NL8900178A

NL8900178A - Groei regulerende clycoproteinen.

Info

Publication number: NL8900178A
Application number: NL8900178A
Authority: NL
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1988-01-25
Filing date: 1989-01-25
Publication date: 1989-08-16
Also published as: FR2628109B1; IL89033A; SE8900247D0; FI890312A0; US5830995A; GR1000849B; NO890299L; NO177788C; FR2628109A1; CH681080A5; GB2214185A; AU2876989A; HUT52545A; GB2214185B; AT399720B; AU623109B2; SE8900247L; NZ227729A; IE890207L; MY104980A

Description

Nederlandse octrooiaanvrage No. 8900178 Titel: Groei regulerende glycoproteinen.

1. Inleiding.

De uitvinding heeft betrekking op de bereiding en toepassingen van Amphireguline, een nieuw groei regulerend glycoproteine. De proteïnen volgens de uitvinding inhibiteren de groei van verscheidene van tu-5 moren afgeleide cellijnen in sterke mate, terwijl zij de celgroei in verscheidene andere cellijnen bevorderen. Van deze bifunctionele groeiregu-lator wordt een ruim traject van therapeutische toepassingen beschreven, onder meer de behandeling van wonden en de diagnose en behandeling van kankers.

10 2. Achtergrond_van de uitvinding.

Celgroei en -differentiatie blijken te worden geïnitieerd, b.v. gehandhaafd en gereguleerd door een aantal stimulerende, inhibiterende en synergistische factoren en hormonen. De verandering en/of stilstand van het cellulaire homeostasemechanisme schijnt een basisoorzaak te zijn 15 van groei-gerelateerde ziekten, waaronder neoplasia. Groei modulerende factoren zijn betrokken bij een ruime variëteit van pathologische en fysiologische processen, waaronder signaaltransductie, celcommunicatie, groei en ontwikkeling, embryogenese, immuunrespons, bloedvorming, cel-overleving en differentiatie, ontsteking, weefselherstel en vernieuwing, 20 aterosclerose en kanker. Er is dan ook veel belangstelling voor de isolering, karakterisering en definiëring van de functionele mechanismen van groei modulerende factoren wegens hun potentiële gebruik voor de diagnose, prognose en behandeling van kanker. Bovendien zal de verwerving van kennis van deze factoren de basismechanismen achter normale groei-25 controle en het verlies daarvan in kankercellen beter doen begrijpen.

Epidermale groeifactor (EGF), transformerende groeifactor-CC.

(TGFcC), plaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF), fibroblastgroeifactor (FGF), zenuwgroeifactor (NGF), transformerende groeifactor-/3 (TGFfi), 89 00 178 : - 2 - . f i*s r> insuline-groeifactor I en II (IGF I, IGF II), bloedvormingsgroeifactoren, zoals erythropoiëtine, kolonie stimulerende factoren (CSF 1 en 2), inter-leukinen (IL-1 tot 6), interferonen (IFN <X, ft, ^), tumornecrosefactor oien (TNF o£, fit) , leukoreguline, oncostatine M, en andere minder gedefi-5 nieerde factoren zijn groei en differentiatie modulerende proteïnen, geproduceerd door een variëteit van celtypen, hetzij onder normale fysiologische omstandigheden, hetzij in reactie op exogene prikkels. De meeste van deze factoren blijken op autocrine en paracrine wijzen te werken. (Voor overzichten zie: Goustin e.a., 1985, Cancer Res. 46: 1015 - 1029; 10 Rozengurt, 1986, Science 234; 161-66; Pardee, 1987, Cancer Res. 47: 1488-1491; Sachs, 1986, Sci. Amer. 254: 40-47; Marhall, 1987, Cell 50:.

5-6; Melcher en Anderson, 1987, Cell 30: 715-720; Clemens en McNurlan, 1985, Biochem. J. 226: 345-360; Nathan, 1987, J. Clin. Invest. 79: 319-326; Sporn en Roberts, 1986, J. Clin. Invest. 78: 329-332; Old, 1987, .

15 Nature, 326: 330-331 ; Beutler en Cerami, 1987, New Eng. J. Med. 316: 379-385; Weinstein, J. Cell. Biochem., 33: 213-224; Zarling e.a., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 9739-9744; Sporn en Todaro, 1985, N. Eng. J. Med. 303: 878-880; Sporn en Roberts, 1985, Nature 313: 745-747.) 20 Biologisch actieve forbolesters, zoals 12-O-tetradecanoyl-forbol- 13-acetaat (TPA) zijn krachtige tumorpromotors in vivo, die een grote verscheidenheid van biologische en biochemische reacties in vivo alsook in vitro uitlokken en moduleren (Blumberg, 1981, Crit. Rev. Toxicol. 9: 153-197; Slaga, 1983, Cancer Surv. 2: 595-612). Het is al enige tijd be- 25 kend dat TPA de groei van de menselijke borstadenocarcinoomcellijn MCF-7 inhibiteert. Verder wijzigt TPA ook de morfologie van MCF-7-cellen, voorzover met TPA behandelde cellen de morfologische eigenschappen van se-cretorische cellen vertonen (Osborne e.a., 1981, J. Clin. Invest. 67: 943-951; Valette e.a., 1987, Cancer Res. 47: 1615-1620).

30 3. Samenvatting van de uitvinding:

De uitvinding heeft betrekking op Amphireguline, een nieuwe cel-groei regulerende factor, die ongewone bifunctionele celgroei regulerende activiteit vertoont. Amphireguline inhibiteert de groei van neoplas-tische cellen, maar vermeerdert de groei van bepaalde normale cellen.

35 Amphireguline is een uitermate hydrofiel glycoproteïne met een mediaan 89 00 178 <' - 3 - - "T> «,» 0 molecuulgewicht van 22.500 Dalton, dat in twee onderscheiden, maar functioneel equivalente vormen voorkomt, een afgeknotte vorm en een grotere vorm. Behalve de additionele zes N-eindstandige groepen, die in de grotere vorm worden gevonden, zijn de twee vormen op het aminozuurniveau 5 (fig.12) volkomen homoloog. De uitvinding is gedeeltelijk gebaseerd op de ontdekking, dat met TPA behandelde MCF-7-cellen een glycoprotefne afgeven, dat de groei van de A431 epidermoïde carcinoomcellijn en andere tumorcellijnen inhibiteert maar de groei van normale menselijke fibro-blasten en sommige andere cellijnen vermeerdert.

10 De uitvinding wordt beschreven aan de hand van voorbeelden, waar in Amphireguline wordt geïdentificeerd, tot homogeniteit gezuiverd en grondig structureel en functioneel gekarakteriseerd wordt. In andere voorbeelden worden de isolering en opeenvolging van cDNA- en genomische clonen, die de Amphireguline-precursor coderen, beschreven. Deze clonen 15 werden gebruikt ter bereiding van expressievectoren, die in staat zijn de synthese op hoog niveau van biologisch actief Amphireguline in getransformeerde bacteriële en getransvecteerde eucaryotische gastheercellen te sturen.

Door de hier beschreven uitvinding wordt een grote verscheiden-20 heid van toepassingen voor deze unieke factor omvat.

4. Korte beschrijving van de_tekening: FIG.1. Preparatieve omgekeerde-fase HPLC van doorbraak en wassen.

FIG.2. Semi-preparatieve omgekeerde-fase HPLC van gecombineerde, fracties 47 - 62 van FIG.1.

25 FIG.3A. Analytische omgekeerde-fase HPLC van combinatie I uit de vorige proef.

FIG.3B. Analytische omgekeerde-fase HPLC van combinatie II uit de vorige proef.

FIG.4. Gelpermeatie-chromatografie van fracties uit FIG.3A en 3B 30 op Bio-Sil TSK 250-kolommen. De chromatografie werd uitgevoerd zoals nader te beschrijven in paragraaf 6.3.2. (A) HPLC van geconcentreerde fractie 35 (FIG.3A); (B) HPLC van geconcentreerde fractie 36 (FIG.3A); (C) HPLC van geconcentreerde fractie 37 (FIG.3A); (D) HPLC van geconcentreerde fracties 41 en 42 tezamen (FIG.3B).

35 FIG.5. Analyse van gezuiverde AR- en S-gepyridylethyleerde AR

8900 178.' *; 'f - 4 - (SPE-AR) door gelpermeatie HPLC op Bio-Sil TSK 250-kolommen. De chroma-tografie werd uitgevoerd zoals nader te beschrijven in paragraaf 6.3.2.

De gebruikte molecuulgewichtmarkers waren ovalbumine, 43 kD; chymotryp-sinogeen A, 25kD; ribonuclease, 14kD; en insuline, 6kD; (A) AR; (B) SPE-5 AR.

FïG.6. Analyse van AR en SPE-AR op een omgekeerde-fase ultraporie RPSC C3-kolom (4,6 x 75 mm). De gradiënt werd geleid tussen primair oplosmiddel 0,1% TFA en het secundaire oplosmiddel acetonitrile met 0,1% TFA bij een vloeisnelheid van 1 ml/minuut bij kamertemperatuur. Fracties 10 van 1 ml werd verzameld. (A) AR; (B) SPE-AR.

FIG.7. SDS-PAGE-analyse van AR-protexnen. (A) Een 15%'s SDS-PAGE-gel (0,75 mm x 18 cm x 15 cm, Bio-Rad) met een discontinu buffersysteem werden geleid bij een constante stroomsterkte van 30 milli-ampère. De gebruikte molecuulgewichtmarkers waren fosforylase B, 92,5kD; BSA, 66,2 15 kD; ovalbumine, 43kD; carbonische anhydrase, 31kD; chymotrypsinogeen A, 25,7kD; sojaboontrypsine-inhibitor, 21,5kD; lactoglobuline, 18,4kD; lysozyme, 14,4kD; aprotonine, 6,2kD; en insuline-subeenheid, 3kD. Route 1: AR; route 2; NG-AR; route 3; SPE-AR; route 4: NG-SPE-AR. (B) 20% SDS-PAGE minigel (0,75 mm x 10 cm x 7 cm) werd geleid bij een constante span-20 ning van 200 volt. De bovengenoemde molecuulgewichtmarkers werden gebruikt. Route 1; AR; route 2: NG-AR; route 3: met fosfolipase behandeld NG-AR, afgescheiden tot rp HPLC.

125 FIG.8. IEF-analyse van I-gemerkt AR. De volgende standaards met P -waarden tussen 4,65 en 9,6 werden gebruikt.· fycocyanine, 4,65; 25 /3 -lactoglobuline B, 5,1; runderkoolstofanhydrase, 6,1; menselijk kool stof anhydrase, 6,5; paardemyoglobine, 7,0; walvismyoglobine 8,05; OC~ chymotrypsine, 8,8; en cytochroom C, 9,6.

125 FIG.9. (A) Dosisreactiecurve van AR op de inhibitering van I- deoxyuridine-opname in DNA van A431-cellen; (B) Effect van AR op de sti-125 30 mulering van I-deoxyuridine-opname in DNA van menselijk voorhuidfibro-plasten (Sadamoto).

125 FIG.10. Competitie van I-EGF-binding aan gefixeerde A431-cel-len of A431-plasmamembranen door muize-EGF en AR. Bindingsproeven werden uitgevoerd zoals nader te beschrijven in paragraaf 6.1.5. Per put werden 35 monsters van 100 yl of 50 yl gebruikt voor proeven met resp. gefixeerde 89 00 178 /* \ * - 5 - cellen of membranen.

Symbool Receptorbron Competitor

gefixeerde cellen EGF

gefixeerde cellen AR

5 membranen EGF

membranen AR

FIG.11. Hydropathie-analyse van AR en menselijk EGF (Kyte en Doolittle). (A) AR (residuen 1 - 84)? (B) AR (residuen 44 - 84); (C) EGF (residuen 1 - 53); (D) AR-precursor (residuen 1 - 252) ; (E) vergelijking 10 van menselijk AR (residuen 1 - 84) en EGF (residuen 1 - 53) (de aansluiting is volgens FIG.13 zodanig, dat cysteine, residu 46 van rijp AR overeenkomt met cysteine, residu 6 van rijp EGF).

FIG.12. Aminozuursequentie van rijp AR en afgeknot AR. De standaard enkele lettercode voor aminozuren wordt toegepast: alanine (A); 15 arginine (R)? asparagine (N); aspartinezuur (D); cysteine (C); glutamine (Q); glutaminezuur (E); glycine (G); histidine (H)? isoleucine (I); leucine (L); lysine (K); methionine (M); fenylalanine (F); proline (P); serine (S); threonine (T); tryptofaan (W) ; tyrosine (Y); en valine (V). FIG.13, Vergelijking van aminozuursequenties van Amphireguline 20 (AR) en leden van de EGF-superfamilie.

125 FIG.14. (A) I-AR-binding aan cellulose (o—o), gedenatureerde 125 DNA-cellulose (O - D) , en natieve DNA-cellulose (Δ-Λ.). (B) I-AR- binding aan cellulose (o-o) en aan DNA-cellulose (EI-O) wordt vergele-125 ken met I-EGF-binding aan cellulose (Δ-A) en aan DNA-cellulose 25 (V-S?).

FIG.15. Synthetische Amphiregulinepeptiden, gegenereerd door vaste fase-techniek. Vijf peptiden, overeenkomend met residu's 166 - 184 (No. 259), 108 - 130 (No.264), 31 - 50 (No.279), 71 - 90 (No.280) en 221 - 240 (No.281) werden geproduceerd door vaste fase-synthese en ver-30 volgens gezuiverd door omgekeerde-fase HPLC

FIG.16. Nucleotide en gededuceerde aminozuursequentie van cDNA-cloon pARl, dat menselijk Amphireguline codeert.

FIG.17. Genomische sequentie van menselijk Amphireguline.

FIG.18. Schematisch diagram van de exon-structuur en proteine-35 domeinen van het AR-molecuul, met betrekking tot de genomische sequentie.

89 00 t 78 .

- 6 - ί" - > FIG.19. Nucleotidesequentie van pDCHBARl Expressie Vector.

FIG.20. Nucleotidesequentie van pTacAPARl.

FIG.21. Nycleotidesequentie van pTacAPHILE.

5. Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding: 5 De uitvinding heeft betrekking op Amphireguline (AR), op de AR en de AR-precursor coderende nucleotidesequenties en op de produktie van AR door conventionele of recombinant DNA-methoden.

AR, een nieuwe celgroei regulerende factor, wordt tot expressie gebracht en afgescheiden door met TPA behandelde MCF-7-cellen als twee 10 onderscheiden, maar functioneel equivalente vormen. De twee vormen zijn structureel identiek afgezien van een additionele 6-amino-eindstandige resten in de grotere vorm. AR vertoont krachtige inhibiterende activiteit op DNA-synthese in neoplastische cellen en heeft daardoor mogelijkheden als krachtige anti-tumorverbinding. Van bijzonder belang is het .

15 vermogen van AR om groei in fibroblasten en andere normale cellen te bevorderen, hetgeen kan betekenen dat AR nuttig kan zijn voor de behandeling van toestanden, die versnelling van de celgroei vereisen, met name verbrandingen en wonden.

AR of fragmenten en derivaten daarvan, hebben een brede potenti-20 ele therapeutische bruikbaarheid bij de behandeling en controle van neoplasia, alsook bij de behandeling van wonden. AR kan toepassing vinden in de modulering van beenresorptie en de immuun-respons, en de stimulering van de arachidonzuurcascade. Amphireguline-gen en gen-produkten, werkwijzen voor hun bereiding en toepassingen daarvan, worden in de vol-25 gende sub-paragrafen en voorbeelden nader beschreven.

5.1. Produktie en zuivering van Amphireguline.

Amphireguline wordt afgescheiden door de menselijke borstcarci-noomcellijn MCF-7 indien behandeld met het tumor bevorderende middel 12-O-tetradecanoyl-forbol-13-acetaat (TPA). Amphireguline kan uit de gecon-30 ditioneerde media van dergelijke gekweekte, met TPA behandelde MCF-7- cellen worden geïsoleerd en vervolgens tot een hoge specifieke activiteit worden gezuiverd. Amphireguline kan ook worden geïsoleerd uit andere cellijnen met of zonder inductie door behandeling met TPA of andere tumor bevorderende middelen. Verder kan Amphireguline worden geproduceerd door 35 recombinant DNA-technieken of door vaste fase-peptidesynthese.

89 00 178 .' - 7 - 4 *

Amphireguline kan worden gezuiverd door diverse bekende procedures en technieken, onder meer chromatografie (b.v. omgekeerde-fase vloeistof-chromatografie, gelpermeatiechromatografie, vloeistofuitwisselingschroma-tografie, ionenuitwisselingschromatografie, grootte-exclusiechromatogra-5 fie en affiniteitschromatografie), centrifugeren, elektroforetische procedures, differentiële oplosbaarheid of door andere standaardtechnieken voor de zuivering van proteïnen.

In een specifieke uitvoeringsvorm van de uitvinding worden MCF-7-cellen gedurende 48 uren behandeld met TPA en gedurende 4 dagen in een 10 vers serumvrij medium gekweekt. Het resulterende geconditioneerde medium wordt verzameld en gebruikt voor de bereiding van ruw AR, zoals zal worden beschreven in paragraaf 6.2. Een combinatie van omgekeerde-fase chromatografie en gelpermeatiechromatografie kan worden gebruikt voor de zuivering van AR tot homogeniteit, zoals nader te beschrijven in paragraaf 15 6.3, en resulteert in AR, gezuiverd tussen 1842-voudig en 2270-voudig ten opzichte van het ruwe uitgangsmateriaal. De methode is reproduceerbaar en levert gezuiverde AR-preparaten met specifieke activiteiten tus- g sen 2,7 en 3,4 x 10 eenheden/mg proteïne.

5.2. Het Amphireguline-gen: 20 5.2.1. Isolering en clonen van het Amphireguline-gen;

In de praktijk van de werkwijze volgens de uitvinding kan de nu-cleotide-coderingssequentie voor menselijk Amphireguline of het functionele equivalent daarvan, worden gebruikt voor het genereren van recombi-nant-moleculen, die de expressie van het menselijke Amphiregulineprodukt 25 zullen leiden. De nucleotide-coderingssequentie voor AR kan worden verkregen uit celbronnen, die AR-achtige activiteit produceren. Zo wordt b.v. in een specifieke belichaming de menselijke borstcarcinoomcellijn MCF-7 gebruikt als de bron van de AR-nucleotide-coderingssequentie. De coderingssequentie kan worden verkregen door cDNA-clonen van RNA, dat 30 uit dergelijke celbronnen is geïsoleerd en gezuiverd, of door genomisch clonen. Hetzij cDNA of genomische reeksen'van clonen kunnen worden bereid uit de DNA-fragmenten, die volgens bekende technieken zijn gegenereerd, onder meer door het gebruik van restrictie-enzymen.

De fragmenten, die het gen voor AR bevatten, kunnen op een aantal 35 bekende manieren worden geïdentificeerd. Zo kan b.v. een gedeelte van de 89 00 178.' * > - δ - AR-aminozuursequentie worden gebruikt voor het deduceren van de DNA-sequentie , welke DNA-sequentie dan chemisch gesynthetiseerd, radioactief gemerkt en als hybridiseringssonde gebruikt kan worden.

Andere methoden, die voor het isoleren van het AR-gen kunnen wor-5 den gebruikt, zijn onder meer het chemisch synthetiseren van de’ gen-se-quentie zelf uit een bekende sequentie, die b.v. kan worden afgeleid uit de aminozuursequentie van AR. Ook kunnen in vitro translatie van gekozen mRNA, gevolgd door functionele of immunologische beproevingen van de translatieprodukten worden toegepast. Het geïdentificeerde en geïsoleer-10 de gen kan dan in een geschikte cloningsvector worden ingevoegd. Daarvoor kan een groot aantal bekende vector-gastheersystemen worden gebruikt. Mogelijke vectoren zijn onder meer plasmiden of gemodificeerde virussen waar het vectorsysteem verenigbaar is met de gastheercel. Zulke vectoren zijn onder meer bacteriofagen, zoals lambda-derivaten of plas-15 miden, zoals PBR322 of pUC-plasmidederivaten. Recombinantmoleculen kunnen in gastheercellen worden geïntroduceerd via transformatie, transfec-tie, infectie, elektroporatie en dergelijke.

In een bijzondere belichaming wordt het door MCF-7-cellen tot expressie gebrachte AR-gen gedoneerd door selectie van mRNA, dat in reac-20 tie op behandeling van MCF-7-cellen met TPA is geproduceerd, en constructie van een cDNA-reeks in bacteriofaag A<?tlO. Daar onbehandelde MCF-7-cellen kennelijk geen AR-proteïne synthetiseren en afscheiden, werd aangenomen dat de inductie van AR door TPA ook zou worden waargenomen op . het niveau van transcriptie en dat een dergelijke cDNA-reeks aanmerke-25 lijk zou worden verrijkt voor AR bevattende sequenties. Sondering van de cDNA-reeks met gedegenereerde en naar beste weten gekozen oligonucleoti-den op basis van menselijk codon-gebruik (Lathe, 1985, J. Mol. Biol.

183: 1 - 12 en zoals beschreven in paragraaf 8.1) resulteerde in isolering van AR cDNA-clonen, Deze cDNA-clonen werden vervolgens gebruikt 30 voor karakterisering van het AR mRNA en het AR-gen. Verder kan de nucleo-tide-sequentie van het AR cDNA (paragraaf 8.2 en FIG.16) worden gebruikt voor het deduceren van de AR primaire aminozuursequentie.

In verband met de inherente degeneratie van nucleotide-coderings-sequenties kunnen andere DNA-sequenties, die nagenoeg dezelfde of een 35 functioneel equivalente aminozuursequentie coderen, in de praktijk van 89 00 178 : - 9 - t i * de werkwijzen volgens de uitvinding worden gebruikt. Zulke veranderingen van de AR nucleotidensequentie omvatten weglatingen, toevoegingen of substituties van verschillende nucleotiden, resulterende in een sequentie, die hetzelfde of een functioneel equivalent gen-produkt coderen. Het gen-5 produkt kan weglatingen, toevoegingen of substituties van aminozuurres-ten binnen de sequentie bevatten, die resulteren in zwijgende veranderingen en aldus een bioactief produkt produceren. Dergelijke aminozuursub-stituties kunnen geschieden op basis van gelijksoortigheid in polariteit, lading, oplosbaarheid, hydrofobiciteit, hydrofiliteit en/of de amfipati-10 sche aard van de betrokken resten. Voorbeelden van negatief geladen aminozuren zijn aspartinezuur en glutaminezuur; voorbeelden van positief geladen aminozuren zijn lysine en arginine; voorbeelden van aminozuren met ongeladen polaire kopgroepen of niet-polaire kopgroepen met analoge hy-drofiliteitswaarden zijn leucine, isoleucine, valine; glycine, alanine; 15 asparagine, glutamine; serine , threonine; fenylalanine, tyrosine.

Bet AR cDNA kan als sonde worden gebruikt voor het detecteren van het AR mRNA in TPA-geïnduceerde MCF-7-cellen. Het AR mRNA heeft een lengte van ongeveer 1400 bp.

Zoals hieronder beschreven in paragraaf 9 kan het AR cDNA worden 20 gebruikt voor karakterisering van het AR-gen. De chromosoom-toekenning van het menselijke AR-gen werd bepaald door in situ hybridisering van ^H-gemerkt AR CDNA tot normale metafasechromosomen, waarbij bleek dat het menselijke AR-gen zich bevindt op chromosoom 4 regio 4ql3-21, een regio die geacht werd betrokken te zijn bij lymfocytdifferentiatie (zie 25 hieronder paragraaf 9.2). Het cDNA werd eveneens gebruikt voor het isoleren van genomisch DNA, dat het gehele AR-gen omvatte, inclusief de 5'-regulerende regio. Het AR-gen bleek een lengte te hebben van ongeveer 10 kb en is verdeeld in zes exons. De 5'' regulerende regio werd opgenomen in een expressievector, die een promotorloos chloramfenicolacetyl-30 transferase-(CAT)-gen bevatte. Dit concept was in staat transcriptie van het CAT-gen te stimuleren bij tijdelijke opname in MCF-7-eellen en de activiteit werd 6- tot 7-voudig gestimuleerd door de toevoeging van TPA (zie paragraaf 9.4). In specifieke belichamingen van de uitvinding kan deze 5' regulerende regio worden toegepast in expressievectoren ter con-35 trole van transcriptie van het AR-gen of andere structurele genen. Het 8900178: ï .> - 10 - chimerieke AR-CAT-concept kan ook worden gebruikt voor het zoeken naar factoren, die de expressie van AR reguleren, zoals beschreven in paragraaf 9A.

5,2.2. Constructie van expressievectoren, die de Amphireguline-co-5 deringssequentie bevatten._

Voor expressie van een biologisch actieve rijpe vorm van AR dient een expressievector/gastheersysteem te worden gekozen, dat niet alleen hoge niveaus van transcriptie en translatie, maar ook een correcte verwerking van het gen-produkt verschaft. Dit is in het bijzonder van be-10 lang wanneer de gehele coderingssequentie van de Amphireguline-precursor in de expressieconcepten wordt toegepast, daar de rijpe vorm van Amphi-reguline via cellulaire verwerkingsgebeurtenissen blijkt te zijn afgeleid van het precursorprodukt. Men kan b.v. een zoogdiergastheercelsy-steem kiezen om het vermogen daarvan om Amphireguline op correcte wijze 15 te verwerken en in de extra-cellulaire omgeving af te scheiden.

Met name blijkt dat twee vormen van rijp Amphireguline worden gesynthetiseerd als het middelste gedeelte van een gebruikelijke 252-amino-zuur-precursor, waaruit de twee rijpe vormen via alternatieve protolyti-sche verwerkingsgebeurtenissen vrijkomen. Amphireguline wordt additioneel 20 geglycosyleerd en kan tyrosine-sulfatering ondergaan, hetgeen verder het belang onderstreept van selectie van een expressiesysteem, dat in staat is deze post-translationele modificaties uit te voeren, desgewenst in het eindprodukt.

De vakman kan met gelijkelijk succes een variëteit van dier/gast-25 heer-expressievectorsystemen (d.w.z. vectoren die de noodzakelijke elementen bevatten voor het dirigeren van de replicatie, transcriptie en translatie van de AR-coderingssequentie in een geschikte gastheercel) gebruiken. Voorbeelden daarvan zijn onder meer virusexpressievector/zoog-diergastheercelsystemen (zoals cytomegalovirus, vacciniavirus, adenovirus 30 en dergelijke); insectvirus-expressievector/insect-celsystemen (zoals baculovirus); of niet-virale promotor-expressiesystemen, afgeleid van de genomen van zoogdiercellen (zoals de muis-metallothioninepromotor).

De expressie-elementen van deze vectoren variëren in sterkte en specificiteiten. Afhankelijk van het gebruikte gastheer/vectorsysteem 35 kan elk van een aantal geschikte transcriptie- en translatie-elementen 89 00 178 Γ ï t - 11 - worden gebruikt. Voor clonen in zoogdiercelsystemen kunnen b.v. promotors worden gebruikt, geïsoleerd uit het genome van zoogdiercellen (b.v. muis-metallothionine-promotor) of uit virussen die in deze cellen groeien (b.v, vacciniavirus 7,5K-promotor of Moloney-muizesarcoomvirus "long 5 terminal repeat"). Ook kunnen promotors, geproduceerd door recombinant DNA of synthetische technieken worden gebruikt voor transcriptie van de ingepaste sequenties.

Voor voldoende translatie van ingepaste proteïnecoderingssequenties zijn ook specifieke initiatiesignalen vereist. Deze signalen bevat-10 ten het ATG-initiatie-codon en aangrenzende sequenties. In gevallen waarin het gehele AR-gen inclusief zijn eigen initiatie-codon en aangrenzende sequenties wordt ingepast in de geschikte expressievectoren, zijn geen verdere translationele controlesignalen nodig. In gevallen waarin slechts een gedeelte van de coderingssequentie wordt ingepast, moeten 15 echter exogene translationele controlesignalen, inclusief het ATG-initiatie-codon worden verschaft. Bovendien moet het initiatie-codon in fase zijn met het leesframe van de AR-coderingssequenties om translatie van de gehele inlas te verzekeren. Deze exogene translationele controlesignalen en initiatie-codons kunnen van diverse oorsprong zijn, Zowel natuur-20 lijk als synthetisch. De doelmatigheid van expressie kan worden verhoogd door opname van transcriptie-verzwakkingssequenties, versterkerelemen-ten, en dergelijke.

Elk van de eerder beschreven methoden voor het inpassen van DNA-fragmenten in een vector kan worden toegepast voor de constructie van 25 expressievectoren, die het AR-gen en geschikte transcriptionele/transla-tionele controlesignalen bevatten. Deze methoden kunnen in vitro recombinant DNA-technieken, synthetische technieken en in vivo recombinaties (genetische recombinatie) omvatten.

Zo kan b.v. in gevallen, waarin een adenovirus als expressievec-30 tor wordt gebruikt, de AR-coderingssequentie worden geligeerd aan een adenovirus-transcriptie/translatiecontrolecomplex, b.v. de nieuwe promotor en drieledige leidersequentie. Dit chimerische gen kan dan door in vitro of in vivo recombinatie in het adenovirus-genoom worden ingepast. Inpassing in een niet-essentiële regio van het virale genoom (b.v. regio 35 El of E3) resulteert dan in een recombinantvirus, dat levenskrachtig en 89 00 178.’ - 12 - 4' ,* in staat is tot expressie van AR in geïnfecteerde gastheren. Evenzo kan vaccinia 7,5K-proraotor worden gebruikt.

Een alternatief expressiesysteem, dat voor expressie van AR kan worden gebruikt, is een insectensysteem. In een van zulke systemen wordt 5 Autographa californica nucleair polyhedrosisvirus (AcNPV) gebruikt als vector voor expressie van vreemde genen. Het virus groeit in Spodoptera frugiperda-cellen. De AR-coderingssequentie kan worden gecloond in niet-essentiële regio's (b.v. het polyhedrin-gen) van het virus en onder controle worden geplaatst van een AcNPV-promotor (b.v. de polyhedrin-promo-10 tor). Succesvolle inpassing van de AR-coderingssequentie zal resulteren in inactivering van het polyhedrin-gen en produktie van niet-geocclu-deerd recombinantvirus (d.w.z. virus dat de eiwitachtige bekleding mist, waarvoor door het polyhedrin-gen wordt gecodeerd). Deze recombinantvirus-sen worden dan gebruikt voor infectie van Spodoptera frugiperda-cellen, 15 waarin het ingepaste gen tot expressie wordt gebracht.

Retrovirale vectoren, bereid in amfotrope verpakkingscellijnen maken expressie in hoge doelmatigheid in talrijke celtypen mogelijk. Met deze methode kan men cel-type specifieke verwerking, regulering of functioneren van de ingepaste proteïne-coderingssequentie beoordelen.

20 Verder kan een gastheercelstam worden gekozen, die de expressie van de ingepaste sequenties moduleert of het gen-produkt op de gewenste specifieke wijze modificeert en verwerkt. Expressie vanuit bepaalde promotors kan worden verhoogd in tegenwoordigheid van bepaalde inducers (b.v. zink- en cadmiumionen voor metallothioneïnepromotors). Daardoor 25 kan expressie van het genetisch gemanipuleerde AR worden beheerst. Dit is van belang indien het proteïneprodukt van het gecloonde vreemde gen dodelijk is voor gastheercellen. Verder zijn modificaties (b.v. glycosy-lering) en behandeling (b.v. splitsing) van proteïneprodukten van belang voor de functie van het proteïne. Verschillende gastheercellen hebben 30 karakteristieke en specifieke mechanismen voor de post-translationele behandeling en modificatie van proteïnen.-Geschikte cellijnen of gast-heersystemen kunnen worden gekozen ter verzekering van de correcte modificatie en behandeling van het tot expressie gebrachte vreemde proteïne.

Expressievectoren, die volgens de uitvinding kunnen worden ge-35 bruikt, zijn onder meer: 83 00 178 / x i - 13 -

Plasmide pSV2Neo. Plasmide pSV2Neo wordt beschreven in Southern e.a., (1982) J. Mol. Applied Genetics 1, 327 -341.

Plasmide pSV2dhfr. Plasmide pSV2dhfr (Subramani e.a., 1981, Mol. Cell Biol. 1, 854 - 864) bevat het rauize-dihydrofolaatreductase-(dhfr)-gen 5 onder de controle van de SV40-promotor.

Plasmide pH3M. Plasmide pH3M (Aruffo e.a., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 3365 - 3369) bevat een chimerische promotor, samengesteld uit het menselijke cytomegalovirus (CMVj AD169 onmiddellijke vroege versterker gebonden aan de LIV LTR-posities -67 tot +80. De LTR wordt ge-10 volgd door een polylinker met 5'- tot 3’-plaatsen: HindlII, Sbal, Xhol,

BstXI, Xhol, PstI, en Xbal. De kleine t antigen splits/polyadenylerings-signalen van pSV2 en een SV40 oorsprong van replicatie bevinden zich benedenstrooms van de polylinker. De laatstgenoemde maakt versterking mogelijk in cellen, die het SV40 grote T antigen bevatten, zoals COS- en 15 WOP-cellen. Een suppressor tRNA-gen ondersteunt de groei in op pVX gebaseerde vectoren en bacteriën, die het P3-plasmide dragen, zoals MC1061/P3. Plasmide pH3M/bOncM. Plasmide pH3M/b0ncM werd verkregen van Najma Malik, Oncogen. Het bevat het ape-TGF-/^ 5' ongetranslateerd en leidersequentie gebonden aan de Oncostatin M-coderingssequentie, ingepast in pH3M op de 20 HindiII/XhoI (gevulde) plaatsen. De TGF-/3-sequentie bestaat uit 85. bp 5* ongetranslateerde regio, beginnend bij HindlII (afkomstig van pSP65 polylinker) en een naastgelegen Pstl-plaats van het TGF-/3 -cDNA, gevolgd door 87 bp coderende de 29 aminozuursignaalsequentie, die normaliter wordt gesplitst tussen een glycine-leucine-dipeptidesequentie.

25 Plasmide pH3ARP. Plasmide pH3ARP is een vector op basis van pH3M, bedoeld voor tijdelijke expressie van de AR-precursor in COS-cellen. Het bevat 13 bp van de AR 5' ongetranslateerde regio en de gehele coderings-regio en 3' ongetranslateerde sequenties. Dit plasmide werd gegenereerd door ligering van het 4 kb-fragment van de pH3M-vector, gedigereerd met 30 HindlII en Xbal, oligonucleotiden EVSAL3 en EVSAL4, en het gel-gezuiver-de 1,1 kb Hgal/Xbal cDNA-fragment van pARl. EVSAL3 en EVSAL4 zijn complementair met 5' HindlII, EcoRV, Sail, en Hgal-plaatsen. Het concept behoudt ook de EcoRl tot Xbal polylinkerplaatsen vanaf pEMBLl8 direct na de 3' ongetranslateerde regio.

8900178/ X a, - 14 -

EcoRV Hgal

HindiII Sail

EVSAL3 5' AGCTTGATATCGTCGA

EVSAL4 31 ACTATAGCAGCTGACGC

5 Plasmide pSVDR/bOM. Plasmide pSVDR/bOM werd verkregen van Jeff Kallestad, Oncogen. Het is een fusie tussen pSV2dhfr en pH3M/bOM en verschaft een vector met een cDNA gedreven door de CMV/HIV-promotor van pH3M, geflankeerd door TGF-/3-signaalsequentie en SV40-polyadenyleringssignalen, naast het muize-dhfr-gen gedreven door SV40 vroege promotor. Het werd ge-10 genereerd door ligering van BamHl/NruI (gevuld) gedigereerd pH3M/bOM met BamHI gedigereerd pSV2dhfr.

Plasmide pHras. Plasmide pHras is een zoogdierexpressievector, ontwikkeld door Stan McKnight, üniversiteit van Washington, Dept. of Pharmacology. Het is een vector op pML-basis, die een 754 bp EcoRI tot Tthllll-fragment 15 bevat van Harvey Ras LTR, een polylinker met Smal, BamHI, Sail, PstI, HindlII en Clal, gevolgd door het muize-DHFR cDNA en Hepatitis B-virus 3' ongetranslateerd/polyadenyleringssignaal. De afstand van het BamHI in de polylinker tot het ATG van DHFR is 54 bp.

Plasmide pHLARGE. Plasmide pHLARGE is een zoogdierexpressieconcept, dat 20 de 10 kb AR-genomische sequenties (Smal tot HindlII) bevat, gedreven door de Harvey ras LTR en gevolgd door een niet-functioneel promotorloos DHFR-gen. Het werd gevormd door drieweg-ligering van de volgende fragmenten: 4,6 kb pHras Smal/HindlII-fragment; 6,0 kb Smal/HindlII AR genomisch fragment uit pARHl2; en 6,4 kb HindlII AR genomisch fragment uit pARH6.

25 Plasmide pHLARGlpcD. Plasmide pHLARGlpcD is een polycistronisch zoogdierexpressieconcept. Het bevat de AR-precursor cDNA-sequentie, gevolgd door het muize-dhfr-gen, gedreven door een enkel Harvey ras LTR. Het primaire transcript is een polycistronische boodschap met 74 bp tussen het stop-codon van AR en het ATG start-codon van dhfr, waardoor het ribosoom kan 30 reinitiëren en translatie kan voortgaan. pH3ARP werd gedigereerd met

EcoRV en het 700 bp-fragment werd geïsoleerd. Dit fragment bevatte 13 bp AR 5' ongetranslateerde regio, de gehele AR-precursor coderende regio en 21 bp van 5' ongetranslateerde sequentie. Dit fragment werd geligeerd met de BamHI-fractie, gevuld, en gefosfataseerde vector pHras.

35 Plasmide pLOSNL. Plasmide pLOSNL werd verkregen van Dusty Miller, Fred 89 00 1787 β - 15 -

Hutchison Cancer Research Center, Seattle, WA. Deze retrovirale expres-sievector was bedoeld voor het genereren van amfotrope helpervrije virale stocks van hoge titer, in staat tot infectie van een breed gastheer-traject, maar niet tot replicatie daarin. De vector bevat: een gemuteerd 5 Moloney muize-leukemievirus LTR met verpakkingssignalen weggelaten; psi+ sequenties; het ornithinetranscarbamylase-(OTC)-gen, dat twee Xhol-plaat-sen voor inpassing van een cDNA bevat en daaropvolgende inactivering van het OTC-gen; SV2Neo, een selecteerbare marker; de 3' LTR; en een pBR322 Amp resistente ruggegraat.

10 Plasmide pLARSNL. Plasmide pLARSNL is een amfotroop retroviraal expres-sieconcept, dat de AR-precursor cDNA coderende regio bevat, een poly(A)-staart mist, gedreven door het virale LTR. SV2Neo laat selectie toe voor expressie van transfectants. pLARSNL werd gegenereerd door ligering van het 800 bp Sail-fragment van pHLARGlpcD met het 7,7 kb Xhol, gedigereerd 15 en gefosfataseerde pLOSNL-vectorfragment.

5.2.3. Identificatie van transfectanten of transformanten, in staat tot expressie van het Amphireguline gen-produkt.__

De gastheercellen, die de recombinant AR coderende sequentie bevatten en die in staat zijn tot expressie van het biologisch actieve rij-20 pe produkt, kunnen volgens tenminste vier algemene benaderingen worden geïdentificeerd: (a) DNA-DNA, DNA-RNA of RNA-antisense- RNA-hybridise-ring; (b) de aanwezigheid of afwezigheid van "marker"-gen-functies; (c) beoordeling van het niveau van transcriptie zoals gemeten door de expressie van AR mRNA-transcripten in de gastheercel; en (d) detectie 25 van het rijpe gen-produkt zoals gemeten door immunoassay en uiteindelijk door zijn biologische activiteit.

In de eerste benadering kan de aanwezigheid van de in de expressie-vector ingepaste menselijke AR coderende sequentie worden gedetecteerd door DNA-DNA-hybridisering met behulp van sondes, die nucleotide sequen-30 ties bevatten, die homoloog zijn met de menselijke AR-coderingssequen-tie.

In de tweede benadering kan het recombinant-expressievector/gast-heersysteem worden geïdentificeerd en geselecteerd op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde "marker"-gen-functies (b.v. thymi-35 dinekinase-activiteit, resistentie tegen antibiotica, resistentie tegen 89 00 178 .1 * .« - 16 - methotrexaat, transformatiefenotype, occlusielichaamvorming in baculo-virus enz.)· Indien b.v. de AR coderende sequentie wordt ingepast binnen een marker-gen-sequentie van de vector, kunnen recombinanten, die de AR coderende sequentie bevatten, worden geïdentificeerd door de aanwezigheid 5 van de marker-gen-functie. Ook kan een marker-gen in tandem worden geplaatst met de AR-sequentie onder controle van dezelfde of een andere promotor als gebruikt voor controle van de expressie van de AR-coderings-sequentie. Expressie van de marker in respons op inductie of selectie, wijst op expressie van de AR coderende sequentie.

10 In de derde benadering kan transcriptionele activiteit voor de AR coderende regio worden beoordeeld door hybridiseringsproeven. Zo kan b.v. gepolyadenyleerd RNA worden geïsoleerd en geanalyseerd door "Northern blot" met behulp van een sonde, die homoloog is met de AR coderende sequentie, of bepaalde gedeelten daarvan. Ook kan het totaal aan 15 nucleïnezuren van de gastheercel worden geëxtraheerd en beproefd voor hybridisering met zulke sondes.

In de vierde benadering kan de expressie van het rijpe proteïne-produkt immunologisch worden beoordeeld, b.v. door "Western blots", im-munoproeven zoals radio-immunoprecipitatie, enzyme-gebonden immunoproe-20 ven en dergelijke. De uiteindelijke test van het succes van het expres-siesysteem omvat echter de detectie van het biologisch actieve AR-gen-produkt. Wanneer de gastheercel het gen-produkt afscheidt kan het cel-vrije medium, dat uit de gekweekte transfecterende gastheercel is verkregen, worden beproefd op AR-activiteit. Wanneer het gen-produkt niet 25 wordt afgescheiden kunnen cellysaten op dergelijke activiteiten worden beproefd. In beide gevallen kunnen biologische proeven, zoals de hier beschreven groei-inhibiterings- en -stimuleringsproeven of dergelijke, worden toegepast.

5.3. Structuur van Amphireguline.

30 De aminozuursequentie van gezuiverd AR toonde dat het preparaat is samengesteld uit een ongelijk mengsel van twee bijna identieke vormen van AR (zie FIG.12). Eén vorm, de grootste van de twee, omvat ongeveer 16% van het preparaat. De andere vorm, een afgeknot AR, omvat de rest en het grootste gedeelte van het preparaat en verschilt van zijn langere 35 tegenhanger slechts in het ontbreken van het amino-eindstandige hexapep- 89 00 178 i. Λ - 17 - tide, SVRVEQ. De twee vormen zijn overigens op het aminozuurniveau volkomen homoloog.

AR is een uitermate hydrofiel glycoproteïne met een mediaan relatief molecuulgewicht van 22.500 dalton. Behandeling met N-glycanase, dat 5 N-gebonden koolhydraat verwijdert, doet het AR als een enkelvoudige band met een molecuulgewicht van 14.000 migreren, in goede overeenstemming met molecuulgewichtsberekeningen uit AR-gelpermeatiechromatografiegege-vens. Onder niet-reducerende omstandigheden migreerde AR op soortgelijke wijze. AR is daarom een glycoproteïne met een enkelvoudige keten.

10 De primaire structuur van AR werd vergeleken met vele protefne- sequenties. Deze vergelijkingen tonen dat AR een uniek proteïne is, dat geen significante structurele homologie heeft met een van de vergelij-kingsproteinen. De primaire structuur van AR is echter verwant met verscheidene andere groeifactoren, waarvan de meeste behoren tot de EGF-15 superfamilie. Het is redelijk AR te klassificeren als lid van deze groep van proteïnen, daar verscheidene van zijn structurele aspecten sterk overeenkomen met de goed behouden structurele aspecten, die onder de proteïnen van de EGF-familie worden gevonden. Zo gelijkt b.v. de N-eindstan-dige AR-sequentie op de N-eindstandige sequenties van de TGF-df, VGF en 20 MGF voorzover deze regio rijk is aan proline-, serine- en threonineres-ten. AR heeft ook plaatsen voor N-gebonden glycosylering zoals ook het geval is met de N-eindstandige precursorregio's van de TGFs en VGF. AR toont verder sequentiehomologie met andere EGF-achtige proteïnen, met het behoud van 6 cysteïneresten, betrokken bij 3 disulfidebindingen, die 25 de secundaire structuur van de rijpe vormen van deze groeifactoren definiëren. Hydropathie-analyse toont echter significante verschillen tussen homologe AR- en EGF-sequenties. Voor verdere vergelijkingen tussen AR en andere leden van de EGF-superfamilie wordt verwezen naar tabel I, FIG.13 en de paragrafen 9.7 en 9.8.

30 TABEL I

Proteïne Species Regio 1_ Regio 2_

EGF menselijk CLHDGVCMYIE CNCWGYIGERC

TGF-OC menselijk CFH-GTCRFLV CVCHSGYVGARC

VGF vaccinia CLH-GDCIHAR CRCSHGYTGIRC

35 SGF "shope" CLNNGTCFTIA CVCRINYEGSRC

89 00 178 1 J.

- 18 - TABEL I (vervolg)

Proteïne Species _Regio 1 _Regio 2_

Factor IX menselijk CLNXGSCKDDI CWCPFGFEGKNC

Factor X menselijk CQNXGKCKDGL CTCLEGFEGKNC

5 Factor XII menselijk CLHXGRCLEVE CHCPVGYTGPFC

Proteïne C menselijk CCGXGTCIDGI CDCRSGWEGRFC

AR menselijk CIH-GECKYIE CKCQQEYFGERC

10 Gecombineerde homologie-scores voor regio 1 en regio 2 EGF-score Coag. score AR-score

Groeifactor-familie >20 <20 < 40

Coagulerings factor <25 >25 <40

Amphireguline-subfamilie <20 <20 >40 15 De in FIG.12 getoonde aminozuursequenties van Amphireguline, als mede hun functionele equivalenten, worden door de uitvinding omvat. Zo kan b.v. het Amphireguline-produkt weglatingen, toevoegingen of substituties van aminozuurresten binnen de sequentie bevatten, die resulteren in stille veranderingen onder vorming van een bioactief produkt. Dergelijke 20 aminozuursubstituties kunnen worden gemaakt op basis van overeenkomst in polariteit, lading, oplosbaarheid, hydrofobiciteit, hydrofiliciteit en/of de amfipatische aard van de betrokken resten. Voorbeelden van negatief geladen aminozuren zijn aspartinezuur en glutaminezuur; voorbeelden van. positief geladen aminozuren zijn lysine en arginine; voorbeelden van 25 aminozuren met ongeladen polaire kopgroepen met analoge hydrofiliciteits-waarden zijn leucine, isoleucine, valine; glycine, alanine; asparagine, glutamine; serine, threonine; fenylalanine en thyrosine.

5.4. Eigenschappen van Amphireguline.

AR is een glycoprotei’ne met een enkelvoudige keten met een medi-30 aan molecuulgewicht van ongeveer 22.500 dalton, dat bifunctionele groei modulerende activiteiten op een variëteit van cellen in cultuur vertoont. Structureel is AR verwant met de EGF-familie van groeifactoren en kan verder functionele overeenkomsten delen met andere leden van deze familie* zoals blijkt uit het vermogen van AR om effectief te concurreren met EGF 35 voor receptorbinding.

8900 178.1 - 19 - AR is een monomeer proteïne, dat binnen de keten disulfidebindin-gen vereist voor activiteit, geen glycosylering vereist voor zijn biologische activiteiten, stabiel is onder matige zure en basische behandelingen en stabiel is bij verwarming gedurende 30 minuten op 56°C. AR ver-5 liest alle biologische activiteit bij reductie, bij verhitting gedurende 5 minuten op 100°C, bij digerering met trypsine, endopeptidase Lys-C, endopeptidase Arg en endopeptidase Glu.

Proteolytische splitsing door fosfolipase D blijkt AR om te zetten in een of meer actieve fragmenten met een relatief molecuulgewicht 10 van ongeveer 5600, zoals gededuceerd uit SDS-PAGE-analyse. Actieve fragmenten van AR worden door de onderhavige octrooiaanvrage omvat en worden verder besproken in paragraaf 5.5.

AR heeft krachtige anti-proliferatieve effecten in vitro op verscheidene menselijke kankercellijnen van epithelische oorsprong. Zo inhi-15 biteert AR effectief DNA-synthese van epidermaal carcinoom van de vulva A431, borstadenocarcinoom ATB 132, cervicaal epidermoïde carcinoom CRL 1550, eierstok-papillairadenoom HTB 75, eierstok-teratocarcinoom HTB 1572 en borstadenocarcinoom HTB 26 cellen. Een 50%'s inhibitering van DNA-synthese wordt waargenomen in A431-cellen, behandeld met 0,13 nM AR. 20 Normale rattenier NRK-SA6-cellen vormen gewoonlijk geen kolonies in zachte agar. De combinatie van exogeen EGF en TGF-/3, toegevoegd aan het cultuurmedium van deze cellen, induceert echter van verankering onafhankelijke groei, hetgeen wijst op een getransformeerd fenotype. Een combinatie van exogeen AR en TGF-/3 induceert eveneens de van verankering 25 onafhankelijke groei van NRK-SA6-cellen, hoewel op een lager niveau (zie tabel V), hetgeen toont dat AR en EGF functioneel verwant zijn.

De synergistische werking van AR met TGF-/S impliceert AR in sterke mate als een belangrijke factor bij de regulering van celgroei. Aldus verschaft de uitvinding researchmogelijkheden, die tevoren niet beschik-30 baar waren, voor onderzoek van het complexe en tevoorschijn komende verhaal van normale celgroeicontrole en het karakteristieke verlies van groeicontrole in neoplastische cellen.

AR induceert eveneens de proliferatie van menselijke voorhuidfi-broblasten (tabel IV). Een tweevoudige toename in DNA-synthese in deze 35 cellen werd waargenomen bij een AR-concentratie van ongeveer 50 pM. Een 89 00 178c’ <* > - 20 - maximum stimulering van ongeveer het zes-voudige trad op bij ongeveer 5 nM.

Het mechanisme, waardoor AR-celproliferatie of groei-inhibitering signaleert is niet bekend. Preliminair onderzoek, gericht op karakteri-5 sering van AR-receptorbinding geeft echter aan dat AR een specifieke receptor kan hebben. AR concurreert met EGF voor binding aan de TGF-receptor en kan ook concurreren met EGF voor binding aan andere gebruikelijke receptoren, waaronder mogelijkerwijze de AR-specifieke receptor zelf.

Het is bekend dat ligandebinding aan de EGF-receptor een groei stimule-10 rend signaal initieert, ten dele door activering van thyrosinekinase-activiteit. Binding van AR aan de EGF-receptor kan op analoge wijze een proliferatieve respons initiëren of kan omgekeerd de initiëring van een proliferatief signaal blokkeren door beperking van het aantal EGF-recep-toren, dat beschikbaar is voor binding van EGF of andere signaal-genere-15 rende liganden.

Ook is echter een ander mechanisme mogelijk, waardoor AR-celgroei inhibiteert, welk mechanisme door de gegevens in tabel I wordt gesuggereerd. Vier clonen van de A431-cellijn met variabele EGF-bindingsplaat-sen per cel werden beproefd op gevoeligheid voor inhibiterende activi-20 teit van AR. Het waargenomen gebrek aan correlatie tussen AR-gevoelig-heid en het aantal EGF-bindingsplaatsen per cel doet vermoeden dat het door AR gegenereerde groei inhibiterende signaal wordt geïnitieerd door een receptprbindingsgebeurtenis, waarbij de EGF-receptor niet betrokken is. Een dergelijke gebeurtenis kan groeiproliferatieve signalen, die 25 door andere groeifactoren zoals b.v. TGF-oC worden gegenereerd, tegenwerken. Aldus kan AR zijn anti-proliferatieve effect door specifieke blokkering van de mitogene respons op TGF-Cf of andere autocrine groeifactoren van een cel, uitvoeren.

AR is een uitermate hydrofiel proteïne, waarvan de aminozuursequen-30 tie een uniek hydropathieprofiel genereert, dat weinig overeenkomst vertoont met de profielen voor de andere proteïnen van de EGF-familie (FIG. 11). AR is een basisch proteïne met een PI van 7,6 - 8,0.

5.4.1. Karakterisering van AR-inductie door TPA.

TPA induceert een pleiotropisch respons op cellen, waaronder ver-35 anderingen in celmorfologie, celproliferatie en -differentiatie, membraan- 89 00 178.

V Λ - 21 - transport, receptor-ligande wisselwerkingen, proteinefosforylering en fosfolipidemetabolisme. Proteïnekinase C (PKC) is een van Ca^+ en fosfo-lipide afhankelijke proteïnekinase, die als receptor voor TPA fungeert. Binding van TPA aan PKC resulteert in de fosforylering van talrijke sub-5 straten, waaronder groeifactorreceptors, cytoskeletale proteïnen en trans-activerende regulerende proteïnen.

c-AMP is een ander regulerend molecuul, dat diverse effecten op cellen uitoefent, voornamelijk via cAMP-afhankelijke proteïnekinase A. Intracellulaire niveaus van cAMP worden gereguleerd door een combinatie 10 van receptor-bemiddelde activering en adenylaatcyclase-inhibitering. Bepaald onderzoek wijst erop dat TPA en cAMP geïnduceerde gen-expressie kunnen convergeren als een gemeenschappelijke weg. Voor bestudering van de regulering van AR gen-expressie werd gekozen voor een onderzoek van het effect van diverse activatoren of inhibitoren van deze beide regule-15 rende wegen op de produktie van AR specifiek RNA in MCF-7-cellen.

Forskoline is een farmaceuticum dat adenylaatcyclase activeert, restulerend in verhoogd intracellulair cAMP. Bij toediening gedurende 4 uren aan MCF-7-cellen in een hoeveelheid van 25 werd een duidelijke stimulering van AR mRNA waargenomen, waaruit zou· kunnen worden afgeleid 20 dat cAMP-wegen eveneens een rol spelen in de regulering van AR-expressie.

5.5. Amphireguline-verwante derivaten, analogen en peptiden.

De produktie en toepassing van derivaten, analogen en peptiden, die verwant zijn met AR, worden eveneens door de uitvinding omvat. Dergelijke derivaten, analogen en peptiden, die groeimodulerende activiteit 25 vertonen, kunnen toepassing vinden in de diagnose, prognose en behandeling van een ruime variëteit van neoplasia's. Dergelijke derivaten, analogen of peptiden kunnen versterkte of verminderde biologische activiteiten bezitten in vergelijking met natief AR en/of kunnen het AR GIA-vat-bare celtraject vergroten of beperken en toch binnen het kader van de 30 uitvinding komen. Hetzelfde geldt voor de produktie en toepassing van met AR verwante derivaten, analogen en peptiden, die versterkte of verminderde groei stimulerende activiteit vertonen en/of het traject van cellen, die responsief zijn voor de groei stimulerende activiteit van AR, vergroten of beperken, welke derivaten, analogen en peptiden nuttige 35 toepassingen vinden, onder meer de behandeling van wonden en verbrandin- 8900f78Γ * 4 - 22 - gen.

AR-verwante derivaten, analogen en peptiden volgens de uitvinding kunnen volgens een variëteit van bekende methoden worden bereid. Procedures en manipuleringen op het genetische en proteine-niveau worden door de 5 uitvinding omvat.

Op het proteine-niveau kunnen talrijke chemische modificaties •worden toegepast voor de produktie van AR-achtige derivaten, analogen of peptiden door bekende technieken, onder meer specifieke chemische splitsing door endopeptidasen (b.v. cyanogeenbromiden, trypsine, chemotrypsi-10 ne, V8 protease en dergelijke) of exopeptidasen, acetylering, formylering, oxydatie, enz.

5.6. Anti-Amphireguline antilichaam-produktie.

De uitvinding omvat mede de produktie van polyclonale en monoclo-nale antilichamen, die Amphireguline herkennen, of verwante proteïnen.

15 Voor de produktie van polyclonale antilichamen tot epitopen van AR kunnen diverse bekende procedures worden toegepast. Voor de produktie van antilichamen kunnen diverse gastheerdieren worden geïmmuniseerd door injectie met het AR-proteïne of een synthetisch AR-peptide, onder meer konijnen, muizen, ratten enz. Ter verhoging van de immunologische respons 20 kunnen diverse hulpstoffen worden gebruikt, afhankelijk van de gastheer-speciës, onder meer Freund's (volledig en onvolledig) , minerale gels zoals aluminiumhydroxyde, capillair-actieve stoffen zoals lysolecithine, pluronische polyolen, polyanionen, peotiden, olie-emulsies, "keyhole lympet" hemocyaninen, dinitrofenol, en mogelijk geschikte menselijke 25 hulpstoffen zoals BCG (bacille Calmette-Guerin) en Corynebacterium parvum.

Een monoclonaal antilichaam tot een epitoop van AR kan worden bereid volgens elke techniek, waarmede antilichaammoleculen kunnen worden geproduceerd door continue cellijnen in cultuur, onder meer de hybrido-30 matechniek, oorspronkelijk beschreven door Kohier en Milstein (1975,

Nature 256, 495 - 497), de meer recente menselijke B-cel hybridomatech-niek (Kosbor e.a., 1983, Immunology Today 4: 72) en EBV-hybridomatech-niek (Cole e.a., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., biz. 77 - 96).

35 Antilichaamfragmenten, die het idiotype van het molecuul bevatten, 89 00 178 : S, Λ' - 23 - kunnen volgens bekende technieken worden gegenereerd. Voorbeelden van zulke fragmenten zijn onder meer het F(ab')fragment, dat kan worden geproduceerd door pepsinedigerering van het antilichaammolecuul; de Fab'-fragmenten, die gegenereerd kunnen worden door reductie van de disulfide-5 bruggen van het F(ab')fragment, en de twee Fab of Fab-fragmenten, die gegenereerd kunnen worden door behandeling van het antilichaammolecuul met papaïne en een reductiemiddel.

Antilichamen tot AR kunnen toepassing vinden in de kwalitatieve en kwantitatieve detectie van rijp AR en zijn precursor- en subcomponent-10 vormen, in de affiniteitzuivering van AR-proteinen en in de opheldering van AR-biosynthese, metabolisme en functie. Antilichamen tot AR kunnen ook nuttig zijn als diagnostische en therapeutische middelen.

5.7. Toepassingen van Amphireguline.

De bifunctionele aard van AR levert een ruime variëteit van toe-15 passingen in vitro en in vivo. Voor de toepassing en werkwijze volgens de uitvinding kan elke verbinding worden gebruikt, die AR bevat of fragmenten en derivaten daarvan, die groei inhibiterende en/of groei stimulerende activiteit vertonen, op zichzelf of samen met andere biologisch actieve groeifactoren, -inhibitors of immunomodulerende middelen.

20 De lokalisering van het AR-gen tot een regio, die betrokken is bij lymfocytdifferentiatie, doet vermoeden dat AR een rol kan spelen in bloed vormende celontwikkeling, activering of immuno-onderdrukking. Deze functie wordt ook ondersteund door de homologie tussen de AR3-ongetrans-lateerde regio en soortgelijke regio's van andere cytokinen.

25 De onderhavige verbindingen kunnen worden toegepast voor de modu lering van angiogenese, botresorptie, immuunrespons en synaptische en neuronale effectorfuncties. AR kan ook worden gebruikt voor de modulering van de arachidonzuurcascade. Enzymatische oxydatie van arachidonzuur leidt tot een menigte van belangrijke produkten, zoals prostaglandinen, 30 thromboxanen, prostacyclinen en leukotriënen. Dergelijke produkten zijn uitermate krachtige, alom tegenwoordige middelen met talrijke fysiologische effecten, waaronder b.v. spiercontractie, plaatjesaggregatie, leuko-cytmigratie en gastrische secretie. AR, AR-verwante moleculen en composities daarvan kunnen bijzonder nuttig zijn voor de behandeling van wonden 35 en voor de diagnose en behandeling van kanker.

89 00 178 : * * - 24 - 5.7.1. Behandeling van wonden.

AR kan worden toegepast in een werkwijze voor de behandeling van wonden, zoals huidwonden, hoornvlieswonden en diverse andere epitheel-en stroma-disrupties, zoals chronische zweren, verbrandingen, chirurgi-5 sche incisies, traumatische wonden en kwetsuren van de holle, met epi-theel beklede organen, zoals de slokdarm, maag, grote en kleine ingewanden, mond, en genitale en urinaire trajecten. De werkwijze berust op de plaatselijke applicatie van een behandelingscompositie, die AR in een fysiologisch aanvaardbare drager bevat.

10 De composities volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt voor de behandeling van een grote variëteit van wonden, waaronder nagenoeg alle huidwonden, hoornvlieswonden en kwetsuren aan de met epitheel beklede holle organen van het lichaam. Voor behandeling geschikte wonden kunnen het gevolg zijn van trauma, zoals brandwonden, schaafwonden, sneden en 15 dergelijke, of van chirurgische procedures, zoals chirurgische incisies en huidtransplantatie. Andere condities, die geschikt zijn voor behandeling met de composities volgens de uitvinding, zijn chronische condities zoals chronische zweren, diabetische zweren en andere niet-helende (tro-fische) condities.

20 AR kan worden opgenomen in fysiologisch aanvaardbare dragers voor applicatie op het aangedane oppervlak. De aard van de dragers kan sterk variëren en zal afhankelijk zijn van de beoogde plaats van applicatie. Voor applicatie op de huid verdient een crème- of zalfbasis gewoonlijk de voorkeur; voorbeelden van geschikte bases zijn lanoline, Silvadene 25 (Marion) (in het bijzonder voor de behandeling van brandwonden), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut) en dergelijke. Desgewenst kunnen AR bevattende composities worden opgenomen in zwachtels en ander wondverband voor continue blootstelling van de wond aan het peptide.

Ook kunnen aerosol-applicaties worden toegepast.

30 De concentratie van AR in de behandelingscompositie is niet kri tisch, maar dient voldoende te zijn om epitheelcelproliferatie te induceren. De composities kunnen plaatselijk op het aangetaste oppervlak worden aangebracht, typisch als oogdruppels op het oog of als crèmes, zalven of lotions op de huid. In het geval van de ogen is een frequente be-35 handeling gewenst, gewoonlijk met intervallen van 4 uren of minder. Op 89 00 1787 V Λ - 25 - de huid is het gewenst de behandelingscompositie tijdens de genezing continu op het gekwetste oppervlak te houden met applicaties van de behande-lingscompositie 2- tot 4-maal daags of vaker.

De hoeveelheid, die van het onderhavige polypeptide wordt ge-5 bruikt, varieert met de wijze van toediening, de toepassing van andere actieve verbindingen en dergelijke, en bedraagt in het algemeen ongeveer 1 jg tot 100 ijq. Het onderhavige polypeptide kan worden toegepast met een fysiologisch aanvaardbare drager, zoals zoutoplossing, met fosfaat gebufferde zoutoplossing of dergelijke. De hoeveelheid van de gebruikte ver-10 binding zal empirisch worden bepaald op basis van de respons van cellen in vitro en de respons van proefdieren op de onderhavige polypeptiden of preparaten, die de onderhavige polypeptiden bevatten.

AR-verbindingen vinden toepassing alleen of in combinatie met andere groeifactoren, inhibitoren of immunomodulatoren.

15 5.7.2. Diagnose en behandeling van neoplasia*s.

De composities volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt bij de diagnose, prognose en behandeling van een ruime variëteit van neoplasia's.

Een aantal diagnostische toepassingen van AR en verwante molecu-20 len wordt voorzien. In de praktijk van de uitvinding kunnen de onderhavige polypeptiden worden gebonden aan een label, zoals een radio-isotoop, enzyme, fluorescent, chemiluminescent, enzymefragment, deeltje, enz. Dergelijke verbindingen kunnen worden gebruikt voor het titreren van het aantal receptoren voor AR op een cel. Identificatie van receptoren voor 25 AR is een aanwijzing voor potentiële respons van de cel op de biologische effecten van AR en verwante moleculen. AR, Ar-verwante moleculen en/of antilichamen daarvoor kunnen worden gebruikt in concurrerende proeven voor detectie van AR in media, in het bijzonder in fysiologische media. Een ruime variëteit van bekende diagnostische proeven kan worden 30 toegepast.

De aanwezigheid en concentratie van AR in lichaamsvloeistoffen en -weefsels kan direct of omgekeerd verband houden met de aanwezigheid en verbreiding van bepaalde kankers. Proeven die AR kunnen detecteren en/of kwantificeren, kunnen toepassing vinden in kankerdiagnose en -prog-35 nose (zie paragraaf 5.6.) 89 00 178: * * - 26 -

De uitvinding heeft ook betrekking op detectie van AR mRNA. Proeven, waarbij gebruik wordt gemaakt met nucleinezuursondes voor de detectie van sequenties, die een bekende gen-sequentie geheel of gedeeltelijk bevatten, zijn algemeen bekend en kunnen worden toegepast. AR mRNA-5 niveaus kunnen wijzen op beginnende of bestaande neoplasia's, zodat proeven, waarmede AR mRNA-niveaus kunnen worden gekwantificeerd, een waarde-vol diagnostisch gereedschap betekenen.

Verder kunnen kwaadaardige cellen, die de AR-receptor tot expressie brengen, worden gedetecteerd door toepassing van gelabelde AR of AR-10 verwante moleculen in een receptorbindingsproef of door toepassing van antilichamen voor de AR-receptor zelf. Cellen kunnen worden onderscheiden volgens de aanwezigheid van receptoren voor AR, waardoor een hulpmiddel wordt verschaft voor het voorspellen van de vatbaarheid van dergelijke cellen voor de biologische activiteiten van AR.

15 AR kan worden gebruikt als anti-neoplastische verbinding. Voor ge bruik in vivo kunnen de onderhavige composities op een aantal manieren worden toegediend, onder meer injectie, infuus, plaatselijk, parenteraal, enz. De toediening kan geschieden in elke fysiologisch aanvaardbare drager, waaronder met fosfaat gebufferde zoutoplossing, zoutoplossing, ge-20 steriliseerd water en dergelijke. AR en verwante moleculen kunnen ook worden ingekapseld in liposomen en kunnen worden geconjugeerd tot antilichamen, die tumor of celspecifieke antigenen herkennen en zich daaraan binden, waardoor een middel wordt verschaft voor "targeting" van de composities volgens de uitvinding.

25 AR kan in vivo nuttig zijn voor het induceren van terminale dif ferentiatie in tumorcellen. Dergelijke cellen zijn afgedwaald van de gewone gang van celdifferentiatiekarakteristiek van normale cellen en zijn in staat tot voortgezette proliferatie. Daarentegen differentiëren normale cellen tot cellen, die onder de meeste omstandigheden niet in staat 30 zijn tot verdere celdeling. Aldus kan het vermogen van AR om normale celdifferentiatie in tumoren te heractiveren en uiteindelijk voortgezette tumorgroei tot stilstand te brengen, waardevolle toepassing vinden voor tumortherapie.

AR en verwante derivaten, analogen en peptiden daarvan kunnen al-35 leen of samen met tenminste één andere anti-proliferatieve verbinding, 8900 17 8 : X >' - 27 - b.v. een interferon, TGF-/3l, TGF-^3 2, tumornecrosefactor-^, tumornecro-sefactor-PC en dergelijke, worden gebruikt voor de behandeling van hormo-naalresponsieve carcinoma's, die een ruime variëteit van organen, zoals de longen, borst, prostaat, dikke dam en dergelijke, kunnen aantastem.

5 Hormonaalresponsieve carcinoma's kunnen ook worden behandeld door inductie van de vorming van AR in de carcinomacellen. Inductiemiddelen zijn onder meer oestrogenen, zoals 17D-oestradiol, verbindingen met oestro-gene activiteit en verbindingen met anti-oestrogene activiteit, zoals Tamoxifen. Van deze verbindingen kunnen ook combinaties worden gebruikt 10 als inductiemiddelen.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen in vitro worden gebruikt voor inhibitering van de groei van cellen of cellijnen, die gevoelig zijn voor AR als onderscheiden van cellen, die niet gevoelig zijn.

Op deze wijze kunnen heterogene mengsels of cellijnen worden bevrijd van 15 ongewenste cellen, indien de ongewenste cellen gevoelig zijn voor de groei inhibiterende activiteit van AR. Zo kunnen b.v. de verbindingen volgens de uitvinding in vitro worden gebruikt voor het elimineren van kwaadaardige cellen uit merg, voor autologe mergtransplantaties en voor het elimineren of inhibiteren van de proliferatie van kwaadaardige cel-20 len in bloed voor herinfusie.

De meest effectieve concentratie van AR voor het inhibiteren van proliferatie van een bepaalde cel kan worden bepaald door toevoeging van diverse concentraties van AR aan de betrokken tumorcel en waarneming van de hoeveelheid inhibitering van celproliferatie. De doelmatigste concen-25 tratie van individuele inductiemiddelen en/of combinaties van inductiemiddelen kan worden bepaald door waarneming van de produktie van AR in de carcinomacellen.

6. Voorbeeld: Produktie, zuivering en karakterisering van menselijk Amphireguline.

30 In onderstaande sub-paragrafen worden de zuivering en karakteri sering beschreven van Amphireguline, geproduceerd door met TPA behandelde MCF-7-cellen.

6.1. Materialen en methoden.

De volgende procedures werden toegepast om de AR-synthese in MCF-35 7-cellen te induceren en nagenoeg zuiver AR te bereiden en te karakteri- 89 00 178.1 *" J.

- 28 - seren.

6.1.1. SDS-polyacrylamidegsl-elektroforese.

Proteïnen werden geanalyseerd op SDS-PAGE plaatgels (normaal of mini Bio-Rad-systeem) zoals beschreven (Laemmli, 1970, Nature 227: 680 -5 685) en werden gedetecteerd door zilverkleuring (Merril e.a., 1981,

Science 211: 1437 - 1439) .

6.1.2. Isoëlektrische focussering.

Isoëlektrische focussering werd uitgevoerd zoals beschreven door de Isolab Technical gegevens voor Resolve IEF-gels. Kort samengevat wer-10 den de monsters geladen op tevoren gegoten agarose-gels (85 x 100 mm, pH 3 - 10) en werden gefocuseerd op een Resolve model FR-2500 isoëlektro-focusseringseenheid onder toepassing van een Bio-Rad model 3000 Xi compu-ter-geregelde elektroforese-energiebron. Bio-Rad IEF-standaards werden naast het monster gefocusseerd, gekleurd, waarna het droge gel werd be-15 licht op Kodak X-Qmat AR film met een DuPont Cronex belichting plus in-tensifiëringsscherm.

6.1.3. Jodering van proteïne.

125

Proteïnen werden gelabeld met I onder toepassing van de chloramine T-methode (Barridge, 1978, Methods Enzymol. 50: 54 - 65).

20 6.1.4. Protelnebepaling.

Proteïneconcentraties werden bepaald door absorptie bij verschillende golflengten (210 - 280 nm). De methoden van Lowry (Lowry e.a., 1951, J. Biol. Chem. 193: 265 - 275) en Bradford (1976, Anal. Biochem.

72: 248 - 252) werden toegepast met runderserumalbumine als standaard.

125 25 6.1.5.- I-EGF-bindingsproef.

De bindingsproeven werden uitgevoerd hetzij in 48-puts weefseloul-tuurplaten, wanneer vers gegroeide en/of met formaline gefixeerde A431-cellen werden gebruikt, zoals beschreven (Carpenter, e.a., 1979, J. Biol. Chem. 254, 4484 - 4891; Shoyab, e.a., 1979, Nature 279: 387 - 391; 30 DeLarco, e.a., 1980, J. Biol. Chem. 255: 3685 - 3690), of door immobiliser ing van plasmamembranen op 96-puts polyvinylchlorideplaten, zoals beschreven (Kimball en Warren, 1984, Biochem. Biophys. Acta 771: 82 - 88).

6.2. Produktie van Amphireguline 6.2.1. Verzameling van geconditioneerd medium uit met TPA behandel-35 de MCF-7-cellen_ MCF-7-cellen werden gekweekt in T 150 Corning-weefselcultuurkol- 89 00 178 .« \ ,ί - 29 - ven in een totaal volume van 25 ml 50% IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media) + 50% DMEM, bevattende 0,6 yg/ml insuline en 15% door warmte ge-inactiveerd foetaal runderserum (MCF-7 compleet medium). Ongeveer 1x106 cellen werden per kolf gezaaid en bij 37°C met 5% CC^ geïncubeerd. Op de 5 zesde dag werden alle media verwijderd en werd 20 ml vers MCF-7 compleet medium, bevattende 100 ng/ml TPA, aan elke kolf toegevoegd. 48 uren later werden de media verwijderd en werd elke kolf gespoeld met 15 ml 50% IDMM + 50% DMEM (serumvrij medium) en werd 25 ml vers serumvrij medium toegevoegd aan elke kolf en bij 37°C met 5% CO^ geincubeerd. Vier dagen 10 later werden de geconditioneerde serumvrije media verzameld, gecentrifugeerd ter verwijdering van brokjes en bewaard bij -20°C. De kolven werden opnieuw gevoed met 25 ml serumvrij medium en elke derde of vierde dag werden geconditioneerde serumvrije media verzameld. Een monster van de geconditioneerde media uit elke collectie werden beproefd op groei 15 inhibiterende activiteit (GIA) op A431 menselijke epidermolde carcinoom-cellen. Gewoonlijk werden 3-4 ronden van geconditioneerde media verzameld uit elke lading van met TPA verzamelde MCF-7-cellen.

6.2.2. Isolering van ruw AR.

Ongeveer 4500 ml geconditioneerd medium werd ontdooid en geduren-20 de 15 minuten bij 4°C gecentrifugeerd bij 3500 omw./minuut. De bovenstaande vloeistof werd bij 4°C geconcentreerd in een Amicon-concentrator van 2 liter onder toepassing van een YM10-membraan (Amicön). Toen het volume van het concentraat ongeveer 200 ml bedroeg werd 1000 ml koud Mili-E-Q-water toegevoegd, waarna het mengsel opnieuw tot 200 ml werd gecon-25 centreerd.

Het concentraat werd verwijderd en overgebracht naar een voorgekoelde Coming-centrifugefles van 250 ml. Geconcentreerd azijnzuur werd langzaam onder roeren toegevoegd tot een eindconcentratie van 1 M azijnzuur. Het mengsel werd 1 uur bij 4°C met rust gelaten en vervolgens 20 30 minuten bij 4°C gecentrifugeerd bij 40.000 x g in een Sorval RC-5B-cen-trifuge. De bovenstaande vloeistof werd verwijderd en bewaard bij 4°C.

De vaste stof werd gesuspendeerd in 30 ml 1 M azijnzuur en opnieuw op de beschreven wijze gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd andermaal zorgvuldig verwijderd en gecombineerd met de eerste bovenstaande 35 vloeistof en vervolgens gedialyseerd tegen 17 liter 0,1 M azijnzuur in 83 0 0 17 8 Γ - 30 - * *

No.3 spectrapore-dialysebuizen (molecuulgewicht bij ongeveer 3000 afgesneden) . De dialysebuffer werd over een periode van 2 dagen driemaal ververst. Het retenaat werd gelyofiliseerd. Het droge materiaal werd verwijderd, samengevoegd, gewogen en bij -20°C bewaard tot verder gebruik.

5 Dit materiaal wordt aangeduid als het ruwe poeder.

6.3. Zuivering van Amphireguline.

6.3.1. Omgekeerde-fase vloeistofchromatografie.

950 mg ruw poeder (uit ongeveer 9 liter serumvrij geconditioneerd medium) werd gesuspendeerd in 300 ml 0,1%'s TFA (trifluorazijnzuur) en 10 gedurende 20 minuten bij 7.000 x g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd zorgvuldig verwijderd en aangebracht op een kolom van pre-paratief Cl8 (2,54 cm x 27 cm; 55 - 105 ym; Waters) geëquilibreerd met 0,1%'s TFA in water. De chromatografische drager werd gesuspendeerd in acetonitrile (MeCN) met 0,1% TFA, de suspensie werd in een kolom met een 15 diameter van 2,54 cm gegoten en de kolom werd gewassen met 400 ml MeCN met 0,1% TFA en vervolgens geëquilibreerd met 600 ml 0,1% TFA in water.

De stroomsnelheid was 4 ml/minuut en de chromatografie werd bij kamertemperatuur uitgevoerd. De kolom werd gewassen met 650 ml 0,1% TFA in water. De doorbraak en de wasvloeistof werden gezamenlijk verzameld. Vervolgens 20 werd trapsgewijze eluering als volgt uitgevoerd: (1) 650 ml 20% MeCN/^O met 0,1% TFA, (2) 650 ml 40% MeCN/H20 met 0,1% TFA, (3) 650 ml 60% MeCN/H20 met 0,1% TFA en (4) 650 ml 100% MeCN met 0,1% TFA. Uit elke fractie werd een monster genomen, dat beproefd werd op GIA. Ongeveer 77% van de totale GIA-activiteit verscheen in de doorbraak- en wasfracties.

25 De doorbraak- en wasfracties werden isocratisch geïnjecteerd op een preparatieve Partisil 10 0DS-3-kolom (10 ym, 2,2 x 50 cm, Whatman), verbonden met een vloeistofchromatografiesysteem (HPLC) met een hoog prestatievermogen (Waters). De stroomsnelheid werd ingesteld op 4 ml/min. Toen het monster de kolom eenmaal had bereikt werd de kolom gewassen met 30 250 ml 0,1%'s TFA in water. De lineaire gradiënt werd gegenereerd tussen het primaire oplosmiddel, 0,1% TFA in water, en het secundaire oplosmiddel, acetonitrile, dat 0,1% TFA bevatte. De gradiëntomstandigheden waren: 0 - 15% in 10 minuten, 15 - 15% in 30 minuten, 15 - 25% in 150 minuten, 25 - 65% in 100 minuten en 65 - 100% in 10 minuten. Alle oplosmiddelen 35 waren van HPLC-kwaliteit. Er werden fracties van 14 ml verzameld en mon- 89 00 178 ; - 31 - sters van elke fractie werden beproefd op GIA. Er werden twee brede acti-viteitspieken waargenomen (fig.1). De vroege elueringspiek (geëlueerd tussen 20 - 23% acetonitrile) werd verder gezuiverd en gekarakteriseerd.

De fracties 47 - 62 werden samengevoegd. Aan de samengevoegde 5 fracties werd 224 ml 0,1%'s TFA in water toegevoegd. Het mengsel werd isocratisch geïnjecteerd op een semi-preparatieve y-Bondapak-Cl8-kolom (7,8 x 300 mm, Waters) bij een stroomsnelheid van 2 ml/minuut bij kamertemperatuur. De lineaire gradiëntomstandigheden waren 0 - 17% in 10 minuten, 17 - 17% in 30 minuten, 17 - 25% in 320 minuten en 25 - 100% in 40 10 minuten. De stroomsnelheid bedroeg 1 ml/minuut tijdens de gradiënt en er werden fracties van 4 ml verzameld. Monsters werden genomen en beproefd op GIA. Er werden twee grotere activiteitspieken waargenomen, elu-erend bij acetonitrileconcentraties van resp. ongeveer 20% en 21% (FIG.

2) .

15 De fracties 49 - 53 werden samengevoegd. Aan de samengevoegde fractie werd 20 ml 0,1%'s TFA toegevoegd. Het mengsel werd isocratisch aangebracht op een y-Bondapak-C18-kolom (3,9 x 300 mm, Waters) bij een stroomsnelheid van 1 ml/minuut bij kamertemperatuur. De gradiëntomstandigheden waren 0 - 18% in 10 minuten, 18 - 18% in 30 minuten, 18 - 25% 20 in 280 minuten en 25 - 100% in 20 minuten. De stroomsnelheid bedroeg 0,4 ml/minuut en er werden fracties van 2 ml verzameld. Het grootste gedeelte van de activiteit kwam uit de kolom bij ongeveer 21,5% acetoni-trileconcentratie (FIG.3A). Fracties 54 - 59 (FIG.2) werden samengevoegd en op precies dezelfde wijze gechromatografeerd als beschreven met be-25 trekking tot FIG.3A. Het grootste gedeelte van de activiteit elueerde uit de kolom bij een acetonitrileconcentratie van ongeveer 22,2% (FIG.3b).

6.3.2. Gelpermeatiechromatografie.

Fracties 35 - 38 (FIG.3A) werden individueel met behulp van een Speed-Vac-concentrator (Savant) geconcentreerd tot ongeveer 70 ι/L, waar-30 aan een gelijk volume acetonitrile, dat 0,1% TFA bevatte, werd toegevoegd. Dit monster van 140 yl werd geïnjecteerd op twee Bio-Sil TSK-250 kolommen (elk 7,5 x 300 mm, Bio-Rad), die tandemsgewijze waren opgesteld. De eluering geschiedde isocratisch met een mobiele fase van 50% aceto-nitrile/^O met 0,1% TFA bij kamertemperatuur. De stroomsnelheid was 0,4 35 ml/minuut en de registratiesnelheid was 0,25 cm/minuut; er werden frac- 8900178/ ♦· r - 32 - ties van 0,4 ml verzameld en monsters daarvan werden beproefd op GIA. Chromatografische profielen van de fracties 35, 36 en 37 (FIG.3A) worden resp. in FIG.4A, 4B en 4C getoond.

De fracties 41 en 42 (FIG.3B) werden samengevoegd, geconcentreerd 5 tot 70 yl en vervolgens onderworpen aan gelpermeatiechromatografie op de hierboven beschreven wijze. Het chromatografische profiel wordt getoond in FIG.4D.

6.4. Celgroeiproeven.

125 6.4.1. Celgroeimoduleringsproef onder toepassing van I-deoxy- 10 uridine-opname in DNA._

De proeven werden uitgevoerd in platen met 96 vlakke putten (Falcon 3072). Menselijke epidermoïde carcinoom van vulva-cellen (A431) werden gebruikt als proefcellen voor groei inhibiterende activiteit (GIA) en menselijke voorhuid-fibroblasten (Sadamoto) als indicatorcellen voor 15 groei stimulerende activiteit (GSA). 3,5 x 10^ cellen in 50 yl DMEM, aangevuld met 5% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), penicilline/streptomycine (PS) en glutamine (proefmedium) werden in alle putten behalve de perifere putten, geplaatst. De perifere putten ontvingen 50 yl PBS. 3 uren later werd 50 yl proefmonster in proefmedium aan 20 elke put toegevoegd, terwijl controleputten slechts 50 yl proefmedium ontvingen. Voor elke concentratie van het proefmonster werden drie putten gebruikt. De platen werden gedurende 2-3 dagen bij 37°C geïncubeerd.

125 125

Hierna werd 100 yl van een oplossing van I-jodo-2'- I-deoxy-uridine (4Ci/mg - 0,5 mCi/ml (2 yl/ml in proefmedium)) aan elke put toegevoegd, 25 waarna de platen bij 37°C werden geïncubeerd. Na 4 - 6 uren werd het medium uit de putten geblazen, eenmaal gewassen met 200 yl PBS. Vervolgens werd 200 yl methanol aan elke put toegevoegd, waarna de platen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur werden geïncubeerd en vervolgens de methanol door blazen werd verwijderd. Na toevoeging van 200 yl 1 M natrium-30 hydroxyde aan elke put werden de platen gedurende 30 minuten bij 37°C ge-incubeerd. Het natriumhydroxyde werd verwijderd met "titertek"-proppen (Flow Labs). De proppen werden overgebracht in 12 x 75 mm kunststofbui-zen en in een gamma-teller geteld ter kwantificering van de opname van 125I-IUdR.

89 00 178 ;

X

- 33 - 6.4.2. Kolonieproef in zachte agar.

Een 0,5 ml basislaag van 0,5% agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in DMEM, dat 10% door warmte geïnactiveerd FBS bevatte, werd gebracht in 24-puts Costar-weefselcultuurplaten. Over de basis- 5 laag van agar werd 0,5 ml 0,3%'s agar, bevattende hetzelfde mengsel van 3 medium en FBS, 5 - 10 x 10 proefcellen en de bij verschillende concentraties te beproeven factoren aangebracht. De platen werden bij 37°C ge-incubeerd in een bevochtigde atmosfeer van 5% COj in lucht en na 7 dagen opnieuw gevoed door toevoeging van 0,5 ml 0,3%'s agar, dat hetzelfde me-10 dium en concentraties van te beproeven materiaal bevatte. Kolonies werden ongefixeerd en ongekleurd geteld en het aantal kolonies met meer dan 20 cellen werd tussen de dagen 7 en 14 genoteerd.

6.4.3. Celgroei-inhibiteringsproef.

In 24-puts Costarplaten (ongeveer 2 cm2/put) werden A431-cellen 4

15 in een hoeveelheid van 2,1 x 10 cellen per put in 0,3 ml medium (DMEM

met 10% FBS, P/S, glutamine) aangebracht en gedurende 2 uren bij 37°C ge-incubeerd. Vervolgens werden proefmonsters in verschillende concentraties in duplo in 0,3 ml medium in elke put toegevoegd. De controleputten ontvingen medium zonder monster. De platen werden 72 uren bij 37°C geïn-20 cubeerd. Het medium werd vervolgens afgeblazen, waarna de cellen werden gewassen met 1 ml PBS/put, gescheiden met 0,5 ml trypsine (0,5%)-EDTA (0,5 mM) en geteld met behulp van een Coulter-teller.

6.5. Analyse van AR primaire structuur.

6.5.1. Reductie en S-pyridylethylering.

25 AR (20 - 30 yg) werd gedroogd in 1,5 ml microfuge-polypropeenbuis, gesuspendeerd in 100 yl 3 M ureum in 0,05 M TRIS-HCl, pH 7,5. Aan het mengsel werd 4 yl 2-mercaptoëthanol toegevoegd, waarna de inhoud werd gemengd, gespoeld met stikstof en geïncubeerd bij 25°C. Na 2,5 uren werd 4,5 yl vers gedestilleerd 4-vinylpyridine aan het mengsel toegevoegd, 30 waarna de buis opnieuw werd gespoeld met stikstof en gedurende 2 uren bij 25°C werd geïncubeerd. Het reactiemengsel werd tot pH 2,0 aangezuurd met 10%'s TFA. S-gepyridylethyleerd AR werd gezuiverd door rp HPLC met behulp van een y-Bondapak C18-kolom (3,9 x 300 mm, Waters). De concentratie van acetonitrile werd lineair verhoogd (1%/minuut) gedurende 55 mi-35 nuten bij een stroomsnelheid van 1 ml/minuut. Het primaire oplosmiddel 89 00 178.

f ί - 34 - was 0,1% TFA. S-gepyridylethyleerd AR (SPE-AR) elueerde bij ongeveer 26,5% acetonitrile, ongeveer bij een 4% hogere acetonitrileconcentratie dan onbehandeld AR.

6.5.2. N-glycanase-behandeling.

5‘ AR of S-gepyridylethyleerd AR (10 - 20 yg) werd gedroogd in een

1,5 ml polypropeen-microfugebuis en gesuspendeerd in 80 yl 0,1 M fosfaat-buffer met een pH van 5,5, waarna 10 - 20 yl N-Glycanase (0,25 eenheid/ yl, Genzyme) werd toegevoegd en het mengsel gedurende 16 uren bij 37°C werd geincubeerd. Aan het reactiemengsel werd 0,9 ml 0,2%'s TFA toege-10 voegd en een monster werd geïnjecteerd op ultrapore RPSC C3 rp HPLO

kolom (4,6 x 75 mm, Altex) bij een stroomsnelheid van 1 ml/min, tevoren geëquilibreerd met het primaire oplosmiddel 0,1%'s TFA. Acetonitrile met 0,1% TFA werd gebruikt als secundair oplosmiddel. De concentratie van acetonitrile werd lineair verhoogd (0,4%/minuut) gedurende 85 minu-15 ten bij kamertemperatuur. N-gedeglycosyleerd-AR en N-gedeglycosyleerd S-gepyridylethyleerd AR elueerde resp. bij acetonitrileconcentraties van ongeveer 16,5% en 20,5%.

6.5.3. Enzymatische splitsing van met N-Glycanase behandeld S-gepyridylethyleerd AR,_;__ 20 Splitsing met endopeptidase Lys-C geschiedde in 60 yl 0,1 M TRIS- azijnzuurbuffer, pH 8,0, bij 25°C gedurende 16 uren. De vernouding enzy-me/substraat bedroeg 1 : 5 (gewicht/gewicht). Endopeptidase-Arg en S. aureus V8 protease-digereringen werden uitgevoerd in 80 ml 0,05 M TRIS-HC1, pH 8,0, en 0,1 M ammoniumbicarbonaat bij 37°C gedurende 16 25 uren. De verhouding enzyme/substraat bedroeg wederom 1 : 5.

6.5.4. Chemische splitsing.

Voor CNBr-splitsing bij methioninerest werd 5 yg met N-Glycanase behandeld S-gepyridylethyleerd AR gedroogd in 1,5 ml polypropeenmicro-fugebuis, gesuspendeerd in 75 yl 70%'s mierezuur, waarna 25 yl CNBr-30 oplossing (25 mg/ml in 70% HCOOH) werd toegevoegd en gemengd, waarna de buis met stikstof werd gespoeld. De reactie werd gedurende 22 uren bij 25°C in het donker uitgevoerd. Het reactiemengsel werd met water verdund tot 1,1 ml en gedroogd in een Speed-Vac-concentrator. Het gedroogde monster werd gesuspendeerd in 20 yl 2-aminoëthanol, 10 minuten bij 22°C met 35 rust gelaten en vervolgens in vacuo gedroogd. Het mengsel werd gesuspen- 89 00 178 Γ -fe Λ - 35 - deerd in 0,9 ml 0,2%'s TFA.

6.5.5. Peptide-isolering.

Peptiden werden afgescheiden op een omgekeerde-fase HPLC C8-kolom (4,6 x 100 mm, Whatman), verbonden met een HPLC-systeem (Waters). Het 5 aangezuurde monster (pH 2,0) werd aangebracht op een kolom geëquilibreerd met 0,1% TFA (primair oplosmiddel) bij een stroomsnelheid van 1 ml/minuut, waarna de kolom verder werd gewassen met ongeveer 15 ml 0,1%'s TFA. Lineaire gradiënten werden toegepast tussen het primaire oplosmiddel en het secundaire oplosmiddel acetonitrile met 0,1% TFA. De gradiëntomstandig-10 heden waren 0 - 50% in 125 minuten bij een stroomsnelheid van 0,5 ml/minuut.

6.5.6. Aminozuur-analyse.

Gedroogde monsters werden gehydrolyseerd met constant kokend HC1 (5,7 M, Pierce) dat 1% (v/v) fenol bevatte, onder verlaagde druk in een 15 met Teflon afgesloten glazen hydrolysebol (Pierce) bij 105°C gedurende 16 uren. De hydrolysaten werden gedroogd in een Speed-Vac-concentrator (Savant Instruments) en gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met fënylisothiocyanaat gederivatiseerd. Het fenylthiocarbamylaminozuurderi-vaat werd geanalyseerd door rp HPLC op een octadecyl-kolom (4,5 x 250 20 mm, IBM). De lineaire gradiënt werd gevormd tussen het primaire oplosmiddel 0,15 M natriumacetaat, pH 6,4, 0,05% triëthylamine, met azijnzuur getitreerd tot pH 6,4, en het secundaire oplosmiddel 60% acetonitrile bij een stroomsnelheid'van 1 ml/minuut bij 38°C.

6.5.7. Aminozuursequentiebepaling.

25 Peptidesequenties werden bepaald met een Applied Biosystem model 475 gas phase sequencer, zoals beschreven (Hewick e.a., 1982, J. Biol.

Chem. 256: 7990 - 7997). Voor het aanbrengen van het monster voor elke proef werden drie precycles van Edman-degradatie uitgevoerd. 25% TFA werd gebruikt voor omzetting van de triazolinederivaten in fenylthiohy-30 dantoine-aminozuren. Identificatie van fenylthiohydantoïne-aminozuren werd on-line uitgevoerd op Model 120A PTH-analyzer (Applied Biosystem) zoals beschreven (Hunkapiller en Hood, 1983, Science 219: 650 - 659).

6.5.8. Diverse behandelingen.

Voor deze proeven (tabel I) werden 50 - 100 eenheden van half-35 zuiver (semi prep, rp Cl8 trap) of schijnbaar zuiver AR gebruikt. N-Gly- __- ^fl>. · 89 00 178 7 * λ - 36 - canase en O-Glycanase waren betrokken van Genzyme Corp., Boston; alle andere enzymen waren afkomstig van Boehringer Mannheim Biochemicals of Worthington Biochemicals. De behandelingen werden uitgevoerd in 50 -200 yl van een geschikte buffer. Er werd een overmaat enzymen gebruikt, 5 gewoonlijk 5 - 20% (gewicht/gewicht) van de substraatconcentratie. Na de behandelingen werden monsters geanalyseerd op GIA door verwijdering van storende materialen volgens diverse analytische methoden. In de meeste gevallen werd de pH van het monster met 10% TFA op ongeveer 2 gebracht.

De monsters werden aangebracht op een omgekeerde-fase ultrapore RPSC C3-10 kolom (4,6 x 75 mm, Altex) geëquilibreerd met 0,1% TFA. De kolom werd verder gewassen met primair oplosmiddel 0,1% TFA. Vervolgens werd de elu-ering op gang gebracht met acetonitrile met 0,1% TFA als secundair oplosmiddel. De gradiëntomstandigheden waren 0-50% gedurende 0,2 minuut en 50 - 50% gedurende 19,8 minuten. De stroomsnelheid bedroeg 0,5 ml/minuut 15 en er werden fracties van 2 ml verzameld. Monsters werden genomen en beproefd op GIA. AR-activiteit elueerde gewoonlijk in fractie 4.

6.6. DNA-bindirigsonderzoek.

De binding van AR aan natieve kalfthymus DNA-cellulose, gedenatureerde kalfthymus DNA en cellulose werd uitgevoerd als beschreven 20 (Herick en Alberts, 1971, Methods in Enzymology 21: 198). Cellulosen (10 mg) werden herhydrateerd in 500 yl ladingbuffer (20 mM Tris pH 7,4, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM /3-mercaptoëthanol, 100 yg/ml BSA en 50 mM NaCl). De reacties werden in duplo uitgevoerd in 1,5 ml eppendorf- buizen met 300 ul gehydrateerde (verpakt volume) cellulosemonsters, die 125

25 5-maal met ladingbuffer werden gewassen. Vervolgens werd 0,2 ng I-AR

125 (specifieke activiteit van 425 yCi/yg) of ander I-gelabeld proteïne in 250 yg ladingbuffer aan elke buis toegevoegd. Monsters werden gemengd en gedurende 20 minuten bij 4°C geïncubeerd met periodieke beroering en werden vervolgens vijfmaal gewassen met 200 yg ladingbuffer per wassing. 30 De eluering werd trapsgewijze uitgevoerd met 0,1 M, 0,15 M, 0,25 M, 0,6 Μ, 1 H en 2 M NaCl in ladingbuffer (vijfmaal met 200 yl bij elke concentratie). Specifiek verbonden materiaal werd gedefinieerd als materiaal, dat elueerde bij een concentratie van 0,25 M NaCl of meer. Materiaal, dat bij een concentratie van 0,15 M NaCl of minder elueerde, werd 35 niet-specifiek gebonden geacht.

89 00 178 :

Jfc > - 37 - 6.7. Resultaten.

6.7.1. Produktie van AR door met TPA behandelde MCF-7-cellen.

MCF-7-cellen, die op een plastic substraat zijn gegroeid, vertonen typische epitheloïde aspecten: de cellen zijn klein en polygonaal 5 van vorm. TPA induceert dramatische morfologische veranderingen op dosis-afhankelijke wijze. MCF-7-cellen verliezen na behandeling met TPA hun goed gedefinieerde morfologie, worden afgerond en uitgespreid. TPA lokt een dosis-afhankelijke vermindering in het aantal cellen uit en een toename van het celvolume, in vergelijking met onbehandelde cellen.

10 Serumvrije geconditioneerde media uit MCF-7-cellen bevatten geen waarneembare groei inhibiterende activiteit voor A431-cellen. Niettemin bleek de serumvrije bovenstaande vloeistof, verzameld uit MCF-7-cellen, die gedurende 2-3 dagen met TPA waren behandeld, de proliferatie van A431-epidermoïde carcinoomcellen te inhibiteren. Waargenomen werd dat de 15 optimale inductie van inhibiterende activiteit gelegen was tussen 25 en 100 ng/ml TPA. Zelfs na verwijdering van TPA werd door met TPA behandelde MCF-7-cellen deze activiteit gedurende tenminste 8 dagen in serumvrij medium afgescheiden. Hoewel na de verwijdering van TPA een met de tijd verminderende groei inhibiterende activiteit werd waargenomen, wijzen de-20 ze resultaten op Amphireguline, dat induceerde of toenam in expressie in MCF-7-cellen, die zijn behandeld met TPA.

6.7.2. Initiële karakterisering.

Tabel I toont het effect van diverse fysische, chemische en enzymatische behandelingen op de anti-proliferatieve activiteit van Amphi-25 reguline. De GIA (groei inhibiterende activiteit) van Amphireguline was bestand tegen behandeling met 1 M azijnzuur, 1 M ammoniumhydroxyde, 6 M ureum, 0,01 M natriummetaperjodaat, verwarming op 56°C gedurende 30 minuten en behandelingen met neuraminidase, N-Glycanase, O-Glycanase, lipase, fosfolipase A2, C of D. De activiteit was echter gevoelig voor verhitting 30 gedurende 10 minuten op 100°C, reductie, reductie en behandeling met 4-vinylpyridine en voor digerering met protéinasen, zoals trypsine, endo-peptidase Lys-C, endopeptidase-Arg en endopeptidase-Glu (V8>. Deze resultaten doen vermoeden dat Amphireguline een proteïne is, dat cysteïnen in disulfidebinding(en) is, die essentieel zijn voor zijn biologische ac-35 tiviteit. Dit proteïne kan oligosaccharide- en/of lipo-molecuulgedeelten 89 00 178 Γ

* X

- 38 - bevatten, die voor de biologische activiteit niet noodzakelijk zijn.

TABEL II

Effecten van diverse behandelingen op GIA van Amphireguline Behandeling % controle 5 1 M azijnzuur, 2 uren bij 4°C 102 1 M NH^OH, 2 uren bij 4°C 97 56°, 30 minuten 96 100°, 10 minuten 5 6 M ureum (2 uren bij 25°C) 82 10 0,2 M 2-mercaptoëthanol (2,5 uren bij 25°C) 6 2-mercaptoëthanol + 4-vinylpiridine (2,5 uur bij 25°C) + (2 uren bij 25°C) 1 0,01 M natriummetaperijodaat (6 uren bij 4°C in het donker) 86 TPCK - trypsine (6 uren bij 37°C) 3 15 TPCK - trypsine + sojaboontrypsine-inhibitor (6 uren bij 37°C) 82 sojaboontrypsine-inhibitor (6 uren bij 37°C) 109 endopeptidase Lys-C (20 uren bij 25°C) 5 endopeptidase Arg (16 uren bij 37°C) 4 endopeptidase Glu (16 uren bij 37°C) 6 20 neuraminidase (16 uren bij 37°C) 103 N-Glycanase (16 uren bij 37°C) 90 O-Glycanase (16 uren bij 37°C) 102 neuraminidase + N-Glycanase (16 uren bij 37°C) 94 neuraminidase + O-Glycanase (16 uren bij 37°C) 105 25 fosfolipase A2 (6 uren bij 37°C) 82 fosfolipase C (6 uren bij 37°C) 95 fosfolipase D (6 uren bij 37°C) 80 lipase (6 uren bij 37°C) 111 6.7.3. Zuivering van Amphireguline.

30 Een samenvatting van Amphireguline-zuivering wordt gegeven in ta bel III. Een 1842-voudige zuivering met een opbrengst van 5,1% werd bereikt voor TSK 250-1-fractie en een 2270-voudige zuivering met een opbrengst van 1,7% werd bereikt voor de TSK 250-II-fractie. De methode is reproduceerbaar. Amphireguline werd bij vier verschillende gelegenheden 35 gezuiverd met analoge resultaten. De specifieke activiteit van gezuiverd 89 00 178 X > - 39 -

Amphireguline valt in een traject van 2,7 - 3,4 x 10^ eenheden/mg prote-ine. Gezuiverd Amphireguline uit de TSK-250-I-kolom met een specifieke β activiteit van ongeveer 3,0 x 10 werd gebruikt voor structurele bepalingen en andere biochemische studies.

5 TABEL III

Samenvatting van de zuivering van Amphireguline (GIA)

Fractie Volume Proteïne GIA* Specifieke Op- Zuivering (ml) (ug) (een- activiteit brengst (-voud) heden (eenheden (%) x 10~3) x 10“3 per 10 ____^___

Ruw 300 916.600 1363 1,49 100 1

Prep.Cl8

Doorstroom en was 950 532.000 1052 1,98 77,2 1,3

Prep, rp ODS 225 2.281 286 125,43 21,0 84,2 15 Semi prep.

rp.C18-I 20 339 '97 286,14 7,1 192,0 -II 20 235 92 391,49 6,7 262,7

Anal. rp

Cl8-1 6 242 50 206,61 3,7 138,7 20 -II 6 173 46 265,89 3,4 178,4 TSK 250-1 3,6 25,5 70 2.745,10 5,1 1842,3 I-A 1,6 6,6 15 2.272.73 1,1 1525,3 I—B 1,2 11,4 33 2.894,74 2,4 1942,8 25 I-C 0,8 7,5 22 2.933,33 1,6 1968,7 TSK 250-11 1,2 6,8 23 3.382,35 1,72270,0 * De details zijn vermeld in paragraaf 6.1.3. en de sub-paragrafen daarvan. Een GIA-eenheid werd gedefinieerd als de hoeveelheid factor, ver- 125 eist voor het inhibiteren van I-deoxy-uridine-opname in A431-cellen 30 door 50%.

6.7.4. Analyse van Amphireguline (AR) en S-gepyridylethyleerd

Amphireguline (SPE-AR) door HPLC._

Gelpermeatiechromatografie van AR en SPE-AR op een TSK 250-kolom (7,5 x 600 mm, Bio-Rad) wordt resp. getoond in FIG.5A en 5B. De activi-35 teit coëlueerde met de proteïnepiek (SA). Het molecuulgewicht van AR en 89 00178." '< Λ- - 40 - SPE-AR werd bepaald uit de gegevens in FIG.5 en bleek resp. ongeveer 14.000 en 17.000 te bedragen. Berekende molecuulgewichten voor de structuren van afgeknot AR en AR, getoond in FIG.12, zijn resp. ongeveer 8500 en 9100 dalton.

5 AR en SPE-AR elueerden als symmetrische enkelvoudige pieken uit een ultrapore RPSC C3 rp HPLC-kolom (4,6 x 75 mm, Altex) (FIG.6A en B).

De GIA coëlueerde met de proteïnepiek (FIG.6A). SPE-AR elueerde bij een acetonitrileconcentratie van ongeveer 21%, een ongeveer 4% hogere acetoni trileconcentratie dan het onbehandelde proteïne. Deze resultaten doen 10 vermoeden dat AR rijk is aan cysteine-resten, die gemodificeerd werden door 4-vinylpyridine en aldus AR meer hydrofoob maken en tevens doen elu-eren bij een hogere acetonitrileconcentratie.

6.7.5. SDS-PAGE-analyse van AR.

FIG.7A toont een analyse van AR, met N-Glycanase behandeld AR 15 (NG-AR), SPE-AR, en met N-glycanase behandeld SPE-AR (NG-SPE-AR) in 15% acrylamide onder reducerende omstandigheden (FIG.7A). AR en SPE-AR migreerden in het gel als een brede, diffuse enkelvoudige band met een mediaan relatief molecuulgewicht van 22.500 binnen een traject van ongeveer 20.000 tot 25.000 (wegen 1 en 3). De behandeling van AR en SPE-AR 20 met N-Glycanase resulteerde in een snellere migratie van deze proteïnen. NG-AR en NG-SPE-AR migreerden als een enkelvoudige band met mediaan molecuulgewichten van resp. 14.000 en 14.500 dalton. Analoge resultaten werden waargenomen wanneer proteïnen onder niet-reducerende omstandigheden in 15% gel werden geleid (gegevens niet getoond). De behandeling van AR 25 met neuraminidase, O-Glycanase of neuraminidase en O-Glycanase samen, bracht geen verandering in zijn elektroforetische mobiliteit in gel onder reducerende of niet-reducerende omstandigheden. Aldus is AR een gly-coproteïne met enkelvoudige keten, bevattende N-gebonden oligosaccharide-keten(s), die niet vereist zijn voor GIA van AR in vitro.

30 De behandeling van NG-AR of AR met fosfolipase D (PLD) (kool) re sulteerde in vermindering van GIA tot 80% van de controle. Met PLD behandeld NG-AR werd onderworpen aan rp HPLC op een C3-kolom, waarbij gezuiverde actieve pieken werden geanalyseerd op 20% SDS-PAGE (FIG.7B).

Een enkelvoudige band van Mr 5600 werd waargenomen. Deze resultaten to-35 nen dat PLD of verontreinigende protease(n) in het PLD-preparaat AR om- 89 00 178 Γ 1. ^ - 41 - zetten in een of meer actieve fragmenten.

6.7.6. Isoëlektrofocusserende-(IEF)-analyse van AR.

125 IEF-analyse van I-gelabelde AR werd uitgevoerd zoals beschreven in paragraaf 6.1.1.2. AR focusseerde als een enkelvoudige brede band 5 met P tussen 7,6 en 8 (FIG.8). NG-AR focusseerde als een enkelvoudige band met PI van ongeveer 8,05. Aldus is AR een basisch N-gebonden glyco-proteine met een enkelvoudige keten.

6.7.7. Biologische eigenschappen.

125

De inhibitering van I-deoxy-uridine-opname in DNA van A431-10 cellen door verschillende concentratie van het gezuiverde AR wordt getoond in FIG.9A. Een 50% inhibitering van DNA-synthese werd waargenomen bij ongeveer 0,2 ng/put. Aldus werd een 50% DNA-synthese-inhibitering in A431 menselijke epidermale carcinoomcellen gezien bij ongeveer 0,13 nM concentratie van zuiver proteïne. Het verdient echter opmerking dat GIA 15 van AR afhankelijk is van experimentele omstandigheden, zoals het aantal cellen/put (celdichtheid), tijd van factorapplicatie, duur van de behandeling, serumconcentratie en andere variabelen.

Wanneer A431-cellen werden gegroeid bij afwezigheid en aanwezigheid van diverse concentraties van AR en celgroei werd gevolgd door een 20 directe celtelling, bleek dat AR A431-proliferatie inhibiteerde op een 125 dosis-afhankelijke wijze (gegevens niet getoond). De mate van I-deoxy- uridine-opname in DNA is aldus een goede maat voor celgroei.

125

De stimulering van I-deoxy-uridine-opname in DNA van menselijke voorhuidfibroblasten (Sadamoto) door verschillende concentraties van 25 het gezuiverde AR wordt getoond in FIG.9B. Een tweevoudige stimulering 125 van I-deoxy-uridine-opname werd waargenomen bij ongeveer 0,7 ng/ml of ongeveer 0,05 nM AR. De maximum respons was ongeveer een zesvoudige 125 stimulering van I-deoxy-uridine-opname in deze fibroblasten. AR fungeert aldus als groeifactor voor menselijke fibroblasten, zelfs bij aan-30 wezigheid van 5% FBS.

125

Het effect van AR op de opname van i-doxy-uridine in DNA van diverse tumor en niet-tumor menselijke cellijnen en sommige niet-mense-lijke cellijnen werd onderzocht. De gegevens zijn vermeld in tabel IV.

AR inhibiteerde de groei van diverse clonen van A431-cellen, menselijke 35 borstcarcinoomcellen HTB 132, menselijke eierstok-teratocarcinoomcellen 89 00 178:

* J

- 42 - HTB 1575, menselijk epidermaal carcinoom van cervix-cellen CRL 155, menselijk papillair adenoom van eierstokcellen HTB 75, en menselijk adeno-carcinoom van borstcellen HTB 26. Het vertoonde geen significant effect op een variëteit van cellen (tabel 3). AR stimuleerde de opname van 125 5 I-deoxy-uridine in diverse menselijke fibroblastcellijnen, menselijke hypofysetumorcellen CRL 7386, menselijke eierstok-adenoomcarcinoomcellen .HTB 77, "African Green Monkey" niercellen BSC 1, en ratteniercellen SA6. AR had geen significante invloed op de proliferatie van T, B, of endo-theliale cellen. AR onderdrukte geen menselijke proliferatieve of cyto-10 toxische T-celresponsen in gemengde leukocytcultuurreacties (MLC).

AR is een monomeer proteïne, dat intraketen-disulfidebindingen nodig heeft voor activiteit, geen glycósylering nodig heeft voor activiteit, stabiel is onder matige zure en basische behandelingen en stabiel is bij verwarming gedurende 30 minuten op 56°C. AR verliest alle biolo-15 gische activiteit bij reductie, bij verhitting op 100°C gedurende 5 minuten, bij digerering met trypsine, endopeptidase Lys-C, endopeptidase ARG, of endopeptidase GLU.

TABEL IV

Effecten van Amphireguline op de proliferatie van cellen 20 Indicatorcellen Groei in- Groei sti- hibiteren- mulerende de activi- activiteit teit (een- (eenheden) heden) c_ _ humaan epidermoïde carcinoom van vulva A431 125 25 humaan adenocarcinoom van borst HTB 132 240 humaan epidermoïde carcioon van cervix CRL 1550 28 humaan papillair adenoom van eierstok HTB 75 19 humaan teratocarcinoom van eierstok HTB 1572 55 humaan adenocarcinoom van borst HTB 26 5 30 humaan melanoom A375 N.D. N.D.

humaan adenocarcinoom van borst ZR 75 30" N.D. N.D.

humaan adenocarcinoom van borst MCF-7 N.D. N.D.

humaan adenocarcinoom van long A549 N.D. N.D.

humaan adenocarcinoom van prostaat PC3 N.D. N.D.

35 humaan carcinoom van colon H3347 N.D. N.D.

89 00 17 8 Γ % *' - 43 - TABEL IV (vervolg) humaan lymfoblastoïde (T-cellen) CEM N.D. N.D.

humaan EBV getransformeerde B-cellen N.D. N.D.

humaan epidermaal carcinoom van larynx Hep 2 N.D. N.D.

5 humaan cervicaal carcinoom CRL 1594 N.D. N.D.

humaan adenocarcinoom van eierstok HTB 77 25 humaan voorhuid-fibroblasten (Sadamoto) 225 humaan voorhuid-fibroblasten (Goodwin) 70 rund foetaal hart-endotheliaal-cel N.D. N.D.

10 muis Balb/3T3 N.D. N.D.

aap "African green monkey" nier BSC-1 65 at nier SA6 45 a 125 eenheden (GIA op A431-cellen) AR werden gesuspendeerd in 250 yl proefmedium, serieel 5-voudig verdund met proef medium. Voor elke cel 15 werden zes verdunningen gebruikt. De fracties werden beproefd op groei modulerende activiteit en de GIA en GSA-eenheden werden berekend.

b Een GIA-eenheid werd gedefinieerd als de hoeveelheid factor, benodigd 125 voor inhibitering van I-deoxy-uridine-opname in cellen voor 50%.

c Een GSA-eenheid werd gedefinieerd als de hoeveelheid factor, benodigd 125 20 voor verhoging van I-deoxy-uridine-opname in cellen voor 100%.

N.D. = niet detecteerbaar.

Het effect van AR en EGF op NRK-SA6-celkolonievorming in zachte agar bij afwezigheid en aanwezigheid van TGF-/3 werd bepaald en de resultaten zijn vermeld in tabel V. EGF induceerde verankerings-afhankelijke 25 groei van SA6-cellen op dosis-afhankelijke wijze in tegenwoordigheid van TGF-yS, terwijl AR de SA-G-kolonievorming in zachte agar slechts zeer zwak bleek te induceren (tabel V).

TABEL V

Effect van AR en EGF op NRK-SA6-celkolonievorming in 30 zachte agar.

Toevoeging (per ml) Aantal kolonies per 6 vel den

Geen 0 TGF-/S (1 ng) 0 35 AR (2 ng) 0 89 00 178 / * * - 44 - TABEL V (vervolg) AR (4 ng) 0 AR (2 ng) + TGF-/3 (1 ng) 7 AR (4 ng) + HGF-fl (1 ng) 8 5 EGF (2 ng) 0 EGF (4 ng) 6 EGF (2 ng) + TGF-/3 (1 ng) 30 EGF (4 ng) + TGF-/3 (1 ng) 114 10 De proeven werden uitgevoerd zoals beschreven in de paragraaf.

Kolonies werden gedefinieerd als een cluster van tenminste 6 cellen.

6.7.8. Effect van AR op de binding van EGF aan zijn specifieke receptoren._ 125

Gevonden werd dat AR de binding van I-EGF aan A431-cellen en 15 aan A431-plasmamembranen inhibiteert (FIG.10). Een 50% inhibitering van 125 I-EGF-binding aan gefixeerde cellen en membranen werd waargenomen bij resp. ongeveer 1,1 nM en 1,8 nM EGF, terwijl een 50% vermindering in EGF-binding aan cellen en membranen werd waargenomen bij resp. ongeveer 125 1,8 nM en 5,7 nM AR. Ongelabeld EGF inhibiteerde de I-EGF-receptor 20 wisselwerking in beide systemen bij hogere concentraties volkomen. De maximum concurrentie met AR voor binding aan cellen en membranen bedroeg echter resp. 75% en 50%. De concurrentiecurven voor AR waren ook niet parallel aan die welke met EGF worden waargenomen. Deze resultaten doen vermoeden dat AR minder affiniteit voor EGF-receptoren vertoont dan EGF. 25 Ook zou de specifieke receptor van AR nauw verwant kunnen zijn met de EGF-receptor.

Verscheidene clonen van de A431-cellijn met variërende gevoeligheid voor AR-inhibitering werden geselecteerd en er werd een gebrek aan correlatie waargenomen tussen de gevoeligheid voor AR en het aantal EGF-30 receptor per cel of (tabel VI) 89 00 178.1 i *'

- 45 -TABEL VI

Gebrek aan correlatie tussen gevoeligheid voor AR van diverse A431-clonen en aantal van EGF-receptor A431-cloon EGF-bindingsparameters Relatieve gevoelig- 5 Bindingsplaatsen per cel K (NM) .

* D (GIA) voor AR

A-3 4,6 x 105 1,80 34 F-8 9,0 x 105 3,13 20 A-2 5,1 x 105 1,38 11 10 A-8 5,3 x 105 3,18 2

Diverse clonen van A431 werden geselecteerd door groei in zachte agar. EGF-binding geschiedde zoals beschreven in paragraaf 6.6.1.5. Κβ en aantallen bindingsplaatsen werden berekend uit Scatchard-grafieken (Scatchard e.a., 1949, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660 - 672).

15 6.7.9. Chemische structuur van Amphireguline.

De aminozuursequentie van AR werd afgeleid uit microsequentie-analyse van S-gepyridylethyleerd proteïne (SPE-AR) en fragmenten, gegenereerd door endoproteïnase Lys C, Staphylococcus aureus V8 en endopepti-dase Arg. De sequenties van het afgeknotte proteïne en het proteïne, dat 20 6 additionele aminozuren bevat, zijn als volgt:

Afgeknot AR

1 10 20 VVKPPQNKTE SENTSDKPKR KKKGGKNGK 30 40 50

25 NRRNRKKKNPC NAEFQNFCIH GECKYI

60 70 78

EHLE AVTCKCQQEY FGERCGEK

groter AR

30 1 10 20 SVRVEQVVKP PQNKTESENT SDKPKRKKK 30 40 50

GGKNGKNRRNR KKKNPCNAEF QNFCI

60 70 80 84

35 HGECKYIEHLEAVTC KCQQEYFGER CGEK

89 00 178? ♦ i - 46 -

In deze sequentie wordt de standaardafkorting tot één letter voor elk aminozuur gebruikt. Aminozuurresten, waarbij twijfel aan hun identiteit bestaat, worden tussen haakjes aangegeven. De letter "X" betreft aminozuur van onbekende identiteit. De hoeveelheid groter AR bleek onge-5 veer 16% te zijn van die van afgeknot AR.

De proteïnesequentie van AR werd vergeleken met alle proteïnen in de National Biomedical Research Foundation database (PIR 13); Genetic Sequence Data Bank (Bolt Beranek and Newman, Inc., Los Alamos National Laboratory; Release No.50) en de European Molecular Biology Laboratory 10 DNA Sequence Library (Release 7" No. 12). Dit onderzoek toonde dat AR een nieuw proteïne is en een lid van de EGF-superfamilie van groeifactoren. Deze familie omvat EGF (muis, humaan, rat, rund enz.), TGF-ct, virale groeifactoren (vaccinia, myxo en Shope fibroom), humaan plasminogen-activator, runderfactor IX, humane factor X, LDL-receptor, runderprote-15 ine C, humaan proteoglycan-kernproteïne, produkt van Drosophila Notch gen, produkt van C. elegans lin 12 gen, en het produkt van celafkomst specifiek gen van zeeëgel S_. purpuratus. Vergelijking van de AR-struc-tuur met de structuren van proteïnen uit de EGF-superfamilie tonen dat AR, evenals andere leden van de EGF-superfamilie, de kenmerkende zes es-20 sentiële cysteïneresten bevat, de instandhouding van afstanden van cyste-ineresten handhaaft en enige van de karakteristieke en hogelijk in stand gehouden aminozuren bevat. Het blijkt dat AR valt tussen de leden van de groeifactor familie, die eruit zien als EGF, TGF, en leden die eruit zien als MGF, SFGF, in het bijzonder in termen van het gebruik van aspa-25 ragine. Zo hebben b.v. op de plaats 2 (eerste cysteine = 1) alle TGF's en EGF's proline, heeft VGF glycine en hebben MGF, SFGF en AR asparagine. In dezelfde lus op de plaats 7, hebben EGF's, VGF's glycine, hebben TGF's glutamine en hebben MGF, SFGF en AR asparagine. In de derde lus heeft AR echter niet de in stand gehouden /3-draai op plaats 34 (een as-30 paragine in MGF, SFGF en een glycine in alle andere leden) , maar een glu-taminezuur (lage /3-draaipotentiaal). AR heeft een andere structuur voor de hogelijk in stand gehouden derde lus, die receptorbinding kan beïnvloeden. AR heeft niet de asparagineresten, die mogelijk in MGF en SFGF worden gebruikt als glycosyleringsplaatsen binnen de echte groeifactor-35 structuur.

89 00 178 .

X * - 47 -

De N-eindstandige sequentie van AR vertoont enige analogie met de N-eindstandige sequenties van TGF's, VGF en MGF in zoverre dat het rijk is aan prolinen, serinen en threoninen en evenals TGF’s en VGF mogelijke N-gebonden glycosyleringsplaatsen (in feite zulk een plaat heeft), als-5 ook de mogelijkheid voor O-gebonden glycosylering in deze regio, die rijk is aan serinen, threoninen en prolinen. Deze regio is hogelijk in stand gehouden tussen het N-eindpunt van de TGF-precursors en het N-eindpunt van VGF en blijkt een sterk geglycosyleerde regio te zijn.

- AR is een extreem hydrofiel proteïne, in het bijzonder in de re-10 gio die de aminozuren 8-45 bevat (FIG.2). Het hydropathieprofiel van AR vertoont weinig gelijkenis met die van de andere leden in de EGF-familie. Het hydropathieprofiel van het C-eindstandige gedeelte van AR is, hoewel structureel verwant met andere leden van de EGF-familie, niet gelijkend op de profielen van andere leden van deze familie (FIG.11b en 15 C).

6.7.10. AR bindt DNA specifiek.

125 I-AR werd op de in paragraaf 6.6 beschreven wijze beproefd op zijn vermogen om cellulose, gedenatureerde DNA-cellulose en natieve DNA-cellulose te binden. De in FIG.14A weergegeven resultaten tonen dat AR 20 zowel gedenatureerde als natieve DNA-cellulose specifiek bindt, maar zich niet aan cellulose bindt. De binding aan natieve DNA was 3- tot 4-maal zo groot als de binding aan gedenatureerde DNA.

Het vermogen van AR om DNA specifiek te binden onderscheidt AR van alle andere leden van de EGF-superfamilie. Zo is b.v. EGF niet in 25 staat om DNA-cellulose te binden (FIG.14B). De resultaten steunen in sterke mate het vermoeden dat het hydrofiele 45 aminozuur N-eindstandige gebied van AR, dat niet aanwezig is in EGF of in andere leden van de EGF-familie, een nucleaire lokaliseringssequentie kan zijn, die betrokken is bij het richten van AR op de kern, waar de factor in wisselwer-30 king treedt met DNA.

7. VOORBEELD: Antilichamen voor Amphireguline.

De produktie van antilichamen voor AR en synthetisch AR en AR-precursorpeptiden wordt in de volgende sub-paragrafen beschreven.

7.1. Materialen en methoden.

35 7.1.1. Peptidesynthese in vaste fase.

Amphireguline werd geproduceerd en gezuiverd op de in paragraaf 8306178.

+ * - 48 - 6 beschreven wijze. Vijf peptiden, overeenkomende met resten 31 - 50 (No. 279), 71 - 90 (No. 280), 108 - 130 (No. 264), 166 - 184 (No. 259) en 221 - 240 (No. 281) van de primaire AR-structuur (FIG.15) werden volgens vaste-fasentechnieken gesynthetiseerd op een Applied Biosystems 5 Ine. automatische peptidesynthetisator, in wezen zoals beschreven (Merrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149). Gesynthetiseerde peptiden werden gesplitst van harsdragers volgens een hoge HF-splitsings-procedure (Tam e.a., 1988, J, Amer. Chem. Soc. 105: 6442). De synthetische peptiden werden gezuiverd door omgekeerde-fase HPLC.

10 7.1.2. Antilichaamproduktie.

Polyclonale antisera voor rijp AR en synthetische AR-peptiden, chemisch geconjugeerd met "keyhole limpet"-hemocyanine (KLH) werden bereid in jonge volwassen Nieuw Zeelandse witte konijnen. De synthetische peptiden werden met KLH geconjugeerd zoals beschreven (Ishikawa e.a., 15 1983, Immunoassat 4: 235); rijp AR werd niet gekoppeld.

AR of peptideconjugaten werden geëmulgeerd met Ribi-hulpstof-systeem (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT). Aan elk konijn werd een totale dosis van 1 ml toegediend: 0,8 ml intramusculair op twee plaatsen in elke achterpoot en 0,2 ml subcutaan op één plaats.

20 Voor het genereren van antisera tegen rijp AR werd 30 yg rijp AR gebruikt voor de primaire inoculering en werd 15 yg gebruikt voor de daaropvolgende booster-injecties. Voor het genereren van antisera tegen de synthetische AR-peptiden werd 100 yg geconjugeerd peptide gebruikt voo.r de primaire inoculering en 50 yg voor de daaropvolgende boosters.

25 Booster-inoculeringen werden elke 3-4 weken toegediend en 10 - 14 dagen na de boosterinjecties werd bij de konijnen bloed afgetapt.

7.1.3. Immunoprecipitatie.

125 AR werd voorzien van een radiolabel met I onder toepassing van de chloramine T-methode (Barridge, 1978, Methods Enzymol. 50: 54 - 65).

30 10 ul polyclonaal serum (of verdunning in PBS) werd gecombineerd met 125 10 yl I-AR (50 ng/ml, specifieke activiteit 425 yCi/yg) en 30 yl PBS. De combinatie werd beproefd zoals beschreven (LeBier e.a., 1982, J. Immunol. 129: 2287 - 2292).

7.1.4. Radio-immunoproef.

125 35 Polyclonale sera werden 1 : 50 verdund in PBS. I-AR (1 yg/ml, 89 00 178 Γ

Jr * - 49 - specifieke activiteit 425 yCi/yg) werd 1 : 200 verdund met TNEN/0,1% BSA (20 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% NP-40, 0,1% BSA).

10 ul ongelabeld AR (1 mg/ml), 10 ul verdunde polyclonale sera en 30 ul 125 verdund I-AR werden gecombineerd en gedurende 45 minuten bij kamer-5 temperatuur geïncubeerd. Proteïne A-sefarose-oplossing werd als volgt bereid: 200 mg droge Pharmacia proteïne A-sefarose werd herhydrateerd met 1,4 ml PBS, waarna 80 yl van het herhydraat werd gewassen en verdund tot 400 yl met een oplossing, die 100 mM TRis pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 2 mM PMSF, 1% Aprotinine en 0,5 yg/ml Levpeptine bevatte.

10 Vervolgens werd 20 yl proteïne A-oplossing toegevoegd aan het mengsel dat gedurende 30 minuten werd geïncubeerd. De sefaroseparels werden tweemaal gewassen met 500 yl TNEN/0,1% BSA, hersuspendeerd in 50 yl SB (80 mM Tris pH 6,8, 3% SDS, 15% glycol, 0,01% broomfenolblauw, 5% /3-mercaptoëthanol) en gedurende 5 minuten op 100°C verhit. Monsters werden 15 gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistoffen werden beproefd op radioactiviteit in een gamraa-teller. Bij deze procedure werd zo weinig als 100 pg AR gedetecteerd.

7.1.5. Enzyme-gebonden immunosorbentproef.

De micro-ELISA-procedure in vaste fase uit de Amerikaanse oc-20 trooiaanvrage 740.124, ingediend op 30 mei 1985, werd gemodificeerd.

Terasaki microschotels werden gereed gemaakt door toevoeging aan elke put van 5 yl AR-synthetische peptiden, in PBS verdund tot diverse concentraties, waarna men de oplossing overnacht bij kamertemperatuur liet drogen. 5% Blotto in PBS werd aan de platen toegevoegd, die gedurende 25 1 uur bij kamertemperatuur met rust werden gelaten. Vervolgens werden 10 yl verdunningen van polyclonale antilichaamoplossing (verdund in PBS/ 1% Blotto/0,05% Triton X-100) aan elke put toegevoegd, gedurende 1 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur en dan viermaal gewassen met PBS. 5 yl peroxydase-geconjugeerde geite-anti-konijne-IgG (Cappel) werd bij een 30 verdunning van 1 : 1000 in PBS/1% Blotto/0,05% Triton X-100 aan elke put toegevoegd, 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens zesmaal met PBS gewassen. 10 yl MicroEIA Chromogan Solution (Genetic Systems Corp.) werd toegevoegd in een 1 : 20 verdunning en vervolgens werd na 20 minuten en na 40 minuten bij OD^^ volgens het Genetic 35 Systems Micro-EIA-protocol het absorberend vermogen afgelezen.

89 00 178 Γ

< I

- 50 - 7.1.6. Western-blotting.

Monsters werden onderworpen aan elektroforese op een 15% poly-acrylamidegel of een 16% tricinepolyacrylamidegel, en een BioRad-mini-gel-apparaat. Vervolgens werd het gel naast een vel nitrocellulose ge-5 plaatst en zodanig in de cassette geklemd dat het nitrocellulosevel zich aan de kathodische zijde bevond. Proteïnetransport geschiedde gedurende 30 minuten onder toepassing van een stroomsterkte van 400 mA bij een constant vermogen. De nitrocellulose werd vervolgens verwijderd en overnacht bij 4°C geweekt in 2,5% Blotto/PBS/0,2% NP-40.

10 Het nitrocellulosefilter werd vervolgens gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur op een schommelplatform blootgesteld aan antiserum, verdund in 2,5% Blotto/PBS/0,2% NP-40-reactiebuffer, gevolgd door viermaal wassen (5 minuten voor elke was) in 2,5% Blotto/PBS/0,2% NP-40.

Aan het nitrocellulosevel werd vervolgens alkalische fosfatase-15 geconjugeerd Proteïne A (Cappel), 1 : 500 verdund in 2,5% Blotto/PBS/ 0,25% NP-40, toegevoegd, waarna gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur op een schommelschotel werd geïncubeerd. Het filter werd daarna viermaal gewassen (3 minuten voor elke was) met PBS/0,2% NP-40, gevolgd door 5 minuten in "APS"-buffer (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM 20 MgC^). Het filter werd ontwikkeld in kleurreagens (40 ml APS-buffer, 12 mg 5-broom-4-chloor-3-indoylfosfaat (Sigma), 6,8 mg nitroblauw-tetrazolium (Sigma), vlak voor het gebruik bereid en gefiltreerd door een 0,2 ym filter) afgeschrikt met H^O en dan aan de lucht gedroogd.

7.2. Karakterisering van AR-antilichamen.

25 Polyclonale sera, verkregen tegen rijp AR en synthetische AR- peptiden werden gekarakteriseerd door radio-immunoprecipitatie, radio-immunoproeven, ELISA, en "Western blotting". De resultaten zijn vermeld in tabel VII.

89 00 178 Γ λ -¥

- 51 -TABEL VII

Karakterisering van antilichamen voor AR en synthetische AR-peptiden

Polyclonale sera Methode

5 V°°r _ RIP RIA ELISA WB

rijp AR 1 : 256& 1 : 250 ND 1 : 250 (0,100 pb)B (1 ng)

peptide 259 1 : 256 ND ND ND

peptide 264 1 : 256 1 : 250 1 : 100 1 : 100 10 (0,100 pb) (5 ng) (0,1 ng) 1 : 500 (1 ng)

peptide 279 ND ND 1 : 100 ND

(5 ng)

15 peptide 280 ND ND 1 : 100 ND

(5 ng)

peptide 281 ND ND 1 : 100 ND

(5 ng) a Verdunning van antisera vereist- 20 De waarden tussen haakjes zijn een aanwijzing voor de gevoeligheid van de methode.

RIP = radio-immunoprecipitatie.

RIA = radio-immunobeproeving.

ELISA ="enzyme linked immunosorbent assay" 25 WB ="Western blot" ND = niet bepaald.

8. VOORBEELD; cDNA-clonen van de Amphireguline-precursor.

Het volgende voorbeeld beschrijft het clonen en de analyse van cDNA's, die de Amphireguline-precursor uit met TPA behandelde MCF-7 30 menselijke borstcarcinoomcellen coderen.

8.1. Materialen en methoden.

8.1.1. RNA-bereiding.

RNA werd geïsoleerd uit subconfluente cellen, gegroeid in Tl50 weefselcultuurflessen, of uit vers bevroren weefselmonsters onder toepas-35 sing van de Guanidinum-methode, zoals geschreven door Chirgwin (1979, 89 00 178.

« * - 52 -

Biochemistry, 18, 5294). Cellen uit vier TISO's werden gewassen in PBS, getrypsiniseerd, opnieuw gewassen in PBS, en hersuspendeerd in 8 ml 4 M guanidiniumisothiocyanaa toplos sing. DNA werd af geschoven door de oplossing door een naald met maat 18 te voeren. Het monster werd gelegd 5 over 2,4 ml 5,7 M CsCl in een Beekman SW4lTi-buis en werd gedurende 20 uren bij 20ÖC bij 32.000 omwentelingen/minuut gecentrifugeerd. Het vaste materiaal werd opnieuw gesuspendeerd in 300 yl 2,5 M CsCl en bij kamertemperatuur met 2 volumes ethanol geprecipiteerd. Het vaste materiaal werd opnieuw gesuspendeerd in 300 yl H^O, waarna 35 yl 3 M natriumace-10 taat (pH 5,2) en 800 yl ethanol werden toegevoegd en het RNA bij -70°C werd geprecipiteerd. De precipitatie werd herhaald en het RNA werd kort gedroogd, opnieuw gesuspendeerd in 100 yl ^0, gekwantiteerd bij OD260 en bij -70°C bewaard.

32 8.1.2, "Random Primed Labeling 11 met P-TTP.

15 Van AR coderende regio werden specifieke fragmenten uitgesneden 32 uit lage geltemperatuur-agarose (BioRad) en gelabeld met P-TTP (NEN, 3000 Ci/mmol) onder toepassing van de "random primed" methode, ontwikkeld door Feinberg (1983, Anal. Biochem., 137, 266). Onopgenomen deoxy-ribonucleosiden werden verwijderd door chromatografie op een 1,5 ml.

9 20 Sephadex 50-kolom. Specifieke activiteiten waren typisch 0,5 - 2,5 x 10 cpm/yg.

8.1.3. RNA-gels en "Northern blot"-analyse.

10 of 20 yg totaal RNA werd onderworpen aan elektroforese op 1,2% agarose/formaldehydegels voor Northern-analyse. De agarose/formalde-25 hydegels werden bereid in 40 mM N-morfolinopropaansulfonzuur (MOPS), pH 7,0/1 mM EDTA/10 mM natriumacetaat/2/2 M gedeloniseerd formaldehyde (pH 5,6) in een IBI VCV-gelapparaat met gematteerde platen. RNA werd in dezelfde buffer gedenatureerd met 50% formamide bij 65°C en geleid in 1 x MOPS bij 20 - 30 mA gedurende 3-5 uren. Het gel werd gedurende 30 10 minuten gespoeld in 10 x SSC en overgebracht naar Hybond-N-membranen (Amersham), UV-dwarsverknoopt (1200 yJoules), geprehybrïdiseerd en gehy-bridiseerd in 5 x SSPE (1 x SSPE is 0,18 M NaCl/10 mM natriumfosfaat, pH 7,7, 0,1 mM EDTA), 5 x Denhardt's, 0,5% SDS, en 20 yg/ml gedenatureerde zalme-sperma DNA als drager. De hybridiseringen werden gedurende 6 32 35 16 uren bij 42°C uitgevoerd met 2 x 10 cpm/ml van de P-ARBPl. De 89 00 178 / - 53 - I * "blots" werden enige malen gewassen in 2 x SSC met 0,1% SDS bij kamertemperatuur, gevolgd door 1 x SSC/0,1% SDS, 65°C, en belicht op Kodak X-OMAT met twee Dupont Lightning Plus intensiferingsschermen bij -70°C. Banden werden genoteerd als (+) indien duidelijk zichtbaar na belichting 5 overnacht, (+/-) indien zichtbaar na 3 dagen belichting en (++) indien detecteerbaar na 6 uren.

8.1.4. cDNA-clonen.

MCF-7-cellen werden geoogst voor RNA na behandeling met 100 yg/ml 12-0-tetradecanoyl-forbol-13-acetaat (TPA) gedurende 24, 40 en 72 uren.

10 Poly(A)+RNA werd geïsoleerd uit gecombineerde porties van deze monsters en werden gebruikt als templaat voor dubbel-strengige cDNA-synthese, in wezen zoals beschreven {Gubler en Hoffman, 1983, Gene 25: 263).

G-staartig cDNA werd geligeerd in de EcoRI-plaats van A gtlO met behulp van BRl oligonucleotide-adapters (Rose e.a., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci.

15 U.S.A. 83: 1261 - 1265).

Met 5 yg TPA behandeld MCF-7 poly(A)+RNA werd door warmte gedenatureerd en geprepareerd met 5 yg Oligo(dT) onder toepassing van 100 eenheden reverse transcriptase in een reactievolume van 45 yl. De synthese van de tweede streng geschiedde met 4 eenheden RNase H en 115 eenheden 20 E. coli DNA pol I. 10 yg T4 DNA polymerase werd gebruikt ter verwijdering van 3' uitsteeksels, waardoor stompe uiteinden werden gevormd. De gehele 6,8 yg dubbelstrengig cDNA werd naar grootte gesorteerd over een Sephadex G5Q-kolom ter selectie van cDNA's van meer dan 500 bp, waarna 150 ng cDNA werd dG-gestaart met terminale deoxynucleotidyltransferase.

25 Het dG-gestaarte cDNA werd geligeerd met de EcoRI-plaats van λ gtlO

met behulp van BRl-adapters (AATTCCCCCCCCCCCC). Geligeerd DNA werd verpakt in vitro (Grosveld e.a., 1981, Gene 13: 227 237) en geplateerd op _ 0 E. coli C600 rK mK hfl met een efficiëntie van 10 recombinanten/yg cDNA. Duplo nitrocelluloselifts werden genomen op 2,5 x 10^ recombinan- 32 30 ten en filters werden gescreened met ( P)-gelabelde "best guess" en gedegenereerde oligonucleotidesonden (tabel VIII) afgeleid van de AR primaire sequentie zoals bepaald door geautomatiseerde Edman-degradatie van met N-Glycanase behandeld-gereduceerd en S-gepyridylethyleerd AR (paragraaf 6).

89 00 178."

* J

- 54 - ί·—*

0 /-N O

H O' O'

•p -H *H

Φ cd Ό Ό 4-1 W 3 3

O' Cl) O O

CC O > 0> ol O' Φ φ cs i im I un co iO O' ^ cm φ CO Ol S w w

O

U U O

< U U

a

O CO

h a u - r

< W Eh W EH

Eh '-'O

U

2 &h O O

Eh U O O O

a u

Ol [h u a

O EH O O O

Eh <

H - fa a O O

h en - a ^ ^ H

> un O O

«— ^ u ^ >h Eh « Eh H Eh ^ f£ ü

3 '-'C —o U - PiOHEH

m til U O

< Eh U Eh U <C -ï „ - .

Eh WB W Eh a U « B O Ü

^ Wü O O ~ B W B O CJ

Eh O < <, O .

OiEn H 3 E §h U U „ U r a 0 Eh Eh ^ ^ U ^ rfj φ eh u a o u o •3 a η oowB a u +J U a < U 1B EH >H eh

ti CO f=C

Φ a U Eh U Eh O

0 u u 2Eh Pi o ucj u p 01 a Eh U U W Eh W Eh

Φ U U

W Eh U<0 O a ^

WEh OU 2 Eh CC Eh O

Eh a Eh U h 3 a Eh

Eh O

rtJU Eh O O O —-

UU w Eh !*$ Eh H a >h ü> U

a O Eh EH'-aag 01 Ol Ol Ol Ό rH CO 5 <“< «Ή

0 m co ro 'nT

φ q Q en '2 2 SS g 3 g g c o Φ O' -3

Ό Φ W

CO ,¾ o Φ w w O - 89 0 0 17 8.' i * - 55 - σ> m

O

H E-t O

O

Ui O

<

O

w B

E-> O E-i O — * B £ g o o Q t* X U &

O O

OJ E-« CU O O O

p U

CU O W ^

O B

o p

O. O Q B O U

O < t4 Eu Cfl ü t< <

u O

> < El O U

0 P

> S 2 u m 89 00 178.' • *' - 56 -

Restrictie-analyse toonde een schaarste aan plaatsen in de CDNA-inlas van pARl met enkelvoudige plaatsen voor Bsml, EcoRV, Hgal, Nael, PvuII, Smal en SstI, en twee plaatsen voor Sspl. Geen digerering binnen de inlat vond plaats met BamHI, Clal, EcoRI, HindlII, Kpnl, PstI, Pvul, 5 Sphl, Stul en Xbal. Een 170 bp Bsml tot PvuII-fragment werd geïsoleerd en gebruikt voor sondering van een tweede cDNA-reeks van 100.000 recombinanten, die op de bovenbeschreven wijze waren gemaakt. Er werden 13 positieve clonen geïdentificeerd met inlassen variërend van 300 bp tot 1,3 kb, waarvan zes groter waren dan 1 kb en vijf die een enkele Sstl-10 plaats bevatten, waarvan bekend is dat deze zich 100 bp vanaf het 5'- uiteinde van pARl bevindt. Vier van de laatstgenoemde vijf inlassen werden gebruikt voor sub-clonen (PAR3, pAR5, pAR9, pAR13) voor verdere restrictie- en sequentie-analyse, Al deze clonen hadden identieke res-trictiepatronen op basis van Bsml, EcoRV, PvuII, SstI en Smal, behalve 15 pAR9, dat een 3'-afknotting van 100 bp had eh later afkomstig bleek te zijn van een A^-track, waarschijnlijk voldoende voor preparering met oligo(dT).

8.2. Nucleotide-sequentieanalyse van AR cDNA-clonen.

Exacte oligonucleotide-primers werden gebruikt voor het sequenti-20 eren van beide strengen van de 1.230 bp pARl-cloon volgens de dideoxy-keten-termineringsmethode (Sanger e.a., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463 - 5467). Het volledige nucleotide en de gededuceerde aminozuursequentie van cloon pARl worden getoond in FIG.16. Een open leesfreem van 965 bp begint bij nucleotidenummer 1. De eerste AUG ligt 25 op positie 210, maar komt niet overeen met de Kozak optimale consensus voor translationele startplaatsen (Kozak, 1984, Nucleic Acids Research 12: 857 - 872; Kozak, 1986, Cell 44: 283 - 292) als gevolg van de afwezigheid van een purine op de positie -3. Niettemin kunnen dergelijke AUG-triplets fungeren als initiatorcode, zoals Kozak in ongeveer 3% van 30 de onderzochte boodschappen waarnam, en van mogelijk belang is de aanwezigheid van een adenosine op de positie -1 in al deze "minder begunstigde" AUG's en in het mRNA van AR. Hoewel een tweede methionine zich bevindt bij nucleotide 378, hetgeen niet overeenkomt met de initiatorcon-sensussequentie, wordt aangenomen dat het eerste AUG de werkelijke trans-35 lationele startplaats is, daar het wordt gevolgd door een voorspeld tra- 89 00 17$: X * - 57 - ject van 19 aminozuren van hoofdzakelijk hydrofobe resten, onderbroken door drie prolinen, typisch van een signaalpeptidesequentie (Heijne, 1983, J. Biochem. 133: 17 - 21).

Het langste open leesfreem, dat begint met een methionine, co-5 deert een 252 aminozuurpolypeptide, dat het 19-rest signaalpeptide omvat. De coderingssequentie wordt voorafgegaan door 209 nucleotiden van 5'-ongetranslateerde sequentie en wordt gevolgd door een translationeel termineringssignaal, TAA, en 262 nucleotiden van 3'-ongetranslateerde sequentie. Een mogelijke poly(A)additiesignaalsequentie, AATAA, bevindt 10 zich 64 nucleotiden stroomopwaarts vanaf een traject van 15 adenylaat-resten, die waarschijnlijk de poly(A)staart vormen. De AR 3' ongetranslateerde regio bevat vier kopieën van de sequentie ATTTTA, die ook aanwezig is in bepaalde lymfokinen, cytokinen en proto-oncogenen. In GM-CSF bemiddeld RNA destabilisering en degradering (Shaw, 1986, Cell 46: 15 659 - 667). Het behoud van dit motief in functioneel analoge moleculen doet vermoeden dat AR eveneens verwant kan zijn met deze klasse van lymfokinen .

De cDNA-sequentie bevestigt de rijpe AR-peptidesequentie (paragraaf 6) behalve bij aminozuurpositie 113 (FIG.15) die door proteïne-20 analyse was gesequentieerd als aspartinezuur (D) en was gededuceerd als asparagine (AAT = N) uit de cDNA-clonen. Van de vijf onderzochte cDNA's hadden alle hun 5'-uiteinde binnen de eerste 25 bp van de dARl-sequentie.

Vergelijking van de cDNA-sequentie met de "best guess"-sonderingen toonde 74% (ARK41) en 77% (ARK31) totale homologie. Geen van beide 25 sondes vertoonde in meer dan acht opeenvolgende bp overeenstemming, maar in totaal produceerden 50 van 67 nucleotiden, gealigneerd voor ARK41, een detecteerbaar signaal onder omstandigheden van zeer geringe restrictie. Het code-gebruik door AR mRNA-sequentie verschilt aanzienlijk van de gebruiksfrequenties, gerapporteerd door Lathe (Lathe, 1985, 30 J. Mol. Biol. 183: 1 - 12), hetgeen verklaart waarom de gedegenereerde oligonucleotiden in dit geval sterkere signalen leverden. Uit de cDNA en proteïne-sequenties vallen twee proteïnen met molecuulgewicht van 9772 en 9173 te voorspellen voor de twee vormen van rijp AR op basis van de cDNA (FIG.16) en proteïne (paragraaf 6.7.9.) sequentie. Het hydropa-35 thieprofiel van de AR-precursor is afgebeeld in FIG.11D.

89 00178.’ » Λ - 58 -

De AR-precursor heeft drie mogelijke N-glycosyleringsplaatsen, één in het N-terminale domein (positie 30 in FIG.16) en twee in de hydrofiele regio van rijp AR (posities 113 en 119). Glycosylering draagt naar bekend 10 - 12 kd bij aan het molecuulgewicht van rijp AR en treedt 5 waarschijnlijk op door koolhydraatadditie aan één plaats of beide plaatsen in de hydrofiele regio.

Het N-terminale serinerijke domein van de AR-precursor (FIG.15) 81 83 87 bevat drie mogelijke tyrosinesulfateringsplaatsen bij Y , Y en Y , op basis van de aanwezigheid van zure resten, draai-inducerende amino-10 zuren en de afwezigheid van resten die zouden kunnen oijdragen aan ste-rische hindering (Huttner, 1987, TIBS 12: 301 - 303). De meeste tyrosi-ne-gesulfateerde proteïnen zijn afscheidende proteïnen. Van tyrosine-sulfateringsmodificaties wordt verondersteld dat zij betrokken zijn bij activering, transport of proteolytische behandeling van precursorprote-15 inen. Het serinerijke domein van AR kan ook O-gebonden koolhydraatketens bevatten gezien de overvloed van serine/threonineresten (23 van 81) in deze regio van het‘molecuul, die plaatsen zijn voor zulke bindingen. Wat dit betreft zijn Q-geglycosyleerde vormen van een ander lid van de EGF-familie, TGF-Q(, geïdentificeerd (Ignotz e.a., 1986, PNAS, 83, 6307.-20 6311).

Geen van de serineresten in de AR-precursor voldoet aan de con-sensussequentie voor cAMP-afhankelijke kinasefosforyleringsplaatsen (Grima e.a., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 617 - 621) en evenmin vertoont een van de tyrosineresten flankerende sequentie-gelijkenis 25 met bekende fosfortyrosineresten.

Het hydrofiele domein van het rijpe AR-proteïne is samengesteld uit talrijke positief geladen aminozuren (16 van 37 resten zijn lysine of arginine), waaronder twee opeenvolgende trajecten van 4-5 basische geladen resten. Het kernrichtende signaal van SV40 groot T-antigen ge-30 lijkt op deze regio van AR en bevat een karakteristieke KKKRK-sequentie, voorafgegaan door kleine aminozuren (glycine, alanine, proline), die de vorming van een o(-spiraalvormige structuur mogelijk maken (Burglin e.a. 1987, EMBO 6: 2617 - 2625; Dingwall e.a., 1987, EMBO 6: 69 - 74). Mutatie-analyse definieerde vier opeenvolgende basische resten als het 35 overwegende aspect van de SV40-kernlokaliseringssequentie (Lanford, 1984, 09 00 178.' - 59 -

Cell/ 37, 801 - 813). Andere nucleaire proteïnen met soortgelijke trajecten van basische aminozuren, waarvan wordt aangenomen dat zij betrokken zijn bij de kernrichting, omvatten nucleoplasmine, polyoma-virus groot T, histonen en c-myc. Fusie van diverse nucleaire signaalsequen-5 ties aan de genen voor kippe-pyruvaatkinase, albumine, immunoglobuline, ferritine en /3-galactosidase resulteert in de lokalisering van deze overigens cytoplasmische proteïnen in de kern (Moreland, 1987, Mol. CelL Biol. 7: 4048 - 4057). Of de hydrofiele sequenties in AR betrokken zijn in het richten van deze groeimodulator op de kern werd niet geverifi-10 eerd; het vermogen van AR tot specifieke binding van DNA houdt echter in, dat AR een functionele rol binnen de kern heeft. In dit verband kan AR DNA-synthese, de celcyclus of een variëteit van andere nucleaire gebeurtenissen reguleren.

De TGF-Af-precursor bevat een aantal cysteïnen in het C-terminale 15 cytoplasmische domein, waarvan sommige covalente palmitaatbinding ondergaan (Bringman, 1987, Cell, 48, 429 - 440). In tegenstelling daarmee heeft de AR-precursor geen cysteïnen in zijn cytoplasmische domein, zodat niet kan worden verwacht dat het palmitaatresten bevat. Hoewel de biologische functie van een palmitaataanhechting onbekend is, betekent 20 dit een verder verschil tussen AR en andere leden van de EGF-superfami-lie.

8.3. Celvormige bronnen van Amphireguline-synthese.

"Northern blot"-analyse (Thomas, 1980, PNAS, 77, 5201) onder toe-32 passing van Af- p-gelabelde AR cDNA-fragmenten toonde hybridisering 25 tot een enkele 1,4 Kb RNA-speciës uit een variëteit van normale humane weefsels en tumorcellijnen. Op Northern blots werd een enkele band waargenomen bij gebruik van hetzij AREB1 (een 480 bp BstEII - PvuII-fragment van pARl, dat de gehele coderende regio van rijp AR en een deel van de N-terminale precursor- en transmembraandomeinen bevatte) hetzij AR 170 30 (een 170 bp Bsml - PvuII-fragment van pARl, dat slechts de C-terminale helft van rijp AR bevatte) als gelabelde.sondes. De in tabel IX vermelde resultaten tonen dat laag-niveau expressie (+) van AR RNA werd waargenomen in normaal volwassen long- en pancreasweefsel. Geringere, maar detecteerbare expressie (+/-) werd waargenomen in normaal nier-, lever-35 en hersenweefsel.

89 00 f78.

* *

- 60 -TABEL IX

Normaal humaan weefsel AR RNA

long + lever +/- 5 pancreas + nier +/- milt hersenen +/- placenta 10 ingewanden, foetaal

Daar AR oorspronkelijk werd geïsoleerd uit met TPA behandelde MCF-7-cellen was het van belang het tijdsverloop voor TPA-inductie van AR RNA in deze cellen vast te stellen. MCF-7-cellen werden gedurende 0, 1, 3, 6, 18, 24 en 48 uren behandeld met TPA, waarna het totale RNA 15 werd geïsoleerd en 10 yg daarvan werd geleid op elk pad van een 1,2% formaldehyde-agarosegel, overgebracht naar nylonmembranen en gescreend met ARBPl-sonde, complementair met de gehele coderingsregio van rijp AR. Reeds 1 uur na de behandeling met TPA werd een indrukwekkende toename in de 1,4 kb AR RNA-speciës waargenomen, terwijl maximale niveaus tus- 20 sen 18 en 24 uren werden bereikt. Daaropvolgende Northern blots, geson- 32 deerd met P-ARBPl toonden TPA-stimulering van de AR RNA-synthese in andere borstkankercellijnen, hoewel de maximale niveaus nooit zo hoog waren als in de met TPA geïnduceerde MCF-7-cellen.

Een reeks van tumorcellijnen werd voor en na 24 uren inductie met 25 TPA beproefd op AR RNA-niveaus. De resultaten zijn vermeld in tabel X. Met slechts enkele uitzonderingen waren de enige bronnen van detecteerbaar AR RNA in humane borstkankerlijnen, behandeld met TPA. Een dergelijke uitzondering is Caki-1, een humane heldere niercarcinoomcellijn, die constitutief hoge niveaus van AR RNA tot expressie brengt, die ver-30 gelijkbaar zijn met de hoeveelheden, die in de met TPA geïnduceerde MCF-7-cellen worden waargenomen. Alle onderzochte, met TPA behandelde borstkankercellijnen vertoonden AR-specifieke hybridisering.

AR speelt kennelijk een functionele rol in de volwassen long, pancreas, nier, lever en hersens en is mogelijk betrokken bij een grote 35 variëteit van processen, waaronder wondgenezing, weefselregeneratie en onderhoud van neuronale cellen.

89 00 178.’ Λ * ’ - 61 - Ό

U

ο ο u 3 + φ ΐ + + + + + + + + 11 + 11 + ο> ι < Λ ι ΕΗ 3 3 ο > *α •η μ β α> 3 C α 2 3 .

« Ό +

(*.5+11+ + 111+ I I ι 1 I I

< 3 θ' s ο ε >1 Λ S Η Ο 3 ο 3 3 ω 6 6 Τ* a α ο ο ο π g B 0 0 6 6 £ - 8 * 8 ·Η ·5 Ο 3 0 ο ο ¢3 +> £ .5 8 8 -5 S ·5 η ® 8 5 3 8 ® ο 330+»0 6®“·^ jS ^ ? η < 3--10054354600 3 0 μ η η

£ nJHfi-4333 3. 00 +> Sj 3 U O O

B O33--4O+>O0S033^0- m^o g g 3 3 § § § -5 3 £ 3 8 i -S o 3 S' «SHI-SS-SSSSJSSSog-e

g ï « -o 6 3 » 3 3 o o | | „ g g | I

rv .Jivrjijij Λ) 1) 4J ·Η ^Μ · ✓n Qj n IT

g* 333WmÜ33MM.336£;0£M

U 3 54 3 3 3 3 3 0 3 ^d'S o'io 8 8 8 8 8 8 λλο'β ι—i s w 3 3 > ^ r- _ £ N N ~ γ-

e 2 S S g ° ~ S

•5> cm g ^ S 2; 2 2 bi m s e·. r·*· ε β t* w , j ο g g ~ S ïï $ ~ Ë £ — Ö ce 6

“ 5g,ii 7 * ~ - i-H-S

c t^Sr-SS eti r~- η ι g <n S t 7 «ϊ ι \ 3 <3- ι -rt SB o a m i c tl J I «£ ι ι ϋ λ: iTrew^Jg I Igsii as s b s s i s i s » 89 00178.

« τ - 62 - 9. VOORBEELD; Genomisch clonen en analyse van het AR-gen.

Het volgende voorbeeld beschrijft het genomisch clonen van het humane Amphireguline-gen, zijn structuur en intron/exon-organisatie.

Ook worden functionele en evolutionaire implicaties met betrekking tot 5 de EGF-superfamilie van groeifactoren besproken.

9.1. Materialen en methoden.

9.1.1. Southern blot-hybridiseringen.

Het totale genomische DNA werd in Tl50-weefselcultuurflessen geïsoleerd (Maniatis, 1982, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual) 10 uit subconfluente cellen. 20 yg DNA werd gedigereerd met restrictie- enzymen zoals gespecificeerd, onderworpen aan elektroforese op 0,8% aga-rose-gel, geblot op Hybond-N (Amersham) met 20 x SSC bottom buffer (Southern, 1975, J. Mol. Bio., 98: 503 - 517) en DNA-gebonden door blootstelling aan 1200 yJoules korte golf-UV. Filters werden overnacht bij 15 65°C gehybridiseerd in hybridiseringsbuffer (6 x SSC, 5 x Denhardt's oplossing, 0,5% SDS en 30 ug/ml afgeschoven gedenatureerd zalmsperma 6 32 DNA), bevattende 2 x 10 cpm P-gelabeld AR specifiek fragment per ml. Sondes werden random prime gelabeld tot een specifieke activiteit van g 5 - 25 x 10 cpm/yg. Filters werden extensief gewassen in 1 x SSC, 65°C, 20 en overnacht bij -70°C onderworpen aan autoradiografie.

9.1.2. Genomische reeksconstructie.

Bacteriofaag lambda L47.1 werd geselecteerd als de cloonvector en met fosfatase behandelde "arms" werden bereid na digerering met BamHI, EcoRI en HindlII. Hoogmoleculair DNA uit MCF-7-cellen werd gedigereerd 25 met HindlII, onderworpen aan elektroforese op 0,8% lage geltemperatuur-agarose (BioRad) en op grootte gefractioneerd. De agarosefractie, die maximaal verrijkt was voor het gewenste restrictiefragment, werd gesmolten bij 65°C, waarna het DNA werd geëxtraheerd met fenol en natriumace-taat en vervolgens met ethanol werd geprecipiteerd en hersuspendeerd in 30 een concentratie van 25 - 100 yg/ml. De reeksconstructies bestonden uit overnacht ligeren bij 14°C van 100 ng lambda L47.1 "arms" en 40 ng geëxtraheerd, grootte-gefractioneerd DNA in een reactievolume van 5 yl onder toepassing van T4 DNA-ligase (Biolabs). Recombinantfaag werd in vitro verpakt met extracten (Brosveld, 1981, Gene, 13, 227 - 237), bereid 434 35 met E_. coli stammen BHB2688 N205 recA m (lambda iram cits b2 red3 89 00 170 , 434 f '·.

- 63 -

Eam4 Sam7), en BHB2690 N205 recA (lambda imm cits b2 red3 Daml5 Sam7). Reeksen werden getiterd op IS. coli LE392. Genomische clonen werden gescreened met de AR-specifieke DNA-sondes door in situ plaathybri-disering (Benton, 1977, Science 196: 180 - 182) en DNA werd geïsoleerd 5 uit plaat-gezuiverde positieve clonen (Huynh, 1985, In DNA cloning techniques: a practical approach, D.Glover, ed. (Oxford: IRL Press), blz.49 - 78). HindlII inlassen werden uitgesneden en onderworpen aan subclonen in pEMBL 18 voor restrictie-analyse en propagering.

9.1.3. Primer extension-proef.

10 RNA werd geïsoleerd uit MCF-7-cellen zoals beschreven in para graaf 8. Synthetische oligonucleotiden, complimentair met nucleotiden 40 tot 60 (ARAP) en 76 tot 97 (ARCP) in de AR cDNA-sequentie werden 32 aan het uiteinde P-gelabeld met T4 polynucleotidekinase tot een speer- 0 fieke activiteit van 2 - 5 x 10 cpm/yg. 1 miljoen cpm gelabeld oligo-15 nucleotide werd gebruikt voor het prepareren van de eerste streng cDNA synthese op 50 yg MCF-7 RNA, in wezen zoals beschreven in paragraaf 8.1.4. De produkten werden behandeld met RNase A, geëxtraheerd met fenol en chloroform, met ethanol geprecipiteerd, in 80% formamide gedenatureerd door verhitting gedurende 5 minuten op 100°C, en geanalyseerd 20 door elektroforese op standaard 8% polyacrylamide-7M-ureum sequentiëren-de gels.

9.1.4. CAT-proef.

MCF-7-cellen werden gegroeid zoals beschreven in paragraaf 6.2.1.

6

Voor elke proef werden 1 - 2 x 10 cellen in 10 ml medium in een scho-25 tel van 100 mm geplateerd en 24 uren later werd 20 yg met calciumfosfaat geprecipiteerd supergewikkeld plasmide DNA aan de cellen toegevoegd (Southern en Berg, 1982). De cellen werden 4 uren na de transfectie gespoeld met vers medium en blootgesteld aan een 25% glycerolschok gedurende 90 seconden. De cellen werden opnieuw gespoeld en overdekt met 30 20 ml vers medium, dat 0 of 100 ng/ml TPA bevatte. De cellen werden 40 uren na de glycerolschok gewassen en geoogst en vervolgens gelyseerd door sonicatie in 100 yl 0,25 M Tris-HCl (pH 7,8). CAT-activiteit werd gemeten, in wezen zoals beschreven door Gorman e.a. (1982). Het cel- 14 extract (3 - 50 yl) werd toegevoegd aan 2,5 mCi C-chloramfenicol (NEN) 35 in een reactievolume van 150 yl van 0,5 M Tris (pH 7,8) , 0,5 mM acetyl- 89 00 178 /

« iJT

- 64 -

CoA. De reacties werden gedurende 1 uur geïncubeerd bij 37°C, geëxtraheerd met 1 ml ethylacetaat en op silicagel TLC-platen ontwikkeld met CHCl., : 1-butanol (95 : 5) . De TLC-platen werden gedroogd en geautoradio- 3 14 grafeerd. Het geacetyleerde en ongeacetyleerde C-chloramfenicol werd 5 gekwantificeerd door telling van uitgesneden plaatsen in Optifluor.

De eenheden van CAT-enzymatische activiteit werden berekend als yg chloramfenical, geacetyleerd per uur per yg proteïne in het celextract.

9.1.5. In situ chromosomale hybridisering.

3

Plasmide pAR9 werd "random prime" gelabeld met H-TTP en gebruikt 10 voor hybridisering aan normale humane metafasecellen, bereid uit met fytohemagglutinine gestimuleerde perifere bloedlymfocieten in de 500 -800 bandtrap. Deze sonde komt overeen met een AR cDNA, dat veel van de 3' ongetranslateerde regio mist en is ingepast in de EcoRI-plaats van PEMBL18.

15 >· De hybridisering geschiedde als eerder beschreven (Le Beau, 1985, PNAS, 82, 6692 - 6696) met 2, 4, 20 en 40 ng sonde per ml hybridiserings- mengsel, Autoradiografieën werden gemaakt onder toepassing van Kodak NTB-2 nucleaire track-emulsie en glaasjes werden gedurende 7-60 dagen belicht. Chromosoombanden werden zichtbaar gemaakt door kleuring met 20 chin-icrinemosterd.

9.2. Chromosomale lokatie van het AR-gen.

De chromosoomtoekenning van het humane AR-gen werd vastgesteld 3 door in situ hybridisering van H-gelabeld AR cDNA aan normale metafase-chromosomen. Zilverkorrels werden geteld op 50 metafase-uitstrijken, 25 waarvan 30% niet-statistisch was verdeeld bij de banden 4ql3 - 4q21.

Het resultaat werd bevestigd door polymerase ketenreactie (PCR) op hamster/humaan somatisch celhybride DNA, dat slechts het humane chromosoom 4 bevatte. Oligonucleotide-primers, afkomstig van AR exon 3 en het flankerende intron genereerden een 220 bp PCR-fragment alleen in mense-30 lijk DNA en het hybride DNA, dat chromosoom 4 bevatte, terwijl het hamster DNA negatief was.

Chromosoomregio 4ql3 - 4q21 bevat eveneens de genen voor gro of Melanoom groei stimulerende activiteit (Anisowicz, A. , e.a., 1987,

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 7188 - 7192; Richmond e.a., 1988, 35 EMBO J., 7: 2025 - 2033) c-kit receptor (Yarden e.a., 1987, EMBO J., 6: 8900178: ï * - 65 - 3341 - 3351), plaatjesfactor 4 (PF4) (Griffin e.a., 1987, Cytogenetic Cell Genet., 45: 43 - 73), de interferon-gamma-induceerbare factor IP-10 (Luster, e.a., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 1868 - 1871), vitamine D bindend proteïne (groep-specifieke component) (Cooke e.a., 5 1986, Human Genetics 73: 225 - 229; McCombs e.a., 1986, Cytogenet Cell

Genet, 42: 62 - 64) en statherin, een calcium regulerend speekselprote-ine (Sabatini e.a., 1987, Am. J. Hum. Genet., 41: 1048 - 1060). Het gen voor EGF bevindt zich distaai bij 4q25.

Gro, ÏP-10, en PF4 behoren tot een klasse van structureel verwan-10 te peptiden, die een familie van op chromosoom 4 gegroepeerde groeifactoren kunnen vormen. c-Kit codeert een celoppervlakreceptor, die structureel en functioneel verwant is met verscheidene groeifactorreceptoren, die thyrosine-specifieke kinase-activiteit bevatten, waaronder EGF-recep tor, Neu oncogeen, PDGF-receptor en insulinereceptor. In het algemeen 15 behoren de genen voor liganden en hun receptoren tot onderscheiden chromosomen, maar sommige zijn aan gemeenschappelijke chromosomale lokaties toegeschreven (Groffin, 1983, Nucl. Acids Res. 11: 6331 - 6339; PettenatL 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 84: 2970 - 2974). De ligande voor c-kit is niet geïdentificeerd en AR moet worden beproefd op een derge-20 lijke activiteit.

Specifieke translokaties worden in vele kwaadaardige tumoren waargenomen. De meest frequent gerapporteerde cytogene afwijking in congenitale acute lymfoblastische leukemie (ALL), t(4;ll) (q21;q23) heeft, betrekking op de regio, waaraan AR is toegeschreven (Heim e.a., 1987, 25 Leukemia, 1: 16 - 23). ALL'S worden nu geklassificeerd door morfologie, zoals gedefinieerd door de Frans-Amerikaans-Britse Coöperatieve Groep (FAB), B en T celmarkers en chromosomale analyse. Deze klassificaties dienen als basis voor diagnose, prognose en behandeling van ALL. Bij 1/3 van alle gevallen van ALL zijn specifieke translokaties betrokken, 30 en t(4;11) correspondeert met een groep met een slechte prognose, die het meest frequent voorkomt bij kinderen met een leeftijd van minder dan 16 maanden met een mediane overleving van minder dan 1 jaar (Kocova e.a., 1985, Cancer Genetics and Cytogenetics 16: 21 - 32). Translokaties, waarbij regio 4q21 betrokken is, zijn ook gerapporteerd in T-lymfoma's 35 (Levine, e.a., 1986, Cancer Res. 46: 6481 - 6488) en een geval van acu- 89 00 170/ * ί - 66 - te myeloblastische leukemie (AML) (Selypes e.a., 1987, Human Genet. 76; 106 - 108). Deze regio bevat eveneens de genen voor een dentaal dysgene-sis-syndroom en voor gezichtsvlekken, een ergerlijke kwaal die leidt tot een vlekkerige huidpigmentatie als gevolg van onvoldoende melano-5 blastmigratie en -differentiatie (Hoo, e.a., 1986, Human Genet., 73: 230 - 231).

Bindingsonderzoek tussen AR en de genetische kwalen, gelokaliseerd bij chromosoom 4ql3-4q21, zullen het mogelijk maken de betekenis van zulke co-lokalisatie vast te stellen. De huidige cytogenetische ana-10 lyse suggereert dat regio 4q21 genen bevat, die betrokken zijn bij lym-focytische differentiatie. Uiteindelijk kunnen deze associaties verdere biologische activiteiten of toepassingen voor dit groei regulerend molecuul suggereren.

9.3. Genomisch clonen.

15 Southern blot-analyse (paragraaf 9.1) van MCF-7 DNA, gedigereerd met HindlII, EcoRI of BamHI toonden enkelvoudige banden van resp. 12 kb, 32 8 kb en 20 kb, indien gehybridiseerd met een 830 bp sonde (met P-gela-beld Pvull/Bsml gedigereerd pARl) dat het 5'-gedeelte van het AR-gen bevatte, hetgeen doet vermoeden dat AR een enkelvoudig kopie-gen is. Een 20 170 bp sonde (AR 170, BsmI-PvuII) van het 3'-einde van rijp AR, omvat tende het transmembraan en cytoplasmische domein coderende regio's, hy-bridiseerde tot dezelfde HindlII, EcoRI en BamHI-fragraenten en ook tot een additioneel 7,5 kb HindlII-fragment, hetgeen impliceert dat het grootste gedeelte van de AR coderende regio is gesplitst tussen twee 25 HindlII-fragmenten van 12 en 6,5 kb. Identieke bandvorming werd waargenomen door Southern analyse van digesten van humane placenta, hersens, melanoom (SK-MEL 28), borstkanker (HTB36), epidermoïde carcinoom (A431) en longkanker DNA en doet vermoeden dat het AR-gen geen vergaande her-rangschikkingen of uitbreidingen heeft ondergaan.

30 Gekozen werd om de twee HindlII-fragmenten van MCF-7 DNA te clo nen, daar zij waarschijnlijk het grootste gedeelte van, zo niet alle AR-gen en zijn flankerende sequenties bevatten. Met HindlII gedigereerde MCF-7 DNA werd op grootte gefractioneerd en de geschikte fracties werden geligeerd in L47.1. Uit talrijke positieve clonen werden twee 35 clonen, ^ ARH12 en λ ARH6, gekozen voor een meer gedetailleerde karak- 69 00 178 Γ - 67 - terisering. Van de 12 en 6,4 kb inlassen werden sub-clonen in pEMBLl8 gemaakt en "mapped" voor verscheidene restrictieplaatsen. Onder toepassing van exacte oligonucleotide primers en directe sequentiëring van verscheidene kleinere sub-clonen werd de sequentie van alle exons en 5 hun intron verbindingen bepaald, waarbij geen discrepanties met de cDNA sequentie aan het licht kwamen.

9.4. Karakterisering van de AR 5' regulerende regio.

Genomisch clonen van AR leidde tot de isolering van 6,5 kb 5’ flankerende sequentie, aanwezig in het 12 kb HindlII-fragment. Het 688 10 bp fragment van de eerste EcoRI-plaats 5' van exon 1 tot de Smal-plaats in exon 1 (positie 40 in cDNA) werd aan subclonen onderworpen en aan beide strengen gesequentieerd. Deze gegevens worden getoond in FIG.17.

Primer-extensie werd uitgevoerd op MCF-7 RNA met twee afzonderlijke oligonucleotiden uit exon 1. Een overwegende transcriptionele start-15 plaats, bevestigd door beide oligonucleotiden, werd gelokaliseerd op 1 bp 5' tot de langste cDNA-cloon. Twee ondergeschikte plaatsen werden waargenomen op positie +1 en +2 in de cDNA-sequentie, hetgeen bevestigde dat vele van de cDNA-clonen op bijna volledige lengte waren. Ter functionele bevestiging van de regulerende regio van het AR-gen werd 20 een chimerisch gen (pXARElCAT) geconstrueerd, dat de 688 bp EcoRI tot Smal AR 5' flankerende regio (sequenties 648 tot +40, waarbij +1 de voornaamste transcriptionele startplaats is) drijvende expressie van een promotorloos chloramfenicolacetyltransferase (CAT) gen bevatte. Deze constructie was in staat transcriptie van het CAT-gen te stimuleren 25 door tijdelijke introductie in MCF-7-cellen, en de activiteit werd 6-tot 7-voudig gestimuleerd door de toevoeging van TPA. Dit bevestigt zowel structureel als functioneel dat het 5' einde van het AR-gen was ge-cloond. Vervolgens werd een reeks van 5' CAT-deletie-mutanten geconstrueerd, die de AR-sequenties -539 tot +40 (Ela), -387 tot+40 (Elb), -277 30 tot +40 (Elc), -148 tot +40 (Eld), -77 tot +40 (Ele), -79 tot +40 (Elg) of +19 tot +40 bp (Elh) in dezelfde vector bevatten. De basale activiteit ging verloren bij deletie voorbij portie -77, d.w.z. Elh toonde geen meetbare activiteit, en al deze constructen vertoonden 3,5- tot 7— voudig versterkte expressie in respons op 40 uren behandeling met 100 ng 35 per ml TPA. Deze constructen kunnen ook worden gebruikt in transient- 89 00 178.

* 4 - 68 - proeven ter vaststelling van de effecten van morfogenen, mitogenen, groeifactoren, farmaceutica of ruwe fermentatie-extracten op de regulering van AR-expressie, waardoor men nieuwe therapeutische middelen kan identificeren.

5 Kern run-off experimenten tonen 3- tot 5-voudig verhoogde trans criptie van AR in respons op TPA, hetgeen doet vermoeden dat verhoogde promotoractiviteit tenminste gedeeltelijk verantwoordelijk is voor de TPA-inductie van AR. Northern-analyse van MCF-7-cellen, behandeld met TPA in aanwezigheid of afwezigheid van actinomycine D identificeert AR 10 als een relatief stabiel RNA met een halveringstijd van meer dan 4 uren. De inductie van AR-expressie in respons op TPA heeft derhalve vele facetten, waarbij een verhoogde transcriptie van een tamelijk stabiel mRNA betrokken is.

9.5. Intron/exon organisatie van het AR-gen, AR-proteïnedomeinen, evolu-15 tionaire en functionele implicaties._

De volledige genomische sequentie van humaan Amphireguline is afgebeeld in FIO.17 en het verband tussen exons en de proteïnedomeinen van het AR-molecuul wordt schematisch weergegeven in FIG.18.

Primer-extensie-analyse van AR mRNA en onderzoek onder toepassing 20 van chimerische AR/CAT-promotor (CAT = chloramfenicolacetyltransferase, een marker-gen) constructen lokaliseren een functionele promotor binnen de 64 bp 5' tot het einde van de langste cDNA-cloon. Bovendien is er een consensus TATA-box 29 bp bovenstrooms van het 5' einde van de cDNA-sequentie. Het 3' einde van het gen wordt voorafgegaan door een consen-25 sus polyadenyleringssignaalsequentie, 64 nucleotiden uit de poly(A)- staart in het cDNA. Het primaire transcript van het AR-gen is ongeveer 10,2 kb.

Zes exons coderen de humane AR-precursor en omspannen 10,2 kb genomisch DNA. De AR-exons variëren van 112 - 270 bp in lengte en wor-30 den onderbroken door introns van. tussen 1,25 kb en 2,1 kb. De vijf introns van AR onderbreken de coderingssequentie zodanig, dat vele van de proteïnedomeinen produkten zijn van een enkel exon. Exon 1 codeert de 5' ongetranslateerde en signaalpeptidedomeinen, exon 2 codeert de N-terminale precursor, exon 5 bevat de cytoplasmische regio en exon 6 35 vertegenwoordigt de 3' ongetranslateerde regio. Tezamen coderen exons 89 00 178 ; « Jf - 69 - 3 en 4 het rijpe AR-proteïne, omvattende zowel de hydrofiele als EGF-achtige sequenties, alsmede het putatieve transmembraandomein. De verbinding tussen exons 3 en 4 vindt plaats tussen de tweede en derde lus van de EGF-achtige regio.

5 Wanneer de exonverbindingen worden gelegd over een groepering van de aminozuursequenties van AR, EGF en TGF- oc, blijkt duidelijk dat al deze proteïnen door twee exons worden gecodeerd en dat het onderbrekende intron zich in dezelfde positie bevindt. Bovendien codeert het 3' exon van elk ook het transmembraandomein van de overeenkomstige pre-10 cursorproteïnen. Daarentegen is de EGF-achtige regio aanwezig op een enkel exon in alle zoogdier-EGF-homologen, waarvoor de exonstructuur werd bepaald; waaronder de 9 EGF-achtige herhalingen in de EGF-precursor (Gray, 1983, Nature, 303: 722 - 725); de drie in LDL-receptor (Yamamoto, 1984, Cell, 39: 27 - 38); en de ene in ratte-fibronectine (Patel, 1987, 15 Embo J., 6: 2565 - 2572) en in humane coagulatiefactor XII (Cool, 1987,-J. Biol. Chem., 262: 1362 - 1373). Invertebraathomologen, zoals het Drosophilia Notch gen en lin-12 uit C. elegans bevatten eveneens veelvuldige EGF-achtige herhalingen (Kidd, 1986, Molec. Cell. Biol., 6: 3094 - 3108; Greenwald, 1985, Cell, 43: 583 - 590). Anders dan de zoog-20 dier-genen bevinden de meeste van de EGF-achtige herhalingen in Notch zich in een enkele coderingsregio, waarin slechts vier van de 36 motieven worden gesplitst door tussenkomende sequenties. Twee van deze vier vertonen sterkere overeenkomst met AR dan met de Notch-herhalingsconsen-sus en één wordt zelfd onderbroken door een intron bij dezelfde CXC-25 sequentie als EGF, TGF-dC en AR. Het nematode lin-12 gen bevat tenminste elf EGF-achtige eenheden, waarvan negen aanwezig zijn op het eerste exon en de resterende twee zich op afzonderlijke exons bevinden, waarbij de intacte EGF-achtige eenheid wordt geflankeerd door introns.

Verschillen in de structuur van de exons, die de EGF-achtige her-30 halingen uit verschillende organismen coderen, doen vermoeden dat zij van verschillende oorsprong zijn. Eén groep bevat het EGF-achtige motief begrensd door introns, en de andere groep, waarvan AR deel uitmaakt, heeft een onderbroken motief. De sequentiegelijkenis tussen de twee groepen zou het resultaat kunnen zijn van convergente evolutie of in-35 tron-inpassing na hun divergentie vanuit een gemeenschappelijk voorouder- 8900178^ * * -ΊΟ- gen.

De intron-lokatie binnen dezelfde CXC-sequentie van EGF, TGF-oc, AR en een van de Notch-herhalingen doet een gemeenschappelijke oorsprong vermoeden, maar nader onderzoek brengt verschillende intron-fasering 5 aan het licht. Intron-fasering heeft betrekking op de vraag of het intron het leesfreem onderbreekt na het eerste (I), tweede (II) of derde (0) nucleotide van een codon. Fasering wordt verondersteld van evolutionair belang te zijn voorzover daardoor de verschuiving van functioneel domein bevattende exons over verschillende proteïnen mogelijk wordt ge-10 maakt. EGF en TGF-04· hebben een fase II-intron in de EGF-achtige eenheid, terwijl AR en Notch fase I-introns hebben. Een soortgelijke verschuiving van één nucleotide wordt waargenomen in het voorlaatste intron binnen het proteasedomein van complement factor B en elastase (Cambell, 1983, PNAS, 80: 4464; Swift, 1984, J. Biol. Chem. 259: 14271). 15 De niet-statistische posities van deze introns kunnen impliceren dat een specifieke intron inlas-sequentie in deze genen aanwezig is. Ook kan er selectieve druk zijn geweest om de coderende regio op deze plaats te verdelen. Vergelijking van sequenties op de exon-intron verbindings-plaats binnen de EGF-achtige eenheid voor humaan EGF, TGF-oc, AR en .

20 de eerste Notch-herhaling tonen geen directe herhalingen, zoals dikwijls wordt waargenomen met transponeerbare elementen. Alle vier hebben echter de sequentie "GTAAGT" grenzend aan de verbinding. Deze sequentie kan enige rol spelen in de oorsprong of splitsing van deze intron.

De virale EGF-homologen bevatten geen introns; vergelijking tus-25 sen VGF, EGF, TGF-«C, en AR toont echter homologie, die zich uitstrekt door het transmembraandomein, terwijl de groeifactoren uit myxoma en shope-virussen eindigen voor deze hydrofobe regio. Recent onderzoek toont dat de TGF-ec-precursor wordt gesynthetiseerd als een transmem-braanprotelne en dat differentiële proteolytische splitsing resulteert 30 in afscheiding van grotere vormen, die celtype-specifiek kunnen zijn (Teixido, 1987, Nature, 326: 883 - 885).

Andere EGF-homologen, die transmembraandomeinen bevatten, omvatten de stollingsfactoren, LDL, en de homeotische genen Notch en lin-12, hoewel geen daarvan grenst aan een EGF-achtige herhaling. De aanwezig-35 heid van het EGF-motief in verscheidene membraan-gebonden precursors 89 00 178.’ > -*· - 71 - dat zij in sommige gevallen kunnen worden behandeld als een afgescheiden groeifactor of dat zij geassocieerd met het membraan kunnen blijven en een rol kunnen spelen in intercellulaire en/of intracellulaire communicatie .

5 Sommige van de AR-homologen omvatten invertebraat homeotische genen. Homeotische gen-produkten zijn betrokken bij de regulering van celontwikkeling. Zo bemiddelt b.v. het Notch-gen-produkt de correcte progressie van een ectodermale cel tot een neuroblast of een dermoblast.

In Notch-mutanten worden al deze cellen neuronaal en het nageslacht, 10 alle hersens en geen huid, sterven. Een homeotisch gen kan op autocrine wijze functioneren ter vestiging of handhaving van een vastgestelde toestand in cellen, die in staat zijn tot expressie van het gen-produkt, en kunnen betrokken zijn bij de regulering van zulke toestanden in aangrenzende cellen via cel-cel-interacties. Of AR ook functioneert ter re-15 gulering van de ontwikkelingstoestand van bepaalde celtypen dient te worden onderzocht.

9.6. Behandeling van rijp Amphiregullne.

Karakterisering van AR cDNA toonde dat de 78 en 84 aminozuurvor-men van AR worden gesynthetiseerd als het middelste gedeelte van een 20 252 aminozuur-transmembraanprecursor (paragraaf 8.2). De plaatsen voor proteolytische splitsing van de AR-precursor, die zou resulteren in het vrijkomen van rijp AR, passen niet op de splitsingsplaatsen van enig bekend protease. Aan het N-terminale uiteinde zijn de plaatsen Asp-Asp/Ser-Val en Glu-Gln/Val-Val, terwijl de C-terminale plaats is Glu-25 Lys/Ser-Met. De twee vormen van AR blijken het resultaat te zijn van beurtelingse proteolytische behandeling vanuit een gemeenschappelijke precursor, daar alle cDNA en genomische clonen dezelfde sequentie in deze regio vertoonden. Interessant is dat een intron is gelegen tussen de twee N-terminale splitsingsplaatsen en het is mogelijk dat "intron-30 verschuiving” voor deze verschillen verantwoordelijk kan zijn.

MCF-7-cellen produceren 80% van hun AR in de grotere 84 amino-zuurvorm, terwijl de choriocarcinoomcellijn HTB-36 80% van zijn AR produceert in de kleinere 78 aminozuurvorm. Om vast te stellen of dit verschil gebonden is aan veranderingen op het DNA-niveau werd de polymera-35 seketenreactietechniek (Scharf, 1986, Science, 233: 1076 - 1078) toege- 88 00 178.

* l - 72 - past voor isolering van M exon 3 uit MCF-7-cellen en HTB-36-cellen, een lijn die constitutief hoge niveaus van AR mRNA produceert. Een AR intron-specifiek "sense" oligonucleotide en een "antisense" oligonucleotide uit de coderende regio van exon 3 werden gebruikt voor specifieke 5 versterking van het tussenkomende 220 bp fragment van het AR-gen uit beide DNA-bronnen. Directe sequentie-analyse toonde geen discrepanties in de intron-exon verbinding of in de exon 3 coderende sequentie tussen deze twee humane DNA-bronnen, hetgeen verder doet vermoeden dat de twee vormen van AR resulteren uit beurtelingse proteolytische splitsing van 10 de precursor.

9.7. Structurele vergelijking van AR en EGF-achtige groeifactoren.

AR toont duidelijke sequentiehomologie met andere EGF-achtige proteïnen, met de conservering van zes cysteïnen, betrokken in drie di-sulfidebindingen, die de secundaire structuur van de rijpe groeifactoren 15 definiëren. Eerder gemaakte (met computerassistentie) vergelijkingen van aminozuursequenties hebben geleid tot de categorisatie van EGF-achtige motieven in twee onderscheiden groepen: groeifactoren en bloedcoa-gulatiefactoren (zie FIG.13). Er werden twee sequentiepatronen geselecteerd voor vergelijking met AR en andere DNA of proteïnesequenties. .

20 De selectie was gebaseerd op het kennelijke vermogen van deze sequenties om te onderscheiden tussen de twee groepen van proteïnen en omdat zeer weinig gaten nodig waren voor optimale aligneringen. De exacte sequenties zijn getoond in tabel I. De eerste regio correspondeert mét de eerste elf aminozuren van de tweede lus van EGF en de tweede correspon-25 deert met de derde cysteïnelus van EGF. Vier vertegenwoordigers uit elke groep van groeifactor en bloedcoagulatiefactoren werden geselecteerd voor het genereren van consensus-sequenties op basis van hun goed vastgestelde functionele en structurele homologie. Waar mogelijk werden humane sequenties geselecteerd, daar het de bedoeling was ze uiteindelijk 30 te vergelijken met humaan AR. De groeifactoren waren: humaan EGF, TGF- , VGF en Shope groeifactor, en de coagulatiefactoren waren: humane factor IX, X, XII en proteïne C. AR werd ook voor deze beide homologieblokken vergeleken met de gegevens in de computer. De consensus-sequentie werd gewogen op basis van de frequentie waarmee een rest op een bepaalde po-35 sitie aanwezig was.

8900 178.

< * - 73 -

Structuur-functieanalyse van diverse TGF- oC, VGF en EGF-derivaten heeft onlangs geleid tot de identificatie van verscheidene resten, die noodzakelijk zijn voor de biologische activiteit van deze groeifactoren.

Recombinantprotelnen, synthetische peptiden, plaats-specifieke chemische 5 derivaten en proteolytische degradatie waren geschikt voor het genereren van veranderde moleculen. Voorbeelden van generalisaties zijn (posities ten opzichte van de rangschikking in FIG.15): de 6 cysteïnen (positie 1, 19, 15, 26, 28 en 37) en hun disulfidelussen (1 - 15, 9 - 26, 28 - 37) zijn vereist voor biologische activiteit, N-terminale extensies hebben 10 weinig effect op de activiteit, een aromatische rest (F, Y) is vereist 32 41 42 op positie 8, een niet-conservatieve verandering van Y , D of L resulteert in activiteitsverlies en/of dramatisch verlies in receptorbinding of autofosforylering.

AR voldoet aan alle behalve de laatstgenoemde twee kriteria, die 15 resten definiëren, die noodzakelijk zijn voor EGF-receptorbinding en/of 41 mitogene activiteit. Rijp AR is vlak voor D afgeknot en mist dit en het "cruciale" leucine 42 volkomen, maar concurreert toch voor EGF-receptorbinding en substitueert voor EGF in sommige mitogene proeven. Deze verschillen kunnen echter verantwoordelijk zijn voor de niet-verzadigba-20 re receptor bindende kinetica en zijn duidelijke functionele verschillen van EGF in bepaalde proeven, zoals TGF-/3-synergisme, het differentiële effect op geselecteerde A431-subclonen, dwarsverknoping, fosforylerings-proeven en zijn vermogen om DNA te binden. Het extreem hydrofiele traject bij het N-uiteinde van rijp AR kan ook sommige van deze verschillen 25 in receptorbinding of biologische activiteit verlenen.

9.8. AR-subcategorie van EGF-superfamilie.

Er werd een matrix berekend van evolutionaire afstanden op basis van de rangschikking in FIG.13 en een computer-analyse op basis van tabel I. Deze matrix werd gebruikt voor afleiding van een dendrogram voor 30 de EGF-superfamilie. Het onderzoek vereist de aanwezigheid van de cyste-inen en voegt een punt toe voor elke rest, die past bij de gewogen con-sensus-sequentie. Deze evolutionaire boom voorspelt dat AR valt binnen een nieuwe subcategorie van de EGF-achtige groeifactoren, op basis van zowel structurele als functionele homologie. Een dergelijk model voor-35 spelt dat andere leden van deze groeifactorfamilie kunnen bestaan en dat 89 00 178/ <· ( - 74 - zij kunnen worden geïdentificeerd door homologie met de genoemde sequen-patronen op basis van drie kriteria: een gecombineerde score met de twee groeifactorregio's van meer dan 20, een gecombineerde coagulatie-factorregioscore van minder dan 20 en een gecombineerde AR-regioscore 5 van meer dan 20. Van alle nieuwe moleculen, die aan deze kriteria voldoen, zou kunnen worden verwacht dat zij ook enige functionele homologie .hebben met EGF, TGF-cC , VGF of AR. Moleculen met een gecombineerde AR-regioscore van meer dan 40 zouden worden geklassificeerd als leden van de AR^familie binnen de EGF-superfamilie en zouden mede door de uitvin-10 ding worden omvat.

10. VOORBEELD: Bacteriële expressie van Amphireguline.

10.1. Materialen en methoden.

10.1.1. Plasmideconstructies.

Plasmide pARDl. Plasmide pARDl bevat het 1,4 kb EcoRI cDNA-fragment 15 (pARl) in pEMBLlS met een T tot C verandering bij nucleotidepositie 532 in het cDNA, overeenkomende met de valine-valine-sequentie bij het ami-no-uiteinde van het rijpe AR. Deze verandering werd tot stand gebracht door plaats-gerichte mutagenese en werd bevestigd door sequentie-analy-se. De constructie maakt toegang mogelijk tot de verbinding tussen het 20 AR-amino-eindstandige precursordomein en de hydrofiele regio door creatie van een Ddeï-plaats (CTAAG).

Plasmide pARSTOP. Plasmide pARSTOP is een tussenconstructie, gebruikt bij de bereiding van een AR-secretievector. pARDl werd gedigereerd met Sspl en Xbal en het 515 bp-fragment, dat de carboxy-eindstandige 9 ami^ 25 nozuren van rijp AR, het transmembraan en cytoplasmische domeinen codeert, en de 3' ongetranslateerde regio werd geïsoleerd. Het 4,7 kb (Sspl-Xbal)-fragment, dat het resterende amino-eindstandige gedeelte van AR cDNA bevatte, werd gel-gezuiverd en geligeerd met gekinaseerde, ontlaten, complementaire oligonucleotiden ARSTOP1 en ARSTOP2 (onder-30 staand afgebeeld). Deze oligonucleotiden hebben een 51 stomp uiteinde verenigbaar met een Sspl-plaats, gevolgd 'door een sequentie, die de carboxy-eindstandige 9 aminozuren van de rijpe AR-sequentie codeert, een TAA-stopcode en EcoRV en Xbal-plaatsen.

YFGERCGEK* EcoRV/Xbal 35 ARSTOP 1 5' ATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTAAGATATCT

ARSTOP 2 3' TAAAGCCACTTGCCACACCCCTTTTCATTCTATAGAGTC

89 00 179: !« ? - 75 -

Piasmide pbAR. Plasmide pbAR bevat een promotorloze TGF-fi-leider, gehecht aan de rijpe 78 aminozuurvorm van AR. Het werd geconstrueerd door ligering van de oligonucleotiden bLARN3 en bLARN4 met het 240 bp Ddel uit Xbal-fragment van pARSTOP in met EcoRI/Xbal gedigereerd pEMBLl8.

5 bLARN3 en bLARN4 zijn complementair en vormen een 5r EcoRI en een 3' Ddel-overhang en een enkele interne Nael-plaats, verenigbaar met die nabij het carboxy-eindstandige uiteinde van de TGF-yd -leidersequentie. Ligering zal de Ddel-plaats vernietigen en de correcte aminozuursequen-tie valine-valine bij het amino-uiteinde van rijp AR regenereren.

10 Sstll

AGVVKPPQNKTESE PHIL1 5' GGGAGTAGTTAAGCCGCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGA

PHIL2 3 * CGCCCTCATCAATTCGGCGGGGTTTTGTTCTGCCTTTCACT

15 NTSDKPKRKKKGG

PHIL1 5' AAATACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGG

PHIL2 3' TTTATGAAGTCTATTOGGCTTTTCTTTCTTTTTCCCTCC

EcoRI

20 KNGKNRRNRKKKN

PHIL1 5' CAAAAATGGAAAAAATCGAAGAAACAGAAAGAAGAAG

PHIL2 31 GTTTTTACCTTTTTTAGCTTCTTTGTCTTTCTTCTTCTTAA

Plasmide pDCHBARl. Plasmide pDCHBARl is een zoogdierexpressievector (FIG.19), bedoeld voor afscheiding van de behandelde, rijpe 78 amino- 25 zuurvorm van AR. Het bevat de TGF-ft-leider/rijp AR-sequentie uit pbAR, gedreven door de CMV/HIV-promotor, geflankeerd door een SV40-polyadeny-leringssignaal. De vector bevat ook SV2dhfr in dezelfde transcriptione-le oriëntatie. PSVDR/bOM werd gedigereerd met Nael en Xbal, en de 6 kb vector werd weggezuiverd uit de uitgesneden OncoM coderingssequentie.

30 pbAR werd ook gedigereerd met Nael en Xbal en het 260 bp-fragment, dat de carboxy-eindstandige 5 aminozuren van TGF-fi-signaalsequentie en de 78 aminozuren rijp AR-sequentie, gevolgd door een termineringscode en EcoRV en Xbal-plaatsen. De verbindingen werden geverificeerd door se-quentie-analyse.

35 Plasmide pDCHBPHILE. Plasmide pDCHBPHILE is een zoogdierexpressievector, 89 00 178; 6, φ· - 76 - bedoeld voor secretie van een chimerisch AR/EGF-proteïne. Het plasmide is ook gevormd ter vergemakkelijking van toekomstige fusieconstructies tussen het AR-hydrofiele domein en andere groeifactoren. Deze constructie werd gecreëerd door ligering van het 6,5 kb Sstll/Xbal-digest 5 pDCHBARl-vectorfragment, het 175 bp EcoRI/Xbal-fragment, dat het synthetische humane EGF-gen bevatte, en oligonucleotiden PHILl en PHIL2. Deze oligonucleotiden zijn complementair met 5' Sstll en 3' EcoRi extensies en coderen de laatste rest van de TGF-/3-signaalsequentie en het gehele AR-hydrofiele domein. pDCHBARl verschaft de CMV/HIV-promotor, alle ami-10 nozuren behalve het laatste van de TGF-^-signaalsequentie en de SV40-polyadenyleringssequentie. Het EGF-fragment werd verkregen van Dr.Timothy M. Rose (Oncogen), en bevat geschikte plaatsen voor toekomstige manipulering.

10.1.2. Bereiding van pTAC-vector.

15 Plasmide TacPak/EGF werd verkregen van Dr. Timothy M. Rose (Oncogen) en is samengesteld uit de volgende eenheden: trp-lac hybride-promotor en Cro-gen Shine-Delgarno-sequentie, geïsoleerd als een Bglll/ BamHI-fragment uit expressievector pl35-l, die op zijn beurt afkomstig was uit pDR540 (Pharmacia); alkalisch fosfatasesignaalsequentie, afkom-20 stig uit synthetitsche oligonucleotiden TacPakl en TacPak2 (Dr. Rose, Oncogen); synthetische EGF-sequentie gependeld uit plasmide pBM22/PAK/ EGF; transcriptionele termineringsregio; pBR322 ruggegraat met het neo-mycine weerstands-gen, alle afkomstig uit plasmide pl35-l. TacPak/EGF werd gedigereerd met BamHI, twee-base gevuld met dATP en dGTP voor vor-25 ming van een plaats, die verenigbaar was met de met 2-base gevulde Sail, en vervolgens gedigereerd met Pvul. Deze digerering verwijdert het synthetische EGF-gen en het grootste gedeelte van de alkalische fosfatasesignaalsequentie, maar laat de Tac-promotor en Shine-Delgarno-sequenties en initiërend ATG intact. Het 2,8 kb-fragment werd gel-gezuiverd.

30 10.1.3. Bereiding van gemodificeerd Amphireguline cDNA-fragment.

Plasmide pARSTOP werd gedigereerd met Sail, 2-base gevuld met TTP en dCTP voor vorming van een plaats, die verenigbaar was met een BamHI 2-base gevulde (dATP, dGTP) extensie en vervolgens gedigereerd met Ddel en BglI. Het laatstgenoemde digest was nodig voor verwijdering van 35 comigrerend DNA uit het gewenste 242 bp-fragment, dat de korte vorm van 89 00 178 Γ s s - 77 - rijp AR codeert, beginnende met VKPP en eindigend met CGEK, gevolgd door een synthetisch geïntroduceerde stopcode. Het 243 pb-fragment werd gel-gezuiverd.

10.1.4. Bereiding van ALKPAR1 en ALKPAR2 synthetische oligonucleo- 5 tidën,_

Complementaire synthetische oligonucleotiden ALKPAR1 en ALKPAR2 werden voorzien van een 5' Pvul-overhang, verenigbaar met TacPak/EGF PvuI/BamHI-partieel gevuld fragment en een 3' Ddel-extensie, verenigbaar met het pARSTOP Ddel/Sall-partieel gevulde fragment. Zij werden gesynthe-10 tiseerd op een Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer en gezuiverd uit een acrylamidegel. Fosfaten werden aan de oligonucleotiden met T4 Kinase toegevoegd, en equimoleculaire hoeveelheden werden ontlaten met langzame afkoeling na warmte-denaturering.

Puvl Ddel

15 IALALLPLLFT§VTKAVV

ALKPAR1 5' CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTGTAG 3' ALKPAR2 3' TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTTTTCGACATCAAT 5 * 10.1.5. Ligering en isolering van pTacAPARl.

Het 243 bp Ddel tot Sall-gedeeltelijk gevulde AR-fragment, het 20 2,8 kg PvuI/BamHI-partieel gevulde TacPak/EGF-vectorfragment; en gekina- seerde, ontlaten ALKPAR1+2 oligonucleotiden werden geligeerd onder toepassing van DNA-ligase, getransformeerd in competente E. coli JM109-cellen en geselecteerd op LB/neomycineplaten. De correcte constructie werd bevestigd met restrictiedigesten en DNA-sequentiëring. De sequentie 25 van pTacAPAR wordt getoond in FIG.20.

10.1.6. Bereiding van chimerisch AR hydrofiel domein/EGF-gen fragment_

Plasmide pDCHBPHILE werd gedigereerd met Sstll en Xbal onder ge-nerering van het 286 bp fragment, dat de laatste twee resten van de 30 TGF-/9-signaalsequentie (AG), 37 resten van het hydrofiele domein van AR (WKP ... RKKK) en de 53 resten bevattende synthetische sequentie van de rijpe humane EGF-sequentie (NSDS ... WELR) codeert. Het 286 bp fragment werd gel-gezuiverd.

10.1.7. Bereiding van APAREGFl en APAREGF2 synthetische oligo- 35 nucleotiden_______ 89 00 178.

* * - 78 -

Complementair synthetische oligonucleotiden APAREGFl en APAREGF2 werden gemaakt met een 5' Pvul-overgang, verenigbaar met pTacAPARl Pvul/ Xbal-fragment en een 3' SstlI-extensie, verenigbaar met het pDCHBPHILE Sstll/Xbal-fragment. Oligonucleotiden werden gesynthetiseerd op een 5 Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer en gezuiverd uit een acrylamide-gel. Fosfaten werden aan de oligonucleotiden toegevoegd met T4 Kinase en equimoleculaire hoeveelheden werden ontlaten met langzame koeling na warmte-denaturering.

Pvul Sstll

10 IALALLPL LFTPVTK

APAREGFl 5' CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACACC 3' APAREGFl 3' TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTGGCG 5' 10.1.8. Ligering en isolering van pTACAPHILE.

Het 286 bp Sstll/Xbal-fragment, dat het hydrofiele domein van 15 AR gehecht aan rijpe EGF-sequentie, het 2,8 kg Pvul/Xbal pTacAPARl- vectorfragment en gekinaseerde ontlaten APAREGFl+2 oligonucleotiden codeert, werden geligeerd onder toepassing van DNA-ligase, getransformeerd in competent E. coli JM109, en geselecteerd op LB/neoraycineplaten. De correcte constructie werd bevestigd met restrictiedigesten en DNA-sequen-20 tiëring. De nucleotidesequentie van pTacAPHILE wordt getoond in FIG.21. Het verwachte translatieprodukt kan worden gesplitst tussen het dipepti-de Ala-Gly direct volgend op de alkalische fosfatasesignaalsequentie, waarbij een verdere rest (glycine) aan het AR hydrofiele domein wordt toegevoegd. Nucleotideresten, die verschillen van de normale humane se-25 quentie, zijn afgebeeld in vet type (FIG.20).

10.1.9. Zuivering van recombinant-Amphireguline.

Plasmiden pTacAPARl en pTacAPHILE werden getransformeerd in competente E_. coli JM109 en tot confluentie gegroeid in 10 ml LB bij 37 °C tot een A^^ van 0,7. Culturen werden vervolgens geïnduceerd met 100 30 ymol IPTG en gedurende 24 - 72 uren gegroeid. De culturen werden tweemaal gecentrifugeerd bij 5000 omw./minuut, beide keren 15 minuten, waarna het vaste materiaal werd bewaard en de zuivering met de bovenstaande vloeistof werd voortgezet. Monsters werden 10-voudig geconcentreerd op een Amicon ultrafiltratie-apparaat met YM5-membranen (5000 MW cutoff).

35 Het concentraat werd verdund met 5 volume MilliQ-water en gereconstitu- 89 00 178: r ^ - 79 - eerd tot 1/10 van het oorspronkelijke cultuurvolume. IJsazijn werd toegevoegd tot 1 M en de monsters werden 2-24 uren op 4°C gehouden. De monsters werden 20 minuten bij 4°C en 19.000 omw./minuut gecentrifugeerd in Oakridge-buizen in de SS34-rotor, waarna het vaste materiaal 5 werd geëxtraheerd met 20 ml 1 M azijnzuur en de bovenstaande vloeistoffen werden gecombineerd. De geklaarde bovenstaande vloeistoffen werden vervolgens gedurende 2 dagen gedialyseerd tegen 0,1 M azijnzuur, gelyo-filiseerd en opgeslagen bij -20°C.

Vast celmateriaal en ruwe gedroogde bovenstaande vloeistoffen 10 werden onderzocht door immunoblocking en groei inhibiterende proeven (GIA's) of AR-proteïne. Het vaste celmateriaal uit 50 yl confluente cultuur of 100 - 200 yl gedroogde bovenstaande vloeistof werd geleid op een 16% Tricine-polyacrylamidegel, gekleurd met Fast Green en overgedragen op nitrocellulose. Western blots werden uitgevoerd zoals beschreven 15 in paragraaf 7.1.6.

10.2. Resultaten en discussie.

Vast celmateriaal uit transformanten, die pTacAPARl droegen, toonden overvloedige hoeveelheden immunoreactief proteïne, migrerend bij 10 kD, alsmede wat degradatieprodukten en waarschijnlijke dimeren. De 20 bovenstaande vloeistoffen hadden ongeveer 100 - 200 ng/ml van afgescheiden immunoreactief AR. GIA op de bovenstaande vloeistoffen toonde activiteit bij ongeveer 150 ng/ml AR op de A431-A3-indicatorcellijn, vergeleken met gezuiverde natieve AR-standaards. In dit systeem werden grote hoeveelheden immunoreactief proteïne geproduceerd, waarvan het grootste 25 gedeelte binnen de cel geaggregeerd bleef. Proeven op periplasmische preparaten en bovenstaande vloeistoffen toonden secretie van actief proteïne na een groei gedurende 2-3 dagen.

pTacAPHlLE verschaft een geschikt middel om het hydrofiele domein van AR te hechten aan het N-uiteinde van enig gecloond gen. Het is moge-30 lijk dat deze regio veranderde bindingseigenschappen aan de normale receptor van de ligande verleent, fungeert als nucleaire lokaliserings-sequentie, bindt aan DNA of transport mogelijk maakt over lipide ofann-dere membranen, die normaliter voor de aangehechte factor ondoordringbaar zijn.

8900178/ I λ - 80 - 11. Depot van microörganismen.

De volgende microörganismen zijn gedeponeerd bij de Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) en hebben de volgende accessienummers toegewezen gekregen: 5 Microörgani sme Plasmide Accessienummer

Escherichia coli HB101 pARl

Escherichia coli SCS-1 pARHl2

Escherichia coli SCS-1 pARH6

Escherichia coli JM 109 pTacAPARl

10 Escherichia coli J M109 pTacAPHILE

De uitvinding mag niet geacht worden te zijn beperkt in omvang door de gedeponeerde cellijnen of de beschreven belichamingen, die bedoeld zijn als illustraties van een aspect van de uitvinding, en alles wat functioneel equivalent is wordt door de uitvinding omvat. Diverse 15 modificaties van de uitvinding naast de hier getoonde en beschreven belichamingen zullen de deskundige uit de voorgaande beschrijving voor de geest komen. Dergelijke modificaties worden mede door de uitvinding omvat. Verder moet duidelijk zijn dat alle basispaar- en aminozuurrest-nummers en -grootten, die voor nucleotiden en peptiden zijn vermeld, 20 slechts bedoeld zijn als benadering ten behoeve van de beschrijving.

89 00 178;

Claims

1. Proteïne, gekenmerkt door de aminozuursequentie: 1 10 20 VVKPPQNKTE SENTSDKPKR KKKGGKNGK 30 40 50

2. Proteïne volgens conclusie 1, gekenmerkt door een molecuulgewicht van ongeveer 8500 - 25.000 dalton.

3. Proteïne volgens conclusie 1, gekenmerkt door een pi van 7,6 - 8,0.

4. Geglycosyleerd proteïne volgens conclusie 1.

5. Ongeglycosyleerd proteïne volgens conclusie 1.

5 NR R NRKKKNPC NAEFQNFCIH GECKÏI 60 70 78 EHLE AVTCKCQQEY FGERCGEK

6. Proteïne, gekenmerkt door de aminozuursequentie: 15 1 10 20 SVRVEQVVKP PQNKTESENT SDKPKRKKK 30 40 50 GGKN G KNR R NR KKKNPCNAEF QNFCI 60 70 80 84

7. Proteïne volgens conclusie 6, gekenmerkt door een molecuulgewicht van ongeveer 9100 - 25.000 dalton.

8. Proteïne volgens conclusie 6, gekenmerkt door een pi van ongeveer 7,6 - 8,0.

9. Geglycosyleerd proteïne volgens conclusie 6.

10. Ongeglycosyleerd proteïne volgens conclusie 6.

11. Proteïne volgens conclusie 1 of een peptide of fragment daarvan, dat de groei van humane kankercellijnen van epitheliale oorsprong inhi-biteert.

12. Proteïne volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de humane kankercellijn van epitheliale oorsprong epidermaal carcinoom van vulva A431 of adenocarcinoora van de borst HTB132 omvat. 89 00 178: < ï - 82 -

13. Proteïne volgens conclusie 1 of peptide of fragment daarvan, dat de groei van in vitro gekweekte humane voorhuid-fibroblasten stimuleert.

14. Proteïne volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de humane voorhuidsfibroblasten Sakamoto of Goodwin-cellijnen omvat.

15 SSSEPSSGADYDYSEEYDNE bevat.

15. Proteïne volgens conclusie 1, of een peptide of fragment daarvan, gekenmerkt door een bifunctionele celgroeiregulator, die de groei van humane kankercellijnen van epitheliale oorsprong inhibiteert en de groei van in vitro gekweekte humane voorhuidsfibroblasten stimuleert,

16. Proteïne volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat de humane 10 kankercellijn van epitheliale oorsprong epidermaal carcinoom van de vulva A431 of adenocarcinoom van de borst HTB132 omvat.

17. Proteïne volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat de humane voorhuidsfibroblasten de Sadamoto of Goodwin-cellijnen omvat.

18. Proteïne volgens een der conclusies 11 - 17 of een peptide of 15 fragment daarvan, met het kenmerk, dat de inhibitering of stimulering van celgroei wordt bepaald door de volgende proef: 4 (a) microtiterputten, elk bevattende 3,5 x 10 cellen in 50 yl proefme-dium, bevattende DMEM, gesuppleerd met 5% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), penicilline/streptomycine en glutamine, 20 worden gedurende 3 uren geïncubeerd; (b) 50 yl proefmedium, dat Amphireguline bevat, wordt aan elke proefput toegevoegd, terwijl 50 yl proefmedium zonder Amphireguline aan elke controleput wordt toegevoegd, waarna gedurende 2-3 dagen wordt ge-incubeerd bij 37°C; 125 125 25 (c) Ϊ00 yl van een oplossing, bevattende I-jood-2'- I-deoxyuridine (I-UdR) wordt aan elke put toegevoegd, waarna gedurende 4-6 uren bij 37°C wordt geïncubeerd; (d) het medium wordt verwijderd en elke put wordt eenmaal gewassen met PBS; 30 (e) 200 yl methanol wordt toegevoegd aan elke put, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd en verwijderd; (f) 200 yl 1 M natriumhydroxydeoplossing wordt toegevoegd aan elke put, gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 37°C; en (g) de 1 M natriumhydroxydeoplossing wordt verwijderd en geteld met be- 35 hulp van een gamma-teller, waarbij de aanwezigheid van radioactieve 89 00 178,' » Λ - 83 -125 telling een maat is voor I-IüdR-incorporatie en celproliferatie, terwijl de afwezigheid van telling wijst op de inhibitering van celproliferatie.

19. Proteïne volgens conclusie 6 of een peptide of fragment daarvan, 5 dat de groei van humane kankercellijnen van epitheliale oorsprong inhi- biteert.

20. Proteïne volgens conclusie 19, waarin de menselijke kankercellijn van epitheliale oorsprong epidermaal carcinoom van de vulva A431 of ade-nocarcinoom van de borst HTB132 omvat.

20 HGECKYIEHLEAVTC KCQQEYFGER CGEK

21. Proteïne volgens conclusie 6 of een peptide of fragment daarvan, dat de groei van in vitro gekweekte humane voorhuidsfibroblasten stimuleert.

22. Proteïne volgens conclusie 21, waarin de humane voorhuidsfibroblasten Sakamoto of Goodwin-cellijnen omvat.

23. Proteïne volgens conclusie 6 of een peptide of fragment daarvan, gekenmerkt door een bifunctionele celgroeiregulator, dat de groei van humane kankercellijnen van epitheliale oorsprong inhibiteert en de groei van in vitro gekweekte humane voorhuidsfibroblasten stimuleert.

24. Proteïne volgens conclusie 23, waarin de humane kankercellijn 20 van epitheliale oorsprong epidermaal carcinoom van de vulva A431 of ade-nocarcinoom van de borst HTB132 omvat.

25. Proteïne volgens conclusie 23, waarin de humane voorhuidsfibroblasten de Sadamoto- of Goodwin-cellijnen omvat.

26. Proteïne volgens een der conclusies 19 - 25 of een peptide of 25 fragment daarvan, waarin inhibitering of stimulering van celgroei wordt bepaald door de volgende proef: 4 (a) microtiterputten, elk bevattende 3,5 x 10 cellen in 50 yl proefme-dium, omvattende DMEM, gesuppleerd met 5% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), penicilline/streptomycine en glutamine, 30 worden gedurende 3 uren geïncubeerd? (b) 50 yl proefmedium, dat Amphireguline bevat, wordt toegevoegd aan elke experimentele put, terwijl 50 yl proefmedium zonder Amphireguline wordt toegevoegd aan elke controleput, waarna gedurende 2-3 dagen bij 37°C wordt geïncubeerd; 125 125 35 (c) 100 yl van een oplossing, bevattende I-jood-2'- 1-deoxyuridine 89 00 178.' * * - 84 - (I-UdE) wordt toegevoegd aan elke put en werd 4-6 uren bij 37°C geincubeerd; (d) het medium wordt verwijderd en elke put wordt eenmaal gewassen met PBS; 5 (e) 200 yl methanol wordt toegevoegd aan elke put, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geincubeerd en verwijderd; (f) 200 yl 1 M natriumhydroxyde-oplossing wordt toegevoegd aan elke put en 30 minuten bij 37°C geincubeerd; (g) de 1 M natriumhydroxydeoplossing wordt verwijderd en geteld met be- 10 hulp van een gamma-teller, waarbij de aanwezigheid van radioactieve 125 telling een maat is voor de I-IUdR-incorporatie en celproliferatie, terwijl de afwezigheid van telling wijst op de inhibitering van celproliferatie.

27. Amphireguline, een bifunctionele groei regulerende factor, verkre-15 gen door (a) kweken van MCF-7-cellen in tegenwoordigheid van 12-O-tetradecanoyl-forbol-13-acetaat (TPA); (b) verzamelen van de geconditioneerde media uit de MCF-7-eellen; en (c) isoleren van het Amphireguline uit de geconditioneerde media.

28. Nucleotidesequentie, die Amphireguline-precursor codeert, geken merkt door de in FIG.16 afgebeelde nucleotide-coderingssequentie vanaf ongeveer nucleotideresidu nummer 1 tot ongeveer nucleotideresidu nummer 1243.

29. Amphiregulineprecursor, gekenmerkt door de in FIG.16 afgebeelde 25 aminozuursequentie vanaf ongeveer aminozuurrest nummer 1 tot ongeveer aminozuurrest nummer 252.

30. Werkwijze voor de bereiding van Amphireguline, met het kenmerk, dat (a) een Escherichia coli-cel wordt gekweekt, die een nucleotide-30 sequentie bevat, welke Amphireguline codeert onder de controle van een tweede nucleotidesequentie, die gen-expressie zodanig reguleert, dat een peptide of proteïne met Amphireguline-activiteit door de Escherichia coli cel wordt geproduceerd; en (b) het Amphireguline uit de kweek wordt gewonnen.

31. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de nucleoti- 89 00 178. * *· - 85 - desequentie, die Amphireguline codeert, nagenoeg is als afgebeeld in FIG.16 vanaf nucleotide nummer 1 tot nummer 1243.

32. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de tweede nucleotidesequentie, die gen-expressie controleert, een Tac-promotor om- 5 vat.

33. Werkwijze ter bereiding van Amphireguline, met het kenmerk, dat (a) Escherichia coli stam JM 109 getransformeerd met plasmide pTacAPARl, onder accessienummer gedeponeerd bij de NRRL, wordt gekweekt; en 10 (b) het Amphireguline uit de kweekcultuur wordt gewonnen.

34. Werkwijze ter bereiding van Amphireguline, met het kenmerk, dat (a) Escherichia coli stam JM 109 getransformeerd met plasmide pTacAPHILE, onder accessienummer gedeponeerd bij de NRRL, wordt gekweekt; en 15 (b) het Amphireguline uit het cultuurmengsel wordt gewonnen.

35. Gemanipuleerde cel, gekenmerkt door een nucleotidesequentie, die Amphireguline codeert onder de controle van een tweede nucleotidesequentie, die gen-expressie zodanig reguleert, dat de cel Amphireguline produceert .

36. Gemanipuleerde cel volgens conclusie 35, met het kenmerk, dat de nucleotidesequentie, die Amphireguline codeert, de nucleotidesequentie zoals afgebeeld in FIG.16 vanaf nucleotide nummer tot omvat.

37. Gemanipuleerde cel volgens conclusie 35, gekenmerkt door een Escherichia coli-cel.

38. Gemanipuleerde cel volgens conclusie 35, met het kenmerk, dat de twee nucleotidesequentie, die gen-expressie controleert, een Tac-promotor omvat.

39. Plasmide, pARl, zoals aanwezig in een Escherichia coli-cellijn die het onder accessienummer bij de NRRL gedeponeerde plasmide 30 draagt.

40. Plasmide, pARHl2, zoals aanwezig in een Escherichia coli-cellijn, die het onder accessienummer bij de NRRL gedeponeerde plasmide draagt.

41. Plasmide, pARH6, zoals aanwezig in een Escherichia coli-cellijn 35 die het onder accessienummer bij de NRRL gedeponeerde plasmide 8900 178. -* +· - 86 - bevat.

42. Plasmide, pTacAPARl, zoals aanwezig in een Escherichia coli-cel-lijn, die het onder accessienummer bij de NRRL gedeponeerde plas mide draagt.

43. Plasmide, pTacAPHILE, zoals aanwezig in een Escherichia coli- cellijn, die het onder accessienummer bij NRRL gedeponeerde plas mide draagt.

44. Antilichaam, dat een epitoop van Amphireguline herkent.

45. Antilichaam volgens conclusie 44, met het kenmerk, dat het epi-10 toop de aminozuursequentie DTYSGKREPPSGDHSADGFE bevat.

46. Antilichaam volgens conclusie 44, met het kenmerk, dat de epitoop de aminozuursequentie

47. Antilichaam volgens conclusie 44, met het kenmerk, dat het epitoop de aminozuursequentie VKPPQNKTESENTSDKPKRKKKG 20 bevat.

48. Antilichaam volgens conclusie 44, met het kenmerk, dat het epitoop de aminozuursequentie EAVTCKCQQËYFGERCGEK bevat.

49. Antilichaam volgens conclusie 44, met het kenmerk, dat het epi toop de aminozuursequentie VQLRRQYVRKYEGEAEERKK bevat.

50. Genomische nucleotidesequentie, die het Amphireguline-gen codeert, 30 bevattende de nucleotidesequentie zoals afgebeeld in FIG.17. 8900178« •*e*Avf*MAG*(hollano) bek. bij schrijven dd. 20 juni 1989 -T > Ln/632 -η- V Wijziging (en) van erratxa(a) in de beschrijving, behorende bij octrooiaanvrage no. 8900178 voorgesteld door aanvrager(ster) onder datna 20 juni 1989 -ooo— Op blz. 10, regel 3 wordt " 9A " gewijzigd in " 9 en volgende”. Op blz. 69, regel 16 wordt "1362 - 1373" gewijzigd in " 13662 - 13673" . * 8900 178