CN1087344C

CN1087344C - 转化生长因子α－H1

Info

Publication number: CN1087344C
Application number: CN94195051A
Authority: CN
Inventors: 保罗·S·梅斯纳; 丽贝卡·富得那; 马克·D·亚当斯
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-03-08
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 2002-07-10
Anticipated expiration: 2014-05-12
Also published as: CN1143386A; ZA943465B; DE69428214D1; AU6835094A; DE69428214T2; ES2161246T3; JPH09509846A; EP0759067A4; DK0759067T3; EP1063293A2; EP0759067A1; KR970701776A; US5633147A; PT759067E; CA2184583A1; ATE205254T1; EP0759067B1; WO1995024466A1; AU681406B2; EP1063293A3

Abstract

本发明公开了人TGFα-H1多肽和编码这种TGFα-H1多肽的DNA(RNA)，还提供了通过重组技术生产这种多肽的方法，以及抗这种多肽的抗体和拮抗剂。这种多肽可以和合适的药物学载体或稀释剂结合以提供针对各种疾病的诊断、治疗和/或预防效果。本发明还提供了为治疗目的使用所述抗体和拮抗剂抑制TGFα-H1的方法。

Description

转化生长因子α-H1

本发明涉及新鉴别的多核苷酸、由该多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途，以及这些多核苷酸和多肽的生产。更具体地，本发明的多肽为人转化生长因子α-H1(TGFα-H1)。本发明还涉及抑制这种多肽的作用。

TGFα-H1是表皮生长因子(EGF)家族的新成员，EGF生长因子超基因家族包括大量的医学上非常重要的生长因子，如α转化生长因子(TGFα)亚族。

生长因子的EGF家族除TGF-α外还包括双调蛋白、cripto、heregulin和肝素结合EGF，最近发现的这一家族的成员是betacellulin，其从小鼠胰腺β肿瘤细胞的条件培养基中纯化得到(Sasada，et al.，B.B.R.C.190：1173-9(1993))。这一基因发现在肾、肝组织和各种肿瘤细胞系中表达。

1992年5月19日颁发的USP5,115,096中公开了纯化并且结构和功能得以鉴定的双调蛋白，双调蛋白是一种双功能细胞生长调节因子，其在致瘤细胞中有潜在的抑制DNA合成的活性，并促进某些正常细胞的生长。已克隆了双调蛋白基因并用于构建质粒以指导生物活性的双调蛋白在转化的E.coli细胞中表达。

TGFα具有多效生物学效应，TGFα家族的某些成员的产量在某些疾病状态下，例如癌症、皮肤病、眼疾以及在炎症或伤口愈合位点通常升高。TGFα家族的成员及其关联受体已被深入研究了若干年，并且最近出版了综述(Prigent and Lemoine.Progress inGrowth Factor Research 4：1-24(1992))；Schultz et al.，J.Cell.Biochem45：346-352(1991)；Derynck，R.，Mol.Reprod.and Dev.27：3-9(1990))。

正常成人的TGFα在各种组织中表达，包括皮肤、脑、胃肠粘膜、乳腺组织(包括未婚、怀孕和哺乳的乳腺)、激活的巨噬细胞、角质形成细胞，并且TGFα还具有血管生成活性(Kudlow，J.E.，and Bjorge，J.D.，Seminars in Cancer Biology，1：293-302(1990)。

除了其参与控制各种疾病中的细胞增殖外，TGFα生长因子对于胚胎发生和维持正常成人的生理状态也是重要的。这些生长因子影响许多过程；有证据表明TGFα参与胚胎发生的若干方面，因为其在未受精的卵细胞、植入前胚胎和母性蜕膜(maternaldecidua)中表达，其可能在植入或胎盘发育中起重要作用。缺少有功能的TGFα基因的转基因小鼠(“失效”小鼠)具有异常的皮肤构造、卷毛、卷胡，它们经常发生角膜炎，这些证据提示TGFα在决定皮肤构造和调节毛发生长方面起关键作用(Mann etal.，Cell 73：249-261(1993))。α转化生长因子家族的许多成员对于来源于多种组织的癌细胞是自分泌和/或旁分泌生长因子，例如乳腺(TGFα)、结肠(cripto)和胰腺(betacellulin)。betacellulin是视网膜色素上皮细胞和血管平滑肌细胞的强力的促分裂原(Shing et al，Science，259：1604-1607(1993))；双调蛋白(AR)根据所测试的靶细胞和加到该细胞的浓度而具有生长刺激性能或生长抑制性能(Shoyab et alScience 243：1074-1076(1989))。例如，AR刺激人包皮成纤维细胞的增殖，AR还抑制A431细胞系的生长。

另外，TGFα生长因子与下列疾病状态相关：a)肿瘤，最近的研究表明给予对小鼠的TGFα(和/或其家族成员)活性具有拮抗作用的制剂可抑制肿瘤(Cook et al.，CancerResearch，52：3224-3227(1992))；b)皮肤病，例如银屑病(Cook et al.，Cancer Research，52：3224-3227(1992))；c)伤口愈合(Schultz et al.，J.Cell.Biochem 45：346-352(1991))。

人型α转化生长因子(TGFα)是一种含50个氨基酸和3个二硫键的小的6Kda促分裂蛋白，TGFα与EGF受体相互作用并激活其内在蛋白激酶。Kudlow，J.E.and Bjorge，J.D.，Cancer Biology，1：293-302(1990)描述了TGFα在正常生理学中的作用。在转化的细胞和肿瘤中，TGFα的表达是最占优势并最丰富的，但在某些成人正常组织(脑、角质形成细胞、上皮细胞、激活的巨噬细胞、脑垂体)中也检测到低或中等水平的TGFα。在发育的胚胎中，在特定的时间和特定的组织中也可检测到TGFα的表达，最明显的是在发育的脑、肾和肝中。

目前已被纯化和克隆的这一家族的几乎所有成员均被发现含有6个保守的半胱氨酸，其形成二硫键以产生三个肽环，从而具有类似的二级结构。另外，所有这些生长因子均以一大得多的膜结合的糖基化的前体而合成。TGFα-H1含有所有6个保守的半胱氨酸残基。

生长因子的这一家族与还包括c-erb-2和c-erb-3的EGF受体家族相互作用，其配位体尚未被鉴别(Prigent and Lemoine，Prog.in Growth Factor Res.，4：1-24(1992))。在人瘤形成中的这些受体的参与作用已被广泛地研究，已发现这些受体的过量表达与某些癌症形式的预后不良有关(Holmes et al.，Science，256：1205-1210(1992))。也已发现一些肿瘤细胞显著地合成高水平的TGFα和/或这一家族的其它成员。

根据本发明的一个方面，提供了新的成熟多肽，其是人转化生长因子αH1(TGFα-H1)，以及该多肽的片段、类似物和衍生物。

根据本发明的另一个方面，提供了编码这些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。

根据本发明的再一方面，提供了一种多肽，其是TGFα-H1的可溶性片段，即不带转膜部分的TGFα。

根据本发明的又一方面，提供了一种通过重组技术生产这些多肽的方法。

根据本发明的再一方面，提供了为诊断和治疗目的而使用这种多肽、或使用编码这种多肽的多核苷酸的方法，例如刺激伤口愈合、在损伤或AIDS痴呆后恢复正常神经学功能、治疗眼疾、瞄准并杀伤某些细胞、治疗肾病或肝病、以及促进头发毛囊发育。

根据本发明的另一方面，提供了抗TGFα-H1的抗体或其可溶性片段。

根据本发明的又一方面，提供了这种多肽的拮抗剂，其可用于抑制这种多肽的作用，例如治疗肿瘤和银屑病并诊断癌症。

本发明的这些及其它方面根据本文的教导对本领域熟练技术人员将是显而易见的。

下述附图旨在说明本发明的实施方案，并非限制本发明的范围。

图1示出TGFα-H1 cDNA的开放读框的预计的氨基酸翻译。数字标始于第7位，因为在1-6位的合成BamHI接头(未示出)用于克隆基因。还示出了位于406位的最终终止密码子。所示下列编码132个氨基酸。通过与TGFα基因家族的其它成员比较可以看出只有下划线的50个氨基酸是生产可溶性生物活性生长因子所必需的(见图3)。

图2示出TGFα-H1 cDNA的全部3286个核苷酸的核苷酸序列，在1位的合成BamHI接头和在3286位的合成XhoI接头以黑体示出。编码TGFα-H1蛋白的开放读框用下划线示出，并且后跟最终终止密码子(以黑体示出)。用标准的IUPAC密码示出序列中长3’非翻译区的未定之处。

图3示出TGFα-H1与TGFα基因家族的其它成员之间的对比，星号*示出这一家族的生长因子分子的生物学活性所必需的6个重要的保守的半胱氨酸残基的位置。下划线的TGFα的50个氨基酸残基是已证明对于可溶性生长因子的活性所必需的氨基酸残基。(Amphi＝双调蛋白)

图4为示出本发明的多肽的RNA表达模式的northern印迹分析结果。

根据本发明的一个方面，提供了分离出的核酸(多核苷酸)，其编码具有图1的推导的氨基酸序列的成熟多肽。

本发明的多核苷酸在衍生自人脑和胎儿组织的cDNA文库中发现，其与TGFα基因家族在结构上相关，含有一编码132个氨基酸的成熟多肽的开放读框，其与TGFα基因家族的一些成员具有明显的同源性，这些成员包括TGFα本身和其它成员如双调蛋白和cripto。另外，在所有成员的一个特征基序中存在的6个半胱氨酸在TGFα-H1中是保守的。

在图1中，下划线的50个氨基酸是TGFα-H1的可溶性片段，即，不包括转膜部分。与TGFα类似，TGFα-H1的可溶形式通过蛋白裂解从一较大的氨基酸膜内在糖蛋白前体中释放，见Derynck，R.，Mol.Repro.and Dev.，27：3-9(1990)(Derynck，Mol.Reprod.Devel.，27：3-9(1990))。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与图1所示的编码序列相同，或者也可以是不同的编码序列，该编码序列由于遗传密码的丰余性或简并性，与图1的DNA编码相同的成熟多肽。

编码图1的成熟多肽的多核苷酸可以包括：成熟多肽的编码序列或其可溶形式；成熟多肽的编码序列或其可溶形式和另外的编码序列如前导序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列或其可溶形式(和任选的另外的编码序列)和非编码序列如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。

因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即仅包括多肽编码序列的多核苷酸，以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码具有图1的推导的氨基酸序列的多肽或其可溶形式的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸的变异体可以是天然发生的该多核苷酸的等位基因变异体，或是该多核苷酸的非天然发生的变异体。

因此，本发明包括编码图1所示的相同成熟多肽或其可溶形式的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，所述变异体编码图1的多肽的片段、衍生物或类似物。这些核苷酸变异体包括缺失变异体、置换变异体和增加或插入变异体。

如上所述，多核苷酸可以具有为图1所示的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列。如本领域所公知的，等位基因变异体是多核苷酸的另一种形式，其可以置换、缺失或增加一个或多个核苷酸，但基本上不改变所编码的多肽的功能。

本发明还包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在同一读框内与有助于多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸融合，例如前导序列，其是用于控制多肽从细胞转运的分泌序列。具有前导序列的多肽是一种前蛋白(preprotein)，前导序列可以由宿主细胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸还可编码一种蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸残基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白为蛋白原并是蛋白质的非活性形式，一旦序列原被切掉，则保留一活性成熟蛋白。

因此，例如，本发明的多核苷酸可以编码一成熟蛋白，或编码一具有序列原的蛋白或一具有序列原和前序列(前导序列)的蛋白。

本发明的多核苷酸还可以具有在读框内与标记序列融合的编码序列，其可用于纯化本发明的多肽。标记序列可以是，例如，由pQE-9载体提供的六组氨酸标记物用于在细菌宿主中纯化与该标记物融合的成熟多肽，或者，例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素标记物(HA)。HA标记物相应于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37：767(1984))。

本发明还涉及可与上述序列杂交的多核苷酸，条件是序列间具有至少50％、优选70％的同一性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用的，术语“严格条件”是指杂交仅发生在序列间具有至少95％、优选97％同一性的情况下。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码基本上保持了由图1的cDNA编码的成熟多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明还涉及具有图1的推导的氨基酸序列的TGFα-H1多肽，以及该多肽的片段、类似物和衍生物。

当指图1的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持这些多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括蛋白原，其可通过裂解蛋白原部分而激活以生产有活性的成熟多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。

图1的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中的一或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基取代(优选由保守的氨基酸残基取代)，并且这种取代的氨基酸残基可以由遗传密码编码，也可不是由遗传密码编码，或者(ii)其中的一或多个氨基酸残基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物例如为增加多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸与成熟多肽融合，例如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。这种片段、衍生物和类似物被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。

本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并优选纯化至均一性。

术语“分离的”是指从其原始环境(例如，若其是天然存在的则是天然环境)中脱离的物质。例如，存在于活体动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但从一些或所有共存物质中分离的相同的多核苷酸或DNA或多肽则是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是某种组合物的一部分，并且如果这种载体或组合物不是其天然环境的一部分，则其还是分离的。

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传工程化的宿主细胞，以及用重组技术生产本发明的多肽。

宿主细胞用本发明的载体遗传工程化(转导或转化或转染)，所述的载体可以是克隆载体或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。遗传工程化的宿主细胞可以在改良的传统营养培养基中培养，改良培养基是为了激活启动子，选择转化子或扩增TGFα-H1基因。培养条件如温度、pH等是先前用于选择用来表达的宿主细胞的条件，其对本领域普通技术人员是显而易见的。

本发明的多核苷酸可通过重组技术用于生产多肽，因此，例如，该多核苷酸可以包括在任一种表达载体中特别是载体或质粒中以表达多肽。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；衍生于质粒和噬菌体DNA的结合体的载体；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和拟狂犬病毒。然而，也可使用任何其它载体，只要其在宿主中可复制和生存。

如上所述，可通过多种程序将合适的DNA序列插入载体，通常，通过本领域公知的程序将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。这些和其它程序属于本领域熟练技术人员的范畴。

可通过各种程序将合适的DNA序列插入载体，一般地，该DNA序列通过本领域已知的程序插入合适的限制性内切酶位点。这些程序和其它程序被视为属于本领域熟练技术人员的范畴。

表达载体中的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA合成，作为这些启动子的代表性例子，可提及的有：LTR或SV40启动子，E.coli lac或trp启动子，λ噬菌体P_L启动子和其它公知用于控制基因在原核细胞或真核细胞或者病毒中表达的启动子。表达载体还含有一用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的合适的序列。

另外，表达载体优选含有一个用于为选择转化的宿主细胞提供表型标记的基因，如对于真核细胞培养为二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如为四环素或氨苄青霉素抗性。

可采用含有如上所述合适DNA序列以及合适启动子或调控序列的载体转化合适的宿主以使宿主表达蛋白质。作为合适的宿主的例子，可以提及的有：细菌细胞，如E.coli、链霉菌、鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇和Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。选择合适的宿主细胞被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。

更具体地，本发明还包括重组构建体，所述构建体包含一或多种上述序列。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，在该载体中以正向或反向插入本发明的序列。在这一实施方案的一个优选方面，该构建体还包括调节序列，包括例如，与所述序列连接的启动子。本领域熟练技术人员已知大量的合适的载体和启动子，它们是可商购的。以下举出载体的例子，细菌的载体：pQE70，PQE60，PQE-9(Qiagen)，Pbs，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，pBsKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核载体：pWLneo，pSV2cat，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它质粒或载体，只要其可在宿主中复制和生存即可。

启动子区可以选自使用CAT(氯霉素转移酶)的载体或其它带有选择性标记的载体的任何所需基因，两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI.lacZ，T3，T7，gpt，lambda P_R，P_L和trp；真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体和启动子属于本领域普通技术人员的水平范畴。

在另一实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞，所述的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))将构建体导入宿主细胞。

可以用传统的方式使用宿主细胞中的构建体以生产由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。

在合适的启动子的控制下，可以在哺乳细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白质，也可采用无细胞翻译系统使用由本发明的DNA构建体衍生的RNA生产这种蛋白质。原核和真核宿主使用的合适的克隆和表达载体见Sambrook，et al，MolecularClonning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，该书引入本文作参考。

高等真核生物对编码本发明的多肽的DNA的转录可通过在载体中插入一增强子序列而得以增加，增强子是约10-300bp的顺式作用的DNA因子，其作用于启动子以增加其转录。其例子包括位于复制起点晚期侧(100-270bp处)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，以及腺病毒增强子。

通常，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞的转化的选择标记，如E.coli的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表达基因的启动子以指导下游结构序列的转录。这种启动子可以衍生于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白的操纵子。在合适的阶段，杂合结构序列装配上翻译起始和终止序列，以及优选地，装配一能指导翻译的蛋白质进入周质空间或胞外培养基的前导序列。任选地，杂合序列可以编码—包括N—末端鉴别肽的融合蛋白质，以赋予所需的特征，如表达的重组产物的稳定性和纯化简便性。

用于细菌的表达载体的构建是通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入带有功能启动子的可操纵阅读相而完成。载体包括一或多种表型选择标记及一个复制起点以确证载体保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中扩增。合适的用于转化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各菌种，当然，也可采用其它菌。

作为代表性而非限制性的例子，有用的细菌表达载体可以包括衍生于包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的选择标记和细菌复制起点，这些商购质粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与合适的启动子及待表达的结构序列结合。

转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至合适的细胞密度后，用合适的方法(如温度改变或化学诱导)诱导选定的启动子，并继续培养细胞一段时间。

典型地，细胞由离心收集，用物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以进一步纯化。

用于表达蛋白质的微生物细胞可用任何常规方法破碎，如冻-融循环、超声处理、机械破碎，或使用细胞裂解试剂。

也可使用各种哺乳细胞培养系统表达重组蛋白，哺乳细胞表达系统包括由Gluzman，Cell，23：175(1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，以及其它能表达相容载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’旁侧非转录序列。可使用源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接体和多腺苷酸化位点以提供所需的非转录遗传因子。

可通过硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阳离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析(例如使用在固相支持物上的DNA或核苷酸)、羟基磷灰石层析和凝集素层析等方法从重组细胞培养物中回收并纯化TGFα-H1或其可溶形式。优选的是在纯化过程中存在低浓度(约0.1-5mM)的钙离子(Price，et al.，J.Biol.Chem.，244：917(1969))。如果需要，可使用蛋白质重折叠步骤以完成成熟蛋白的构型，最后，可采用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成过程的产物，或者通过重组技术从原核或真核宿主(例如，通过培养细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳类细胞)而生产。根据在重组生产过程中采用的宿主，本发明的多肽可以用哺乳类或其它真核类的碳水化合物糖基化或是非糖基化的。本发明的多肽还可以包括一起始的甲硫氨酸残基。

本发明的多肽可用于在EGF受体的EGFR家族中鉴定受体，这一家族目前包括EGFR1、EGFR2、EGFR3和EGFR4受体，EGFR2又称erb-2，这一分子在各种诊断和治疗中有用(Prigent，S.A.，and Lemoine，N.R.，Prog.in Growth Factor Res.，4：1-24(1992))。TGFα-H1可能是一或多种这些受体以及未被识别的新EGF型受体的一个配位体。TGFα-H1的使用有助于这种受体的识别、鉴定和克隆。

本发明的多肽还可用于恢复或增强由于损伤或其它损害病理(如AIDS痴呆、老年性痴呆等)而丧失的神经功能。已发现TGFα和其同系物在脑的大部分中是EGF/TGFα受体的最丰富的配位体(Kaser，et al.，Brain Res Mol Brain Res：16：316-322，(1992))。与EGF仅存在于脑的较小的更集中的区域相反，TGFα似乎在脑的各个区域中均有广泛的分布，提示TGF-α可能在脑组织中其生理学作用。在脑中的这些大量的TGFα受体位点表明TGF在促进正常脑细胞的分化和功能方面起重要作用，因此，当神经功能丧失时，给予本发明的多肽可以刺激大脑并增强合适的生理学功能。

TGFα-H1或其可溶形式还可用于治疗眼疾，例如角膜炎。各种实验包括了这种病理中的TGFα基因家族的各种成员，一篇最近的论文总结了与这些生长因子在眼疾中所起的作用相关的资料(Mann et al Cell 73：249-261(1993))。最近的实验证实缺乏TGFα基因的一些小鼠出现由于白细胞和其它细胞渗入眼睛固有质而引起的角膜炎。

另外，TGFα生长因子对于其靶细胞的特异性可被用作为摧毁靶细胞的机制，例如，TGFα-H1或其可溶形式可(通过各种方法)与毒性分子例如使靶细胞失活的放射性药物偶合，这些生长因子-毒素融合体杀伤靶细胞(在某些情况下通过各种“旁观者”效应杀伤邻近细胞)。这种毒素-融合基因的一个最近的例子由Mesri，et al在J.Biol.Chem.268：4853-62(1993)中公开。

以这种方式，TGFα-H1可用作抗瘤化合物。对于体内应用，本发明的多肽可以各种方式给药，包括但不限于注射、输注、局部、非肠道给药等。可通过任何生理学可接受载体如磷酸缓冲的盐水、盐水、无菌水等给药。TGFα-H1及其相关分子还可包在脂质体中，并可以与识别并结合于肿瘤或细胞特异性抗原的抗体辍合从而提供一种用于“瞄着”细胞的方法。

TGFα-H1多肽片段还可用于治疗某些肾脏疾病，因为已发现肾脏中有这些生长因子的表达。因此，这些因子对于保持这一器官的正常生理状态是必需的。

治疗还涉及肝再生/肝功异常，因为在部分肝切除和急性肝细胞坏死TGFα和其同系物与肝细胞生长因子能引起肝细胞再生(Masuhara，M.et al，Hepatology16：1241-1249(1992))。

TGFα-H1的一个显著用途涉及伤口愈合。本发明的组合物可以用于治疗各种伤口，包括几乎所有的皮肤伤口、角膜伤口和机体的上皮系中空器官的损伤。适合治疗的伤口包括由损伤如烧伤、擦伤和刀伤引起的伤口，以及外科程序如外科手术和皮肤移植产生的伤口。适于用本发明的多肽治疗的其它病情包括慢性病如慢性溃疡、糖尿病性溃疡和其它不愈合性(热带性)疾病。

TGFα-H1或其可溶片段可以掺入生理学可接受载体以用于感染区域，载体的性质可有各种变化并取决于欲施用的位置。用于皮肤时通常优选的是以乳状或膏状体为基；合适的基底材料包括羊毛脂，Silvadene(Marion)(特别是用于治疗烧伤)、Aquaphor(Duke Laboratories，South Norwalk，Conn.)等。如果需要，可将含TGFα-H1的组合物掺入绷带及其它伤口包扎物以使伤口持续与该肽接触。气雾剂有时也可应用。

在治疗组合物中的TGFα-H1的浓度不是重要的，但应足以诱导上皮细胞增殖。该组合物可局部用于感染区域，典型地用作眼药水或用于皮肤时作为乳液、药膏或药液。当用于眼疾时，最好经常使用，通常以少于等于4小时的间隔使用。用于皮肤时，希望的是在愈合过程中治疗组合物能持续保持在感染区域，每天施用该治疗组合物2-4次或更频繁。

本发明的多肽的用量将根据给药方式、所采用的其它活性化合物等而变化，通常为约1μg-100μg。本发明的多肽可与生理学可接受的载体如盐水、磷酸盐缓冲的盐水等一起使用。化合物的用量根据实验确定，根据细胞在体外对本发明的多肽或含本发明的多肽的制剂的反应以及实验动物对其的反应决定。

TGFα-H1或其可溶性片段可以用于调节血管生成、骨骼再吸收、免疫反应以及突触和神经元效应器功能。TGFα-H1还可以用于调节花生四烯酸级联系统。

TGFα-H1或其可溶性片段还可以用于与终末分化相关的应用。许多TGFα因子及其同系物在其靶细胞中诱导终末分化，可通过给予该因子并诱导靶细胞死亡而在体内利用这一性质，这一疗法正考虑用于与医学上不希望的细胞类型的过量增殖相关的疾病如癌症和其它增殖性疾病(例如炎症、银屑病等)。除了体内给药，也有各种情况需体外给药，例如，可通过用生长因子和/或其衍生物治疗细胞而在体外清除骨髓中不需要的细胞群。

相关的治疗还涉及脱发、掉发及其它影响头发毛囊发育的皮肤病。各种证据表明在这些病情中均有TGFα生长因子的参与。如上所述，进行了工程操作以在其TGFα基因中包含一无效突变的“失效”小鼠显现了与头发合成的数量和质量相关的异常，另外，在小鼠中的作图研究表明一些影响头发生长的突变定位在TGFα基因座(Mann et al，Cell 73：249-261(1993))。TGFα-H1或其衍生物的局部或全身应用可以治疗一些形式的头发和掉发，这些权利要求属于本发明的范围。

通过系统性临床给予TGFα-H1生长因子可以部分或全部消除一些疾病病理，给药可以以基因疗法的形式(见下述)；或通过给予由TGFα-H1 DNA的重组构建体合成的或肽化学合成的肽或蛋白质(Woo，et al.，Protein Engineering 3：29-37(1989))。

基因疗法是在体内表达本发明的多肽。

因此，例如，可用编码来自体内的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)对细胞如骨髓细胞进行工程化，随后将工程化的细胞再提供给需用多肽治疗的患者，这些方法是本领域公知的。例如，可用含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒利用本领域熟知的程序对细胞进行工程化。

类似地，例如也可通过本领域公知的程序在体内对细胞进行工程化以在体内表达多肽。如本领域所公知的，可将生产含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产者细胞给予患者以在体内进行细胞的工程化并在体内表达多肽。

通过这种方法给予本发明的多肽的这些和其它方法对于本领域熟练技术人员根据本发明的教导是显而易见的。例如，用于工程化细胞的表达载体可以不是反转录病毒，而是例如腺病毒，其在与合适的输送载体结合后可用于在体内工程化细胞。

基因疗法的另一种方法是给药可通过直接注射裸露的或胶囊化的(例如脂质体等)TGFα-H1 DNA而完成。

本发明的多肽可以与合适的药物载体结合应用，这种组合物包括治疗有效量的蛋白质以及药物学可接受的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水、缓冲的盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其结合物。配制品应适合给药方式。

本发明还提供了一种药物包装盒或试剂盒，其包括一或多个填充有一或多种本发明的药物组合物成分的容器。与这种容器在一起的还有由控制药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构出具的通知，该通知反应了该机构许可其为人体用而生产、使用或销售。另外，本发明的多肽可以与其它药物化合物结合应用。

用于诱导或抑制对TGFα-H1敏感的靶细胞群的增殖的最有效的浓度可通过向细胞加入各种量的TGFα-H1并检测其反应而确定。另外，增强或降低TGFα-H1的产量的药物可通过用该感兴趣的制剂治疗的细胞检测TGFα-H1信息或蛋白质的合成而测定。

本发明的序列还可用于染色体鉴定，该序列特异地定向于个别的人染色体的特定位置并可与之杂交。另外，目前需要鉴定染色体上的特定位点，而现在只有很少几种基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可以商购用于标记染色体位置。本发明的将DNA定位于染色体是将这些序列与相关疾病的基因联系起来的非常重要的第一步。

简而言之，可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)而将序列定位在染色体上。使用cDNA的计算机分析快速选择长度不超过基因组DNA的一个外显子并因而不会使扩增复杂化的引物，随后使用这些引物对含有个别的人染色体的体细胞杂合子进行PCR筛选。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合子能得到扩增产物。

体细胞杂合子的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的一个快速程序。采用本发明相同的寡核苷酸引物，可以类似的方式将来自特定染色体的一组片段或大基因组克隆的集合体进行亚定位。其它的可类似用于染色体作图的作图策略包括原位杂交、用标记的流选的染色体进行的预筛选，以及通过杂交预选以构建染色体—特异cDNA文库。

cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的一步法染色体定位。这一技术可使用短至500或600个碱基cDNA；然而，大于2000bp的克隆更易于与独特的染色体位置结合以具有足够的信号强度便于检测。FISH需要使用衍生EST的克隆，越长越好。例如，2000bp是好的，更好为4000bp，而超过4000则可能不是获得好结果所必须的，因其时间不合理。此技术的综述见Verma et al.，HumanChromosomes：a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦某一序列已被精确定位于染色体某一位置，则可比较该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱资料的关系，这种资料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritancein Man中发现(可在线从Johns Hopkins University Welch Medical Library获得)。随后可通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)鉴别基因与已定位于相同染色体区的疾病之间的关系。

接着，必须确定感染个体和未感染个体之间的cDNA或基因组序列的差异，如果在一些或所有感染个体中观察到某一突变而未在任何正常个体中观察到这种突变，则该突变可能是该疾病的致病原。

应用目前的物理作图和遗传作图技术的分辨率，一种精确定位于与疾病有关的染色体区的cDNA可以是50-500个潜在的致病基因中的一个(这假定作图分辨率为1兆碱基，并且每20kb为一个基因)。

感染个体和未感染个体的比较通常是首先寻找染色体的结构改变，如可从染色体涂片上观察到的或者用基于该cDNA序列的PCR检测到的缺失或易位。最后，需要对来自一些个体的基因进行全测序以证实存在突变并从多态性中区分突变。

本发明还涉及用反义技术体内抑制TGFα-H1，反义技术通过三螺旋形成或反义DNA或RNA可用于控制基因表达，这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，用编码本发明的多肽的多核苷酸序列的5’编码区设计长度为10-40bp的反义RNA寡核苷酸。设计一DNA寡核苷酸以互补于转录涉及的基因的某区域(三螺旋—见Lee et al.，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooney et al，Science，241：456(1988)；and Dervanet al，Science，251：1360(1991))，从而防止TGFα-H1的转录和生产。反义RNA寡核苷酸与mRNA体内杂交并阻断mRNA分子翻译成TGFα-H1(反义-Okano，J.Neurochem.，56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression.CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。

或者，上述寡核苷酸可以通过本领域公知的程序输送到细胞，从而反义RNA或DNA可以体内表达以通过上述方式抑制TGFα-H1的生产。

因此，TGFα-H1的反义构建体可以用于抗肿瘤治疗，因为最近的研究表明在小鼠中抑制肿瘤细胞的TGFα(或其同系物)的分泌或表达可以抑制肿瘤。这种抑制剂可以是反义寡核苷酸、单克隆抗体等。反义寡核苷酸防止细胞生产生长因子，而抗体与表面结合的或分泌的生长因子结合并中和之。

多肽、其片段或其它衍生物、或其类似物、或表达其的细胞可用作免疫原生产抗体，这些抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体，以及Fab片段，或者Fab表达文库的产物。可使用现有技术中公知的各种程序生产这些抗体和片段。

抗对应于本发明的序列的多肽或其体内受体的抗体可以通过将多肽直接注射给动物或将多肽给予动物、优选非人而获得，如此获得的抗体随后与多肽本身结合。以这种方式，仅编码多肽的一个片段的序列也可用于生产与完整天然多肽结合的抗体，这种抗体随后可用于从表达该多肽的组织中分离该多肽。

为制备单克隆抗体，可使用任何提供由连续细胞系培养物生产的抗体的技术，例如杂交瘤技术(Kohler and Milstein，1975，Nature，256：495-497)，三瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(kozbor et al.，1983，Immunology Today 4：72)，以及生产人单克隆多肽的EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。

用于生产单链抗体的技术(USP4.946,778)可以用来生产本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。

特异于TGFα的抗体可用于癌症的诊断和治疗，因为在赘生和增生过程中许多中癌细胞增量调节TGFα家族的各种成员。这些抗体与TGFα-H1结合并使之失活。抗TGFα(和/或其家族成员)的单克隆抗体正临床用于诊断和治疗某些疾病，如(但不限于)赘生和增生性生长异常。赘生组织对生长因子表达的增量调节形成了许多血清检测的基础，该检测是是检查在感染患者血中生长因子的增加。这些检测不仅典型地适用于诊断装置，还适用于预后装置(以检测手术、化疗等后的隐藏肿瘤细胞的存在)。

另外，表达TGFα-H1受体的恶性细胞可在受体结合分析中用标记的TGFα-H1或TGFα-H1相关分子检测，或用抗TGFα-H1受体本身的抗体检测。可根据TGFα-H1受体的存在和密度区分细胞，从而提供一种方法预测这种细胞对TGFα-H1的生物活性的易感性。

本发明还涉及本发明的多肽的拮抗剂/抑制剂，该拮抗剂/抑制剂抑制或消除该多肽的功能。

因此，例如，拮抗剂与本发明的多肽结合并抑制或消除其功能，拮抗剂例如可以是与多肽结合的抗体，或在某些情况下是寡核苷酸。抑制剂的一个例子是与多肽结合并占据多肽的催化位点的小分子从而使催化位点不能与底物接触，进而防止正常的生物学活性，这些小分子的例子包括但不限于小肽或类肽分子。

或者，可以采用与受体(本发明的多肽正常与该受体结合)结合的本发明的多肽的拮抗剂，该拮抗剂可以是紧密相关的蛋白质以便它们识别并结合于天然蛋白质的受体位点，但它们是天然蛋白质的无活性形式并由此因为受体位点被占据而防止TGFα-H1的作用。以这种方式，拮抗剂/抑制剂还可用于治疗某些皮肤病，如银屑病。最近的研究发现在取自如银屑病损害的皮肤活体组织中有升高水平的这些生长因子的表达(Cooket al Cancer Research 52：3224-3227(1992))。

拮抗剂/抑制剂还可用于诊断检测癌症，因为TGFα-H1可由某些类型的肿瘤细胞增量调节，拮抗剂可用在一分析中确定TGFα-H1的升高的水平。这些拮抗剂/抑制剂还可用于治疗癌症，因为它们阻断肿瘤上的TGFα-H1受体位点，在小鼠中抑制TGFα或其同系物的活性导致抑制肿瘤。

拮抗剂/抑制剂可与例如上述的药物学可接受载体形成组合物而应用。

以下将参照实施例进一步描述本发明，但是应理解的是，本发明不受这些实施例的限制。除非另有说明，所有的份或量均为重量份或重量。

为促进对下述实施例的理解，以下将描述常用的方法和/或术语。

“质粒”的命名是将小写字母p置于前面和/或后跟大写字母和/或数字。本文的起始质粒或者是商购得到的，或者是公众可以不受限制地得到的，或者可以根据公布的程序由可得到的质粒构建的。另外，与所述的这些等效的质粒是本领域公知的，并对本领域普通技术人员是显而易见的。

DNA的“消化”是指用仅作用于DNA的特定序列的限制性酶对DNA的催化裂解。本文所用的各种限制性酶是可商购的，其反应条件、辅因子和其它要求对于本领域普通技术人员是公知的。为分析目的，典型地，1μg质粒或DNA片段使用约2单位的酶，反应体积为20μl缓冲液；为分离DNA片段用于构建质粒的目的，典型地，在较大体积中用20-250单位酶消化5-50μgDNA。对特定限制性酶的合适的缓冲液和底物由厂商提供。通常使用37℃1小时的温育时间，但可根据供应商的指示而变化。消化后，将反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需片段。

裂解片段的大小分离是根据Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行。

“寡核苷酸”是指可化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两个互补的聚脱氧核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸则不能与另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有经过脱磷酸化的片段连接。

“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，etal.，Id.，p.146)。除非另有说明，连接可以采用公知的缓冲液，在每0.5μg约等摩尔的待连接DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)的条件下进行。

除非另有说明，使用Graham，F.and Van der Eb.A.，Virology，52：456-457(1973)的方法进行转化。实施例1

从插入有TGFα-H1的Bluescript为基的载体中切下TGFα-H1的开放读框并置入称为p QE9的新型克隆载体(见下述)。这一载体可以接受BamHI-HindIII片段。BamHI-HindIII相容性限制片段的产生是由TGFα-H1通过使用对应于该DNA序列的5’和3’末端的PCR寡核苷酸引物进行扩增以合成插入片段。5’寡核苷酸引物的序列为5’-ATTCTAGTTGGATCCGATGGACTACAATATCGACCA-3’，其含有-BamHI限制性酶位点(下划线)，后接21个TGFα-H1编码序列的核苷酸；3’引物序列为5’-CTCCCTCAAAGGAAGCTTTTAAGAGC-3’，其含有互补于位于TGFα-H1基因的3’非翻译区内的天然存在的HindIII位点(下划线)的序列。该BamHI-HindIII位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)上的BamHI-HindIII位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调控启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记(6-His)和限制性酶克隆位点。用连接混合物转化E.coli菌株M15/rep4(得自Qiagen，商标m15/rep4)，该菌株含有多拷贝的表达lacI阻抑物并赋予卡那霉素抗性(Kan^r)的质粒pREP4。在LB平板上培养转化子并筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的液体LB培养基中将含有所需构建物的克隆培养过夜(O/N)，O/N培养物以1∶100-1∶250的比例接种到大体积培养基中，培养细胞至光密度600(O.D.⁶⁰⁰)为0.4-0.6。随后加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度为1mM，通过使lacI阻抑物失活，IPTG诱导激活P/O，使基因表达水平提高。再培养细胞3-4小时，随后离心收集细胞，将细胞溶解在离液剂6M盐酸胍中，澄清后，在使得与含6-His标记的蛋白质紧密结合的条件下，通过镍-螯合柱层析(Hochuli，E.et al.，Genetic Engineering，Principles & Methods，12：87-98(1990))从溶液中纯化溶解的TGFα-H1。在6M盐酸胍pH5.0中从柱中洗脱TGFα-H1，并为复性目的调整至3M盐酸胍、100mM磷酸钠、10mM谷胱甘肽(还原型)和2mM谷胱甘肽(氧化型)。将这—溶液温育12小时后，将蛋白质对50mM磷酸钠透析。

根据以上的教导，对本发明作出各种改进和变动是可能的，预测，在所附权利要求书的范围内，本发明可以不同于所述的方式实施。

序列表(1)一般信息：(i)申请人：MEISSNER，ET AL。(ii)发明名称：转化生长因子α-H1(iii)序列数：3(iv)联系地址：

(A)联系人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART & OLSTEIN

(B)街道：6 BECKER FARM ROAD

(C)城市：ROSELAND

(D)州：新泽西州

(E)国家：美国

(F)邮编：07068(v)计算机可读形式：

(A)媒介类型：3.5寸软盘

(B)计算机：IBM PS/2

(C)操作系统：MS-DOS

(D)软件：WORD PERFECT 5.1(vi)本申请资料

(A)申请号：PCT/US94/05476

(B)申请日：1994年5月12日

(C)分类：(v)在先申请资料

(A)申请号：08/208,008

(B)申请日：1994年3月8日(vi)律师/代理人信息：

(A)姓名：FERRARO，GREGORY D.

(B)注册号：36，134

(C)案号/文档号：325800-154(viii)通讯信息：

(A)电话：201-994-1700

(B)传真：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征(A)长度：400碱基对(B)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：1GATGGACTAC AATATCGACC AGATGTGAAA GATGCTAGTC ATCAAAGAGA AGATGTTTAT 60ATTGGAAACC ACATGCCTTG CCCTGAAAAC CTCAATGGTT ACTGCATCCA TGGAAAATGT 120GAATTCATCT ATTCTACTCA GAAGGCTTCT TGTAGATGTG AATCTGGCTA CACTGGACAG 180CACTGTGAAA AGACAGACTT TAGTATTCTC TATGTAGTGC CAAGTAGGCA AAAGCTCACT 240CATGTTCTTA TTGCAGCAAT TATTGGAGCT GTACAGATTG CCATCATAGT AGCAATTGTA 300ATGTGCATAA CAAGAAAATG CCCCAAAAAC AATAGAGGAC GTCGACAGAA GCAAAACCTA 360GGTCATTTTA CTTCAGATAC GTCATCCAGA ATGGTTTAAA 400(2)SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征(A)长度：132个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链性：(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Asp Gly Leu Gln Tyr Arg Pro Asp Val Lys Asp Ala Ser Asp Gln

5 10 15Arg Glu Asp Val Tyr Ile Gly Asn His Met Pro Cys Pro Glu Asn

20 25 30Leu Asn Gly Tyr Cys Ile His Gly Lys Cys Glu Phe Ile Tyr Ser

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50 55 60His Cys Glu Lys Thr Asp Phe Ser Ile Leu Tyr Val Val Pro Ser

65 70 75Arg Gln Lys Leu Thr His Val Leu Ile Ala Ala Ile Ile Gly Ala

80 85 90Val Gln Ile Ala Ile Ile Val Ala Ile Val Met Cys Ile Thr Arg

95 100 105Lys Cys Pro Lys Asn Asn Arg Gly Arg Arg Gln Lys Gln Asn Leu

110 115 120Gly His Phe Thr Ser Asp Thr Ser Ser Arg Met Val

125 130(2)SEQ ID NO：3的信息(i)序列特征(A)长度：3288碱基对(B)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：3GGATCCGATG GACTACAATA TCGACCAGAT GTGAAAGATG CTAGTGATCA AAGAGAAGAT 60GTTTATATTG GAAACCACAT GCCTTGCCCT GAAAACCTCA ATGGTTACTG CATCCATGGA 120AAATGTGAAT TCATCTATTC TACTCAGAAG GCTTCTTGTA GATGTGAATC TGGCTACACT 180GGACAGCACT GTGAAAAGAC AGACTTTAGT ATTCTCTATG TAGTGCCAAG TAGGCAAAAG 240CTCACTCATG TTCTTATTGC AGCAATTATT GGAGCTGTAC AGATTGCCAT CATAGTAGCA 300ATTGTAATGT GCATAACAAG AAAATGCCCC AAAAACAATA GAGGACGTCG ACAGAAGCAA 360AACCTAGGTC ATTTTACTTC AGATACGTCA TCCAGAATGG TTTAAACTGA TGACTTTTAT 420ATGTACACTG ACCATGTGAT GTACATTTAT TATGTCTTTT TTTAAAGAAT GGAAATATTT 480ATTTCAGAGG CCTTATTTTT GGACATTTTT AGTGTAGTAC TGTTGGCTCG TATTTAGAAT 540ATTCAGCTAC GACAGTTTTG GACTGTTTAG TAGTCTTTGT TTTATGTTTT TAAATACAGA 600AATTGCTTTC ACAAATTTGT ACCACATGGT AATTCTAAGA CTTGTTCTTT ACCCATGGAA 660TGTAATATTT TKGGAAAGAT GGACTACTTC ACAAATGGGT TATAAAGTCA TATTCCACTT 720CTTCCACAAA TGACCACAGG AAATTGACCA AGCATGAACT TAARGAATCG CCTGTCGRGR 780GTTACAGRAG RTGAAGGACC ARGACGCTGC TCTTACCATT GTGACTGTGC TGGACAAAGT 840AGCCTCCATC GTGGACAGTG TGCAGGCAAG CCAGAAGAGA ATAGAAGAGA GACACAGGGA 900AATGGAAAAT GCCATAAAAT CCGTCCAGAT TGACCTGTTG RAGCTTTCAC AGTCGCATAG 960CAATACAGGG CATATCATTA ACAAATTGTT TGAGAAAACC CGAAAAGTTA GTGCTCACAT 1020TAAAGATGTG AAAGCCCGGG TGGAGAAGCA ACAAATTCAT GTTAAAAAAG TTGAAGTCAA 1080GCAAGAGGAA ATAATGAAGA AAAACAAATT CCGCGTGGTA ATATTCCAGG AGAAGTTTCG 1140GTGTCCGACA TCCCTGTCTG TTGNTTAAAG ACAGAAACCT AACTGAGAAC CAAGAAGAGG 1200ATGATGATG ATATCTTTGGA TCCCCCAGTA GGATCTTGTC TTCGGATGAA GATTATTATG 1260TTGAAGAAA GCAGGTCTTGC CAGGCTTAGG AAGTCCGGCC AGGAGCCCCT TGATAATATC 1320CAGAAGGCN TTTTCCAAAGA AAACTGCGAA GACCCGGCAG AATCTTGACC AGAAAGTGAA 1380CGAATTAGA ACTAGAATAGT GACCCCGGAG AGGAGAGAGA GGCTAAGGCA GTCAGGAGTA 1440GAGGCTGAG TACAGTCAGGG GAGAGGCTGA GACAGTCAGG GGGAGAGGTT TAAGAAATCT 1500ATTTCTAAT GCAGCTCCCTC AAAGGAAGCT TTTAAGATGC GCAGCCTCAG GAAAGGTAAG 1560GACCGAACA GTGGCTGAAGG TGAGGAATTG TGCCAGGGGA GATGGTGTTG GACATCAWTG 1620SCAGGAGCG AGTCTTCTKGG SCCCATCAGK GAGCTCTWCT CTGATGAGTC ARTGACCAAA 1680AMACGAGGC AGCCAGGCCGG TGTATCCTCC CCATGAAGGA AGAGAAATCC CCACCCCCGA 1740RCCTTTAAA AGTTACTTTTA AATCTCAGGT GAAAGTAGAG GATGATGAAT CTCTTTTGGT 1800TAGATTTAA AGCACTCATCG TAAAGAGGGA ATTAAGTATA TCCTAAATAT GAATCTCCTA 1860ATCATGCAG TTTTAGTTTGA ATAGTGTAGT CGTCYACATT TCTGTGCCAT GTAGGAAAAC 1920ATAAATGTA ATTTTTTTCTT ATATTTAAAA TCTTGAAGAT AATATAAATA TTATTATCAC 1980TCTTTCTCA TGGCAGCTGTG GATTTTTTAG TTCCTTTCTC TTGTCCACCA GAAAAATAGT 2040TTCCTAGGT TGGGCCAGTTA CGTGTTTGGT AAGGGCAACT TTGCGSCCGT CATTTGCAGG 2100AGAACTCTA AATATTGGTTA GGATTAATAT TGTGGCCASC CTCMAAGGGG AATAACTCAT 2160GTGTGGGTT ATATCGTCCAG ATGTTCAGAT CAACAGATTT GTTAGTAAAT TAGCAGTCAC 2220ACCCCTTTT TTGATGCTTTC ACATTAAAAA ATTGAAGTTT TGGACTTGAG CATTTGGCTC 2280TAGTATCAT AGCTTTACTTA AAAGAAAACC CTGGSCAAGT CATCATCTGC TTATTCTCAT 2340CAGTAAAAA TGGAGAGGGTT GGCCTCTSCT KCCTGCCTCA GAGGACTGTT GTGATGATCA 2400AAGGAAATG GTACACATTCT GGGGGAACAA GAAGCACACC CAGAGAAAAC AARCCTCATC 2460AGTTCCTCC CAAACAGAATG GAAAGAGTTA CACCTTCTGA WAAGCCCTCA GCACCAATCA 2520GTAAGGTCC TAGGTTGGAGA GAAACTAAAG CTGGTCTTCA GAARCCTTTT CACAGAATCA 2580AGAGTGAAA AATAAGTAAAT GTTTGGGTGW CCACTTTTTC ATCAGACTAA CTATATCTTG 2640GGTTTTAGT TGGGTCCAAAT GTTCCCCAGC CAGACCCTTT CTAATTTCCT TTTGATTAAG 2700ATCTTTGGT GGACTATAGCA CNTAAATTTG TTTAAGCAGT ATGAGGCATA AAATTGTGAC 2760TATGTTTCT AAAGTCGGCCC TGATGCATTG GGTTTGGAAA TGACCACAAA TATTCCTGTT 2820TTCCTGAGT GTACCCTTCAG GGTCCAGCTG TCCAAAACAG TGTTGATAGG AGTTCATCAT 2880ACCTCCTTT GGGAGGAAGCC AAGATTCTCC TTATCTTTTA GCTTTAAGAT CCGTGGAATC 2940CAGGAAGAG AACAATGTCTA TTGTTGCTAA AGAAAGAAAG AAATGGGCCG GGTGTGGTGG 3000CTCACGGGG AGTAATCCCAG CACTTTGCGA GGCCGAGGTG GGTGAATCAC CTGAGGTCAG 3060AAGTTCACG ACCAGCCTGAC CAACATGGCG AAACCCTGAC TCTACTGAAA AAACCAAAAT 3120TACTGGGCA TGGTGGCATGC GCCTGTCCCA GCTACTCAGG AGGCTGAGAC AGGAGAATTG 3180CTTGAACCC AGGAGGCGGAG GTTCAGTGAA CCGAGATTGT TCCACTCACT CAAGCCTGGG 3240CCAAAGAGC CAGACTCTGTT TCCAAAAAAA AAAAAAAAAA AACTCGAG 3288

Claims

1、一种编码TGFα-H1的分离的多核苷酸，所述的多核苷酸为编码具有图1的推导的氨基酸序列的TGFα-H1多肽的多核苷酸。

2、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是DNA。

3、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸编码TGFα-H1的可溶性片段。

4、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。

5、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是基因组DNA。

6、权利要求1的多核苷酸，具有图1所示的TGFα-H1的编码序列。

7、含有权利要求2的DNA的载体。

8、用权利要求10的载体遗传工程化的原核宿主细胞。

9、一种用于生产多肽的方法，包括：

用权利要求8的宿主细胞表达由所述DNA编码的多肽。

10、一种生产能表达多肽的原核细胞的方法，包括用权利要求7的载体对细胞进行遗传工程化。

11、可与权利要求2的DNA杂交并编码具有TGFα-H1活性的多肽的分离的DNA。

12、一种多肽，其为具有图1的推导的氨基酸序列的TGFα-H1多肽。

13、权利要求12的多肽在制备治疗需要TGFα-H1的疾病的药物中的应用。

14、权利要求12的多肽的拮抗剂/抑制剂在制备治疗需要抑制TGFα-H1的疾病的药物中的应用。

15、权利要求12的多肽，其中该多肽是TGFα-H1的可溶性片段。