｌアンピシリン含有ＬＢブイヨンを入 れたフラスコ内で１　：　１００に希釈した。５５０　ｎｍの光学密度が分光光 度計で測定して０．９に到達するまで、細胞を３７℃で振盪しながら対数期で増 殖させた。 第二のステップでは、Ｉ　ＰＴＧ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を最終濃度０．２ｍＭで 加えることにより、サボリン発現を誘発した。誘導された培養物を更に２時間増 殖させ、次いで遠心分離（２５分間、６５００ｘｇ）で回収した。細胞ペレット を水冷１．０Ｍトリス、ｐ）（９，０１２ｍＭ　ＥＤＴＡ（ペレット１ｇ当たり １０ｍ１添加）に再懸濁した。再懸濁した材料を氷上に２０〜６０分間維持し、 次いで遠心分離して（２０分間、６５００Ｘｇ）、上清に対応する大腸菌の細胞 周縁質フラクションを、ペレットに対応する細胞内フラクションから分離した。 実施例１．Ｄ、の細胞周縁質フラクションを、ホウ酸塩緩衝塩水（ＢＢＳ　：　 ５ｍＭホウ酸、１．２５ｍＭボラックス、１４５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８， ５）に対して透析した。透析物を、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ　１０に結合し且つ約０． ５ｍｌ／分の流速でＢＢＳ中で平衡化した、Ｌａｐで得た抗すポリン抗体のイム ノアフィニテイ力ラム（０゜５ｘ２ｃｍ）に充填した。該カラムを、素通り画分 の２８Ｑｎｍの吸光度がベースライン値（ｂａｓｅ　］　１ｎｅ）に低下するま でＢＢＳで洗浄した。次いで、抗体結合サボリンを含んでいるカラムを１．０Ｍ 酢酸で溶離し、０．５ｍｌフラクションを、Ｑ、３ｍｌの２Ｍアンモニア水、ｐ Ｈ１０を入れた管内に回収した。フラクションをＥＬ　Ｉ　ＳＡで分析した（例 えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍ。 Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ。 ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｌａｂ。 ｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ参照 ）、ＥＬＩＳＡのピークフラクションを実施例１．Ａ、２に記載のようにウェス タンブロッティングで分析すると、天然サポリンよりやや大きい分子量の単一バ ンドが観察された。ＥＬ　Ｉ　ＳＡでの検査でサボリンタンパク質を含んでいた フラクションを、更に精製するためにプールした。 ２　逆相高速液体クロマトグラフィー精製細胞周縁質に分泌したサポリンを更に 精製するために、実施例１．Ｅ、１のプールしたフラクションを水中０．１％ト リフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）で１：１で希釈し、２０％アセトニトリル、水中 ０，１％ＴＦＡで平衡化したｖｙｄａｃ　Ｃ４カラム（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ａｎａ ｌｙｔｉｃａｌ）で逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ｌこかけた。 タンパク質を６０％アセトニトリルまでの２０分間勾配で溶離した。該ＨＰＬＣ では、実施例’１．Ｅ、１１こ記載のようにウェスタンプロ・ソトで分析した特 に抗ＳＡＰ抗血清に対して免疫反応性を示した唯一の領域である単一ピークが得 られた。試料をＥＬ　Ｉ　ＳＡでア・ツセイした。Ｌａうに、気相シーケンサ− （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ　ｅｍｓ）でのエドマン分解により配列分析 を行った。結果は、成熟天然サポリン（配列番号３：残基−１２〜−７）の最初 のアミノ酸バリンの前のＮ末端サポリン１ノーグーの７〜１２アミノ酸の長さが 異なる５個のポリペプチドカ罵得られたことを示した。Ｎ末端延長変異体は総て 、細胞毒活性を保持していた。天然リーダーの大きさは１８残基であり、これは 天然シグナルペプチドが細菌ブロモ・ソシング酵素によって適当にプロセスされ ないことを意味する。しかしながら、ｏｍｐＡシグナルは適当にプロセスされた 。 Ｆ、細胞内可溶性サポリンの精製 シトモル可溶性サポリンタンすク質を精製するため（こ、前記実施例１．Ｅ、の 細胞内フラクションに由来するペレットを溶解緩衝液（３０ｍＭｔ−リス、２ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、０゜１％トリトンＸ−１００、ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＰＭＳＦ。 １０μｇ　／　ｍ　ＩペプスタチンＡ１１０μｇアプロチニン、μｇ　／　ｍ　 １０イペプチン及び１００μｇ／ｍｌリゾチーム、元のペレット１ｇ当たり３． ５ｍ１）に再懸濁した。細胞を溶解するために、該懸濁液を室温で１時間静置し 、次いで液体窒素中で凍結し、３７℃の浴中で３回解凍し、次いで２分間音波処 理した。溶解物を１１，５００Ｘｇで３０分間遠心分離した。上演を除去し貯蔵 した。ペレットを同量の溶解緩衝液に再懸濁し、前述のように遠心分離し、得ら れた第二の上清を第一の上清と一緒にした。プールした上清をＢＢＳに対して透 析し、実施例１．Ｅ、１に記載のようにイムノアフィニティ力ラムでクロマトグ ラフィーにかけた。この物質も細胞毒活性を保持していた。 Ｇ、細胞毒活性に関するアッセイ ヌクレアーゼ処理したウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒ。 ｍｅｇａ）中の無細胞タンパク質合成を測定するｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイで、 組換えサポリンのＲＩＰ活性を天然ＳＡＰのＲＩＰ活性と比較した。実施例１． Ｅ、１で得たイムノアフィニティ精製すボリンの試料をＰＢＳ中で希釈し、５μ ｍ試料を氷上で、３５μＩのウサギ網状赤血球溶解物と、０．５μｍのブロムモ ザイクウィルス（Ｂ　ｒ　ｏｍｅ　Ｍｏ５ａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ、１ｍＭ のロイシン無含有アミノ酸混合物、５μＣｉのトリチウム化ロイシン及び３μｍ の水を含む１０μｌの反応混合物とに加えた。 アッセイ管３０℃の水浴中で１時間インキュベートした。 鎖管を氷に移し且つ５μｍのアッセイ混合物を三つ組みでＭｉｌｌｉｔｉｔｅｒ 　ＨＡ　９６ウエル瀘過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウェル内の７５μｍ のＩＮ水酸化ナトリウム、２．５％過酸化水素に加えることにより、反応を停止 させた。試料から赤色が消えたら、各ウェルに３００μｌの水冷２５％トリクロ ロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、プレートを更に３０分間氷上に静置した。Ｍｉｌｌｉ ｐ。 ｒｅ真空ホルダーで真空濾過を行った。ウェルを３００μ夏の水冷８％ＴＣＡで ３回洗浄した。乾燥後、環状濾紙を９６ウエルプレートから取り出しくｐｕｎｃ ｈ　ｏｕｔ）、液体シンチレーション法で計数した。 組換え及び天然サボリンのＩＣｓ、は約２０ｐＭであった。 従って、組換えサボリン含有タンパク質は、天然サボリンと比較して、完全なタ ンパク質合成阻止活性を有する。 大腸菌株ＢＬ２１　（ＤＥ３）　、ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙ　ｓ　Ｓ、　Ｈ ＭＳ　１７４　（ＤＥ３）及び８ＭＳ１７４　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳは、ＮＯＶ ＡＧＥＮＳＭａｄ　ｉ　ｓ　ｏｎ、ＷＩから購入した。下記のプラスミドｐＦｃ ８０は、ＷＩＰＯ国際特許出願第ＷＯ９０１０２８００号に記載されているが、 相違点として、本発明細書中のｐＦｃｇＱと称するプラスミドのｂＦＧＦコーデ ィング配列は、配列番号１２、ヌクレオチド１〜４６５に示されている配列を有 する。 本明細書に記載のプラスミドは、ｐＦｃ８０を出発材料として、又はＦＧＦコー ディングＤＮＡ　（配列番号１２）に結合したＣＩＩリポソーム結合部位（配列 番号１５）を含むフラグメントを出発材料として製造し得る。 ２、ＤＮＡの操作 本発明で使用する制限酵素及び修飾酵素はＵ、Ｓ、Ｎａｔｉｖｅ　ＳＡＰで市販 されており、化学的結合ｂＦＧＦ−３ＡＰと、ＳＡＰ及びＦＧＦに対するウサギ ポリクローナル抗血清は、ｌ、ａｐｐ　ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ 、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、１２９：９３４−９４２（１９８５）及びＬａｐｐｉら 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ。 ｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、１６０：９１７−９２３（１９８９）に記載の 方法で得た。ｐＥＴシステム誘発対照はＮ０ＶＡＧＥＮ、Ｍａｄ　ｉ　ｓｏｎ、 ＷＩから購入した。 種ｋＯ）構築物の配列決定は、Ｕｎｉｔｅｄ　ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの５ｅＱｕｅｎａｓｅキツト（バージョン２．０ ）を製造業者の指示通りに使用して行った。プラスミドの微量調製及び大量調製 、コンピテント細胞の製造、形質転換、Ｍ１３操作、細菌培地、ウェスタンブロ ッティングは、ルーチンの方法を用いて実施した（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（ １９ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ参照）。ＤＮＡフラグメントの精製は、Ｂｉｏ　１０１から購入したＧｅｎ ｅｃｌｅａｎ　ＩＩキ・ソトを用（１て行った。ＳＤＳゲル電気泳動はＰｈａｓ ｔｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で実施した。 Ｂ、　ＦＧＦ−３ＡＰ融合タンパク質をコードするプラスミドの構築 １、ＦＧＦに結合したＣＩリポソーム結合部位をコードするＤＮＡを含むＦＧＦ ＭＩ３の構築 Ａｍｅｒｓｂａｍ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発システム２．１を用いて、部 位特異的突然変異誘発法により、実施例１．Ｂ、２．に記載のように製造したＳ ＡＰコーディングＤＮＡＳＭ１３ｍｐ１ｇ−Ｇ４クローンに、Ｎｃｏｌ制限部位 を導入した。ＮｃｏＩ制限部位を形成するために使用したオリゴヌクレオチドは ３８０Ｂ自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて 合成し、配列番号８−Ｃ＾＾Ｃ＾＾ＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＴＣとして示 した。 Ｎｃｏ１部位を含む該オリゴヌクレオチドは、配列番号３、ヌクレオチド３２〜 ５３で元のＳＡＰ含有コーディング配列を置換した。得られたＭ１３ｍｐ　１８ −Ｇ４誘導体をｍｐＮＧ４と命名する。 ストップコドンが除去されたｂＦＧＦコーディング配列を製造するために、ＦＧ ＦコーディングＤＮＡｔ−Ｍ１３ファージにサブクローニングし、部位特異的突 然変異誘発にかけた。プラスミドｐＦｃ８０は、ｐＤｓ２０のヌクレオチド２４ ４０と２８８０との間のｇａ　ＩＫの遠位末端に余分な４４０ｂｐを含むという 点を除いて、プラスミドｐＫＧ１８００　（Ｂｅｒｎａｒｄｉら（１９９０）Ｄ ＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　１：１４７−１５０、及びＭｃＫｅｎｎｙら（１９８ １）Ｇｅｎｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　２：Ａ ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｂｙ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ 　Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｃｈｉｒｉｋｊｉａｎら編、Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　 Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｐＤ、３８３− ４１５参照）とほぼ同じである、ｐＤｓ２０　（例えばＤｕｅｓｔｅｒら（１９ ８２）Ｃｅ　Ｉ　Ｉ　３０　：　８５５−８６４、米国特許第４．９１４，０２ ７号、第５．０３７，７４４号、第５゜１００．７８４号及び第５．１７８，２ ６１号、ＰＣＴ国際出願第Ｗ０　９０１０２８００号、並びに欧州特許出願第Ｅ Ｐ　２６７７０３　Ａ１号参照）の誘導体である。プラスミドｐＫＧ１８００は 、アンピシリン耐性遺伝子と複製起点とを含むｐＢＲ３２２の２８８０ｂｐのＥ ｃｏＲＩ−ＰｖｕｌＩを含んでいる。 プラスミドｐＦｃ８０は、ｇａ　ＩＫ遺伝子全体を配列番号１２のＦＧＦコーデ ィングＤＮＡで置換し、ｔｒｐプロモーター（配列番号１４）と、ＦＧＦコーデ ィングＤＮＡの上流にあって該ＤＮＡに作動可能なように結合しているバクテリ オファージλＣＩＩリポソーム結合部位（配列番号１５、例えばＳｃｈｗａｒｚ ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　２７２：４１０参照）とを挿入することによって 、ｐＤＳ２０から製造した。Ｔｒｐプロモーターはプラスミド１）ＤＲ７２０（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から得ることができ、 又は配列番号１４に従って合成し得る。プラスミドｐＦｃ８０はプラスミドｐＳ Ｄ２０の２８８０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ７ラグメント、Ｔｒｐプロモー ター領域（配列番号１４）：Ｌ逗ＲＩ ＡＡＴｒＣＣＣＣＴＧＴｒＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴｒＡ ＡＣ↑ＡＧＴＡＣＧＣＡＧＣＴｒＧＧＣＴＧＣＡＧとＣＩＩリポソーム結合部位 （配列番号１５）：とをコードする合成５ａｌｌ−Ｎｄｅｌフラグメントを含む 。 下記の処理によってＦＧＦコーディングＤＮＡをｐＦＣ８０から除去した。ｐＦ ｃ８０プラスミドをＨｇａｌ及び５ａｉｌで消化した。その結果、ＦＧＦコーデ ィングＤＮＡに結合したＣＩＩリポソーム結合部位を含むフラグメントが得られ る。得られたフラグメントをフレノウ試薬で平滑末端化し、Ｓｍａｌで開き且つ 平滑末端連結のためにアルカリホスファターゼで処理しておいたＭ１３ｍｐ１８ 内に挿入した。ストップコドンを除去するために、次のオリゴヌクレオチド（配 列番号９）： ＧＣＴＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡを使用し、前述のようにＡｍｅ　ｒ　 ｓ　ｈ　ａｍキットを用いて、ＯＲＩマイナス方向の挿入物を突然変Ｒ１！発し た。配列番号９は、ＦＧＦカルボキシ末端セリンコドンとＮｃｏＩ制限部位との 間に１ヌクレオチドを含み、配列番号１０を有する下記の野生型ＦＧＦコーディ ングＤＮＡ　：ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＡＧＣＴＧＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＡＧ＾Ａｌａ 　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　５ＴＯＰ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｒｇを置換した。 その結果得られた、ｂＦＧＦのカルボキシ末端セリンコドンの後の天然ストップ コドンを欠失したＭｌ　３ｍｐ　１８突然変異誘導体をＦＣＦＭ１３と命名した 。ＦＧＦＭ１３の突然変異誘発領域（ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ） は正確な配列（配列番号１１）を含んでいた。 ２、ＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質をコードするプラスミドｐＦＳ９２　（ＰＺ ＩＡ）、ＰＺＩＢ及びＰＺＩＣの製造して、ストップコドンが置換されたｂＦＧ Ｆコーディング配列に結合したＣｌｌリポソーム結合部位を含むフラグメントを 得た。 サポリンコーディング配列を含むＭｌ　３ｍｐ　１８誘導体ｍｐＮＧ４も制限エ ンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＳａｃ■で切断し、ＦＧＦＭ１３由来のｂＦＧＦ コーディングフラグメントを、融合タンパク質ｂＦＧＦ−３ＡＰをコードするＤ ＮＡへの連結によってＭ１３ｍｐ　１８誘導体に挿入し、ＦＧＦ−ＳＡＰ融合遺 伝子に結合したＣ１ｌリポソーム結合部位を含むｍｐＦＧＦ−ＳＡＰを製造した 。前記融合遺伝子の配列は配列番号１２に示されており、ＦＧＦタンパク質カル ボキシ末端及びサボリンタンパク質アミノ末端が、二つのアミノ酸ＡＩａＭｅｔ をコードする６個のヌクレオチド（配列番号１２及び１３、ヌクレオチド４６６ 〜４７１）によって分離されていることを示す。 プラスミドｍｐＦＧＦ−８ＡＰをＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、その結果得 られた、ｂＦＧＦ−３ＡＰコ一デイＶＡＧＥＮＳＭａｄ　ｉ　ｓｏｎ、ＷＩから 入手可能；該プラスミドの説明については米国特許第４．９５２．４９６号、に 連結した。得られたプラスミドをｐＦＳ９２と命名した。 これをＰＺＩＡと改名した。 プラスミドｐＦＳ９２　（又はＰＺＩＡ）はＤＮＡ、塩基性ＦＧＦタンパク質（ 配列番号１２）全体、２アミノ酸長さの接続ペプチド、及び成熟ＳＡＰタンパク 質のアミノ酸１〜２５３を含む。プラスミドｐＦＳ９２は更に、ＦＧＦ−ＳＡＰ 融合タンパク質に結合したＣ１ｌリポソーム結合部位と、ｐＥＴ−１１ａ由来の Ｔ７プロモーター領域とを大腸菌株ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ　（ＮＯＶ ＡＧＥＮ、Ｍａｄ　ｉ　ｓｏｎ、ＷＩ）を、製造業者の指示と実施例２、Ａ、２ に記載の方法とに従って、ｐＦＳ９２で形質転換した。 シトトリホスフェートとフレノウＤＮＡポリメラーゼとの添加によって末端を修 復し、次いでＮｄｅｌで消化して、Ｃｌｌリポソーム結合部位をもたないＦＧＦ コーディングＤＮＡを取り出した。このフラグメントを、ＢａｍＨＩ消化したｐ ＥＴｌ　ｌ　ａ内に連結し、末端を修復すべく処理し、ＮｄｅＩで消化した。得 られたプラスミドをＰＺＩＢと命名した。ＰＺＩＢは、Ｔ７転写ターミネータ− とｐＥＴ−１１ａリポソ一ム結合部位とを含む。 大腸菌株ＢＬ２１　（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、 製造業者の指示と実施例２、Ａ、２に記載の方法とに従って、ＰＺＩＢで形質転 換した。 Ｃ，プラスミドｐｚｉｃ アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置換することにより、ＰＺ ＩＢからプラスミドＰＺＩＣを製造した。 プラスミドｐＦＳ９２をＥｃｏＲＩ及びＮｄｅＩで消化して、Ｃｌｌリポソーム 結合部位を含まないＦＧＦコーディングＤＮＡを取り出し、末端を修復した。該 フラグメントを、ＢａｍＨ消化し且つ末端修復処理したｐＥＴ　１２ａ内に連結 した。得られたプラスミドをＰＺＩＤと命名した。 ＰＺＩＤは、融合タンパク質をコードするＤＮＡに作動的に結合したＯＭＰ　Ｔ 分泌シグナルをコードするＤＮＡを含む。 大腸菌株ＢＬ２１　（ＤＥ３）　、ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳＳＨＭＳ１ ７４　（ＤＥ３）及びＨＭＳ１７４　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ　（ＮＯＶＡＧＥＮ 、Ｍａｄ　ｉ　ｓｏｎ、Ｗｌ）を、製造業者の指示と実施例２．Ａ、２に記載の 方法とに従って、ＰＺＩＤで形質転換した。 Ｃ０組換えｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の発現前述の２段階方法を用いて組 換えｂＦＧＦ−ＳＡＰタンパク質を産生じた（以後ｂＦＧＦ−５ＡＰ融合タンパ ク質と称する）。 １、ｐＦＳ９２　（ＰＺＩＡ）からのｒｂＦＧＦ−ＳＡＰの発現 アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）と を含むＬＢブイヨン３１に、実施例２．Ｈに従って得た一晩の培養物（１：１０ ０希釈）に由来するｐＦＳ９２プラスミド含有細菌細胞（株ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ）を接種した。細胞を、インキュベーターシエイ力−で３７℃で、Ｏ Ｄ、。。が０．７になるまで増殖させた。ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ。 Ｓ　ｔ、Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、ＭＯ）を最終濃度０．２ｍＭで加え、増殖を１．５時 間続け、１．５時間が経過した時点で細胞を遠心分離した。 後続の実験で、ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を３７℃ではなく３０℃で 増殖させると収率が増加することが判明した。細胞を３０℃で増殖させる場合は 、誘導の前に１．５のＯＤ、。。まで増殖させる。誘導後に、増殖を約２〜２． ５時間続け、この時間が経過した時点で細胞を遠心分離により回収する。 ペレットを溶解溶液（ペレット１６ｇ当たり４６〜６０ｍ１：２０ｍＭ）リス、 ｐＨ７，４，５ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　。 １０％スクロース、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍ１のリゾチーム、１ ０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ　／　ｍ　ｌのロイペプチン、１０μｇ 　／　ｍ　１のペプスタチンＡ及び１ｍＭ　ＰＭＳＦ）に再懸濁し、撹拌しなが ら室温で１時間インキュベートした。該溶液を冷凍し、３回解凍し、２．５分間 音波処理した。該懸濁液を１２，０００×ｇで１時間遠心分離し、得られた第一 の上清を保存し、ペレットを同量のリゾチーム無含有溶解溶液に再懸濁した。 再懸濁した物質を再び遠心分離して第二の上清を得、これら二つの上清をプール し、ホウ酸塩緩衝塩水、ｐＨｓ、３に対して透析した。 ２、ＰＺＩＢ及びＰＺＩＣからのｂＦＧＦ−８ＡＰ融合タンパク質の発現 アンピシリン（１００μｇ　／　ｍ　Ｉ　）を含む２５０ｍ１のＬＢ培地に、Ｐ ＺＩＢの新しいグリセロールスト、ツクを接種した。細胞を、インキュベーター シエイ力−で３０℃で、ＯＤ　８＠０が０．７になるまで増殖させ、４℃で一晩 貯蔵した。翌日、細胞をペレット化し、新しいＬＢ培地（アンピシリン無含有） に再懸濁した。細胞を５つの１１ノくツチに分割し、ＯＤ６．０が１．５になる までインキュベーターシエイ力−で３０℃で増殖させた。ＩＰＴＧ（ＳＩＧＭＡ 　ＣＨＥＭＩＣＡＬ、Ｓ　ｔ、Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、ＭＯ）を最終濃度０゜１ｍＭで 加え、増殖を約２〜２，５時間続け、この時間が経過した時点で細胞を遠心分離 により回収した。 誘導の前にＰＺＩＣを増殖させるために、アンピシリンに代えてカナマイシン（ ５０μｇ　／　ｍ　＋　）を含む培地で細胞を増殖させる。 ３、　ＰＺＩＤからのｂＦＧＦ−３ＡＰ融合タンノ々り質の聚男 アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２５０ｍ１のＬＢ培地に、ＰＺＩＢの 新しいグリセロールスト・ツクを接種した。細胞をＯＤ　ａ。。が０．７になる までインキュベーターシエイカーで３０℃で増殖させ、４℃で一晩貯蔵した。 翌日、細胞をペレット化し、新しいＬＢ培地（アンピシリン無含有）に再懸濁し た。該細胞をＬＢ培地の１ｉｔ＜、ソチに接種し、ＯＤ６゜。が１．５になるま でインキュベーターシエイ力−で３０℃で増殖させた。Ｉ　ＰＴＧ　（Ｓ　ＩＧ ＭＡＣＨＥＭＩＣＡＬ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を最終濃度Ｑ、１ｍＭで加え 、増殖を約２〜２．５時間続け、この時間が経過した時点で細胞を遠心分離によ り回収した。 細胞ペレットを水冷１．０Ｍｌ−リス、ｐＨ９，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡに再懸濁 した。再懸濁した物質を更に２０〜６０分間氷上に維持し、次いで遠心分離にか けて、細胞内フラクション（ペレット）から細胞周縁質フラクション（上清）を 分離した。 Ｄ、ｂＦＧＦ−３ＡＰ融合タンパク質のアフイニテイ精製実施例２．ＣのｂＦＧ Ｆ−ＳＡＰ融合タンパク質を含む３Ｑｍｌの透析溶液を、１０ｍＭトリス、ｐＨ ７，４（緩衝液Ａ）中０．．１５Ｍ　ＮａＣ１で平衡化したＨｉＴｒａｐヘパリ ン−セファロースカラム（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ。 Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）にかけた。該カラムを、平衡化緩衝液、緩衝液 Ａ中０．６Ｍ　ＮａＣｌ、緩衝液Ａ中１．０Ｍ　ＮａＣ１で順次洗浄し、最後に 緩衝液Ａ中２ＭＮａＣ１で１．０ｍｌフラクションに溶離した。試料をＥＬＩＳ Ａ法でアッセイした。 結果は、ｂＦＧＦ−３ＡＰ融合タンパク質が、天然及び組換え産生ｂＦＧＦと同 じ濃度（２Ｍ　ＮａＣ１）でヘパリン−セファロースカラムから溶離することを 示している。 これは、ヘパリン親和性がｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質において保持されて いることを意味する。 １、アフィニティ精製ｂＦＧＦ−３ＡＰ融合タンパク質の２０％ゲルを用いるＰ ｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）でＳＤＳゲル電気泳動を実 施した。Ｐｈａｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｒシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を製造 業者の指示通りに用いて、電気泳動タンパク質をニトロセルロースにトランスフ ァーすることにより、ウェスタンプロットを実施した。ＳＡＰ及びｂＦＧＦに対 する抗血清を１　：　１０００の希釈度で使用した。西洋ワサビペルオキシダー ゼ標識抗１ｇＧを第二抗体として使用した（Ｄａｋ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉ ｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、ｐｐｌ−３３８）。 抗ＳＡＰ及び抗ＦＧＦ抗血清は、ＳＡＰ　（３０，０００）及びｂＦＧＦ　（１ ８，０００）の個々の分子量の合計に相当する約４８，０００ｋｄの分子量を有 するタンパク質に結合した。 ａ、無細胞タンパク質合成に対するｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合ＦＧＦ−３ＡＰ化学結 合体と比較したｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質のＲＩＰ活性を、実施例１．Ｇ に記載のようにアッセイした。結果は、ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質のＩＣ ，。が約０．２ＯＭであり、化学的結合体ＦＧＦ−８ＡＰのＩＣ５Ｏが約０．１ ２５Ｏｍであることを示した。 ｂ、ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質の細胞毒性Ｐｒｏｍｅｇａ　（Ｍａｄ　１ ｓｏｎ、Ｗｌ）のＣｅ１ｌＴｉｔｅｒ９５細胞増殖／細胞毒性アツセイで細胞毒 性の実験を行った。ヒト黒色腫細胞系であるＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞（ＡＴＣＣ から入手可能）を、９０μＩ　ＨＤＭＥＭ及び１０％ＦＣＳ中で、９６ウエルプ レートの各ウェル当たり約１．５００個でブレーティングし、３７℃、５％Ｃ０ ２で一晩インキユベートした。翌朝、１０μｌの培地のみ、又は種々の濃度のｒ ｂＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質、塩基性ＦＧＦもしくはサボリンを含む１０μ ｌの培地をウェルに加えた。該プレートを３７℃で７２時間インキュベートした 。インキュベーション時間が経過した時点で、Ｐｒ得る染料ＭＴＴの取込み及び 変換を測定することにより、生存細胞の数を調べた。該ＭＴＴ溶液１５μｌを各 ウェルに加え、インキュベーションを４時間続けた。次いで、Ｐｒｏｍｅｇａキ ットの一部として与えられた標準的可溶化溶液１００μｌを各ウェルに加えた。 プレートを室温で一晩静置し、５６０Ｏｍの吸光度をＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートリ ーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＰＬＵＳ。 ＩＮＣ，Ｆｌｏｗ、Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、ＣＡ）で読み取った。 結果は、化学的ＦＧＦ−ＳＡＰ結合体のＩＤ５ｏが０．　３ＯＭであり、ｂＦＧ Ｆ−ＳＡＰ融合タンパク質のＩＤ、。が類似のＱ、５ＯＭであり、細胞表面に結 合できない非結合ＳＡＰのＩＤ５ｏが２００ＯＭであることを示した。従ってｂ ＦＧＦ−ＳＡＰ融合タンパク質は、インターナライズされるときに、化学的に結 合したＦＧＦ−ＳＡＰとほぼ同じ細胞毒活性を有すると考えられる。 種々の変形は当業者には明らかであろうと思われるため、本発明は「請求の範囲 」によってのみ限定されるものとする。

【配列表】

配列番号＝１ 配列の長さ：３０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス＝ＮＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ存在位置：６．．１１ 他の情報二標準的名称＝ｒＥｃｏＲＩ制限部位」配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１２．．３０ 他の情報二機能＝ｒＮ末端延長」／産物＝「天然サポリンシグナルペプチド」 配列 ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴ　ＣＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＡＡＴ配列番号＝ ２ 配列の長さ＝３０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 特徴を表す記号＋ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ存在位置：６．．１１ 他の情報：標準的名称＝ｒＥｃｏＲＩ制限部位」配列の特徴 特徴を表す記号：　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ存在位ＩＩＩ：２３．．２５ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｒアンチセンスストップコドン」配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：２６．．３０ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｒ成熟ペプチドのカルボキシル末端に対するアンチセンス 」 配列 ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴ　ＣＧＣＣＴＣＧＴＴＴ　ＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧ配列番号 ＝３ 配列の長さ＝８０４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置：１．．８０４ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．８０４ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｒ実施例１．Ｂ、２のクローンＭ１３　ｍｐ１８−Ｇ４に 対応するヌクレオチド配列」 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：４６．．８０４ 他の情報：産物＝「サポリン」 配列 配列番号：４ 配列の長さ＝８０４塩基対 配列の型：核酸 鏑の数二二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：　ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 配列の特徴 特徴を表す記号＋ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．８０４ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｒ実施例１．Ｂ、２のクローンＭ１’３　ｍｐ１８−Ｇｌ に対応するヌクレオチド配列」 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：　４６．．８０４ 他の情報：産物＝「サボリン」 配列 配列番号：５ 配列の長さ：８０４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー二不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．８０４ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．８０４ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｒ実施例１．８．２のクローンＭ１３　ｍｐ１８−Ｇ２に 対応するヌクレオチド配列」 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：　４６．．８０４ 他の情報二産物＝「サボリン」 配列 配列番号＝６ 配列の長さ二８０４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポ゛ロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．８０４ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置＋１．．８０４ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｒ実施例１．Ｂ、２のクローンＭ１３　ｍｐ１８−Ｇ７に 対応するヌクレオチド配列」 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：４６．．８０４ 他の情報：産物＝「サポリン」 配列 配列番号＝７ 配列の長さ：８０４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー二不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．８０４ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ存在位置：１．．８０４ 他の情報：ｎｏｔｅ＝ｒ実施例１．Ｂ、２のクローンＭ１３　ｍｐ１８−Ｇ９に 対応するヌクレオチド配列」 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置・４６．．８０４ 他の情報：産物＝「サボリン」 配列 配列番号：８ 配列の長さ：２２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー；直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ存在位置：１０．．１５ 他の情報二標準的名称＝　「Ｎｃｏ　Ｉ制限酵素認識部位」配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１５．．２２ 他の情報：産物＝「サポリンタンパク質のＮ末端」配列 ＣＡＡＣ＾＾ＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡ　ＴＣ配列番号二９ 配列の長さ：１９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎮 トポロジー二直鎮状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ存在位置：１１．．１６ 他の情報二標準的名称＝ｒＮｃｏ１ｍ１Ｎ酵素認識部位」配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位１！：１．．１０ 他の情報二産物＝「成熟ＦＧＦタンパク質のカルボキシ末端」 配列 ＧＣＴ＾＾ＧＡＧＣＧ　ＣＣＡＴＧＧＡＧＡ配列番号＝１０ 配列の長さ：２１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー二不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．１２ 他の情報、産物＝「野生型ＦＧＦのカルボキシ末端」配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ存在位置：１３．．１８ 他の情報：標準的名称＝ｒＮｃｏｌ制限酵素認識部位」配列 ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＡＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡ　Ｇ＾＾１ａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ 配列番号＝１１ 配列の長さ：１０２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置：１．．９６ 他の情報：産物＝　ｒｐＦＧＦＮｃｏ　ＩＪ　／ｎｏ　ｔ　ｅ＝「天然ＦＧＦス トップコドンが除去されたプラスミドｐＦｃ８０と同等」 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ存在位置：２９．．３４ 他の情報二標準的名称＝［’Ｎｃｏｌ制限酵素認識部位」配列 配列番号：１２ 配列の長さ＋１２３０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二重鎮 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置：１．．１２３０ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１．．４６５ 他の情報、産物＝　ｒｂＦＧＦＪ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：４７２．．１２３０ 他の情報；産物＝「サボリン」 配列 配列番号＝１３ 配列の長さ：　１２３０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー不明： 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：　ＣＤＳ 存在位置：　１．．１２３０ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐ−ｅｐｔｉｄｅ存在位置：１．．４６５ 他の情報：産物＝ｒｂＦＧＦＪ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：４７２．．１２３０ 他の情報二産物＝「サポリン」 ＴＣｒ　ＡｃＧ　ＧＣｋ　ＡＴＡ　？Ａｅ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＧＣＣＡＡＡ　Ａ Ａｅ　Ｏｃｅ　Ｇ丁Ｇ　Ｔ’ｆｆ　ｋｋＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴ@１１５２ ｊａｒ　品５　Ａｌａ　ＸＬ＊　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｙ−＾− ｎ　Ｇｌｙ　ＶＲＰｈ・　ｋｅｎ　ＬＹ−＾−ｐ配列番号１４： 配列の長さ＝５９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数；−重鎖 トボロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 ｋｋＴＴｃｃｃｃＴＧ　？ＴＧＡＣＡＡＴ’ＴＡ　ＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＡＯ ＴＴＭＣＴＡ　ＧＴＡＣＯＣＡＧＣＴ　ＴＧＧＣＴＧＣＪＯT９ 配列番号：１５ 配列の長さ：５９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数ニ一本舗 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列 ０ＴＣＯｋＣＣｋＡＧ　Ｃ’Ｔ丁ＧＧＧＣｋＴ＾　Ｃ＾丁ＴＣＡ＾τＣＡ　＾Ｔ τａｒｔλ〒Ｃ丁　＾＾ｃａ八八Ａへへｅ？テ＾Ｃ＾丁＾丁p　５９ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　１／ ２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＮＥ 、ＳＮ。 ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。 ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、 ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、 ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ。 ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　ラツピ、ダグラス・エイアメリカ合衆国、カリフォルニア・９ ２０１４、サン・デイエイ、カミニート・デ・ラス・オラス・１２８４２ （７２）発明者　バーセレミー、イサベルスペイン国、マドリッド・２８０３９ 、エセ・エセ・アー、カレ・レネロス・３９ （７２）発明者　バード、ジエイ・アンドリューアメリカ合衆国、カリフォルニ ア・９２１２２、サン・デイエイ、ビア・ペイペル・５０３９（７２）発明者　 ソスナウスキ、バーバラ・エイアメリカ合衆国、カリフォルニア・９２１１８、 サン・デイエイ、コロナート、アデラ・アベイニュー・１０１３

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．サポリン含有タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離組換えＤ ＮＡフラグメントであって、サポリン含有タンパク質が本質的に、サポリンタン パク質の全部又は一部のアミノ末端に結合したＮ末端延長領域からなり、Ｎ末端 延長領域及びサポリン部分が、サポリン含有タンパク質が真核細胞によるインタ ーナリゼーションの際に細胞毒性を示すように選択されていることを特徴とする 前記ＤＮＡフラグメント。
2. ２．更にプロモーター領域と転写ターミネーター領域とを含み、プロモーター領 域が誘導性プロモーターを含み、プロモーター領域及び転写ターミネーターが独 立して同じ又は異なる遺伝子から選択され、サポリン含有タンパク質をコードす るＤＮＡに作動可能なように結合されている請求項１に記載のＤＮＡフラグメン ト。
3. ３．Ｎ末端延長サポリン含有タンパク質が長さ２〜１５アミノ酸をコードする請 求項１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
4. ４．２〜１５アミノ酸の配列が、サポリンタンパク質の天然分泌シグナル配列の ２〜１５アミノ酸の配列と同じである請求項３に記載のＤＮＡ構築物。
5. ５．Ｎ末端が、細胞表面タンパク質と特異的に作用し合うリガンドを含む請求項 １又は２に記載のＤＮＡフラグメント。
6. ６．リガンドが塩基性ＦＧＦである請求項５に記載のＤＮＡフラグメント。
7. ７．プロモーター領域がｌａｃプロモーターオペレーター（１ａｃＯ）を含む請 求項２に記載のＤＮＡフラグメント。
8. ８．プロモーターがｌｐｐである請求項２に記載のＤＮＡフラグメント。
9. ９．サポリン含有タンパク質のアミノ酸配列が配列番号３、配列番号４、配列番 号５、配列番号６又は配列番号７に示されているものである請求項１又は２に記 載のＤＮＡフラグメント。
10. １０．サポリン含有タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１２又は配列番号１３ に示されているものである請求項１又は２に記載のＤＮＡフラグメント。
11. １１．更に、サポリン含有タンパク質をコードするＤＮＡに作動的に結合した分 泌シグナル配列をコードするＤＮＡも含む請求項１に記載のＤＮＡフラグメント 。
12. １２．分泌シグナルがｏｍｐＡ又はｏｍｐＴである請求項１１に記載のＤＮＡフ ラグメント。
13. １３．プロモーターがＴ７プロモーター又は１ａｃＵＶ５プロモーターである請 求項１２に記載のＤＮＡフラグメント。
14. １４．請求項１から１３のいずれか一項に記載のＤＮＡフラグメントを含むプラ スミド。
15. １５．ｐＯＭＰＡＧ４、ｐＯＭＰＡＧ１、ｐＯＭＰＡＧ２、ｐＯＭＰＡＧ７及び ｐＯＭＰＡＧ９の中から選択される請求項１４に記載のプラスミド。
16. １６．ＰＺ１Ａ、ＰＺ１Ｂ、ＰＺ１Ｃ又はＰＺ１Ｄである請求項１４に記載のプ ラスミド。
17. １７．請求項１４から１６のいずれか一項に記載のプラスミドで形質転換した大 腸菌細胞。
18. １８．請求項１７に記載の細胞を含む生存可能大腸菌細胞の培養物。
19. １９．生物学的に活性なサポリン含有タンパク質を大腸菌内で産生するための方 法であって、請求項１９に記載の細胞を、サポリン含有タンパク質が発現される ような条件下で培養し、サポリン含有タンパク質を単離することを包含する方法 。
20. ２０．前記Ｎ末端延長領域がリガンドを含む請求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記リガンドが増殖因子、ホルモン、又は抗体の細胞結合ドメインである 請求項１９又は２０に記載の方法。
22. ２２．前記リガンドが塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である請求項２０ 又は２１に記載の方法。
23. ２３．サポリンとＮ末端延長領域とを含む単離サポリン含有タンパク質であって 、該サポリン含有タンパク質が真核細胞によるインターナリゼーションの際に細 胞毒性を示すことを特徴とする前記サポリン含有タンパク質。
24. ２４．配列番号３〜７、１２及び１３のいずれかに示されているアミノ酸配列を 含む請求項２３に記載のサポリン含有タンパク質。
25. ２５．２〜約１２アミノ酸のリンカーペプチドを介して塩基性線維芽細胞増殖因 子に結合したサポリンを含む請求項２４に記載のサポリン含有タンパク質。