JP6835590B2 - インスリン様成長因子−１および上皮増殖因子を含む融合タンパク質およびそのバリアントならびにその使用 - Google Patents

Description

背景
現在、米国だけで毎年１３０万人の人々ががんと診断され、５００，０００人を超える人々が死亡している。ほとんどのタイプのがんの治療は化学療法を含む。化学療法薬は、全身的に投与され、がん細胞だけでなく身体のすべての細胞、特に分裂細胞を攻撃する。したがって、化学療法薬の副作用は、重度となることが多い。これらには、貧血、悪心、脱毛、および白血球の枯渇による好中球減少を含む免疫抑制が含まれる。これらの副作用により、投与することができる化学療法剤の用量が制限されることが多い。

がん細胞は、偏性解糖性（ｏｂｌｉｇａｔｅｌｙ ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ）である。すなわち、それらは、エネルギーの必要性に応じてグルコースを消費しなければならず、それらは、グルコースを嫌気的に消費し、これは好気呼吸よりも少ないエネルギーしか産出しない。結果として、がん細胞は、大量のグルコースを消費しなければならない。おそらくグルコースの獲得を促進するために、多くのタイプのがんのがん細胞は、正常細胞よりも多くのインスリン受容体を有することが観察された。（Ａｙｒｅ，Ｓ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ，２０００，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ５５：３３０；Ａｂｉｔａ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ，１９８４，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓ．８：２１３．）最近、がん細胞のインスリン受容体を活用することを試みるインスリン増強療法（ＩＰＴ）と呼ばれるがん治療の方法が、米国において導入された。（Ａｙｒｅ，Ｓ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ，２０００，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ ５５：３３０．）この方法は、がん患者へのインスリンの投与、その後、少し後の化学療法薬の投与を含む。低用量の化学療法薬が使用され、これにより副作用が低下する。インスリンは、がん細胞に対する化学療法剤の効果をなんらかの形で増強し、低用量の使用を可能にするとされている。

組織培養中の乳がん細胞にメトトレキサートがインスリンと共に投与された場合、同じパーセントの細胞の死滅が、メトトレキサートを単独で投与した場合よりも、１０^４分の１のメトトレキサート濃度で実現されることを示すインビトロデータが報告されている。（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｅｕｒ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１２２３．）。メトトレキサートは、テトラヒドロ葉酸の枯渇に至る葉酸類似体である。これは、チミジンおよびプリンの合成を妨害し、よってＤＮＡ合成を妨害する。

インスリンは、化学療法剤の取込みをそれほど刺激しない。ある研究は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞によるエリプチシン（ｅｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）の取込みが、細胞をインスリンと共にインキュベートした場合に、２倍しか刺激されなかったことを示した。（Ｏｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ，１９８１，Ｅｕｒ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１０９７．）別の研究は、細胞をインスリンと共にインキュベートした場合、乳がん細胞によるメトトレキサートの取込みの５０％の刺激を示した。（Ｓｈｉｌｓｋｙ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ，１９８１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３０：１５３７．）したがって、メトトレキサート細胞傷害性のインスリンによる増強についてのメカニズムは、主として、取込みの強化以外の因子によるに違いない。

同じ組織型の正常細胞よりもがん細胞において多く見つけられる別の受容体は、インスリン型増殖因子−１受容体（ＩＧＦ−１受容体またはＩＧＦ−１Ｒ）である。ＩＧＦ−１は、プロインスリンと４０％の同一性を有する７０アミノ酸残基のペプチドである。（Ｄａｕｇｈａｄａｙ，Ｗ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｓ．１０：６８．）インスリンおよびＩＧＦ−１は、互いの受容体といくらかの交差反応性を有する。（Ｓｏｏｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９０：４１９．）ＩＧＦ−１は肝臓によって循環系の中に分泌され、多くの細胞型の増殖を刺激する。ＩＧＦ−１はまた、多くのがんを含む全身の多くの細胞型によっても産生され、オートクリン効果およびパラクリン効果がある。ＩＧＦ−１産生は、成長ホルモンによって刺激される。（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．７６：１００５；Ｙａｋａｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，２００２，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ １９：２３９．）

がん治療においてＩＧＦ受容体を標的にするために、本発明者らは、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）受容体リガンドに連結された抗がん化学療法剤を有する、がんを治療するための化合物を作製した（国際公開第２００５／０４１８６５号；米国特許第８，５０１，９０６号明細書；米国特許出願公開第２０１００１９７８９０号明細書、すべて参照によって組み込まれる）。
がん細胞において過剰発現されていることが見られることが多い別の受容体は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ−１）である。

ＩＧＦ−１Ｒ（Ｉ型ＩＧＦ受容体）に対する、化学療法剤にコンジュゲートするのに有利な改善されたリガンドが必要である。化学療法剤へのコンジュゲーションに有利な、ＥｒｂＢ−１に対するリガンドもまた、必要である。サイトカインの微生物宿主における発現の改善もまた、所望される。

本発明者らは、配列番号２の配列を有する７６５ＩＧＦと命名したＩＧＦ−１のバリアントを合成した。配列番号３は、野生型ヒトＩＧＦ−１の配列である。配列番号２の２１位のアルギニンが野生型ＩＧＦ−１（配列番号３）の３位のグルタミン酸の置換であるという点を除いて、配列番号２の残基１９〜８８は、野生型ＩＧＦ−１と同一である。配列番号２の残基１９〜８８は、可溶型ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合が低下した（野生型ＩＧＦ−１と比較して）ＩＧＦ−１のバリアント形態であるＲ３−ＩＧＦに相当する。可溶型ＩＧＦ−１結合タンパク質は、循環ＩＧＦ−１に強固に結合する血液中の可溶性タンパク質である。可溶型ＩＧＦ−１結合タンパク質に結合すると、ＩＧＦ−１は、膜ＩＧＦ受容体（１型ＩＧＦ受容体、ＩＧＦ−１Ｒ）に結合することができない。本発明者らのＩＧＦ−化学療法剤コンジュゲートのＩＧＦリガンド部分を、より有効にＩＧＦ−１受容体の標的とするために、本発明者らは、リガンド部分を、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質への結合親和性が低下したバリアントにしたかった。

７６５ＩＧＦ（配列番号２）の残基１〜１８は、ポリヒスチジン精製タグおよびいくつかのリジン残基を提供するリーダー配列である。リジン残基は、化学療法剤へのコンジュゲーションに利用できるアミノ基を有する。したがって、野生型ＩＧＦ−１またはＲ３−ＩＧＦよりも多くの化学療法剤を７６５ＩＧＦにつなぐことが可能となる。
本発明者らはまた、７６５ＩＧＦのアミノ基にメトトレキサート（ＭＴＸ）をコンジュゲートして（共有結合し）７６５ＩＧＦ−ＭＴＸコンジュゲートを作製し、このコンジュゲートがインビトロにおいて腫瘍細胞の増殖を阻害することも示した。

７６５ＩＧＦは、いくつかの驚くべき利点を有することが分かった：
・発酵させた微生物宿主１リットル当たりの、組換え微生物宿主から精製された７６５ＩＧＦの収率が、ＩＧＦ−１の他のバリアントよりも高い。
・７６５ＩＧＦは、ＩＧＦ受容体に優れた親和性で結合し、ＩＧＦ−１の別のバリアント、ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦよりも野生型ＩＧＦ−１に置き換わり、ＩＧＦ−１が結合するがん細胞上の第２の部位に７６５ＩＧＦが結合するかもしれないことを示唆する。
・メトトレキサートにコンジュゲートされた７６５ＩＧＦは、２つの他のＩＧＦバリアント−ＩＧＦ１３２およびｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦよりも、メトトレキサートの高い積載（ＩＧＦ分子当たりに共有結合した、より多くのメトトレキサート基）をもたらす。
・７６５ＩＧＦは、ＩＧＦ１３２よりも保存がより安定している。ＩＧＦ１３２は、分解してかなりの量のＩＧＦ１３２の低分子量断片を産生する。これらの低分子断片はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察される。７６５ＩＧＦは保存がより安定しており、これらの低分子断片をそれほど産生しない。

７６５ＩＧＦのリーダー配列は配列番号１である。本発明者らは、ここで、大腸菌において発現される他のサイトカインおよび他のタンパク質上のＮ−末端リーダーとして前述のリーダー配列を使用し、これまでに試験したすべてのケースにおいてこのリーダー配列は、活性型での優れた収率のタンパク質の精製を可能にした。

したがって、本発明の一実施形態は、配列番号２を含むポリペプチドを提供する。
別の実施形態は、配列番号１を含むポリペプチドを提供する。
配列番号１および配列番号２のアミノ末端メチオニンは、時に、大腸菌においてポリペプチドから切断され、したがって、一実施形態は、配列番号１の残基２〜１８を含むポリペプチドを提供する。

別の実施形態は、（ａ）配列番号１または配列番号１の残基２〜１８および（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントを含むポリペプチドを提供する。

別の実施形態は、（ａ）配列番号１または配列番号１の残基２〜１８および（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントを含むポリペプチドに共有結合された抗がん化学療法剤を含む化合物を提供する。好ましくは、抗がん化学療法剤は、ポリペプチドにおける配列番号１のリジン側鎖に共有結合される。

別の実施形態は、（ａ）配列番号１または配列番号１の残基２〜１８および（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントを含むポリペプチドに共有結合された抗がん性化学療法剤を含む化合物とがん細胞を接触させることを含む、がん細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。
同様に、別の実施形態は、哺乳動物に同じ化合物を投与することを含む、哺乳動物のがんを治療するための方法を提供する。

放射線を照射するのとほぼ同時に（すなわち放射線の照射の前または後のおよそ６時間以内に）ＩＧＦ−１によりがん細胞を刺激して分裂させることにより、がん細胞が増感され、放射線によって死滅すると考えられている。（米国特許出願公開第２００６０２５８５８９号明細書を参照されたい）したがって、一実施形態は、哺乳動物におけるがんを治療するための方法であって、哺乳動物に配列番号２または配列番号２の残基２〜８８を含むポリペプチドを投与することおよび哺乳動物に放射線を照射することを含む方法を提供する。

同様に、化学療法を行うのとほぼ同時に（すなわち化学療法を行う前または後のおよそ６時間以内に）ＩＧＦ−１によりがん細胞を刺激して分裂させることにより、がん細胞が増感され化学療法によって死滅すると考えられている。（米国特許第８，５０１，９０６号明細書を参照されたい）したがって、一実施形態は、哺乳動物におけるがんを治療するための方法であって、哺乳動物に、抗がん性化学療法剤および配列番号２または配列番号２の残基２〜８８を含むポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。

別の実施形態は、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントおよび（ｂ）（ａ）のＮ−末端にあるポリペプチドセグメントまたは（ａ）のＣ−末端にあるポリペプチドセグメントまたは（ａ）のＮ−末端および（ａ）のＣ−末端の両方にあるポリペプチドセグメントを含む融合ポリペプチドであって、ポリペプチドセグメント（ｂ）が、合計３〜４０アミノ酸残基であり、リジン残基である３〜２０アミノ酸残基またはアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基である３〜２０アミノ酸残基である融合ポリペプチドを提供する。

別の実施形態は、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上同一のバリアントおよび（ｂ）（ａ）のＮ−末端のまたは（ａ）のＣ−末端のまたは（ａ）のＮ−末端のおよび（ａ）のＣ−末端の両方のポリペプチドセグメントを含む融合ポリペプチドであって、ポリペプチドセグメント（ｂ）（複数可）が、合計３〜４０（または３〜３０もしくは３〜２０）アミノ酸残基であり、リジン残基である３〜２０アミノ酸残基またはアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基である３〜２０アミノ酸残基を含む融合ポリペプチドに共有結合された抗がん化学療法剤を含む化合物を提供する。好ましくは、化学療法剤は、融合ポリペプチドのセグメント（ｂ）のリジン残基またはアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基に共有結合される。

別の実施形態は、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上同一のバリアントおよび（ｂ）（ａ）のＮ−末端のまたは（ａ）のＣ−末端のまたは（ａ）のＮ−末端のおよび（ａ）のＣ−末端の両方のポリペプチドセグメントを含む融合ポリペプチドであって、ポリペプチドセグメント（ｂ）は、合計３〜４０アミノ酸残基であり、リジン残基である３〜２０アミノ酸残基またはアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基である３〜２０アミノ酸残基を含む融合ポリペプチドに共有結合された抗がん化学療法剤を含む化合物と、がん細胞とを接触させることを含むがん細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。好ましくは、化学療法剤は、融合ポリペプチドのセグメント（ｂ）のリジン残基またはアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基に共有結合される。

同様に、別の実施形態は、哺乳動物に同じ化合物を投与するステップを含む、哺乳動物のがんを治療するための方法を提供する。

配列番号１のリーダー配列を有する融合タンパク質における可溶型上皮増殖因子を含む融合タンパク質とベンダムスチンのコンジュゲートが、ＥｒｂＢ−１（ＥＧＦ）受容体が高いがん細胞株の異種移植片を有するマウスインビボモデルにおいて、がんを治療する、いくつかの症例においては治す、のに有効であることが本明細書において示される。ベンダムスチンコンジュゲートは、フリーのベンダムスチンよりも１０００分の１未満の濃度で同じ細胞株の細胞株の増殖を阻害した。したがって、一実施形態は、ＥｒｂＢ−１のリガンドであるサイトカインに共有結合されたベンダムスチンを含む化合物を提供する。サイトカインは融合タンパク質の一部であってもよいが、必ずしも融合タンパク質の一部ではない。

７６５ＩＧＦまたはｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦの濃度に対する、結合している放射性シグナル（放射性ＩＧＦ−１）の％を示すＩＧＦ受容体結合アッセイの結果を示す図である。 増殖阻害についての７６５ＩＧＦ−ＭＴＸのＩＣ_５０を決定するために使用した７６５ＩＧＦ−ＭＴＸによるＭＣＦ７細胞増殖阻害のプロットを示す図である。 ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸによるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の阻害アッセイの結果を示す図である。 ７６５ＥＧＦ−ベンダムスチンのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトルを示す図である。 ７６５ＥＧＦ−ベンダムスチンおよびフリーベンダムスチンの両方によるＡ−４３１細胞でのインビトロ増殖阻害のプロットを示す図である。 ７６５ＥＧＦ−ベンダムスチンのＩＣ_５０を計算する、Ａ−４３１細胞の７６５ＥＧＦ−ベンダムスチンによるインビトロ増殖阻害のプロットを示す図である。 Ａ−４３１異種移植片を有し、７６５ＥＧＦ−ベンダムスチン治療を受けているマウスにおける様々な治療群の異種移植片腫瘍増殖対治療後の時間のプロットを示す図である。 ０および５０ｐＥｑ／ｇ群、２００ｐＥ以上／ｇ群、ならびにＩＶ ２００ｐＥｑ／ｇ群についてプールしたデータを用いる７６５ＥＧＦ−ベンダムスチン研究における異種移植片腫瘍増殖のプロットを示す図である。

定義：
用語「抗がん化学療法剤」は、酵素ではなく、かつがん細胞を死滅させるかまたはがん細胞の増殖を阻害するが、非がん性細胞にはより少ない効果を有する合成、生物学的、または半合成化合物を指す。
用語「がんを治療すること」は、たとえば、転移を予防すること、がんの増殖を阻害すること、がんの増殖を停止させること、またはがんの細胞を死滅させることを含む。
特定の受容体に対するリガンドの「結合親和性」という用語は、結合定数Ｋ_Ａ（解離定数Ｋ_Ｄの反対）またはその実験的に決定された近似値を指す。
用語「代謝拮抗物質」は、天然に存在する物質と構造的な類似性を持ち、阻害剤または基質として、酵素と相互作用し、細胞のプロセスに干渉する抗がん化学療法剤を指す。例として、メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、アザシチジン、クラドリビン、およびペントスタチンを含む。
用語「サイトカイン」は、免疫応答の生成におけるように、特異的な抗原と接触したある細胞集団によって放出される、細胞間媒介物質として作用する非抗体タンパク質を指す。サイトカインは、たとえばインスリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子アルファ、トランスフォーミング増殖因子ベータ、およびインターロイキンを含む。
「ＩＧＦ−１受容体」はまた、１型ＩＧＦ受容体としても文献において知られている。
本明細書において使用される「含有する」は、オープンエンド（ｏｐｅｎ ｅｎｄｅｄ）である、すなわち、「含有する」は、他の不特定のエレメントの包含を可能にし、「含む」と同じ意味を有する。
本明細書において使用される「ＥＧＦ受容体」は、ＥｒｂＢ−１を指す。

説明：
本発明者らは、発現をＴ７プロモーターによってコントロールし、ＩＰＴＧにより誘導して、大腸菌において組換えベクターから配列番号２の配列を有する融合タンパク質を発現させた。このタンパク質は、配列番号１のＮ−末端に、精製のためのｐｏｌｙｈｉｓタグおよびいくつかのさらなるリジン残基を提供するリーダー配列を有する。このタンパク質のＣ−末端は、残基１９〜８８であり、野生型ＩＧＦ−１（配列番号３）の３位の本来のグルタミン酸と置換された、配列番号２の２１位のアルギニンを有するヒト野生型ＩＧＦ−１配列である、Ｒ３−ＩＧＦに相当する。
Ｒ３−ＩＧＦは、下記に議論されるように変異ＩＧＦ−１である。
リーダー配列としての配列番号１、その後に続くＲ３−ＩＧＦを含む７６５ＩＧＦ（配列番号２）は、高い収率で発現され、異なるリーダー配列を含む他のＩＧＦ融合タンパク質コンストラクトよりも高い収率で精製された。７６５ＩＧＦは、ＩＧＦ−１の別のバリアントであるＩＧＦ１３２よりも保存が安定していた。７６５ＩＧＦはまた、活性型の収率がほぼ１００％でリフォールディングもされ、７６５ＩＧＦは、ＩＧＦ−１の別のバリアントであるｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦよりも、ＭＣＦ７細胞上の受容体からより多くの野生型ＩＧＦ−１を置換した。

配列番号１リーダーはまた、５つのリジン残基をも提供する。７６５ＩＧＦ−メトトレキサートコンジュゲートは、７６５ＩＧＦのアミノ基にメトトレキサートのカルボキシル基のうちの１つをアミド結合によって共有結合することにより調製した。７６５ＩＧＦは、８つのリジン側鎖（配列番号１リーダー中にこれらのうちの５つ）およびアミノ末端アルファ−アミノ基を含む９つのアミノ基を有する。７６５ＩＧＦ−ＭＴＸは、ＩＧＦ単量体当たりに結合した平均約８つのメトトレキサート基を有した。ｌｏｎｇＲ３−ＩＧＦおよびＩＧＦ１３２のコンジュゲートは、ＩＧＦ単量体当たりに有したメトトレキサート基がより少なかった。つまり、これは配列番号１リーダーのもう一つの利点であった。

成熟可溶型ＥＧＦの配列に融合された、Ｎ−末端に配列番号１リーダーを有する７６５ＥＧＦと呼称される融合タンパク質もまた合成した（配列番号８）。これもまた、大腸菌においてＴ７プロモーターのコントロール下で組換えベクターから発現させ、収率は高く、良好な収率で精製された。７６５ＥＧＦはまた、生物学的活性型にリフォールディングもした。
配列番号１リーダーは、したがって、一般に、微生物宿主、特に大腸菌から良好な収率でタンパク質を発現させ、かつ良好な収率で効率的に精製するために適用可能である。配列番号１リーダーは、サイトカインの発現に特に適用可能である。

Ｒ３−ＩＧＦは、配列番号２において配列番号１を有する融合タンパク質におけるＩＧＦ−１のバリアントである。Ｒ３−ＩＧＦは、ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）を活性化するバリアントであるが、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性が低下している（野生型ＩＧＦ−１と比較して）（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：２１３−２２３；Ｔｏｍａｓ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３７：４１３−４２１）。可溶型ＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦ−１に結合する天然の血清タンパク質であり、血液循環中にＩＧＦ−１を保持しＩＧＦ−１の生物学的半減期を延ばす。しかし、ＩＧＦ−１がＩＧＦ結合タンパク質に結合すると、ＩＧＦ−１は膜ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合することができない。（Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｄ．Ｒ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４０：１９−２４．）このような理由で、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質への結合が低下したＩＧＦ−１のバリアントは、野生型ＩＧＦ−１よりもインビボにおいて活性であり、より速くにＩＧＦ受容体を標的にする。

ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性は、ラットＬ６筋芽細胞条件培地により試験することができる。増殖ラットＬ６筋芽細胞からの培地（０．２ｍｌ）を、０．３ｍｌ最終容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５中の８，０００ｃｐｍ ^１２５Ｉ−ＩＧＦ−１（およそ０．０５ｕＣｉ）、０．２５％ウシアルブミン、および０．１ｎＭ〜１ｕＭ最終濃度の試験競合者（野生型ＩＧＦ−１またはＩＧＦバリアント）と混合する。室温での９０分間のインキュベーションの後に、結合したトレーサーおよびフリーのトレーサーを分離するために、０．２ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミンを含有するアッセイバッファー中５ｍｇ／ｍｌの木炭の氷冷急速撹拌懸濁液をサンプルに追加し、氷上での８分後、混合物を５，０００ｘｇで２０分間遠心分離する。上清の放射活性をガンマカウンターでカウントする。バリアントの結合親和性は、バリアントが可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する低下した結合親和性を有するかどうかを決定するために野生型ＩＧＦと比較することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチドが、配列番号１および可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性が低下している変異ＩＧＦ−１を含む。

可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性が低下したＩＧＦ−１のいくつかの具体的なバリアントは、ＩＧＦ１３２（配列番号４）（米国特許第４，８７６，２４２号明細書において開示される）、ＬＯＮＧ−Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号５）、Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号６）、および野生型ＩＧＦ−１の最初の３つの残基を欠くｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ１（配列番号７）を含む（ＬｏｎｇＲ３−ＩＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ、およびｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ１は、Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：２１３−２２３；Ｔｏｍａｓ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３７：４１３−４２１において記載される）。したがって、特定の実施形態では、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合が低下している変異ＩＧＦ−１であるポリペプチドが、配列番号４〜７のいずれか１つを含む。

ＩＧＦ受容体は、配列番号１または配列番号１の残基２〜１８を含むポリペプチド融合物において（ｂ）本明細書において記載されるＩＧＦ−１またはＩＧＦバリアントなどのようなＩＧＦ受容体リガンドに共有結合でつながれた（ａ）抗がん化学療法剤を含むコンジュゲートにより、がんにおいて標的にされてもよい。

好ましくは、可溶型ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する親和性が低下しているＩＧＦ−１受容体リガンドは、野生型ＩＧＦ−１の少なくとも５分の１、より好ましくは少なくとも１０分の１、より好ましくは、さらに少なくとも１００分の１の、可溶型ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合親和性を有する。可溶型ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合親和性は、Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：２１３−２２３）；Ｓｚａｂｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５１：２０７−２１４）；およびＭａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：８７５４−８７６０）において記載されるように、精製ＩＧＦ−１結合タンパク質の混合物またはラットＬ６筋芽細胞条件培地（ＩＧＦ−１結合タンパク質の天然に産生された混合物）を使用する、標識ＩＧＦ−１（たとえば^１２５Ｉ ＩＧＦ−１）に対する競合結合アッセイによって測定することができる。好ましくは、変異ＩＧＦ−１は、Ｌ６筋芽細胞条件培地における可溶型ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合について標識野生型ＩＧＦ−１に対する競合結合アッセイにおいて１０ｎＭを超える、より好ましくは１００ｎＭを超えるＩＣ_５０を有する。

好ましくは、可溶型ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する親和性が低下しているＩＧＦ−１バリアントは、野生型ＩＧＦ−１に近いＩＧＦ−１受容体に対する親和性を有する（たとえば野生型ＩＧＦ−１の３０倍未満、より好ましくは野生型ＩＧＦ−１の１０倍未満）。特定の実施形態では、ＩＧＦ−１バリアントは、標識野生型ＩＧＦ−１に対する競合結合アッセイにおいて、ＩＧＦ−１受容体（たとえばＭＣＦ−７細胞上の）に対する結合が５０ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、より好ましくはさらに５ｎＭ未満、より好ましくはさらに３ｎＭ未満のＩＣ_５０を有する。このアッセイは、Ｒｏｓｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５８：２６７−２７２）およびＦｒａｎｃｉｓ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：２１３−２２３）ならびに本明細書における実施例４において記載される。

同じ組織型の正常細胞よりもがん細胞において多く見られるもう１つの受容体は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体である。（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｒ．Ｉ．ｅｔ ａｌ，２００１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３７：Ｓ９−Ｓ１５．Ｋｏｐｐ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６２：１１５−１３２．Ｆｏｘ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．２９：４１−４９．）ＥｒｂＢ−１としても知られているＥＧＦ受容体は、ＥＧＦ自体、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、およびベータセルリン（ＢＴＣ）を含むいくつかのアゴニストによって活性化される。（Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６０７１−６０７６．Ｅａｒｐ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ，２００３，Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｃｌｉｍ．Ａｓｓｏｃ．１１４：３１５−３３３．）他の３つの受容体もまた、受容体のＥＧＦファミリーのメンバーと考えられる。それらは、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、およびＥｒｂＢ−４（ヒトＥＧＦ受容体２、３、および４についてはそれぞれＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４としても知られている）である。これらの受容体、とりわけＥｒｂＢ−２は、がん性細胞上でしばしば過剰発現される。受容体ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−４は、チロシンキナーゼである。上記に列挙されたＥＧＦ受容体アゴニストは、ＥＧＦ受容体に最も強く結合する。それらは、ＥＧＦ受容体ファミリーにおける他の受容体にそれほど強く結合しない。Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）／ヘレグリンは、ＥｂｒＢ−３およびＥｒｂＢ−４のリガンドである。（Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６０７１−６０７６．Ｃａｒｒａｗａｙ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４３０３−１４３０６．Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６６：４７３−４７５．）
したがって、ＥＧＦ、ＴＧＦα、アンフィレギュリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＴＣ、およびＮＤＦもまた、配列番号１を有する融合タンパク質中にあってもよいポリペプチドである。

ＥＧＦの前駆体の配列は、配列番号９である。成熟ＥＧＦにおいて、配列番号９のアミノ末端メチオニンは除去される。（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｈ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５７：３２５−３２７．）ＴＧＦαの前駆体の配列は、配列番号１０である。成熟ＴＧＦαは、配列番号１０の残基４０〜８９であると考えられる。（Ｑｉａｎ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｇｅｎｅ １３２：２９１−２９６．Ｈｉｇａｓｈａｙａａｍ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：９３６−９３９．）アンフィレギュリンの前駆体の配列は、配列番号１１である。成熟アンフィレギュリンは、配列番号１１の残基１０１〜１８４であると考えられる。（Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１９６９−１９８１．）ＨＢ−ＥＧＦの前駆体の配列は、配列番号１２である。成熟ＨＢ−ＥＧＦは、配列番号１２の残基６３〜１４８であると考えられる。（Ｈｉｇａｓｈａｙａｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６２０５−６２１２．Ｈｉｇａｓｈａｙａａｍ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：９３６−９３９．）ベータセルリンの前駆体の配列は、配列番号１３である。成熟ベータセルリンは、配列番号１３の残基３２〜１１１であると考えられる。（Ｓａｓａｄａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９０：１１７３−１１７９．）配列番号９のシステイン残基７と２１、１５と３２、および３４と４３は、成熟ＥＧＦにおいて互いにジスルフィド架橋を形成する。（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｈ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５７：３２５−３２７．）他の天然のＥＧＦ受容体リガンドにおける相同なシステイン残基もまた、ジスルフィド架橋を形成する。（Ｈｉｇａｓｈａｙａａｍ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：９３６−９３９．）ＥＧＦ受容体に対する別のポリペプチドリガンドは、天然のＥＧＦ受容体リガンド由来の配列のキメラ、たとえば、ＥＧＦ配列およびＴＧＦα配列のキメラであるキメラＥ４Ｔであり、ＥＧＦまたはＴＧＦαよりも活性なアゴニストである。（Ｌｅｎｆｅｒｉｎｋ，Ａ．Ｅ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ，１９９８，ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３３８５−３３９７．Ｋｒａｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８７０８−８７１１．）Ｅ４ＴなどのようなＥｒｂＢ−１のアゴニストである活性なキメラもまた、配列番号１を有する融合タンパク質中にあってもよい。

本明細書において記載される配列番号１または配列番号１の残基２〜１８およびＩＧＦ−１またはバリアントＩＧＦ−１を含む融合ポリペプチドはまた、国際公開第２００５／０４１８６５号および米国特許第８，５０１，９０６号明細書および米国特許出願公開第２００６０２５８５８９号明細書において記載されるように、患者への化学療法剤または放射線療法の投与の６時間以内にがん患者に投与することによって、化学療法または放射線の有効性を強化するために使用することもできる。

本発明の別の実施形態は、（ａ）ＩＧＦまたはＩＧＦバリアントまたはＥＧＦまたは別のＥｒｂＢ−１リガンドまたはそのバリアントと、（ｂ）化学療法剤がコンジュゲートされてもよいさらなるアミノ酸残基、特にリジン残基、グルタミン酸残基、またはアスパラギン酸残基を有する別のポリペプチドセグメントとを含む融合タンパク質を提供する。ＩＧＦ−１は、３つのリジン残基しか有しておらず、ＥＧＦは、２つのリジン残基しか有していない。化学療法剤の積載を高めるために、本発明者らは、さらなる反応性のアミノ酸残基、特にリジン残基を有し、化学療法剤をコンジュゲートすることができる融合タンパク質セグメントを、ＩＧＦ−１またはＥＧＦセグメント（ａ）に追加することが有利であることを発見した。

したがって、本発明の一実施形態は、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントと、（ｂ）（ａ）のＮ−末端または（ａ）のＣ−末端または（ａ）のＮ−末端のおよび（ａ）のＣ−末端の両方にある１つまたは複数のポリペプチドセグメントと、を含む融合ポリペプチドであって、１つまたは複数のポリペプチドセグメント（ｂ）が、合計３〜４０（または３〜２０もしくは３〜６０または５〜２０もしくは５〜６０）アミノ酸残基であり、リジン残基である３〜２０アミノ酸残基またはアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基である３〜２０アミノ酸残基を含む融合ポリペプチドを提供する。

特定の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドセグメント（ｂ）が、リジンである３〜２０（または３〜１０または５〜２０もしくは５〜１０）アミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、１つまたは複数のセグメント（ｂ）の残基の少なくとも２０％が、リジン残基である。
他の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドセグメント（ｂ）が、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基である３〜２０（または３〜１０または５〜１０もしくは５〜１０）アミノ酸残基を含む（すなわち、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基の合計が記載される数と等しい）。特定の実施形態では、１つまたは複数のセグメント（ｂ）の残基の少なくとも２０％が、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基である。

この融合タンパク質の特定の実施形態では、ポリペプチドセグメント（ａ）が、ＩＧＦ−１または配列番号３および４のいずれかに少なくとも９０％の同一性を有するＩＧＦ−１のバリアントを含む。

この融合タンパク質の別の特定の実施形態では、ポリペプチドセグメントが、（ａ）配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１か、または配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１と９０％以上の同一性を有するバリアントを含む。

本発明の別の実施形態は、ＥｒｂＢ−１またはＩＧＦＲ１のリガンドを含む融合ポリペプチドに共有結合された化学療法剤を含む化合物を提供する。
より詳細な実施形態では、化学療法剤が、ポリペプチドにおけるセグメント（ｂ）（複数可）の１以上のリジン残基側鎖に共有結合される。
化学療法剤が１つまたは複数のセグメント（ｂ）の１つ以上のリジン残基側鎖に共有結合されるさらに具体的な実施形態では、化学療法剤は、メトトレキサート、クロラムブシル、またはベンダムスチンなどのような、遊離カルボキシル基を有するものであってもよい。

本明細書において記載される方法の特定の実施形態では、治療されるがんが、肺がん、前立腺がん、大腸がん、乳がん、膵がん、白血病、肝がん、胃がん、卵巣がん、子宮がん、精巣がん、脳がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、黒色腫、または脳がんである。
ＥｒｂＢ−１のリガンドであるサイトカインを含む融合タンパク質を含むコンジュゲートによる方法の特定の実施形態では、がんが、上皮細胞がんである。

特定の実施形態では、ポリペプチドにコンジュゲートされる化学療法剤が、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトキサントロン、メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、アザシチジン、クラドリビン、ペントスタチン、シスプラチン、カルボプラチン、ミトタン、プロカルバジン、またはアムサクリンである。

受容体リガンドに抗がん化学療法剤を結合するためのガイドライン
インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体の天然のリガンドは、タンパク質、すなわちインスリン、ＩＧＦ−１、およびＩＧＦ−２である。化学療法剤は、典型的に、タンパク質に存在する反応基によってタンパク質に結合させる。これらは、Ｎ−末端アルファアミノ基、Ｃ−末端アルファカルボキシル基、リジンの側鎖アミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖カルボキシル基、システインの側鎖チオール、ならびにアルギニンの側鎖を含む。タンパク質に見られる他の反応性の側鎖は、セリンおよびトレオニンの側鎖ヒドロキシル、チロシンのヒドロキシアリール、ヒスチジンのイミダゾール、ならびにメチオニン側鎖である。

同じ反応基の多くは、化学療法剤ならびにインスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体の非タンパク質性リガンドに見い出される。したがって、本明細書において議論されるタンパク質の修飾および架橋の原理の多くはまた、化学療法剤および非タンパク質性リガンドの修飾および架橋にも適用される。
タンパク質コンジュゲーションおよび架橋の化学および原理は、Ｗｏｎｇ，Ｓｈａｎ Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９１，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａにおいて記載される。この化学についての情報についての他のソースは、ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｃａｔａｌｏｇ；およびＧｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．，ａｎｄ Ｗｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびそこに引用される参考文献を含む。

アミノ酸側鎖の中で最も強い求核剤は、還元システイン側鎖のチオールである。チオールは、ほとんどのタンパク質修飾試薬と反応する。アルファ−ハロアセトアミドおよびマレイミドは、システイン残基と、特にｐＨ７．０以下で特異的に反応すると考えられる。チオールは、ジスルフィド交換によってジスルフィド試薬とも反応する。

アミノ基は、タンパク質に見出されるれる次に強い求核剤である。アルデヒドは、アミノ基と反応し、シッフ塩基を形成する。シッフ塩基は加水分解可能であり、これは本発明において利点となり得る。リガンド−化学療法剤コンジュゲートのがん細胞の中への取込みと共に、いくつかのケースでは、化学療法剤が活性となるためにコンジュゲートから化学療法剤を切断する必要がある。化学療法剤が加水分解可能な連結などのような切断可能な連結によってリガンドに連結される場合、これはより良好に達成される。切断可能な連結は、自然にまたは細胞の酵素によって切断することができる。たとえば、アミド結合は、プロテアーゼを含むいくつかの酵素によって切断される。シッフ塩基の結合は、かなりの割合で自然に加水分解する。ジスルフィドの結合は、がん細胞の細胞内還元的環境において還元的に切断されることが期待される。

アルデヒドとのアミノ基の反応によって形成されるシッフ塩基は、たとえば水素化ホウ素ナトリウムまたはピリジンボランによる還元によって安定化することができる。ピリジンボランは、インスリン、ＩＧＦ−１、およびＩＧＦ−２において見られ、それらのタンパク質の構造にとって不可欠であるジスルフィドを還元しないという利点を有する。
いくつかの化学療法剤において見られる、隣接する炭素上にヒドロキシル基を有する糖または他の成分は、たとえば過ヨウ素酸塩により糖を酸化することによって、アミノ基と反応するように修飾することができる。これは、炭素間を切断し、ジアルデヒドを産生する。アルデヒド基がアミノ基と反応する。
グルタルアルデヒドなどのようなジアルデヒドは、アミノ基を有する２つの分子を架橋するであろう。
他のアミノ試薬は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、または酸無水物（たとえば無水コハク酸）などのような活性化カルボニルを含む。

アミノ基は、ハロゲン化スルホニルおよびハロゲン化アリール（たとえば２，４−ジニトロフルオロベンゼン）とも反応する。

アミノ基はまた、イソシアネートおよびイソチオシアネートと反応し、尿素またはチオ尿素誘導体を形成する。

イミドエステルは、アミノ基に対する最も特異的なアシル化剤である。イミドエステルは、約７〜１０のｐＨで、アミンと特異的に反応し、イミドアミドを形成する。この反応は、もとのアミノ基で、正に荷電している基、イミドアミドを生成することによって電荷安定性を維持するという利点を有する。イミドアミドはまた、中性を超えるｐＨでゆっくりと加水分解し、これはまた、加水分解によりがん細胞において遊離化学療法剤を放出することができるという点で利点ともなり得る。

カルボキシル基は、穏やかな酸性条件、たとえばｐＨ５下で、ジアゾアセテートおよびジアゾアセトアミドと特異的に反応する。

カルボキシルの中で最も重要な化学修飾は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）および３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのようなカルボジイミドを使用する。アミンの存在下において、カルボジイミドは、２ステップでカルボキシルにアミド結合を形成する。第１のステップにおいて、カルボキシル基は、カルボジイミドに追加され、Ｏ−アシルイソ尿素中間体が形成される。アミンとの続く反応により、対応するアミドがもたらされる。

特に重要なカルボジイミド反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによりカルボキシルを活性化し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成におけるその使用である。

アルギニンは、グリオキサール、２，３−ブタンジオン、および１，２−シクロヘキサンジオンなどのような近接するジアルデヒドまたはジケトンと反応する。安定化が所望される場合、ホウ酸は付加物を安定化し得る。

反応基はまた、上記の反応のいくつかによって他の反応基と置換することができる。たとえば、無水コハク酸などのような酸無水物によるアミノ基の修飾は、正に荷電しているアミノ基を遊離カルボキシル基と置換する。同様に、カルボジイミドおよびエチレンジアミンなどのようなジアミンとのカルボキシル基の反応は、カルボキシル基を遊離アミノ基と置換する。

架橋：上記に記載される反応基のうちの２つ、たとえば２つのアミノ反応基またはアミノ反応基およびチオール反応基を含有する試薬は、適切な基のうちの一方を含有する化学療法剤を、他方の適切な基を含有するインスリン受容体リガンドまたはＩＧＦ−１受容体リガンドに架橋するために使用することができる。また、カルボジイミドまたはカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたカルボキシル（たとえば化学療法剤の）は、アミノ基（たとえばタンパク質リガンドの）と反応することができ、アミド結合架橋を形成する。

活性化されたカルボキシルは、単離するのに十分に安定しているが、次いで、アミノ基と容易に反応し、アミド結合を形成するであろう。
Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオナート（ＳＰＤＰ）などのようなスクシンイミドは、アミノ基を通して２つの化合物をつなぐために使用することができる。（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔａｌｏｇおよびＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−１５８．を参照されたい）

本発明の説明：
１．配列番号１または配列番号１の残基２〜１８を含むポリペプチド。
２．ポリペプチドが、Ｎ−末端を有し、配列番号１または配列番号１の残基２〜１８が、ポリペプチドのＮ−末端にある、説明１のポリペプチド。
３．ポリペプチドが、サイトカインをさらに含む融合タンパク質である、説明１〜２のいずれかのポリペプチド。
４．サイトカインが、ＥｒｂＢ−１またはＩＧＦＲ１のリガンドである、説明３のポリペプチド。
４ｂ．サイトカインが、腫瘍壊死因子−アルファである、説明３のポリペプチド。
４ｃ．ポリペプチドが、配列番号１７または配列番号１７の残基２〜１７５を含む、説明４ｂのポリペプチド。
５．ポリペプチドが、（ａ）配列番号１または配列番号１の残基２〜１８および（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントを含む、説明４のポリペプチド。
５ａ．セグメント（ｂ）が、配列番号３、配列番号４、または配列番号３もしくは配列番号４に９０％以上の同一性を有するバリアントである、説明５のポリペプチド。
５ｂ．セグメント（ｂ）が、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントである、説明５のポリペプチド。
５ｃ．セグメント（ｂ）が、配列番号９の残基２〜５４である、説明５ｂのポリペプチド。
５ｄ．セグメント（ｂ）が、配列番号６および配列番号７から選択される、配列番号３に９０％以上の同一性を有するバリアントである、説明５のポリペプチド。
６．ポリペプチドが、配列番号２または配列番号２の残基２〜８８を含む、説明５のポリペプチド。

７．説明５のポリペプチドに共有結合された抗がん化学療法剤を含む化合物。
８．化学療法剤が、ポリペプチドにおいて配列番号１の残基２〜１８の１つまたはそれを超えるリジン残基側鎖に共有結合されている、説明７の化合物。
９．化学療法剤が、メトトレキサートである、説明７の化合物。
１０．化学療法剤が、メトトレキサート、クロラムブシル、およびベンダムスチンからなる群から選択される、説明５の化合物。
１１．配列番号２または配列番号２の残基２〜８８を含むポリペプチドに共有結合されたメトトレキサートを含む、説明９の化合物。
１２．メトトレキサートが、化学療法剤のカルボキシル基とポリペプチドのアミノ基との間のアミド結合によって結合される、説明１１の化合物。

１３．説明７〜１２のいずれか１つの化合物とがん細胞を接触させることを含む、がん細胞の増殖を阻害する方法。
１４．接触がインビトロにおけるものである、説明１３の方法。
１５．接触がインビボにおけるものである、説明１３の方法。
１６．接触がヒトにおけるインビボにおけるものである、説明１５の方法。
１７．接触が非ヒト哺乳動物におけるインビボにおけるものである、説明１５の方法。
１８．説明７〜１２のいずれか１つの化合物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるがんを治療するための方法。
１９．哺乳動物がヒトではない、説明１８の方法。
２０．哺乳動物がヒトである、説明１８の方法。
２１．哺乳動物に配列番号２または配列番号２の残基２〜８８を含むポリペプチドを投与するステップおよび哺乳動物に放射線を投与するステップを含む、哺乳動物におけるがんを治療するための方法。
２２．抗がん化学療法剤および哺乳動物に配列番号２または配列番号２の残基２〜８８を含むポリペプチドを投与することを含む、哺乳動物におけるがんを治療するための方法。

２３．（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントおよび（ｂ）（ａ）のＮ−末端のまたは（ａ）のＣ−末端のまたは（ａ）のＮ−末端のおよび（ａ）のＣ−末端の両方の１つまたは複数のポリペプチドセグメントを含む融合ポリペプチドであって、１つまたは複数のポリペプチドセグメント（ｂ）は、合計３〜４０アミノ酸残基であり、リジン残基である３〜２０アミノ酸残基またはアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基である３〜２０アミノ酸残基を含む融合ポリペプチド。
２３ａ．セグメント（ｂ）が、配列番号１または配列番号１の残基２〜１８であり、セグメント（ａ）のＮ−末端である、説明２３の融合ポリペプチド。
２３ｂ．１つまたは複数のポリペプチドセグメント（ｂ）が、リジン残基である３〜１０アミノ酸残基またはアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基である３〜１０アミノ酸残基を含む、説明２３の融合ポリペプチド。
２４．ポリペプチドセグメント（ｂ）が、リジンである３〜２０アミノ酸残基を含む、説明２３の融合ポリペプチド。
２５．ポリペプチドセグメント（ａ）が、ＩＧＦ−１または配列番号３および４のいずれかに少なくとも９０％の同一性を有するＩＧＦ−１のバリアントを含む、説明２３または２４の融合タンパク質。
２６．ポリペプチドセグメント（ａ）が、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、または残基３２〜１１１もしくは配列番号１３または配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントを含む、説明２３または２４の融合タンパク質。

２７．説明２３〜２６のいずれか１つの融合ポリペプチドに共有結合された化学療法剤を含む化合物。
２７ａ．ポリペプチドセグメント（ａ）が、配列番号３もしくは配列番号４または配列番号３および４のいずれか１つに少なくとも９０％の同一性を有するバリアントを含む、説明２７の化合物。
２７ｂ．融合ポリペプチドが、配列番号２または配列番号２の残基２〜８８を含む、説明２７ａの化合物。
２７ｃ．ポリペプチドセグメント（ａ）が、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、残基３２〜１１１もしくは配列番号１３または配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上同一のバリアントを含む、説明２７の化合物。
２８．化学療法剤が、ポリペプチドにおけるセグメント（ｂ）の１つ以上のリジン残基側鎖に共有結合されている、説明２７の化合物。
２９．化学療法剤がメトトレキサートである、説明２８の化合物。
３０．化学療法剤が、メトトレキサート、クロラムブシル、およびベンダムスチンからなる群から選択される、説明２８の化合物。
３１．化学療法剤が、ポリペプチドにおいてセグメント（ｂ）の１つ以上のアスパラギン酸側鎖またはグルタミン酸側鎖に共有結合されている、説明２７の化合物。

３２．説明２７〜３１のいずれか１つの化合物とがん細胞を接触させることを含む、がん細胞の増殖を阻害する方法。
３３．接触がインビトロにおけるものである、説明３２の方法。
３４．接触がインビボにおけるものである、説明３２の方法。
３５．接触がヒトにおけるインビボにおけるものである、説明３４の方法。
３６．接触が非ヒト哺乳動物におけるインビボにおけるものである、説明３４の方法。

３７．説明２７〜３１のいずれか１つの化合物を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物におけるがんを治療するための方法。
３８．哺乳動物が、ヒトではない、説明３７の方法。
３９．哺乳動物が、ヒトである、説明３７の方法。

４０．ベンダムスチンに共有結合された、ＥｒｂＢ−１のリガンドであるサイトカインを含むポリペプチドを含む化合物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてがんを治療するための方法。
４１．ポリペプチドが、サイトカインのＮ−末端またはＣ−末端にある１つ以上の非サイトカインセグメントを含む融合タンパク質である、説明４０の方法。
４２．サイトカインが、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、残基３２〜１１１もしくは配列番号１３または配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、残基３２〜１１１もしくは配列番号１３に９０％以上の同一性を有するバリアントである、説明４０の化合物。
４３．ポリペプチドが配列番号８を含む、説明４０の方法。

４４．ＥｒｂＢ−１のリガンドであるサイトカインを含むポリペプチドに共有結合されたベンダムスチンを含む化合物。

大腸菌における発現について最適化されたヌクレオチド配列を有し、Ｔ７プロモーターのコントロール下にある、以下のタンパク質をコードするプラスミドは、ＤＮＡ２．０社（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって合成された。

コードされるタンパク質 説明 配列
４０３ＩＧＦ Ｈｉｓ６−ＩＧＦ 配列番号：１４
７６４ＩＧＦ Ｈｉｓ６−Ｋ５−ＩＧＦ１３２ 配列番号：１８
７６５ＩＧＦ Ｈｉｓ６−Ｋ５−Ｒ３ＩＧＦ 配列番号：２
７８４ＩＧＦ ｍｕｔＴｒｘ−Ｒ３ＩＧＦ 配列番号：１５
７８５ＩＧＦ ｍｕｔＴｒｘ−ＩＧＦ１３２ 配列番号：１６

大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を、それぞれのプラスミドで形質転換し、形質転換体を単離した。それぞれの１０ｍｌの形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物を、２Ｌバッフル付きフラスコ中５０ｕｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５００ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ−ｋａｎ）に接種するために使用した。これらを、０．６のＯ．Ｄ．６００ｎｍで、最終０．４ｍＭＩＰＴＧにより誘導し、２５℃で一晩増殖させた。

細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０中に再懸濁し、凍結した。それらを解凍し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、細胞ペースト１ｇ当たり０．５ｍｇリゾチーム中、５％湿重量／容量の細胞重量で室温で３０分間インキュベートした。次いで、それらを超音波処理し、細胞を破壊した。ＭｇＣｌ_２を３ｍＭの最終濃度で追加し、２５０μｌのＢＥＮＺＯＮＡＳＥを培養物１リットル当たりに追加した。これを室温でさらに１時間インキュベートした。

封入体を遠心分離によって単離した。可溶性画分を保存した。
封入体を、７Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ｐＨ７．８中で可溶化した。
可溶化した封入体を、カラム中１ｍｌのＮｉ−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂にロードした。カラムをＮｉ−Ａバッファーにより洗浄し、Ｎｉ−Ｂバッファーにより溶出した。
Ｎｉ−Ａ ６Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．３。
Ｎｉ−Ｂ ６Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．４Ｍイミダゾール、ｐＨ７．３。

タンパク質収量は以下のとおりであった。
４０３ＩＧＦ溶出物３．６ｍｇ
７６４ＩＧＦ溶出物１６ｍｇ
７６５ＩＧＦ溶出物２４ｍｇ
７８４ＩＧＦ溶出物６．７ｍｇ
７８５ＩＧＦ溶出物１．９ｍｇ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、溶出物ならびに粗不溶性画分および粗可溶性画分について実行した。７８４ＩＧＦおよび７８５ＩＧＦは、可溶性画分中にＩＧＦの約半分、不溶性画分中に半分を有したようであった。４０３ＩＧＦ、７６４ＩＧＦ、および７６５ＩＧＦは、不溶性画分中にＩＧＦのほぼすべてを有するようであった。

このデータから、収量は７６５ＩＧＦで最も良好であった。配列番号１リーダー配列を有するもの（７６４ＩＧＦおよび７６５ＩＧＦ）は、単純なＭｅｔ−Ｈｉｓ６リーダー（４０３ＩＧＦ）を有するもの、またはチオレドキシンリーダー配列（７８４ＩＧＦおよび７８５ＩＧＦ）を有するものよりも良好な収量をもたらした。また、ＩＧＦ部分についてＲ３ＩＧＦ変異を有するコンストラクト（７６５ＩＧＦおよび７８４ＩＧＦ）は、融合タンパク質のＩＧＦ部分についてＩＧＦ１３２変異を有する対応するコンストラクト（７６４ＩＧＦおよび７８５ＩＧＦ）よりも良好な収量をもたらした。

実施例２
リフォールディングおよび結合アッセイ
実施例１の各２ｍｌのもとのＮｉ溶出物を、およそ等容量の１００ｍＭグリシン、６Ｍ尿素、ｐＨ９．５と混合し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ ３ｋＤａフィルターユニットで限外濾過によって濃縮し、次いで、前記バッファー中に再び戻し、約４２０μｌまで濃縮した。次いで、それらを４０３ＩＧＦ、７６４ＩＧＦ、および７６５ＩＧＦについては２ｍｇ／ｍｌ、７８４ＩＧＦについては４ｍｇ／ｍｌ、７８５ＩＧＦについては２．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。

これらの各２００μｌを、１．８ｍｌのリフォールディングバッファーと急速に混合した。リフォールディングバッファーは、１．４Ｍ尿素、１００ｍＭグリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１９％エタノール、０．５ｍＭ ＧＳＳＧ、４ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ９．５とした。それらを３時間室温でリフォールディングし、次いで、Ｉ−１３２放射性野生型ＩＧＦ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）に対して、ＩＧＦ受容体への競合結合を結合アッセイで試験した。比較のために、市販のＬｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ（ＬＲ３ＩＧＦ）も試験した。

この実験においておよその結合定数（ＫＤ）は、以下のとおりであった。
ＬＲ３ＩＧＦ １ｎＭ
４０３ＩＧＦ ２ｎＭ
７６４ＩＧＦ １００ｎＭ
７６５ＩＧＦ １０ｎＭ
７８４ＩＧＦ ３ｎＭ
７８５ＩＧＦ ４０ｎＭ

Ｒ３ＩＧＦバリアント（ＬＲ３ＩＧＦ、７６５ＩＧＦ、および７８４ＩＧＦ）を含む融合タンパク質は、ＩＧＦ１３２バリアント（４０３ＩＧＦ、７６４ＩＧＦ、および７８５ＩＧＦ）を含むものよりもＫ_Ｄが低かった。

実施例３
７６５ＩＧＦの精製および収量
Ｔ７プロモーターのコントロール下に７６５ＩＧＦ遺伝子を有し、大腸菌についての最適化コドン使用頻度を有する７６５ＩＧＦをコードするプラスミドは、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって合成された。大腸菌Ｂ１２１株（ＤＥ３）を前記プラスミドにより形質転換し、ファーメンター培養において増殖させ、ＩＰＴＧにより誘導した。

７６５ＩＧＦは、イオン交換クロマトグラフィーおよびニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって変性条件下で精製した。精製７６５ＩＧＦの収量は、培養物１リットル当たり約６０ｍｇであった。
７６５ＩＧＦを、実施例２と同様の手順によってリフォールディングし、次いで、リフォールディングしたタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。

実施例４
ＩＧＦ−１受容体への７６５ＩＧＦ結合アッセイ
方法：
アッセイの理論：放射性^１２５Ｉ標識インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）は、インビトロにおいて、ＭＣＦ７細胞（ヒト乳がん細胞株）上に豊富な１型ＩＧＦ受容体への結合について試験リガンドと競合する。試験するリガンドは、本発明者らのインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の７６５ＩＧＦバリアント、および７６５ＩＧＦと結合した葉酸代謝拮抗剤メトトレキサートを含有する本発明者らの新規な共有結合コンジュゲート、ならびに比較およびポジティブコントロールとしての市販で入手可能なｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含む。

ＭＣＦ７細胞培地：５００ｍＬ ＭＥＭ、０．０１ｍｇ／ｍＬウシインスリン；５ｍＬピルビン酸ナトリウム、５ｍＬ非必須アミノ酸、１０ｍＬ炭酸水素ナトリウム、１０ｍＬウシ胎児血清、５ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン。
ＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）を、４８ウェル組織培養プレート（平底、低蒸発蓋を有り）に０．５ｍＬ／ウェルの容量でウェル当たり２０，０００細胞でまき、５％ＣＯ_２、３７℃に設定した細胞培養インキュベーター中に置いた。培養の２〜３日後、プレートを、ウェル当たり０．５ｍＬの冷結合アッセイバッファー（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．２；１２０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４；０．１％ＢＳＡ）により２×洗浄した。最終の洗浄の後に、０．５ｍＬの結合アッセイバッファーをそれぞれのウェルに追加し、プレートを２〜６時間４℃で置いた。

試験リガンドは、２００ｕｌの容量で５ｍＭ ＨＣｌ中１０マイクロモル（ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ）または２０マイクロモル（７６５ＩＧＦおよびＩＧＦ−ＭＴＸ）の濃度で調製した。濃度を決定するために、７６５ＩＧＦ（９７４２ダルトン）およびｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ（９１１１ダルトン）の分子量を使用する。ｌｏｎｇ−Ｒ３については、凍結乾燥した市販の物質を、１０ｍＭ ＨＣｌ中に１．０ｍｇ／ｍｌで溶解し、これを、９１ｕｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、１０ｕＭ溶液にする。
７６５ＩＧＦおよびｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦは、２０００ｎＭ〜１ｎＭの濃度でウェルにおいて結合バッファー中に希釈した。
次に、Ｉ−１２５ＩＧＦの２５ｕＣｉロット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を、１ｍｌの水中に溶解した。結合バッファー中への適切な希釈液を作製し、次いで、５０ｕｌの希釈放射性ＩＧＦをそれぞれのウェルに加えてウェル当たり０．０３ｕＣｉ以上を加えた。新鮮なＩ−１２５ＩＧＦについて、使用するプレート当たり、Ｉ−１２５ＩＧＦの１ｍｌの水溶液のうちの１００ｕｌを、使用するプレート当たり２．６ｍｌの結合バッファーに追加することができ、５０ｕｌをウェルに追加する。
次いで、プレートを４℃で一晩インキュベートした。次いで、液体を、マイクロピペッターによりそれぞれのウェルから取り出し、ウェルを、結合バッファーで２度洗浄した。細胞を、０．５ｍＬ ３００ｍＭ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳにより溶解し、溶解物をガンマカウンターで数えた。

結果：
７６５ＩＧＦおよび市販のｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦについてのＩＧＦ−１受容体結合アッセイの結果を図１に示す。高濃度で、７６５ＩＧＦは、一貫してｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦよりも多くの放射活性を減少させ、ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦが結合しない膜上のＩＧＦ−１結合部位に７６５ＩＧＦが結合するかもしれないことを示唆する。このアッセイにおける７６５ＩＧＦのＫ_Ｄは１ｎＭ未満であったが、ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦのＫ_Ｄは約３ｎＭであった。

実施例５
７６５ＩＧＦへのメトトレキサートのコンジュゲーション
タンパク質を、ｐＨ７．３コンジュゲーションバッファーにバッファー交換し、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調節した。
ｐＨ７．３コンジュゲーションバッファー：２５ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、ｐＨ７．３。
ｐＨ６．３コンジュゲーションバッファーは、ｐＨ６．３の同じバッファーとする。
メトトレキサートを、２０ｍｇ／ｍｌでｐＨ６．３コンジュゲーションバッファーに溶解し、ｐＨをＮａＯＨによりｐＨ６．３に調節した。
１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を、７５ｍｇ／ｍｌでｐＨ６．３コンジュゲーションバッファーに新たに溶解した。
１容量のＥＤＣ溶液を１容量のＭＴＸ溶液に追加し、室温で３０秒間インキュベートし、次いで、この混合物を、ｐＨ７．３コンジュゲーションバッファー中８容量の２．５ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液に追加した。
混合物を混合し、次いで、室温で一晩反応させた。次いで、６Ｍ ＨＣｌを最終濃度６０ｍＭで反応混合物に追加した。次いで、反応混合物を１０ｍＭ ＨＣｌにバッファー交換した。

結果：
タンパク質１モル当たりにコンジュゲートされたメトトレキサートの量は、１ｍＭ当たり２１．６のメトトレキサート基のモル吸光係数を使用し、１００ｍＭ ＨＣｌにおいて３０５ｎｍでのコンジュゲートの吸光度を測定することによって決定した（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，１９７６，５：２８３−３０６．）タンパク質濃度は、定量的アミノ酸分析によって決定した。これによって、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸコンジュゲートにおけるＩＧＦに対するＭＴＸ基のモル比は、およそ８となった。

実施例６
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸインビトロ細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイ．この効力アッセイは、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸとのインキュベーションによるインビトロにおけるＭＣＦ−７腫瘍細胞の増殖阻害アッセイである。
方法
０日目．０日目に、１ウェルにつき５０００のＭＣＦ７細胞を、１００ｕｌの富栄養培地に９６ウェル試験プレートにまいた。
１日目．シャドウプレート（ｓｈａｄｏｗ ｐｌａｔｅ）を、それぞれの試験プレートについて作製し、シャドウプレートのそれぞれのウェルは、それぞれのウェルにおいて培地または３×の予定最終濃度の試験薬剤を培地中に含有した。ネガティブコントロールとして、培地を使用する。ポジティブコントロールとして、３ｕＭのフリーのメトトレキサートを使用する。
シャドウプレートを作製した後、５０ｕｌを、シャドウプレートのそれぞれのウェルから試験プレートの対応するウェルに移し、試験プレートのウェルにおいて最終濃度の試験薬剤を生成した。
５日目．細胞増殖は、メーカーの指示に従って、Ｄｏｊｉｎｄｏ ＣＣＫ−８試薬を追加し、インキュベートし、色素の吸光度を測定することによって決定する。

結果：
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸによる代表的な細胞傷害性アッセイの結果を図２に示す。７６５ＩＧＦ−ＭＴＸのＩＣ_５０（細胞増殖の５０％の阻害に必要とされる濃度）は、１Ｌ当たり２４９ｎ当量であった。（ナノ当量は、７６５ＩＧＦにコンジュゲートされたメトトレキサート基のナノモルである。）比較のために、同じアッセイにおいて、フリーのメトトレキサートのＩＣ_５０を測定し、８８ｎＭとなった。
比較のために、ＬＲ３ＩＧＦ−ＭＴＸコンジュゲート（ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦにコンジュゲートされたメトトレキサート）は、約４００ｎＥｑ／ＬのＩＣ_５０を有した（ＭｃＴａｖｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５３：２７５−２８２）。

実施例７
メトトレキサートおよびＩＧＦ−メトトレキサートコンジュゲートによるジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害
方法：
実験は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）のジヒドロ葉酸レダクターゼアッセイキットによりメーカーの指示に従って、行った。アッセイにおいて、ジヒドロ葉酸レダクターゼをｐＨ７．５バッファーと混合する。次に、阻害剤−メトトレキサートまたはＩＧＦ−メトトレキサートコンジュゲート−を追加し、溶液を混合する。それを、３０秒間インキュベートして阻害剤を結合させた。次いで、ＮＡＤＰＨを５０ｕＭ最終濃度５０ｕＭで追加し、次いで、ジヒドロ葉酸を最終濃度６０ｕＭで追加する。反応を、３４０ｎｍで吸光度を測定することによってモニターする。

結果：
試験したコンジュゲートは、以下のとおりであった。
実施例４において記載されるように調製した７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ。７６５ＩＧＦは、メトトレキサートにコンジュゲートするのに利用可能な９つのアミノ基（８つのリジンおよびＮ−末端アミノ基）を有する。このバッチは、７．５のＭＴＸ：タンパク質モル比を有した。
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ １／３。このコンジュゲートは、コンジュゲーション反応において、通常の濃度の１／３のＭＴＸおよびＥＤＣにより調製した。これにより、１．２のＭＴＸ：タンパク質モル比を有するコンジュゲートを産生した。
ＬＲ３ＩＧＦ−ＭＴＸ。この場合、ＩＧＦのバージョンは、ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦである。これは、コンジュゲーションについて４つの利用可能なアミノ基（３つのリジン側鎖およびＮ−末端アミノ基）を有する。このコンジュゲートは、２．８のＭＴＸ：タンパク質比を有した。
加えて、フリーのメトトレキサートを試験した。
コンジュゲートは、阻害アッセイにおけるそれらの使用の前に、フリーのメトトレキサートを完全に除去するために徹底的に限外濾過した。
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸについての阻害データのプロットを図３に示す。
メトトレキサートおよびコンジュゲートのＩＣ_５０は、このとおりであった。

競合相手 ＩＣ５０ ＭＴＸ：ＩＧＦ比
メトトレキサート ５．３ｎＭ Ｎ．Ａ．
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ ９５ｎＥｑ／Ｌ ７．５
１／３ ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ ９０ １．２
ＬＲ３ＩＧＦ−ＭＴＸ ９９ ２．８

ｎＥｑ／ＬでのＩＣ_５０は、ＩＧＦタンパク質単量体当たりにコンジュゲートされたＭＴＸ基の数が異なったにもかかわらず、３つすべてのＩＧＦ−ＭＴＸコンジュゲートについてほぼ同じであった。これは、それぞれのコンジュゲートされたメトトレキサート基が、独立した酵素の阻害剤として作用することを示す。一度、１つの基がＤＨＦＲ酵素に結合したら、コンジュゲート単量体上のさらなるメトトレキサート基が立体的にＤＨＦＲ酵素に結合することができず、阻害できないならば、コンジュゲートのＩＣ_５０は、観察されるように、ｎＥｑ／Ｌ ＭＴＸ基濃度の点から同じとなる代わりに、コンジュゲートそれぞれのタンパク質濃度ｎＭについて同じとなるであろうということが期待されるであろう。阻害がＭＴＸ基に比例するので、より高度なＭＴＸ積載を有する７６５ＩＧＦ−ＭＴＸは、１３ｎＭのタンパク質濃度の阻害定数を有し（９５ｎＥｑ／ＬをＩＧＦ当たり７．５ＭＴＸで割ると１３ｎＭ ＩＧＦとなる）、それに対して、ＬＲ３ＩＧＦ−ＭＴＸは、３５ｎＭのタンパク質濃度の阻害定数を有する。したがって、ＭＴＸのより高度な積載により、ＤＨＦＲの同じ阻害、また推測では同じレベルの腫瘍細胞の死滅を実現するために使用される７６５ＩＧＦタンパク質はより少量しか必要とされない。
データは、タンパク質コンジュゲートＭＴＸ基がＤＨＦＲを阻害するが、フリーＭＴＸと比較して、より高い濃度が阻害に必要とされることを示す。

実施例８
７６５ＥＧＦ
配列番号８を有するタンパク質７６５ＥＧＦを合成した：
ＭＶＫＧＫＨＨＨＨＨＨＮＧＫＧＫＳＫ ＮＳＤＳＥＣＰＬＳＨ ＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣ ＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡ ＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥ ＲＣＱＹＲＤＬＫＷＷ ＥＬＲ（配列番号８）。
上記の下線を引いた部分は、７６５ＩＧＦにも見出される配列番号１リーダー配列である。下線を引いていない部分は、成熟可溶型のヒト上皮増殖因子のアミノ酸配列である。Ｔ７プロモーターの発現コントロール下に、大腸菌の最適化コドン使用頻度を有するこのタンパク質をコードするプラスミドを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって合成した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をプラスミドにより形質転換し、タンパク質を発現させるために使用した。タンパク質は、２ＸＹＴ培地＋２．１ｇ／Ｌデキストロース、５０ｕｇ／ｍｌカナマイシンにおける増殖により発現させた。０．４ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、５時間後に回収した。
７６５ＥＧＦタンパク質は封入体に見出された。封入体を単離し、可溶化し、７６５ＥＧＦタンパク質は、６Ｍ尿素および２０ｍＭメルカプトエタノール中での変性条件下でイオン交換クロマトグラフィーおよびＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。収量は優れていた：培養物１リットル当たり８３．５ｍｇの精製７６５ＥＧＦ。

Ｎｉ溶出バッファー中２ｍｇ／ｍｌ以下のＮｉ精製タンパク質は、１．６Ｍ尿素、２０％１９０プルーフエタノール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍグリシン、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、４ｍＭ還元グルタチオン、ｐＨ９．６である１０容量のリフォールディングバッファーに、撹拌しながらゆっくり追加することによって、リフォールディングさせた。それを室温で一晩インキュベートした。
リフォールディングしたタンパク質を、ｐＨ４．５まで酸性化し、次いで、陽イオン交換クロマトグラフィーによってｐＨ４．５で精製した。
リフォールディングしたタンパク質を、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析にかけた。質量は、８５％が、まさに、ジスルフィド中に６つのシステインすべてを有するタンパク質について予測される質量である８２８２であり、１５％が、最初のメチオニンが除去された完全に酸化されたタンパク質について予測される質量である８１５１であった。

実施例９
７６５ＥＧＦ−ベンダムスチンコンジュゲート
天然のＥＧＦは、２つの利用可能なアミノ基（１つのリジン側鎖およびアミノ末端アミン）しか有していない。７６５ＥＧＦは、５つの追加されたリジン側鎖を有し、それに７つのアミノ基を与える。本発明者らは、構造を下記に示すカルボキシル含有がん化学療法薬ベンダムスチンを７６５ＥＧＦにコンジュゲートすることを試みた。

ＥＤＣによる反応により、カルボキシルおよびアミノ基の間で直接的なアミド結合が形成される。
精製され、リフォールディングされた７６５ＥＧＦを、ｐＨ７．３コンジュゲーションバッファー（６Ｍ尿素、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３）で透析した。透析されたタンパク質は、１．１５ｍｇ／ｍｌで３４ｍｌであった。
ベンダムスチンを、２０のｍｇ／ｍｌでｐＨ６．３コンジュゲーションバッファー（５．５ｍｌ；６Ｍ尿素、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．３）に溶解した。ｐＨは４．１であった。１８０ｕｌの２Ｍ ＮａＯＨを追加し、これによりｐＨが約６．７になった。
ＥＤＣは、使用直前に溶解し、６０ｍｇ／ｍｌとした。次いで、４．２５ｍｌの６０ｍｇ／ｍｌ ＥＤＣおよび４．２５ｍｌ ２０ｍｇ／ｍｌベンダムスチンを混合し、約３０秒間インキュベートした。次いで、この混合物を、３４ｍｌの１．１５ｍｇ／ｍｌ ＥＧＦに追加した。
これを室温で一晩インキュベートし、次いで、ｐＨをｐＨ２．５に調節し、次いで、１０ｍＭ ＨＣｌで透析した。コンジュゲートを−２０℃で保存した。

コンジュゲートの分子量は、９１４５の平均分子量を有する広範なピークとしてマトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）質量分析によって決定された（図４）。非コンジュゲート７６５ＥＧＦは、８２８２の分子量を有する。追加されたそれぞれのベンダムスチンは、コンジュゲーションのために１つの水分子を失った後、３４０の質量を追加すると思われ、したがって、タンパク質当たり２．５ベンダムスチンとなる。７６５ＥＧＦは、コンジュゲーションに利用可能な７つのアミノ基（６つのリジンおよびアミノ末端）を有する。したがって、７つのうちの平均２．５がコンジュゲートされる。質量スペクトルは、約１０，５００までのより少量の質量種を示す。７つのアミノ基すべてがコンジュゲートされたベンダムスチンを有する種の予測される質量は、１０，６６２となるであろう。コンジュゲートの質量スペクトルは、目立った特異的な質量ピークをほとんど有しておらず、１、２、３、４、５、６、または７つの未修飾ベンダムスチン基が共有結合した未修飾の７６５ＥＧＦタンパク質他の単純な混合物であるのではなく、産物が多くのバリエーションおよびクロス反応を有することを示唆する。
コンジュゲートに、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥも行った（データ示さず）。９０％以上の材料が、１０ｋＤａ単量体として泳動された。１０％未満が、約２０ｋＤａの二量体として現われた。

実施例１０
７６５ＥＧＦ−ベンダムスチンの細胞傷害性活性
Ａ−４３１ヒト上皮がん細胞を、９６ウェルプレートにウェル当たり５，０００細胞で播種し、１日間増殖させた。Ａ−４３１細胞は、豊富なＥＧＦ受容体を有する。増殖の１日後、フリーのベンダムスチンおよび７６５ＥＧＦ−ベンダムスチンを、２００マイクロモルベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｓｔｉｎｅ）〜６ｎＭおよび２０マイクロＥｑ／Ｌ ７６５ＥＧＦ−ベンダムスチン〜０．６ｎＭの範囲の濃度でプレートに加えた。プレートを、４日間、加湿５％ＣＯ_２下３７℃で薬剤と共にインキュベートし、次いで、ＤＯＪＩＮＤＯ細胞カウンティングキット−８の試薬を、ウェルに追加し、増殖を調べた。プレートをメーカーの指示に従って調べた。フリーのベンダムスチンおよびＥＧＦ−ベンダムスチンの両方による細胞の相対的な増殖を図５に示す。フリーのベンダムスチンおよびＥＧＦ−ベンダムスチンの間に大きな差異があった。フリーベンダムスチンは、約１０マイクロモルを超える濃度で増殖を阻害したのみであり、約９０マイクロモルのＩＣ_５０を有した。ＥＧＦ−ベンダムスチンは、１２ナノ当量（Ｅｑｕｉｌａｖｅｎｔ）／ＬのＩＣ_５０を有した（図６）。有効性の差異は、ベンダムスチン基の濃度で表現すると、１０００倍を超えた。

実施例１１
７６５ＥＧＦ−ベンダムスチンによるインビボにおける腫瘍異種移植片治療
Ａ−４３１細胞を増殖させ、回収し、培地中で再懸濁した。細胞を数え、次いで、速やかに遠心分離し、１ｍｌ当たりおよそ７００万細胞でＰＢＳ中に再懸濁し、次いで、氷上で等容量のｍａｔｒｉｇｅｌと混合した。３５０万細胞を含有する１００ｕｌを、それぞれのマウスの脇腹に皮内注射した。マウスの腫瘍増殖をモニターした。腫瘍容積は、（長さ×幅^２）／２として計算した。腫瘍が１００ｍｍ３に達したら、治療を開始した。マウスは０、７、および１４日目に治療した。腫瘍サイズは、３日または４日ごとに測定した。マウスは、食塩水のみ（用量０）または腹腔内注射による体重１グラム当たり５０、２００、８００、もしくは３２００ピコ当量のＥＧＦ−ベンダムスチンまたは静脈内尾静脈注射による１グラム当たり２００ピコ当量のＥＧＦ−ベンダムスチンを投与された。薬剤は、分子量８２８２でタンパク質当たり２．５ベンダムスチン基のタンパク質を使用し０．８２ｍｇ／ｍｌタンパク質であり、これは１ｍｌ当たり２５０ナノ当量となった。これを、注射用に２ｍＭ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌに希釈した。３００ｕｌの容量をＩＰ注射でおよび１００ｕｌをＩＶ注射で注射した。

結果：
各治療群対の時間に対する平均腫瘍容積のグラフを図７に示す。２００ｐＥｑ／ｇ以上の用量を投与されている治療群はすべて、未治療の（ｕｎｒｔｒｅａｔｅｄ）コントロールおよび５０ｐＥｑ／ｇの最低用量を受けている群と比較して腫瘍増殖が低下した。
図８は、（ａ）用量０または５０ｐＥｑ／ｇを投与されている群をまとめた、（ｂ）用量２００ｐＥｑ／ｇ以上を受けている群をまとめた、および（ｃ）２００ｐＥｑ／ｇのＩＶ投与を受けている群の腫瘍増殖を示す。１４日目およびそれ以降、２００＋およびＩＶ２００群の両方が、０＋５０をまとめた群と有意に異なった（ｐ＝０．０５ 有意性レベル）。
この試験でｗ５匹のマウスが治癒した。すなわち、１回目の治療投与の後それらの腫瘍は検出できなくなり、５０日までそのままであった。ＩＶ２００群における１０匹のうちの３匹、２００のＩＰ用量を受けている８匹のうちの１匹、および８００のＩＰ用量を受けている７匹のうちの１匹が治癒した。これを表１に要約する。このように、差異は統計的に有意ではなかったが、ＩＶ投与は、腹腔内よりも有効であったように思われた。
腫瘍サイズおよび腫瘍増殖の遅れは、２００ｐＥｑ／ｇ以上の投与を受けているマウス対５０ｐＥｑ／ｇ以下を投与されているマウスの間ならびにＩＶ ２００ｐＥｑ／ｇ投与を受けているマウスおよび５０ｐＥｑ／ｇ以下を投与されているマウスの間で有意に異なった。

結論：
７６５ＥＧＦ−ベンダムスチンは、ＥＧＦ受容体を有する細胞株であるＡ−４３１を有するマウス異種移植片の治療に成功した。この細胞株は、遊離ベンダムスチンにほぼ完全に非感受性であった。したがって、ＥＧＦおよびＥＧＦ融合タンパク質への化学療法剤のコンジュゲーションは、ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍細胞を標的にするのに好結果となる方法となる。

実施例１２
７６５ＴＮＦａ融合タンパク質
配列番号１のリーダー配列を有する融合タンパク質において可溶型腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）をコードするプラスミドを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって合成した。コドンは大腸菌用に最適化した。コード配列は、Ｔ７プロモーターの発現コントロール下とした。コードタンパク質は、７６５ＴＮＦａ（配列番号１７）と呼ぶ。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をプラスミドにより形質転換し、形質転換体を、５０ｕｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢ培地中で増殖させた。培養物は、それが０．６のＯ．Ｄ．６００ｎｍに達したら、０．４ｍＭ ＩＰＴＧにより誘導した。４００ｍｌの量の培養物は、３７℃で振盪しながら、２本の２Ｌバッフル付きフラスコのそれぞれにおいて増殖させた。

細胞を回収し、リゾチーム処理および超音波処理によって破壊した。破壊した細胞を遠心分離し、不溶性のデブリを除去した。７６５ＴＮＦａタンパク質は、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって上清（可溶性画分）から取り出した。５０ｍｇの精製７６５ＴＮＦａが、８００ｍｌの培養物から得られた。精製７６５ＴＮＦａは、１９ｋＤａの予測質量でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純粋にした（データ示さず）。ファーメンター培養から、９９ｍｇの精製７６５ＴＮＦａを培養物１リットル当たりに得た。これらの収量は優れている。

活性アッセイ．
Ｌ９２９細胞は、２％ウシ胎児血清を含有する推奨増殖培地中で２つの９６ウェルプレートにウェル当たり１０，０００細胞でまいた。それらは、５％ＣＯ_２加湿大気中３７℃で２日間増殖させた。一方のプレートにおいて、２日間のインキュベーションの後に、最終濃度１ｕｇ／ｍｌアクチノマイシンＤを追加し、他方のプレートでは、アクチノマイシンＤは追加しなかった。次いで、７６５ＴＮＦａを一連の濃度で追加した。プレートをさらに２４時間インキュベートした。次いで、細胞生存率を、ＤＯＪＩＮＤＯ細胞カウンティングキット−８によりメーカーの指示に従って定量化した。１ｕｇ／ｍｌアクチノマイシンを有するプレートでは、７６５ＴＮＦａは、７９ｐｇ／ｍｌ未満の、細胞を死滅させるためのＩＣ_５０を有した。アクチノマイシンなしでは、ＩＣ_５０は、約７０ｎｇ／ｍｌであった。これらは、ＴＮＦ−アルファについて文献において報告されるものよりもさらに低いＩＣ_５０である。したがって、記載されるように精製した７６５ＴＮＦａは、活性であり、野生型ＴＮＦアルファよりも活性が高い可能性がある。

配列
配列番号１ ＭＶＫＧＫＨＨＨＨＨＨＮＧＫＧＫＳＫ

配列番号２（７６５ＩＧＦ）
ＭＶＫＧＫＨＨＨＨＨ ＨＮＧＫＧＫＳＫＧＰ ＲＴＬＣＧＡＥＬＶＤ ＡＬＱＦＶＣＧＤＲＧ ＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧ ＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧ ＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣ ＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡ ＰＬＫＰＡＫＳＡ

配列番号３（ヒトＩＧＦ−１）
ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬ ＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤ ＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧ ＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱ ＴＧＩＶＤＥＣＣＦＲ ＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹ ＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ

配列番号４（ＩＧＦ１３２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬ ＶＣＧＤＲＧ ＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧ ＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧ ＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲ ＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ

配列番号５（ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ）
ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬＦＶＮ ＧＰＲＴＬ ＣＧＡＬＶＤＡＬＱ ＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦ ＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳ ＲＲＡＰＱＴＧＩＶＤ ＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲ ＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫ ＰＡＫＳＥＡ

配列番号６（Ｒ３−ＩＧＦ）
ＧＰＲＴＬＣＧＡＥＬＶＤ ＡＬＱＦＶＣＧＤＲＧ ＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧ ＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧ ＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣ ＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡ ＰＬＫＰＡＫＳＡ

配列番号７（ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ１）
ＴＬＣＧＡＥＬＶＤ ＡＬＱＦＶＣＧＤＲＧ ＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧ ＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧ ＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣ ＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡ ＰＬＫＰＡＫＳＡ

配列番号８（７６５ＥＧＦ）
ＭＶＫＧＫＨＨＨＨＨＨＮＧＫＧＫＳＫ
ＮＳＤＳＥＣＰＬＳＨ ＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣ ＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡ ＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥ ＲＣＱＹＲＤＬＫＷＷ ＥＬＲ

配列番号９、ＥＧＦ前駆物質：
ＭＮＳＤＳＥＣＰＬＳ ＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶ ＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹ ＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧ ＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷ ＷＥＬＲ（配列番号９）

配列番号１０、ＴＧＦα前駆物質
ＭＶＰＳＡＧＱＬＡＬ ＦＡＬＧＩＶＬＡＡＣ ＱＡＬＥＮＳＴＳＰＬ ＳＡＤＰＰＶＡＡＡＶ ＶＳＨＦＮＤＣＰＤＳ ＨＴＱＦＣＦＨＧＴＣ ＲＦＬＶＱＥＤＫＰＡ ＣＶＣＨＳＧＹＶＧＡ ＲＣＥＨＡＤＬＬＡＶ ＶＡＡＳＱＫＫＱＡＩ ＴＡＬＶＶＶＳＩＶＡ ＬＡＶＬＩＩＴＣＶＬ ＩＨＣＣＱＶＲＫＨＣ ＥＷＣＲＡＬＩＣＲＨ ＥＫＰＳＡＬＬＫＧＲ ＴＡＣＣＨＳＥＴＶＶ（配列番号１０）

配列番号１１、アンフィレギュリン前駆物質：
ＭＲＡＰＬＬＰＰＡＰ ＶＶＬＳＬＬＩＬＧＳ ＧＨＹＡＡＧＬＤＬＮ ＤＴＹＳＧＫＲＥＰＦ ＳＧＤＨＳＡＤＧＦＥ ＶＴＳＲＳＥＭＳＳＧ ＳＥＩＳＰＶＳＥＭＰ ＳＳＳＥＰＳＳＧＡＤ ＹＤＹＳＥＥＹＤＮＥ ＰＱＩＰＧＹＩＶＤＤ ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰ ＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴ ＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧ ＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲ ＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦ ＱＮＦＣＩＨＧＥＣＫ ＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣ ＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲ ＣＧＥＫＳＭＫＴＨＳ ＭＩＤＳＳＬＳＫＩＡ
ＬＡＡＩＡＡＦＭＳＡ ＶＩＬＴＡＶＡＶＩＴ ＶＱＬＲＲＱＹＶＲＫ ＹＥＧＥＡＥＥＲＫＫ ＬＲＱＥＮＧＮＶＨＡ ＩＡ（配列番号１１）

配列番号１２、ＨＤ−ＥＧＦ前駆物質
ＭＫＬＬＰＳＶＶＬＫ ＬＬＬＡＡＶＬＳＡＬ ＶＴＧＥＳＬＥＱＬＲ ＲＧＬＡＡＧＴＳＮＰ ＤＰＳＴＧＳＴＤＱＬ ＬＲＬＧＧＧＲＤＲＫ ＶＲＤＬＱＥＡＤＬＤ ＬＬＲＶＴＬＳＳＫＰ ＱＡＬＡＴＰＳＫＥＥ ＨＧＫＲＫＫＫＧＫＧ ＬＧＫＫＲＤＰＣＬＲ ＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥ ＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰ ＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧ ＥＲＣＨＧＬＳＬＰＶ ＥＮＲＬＹＴＹＤＨＴ ＴＩＬＡＶＶＡＶＶＬ ＳＳＶＣＬＬＶＩＶＧ ＬＬＭＦＲＹＨＲＲＧ ＧＹＤＶＥＮＥＥＫＶ ＫＬＧＭＴＮＳＨ（配列番号１２）

配列番号１３、ベータセルリン前駆物質：
ＭＤＲＡＡＲＣＳＧＡ ＳＳＬＰＬＬＬＡＬＡ ＬＧＬＶＩＬＨＣＶＶ ＡＤＧＮＳＴＲＳＰＥ ＴＮＧＬＬＣＧＤＰＥ ＥＮＣＡＡＴＴＴＱＳ ＫＲＫＧＨＦＳＲＣＰ ＫＱＹＫＨＹＣＩＫＧ ＲＣＲＦＶＶＡＥＱＴ ＰＳＣＶＣＤＥＧＹＩ ＧＡＲＣＥＲＶＤＬＦ ＹＬＲＧＤＲＧＱＩＬ ＶＩＣＬＩＡＶＭＶＶ ＦＩＩＬＶＩＧＶＣＴ ＣＣＨＰＬＲＫＲＲＫ ＲＫＫＫＥＥＥＭＥＴ ＬＧＫＤＩＴＰＩＮＥ ＤＩＥＥＴＮＩＡ（配列番号１３）

配列番号１４、４０３ＩＧＦ
ＭＴＳＧＨＨＨＨＨＨＳＡＧＶＮＧ ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬ ＶＥＡＬＹＬＶＣＧＤ ＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧ ＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱ ＴＧＩＶＤＥＣＣＦＲ ＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹ ＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ

配列番号１５、７８４ＩＧＦ
ＭＶＫＱＩＥＳＫＴＡＦＱＥＡＬＤＡＡＧＤＫＬＶＶＶＤＦＳＡＴＷＣＧＨＣＫＭＩＫＰＦＦＨＳＬＳＥＫＹＳＮＶＩＦＬＥ ＶＤＶＤＤＳＱＤＶＡＳＥＳＥＶＫＳＭＰＴＦＱＦＦＫＫＧＱＫＶＧＥＦＳＧＡＮＫＥＫＬＥＡＴＩＮＥＬＶＧＳＫＳＧＨＨＨＨＨＨ ＳＡＫＧＧＰＲＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲ ＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ

配列番号１６、７８５ＩＧＦ
ＭＶＫＱＩＥＳＫＴＡＦＱＥＡＬＤＡＡＧＤＫＬＶＶＶＤＦＳＡＴＷＣＧＨＣＫＭＩＫＰＦＦＨＳＬＳＥＫＹＳＮＶＩＦＬＥ ＶＤＶＤＤＳＱＤＶＡＳＥＳＥＶＫＳＭＰＴＦＱＦＦＫＫＧＱＫＶＧＥＦＳＧＡＮＫＥＫＬＥＡＴＩＮＥＬＶＧＳＫＳＧＨＨＨＨＨＨ ＳＡＫＧＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲ ＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ

配列番号１７、７６５ＴＮＦａ
ＭＶＫＧＫＨＨＨＨＨＨＮＧＫＧＫＳＫ
ＶＲＳＳ ＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡ ＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧ ＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮ ＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲ ＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧ ＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦ ＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶ ＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡ ＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬ ＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥ ＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷ ＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦ ＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡ ＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦ ＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩ ＩＡＬ

配列番号１８、７６４ＩＧＦ
ＭＶＫＧＫＨＨＨＨＨＨＮＧＫＧＫＳＫＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲ ＡＰＱＴＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫ

特許、特許文献、および引用される他の参考文献はすべて、参照によって組み込まれる。

Claims (17)

1. （ａ）配列番号１または配列番号１の残基２〜１８からなるＮ−末端リーダー配列、および（ｂ）可溶型タンパク質、からなり、前記（ａ）Ｎ−末端リーダー配列は（ｂ）可溶型タンパク質に直接融合しており、Ｎ−末端を有し、配列番号１または配列番号１の残基２〜１８が、ポリペプチドのＮ−末端にある、融合ポリペプチド。
2. （ｂ）可溶型タンパク質が、サイトカインである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
3. （ａ）配列番号１または配列番号１の残基２〜１８および（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、配列番号１３の残基３２〜１１１、または配列番号１７の残基１９〜１７５からなり、（ａ）はＮ−末端に存在し、（ａ）は（ｂ）に直接融合している、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
4. （ａ）配列番号１または配列番号１の残基２〜１８および（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１、または配列番号３、配列番号４、配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１と９０％以上の同一性を有するバリアント、からなり、（ａ）はＮ−末端に存在し、（ａ）は（ｂ）に直接融合しており、前記バリアントはＥｒｂＢ−１またはＩＧＦＲ１のリガンドとしての機能を有している、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
5. 前記サイトカインが、ＥｒｂＢ−１またはＩＧＦＲ１のリガンドである、請求項２または請求項３に記載の融合ポリペプチド。
6. （ｂ）可溶型タンパク質が、配列番号３、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号７、または配列番号３、配列番号４と９０％以上の同一性を有するバリアントであり、前記バリアントはＩＧＦＲ１のリガンドとしての機能を有している、請求項３または請求項４に記載の融合ポリペプチド。
7. （ｂ）可溶型タンパク質が、配列番号６および配列番号７から選択される、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
8. 配列番号２または配列番号２の残基２〜８８からなる、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
9. （ｂ）可溶型タンパク質が、（ｂ）（ｉ）配列番号９の残基２〜５４、配列番号１０の残基４０〜８９、配列番号１１の残基１０１〜１８４、配列番号１２の残基６３〜１４８、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１、または（ｂ）（ｉｉ）配列番号９の残基２〜５４に９０％以上の同一性を有するバリアント、配列番号１０の残基４０〜８９に９０％以上の同一性を有するバリアント、配列番号１１の残基１０１〜１８４に９０％以上の同一性を有するバリアント、配列番号１２の残基６３〜１４８に９０％以上の同一性を有するバリアント、もしくは配列番号１３の残基３２〜１１１に９０％以上の同一性を有するバリアントであり、（ｂ）（ｉｉ）のバリアントはＥｒｂＢ−１のリガンドとしての機能を有している、請求項３または請求項４に記載の融合ポリペプチド。
10. （ｂ）可溶型タンパク質が、配列番号９の残基２〜５４である、請求項９に記載の融合ポリペプチド。
11. 前記サイトカインが、腫瘍壊死因子−アルファである、請求項２または請求項３に記載の融合ポリペプチド。
12. 配列番号１７または配列番号１７の残基２〜１７５からなる、請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
13. 請求項４〜請求項１０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドに共有結合された抗がん化学療法剤を含む化合物。
14. 前記化学療法剤が、前記ポリペプチドにおいて配列番号１の残基２〜１８の１つ以上のリジン残基側鎖に共有結合で結合されている、請求項１３に記載の化合物。
15. 前記化学療法剤が、メトトレキサート、クロラムブシル、およびベンダムスチンからなる群から選択される、請求項１３または請求項１４に記載の化合物。
16. 前記融合ポリペプチドに共有結合されたメトトレキサートを含む、請求項１３〜請求項１５のいずれか一項に記載の化合物。
17. 配列番号８からなる融合ポリペプチドに共有結合されているベンダムスチンまたはクロラムブシルを含む、請求項１３または請求項１５に記載の化合物。