PL238516B1

PL238516B1 - Sposób otrzymywania modyfikowanego polipeptydu

Info

Publication number: PL238516B1
Application number: PL417544A
Authority: PL
Inventors: Mateusz KRZYŚCIK; Mateusz Krzyścik; Michał ŁOBOCKI; Michał Łobocki; Aleksandra SOKOŁOWSKA-WĘDZINA; Aleksandra Sokołowska-Wędzina; Aleksandra Borek; Alicja Sochaj-Gregorczyk; Alicja Sochajgregorczyk; Piotr JAKIMOWICZ; Piotr Jakimowicz; Małgorzata ZAKRZEWSKA; Małgorzata Zakrzewska; Daniel KROWARSCH; Daniel Krowarsch; Jacek OTLEWSKI; Jacek Otlewski
Original assignee: Univ Wroclawski
Priority date: 2016-06-13
Filing date: 2016-06-13
Publication date: 2021-08-30
Also published as: PL417544A1; EP3468611A1; WO2017216620A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania modyfikowanego polipeptydu. Wynalazek ten może być szeroko stosowany w technologii koniugatów, zwłaszcza w zastosowaniach medycznych, takich jak: terapia kierowana czy obrazowanie medyczne.

Z powodu skomplikowanej struktury przestrzennej, polipeptydy, w tym białka, są grupą biopolimerów, dla której trudno jest wprowadzić specyficzną i wydajną modyfikację chemiczną. Z praktycznego punktu widzenia najczęściej modyfikowanymi są grupy: a-aminowa, ε-aminowa lizyny oraz sulfhydrylowa cysteiny. W przypadku większości białek wymagane jest fizjologiczne środowisko, w którym grupa a-aminowa łańcucha głównego i ε-aminowa lizyny są dodatnio naładowane. Podstawienie tych grup powoduje obniżenie ładunku białka, co może powodować jego denaturację lub utratę pewnych specyficznych własności. Addycja do grupy sulfhydrylowej nie zmienia wypadkowego ładunku białka. Niestety możliwość modyfikacji grup sulfhydrylowych cystein jest mocno ograniczona ze względu na stosunkowo rzadkie występowanie tego aminokwasu w białkach. Ponadto, większość z nich występuje w rdzeniu białkowym, co uniemożliwia ich wydajne podstawienie. Natomiast cysteiny eksponowane na powierzchni białka często uczestniczą w kowalencyjnych oddziaływaniach dom en białkowych, tworząc mostki disiarczkowe.

Modyfikacje wprowadzane w sekwencję polipeptydów, umożliwiające specyficzne przyłączenie do nich określonych cząsteczek, mają bardzo szerokie spektrum aplikacji, począwszy od koniugacji do białek znaczników fluorescencyjnych, wykorzystywanych m.in. do wizualizacji białek w organizmach żywych, przez tworzenie materiałów o nowych właściwościach, aż do produkcji najnowszej generacji leków, wykorzystywanych w leczeniu nowotworów, gdzie białka są cząsteczkami specyficznie transportującymi leki do komórek zmienionych chorobowo, nie uszkadzając przy tym komórek zdrowych.

Powyższe zastosowania wymagają, aby modyfikacja białka zachodziła z wysoką wydajnością i wykazywała jak najmniejszy wpływ na jego właściwości. Ponadto istotne jest aby miejsce modyfikacji było ściśle zdefiniowane, określając jednoznacznie stechiometrię podstawienia.

Niniejszy wynalazek rozwiązuje powyższe problemy, ponieważ polega na zwiększeniu reaktywności reszty cysteiny w białku, a nie koniugowanej do niej cząsteczki - co jest przedmiotem m.in. następujących publikacji: WO1990013540 A1, US6908963 B2. Ponadto wyróżnia się też tym, że może być zastosowane do więcej niż jednej rodziny białek, w przeciwieństwie do wynalazków opisanych w patentach US5166322 A i US8093032 B2.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania modyfikowanego polipeptydu, charakteryzujący się tym, że do N lub C końca polipeptydu przyłącza się metodami inżynierii genetycznej łącznik peptydowy zawierający reaktywną resztę Cys wybrany spośród peptydów o sekwencji: GGSKCK lub MKCKSGG, a następnie izoluje się zmodyfikowany polipeptyd.

Korzystnie, jako polipeptyd stosuje się jednołańcuchowy fragment zmienny przeciwciała (scFv) skierowanego wobec receptora ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 lub 2.

Zaprojektowany łącznik stosowany w sposobie według wynalazku zawiera resztę lub reszty cysteiny w otoczeniu zwiększającym jej reaktywność. Wprowadzenie go już na etapie sekwencji nukleotydowej powoduje, że nadprodukowane rekombinowane białko jest gotowe do reakcji koniugacji, bez dodatkowych etapów i procedur. Dzięki zwiększeniu reaktywności grupy sulfhydrylowej przez obniżenie jej pKa, łącznik pozwala na modyfikację wprowadzonej reszty cysteinowej powszechnie stosowanymi dotychczas odczynnikami, w tym pochodnymi jodoacetamidowymi i maleimidowymi.

Możliwy jest sposób modyfikacji sekwencji polipeptydów polegający na wprowadzeniu sekwencji peptydowej (łącznika), w taki sposób, że łącznik ten posiada motyw XC, CX lub XCX, gdzie X to aminokwas o dodatnio naładowanym łańcuchu bocznym; C - Cys.

Stosowany w sposobie według wynalazku aminokwas X to Lys.

Możliwe jest również zastosowanie wyżej wymienionej sekwencji do chemicznej modyfikacji polipeptydów poprzez reakcję podstawienia reszty cysteinowej.

KRÓTKI OPIS FIGUR

Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:

Na Fig. 1 przedstawione zostały widma MS po 24 godzinnej reakcji MMAE z peptydami zawierającymi cysteinę, zielona ramka - wolny peptyd, niebieska ramka - wolne MMAE, czerwona

PL 238 516 B1 ramka - kompleks MMAE-peptyd: AAAACAAAA (A), AAAACKAAAA (B), AAAAKCAAAA (C) oraz AAAAKCKAAAA (D). Wydajność reakcji podstawienia MMAE wynosiła 3,8% (A) , 58,2% (B), 67,7% (C) i 60,7% (D).

Na Fig. 2 przedstawiony został żel SDS-PAGE przedstawiający wyniki reakcji koniugacji poszczególnych białek w odniesieniu do próbek niekoniugowanych.

Na Fig. 3 przedstawiona została Analiza MALDI-MS otrzymanego koniugatu FGF13X3s- GGSKCK-MMAE.

Na Fig. 4 przedstawione zostały widma fluorescencyjne koniugatów oraz białek przed reakcją.

Na Fig. 5 przedstawione zostały wyniki badania cytotoksyczności koniugatu FGFl3X3s- GGSKCK-MMAE. Czerwone trójkąty - U2OS-R1, czarne kwadraty - U2OS.

Na Fig. 6 przedstawione zostały wyniki analizy SDS-PAGE z przykładu 2. Zaprezentowano zdjęcie żelu po analizie SDS-PAGE. Na żel naniesiono po 2 ąg każdego preparatu. Białko: KCK-FGF2 posiada dwie natywne, eksponowane do roztworu reszty cysteiny oraz łącznik na końcu N; pozwala to na trzykrotne podstawienie cząsteczki. KCK-FGF2 SS ma wymutowane powierzchniowe do seryn C78S/C96S oraz łącznik na końcu N; pozwala to na jednokrotne podstawienie cząsteczki. FGF2-KCK SS ma wymutowane powierzchniowe do seryn C78S/C96S oraz łącznik na końcu C; pozwala to na jednokrotne podstawienie cząsteczki. vcMMAE - maleimidowa pochodna monometyloaurystatyny E, YCP - PEGylowana pochodna aurystatyny Y.

Na Fig. 7 przedstawione zostało widmo emisji fluorescencji przy wzbudzeniu falą λ= 280 nm. Widoczne jest widmo białek i ich koniugatów. Brak silnej emisji przy 353 nm świadczy o poprawnym zwinięciu wszystkich białek i koniugatów.

Na Fig. 8 przedstawiony został wpływ ilości cząsteczek leku cytotoksycznego przypadających na cząsteczkę FGF2 na efekt cytotoksyczny na komórkach U2OS-R1 posiadających receptor FGF1.

Na Fig. 9 przedstawiony został wpływ ilości cząsteczek leku cytotoksycznego przypadających na cząsteczkę FGF2 na efekt cytotoksyczny na komórkach U2OS nie posiadających receptora FGF1.

Na Fig. 10 przedstawione zostały wyniki analizy MALDI-MS fragmentu przeciwciała scFv skierowanego wobec FGFR1 z dodanym linkerem (a) oraz to samo białko po koniugacji z MMAE (b).

Na Fig. 11 przedstawione zostały wyniki analizy SDS-PAGE fragmentu przeciwciała scFv skierowanego wobec FGFR1 z linkerem GGSKCK oraz scFv-GGSKCK po koniugacji z MMAE (b).

Na Fig. 12 przedstawiony został wpływ scFv-GGSKCK-MMAE (pomarańczowe kwadraty) i scFv-Fc (niebieskie romby) na żywotność komórek nadprodukujących receptor FGFR1 (a, c) w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które charakteryzują się brakiem nadprodukcji FGFR1 (b, d). Na panelach a i b przedstawiono wynik analizy żywotności komórek U2OS (a) oraz U2OS stabilnie transfekowanych FGFR1 (b). Komórki inkubowano z scFv-GGSKCK-MMAE lub białkiem kontrolnym scFv-GGSKCK przez 96 godzin. Żywotność komórek określono na podstawie pomiaru fluorescencji przy długości fali 590 nm wykorzystując odczynnik Alamar Blue. Na panelach c i d przedstawiono wyniki analizy dwóch linii komórkowych raka płuc NCI-H1581(c) oraz linii kontrolnej NCI-H1975 (d). Komórki inkubowano przez 24 godziny z koniugatem lub samym białkiem, następnie komórki przemywano i hodowano dodatkowo przez 72 godziny w nieobecności cząsteczek badanych. Żywotność komórek określono na podstawie pomiaru fluorescencji przy długości fali 590 nm wykorzystując odczynnik Alamar Blue. Żywotność komórek normalizowano względem komórek nie traktowanych cząsteczkami badanymi.

Na Fig. 13 przedstawiona została koniugacja cząsteczki scFvF7 z MMAE. Białko scFvF7 poddawano redukcji odczynnikiem TCEP, a następnie reakcji koniugacji z MMAE w różnych czasach: 1 h, 4 h, 18 h. Uzyskane w wyniku reakcji koniugacji preparaty analizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w warunkach redukujących i barwienie błękitem Coomassie.

Na Fig. 14 przedstawiona została koniugacja cząsteczki scFvF7 z MMAE. Białko scFvF7 poddawano redukcji odczynnikiem TCEP, w części próbek wymieniano bufor po redukcji, a następnie przeprowadzano reakcję koniugacji w czasie (A) 1 h oraz (B) 4 h stosując różne nadmiary molowe MMAE w stosunku do białka. Uzyskane w wyniku reakcji koniugacji preparaty analizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w warunkach redukujących i barwienie błękitem Coomassie.

Na Fig. 15 przedstawione zostało widmo masowe cząsteczki scFvF7.

Na Fig. 16 przedstawiona została koniugacja cząsteczki scFvF7 z MMAE. Zaprezentowano widmo masowe cząsteczki scFvF7 zredukowanej odczynnikiem TCEP i poddanej reakcji koniugacji z MMAE.

PL 238 516 B1

Na Fig. 17 przedstawiona została koniugacja cząsteczki scFvF7 z MMAE. Białko scFvF7 poddawano redukcji odczynnikiem TCEP, a następnie przeprowadzano reakcję koniugacji w buforze boranowym oraz w buforze PBS, w czasie 1 h stosując 2,5-krotny nadmiar molowy MMAE w stosunku do białka. Uzyskane w wyniku reakcji koniugacji preparaty analizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w warunkach redukujących i barwienie błękitem Coomassie.

Na Fig. 18 przedstawiona została denaturacja termiczna białka affibody ZHER2:2891 oraz ZHER2:2891-GGSKCK.

Na Fig. 19 przedstawiony został rozdział HPLC mieszaniny po reakcji koniugacji.

Na Fig. 20 przedstawiona została analiza MALDI-MS otrzymanego koniugatu ZHER2:2891GGSKCK-MMAE.

Na Fig. 21 przedstawione zostały wyniki badania cytotoksyczności koniugatu ZHER2:2891GGSKCK-MMAE na liniach SK-BR-3 (HER2+, pierwsza kolumna) oraz linii MDA-MB-231(HER2-, druga kolumna).

P r z y k ł a d 1. Porównanie wydajności reakcji grupy tiolowej cysteiny z maleimidem przyłączonym do pochodnej monometyloaurystatyny E(vcMMAE).

Wykorzystano następujące peptydy:

AC-AAAACAAAA-NH2 zwanym peptyd C;

AC-AAAACKAAAA-NH2 zwanym peptyd CK;

AC-AAAAKCAAAA-NH2 zwanym peptyd KC;

Ac-AAAAKCKAAAA-NH2 zwanym peptyd KCK.

Reakcję przeprowadzono w 50 mM buforze fosforanowym o pH = 6,9 zawierającym 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA i 10% DMSO. Do roztworów peptydów o stężeniu 3,5 mM dodano 5-ciokrotny molowy nadmiar cytostatyku, rozpuszczonego w DMAc (50 mg/mL; 37,99 mM). Reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po reakcji mieszaninę reakcyjną poddano analizie MS. Porównano pola powierzchni odpowiadające wolnym składnikom peptyd i vcMMAE oraz kompleksowi peptyd-vcM-MAE utworzonemu w wyniku podstawienia grupy tiolowej maleimidem. Widma normalizowano na pola powierzchni sygnału tła przy 650 m/z. Wydajność reakcji podstawienia MMAE wynosiła 3,8% dla peptydu C, 58,2% dla peptydu KC, 60,7% dla peptydu KCK i 67,7% dla peptydu CK.

Przykładowe wyniki przedstawiono na Fig. 1

P r z y k ł a d 2. Wykorzystanie łącznika w celu uzyskania z wysoką wydajnością terapeutycznego koniugatu ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGF1).

Wprowadzenie łącznika

Za pomocą ukierunkowanej mutagenezy QuikChange (Stratagene) przygotowano szereg wariantów mutacyjnych ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 z mutacjami opisanymi w tab. 1. Czter y z nich zawierały jedynie naturalnie występujące cysteiny, dwa łączniki o sekwencji CGGG i dwa łączniki będące przykładami przedmiotu wynalazku MKCKSGG oraz GGSKCK, odpowiednio na końcu N i C polipeptydu (Tab. 1). Wszystkie zaprojektowane białka zostały otrzymane na drodze ekspresji w systemie bakteryjnym E. coli BL21 (DE3)pLysS z użyciem wektora pET-3c (Invitrogen). Hodowlę prowadzono w pożywce LB zawierającej 1% glukozy, 100 μg/mL ampicyliny oraz 32 μg/mL chloramfenikolu w temperaturze 37°C. Ekspresję indukowano izopropylotiogalaktozydem o końcowym stężeniu 0,5 mM przy OD6qq®0,9, a następnie hodowlę kontynuowano przez ok. 4 godziny. Hodowlę żwirowano, a osad zawieszono w 50 mL buforu do lizy: 50 mM bufor fosforanowy pH = 6,8; 0,5 M NaCl; 1 mM DTT; 1 mM EDTA; 1 mM PMSF. Tak przygotowaną zawiesinę bakterii poddano dezintegracji z wykorzystaniem prasy Frencha, a pozostałości bakteryjne usunięto poprzez wirowanie. Supernatant naniesiono na kolumnę HiTrap Heparin HP 5 ml (GE) podłączoną do systemu GE AKTA Purifier, elucję przeprowadzano 50 mM buforem fosforanowym, pH = 6,8; zawierającym 1 mM DTT; 1 mM EDTA; 1 mM PMSF w gradiencie NaCl w 0-2 M. Dla wszystkich wariantów proces nadprodukcji i oczyszczania przebiegł z podobną wydajnością, co wskazuje, że wprowadzenie łącznika nie wpływa w istotnym stopniu na wydajność procesu otrzymywania białka. Tożsamość otrzymanych białek została potwierdzona z wykorzystaniem spektrometrii mas MALDI-MS.

Analiza reaktywności

Następnie przeprowadzono reakcję koniugacji z lekiem cytotoksycznym, pochodną monometyloaurystatyną E (vcMMAE). Reakcję przeprowadzono w 50 mM buforze fosforanowym o pH = 6,9 zaPL 238 516 B1 wierającym 0,5 M NaCI i 1 mM EDTA. Do białka o stężeniu 0,3 mg/ml dodano 5-ciokrotny molowy nadmiar vcMMAE, rozpuszczonej w DMAc (50 mg/mL). Reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Tak otrzymane próbki poddano analizie SDS-PAGE (Fig. 2), MALDI-MS (Fig. 3) oraz HPLC w celu oznaczenia wydajności reakcji koniugacji (Tab. 3). Dodatkowo, na podstawie otrzymanych widm fluorescencji, wykonano analizę stanu natywnego otrzymanych koniugatów, aby potwierdzić ich prawidłową konformację (Fig. 4). W stanie natywnym sygnał fluorescencyjny pochodzący od pojedynczej reszty tryptofanu obecnej w białku (Trp107) jest całkowicie wygaszony dzięki obecności w jego bliskim otoczeniu grupy imidazolowej His102, a także pierścienia pirolidynowego Pro121. W momencie rozluźnienia struktury, spowodowanego zmianami konformacyjnymi, widmo FGF-1 staje się zdominowane przez szczyt położony około 350 nm charakterystyczny dla pierścienia indolowego reszty Trp.

Rozwijanie białka nie wpływa w istotny sposób na emisję tyrozyn.

Pomiary fluorescencji w zakresie emisji 300-400 nm przy długości fali wzbudzenia 280 nm zostały przeprowadzone przy użyciu spektrofluorymetru Jasco FP-950, w buforze fosforanowym (25 mM H3PO4, pH 7,3), w temperaturze 21°C. Stężenie białka w kuwecie, o drodze optycznej 1 cm, wynosiło 5 μM. Szerokość szczelin wzbudzenia i emisji ustawiono na 5 nm.

Aktywność biologiczna in vitro

Testy proliferacyjne przeprowadzono na linii komórkowej U2OS oraz U2OS stabilnie transfekowanej receptorem 1 czynnika wzrostu fibroblastów (U2OS FGFR1). Komórki były hodowane w medium DMEM z 10% FBS oraz 1% dodatkiem mieszaniny penicylina/streptomycyna. Komórki wysiewano na 96-cio dołkowe płytki (10000 komórek na dołek). Hodowlę prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Preparaty białkowe dodawano do komórek 24 godziny po ich wysianiu. Komórki inkubowane były z białkami przez 72 godziny. Przez ostatnie 4 godziny w hodowli obecny był odczynnik Alamar Blue (Invitrogen). Odczytu sygnału fluorescencji, proporcjonalnego do żywotności komórek, dokonywano na czytniku płytek EnVisionMultilabelPlate Reader (PerkinElmer). Żywotność komórek normalizowano względem kontroli pozytywnej i negatywnej odpowiednio: komórek traktowanych PBS oraz traktowanych 0,1% detergentem (TWEEN-20) (Fig. 5).

P r z y k ł a d 3. Wykorzystanie łącznika w celu uzyskania kontrolowanego miejsca i liczby podstawień ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 2 cytostatykiem pochodną monometyloaurystatyny E (vcMMAE) i PEGylowaną pochodną aurystatyny Y (YCP).

Wprowadzenie łącznika

Przygotowano trzy warianty mutacyjne ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 2 z mutacjami opisanymi w Tab. 2. Mutacje wprowadzono przy użyciu systemu QuikChange (Stratagene). Dwa mutanty: KCK-FGF2 SS i FGF2-KCK SS zawierają w swojej sekwencji po jednej eksponowanej do środowiska reszcie cyteinylowej - te występujące we wprowadzonych łącznikach, odpowiedni na końcu N i C. Pozostały mutant posiada trzy eksponowane do środowiska reszty cysteinylowe. Dwie natywne i jedną w łączniku. Wszystkie zaprojektowane białka zostały otrzymane na drodze ekspresji w systemie bakteryjnym E. coli BL21(DE3)pLysS z użyciem wektora pET-3c (Invitrogen). Hodowlę prowadzono w pożywce TB zawierającej 1% glukozy, 100 μg/mL ampicyliny oraz 32 μg/mL chloramfenikolu w temperaturze 37°C. Ekspresję indukowano izopropylotiogalaktozydem o końcowym stężeniu 0,5 mM przy OD600 κ 0,9, a następnie hodowlę kontynuowano przez 12 godziny. Hodowlę wirowano, a osad zawieszono w 50 mL buforu do lizy: 50 mM bufor fosforanowy pH = 6,8; 0,5 M NaCl; 1 mM DTT; 1 mM EDTA; 1 mM PMSF. Następnie komórki bakterii dezintegrowano przy pomocy prasy Frencha. Frakcję rozpuszczalną odseparowano poprzez wirowanie 50000x g przez godzinę. Supernatant naniesiono na kolumnę HiT rap Heparin HP 5 ml (GE) podłączoną do systemu GE AKTA Purifier, elucję przeprowadzano 50 mM buforem fosforanowym, pH = 6,8; zawierającym 1 mM DTT; 1 mM EDTA; 1 mM PMSF w gradiencie NaCl w 0,7-2 M. Dla wszystkich wariantów proces nadprodukcji i oczyszczania przebiegł z podobną wydajnością, co wskazuje, że wprowadzenie łącznika nie wpływa w istotnym stopniu na wydajność procesu otrzymywania białka. Tożsamość otrzymanych białek została potwierdzona z wykorzystaniem spektrometrii mas MALDI-MS.

Analiza reaktywności

Przeprowadzono reakcję koniugacji otrzymanych wariantów białka FGF2 z lekiem cytotoksycznym, pochodną monometyloaurystatyny E (vcMMAE) oraz PEGylowaną pochodną aurystatyny Y. Reakcję przeprowadzono w 50 mM buforze fosforanowym o pH = 6,9 zawierającym 0,5 MNaCl i 1 mM EDTA. Do białka o stężeniu 0,3 mg/ml dodano 5-ciokrotny molowy nadmiar cytostatyku, rozpuszczonego w DMAc (50 mg/mL). Reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Tak

PL 238 516 B1 otrzymane próbki poddano analizie SDS-PAGE (Fig. 6), oraz HPLC w celu oznaczenia wydajności reakcji koniugacji (Tab. 4). Dodatkowo, na podstawie otrzymanych widm fluorescencji, wykonano analizę stanu natywnego otrzymanych koniugatów, aby potwierdzić ich prawidłową konformację (Fig. 7). W stanie natywnym sygnał fluorescencyjny pochodzący od pojedynczej reszty tryptofanu obecnej w białku jest wygaszony. Rozluźnienie struktury, spowodowane zmianami konformacyjnymi, powoduje wzrost fluorescencji tryptofanu a widmo staje się zdominowane przez szczyt położony około 353 nm, charakterystyczny dla pierścienia indolowego reszty Trp. Rozwijanie białka nie wpływa w istotny sposób na emisję tyrozyn.

Aktywność biologiczna in vitro

Dla wybranych koniugatów: KCK-FGF2-vcMMAE, KCK-FGF2 SS-vcMMAE, FGF2-KCK SS i FGF2 WT przeprowadzono testy cytotoksyczności na nowotworowych liniach komórkowych (kostniakomięsak ludzki) U2OS (Fig. 9) oraz U2OS stabilnie transfekowanej receptorem 1 czynnika wzrostu fibroblastów (U2OS_FGFR1) (Fig. 8). Komórki były hodowane w medium DMEM z 10% FBS oraz 1% dodatkiem mieszaniny penicilina/streptomycyna. Komórki wysiewano na 96-cio dołkowe płytki (ok. 10000 komórek na dołek). Hodowlę prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Preparaty białkowe dodawano do komórek 24 godziny po ich wysianiu. Komórki inkubowane były z białkami przez 72 godziny. Przez ostatnie 4 godziny w hodowli obecny był odczynnik Alamar Blue (Invitrogen). Odczytu sygnału fluorescencji, proporcjonalnego do żywotności komórek, dokonywano na czytniku płytek EnVisionMultilabelPlate Reader (PerkinElmer). Żywotność komórek normalizowano względem kontroli pozytywnej i negatywnej odpowiednio: komórek traktowanych buforem PBS oraz traktowanych 0,1% detergentem (TWEEN-20).

P r z y k ł a d 4. Wykorzystanie łącznika w celu uzyskania specyficznego miejsca podstawienia cytostatyku pochodną monometyloaurystatyny E (vcMMAE) do jednołańcuchowego fragmentu zmiennego przeciwciała (scFv) skierowanego wobec receptora 1 FGF oraz jednołańcuchowego fragmentu zmiennego przeciwciała (scFv) skierowanego wobec receptora 2 FGF.

Wprowadzenie łącznika

Przygotowano warianty scFv, do których na końcu C wprowadzono sekwencję łącznika GGSKCK wykorzystując technikę PCR. Uzyskane konstrukty posiadały wyłącznie jedną eksponowaną do środowiska resztę cysteinylową (zawartą w łączniku). Zaprojektowane białka zostały wyprodukowane w komórkach bakteryjnych E. coli HB2151. Plazmid pIT2 zawierający sekwencję scFv-GGSKCK wprowadzono do komórek HB2151 na drodze elektroporacji, następnie komórki hodowano do OD600 » 0,8 w temperaturze 37°C w medium 2xTY zawierającym 100 μg/ml ampicyliny i 0,1% glukozę. Produkcję białka indukowano izopropylotiogalaktozydem o stężeniu 0,5 mM, hodowlę kontynuowano przez 12 godzin w temperaturze 30°C. Hodowlę żwirowano (4,000 ref, 4°C, 40 minut), a otrzymany supernatant przefiltrowano przez filtr o średnicy 0,22 μm. Do supernatantu dodano EDTA do końcowego stężenia 2 mM, następnie supernatant nanoszono na złoże z białkiem A (Protein A Sepharose Fast Flow Resin, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) w temperaturze 4°C z szybkością 1 ml/min. Elucję białka z kolumny prowadzono w wysokim pH z użyciem 100 mM trietylaminy, eluat neutralizowano buforem: 1M Tris pH 7,2. Roztwór białka dializowano do buforu PBS pH 7,4 w 4°C przez noc. Tożsamość białek została potwierdzona z wykorzystaniem spektrometrii mas MALDI-MS. Wydajność nadprodukcji białek scFv-GGSKCK była taka sama jak scFv bez linkera, co sugeruje że wprowadzenie linkera do sekwencji białka nie wpływa na proces jego produkcji.

Analiza reaktywności

Reakcję koniugacji scFv-GGSKCK z lekiem cytotoksycznym, pochodną monometyloaurystatyną E (vcMMAE) przeprowadzono w buforze: 25 mM boran sodu, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0. Do białka o stężeniu 0,8 mg/ml dodano 2-krotny molowy nadmiar TCEP, mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 60 min w celu zredukowania reszty cysteinylowej. Następnie dodano czterokrotny molowy nadmiar cytostatyku vcMMAE, rozpuszczonego w DMAc (50 mg/mL). Reakcję prowadzono przez 180 min w temperaturze 4°C. W celu usunięcia pozostałości vcMMAE roztwór dializowano do PBS pH 7,4 przez noc w temperaturze 4°C, następnie preparat przefiltrowano przez filtr 0,22 μm.

PL 238 516 B1

Analiza MALDI-MS (Fig. 10; Fig. 11) oraz SDS-PAGE (Fig. 12; Fig. 13) wykazała prawidłowe - jednokrotne podstawienie vcMMAE zarówno do scFv jak i scFvF7.

Aktywność biologiczna in vitro

Określono wpływ koniugatu scFv-GGSKCK-vcMMAE na żywotność komórek nowotworowych (Fig. 14). Do testów wybrano linię U2OS (kostniakomięsak ludzki) stabilnie transfekowaną FGFR1 (U2OSF_GFR1) oraz NCI-H1581 (niedrobnokomórkowy rak płuca) naturalnie nadprodukującą FGFR1. Jako komórek kontrolnych użyto linii U2OS oraz NCI-1975 (niedrobnokomórkowy rak płuca), charakteryzujące się brakiem nadprodukcji FGFR1. Komórki U2OS_FGFR1 hodowano w medium DMEM z 10% FBS, 1% dodatkiem mieszaniny penicylina/streptomycyna oraz 0,2 mg/ml G-418. Pozostałe komórki hodowano zgodnie z zaleceniami sprzedawcy. Eksperyment przeprowadzono według dwóch schematów. W pierwszym komórki U2OS (Fig. 14a) i U2OS-R1 (Fig. 14b) inkubowano z scFv-GGSKCK-vcM-MAE lub białkiem kontrolnym scFv-GGSKCK przez 92 godzin, następnie do hodowli dodano odczynnik Alamar Blue (Invitrogen), a komórki inkubowano przez następne 4 godziny w 37°C. Żywotność komórek określono na podstawie pomiaru fluorescencji wykorzystując czytnik płytek EnVision MultilabelPlate Reader (PerkinElmer). W drugim eksperymencie linie komórkowe raka płuc NCI-H1581(Fig. 14c) oraz NCI-H1975 (Fig. 14d) inkubowano przez 24 godziny z koniugatem lub samym białkiem, następnie komórki przemywano i hodowano dodatkowo prze 72 godziny w nieobecności cząsteczek badanych. Przez ostatnie 4 godziny w hodowli obecny był odczynnik Alamar Blue (Invitrogen). Odczytu sygnału fluorescencji, proporcjonalnego do żywotności komórek, dokonywano analogicznie jak w przypadku komórek U2OS i U2OS_FGFR1. Żywotność komórek normalizowano względem komórek nie traktowanych cząsteczkami badanymi (Fig. 14).

P r z y k ł a d 5. Wykorzystanie łącznika w celu uzyskania z wysoką wydajnością terapeutycznego koniugatu białka affibody skierowanego przeciwko receptorom HER2.

Wprowadzenie łącznika

Białko ZHER2:2891 w swojej sekwencji aminokwasowej liczącej 58 reszt aminokwasowych nie zawiera reszt cyteinylowych. W celu miejscowo-specyficznej koniugacji związków cytotoksycznych oraz znaczników fluorescencyjnych do białka affibody, na końcu C tego białka została wprowadzona sekwencja łącznika GGSCKC za pomocą techniki inverse pcr. Natomiast na końcu N biała wprowadzono miejsce cięcia proteazy rTEV. Białko zostało otrzymane na drodze ekspresji w systemie bakteryjnym E. coli BL21(DE3)pLysS z użyciem wektora Gateway pDEST15 (Invitrogen), który umożliwia ekspresję białka w fuzji z S-transferazą glutationu (GST). Hodowlę prowadzono w pożywce LB zawierającej 1% glukozy, 100 pg/mL ampicyliny oraz 32 pg/mL chloramfenikolu w temperaturze 37°C. Ekspresję indukowano izopropylotiogalaktozydem o końcowym stężeniu 0,5 mM przy OD600 » 0,8, a następnie hodowlę kontynuowano przez 4 godziny. Hodowlę żwirowano, a osad zawieszono w 50 mL buforu lizującego zawierającego 25 mM bufor fosforanowy pH = 6,8; 0,150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM PMSF. Komórki zdezintegrowano przy użyciu sonikatora igłowego. Następnie uzyskany ekstrakt komórkowy żwirowano przy 20000 ref przez godzinę. Supernatant inkubowano ze złożem glutationowym Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare Life Sciences) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu złoża buforem do cięcia proteolitycznego rTEV zawierającego 50 mM Tris pH = 8,0; 0,5 mM EDTA; 1 mM DTT. Następnie złoże zawieszono w powyższym buforze, dodano proteazy rTEV i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Po tym czasie oddzielono złoże od supernatantu na kolumnie grawitacyjnej, supernatant zagęszczono i poddano filtracji żelowej na kolumnie Superdex 75 Prep Grade (GE Healthcare) z wykorzystaniem buforu do koniugacji zawierającego 25 mM bufor fosforanowy; 0,150 M NaCl; 1 mM EDTA. Tożsamość otrzymanego białka została potwierdzona z wykorzystaniem spektrometrii mas MALDI-MS. Wprowadzenie łącznika GGSKCK nie wpłynęło na wydajność ekspresji białka affibody. Wprowadzenie łącznika GGSKCK spowodowało wzrost temperatury denaturacji białka z 71,9°C (dla ZHER2:2891) do 76,2°C (dla ZHER2:2891-GGSKCK) (Fig. 15).

Analiza reaktywności

Przeprowadzono reakcję koniugacji białka affibody ZHER2:2891 -GGSKCK z lekiem cytotoksycznym pochodną monometyloaurystatyny E (vcMMAE). Reakcję przeprowadzono w 25 mM buforze fosforanowym o pH = 6,8 zawierającym 0,15 M NaCl i 1 mM EDTA. Do białka o stężeniu 0,25 mg/ml dodano dwu oraz pięciokrotny molowy nadmiar cytostatyku, rozpuszczonego w DMAC (10 mg/mL). Zwiększenie nadmiaru molowego cytostatyku w tym przypadku nie zwiększyło wydajności reakcji. Reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Tak otrzymane próbkę poddano analizie HPLC w celu oznaczenia wydajności koniugacji, która wykazała iż reakcja ta przebiegła z 72% wydajnością

PL 238 516 B1 (Fig. 16). Tożsamość otrzymanego koniugatu ZHER2:2891-GGSKCK-vcMMAE została potwierdzona za pomocą spektrometrii mas MALDI-MS (Fig. 17).

Aktywność biologiczna in vitro

Testy cytotoksyczności koniugatu przeprowadzono na liniach komórkowych nowotworu gruczołu piersiowego: linii SK-BR-3 charakteryzującej się nadekspresją receptora HER2 oraz linii MDA-MB-231 posiadającej fizjologiczny poziom tego receptora. Komórki SK-BR-3 oraz MDA-MB-231 hodowane były, odpowiednio, w medium McCoy’s 5A (Lonza) oraz w medium DMEM (Biowest) z 10% dodatkiem FBS oraz 1% dodatkiem mieszaniny penicilina/streptomycyna. Hodowlę prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Komórki wysiewano na 96-cio dołkowe płytki (ok. 5000 komórek na dołek). Koniugat ZHER2:2891-GGSKCK-vcMMAE został dodany w różnych stężeniach do komórek 24 godziny po ich wysianiu. Komórki inkubowane były z koniugatem przez 96 godziny. Przez ostatnie 4 godziny w hodowlę prowadzono w medium z 10% dodatkiem odczynnika Alamar Blue (Invitrogen). Odczytu sygnału fluorescencji, proporcjonalnego do żywotności komórek, dokonywano na czytniku płytek EnVisionMultilabelPlate Reader (PerkinElmer). Jako kontrolę negatywną użyto komórki traktowane 1% Tween-20. Żywotność komórek normalizowano względem komórek traktowanych PBS-em (Fig. 18).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania modyfikowanego polipeptydu, znamienny tym, że: do N lub C końca polipeptydu przyłącza się metodami inżynierii genetycznej łącznik peptydowy zawierający reaktywną resztę Cys wybrany spośród peptydów o sekwencji: GGSKCK lub MKCKSGG, a następnie izoluje się zmodyfikowany polipeptyd.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako polipeptyd stosuje się jednołańcuchowy fragment zmienny przeciwciała (scFv) skierowanego wobec receptora ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 1 lub 2.