DE3902157A1

DE3902157A1 - Amphiregulin, verfahren zu dessen herstellung und pharmazeutische mittel

Info

Publication number: DE3902157A1
Application number: DE3902157A
Authority: DE
Inventors: Mohammed Shoyab; Vicki L Mcdonald; Greg Plowman; James G Bradley
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1988-01-25
Filing date: 1989-01-25
Publication date: 1989-07-27
Also published as: IT1229504B; NO890299D0; CN1038126A; IE890207L; AT399720B; ATA14789A; AU2876989A; FR2628109A1; ES2016432A6; YU16989A; IL89033A0; HUT52545A; IL89033A; GR1000849B; DK29989D0; DK29989A; IT8919186A0; IE61146B1; US5830995A; GB2214185B

Description

1. Einleitung

Die vorliegende Erfindung betrifft Amphiregulin, einen bifunktionellen Wachstumsregulationsfaktor, Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung. Die erfindungsgemäßen Proteine zeigen eine starke Inhibition des Wachstums mehrerer tumorabgeleiteter Zellinien, während sie das Zellwachstum mehrerer anderer Zellinien fördern.

Weiterhin wird ein weiterer therapeutischer Anwendungsbereich für diesen bifunktionellen Wachstumsregulator beschrieben, so z. B. für die Behandlung von Wunden und zur Diagnose und Behandlung von Krebs.

2. Stand der Technik

Zelluläres Wachstum und Differenzierung scheint durch eine Vielzahl von stimulierenden, inhibierenden und synergistisch wirkenden Faktoren und Hormonen injiziert, beschleunigt, aufrechterhalten und reguliert zu werden. Die Veränderung und/oder der Zusammenbruch des zellulären homeostatischen Mechanismus scheint die grundlegende Ursache für wachstumsbedingte Erkrankungen einschließlich der Neoplasin zu sein. Wachstumsmodulierende Faktoren sind an einer Vielzahl von pathologischen und physiologischen Prozessen wie Signalübermittlung, Zellkommunikation, Wachstum und Entwicklung, Embryogenese, Immunantwort, Hematopoesin, Überleben von Zellen und Zelldifferenzierung, Entzündungen, Gewebereparatur und Remodellierung, Athereosklerose und Krebs beteiligt. Aufgrund ihrer potientiellen Verwendung bei der Diagnose, Prognose und Behandlung von Krebs besteht ein großes Interesse an deren Isolierung und Charakterisierung sowie an der Aufklärung der funktionellen Mechanismen von wachstumsregulierenden Faktoren. Darüber hinaus kann die Erkenntnis dieser Faktoren zu einem besseren Verständnis von grundlegenden Mechanismen der normalen Wachstumskontrolle und von deren Verlust in Krebszellen führen.

Faktoren wie Epidermal growth factor (EGF), Transforming growth factor-α (TGF), Platelet-derived growth factor (PDGF), Fibroblast growth factor (FGF), Nerve growth factor (NGF), Transforming growth factor-β (TGFb), Insulin growth factor I und II (IGF I, IGF II), Hematopoietic growth Factor, wie das Erythropoietin, Colony stimulating factors (CSF 1 and 2), Interleukine (IL-1 to 6), Interferons (IFNα,β,γ), Tumor necrosis factor α und β (TNF α, β), Leukoregulin, Oncostatin M und weitere weniger definierte Faktoren sind Proteine, welche das Wachstum und die Differenzierung modulieren und werden von verschiedenen Zelltypen entweder unter normalen physiologischen Bedingungen oder als Antwort auf eine exogene Stimulierung produziert. Die meisten dieser Faktoren erscheinen autokrin oder parakrin zu wirken. (Goustin et al., 1986, Cancer Res. 46: 1015-1029; Rozengurt, 1986, Science 234: 161-66; Pardee, 1987, Cancer Res. 47: 1488-1491; Sachs 1986, Sci. Amer. 254: 40-47; Marshall 1987, Cell 50: 5-6; Melcher und Anderson, 1987, Cell 30: 715-720; Clemens und McNurlan, 1985, Biochem. J. 226: 345-360; Nathan, 1987, J. Clin. Invest. 79: 319-326; Sporn und Roberts, 1986, J. Clin. Invest. 78: 329-332; Old, 1987, Nature, 326: 330-331; Beutler und Cerami, 1987, New Eng. J. Med. 316: 379-385; Weinstein, J. Cell. Biochem., 33: 213-224; Zarlling et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9739-9744; Sporn und Todaro, 1985, N. Eng. J. Med. 303: 878-880; Sporn und Roberts, 1985, Nature 313; 745-747).

Biologisch aktive Phorbolester, wie 12-O-Tetradecanoylphorbol- 13-acetat (TPA) sind in vivo wirksame Tumorpromotoren und Auslöser und Modulatoren für eine große Vielzahl biologischer und biochemischer Reaktionen sowohl in vivo als auch in vitro (Blumberg, 1981, Crit. Rev. Toxicol. 9: 153-197; Slaga, 1983, Cancer Surv. 2: 595-612). Seit einiger Zeit ist bekannt, daß TPA das Wachstum der menschlichen Brust-Adenokarzinomzelline MCF-7 inhibiert. Zusätzlich verändert TPA die Morphologie von MCF-7-Zellen insofern, als TPA-behandelte Zellen morphologische Merkmale von sekretorischen Zellen zeigen (Osborne et al., 1981, J. Clin. Invest. 67: 943-951; Valette et al., 1987, Cancer Res. 47: 1615-1620).

3. Kurzfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Amphiregulin, einen wachstusregulierenden Faktor, welcher eine ungewöhnliche Zellwachstum-regulierende Aktivität aufweist. Amphiregulin inhibiert das Wachstum neoplastischer Zellen und verstärkt das Wachstum bestimmter normaler Zellen. Amphiregulin ist ein extrem hydrophiles Glykoprotein mit einem mittleren Molekulargewicht von 22 500 Daltons und ist in zwei unterschiedlichen, allerdings funktionell äquivalenten Formen, einer gekürzten und einer größeren Form zu finden. Mit Ausnahme der zusätzlichen sechs N-terminalen Reste, die in der größeren Form gefunden werden, sind die beiden Formen auf der Aminosäureebene (Fig. 12) absolut homolog. Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Beobachtung daß TPA-behandelte MCF-Z-Zellen ein Glykoprotein freisetzen, welches das Wachstum der epidermalen Krebszellinie A431 und anderer Tumorzellinien inhibiert, aber das Wachstum normaler Human-Fibroblasten und einiger anderer Zellen fördert.

Die vorliegende Erfindung wird anhand von Beispielen beschrieben, worin Amphiregulin nachgewiesen, bis zur Homogenität gereinigt und strukturell und funktionell genau charakterisiert wird. In anderen Beispielen ist die Isolierung und Sequenzierung sowohl von cDNA- und genomischen Klonen beschrieben, welche für den Amphiregulin-Prekursor kodierten. Diese Klone werden zur Herstellung von Expressionsvektoren verwendet, welche in der Lage sind, eine hohe Syntheserate von biologisch aktivem Amphiregulin in transformierten Bakterien und transfizierten eucaryotischen Wirtszellen zu steuern.

Eine große Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für diesen Faktor wird im Rahmen der Beschreibung aufgezeigt.

4. Kurze Figurenbeschreibung

Fig. 1 präparative reversed-phase HPLC von Durchlauf- und Waschfraktion.

Fig. 2 halb-präparative reversed phase HPLC der vereinigten Fraktionen 47 bis 62 aus Fig. 1.

Fig. 3A analytische reversed-phase HPLC von Pool I des vorhergehenden Laufs.

Fig. 3B analytische reversed-phase HPLC von Pool II des vorhergehenden Laufs.

Fig. 4 Gelpermeationschromatographie von Fraktionen aus Fig. 3A und 3B mit Bio-Sil TSK 250-Säulen. Die Chromatographie wurde wie in Abschnitt 6.3.2. beschrieben, durchgeführt.

(A) HPLC der aufkonzentrierten Fraktion 35 (Fig. 3A);
(B) HPLC der aufkonzentrierten Fraktion 36 (Fig. 3A);
(C) HPLC der aufkonzentrierten Fraktion 37 (Fig. 3A);
(D) HPLC der aufkonzentrierten Fraktionen 41 und 42 zusammen (Fig. 3B).

Fig. 5 Analyse von gereinigtem AR und S-pyridyl- ethyliertem-AR (SPE-AR) mit Hilfe von Gelpermeations- HPLC auf Bio-Sil TSK 250-Säulen. Die Chromatographie wurde wie in Abschnitt 6.3.2. beschrieben, durchgeführt. Als Molekulargewichtstandard wurden verwendet Ovalbumin, 43 kD; Chymotrypsinogen A, 25 kD; Ribonuklease 14 kD; und Insulin, 6 kD

(A) AR;
(B) SPE-AR.

Fig. 6 Analyse von AR und SPE-AR auf einer Reversed- Phase Ultrapore RPSC C3-Säule (4,6×75 mm). Es wurde ein Gradient zwischen 0,1% TFA als erstem Lösungsmittel und Acetonitril mit 0,1% TFA als zweitem Lösungsmittel bei einer Flußrate von 1 ml/Min. bei Zimmertemperatur verwendet). Es wurden 1 ml-Fraktionen gesammelt.

(A) AR;
(B) SPE-AR.

Fig. 7 SDS-PAGE-Analyse von AR-Proteinen

(A) ein 15%iges SDS-PAGE-Gel (0,75 mm×18 cm ×15 cm, Bio-Rad) in einem diskontinuierlichem Puffersystem wurde bei einem konstanten Strom von 30 mA entwickelt. Als Molekulargewichtsstandards wurden verwendet: Phosphorylase B, 92,5 kD; BSA, 66,2 kD; Ovalbumin, 43 kD; Carbonanhydrase 31 kD; Chymotrypsinogen A, 25,7 kD; Soyabohnentrypsin-Inhibitor, 21,5 kD; Lactoglobulin, 18,4 kD, Lysozym, 14,4 kD; Aprotonin, 6,2 kD; und Insulin-Untereinheit, 3 kD.
Spur 1: AR,
Spur 2: NG-AR,
Spur 3: SPE-AR,
Spur 4: NG-SPE-AR:
(B) 20%iges STS-PA-GE-Minigel (0,75 mm×10 cm ×7 cm) entwickelt bei einer konstanten Spannung von 200 V. Es wurden die gleichen Molekulargewichtsstandard verwendet.
Spur 1: AR,
Spur 2: NG-AR,
Spur 3: Phospholipase behandelt mit NG-AR getrennt auf rp HPLC.

Fig. 8 IEF-Analyse von ¹²⁵I-markiertem AR. Folgende Standards mit pI-Werten zwischen 4,65 und 9,6 wurden verwendet: Phycocyanin, 4,65; β-Lactoglobulin B, 5,1; Rindercarboanhydrase, 6,1; Human-Carbonanhydrase, 6,5; Pferdemyoglobin, 7,0; Wal-Carboanhydrase 6,5; α-Chymotrypsin, 8,8; und Cytochrom C, 9,6.

Fig. 9

(A) Dosis-Wirkungskurve von AR auf die Inhibition des ¹²⁵I-Deoxyuridin-Einbaus in die DNA von A431-Zellen;
(B) Einfluß von AR auf die Stimulierung des ¹²⁵I-Deoxyuridin-Einbaus in die DNA von von Human-Vorhautfibroblasten (Sadamoto).

Fig. 10 Beeinflussung der ¹²⁵I-EGF-Bindung an fixierte A431-Zellen oder A-431-Plasmamembrane durch Mäuse- EGF und Ar. Die Bindungstests wurden wie in Abschnitt 6.1.5. beschrieben durchgeführt. 100 µl- oder 50 µl-Proben in Näpfen wurden für die Tests mit fixierten Zellen oder Membranen verwendet.

Fig. 11 Analyse der Hydropathizität von AR und Human-EGF (Kyte und Doolittle).

(A) AR (Reste 1-84);
(B) AR (Reste 44-84);
(C) EGF (Reste 1-53);
(D) AR (Prekursor) (Reste 1-252) und EGF (Reste 1-53).

(die Anordnung folgt gemäß Fig. 13 so, daß Cystein, Rest 46 von maturiertem AR dem Cystein- Rest Nr. 6 von maturiertem EGF entspricht).

Fig. 12 Aminosäuresequenz von maturiertem AR und verkürztem AR. Es wurde der Standard Einbuchstabencode für Aminosäuren verwendet:
Alanin (A), Arginin (R), Asparagin (N), Asparaginsäure (D), Cystein (C), Glutamin (Q), Glutaminsäure (E), Glycin (G), Histidin (H), Isoleucin (I), Leucin (L), Lysin (K), Methionin (M), Phenylalanin (F), Prolin (P), Serin (S), Threonin (T), Tryptophan (W), Tyrosin (Y) und Valin (V).

Fig. 13 Vergleich der Aminosäuresequenzen von Amphiregulin (AR) und Mitgliedern der EGF-Oberfamilie

Fig. 14

(A) ¹²⁵I-AR-Bindung an Cellulose (○-○), denaturierter DNA-Cellulsoe (-) und native DNA-Cellulose (∆-∆);
(B) ¹²⁵I-AR-Bindung an Cellulose (○-○) und an DNA-Cellulose (-) wird verglichen mit ¹²⁵I- EGF-Bindung an Cellulose (∆-∆) und an DNA- Cellulose (∇-∇)

Fig. 15 synthetische Amphiregulinpeptide, welche mit Hilfe der Festphasentechnik erzeugt wurden. Fünf Peptide, entsprechend den Resten 166-184 (Nr. 259), 108-130 (Nr. 264), 31-50 (Nr. 279) 71-90 (Nr. 280) und 221-240 (Nr. 281) werden mit Hilfe der Festphasensynthese synthetisiert und anschließend mit Hilfe der Reverse-Phase HPLC gereinigt.

Fig. 16 Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des cDNA-Klons pAR1, der für Human- Amphiregulin kodiert;

Fig. 17 genomische Human-Amphiregulinsequenz

Fig. 18 schematisches Diagramm der Exonstruktur und von Proteindomänen des AR-Moleküls in bezug auf die genomische Sequenz

Fig. 19 Nukleotidsequenz des pDCHBAR1-Expressionsvektors

Fig. 20 Nukleotidsequenz für pTacAPAR1;

Fig. 21 Nukleotidsequenz von pTacAPHILE.

5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Amphiregulin (AR), für AR und den AR-Prekursor kodierende Nukleotidsequenzen sowie die Produktion von AR mit Hilfe von konventionellen oder rekombinanten DNA-Methoden.

AR, ein neuer zellwachstumsregulierender Faktor wird von TPA-behandelten MCF-7-Zellen in zwei unterschiedlichen, aber funktionell äquivalenten Formen exprimiert und sezerniert. Die beiden Formen sind strukturell identisch mit Ausnahme von sechs zusätzlichen aminoterminalen Resten bei der größeren Form. AR besitzt eine sehr wirksame inhibitorische Aktivität auf die DNA-Synthese in neoplastischen Zellen und kann daher als wirksame Antitumorverbindung verwendet werden. Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit von AR das Wachstum von Fibroblasten und anderen normalen Zellen zu fördern. AR kann daher bei der Behandlung solcher Zustände von Nutzen sein, die eine Beschleunigung des Zellwachstums erfordern (z. B. Verbrennungen und Wunden).

AR, dessen Fragmente oder Derviate besitzen eine weit verbreitete potentielle therapeutische Anwendbarkeit bei der Behandlung und Überwachung von Neoplasien, sowie bei der Wundbehandlung. AR kann auch zur Modulation der Knochenresorption und der Immunantwort, sowie zur Stimulation der Arachidonsäurekaskade verwendet werden. Das Amphiregulingen und die Genprodukte, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung werden im einzelnen in folgenden Unterabschnitten und in den Beispielen beschrieben.

5.1 Herstellung und Reinigung von Amphiregulin

Amphiregulin wird durch die Human-Brustkarzinomzellinie MCF-7 bei Behandlung mit der tumorstimulierenden Verbindung 12-O-Tetradecanoyl-Phorbol-13-Acetat (TPA) sezerniert. Amphiregulin kann aus den konditionierten Medien solcher kultivierter TPA-behandelter MCF-7-Zellen isoliert und anschließend unter Erzielung einer hohen spezifischen Aktivität gereinigt werden. Amphiregulin kann auch aus anderen Zellinien mit oder ohne Induktion durch Behandlung mit TPA oder anderen tumorstimulierenden Verbindungen isoliert werden. Andererseits kann man Amphiregulin mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken oder mit Hilfe der Festphasenpeptidsynthese herstellen.

Amphiregulin kann unter Verwendung von unterschiedlichen aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren und Techniken gereinigt werden, welche z. B. Chromatographien (z. B. Umkehrphasen-(Reversed-Phasen)-Flüssig-, Gelpermeations- Flüssigkeitsaustausch-, Ionenaustausch-, Größenausschluß- und Affinitäts-Chromatographie), Zentrifugation, elektrophoretische Verfahren, unterschiedliche Löslichkeit oder andere Standardtechniken zur Reinigung eines Proteins umfassen.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden MCF-7-Zellen 48 h mit TPA behandelt und in frischem serumfreien Medium 4 Tage gezüchtet. Das resultierende konditionierte Medium wird abgetrennt und wie in Abschnitt 6.2 beschrieben, zur Herstellung von ungereinigtem AR verwendet. Eine Kombination aus Reversed-Phase-Flüssig- und Gelpermeations-Chromatographie kann zur Reinigung von AR bis zur Homogenität gemäß Abschnitt 6.3 verwendet werden. Man erhält gereinigtes AR, das im Vergleich zum Ausgangsmaterial 1842fach bis 2270fach angereichert ist. Das Verfahren ist reproduzierbar und man erhält AR-Präparationen mit spezifischen Aktivitäten zwischen 2,7 und 3,4×10⁶ Units/mg-Protein.

5.2 Das Amphiregulingen 5.2.1 Isolierung und Klonierung des Amphiregulingens

Erfindungsgemäß kann die kodierende Nukleotidsequenz für Human-Amphiregulin oder ein funktionelles Äquivalent davon zur Erzeugung rekombinanter Moleküle verwendet werden, welche die Expression des Human-Amphiregulin- Produktes steuern. Die kodierende Nukleotidsequenz für AR kann man aus Zellen isolieren, welche eine AR- ähnliche Aktivität produzieren. Beispielsweise wird gemäß einer speziellen Ausführungsform die Human- Brustkarzinom-Zellinie MCF-7 als Quelle für die AR-kodierende Nukleotidsequenz verwendet. Man kann die kodierende Sequenz durch cDNA-Klonierung der aus solchen Zellen gewonnenen und gereinigten RNA oder durch genomische Klonierung erhalten. Man kann entweder eine cDNA- oder genomische Genbank von Klonen aus den erzeugten DNA-Fragmenten mit Hilfe von Techniken herstellen, welche aus dem Stand der Technik bekannt sind und beispielsweise Restriktionsenzyme verwenden.

Fragmente, die das AR-Gen enthalten, können mit Hilfe bekannter Methoden auf verschiedene Weise identifiziert werden. Beispielsweise kann ein Teil der Aminosäuresequenz von AR zur Ableitung der entsprechenden DNA-Sequenz verwendet werden, wobei anschließend die DNA-Sequenz auf chemischem Weg synthetisiert, radioaktiv markiert und als Hybridisierungssonde verwendet wird.

Andere Verfahren zur Isolierung des AR-Gens beinhalten z. B. die chemische Synthese der Gensequenz selbst auf Grundlage einer bekannten Sequenz, die z. B. von der Aminosäuresequenz von AR abgeleitet ist. Andererseits kann die in vitro-Translation von selektierter mRNA, gefolgt von funktionellen oder immunologischen Tests mit den translatierten Produkten verwendet werden. Das identifizierte und isolierte Gen kann dann in einen geeigneten Klonierungsvektor insertiert werden. Eine große Anzahl von Vektor- Wirtssystemen sind aus dem Stand der Technik bekannt und anwendbar. Mögliche Vektoren umfassen z. B. Plasmide oder modifizierten Viren, wobei das Vektorsystem und die Wirtszelle kompatibel sind. Derartige Vektoren sind z. B. Bakteriophagen, wie λ-Abkömmlinge oder Plasmide, pBR322 und pUC-Plasmidderivate. Rekombinante Moleküle können in die Wirtszelle über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation, usw. eingeschleust werden.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird das MCF-7- Zellen exprimierte AR-Gen dadurch kloniert, daß man mRNA selektioniert, welche als Antwort auf eine Behandlung von MCF-7-Zellen mit TPA produziert wird und eine cDNA-Genbank im Bakteriophagen λgt10 konstruiert. Da unbehandelte MCF-7-Zellen offensichtlich kein AR-Protein synthetisieren und sezernieren, wurde angenommen, daß sich die Induktion von AR mit Hilfe von TPA auch auf der Ebene der Transkription bemerkbar macht und daß eine derartige cDNA-Genbank AR-enthaltende Sequenzen in erhöhtem Maße enthält. Ein Screening der cDNA-Genbank mit degenerierten und "best guess"- Oligonukleotiden basierend auf der Verwendung von Human- Kodons (Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 183: 1-12 und Abschnitt 8.1., wie oben) führte zur Isolierung von AR-cDNA-Klonen. Diese cDNA-Klone wurden anschließend zur Charakterisierung der Ar-mRNA und des AR-Gens verwendet. Außerdem kann die Nukleotidsequenz der Ar cDNA (Abschnitt 8.2, wie oben und Fig. 16) zur Ableitung der primären AR-Aminosäuresequenz verwendet werden.

Aufgrund der inhärenten Degenerierung der kodierenden Nukleotidsequenz können auch andere DNA-Sequenzen, welche im wesentlichen für die gleiche oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz kodieren zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Derartige Veränderungen der AR-Nukleotidsequenz umfassen Deletionen, Additionen oder Substitutionen verschiedener Nukleotide, welche zu einer Sequenz führen, die für das gleiche oder ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodieren. Das Genprodukt kann Delectionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureestern innerhalb der Sequenz enthalten, welche zu stummen Veränderungen führen, so daß ein bioaktives Produkt produziert wird. Derartige Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis von Ähnlichkeiten in der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobizität, der Hydrophilie und/oder der amphiphatischen Natur der betroffenen Reste erfolgen. Beispielsweise umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen oder unpolaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilizitätswerten umfassen folgende Verbindungen: Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin.

Die AR-cDNA kann als Sonde zum Nachweis der AR-mRNA in TPA-induzierten MCF-7-Zellen verwendet werden. Die AR-mRNA besitzt eine Länge von etwa 1400 bp.

Wie in Abschnitt 9, unten, beschrieben wird, kann die AR-cDNA zur Charakterisierung des AR-Gens verwendet werden. Die Zuordnung des Chromosons für das Human- Ar-Gen wurde durch in situ-Hybridisierung von ³H- markierter Ar-cDNA mit normalen Metaphasen-Chromosomen bestimmt. Hierbei ergab sich, daß das Human-AR-Gen auf Chromosom 4 in der Region 4q13-21 zu finden ist, der man eine gewisse Rolle bei der Differenzierung von Lymphocyten zuschrieb (siehe Abschnitt 9.2., unten). Die cDNA wurde auch zur Isolierung der genomischen DNA verwendet, die das gesamte AR-Gen umfaßt einschließlich der 5′-regulativen Region. Es wurde gefunden, daß das AR-Gen eine Länge von 10 kb aufweist und in 6 Exons aufgeteilt ist. Die 5′-regulative Region wurde in einen Expressionsvektor eingebracht, der ein Promotor-freies Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT)-Gen enthält. Diese Konstruktion war zur Stimulation der Transkription des CAT-Gens noch vorübergehender Einführung in MCF-7-Zellen befähigt. Durch Zugabe von TPA wurde eine 6- bis 7fache Aktivität stimuliert (siehe Abschnitt 9.4 unten). Gemäß besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann diese 5′-regulative Region in Expressionsvektoren zur Kontrolle der Transkription des AR-Gens oder anderer Strukturgene verwendet werden. Die chimäre AR-CAT- Konstruktion kann auch zur Suche nach solchen Faktoren verwendet werden, welche die Expression von AR regulieren (siehe Abschnitt 9A).

5.2.2 Konstruktion des Expressionsvektors der die kodierende Sequenz für Amphiregulin enthält

Um biologisch aktives AR in maturierer Form zu exprimieren, sollte ein solches Vektor/Wirtssystem gewählt werden, das nicht für hohe Transkriptions- und Translationsraten, sondern auch für die korrekte Prozessierung des Genproduktes sorgt. Dies ist insbesondere wichtig, wenn die gesamte kodierende Sequenz des Amphiregulin-Prekursors in der Expressionskonstruktion verwendet wird, da die maturierte Form von Amphiregulin wahrscheinlich aus einem Prekursorprodukt über zelluläre Prozessierungsvorgänge abgeleitet wird. Beispielsweise kann ein Säuger-Wirtszellsystem danach ausgewählt werden, ob es die Fähigkeit zur korrekten Prozessierung und Sekretion von Amphiregulin in die extrazelluläre Umgebung besitzt.

Im vorliegenden Fall scheinen insbesondere zwei Formen von maturiertem Amphiregulin als mittlerer Abschnitt eines gemeinsamen 252-Aminosäure langen Prekursors synthetisiert zu werden, aus dem die zwei maturierten Formen durch unterschiedliche proteolytische Prozessierung freigesetzt werden. Zusätzlich wird Amphiregulin glykosiliert und kann zusätzlich einer Tyrosin-Sulfatierung unterzogen werden, was nochmals die Wichtigkeit der Auswahl des Expressionssystems unterstreicht, welches zur Ausführung dieser post-translationalen Modifikationen befähigt ist, wenn diese im Endprodukt gewünscht sind.

Eine Vielzahl von Tier/Wirtsexpressions-Vektorsystemen (d. h. Vektoren, welche die erforderlichen Elemente zur Steuerung der Replikation, Transkription und Translation der kodierenden AR-Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle enthalten) sind dem Fachmann bekannt. Diese umfassen beispielsweise Virusexpressionsvektor/Säugerwirtszellsysteme (z. B. Cytomegalovirus, Vaczinavirus, Adenovirus und ähnliche) Insektenviren-Expressionsvektor/Insektenzellsysteme (z. B. Baculovirus); oder nicht-virale Promotor-Expressionssysteme abgeleitet aus den Genomen von Säugerzellen (z. B. der Maus-Methallothioninpromotor).

Die Expressionselemente dieser Vektoren unterscheiden sich in ihrer Stärke und Spezifität. In Abhängigkeit vom verwendeten Wirts/Vektorsystem können beliebige aus einer Reihe von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden. Zum Beispiel, wenn in einem Säugerzellsystem kloniert wird, können Promotoren verwendet werden, welche aus dem Genom von Säugerzellen (z. B. Maus-Metallothioninpromotor) oder aus Viren isoliert werden, welche sich in diesen Zellen vermehren (z. B. Vaczinavirus -7,5 k-Promotor oder das "Moloney murine sarcoma virus long terminal repeat").

Promotoren, welche mit Hilfe der DNA-Rekombinationstechnik oder mit Hilfe von synthetischen Methoden hergestellt wurden, können ebenso zur Transkription der insertierten Sequenz verwendet werden.

Außerdem sind für eine ausreichende Translation der insertierten kodierenden Proteinsequenz spezifische Initiationssignale erforderlich. Diese Signale beinhalten das ATG-Initiationskodon und benachbarte Sequenzen. Für den Fall, daß das gesamte AR-Gen einschließlich seines eigenen Initiationskodons und der benachbarten Sequenzen in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert wurden, sind keine zusätzlichen Translationskontrollsignale erforderlich. Wenn allerdings nur ein Teil der kodierenden Sequenz insertiert wird, müssen exogene Translationskontrollsignale einschließlich dem ATG-Initiationskodon bereitgestellt werden. Weiterhin muß das Initiationskodon mit dem Leserrahmen der AR-kodierenden Sequenz in Phase vorliegen, um eine Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Initiationskodons können unterschiedlichen, sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs sein. Die Effektivität der Expression kann durch Einbau von Transkriptions-Attenuationssequenzen, Enhancerelementen usw. gesteigert werden.

Jedes beliebige, bereits beschriebene Verfahren zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, welche das AR-Gen und geeignete Transkriptions/Translationskontrollsignale enthalten. Diese Verfahren können in vitro DNA-Rekombinationstechniken, synthetische Techniken und in vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination) beeinhalten.

Wenn beispielsweise ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die AR-kodierende Sequenz mit dem Adenovirus Transkriptions/Translationskontrollkomplex z. B. der "late promotor" und "tripartite leader"-Sequenz ligiert werden. Diese chimären Gene können dann in das Adenovirusgenom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination insertiert werden. Die Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z. B. die Region E1 oder E3) führt zu einem intakten rekombinanten Virus, der zur Expression von AR im infizierten Wert fähig ist. In ähnlicher Weise kann der Vaczina 7,5 K-Promotor verwendet werden.

Ein alternatives Expressionssystem zur Expression von AR ist ein Insektensystem. In einem solchen System wird der Nuclear-Polyhedrosisvirus (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die AR-kodierende Sequenz kann in nicht- essentiellen Regionen (z. B. dem Polyhedringen) des Virus unter der Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z. B. dem Polyhedrinpromotor) kloniert werden. Eine erfolgreiche Insertion der AR-kodierenden Sequenz führt zu einer Inaktivierung des Polyhydringens und zur Produktion von nicht-okkludierten rekombinanten Viren (d. h. Viren ohne Proteinhülle, für die das Polyhedringen kodiert). Diese rekombinanten Viren werden anschließend zur Infektion von Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet, in welchen das insertierte Gen exprimiert wird.

Retrovirale Vektoren, welche in amphotropen Verpackungszellinien bereitgestellt werden, ermöglichen eine sehr effektive Expression in zahlreichen Zelltypen. Dieses Verfahren ermöglicht die Bestimmung einer Zell-Typ- spezifischen Prozessierung, Regulation oder Funktion der insertierten proteinkodierenden Sequenz.

Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm ausgewählt werden, der die Expression der insertierten Sequenz moduliert oder das Genprodukt auf gewünschte Art und Weise modifiziert und prozessiert. Die promotorabhängige Expression kann in Gegenwart bestimmter Induktoren (z. B. Zink- oder Cadmium- Ionen für Metallothionin-Promotoren) erhöht werden. Dadurch kann die Expression von gentechnologisch erzeugtem AR kontrolliert werden. Dies ist wichtig, für den Fall, daß das Proteinprodukt des klonierten Fremdgens auf Wirtszellen lethal wirkt. Weiterhin sind Modifikationen (z. B. Glykosilierung) und Prozessierung (z. B. Spaltung) des Proteinprodukts wichtig für die Funktion des Proteins. Verschiedene Wirtszellen besitzen charakteristische und spezifische Mechanismen für die post-translationale Prozessierung und Modifizierung von Proteinen. Geeignete Zellinien des Wirtssystems können zur Gewährleistung der korrekten Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins ausgewählt werden.

Beispiele für erfindungsgemäß verwendete Expressionsvektoren sind:

Plasmid pSV2Neo

Plasmid pSV2Neo wird beschrieben in Southern et al., (1982) J. Mol. Applied Genetics 1, 327-341.

Plasmid pSV2dhfr

Das Plasmid pSV2dhfr (Subramani et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) enthält das Mäusedihydrofolatreduktase- Gen (dhfr) unter der Kontrolle des SV40-Promotors.

Plasmid pH3M

Das Plamid pH3M (Aruffo et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369) enthält einen chimären Promotor zusammengesetzt aus dem Human-Cytomegalovirus (CMV) AD169 Immediate Early Enhancer verbunden mit den HIV LTR-Positionen -67 bis +80. Auf LTR folgt ein Polylinker mit den 5′- bis 3′-Schnittstellen: HindIII, XbaI, XhoI, BstXI, XHoI, PstI und XbaI. Die "small t antigen"-Spleiss/Polyadenylierungssignale von pSV2 und ein SV40-"Origin" der Replikation befinden sich in "downstream" (in 3′-Richtung) vom Polylinker. Letzteres erlaubt eine Amplifizierung in Zellen, welche das SV40-"large T antigen" enthalten (die COS- und WOP- Zellen). Ein Supressor-tRNA-Gen begünstigt das Wachstum in pVX-verwandten Vektoren und Bakterien, welche das P3-Plasmid tragen (wie z. B. MC1061/P3).

Plasmid pH3M/bOncM

Plasmid pH3M/bOncM wurde von Najma Malik, Oncogen, zur Verfügung gestellt. Es enthält die Simian-TGF-β-5′-untranslatierte Sequenz und die Leadersequenz, welche mit der Oncostatin M-kodierenden Sequenz verbunden ist und in pH3M und an der HindIII/XhoI-(filled)-Schnittstelle insertiert ist. Die TGF-β-Sequenz besteht aus der 85 bp- 5′-untranslatierten Region, beginnend an einer HindIII- Schnittstelle (ausgehend vom pSP65-Polylinker) und einer benachbarten PstI-Schnittstelle der TGF-β-cDNA, gefolgt von 87 bp, welche für die 29-aminosäurenlange Signalsequenz kodieren, welche normalerweise zwischen einer Glycinleucindipeptidsequenz gespalten wird.

Plasmid pH3ARP

Das Plasmid pH3ARP ist ein pH3M-abgeleiteter Vektor, der zur vorübergehenden Expression des AR-Prekursors in COS- Zellen entworfen wurde. Das Plasmid enthält 13 bp der AR-5′-untranslatierten Region und die gesamte kodierende Sequenz sowie 3′-untranslatierte Sequenzen. Dieses Plasmid wurde durch Ligierung des 4kb-Fragmentes des pH3M-Vektors nach Verdauung mit HindIII und XbaI, mit den Oligonukleotiden EVSAL3 und EVSAL4 und den Gel-gereinigten 1,1 kb HgaI/XbaI cDNA-Fragmenten aus pAR1 hergestellt. EVSAL3 und EVSAL4 sind komplementär mit den 5′-HindIII, EcoRV, SalI und HgaI- Schnittstellen. Die Konstruktion enthält weiterhin die EcoRI bis XbaI-Polylinker-Schnittstellen von pEMBL18, die der 3′-untranslatierten Region folgen.

Plasmid pSVDR/bOM

Das Plasmid pSVDR/bOM wurde von Jeff Kallestad, Oncogen, zur Verfügung gestellt. Es stellt eine Fusion zwischen pSV2dhfr und pH3M/bOM dar und ist ein Vektor mit einer cDNA, die durch den CMV/HIV-Promotor aus pH3M gesteuert wird und von der TGF-β-Signalsequenz und den SV40-Polyadenylierungssignalen flankiert ist und zusätzlich das Maus- dhfr-Gen gesteuert vom SV40-Earlypromotor aufweist. Das Plasmid wurde durch Ligierung von BamHI/NruI (filled)-verdautem pH3M/bOM mit BamHI-verdautem pSV2dhfr hergestellt.

Plasmid pHras

Das Plasmid pHras ist ein Säuger-Expressionsvektor und wurde von Stan McKnight, Univ. of Washington, Dept. of Pharmacology entwickelt. Das Plasmid ist ein pML-verwandter Vektor, der ein 754 bp EcoRI bis TthlllI-Fragment von Harvey Ras LTR, einen Polylinker mit SmaI, BamHI, SalI, PstI, HindIII und ClaI-Schnittstellen gefolgt von dem Maus-DHFR cDNA und dem Hepatitis B-Virus 3′-untranslatierten/ polyadenylierungssignal enthält. Der Abstand von BamHI im Polylinker zum ATG der DHFR beträgt 54 bp.

Plasmid pHLARGE

Das Plasmid pHLARGE stellt eine Säuger-Expressionskonstruktion dar, welche die 10 kb AR-genomischen Sequenzen (SmaI bis HindIII) gesteuert durch Harvey ras LTR und gefolgt von einem nicht-funktionalen, promotorfreien DHFR- Gen enthält. Es wurde durch Dreier-Ligierung folgender Fragmente hergestellt: 4,6 kb pHras SmaI/HindIII-Fragment; 6,0 kb SmaI/HindIII AR-genomisches Fragment von pARH12; und 6,4 kb HindIII AR-genomisches Fragment von pARH6.

Plasmid pHLARGlpcD

Das Plasmid pHLARGlpcD ist eine polycistronische Säuger- Expressionskonstruktion. Es enthält die AR-Prekursor-cDNA- Sequenz, gefolgt vom Maus-dhfr-Gen unter der Kontrolle einer einzelnen Harvey ras LTR-Sequenz. Das Primärtranskript stellt eine polycistronische Information mit 74 bp zwischen dem Stoppkodon von AR und dem ATG-Startkodon von dhfr dar, wodurch das Ribosom reinitiiert und die Translation fortgesetzt wird. pH3ARP wurde mit EcoRV verdaut und ein 700 bp- Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment enthielt die 13 bp AR-5′-untranslatierte Region, die vollständige AR- Prekursor kodierende Region und 21 bp der 5′-untranslatierten Sequenz. Dieses Fragment wurde mit dem BamHI geschnittenen, aufgefüllten und phosphatase-behandelten Vektor pHras ligiert.

Plasmid pLOSNL

Das Plasmid pLOSNL wurde von Dusty Miller, Fred Hutchison Cancer Research Center, Seattle, WA zur Verfügung gestellt. Dieser retrovirale Expressionsvektor wurde zur Erzeugung hoher Titer von amphotropem helferfreiem viralem Material entwickelt, das zur Infektion aber nicht zur Peplikation in einer großen Vielzahl von Wirten befähigt ist. Der Vektor enthält: ein mutiertes Moloney murine leukemia-Virus LTR mit deletierten Verpackungssignalen; psi+-Sequenzen; das Ornithintranscarbamylase (OCT)-Gen mit zwei XhoI-Schnittstellen zur Insertion einer cDNA und folgender Inaktivierung des OTC-Gens; SV2Neo, einen selektierbaren Marker; das 3′-LTR; und ein pBR322 Amp-Resistenzgerüst.

Plasmid pLARSNL

Das Plasmid pLARSNL ist eine amphotrope retrovirale Expressionskonstruktion, welche die AR-Prekursor kodierende cDNA-Region enthält, der ein Poly(A)- Schwanz fehlt, und durch virale LTR gesteuert wird. SV2Neo ermöglicht die Selektion exprimierender Transfektanten. pLARSNL wurde durch Ligierung des 800 bp SalI-Fragmentes aus pHLARGlpcD mit dem 7,7 kb -Fragment desXhoI-verdauten und phosphatase-behandelten pLOSNL-Vektorfragmentes erzeugt.

5.2.3 Identifizierung von Transfektanten oder Transformanten, welche das Amphiregulin-Gen exprimieren.

Die Wirtszellen, welche die rekombinante AR-kodierende Sequenz enthalten und das biologisch aktive, maturierte Produkt exprimieren können, können mit Hilfe von wenigstens vier allgemeinen Verfahren identifiziert werden:

(a) DNA-DNA-, DNA-RNA- oder RNA-Antisens (gegenläufige) RNA-Hybridisierung
(b) Anwesenheit oder Abwesenheit von "Marker" Genfunktionen;
(c) Bestimmung der Transkriptionsrate auf Basis der Expression des AR-mRNA-Transkripts in der Wirtszelle; und
(d) Detektion des maturierten Genproduktes durch Immuno- Assay und zuletzt durch dessen biologische Aktivität.

Im Rahmen des ersten Verfahrens wird die human-AR-kodierende Sequenz, welche im Expressionsvektor insertiert ist, durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden detektiert. Diese Sonden umfassen Nukleotidsequenzen, welche zur kodierenden Sequenz von Human-AR homolog sind.

In dem zweiten Verfahren kann das System aus rekombinantem Expressionsvektor und Wirt auf Grundlage des Vorhandenseins oder des Fehlens bestimmter Markergenfunktionen identifiziert und selektiert werden. Beispiele für Markergenfunktionen sind die Thymidinkinaseaktivität, Antibiotikaresistenz, Methotrexatresistenz, Transformationsphenotyp, Bildung von Einschlußkörpern (occlusion body) im Baculovirus, etc. Wenn z. B. die AR-kodierende Sequenz innerhalb einer Markergensequenz eines Vektors insertiert ist, können Rekombinanten, welche die AR-kodierende Sequenz enthalten, durch das Fehlen der Markergenfunktion identifiziert werden. Andererseits kann ein Markergen in Tandemposition mit der AR-Sequenz unter der Kontrolle des gleichen oder eines weiteren Promotors angeordnet werden, um die Expression der AR-kodierenden Sequenz zu kontrollieren. Die Expression des Markers aufgrund einer Induktion oder Selektion weist auf die Expression der AR-kodierenden Sequenz hin.

Beim dritten Verfahren kann die Transkriptionsaktivität für die AR-kodierende Region durch Hybridisierungs-Tests bestimmt werden. Beispielsweise kann man polyadenylierte RNA isolieren und durch Northern-Blotting unter Verwendung einer Sonde analysieren, welche zur AR-kodierenden Sequenz oder Teilbereichen davon homolog ist. Außerdem kann die gesamte Nukleinsäure der Wirtszelle extrahiert und auf Hybridisierung mit derartigen Sonden untersucht werden.

Im vierten Verfahren wird die Expression des maturierten Proteinproduktes auf immunologischem Weg, z. B. durch Western-Blotting, Immuno-Assays, wie der Radioimmuno- Präzipitation, enzym-gebundenen Immunoassays usw. bestimmt. In einem letzten Test zur Bestimmung der Funktion des Expressionssystems, wird das biologisch aktive AR-Genprodukt nachgewiesen. Wird das Genprodukt durch die Wirtszelle sezerniert, so kann das zellfreie Medium der transfektierten Wirtszellkultur abgetrennt und auf AR- Aktivität getestet werden. Wird das Genprodukt nicht ausgeschieden, können Zellysate auf Aktivität getestet werden. In beiden Fällen können biologische Test wie die hierin beschriebenen Wachstumsinhibitions- und Stimulations-Tests oder ähnliche verwendet werden.

5.3 Struktur von Amphiregulin

Aminosäuresequenzierung von gereinigtem AR ergab, daß die Präparation aus einem ungleichen Gemisch von zwei nahezu identischen Formen von AR bestand (siehe Fig. 12). Die größere der beiden Formen umfaßt etwa 16% der Präparation. Die zweite Form, das verkürzte AR, umfaßt den überwiegenden Anteil der Präparation und unterscheidet sich von der längeren Form durch das Fehlen des aminoterminalen Hexapeptids SVRVQ. Ansonsten sind die beiden Formen auf der Aminosäureebene absolut homolog.

AR ist ein extrem hydrophiles Glykoprotein mit einem mittleren relativen Molekulargewicht von 22,500 Dalton. Nach N-Glycanase-Behandlung, wodurch N-gebundene Kohlenhydrate entfernt werden, wandert AR in Form einer einzelnen Bande mit einem relativen Molekulargewicht von 14 000. Dies stimmt annähernd mit den Molekulargewichtsbestimmungen für AR aus Gelpermeations-Chromatographiedaten überein. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wandert AR auf ähnliche Weise. AR ist deshalb ein Einzelstrang-Glykoprotein.

Die Primärstruktur von AR wurde mit einer Vielzahl von Proteinsequenzen verglichen. Diese Vergleiche zeigen, daß AR ein neuartiges Protein ist, welches keine signifikanten Strukturhomologien mit irgendeinem der verglichenen Proteine zeigt. Die Primärstruktur von AR ist jedoch mit der Struktur mehrerer anderer Wachstumsfaktoren verwandt, wobei die meisten davon zur EGF-Oberfamilie gehören. Es ist daher sinnvoll, AR als Mitglied dieser Gruppe von Proteinen zu klassifizieren, da mehrere Strukturmerkmale dieses Proteins parallel verlaufen mit hochkonservierten Strukturmerkmalen, welche innerhalb der EGF-Proteinfamilie gefunden wurden. Beispielsweise ähnelt die N-terminale AR-Sequenz den N- terminalen Sequenzen von TGF-α, VGF und MGF. Diese Regionen sind reich an Prolin-, Serin- und Threonin-Resten. AR weist auch Stellen für N-verknüpfte Glykosilierung ähnlich wie die N-terminalen Prekursorregionen der TGFs und von VGF auf. AR zeigt außerdem eine Sequenzhomologie mit anderen EGF- ähnlichen Proteinen durch Konservierung von 6 Cysteinresten, die an 3 Disulfid-Bindungen beteiligt sind und die Sekundärstruktur der maturierten Formen dieser Wachstumsfaktoren definieren. Eine Analyse der hydrophatischen Eigenschaften ergibt jedoch signifikante Unterschiede zwischen homologen AR und EGF-Sequenzen. Für weitere Vergleiche zwischen AR und anderen Mitgliedern der EGF-Oberfamilie ist auf Tabelle I, Fig. 13 und die Abschnitte 9.7 und 9.8 verwiesen.

Tabelle I

"Combined Homology Scores" für die Regionen #1 und #2

Die in Fig. 12 angegebenen Amphiregulin-Aminosäuresequenzen ebenso wie funktionellen Äquivalente sind Gegenstand dieser Erfindung. Beispielsweise kann das Amphiregulin-Produkt Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz umfassen, die zu stummen Veränderungen führen und ein bioaktives Produkt produzieren. Derartige Aminosäuresubstitutionen können auf Grundlage von Ähnlichkeiten in der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobizität, der Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der entsprechenden Reste erfolgen. Beispielsweise umfassen negativ geladene Aminosäuren die Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen ähnlicher Hydrophobizität umfassen folgende Verbindungen: Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.

5.4 Eigenschaften von Amphiregulin

Amphiregulin ist ein einzelsträngiges Glykoprotein mit einem mittleren Molekulargewicht von 22 500 Dalton und zeigt bifunktionelle Wachstumsmodulationsaktivitäten in einer Vielzahl von Zellkulturen. AR ist strukturell mit der EGF-Familie von Wachstumsfaktoren verwandt und kann zusätzlich funktionelle Ähnlichkeiten mit anderen Mitgliedern dieser Familie besitzen. Ein Hinweis darauf ist das ausgeprägt kompetitive Verhalten gegenüber EGF bei der Rezeptorbindung.

AR stellt ein monomeres Protein dar, das um Aktivität zu zeigen, intramolekulare Disulfidbrücken benötigt. Glykosilierung ist für dessen biologische Aktivität nicht erforderlich. Das Protein ist gegenüber milder Säure- und Basen-Behandlung stabil; ebenso bei 30minütiger Hitzebehandlung bei 56°C. Die biologische Aktivität von AR geht vollständig verloren nach Reduktion, nach 5minütiger Hitzebehandlung bei 100°C, und durch Verdauung mit Trypsin, Endopeptidase Lys-C, Endopeptidase Arg und Endopeptidase Glu.

Durch proteolytische Spaltung mit Phospholipase D scheint AR in ein aktives Fragment oder aktive Fragmente mit einem relativen Molekulargewicht von etwa 5600 (bestimmt durch SDS-PAGE-Analyse) überführt zu werden. Aktive Fragmente von AR sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung und werden in Abschnitt 5.5, unten, näher besprochen. AR zeigt in vitro ausgeprägte anti-proliferative Effekte auf mehrere Human- Krebszellinien epithelialen Ursprungs. Beispielsweise wird von AR die DNA-Synthese von Epidermalkarzinomen von Vulva A431-Zellen, Brustadenokarzinom-HTB-132-Zellen, Cervicalepidermoidkarzinom- CRL-1550-Zellen, Ovarial-papillär- Adenom-HTB-75-Zellen, Ovarial-teratokarzinom-HTB-1572- Zellen und Brust-Adenokarzinom-HTB-26-Zellen wirkungsvoll inhibiert. Man beobachtet eine 50%ige Inhibition der DNA-Synthese in A431-Zellen nach Behandlung mit 0,13 nM AR.

Normale Rattennieren NRK-SA6-Zellen bilden gewöhnlich keine Kolonien in Softagar. Jedoch in Kombination mit exogenem EGF und TGF-β im Kulturmedium dieser Zellen wird ein verankerungsunabhängiges Wachstum induziert, was auf einen transformierten Phenotyp hinweist. Eine Kombination von exogenem AR und TGF-β induziert ebenfalls ein verankerungsunabhängiges Wachstum der NRK-SA6-Zellen, jedoch in geringerem Maße (siehe Tabelle V). Dies liefert einen direkten Hinweis auf die funktionelle Verwandtschaft von AR und EKF.

Die synergistische Wirkung von AR und TGF-β impliziert AR als einen wichtigen Faktor bei der Regulation des Zellwachstums. Durch die vorliegende Erfindung werden erstmals Hilfsmittel zur Erforschung der komplexen Zusammenhänge der normalen Zellwachstumskontrolle sowie dem charakteristischen Verlust der Wachstumskontrolle in neoplastischen Zellen bereitgestellt.

AR induziert ebenso die Proliferation von Human-Vorhautfibroblasten (Tabelle IV). Man beobachtet einen zweifachen Anstieg der DNA-Synthese in diesen Zellen bei einer AR- Konzentration von etwa 50 pM. Eine maximale, etwa sechsfache Stimulation beobachtet man bei etwa 5 nM.

Der Mechanismus der Beeinflussung der Zellproliferation oder der Wachstumsinhibition durch AR ist nicht bekannt.

Vorläufige Untersuchungen zur Charakterisierung der AR- Rezeptorbildung weisen darauf hin, daß AR möglicherweise einen spezifischen Rezeptor besitzt. AR zeigt ein kompetitives Verhalten mit EGF bei der Bindung an den EGF- Rezeptor und möglicherweise auch bei der Bindung an andere gemeinsame Rezeptoren, welche möglicherweise den AR- spezifischen Rezeptor selbst umfassen. Man weiß, daß die Anbindung eines Liganden an den EGF-Rezeptor ein wachstumsstimulierendes Signal, teilweise durch Aktivierung der Tyrosinkinaseaktivität, erzeugt. Die Bindung von AR an den EGF-Rezeptor kann in ähnlicher Weise eine proliferative Antwort initiieren und/oder umgekehrt die Initiation eines proliferativen Signals dadurch blockieren, daß die Anzahl der verfügbaren EGF-Rezeptoren zur Bindung von EGF oder anderen signalerzeugenden Liganden eingeschränkt wird. Andererseits ist ein weiterer Mechanismus denkbar, über den AR das Zellwachstum inhibiert und wird durch die Daten aus Tabelle I nahegelegt. Vier Klone der A431-Zellinie mit variablen EGF-Bindungsstellen je Zelle wurden auf ihre Sensitivität gegenüber der AR-inhibierenden Aktivität getestet. Die beobachtete fehlende Korrelation zwischen AR- Sensititvität und der Anzahl der EGF-Bindungsstellen pro Zelle weist darauf hin, daß das von AR erzeugte Wachstumsinhibitionssignal durch eine Rezeptorbindung initiiert wird, an der der EGF-Rezeptor nicht beteiligt ist. Solch eine Rezeptorbindung kann möglicherweise wachstums-proliferative Signale antagonisieren, welche von anderen Wachstumsfaktoren, wie z. B. TGF-α ausgelöst wurden. AR kann somit seinen anti-proliferativen Effekt durch speziffische Blockierung der mitogenen Antwort einer Zelle auf TGF-α oder andere autokrine Wachstumsfaktoren ausüben.

AR ist ein extrem hydrophiles Protein, dessen Aminosäuresequenz ein unverwechselbares Hydropathizitätsprofil erzeugt, das nur eine geringfügige Ähnlichkeit mit den Profilen anderer Proteine der EGF-Familie zeigt (Fig. 11). AR ist ein basisches Protein mit einem pI von 7,6 bis 8,0.

5.4.1 Charakterisierung der AR-Induktion durch TPA

TPA induziert eine pleitrope Zellantwort einschließlich von Veränderungen in der Zellmorphologie, der Zellproliferation und Differenzierung im Membrantransport, bei Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen, bei der Proteinphosphorylierung und im Phospholipid- Metabolismus. Proteinkinase C (PKC) ist eine Ca²⁺- und Phospholipid-abhängige Proteinkinase und wirkt als Rezeptor für TPA. Die Bindung von TPA an PKC führt zur Phosphorylierung einer Vielzahl von Substraten, wie Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Cytoskelettproteinen und trans-aktivierenden regulatorischen Proteinen.

c-AMP stellt ein weiteres regulatorisches Molekül dar, welches verschiedene Effekte auf Zellen, überwiegend über die c-AMP-abhängige Proteinkinase A, ausübt. Der intrazelluläre c-AMP-Gehalt wird durch eine Kombination von Rezeptor-mediierter Aktivierung und Adenylatcyclase-Inhibition reguliert. Einige Studien weisen darauf hin, daß TPA- und c-AMP- induzierte Genexpression zu einem gemeinsamen Weg zusammenlaufen. Zur Untersuchung der Regulation der AR-Genexpression wurde ein Einfluß verschiedener Aktivatoren oder Inhibitoren dieser beiden regulatorischen Wege auf die Produktion von AR- spezifischer RNA in MCF-7-Zellen bestimmt.

Forskolin ist ein Wirkstoff, welcher die Adenylatcyclase aktiviert und den Gehalt an intrazellulärem cAMP erhöht. Bei Verabreichung an MCF-7-Zellen in einer Konzentration von 25 µM über einen Zeitraum von 4 h beobachtet man eine markante Stimulierung der AR-mRNA. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß cAMP auch bei der Regulation der AR-Expression eine Rolle spielt.

5.5 Von Amphiregulin abgeleitete Derivate, Analoga und Peptide

Die Produktion und die Verwendung von Derivaten, Analoga und Peptiden, welche von AR abgeleitet sind, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Derartige Derivate, Analoga und Peptide, welche eine wachstums- modulierende Aktivität zeigen, können in der Diagnose, Prognose sowie bei der Behandlung einer Vielzahl von Neoplasien angewendet werden. Derartige Derivate, Analoga oder Peptide können eine verstärkte oder verringerte biologische Aktivität im Vergleich zu nativem AR aufweisen und können den Bereich von AR GIA- susceptiblen Zellen erweitern oder verringern. In ähnlicher Weise können sich für die Produktion und Verwendung von Derivaten, Analoga und Peptiden, welche von AR abgeleitet sind, nützliche Anwendungsmöglichkeiten, z. B. bei der Behandlung von Wunden und Verbrennungen ergeben. Diese von AR abgeleiteten Proteine können eine vergrößerte oder verringerte wachstums-stimulierende Aktivität zeigen und/oder einen größeren oder geringeren Wirkungsbereich auf Zellen zeigen, welche auf die wachstums-stimulierende Aktivität von AR ansprechen.

Erfindungsgemäße AR-Derivate, -Analoga und -Peptide können unter Verwendung einer Vielzahl von Hilfsmitteln aus dem Stand der Technik hergestellt werden. Verfahren und Manipulationen auf der genetischen Ebene sowie auf der Proteinebene sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Auf der Proteinebene kann man eine Vielzahl chemischer Modifikationen zur Herstellung AR-ähnlicher Derivate, Analoga oder Peptide mit Hilfe von Verfahren aus dem Stand der Technik herstellen. Beispiele hierfür sind spezifische Spaltungen durch Cyanogenbromid, Endopeptidasen (Trypsin, Chymotrypsin, V8-Protease und ähnliche) oder Exopeptidasen oder Acetylierung, Formylierung, Oxidation usw.

5.6 Anti-Amphiregulin-Antikörperproduktion

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Produktion polyklonaler und monoklonaler Antikörper, welche Amphiregulin oder verwandte Proteine erkennen.

Verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren können zur Produktion polyklonaler Antikörper für AR- Epitope verwendet werden. Für die Antikörperproduktion können verschiedene Wirtstiere, wie z. B. Hasen, Mäuse, Ratten usw. durch Injektion des AR-Proteins oder eines synthetischen AR-Peptides immunisiert werden. Hierzu können zur Verstärkung der Immunantwort je nach Art des Wirtes verschiedene Adjuvantien verabreicht werden, wie z. B. das Freund′sche (komplette oder inkomplette) Adjuvans, mineralische Gele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyholelympethemocyanine, Dinitrophenol oder möglicherweise geeignete Human-Adjuvantien, wie das BCG (bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.

Ein monoklonaler Antikörper für ein AR-Apitop kann hergestellt werden, unter Verwendung irgendeiner Technik, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Kulturen von Zellinien ermöglichen. Diese umfassen beispielsweise die Hybridomatechnik, welche ursprünglich von Kohler und Milstein (1975, Nature 256, 495-497) beschrieben wurde, sowie die neuere Human-B-Zellhybridoma- Technik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) und EBV-Hybridoma-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies und Cancer Therapy, Alan, R. Liss, Inc. S. 77- 96).

Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können mit Hilfe bekannter Techniken hergestellt werden. Beispielsweise umfassen solche Fragmente das F(ab′)₂-Fragment, das durch Pepsin-Verdauung des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab′- Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab′)₂-Fragmentes erzeugt werden und die zwei Fab′- oder Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpers mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.

Antikörper gegen AR können zur qualitativen und quantitativen Detektion von maturiertem AR und dessen Prekursor sowie dessen Unterkomponenten, bei der Affinitätsreinigung von AR-Proteinen und beim Nachweis der AR-Biosynthese, dessen Metabolismus und Funktion verwendet werden. Antikörper gegen AR können auch in diagnostischen und therapeutischen Mitteln verwendet werden.

5.7 Verwendungen von Amphiregulin

Die bifunktionelle Natur von AR ermöglicht eine große Vielfalt von in vitro- und in vivo-Anwendungen. Jegliche Art von Verbindungen, die AR oder Fragmente oder Derivate davon beinhalten und eine Wachstumsinhibition und/oder eine wachstumsstimulierende Aktivität einzeln oder in Verbindung mit anderen biologisch aktiven Wachstumsfaktoren, Inhibitoren oder Immunomodulatoren zeigen, können bei erfindungsgemäßen Anwendungen und Verfahren eingesetzt werden.

Die Lokalisierung des AR-Gens in einem Bereich, der bei der Lymphocytendifferenzierung eine Rolle spielt, weist darauf hin, daß AR möglicherweise bei der hematopoetischen Zellentwickung, bei der Aktivierung oder Immunsuppression beteiligt ist. Dies findet Unterstützung durch die Homologie zwischen der AR-3-untranslatierten Region und ähnlichen Regionen anderer Cytokine.

Die vorliegenden Verbindungen können zur Modulation der Angiogenese, der Knochenresorption, der Immunantwort sowie der synaptischen und neuronalen Effektorfunktionen verwendet werden. AR kann ebenfalls zur Modulation der Arachidonsäure-Kaskade verwendet werden. Die enzymatische Oxidation der Arachidonsäure führt zu einer Vielzahl von wichtigen Produkten, wie Prostaglandine, Thromboxane, Prostacycline und Leukotriene. Diese Produkte sind äußerst wirksame, ubiquitäre Wirkstoffe mit einer Vielzahl von physiologischen Effekten, wie z B. der Muskelkontraktion, der Blutplättchenaggregation, der Leukocytenmigration und der gastrischen Sekretion. AR, AR-verwandte Moleküle und Mischungen davon, können insbesondere bei der Behandlung von Verletzungen sowie zur Diagnose und der Behandlung von Krebs verwendet werden.

5.7.1 Behandlung von Wunden

AR kann in einem Verfahren zur Behandlung von Verletzungen wie kutane Verletzungen, korneale Verletzungen, verschiedene andere Epithelial- und Stroma-Verletzungen, wie einem chronischen Ulkus, Verbrennungen, Operationsschnitten, traumatischen Wunden und Verletzungen von hohlen, epithel-begrenzten Organen, wie der Speiseröhre, dem Magen, dem Dick- und Dünndarm, dem Mund, im Genitalbereich und im Harntrakt verwendet werden. Das Verfahren beruht auf der topischen Applikation des zur Behandlung verwendeten Mittels, welches AR in einem physiologisch verträglichen Träger enthält.

Die erfindungsgemäßen Mittel können zur Behandlung einer Vielzahl von Verletzungen verwendet werden, die im wesentlichen sämtliche kutane Verletzungen, korneale Verletzungen sowie Verletzungen epithel-begrenzter Hohlorgane des Körpers umfassen. Zur Behandlung geeignete Wunden umfassen solche Verletzungen, die durch ein Trauma verursacht werden, wie Verbrennungen, Abschürfungen, Schnitte usw. sowie durch operative Eingriffe verursachte Verletzungen, wie Operationsschnitte und Hauttransplantationen. Andere Zustände, die zur Behandlung mit den erfindungsgemäßen Mitteln geeignet sind, umfassen weiterhin chronische Zustände, wie einen chronischen Ulkus, diabetischen Ulkus und andere nicht-heilende (trophische) Zustände.

AR kann in physiologisch verträglichen Trägern zur Anwendung auf dem betroffenen Bereich enthalten sein. Die Art des Trägers ist variierbar und abhängig vom jeweiligen Applikationsort. Für eine Applikation auf der Haut wird eine Creme oder eine Salbe als Grundlage verwendet; geeignete Grundlagen umfassen Lanolin, Silvaden (Marion) (insbesondere zur Behandlung von Verbrennungen), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut), usw. Gewünschtenfalls ist es möglich, AR-haltige Mittel in Bandagen und andere Wundauflagen zu integrieren, um die Wunde dem Peptid kontinuierlich auszusetzen. Aerosolanwendungen sind ebenfalls möglich. In dem zur Behandlung verwendeten Mittel gibt es keine kritische Konzentration für AR; sie sollte jedoch ausreichen, um die Epithelzellproliferation zu induzieren. Die Mittel können topisch auf die jeweilige Fläche aufgetragen werden, wobei typischerweise Augentropfen für die Augen oder Cremes, Salben oder Lotionen für die Haut verwendet werden. Im Falle der Augen ist eine wiederholte Behandlung wünschenswert, wobei gewöhnlich in Intervallen von 4 h oder weniger appliziert wird. Im Falle der Haut ist es wünschenswert, das Behandlungsmittel auf der jeweiligen Fläche während des Heilungsvorganges kontinuierlich zu behalten, wobei das Behandlungsmittel zwei- bis viermal pro Tag oder häufiger appliziert wird. Die verwendete Menge des erfindungsgemäßen Polypeptides ist abhängig von der Art der Verabreichung, der Verwendung anderer aktiver Verbindungen usw. und liegt generell im Bereich von 1 µg bis 100 µg. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann mit einem physiologisch verträglichen Träger, wie Saline, phosphatgepufferter Saline usw. verwendet werden. Die Menge der verwendeten Verbindung wird empirisch bestimmt, basierend auf der in vitro beobachteten Antwort der Zellen und basierend auf der Reaktion von Versuchstieren auf die erfindungsgemäßen Polypeptide oder auf Formulierungen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten.

AR-Verbindungen können einzeln oder in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren, Inhibitoren oder Immunomodulatoren verwendet werden.

5.7.2 Diagnose und Behandlung von Neoplasien

Die erfindungsgemäßen Mittel können zur Diagnose, Prognose und Behandlung einer großer Vielzahl von Neoplasien verwendet werden.

Es gibt eine Vielzahl diagnostischer Anwendungsmöglichkeiten von AR und verwandten Molekülen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen Polypeptide mit einem Label, wie einem Radioisotop, einem Enzym, einem Fluoreszenzmarker, einem Chemilumineszenzmarker, einem Enzymfragment, einem Partikel usw. verbunden werden Derartige Verbindungen kann man zur Bestimmung der Anzahl der AR-Rezeptoren auf einer Zelle verwenden. Die Identifizierung von AR-Rezeptoren dient als Hinweis auf die potentielle Ansprechbarkeit der Zelle auf biologische Effekte von AR und verwandten Molekülen. AR, AR-verwandte Moleküle und/oder Antikörper hierfür können in kompetitiven Tests zum Nachweis von AR in Medien, insbesondere in physiologischen Medien verwendet werden. Eine Vielzahl aus dem Stand der Technik bekannter diagnostischer Tests kann verwendet werden.

Die Anwesenheit und der Gehalt von AR in Körperflüssigkeiten und Geweben kann proportional oder umgekehrt proportional zum Vorliegen und zur Ausbreitung bestimmter Krebsarten sein. Tests zur Bestimmung und/oder Quantifizierung von AR können eine Anwendung bei der Krebsdiagnose und Prognose finden (siehe Abschnitt 5.6, oben).

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin den Nachweis von AR-mRNA. Tests, welche Nukleinsäuresonden zum Nachweis von Sequenzen verwenden, welche die bekannte Gensequenz ganz oder teilweise enthalten, sind aus dem Stand der Technik bekannt und anwendbar. Der AR-mRNA-Gehalt kann auf ein Auftreten oder ein Bestehen von Neoplasien hinweisen. Deshalb sind Tests zur Quantifizierung des AR-mRNA-Gehalts geeignete diagnostische Hilfsmittel.

Zusätzlich können maligne Zellen, welche den AR-Rezeptor exprimieren, unter Verwendung von markiertem AR oder Ar-verwandten Molekülen mit Hilfe eines Rezeptorbindungstets oder durch Verwendung von Antikörpern gegen den AR-Rezeptor nachgewiesen werden. Man kann Zellen aufgrund der Anwesenheit und der Dichte der AR-Rezeptoren unterscheiden, wobei eine Vorhersage der Suszeptiblität solcher Zellen für biologische Aktivitäten von AR möglich ist.

AR kann als anti-neoplastische Verbindung verwendet werden. Für eine in vivo-Verwendung kann das erfindungsgemäße Mittel auf verschiedene Weise verabreicht werden. Beispiele hierfür sind Injektion, Infusion, sowie topische und parenterale Verabreichung, usw. Die Verabreichung kann in jedem physiologisch verträglichen Träger, wie z. B. phosphatgepufferter Saline, Saline, sterilisiertem Wasser, usw. erfolgen. AR und verwandte Moleküle können auch eingekapselt in Liposomen sowie konjugiert an Antikörper vorliegen, welche den Tumor oder zellspezifische Antigene erkennen und daran binden, wodurch ein "Targeting" der erfindungsgemäßen Mittel ermöglicht wird.

AR kann sich in vivo zur Induktion der terminalen Differenzierung von Tumorzellen eignen. Derartige Zellen haben den normalen Weg der Zelldifferenzierung verlassen, der für normale Zellen charakteristisch ist und sind zur ununterbrochenen Proliferation befähigt. Dagegen differenzieren normale Zellen zu Zellen, welche unter den meisten Umständen zu einer weiteren Zellteilung unfähig sind. Deshalb kann die Fähigkeit von AR zur Reaktivierung der normalen Zelldifferenzierung in Tumorzellen und schließlich die Unterbrechung des Tumorwachstums eine wertvolle Anwendung bei der Tumortherapie finden.

AR und verwandte Derivate, Analoga und Peptide können einzeln oder in Kombination mit mindestens einer weiteren anti-proliferativen Verbindung, wie beispielsweise einem Interferon, TGF-β1, TGF-β2, Tumornekrosefaktor- β, Tumornekrosefaktor-α usw. bei der Behandlung hormonell ansprechbarer Karzinome, die eine Vielzahl von Organen, wie Lunge, Brust, Prostata, Dickdarm usw. betreffen können, verwendet werden. Hormonell ansprechbare Karzinome können auch durch Induktion der AR-Produktion in den Karzinomzellen behandelt werden. Beispiele für Induktoren sind Estrogene, wie 17-B-Estradiol, Verbindungen mit Antiestrogenaktivität, wie Tamoxifen. Beliebige Kombinationen dieser Verbindungen können als Induktoren verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in vitro zur Inhibierung des Zellwachstums von Zellinien verwendet werden, welche im Unterschied zu nicht-sensitiven Zellen eine AR-Sensitivität zeigen. Auf diese Art und Weise können heterogene Gemische oder Zellinien von ungewünschten Zellen befreit werden, wobei die ungewünschten Zellen auf die wachstumsinhibierende Aktivität von AR reagieren. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen in vitro zur Eliminierung maligner Zellen aus Knochenmark oder autologen Marktransplantaten sowie zur Eliminierung oder Inhibierung der Proliferation maligner Zellen in Blut vor einer Reinfusion verwendet werden.

Die effektivste AR-Konzentration zur Inhibition der Proliferation einer gegebenen Zelle kann durch Zugabe unterschiedlicher AR-Konzentrationen zu den jeweiligen Tumorzellen und durch Aufzeichnung der Inhibitionsstärke der Zellproliferation bestimmt werden. Die wirksamste Konzentration eines einzelnen Induktors und/oder einer Kombination von Induktoren kann durch Aufzeichnung der AR-Produktion in Karzinomzellen bestimmt werden.

6. Beispiel: Produktion, Reinigung und Charakterisierung von Human-Amphiregulin

Die folgenden Unterabschnitte beschreiben die Reinigung und Charakterisierung von Amphiregulin aus TPA-behandelten MCF-7-Zellen.

6.1 Material und Methoden

Die folgenden Verfahren wurden zur Induktion der Ar- Synthese in MCF-7-Zellen und zur Präparation und Charakterisierung von im wesentlichen reinen AR verwendet.

6.1.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Proteine wurden auf SDS-PAGE Slab-Gelen (Normal- oder Mini-Bio-Rad-System) wie beschrieben analysiert (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685) und durch Silberfärbung detektiert (Merril et al., 1981, Science 211: 1437-1439).

6.1.2 Isoelektrische Fokusierung

Die isoelektrische Fokussierung wurde im wesentlichen auf Basis der Beschreibung des Isolab Technical Data Sheets für Resolve IEF-Gel durchgeführt. Die Proben wurden hierzu auf vorgefertigten Agarosegelen (85×100 mm, pH 3-10) aufgetragen und auf einer Resolve-FR-2500-Isoelektrofokusierungseinheit unter Verwendung eines Bio-Rad-3000 Xi computergesteuerten Elektrophoresespannungsgerätes fokusiert. IEF- Standards wurden neben der Probe fokusiert, gefärbt und das trockne Gel auf einen Kodak X-Omat AR-Film in einem DuPont Cronex-Beleuchtungs- und Verstärkungsschirm aufgelegt.

6.1.3 Proteiniodierung

Proteine wurden mit ¹²⁵I unter Verwendung der Chloramin-T-Methode markiert (Barridge, 1978, Methods Enzymol. 50: 54-65).

6.1.4 Proteinbestimmung

Die Proteinkonzentrationen wurden über die Absorption bei verschiedenen Wellenlängen (210 bis 280 nm) bestimmt. Die Verfahren nach Lowry (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275) und Bradford (1976, Anal. Biochem. 72: 248-252) wurden unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard durchgeführt.

6.1.5 ¹²⁵I-EGF-Bindungstest

Die Bindungstests wurden entweder in Gewebekulturschalen mit 48 Näpfchen durchgeführt, wenn frisch gewachsene und/oder Formalin fixierte A431-Zellen wie beschrieben verwendet wurden (Carpenter et al., 1979, J. Biol. Chem. 254, 4484-4891; Shoyab et al., 1979, Nature 279: 387-391; DeLarco et al., 1980, J. Biol. Chem. 225: 3685-3690). Die Bestimmung erfolgte in Polyvinylchloridplatten mit 96-Näpfchen durch Immobilisierung der Plasmamembran (Kimball and Warren, 1984, Biochem. Biophys. Acta 771: 82-88).

6.2 Produktion von Amphiregulin 6.2.1 Abtrennung konditionierter Medien von TPA-behandelten MCF-7-Zellen

MCF-7-Zellen wurden in T 150 Corning-Gewebskulturflaschen in einem Gesamtvolumen von 25 ml 50%igem IMDM (Iscove′s Modified Dulbecco′s Media) +50%igem DMEM mit 0,6 µg/ml Insulin und 15% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum kultiviert (komplettes MCF-7- Medium). Ungefähr 1×10⁶-Zellen werden pro Flasche überimpft und bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Am 6. Tag wird das gesamte Medium entfernt und man gibt 20 ml frisches komplettes MCF-7-Medium mit 100 ng/ml TPA zu jeder Flasche hinzu. 48 h später wird das Medium entfernt und jede Flasche mit 15 ml 50% IDMM+ 50% DMEM (Serumfreies Medium) gewaschen und nach Zugabe von 25 ml frischem serumfreien Medium zu jeder Flasche bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. 4 Tage später wird das konditionierte serumfreie Medium isoliert und nach Abzentrifugieren von Zellbestandteilen bei -20°C aufbewahrt. Die Flaschen werden erneut mit 25 ml serumfreiem Medium beschickt und konditioniertes serumfreies Medium wird jeden 3. oder 4. Tag isoliert. Ein Teil des konditionierten Mediums jeder einzelnen Isolierung wird auf Wachstumsinhibitions-Aktivität (GIA) auf A431-Human-Epidermal-Karzinomzellen getestet. Gewöhnlich wird von jeder Serie von TPA-behandelten MCF-7-Zellen drei- bis viermal konditioniertes Medium abgetrennt.

6.2.2 Isolation von rohem AR

Etwa 4500 ml konditioniertes Medium wird aufgetaut und 15 Min. bei 4°C und 3500 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird in einem 2 l-Konzentrator der Fa. Amicon unter Verwendung einer YM10-Membran (Amicon) bei 4°C konzentriert. Beträgt das Volumen des Retentats etwa 200 ml, gibt man 1000 ml kaltes Mili-E-Q-Wasser hinzu und konzentriert erneut das Gemisch auf 200 ml.

Das Konzentrat wird entfernt und in einen vorgekühlten 250 ml Corning-Zentrifugenbehälter überführt. Konzentrierte Essigsäure wird unter Rühren langsam bis zu einer Endkonzentration von 1 M Essigsäure hinzugefügt. Das Gemisch wird 1 h bei 4°C aufbewahrt und 20 Min. bei 40 000×g bei 4°C in einer Sorval RC-5B-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird abgetrennt und bei 4°C aufbewahrt. Das Pellet wird in 30 ml 1M Essigsäure suspendiert und wie oben beschrieben erneut zentrifugiert. Der Überstand wird erneut vorsichtig abgetrennt und mit dem ersten Überstand vereinigt und anschließend gegen 17 l 0,1M Essigsäure in einem Spektropordialyseschlauch Nr. 3 (Molekulargewichtsausschluß etwa 3000) dialysiert. Der Dialysepuffer wird innerhalb von 2 Tagen 3× gewechselt. Das Retentat wird lyophilisiert. Das trockene Produkt wird isoliert, vereinigt, gewogen und bei -20°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Dieses Produkt wird als Rohpulver bezeichnet.

6.3 Reinigung von Amphiregulin 6.3.1 Reversed-Phase-Flüssigchromatographie

950 mg des Rohpulvers (aus etwa 9 l serumfreiem konditionierten Medium) wird in 300 ml 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) suspendiert und 20 Min. bei 7000×g zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abgetrennt und auf eine präparative C18-Säule (2,54 cm×27 cm; 55-105 Mikron; Wasser) aufgetragen, die mit 0,1% TFA in Wasser äquilibriert ist. Hierauf wurde der chromatographische Träger in Acetonitril (MeCN) mit 0,1% TFA suspendiert, die Aufschlämmung wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,54 cm gegossen und mit 400 ml MeCN in 0,1% TFA gewaschen und anschließend mit 600 ml 0,1% TFA in Wasser äquilibriert. Die Flußrate beträgt 4 ml/Min. und die Chromatographie wird bei Zimmertemperatur durchgeführt. Die Säule wird mit 650 ml in 0,1% TFA in Wasser gewaschen. Der Durchlauf und die Waschfraktion werden gemeinsam gesammelt. Anschließend wird wie folgt eluiert:

(1) 650 ml 20% MeCN/H₂O mit 0,1% TFA
(2) 650 ml 40% MeCN/H₂O mit 0,1% TFA
(3) 650 ml 60% MeCN/H₂O mit 0,1% TFA und
(4) 750 ml 100% MeCN mit 0,1% TFA

Eine Probe jeder Fraktion wird auf GIA getestet. Etwa 77% der gesamten GIA-Aktivität sind im Durchlauf und den Waschfraktionen zu finden.

Durchlauf und Waschfraktionen werden isokratisch auf eine präparative Partisil 10 ODS-3-Säule (10 Mikron, 2,2×50 cm, Whatman) aufgetragen, die an ein hochauflösendes Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-System (Waters) angeschlossen ist. Die Flußrate beträgt 4 ml/Min. Nach Auftragen der Probe auf die Säule, wird die Säule mit 250 ml 0,1% TFA in Wasser gewaschen. Man erzeugt einen linearen Gradienten zwischen 0,1% TFA in Wasser als erstes Lösungsmitel und Acetonitril mit 0,1% TFA als zweites Lösungsmittel. Die Bedingungen für den Gradienten sind wie folgt: 0 bis 15% in 10 Min., 15 bis 15% in 30 Min., 15 bis 25% in 150 Min., 25 bis 65% in 100 Min., und 65 bis 100% in 10 Min. Es wurden HPLC-Grade-Lösungsmittel verwendet. 14 ml-Fraktionen werden gesammelt und Proben einer jeden Fraktion werden auf GIA getestet. Es werden zwei breite Aktivitätspeaks gefunden (Fig. 1). Der zuerst eluierte Peak (eluiert zwischen 20-23% Acetonitril) wird weiter gereinigt und charakterisiert.

Die Fraktionen 47 bis 62 werden vereinigt. Man gibt 224 ml 0,1% TFA in Wasser zu den vereinigten Fraktionen hinzu. Das Gemisch wird isokratisch auf eine semi- präparative µ-Bondapak-C18-Säule (7,8×300 mm, Waters) bei einer Flußrate von 2 ml/Min. bei Zimmertemperatur aufgetragen. Die Parameter des linearen Gradienten sind: 0 bis 17% in 10 Min., 17 bis 17% in 30 Min., 17 bis 25% in 320 Min. und 25 bis 100% in 40 Min. Die Flußrate beträgt 1 ml/Min. während der Anlegung des Gradienten und Fraktionen mit einem Volumen von 4 ml werden gesammelt. Proben davon werden auf GIA getestet. Man erhält zwei Hauptaktivitätsmaxima, die bei einer Acetonitrilkonzentration von etwa 20% bzw. 21% eluiert werden (Fig. 2).

Die Fraktionen 49 bis 53 werden vereinigt und man fügt 20 ml 0,1% TFA hinzu. Das Gemisch wird isokratisch auf eine µ-Bondapak-C18-Säule (3,9× 300 mm, Waters) bei einer Flußrate von 1 ml/Min. bei Zimmertemperatur aufgetragen. Die Gradientenparameter sind: 0-18% in 10 Min., 18 bis 18% in 30 Min., 18 bis 25% in 280 Min. und 25 bis 100% in 20 Min. Die Flußrate beträgt 0,4 ml/Min. und das Fraktionsvolumen 2 ml. Der größte Teil der Aktivität wird von der Säule bei einer Acetonitrilkonzentration von etwa 21,5% eluiert (Fig. 3A). Die Fraktionen 54 bis 59 (Fig. 2) werden vereinigt und unter identischen Bedingungen wie für Fig. 3A angegeben, chromatographiert. Der größte Teil der Aktivität wird von der Säule bei einer Acetonitrilkonzentration von etwa 22,2% eluiert (Fig. 3B).

6.3.2 Gelpermeations-Chromatographie

Die Fraktionen 25 bis 38 (Fig. 3A) werden jeweils unter Verwendung eines Speed-Vac-Konzentrators (Savant) auf 70 µl aufkonzentriert und mit dem gleichen Volumen Acetonitril mit 0,1% TFA versetzt. Diese 140 µl-Proben werden auf zwei Bio-sil TSK-250- Säulen (jeweils 7,5×300 mm, Bio-Rad) in Tandemanordnung aufgetragen. Die Elution erfolgt isokratisch mit einer mobilen Phase von 50% Acetonitril/H₂O mit 0,1% TFA bei Zimmertemperatur. Die Flußrate beträgt 0,4 ml/Min. und einer Schreibergeschwindigkeit von 0,25 cm/Min.; Fraktionen von 0,4 ml werden gesammelt und Proben davon auf GIA getestet. Das Elutionsprofil der Fraktionen 35, 36 und 37 (Fig. 3A) sind in den Fig. 4A, 4B bzw. 4C gezeigt. Die Fraktionen 41 und 42 (Fig. 3B) werden vereinigt, auf 70 µl aufkonzentriert und wie oben beschrieben, einer Gelpermeations-Chromatographie unterzogen. Das Elutionsprofil zeigt Fig. 4D.

6.4 Zellwachstumstests 6.4.1 Zellwachstumsmodulationstests mit Hilfe des ¹²⁵I- Deoxyuridineinbaus in DNA

Die Tests werden auf Platten mit 96 flachen Näpfchen (Falcon 3072) durchgeführt. Menschliche epidermale Pulverkarzinomzellen (A431) werden als Testzellen für die Wachstumsinhibitionsaktivität (GIA) und Human-Vorhautfibroblasten (Sadamoto) als Indikatorzellen zur Bestimmung der wachstumstimulierenden Aktivität (GSA) verwendet. 3,5×10⁴-Zellen in 50 µl DMEM mit 5% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin/Streptomycin (PS) und Glutamin (Testmedium) werden in allen Näpfchen mit Ausnahme der peripheren Näpfchen vorgelgt. In die peripheren Näpfchen überführt man 50 µl PBS. 3 h später gibt man 50 µl der zu testenden Probe in Testmedium zu jedem Näpfchen hinzu, während den Kontrollnäpfchen lediglich 50 µl Testmedium zugefügt wird. 3 Näpfchen werden je Konzentration der zu testenden Probe verwendet. Die Platten werden bei 37°C 2 bis 3 Tage inkubiert. Anschließend gibt man 100 µl einer Lösung von ¹²⁵I-Iodo-2′-¹²⁵I-deoxyuridin (4 Ci/mg -0,5 mCi/ml) (2 µl/ml in Testmedium) hinzu und inkubiert die Platten bei 37°C. Nach 4 bis 6 Tagen wird das Medium aus den Näpfchen abgesaugt und 1× mit 200 µl PBS nachgewaschen. Anschließend fügt man zu jedem Näpfchen 200 µl Methanol hinzu, inkubiert die Platten 10 Min. bei Zimmertemperatur und saugt das Methanol ab. Man gibt 200 µl 1M Natriumhydroxid zu jedem Näpfchen hinzu und inkubiert die Platten 30 Min. bei 37°C. Natriumhydroxid wird mit Hilfe von "Titertek plugs" (Flow Labs) entfernt. Man überführt die Plugs in 12×75 mm Plastikröhrchen und mißt diese in einem Gammazähler zur Quantifizierung des ¹²⁵I-IUdR- Einbaus.

6.4.2 Softagar-Kolonietest

Eine 0,5 ml-Basisschicht aus 0,5% Agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem FBS wird zu Costar- Gewebskulturplatten mit 24 Näpfchen hinzugefügt. 0,5 ml eines 0,3%igen Agars mit dem gleichen Medium- FBS-Gemisch, 5 bis 10×10³-Testzellen und den bei verschiedenen Konzentrationen zu testenden Faktoren werden zur Überschichtung der ersten Agarschicht verwendet. Man inkubiert die Platten bei 37°C in einer humidifizierten Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft und füttert erneut nach 7 Tagen durch Zugabe von 0,5 ml 0,3%igem Agar, der das gleiche Medium und die gleichen Konzentrationen der zu testenden Verbindung enthält. Die Kolonien werden unfixiert und ungefärbt gezählt und die Anzahl der Kolonien mit mehr als 20 Zellen werden zwischen dem 7. und dem 14. Tag bestimmt.

6.4.3 Zellwachstums-Inhibitionstest

A431-Zellen werden mit 2,1×10⁴-Zellen pro Näpfchen in 0,3 ml Medium (DMEM mit 10%igem FBS, P/S Glutamin) in Costarplatten (24 Näpfchen etwa 2 cm² pro Näpfchen) ausplattiert und 2 h bei 37°C inkubiert. Anschließend werden die Testverbindungen bei verschiedenen Konzentrationen jeweils 2× in 0,3 ml Medium in jedes Näpfchen gegeben. Die Kontrollnäpfchen enthalten Medium ohne Probe. Die Platten werden bei 37°C 72 h inkubiert. Das Medium wird anschließend abgesaugt, die Zellen werden mit 1 ml PBS/Näpfchen gewaschen, mit 0,5 ml Trypsin (0,5%-EDTA, 0,5 mM) abgelöst und unter Verwendun eines "Coulter"-Zählers gezählt.

6.5 Analyse der AR-Primärstruktur 6.5.1 Reduktion und S-Pyridylethylierung

AR (20-30 µg) wird in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugen- Polypropylenröhrchen getrocknet und in 100 µl 3M Harnstoff in 0,05 M TRIS-HCl, pH 7,5, suspendiert. 4 µl 2-Mercaptoethanol werden zu dem Gemisch hinzugefügt, vermischt, mit Stickstoff gespült und bei 25°C inkubiert. Nach 2,5 h gibt man 4,5 µl frisch destilliertes 4-Vinylpyridin zu dem Gemisch hinzu, spült das Röhrchen erneut mit Stickstoff und inkubiert 2 h bei 25°C. Das Reaktionsgemisch wird auf pH 2,0 mit 10% TFA angesäuert. Das S-pyridylethylierte AR wird durch rp HPLC unter Verwendung einer µ-Bondapak C18-Säule (3,9×300 mm, Waters) gereinigt. Die Acetonitrilkonzentration wird innerhalb von 55 Min. linear erhöht (1%/Min.) bei einer Flußrate von 1 ml/Min. Als erstes Lösungsmittel wird 0,1% TFA verwendet. S-Pyridylethyliertes AR (SPE-AR) wird bei etwa 26,5% Acetonitril, einer um etwa 4% höheren Acetonitrilkonzentration als für unbehandeltes AR, eluiert.

6.5.2 N-Glycanase-Behandlung

AR oder S-pyridylethylierts AR (10 bis 20 µg) wird in 1,5 ml Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen getrocknet und in 80 µl 0,1 M Phosphatpuffer, pH 5,5, suspendiert. Man inkubiert das Gemisch 16 h bei 37°C, fügt 0,9 ml 0,2 TFA zu dem Reaktionsgemisch hinzu und injiziert eine Probe in eine Ultrapore- RPSC C3 rp HPLC-Säule (4,6×75 mm, Altex) bei einer Flußrate von 1 ml/Min. in Anschluß an eine Äqilibrierung der Säule mit 0,1% TFA als erstem Lösungsmittel. Acetonitril mit 0,1% TFA wird als zweites Lösungsmittel verwendet. Die Acetonitrilkonzentration wird linear (0,4%/Min.) während 85 Min. bei Zimmertemperatur erhöht. N-deglykosiliertes AR und N-deglykosilierts S-pyridylethyliertes AR werden bei einer Acetonitrilkonzentration von annähernd 16,5 bzw. 20,5% eluiert.

6.5.3 Enzymatische Spaltung von N-glykanasebehandeltem S-pyridylethyliertem AR

Spaltung mit Endopeptidase Lys-C wird in 60 µl 0,1 M TRIS-Essigsäurepuffer, pH 8,0 innerhalb von 16 h bei 25°C durchgeführt. Das Enzym/Substratverhältnis beträgt 1 bis 5 (w/w).

Endopeptidase-Arg- und S. Aureus V8-Proteaseverdauung werden in 80 µl 0,05 M TRIS-HCl, pH 8,0 und 0,1 M Ammoniumbicarbonat innerhalb von 16 h bei 37°C durchgeführt. Das Enzym/Substratverhältnis beträgt wieder 1 bis 5.

6.5.4 Chemische Spaltung

Zur CNBr-Spaltung am Methioninrest werden 5 µg N- glycanase-behandeltes S-Pyridylethyliertes AR in 1,5 ml Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen getrocknet, in 75 µl 70% Ameisensäure suspendiert und anschließend mit 25 µl einer CNBr-Lösung (25 mg/ml in 70% HCOOH) versetzt. Man mischt und spült das Röhrchen mit Stickstoff. Die Reaktion führt man 22 h bei 25°C im Dunklen durch. Das Reaktionsgemisch wird auf 1,1 ml mit Wasser verdünnt und in einem Speed-Vac-Konzentrator getrocknet. Die getrocknete Probe in 20 µl 2-Aminoethanol suspendiert, 10 Min. bei 22°C aufbewahrt und anschließend vakuumgetrocknet. Das Gemisch wird in 0,9 ml 0,2% TFA suspendiert.

6.5.5 Peptidisolierung

Die Peptide werden auf einer Reverse-Phase HPLC C8- Säule (4,6×100 mm, Whatman) getrennt, die an ein HPLC-System (Waters) angeschlossen ist. Die angesäuerte Probe (pH 2,0) wird bei einer Flußrate von 1 ml/Min. auf eine Säule aufgetragen, die mit 0,1% TFA (erstes Lösungsmittel) äquilibriert ist. Anschließend wäscht man die Säule mit 15 ml 0,1% TFA. Man verwendet lineare Gradienten zwischen dem ersten Lösungsmittel und dem zweiten Lösungsmittel Acetonitril mit 1% TFA. Die Gradientenparameter sind: 0 bis 50% in 125 Min. bei einer Flußrate von 0,5 ml/Min.

6.5.6 Aminosäureanalyse

Getrocknete Proben werden mit konstant siedender HCl (5,7 M Pierce), welche 1% (v/v) Phenol enthält, bei vermindertem Druck in einer Teflon-versiegelten Glashydrolyseampulle (Pierce) bei 105°C während 16 h hydrolysiert. Die Hydrolysate werden in einem Speed-Vac-Konzentrator (Savant Instruments) getrocknet und mit Phenylisothiocyanat 20 Min. bei Zimmertemperatur derivatisiert. Die Phenylthiocarbamylaminosäure- Derivate werden durch rp HPLC auf einer Octadecylsäule (4,5×250 mm, IB) analysiert. Es wird ein linearer Gradient zwischen dem ersten Lösungsmittel (0,15 M Natriumacetat, pH 6,4, 0,05% Triethylamin, titriert auf pH 6,4 mit Essigsäure) und dem zweiten Lösungsmittel (60% Acetonitril) bei einer Flußrate von 1 ml/Min. bei 38°C verwendet.

6.5.7 Bestimmung der Aminosäuresequenz

Peptidsequenzen werden auf einem Applied-Biosystem- Modell 475-Gasphasensequenator wie beschrieben bestimmt (Hewick et. al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 7990-7997). Drei Vorcyclen des Edman-Abbaus werden vor dem Einbringen der Probe vor jedem Lauf durchgeführt. 25% TFA wird zur Überführung der Triazolin-Derivate in die Phenylthiohydantoinaminsäuren verwendet. Die Identifizierung der Phenylthiohydantoinaminosäuren wird on-line auf einem PTH-Analyzer Modell 120A (Applied Biosystem) wie beschrieben (Hunkapiller and Hood, 1983, Science 219: 650-659) durchgeführt.

6.5.8 Verschiedene Behandlungen

50 bis 100 Units von entweder halbgereinigtem (semi-präparativer rp C18-Schritt) oder von gereinigtem AR werden für diese Experimente verwendet (Tabelle 1). N-Glykanase und O-Glykanase werden von Genzyme Corp., Boston bezogen; alle anderen Enzyme werden von Boehringer Mannheim Biochemicals oder Worthington Biochemicals bezogen. Die Behandlungen werden in 50 bis 200 µl eines geeigneten Puffers durchgeführt. Die Enzyme werden im Überschuß verwendet, gewöhnlich 5 bis 20% (w/w) der Substratkonzentration. Nach den Behandlungen werden die Proben auf GIA nach Entfernung störender Verbindung mit Hilfe unterschiedlicher analytischer Mittel getestet. In den meisten Fällen wird der pH der Proben mit 10% TFA auf etwa 2 eingestellt. Die Proben werden auf eine Reverse-Phase Ultra-pore RPSC C3-Säule (4,6×75 mm, Altex) aufgetragen, welche mit 0,1% TFA äquilibriert ist. Die Säule wird mit dem ersten Lösungsmittel 0,1% TFA gewaschen. Anschließend erfolgt die Elution unter Verwendung von Acetonitril mit 0,1% TFA als zweites Lösungsmittel. Die Gradientenparameter sind 0 bis 50% 0,2 Min. und 50 bis 50%, 19,8 Min. Die Flußrate beträgt 0,5 ml/Min. und Fraktionen mit 2 ml Volumen werden gesammelt. Proben davon werden auf GIA getestet. Die AR-Aktivität wird gewöhnlich mit Fraktion 4 eluiert.

6.6 DNA-Bindungsstudien

Die Bindung von AR an native Kalbsthymus-DNA-Cellulose, denaturierte Kalbsthymus-DNA, und Cellulose wird wie beschrieben durchgeführt (Herick and Alberts, 1971, Methods Enzymology 21: 198). Die Cellulose (10 mg) werden in 500 µl Beladungspuffer (20 mM Tris PH 7,4, 10% Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM β-Mercaptoethanol, 100 µg/ml BSA und 50 mM NaCl) rehydratisiert. Die Reaktionen werden zweimal in 1,5 ml Eppendorf-Behältern mit 300 µl hydratisierten (gepacktes Volumen) Celluloseproben durchgeführt, welche 5× mit Beladungspuffer gewaschen wurden. Anschließend gibt man 0,2 ng ¹²⁵I-AR (spezifische Aktivität 425 µCi/µg) oder andere ¹²⁵I-markierte Proteine in 250 µl Beladungspuffer zu jedem Gefäß hinzu. Die Proben werden gemischt und 20 Min. bei 4°C unter periodischem Schütteln inkubiert und anschließend 5× mit je 200 µl Beladungspuffer gewaschen. Die Elution erfolgte schrittweise mit 0,1 M, 0,15 M, 0,25 M, 0,6 M, 1 M und 2 M NaCl in Beladungspuffern (5× mit 200 µl bei jeder Konzentration). Als spezifisch gebundenes Material wird solches betrachtet, welches bei einer NaCl- Konzentration von 0,25 M oder größer eluiert wird. Das bei einer Konzentration von 0,15 M NaCl oder weniger eluierte Material gilt als nicht-spezifisch gebunden.

6.7 Ergebnisse 6.7.1 P 94790 00070 552 001000280000000200012000285919467900040 0002003902157 00004 94671roduktion von AR durch TPA-behandelte MCF-7-Zellen

MCF-7-Zellen, die auf einem plastischen Substrat gezogen werden, zeigen typische ephiteliale Eigenschaften: die Zellen sind klein und weisen eine polygonale Form auf. TPA induziert deutliche morphologische dosisabhängige Veränderungen. Im Anschluß an eine TPA-Behandlung verlieren MCF-7-Zellen ihre definierte Morphologie, formen sich rundlich und breiten sich aus. TPA führt zu einer dosisabhängigen Reduktion der Zellzahl und zu einer Zunahme des Zellvolumens im Vergleich zu unbehandelten Zellen.

Serumfreies konditioniertes Medium von MCF-7-Zellen enthält keinerlei nachweisbare wachstumsinhibierende Aktivität für A431-Zellen. Serumfreier Überstand, der jedoch nach einer 2- bis 3tägigen Behandlung von MCF-7-Zellen mit TPA isoliert wird, inhibiert die Proliferation von A431-Epidermal-Karzinomzellen. Optimale Induktion der inhibierenden Aktivität wird bei 25 bis 100 ng/ml TPA beobachtet. Auch nach Entfernung von TPA sezernieren TPA-behandelte MCF-7-Zellen diese Aktivität in das serumfreie Medium noch wenigstens 8 Tage. Obwohl eine Verminderung der wachstumsinhibierenden Aktivität innerhalb dieses Zeitraums nach der TPA-Entfernung zu beobachten ist, weisen diese Ergebnisse auf Amphiregulin hin, dessen Expression in TPA behandelten MCF-7-Zellen impliziert oder verstärkt wurde.

6.7.2 Erste Charakterisierung

Tabelle II faßt den Einfluß verschiedener physikalischer chemischer und enzymatischer Behandlungen auf die anti-proliferative Aktivität von Amphiregulin zusammen. Die wachstumsinhibierende Aktivität (GIA) bleibt trotz Behandlungen mit 1 M Essigsäure, 1 M Ammoniumhydroxid, 6 M Harnstoff, 0,01 M Natriummetaperiodat, 30minütiges Erhitzen auf 56°C und Behandlungen mit Neuraminidase, N-Glykanase, O-Glykanase, Lipase, Phospholipase A2, C oder D erhalten. Die Aktivität reagiert jedoch auf 10minütige Hitzebehandlung bei 100°C, auf Reduktion, auf Reduktion und 4-Vinylpyridinbehandlung und auf Verdauung mit Proteinasen, wie Trypsin, Endopeptidase Lys-C, Endopeptidase-Arg und Endopeptidase-Glu (V8). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß Amphiregulin ein Protein ist, welches Cystein in Disulfidbrücken enthält, welche von essentieller Bedeutung für die biologische Aktivität sind. Das Protein kann Oligosaccharid- und/oder Lipideinheiten enthalten, die für die biologische Aktivität nicht obligatorisch sind.

Einflüsse verschiedener Behandlungen auf die GIA von Amphiregulin
Behandlung
Prozent der Kontrolle
1 M Essigsäure, 2 h bei 4°C
102
1 M NH₄OH, 2 h bei 4°C	97
56°C bei 30 in	96
100° bei 10 in	5
6 M Harnstoff (2 h bei 25°C)	82
0,2 M 2-Mercaptoethanol (2,5 h bei 25°C)	6
2-Mercaptoethanol + 4 Vinylpyridin (2,5 h bei 25°C) + (2 h bei 25°C)	1
0,01 M Natrium-metaperiodat (6 h bei 4°C im Dunkeln)	86
TPCK-Trypsin (6 h bei 37°C)	3
TPCK-Trypsin + Soyabohnen-Inhibitor (6 h bei 37°C)	82
Soyabohnen-Trypsin-Inhibitor (6 h bei 37°C)	109
Endopeptidase Lys-C (20 h bei 25°C)	5
Endopeptidase Arg (16 h bei 37°C)	4
Endopeptidase Glu (16 h bei 37°C)	6
Neuraminidase (16 h bei 37°C)	103
N-Glycanase (16 h bei 37°C)	90
O-Glycanase (16 h bei 37°C)	102
Neuraminidase + N-Glycanase (16 h bei 37°C)	94
Neuraminidase + O-Glycanase (16 h bei 37°C)	105
Phospholipase A2 (6 h bei 37°C)	82
Phospholipase C (6 h bei 37°C)	95
Phospholipase D (6 h bei 37°C)	80
Lipase (6 h bei 37°C)	111

6.7.3 Reinigung von Amphiregulin

Eine Zusammenfassung der Amphiregulin-Reinigung ist in Tabelle III enthalten. Es wird eine 1842fache Anreicherung mit 5,1% Ausbeute für die TsK 250-I- Fraktion I und eine 2270fache Anreicherung mit 1,7% Ausbeute für die TSK-Fraktion II erreicht. Das Verfahren ist reproduzierbar. Amphiregulin wurde 4× mit ähnlichem Ergebnis gereinigt. Die spezifische Aktivität von gereinigtem Amphiregulin liegt im Bereich von 2,7 bis 3,4×10⁶-Units/mg-Protein. Gereinigtes Amphiregulin von der TSK-250 I-Säule weist eine spezifische Aktivität von 3,0×10⁶ auf und wurde zur Strukturbestimmung und anderen biochemischen Studien verwendet.

Tabelle III

Zusammenfassung der Reinigung von Amphiregulin (GIA)

6.7.4 Analyse von Amphiregulin (AR) und S-pyridylethyliertem Amphiregulin (SPE-AR) durch HPLC

Die Gelpermeations-Chromatographie von AR und SPE-AR über eine TSK-250-Säule (7,5 × 600 mm, Bio-Rad) ist in den Fig. 5A bzw. 5B dargestellt. Die Aktivität wurde zusammen mit dem Protein-Peak eluiert (5A). Das Molekulargewicht von AR und SPE-AR wurde aus den Daten in Fig. 5 bestimmt und beträgt etwa 14 000 bzw. 17 000. Die berechneten Molekulargewichte für die Strukturen von verkürztem AR und AR in Fig. 12 betragen etwa 8500 bzw. 9100 Dalton.

AR und SPE-AR wurden als symmetrische Einzel-Peaks von einer Ultrapore RPSC C3 rp HPLC-Säule (4,6 × 75 mm, Altex) Fig. 6A und b) eluiert. Die GIA wurde zusammen mit dem Protein-Peak eluiert (Fig. 6A). SPE-AR wurde bei einer Acetonitril-Konzentration von etwa 21%, und somit bei einer um etwa 4% höheren Acetonitril-Konzentration im Vergleich zu unbehandeltem Protein, eluiert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß AR reich an Cysteinresten ist, die durch 4-Vinylpyridin modifiziert werden, wodurch AR hydrophober wird und folglich bei einer höheren Acetonitrilkonzentration eluiert wird.

6.7.5 SDS-PAGE-Analyse von AR

Fig. 7A zeigt eine Analyse von AR, N-Glykanase behandeltem AR (NG-AR), SPE-AR und N-Glykanase-behandelten AR (NG-SPE-AR) in 15% Acrylamid unter reduzierenden Bedingungen (Fig. 7A). AR und SPE-AR wandern in dem Gel als breite diffuse Einzelbande mit einem mittleren relativen Molekulargewicht von 22 500 innerhalb eines Bereichs von 20 000 bis 25 000 (Bahnen 1 und 3). Die Behandlung von AR und SPE-AR mit N-Glykanase führt zu einer größeren Wandergeschwindigkeit dieser Proteine. NG-AR und NG-SPE-AR wandern in Form einer Einzelbahn mit einem mittleren Molekulargewicht von 14 000 bzw. 14 500 Dalton. Ähnliche Ergebnisse erhält man, wenn die Proteine in einem 15%igem Gel unter nichtreduzierenden Bedingungen analysiert werden (Daten nicht angegeben). Die Behandlung von AR mit Neuraminidase, O-Glykanase oder Neuraminidase und O-Glykanase zusammen führen zu keiner Veränderung der elektrophoretischen Mobilität in einem Gel unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen. AR ist somit ein Einzelstrang-Glykoprotein und enthält eine oder mehrere N-verbrückte Oligosaccharidketten, die in vitro für die GIA von AR nicht erforderlich sind.

Die Behandlung von NG-AR oder AR mit Phospholipase D (PLD) (Kohl) führen zu einer GIA-Reduktion auf 80% des Kontrollwerts. PLD-behandeltes NG-AR wird auf eine C3-rp HPLC-Säule aufgetragen und die gereinigten aktiven Peaks werden auf einem 20% SDS-PAGE (Fig. 7B) analysiert. Eine Einzelbande mit Mr 5600 ist zu beobachten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß PLD oder eine oder mehrere Protease- Kontaminationen in der PLD-Preparation AR in ein oder mehrere aktive Fragmente überführen.

6.7.6 Analyse von AR durch isoelektrische Fokusierung (IEF)

Eine IEF-Analyse von ¹²⁵I-markiertem AR wird gemäß der Anleitung in Abschnitt 6.1.1.2, oben, durchgeführt. AR wird als einzelne breite Bande mit einem P_I-Wert zwischen 7,6 und 8 fokussiert (Fig. 8). NG-AR wird als einzelne Bande mit einem pI-Wert von 8,05 fixiert. AR stellt somit ein basisches einzelnes N-verbrücktes Glykoprotein dar.

6.7.7 Biologische Eigenschaften

Die Inhibition der ¹²⁵I-Deoxyuridinaufnahme in die DNA von A431-Zellen durch verschiedene Konzentration von gereinigtem AR ist in Fig. 9A angegeben. Eine 50%ige Inhibition der DNA-Synthese wird bei annähernd 0,2 ng/Näpfchen beobachtet. Eine 50%ige Inhibition der DNA-Synthese in A431-Human-Epidermal- Karzinomzellen ist daher bei einer Konzentration des reinen Proteins von etwa 0,13 nM zu beobachten. Es ist zu bemerken, daß die wachstumsinhibierende Aktivität von AR von experimentellen Bindungen, wie der Anzahl der Zellen pro Näpfchen (Zelldichte), dem Zeitpunkt der Faktor-Applikation, der Behandlungsdauer, der Serumkonzentration sowie von anderen Variablen abhängig ist.

Wenn A431-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener AR-Konzentrationen gezüchtet werden, und das Zellwachstum durch Zählen der Zellen aufgezeichnet wird, findet man, daß AR die A431-Proliferation dosisabhängig inhibiert (Daten nicht angegeben). Das Ausmaß der der ¹²⁵I-Deoxyuridin-Aufnahme in die DNA stellt somit ein gutes Maß für das Zellwachstum dar.

Die Stimulation der ¹²⁵I-Deoxyuridin-Aufnahme in die DNA von Human-Vorhautfibroblasten (Satamoto) in Abhängigkeit von verschiedenen Konzentrationen von gereinigtem AR ist in Fig. 9B dargestellt. Man erhält eine zweifache Stimulierung der ¹²⁵I-Deoxyuridininkorporation bei etwa 0,7 ng/ml oder etwa 0,05 nM AR. Die maximale Antwort ist eine sechsfache Stimulierung des ¹²⁵I-Deoxyuridinseinbaus in diese Fibroblasten. AR wirkt somit als Wachstumsfaktor für Human-Fibroblasten sogar in Gegenwart von 5% FBS.

Der Effekt von AR auf den Einbau von ¹²⁵I-Deoxyuridin in die DNA verschiedener Tumorzellinien und Nicht-Tumorhumanzellinien sowie einige Nicht-Humanzellinien wurde untersucht. Die Daten sind in Tabelle IV zusammengefaßt. AR inhibiert das Wachstum verschiedener Klone von A431-Zellen, Human- Brustkarzinomzellen HTP 132, Human-Ovarial-Tetrakarzinom- Zellen HTP 1575, von Human-Cervix-Epidermal-Karzinomzellen CRL 155, Human-Ovarial-Papillaradenomzellen HTB 75 und Human-Brustadenokarzinomzellen HTB 26. Der Faktor zeigt keine signifikante Wirkung auf eine Vielzahl von Zellen (Tabelle III). AR stimuliert die Aufnahme von ¹²⁵I-Deoxyuridin in mehreren Human-Fibroblastenzellinien, in Human-Hypophysentumorzellen CRL 7386, in Human-Ovarialadenokarzinomzellen HTB 77, in den Leberzellen BSCl der afrikanischen grünen Meerkatze und Rattennierenzellen SA6. AR zeigt keinen signifikanten Einfluß auf die Proliferation von T-, B- oder Endothelial- Zellen. AR supprimiert nicht menschliche proliferative oder cytotoxische T-Zellen-Antworten in gemischten Leukocytenkulturreaktionen (MLC).

AR stellt ein monomeres Protein dar, welches für seine Aktivität Disulfidbrücken innerhalb der Proteinkette benötigt. Eine Glykosilierung ist für die Aktivität nicht erforderlich. AR ist stabil unter schwach sauren und basischen Bedingungen sowie bei 30minütiger Hitzebehandlung bei 56°C. Die biologische Aktivität von AR geht vollständig verloren durch Reduktion, durch 5-minütige Hitzebehandlung bei 100°C, durch Verdauung mit Trypsin, Endopeptidase Lys-C, Endopeptidase ARG oder Endopeptidase GLU.

Tabelle IV

Wirkung von Amphiregulin auf die Proliferation von Zellena)

Der Einfluß von AR und EGF auf die NRK-SA6-Zellenkoloniebildung in Softagar in Gegenwart bzw. Abwesenheit von TGF-β wurde getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. EgF induziert in Gegenwart von TGF-β ein dosisabhängiges und verankerungsunabhängiges Wachstum von SA6- Zellen. AR ist ein sehr schwacher Induktor für die SA-G- Koloniebildung in Softagar.

Effekt von AR und EGF auf NRK-SA6-Zellen-Koloniebildung in Softagar
Zugabe (pro ml)
Anzahl der Kolonien pro 6 Felder
keine
0
TGF-β (1 ng)	0
AR (2 ng)	0
AR (4 ng)	0
AR (2 ng) + TGF-β (1 ng)	7
AR (4 ng) + TGF-β (1 ng)	8
EGF (2 ng)	0
EGF (4 ng)	6
EGF (2 ng) + TGF-β (1 ng)	30
EGF (4 ng) + TGF-β (1 ng)	114

Die Tests wurden wie in Abschnitt beschrieben.

6.7.8 Einfluß von AR auf die Bindung von EGF an dessen spezifische Rezeptoren

Man findet, daß AR die Bindung von ¹²⁵I-EGF an A431- Zellen sowie an A431-Plasmamembranen inhibiert (Fig. 10). Eine 50%ige Inhibition der ¹²⁵I-EGF-Bindung an fixierte Zellen und Membranen ist bei etwa 1,1 nM bzw. 1,8 nM zu beobachten, während eine 50%ige Reduktion der EGF-Bindung an Zellen und Membranen bei etwa 1,8 nM bzw. 5,7 nM AR zu beobachten ist. Unmarkiertes EGF inhibiert die ¹²⁵I-EGF-Rezeptorwechselwirkung bei höheren Konzentrationen in beiden Systemen. Die Kompetitions-Maxima mit AR betrugen 75% und 50% für die Bindung an Zellen bzw. Membranen. Die Kompetitions-Kurven für AR verlaufen mit denjenigen von EGF nicht parallel. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß AR eine geringere Aktivität gegenüber EGF- Rezeptoren zeigt als EGF selbst. Außerdem könnte der AR-spezifische Rezeptor mit dem EGF-Rezeptor nahe verwandt sein.

Aus mehreren selektionierten Klonen der A431-Zellinie mit unterschiedlicher Sensitivität gegenüber der AR-Inhibition ist eine fehlende Korrelation zwischen AR-Sensitivität und der Anzahl der EGF-Rezeptoren pro Zelle oder dem K _D-Wert zu beobachten.

Tabelle VI

Fehlende Korrelation zwischen Amphiregulin-Sensitivität verschiedener A431-Klone und dem K _D-Wert des EGF-Rezeptors

Verschiedene A431-Klone wurden durch Wachstum im Softagar selektioniert. EGF-Bindung erfolgte gemäß Abschnitt 6.6.1.5 oben. K _D und die Anzahl der Bindungsstellen wurden aus Scatchards-Plots abgeleitet (Scatchard et al., 1949, Ann.N.Y. Acad. Sci. 51 : 660-672).

6.7.9 Chemische Struktur von Amphiregulin

Die Aminosäuresequenz von AR wurde aus der Mikrosequenzanalyse von S-pyridylethyliertem Protein (SPE-AR) und den durch Endoproteinase Lys-C, Staphylococcus aureus-Protease V8 und Endopeptidase Arg erzeugten Fragmente abgeleitet. Die Sequenzen des verkürzten Protein sowie des Proteins mit sechs zusätzlichen Aminosäuren sind folgende:

Verkürztes AR

Größeres AR

In den oben angegebenen Sequenzen werden die Aminosäuren mit dem üblichen Einbuchstabencode für eine Aminosäure bezeichnet. Aminosäuren, deren Identität nicht völlig abgesichert ist, sind in Klammern angegeben. Der Buchstabe "X" bezeichnet Aminosäuren unbekannter Identität. Die Menge des größeren AR beträgt etwa 16% des verkürzten AR.

Die Proteinsequenz von AR wurde mit allen Proteinen in der National Biomedical Research Foundation-Datenbank (PIR 13) und in der Genetic Sequenz-Datenbank (Bolt Beranek und Newman Inc. Los Alamos National Laboratory DNA sequence library (Release γ #12) verglichen. Diese Recherchen ergaben, daß AR ein neues Protein ist und zur EGF-Oberfamilie von Wachstumsfaktoren gehört. Diese Familie umfaßt EGF (Maus, Mensch, Ratte, Rind usw.), TGF-α, virale Wachstumsfaktoren (Vaczina, Myso, Shopefibroma), Human-Plasminogenaktivator, Rinderfaktor IX, menschlicher Faktor X, LDL-Rezeptor, Rinderprotein C, menschliches Proteoglykan-core-protein, Produkt des Drosophila Notch-Gens, Produkt des C. elegans lin 12-Gens, und das Produkt des "cell lineage" spezifischen Gens für Seeigel S. Purpuratus. Ein Vergleich der AR- Struktur mit den Strukturen von Proteinen der EGF-Oberfamilie ergibt, daß AR wie andere Mitglieder der EGF-Oberfamilie, die charakteristischen sechs essentiellen Cysteinreste enthält, die Konservierung der Abstände zwischen den Cysteinresten beibehält und einen Teil der charakteristischen stark konservierten Aminosäuren enthält. Es scheint, daß AR zwischen EGF und TGF-ähnlichen Mitgliedern bzw. MGF- und SFGF-ähnlichen Mitgliedern der Wachstumsfaktorfamilie einzuordnen ist, insbesondere im Hinblick auf das Auftreten von Asparagin. Beispielsweise weisen an Position 2 (erstes Cystein=1) alle TGF's und EGF's einen Prolinrest auf, VGF zeigt einen Glycinrest und MGF, SFGF und AR besitzen einen Asparaginrest. In der gleichen Schleife an Position 7 besitzen EGF's und VGF's einen Glycinrest, TGF's einen Glutaminrest und MGF, SFGF und AR einen Asparaginrest. Jedoch in der dritten Schleife weist AR nicht den konservierten Betaturn an Position 34 auf (entweder ein Asparagin in MGF und SFGF und ein Glycinrest bei all den anderen Mitgliedern), sondern besitzt an dieser Stelle einen Glutaminsäurerest (niedriges Betaturn-Potential). AR besitzt eine andere Struktur für den stark konservierten dritten Loop, der die Rezeptorbindung beeinflussen kann. Im AR fehlen auch die Asparaginreste, welche möglicherweise in MGF und SFGF als Glykosilierungsstellen innerhalb der Wachstumsfaktorstruktur verwendet werden.

Die N-terminale Sequenz von AR zeigt eine gewisse Analogie mit den N-terminalen Sequenzen von TGFs, VGF und MGF insofern, als sie reich an Prolinen, Serinen und Threoninen ist und wie TGFs und VGF potentielle N-verbrückte Glykosilierungsstellen (in Wirklichkeit eine Stelle) und ebenso die Möglichkeit zur O-verbrückten Glykosilierung in diesem Bereich aufweist, da diese Region reich an Serinen, Threoninen und Prolinen ist. Dieser Bereich ist stark konserviert zwischen dem N-Terminus des TGF-Prekursors und dem N-Terminus von VGF und scheint eine stark glykosilierte Region zu sein.

AR ist ein extrem hydrophiles Protein, insbesondere im Bereich der Aminosäuren 8 bis 45 (Fig. 2). Das Hydropathizitätsprofil von AR zeigt wenig Ähnlichkeit mit den Profilen anderer Mitglieder der EGF-Familie. Das Hydrophatizitätsprofil des C-terminalen Bereichs von AR unterscheidet sich trotz struktureller Verwandtschaft mit anderen Mitgliedern der EGF-Familie, gegenüber den Profilen anderer Mitglieder dieser Familie (Fig. 11B und C).

6.7.10 Spezifische Bindung von AR an DNA

¹²⁵I-AR wird auf seine Fähigkeit zur Anbindung an Cellulose, denaturierter DNA-Cellulose und nativer DNA-Cellulose gemäß den Testbedingungen in Abschnitt 6.6, oben, geprüft. Die Ergebnisse in Fig. 14A weisen darauf hin, daß AR spezifisch sowohl an denaturierte als auch an native DNA-Cellulose, nicht aber Cellulose selbst bindet. Die Anbindung an nativer DNA war 3 bis 4 × größer als die Anbindung denaturierter DNA.

Die Fähigkeit von AR zur spezifischen Anbindung an DNA unterscheidet AR von allen anderen Mitgliedern der EGF-Oberfamilie. Beispielsweise ist EGF nicht in der Lage an DNA-Cellulose anzubinden (Fig. 14B). Die Ergebnisse geben einen starken Hinweis darauf, daß die hydrophile 45 Aminosäuren-N-terminale Domäne von AR, die weder in EGF, noch in anderen Mitgliedern der EGF- Familie zu finden ist, eine nukleare Lokalisierungssequenz darstellt, welche beim "Targeting"-Vorgang von AR zum Nukleus beteiligt ist, wo dann der Faktor mit der DNA wechselwirkt.

7. Beispiel: Antikörper gegen Amphiregulin

Die Produktion von Antikörpern gegen AR, synthetischem AR und AR-Prekursorpeptiden wird in den folgenden Unterabschnitten beschrieben.

7.1 Material und Methoden 7.1.1 Festphasenpeptid-Synthese

Amphiregulin wird gemäß Abschnitt 6 hergestellt und gereinigt. Fünf Peptide, die den Resten 31-50 (Nr. 279), 71-90 (Nr. 280), 108-130 (Nr. 264), 166-184 (Nr. 259) und 221-240 (Nr. 281) der AR- Primärstruktur entsprechen (Fig. 15) werden mit Hilfe der Festphasentechnik auf einem automatischen Peptid-Synthesizer der Fa. Applied Biosystems Inc. wie beschrieben synthetisiert (Meerrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc. 85 : 2149). Die synthetisierten Peptide werden vom Trägerharz mit Hilfe von HF abgespalten (Tam et al., 1988, J. Amer. Chem. Soc. 105 : 6442). Die synthetischen Peptide werden mit Hilfe der Reserve-Phase-HPLC gereinigt.

7.1.2 Antikörperproduktion

Polyklonale Antiseren gegen maturiertes AR und synthetische AR-Peptide, chemisch konjugiert mit Keyhole-limpet hemocyanin (KLH) werden in jungen erwachsenen weißen Neuseeland-Hasen hergestellt. Die synthetischen Peptide werden mit KLH wie beschrieben konjugiert (Ishikawa et al., 1983, Immunoassay 4 : 235). Maturiertes AR wurde nicht gekoppelt.

AR oder die Peptidkonjugate werden mit dem Ribi- Adjuvans-System emulgiert (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT). Eine Gesamtdosis von 1 ml wird an jeden Hasen verabreicht: 0,8 ml intramuskulär an zwei Stellen in jedes Hinterbein und 0,2 ml subkutan an einer Stelle. Zur Erzeugung von Antiseren gegen maturiertes AR werden 30 µg maturiertes AR für die erste Inokulation verwendet und 15 µg für die folgenden "Booster"-Injektionen. Zur Erzeugung von Antiseren gegen synthetische AR-Peptide werden 100 µg des konjugierten Peptides für die Erstinjektion und 50 µg für die folgenden Booster-Injektionen verwendet. Die Booster-Injektionen erfolgen in drei- bis vierwöchigem Abstand und dem Hasen wird 10 bis 14 Tage nach der Booster-Injektion Blut entnommen.

7.1.3 Immunopräzipitation

AR wird mit ¹²⁵I unter Verwendung der Chloramin-T- Methode (Barridge, 1978, Methods Enzymol. 50 : 54-65) radiomarkiert. 10 µl polyklonales Serum (oder verdünnt in PBS) wird mit 10 µl ¹²⁵I-AR (50 ng/ml, spezifische Aktivität 425 µCi/µg) und 30 µl PBS kombiniert und im wesentlichen wie beschrieben getestet (LeBier et al., 1982, J. Immunol. 129 : 2287- 2292).

7.1.4 Radioimmunoassay

Polyklonale Seren werden 1 : 50 in PBS verdünnt. ¹²⁵I-AR (1 µg/ml, spezifische Aktivität 425 µCi/µg) wird 1 : 200 mit TNEN/0,1% BSA (20 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% NP-40, 0,1% BASA) verdünnt. 10 µl unmarkiertes AR (1 mg/ml), 10 µl verdünntes polyklonales Serum und 30 µl verdünntes ¹²⁵I-AR werden vereinigt und bei Zimmertemperatur 45 Min inkubiert. Eine Protein-A-Sepharose-Lösung wird wie folgt hergestellt: 200 mg trockene Protein-A- Sepharose (Pharmacia) wird mit 1,4 ml PBS rehydratisiert und 80 µl des Rehydrates wird gewaschen und auf 400 µl mit einer Lösung aus 100 mM Tris pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 2 mM PMSF, 1% Aprotinin und 0,5 µg/ml Levpeptin verdünnt. 20 µl Protein-A-Lösung werden dann zu dem Gemisch hinzugefügt und weitere 30 Min. inkubiert. Die Sepharose wird anschließend 2 × mit 500 ml TNEN/0,1% BSA gewaschen, in 50 µl SB (80 mM Tris pH 6,8, 3% SDS, 15% Glycin, 0,01% Bromphenol blau, 5% β-Mercaptoethanol) suspendiert und 5 Min. auf 100°C erhitzt. Die Proben werden zentrifugiert und die Überstände auf Radioaktivität in einem γ-Zähler überprüft. Mit diesen Verfahren können noch 100 pg von AR nachgewiesen werden.

7.1.5 Enzym-linked Immunosorbent-Assay

Die Festphasen-Mikro-ELISA-Methode wurde gegenüber der US-Anmeldung 7 : 0 124 modifiziert. Terasaki Mikrotrays werden durch Zugabe von 5 µl des synthetischen AR-Peptids, das in PBS auf verschiedene Konzentrationen verdünnt wurde, zu jedem Näpfchen hinzugefügt. Anschließend läßt man die Lösung über Nacht bei Zimmertemperatur trocknen. 5% Blotto in PBS wird zu den Platten hinzugefügt und bei Zimmertemperatur 1 h stehengelassen. Im nächsten Schritt werden 10 µl Verdünnungen der polyklonalen Antikörperlösung (verdünnt in PBS/1% Blotto/0,5% Triton X-100) zu jedem Näpfchen hinzugefügt, 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend 4 × mit PBS gewaschen. 5 µl von Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti- Hasen-IgG (Cappel) wird in einer Verdünnung von 1 : 1000 in PBS/1% Blotto/0,05% Triton X-100 jedem Näpfchen hinzugefügt, 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend 6 × mit PBS gewaschen. 10 µl der MicroEIA Chromagan-Lösung (Genetic Systems Corp.) werden in einer 1 : 20-Verdünnung hinzugefügt. Anschließend bestimmt man die Absorption bei OD₄₉₂ nach 20 Min. und 40 Min. gemäß der Genetic Systems-Micro-EIA-Anleitung.

7.1.6 Western-Blotting

Die Proben werden auf einem 15% Polyacrylamidgel oder einem 16%-igen Tricinpolyacrylamidgel in einer BioRad- Minogelapparatur elektrophoretisiert. Das Gel wird anschließend mit einem Nitrocelluloseblatt so in die Kassette eingelegt, daß die Nitrocellulose auf der Kathodenseite angeordnet ist. Der Proteintransfer erfolgt bei einer Stromstärke von 400 mA und konstanter Leistung innerhalb von 30 Min. Die Nitrocellulose wird anschließend entfernt und in 2,5% Blotto/PBS/ 0,2% NP-40 über Nacht bei 4°C eingetaucht.

Der Nitrocellulosefilter wird dann mit Antiserum, verdünnt in 2,5% Blotto/PBS/0,2% NP-40-Reaktionspuffer, 90 Min. bei Zimmertemperatur auf einer Schüttelapparatur versetzt, gefolgt von 4 Waschschritten (jeweils 5 Min.) in 2,5 Blotto/PBS/0,2% NP-40.

Alkalische phosphatase-konjugiertes Protein A (Cappel) 1 : 500 verdünnt in 2,5% Blotto/PBS/0,25% NP-40 wird anschließend zu dem Nitrocelluloseblatt hinzugefügt und 60 Min. bei Zimmertemperatur in einer Schüttelapparatur inkubiert. Der Filter wird anschließend 4 × mit PBS/0,2% NP-40 gewaschen (je 3 Min.), gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation in APS-Puffer (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂). Die Filter werden in einem Farbreagenz (40 ml APS-Puffer, 12 mg 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat (Sigma), 6,8 mg Nitroblautetrazolium (Sigma) hergestellt unmittelbar vor Gebrauch und durch ein 0,2 µm Filter filtriert) entwickelt, die Reaktion wird mit H₂O gequencht und anschließend wird an der Luft getrocknet.

7.2 Charakterisierung von AR-Antikörpern

Polyklonale Antikörper gegen maturiertes AR und synthetische AR-Peptide werden durch Radioimmunopräzipitation, Radioimmuno-Assay, ELISA und Western- Blotting charakterisiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

Tabelle VII

Charakterisierung von Antikörpern gegen Amphiregulin und synthetisches AR-Peptid

Beispiel: cDNA-Klonierung des Amphiregulin-Prekursors

Das folgende Beispiel beschreibt Klonierung und Analyse von cDNAS, die für den Amphiregulin-Prekursor aus TPA-behandelten MCF-7-Humanbrustkarzinomzellen kodieren.

8.1. Material und Methoden 8.1.1 RNA-Präparation

Die RNA wird aus subkonfluenten Zellen, die in T150- Gewebskulturflaschen gezüchtet wurden oder aus frisch aufgetauten Gewebskulturen mit Hilfe der von Chirgwin (1979, Biochemistry, 19, 5294) beschriebenen Guanidinium- Methode isoliert. Zellen aus vier T150-Flaschen werden in PBS gewaschen, trypsinisiert und erneut in PBS gewaschen. Das Pellet wird in 8 ml 4M Guanidiniumisothiocyanat- Lösung suspendiert. Die DNA wird beim Durchlauf der Lösung durch eine "18 Gauge"-Nadel verkleinert. Mit der Probe werden 2,4 ml einer 5,7 M CsCl-Lösung in einem Beckman-SW41Ti-Becher überschichtet und bei 32 000 Upm 20 h bei 20°C zentrifugiert. Die Pellets werden in 300 µl 2,5 M CsCl resuspendiert, und bei Zimmertemperatur mit 2 Volumina EtOH präzipitiert. Die Pellets werden in 300 µl H₂O resuspendiert und nach Zugabe von 35 µl 3M Natriumacetat (pH 5,1) und 800 µl EtOH wird RNA bei -70°C präzipitiert. Die Ausfällung wird wiederholt und die RNA kurz getrocknet. Anschließend wird die RNA in 100 µl H₂O resuspendiert bei OD₂₆₀ quantifiziert und bei -70°C gelagert.

8.1.2 "Random Primed"-Markierung mit ³²P-TTP

Spezifische Fragmente für die AR-kodierende Region werden aus "low gel temperature"-Agarose (BioRad) ausgeschnitten und mit ³²P-TTP (NEN, 300 Ci/mmol) unter Verwendung der "Random primed"-Methode von Feinberg (1983, Anal Biochem. 137, 266) markiert. Nicht eingebaute Deoxyribunukleoside werden zur Chromatographie über eine 1,5 ml Sephadex-50-Säule entfernt. Spezifische Aktivitäten liegen typischerweise im Bereich von 0,5-2,5 × 10⁹ cpm/µg.

8.1.3 RNA-Gele und Northern-Blot-Analyse

10 oder 20 µg der Gesamt-RNA werden auf 1,2% Agarose/ Formaldehydgelen für die Northern-Blot-Analyse elektrophoretisiert. Die Agarose/Formaldehyd-Gele werden in 40 mM N-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS), pH 7,0/1 mM EDTA/10 mM Natriumacetat/2M deionisiertes Formaldehyd (pH 5,6) in einer IBI VCV-Gelapparatur mit gekühlten Platten vorbereitet. RNA wird im gleichen Puffer mit 50% Formamid bei 65°C denaturiert und in 1 × MOPS bei 20 bis 30 mA während 3 bis 5 h denaturiert und in 1 × MOPS bei 20 bis 30 mA während 3 bis 5 h aufgetrennt. Das Gel wird 30 Min. in 10 × SSC gespült und auf Hybond-N-Membrane (Amersham) transferiert, UV-vernetzt (1200 µJoules) prehybridisiert und in 5 × SSPE (1 × SSPE ist 0,18 M NaCl/10 mM Natriumphosphat, pH 7,7, 0,1 mM EDTA), 5 × Denhardt's, 0,5% SDS, und 20 µg/ml denaturierter Lachs-Sperma-DNA als Carrier hybridisiert. Die Hybridisierungen werden 16 h bei 42°C mit 2 × 10⁶ cpm/ml ³²P-ARBPl durchgeführt. Die Blots werden mehrere Male in 2 × SSC mit 0,1% SDS bei Zimmertemperatur und mit 1 × SSC/0,1% SDS bei 65°C gewaschen und auf einen Kodak X-OMAT-Film mit zwei Dupont-Lightning Plus- Verstärkerschirmen bei -70°C aufgelegt. Die Banden werden als (+) eingestuft, wenn sie über Nacht sichtbar sind, als (+/-), wenn sie nach 3 Tagen sichtbar sind und als (++) wenn sie nach 6 h detektierbar sind.

8.1.4 cDNA-Klonierung

RNA wird aus MCF-7-Zellen nach einer 24, 40 und 72 h- Dauerbehandlung mit 100 µg/ml 12-O-Tetradecanoyl-phorbol- 13-acetat (TPA) isoliert. Poly(A)⁺RNA wird aus einzelnen Pools dieser Proben isoliert und als Matrize für die Doppelstrang-cDNA-Synthese wie beschrieben verwendet (Gubler und Hoffmann, 1983, Gene 25 : 263). G-verlängerte cDNA wird in die EcoRI-Schnittstelle von gt10 unter Verwendung der BR1-Oligonukleotid-Adapter legiert (Rose et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 1261-1265).

Im einzelnen werden 5 µg Poly(A)⁺-RNA aus TPA-behandelten MCR-7-Zellen hitzedenaturiert und mit 5 µg Oligo(dT) unter Verwendung von 100 U reverse Transkriptase in 45 µl Reaktionsvolumen behandelt. Die Synthese des zweiten Stranges wird unter Verwendung 4U RNase H und 115 U.E. Coli DNA pol I durchgeführt. 10 µg T4 DNA-Polymerase werden zur Entfernung von glatten 3′-überstehenden Enden unter Erzeugung von glatten Enden verwendet. Die gesamten 6,8 µg der Doppelstrang- cDNA werden über eine Sephadex G50-Säule nach Größe getrennt. Es werden cDNAs größer 500 bp ausgewählt. Anschließend werden 150 ng cDNA unter Verwendung der terminalen Deoxynukleotidyltransferase durch dG- Tailing verlängert. Die dG-tailed cDNA wird mit der EcoRI-Schnittstelle von λ gt10 unter Verwendung des BR1-Adapters (AATTCCCCCCCCCCCC) ligiert. Die ligierte DNA wird in vitro verpackt (Grosveld et. al., 1981, Gene 13 : 227-237) und auf E. Coli C600 rK^-mK hfl mit einer Effektivität von 10⁶ Rekombinanten/µg cDNA ausplattiert. Es werden doppelte Nitrocellulose-Filterabdrücke von 2,5 × 10⁵-Rekombinanten angefertigt und die Filter werden mit [³²p]-markierten "best guess"- und degenerierten Olionukleotidsonden (Tabelle VII, unten) gescreent. Die Sonden sind aus der AR-Primärsequenz abgeleitet, die durch den automatisierten Edman-Abbau von AR nach N-Glykanasebehandlung, Reduktion und S-pyridylethyliertes AR erhalten wurde (Abschnitt 6, oben).

Die Restriktionsanalyse ergibt eine geringere Anzahl von Schnittstellen in den cDNA-Inserts von pAR1, mit einer Schnittstelle von BsmI, EcoRV, HgaI, NaeI, PvuII, SmaI und SstI und zwei Schnittstellen für SspI. Keine Verdauung innerhalb des Inserts erfolgt mit BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, PvuI, SphI, StuI, und XbaI, Ein 170 bp großes BSmI - PvuII-Fragment wird isoliert und als Sonde für eine zweite cDNA-Genbank von 100 000 Rekombinanten verwendet, die wie oben beschrieben hergestellt wird. Man identifiziert 13 positive Klone mit Inserts in einem größeren Bereich von 300 bp bis 1,3 kb, wobei sechs Inserts größer als 1 kb sind und fünf Inserts eine einzelne SstI-Schnittstelle aufweisen, von denen man weiß, daß sie innerhalb eines 100 bp- Fragmentes am 5′-Ende von pAR1 liegt. Vier der fünf Inserts (pAR3, pAR5, pAR13) werden zur weiteren Restriktions- und Sequenzanalyse subkloniert. Sämtliche dieser Klone weisen identische Restriktionsmuster auf der Basis von BsmI, EcoRV, PvuII, SstI und SmaI auf, mit Ausnahme von pAR9, das am 3′-Ende um 100 bp verkürzt ist und von dem man später fand, daß es von einer A₅- Folge ausgeht, die möglicherweise für ein Priming mit Oligo(dT) geeignet ist.

8.2 Nukleotidsequenz-Analyse von AR-cDNA-Klonen

Exakte Oligonukleotid-Primer werden zur Sequenzierung beider Stränge des 1,230 bp großen pAR1-Klons unter Verwendung der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode verwendet (Sanger et al., 1977, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 74 : 5463-5467). Die gesamte Nukleotidsequenz sowie die davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Klons pAR1 ist in Fig. 16 angegeben. Ein offener Leserahmen von 965 bp beginnt beim Nukleotid Nr. 1. Das erste AUG liegt bei Position 210, stimmt aber nicht mit dem optimalen Kozak- Konsensus für Translationsstartbereiche überein (Kozak, 1984, Nucleic Acids Research 12 : 857-872; Kozak, 1986, Cell 44 : 283-292), da ein Purin an der Position -3 fehlt. Solche AUG-Tripletts können jedoch als Initiator-Kodon dienen (wie Kozak für etwa 3% der untersuchten Informationen gefunden hat; möglicherweise ist auch von Wichtigkeit das Vorliegen eines Adenosins auf Position -1 bei all diesen "weniger bevorzugten" AUGs und in der mRNA von AR. Obowhl ein zweites Methionin beim Nukleotid 378 vorliegt und mit der Initiator-Konsensussequenz übereinstimmt, nimmt man an, daß das erste AUG der eigentliche Translationsstartpunkt ist, da auf diesen eine vorhergesagte 15-Aminosäure- Sequenz folgt, die überwiegend aus hydrophoben Resten besteht, welche von 3 Prolinen unterbrochen wird, was typisch für eine Signalpeptidsequenz ist (Heÿne, 1983, J. Biochem. 133 : 17-21).

Der längste offene Leserahmen, beginnend mit einem Methionin, kodiert für ein 252-Aminosäuren-Polypeptid, und erhält das 19-Reste lange Signalpeptid. Die kodierende Sequenz folgt einer 5′-untranslatierten Sequenz mit 209 Nukleotiden. Auf die kodierende Sequenz folgt das Translationsstoppsignal (TAA) und die 3′-untranslatierte Sequenz mit 262 Nukleotiden. Eine potentielle Poly(A)-Additionssignalsequenz (AATAA) ist 64 Nukleotide upstream (in 5′-Richtung) von einer Folge von 15 Adenylresten zu finden, die wahrscheinlich den Poly(A)-Tail darstellt. Die 3′-untranslatierte Region von AR enthält vier Kopien der Sequenz ATTTTA, die auch in bestimmten Lymphokinen, Cytokinen und Protooncogenen zu finden ist. In GM-CSF mediatisiert diese Sequenz die Destabilisierung und den Abbau der RNA (Shaw, 1986, Cell 46 : 659-667). Eine Konservierung dieser Einheit in funktionell ähnlichen Molekülen weist darauf hin, daß AR auch zu dieser Klasse von Lymphokinen verwandt ist.

Die cDNA-Sequenz bestätigt die Peptidsequenz von maturiertem AR (Abschnitt 6, oben) mit Ausnahme von Aminosäure 113 (Fig. 15), die durch Proteinsequenzierung als Asparaginsäure (D) bestimmt wird. Aus den cDNA-Klonen wird hierfür ein Asparagin (AAT=N) abgeleitet. Von fünf untersuchten cDNAs befanden sich sämtliche 5′-Enden innerhalb der ersten 25 bp der pAR1-Sequenz.

Ein Vergleich der cDNA-Sequenz mit den "best guess"-Sonden ergibt eine Gesamthomologie von 74% (ARK41) und 77% (ARK31). Keine der Proben zeigte bei mehr als 8 aufeinanderfolgenden Basenpaaren eine Übereinstimmung, aber 50 von 67 Nukleotiden von ARK41 ergaben ein detektierbares Signal unter Bedingungen sehr niedriger Stringence. Die Kodonverwendung in der AR-mRNA-Sequenz unterscheidet sich beträchtlich von den Verwendungshäufigkeiten nach den Angaben von Lathe (Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 183 : 1-12). Dies erklärt, warum in diesem Fall die degenerierten Oligonukleotide stärkere Signale ergaben. Aus den cDNA- und Protein-Sequenzen werden zwei Proteine mit einem Molekulargewicht von 9772 bzw. 9173 für die beiden Formen von maturiertem AR auf der Basis der cDNA-Sequenz (Fig. 16) und der Proteinsequenz (Abschnitt 6.7.9) abgeleitet. Das Hydropathie-Profil des AR-Prekursors ist in Fig. 11D angegeben.

Der AR-Prekursor weist drei potentielle N-Glykosilierungsstellen auf, wobei sich eine in der N-terminalen Domäne (Position 30 in Fig. 16) und zwei in der hydrophilen Region des maturierten AR (Positionen 113 und 119) befinden. Man weiß, daß die Glykosilierung 10 bis 12 kd zum Molekulargewicht von maturiertem AR beiträgt und wahrscheinlich durch Kohlenhydrataddition an eine oder an beide dieser Positionen in der hydrophilen Domäne verursacht wird.

Die N-terminale Serin-reiche Domäne des AR-Prekursors (Fig. 15) enthält drei potentielle Tyrosinsulfatierungsstellen bei Y⁸¹, Y⁸³, Y⁸⁷ aufgrund der Anwesenheit saurer Reste, turn-induzierender Aminosäuren und dem Fehlen von Resten, die zu einer sterischen Hinderung beitragen könnten (Huttner, 1987, TIBS 12 : 301-303). Die meisten tyrosinsulfatierten Proteine sind sekretorische Proteine. Man vermutet, daß Modifikationen durch Tyrosinsulfatierung bei der Aktivierung, dem Transport oder der proteolytischen Prozessierung der Prekursorproteine beteiligt sind. Die Serin-reiche Domäne von AR kann ebenso O-verbrückte Kohlenhydratketten aufgrund der großen Anzahl von Serin/Threonin- Resten (23 von 81) in diesen Bereich des Moleküls enthalten, welche Verbrückungsstellen hierfür darstellen. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, daß O-glykosilierte Formen eines anderen Mitglieds der TGF-Familie, dem TGF-α, nachgewiesen wurden (Ignotz et al., 1986, PNAS, 83, 6307-6311).

Keiner der Serinreste im AR-Prekursor stimmt mit der Konsensussequenz für die cAMP-abhängige Kinasephosphorlierungsstellen überein (Grima et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 617-621). Außerdem besitzt keiner der Tyrosinreste ähnliche flankierende Sequenzen, wie bekannte Phosphotyrosinreste.

Die hydrophile Domäne des maturierten AR-Proteins besteht aus einer Vielzahl positiv geladener Aminosäuren (16 von 37 Resten sind Lysin- oder Arginin-Reste) einschließlich zweier aufeinanderfolgender Bereiche von 4 bis 5 basischen, geladenen Resten. Das Kern-"targeting"-Signal des SV40 large T-Antigens weist Ähnlichkeiten mit dieser AR- Region auf und enthält eine charakteristische KKKRK-Sequenz, wobei kleine Aminosäuren (Glycin, Alanin, Prolin) vorausgestellt sind, die möglicherweise die Bildung einer α-helikalen Struktur ermöglichen (Burglin et al., 1987, EMBO 6 : 2617-2625, Dingwall et al., 1987, EMBO 6 : 69-74). Durch Mutationsanalyse werden vier aufeinanderfolgende basische Reste als dominierendes Merkmal der SV40-Kern-Lokalisierungssequenz bestimmt (Lanford, 1984, Cell, 37, 801-813). Andere Kern-Proteine mit ähnlichen Abschnitten aus basischen Aminosäuren, die möglicherweise bei Kern-Targetingvorgängen eine Rolle spielen, umfassen Nukleoplasmin, Polyomavirus large T, Histone und m-myc. Eine Fusion verschiedener Kern-Signalsequenzen an die Gene für Hühner-Pyruvatkinease, Albumin, Immunoglobulin, Ferritin und β-Galactosidase führt zu einer Lokalisierung dieser ansonsten cytoplasmatischen Proteine am Kern (Moreland, 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 4048-4057). Ob die hydrophilen Sequenzen in AR bei einem Kern-Targeting dieses Wachstumsmodulators beteiligt sind, wurde nicht überprüft. Durch die Fähigkeit von AR an DNA spezifisch zu binden wird jedoch eine funktionelle Rolle von AR im Kern angedeutet. Hierbei kann AR die DNA-Synthese, den Zellcyclus oder eine Vielzahl anderer Kernvorgänge regulieren.

Der TGF-α-Prekursor enthält eine Vielzahl von Cysteinen in der C-terminalen cytoplasmatischen Domäne, wobei sich an einige dieser Reste Palmitatkovalent anlagert (Bringman, 1987, Cell 48, 429-440). Im Gegensatz hierzu fehlen dem AR-Prekursor jegliche Cysteinreste in der cytoplasmatischen Domäne und es ist anzunehmen, daß der Prekursor keine Palmitatreste enthält. Obwohl die biologische Funktion der Palmitatanlagerung unbekannt ist, stellt dies einen weiteren Unterschied zwischen AR und anderen Mitgliedern der EGF-Oberfamilie dar.

8.3 Zelluläre Quellen für Amphiregulin-Synthese

Eine Northern-Blot-Analyse (Thomas, 1980, PNAS, 77, 5201) unter Verwendung von a³²P-markierten AR-cDNA-Fragmenten zeigt die Hybridisierung einer einzigen 1,4 Kb-großen RNA- Spezies in einer Vielzahl von normalen Humangewebszellinien und Tumorzellinien. Eine einzelne Bande ist in Northern-Blots zu finden, wenn man entweder AREB1 (ein 480 bp BstEII-Pvu II-Fragment von pAR1, das die gesamte kodierende Region von maturierten AR und einen Teil des N-terminalen Prekursors und der Transmembrandomänen enthält) oder AR170 (ein 170 bp BsmI-PvuII-Fragment von pAR1, das lediglich die C-terminale Hälfte von maturierten AR enthält) als markierte Sonden verwendet. Die Ergebnisse in Tabelle IX unten zeigen, daß eine geringe Expression (+) von AR-RNA in normalen adulten Lungengewebe und Pankreasgewebe zu finden ist. Eine niedrigere, gerade noch nachweisbare Expression (+/-) ist in normalen Nieren-Leber- und Gehirn- Gewebe nachzuweisen.

Normales Humangewebe
AR RNA
Lunge
+
Leber	+/-
Pankreas	+
Niere	+/-
Milz	-
Gehirn	+/-
Plazenta	-
Darm, fötal	-

Da AR ursprünglich aus TPA-behandelten MCF-7-Zellen isoliert wird, ist die Bestimmung des zeitlichen Verlaufes der TPA-Induktion von AR-RNA in diesen Zellen von Interesse. MCF-7-Zellen werden 0, 1, 3, 6, 18, 24 und 48 h mit TPA behandelt; die gesamte RNA wird isoliert und 10 µg werden je Spur auf einen 1,2% Formaldehydagarose-Gel aufgetrennt, auf Nylonmembrane übertragen und mit einer ARBP1-Sonde gescreent, welche mit der gesamten kodierenden Region von maturiertem AR komplementär ist. Eine eindrucksvolle Zunahme der 1,4 kb AR-RNA-Spezies ist bereits 1 h nach der TPA- Behandlung zu beobachten, wobei maximale Werte zwischen 18 und 24 h erreicht werden. Anschließende Northern-Blots unter Verwendung einer ³²P-ARBP1-Sonde zeigen eine TPA- Stimulierung der AR-RNA-Synthese in anderen Brustkrebszellinien, wobei allerdings die Maximalwerte niemals die hohen Werte der TPA-induzierten MCF-7-Zellen erreichen.

Man untersucht eine Reihe von Tumorzellinien auf deren AR-RNA-Gehalt sowohl vor als auch 24 h nach einer TPA-Induktion. Die Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengefaßt. Mit wenigen Ausnahmen sind TPA-behandelte Human- Brustkrebszellinien die einzigen Quellen für nachweisbare Mengen von AR-RNA. Eine solche Ausnahme ist Caki-1, eine Human-clear-cell-Nierenkarzinomzellinie, die große Mengen von AR-RNA exprimiert, welche mit den nachgewiesenen Mengen in den TPA-induzierten MCF-7-Zellen vergleichbar sind. Alle überprüften TPA-behandelten Brustkarzinomzellinien zeigen eine AR-spezifische Hybridisierung.

AR besitzt offensichtlich eine funktionelle Rolle in adulter Lunge, Pankreas, Niere, Leber und Gehirn, und ist möglicherweise in einer Vielzahl von Vorgängen, wie Wundheilung, Gewebsregenerierung und Erhaltung neuronaler Zellen beteiligt.

Tabelle X

Beispiel: Genomische Klonierung und Analyse des Amphiregulin-Gens

Das folgende Beispiel beschreibt die genomische Klonierung des Human-Amphiregulin-Gens, dessen Struktur und Intron/Exon-Organisation. Funktionelle und evolutionäre Verbindungen in bezug auf die EGF-Oberfamilie von Wachstumsfaktoren werden ebenfalls diskutiert.

9.1 Material und Methoden 9.1.1 Southern-Blot-Hydrobisierungen

Die gesamte genomische DNA wird aus subkonfluenten Zellen in T150-Gewebskulturflaschen isoliert (Maniats, 1982, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual). 20 µg DNA werden mit den angegebenen Restriktionsenzymen verdaut, auf einem 0,8% Agarosegel elektrophoretisiert und auf Hybond-N (Amersham) mit 20 × SCC-Bottom-Puffer (Southern, 1975, J. Mol. Bio., 98, 503-517) geblottet. Die DNA wird unter Einwirkung von kurzwelligem UV (1200 µJoules) gebunden. Die Filter werden bei 65°C über Nacht im Hybridisierungs-Puffer hybridisiert, der 2 × 10⁶ cpm des ³²P-markierten AR- spezifischen Fragmentes pro ml enthält (6 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und 20 µg/ml gescherte denaturierte Lachssperma-DNA). Die Sonden werden bis zu einer spezifischen Aktivität von 5 bis 25 × 10⁸ cpm/µg "Random prime" markiert. Die Filter werden bei 65°C in 1 × SSC ausgiebig gewaschen und über Nacht bei -70°C autoradiographiert.

9.1.2 Konstruktion der genomischen Genbank

Der Bacteriophage lambda L41,7 wird als Klonierungsvektor ausgewählt und die phosphatase-behandelten Arme werden nach Verdauung mit BamHI, EcoRI und HindIII hergestellt. Hochmolekulare DNA aus MCF-7-Zellen wird mit HindIII verdaut, auf 0,8%iger "Low gel temperature"- Agarose (BioRad) elektrophoretisiert und nach Größe fraktioniert. Die mit dem gewünschten Restriktionsfragment maximal angereicherte Agarose-Fraktion wird bei 65°C geschmolzen und die DNA daraus mit Phenol und NaOAc extrahiert. Anschließend erfolgt eine Ethanol- Präzipitation und eine Resuspension auf 25-100 µg/ml. Die Genbank-Konstruktionen bestehen aus einer Ligierung (über Nacht bei 14°C) von 100 g Lambda L47,1-Armen und 40 ng extrahierter und nach Größe fraktionierter DNA einem Reaktionsvolumen von 5 µl in Anwesenheit von T4 DNA-Ligase (Biolabs). Rekombinante Phagen werden in vitro mit Extrakten aus den E.Coli-Stämmen BHB2688 N205 recA (lambda imm⁴³⁴-cIts b2 red3 Eam4 Sam7) und BHB2690 N202 recA^- (lamda imm⁴³⁴ cIts b2 red3 Dam15 Sam7) verpackt (Grosveld, 1981, Gene, 13, 227-23). Die Genbanken werden auf E. Coli LE392 bestimmt. Genomische Klone werden mit den AR-spezifischen Sonden durch in situ-Plaque-Hybridisierung gescreent (Benton, 19 877, Science 196, 180-182) und man isoliert die DNA aus den Plaque-gereinigten positiven Klonen (Huynh, 1985, In DNA cloning techniques: a practical approach, D. Glover, Hrsg. (Oxford: IRL Press), S. 49-78). Man schneidet die HindIII-Inserts aus und subkloniert diese in pEMBL 18 zur Restriktionsanalyse und zur Vermehrung.

9.1.3 Primer-Extension-Test

Man isoliert RNA aus MCF-7-Zellen wie in Abschnitt 8 beschrieben. Synthetische Oligonukleotide, welche mit den Nukleotiden 40 bis 60 (ARAP) und 76 bis 97 (ARCP) in der AR-cDNA-Sequenz komplementär sind, werden mit Hilfe der T4-Polynukleotidkinase bis zu einer spezifischen Aktivität von 2 bis 5 × 10⁸ cpm/µg ³²P-endmarkiert. 1 Mio. cpm des markierten Oligonukleotids werden als Primer für die 1-Strang-cDNA- Synthese mit 50 µg MCF-7-RNA wie in Abschnitt 8.1.4 beschrieben, verwendet. Das Produkt wird mit RNase A behandelt, mit Phenol und Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert in 80% Formamid bei 100°C 5 Min. denaturiert und durch Elektrophorese auf einem Standard 8% Polyacrylamid-7M-Harnstoff Sequenziergel analysiert.

CAT-Test

MCF-7-Zellen werden wie in Abschnitt 6.2.1 beschrieben, gezüchtet. Für jeden Test werden 1-2 × 10⁶-Zellen in einer 100-mm-Schale in 10 ml Medium ausplattiert, und 24 h später mit 20 µg Calciumphosphat-präzipitierter "supercoiled" Plasmid- DNA versetzt (Southern und Berg, 1982). Die Zellen werden mit frischem Medium 4 h nach der Transfektion gespült und 90 Sek. mit 25% Glycerin schockbehandelt. Die Zellen werden erneut gespült und mit 20 ml frischem Medium mit einem Gehalt von 0 oder 100 ng/ml TPA überschichtet. Die Zellen werden gewaschen und 40 h nach dem Glycerinschock abgeerntet und durch Ultraschallbehandlung in 100 µl 0,25 M Tris-HCL (pH 7,8) lysiert. Die CAT-Aktivität wird im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Gorman et al. (1982) bestimmt. Der Zellextrakt (3-50 µl) wird mit 2,5 mCi ¹⁴C-Chloramphenicol (NEN) in einem Reaktionsvolumen von 150 µl 0,5 M Tris (pH 7,8) und 0,5 mM AcetylCoA versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei 37°C inkubiert, mit 1 ml Ethylacetat extrahiert und auf einer Silikagel-TLC-Platte mit CHCl₃ : 1-Butanol (95 : 5) entwickelt. Die TLC-Platten werden getrocknet und autoradiographiert. Das acetylierte und das nicht acetylierte ¹⁴C-Chloramphenicol wird durch Zählen der ausgeschnittenen Banden in Optifluor quantifiziert. Die Einheiten für CAT Enzymaktivität bezeichnen diejenigen µg-Chloramphenicol, die pro Stunde und pro µg- Protein im Zellextrakt acetyliert werden.

9.1.5 In situ-chromosomale Hybridisierung

Das Plasmid pAR9 wird "random prime"-markiert mit ³H-TTP und zur Hybridisierung mit normalen Human- Metaphasezellen verwendet, die man aus Phytohemagglutinin- stimulierten peripheren Blutlymphocyten herstellt (500 bis 800 band stages). Diese Sonde entspricht einer AR-cDNA der ein Großteil der 3′ untranslatierten Region fehlt und in die EcoRI-Schnittstelle von pEMPL18 eingebaut ist.

Die Hybridisierung wird mit 2, 4, 20 und 40 ng der Sonde pro ml des Hybridisierungsgemisches wie beschrieben durchgeführt (Le Beau, 1985, PNAS, 82, 6692-6696). Die Autoradiogramme werden unter Verwendung einer Kodak NTP-2 Nuklear-Track-Emulsion hergestellt und die Filme werden 7 bis 60 Tage aufgelegt. Chromosomenbanden werden durch Anfärbung mit "quinicrine mustard" sichtbar gemacht.

9.2 Chromosomale Lage des AR-Gens

Die chromosomale Festlegung des Human-AR-Gens wird durch in situ-Hybridisierung der ³H-markierten AR-cDNA mit normalen Metaphasechromosomen bestimmt. Man verteilt Silberkörner auf 50 Metaphase-Ausstrichen, wobei 30% auf die Banden 4q13-4q21 nicht-zufallsmäßig verteilt sind. Dieses Resultat wird bestätigt durch die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) mit Hamster/Human-somatischen Zellhybrid-DNA, die nur das Humanchromosom 4 enthält. Oligonukleotid-Primer, abgeleitet vom AR-Exon 3 und dem flankierenden Intron erzeugen ein 220 bp PCR-Fragment ausschließlich in Human-DNA und in der Chromosom-4-haltigen Hybrid-DNA, während die Hamster-DNA ein negatives Ergebnis liefert.

Die chromosomale Region 4q13-4q21 enthält auch die Gene für gro oder die Melanomwachstums-stimulierende Aktivität (Anisowicz, A. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7188-7192; A. Richmond et al., 1988, J. EMBO, 2025-2033), für den c-Kitrezeptor (Yarden et al., 1987, J. EMBO 6, 3341-3351), den Platelett-Faktor 4 (PF4) (Griffin et al., 1987, Cytogenetic Cell Genet. 45, 43-73), den interferongamma- induzierten Faktor IP-10 (A.D. Luster et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84, 1868-1871), für das Vitamin-D-bindende Protein (gruppenspezifische Komponente) (N.E. Cook et al., 1986, Human Genetics 73, 225-229; J.L. McCombs et al., 1986; Cytogenet Cell Genet, 42, 62-64) und für Statherin, einem Calcium-regulierenden Speichelprotein (Sabatini L.M. et al., 1987, Am. J. Hum. Genet. 41, 1048-1060). Das Gen für EGF ist weiter entfernt bei 4q25 angeordnet.

Gro, IP-10 und PF4 gehören zu einer Klasse strukturell verwandter Peptide, die möglicherweise eine Wachstumsfaktorfamilie bilden, die auf Chromosom 4 als Kluster angeordnet sind. c-Kit-kodiert für einen Zelloberflächenrezeptor, der strukturell und funktionell mit mehreren Wachstumsfaktorrezeptoren verwandt ist, die eine Tyrosin-spezifische Kinaseaktivität aufweisen, wie z. B. dem EGF-Rezeptor, dem Neu-Oncogen, dem PDGF-Rezeptor und dem Insulinrezeptor. Gene für Liganden und die dazugehörigen Rezeptoren befinden sich im allgemeinen auf verschiedenen Chromosomen, doch befinden sich auch einige gemeinsam in einem bestimmten chromosomalen Bereich (Groffin, 1983, Nucl. Acids Res. 11 : 6331-6339; Pettenati, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 2970-2974). Der Ligand für c-Kit wurde noch nicht identifiziert, deshalb ist AR auf eine derartige Aktivität zu testen.

Spezifische Translokationen sind bei einer Vielzahl bösartiger Veränderungen festzustellen. Die am häufigsten zu beobachtende cytogenetische Aberration bei kongenitaler akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), t (4; 11) (q 21; q 23) betrifft diejenige Region, in der AR lokalisiert wurde (S. Heim et al., 1987, Leukemia, 1, 26-23). ALLs werden nun nach Morphologie (gemäß der Morphology as defined by the French-American-British Cooperative Group (FAB), mit B- und T-Zellmarkern und mit Hilfe der Chromosomenanalyse klassifiziert. Diese Klassifikationen dienen als Basis für Diagnose, Prognose und Behandlung der ALL. Ein Drittel aller Fälle von ALL beinhaltet spezifische Translokationen und t (4; 11) entspricht einer Prognosegruppierung, die häufig bei Kindern in einem Alter von weniger als 16 Monaten mit einer mittleren Lebenszeit von weniger als 1 Jahr zu finden ist (Kocova et al., 1985, Cancer Genetics and Cytogenetics 16, 21-32).

Translokationen, die Region 4q21 betreffen, sind auch in T-Lymphomas (E.G. Levine et al., 1986, Cancer Res. 46, 6481-6488) und in einem Fall von akuter myeloblastischer Leukämie (AML) (A. Selypes, 1987, Human Genet, 76, 106-108) beobachtet worden. Diese Region enthält auch die Gene für ein dentales Dysgenesis-Syndrom und dem "Piebald Trait" zu einer vererbten Erkrankung, die aufgrund von fehlender Melanoblasten-Migration und Differenzierung zu einer fleckigen Hautpigmentierung führt (J.J. Hoo et al., 1986, Human Genet. 73, 230-231).

Bindungsstudien zwischen AR und den auf Chromosom 4q13 - 4q21 lokalisierten Störungen erlauben die Bestimmung der Signifikans dieser Ko-Lokalisierung. Gegenwärtige cytogenetische Analysen weisen darauf hin, daß die Region 4q21 Gene umfaßt, die an der lymphocytischen Differenzierung beteiligt sind. Diese Zusammenhänge können als Hinweis für weitere biologische Aktivitäten oder Anwendungsmöglichkeiten für das erfindungsgemäße wachstumsregulierende Molekül sein.

9.3 Genomische Klonierung

Southern-Blot-Analysen (Abschnitt 9.1.) von HindIII- EcoRI- oder BamHI-verdauter MCF-7-DNA ergeben bei Hybridisierung mit einer 830 bp-großen Sonde (³²P- markierte PvuII/BsmI-verdautes pAR1), die den 5′-Bereich des AR-Gens enthält, einzelne Banden von 12 kb, 9 kb und 20 kb, was darauf hinweist, daß das AR-Gen in einer einzigen Kopie vorliegt. Eine 170 bp-Sonde (AR 170, BsmI-PvuII) vom 3′-Ende des naturierten AR, die die kodierenden Regionen für die Transmembrandomäne und die cytoplasmatische Domäne enthält, hybridisiert mit den gleichen HindIII-, EcoRI- und BamHI-Fragmenten und ebenfalls an ein weiteres 7,5 kb HindIII-Fragment, was darauf hinweist, daß der größte Teil der AR-kodierenden Region zwischen zwei HindIII- Fragmenten von 12 und 6,5 kb aufgeteilt ist. Eine identische Bandenbildung kann man bei Southern-Blot- Analysen mit verdauter DNA aus Humanplazenta, Gehirn, Melanom (SK-MEL 28), Brustkrebs (HTB36), Epidermidkarzinom (A431) und Lungenkrebs beobachten. Dies gilt als Hinweis darauf, daß am AR-Gen keine umfassenden Umordnungen oder Amplifizierungen erfolgt sind.

Die beiden HindIII-Fragmente der MCF-7-DNA werden kloniert, da sie möglicherweise den größten Teil des AR-Gens bzw. das gesamte AR-Gen und die benachbarten Sequenzen enthalten. Die mit HindIII verdaute MCF-7- DNA wird nach Größe fraktioniert und die entsprechenden Fraktionen werden mit λL47,1 ligiert. Aus einer Vielzahl positiver Klone werden die beiden Klone λ ARH12 und gARH6 für detailliertere Untersuchungen ausgewählt. Die 12 und 6,4 kb-Inserts werden in pEMBL18 subkloniert und mit verschiedenen Restriktionsschnittstellen kartiert. Unter Verwendung exakter Oligonukleotid-Primer und direkter Sequenzierung verschiedener kleinerer Subklone werden die Sequenzen sämtlicher Exons und ihrer Intron- Verbindungen bestimmt, wobei sich keinerlei Diskrepanzen zur cDNA-Sequenz ergeben.

9.4 Charakterisierung der AR-5′-regulierenden Region.

Die genomische Klonierung von AR führt zur Isolierung von 6,5 kb der 5′-flankierenden Sequenz, welche im 12 kb HindIII-Fragment enthalten ist. Das 688 bp-Fragment der ersten EcoRI-Schnittstelle in 5′-Richtung vom Exon 1 bis zur SmaI-Schnittstelle im Exon 1 (Position 40 in der cDNA) wird subkloniert und an beiden Strängen sequenziert. Diese Ergebnisse sind in Fig. 17 zusammengefaßt.

Die Primer-Verlängerung erfolgt an der MCF-7-RNA mit zwei separaten Oligonukleotiden vom Exon 1. Ein Hauptpunkt für den Start der Transkription von beiden Oligonukleotiden bestätigt) wird 1 bp in 5′-Richtung zum längsten cDNA-Klon lokalisiert. Zwei untergeordnete Punkte sind in der Position +1 und +2 in der cDNA- Sequenz zu finden, wodurch bestätigt wird, daß viele der cDNA-Klone meist die volle Länge umfassen. Für eine funktionelle Bestätigung der regulatorischen Region des AR-Gens wird ein chimäres Gen (pXARE1CAT) konstruiert, das den 688 bp EcoRI bis SmaI Ar-5′-flankierenden Bereich (die Sequenzen 648 bis +40, mit +1 als dem Hauptstartpunkt der Transskription) enthält und die Expression eines promotorfreien Chloramphenicol-Transferase (CAT)-Gens steuert. Diese Konstruktion besitzt die Fähigkeit, die Transskription des CAT-Gens nach Insertion in MCR-7-Zellen zu stimulieren, wobei durch Zugabe von TPA eine 6- bis 7fache Stimulierung der Aktivität erfolgt. Dies bestätigt sowohl strukturell als auch funktionell die Klonierung des 5′-Endes des AR-Gens. Außerdem wird eine Serie von 5′-CAT-Deletionsmutanten konstruiert, die die AR-Sequenzen -539 bis +40 (Ela), -387 bis +40 (Elb), -277 bis +40 (Elc), -148 bis +40 (Eld), -77 bis +40 (Ele), -79 bis +40 (Elg), oder +19 bis +40 bp (ElH) im gleichen Vektor enthalten. Bei Deletion unterhalb des Bereiches -77 geht die Grundaktivität verloren, d. h. Elh zeigt keine meßbare Aktivität, und all diese Konstruktionen zeigen eine 3,5- bis 7fach verstärkte Expression als Folge 40stündiger Behandlung mit 100 ng/ml TPA. Diese Konstruktionen können weiterhin in Versuchen verwendet werden, um die Einflüsse von Morphogenen, Mitogenen, Wachstumsfaktoren, Wirkstoffen oder Fermentationsrohextrakten auf die Regulation der AR-Expression zu bestimmen und somit neue therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren.

"Nuclear run-off" Experimente zeigen eine 3- bis 5fach erhöhte Transkription von AR als Folge einer TPA-Behandlung, und weisen darauf hin, daß eine erhöhte Promotoraktivität zumindest teilweise für die TPA- Induktion von AR verantwortlich ist. Northern-Blot- Analysen mit MCF-7-Zellen, die mit TPA in Gegenwart bzw. Abwesenheit von Actinomycin D behandelt werden, weisen auf eine relativ stabile AR-RNA, mit einer Halbwertszeit von größer 4 h hin. Die Induktion der AR-Expression als Folge der TPA-Behandlung ist deshalb vielschichtig und beinhaltet eine verstärkte Transkription einer ziemlich stabilen RNA.

9.5 Intron/Exon-Organisation des AR-Gens, AR-Proteindomänen, evolutionäre und funktionelle Zusammenhänge

Die gesamte genomische Sequenz von Humanamphiregulin ist in Fig. 17 dargestellt. Der Zusammenhang zwischen Exons und den Proteindomänen ist in Fig. 18 schematisch dargestellt.

Primer-Verlängerungsanalysen von AR-mRNA und Studien mit chimären AR/CAT-Promotor-Konstruktionen (CAT= Chloramphenicolacetyltransferase, ein Markergen) lokalisieren einen funktionellen Promotor in dem 64 bp Bereich in 5′-Position zum Ende des längsten cDNA-Klons. Weiterhin befindet sich eine Konsensus-TATA-Box 29 bp upstream vom 5′-Ende der cDNA-Sequenz. Vor dem 3′-Ende des Gens ist eine Konsensus-Polyadenylierungssignalsequenz angeordnet, die sich 64 Nukleotide entfernt vom Poly(A)-Tail in der cDNA befindet. Das Primärtranskript des AR-Genes weist eine Größe von etwa 10,2 kb auf.

Sechs Exons kodieren für den Human-AR-Prekursor und umfassen 10,2 kb der genomischen DNA. Die AR-Exons sind 112 bis 270 bp lang und voneinander durch Introns mit einer Größe zwischen 1,25 kb und 21, kb getrennt. Die fünf Introns von AR unterbrechen die kodierende Sequenz in der Weise, daß die Proteindomänen Produkte der einzelnen Exons darstellen. Exon 1 kodiert für die 5′- untranslatierte Domäne und die Signalpeptiddomäne, Exon 2 kodiert für den N-terminalen Prekursor, Exon 5 enthält die cytoplasmatische Region und Exon 6 stellt die 3′-untranslatierte Region dar. Exon 3 und Exon 4 kodieren zusammen für das maturierte AR-Protein und beinhalten sowohl die hydrophilen und EGF-ähnlichen Sequenzen als auch die wahrscheinliche Transmembrandomäne. Die Verbindung zwischen Exon 3 und 4 ist zwischen dem zweiten und dem dritten Loop der EGF-ähnlichen Region zu finden.

Wenn man die Exon-Verbindungsstellen der Aminosäuresequenzen von AR, EGF und TGF-α übereinander anordnet, zeigt sich deutlich, daß all diese Proteine durch zwei Exons kodiert werden, und daß das dazwischenliegende Intron in der gleichen Position angeordnet ist. Darüber hinaus kodiert jedes der 3′-Exons für die Transmembrandomäne des entsprechenden Prekursorproteins. Im Gegensatz dazu ist die EGF-ähnliche Region auf einem einzelnen Exon untergebracht, bei all den anderen Säuger-EGF-Homologen, für die die Exonstruktur bestimmt wurde: einschließlich der neuen EGF-ähnlichen Repeats im EGF-Prekursor (Gray, 1983, Nature, 303, 722-725); den drei Repeats im LDL-Rezeptor (Yamamoto, 1984, Cel., 39, 27-38); und von dem jeweils einen Repeat im Rattenfibronektion (Patel, 1987, Embo J., 6, 2565-2572) und im Human-Koagulationsfaktor XII (Cool, 1987, J. Biol. Chem. 262, 1362-1373). Invertebraten-Homologe, wie das Drosophilia Notch-Gen und lin-12 aus C. Elegans enthalten ebenso multiple EGF-ähnliche Repeats (Kidd, 1986, Molec. Cell. Biol., 6, 3094-3108; Greenwald, 1985, Cell, 43, 583-590). Im Gegensatz zu den Säugergenen, sind die meisten EGF- ähnlichen Repeats in Notch in einer einzelnen kodierenden Region enthalten, wobei lediglich vier der 36 Strukturen durch dazwischenliegende Sequenzen getrennt sind. Bemerkenswerterweise zeigen zwei dieser vier Strukturen eine stärkere Übereinstimmung mit AR als mit dem Notch-Repeat- Konsensus und eine Struktur wird sogar von einem Intron bei der gleichen CXC-Sequenz, wei bei EGF, TGF- und AR unterbrochen. Das Nematoden lin-12-Gen enthält mindestens 11 EGF-ähnliche Einheiten, wovon neun im ersten Exon enthalten sind und die übrigen beiden Einheiten in anderen Exons zu finden sind, wobei die intakte EGF-ähnliche Einheit von Introns flankiert wird.

Unterschiede in der Struktur der für die EG-ähnlichen Repeats kodierenden Exons aus verschiedenen Organismen weisen auf deren unterschiedlichen Ursprung hin. Eine Gruppe enthält eine von Introns begrenzte EGF-ähnliche Struktur und die andere Gruppe zu der AR gehört, weist eine unterbrochene Struktur auf. Die Ähnlichkeiten in der Sequenz zwischen den beiden Gruppen könnten als Ergebnis einer konvergierenden Evolution oder einer Intron-Insertion nach deren Divergieren von einem gemeinsamen Gen-Vorfahren.

Die Intron-Anordnung innerhalb der gleichen CXC-Sequenz von EGF, TGF-α und AR und einem der Notch-Repeats weist auf einen gemeinsamen Ursprung hin, jedoch ergibt eine nähere Untersuchung, ein unterschiedliches "Intron phasing". "Intronphasing" weist darauf hin, ob das Intron den Leserahmen nach dem ersten (I), zweiten (II) oder dritten (0) Nukleotid eines Kodons unterbricht. Man ist der Ansicht, daß das "Phasing" insofern von evolutionärer Bedeutung ist als es das Verschieben von Exons, welche funktionale Domänen enthalten, innerhalb verschiedener Proteine ermöglicht. EGF und TGF weisen ein "Phase II"-Intron in der EGF-ähnlichen Einheit auf, während AR und Notch "Phase-I"-Introns besitzen. Eine ähnliche Verschiebung von einem Nukleotid ist im vorletzten Intron innerhalb der Proteasedomäne des Komplementfaktors B und der Elastase zu finden (Cambell, 1983, PNAS, 80, 4464; Swift, 1984, J. biol. Chem., 259, 14 271). Die Nicht-Zufallspositionen dieser Introns können bedeuten, daß eine spezifische Intron-Insertionssequenz in diesen Genen vorliegt. Andererseits kann ein Selektionsdruck für eine Teilung der kodierenden Region an dieser Stelle bestanden haben. Ein Vergleich der Sequenzen an der Exon-Intron-Bindungsstelle innerhalb der EGF-ähnlichen Einheit für Human-EGF, TGF- und AR und das erste Notch-Repeat ergeben keinerlei direkte Repeats, die man häufig bei transponierbaren Elementen beobachten kann. Alle vier Strukturen weisen jedoch die Sequenz "gtaagt" auf, die die Bindungsstelle begrenzt. Diese Sequenz kann eine gewisse Funktion beim Spleißen dieses Introns besitzen.

Virale EGF-Homologe enthalten keine Introns; ein Vergleich zwischen VGF, EGF, TGF- und AR ergibt jedoch eine Homologie im Bereich der Transmembrandomäne, während Wachstumsfaktoren aus Myxoma und "Shope-Viren" vor dieser hydrophoben Region enden. Neuere Untersuchungen weisen darauf hin, daß der TGF-Prekursor als Transmembranprotein synthetisiert wird, wobei der differentielle proteolytische Spaltung zur Sekretion größerer Formen führt; die zelltypspezifisch sein können (Teixido, 1987, Nature, 326, 883-885).

Andere EGF-Homologe, die Transmembrandomänen enthalten, umfassenen die Gerinnungsfaktoren, LDL sowie die homeotischen Gene Notch und lin-12, obwohl sie nicht von einem EGF-ähnlichen Repeat benachbart sind. Das Vorliegen der EGF-Struktur in mehreren Membran-gebundenen Prekursoren weist darauf hin, daß diese in manchen Fällen als sezenierte Wachstumsfaktoren prozessiert werden oder in einem mit der Membran assoziierten Zustand verbleiben und eine Funktion bei der interzellulären und/oder intrazellulären Kommunikation besitzen.

Einige der AR-Homologe beinhalten homeotische Invertibraten- Gene. Homeotische Genprodukte sind an der Regulation der Zellentwicklung beteiligt. Beispielsweise mediatisiert das Notch-Genprodukt die korrekte Progression einer ectodermalen Zelle in einen Neuroblasten oder einen Dermoblasten. Bei Notch-Mutanten werden all diese Zellen neuronal und die Nachkommen, all brain and no skin, gehen zugrunde. Ein homeotisches Gen kann eine autokrine Funktion aufweisen, um einen bestimmten Zustand in den Zellen herzustellen, bzw. stabilisieren, welche das Genprodukt exprimieren und kann außerdem bei der Regulation derartiger Zustände in benachbarten Zellen über Zell-Zell-Wechselwirkungen beteiligt sein. Es bleibt zu untersuchen, ob AR einen regulierenden Einfluß auf den Entwicklungszustand bestimmter Zelltypen aufweist.

9.6 Prozessierung von maturierten Amphiregulin

Eine Charakterisierung der AR-cDNA ergibt, daß die 78- und 84-Aminosäurenformen von AR als Mittelabschnitt einer 252-Aminosäure-Transmembran-Prekursorform syntetisiert werden (Abschnitt 8.2). Die Stellen für die proteolytische Spaltung des AR-Prekursors, welche zur Freisetzung des maturierten AR führen würden, stimmen mit keiner Schnittstelle irgendeiner bekannten Protease überein. Am N-terminalen Ende der Schnittstellen sind zu finden Asp-Asp/Ser-Val und Glu-Gln/Val-Val, während die C-terminalen Schnittstellen folgende Aminosäuren aufweisen Glu-Lys/Ser-Met. Die zwei Formen von AR scheinen das Ergebnis einer weiteren proteolytischen Prozessierung eines gemeinsamen Prekursors zu sein, da sämtliche cDNA-Klone und genomische Klone die gleiche Sequenz in diesem Bereich aufweisen. Interessanterweise liegt ein Intron zwischen den zwei N-terminalen Schnittstellen und es ist möglich, daß "Intron-sliding" für diese Unterschiede verantwortlich ist.

MCF-7-Zellen produzieren 80% des AR in der größeren 84-Aminosäureform, während die Choriokarzinomzellinie HTB36 80% ihres AR in der kleineren 78-Aminosäureform produziert. Um zu bestimmen, ob diese Unterschiede mit Veränderungen auf der DNA-Ebene verbunden sind, wird die Polymerase-Chain-Reaktions-Technik (Scharf, 1986, Science, 233, 1076-1078) dazu verwendet, um das AR-Exon 3 aus MCF-7-Zellen und HTB-36-Zellen, welche AR-mRNA in großen Mengen produzieren, zu isolieren. Ein AR-Intron-spezifisches "Sense"-Oligonukleotid und ein "antisense"-Oligonukleotid der kodierenden Region von Exon 3 wurde für eine spezifische Amplifizierung des zwischenliegenden 220 bp-Fragmentes des AR-Gens aus beiden DNA-Quellen verwendet. Eine direkte Sequenzanalyse ergab keinerlei Diskrepanzen bei den Intron- Exon-Bindungsstellen oder bei der Exon-3-kodierenden Sequenz zwischen diesen beiden Human-DNA-Quellen. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, daß die beiden Formen von AR durch unterschiedliche proteolytische Spaltung des Prekursors gebildet werden.

9.7 Strukturvergleich von AR und EGF-ähnlichen Wachstumsfaktoren

AR zeigt eine deutliche Sequenzhomologie mit anderen EGF-ähnlichen Proteinen, wobei 6 Cysteine, die 3 Disulfidbrücken ausbilden, konserviert sind und die Sekundärstruktur des maturierten Wachstumsfaktors bestimmen. Vorausgegangene Computer-unterstützte Vergleiche von Aminosäuresequenzen führen zu einer Kategorisierung EGF-ähnlicher Strukturen in zwei unterschiedliche Gruppen: Wachstumsfaktoren und Blutgerinnungsfaktoren (siehe Fig. 13). Es wurden zwei Sequenzmodelle für einen Vergleich mit AR und anderen bekannten DNA oder Proteinsequenzen ausgewählt. Die Auswahl basiert darauf, daß diese Sequenzen zwischen den beiden Proteingruppen unterschieden werden können und daß sehr wenige Lücken für eine optimale Übereinstimmung erforderlich sind. Die exakten Sequenzen sind in Tabelle 1 angegeben. Die erste Region entspricht den ersten 11 Aminosäuren des zweiten Loops in EGF und die zweite Region entspricht dem dritten Cysteinloop in EGF. Vier Vertreter einer jeden Gruppe von Wachstumsfaktoren und Blutgerinnungsfaktoren werden zur Erzeugung von Konsens-Sequenzen auf der Grundlage ihrer nachgewiesenen funktionellen und strukturellen Homologie ausgewählt. Wenn möglich, werden Humansequenzen ausgewählt, da ein Vergleich mit Human-AR angestrebt wird. Die Wachstumsfaktoren umfassen: Human-EGF, TGF-a, VGT und Shope-Wachstumsfaktor; die Gerinnungsfaktoren umfassen: Humanfaktoren IX, X, XII und Protein C. AR wurde auch mit der Datenbank für beide dieser Homologieblocks verglichen. Die Konsensus-Sequenz wurde auf der Basis der Häufigkeit des Auftretens eines Restes an einer bestimmten Position gewichtet.

Struktur Funktionsanalysen verschiedener TGF-α VGF und EGF-Derivate führten kürzlich zur Identifizierung mehrerer Reste, die für die biologische Aktivität dieser Wachstumsfaktoren notwendig sind. Rekombinante Proteine, synthetische Peptide, stellenspezifische chemische Derivate und proteolytische Abbaureaktionen wurden zur Erzeugung veränderter Moleküle verwendet. Einige Generalisierungen beinhalten (die Positionen werden in bezug auf die Anordnung in Fig. 15 angegeben): Die 6 Cysteinreste (Position 1, 19, 15, 26, 28 und 37) und deren Disulfidschleifen (1-15, 9-26, 28-37) sind für die biologische Aktivität erforderlich; N-terminale Extensionen besitzen wenig Einfluß auf die Aktivität; ein aromatischer Rest (F, Y) ist erforderlich an Position 8; ein nicht-konservativer Austausch von Y³², D⁴¹ oder L⁴² führt zu einem Aktivitätsverlust und/oder einer ausgeprägten Abnahme der Rezeptorbindung oder Autophosphorylierung.

AR erfüllt bis auf die letzten zwei Kriterien sämtliche Kriterien, die diejenigen Reste definieren, welche zur EGF-Rezeptorbindung und/oder für eine mitogene Aktivität erforderlich sind. Maturiertes AR endet unmittelbar vor D⁴¹ und weist weder diesen noch den entscheidenden Rest Leucin 42 auf und wechselwirkt dennoch bei der EGF-Rezeptorbindung und substituiert EGF bei einigen Mitogen-Tests. Diese Unterschiede können jedoch verantwortlich sein für die nicht-absättigbare Rezeptor- Bindungskinetik, sowie deren funktionale Unterschiede zu EGF. Diese Unterschiede sind bei der Untersuchung des TGF-β-Synergismus, des differentiellen Effekts auf selektierte A431-Subklone, der Quervernetzung, der Phosphorylierung, und der Fähigkeit zur DNA-Bindung zu beobachten. Der extrem hydrophile Bereich und der N-Terminus von maturiertem AR können einen Teil dieser Unterschiede bei der Rezeptorbindung oder der biologischen Aktivität mitbewirken.

9.8 AR-Unterkategorie der EGF-Oberfamilie

Auf Grundlage der Gegenüberstellung in Fig. 13 und von Computeranalysen auf der Basis von Tabelle I (Seite 25) wird der evolutionäre Abstand berechnet. Diese Berechnung dient zur Ableitung eines Dendrogramms für die EGF-Oberfamilie. Diese Suche erfordert die Anwesenheit der Cysteine, wobei jeweils ein Punkt für jeden Rest hinzugefügt wird, der in der gewichteten Konsensus- Sequenz wiederzufinden ist. Dieser evolutionäre Stammbaum sagt vorher, daß AR in eine neue Unterkategorie von EGF-ähnlichen Wachstumsfaktoren, basierend auf der strukturellen und funktionellen Homologie, einzuordnen ist. Ein derartiges Modell ergibt, daß weitere Mitglieder dieser Wachstumsfamilie existieren und daß sie aufgrund der Homologie mit den obigen Sequenzmustern auf der Grundlage von drei Kriterien identifiziert werden können: ein "combined score" für die beiden Wachstumsfaktorregionen größer als 20, ein "combined coagulation factor region score" kleiner als 20, und ein combined AR region score" größer als 20. Sämtliche neuen Moleküle, die diese Kriterien erfüllen, weisen wahrscheinlich eine gewisse funktionelle Homologie mit EGF, TGF-α, VGF oder AR auf. Moleküle mit einem "combined AR region score" größer als 40 werden als Mitglied der AR-Familie innerhalb der EGF-Oberfamilie klassifiziert und wären somit Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

10. Beispiel: Bakterielle Expression von Amphiregulin 10.1 Material und Methoden 10.1.1 Plasmid-Konstruktionen Plasmid-pARD1

Das Plasmid pARD1 enthält das 1,4 kb EcoRI-cDNA- Fragment (pAR1) in pEMBLE18 mit einem T/C-Austausch an der Nukleotidposition 532 in der cDNA, die der Valin-Valin-Sequenz am Amino-terminalen Ende des maturierten AR entspricht. Dieser Basenaustausch wird durch "site directed mutagensis" erzeugt und durch Sequenzanalyse bestätigt. Diese Konstruktion ermöglicht den Zugang zur Verbindungsstelle zwischen der AR- aminoterminalen Prekursordomäne und der hydrophilen Region durch Erzeugung einer DdeI-Schnittstelle (CTAAG).

Plasmid pARSTOP

Das Plasmid pARSTOP ist eine Zwischenkonstruktion zur Herstellung eines AR-Sekretionsvektors. pARD1 wird mit SspI und XbaI verdaut und man isoliert das 515 bp- Fragment, welches für die carboxy-terminalen 9 Aminosäuren des maturierten AR, die Transmembrane und cytoplasmatische Domäne sowie für die 3′-ungesättigte Region kodiert. Das 4,7 kb (SspI-XbaI)-Fragment, das den übrigen amino-terminalen Bereich der AR-cDNA enthält, wurde Gel-gereinigt und mit den kinasierten, annellierten komplementären Oligonukleotiden ARSTOP1 und ARSTOP2 ligiert (Abbildung unten) Diese Oligonukleotide weisen ein 5′-glattes Ende auf, welches mit einer SspI-Schnittstelle kompatibel ist, worauf diejenige Sequenz folgt, die für die carboxy-terminalen 9-Aminosäuren der maturierten AR-Sequenz, für ein TAA-Stopkodon und eine EcoRV und XbaI- Schnittstelle kodiert.

Plasmid pbAR

Das Plasmid pbAR enthält einen promotorfreien TGF-β-Leader der mit der maturierten 78-Aminosäureform von AR verbunden ist. Das Plasmid wird durch Legierung der Oligonukleotide bLARN3 und bLARN4 mit dem 240 bp DdeI-XbaI-Fragment aus pARSTOP in EcoRI/XbaI-verdautem pEMPL18 hergestellt. bLARN3 und bLARN4 sind komplementär und erzeugen einen 5′EcoRI und einen 3′DdeI-Überhang und eine einzelne NaeI-Schnittstelle, die mit der einen Schnittstelle in der Nähe des carboxy-terminalen Endes der TGF-β-Leadersequenz kompatibel ist. Durch Legierung wird die DdeI-Schnittstelle zerstört und die korrekte Aminosäuresequenz Valin-Valin am Amino-Terminus von maturiertem AR erzeugt.

Das Plasmid pDCHBAR1 ist ein Säuger-Expressionsvektor (Fig. 19), der zur Sekretion der prozessierten, maturierten 78-Aminosäureform von AR entworfen wurde. Er enthält die TGF-β-Leader/Mature-AR-Sequenz aus pbAR unter der Steuerung des CMV/HIV-Promotors, flankiert von einem SV40-Polyadenylierungssignal. Der Vektor enthält außerdem Sv2dhfr in der gleichen transkriptionalen Orientierung. PSVDR/bOM wird mit NaeI und XbaI verdaut und der 6 kb-Vektor wird von der ausgeschnittenen OncoM-kodierenden Sequenz abgetrennt. pBAR wird ebenfalls mit NaeI und XbaI verdaut und das 260 bp-Fragment, das für die carboxy-terminalen 5-Aminosäuren der TGF-β-Signalsequenz und die 78 Aminosäuren- Sequenz von maturiertem AR, gefolgt von einem Terminationskodon und einer EcoRV und XbaI-Schnittstelle kodiert, wurden isoliert;
die Verbindungen werden durch Sequenzanalyse bestätigt.

Plasmid pDCHBPHILE

Das Plasmid pDCHBPHILE ist ein Säuger-Expressionsvektor und wird zur Sekretion eines chimären AR/EGF-Proteins verwendet. Das Plasmid wird auch erzeugt, um zukünftige Fusionskonstruktionen zwischen der hydrophilen AR-Domäne und anderen Wachstumsfaktoren zu erleichtern. Diese Konstruktion wird durch Legierung des durch SstII/XbaI-Verdauung hergestellten 6,5 kb-Fragmentes des pDCHBAR1-Vektors, des 175 kp EcoRI/ XbaI-Fragmentes, das das synthetische Human-EGF-Gen enthält, sowie der Oligonukleotide PHIL1 und PHIL2 erzeugt. Diese Oligonukleotide sind komplementär zu den 5′-SstII und 3′EcoRI-Extensionen und kodieren für die letzten Reste der TGF-β-Signalfrequenz und die gesamte hydrophile AR-Domäne. pDCHBAR1 enthält den CMV/HIV-Promotor, alle Aminosäuren der TGF-β-Signalfrequenz (bis auf die letzte Aminosäure) und die SV40-Polyadenylierungssequenz. Das EGF-Fragment wurde von Dr. Timothy M. Rose (Oncogen) zur Verfügung gestellt und enthält geeignete Schnittstellen für weitere Manipulationen.

10.1.2 Herstellung des pTAC-Vektors

Das Plasmid TacPak/EGF wird von Dr. Timothy M. Rose (Oncogen) zur Verfügung gestellt und besteht aus folgenden Einheiten: trp-lac hybrid promoter und Cro- Gen Shine-Delgarno-Sequenz, isoliert aus einem Bg1II/ BamHI-Fragment aus dem Expressionsvektor p135-1, welcher wiederum von pDR540 (Pharmacia) abgeleitet wurde; der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz, abgeleitet von synthetischen Oligonukleotiden TacPak1 und TAcPak2 (Dr. Rose, Oncogen); der synthetischen EGF-Sequenz, abgeleitet aus Plasmid pBM22/PAK/EGF; der Transkriptionsterminations- Region; dem pBR322-Gerüst mit dem Neomycin- Resistenz-Gen, abgeleitet aus Plasmid p135-1. TacPak/EGF wird mit BamHI verdaut, mit dATP und dGTP in "2-basic" gefüllt, um eine Schnittstelle zu erhalten, welche mit der "2-basic" gefüllten SalI-Stelle kompatibel ist und anschließend mit PvuI verdaut. Durch diese Verdauung wird das synthetische EGF-Gen und der Großteil der alkalischen Phosphatase-Signalfrequenz entfernt, wobei der Tac-Promotor, die Shine-Delgarno-Sequenzen und das Initiations-ATG intakt bleiben. Das 2,8 kb-Fragment wird über ein Gel gereinigt.

10.1.3 Herstellung eines modifizierten Amphiregulin-cDNA- Fragmentes

Plasmid pARSTOP wird mit SalI verdaut, "2-basic" mit TTP und dCTP aufgefüllt, zur Erzeugung einer Schnittstelle, die mit der 2-basic-gefüllten (dATP, dGTP) BamHI-Extension kompatibel ist und anschließend mit DdeI und BgII verdaut. Der spätere Verdau war erforderlich, um gleichlaufende DNA vom gewünschten 242 bp-Fragmente abzutrennen, das für die kurze Form des maturierten AR kodiert, beginnend mit VKPP und endend bei CGEK, gefolgt von einem synthetisch eingefügten Stopkodon. Das 243-bp-Fragment wird über ein Gel gereinigt.

10.1.4 Herstellung der synthetischen Oligonukleotide ALKPAR1 und ALKPAR2

Die komplementären synthetischen Oligonukleotide ALKPAR1 und ALKPAR2 werden hergestellt mit einem 5′PvuI-Überhang, kompatibel mit dem teilweise gefüllten TacPak/EGF PvuI/BamHI-Fragment, und einer 3′DdeI-Extension, kompatibel mit dem teilweise gefüllten pARSTOP DdeI/SalI-Fragment. Sie werden auf einem Applied Blosystems Oligonucleotide Synthesizer synthetisiert und auf einem Arcylamidgel gereinigt. Phosphate werden an die Oligonukleotide mit der T4-Kinase angefügt und äquimolare Mengen werden unter langsamer Abkühlung nach der Hitzedenaturierung anneliert.

10.1.5 Ligierung und Isolierung von pTAcAPAR1

Das 243 bp große, teilweise gefüllte DdeI-SalI- AR-Fragment, das teilweise gefüllte 2,8 kb PvuI/ BamHI TacPak/EGF-Vektorfragment, sowie die kinasierten und annellierten ALKPAR1+2-Oligonukleotide werden unter Verwendung der DNA-Ligase ligiert, in kompetente E. Coli JM109-Zellen transformiert und auf LB/Neomycin-Platten selektiert. Die korrekte Konstruktion wird durch Restriktionsverdauung und DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Sequenz von pTacAPAR ist in Fig. 20 angegeben.

10.1.6 Herstellung von chimären AR-Hydrophildomäne/ EGF-Genfragment

Das Plasmid pDCHBPHILE wird mit SstII und XbaI zur Erzeugung des 286 bp-Fragmentes verdaut, das für die letzten zwei Reste der TGF-Signalsequenz (AG), für die 37 Reste der hydrophilen Domäne von AR (VVKP . . . RKKK) und für die 53 Reste große synthetische Sequenz aus der maturierten Human- Sequenz (NSDS . . . WELR) kodiert. Das 286 bp-Fragment wird über ein Gel gereinigt.

10.1.7 Herstellung der synthetischen Oligonukleotide APAREGF1 und APAREGF2

Die komplementären synthetischen Oligonukleotide APAREGF1 und APAREGF2 werden erzeugt mit einem 5′- PvuI-Überhang, kompatibel mit dem pTacAPARI PvuI/ XbaI-Fragment und einer 3′-SstII-Exension, kompatibel mit dem pDCHBPHILE SstII/XbaI-Fragment. Die Oligonukleotide werden auf einem Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer synthetisiert und mit Hilfe eines Acrylamidgels gereinigt. Die Phosphate werden an die Oligonukleotide mit Hilfe der T4-Kinase addiert und äquimolare Mengen unter langsamer Abkühlung nach der Hitzedenaturierung annelliert.

10.1.8 Ligierung und Isolierung von pTACAPHILE

Das 286 bp SstII/XbaI-Fragment, welches für die hydrophile Domäne von AR verbunden mit der maturierten EGF-Sequenz kodiert, das 2,8 kb PvuI/XbaI pTacAPAR1- Vektorfragment und die kinasierten, annelierten APAREGF1+2-Oligonukleotide werden unter Verwendung der DNA-Ligase ligiert, in kompetente E. Coli JM109 transformiert und auf LB/Neomycin-Platten selektiert. Die korrekte Konstruktion wird durch Restriktionsanalysen und DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Nukleotidsequenz von pTacAPHILE ist in Fig. 21 dargestellt. Das erwartete Translationsprodukt sollte zwischen dem Dipeptid Ala-Gly, das auf die alkalische Phosphatase-Signalsequenz folgt, gespalten werden, wobei ein zusätzlicher Rest (Glycin) an die hydrophile Domäne von AR addiert wird. Die Nukleotidsequenzen, die sich von der normalen Humansequenz unterscheiden, sind hervorgehoben (Fig. 20).

10.1.9 Reinigung von rekombinanten Amphiregulin

Die Plasmide pTacAPAR1 und pTacAPHILE werden in kompetente E. Coli JM109-Zellen transformiert. Diese werden bis zur Konfluenz in 10 ml LB bei 37°C bis zu einer A₆₀₀ von 0,7 gezüchtet. Die Kulturen werden anschließend mit 100 µM EPTG induziert und 24 bis 72 h gezüchtet. Die Kulturen werden 2 × bei 5000 Upm jeweils 15 Min. abzentrifugiert. Das Pellet wird beiseite gelegt und die Reinigung mit dem Überstand fortgesetzt. Proben werden in einer Amicon-Ultrafiltrations- Apparatur mit YM5-Membranen konzentriert (Ausschluß Molekulargewicht 5000). Das Konzentrat wird mit 5 Volumina MilliQ Wasser verdünnt und auf 1/10 des ursprünglichen Kulturvolumens erneut konzentriert. Man fügt Eisessig bis zu einer Konzentration von 1 M hinzu und bewahrt die Proben 2 bis 24 h bei 4°C auf. Die Proben werden bei 19 000 Upm bei 4°C in Oakridge-Gefäßen in einem SS34-Rotor 20 Min. zentrifugiert, das Pellet wird mit 20 ml 1 M Essigsäure extrahiert und die Überstände werden vereinigt. Die klaren Überstände werden anschließend gegen 0,1 M Essigsäure 2 Tage dialysiert, lyophilisiert und bei -20°C aufbewahrt.

Die Zell-Pellets und der gereinigte getrocknete Überstand wird durch Immuno-Blotting und Wachstzums- Inhibitionstest (GIAs) auf AR-Protein getestet. Das Zell-Pellet aus 50 µl konfluenten Zellen oder 100 bis 200 µl getrocknetem Überstand wird auf einem 16% Tricin-polyacrylamid-Gel analysiert. Man färbt das Gel mit "Fast Green", transferiert es auf Nitrocellulose und führt Western-Blots, wie in Abschnitt 7.1.6 beschrieben, durch.

10.2 Ergebnisse und Diskussion

Die Zell-Pellets von Tranformanten, mit pTacAPAR1 enthalten große Mengen eines immunoreaktiven Proteins, welches mit 10 kd wandert, sowie einige Abbauprodukte und mögliche Dimere. In den Überständen sind annähernd 100 bis 200 ng/ml des sezenierten immunoreaktiven ARs enthalten. Durch GIA mit den Überständen wird eine Aktivität von annähernd 150 ng/ml AR auf die A431-A3- Indikatorzellinie im Vergleich mit gereinigtem nativen AR bestimmt. Große Mengen von immunreaktiven Protein werden in diesem System produziert, wobei der Großteil innerhalb der Zelle aggregiert vorliegt. Tests mit periplasmatischen Präparationen und Überständen ergeben eine Sekretion von aktivem Protein nach 2 bis 3 Tagen.

pTacAPHILE stellt ein geeignetes Hilfsmittel zur Anbindung der hydrophilen Domäne von AR an den N-Terminus jeglicher klonierter Gene dar. Diese Region kann die Bindungscharakteristika an den normalen Rezeptor des Liganden verändern, kann als Kernlokalisierungssequenz funktionieren, kann an DNA binden oder den Transport durch eine Lipidmembrane oder andere Membrane bewerkstelligen, die normalerweise für den angebundenen Faktor undurchlässig sind.

11. Hinterlegung von Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismen wurden bei der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) unter den folgenden Hinterlegungsnummern hinterlegt:

Claims

1. Protein mit einer Aminosäuresequenz, umfassend:

2. Protein nach Anspruch 1 mit einem Molekulargewicht von etwa 8 500 bis 25 000 Dalton.

3. Protein nach Anspruch 1 mit einem pI-Wert im Bereich von etwa 7,6 bis 8,0.

4. Ein glycosiliertes Protein nach Anspruch 1.

5. Ein nicht-glycosiliertes Protein nach Anspruch 1.

6. Protein mit einer Aminosäuresequenz, umfassend:

7. Protein nach Anspruch 6 mit einem Molekulargewicht von etwa 9 100 bis 25 000 Dalton.

8. Protein nach Anspruch 6 mit einem pI-Wert im Bereich von etwa 7,6 bis 8,0.

9. Ein glycosiliertes Protein nach Anspruch 6.

10. Ein nicht-glycosiliertes Protein nach Anspruch 6.

11. Protein nach Anspruch 1 oder ein Peptid oder Fragment davon, welches das Wachstum menschlicher Krebszellinien epithelialen Ursprungs inhibiert.

12. Protein nach Anspruch 11, wobei die menschliche Krebszellinie epithelialen Ursprungs die epidermale Vulva-Karzinomzellinie A431 oder die Brust-Adenokarzinomzellinie HTB132 umfaßt.

13. Protein nach Anspruch 1 oder ein Peptid oder Fragment davon, welches das Wachstum in vitro kultivierter menschlicher Vorhaut-Fibroblasten stimuliert.

14. Protein nach Anspruch 13, wobei die menschlichen Vorhaut- Fibroblasten Sakamoto- oder Godwin-Zellinien umfassen.

15. Protein nach Anspruch 1 oder ein Peptid oder Fragment davon, welches einen bifunktionalen Zellwachstums- Regulator umfaßt, welcher das Wachstum menschlicher Krebszellinien epithelialen Ursprungs inhibiert und das Wachstum von in vitro kultivierten menschlichen Vorhaut-Fibroblasten stimuliert.

16. Protein nach Anspruch 15, wobei die menschliche Krebszellinie epithelialen Ursprungs die epidermale Vulva- Karzinomzellinie A431 oder die Brust-Adenokarzinomzellinie HTB132 umfaßt.

17. Protein nach Anspruch 15, wobei die menschlichen Vorhaut- Fibroplasten die Sakamoto- oder Goodwin-Zellinien umfassen

18. Protein nach Anspruch 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder 17 oder ein Peptid oder Fragment davon, wobei die Inhibition oder Stimulierung des Zellwachstums durch folgenden Test bestimmt wird:

(a) Mikrotiternäpfchen, welche jeweils 3,5 × 10⁴ Zellen in 50 µl Testmedium enthalten, welches DMEM, supplementiert mit 5% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), Penicillin/Streptomycin und Glutamin umfaßt, inkubiert man 3 h;
(b) 50 µl des Testmediums, welches Amphiregulin enthält, gibt man zu jedem Testnäpfchen hinzu, wobei man 50 µl des Testmediums ohne Amphiregulin zu jedem Kontrollnäpfchen hinzufügt; anschließend inkubiert man 2-3 Tage bei 37°C;
(c) man gibt 100 µl einer Lösung, umfassend ¹²⁵I-Jod- 2′-¹²⁵I-deoxyuridin (I-UdR), zu jedem Näpfchen hin zu und inkubiert 4 bis 6 h bei 37°C;
(d) man entfernt das Medium und wäscht jedes Näpfchen einmal mit PBS;
(e) man gibt 200 µl Methanol zu jedem Näpfchen hinzu, inkubiert 10 min bei Zimmertemperatur und entfernt das Methanol;
(f) man gibt 200 µl einer 1M Natriumhydroxidlösung zu jedem Näpfchen hinzu und inkubiert 30 min bei 37°C; und
(g) man entfernt die 1M Natriumhydroxidlösung und vermißt sie unter Verwendung eines Gamma-Zählers, wobei die Anzahl der bestimmten Counts ein Maß für den ¹²⁵I-IUdR-Einbau sowie für die Zellproliferation ist, wobei das Fehlen von Counts eine Inhibierung der Zellproliferation andeutet.

19. Protein nach Anspruch 6 oder ein Peptid oder Fragment davon, welches das Wachstum menschlicher Krebszellinien epithelialen Ursprungs inhibiert.

20. Protein nach Anspruch 19, wobei die menschliche Krebszellinie epithelialen Ursprungs die epidermale Vulva- Karzinomzellinie A431 oder die Brust-Adenokarzinomzellinie HTB132 umfaßt.

21. Protein nach Anspruch 6 oder ein Peptid oder Fragment davon, welches das Wachstum von in vitro-kultivierten menschlichen Vorhaut-Fibroblasten stimuliert.

22. Protein nach Anspruch 21, wobei die menschlichen Vorhaut-Fibroplasten Sakamoto- oder Goodwin-Zellinien umfassen.

23. Protein nach Anspruch 6 oder ein Peptid oder Fragment davon, welches einen bifunktionalen Zellwachstumsregulator umfaßt, welcher das Wachstum menschlicher Krebszellinien epithelialen Ursprungs inhibiert und das Wachstum von in vitro-kultivierten menschlichen Vorhaut-Fibroblasten stimuliert.

24. Protein nach Anspruch 23, wobei die menschliche Krebszellinie epithelialen Ursprungs die epidermale Vulva- Krebszellinie A431 oder die Brust-Adenokarzinomzellinie HTB132 umfaßt.

25. Protein nach Anspruch 23, wobei die menschlichen Vorhaut- Fibroblasten Sakamoto- oder Goodwin-Zellinien umfassen.

26. Protein nach Anspruch 19, 20, 21, 23, 24 oder 25 oder Peptide oder Fragmente davon, wobei die Inhibition oder Stimulierung des Zellwachstums durch folgenden Test bestimmt wird:

(a) Mikrotriternäpfchen, welche jeweils 3,5 × 10⁴ Zellen in 50 µl Testmedium enthalten, welches DMEM, supplementiert mit 5% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), Penicillin/Streptomycin und Glutamin umfaßt, inkubiert man 3 h;
(b) 50 µl des Testmediums, welches Amphiregulin enthält, gibt man zu jedem Testnäpfchen hinzu, wobei man 50 µl des Testmediums ohne Amphiregulin zu jedem Kontrollnäpfchen hinzufügt; anschließend inkubiert man 2-3 Tage bei 37°C;
(c) man gibt 100 µl einer Lösung, umfassend ¹²⁵I-Iod- 2′-¹²⁵I-deoxyuridin (I-UdR), zu jedem Näpfchen hinzu und inkubiert 4 bis 6 h bei 37°C;
(d) man entfernt das Medium und wäscht jedes Näpfchen einmal mit PBS;
(e) man gibt 200 µl Methanol zu jedem Näpfchen hinzu, inkubiert 10 min bei Zimmertemperatur und entfernt das Methanol;
(f) man gibt 200 µl einer 1M Natriumhydroxidlösung zu jedem Näpfchen hinzu und inkubiert 30 min bei 37°C; und
(g) man entfernt die 1M Natriumhydroxidlösung und vermißt sie unter Verwendung eines Gamma-Zählers, wobei die Anzahl der bestimmten Counts ein Maß für den ¹²⁵I-IUdR-Einbau sowie für die Zellprofileration ist, wobei das Fehlen von Counts eine Inhibierung der Zellproliferation andeutet.

27. Amphiregulin, ein bifunktionaler Wachstumsregulationsfaktor, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend:

(a) Kultivierung von MCF-7-Zellen in Gegenwart von 12-O-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat (TPA);
(b) Abtrennung der konditionierten Medien von den MCF-7-Zellen; und
(c) Isolierung von Amphiregulin aus den konditionierten Medien.

28. Nukleotidsequenz kodierend für den Amphiregulin-Prekursor, umfassend die kodierende Nukleotidsequenz, welche im wesentlichen in Fig. 16 etwa vom Nukleotidrest Nr. 1 bis etwa zum Nukleotidrest Nr. 1243, dargestellt ist.

29. Amphiregulin-Prekursor, umfassend die Aminosäuresequenz, welche im wesentlichen in Fig. 16 etwa vom Aminosäurerest Nr. 1 bis etwa zum Aminosäurerest Nr. 252 dargestellt ist.

30. Verfahren zur Herstellung von Amphiregulin, umfassend:

(a) Kultivierung einer Escherichia coli-Zelle, welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für Amphiregulin kodiert und unter der Kontrolle einer zweiten Nukleotidsequenz steht, welche die Genexpression reguliert, so daß ein Peptid oder Protein durch die Escherichia coli-Zelle produziert wird, welches Amphiregulinaktivität zeigt; und
(b) Isolierung des Amphiregulins aus der Kultur.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die für Amphiregulin kodierende Nukleotidsequenz die Nukleotidsequenz umfaßt, welche im wesentlichen in Fig. 16 vom Nukleotid Nr. 1 bis 1243 dargestellt ist.

32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die zweite Nukleotidsequenz, welche die Genexpression kontrolliert, einen Tac-Promoter umfaßt.

33. Verfahren zur Herstellung von Amphiregulin, umfassend:

(a) Kultivierung des Escherichia coli-Stammes JM 109, welcher mit dem Plasmid pTacAPAR1 transformiert ist, welches bei der NRRL mit der Hinterlegungsnummer B 18 441 hinterlegt ist; und
(b) Isolierung des Amphiregulins aus dem Medium.

34. Verfahren zur Herstellung von Amphiregulin, umfassend:

(a) Kultivierung des Escheria coli-Stamms JM 109, welcher mit dem Plasmid pTacAPHILE transformiert ist, welches bei der NRRL unter der Hinterlegungsnummer B 18 442 hinterlegt ist; und
(b) Isolierung des Amphiregulins aus der Kultur.

35. Modifizierte Zelle, welche eine Nukleotidsequenz enthält, die für Amphiregulin kodiert und unter der Kontrolle einer zweiten Nukleotidsequenz steht, welche die Genexpression reguliert, so daß die Zelle Amphiregulin produziert.

36. Modifizierte Zelle nach Anspruch 35, wobei die für Amphiregulin kodierende Nukleotidsequenz diejenige Nukleotidsequenz umfaßt, welche im wesentlichen in Fig. 16 vom Nukleotid Nr. 528 bis 761 dargestellt ist.

37. Modifizierte Zelle nach Anspruch 35, welche eine Escherichia coli-Zelle umfaßt.

38. Modifizierte Zelle nach Anspruch 35, wobei die zweite Nukleotidsequenz, welche die Genexpression kontrolliert, einen Tac-Promoter umfaßt.

39. Ein Plasmid pAR1, das in einer Escherichia coli-Zellinie enthalten ist, welche das Plasmid trägt und bei der NRRL unter der Hinterlegungsnummer B-18 438 hinterlegt ist.

40. Ein Plasmid pARH12, das in einer Escherichia coli-Zellinie enthalten ist, welche das Plasmid trägt und bei der NRRL mit der Hinterlegungsnummer B-18 439 hinterlegt ist.

41. Ein Plasmid pARH6, das in einer Escherichia coli- Zellinie enthalten ist, welche das Plasmid trägt und bei der NRRL mit der Hinterlegungsnummer B-18 440 hinterlegt ist.

42. Ein Plasmid pTacAPAR1, das in einer Escherichia coli- Zellinie enthalten ist, welche das Plasmid trägt und bei der NRRL mit der Hinterlegungsnummer B-18 441 hinterlegt ist.

43. Ein Plasmid pTacAPHILE, das in einer Escherichia coli- Zellinie enthalten ist, welche das Plasmid trägt und bei der NRRL mit der Hinterlegungsnummer B-18 442 hinterlegt ist.

44. Ein Antikörper, welcher ein Epitop von Amphiregulin erkennt.

45. Antikörper nach Anspruch 44, wobei das Epitop folgende Aminosäuresequenz umfaßt: D T Y S G K R E P F S G D H S A D G F E.

46. Antikörper nach Anspruch 44, wobei das Epitop folgende Aminosäuresequenz umfaßt: S S S E P S S G A D Y D Y S E E Y D N E.

47. Antikörper nach Anspruch 44, wobei das Epitop folgende Aminosäuresequenz umfaßt: V K P P Q N K T E S E N T S D K P K R K K K G.

48. Antikörper nach Anspruch 44, wobei das Epitop folgende Aminosäuresequenz umfaßt: E A V T C K C Q Q E Y F G E R C G E K.

49. Antikörper nach Anspruch 44, wobei das Epitop folgende Aminosäuresequenz umfaßt: V Q L R R Q Y V R K Y E G E A E E R K K.

50. Eine genomische Nukleotidsequenz, welche für das Amphiregulingen kodiert und eine Nukleotidsequenz umfaßt, welche im wesentlichen in Fig. 17 dargestellt ist.

51. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend Amphiregulin und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Adjuvantien.