CN108472386A - 用于缀合抗体的转谷氨酰胺酶变体 - Google Patents

用于缀合抗体的转谷氨酰胺酶变体 Download PDF

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Abstract

转谷氨酰胺酶变体能够缀合不被来自茂原链霉菌的野生型转谷氨酰胺酶缀合的抗体。

Description

用于缀合抗体的转谷氨酰胺酶变体
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求在2015年10月2日提交的美国临时申请No.62/236274的权益，其公开内容通过提述并入本文。
序列表
通过提述将名称为“12610WOPCT_ST25”的序列表整体并入本文，其包括SEQ IDNO:1到SEQ ID NO:12，包括本文中公开的核酸和/或氨基酸序列。该序列表已经通过EFS-Web以ASCII文本格式一并提交，从而构成其纸件和计算机可读形式。该序列表最初在2015年9月24日使用PatentIn 3.5创建，大小约为25KB。
发明背景
抗体在医学和生物技术中有广泛应用。对于一些应用，希望将抗体与另一化学模块缀合，即，将抗体与这样的模块共价连接。所述模块可以是例如另一种蛋白质、放射性同位素、测定剂(例如，生物素或荧光标记)或药物。
已经公开了许多用于实现缀合的方法。转谷氨酰胺酶，特别是具有根据SEQ IDNO:1的氨基酸序列并在下文中称为BTG的来自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的细菌转谷氨酰胺酶，已经用于缀合抗体和其他蛋白质。
BTG可以在转酰胺反应中在第一蛋白质中的谷氨酰胺(胺受体)的甲酰胺侧链和第二蛋白质中的赖氨酸(胺供体)的ε-氨基之间形成酰胺键。在特异性方面，转谷氨酰胺酶对于谷氨酰胺残基具有选择性，要求它位于蛋白质环的柔性部分中，并且侧接特定的氨基酸。相反，BTG对于赖氨酸残基是宽容的：它甚至接受来自非蛋白质来源如亚烷基氨基化合物的氨基作为赖氨酸ε-氨基替代物。参见Fontana等人，2008。
IgG同种型的抗体具有多个谷氨酰胺——仅在重链恒定区中就具有九个或更多个，确切的数量取决于同种型。然而，在天然抗体中它们都不与BTG反应——即，它们不会转谷氨酰胺酶转酰胺基——因而对抗体进行一些修饰对于诱导反应性是必需的。通常，抗体在重链的天冬酰胺297(N297)处被糖基化(N-连接的糖基化)。Jeger在2009年和Jeger等人在2010年公开，通过N297A置换消除糖基化位点或使用诸如s PNGase F(肽-N-糖苷酶F)之类的酶进行翻译后酶促去糖基化使抗体去糖基化，可导致邻近的谷氨酰胺295(Q295)具有BTG反应性。(抗体恒定区中氨基酸位置的参考采用了按照EU索引的编号，如在Kabat等人的“Sequences of proteins of immunological interest”，第5版，出版号91-3242，U.S.Dept.Health&Human Services,NIH，Bethesda,Md.,1991；以下简称“Kabat”中所给出)。他们进一步显示，N297Q取代不仅消除了糖基化，而且还在第297位引入了第二个谷氨酰胺残基，即胺受体。因此，简单的去糖基化在每个抗体中产生两个BTG反应性谷氨酰胺残基(每条重链一个，位于Q295)，而N297Q取代产生四个BTG反应性谷氨酰胺残基(每条重链两个，位于Q295和Q297)。
BTG的谷氨酰胺选择性可通过改变其氨基酸序列加以调变。在对人生长激素(hGH)研究中，Norskov-Lauritsen等人在2009年发现，通过用其他碱性或酸性氨基酸取代多达三个碱性或酸性氨基酸残基，可以提高BTG对hGH中的Gln-40与Gln141相比的选择性。在对另一种生物，拉达卡链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum)的研究中，Hu等人在2009年、2010a和2010b报道，该生物的转谷氨酰胺酶对Gln-141的选择性可以通过在某些位置修饰其氨基酸序列或通过向其N端添加残基得以提高。
Tagami等人在2009年、Yokoyama等人在2010年研究了突变对BTG针对作为胺受体的二肽N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺酰甘氨酸(在Tagami等人2009年的工作中还有卵清蛋白)的比活性的影响。他们所进行的取代以及突变对比活性的影响分别概括在表1和表2-4中。另一篇关于谷氨酰胺标签的公开文献可参见Rao-Naik在2015年10月2日提交的美国临时申请系列号62/236,282。
作为与修饰BTG的氨基酸序列改变其底物特异性或活性互为补充的手段，可以修饰抗体的结构使其具有BTG反应性。除了如上讨论的Jeger在2009年和Jeger等人在2010年公开的修饰之外，可以将含谷氨酰胺的肽或“标签”添加至抗体，以引入BTG反应性的外源谷氨酰胺。参见Dorywalska等人，2015；Pons等人，2013以及Rao-Naik 2015。标签可以是插入或取代进入抗体中的谷氨酰胺——即，单个氨基酸的插入或取代——或者标签可以是插入抗体链的N端、中间或C端的含谷氨酰胺的多肽，上述抗体链通常是但不一定是重链。
在抗体缀合物中，在医疗领域引起强烈兴趣的一种类型是抗体-药物缀合物(ADC，也称为免疫缀合物)。在ADC中，治疗剂(也称为药物、有效负载或弹头)与抗体共价连接，所述抗体的抗原(肿瘤相关抗原)由癌细胞表达。抗体通过与抗原结合将ADC递送至癌症部位。在癌症部位，共价连接被切割或抗体被降解，使得治疗剂被释放。相反，当ADC在血液系统中循环时，由于治疗剂与抗体是共价连接的，治疗剂保持无活性。由于ADC中的治疗剂是局部释放的，可以比普通的化疗剂更有效(细胞毒性)得多。总之，ADC包含三个组分：(1)抗体、(2)药物和(3)共价连接抗体和药物的接头。有关ADC的一般综述，参见Schrama等人，2006。有关ADC的BTG介导的制备的公开包括：Dennler等人，2014，Hu等人，2015，Innate Pharma2013，Jeger 2009，Jeger等人，2010，Lhospice等人，2015，Pons等人，2013，以及Strop等人，2013。
其他一般性地涉及蛋白质(包括抗体)的标记或修饰的有关转谷氨酰胺酶的公开包括：Bregeon 2014，Bregeon等人，2013和2014，Chen等人，2005，Fischer等人，2014，Kamiya等人，2011，Lin等人，2006，Mero等人，2009，Mindt等人，2008，Sato 2002，Sato等人，2001，Schlibi等人，2007以及Sugimura等人，2007。
在本说明书的末尾列出了按照第一作者或发明人和年度的在本文中引证的文件的全部出处。
发明简述
虽然理论上BTG作为用于制造抗体缀合物的作用剂是有吸引力的，但其一个实际限制在于，需要以某种方式修饰抗体——去糖基化或添加含有接受BTG的谷氨酰胺的标签——以便提供可用作胺受体的谷氨酰胺。
本发明提供了变体转谷氨酰胺酶和使用它们来制造抗体缀合物的方法。本发明的方法不限于任何特定的抗体，但它们特别有利地用于缀合处于天然状态的抗体，即，未经修饰以引入外源BTG反应性谷氨酰胺或使得内源谷氨酰胺具有BTG反应性，并且不可与BTG缀合的抗体。
在第一个方面，本发明提供了制造抗体缀合物的方法，其包括：
(a)在变体转谷氨酰胺酶存在下，将抗体与包含伯胺和选自蛋白质、放射性同位素、测定剂及药物的模块的胺供体化合物混合，所述变体转谷氨酰胺酶包含与SEQ ID NO:1至少90％相同(优选至少95％同一性，更优选100％同一性)的氨基酸序列，条件是所述变体转谷氨酰胺酶具有选自下组的氨基酸取代特征：(A)E300A，(B)I240A和P241A，(C)E249Q，和(D)E300A和Y302A；并且
(b)容许所述变体转谷氨酰胺酶催化所述抗体的谷氨酰胺的侧链甲酰胺与所述胺供体化合物的伯胺之间形成酰胺键，由此制造抗体缀合物。
在第二个方面，本发明提供了制造抗体缀合物的另一种方法，其包括：
(a)在变体转谷氨酰胺酶存在下，将抗体与第一化合物混合，其中第一化合物为具有伯胺和第一反应性官能团的胺供体化合物，所述变体转谷氨酰胺酶包含与SEQ ID NO:1至少90％相同(优选至少95％同一性，更优选100％同一性)的氨基酸序列，条件是所述变体转谷氨酰胺酶具有选自下组的氨基酸取代特征：(A)E300A，(B)I240A和P241A，(C)E249Q，和(D)E300A和Y302A；
(b)容许所述变体转谷氨酰胺酶催化所述抗体的谷氨酰胺的侧链甲酰胺与所述第一化合物的伯胺之间形成酰胺键，从而产生所述抗体与所述第一化合物的加合物；
(c)使所述加合物与具有第二反应性官能团和选自蛋白质、放射性同位素、测定剂及药物的模块的第二化合物接触；所述第二反应性官能团能够与所述第一反应性官能团反应以在二者之间形成共价键；并且
(d)容许所述第一和第二反应性官能团反应并在二者之间形成共价键，由此制造抗体缀合物。
在前述两种方法中的任意一种中，抗体优选是按照Kabat中的EU索引编号在第295位具有谷氨酰胺(Q295)并且在第297位具有糖基化的天冬酰胺(N297)的IgG抗体。这样的抗体不会被BTG转酰胺基，但会被本发明的变体转谷氨酰胺酶在Q295转酰胺基。
在前述两种方法中的任意一种中，变体转谷氨酰胺酶优选具有选自下组的氨基酸取代特征：(B)I240A和P241A，(C)E249Q，(D)E300A和Y302A。
在模块(在所述第一化合物或第二化合物中，视情况而定)为蛋白质的情况下，所得到的缀合物是融合蛋白。在所述模块为放射性同位素的情况下，所得到的缀合物可用于放射治疗。所述模块可以是测定剂，例如荧光标记或配体如生物素，在这种情况下，缀合物可以用于诊断或分析应用。优选地，所述模块是药物，在这种情况下，产物是抗体-药物缀合物，其可以用于医学治疗，特别是癌症治疗。
在又另一方面，本发明提供了变体转谷氨酰胺酶，所述变体转谷氨酰胺酶包含与SEQ ID NO:1至少90％相同(优选至少95％同一性，更优选100％同一性)的氨基酸序列，条件是所述变体转谷氨酰胺酶具有选自下组的氨基酸取代特征：(a)I240A和P241A，(b)E249Q，以及(c)E300A和Y302A。在一个优选的实施方案中，所述取代特征是I240A和P241A。在另一个优选的实施方案中，所述取代特征是E249Q。在又另一个优选的实施方案中，所述取代特征是E300A和Y302A。
附图简述
图1示意性地显示了缀合物的BTG介导的制备，其借助于两种方法，分别称为一步法和两步法。
图2是显示利用命名为M8的变体转谷氨酰胺酶的各种抗体缀合的结果的Western印迹。
图3A和3B比较了单独使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与使用变体M8缀合的胰蛋白酶消化片段。
图4是利用命名为M10、M12和M14的变体转谷氨酰胺酶缀合的抗体的Western印迹，以及两个比较/对照抗体的结果。
发明详述
本发明的变体转谷氨酰胺酶能够缀合对茂原链霉菌转谷氨酰胺酶无反应性的抗体。这是一个显著的优点，因为避免了以某种方式改造或修饰抗体的需要。
本发明的一个转谷氨酰胺酶变体，命名为M8，相对于野生型茂原链霉菌转谷氨酰胺酶(SEQ ID NO:1)的序列具有单个突变(E300A)。变体M8的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:4中。在超过30种微生物转谷氨酰胺酶变体中，Tagami等人2009年披露了E300A变体，但仅评估了其针对CBZ-Gln-Gly或卵清蛋白的比活性。
本发明的另一个转谷氨酰胺酶变体，命名为M10，相对于野生型茂原链霉菌转谷氨酰胺酶(SEQ ID NO:1)的序列具有双重突变(I240A和P241A)。变体M10的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:5中。
本发明的又另一个转谷氨酰胺酶变体，命名为M12，相对于野生型茂原链霉菌转谷氨酰胺酶(SEQ ID NO:1)的序列具有单个突变((E249Q)。变体M12的氨基酸序列显示在SEQID NO:6中。
本发明的又另一个转谷氨酰胺酶变体，命名为M12，相对于野生型茂原链霉菌转谷氨酰胺酶(SEQ ID NO:1)的序列具有双重突变(E300A和Y302A)。变体M10的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:7中。
变体M8、M10、M12和M14可以具有保守取代，前提是保留它们各自的特征性取代(a)E300A、(b)I240A/P241A、(c)E249Q或(d)E300A/Y302A。这样的保守修饰形式的变体M8、M10、M12和M14包括在本发明的范围内。关于多肽的“保守修饰”或“保守取代”是指其中的氨基酸被另一个具有相似侧链的氨基酸置换。具有相似侧链的氨基酸的家族在本领域中是已知的。这样的家族包括下列氨基酸：其具有碱性侧链(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、小侧链(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸)、改变链取向的侧链(甘氨酸、脯氨酸)和芳香族侧链(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。可以存在多个保守取代/修饰。优选地，变体M8、M10、M12和M14的保守修饰形式与它们对应的未修饰序列至少90％相同，更优选至少95％同一性，或者具有1至3个保守氨基酸取代。
BTG变体M8、M10、M12和M14可进一步包含根据SEQ ID NO:8的四肽的N端延伸部分(FRAP)。Yokoyama等人在2010年公开，在S199A取代的背景下，FRAP延伸部分可以对比活性产生积极影响。
BTG变体M8、M10、M12和M14可以在其C端进一步包含聚组氨酸肽延伸部分，例如SEQID NO:3的氨基酸残基336-441。聚组氨酸肽是用于纯化目的的有用标签，并且不影响酶活性。通常，聚组氨酸肽长度为6-8个残基，优选长度为6个残基。
可以通过本发明的方法缀合的抗体包括识别以下抗原的抗体：间皮素、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD19、CD22、CD30、CD70、B7H3、B7H4(也称为O8E)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、RG1、岩藻糖基-GM1、CTLA-4和CD44。抗体可以是动物的(例如鼠的)、嵌合的、人源化的，或者优选人的。抗体优选是单克隆抗体，特别是单克隆人抗体。针对一些上述抗原的人单克隆抗体的制备公开于Korman等人，US 8,609,816 B2(2013；B7H4，也称为08E；尤其是抗体2A7、1G11和2F9)；Rao-Naik等人，8,097,703B2(2012；CD19；尤其是抗体5G7、13F1、46E8、21D4、21D4a、47G4、27F3和3C10)；King等人，US 8,481,683B2(2013；CD22；尤其是抗体12C5、19A3、16F7和23C6)；Keler等人，US 7,387,776B2(2008；CD30；尤其是抗体5F11、2H9和17G1)；Terrett等人，US 8,124,738B2(2012；CD70；尤其是抗体2H5、10B4、8B5、18E7和69A7)；Korman等人，US 6,984,720 B1(2006；CTLA-4；尤其是抗体10D1、4B6和1E2)；Vistica等人，US 8,383,118 B2(2013，岩藻糖基-GM1,尤其是抗体5B1、5B1a、7D4、7E4、13B8和18D5)Korman等人，US 8,008,449B2(2011；PD-1；尤其是抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4)；Huang等人，US 2009/0297438A1(2009；PSMA；尤其是抗体1C3、2A10、2F5、2C6)；Cardarelli等人，US 7,875,278B2(2011；PSMA；尤其是抗体4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3)；Terrett等人，US 8,222,375B2(2012；PTK7；尤其是抗体3G8、4D5、12C6、12C6a和7C8)；Terrett等人，US 8,680,247B2(2014；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；尤其是抗体4A6、11E7和16D10)；Harkins等人，US 7,335,748B2(2008；RG1；尤其是抗体A、B、C和D)；Terrett等人，US 8,268,970B2(2012；间皮素；尤其是抗体3C10、6A4和7B1)；Xu等人，US 2010/0092484A1(2010；CD44；尤其是抗体14G9.B8.B4、2D1.A3.D12和1A9.A6.B9)；Deshpande等人，US 8,258,266B2(2012；IP10；尤其是抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、7C10、8F6、10A12、10A12S和13C4)；Kuhne等人，US 8,450,464B2(2013；CXCR4；尤其是抗体F7、F9、D1和E2)；以及Korman等人，US 7,943,743 B2(2011；PD-L1；尤其是抗体3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4)；将上述公开内容通过提述并入本文。
BTG介导的抗体缀合物的制备可以通过一步法或两步法来进行，如图1中示意性展示。在一步法中，BTG将抗体上充当胺受体的谷氨酰胺甲酰胺与胺供体化合物H2N-L-D偶联，从而直接形成缀合物，其中L是接头模块，D是蛋白质、放射性同位素、测定剂或药物。在两步法中，BTG催化充当胺受体的抗体谷氨酰胺甲酰胺与胺供体化合物即第一化合物H2N-L’-R’(其中L'是接头模块，R'是第一反应性官能团)之间形成初始转酰胺加合物。随后，让所述加合物与第二化合物R”-L”-D反应，其中R”是能够与R’反应的第二反应性官能团，L”是接头模块，D如上所定义。有时，一步法被称为酶法，而两步法被称为化学-酶法。
胺供体，无论是H2N-L-D还是H2N-L’-R’，通常大量过量使用，以便抑制谷氨酰胺甲酰胺与抗体赖氨酸的ε-氨基之间发生不希望的转酰胺基作用。如果模块D昂贵或难以获得，则大量过量使用可能是不切实际的。在这样的情况下，两步法可能是优选的。
在一个优选的实施方案中，一步法中的胺供体化合物由式(I)表示：
H2N-(CH2)2-6D (I)
其中D是蛋白质、放射性同位素、测定剂或药物。
更优选地，使用一步法来制造ADC，这样胺供体化合物可以具有由式(Ia)表示的结构：
其中
D是药物；
T是自消基团；
t是0或1；
AAa和AAb各自独立地选自下组：丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
p是1、2、3或4；
q是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
r是1、2、3、4或5；并且
s是0或1。
在式(Ia)中，-AAa-[AAb]p-代表其长度由p的值决定的多肽(如果p为1则为二肽，如果p为3则为四肽，等)。AAa位于多肽的羧基末端，并且其羧基与药物D(或自消基团T，如果存在的话)的胺基氮形成肽(酰胺)键。相反，最后一个AAb位于多肽的氨基末端，并且其α-氨基与
形成肽键，这取决于s分别是1还是0。优选的多肽-AAa-[AAb]p-是Val-Cit、Val-Lys、Lys-Val-Ala、Asp-Val-Ala、Val-Ala、Lys-Val-Cit、Ala-Val-Cit、Val-Gly、Val-Gln和Asp-Val-Cit,以常规的N至C方向书写，正如H2N-Val-Cit-CO2H)。更优选地，所述多肽是Val-Cit、Val-Lys或Val-Ala。优选地，多肽-AAa-[AAb]p-可被靶(癌)细胞内存在的酶切割，这样的酶例如组织蛋白酶，特别是组织蛋白酶B。
如果下标s为1，则药物-接头(Ia)含有聚(乙二醇)(PEG)基团，其可以有利地改善药物-接头(Ia)的溶解性，促进与抗体的缀合——一个在水性介质中进行的步骤。而且，PEG基团可以用作抗体和肽-AAa-[AAb]p-之间的间隔物，使得抗体的大体积在空间上不干扰肽切割酶的作用。
如下标t等于0或1所表明的，自消基团T可任选地存在。自消基团是这样的一个基团，其使得当AAa或AAb(视情况而定)被切割时，引发一系列反应，导致自消基团将自己与药物D脱离结合(disband)并释放后者以发挥其治疗功能。当存在时，自消基团T优选为对氨基苄基氧羰基(PABC)基团，其结构如下所示，其中星号(*)表示与药物D的胺氮键合的PABC的末端，波浪线表示与多肽-AAa-[AAb]p-键合的末端。
可以使用的另一自消基团是取代的噻唑，如Feng在US7,375,078B2(2008)中所公开的，。
在两步缀合中，可以使用基团R'和R”的多种组合。适合的R'和R”(或反之，R”和R')的组合包括：
(a)马来酰亚胺基团和巯基基团，用以形成迈克尔加成加合物，如
(b)二苯并环辛炔基和叠氮基，用于通过“点击”化学形成环加成产物，如
(c)N-羟基琥珀酰亚胺酯和胺，用以形成酰胺，如
和
(d)醛或酮(其中“烷基”优选为C1-3烷基)和羟胺，用以形成肟，如
因此，R'可以选自
反过来，R”可以选自
式(II)中描绘了适合的用于两步法的胺供体化合物H2N-L’-R’
H2N-(CH2)2-8-R' (II)
其中R'如上所定义且优选为
式(III)中示出了相应的适合的化合物R”-L”-D
其中R”如上所定义且优选为
并且r、q、s、AAb、p、AAa、T、t和D如上关于式(Ia)所定义。
在缀合物是旨在用于癌症治疗的ADC的情况下，药物模块优选是引起靶癌细胞死亡的细胞毒性药物。可以在ADC中使用的细胞毒性药物包括下列类型的化合物及其类似物和衍生物：
(a)烯二炔类，如卡奇霉素(参见，例如，Lee等人，J.Am.Chem.Soc.1987,109,3464和3466)和uncialamycin(参见，例如，Davies等人，WO 2007/038868A2(2007)；Chowdari等人，US 8,709,431B2(2012)；以及Nicolaou等人，WO 2015/023879 A1(2015))；
(b)微管溶素类(参见，例如，Domling等人，US 7,778,814B2(2010)；Cheng等人，US 8,394,922 B2(2013)；以及Cong等人，US 8,980,824 B2(2015))；
(c)DNA烷化剂类，比如CC-1065的类似物和倍癌霉素(参见，例如，Boger,US 6,5458,530 B1(2003)；Sufi等人，US 8,461,117 B2(2013)；以及Zhang等人，US 8,852,599 B2(2014))；
(d)埃坡霉素类(参见，例如，Vite等人，US 2007/0275904 A1(2007)和US RE42930 E(2011))；
(e)奥利斯达汀类(auristatins)(参见，例如，Senter等人，US 6,844,869 B2(2005)和Doronina等人，US 7,498,298 B2(2009))；
(f)吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体类(参见，例如，Howard等人，US 2013/0059800A1(2013)；US 2013/0028919 A1(2013)；以及WO 2013/041606 A1(2013))；和
(g)美登木素生物碱类，如DM1和DM4(参见，例如，Chari等人，US 5,208,020(1993)和Amphlett等人，US 7,374,762 B2(2008))。
优选地，所述药物是DNA烷化剂、微管溶素、奥利斯达汀、吡咯并苯并二氮杂卓、烯二炔或美登木素生物碱化合物。具体的例子是：
在上述前五种药物的情况下，实现与接头L或L”(视情况而定)缀合的官能团是胺(-NH2)基团，并且在最后两种药物的情况下，所述官能团是甲胺(-NHMe)基团。
上述药物模块可用于通过一步法或两步法制造的ADC中。
除了公开药物模块本身之外，上述参考文献还公开了根据式(Ia)或(III)的药物-接头构建体，或者可以在做必要的修改之后适用于制造这样的药物-接头化合物的药物-接头构建体。与药物-接头化合物的制备有关的特别有关的公开可见于Chowdari等人，US 8,709,431 B2(2012)；Cheng等人，US 8,394,922 B2(2013)；Cong等人，US 8,980,824 B2(2015)；Sufi等人，US 8,461,117 B2(2013)；以及Zhang等人，US 8,852,599 B2(2014)。尽管这些参考文献可以涉及的是具体的药物模块，但本领域技术人员将会理解，制造药物-接头化合物的原理在做必要的修改之后而同样适用于其他类型的药物。
本领域技术人员将会理解，利用本发明的变体转谷氨酰胺酶制造抗体缀合物的一个特殊优势在于，避免了修饰抗体以引入外源BTG反应性谷氨酰胺或使内源性谷氨酰胺具有BTG反应性的需要。然而，并不排除使用变体转谷氨酰胺酶来制造经过了如此修饰的抗体的缀合物。可以通过用谷氨酰胺取代内源氨基酸来修饰抗体，以便引入BTG反应性的外源抗体。如由Jeger在2009年和Jeget等人在2010年所公开的N297Q取代是一个实例。或者，可以通过在抗体(特别是重链)的N端、内部或C端插入含谷氨酰胺的肽或“标签”来引入外源谷氨酰胺，如在Dorywaslka等人，2015，Pons等人，2013，和Rao-Naik 2015中公开的。使内源谷氨酰胺具有BTG反应性的抗体修饰的实例是：通过消除第297位的糖基化、通过酶促去糖基化、通过N297A取代或通过N297Q取代来激活Q295，正如在Jeger在2009年和Jeger等人在2010年公开的。
如果抗体的谷氨酰胺的甲酰胺侧链用作茂原链霉菌转谷氨酰胺酶(SEQ ID NO:1)的胺受体，使用羟胺作为胺供体，则抗体中的谷氨酰胺是BTG反应性的(与“转谷氨酰胺酶反应性的”同义)谷氨酰胺。
通过参考以下实施例可以进一步理解本发明的实践，所述实施例的提供是为了举例说明而不是为了限制。
实施例1--转谷氨酰胺酶
茂原链霉菌转谷氨酰胺酶(BTG)的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:1中。为了产生本发明的突变体，通过在大肠杆菌中重组表达产生BTG，最初产生如SEQ ID NO:2所示的酶原。通过分散酶(dispase)切掉N端肽进行活化，产生如SEQ ID NO:3所示的重组BTG，其在N端含有FRAP四肽，在C端含有聚组氨酸尾(分别为SEQ ID NO:3的氨基酸1-4及336-441)。SEQ IDNO:3的核心部分(氨基酸5-335)与SEQ ID NO:1相同。该重组BTG具有与野生型BTG相同的活性。以下详细描述本文中使用的重组BTG的制备。
来自茂原链霉菌的细菌转谷氨酰胺酶在大肠杆菌中表达为具有C端His标签的酶原。收集表达酶原的细菌细胞离心沉淀并如下处理：在冷冻时将离心沉淀称重。对于每1g离心沉淀，加入2mL的BPER II试剂、0.5mg/mL溶菌酶、0.5U/mL核酸内切酶(EMD Millipore)和一片蛋白酶抑制剂将离心沉淀重悬。重悬液均匀后，将其转移到离心管中，在27000x g下离心15分钟。将上清液倒入单独的容器中，向离心沉淀中加入额外的重悬缓冲液以进一步重悬，在27000x g下离心15分钟。重复该过程两次，合并收集的上清液级分。将合并的上清液级分通过0.2μm过滤器过滤，然后上样到柱上进行纯化。
5mLExcel柱用50mM tris-HCl、300mM NaCl、2mM CaCl2、1mM谷胱甘肽，pH 8.0以10个柱体积(CV)平衡。将提取的蛋白质(约40mL)上样到柱子上。然后用平衡缓冲液(约20个柱体积)洗涤柱子。然后使用含有1.3mg/mL分散酶的平衡缓冲液洗涤柱，直到基线增加为止，这表明分散酶已经在柱内达到平衡。将柱子从仪器中取出并在37℃下温育1小时。温育后，将柱子用平衡缓冲液(无分散酶)洗涤直至达到基线。用35％缓冲液B(50mMTris-HCl、300mM NaCl、500mM咪唑，pH8.0)洗脱活化的蛋白质。
将自洗脱的收集的峰级分合并，并用50mM乙酸钠、500mM NaCl pH 5.5透析过夜。透析后，将最终材料通过0.2μm过滤器过滤，等分并在-80℃下储存。
使用来自Zedira的微生物转谷氨酰酶试剂盒来测量BTG和本发明的变体的比活性。该试剂盒使用N-苄氧羰基-L-谷氨酰胺酰甘氨酸(Z-Gln-Gly或CBZ-Gln-Gly)作为胺受体底物，羟胺作为胺供体。在存在转谷氨酰胺酶的情况下，羟胺被纳入而形成Z-谷氨酰异羟肟酸酯-甘氨酸，后者与铁(III)产生在525nm处可检测到的有色复合物。
实施例2–变体转谷氨酰胺酶的制备
使用重组特异性引物zg67,901(SEQ ID NO:10)和zg67,900(SEQ ID NO:11)通过PCR扩增转谷氨酰胺酶插入物。使用引物扩增每个变体的1238个碱基对的转谷氨酰胺酶片段。为了示例说明，变体M8的扩增子的核苷酸序列提供在SEQ ID NO:12中。本领域技术人员将能够推导出变体M10、M12和M14的相应核苷酸序列。插入片段由内部自行密码子优化，加上C端(His)6标签，并用于亚克隆到包涵体表达载体(pTAP238受体载体，内部自制)中。所得质粒命名为pSDH839(M8，E300A)、pSDH835(M10，I240A/P241A)、pSDH836(M12，E249Q)和pSDH840(M14，E300A/Y302A)。随后将质粒转化到大肠杆菌宿主ZGOLD5中进行表达分析和蛋白质放大生产。
实施例3–抗体与变体M8的缀合
使用N-(生物素基)尸胺(NBC，从德国Zedira GmbH以盐酸盐形式获得，目录号B002)作为胺供体化合物，以演示本发明的BTG变体在N297处存在糖基化时仍然能够在Q295处缀合抗体。
用转谷氨酰胺酶变体M8将NBC与四种不同的抗体(抗间皮素抗体、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体、抗岩藻糖基GM1抗体和抗CD70抗体，每种抗体均在N297处被糖基化)缀合。
抗间皮素抗体和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的实验以较大的规模进行，如下所述：将抗体预稀释至1.14mg/mL用于缀合反应。对于11.4mg的抗体反应(10mL，1.14mg/mL)，将0.255mL的变体M8(净)和1.126mL的NBC(80倍摩尔过量，假定每个抗体具有四个反应性谷氨酸时，为20倍摩尔过量)加入到反应混合物中，得到1.0mg/mL的最终抗体浓度和0.1mg/mL的最终变体M8浓度。将该反应混合物在37℃下温育24小时。
以较小规模进行抗岩藻糖基GM1抗体的缀合反应。将抗体预稀释至1.14mg/mL。对于0.57mg的抗体反应(0.5mL，1.14mg/mL)，将0.0127mL的变体M8(净)和0.056mL的NBC(80倍摩尔过量有效负载，每个位点20倍摩尔过量)加入到反应混合物中，得到1.0mg/mL的最终抗体浓度和0.1mg/mL的最终M8浓度。将反应混合物在37℃下温育24小时。
温育24小时后，使用MabSelect SuRe柱从反应混合物中清除未缀合的生物素-尸胺。上样前先用1x PBS pH 7.4平衡柱子。在将反应混合物上样到柱子后，用平衡缓冲液洗涤柱子，然后用20mM甘氨酸、10mM琥珀酸盐在pH 3.2下洗脱。将合并的洗脱物(elutionpool)在配制缓冲液(20mg/mL山梨醇、10mg/mL甘氨酸，pH 5.0)中透析过夜。
图2是显示缀合结果的Western印迹。使用NeutrAvidin辣根过氧化物酶缀合物(Thermo Scientific，目录号31001)通过Neutravidin HRP检测蛋白结合的生物素并使其可视化。表1显示了泳道分配。
51kDa条带(箭头)对应于抗体的重链。未缀合抗体的泳道1、3、5和7是暗的。相反，51kDa条带在泳道2、4、6和8处发光，证明NBC与抗体重链成功缀合。抗岩藻糖基GM1抗体在其轻链的CDR2中具有谷氨酰胺，其显然也被BTG进行转酰胺基作用，从而解释了28kDa处的泳道6的发光点。
用胰蛋白酶消化上述实验中使用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，包括未缀合和缀合的。图3A和3B分别是未缀合抗体和缀合抗体的所得片段的色谱图。在图3B中，有一个对应于生物素化肽EEQYNSTYR(SEQ ID NO:9)的另外的峰，其准确地将Q295确定为被变体M8进行转酰胺基作用的谷氨酰胺。
表2中显示了每个抗体附接的生物素基团的数目。使用来自Thermo Scientific的Pierce生物素定量试剂盒测量生物素含量，该试剂盒使用HABA(4'-羟基偶氮苯-2-羧酸)作为显色剂。
实施例4–抗体与变体M10、M12和M14缀合
使用与前述实施例相同的技术，使用转谷氨酰胺酶变体M10、M12和M14来缀合抗体。另外，使用另外两个变体，分别命名为M9(Q74A/Y75F/P76G)和M11(Y75F/N239A)，作为比较例。
图4是显示结果的蛋白质印迹。表3中提供了泳道分配。
参照51kDa条带，属于对比变体M9和M11的泳道1、3、6和8是暗的，表明NBC不存在，而属于本发明的变体M10、M12和M14的泳道2、4、5、7、9和10是亮的，表明附接了生物素并且通过NeutrAvidin辣根过氧化物酶缀合物检测到并可视化。
生物素/抗体比率显示在表4中。
实施例5–变体M8、M10、M12和M14的比活性
变体M8、M10、M12和M14与BTG对照(未突变)相比较的比活性提供在表5中。活性是使用上面提到的Zedira试剂盒以及底物对Z-Gln-Gly和羟胺获得的。
本发明的前述详细描述包括主要或专门涉及本发明的特定部分或方面的段落。应该理解的是，这是为了清楚和方便，特定的特征可能不仅仅在公开它的段落中有意义，并且本文中的公开内容包括所有适当的在不同段落中所见信息的组合。类似地，虽然本文中的各种附图和描述涉及本发明的具体实施方案，但是应该理解的是，在特定附图或实施方案的背景下公开了具体特征的情况下，也可以在适当的情形下在另一个附图或实施方案的背景下或通常在本发明中结合另一个特征使用这样的特征。
此外，虽然已经根据某些优选实施方案具体描述了本发明，但是本发明不限于这样的优选实施方案。更确切地说，本发明的范围由所附权利要求书限定。
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1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210> 2
<211> 382
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组转谷氨酰胺酶
<400> 2
Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg
1 5 10 15
Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala
20 25 30
Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp
35 40 45
Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro
50 55 60
Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile
65 70 75 80
Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln
85 90 95
Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val
100 105 110
Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala
115 120 125
Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro
130 135 140
Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu
145 150 155 160
Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser
165 170 175
Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu
180 185 190
Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn
195 200 205
Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser
210 215 220
Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala
225 230 235 240
Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser
245 250 255
Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro
260 265 270
Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser
275 280 285
Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe
290 295 300
Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly
305 310 315 320
Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr
325 330 335
Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg
340 345 350
Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro
355 360 365
Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro His His His His His His
370 375 380
<210> 3
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 活化的重组转谷氨酰胺酶
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(4)
<223> N-末端四肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (336)..(341)
<223> C-末端聚组氨酸
<400> 3
Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu
20 25 30
Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His
35 40 45
Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu
50 55 60
Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro
65 70 75 80
Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn
85 90 95
Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe
100 105 110
Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln
115 120 125
Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala
130 135 140
His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn
145 150 155 160
Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser
165 170 175
Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His
180 185 190
Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser
195 200 205
Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro
210 215 220
Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg
225 230 235 240
Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val
245 250 255
Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp
260 265 270
Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser
275 280 285
Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu
290 295 300
Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro
305 310 315 320
Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro His
325 330 335
His His His His His
340
<210> 4
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体M8
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (300)..(300)
<223> E300A取代
<400> 4
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Ala Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210> 5
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体M10
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (240)..(240)
<223> I240A取代
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (241)..(241)
<223> P241A取代
<400> 5
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ala
225 230 235 240
Ala Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210> 6
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体M12
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (249)..(249)
<223> E249Q取代
<400> 6
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Gln Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210> 7
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体M14
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (300)..(300)
<223> E300A取代
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (302)..(302)
<223> Y302A取代
<400> 7
Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met
1 5 10 15
Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn
20 25 30
Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg
35 40 45
Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys
50 55 60
Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn
85 90 95
Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val
100 105 110
Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala
145 150 155 160
Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn
165 170 175
Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg
180 185 190
Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg
195 200 205
Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg
210 215 220
Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile
225 230 235 240
Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr
245 250 255
Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp
260 265 270
Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met
275 280 285
His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Ala Gly Ala Ser Asp
290 295 300
Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn
305 310 315 320
Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端四肽
<400> 8
Phe Arg Ala Pro
1
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰蛋白酶消化片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> 抗体Q295残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 抗体N297残基
<400> 9
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
1 5
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物zg67,901
<400> 10
tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatatat atggataacg gcgcgggcga 60
agaaac 66
<210> 11
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物zg67,900
<400> 11
tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca ttagtgatgg tgatggtgat 60
gtgaacccgg ccagccctgt ttcactttat c 91
<210> 12
<211> 1238
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体M8扩增子
<400> 12
tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatatat atggataacg gcgcgggcga 60
agaaaccaaa agctatgcgg aaacctatcg cctgaccgcg gatgatgtgg cgaacattaa 120
cgcgctgaac gaaagcgcgc cggcggcgag cagcgcgggc ccgagctttc gcgcgccgga 180
tagcgatgat cgcgtgaccc cgccggcgga accgctggat cgcatgccgg atccgtatcg 240
cccgagctat ggccgcgcgg aaaccgtggt gaacaactat attcgcaaat ggcagcaggt 300
gtatagccat cgcgatggcc gcaaacagca gatgaccgaa gaacagcgcg aatggctgag 360
ctatggctgc gtgggcgtga cctgggtgaa cagcggccag tatccgacca accgcctggc 420
gtttgcgagc tttgatgaag atcgctttaa aaacgaactg aaaaacggcc gcccgcgcag 480
cggcgaaacc cgcgcggaat ttgaaggccg cgtggcgaaa gaaagctttg atgaagaaaa 540
aggctttcag cgcgcgcgcg aagtggcgag cgtgatgaac cgcgcgctgg aaaacgcgca 600
tgatgaaagc gcgtatctgg ataacctgaa aaaagaactg gcgaacggca acgatgcgct 660
gcgcaacgaa gatgcgcgca gcccgtttta tagcgcgctg cgcaacaccc cgagctttaa 720
agaacgcaac ggcggcaacc atgatccgag ccgcatgaaa gcggtgattt atagcaaaca 780
tttttggagc ggccaggatc gcagcagcag cgcggataaa cgcaaatatg gcgatccgga 840
tgcgtttcgc ccggcgccgg gcaccggcct ggtggatatg agccgcgatc gcaacattcc 900
gcgcagcccg accagcccgg gcgaaggctt tgtgaacttt gattatggct ggtttggcgc 960
gcagaccgaa gcggatgcgg ataaaaccgt gtggacccat ggcaaccatt atcatgcgcc 1020
gaacggcagc ctgggcgcga tgcatgtgta tgaaagcaaa tttcgcaact ggagcgcggg 1080
ctatagcgat tttgatcgcg gcgcgtatgt gattaccttt attccgaaaa gctggaacac 1140
cgcgccggat aaagtgaaac agggctggcc gggttcacat caccatcacc atcactaatg 1200
ttttggcgga tgagataaga ttttcagcct gatacaga 1238

Claims (14)

1.一种制造抗体缀合物的方法，其包括：
a)在变体转谷氨酰胺酶存在下，将抗体与包含伯胺和选自蛋白质、放射性同位素、测定剂和药物的模块的胺供体化合物混合，所述变体转谷氨酰胺酶包含与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列，条件是所述变体转谷氨酰胺酶具有选自下组的氨基酸取代特征：(A)E300A，(B)I240A和P241A，(C)E249Q，和(D)E300A和Y302A；和
b)容许所述变体转谷氨酰胺酶催化所述抗体的谷氨酰胺的侧链甲酰胺与所述胺供体化合物的伯胺之间形成酰胺键，由此制造抗体缀合物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述抗体具有第295位的谷氨酰胺和第297位的糖基化天冬酰胺的IgG抗体(按照Kabat中的EU索引编号)。
3.根据权利要求1的方法，其中所述变体转谷氨酰胺酶具有选自下组的氨基酸取代特征：(B)I240A和P241A，(C)E249Q，和(D)E300A和Y302A。
4.根据权利要求1的方法，其中所述胺供体化合物中的模块是药物，优选DNA烷化剂、微管溶素、奥利斯达汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓或美登木素生物碱化合物。
5.根据权利要求1的方法，其中所述胺供体化合物具有由式(I)表示的结构：
H2N-(CH2)2-6D (I)
其中D是蛋白质、放射性同位素、测定剂或药物。
6.根据权利要求1的方法，其中所述胺供体化合物具有由式(Ia)表示的结构：
其中
D是药物，优选DNA烷化剂、微管溶素、奥利斯达汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓、或美登木素生物碱化合物；
T是自消基团；
t是0或1；
AAa和AAb各自独立地选自下组：丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
p是1、2、3或4；
q是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
r是1、2、3、4或5；并且
s是0或1。
7.一种制造抗体缀合物的方法，其包括：
a)在变体转谷氨酰胺酶存在下，将抗体与第一化合物混合，其中第一化合物为具有伯胺和第一反应性官能团的胺供体化合物，所述变体转谷氨酰胺酶包含与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列，条件是所述变体转谷氨酰胺酶具有选自下组的氨基酸取代特征：(A)E300A，(B)I240A和P241A，(C)E249Q，和(D)E300A和Y302A；
b)容许所述变体转谷氨酰胺酶催化在所述抗体的谷氨酰胺的侧链甲酰胺与所述第一化合物的伯胺之间形成酰胺键，从而产生所述抗体与所述第一化合物的加合物；
c)使所述加合物与具有第二反应性官能团和选自蛋白质、放射性同位素、测定剂和药物的模块的第二化合物接触；所述第二反应性官能团能够与所述第一反应性官能团反应以在二者之间形成共价键；并且
d)容许所述第一反应性官能团和第二反应性官能团反应并在二者之间形成共价键，由此制造抗体缀合物。
8.根据权利要求7的方法，其中所述抗体是具有第295位的谷氨酰胺和第297位的糖基化天冬酰胺的IgG抗体(按照Kabat中的EU索引编号)。
9.根据权利要求7的方法，其中所述变体转谷氨酰胺酶具有选自下组的氨基酸取代特征：(B)I240A和P241A，(C)E249Q，和(D)E300A和Y302A。
10.根据权利要求7的方法，其中所述胺供体化合物具有由式(II)表示的结构：
H2N-(CH2)2-8-R' (II)
其中
R’选自
并且所述第二化合物具有由式(III)表示的结构
其中
R”选自
D是药物，其优选为DNA烷化剂、微管溶素、奥利斯达汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓、或美登木素生物碱化合物；
T是自消基团；
t是0或1；
AAa和AAb各自独立地选自下组：丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
p是1、2、3或4；
q是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
r是1、2、3、4或5；并且
s是0或1。
11.一种变体转谷氨酰胺酶，其包含与SEQ ID NO:1至少95％相同的氨基酸序列，条件是所述变体转谷氨酰胺酶具有选自下组的氨基酸取代特征：(a)I240A和P241A，(b)E249Q，以及(c)E300A和Y302A。
12.根据权利要求11的变体转谷氨酰胺酶，其具有I240A和P241A氨基酸取代特征并且包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
13.根据权利要求11的变体转谷氨酰胺酶，其具有E249Q氨基酸取代特征并且包含SEQID NO:6的氨基酸序列。
14.根据权利要求11的变体转谷氨酰胺酶，其具有E300A和Y302A氨基酸取代特征并且包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
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